抗血管新生性ポリペプチド及び血管新生を抑制するための方法
【課題】癌、関節炎、黄斑変性、糖尿病性網膜症、原発性及び転移性固形腫瘍、がん腫、肉腫、リンパ腫、乾癬、及び血管腫などの血管新生性疾患を抑制するための組成物を提供する。
【解決手段】ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又はｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５から成る複合クリングルペプチドフラグメントを含む組成物。（ただし、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、特定の４５０−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコール及びセリンを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドであり、ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、特定の４５８−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコールを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドである。）
【解決手段】ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又はｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５から成る複合クリングルペプチドフラグメントを含む組成物。（ただし、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、特定の４５０−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコール及びセリンを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドであり、ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、特定の４５８−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコールを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドである。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の交叉参照）
本出願は、参照してここに組み込まれる、２０００年９月２９日に出願された米国特許仮出願通し番号第６０／２３６，５５０号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明はペプチド化学の分野に関する。より詳細には、本発明は、哺乳類プラスミノーゲンの対応する配列と実質的に類似するアミノ酸配列を含む複合ペプチドの調製と使用、該ペプチドを含む医薬組成物、及び血管新生から生じる又は血管新生によって増悪される疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
新しい血管が形成される過程である血管新生は、再生、成長及び創傷修復を含めた正常な身体活動にとって不可欠である。その過程は完全には理解されていないが、内皮細胞（毛細血管の一次細胞）の増殖を調節する分子の複雑な相互作用に関わると考えられている。正常条件下では、これらの分子は、数週間又は一部の場合には数十年間続くこともある長期間にわたって、微小血管系を静止状態（すなわち毛細管の増殖がない状態）に保持すると思われる。必要なときには（創傷修復の際など）、これらの同じ細胞が５日間以内に速やかな増殖と代謝回転を受けると考えられる（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．とＳｈｉｎｇ，Ｙ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７（１６）、１０９３１−１０９３４、及びＦｏｌｋｍａｎ，Ｊ．とＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、４４２−４４７（１９８７））。
【０００４】
正常条件下では血管新生は高度に調節されたプロセスであるが、多くの疾患（血管新生性疾患として特徴付けられる）が持続的な正しく調節されない血管新生によって促進される。特に異なる記載がない限り、正しく調節されない血管新生は、直接特定疾患を引き起こしうるか又は既存の病的状態を増悪させうる。例えば、眼の新生血管形成は失明の最も一般的な原因として関係付けられており、約２０の眼疾患を支配する。関節炎のようなある種の既存状態においては、新たに形成された毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に形成された新しい毛細血管が硝子体に侵入し、出血を生じさせ、失明を引き起こす。固形腫瘍の増殖と転移も血管新生に依存する（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６、４６７−４７３（１９８６）、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，８２、４−６（１９８９））。例えば，２ｍｍ以上に拡大する腫瘍はそれら自身の血液供給を得なければならず、新しい毛細血管の増殖を誘導することによって血液供給を確保する。ひとたびこれらの新しい血管が腫瘍内に取り込まれると、それらは、腫瘍細胞が循環に入り込み、肝臓、肺又は骨のような遠く離れた部位へと転移する手段を提供する（Ｗｅｉｄｎｅｒ，Ｎ．ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３２４（１）：１−８（１９９１）。
【０００５】
いくつかの血管新生抑制因子が、現在、血管新生性疾患を治療する際に使用するために開発されているが、これらの化合物に関連した難点が存在する。真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｉｓ ｆｒｅｓｅｎｉｕｓによって分泌される化合物、フマギリンは、血管新生抑制作用を示したが、長期暴露後に実験動物が呈した劇的な体重喪失により臨床開発は行われなかった。フマギリンの合成類似体、ＴＮＰ−４７０も内皮細胞増殖を阻害するが、ヒトにおいて無力症及び神経皮質毒性を誘発することが明らかにされ、許容用量が制限された（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １７、２５４１（１９８９））。
【０００６】
現在までに、いくつかの血管新生因子、特にプラスミノーゲンのクリングルペプチドフラグメントが報告されている（例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、米国特許第５，６３９，７２５号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７９２，８４５号、米国特許第５，８３７，６８２号、米国特許第５，８６１，３７２号、米国特許第５，８８５，７９５号、米国特許第６，０２４，６８８号、米国特許第５，８５４，２２１号、米国特許第５，８０１，１４６号、米国特許第５，９８１，４８４号、米国特許第６，０５７，１２２号及び米国特許第５，９７２，８９６号参照）。これらのフラグメントの有望な抗血管新生作用にもかかわらず、それらの循環半減期は短い。それ故、改善された薬物動態作用を持つ、クリングルペプチドフラグメントのような抗血管新生性化合物がなお必要とされている。そのような化合物はまた、容易に且つコスト効果的に製造できなければならない。
【０００７】
（発明の概要）
その原則実施形態において、本発明は、官能基化ポリマーに化学結合した官能基化クリングルペプチドフラグメントから成る複合クリングルペプチドフラグメントを開示する。好ましくは、官能基化クリングルペプチドフラグメントのＮ末端は、オキシム結合又は炭素−窒素単結合のいずれかを通して官能基化ポリマーに複合している。
【０００８】
好ましい実施形態では、官能基化クリングルペプチドフラグメントは実質的に、プラスミノーゲンのクリングル１、プラスミノーゲンのクリングル５、プラスミノーゲンのクリングル４−５、及びプロトンビンのクリングル２から成る群より選択されるクリングルペプチドフラグメントから成る。好ましくは、クリングルペプチドフラグメントはプラスミノーゲンのクリングル５又はプラスミノーゲンのクリングル４−５である。最も好ましくは、クリングルペプチドフラグメントは、ヒト、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、アカゲザル、及びブタプラスミノーゲンから成る群より選択されるプラスミノーゲンフラグメントに実質的な配列相同性を持つ、クリングル５ペプチドフラグメントである。
【０００９】
もう１つの好ましい実施形態では、官能基化ポリマーは、基本的にポリアルキレングリコールであるポリマーから成る。好ましくは、ポリアルキレングリコールは、直鎖、分枝、二置換、又は非置換ポリアルキレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、及びエチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーから成る群より選択され、該ホモポリマー及びコポリマーは置換されていないか又は１つの末端においてアルキル基で置換されている。特に好ましいポリアルキレングリコールは、約５，０００から約４０，０００までの分子量を持つポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。最も好ましくは、ポリアルキレングリコールは、約１０，０００から約２０，０００までの分子量を持つメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【００１０】
もう１つの実施形態では、本発明は、治療上許容される担体と組み合わせて複合クリングルペプチドを含む医薬組成物を開示する。
【００１１】
もう１つの実施形態では、本発明は、治療上有効な量の複合クリングルペプチドフラグメントをヒト又は動物に投与することを含む、抗血管新生治療を必要とする患者において疾患を治療する方法を開示する。好ましくは、疾患は、癌、関節炎、黄斑変性、及び糖尿病性網膜症から成る群より選択される。より好ましくは、疾患は癌であり、最も好ましくは、疾患は、原発性及び転移性固形腫瘍、癌、肉腫、リンパ腫、乾癬、及び血管腫から選択される。
【００１２】
もう１つの実施形態では、本発明は、有効量の複合クリングルペプチドを個体に投与することを含む、該個体において内皮細胞増殖を抑制する方法を開示する。
【００１３】
もう１つの実施形態では、本発明は、有効量の複合クリングルペプチドフラグメントを内皮細胞に投与することを含む、インビトロで内皮細胞増殖を抑制する方法を開示する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
ここで使用するとき、単数形態の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに命じない限り複数の指示を包含する。さらに、ここで言及されるすべての公表学術及び特許文献（特許出願を含む）は、その全体が参照してここに組み込まれる。
【００１５】
ここで使用するとき、「Ｋ５」、「クリングル５」、「Ｋ１」、及び「クリングル１」はプラスミノーゲンのクリングル領域を指す。
【００１６】
ここで使用するとき、「Ｋ２」はプロトロンビンのクリングル領域を指す。
【００１７】
特に異なる記載がない限り、次の語は次のような意味を持つものとする：
「アシル基」の語は、カルボニル基を通して親分子部分に結合したＣ１−Ｃ１０アルキル基を意味する。
【００１８】
「アシル化基（ａｃｙｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」の語は、反応の経過においてアシル基を分子の窒素原子に供与することができる試薬を意味する。アシル化基の例は、無水酢酸、塩化アセチル、等を含む。
【００１９】
「Ｃ１−Ｃ１０アルキル」の語は、直鎖又は分枝飽和炭化水素から１個の水素原子を除去することによって誘導される１から１０個の炭素原子の一価の基を意味する。
【００２０】
「Ｃ１−Ｃ１０アルキレン」の語は、直鎖又は分枝飽和炭化水素から誘導される１から１０個の炭素原子の二価の基を意味する。
【００２１】
「カルボニル基」の語は−Ｃ（Ｏ）−を意味する。
【００２２】
「クリングルペプチドフラグメントの複合体」又は「複合クリングルペプチドフラグメント」の語は、官能基化ポリマーに化学結合した官能基化クリングルペプチドフラグメントを意味する。そのような複合体を作製する方法はこれまでに報告されている（例えば、ＷＯ９６／４１８１３号及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．８７、１４４６−１４４９（１９９８）参照）。クリングルペプチドフラグメントの複合体の非制限的な例は、ポリエチレングリコールに結合したクリングル５ペプチドフラグメント、メトキシポリエチレングリコールに結合したクリングル５ペプチドフラグメント、メトキシポリエチレングリコールに結合したクリングル４−５ペプチド、等を含む。
【００２３】
「官能基化クリングルペプチドフラグメント」の語は、反応基を含むように部位特異的に修飾された、ここで定義するようなクロマトグラフィーペプチドフラグメントを指す。官能基化クリングルペプチドフラグメントはまた、Ｎ末端に１個又はそれ以上の非天然アミノ酸を付加することによって修飾されたクリングルペプチドフラグメントを含むことが意図されている。付加アミノ酸は反応基として働くか、又は代替的にそれ自体が反応基を形成するように修飾されうる。例えば、アミノ酸４５０位からアミノ酸５４３位までの配列を持つクリングル５ペプチドフラグメントの４５０位のロイシン（Ｌｅｕ）残基のすぐ上流（すなわち直前）にセリン（Ｓｅｒ）を付加することができる。その後Ｎ末端のＳｅｒ残基を、アルデヒドのような反応基を形成するように特異的に修飾することができる。Ｎ末端に１個又はそれ以上の非天然アミノ酸を持つクリングルペプチドフラグメントは、例えば組換えＤＮＡ法又は合成ペプチド化学のような、当該技術において既知の何らかの手段によって作製することができる。ポリペプチドを官能基化するための方法は当業者に既知である（例えばＷＯ９６／４１８１３号及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．８７、１４４６−１４４９（１９９８）参照）。
【００２４】
「官能性又は官能基化ポリマー」の語は、ポリマーが官能基化クリングルペプチドフラグメントのような相補的官能基化標的に部位特異的に複合できるように、ここで定義するようなポリマー上のアミノ−オキシ基又はアルデヒドのいずれかの形成を意味する。例として、ポリマーを官能基化するための方法はまた、ＷＯ９６／４１８１３号及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．８７、１４４６−１４４９（１９９８）においても提供される。
【００２５】
「クリングル融合蛋白質」の語は、そのうちの１個がクリングルペプチドフラグメントである、２個又はそれ以上の個々のポリペプチドから導かれるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。クリングル融合蛋白質は、クリングルペプチドフラグメントについてのコード配列が、２個（又はそれ以上の）リーディングフレームがインフレームであるように少なくとも１個の他のポリペプチドのコード配列と連結されているポリヌクレオチドの発現によって形成されうる。クリングル融合蛋白質の非制限的な例は、クリングル４−５（Ｋ４−５）のような２個又はそれ以上の個々のクリングルペプチドフラグメントの融合を含む。本発明のクリングル融合蛋白質の他の例は、生物学的標識に連結されている、単独の又はもう１つのポリペプチドに融合されたクリングルペプチドフラグメントを含む。そのようなクリングル融合蛋白質は、それらが由来する別々の蛋白質に開裂されうるか又は開裂されなくてもよい。
【００２６】
「クリングルペプチドフラグメント」の語は、抗血管新生作用を持つプラスミノーゲン又はプロトロンビンのクリングル領域を指し、次の配列を含む：（ａ）プラスミノーゲンのクリングル１（Ｋ１）及びクリングル５（Ｋ５）のような個々のクリングルペプチド、（ｂ）プロトロンビンのクリングル２（Ｋ２）のようなクリングルペプチド、（ｃ）ここで定義するようなクリングル融合蛋白質、（ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の配列に実質的な配列相同性を持つクリングルペプチド、及び（ｅ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）で述べる配列に実質的な配列相同性を持つ（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のペプチドセグメント。上述したクリングルペプチドフラグメント及び該フラグメントを作製し、使用するための方法は、特許資料（米国特許第５，６３９，７２５号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７９２，８４５号、米国特許第５，８３７，６８２号、米国特許第５，８６１，３７２号、米国特許第５，８８５，７９５号、米国特許第６，０２４，６８８号、米国特許第５，８５４，２２１号、米国特許第５，８０１，１４６号、米国特許第５，９８１，４８４号、米国特許第６，０５７，１２２号及び米国特許第５，９７２，８９６号参照）ならびに学術文献において広汎に記述されている。好ましいクリングルペプチドフラグメントは、単独であるか、１個又はそれ以上のクリングルペプチドフラグメントと融合している、又はプラスミノーゲンの他のクリングル領域（例えばアンギオスタチン）及び／又はエンドスタチンのような抗血管新生因子と組み合わせて使用される、Ｋ５ペプチドフラグメントである。さらにもう１つの好ましいＫ５ペプチドフラグメントは、ここで述べるような、ヒトＫ５ペプチドフラグメントに実質的な配列相同性を持つものである。特に好ましいＫ５ペプチドフラグメントは、配列番号１のアミノ酸残基４５０から５４３及び配列番号１のアミノ酸残基４５８から５４３の配列を持つ。
【００２７】
「ポリマー」の語は、反復非ペプチド構造単位から成る化学化合物を意味する。本発明の好ましいポリマーは水溶性である。最も好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「蛋白質」の語は、各々アミノ酸の分子鎖を指し、特定の鎖長を意味しない。この語はまた、ポリペプチド、ペプチド、及び蛋白質の発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を指すことが意図されている。
【００２９】
「精製ポリペプチド」の語は、目的とするポリペプチドが天然に結合している細胞成分を基本的に含まない、すなわち約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満含む、目的とするポリペプチド又はそのフラグメントを意味する。ポリペプチドを精製するための方法は当該技術において既知である。
【００３０】
「実質的な配列相同性」の語は、ヒト、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、アカゲザル、又はサルプラスミノーゲンの対応するペプチド配列の約６０％のアミノ酸同一性、望ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸同一性、より望ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸同一性、さらに一層望ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸同一性、最も望ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸同一性を意味する。ヒトプラスミノーゲンに実質的な配列相同性を持つ配列を「相同体」と称する。実質的な配列相同性を持つことに加えて、本発明の相同体は、ここで述べるクリングルペプチドフラグメントと同様の生物活性（すなわち抗血管新生作用）を示す。クリングルペプチドフラグメント内のアミノ酸配列又はアミノ酸の数は種によって又は生産方法によって異なることがあり、クリングルペプチドフラグメント内のアミノ酸の総数は、一部の場合、正確に定義することができない。これらの配列がそれらのアミノ酸の少なくとも７３％において同一であると仮定すれば、クリングルペプチドフラグメントのアミノ酸配列が種間で実質的に同様であり、クリングルペプチドフラグメントの生産方法はヒトプラスミノーゲンの対応するアミノ酸配列に実質的な配列相同性を持つクリングルペプチドフラグメントを提供することは明白である。
【００３１】
すべてのペプチド配列は一般的に認められている慣例に従って表記するものとし、α−Ｎ末端のアミノ酸残基は左側、α−Ｃ末端は右側である。ここで使用するとき、「α−Ｎ末端」の語はペプチド内のアミノ酸の遊離α−アミノ基を指し、「α−Ｃ末端」はペプチド内のアミノ酸の遊離α−アミノ酸カルボン酸末端を指す。
【００３２】
本発明は、官能基化ポリマーに複合した官能基化クリングルペプチドフラグメントを含む、抗血管新生作用を備えた化合物を提供する。そのような複合体の形成により、それらは治療薬としてより適したものとなる。例えば、複合クリングルペプチドフラグメントの望ましい特性は、水溶液への高い溶解度、保存中の高い安定性、低い免疫原性、酵素分解に対する高い抵抗性、多様な薬剤投与システムとの適合性、及び長いインビボ半減期を含む。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明の官能基化ポリマーは次の式：
Ｐ−Ｘ−Ｏ−ＮＨ２
［式中、Ｐはポリマー、好ましくは水溶性のポリマーを表わし、Ｘは任意に存在するスペーサー基を表わし、そして−Ｏ−ＮＨ２はアミノ−オキシを表わす］
によって表わされる。ポリマーＰは様々な量の多数の反復単位を含むので、Ｐの分子量が大きく変化しうることは理解されるであろう。Ｐが所与の分子量を持つというとき、その分子量は、分子中に存在するサブユニット数が互いに異なるＰ分子群の平均分子量を反映する、単なる近似値であると考えられる。一般に、Ｐは約５，０００から約４０，０００まで、好ましくは約１０，０００から約２０，０００までの分子量を持つ。しかし、Ｐに適する分子量は修飾するクリングルペプチドフラグメントに依存して変化するであろうことは明白である。
【００３４】
スペーサー基Ｘは存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合には、アミノ−オキシ基を目的とするポリマーに接続する役割を果たす。スペーサー基Ｘは、フェニル又はＣ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、又はそれらの組合せのような置換又は非置換の分枝又は線状脂肪族又は芳香族基を含む非反応基、あるいはアミノ酸鎖（フレキシブルヒンジ又はループ配列など（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１、９４３−９５８（１９９０）参照））、ヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組合せを表わし、ヘテロ原子を含みうる。好ましい実施形態では、Ｘは−ＣＨ２−又は−ＣＨＯＨ−又は−ＣＯＣＨ２−又は−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２を含む。アミノ−オキシ基が官能基化ポリマー上にあるとき、アミノ−オキシ官能基に隣接する付加的な接続構造（すなわちスペーサー基）中に存在する基は決定的に重要ではない；しかしながら、スペーサー基についての必要条件はアミノ−オキシ基とその相補的アルデヒド間のオキシム結合の形成に干渉しないことである。さらに、スペーサー基はアミノ−オキシ基に先んじてアルデヒドと結合すべきではなく、また反応に立体障害を与えてはならず、さらに反応基を不活性化してはならない。
【００３５】
もう１つの実施形態では、二及び多ポリマー含有官能基化ポリマーを提供する。そのようなポリマーは一般式：
（Ｐ）ｍ−Ｌ−Ｘ−Ｏ−ＮＨ２
［式中、Ｐ、Ｘ、及びＯ−ＮＨ２は本文中で定義するとおりであり、ｍは２から１０まで、より好ましくは２から５までの整数であり、そしてＬ各々のＰ（その数はｍ個）が別々に共有結合している多価リンキング基であって、Ｌの価数は少なくともｍ＋１である］
を持つ。本発明の二及び多ポリマー官能基化ポリマーの場合には、標的巨大分子への官能基化ポリマーの部位特異的複合は、多価Ｌ構造に連結した−Ｏ−ＮＨ２基による単オキシム結合を通して、２個又はそれ以上のポリマーの部位特異的な結合をもたらす。
【００３６】
従って、二又は多ポリマー含有官能基化ポリマーは、同じか又は異なる、好ましくは同じである、２個又はそれ以上のポリマーを、標的巨大分子上のあらかじめ選択された単一部位に結合することができる。Ｌが三価の基である場合には、ｍは２である。好ましくは、Ｌの価数はｍ＋１であり、その場合Ｌの１原子価は、場合によってはＸを通して、オキシム−形成基によって占められ、Ｌの残りの原子価は１個又はそれ以上の（すなわちｍ個の）ポリマーによって占められる。Ｌがその後のオキシム反応に立体障害を与えず、反応基を不活性化しない限り、Ｌの構造は決定的に重要ではなく、またＬをポリマーに連結する結合も重要ではない。Ｌは他の存在する機能と反応しない。官能基化ポリマー内のリンキング基Ｌの各々の腕又は原子価は、好ましくは、フェニル又はＣ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、又はそれらの組合せのような置換又は非置換脂肪族又は芳香族基を含む非反応基、あるいはレキシブルヒンジ又はループ配列のようなアミノ酸鎖（フレキシブルヒンジ又はループ配列など（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１、９４３−９５８（１９９０）参照））、ヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組合せを含み、ヘテロ原子を含みうる。ポリマーとの複合前には、好ましくはＬの１つを除くすべての腕又は原子価は、好ましくはポリマーの末端に位置する、ポリマー上の基と特異的に反応することができる官能基を含む。残りの原子価は、オキシム−形成官能基（該官能基は、所望する場合には脱保護可能な状態にある）を提供する化合物とのその後の反応のために保護されているか、又はさもなければかかる化合物によって占められている。ポリマー複合体を抗原性又は免疫原性のために使用する場合、それ自体強い免疫原性ではないリンカー基を選択することは当業者には明白である。ポリマー複合体を結合のために使用する場合には、好ましいリンカー基は、結合、アビディティー、生成物安定性、又は溶解度のような特性を高めるか又は少なくともそのような特性に干渉しない。リンキング構造はそれ自体、本発明の相補的官能基化ポリマーとのオキシム形成による平行構築を用いて（Ｐ）ｍＬ構造を構築するように、オキシム形成基で占められた原子価を含みうる。従って、米国特許願通し番号第０８／０５７，５９４号、同第０８／１１４，８７７号、及び同第０８／０５７，５９４号、ならびに国際特許願ＰＣＴ／ＩＢ９４／０００９３号に述べられているベースプレート構造はＬ構造としての使用に適する。ベースプレートのオキシム形成基は他の相補的反応基で置換することができる；しかし、最も好ましくはオキシム形成を構築のために使用する。好ましいＬ構造は、いずれか２個のアミノ基が各々ポリマーへのカップリングのために使用可能であり、残りのアミノ基がオキシム形成基の導入のために使用しうるトリアミン化合物から誘導される。好ましいトリアミンは式、Ｎ（Ｒ５−ＮＨ２）３［式中、いずれか２個のアミノ基（−ＮＨ２）が各々ポリマーへのカップリングのために使用可能であり、残りのアミノ基がオキシム形成基の導入のために使用可能であって、Ｒ５は、フェニル又はＣ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、又はそれらの組合せのような置換又は非置換脂肪族又は芳香族基を含む非反応基、あるいはアミノ酸鎖（フレキシブルヒンジ又はループ配列など（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１、９４３−９５８（１９９０）参照））、ヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組合せであり、ヘテロ原子を含みうる。Ｒ５は好ましくは−ＣＨ２−ＣＨ２−である。３個の第一アミノ基は好ましくは窒素から遠位である。最も好ましくはトリアミン化合物はトリス−（２−アミノエチル）アミンである。
【００３７】
もう１つの実施形態では、二又は多ポリマー官能基化ポリマーは、最初に所望する多価の、通常は保護された一価を持つＬ構造を得、次に保護されたＬ構造を、典型的には当該技術において既知の結合化学を用いて適切に活性化されたポリマー中間体と、又はオキシム化学を通して本発明の化合物ポリマーと反応させることによって合成される。二又は多ポリマー産物を単離した後、Ｌの保護された残りの原子価を脱保護し、その後アシル化基を含む適当に保護されたアミノ−オキシと反応させる（例えばアミノ基の場合にはアシル化する）ことにより、本発明に従って産物を官能基化する。オキシム形成官能基を脱保護した後、最終産物である二又は多ポリマー官能基化ポリマーを得る。
【００３８】
代替的には、最初に適切に保護されたアミノ−オキシ含有基でＬを誘導体化し、次にモノ置換Ｌ誘導体を各々の残りの原子価においてポリマー中間体（ＬがＮＨ２を含むときにはＣＯＯＨ又はＬがＣＯＯＨを含むときにはＮＨ２基を有するもののような）又は本発明の官能基化ポリマー（ＰをＬに構築するためにオキシム化学を使用するとき）と反応させる。例えば、ｍＰＥＧ−ＣＯＯＨ中間体ポリマーを、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物）及びＤＣＣ（１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下で、又はｍＰＥＧ−ＣＯＯＨのスクシニミジル誘導体をあらかじめ調製する場合にはこれらの試薬なしで、Ｌ構造上の遊離アミノ基に結合することができる。オキシム形成官能基を脱保護した後、最終産物である二又は多ポリマー官能基化ポリマーを得る。
【００３９】
アミノ酸からＬ基を形成するとき、Ｌ構造のペプチド配列は常套的な固相ペプチド合成法（「ＳＰＰＳ」）によって合成することができ、ペプチドがまだＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルのような活性形態で固相ＰＥＧ−ＣＯＯＨに結合している間に、新生ペプチド鎖に付加することができる。例えば、Ｌ構造は、５個のリシン残基と１個のＮ末端アミノ基のような６個の反応基を持つペプチドで構成されうる。ＰＥＧ−ＣＯＯＳｕヒドロキシスクシニミドエステルはリシン残基のε−アミノ基の各々と反応することができる（但しＮ末端α−アミノ基は保護されたままである）。次に完全にアシル化されたペプチドのＮ末端アミノ基を脱保護し、ポリマー含有構造をＢｏｃ−ＡｏＡ含有活性エステルと反応させてＡｏＡ基を導入し、Ｂｏｃを除去して樹脂から穏やかに開裂した後、本発明のペンタポリマー含有官能基化ポリマーを得る。この方法は、工程の間の保護とその後の脱保護を必要とする付加残基を排除するように設計することができるので、合成構造に関して（そしておそらく一部の組換え産物に関して）特に有用であることに注目すべきである。代替的には、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルのような活性形態のＢｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−ブチル）−ＯＨをリシン残基のε−アミノ基に結合することができる。次にＮ末端α−アミノ基を脱保護してアミノ−オキシ基（例えばＡｏＡ）を導入し、Ｂｏｃを除去した後、ε−Ｓｅｒ−ペンタリシンを含む前駆体Ｌ構造を得る。ひとたび蛋白質に複合した前駆体Ｌ構造をｐＨ７の過ヨウ素酸塩のような弱酸化剤で処理して、ε−Ｓｅｒ−ペンタリシンをε−ＧＸＬ−ペンタリシンに変換し、それによってペンタ−ＧＸＬ Ｌ構造を生成して、その後それを本発明のアミノ−オキシ官能基化ポリマーと反応させることができる。エチレングリコールのような、１，２結合について比較的自由な回転を有する１，２−ジオール又は１−アミノ−２−オール又は１−オール−２−アミノ化合物を用いて酸化反応を終了することができる。代替的には、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、過ヨウ素酸塩を速やかに除去することによって酸化反応を終了することができる。酸化反応は第一アミノ基を含むセリン残基に関してのみ起こるので、ε−セリン残基だけがグリオキシルに変換される。保護を所望するときには、Ｎ末端セリンを酸化から化学的に保護するための方法は当業者に既知である。その後Ｎ末端アミン基を脱保護し、ポリマー含有構造をＢｏｃ−ＡｏＡ含有活性エステルと反応させてＡｏＡ基を導入し、Ｂｏｃを除去した後、本発明のペンタポリマー含有官能基化ポリマーを得る。Ｂｏｃ又はその後穏やかな条件下で除去することができる、ペプチド合成において使用される典型的なアミノ保護基が適する（例えばＧｒｅｅｎとＷｕｔｓ（１９９１）「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第２版、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照）。
【００４０】
もう１つの実施形態では、本発明の官能基化ポリマーは次の式：
【００４１】
【化１】
［式中、Ｐは先に定義したようなポリマーを表わし、Ｘは任意に存在するスペーサー基を表わす］
によって表わされる。スペーサー基Ｘは存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合には、アルデヒドを目的とするポリマーに接続する役割を果たす。スペーサー基Ｘは、フェニル又はＣ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、又はそれらの組合せのような置換又は非置換の分枝又は線状脂肪族又は芳香族基を含む非反応基、あるいはアミノ酸鎖（フレキシブルヒンジ又はループ配列など（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１、９４３−９５８（１９９０）参照））、ヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組合せを表わし、ヘテロ原子を含みうる。好ましい実施形態では、Ｘは−ＣＨ２−を含む。アミノ−オキシ基が官能基化ポリマー上にあるとき、アルデヒドに隣接する付加的な接続構造（すなわちスペーサー基）中に存在する基は決定的に重要ではない；しかしながら、スペーサー基についての必要条件は、アルデヒドとその相補的第一アミノ基間の炭素−窒素結合の形成に干渉しないことである。さらに、スペーサー基はアルデヒドに先んじて第一アミノ基と結合すべきではなく、また反応に立体障害を与えてはならず、さらに反応基を不活性化してはならない。
【００４２】
本発明はまた、複合クリングルペプチドフラグメントを使用してインビトロ及びインビボで内皮細胞増殖を抑制するための方法、ならびに抗血管新生治療を必要とするヒト又は動物を治療するための方法であって、治療上有効な量のクリングルペプチドの複合体をそのような個体に投与することを含む方法を提供する。本発明はさらに、クリングルペプチドフラグメントの複合体と治療上許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４３】
実施例において特定するものを含むがそれらに限定されない本発明の化合物は、抗血管新生作用を有する。血管新生抑制因子として、そのような化合物は、原発性及び転移性固形腫瘍、及び下記の癌：乳癌；結腸癌；直腸癌；肺癌；口腔咽頭癌；下咽頭癌；食道癌；胃癌；膵癌；肝癌；胆嚢癌；胆管癌；小腸癌；腎、膀胱、及び尿路上皮を含めた尿路の癌；子宮頸、子宮、卵巣、絨毛癌及び妊娠期栄養膜疾患を含めた女性生殖管の癌；前立腺、精嚢、精巣及び生殖細胞腫瘍を含めた男性生殖管の癌；甲状腺、副腎及び下垂体を含めた内分泌腺の癌；血管腫、黒色腫、骨及び軟組織から生じる肉腫及びカポジ肉腫を含めた皮膚癌；脳、神経、眼、及び神経膠星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫及び髄膜腫を含めた髄膜の癌；白血病のような造血に関する悪性疾患から生じる、緑色腫、プラスマ細胞腫、血小板、そして菌状息肉腫及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病を含めた固形腫瘍；ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；リウマチ、免疫性及び変形性関節炎を含めた自己免疫疾患の予防；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶反応、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性及び低酸素症による網膜新生血管形成を含めた眼疾患；眼の異常新生血管形成状態；乾癬を含めた皮膚疾患；血管腫及びじゅく状斑内の毛細血管増殖を含めた血管疾患；オースラー−ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；創傷肉芽形成；腸癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症及び過形成性瘢痕（すなわちケロイド）を含めた内皮細胞の過剰又は異常刺激を特徴とする疾患ならびにネコ引っ掻き病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）及び潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）を含めた病的結果として血管新生を有する疾患の治療において有用である。もう１つの用途は、排卵と胎盤の定着を抑制する産児制限剤としてである。
【００４４】
本発明の化合物はまた、単独で又は放射線療法及び／又は血管新生性疾患を治療するために慣例的に患者に投与される他の化学療法治療と組み合わせて及び／又は他の抗血管新生性物質と組み合わせて使用するとき、上述した腫瘍からの転移を予防するために有用であると考えられる。例えば、固形腫瘍に治療において使用するとき、本発明の化合物は、αインターフェロン、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキセート及びプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びデキサメタゾン）、ＰＲＯ−ＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキセート（ｗ／ロイコビンレスキュー）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリスルフェート、血小板第４因子、アンギオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、Ｔｅｃｈｇａｌａｎ、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧ等のような化学療法剤と共に投与しうる。他の化学療法剤は、メクロレタミン、メルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド及びイフォスファミドを含めたナイトロジェンマスタードのようなアルキル化剤；カルムスチン、ロムスチン、セムスチン及びストレプトゾシンを含めたニトロソ尿素類；ブスルファンを含めたスルホン酸アルキル；ダカルバジンを含めたトリアジン；チオテパ及びヘキサメチルメラミンを含めたエチエニミン；メトトレキサートを含めた葉酸類似体；５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシドを含めたピリミジン同族体；６−メルカプトプリン及び６−チオグアニンを含めたプリン類似体；アクチノマイシンＤを含めた抗腫瘍性抗生物質：ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトマイシンＣ及びメトラマイシンを含めたアントラサイクリン；タモキシフェン及びコルチコステロイドを含めたホルモン及びホルモン拮抗物質ならびにシスプラチン及びブレキナールを含めた種々の薬剤を含む。例えば、腫瘍は、手術、放射線療法又は化学療法と複合クリングル５の投与及び微小転移巣の静止を延長し、残存原発腫瘍を安定化させてその増殖を抑制するためのその後の複合クリングル５の投与によって慣例的に治療しうる。他の抗血管新生性物質は、Ｋ１及びＫ４−５のようなプラスミノーゲンの他のクリングルペプチドフラグメントならびにプロトロンビンのＫ２を含む。
【００４５】
ここで使用するとき「非経口」の語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入を含む投与様式を指す。非経口注射用の医薬組成物は、製薬上許容される無菌水性又は非水性溶液、分散、懸濁液又は乳剤ならびに使用の直前に無菌注射用溶液又は分散に還元するための無菌粉末を含む。適当な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒又は賦形剤の例は、水、エタノール、ポリオル（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のような）、カルボキシメチルセルロース及びそれらの適当な混合物、植物油（オリーブ油のような）及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含む。例えばレシチンのような被覆材料の使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、また界面活性剤の使用によって適切な流動性を保持することができる。これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助薬を含みうる。微生物の作用の予防は、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等のような様々な抗菌及び抗真菌薬を含めることによって確保しうる。また、糖類、塩化ナトリウム等のような等張剤を含むことも望ましいと考えられる。吸収を遅延させるモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような物質を含めることによって注射用製剤の持続的な吸収を生じさせることができる。注射用デポ製剤は、ポリアクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）のような生分解性ポリマー中に薬剤のミクロ被包マトリックスを形成することによって作製しうる。薬剤対ポリマーの比率及び使用する個々のポリマーの性質に依存して、薬剤放出の速度を調節することができる。デポ注射用製剤はまた、体組織と適合性のリポソーム又はミクロ乳剤中に薬剤を捕捉することによって調製される。注射用製剤は、例えば細菌捕獲フィルターを通してろ過によって又は使用の直前に無菌水又は他の無菌注射用媒質に溶解又は分散することができる無菌固形組成物の形態の殺菌薬を組み込むことによって滅菌することができる。
【００４６】
局所投与は皮膚、粘膜及び肺の表面への投与を含む。局所投与用組成物は、加圧しうる又は加圧されない乾燥粉末として調製しうる。非加圧粉末組成物においては、微細に分割した形態の有効成分を、例えば直径１００マイクロメートルまでの大きさを持つ粒子を含む、より大きなサイズの製薬上許容される不活性担体と混合して使用しうる。適当な不活性担体はラクトースのような糖類を含む。望ましくは、有効成分の粒子の少なくとも９５重量％が０．０１から１０マイクロメートルの範囲の有効粒子サイズを持つ。代替的には、本発明の化合物は眼の硝子体及び房水に直接注入することができる。
【００４７】
本発明の化合物はまた、リポソームの形態で投与することもできる。当該技術分野において既知であるように、リポソームは一般にリン脂質又は他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒質に分散する単層又は多重膜水和液晶によって形成される。リポソームを形成することができる、無毒性で生理的に許容される代謝可能ないかなる脂質も使用できる。リポソーム形態の本発明の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、防腐剤、賦形剤等を含みうる。好ましい脂質は、天然及び合成のリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は当該技術において既知である。
【００４８】
上記又は他の治療において使用するとき、治療上有効な量の本発明の化合物の１つを純粋な形態で、又は、そのような形態が存在する場合には、製薬上許容される塩の形態で製薬上許容される賦形剤と共に又は賦形剤なしで用いることができる。本発明の化合物の「治療上有効な量」とは、医学的処置に適用される妥当な利益／危険度比で血管新生性疾患を治療する（例えば腫瘍の増殖を抑えるあるいは腫瘍の転移を遅らせる又は遮断する）ために十分な化合物の量を意味する。しかし、本発明の化合物及び組成物の総一日量は、合理的な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることは明白であろう。個々の患者についての明細な治療上有効な用量レベルは、治療する疾患及び疾患の重症度、用いる特定化合物の活性、用いる特定組成物、患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、用いる特定化合物の排泄速度、治療期間、用いる特定化合物と組み合わせて又は同時に使用する薬剤及び医学技術において既知の同様の因子を含めて、様々な因子に依存するであろう。例えば、所望する治療効果を達成するために必要なレベルよりも低い用量レベルで化合物の投与を開始し、所望する効果が達成されるまで徐々に用量を高めていくことは十分に当該技術の範囲内である。単回又は分割投与でヒト又は他の哺乳類宿主に局所又は全身投与する複合クリングル５ペプチドフラグメントの総一日量は、例えば０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重／日、より一般的には０．０５から１ｍｇ／ｋｇ体重の量であると考えられる。所望する場合には、投与のために有効一日量を多回に分けてもよい。結果として、１回用量の組成物は、一日量を構成するような量又はその多回分割量を含みうる。
【００４９】
血管新生性疾患の抑制、治療又は予防のために本発明の化合物と組み合わせることができる物質は、上記で列挙したものには限定されず、原則として、血管新生性疾患の治療又は予防のために有用ないかなる物質も含む。
【００５０】
合成工程
【００５１】
【化２】
【００５２】
スキーム１は、他の複合クリングルペプチドフラグメントの合成に容易に拡大することができる、Ｋ５のポリアルキレングリコール複合体の１つのタイプの調製を示す。アミノメトキシポリエチレングリコール（２）（５−３０ｋＤ）を（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）オキシ）アセチルＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル（３）と縮合して、（アミノオキシ）アセチル−官能基化ポリエチレングリコール（４）を得る。これらをアルデヒド（６）（過ヨウ素酸ナトリウムによる（セリン４５９）Ｋ５（５）の酸化によって形成される）と縮合して、種々のポリエチレングリコール長を持つ所望する複合ペプチドフラグメント（７）を形成する。
【００５３】
【化３】
【００５４】
スキーム２は、他の複合クリングルペプチドフラグメントの合成に容易に拡大することができる、代替的なＫ５のポリアルキレングリコール複合体の調製を示す。メトキシポリエチレングリコールアルデヒド（８）（５−３０ｋＤ）をシアノホウ水素化ナトリウムのような還元剤の存在下で（セリン４５９）Ｋ５と縮合して、種々のポリエチレングリコール長を持つ所望する複合ペプチドフラグメント（９）（ＬＬＰＤ−Ｋ５＝ロイシン−ロイシン−プロリン−アスパラギン酸−Ｋ５）を形成する。
【００５５】
下記の実施例は本発明の新規化合物の調製をさらに例示するものである。
【実施例１】
【００５６】
ｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｅｋ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、ｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｅｋ−ＳＥＥＤ−Ｋ５、ｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｔｅｖ−ＳＥＥＤ−Ｋ５の構築
ＰＣＲを用いて、クリングル５ペプチドフラグメントを含むクリングル融合蛋白質を作製した。エンテロキナーゼ開裂部位Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号２）をコードし、その後にＳｅｒ残基及びプラスミノーゲンの残基４５０に始まり、配列番号１の残基４５３に及ぶＫ５ Ｎ末端コード配列が続く５’ＰＣＲプライマーを合成した：ＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡ（配列番号３）。エンテロキナーゼ開裂部位Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号２）をコードし、その後にプラスミノーゲンの残基４５８に始まり、配列番号１の残基４６１に及ぶＫ５ Ｎ末端コード配列が続く５’ＰＣＲプライマーを合成した：ＴＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧ（配列番号４）。タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ、ＴＥＶ）プロテアーゼ開裂部位Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（配列番号５）をコードし、その後にプラスミノーゲンの残基４５８に始まり、配列番号１の残基４６１に及ぶＫ５ Ｎ末端コード配列が続く５’ＰＣＲプライマーを合成した：ＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧ（配列番号６）。Ｋ５ Ｃ末端３’プライマーＴＴＡＴＴＡＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号７）も合成した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）５０μＬ、ｄＮＴＰ各々２００μＭ、ＡＴＰ ５００μＭ、適切な５’プライマー及び３’プライマー及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの１つを各々０．５μＭ使用して、別々にＰＣＲフラグメントを作製した。３７℃で１５分間インキュベートした後、キナーゼとプライマーに、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及びＫ４−Ｋ５Ａプラスミドを含むＤｒａＩ消化したベクターｐＨＩＬ−Ｄ８（先に米国特許第６，０５７，１２２号に記述されている）約１０ｎｇを加えた。配列番号４と配列番号７をプライマーとして使用して、９４℃で１分間後、［９４℃１秒間、４０秒間；７２℃１秒間；５０℃１分間、３０秒間；７２℃１秒間、４分間］の２０サイクルを使用するサーモサイクルファイルでＰＣＲを実施し、Ｅｋ−ＳＥＥＤ−Ｋ５をコードする産物を生じた。配列番号３と７及び配列番号６と７をプライマーセットとして使用して、９４℃で１分間後、［９４℃１秒間、４０秒間；７２℃１秒間；５０℃２分間、３０秒間；７２℃１秒間、４分間］の２０サイクルを使用するサーモサイクルファイルでＰＣＲを実施し、それぞれＥｋ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びＴｅｖ−ＳＥＥＤ−Ｋ５をコードするＰＣＲ産物を生じた。次にＳ４００−ＨＲスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でＰＣＲ産物を精製した。
【００５７】
ｐＥＴ３２−Ｋａｎ発現ベクターを次のようにして構築した：ｐＥＴ３２ａ ＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をＢｐｕ１１０２Ｉ＋ＳａｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で切断し、３４２６ｂｐフラグメント（マップ位置８１−３５０７）をアガロースゲル電気泳動によって精製した。ｐＥＴ２４ｄ ＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）もＢｐｕ１１０２Ｉ＋ＳａｐＩで切断し、Ｋａｎ遺伝子を含む２３４１ｂｐフラグメント（マップ位置３０４７−８１）をアガロースゲル電気泳動によって精製した。迅速ライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて２つのフラグメントをライゲートし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をライゲーション混合物で形質転換し、ＬＢ−Ｋａｎ寒天平板（Ｍｉｃｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｏｍｂａｒｄ，ＩＬ）に塗布した。個々のコロニーをＬＢ−Ｋａｎ培地で増殖させ、ミディプレップキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーターを含むコード領域のＤＮＡ配列をＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。
【００５８】
ｐＥＴ３２−Ｋａｎ １μｇをＢｇｌＩＩ＋ＸｈｏＩで消化し、次に末端を充填して、先に述べられているように（米国特許第６，０５７，１２２号、前出）ＤＮＡをホスファターゼ処理し、精製した。このｐＥＴ３２−Ｋａｎベクター１μＬ（約１０ｎｇ）とＫ５ ＰＣＲ産物１μＬを、先に述べたような迅速ライゲーションキットを用いて５．２５μＬの容量でライゲートした。次に各々のライゲーション混合物１μＬをＨＭＳ１７４（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）２０μＬに形質転換した。ＬＢ−カナマイシン寒天上で組換え細胞を選択した。先に述べられているように（米国特許第６，０５７，１２２号、前出）コロニーを正しいサイズと方向のインサートの存在に関してＰＣＲによってスクリーニングした。その後正しいコロニーを、ＤＮＡ塩基配列確認用のプラスミドＤＮＡの単離のため、及び先に述べられているような（米国特許第６，０５７，１２２号、前出）小規模発現試験のために増殖させた。
【実施例２】
【００５９】
ｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｔｅｖ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｔｅｖ−ＬＬＰＤ−Ｋ５の構築
ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（配列番号５）をコードし、１個はＳｅｒ残基を伴い、１個はＳｅｒ残基を伴わず、その後にプラスミノーゲンの残基４５０に始まり、配列番号１の残基４５３に及ぶＫ５ Ｎ末端コード配列が続く、２個の５’ＰＣＲプライマーを合成した：
ＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡ（配列番号８）及びＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡＣＴＣ（配列番号９）。Ｃ末端３’プライマーを上記の実施例１で述べたように調製した。氷上で薄壁試験管においてＰＣＲ反応を実施し、その後直接、あらかじめ９４℃に加熱しておいたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０サーモサイクラーブロックに移した。配列番号８と７及び配列番号９と７をプライマーセットとして使用して、９４℃で１分間後、［９４℃１秒間、４０秒間；８０℃１秒間；４５℃５分間、３０秒間；７２℃１秒間、８分間］の２５サイクルを使用するサーモサイクルファイルでＰＣＲを実施し、それぞれＴｅｖ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びＴｅｖ−ＬＬＰＤ−Ｋ５をコードするＰＣＲ産物を生じた。クローニングは上記の実施例１で述べたように実施した。
【実施例３】
【００６０】
融合蛋白質からのＫ５の単離と精製
（ａ）融合蛋白質の単離：実施例１及び２からのＥｋ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、Ｅｋ−ＳＥＥＤ−Ｋ５、Ｔｅｖ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、Ｔｅｖ−ＳＥＥＤ−Ｋ５又はＴｅｖ−ＬＬＰＤ−Ｋ５の細胞ペーストを−８０℃保存から取り出し、溶解緩衝液（５０ｍＭトリス、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．９、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、プロテアーゼ阻害剤（８７μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍＬアプロチニン、７８μｇ／ｍＬベンズアミジン、１μｇ／ｍＬロイペプチン、５μｇ／ｍＬフェナントロリン）（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２０μＬ／１００ｇ細胞ペースト）（ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）と混合した。懸濁液中の細胞を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて１１，０００ｐｓｉで溶解した。顕微鏡で確認したとき典型的な溶解は＞９０％であった。懸濁液を遠心分離によって（ＲＣＦ＝４℃、２２０００ｇで３０分間）清澄化した。上清をデカントし、バッチ法でＮｉ ＩＭＡＣ樹脂（Ｐｒｏｂｏｎｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と混合した。樹脂を溶解緩衝液で洗って非特異的結合蛋白質を除去した。溶解緩衝液中イミダゾールの階段勾配（５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、及び５００ｍＭ）で融合蛋白質を溶出した。純粋な融合蛋白質を濃縮し、緩衝液を透析によって開裂緩衝液（５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．９）（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に交換した。
【００６１】
（ｂ）エンテロキナーゼを用いた融合蛋白質の開裂：Ｅｋ融合蛋白質溶液を１ｍＭ ＣａＣｌ２の最終濃度で作製した。２８０ｎｍの吸光度で測定したとき融合蛋白質１グラム当たり０．８１６３から１４．３単位のエンテロキナーゼ（ＥＫＭａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を融合蛋白質に加えた。溶液を３７℃にして、開裂反応を２０から２４時間進行させた。開裂の進行を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察した。
【００６２】
（ｃ）ＴＥＶプロテアーゼを用いた融合蛋白質の開裂：Ｔｅｖ融合蛋白質溶液を１ｍＭ ＤＴＴ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の最終濃度で作製した。２８０ｎｍの吸光度で測定したとき融合蛋白質１グラム当たり７６．２から１３３０単位の組換えＴＥＶプロテアーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を融合蛋白質に加えた。溶液を３０℃にして、開裂反応を２０から２４時間進行させた。開裂の進行を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察した。
【００６３】
（ｄ）Ｋ５の単離：開裂溶液をバッチ法でＮｉ ＩＭＡＣ樹脂（Ｐｒｏｂｏｎｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と混合することにより、開裂したＫ５を単離した。開裂フロースルーを収集し、樹脂を開裂緩衝液で洗った。Ｋ５を含む洗浄液を開裂フロースルーと一緒にして、陰イオン交換樹脂（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ，ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に適用した。開裂緩衝液中線状ＮａＣｌ勾配（０ｍＭ−３００ｍＭ）を用いて純粋なＫ５を単離した。
【００６４】
適切な酵素で融合蛋白質を開裂して、以下ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、ＳＥＥＤ−Ｋ５、及び組換えＬＬＰＤ−Ｋ５と称する産物を得た。
【実施例４】
【００６５】
ＳＬＬＰＤ−Ｋ５のＮ末端の官能基化及びメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ、分子量２０，０００）との複合
基本的にＧａｅｒｔｎｅｒらがＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，７、３８−４４（１９９６）で述べたようにして、クリングル５ペプチドフラグメントＳＬＬＰＤ−Ｋ５を官能基化し、メトキシポリエチレングリコール（５−３０ｋＤ）と複合した。使用したプロトコールを下記に簡単に述べる。
【００６６】
（ａ）ＢＯＣ−ＡＯＡのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形成：室温の酢酸エチル（３０ｍＬ）中のＢＯＣ−アミノオキシ酢酸（ＢＯＣ−ＡＯＡ、１．９ｇ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍより購入した）の溶液を、酢酸エチル（３０ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシニミド（１．１５ｇ）の溶液で処理した。生じた混合物を酢酸エチル（５ｍＬ）中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０６ｇ）の溶液で処理し、１８時間攪拌してろ過し、濃縮した。濃縮物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）で粉砕し、ろ過して、生じた固体を真空下で乾燥して所望する生成物１．２ｇを得た。
ＭＳｍ／ｅ３０６（Ｍ＋ＮＨ４）＋；
１Ｈ ＮＭＲδ１．４８（９Ｈ），２．８８（４Ｈ），４．７８（２Ｈ）。
【００６７】
（ｂ）ＭｅＯ−ＰＥＧ２０ｋｄ−ＮＨ−ＣＯＣＨ２−Ｏ−ＮＨ（ＡＯＡ−ＰＥＧ２０ｋｄ）の形成：室温のアセトニトリル（４．５ｍＬ）のＭｅＯ−ＰＥＧ２０ｋｄ−ＮＨ２（１．５ｇ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ Ｉｎｃ．，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙより購入した）の溶液を実施例３Ａ（５０ｍｇ）及び４−メチルモルホリン（０．１ｍＬ）で処理し、２時間攪拌して、濃縮した。濃縮物を水（９ｍＬ）に溶解し、β−アラニン（１００ｍｇ）で処理して、２Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９．２に調整した。分子量３，５００のカットオフ透析管を使用して混合物を水（４リットルずつ２回交換）に透析し、その後凍結乾燥して、ＢＯＣ−ＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅを１．４ｇ得た。
【００６８】
室温のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、２．５ｍＬ）中のＢＯＣ−ＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１．４ｇ）の溶液を３時間放置し、濃縮して、水（５ｍＬ）で処理し、再び濃縮した。濃縮物を水（７．５ｍＬ）に溶解し、２Ｍ ＮａＯＨでｐＨ３．０に調整した。次に溶液を４℃の水に透析し（３．５ｋｄカットオフ透析管）、凍結乾燥した。生じた固体の一部（２９ｍｇ）を水（１ｍＬ）に溶解した。この溶液のアミノ−オキシ官能基を、５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０中ｍ−ニトロベンズアルデヒド（ＭＮＢＡ）と縮合して、分光測光法で評価した。過剰のＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅを含む、計量した量のＭＮＢＡの溶液からの定量的反応は、このアルデヒドの吸光度のモル上昇が、ｍＰＥＧ−オキシムに変換したとき２５５ｎｍで１２，４００であることを示した。アルデヒドが１．０ｍＭであるとき、ＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅの完全な反応は６０℃で１５分後に達成され、後者の重量で評価したときＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅの濃度に対して１．５から２倍過剰であった。２９ｍｇ／ｍＬ溶液は０．９５ｍＭ（６８％活性）であり、２０，０００の分子量に基づき、１９ｍｇ／ｍＬのアルデヒド反応性ポリマーに等しいことが認められた。
【００６９】
（ｃ）ＳＬＬＰＤ−Ｋ５の酸化：１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８を含むトリス−Ｃｌ緩衝液に約１ｍｇ／ｍＬの精製ＳＬＬＰＤ−Ｋ５を加えた。Ｋ５、ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、及びＫ５のＰＥＧ複合体の蛋白質濃度を、１．０ｍｇ／ｍＬ溶液（１．０ｃｍ光路長、ｐＨ範囲４−８．５）がＯＤ＝１．７０を持つ場合の、２８０ｎＭでの光学密度から評価した。
【００７０】
ＳＬＬＰＤ−Ｋ５を０．１Ｍ ＮＨ４ＣＯ３（ｐＨ７．５−８）に透析し、次に３ｋｄカットオフ膜を通してろ過して、３．３ｍｇ／ｍＬに濃縮した。溶液（６６．６ｍＬ、２２０ｍｇクリングル５、分子量１０，５００）を１−メチオニン（５０ｍｇ）で処理して、５ｍＭの最終メチオニン濃度を得た。混合物を濃縮ＮＨ４ＯＨでｐＨ８．６に調整し、過ヨウ素酸ナトリウム（１８ｍｇ、４当量）で処理して、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−８ Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ４．６×２５０ｍｍ、０．１％ＴＦＡを含む水中アセトニトリル、ＣＨ３ＣＮを３０分間かけて５％から４０％まで上昇させる）によって観察した。１時間後、混合物をさらに１３．５ｍｇで処理して、さらに１時間攪拌し、プロパンジオール２０μＬで処理して、１時間攪拌し、１：１の氷酢酸／水でｐＨ４．８に調整した。混合物を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０（４Ｌ）に一晩透析し（３，５００分子量カットオフ膜）、質量スペクトル分析によって分析した結果、グリオキシリルクリングル５（１０，５１６）及びその水和物（１０，５３４）の存在を示唆した。
【００７１】
（ｄ）グリオキシリル−ＬＬＰＤ−Ｋ５とＡＯＡ−ＰＥＧの縮合：１：１の氷酢酸／水を１滴ずつ加えて実施例４（ｃ）の溶液（３ｍｇ／ｍＬ、６６．７ｍＬ、１９μｍｍｏｌ）をｐＨ４．０に調整した。０．９５ｍＭの実施例４（ｂ）（３４ｍＬ、３２μｍｍｏｌ、蛋白質に対して１．６８倍過剰）で溶液を処理して、３，５００分子量カットオフ膜と攪拌細胞を使用して、４時間かけてもとの容量の１／５に濃縮し、約１０ｍｇ／ｍＬの採集蛋白質濃度を得た。反応を２４時間継続させ、エタノール（０．１２ｍＬ）中の１００ｍＭ ｍ−ニトロベンズアルデヒドでクエンチングして、３０分間攪拌し、２Ｍトリス塩基でｐＨ７．８に調整して、所望する生成物を得た。
【００７２】
またｍＰＥＧを基本的に上記で述べたようにしてＳＥＥＤ−Ｋ５に結合させた。メトキシポリエチレングリコールに結合したＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びＳＥＥＤ−Ｋ５ペプチドを以下ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５と称する。
【実施例５】
【００７３】
ＰＥＧ化クリングルペプチドフラグメントの作製
クリングルペプチドフラグメント及び／又は天然に生じる又は非天然に生じるＮ末端セリンを持つクリングルペプチドフラグメントを作製するための当該技術分野において既知の方法（例えば組換え及び合成手法のような）を用いて、及び／又は下記のスキーム１と上記の実施例によって、下記の化合物を調製することができる：
（ａ）（プラスミノーゲンの）クリングル１−メトキシポリエチレングリコール複合体、
（ｂ）（プラスミノーゲンの）クリングル４−５−メトキシポリエチレングリコール複合体、及び
（ｆ）プロトンビンクリングル２−メトキシポリエチレングリコール複合体。
【００７４】
さらに、スキーム１と実施例１から５で概説する手順においてメトキシポリエチレングリコールを代替ポリアルキレングリコールに置き換えることにより、他のポリアルキレングリコールと上記のクリングルペプチドフラグメントの各々との複合体を合成することができる。
【実施例６】
【００７５】
内皮細胞移動アッセイ
ＨＭＶＥＣ（ヒト皮膚微小血管内皮細胞）の初代株を８０から９０％の集密度まで増殖させ、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗って、その後１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む最小培地（イーグルの平衡塩類溶液）中に１８時間放置した。細胞をＰＢＳで洗い、トリプシン処理して、２−５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、次に暗所でＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ（商標）（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ、Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）と共にインキュベートすることにより発蛍光団を充填した。培地中の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を９６穴プレートのウエルに入れ、次にこれらの溶液の上にフィルターを置いた。遠心分離し、再懸濁して、標識化の度合を評価した後、細胞を種々の量のｒＫ５（配列番号１のアミノ酸４５０位からアミノ酸５４３位まで）、精製ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又は精製ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５と共にこれらのウエルの上部に加えた。３７℃で４時間後、遊離細胞（移動していない）を上部フィルターからふき取り、蛍光を測定した。阻害因子を含まない対照ウエルにおいて移動した細胞数の画分としてデータを誘導し、表１に％阻害として示している。Ｓｅｍは平均の標準誤差を表わす。
【００７６】
【表１】
【００７７】
表１が示すように、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、非ＰＥＧ化ｒＫ５と同程度に、それよりも大きな度合ではないにしても、内皮細胞移動を阻害した。
【実施例７】
【００７８】
サルの薬物動態
すべての試料をリン酸緩衝食塩水中で１．１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。体重３から６ｋｇの９匹のカニクイザルを投与の前に一晩絶食させたが、水は自由に摂取させた。投与の約３時間後にサルに食餌を与えた。試験期間中、動物は個体別に収容した。
【００７９】
この試験は、３群のサルにおいて平行して実施した；各々の群は３匹の動物を含んだ。すべての動物に、１ｍｇ／ｋｇ（０．９１ｍＬ／ｋｇ）の静脈内用量の化合物（ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５又は組換えＬＬＰＤ−Ｋ５のいずれか）を伏在静脈中に緩徐なボーラスとして投与した。投与前、投与後０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、６、９及び２４時間後に、ＥＤＴＡ保存血液試料（約３ｍＬ）を各動物の大腿動脈又は静脈から採取した。結果を下記の表２及び図２に示す。
【００８０】
【表２】
【００８１】
表２に示すように、サルにおいて静脈内投与したとき、ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５及びｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、組換えＬＬＰＤ−Ｋ５よりも２７倍長い半減期（ｔ１／２）と非ＰＥＧ化Ｋ５よりも１３倍緩やかなクリアランス速度（Ｃｌｐ）を示した。
【実施例８】
【００８２】
ＳＬＬＰＤ−Ｋ５のＮ末端とメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（ＰＥＧ−アルデヒド、分子量２０，０００の複合
基本的にＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，８７，１４４６−１４４９（１９９８）に述べられているように、クリングル５ペプチドフラグメントＳＬＬＰＤ−Ｋ５を官能基化し、メトキシポリエチレングリコール（５−３０ｋｄ）と複合した。プロトコールを下記で簡単に述べる。
【００８３】
（ａ）メトキシポリエチレングリコールアルデヒドの滴定：２ｍＭメトキシポリエチレングリコールアルデヒドの混合物（２００μＬ、Ｈ２Ｏ中４０ｍｇ／ｍＬ ）を１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルヒドラジン（２００μＬ、１０ｍＬエタノール中１５．３ｍｇ）で処理し、室温で２４時間インキュベートした。５０μＬアリコートを１００ｍＭ ＨＣｌで１．０ｍＬに希釈し、ｔ＝０及びｔ＝２４時間目に４０５ｎｍで吸光度を測定した。吸光度の変化（λ４０５＝０．６４、ｔ＝２４時間目）を３−フェニルプロパノール中のｐ−ニトロフェニルヒドラジンの５０μＭ標準品（λ４０５＝０．６７）と比較すると、予想されたものと比べて９６重量％のアルデヒド含量を示した。
【００８４】
（ｂ）メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとＳＬＬＰＤ−Ｋ５の縮合：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（２１．７ｍＬ、ｐＨ４．７）中のＳＬＬＰＤ−Ｋ５（３００ｍｇ）の混合物をメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（１．１４ｇ、０．０５７２ｍｍｏｌ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒより購入した）及び１Ｍ ＮａＯＨ中の５Ｍシアノホウ水素化ナトリウム（４３．４μＬ、０．２１７ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を室温で４８時間インキュベートし、反応の進行をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ８ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラム、４．６×１５０ｍｍ；溶媒勾配：３０分間で５％から４０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ）によって観察した。混合物をさらなるメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（２００ｍｇ）とシアノホウ水素化ナトリウム（４３．４μＬ）で処理し、室温でさらに２４時間インキュベートした。
【００８５】
（ｃ）還元的アミノ化によって形成したｍＰＥＧ化−Ｋ５の精製：ｍＰＥＧ化−Ｋ５を、ｐＨ７．７の５０ｍＭトリス緩衝液、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＮａＮ３中３−７ｍｇ／ｍＬで保存した。ＰＥＧ化Ｋ５反応混合物を約１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、クロマトグラフィーのためにｐＨ５．０の２５ｍＭ酢酸ナトリウムを含む緩衝液（緩衝液Ａ）に透析した。ｐＨ５．０の２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いてＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）ＴＳＫ−ＳＰ５ＰＷカラムでクロマトグラフィーを実施した。蛋白質を溶出するためにＰｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムを用いてｐＨ５．０の２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対する勾配（緩衝液Ｂ）を作製した。様々な試料充填を行うために種々のサイズのカラムを使用したが、最も一般的に使用したのはＴＳＫ−ＳＰ５ＰＷ−ＨＲ（２×１５ｃｍ）であった。流速はカラムサイズと適合するように調整され、１．０から２．５ｍＬ／分と異なっていた。カラムを緩衝液Ａ中で平衡させ、あらかじめ緩衝液Ａ中に透析した試料を充填した。次に３カラム容量までの緩衝液Ａでカラムを洗って過剰のｍＰＥＧ−アルデヒドを除去し、除去後２８０ｎｍで吸光度を測定した。カラムを洗った後、緩衝液Ａから２５％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＮａＣｌ）まで２から３カラム容量で勾配を開始した。吸光度が基線値に回復するまで５０ｍＭ ＮａＣｌに保持して勾配を適用した。その時点で勾配を１００％緩衝液Ｂ（２００ｍＭ ＮａＣｌに上昇させて非反応Ｋ５を溶出した。３つのピークが５０ｍＭ ＮａＣｌ「保持勾配（ｈｏｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ）」段階で溶出した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析は、最初の（小さな）ピークが約９０，０００分子量（おそらくジ−ｍＰＥＧ化産物）であることを示唆した。２番目の小さなピークは約５０，０００Ｄａで溶出し、やはり５０，０００Ｄａ付近でゲル上を移動する３番目の（主要な）ピークと分離された。主要ピークからの分画をＳＤＳ ＰＡＧＥによってプールした。主要ピーク（全体の８０から９０％）を下記の方法によって純度と同一性に関してさらに特徴づけ、Ｎ末端モノ−ＰＥＧ化Ｋ５であると判定した。
【００８６】
Ｎ末端モノ−ＰＥＧ化Ｋ５を特徴付けるために使用した方法：
１．質量分析法；
２．モノ−Ｓ（ＨＲ）での分析クロマトグラフィー；
３．モノ−Ｑ（ＨＲ）での分析クロマトグラフィー；
４．ＴＳＫフェニル５ＰＷでの疎水性相互作用；
５．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＨＲ）でのゲルろ過；
６．臭化シアン開裂；
７．Ｎ−末端塩基配列決定法；及び
８．アミノ酸組成物分析。
【実施例９】
【００８７】
ｍＰＥＧ化クリングルペプチドフラグメントの作製
クリングルペプチドフラグメント及び／又は天然に生じる又は非天然に生じるＮ末端セリンを持つクリングルペプチドフラグメントを作製するための当該技術において既知の方法（例えば組換え及び合成手法のような）を用いて、及び／又は下記のスキーム２と上記の実施例によって、下記の化合物を調製することができる：
（ａ）（プラスミノーゲンの）クリングル１−メトキシポリエチレングリコール複合体、
（ｅ）（プラスミノーゲンの）クリングル４−５−メトキシポリエチレングリコール複合体、及び
（ｆ）プロトンビンクリングル２−メトキシポリエチレングリコール複合体。
さらに、スキーム２と実施例８で概説する手順においてメトキシポリエチレングリコールを代替ポリアルキレングリコールに置き換えることにより、他のポリアルキレングリコールと上記のクリングルペプチドフラグメントの各々との複合体を合成することができる。
【実施例１０】
【００８８】
サルの薬物動態
カニクイザルにおいて１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）で静脈内投与を実施した。ウエスタンブロット分析によって血漿濃度を測定した。結果を表３に示す。
【００８９】
【表３】
【００９０】
表３が示すように、２０ｋＤｍＰＥＧによるＮ末端でのｍＰＥＧ化は、非ｍＰＥＧ化Ｋ５と比較してサルにおける血漿からのクリアランスを劇的に低下させる。還元的アミノ化を通して実現されるｍＰＥＧ化は、オキシム形成によるｍＰＥＧ化と比べてより緩やかなクリアランスをもたらす。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の交叉参照）
本出願は、参照してここに組み込まれる、２０００年９月２９日に出願された米国特許仮出願通し番号第６０／２３６，５５０号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明はペプチド化学の分野に関する。より詳細には、本発明は、哺乳類プラスミノーゲンの対応する配列と実質的に類似するアミノ酸配列を含む複合ペプチドの調製と使用、該ペプチドを含む医薬組成物、及び血管新生から生じる又は血管新生によって増悪される疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
新しい血管が形成される過程である血管新生は、再生、成長及び創傷修復を含めた正常な身体活動にとって不可欠である。その過程は完全には理解されていないが、内皮細胞（毛細血管の一次細胞）の増殖を調節する分子の複雑な相互作用に関わると考えられている。正常条件下では、これらの分子は、数週間又は一部の場合には数十年間続くこともある長期間にわたって、微小血管系を静止状態（すなわち毛細管の増殖がない状態）に保持すると思われる。必要なときには（創傷修復の際など）、これらの同じ細胞が５日間以内に速やかな増殖と代謝回転を受けると考えられる（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．とＳｈｉｎｇ，Ｙ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７（１６）、１０９３１−１０９３４、及びＦｏｌｋｍａｎ，Ｊ．とＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、４４２−４４７（１９８７））。
【０００４】
正常条件下では血管新生は高度に調節されたプロセスであるが、多くの疾患（血管新生性疾患として特徴付けられる）が持続的な正しく調節されない血管新生によって促進される。特に異なる記載がない限り、正しく調節されない血管新生は、直接特定疾患を引き起こしうるか又は既存の病的状態を増悪させうる。例えば、眼の新生血管形成は失明の最も一般的な原因として関係付けられており、約２０の眼疾患を支配する。関節炎のようなある種の既存状態においては、新たに形成された毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に形成された新しい毛細血管が硝子体に侵入し、出血を生じさせ、失明を引き起こす。固形腫瘍の増殖と転移も血管新生に依存する（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６、４６７−４７３（１９８６）、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，８２、４−６（１９８９））。例えば，２ｍｍ以上に拡大する腫瘍はそれら自身の血液供給を得なければならず、新しい毛細血管の増殖を誘導することによって血液供給を確保する。ひとたびこれらの新しい血管が腫瘍内に取り込まれると、それらは、腫瘍細胞が循環に入り込み、肝臓、肺又は骨のような遠く離れた部位へと転移する手段を提供する（Ｗｅｉｄｎｅｒ，Ｎ．ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３２４（１）：１−８（１９９１）。
【０００５】
いくつかの血管新生抑制因子が、現在、血管新生性疾患を治療する際に使用するために開発されているが、これらの化合物に関連した難点が存在する。真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｉｓ ｆｒｅｓｅｎｉｕｓによって分泌される化合物、フマギリンは、血管新生抑制作用を示したが、長期暴露後に実験動物が呈した劇的な体重喪失により臨床開発は行われなかった。フマギリンの合成類似体、ＴＮＰ−４７０も内皮細胞増殖を阻害するが、ヒトにおいて無力症及び神経皮質毒性を誘発することが明らかにされ、許容用量が制限された（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １７、２５４１（１９８９））。
【０００６】
現在までに、いくつかの血管新生因子、特にプラスミノーゲンのクリングルペプチドフラグメントが報告されている（例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、米国特許第５，６３９，７２５号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７９２，８４５号、米国特許第５，８３７，６８２号、米国特許第５，８６１，３７２号、米国特許第５，８８５，７９５号、米国特許第６，０２４，６８８号、米国特許第５，８５４，２２１号、米国特許第５，８０１，１４６号、米国特許第５，９８１，４８４号、米国特許第６，０５７，１２２号及び米国特許第５，９７２，８９６号参照）。これらのフラグメントの有望な抗血管新生作用にもかかわらず、それらの循環半減期は短い。それ故、改善された薬物動態作用を持つ、クリングルペプチドフラグメントのような抗血管新生性化合物がなお必要とされている。そのような化合物はまた、容易に且つコスト効果的に製造できなければならない。
【０００７】
（発明の概要）
その原則実施形態において、本発明は、官能基化ポリマーに化学結合した官能基化クリングルペプチドフラグメントから成る複合クリングルペプチドフラグメントを開示する。好ましくは、官能基化クリングルペプチドフラグメントのＮ末端は、オキシム結合又は炭素−窒素単結合のいずれかを通して官能基化ポリマーに複合している。
【０００８】
好ましい実施形態では、官能基化クリングルペプチドフラグメントは実質的に、プラスミノーゲンのクリングル１、プラスミノーゲンのクリングル５、プラスミノーゲンのクリングル４−５、及びプロトンビンのクリングル２から成る群より選択されるクリングルペプチドフラグメントから成る。好ましくは、クリングルペプチドフラグメントはプラスミノーゲンのクリングル５又はプラスミノーゲンのクリングル４−５である。最も好ましくは、クリングルペプチドフラグメントは、ヒト、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、アカゲザル、及びブタプラスミノーゲンから成る群より選択されるプラスミノーゲンフラグメントに実質的な配列相同性を持つ、クリングル５ペプチドフラグメントである。
【０００９】
もう１つの好ましい実施形態では、官能基化ポリマーは、基本的にポリアルキレングリコールであるポリマーから成る。好ましくは、ポリアルキレングリコールは、直鎖、分枝、二置換、又は非置換ポリアルキレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、及びエチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーから成る群より選択され、該ホモポリマー及びコポリマーは置換されていないか又は１つの末端においてアルキル基で置換されている。特に好ましいポリアルキレングリコールは、約５，０００から約４０，０００までの分子量を持つポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。最も好ましくは、ポリアルキレングリコールは、約１０，０００から約２０，０００までの分子量を持つメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【００１０】
もう１つの実施形態では、本発明は、治療上許容される担体と組み合わせて複合クリングルペプチドを含む医薬組成物を開示する。
【００１１】
もう１つの実施形態では、本発明は、治療上有効な量の複合クリングルペプチドフラグメントをヒト又は動物に投与することを含む、抗血管新生治療を必要とする患者において疾患を治療する方法を開示する。好ましくは、疾患は、癌、関節炎、黄斑変性、及び糖尿病性網膜症から成る群より選択される。より好ましくは、疾患は癌であり、最も好ましくは、疾患は、原発性及び転移性固形腫瘍、癌、肉腫、リンパ腫、乾癬、及び血管腫から選択される。
【００１２】
もう１つの実施形態では、本発明は、有効量の複合クリングルペプチドを個体に投与することを含む、該個体において内皮細胞増殖を抑制する方法を開示する。
【００１３】
もう１つの実施形態では、本発明は、有効量の複合クリングルペプチドフラグメントを内皮細胞に投与することを含む、インビトロで内皮細胞増殖を抑制する方法を開示する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
ここで使用するとき、単数形態の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに命じない限り複数の指示を包含する。さらに、ここで言及されるすべての公表学術及び特許文献（特許出願を含む）は、その全体が参照してここに組み込まれる。
【００１５】
ここで使用するとき、「Ｋ５」、「クリングル５」、「Ｋ１」、及び「クリングル１」はプラスミノーゲンのクリングル領域を指す。
【００１６】
ここで使用するとき、「Ｋ２」はプロトロンビンのクリングル領域を指す。
【００１７】
特に異なる記載がない限り、次の語は次のような意味を持つものとする：
「アシル基」の語は、カルボニル基を通して親分子部分に結合したＣ１−Ｃ１０アルキル基を意味する。
【００１８】
「アシル化基（ａｃｙｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」の語は、反応の経過においてアシル基を分子の窒素原子に供与することができる試薬を意味する。アシル化基の例は、無水酢酸、塩化アセチル、等を含む。
【００１９】
「Ｃ１−Ｃ１０アルキル」の語は、直鎖又は分枝飽和炭化水素から１個の水素原子を除去することによって誘導される１から１０個の炭素原子の一価の基を意味する。
【００２０】
「Ｃ１−Ｃ１０アルキレン」の語は、直鎖又は分枝飽和炭化水素から誘導される１から１０個の炭素原子の二価の基を意味する。
【００２１】
「カルボニル基」の語は−Ｃ（Ｏ）−を意味する。
【００２２】
「クリングルペプチドフラグメントの複合体」又は「複合クリングルペプチドフラグメント」の語は、官能基化ポリマーに化学結合した官能基化クリングルペプチドフラグメントを意味する。そのような複合体を作製する方法はこれまでに報告されている（例えば、ＷＯ９６／４１８１３号及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．８７、１４４６−１４４９（１９９８）参照）。クリングルペプチドフラグメントの複合体の非制限的な例は、ポリエチレングリコールに結合したクリングル５ペプチドフラグメント、メトキシポリエチレングリコールに結合したクリングル５ペプチドフラグメント、メトキシポリエチレングリコールに結合したクリングル４−５ペプチド、等を含む。
【００２３】
「官能基化クリングルペプチドフラグメント」の語は、反応基を含むように部位特異的に修飾された、ここで定義するようなクロマトグラフィーペプチドフラグメントを指す。官能基化クリングルペプチドフラグメントはまた、Ｎ末端に１個又はそれ以上の非天然アミノ酸を付加することによって修飾されたクリングルペプチドフラグメントを含むことが意図されている。付加アミノ酸は反応基として働くか、又は代替的にそれ自体が反応基を形成するように修飾されうる。例えば、アミノ酸４５０位からアミノ酸５４３位までの配列を持つクリングル５ペプチドフラグメントの４５０位のロイシン（Ｌｅｕ）残基のすぐ上流（すなわち直前）にセリン（Ｓｅｒ）を付加することができる。その後Ｎ末端のＳｅｒ残基を、アルデヒドのような反応基を形成するように特異的に修飾することができる。Ｎ末端に１個又はそれ以上の非天然アミノ酸を持つクリングルペプチドフラグメントは、例えば組換えＤＮＡ法又は合成ペプチド化学のような、当該技術において既知の何らかの手段によって作製することができる。ポリペプチドを官能基化するための方法は当業者に既知である（例えばＷＯ９６／４１８１３号及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．８７、１４４６−１４４９（１９９８）参照）。
【００２４】
「官能性又は官能基化ポリマー」の語は、ポリマーが官能基化クリングルペプチドフラグメントのような相補的官能基化標的に部位特異的に複合できるように、ここで定義するようなポリマー上のアミノ−オキシ基又はアルデヒドのいずれかの形成を意味する。例として、ポリマーを官能基化するための方法はまた、ＷＯ９６／４１８１３号及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．８７、１４４６−１４４９（１９９８）においても提供される。
【００２５】
「クリングル融合蛋白質」の語は、そのうちの１個がクリングルペプチドフラグメントである、２個又はそれ以上の個々のポリペプチドから導かれるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。クリングル融合蛋白質は、クリングルペプチドフラグメントについてのコード配列が、２個（又はそれ以上の）リーディングフレームがインフレームであるように少なくとも１個の他のポリペプチドのコード配列と連結されているポリヌクレオチドの発現によって形成されうる。クリングル融合蛋白質の非制限的な例は、クリングル４−５（Ｋ４−５）のような２個又はそれ以上の個々のクリングルペプチドフラグメントの融合を含む。本発明のクリングル融合蛋白質の他の例は、生物学的標識に連結されている、単独の又はもう１つのポリペプチドに融合されたクリングルペプチドフラグメントを含む。そのようなクリングル融合蛋白質は、それらが由来する別々の蛋白質に開裂されうるか又は開裂されなくてもよい。
【００２６】
「クリングルペプチドフラグメント」の語は、抗血管新生作用を持つプラスミノーゲン又はプロトロンビンのクリングル領域を指し、次の配列を含む：（ａ）プラスミノーゲンのクリングル１（Ｋ１）及びクリングル５（Ｋ５）のような個々のクリングルペプチド、（ｂ）プロトロンビンのクリングル２（Ｋ２）のようなクリングルペプチド、（ｃ）ここで定義するようなクリングル融合蛋白質、（ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の配列に実質的な配列相同性を持つクリングルペプチド、及び（ｅ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）で述べる配列に実質的な配列相同性を持つ（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のペプチドセグメント。上述したクリングルペプチドフラグメント及び該フラグメントを作製し、使用するための方法は、特許資料（米国特許第５，６３９，７２５号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７９２，８４５号、米国特許第５，８３７，６８２号、米国特許第５，８６１，３７２号、米国特許第５，８８５，７９５号、米国特許第６，０２４，６８８号、米国特許第５，８５４，２２１号、米国特許第５，８０１，１４６号、米国特許第５，９８１，４８４号、米国特許第６，０５７，１２２号及び米国特許第５，９７２，８９６号参照）ならびに学術文献において広汎に記述されている。好ましいクリングルペプチドフラグメントは、単独であるか、１個又はそれ以上のクリングルペプチドフラグメントと融合している、又はプラスミノーゲンの他のクリングル領域（例えばアンギオスタチン）及び／又はエンドスタチンのような抗血管新生因子と組み合わせて使用される、Ｋ５ペプチドフラグメントである。さらにもう１つの好ましいＫ５ペプチドフラグメントは、ここで述べるような、ヒトＫ５ペプチドフラグメントに実質的な配列相同性を持つものである。特に好ましいＫ５ペプチドフラグメントは、配列番号１のアミノ酸残基４５０から５４３及び配列番号１のアミノ酸残基４５８から５４３の配列を持つ。
【００２７】
「ポリマー」の語は、反復非ペプチド構造単位から成る化学化合物を意味する。本発明の好ましいポリマーは水溶性である。最も好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「蛋白質」の語は、各々アミノ酸の分子鎖を指し、特定の鎖長を意味しない。この語はまた、ポリペプチド、ペプチド、及び蛋白質の発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を指すことが意図されている。
【００２９】
「精製ポリペプチド」の語は、目的とするポリペプチドが天然に結合している細胞成分を基本的に含まない、すなわち約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満含む、目的とするポリペプチド又はそのフラグメントを意味する。ポリペプチドを精製するための方法は当該技術において既知である。
【００３０】
「実質的な配列相同性」の語は、ヒト、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、アカゲザル、又はサルプラスミノーゲンの対応するペプチド配列の約６０％のアミノ酸同一性、望ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸同一性、より望ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸同一性、さらに一層望ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸同一性、最も望ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸同一性を意味する。ヒトプラスミノーゲンに実質的な配列相同性を持つ配列を「相同体」と称する。実質的な配列相同性を持つことに加えて、本発明の相同体は、ここで述べるクリングルペプチドフラグメントと同様の生物活性（すなわち抗血管新生作用）を示す。クリングルペプチドフラグメント内のアミノ酸配列又はアミノ酸の数は種によって又は生産方法によって異なることがあり、クリングルペプチドフラグメント内のアミノ酸の総数は、一部の場合、正確に定義することができない。これらの配列がそれらのアミノ酸の少なくとも７３％において同一であると仮定すれば、クリングルペプチドフラグメントのアミノ酸配列が種間で実質的に同様であり、クリングルペプチドフラグメントの生産方法はヒトプラスミノーゲンの対応するアミノ酸配列に実質的な配列相同性を持つクリングルペプチドフラグメントを提供することは明白である。
【００３１】
すべてのペプチド配列は一般的に認められている慣例に従って表記するものとし、α−Ｎ末端のアミノ酸残基は左側、α−Ｃ末端は右側である。ここで使用するとき、「α−Ｎ末端」の語はペプチド内のアミノ酸の遊離α−アミノ基を指し、「α−Ｃ末端」はペプチド内のアミノ酸の遊離α−アミノ酸カルボン酸末端を指す。
【００３２】
本発明は、官能基化ポリマーに複合した官能基化クリングルペプチドフラグメントを含む、抗血管新生作用を備えた化合物を提供する。そのような複合体の形成により、それらは治療薬としてより適したものとなる。例えば、複合クリングルペプチドフラグメントの望ましい特性は、水溶液への高い溶解度、保存中の高い安定性、低い免疫原性、酵素分解に対する高い抵抗性、多様な薬剤投与システムとの適合性、及び長いインビボ半減期を含む。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明の官能基化ポリマーは次の式：
Ｐ−Ｘ−Ｏ−ＮＨ２
［式中、Ｐはポリマー、好ましくは水溶性のポリマーを表わし、Ｘは任意に存在するスペーサー基を表わし、そして−Ｏ−ＮＨ２はアミノ−オキシを表わす］
によって表わされる。ポリマーＰは様々な量の多数の反復単位を含むので、Ｐの分子量が大きく変化しうることは理解されるであろう。Ｐが所与の分子量を持つというとき、その分子量は、分子中に存在するサブユニット数が互いに異なるＰ分子群の平均分子量を反映する、単なる近似値であると考えられる。一般に、Ｐは約５，０００から約４０，０００まで、好ましくは約１０，０００から約２０，０００までの分子量を持つ。しかし、Ｐに適する分子量は修飾するクリングルペプチドフラグメントに依存して変化するであろうことは明白である。
【００３４】
スペーサー基Ｘは存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合には、アミノ−オキシ基を目的とするポリマーに接続する役割を果たす。スペーサー基Ｘは、フェニル又はＣ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、又はそれらの組合せのような置換又は非置換の分枝又は線状脂肪族又は芳香族基を含む非反応基、あるいはアミノ酸鎖（フレキシブルヒンジ又はループ配列など（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１、９４３−９５８（１９９０）参照））、ヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組合せを表わし、ヘテロ原子を含みうる。好ましい実施形態では、Ｘは−ＣＨ２−又は−ＣＨＯＨ−又は−ＣＯＣＨ２−又は−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２を含む。アミノ−オキシ基が官能基化ポリマー上にあるとき、アミノ−オキシ官能基に隣接する付加的な接続構造（すなわちスペーサー基）中に存在する基は決定的に重要ではない；しかしながら、スペーサー基についての必要条件はアミノ−オキシ基とその相補的アルデヒド間のオキシム結合の形成に干渉しないことである。さらに、スペーサー基はアミノ−オキシ基に先んじてアルデヒドと結合すべきではなく、また反応に立体障害を与えてはならず、さらに反応基を不活性化してはならない。
【００３５】
もう１つの実施形態では、二及び多ポリマー含有官能基化ポリマーを提供する。そのようなポリマーは一般式：
（Ｐ）ｍ−Ｌ−Ｘ−Ｏ−ＮＨ２
［式中、Ｐ、Ｘ、及びＯ−ＮＨ２は本文中で定義するとおりであり、ｍは２から１０まで、より好ましくは２から５までの整数であり、そしてＬ各々のＰ（その数はｍ個）が別々に共有結合している多価リンキング基であって、Ｌの価数は少なくともｍ＋１である］
を持つ。本発明の二及び多ポリマー官能基化ポリマーの場合には、標的巨大分子への官能基化ポリマーの部位特異的複合は、多価Ｌ構造に連結した−Ｏ−ＮＨ２基による単オキシム結合を通して、２個又はそれ以上のポリマーの部位特異的な結合をもたらす。
【００３６】
従って、二又は多ポリマー含有官能基化ポリマーは、同じか又は異なる、好ましくは同じである、２個又はそれ以上のポリマーを、標的巨大分子上のあらかじめ選択された単一部位に結合することができる。Ｌが三価の基である場合には、ｍは２である。好ましくは、Ｌの価数はｍ＋１であり、その場合Ｌの１原子価は、場合によってはＸを通して、オキシム−形成基によって占められ、Ｌの残りの原子価は１個又はそれ以上の（すなわちｍ個の）ポリマーによって占められる。Ｌがその後のオキシム反応に立体障害を与えず、反応基を不活性化しない限り、Ｌの構造は決定的に重要ではなく、またＬをポリマーに連結する結合も重要ではない。Ｌは他の存在する機能と反応しない。官能基化ポリマー内のリンキング基Ｌの各々の腕又は原子価は、好ましくは、フェニル又はＣ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、又はそれらの組合せのような置換又は非置換脂肪族又は芳香族基を含む非反応基、あるいはレキシブルヒンジ又はループ配列のようなアミノ酸鎖（フレキシブルヒンジ又はループ配列など（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１、９４３−９５８（１９９０）参照））、ヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組合せを含み、ヘテロ原子を含みうる。ポリマーとの複合前には、好ましくはＬの１つを除くすべての腕又は原子価は、好ましくはポリマーの末端に位置する、ポリマー上の基と特異的に反応することができる官能基を含む。残りの原子価は、オキシム−形成官能基（該官能基は、所望する場合には脱保護可能な状態にある）を提供する化合物とのその後の反応のために保護されているか、又はさもなければかかる化合物によって占められている。ポリマー複合体を抗原性又は免疫原性のために使用する場合、それ自体強い免疫原性ではないリンカー基を選択することは当業者には明白である。ポリマー複合体を結合のために使用する場合には、好ましいリンカー基は、結合、アビディティー、生成物安定性、又は溶解度のような特性を高めるか又は少なくともそのような特性に干渉しない。リンキング構造はそれ自体、本発明の相補的官能基化ポリマーとのオキシム形成による平行構築を用いて（Ｐ）ｍＬ構造を構築するように、オキシム形成基で占められた原子価を含みうる。従って、米国特許願通し番号第０８／０５７，５９４号、同第０８／１１４，８７７号、及び同第０８／０５７，５９４号、ならびに国際特許願ＰＣＴ／ＩＢ９４／０００９３号に述べられているベースプレート構造はＬ構造としての使用に適する。ベースプレートのオキシム形成基は他の相補的反応基で置換することができる；しかし、最も好ましくはオキシム形成を構築のために使用する。好ましいＬ構造は、いずれか２個のアミノ基が各々ポリマーへのカップリングのために使用可能であり、残りのアミノ基がオキシム形成基の導入のために使用しうるトリアミン化合物から誘導される。好ましいトリアミンは式、Ｎ（Ｒ５−ＮＨ２）３［式中、いずれか２個のアミノ基（−ＮＨ２）が各々ポリマーへのカップリングのために使用可能であり、残りのアミノ基がオキシム形成基の導入のために使用可能であって、Ｒ５は、フェニル又はＣ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、又はそれらの組合せのような置換又は非置換脂肪族又は芳香族基を含む非反応基、あるいはアミノ酸鎖（フレキシブルヒンジ又はループ配列など（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１、９４３−９５８（１９９０）参照））、ヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組合せであり、ヘテロ原子を含みうる。Ｒ５は好ましくは−ＣＨ２−ＣＨ２−である。３個の第一アミノ基は好ましくは窒素から遠位である。最も好ましくはトリアミン化合物はトリス−（２−アミノエチル）アミンである。
【００３７】
もう１つの実施形態では、二又は多ポリマー官能基化ポリマーは、最初に所望する多価の、通常は保護された一価を持つＬ構造を得、次に保護されたＬ構造を、典型的には当該技術において既知の結合化学を用いて適切に活性化されたポリマー中間体と、又はオキシム化学を通して本発明の化合物ポリマーと反応させることによって合成される。二又は多ポリマー産物を単離した後、Ｌの保護された残りの原子価を脱保護し、その後アシル化基を含む適当に保護されたアミノ−オキシと反応させる（例えばアミノ基の場合にはアシル化する）ことにより、本発明に従って産物を官能基化する。オキシム形成官能基を脱保護した後、最終産物である二又は多ポリマー官能基化ポリマーを得る。
【００３８】
代替的には、最初に適切に保護されたアミノ−オキシ含有基でＬを誘導体化し、次にモノ置換Ｌ誘導体を各々の残りの原子価においてポリマー中間体（ＬがＮＨ２を含むときにはＣＯＯＨ又はＬがＣＯＯＨを含むときにはＮＨ２基を有するもののような）又は本発明の官能基化ポリマー（ＰをＬに構築するためにオキシム化学を使用するとき）と反応させる。例えば、ｍＰＥＧ−ＣＯＯＨ中間体ポリマーを、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物）及びＤＣＣ（１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下で、又はｍＰＥＧ−ＣＯＯＨのスクシニミジル誘導体をあらかじめ調製する場合にはこれらの試薬なしで、Ｌ構造上の遊離アミノ基に結合することができる。オキシム形成官能基を脱保護した後、最終産物である二又は多ポリマー官能基化ポリマーを得る。
【００３９】
アミノ酸からＬ基を形成するとき、Ｌ構造のペプチド配列は常套的な固相ペプチド合成法（「ＳＰＰＳ」）によって合成することができ、ペプチドがまだＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルのような活性形態で固相ＰＥＧ−ＣＯＯＨに結合している間に、新生ペプチド鎖に付加することができる。例えば、Ｌ構造は、５個のリシン残基と１個のＮ末端アミノ基のような６個の反応基を持つペプチドで構成されうる。ＰＥＧ−ＣＯＯＳｕヒドロキシスクシニミドエステルはリシン残基のε−アミノ基の各々と反応することができる（但しＮ末端α−アミノ基は保護されたままである）。次に完全にアシル化されたペプチドのＮ末端アミノ基を脱保護し、ポリマー含有構造をＢｏｃ−ＡｏＡ含有活性エステルと反応させてＡｏＡ基を導入し、Ｂｏｃを除去して樹脂から穏やかに開裂した後、本発明のペンタポリマー含有官能基化ポリマーを得る。この方法は、工程の間の保護とその後の脱保護を必要とする付加残基を排除するように設計することができるので、合成構造に関して（そしておそらく一部の組換え産物に関して）特に有用であることに注目すべきである。代替的には、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルのような活性形態のＢｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−ブチル）−ＯＨをリシン残基のε−アミノ基に結合することができる。次にＮ末端α−アミノ基を脱保護してアミノ−オキシ基（例えばＡｏＡ）を導入し、Ｂｏｃを除去した後、ε−Ｓｅｒ−ペンタリシンを含む前駆体Ｌ構造を得る。ひとたび蛋白質に複合した前駆体Ｌ構造をｐＨ７の過ヨウ素酸塩のような弱酸化剤で処理して、ε−Ｓｅｒ−ペンタリシンをε−ＧＸＬ−ペンタリシンに変換し、それによってペンタ−ＧＸＬ Ｌ構造を生成して、その後それを本発明のアミノ−オキシ官能基化ポリマーと反応させることができる。エチレングリコールのような、１，２結合について比較的自由な回転を有する１，２−ジオール又は１−アミノ−２−オール又は１−オール−２−アミノ化合物を用いて酸化反応を終了することができる。代替的には、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、過ヨウ素酸塩を速やかに除去することによって酸化反応を終了することができる。酸化反応は第一アミノ基を含むセリン残基に関してのみ起こるので、ε−セリン残基だけがグリオキシルに変換される。保護を所望するときには、Ｎ末端セリンを酸化から化学的に保護するための方法は当業者に既知である。その後Ｎ末端アミン基を脱保護し、ポリマー含有構造をＢｏｃ−ＡｏＡ含有活性エステルと反応させてＡｏＡ基を導入し、Ｂｏｃを除去した後、本発明のペンタポリマー含有官能基化ポリマーを得る。Ｂｏｃ又はその後穏やかな条件下で除去することができる、ペプチド合成において使用される典型的なアミノ保護基が適する（例えばＧｒｅｅｎとＷｕｔｓ（１９９１）「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第２版、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照）。
【００４０】
もう１つの実施形態では、本発明の官能基化ポリマーは次の式：
【００４１】
【化１】
［式中、Ｐは先に定義したようなポリマーを表わし、Ｘは任意に存在するスペーサー基を表わす］
によって表わされる。スペーサー基Ｘは存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合には、アルデヒドを目的とするポリマーに接続する役割を果たす。スペーサー基Ｘは、フェニル又はＣ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、又はそれらの組合せのような置換又は非置換の分枝又は線状脂肪族又は芳香族基を含む非反応基、あるいはアミノ酸鎖（フレキシブルヒンジ又はループ配列など（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１、９４３−９５８（１９９０）参照））、ヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組合せを表わし、ヘテロ原子を含みうる。好ましい実施形態では、Ｘは−ＣＨ２−を含む。アミノ−オキシ基が官能基化ポリマー上にあるとき、アルデヒドに隣接する付加的な接続構造（すなわちスペーサー基）中に存在する基は決定的に重要ではない；しかしながら、スペーサー基についての必要条件は、アルデヒドとその相補的第一アミノ基間の炭素−窒素結合の形成に干渉しないことである。さらに、スペーサー基はアルデヒドに先んじて第一アミノ基と結合すべきではなく、また反応に立体障害を与えてはならず、さらに反応基を不活性化してはならない。
【００４２】
本発明はまた、複合クリングルペプチドフラグメントを使用してインビトロ及びインビボで内皮細胞増殖を抑制するための方法、ならびに抗血管新生治療を必要とするヒト又は動物を治療するための方法であって、治療上有効な量のクリングルペプチドの複合体をそのような個体に投与することを含む方法を提供する。本発明はさらに、クリングルペプチドフラグメントの複合体と治療上許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４３】
実施例において特定するものを含むがそれらに限定されない本発明の化合物は、抗血管新生作用を有する。血管新生抑制因子として、そのような化合物は、原発性及び転移性固形腫瘍、及び下記の癌：乳癌；結腸癌；直腸癌；肺癌；口腔咽頭癌；下咽頭癌；食道癌；胃癌；膵癌；肝癌；胆嚢癌；胆管癌；小腸癌；腎、膀胱、及び尿路上皮を含めた尿路の癌；子宮頸、子宮、卵巣、絨毛癌及び妊娠期栄養膜疾患を含めた女性生殖管の癌；前立腺、精嚢、精巣及び生殖細胞腫瘍を含めた男性生殖管の癌；甲状腺、副腎及び下垂体を含めた内分泌腺の癌；血管腫、黒色腫、骨及び軟組織から生じる肉腫及びカポジ肉腫を含めた皮膚癌；脳、神経、眼、及び神経膠星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫及び髄膜腫を含めた髄膜の癌；白血病のような造血に関する悪性疾患から生じる、緑色腫、プラスマ細胞腫、血小板、そして菌状息肉腫及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病を含めた固形腫瘍；ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；リウマチ、免疫性及び変形性関節炎を含めた自己免疫疾患の予防；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶反応、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性及び低酸素症による網膜新生血管形成を含めた眼疾患；眼の異常新生血管形成状態；乾癬を含めた皮膚疾患；血管腫及びじゅく状斑内の毛細血管増殖を含めた血管疾患；オースラー−ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；創傷肉芽形成；腸癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症及び過形成性瘢痕（すなわちケロイド）を含めた内皮細胞の過剰又は異常刺激を特徴とする疾患ならびにネコ引っ掻き病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）及び潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）を含めた病的結果として血管新生を有する疾患の治療において有用である。もう１つの用途は、排卵と胎盤の定着を抑制する産児制限剤としてである。
【００４４】
本発明の化合物はまた、単独で又は放射線療法及び／又は血管新生性疾患を治療するために慣例的に患者に投与される他の化学療法治療と組み合わせて及び／又は他の抗血管新生性物質と組み合わせて使用するとき、上述した腫瘍からの転移を予防するために有用であると考えられる。例えば、固形腫瘍に治療において使用するとき、本発明の化合物は、αインターフェロン、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキセート及びプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びデキサメタゾン）、ＰＲＯ−ＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキセート（ｗ／ロイコビンレスキュー）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリスルフェート、血小板第４因子、アンギオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、Ｔｅｃｈｇａｌａｎ、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧ等のような化学療法剤と共に投与しうる。他の化学療法剤は、メクロレタミン、メルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド及びイフォスファミドを含めたナイトロジェンマスタードのようなアルキル化剤；カルムスチン、ロムスチン、セムスチン及びストレプトゾシンを含めたニトロソ尿素類；ブスルファンを含めたスルホン酸アルキル；ダカルバジンを含めたトリアジン；チオテパ及びヘキサメチルメラミンを含めたエチエニミン；メトトレキサートを含めた葉酸類似体；５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシドを含めたピリミジン同族体；６−メルカプトプリン及び６−チオグアニンを含めたプリン類似体；アクチノマイシンＤを含めた抗腫瘍性抗生物質：ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトマイシンＣ及びメトラマイシンを含めたアントラサイクリン；タモキシフェン及びコルチコステロイドを含めたホルモン及びホルモン拮抗物質ならびにシスプラチン及びブレキナールを含めた種々の薬剤を含む。例えば、腫瘍は、手術、放射線療法又は化学療法と複合クリングル５の投与及び微小転移巣の静止を延長し、残存原発腫瘍を安定化させてその増殖を抑制するためのその後の複合クリングル５の投与によって慣例的に治療しうる。他の抗血管新生性物質は、Ｋ１及びＫ４−５のようなプラスミノーゲンの他のクリングルペプチドフラグメントならびにプロトロンビンのＫ２を含む。
【００４５】
ここで使用するとき「非経口」の語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入を含む投与様式を指す。非経口注射用の医薬組成物は、製薬上許容される無菌水性又は非水性溶液、分散、懸濁液又は乳剤ならびに使用の直前に無菌注射用溶液又は分散に還元するための無菌粉末を含む。適当な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒又は賦形剤の例は、水、エタノール、ポリオル（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のような）、カルボキシメチルセルロース及びそれらの適当な混合物、植物油（オリーブ油のような）及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含む。例えばレシチンのような被覆材料の使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、また界面活性剤の使用によって適切な流動性を保持することができる。これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助薬を含みうる。微生物の作用の予防は、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等のような様々な抗菌及び抗真菌薬を含めることによって確保しうる。また、糖類、塩化ナトリウム等のような等張剤を含むことも望ましいと考えられる。吸収を遅延させるモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような物質を含めることによって注射用製剤の持続的な吸収を生じさせることができる。注射用デポ製剤は、ポリアクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）のような生分解性ポリマー中に薬剤のミクロ被包マトリックスを形成することによって作製しうる。薬剤対ポリマーの比率及び使用する個々のポリマーの性質に依存して、薬剤放出の速度を調節することができる。デポ注射用製剤はまた、体組織と適合性のリポソーム又はミクロ乳剤中に薬剤を捕捉することによって調製される。注射用製剤は、例えば細菌捕獲フィルターを通してろ過によって又は使用の直前に無菌水又は他の無菌注射用媒質に溶解又は分散することができる無菌固形組成物の形態の殺菌薬を組み込むことによって滅菌することができる。
【００４６】
局所投与は皮膚、粘膜及び肺の表面への投与を含む。局所投与用組成物は、加圧しうる又は加圧されない乾燥粉末として調製しうる。非加圧粉末組成物においては、微細に分割した形態の有効成分を、例えば直径１００マイクロメートルまでの大きさを持つ粒子を含む、より大きなサイズの製薬上許容される不活性担体と混合して使用しうる。適当な不活性担体はラクトースのような糖類を含む。望ましくは、有効成分の粒子の少なくとも９５重量％が０．０１から１０マイクロメートルの範囲の有効粒子サイズを持つ。代替的には、本発明の化合物は眼の硝子体及び房水に直接注入することができる。
【００４７】
本発明の化合物はまた、リポソームの形態で投与することもできる。当該技術分野において既知であるように、リポソームは一般にリン脂質又は他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒質に分散する単層又は多重膜水和液晶によって形成される。リポソームを形成することができる、無毒性で生理的に許容される代謝可能ないかなる脂質も使用できる。リポソーム形態の本発明の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、防腐剤、賦形剤等を含みうる。好ましい脂質は、天然及び合成のリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は当該技術において既知である。
【００４８】
上記又は他の治療において使用するとき、治療上有効な量の本発明の化合物の１つを純粋な形態で、又は、そのような形態が存在する場合には、製薬上許容される塩の形態で製薬上許容される賦形剤と共に又は賦形剤なしで用いることができる。本発明の化合物の「治療上有効な量」とは、医学的処置に適用される妥当な利益／危険度比で血管新生性疾患を治療する（例えば腫瘍の増殖を抑えるあるいは腫瘍の転移を遅らせる又は遮断する）ために十分な化合物の量を意味する。しかし、本発明の化合物及び組成物の総一日量は、合理的な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることは明白であろう。個々の患者についての明細な治療上有効な用量レベルは、治療する疾患及び疾患の重症度、用いる特定化合物の活性、用いる特定組成物、患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、用いる特定化合物の排泄速度、治療期間、用いる特定化合物と組み合わせて又は同時に使用する薬剤及び医学技術において既知の同様の因子を含めて、様々な因子に依存するであろう。例えば、所望する治療効果を達成するために必要なレベルよりも低い用量レベルで化合物の投与を開始し、所望する効果が達成されるまで徐々に用量を高めていくことは十分に当該技術の範囲内である。単回又は分割投与でヒト又は他の哺乳類宿主に局所又は全身投与する複合クリングル５ペプチドフラグメントの総一日量は、例えば０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重／日、より一般的には０．０５から１ｍｇ／ｋｇ体重の量であると考えられる。所望する場合には、投与のために有効一日量を多回に分けてもよい。結果として、１回用量の組成物は、一日量を構成するような量又はその多回分割量を含みうる。
【００４９】
血管新生性疾患の抑制、治療又は予防のために本発明の化合物と組み合わせることができる物質は、上記で列挙したものには限定されず、原則として、血管新生性疾患の治療又は予防のために有用ないかなる物質も含む。
【００５０】
合成工程
【００５１】
【化２】
【００５２】
スキーム１は、他の複合クリングルペプチドフラグメントの合成に容易に拡大することができる、Ｋ５のポリアルキレングリコール複合体の１つのタイプの調製を示す。アミノメトキシポリエチレングリコール（２）（５−３０ｋＤ）を（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）オキシ）アセチルＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル（３）と縮合して、（アミノオキシ）アセチル−官能基化ポリエチレングリコール（４）を得る。これらをアルデヒド（６）（過ヨウ素酸ナトリウムによる（セリン４５９）Ｋ５（５）の酸化によって形成される）と縮合して、種々のポリエチレングリコール長を持つ所望する複合ペプチドフラグメント（７）を形成する。
【００５３】
【化３】
【００５４】
スキーム２は、他の複合クリングルペプチドフラグメントの合成に容易に拡大することができる、代替的なＫ５のポリアルキレングリコール複合体の調製を示す。メトキシポリエチレングリコールアルデヒド（８）（５−３０ｋＤ）をシアノホウ水素化ナトリウムのような還元剤の存在下で（セリン４５９）Ｋ５と縮合して、種々のポリエチレングリコール長を持つ所望する複合ペプチドフラグメント（９）（ＬＬＰＤ−Ｋ５＝ロイシン−ロイシン−プロリン−アスパラギン酸−Ｋ５）を形成する。
【００５５】
下記の実施例は本発明の新規化合物の調製をさらに例示するものである。
【実施例１】
【００５６】
ｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｅｋ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、ｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｅｋ−ＳＥＥＤ−Ｋ５、ｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｔｅｖ−ＳＥＥＤ−Ｋ５の構築
ＰＣＲを用いて、クリングル５ペプチドフラグメントを含むクリングル融合蛋白質を作製した。エンテロキナーゼ開裂部位Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号２）をコードし、その後にＳｅｒ残基及びプラスミノーゲンの残基４５０に始まり、配列番号１の残基４５３に及ぶＫ５ Ｎ末端コード配列が続く５’ＰＣＲプライマーを合成した：ＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡ（配列番号３）。エンテロキナーゼ開裂部位Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号２）をコードし、その後にプラスミノーゲンの残基４５８に始まり、配列番号１の残基４６１に及ぶＫ５ Ｎ末端コード配列が続く５’ＰＣＲプライマーを合成した：ＴＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧ（配列番号４）。タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ、ＴＥＶ）プロテアーゼ開裂部位Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（配列番号５）をコードし、その後にプラスミノーゲンの残基４５８に始まり、配列番号１の残基４６１に及ぶＫ５ Ｎ末端コード配列が続く５’ＰＣＲプライマーを合成した：ＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧ（配列番号６）。Ｋ５ Ｃ末端３’プライマーＴＴＡＴＴＡＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡ（配列番号７）も合成した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）５０μＬ、ｄＮＴＰ各々２００μＭ、ＡＴＰ ５００μＭ、適切な５’プライマー及び３’プライマー及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの１つを各々０．５μＭ使用して、別々にＰＣＲフラグメントを作製した。３７℃で１５分間インキュベートした後、キナーゼとプライマーに、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及びＫ４−Ｋ５Ａプラスミドを含むＤｒａＩ消化したベクターｐＨＩＬ−Ｄ８（先に米国特許第６，０５７，１２２号に記述されている）約１０ｎｇを加えた。配列番号４と配列番号７をプライマーとして使用して、９４℃で１分間後、［９４℃１秒間、４０秒間；７２℃１秒間；５０℃１分間、３０秒間；７２℃１秒間、４分間］の２０サイクルを使用するサーモサイクルファイルでＰＣＲを実施し、Ｅｋ−ＳＥＥＤ−Ｋ５をコードする産物を生じた。配列番号３と７及び配列番号６と７をプライマーセットとして使用して、９４℃で１分間後、［９４℃１秒間、４０秒間；７２℃１秒間；５０℃２分間、３０秒間；７２℃１秒間、４分間］の２０サイクルを使用するサーモサイクルファイルでＰＣＲを実施し、それぞれＥｋ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びＴｅｖ−ＳＥＥＤ−Ｋ５をコードするＰＣＲ産物を生じた。次にＳ４００−ＨＲスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でＰＣＲ産物を精製した。
【００５７】
ｐＥＴ３２−Ｋａｎ発現ベクターを次のようにして構築した：ｐＥＴ３２ａ ＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をＢｐｕ１１０２Ｉ＋ＳａｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で切断し、３４２６ｂｐフラグメント（マップ位置８１−３５０７）をアガロースゲル電気泳動によって精製した。ｐＥＴ２４ｄ ＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）もＢｐｕ１１０２Ｉ＋ＳａｐＩで切断し、Ｋａｎ遺伝子を含む２３４１ｂｐフラグメント（マップ位置３０４７−８１）をアガロースゲル電気泳動によって精製した。迅速ライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて２つのフラグメントをライゲートし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をライゲーション混合物で形質転換し、ＬＢ−Ｋａｎ寒天平板（Ｍｉｃｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｏｍｂａｒｄ，ＩＬ）に塗布した。個々のコロニーをＬＢ−Ｋａｎ培地で増殖させ、ミディプレップキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーターを含むコード領域のＤＮＡ配列をＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。
【００５８】
ｐＥＴ３２−Ｋａｎ １μｇをＢｇｌＩＩ＋ＸｈｏＩで消化し、次に末端を充填して、先に述べられているように（米国特許第６，０５７，１２２号、前出）ＤＮＡをホスファターゼ処理し、精製した。このｐＥＴ３２−Ｋａｎベクター１μＬ（約１０ｎｇ）とＫ５ ＰＣＲ産物１μＬを、先に述べたような迅速ライゲーションキットを用いて５．２５μＬの容量でライゲートした。次に各々のライゲーション混合物１μＬをＨＭＳ１７４（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）２０μＬに形質転換した。ＬＢ−カナマイシン寒天上で組換え細胞を選択した。先に述べられているように（米国特許第６，０５７，１２２号、前出）コロニーを正しいサイズと方向のインサートの存在に関してＰＣＲによってスクリーニングした。その後正しいコロニーを、ＤＮＡ塩基配列確認用のプラスミドＤＮＡの単離のため、及び先に述べられているような（米国特許第６，０５７，１２２号、前出）小規模発現試験のために増殖させた。
【実施例２】
【００５９】
ｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｔｅｖ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びｐＥＴ３２−Ｋａｎ−Ｔｅｖ−ＬＬＰＤ−Ｋ５の構築
ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（配列番号５）をコードし、１個はＳｅｒ残基を伴い、１個はＳｅｒ残基を伴わず、その後にプラスミノーゲンの残基４５０に始まり、配列番号１の残基４５３に及ぶＫ５ Ｎ末端コード配列が続く、２個の５’ＰＣＲプライマーを合成した：
ＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡ（配列番号８）及びＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡＣＴＣ（配列番号９）。Ｃ末端３’プライマーを上記の実施例１で述べたように調製した。氷上で薄壁試験管においてＰＣＲ反応を実施し、その後直接、あらかじめ９４℃に加熱しておいたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０サーモサイクラーブロックに移した。配列番号８と７及び配列番号９と７をプライマーセットとして使用して、９４℃で１分間後、［９４℃１秒間、４０秒間；８０℃１秒間；４５℃５分間、３０秒間；７２℃１秒間、８分間］の２５サイクルを使用するサーモサイクルファイルでＰＣＲを実施し、それぞれＴｅｖ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びＴｅｖ−ＬＬＰＤ−Ｋ５をコードするＰＣＲ産物を生じた。クローニングは上記の実施例１で述べたように実施した。
【実施例３】
【００６０】
融合蛋白質からのＫ５の単離と精製
（ａ）融合蛋白質の単離：実施例１及び２からのＥｋ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、Ｅｋ−ＳＥＥＤ−Ｋ５、Ｔｅｖ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、Ｔｅｖ−ＳＥＥＤ−Ｋ５又はＴｅｖ−ＬＬＰＤ−Ｋ５の細胞ペーストを−８０℃保存から取り出し、溶解緩衝液（５０ｍＭトリス、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．９、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、プロテアーゼ阻害剤（８７μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍＬアプロチニン、７８μｇ／ｍＬベンズアミジン、１μｇ／ｍＬロイペプチン、５μｇ／ｍＬフェナントロリン）（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２０μＬ／１００ｇ細胞ペースト）（ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）と混合した。懸濁液中の細胞を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて１１，０００ｐｓｉで溶解した。顕微鏡で確認したとき典型的な溶解は＞９０％であった。懸濁液を遠心分離によって（ＲＣＦ＝４℃、２２０００ｇで３０分間）清澄化した。上清をデカントし、バッチ法でＮｉ ＩＭＡＣ樹脂（Ｐｒｏｂｏｎｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と混合した。樹脂を溶解緩衝液で洗って非特異的結合蛋白質を除去した。溶解緩衝液中イミダゾールの階段勾配（５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、及び５００ｍＭ）で融合蛋白質を溶出した。純粋な融合蛋白質を濃縮し、緩衝液を透析によって開裂緩衝液（５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．９）（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に交換した。
【００６１】
（ｂ）エンテロキナーゼを用いた融合蛋白質の開裂：Ｅｋ融合蛋白質溶液を１ｍＭ ＣａＣｌ２の最終濃度で作製した。２８０ｎｍの吸光度で測定したとき融合蛋白質１グラム当たり０．８１６３から１４．３単位のエンテロキナーゼ（ＥＫＭａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を融合蛋白質に加えた。溶液を３７℃にして、開裂反応を２０から２４時間進行させた。開裂の進行を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察した。
【００６２】
（ｃ）ＴＥＶプロテアーゼを用いた融合蛋白質の開裂：Ｔｅｖ融合蛋白質溶液を１ｍＭ ＤＴＴ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の最終濃度で作製した。２８０ｎｍの吸光度で測定したとき融合蛋白質１グラム当たり７６．２から１３３０単位の組換えＴＥＶプロテアーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を融合蛋白質に加えた。溶液を３０℃にして、開裂反応を２０から２４時間進行させた。開裂の進行を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察した。
【００６３】
（ｄ）Ｋ５の単離：開裂溶液をバッチ法でＮｉ ＩＭＡＣ樹脂（Ｐｒｏｂｏｎｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と混合することにより、開裂したＫ５を単離した。開裂フロースルーを収集し、樹脂を開裂緩衝液で洗った。Ｋ５を含む洗浄液を開裂フロースルーと一緒にして、陰イオン交換樹脂（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ，ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に適用した。開裂緩衝液中線状ＮａＣｌ勾配（０ｍＭ−３００ｍＭ）を用いて純粋なＫ５を単離した。
【００６４】
適切な酵素で融合蛋白質を開裂して、以下ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、ＳＥＥＤ−Ｋ５、及び組換えＬＬＰＤ−Ｋ５と称する産物を得た。
【実施例４】
【００６５】
ＳＬＬＰＤ−Ｋ５のＮ末端の官能基化及びメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ、分子量２０，０００）との複合
基本的にＧａｅｒｔｎｅｒらがＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，７、３８−４４（１９９６）で述べたようにして、クリングル５ペプチドフラグメントＳＬＬＰＤ−Ｋ５を官能基化し、メトキシポリエチレングリコール（５−３０ｋＤ）と複合した。使用したプロトコールを下記に簡単に述べる。
【００６６】
（ａ）ＢＯＣ−ＡＯＡのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形成：室温の酢酸エチル（３０ｍＬ）中のＢＯＣ−アミノオキシ酢酸（ＢＯＣ−ＡＯＡ、１．９ｇ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍより購入した）の溶液を、酢酸エチル（３０ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシニミド（１．１５ｇ）の溶液で処理した。生じた混合物を酢酸エチル（５ｍＬ）中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０６ｇ）の溶液で処理し、１８時間攪拌してろ過し、濃縮した。濃縮物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）で粉砕し、ろ過して、生じた固体を真空下で乾燥して所望する生成物１．２ｇを得た。
ＭＳｍ／ｅ３０６（Ｍ＋ＮＨ４）＋；
１Ｈ ＮＭＲδ１．４８（９Ｈ），２．８８（４Ｈ），４．７８（２Ｈ）。
【００６７】
（ｂ）ＭｅＯ−ＰＥＧ２０ｋｄ−ＮＨ−ＣＯＣＨ２−Ｏ−ＮＨ（ＡＯＡ−ＰＥＧ２０ｋｄ）の形成：室温のアセトニトリル（４．５ｍＬ）のＭｅＯ−ＰＥＧ２０ｋｄ−ＮＨ２（１．５ｇ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ Ｉｎｃ．，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙより購入した）の溶液を実施例３Ａ（５０ｍｇ）及び４−メチルモルホリン（０．１ｍＬ）で処理し、２時間攪拌して、濃縮した。濃縮物を水（９ｍＬ）に溶解し、β−アラニン（１００ｍｇ）で処理して、２Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９．２に調整した。分子量３，５００のカットオフ透析管を使用して混合物を水（４リットルずつ２回交換）に透析し、その後凍結乾燥して、ＢＯＣ−ＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅを１．４ｇ得た。
【００６８】
室温のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、２．５ｍＬ）中のＢＯＣ−ＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１．４ｇ）の溶液を３時間放置し、濃縮して、水（５ｍＬ）で処理し、再び濃縮した。濃縮物を水（７．５ｍＬ）に溶解し、２Ｍ ＮａＯＨでｐＨ３．０に調整した。次に溶液を４℃の水に透析し（３．５ｋｄカットオフ透析管）、凍結乾燥した。生じた固体の一部（２９ｍｇ）を水（１ｍＬ）に溶解した。この溶液のアミノ−オキシ官能基を、５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０中ｍ−ニトロベンズアルデヒド（ＭＮＢＡ）と縮合して、分光測光法で評価した。過剰のＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅを含む、計量した量のＭＮＢＡの溶液からの定量的反応は、このアルデヒドの吸光度のモル上昇が、ｍＰＥＧ−オキシムに変換したとき２５５ｎｍで１２，４００であることを示した。アルデヒドが１．０ｍＭであるとき、ＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅの完全な反応は６０℃で１５分後に達成され、後者の重量で評価したときＡＯＡ−ＰＥＧ−ＯＭｅの濃度に対して１．５から２倍過剰であった。２９ｍｇ／ｍＬ溶液は０．９５ｍＭ（６８％活性）であり、２０，０００の分子量に基づき、１９ｍｇ／ｍＬのアルデヒド反応性ポリマーに等しいことが認められた。
【００６９】
（ｃ）ＳＬＬＰＤ−Ｋ５の酸化：１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８を含むトリス−Ｃｌ緩衝液に約１ｍｇ／ｍＬの精製ＳＬＬＰＤ−Ｋ５を加えた。Ｋ５、ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、及びＫ５のＰＥＧ複合体の蛋白質濃度を、１．０ｍｇ／ｍＬ溶液（１．０ｃｍ光路長、ｐＨ範囲４−８．５）がＯＤ＝１．７０を持つ場合の、２８０ｎＭでの光学密度から評価した。
【００７０】
ＳＬＬＰＤ−Ｋ５を０．１Ｍ ＮＨ４ＣＯ３（ｐＨ７．５−８）に透析し、次に３ｋｄカットオフ膜を通してろ過して、３．３ｍｇ／ｍＬに濃縮した。溶液（６６．６ｍＬ、２２０ｍｇクリングル５、分子量１０，５００）を１−メチオニン（５０ｍｇ）で処理して、５ｍＭの最終メチオニン濃度を得た。混合物を濃縮ＮＨ４ＯＨでｐＨ８．６に調整し、過ヨウ素酸ナトリウム（１８ｍｇ、４当量）で処理して、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−８ Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ４．６×２５０ｍｍ、０．１％ＴＦＡを含む水中アセトニトリル、ＣＨ３ＣＮを３０分間かけて５％から４０％まで上昇させる）によって観察した。１時間後、混合物をさらに１３．５ｍｇで処理して、さらに１時間攪拌し、プロパンジオール２０μＬで処理して、１時間攪拌し、１：１の氷酢酸／水でｐＨ４．８に調整した。混合物を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０（４Ｌ）に一晩透析し（３，５００分子量カットオフ膜）、質量スペクトル分析によって分析した結果、グリオキシリルクリングル５（１０，５１６）及びその水和物（１０，５３４）の存在を示唆した。
【００７１】
（ｄ）グリオキシリル−ＬＬＰＤ−Ｋ５とＡＯＡ−ＰＥＧの縮合：１：１の氷酢酸／水を１滴ずつ加えて実施例４（ｃ）の溶液（３ｍｇ／ｍＬ、６６．７ｍＬ、１９μｍｍｏｌ）をｐＨ４．０に調整した。０．９５ｍＭの実施例４（ｂ）（３４ｍＬ、３２μｍｍｏｌ、蛋白質に対して１．６８倍過剰）で溶液を処理して、３，５００分子量カットオフ膜と攪拌細胞を使用して、４時間かけてもとの容量の１／５に濃縮し、約１０ｍｇ／ｍＬの採集蛋白質濃度を得た。反応を２４時間継続させ、エタノール（０．１２ｍＬ）中の１００ｍＭ ｍ−ニトロベンズアルデヒドでクエンチングして、３０分間攪拌し、２Ｍトリス塩基でｐＨ７．８に調整して、所望する生成物を得た。
【００７２】
またｍＰＥＧを基本的に上記で述べたようにしてＳＥＥＤ−Ｋ５に結合させた。メトキシポリエチレングリコールに結合したＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びＳＥＥＤ−Ｋ５ペプチドを以下ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５と称する。
【実施例５】
【００７３】
ＰＥＧ化クリングルペプチドフラグメントの作製
クリングルペプチドフラグメント及び／又は天然に生じる又は非天然に生じるＮ末端セリンを持つクリングルペプチドフラグメントを作製するための当該技術分野において既知の方法（例えば組換え及び合成手法のような）を用いて、及び／又は下記のスキーム１と上記の実施例によって、下記の化合物を調製することができる：
（ａ）（プラスミノーゲンの）クリングル１−メトキシポリエチレングリコール複合体、
（ｂ）（プラスミノーゲンの）クリングル４−５−メトキシポリエチレングリコール複合体、及び
（ｆ）プロトンビンクリングル２−メトキシポリエチレングリコール複合体。
【００７４】
さらに、スキーム１と実施例１から５で概説する手順においてメトキシポリエチレングリコールを代替ポリアルキレングリコールに置き換えることにより、他のポリアルキレングリコールと上記のクリングルペプチドフラグメントの各々との複合体を合成することができる。
【実施例６】
【００７５】
内皮細胞移動アッセイ
ＨＭＶＥＣ（ヒト皮膚微小血管内皮細胞）の初代株を８０から９０％の集密度まで増殖させ、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗って、その後１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む最小培地（イーグルの平衡塩類溶液）中に１８時間放置した。細胞をＰＢＳで洗い、トリプシン処理して、２−５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、次に暗所でＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ（商標）（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ、Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）と共にインキュベートすることにより発蛍光団を充填した。培地中の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を９６穴プレートのウエルに入れ、次にこれらの溶液の上にフィルターを置いた。遠心分離し、再懸濁して、標識化の度合を評価した後、細胞を種々の量のｒＫ５（配列番号１のアミノ酸４５０位からアミノ酸５４３位まで）、精製ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又は精製ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５と共にこれらのウエルの上部に加えた。３７℃で４時間後、遊離細胞（移動していない）を上部フィルターからふき取り、蛍光を測定した。阻害因子を含まない対照ウエルにおいて移動した細胞数の画分としてデータを誘導し、表１に％阻害として示している。Ｓｅｍは平均の標準誤差を表わす。
【００７６】
【表１】
【００７７】
表１が示すように、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５及びｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、非ＰＥＧ化ｒＫ５と同程度に、それよりも大きな度合ではないにしても、内皮細胞移動を阻害した。
【実施例７】
【００７８】
サルの薬物動態
すべての試料をリン酸緩衝食塩水中で１．１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。体重３から６ｋｇの９匹のカニクイザルを投与の前に一晩絶食させたが、水は自由に摂取させた。投与の約３時間後にサルに食餌を与えた。試験期間中、動物は個体別に収容した。
【００７９】
この試験は、３群のサルにおいて平行して実施した；各々の群は３匹の動物を含んだ。すべての動物に、１ｍｇ／ｋｇ（０．９１ｍＬ／ｋｇ）の静脈内用量の化合物（ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５、ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５又は組換えＬＬＰＤ−Ｋ５のいずれか）を伏在静脈中に緩徐なボーラスとして投与した。投与前、投与後０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、６、９及び２４時間後に、ＥＤＴＡ保存血液試料（約３ｍＬ）を各動物の大腿動脈又は静脈から採取した。結果を下記の表２及び図２に示す。
【００８０】
【表２】
【００８１】
表２に示すように、サルにおいて静脈内投与したとき、ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５及びｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、組換えＬＬＰＤ−Ｋ５よりも２７倍長い半減期（ｔ１／２）と非ＰＥＧ化Ｋ５よりも１３倍緩やかなクリアランス速度（Ｃｌｐ）を示した。
【実施例８】
【００８２】
ＳＬＬＰＤ−Ｋ５のＮ末端とメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（ＰＥＧ−アルデヒド、分子量２０，０００の複合
基本的にＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，８７，１４４６−１４４９（１９９８）に述べられているように、クリングル５ペプチドフラグメントＳＬＬＰＤ−Ｋ５を官能基化し、メトキシポリエチレングリコール（５−３０ｋｄ）と複合した。プロトコールを下記で簡単に述べる。
【００８３】
（ａ）メトキシポリエチレングリコールアルデヒドの滴定：２ｍＭメトキシポリエチレングリコールアルデヒドの混合物（２００μＬ、Ｈ２Ｏ中４０ｍｇ／ｍＬ ）を１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルヒドラジン（２００μＬ、１０ｍＬエタノール中１５．３ｍｇ）で処理し、室温で２４時間インキュベートした。５０μＬアリコートを１００ｍＭ ＨＣｌで１．０ｍＬに希釈し、ｔ＝０及びｔ＝２４時間目に４０５ｎｍで吸光度を測定した。吸光度の変化（λ４０５＝０．６４、ｔ＝２４時間目）を３−フェニルプロパノール中のｐ−ニトロフェニルヒドラジンの５０μＭ標準品（λ４０５＝０．６７）と比較すると、予想されたものと比べて９６重量％のアルデヒド含量を示した。
【００８４】
（ｂ）メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとＳＬＬＰＤ−Ｋ５の縮合：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（２１．７ｍＬ、ｐＨ４．７）中のＳＬＬＰＤ−Ｋ５（３００ｍｇ）の混合物をメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（１．１４ｇ、０．０５７２ｍｍｏｌ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒより購入した）及び１Ｍ ＮａＯＨ中の５Ｍシアノホウ水素化ナトリウム（４３．４μＬ、０．２１７ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を室温で４８時間インキュベートし、反応の進行をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃ８ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラム、４．６×１５０ｍｍ；溶媒勾配：３０分間で５％から４０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ）によって観察した。混合物をさらなるメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（２００ｍｇ）とシアノホウ水素化ナトリウム（４３．４μＬ）で処理し、室温でさらに２４時間インキュベートした。
【００８５】
（ｃ）還元的アミノ化によって形成したｍＰＥＧ化−Ｋ５の精製：ｍＰＥＧ化−Ｋ５を、ｐＨ７．７の５０ｍＭトリス緩衝液、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＮａＮ３中３−７ｍｇ／ｍＬで保存した。ＰＥＧ化Ｋ５反応混合物を約１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、クロマトグラフィーのためにｐＨ５．０の２５ｍＭ酢酸ナトリウムを含む緩衝液（緩衝液Ａ）に透析した。ｐＨ５．０の２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いてＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）ＴＳＫ−ＳＰ５ＰＷカラムでクロマトグラフィーを実施した。蛋白質を溶出するためにＰｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムを用いてｐＨ５．０の２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対する勾配（緩衝液Ｂ）を作製した。様々な試料充填を行うために種々のサイズのカラムを使用したが、最も一般的に使用したのはＴＳＫ−ＳＰ５ＰＷ−ＨＲ（２×１５ｃｍ）であった。流速はカラムサイズと適合するように調整され、１．０から２．５ｍＬ／分と異なっていた。カラムを緩衝液Ａ中で平衡させ、あらかじめ緩衝液Ａ中に透析した試料を充填した。次に３カラム容量までの緩衝液Ａでカラムを洗って過剰のｍＰＥＧ−アルデヒドを除去し、除去後２８０ｎｍで吸光度を測定した。カラムを洗った後、緩衝液Ａから２５％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＮａＣｌ）まで２から３カラム容量で勾配を開始した。吸光度が基線値に回復するまで５０ｍＭ ＮａＣｌに保持して勾配を適用した。その時点で勾配を１００％緩衝液Ｂ（２００ｍＭ ＮａＣｌに上昇させて非反応Ｋ５を溶出した。３つのピークが５０ｍＭ ＮａＣｌ「保持勾配（ｈｏｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ）」段階で溶出した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析は、最初の（小さな）ピークが約９０，０００分子量（おそらくジ−ｍＰＥＧ化産物）であることを示唆した。２番目の小さなピークは約５０，０００Ｄａで溶出し、やはり５０，０００Ｄａ付近でゲル上を移動する３番目の（主要な）ピークと分離された。主要ピークからの分画をＳＤＳ ＰＡＧＥによってプールした。主要ピーク（全体の８０から９０％）を下記の方法によって純度と同一性に関してさらに特徴づけ、Ｎ末端モノ−ＰＥＧ化Ｋ５であると判定した。
【００８６】
Ｎ末端モノ−ＰＥＧ化Ｋ５を特徴付けるために使用した方法：
１．質量分析法；
２．モノ−Ｓ（ＨＲ）での分析クロマトグラフィー；
３．モノ−Ｑ（ＨＲ）での分析クロマトグラフィー；
４．ＴＳＫフェニル５ＰＷでの疎水性相互作用；
５．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＨＲ）でのゲルろ過；
６．臭化シアン開裂；
７．Ｎ−末端塩基配列決定法；及び
８．アミノ酸組成物分析。
【実施例９】
【００８７】
ｍＰＥＧ化クリングルペプチドフラグメントの作製
クリングルペプチドフラグメント及び／又は天然に生じる又は非天然に生じるＮ末端セリンを持つクリングルペプチドフラグメントを作製するための当該技術において既知の方法（例えば組換え及び合成手法のような）を用いて、及び／又は下記のスキーム２と上記の実施例によって、下記の化合物を調製することができる：
（ａ）（プラスミノーゲンの）クリングル１−メトキシポリエチレングリコール複合体、
（ｅ）（プラスミノーゲンの）クリングル４−５−メトキシポリエチレングリコール複合体、及び
（ｆ）プロトンビンクリングル２−メトキシポリエチレングリコール複合体。
さらに、スキーム２と実施例８で概説する手順においてメトキシポリエチレングリコールを代替ポリアルキレングリコールに置き換えることにより、他のポリアルキレングリコールと上記のクリングルペプチドフラグメントの各々との複合体を合成することができる。
【実施例１０】
【００８８】
サルの薬物動態
カニクイザルにおいて１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）で静脈内投与を実施した。ウエスタンブロット分析によって血漿濃度を測定した。結果を表３に示す。
【００８９】
【表３】
【００９０】
表３が示すように、２０ｋＤｍＰＥＧによるＮ末端でのｍＰＥＧ化は、非ｍＰＥＧ化Ｋ５と比較してサルにおける血漿からのクリアランスを劇的に低下させる。還元的アミノ化を通して実現されるｍＰＥＧ化は、オキシム形成によるｍＰＥＧ化と比べてより緩やかなクリアランスをもたらす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又はｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５から成る複合クリングルペプチドフラグメントを含む、抗血管新生治療による疾患治療のための医薬組成物であって、
ただし、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５０−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコール及びセリンを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドであって、
ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５８−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコールを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項２】
疾患が、癌、関節炎、黄斑変性、及び糖尿病性網膜症から成る群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
疾患が癌である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
疾患が、原発性及び転移性固形腫瘍、がん腫、肉腫、リンパ腫、乾癬、及び血管腫から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又はｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５から成る複合クリングルペプチドフラグメントを含む、個体において内皮細胞増殖を抑制するための医薬組成物であって、
ただし、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５０−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコール及びセリンを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドであって、
ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５８−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコールを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項６】
有効量のｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又はｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５から成る複合クリングルペプチドフラグメントを内皮細胞に投与することを含む、インビトロで内皮細胞増殖を抑制する方法であって、
ただし、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５０−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコール及びセリンを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドであって、
ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５８−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコールを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドである、前記方法。
【請求項１】
ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又はｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５から成る複合クリングルペプチドフラグメントを含む、抗血管新生治療による疾患治療のための医薬組成物であって、
ただし、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５０−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコール及びセリンを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドであって、
ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５８−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコールを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項２】
疾患が、癌、関節炎、黄斑変性、及び糖尿病性網膜症から成る群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
疾患が癌である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
疾患が、原発性及び転移性固形腫瘍、がん腫、肉腫、リンパ腫、乾癬、及び血管腫から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又はｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５から成る複合クリングルペプチドフラグメントを含む、個体において内皮細胞増殖を抑制するための医薬組成物であって、
ただし、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５０−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコール及びセリンを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドであって、
ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５８−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコールを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項６】
有効量のｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５又はｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５から成る複合クリングルペプチドフラグメントを内皮細胞に投与することを含む、インビトロで内皮細胞増殖を抑制する方法であって、
ただし、ｍＰＥＧ−ＳＬＬＰＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５０−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコール及びセリンを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドであって、
ｍＰＥＧ−ＳＥＥＤ−Ｋ５は、配列番号１の４５８−５４３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、メトキシポリエチレングリコールを該アミノ酸配列のＮ末端に結合させた前記ペプチドである、前記方法。
【公開番号】特開２００８−２３１１０７（Ｐ２００８−２３１１０７Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９５６９２（Ｐ２００８−９５６９２）
【出願日】平成２０年４月２日（２００８．４．２）
【分割の表示】特願２００２−５３１１６５（Ｐ２００２−５３１１６５）の分割
【原出願日】平成１３年９月２７日（２００１．９．２７）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２日（２００８．４．２）
【分割の表示】特願２００２−５３１１６５（Ｐ２００２−５３１１６５）の分割
【原出願日】平成１３年９月２７日（２００１．９．２７）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]