新属シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属に属する微生物および微生物製剤並びに経口組成物
【課題】消化管において良好な付着性と定着性を有し、下痢や疝痛（せんつう）の予防・治療効果を有し、またストレス軽減効果などプロバイオティクス効果を有するとともに、ダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオール産生能を有する微生物を提供する。
【解決手段】ストレス軽減作用を有する下記菌学的性質を示すシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物：（１）細菌の形態；桿菌、（２）運動性；無、（３）胞子形成；無、（４）グラム染色性；陽性、（５）カタラーゼ反応；陰性、（６）酸素に対する態度；絶対嫌気性、（７）Ｇ＋Ｃ含量；３６〜３８ｍｏｌ％。
【解決手段】ストレス軽減作用を有する下記菌学的性質を示すシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物：（１）細菌の形態；桿菌、（２）運動性；無、（３）胞子形成；無、（４）グラム染色性；陽性、（５）カタラーゼ反応；陰性、（６）酸素に対する態度；絶対嫌気性、（７）Ｇ＋Ｃ含量；３６〜３８ｍｏｌ％。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス軽減効果を有する新属であるシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属に属する微生物および当該微生物を含有する微生物製剤並びに当該微生物の発酵物を含有する経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛や豚、馬などの哺乳動物の飼育においては、消化器疾患がしばしば問題となり、例えば、馬の飼育における、疝痛（せんつう）や下痢症などの消化器疾患は、消化吸収に影響を及ぼし栄養障害につながるため、馬の発育を阻害する要因となる。特に仔馬はこのような消化器疾患を発症しやすく、生後６ヶ月までに約７０〜８０％の仔馬が何らかの下痢を発症することが報告されている。このような下痢や腸炎の原因となる病原微生物の報告はあるが、仔馬の場合は不顕性保菌馬も多いため、効果的な治療法がとれず下痢状態が長期間に及ぶ場合もある。したがって、腸内フローラの状態を改善し下痢症などの消化器疾患を予防・治療することが望まれていた。
【０００３】
一方、馬は家畜として人に飼育され、競走用、使役用、ホースセラピー用などの用途に使用されており、様々なストレスに曝される。例えば競走馬であれば、調教や輸送などにおいて多大なストレスを受け、輸送熱などの症状となって顕れることもある。したがって、日常飼育の中でのストレスを軽減することも望まれていた。
【０００４】
近年、馬に対して下痢の予防や治療、増体重の促進を目的として、乳酸菌を添加した飼料が使用されている。しかしながら、従来の乳酸菌では、馬の有用な腸内フローラの形成には有効に働かず下痢症などを十分に予防、治療することができないものであった。さらに、馬に対してストレス軽減効果を有する乳酸菌に近縁の微生物はこれまで知られていなかった。
【０００５】
また、女性、男性共に存在するエストロゲンのもつ選択的エストロゲン受容体モヂュレーターは近年、骨粗鬆症の治療薬として、また動脈硬化に対する効果が示唆されている。植物中に含まれる植物エストロゲンの存在は以前より知られ、例えば大豆に豊富に含まれるゲニステインやダイゼインは代表的なイソフラボンであり、植物エストロゲンとして作用することが知られている。このダイゼインは摂取された後に腸内細菌叢によって代謝を受けてダイハイドロダイゼインを経てエクオールに変換される（非特許文献１）。
【０００６】
最近の研究において、これらダイゼインの代謝産物であるダイハイドロダイゼインやエクオールが、エストロゲン受容体α，βのいずれに対しても活性を有することが報告されている。しかしながら、ヒトにおいて、このダイゼインの代謝を司る腸内細菌叢を有する割合は約３０％程度にすぎないとされており、かかる腸内細菌叢を有さないヒトでは、ダイゼインを摂取してもその代謝産物による効果が得られないと考えられる（非特許文献２）。
【０００７】
したがって、ダイゼインからダイハイドロダイゼインやエクオールを産生する微生物を摂取するか、または産生されたダイハイドロダイゼインやエクオールを直接摂取することにより、これらの成分によるエストロゲン受容体活性作用を介し骨成分の増強効果などの種々の生理活性が期待できるが、このようなダイハイドロダイゼインやエクオールの産生能を有する微生物はこれまでほとんど知られていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇ Ｈ．Ｈ．， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ａ．Ｒ． ａｎｄ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒ．Ｈ．， Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｄａｉｚｅｉｎ ａｎｄ ｅｑｕｏｌ ａｓ ｍｏｎｏｓｕｌｆａｔｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｕｌｆａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｙｉｎｇ ｈｅｎ． Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，２２３−２３０（１９７５）．
【非特許文献２】大豆に含まれるゲニステイン、ダイゼインおよびその代謝産物エクオールの分子生物学的薬理作用の検討およびその生体内濃度の臨床的意義、大豆たん白質研究、９，１５３−１５７（２００６）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は、哺乳動物の消化管中に良好な付着性と定着性を有し、下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療することができ、さらにはストレス軽減効果などプロバイオティクス効果を有するとともに、ダイゼインを資化してダイヒドロダイゼインやエクオールを産生する能力を有する微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、馬の腸内に常在する乳酸菌の分布や構成を調べ、それらの馬の消化管由来株の分離同定を行う過程で、乳酸菌と類似の性質をもつが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統樹では、Ｍｏｌｉｃｕｔｅｓ綱に属する４種の未同定菌株を分離した。そしてその菌株を馬に投与することにより、馬の下痢や疝痛の発生を予防・治療することができ、また馬およびラットに対してストレス軽減効果を奏することを見出した。さらにこの菌株は、ダイゼインを資化し、ダイヒドロダイゼインおよびエクオール産生能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、ストレス軽減作用を有する下記菌学的性質を示すシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物である。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％
【００１２】
また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を含有する微生物製剤である。
【００１３】
また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有することを特徴とする経口組成物である。
【００１４】
また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールの製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物は、消化管内での定着能が高く、馬などの哺乳動物に投与することにより有効に下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療できるとともに、ストレスを低減できるものである。また、ダイゼインを資化して、ダイヒドロダイゼインやエクオールを産生する能力を有するため、産生されたダイヒドロダイゼインやエクオールを摂取することによって、あるいはこのシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を摂取することにより、骨粗鬆症や動脈硬化などのエストロゲン受容体関連疾患を予防・治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の新属に属する微生物は、競走馬の糞便より分離されたものである。すなわち、健常なサラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない７℃以下の冷蔵で運搬した。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＬ寒天培地またはＬＢＳ寒天培地（ともに栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養して形成されたコロニーからＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９の４種の未同定株を分離した。
【００１７】
これらのうち、ＳＴ１８株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌
（２）細菌の大きさ： ０．７〜１×２〜１０μｍ
（３）運動性：無
（４）胞子：無
【００１８】
このＳＴ１８株の顕微鏡写真を図１に示す。
【００１９】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）ＡＢＣＭブイヨン寒天培地での培養：
３７℃、２４時間培養により、直径１〜２．５ｍｍ程度のやや不規則な円形状
で扁平状に隆起し、周縁は波状、表面は円滑で、露滴状の構造であって、褐色で
透明、硬度は脂状のコロニーを生じる。
（２）ＡＢＣＭブイヨン液体培地での培養：
３７℃、１５〜２４時間培養によって懸濁する。
（Ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（４）乳酸発酵：ヘテロ型
（５）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｄ型
（６）グルコースからのガス発生：あり
（７）生育の範囲
温度 １５℃ なし
４５℃ あり
（８）耐塩性 ３％耐塩性
（９）糖類からの酸生成の有無
ＡＰＩ ５０ ＣＨ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ社製）を用いた。
（＋酸生成あり、＋／−酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
Ｄ−アラビノース −
リボース −
Ｄ−キシロース −
ガラクトース ＋
グルコース ＋
フラクトース ＋
マンノース ＋
ラムノース −
マンニトール −
ソルビトール −
サリシン −
セロビオース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
トレハロース −
メレジトース −
ラフィノース −
デンプン ＋
グルコン酸 −
【００２０】
（ｄ）化学分類学的性質
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Ｍｅｓｂａｈらの方法（Ｍｅｓｂａｈ Ｍ．， Ｐｒｅｍａｃｈａｎｄｒａｎ Ｕ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｍａｎ Ｗ．Ｅ．， Ｐｒｅｃｉｓｅ ｍｅａｓｕｒｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｇ＋Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３９，１５９−１６７（１９８９）によって測定した。
Ｇ＋Ｃ含量：３７．４ｍｏｌ％
（２）細胞壁のアミノ酸組成
アミノ酸組成：アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、メソジ
アミノピメリン酸
ペプチドグリカンタイプ：Ａ１γ、（Ｌ−Ａｌａ）−Ｄ−Ｇｌｕ−ｍ−Ｄｐｍ
【００２１】
（３）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定）
コロニーＰＣＲにより、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いた。
【００２２】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００２３】
決定したＳＴ１８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列１に示す。
【００２４】
（相同性検索）
このＳＴ１８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁のＬ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔ（アクセッションナンバー：Ｍ２３７２９）との相同性は８９．９％であった。配列表の塩基配列１に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００２５】
（系統解析）
さらに解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ Ｗにより系統樹を作成した。図２は、クロストリジウムクラスターＸＶ〜ＸＩＸに属する既知の種とＳＴ１８株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、括弧内の記号はアクセッションナンバーである。
【００２６】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、Ｅｚａｋｉらの蛍光検出によるマイクロプレート法（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３９，２２４−２２９（１９８９））により行った。３株の近縁菌種の基準株（Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１Ｔ、Ｌ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔ、Ｃ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔ）を、ＳＴ１８株と比較するのに使用した。
【００２７】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
Ｃ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔ：１５．６％
Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１Ｔ：１４．３％
Ｌ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔ：０．７％
【００２８】
このように、ＳＴ１８株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が２０％未満の低い相同性しか示さなかった。本発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株（Ｃ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔ、Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１Ｔ、Ｌ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔ）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００２９】
以上の化学分類学的性質により、ＳＴ１８株は、クロストリジウムクラスターＸＶＩＩに含まれるいずれの属にも属さない新属の微生物であると判断され、シャーペア属（Ｓｈａｒｐｅａ）に属するシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａ ａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）と命名された。このシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００として寄託した。
【００３０】
ＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９についても同様にして分類学的性質を調べた。Ｃ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔ、Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１Ｔ、Ｌ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔの結果も併せて表１に示す。
【００３１】
【表１】
＊ Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１ＴおよびＣ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔについては、Ｓｈａｒｐｅａ Ｍ．Ｅ．， Ｌａｔｈａｍ Ｍ．Ｊ．， Ｇａｒｖｉｅ Ｅ．Ｉ． Ｚｉｒｎｇｉｂｌ Ｊ． ａｎｄ Ｋａｎｄｌｅｒ Ｏ．， Ｔｗｏ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｍｅｎ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ． ａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７７，３７−４９（１９７３）とＫａｇｅｙａｍａ Ａ． ａｎｄ Ｂｅｎｎｏ Ｙ．， Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ｇｅｎ． ｎｏｖ．， ｓｐ． ｎｏｖ．， ａ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｆａｅｃｅｓ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｅｖｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０，１５９５−１５９９（２０００）のデータをそれぞれ用いた。
＋：陽性、−：陰性、ｗ：弱陽性、ＮＴ：試験せず
【００３２】
ＳＴ１８株とこれら３種の菌株は下記の共通する性質を有する。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％
【００３３】
また、ＳＴ１８のＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９に対するＤＮＡ−ＤＮＡ相同性は、それぞれ、８１．８、９３．１、８９．２％であった。一般にＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が７０％以上であると同種であるとされる（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ Ｅ．Ｇ． ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ Ｂ．Ｍ．， Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｎｏｔｅ： ａ ｐｌａｃｅ ｆｏｒ ＤＮＡ−ＤＮＡ ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４４：８４６−８４９（１９９４））。
【００３４】
さらにこれら４種の１６Ｓ ｒＲＮＡ相同性を調べたところ、９９％以上の相同性を示した。
【００３５】
以上より、ＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０およびＤＩ４９は、同種に属する微生物であると判断された。ＳＴ１８は、シャーペア・アザブエンシスの基準株である。
【００３６】
上記本発明のシャーペア属（Ｓｈａｒｐｅａ）微生物を得るには、通常の培養方法に準じて培養を行えばよい。例えば、ＡＢＣＭブイヨン培地に接種し、３７℃で２４時間培養して得ることができる。
【００３７】
本発明の微生物製剤は、上記のように培養した本発明の微生物の培養液をそのまま用いることもできるが、遠心分離等の手段を用いて集菌した菌体をスキムミルク等に分散して懸濁液として用いてもよい。さらに、培養液や懸濁液を凍結乾燥等により乾燥させた乾燥菌体として用いることもできる。
【００３８】
本発明の微生物製剤の剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができ、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等の賦形剤やその他フラクトオリゴ糖など各種のプロバイオティクス成分等の任意成分を配合することもできる。
【００３９】
かくして得られた本発明の新規微生物を馬などの哺乳動物に投与することにより、微生物が消化管に付着・定着し、下痢や疝痛等の消化器疾患を予防・治療することができ、またストレスを軽減させることができる。さらに、摂取したダイゼインを代謝して、ダイハイドロダイゼインやエクオールを産生することができるため、これらのエストロゲン受容体活性化作用により骨増強効果等を得ることができる。投与量は１頭当たり１日に１×１０６〜１×１０１１ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、特に１×１０７〜１×１０１０ｃｆｕ程度が好ましい。なお、本発明においてストレスの軽減とは、本発明製剤の投与前後で血清アルブミンのフリーのＳＨ基保有率が例えば、対照群３頭の平均から、試験群の平均が１．５倍以上増加することをいう。
【００４０】
本発明の微生物製剤は、哺乳動物に直接経口投与してもよく、飼料や餌等に混ぜて投与してもよい。なお、本発明の微生物製剤の投与対象である哺乳動物としては、ヒト、馬、牛、豚、ヒツジ、山羊等が例示できる。
【００４１】
本発明の経口組成物は、上記微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有するものである。このダイゼイン含有物としては、精製されたダイゼインだけでなく、ダイゼインを含有する大豆、その大豆を原料とした食品である豆乳、豆腐、納豆、そして、クズ、葛根、グワーオクルア、ザクロなども含まれる。
【００４２】
発酵にあたっては、上記ダイゼイン含有物を基質として通常の発酵方法に従って上記シャーペア属微生物を培養することにより行うことができる。すなわち、ＡＢＣＭブイヨン培地、ＭＲＳ液体培地（Ｏｘｏｉｄ）、ＧＡＭ液体培地（日水製薬）等の栄養培地または牛乳、豆乳などの食品素材に、滅菌したダイゼイン含有物およびシャーペア属微生物を添加し、３７℃程度で３〜５日間程度発酵させることにより行うことができる。基質となるダイゼイン含有物は、ダイゼインの含有量を２００ｍＭ以上添加することが好ましい。また、微生物の接種量は、０．２〜１．０％程度が好ましい。
【００４３】
本発明の経口組成物は上記発酵物をそのまま食品や医薬品の形態として用いることができるが、常法にしたがって、ダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールを分離・精製してもよい。分離・精製方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いる方法が例示できる。
【００４４】
上記発酵物または分離精製したダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールを、適当な飲食品原料または医薬用担体を用いて本発明の経口組成物を調製することができる、飲食品形態としては、例えば、乳酸菌飲料、ヨーグルト等の発酵乳、野菜の発酵物（漬物）等が例示できる。
【００４５】
医薬品形態とするための医薬用担体としては、例えばブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等が挙げられ、また剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができる。
【００４６】
医薬用経口組成物の投与量は、疾患の程度、被投与者の年齢等によって異なるが、一般には、大人１日当たりダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールとして１００ｎＭ〜１，０００ｎＭ程度となる量を投与すれば良い。本発明の医薬用経口組成物は、有効成分であるダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールのエストロゲン受容体活性作用により、動脈硬化や骨粗鬆症の予防・治療効果を奏する。
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
実 施 例 １
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の培養：
ＡＢＣＭブイヨン培地（栄研化学社製）５Ｌをフラスコに入れ、ｐＨを７．２に調整しオートクレーブで、１１５℃、１５分間の滅菌を行った。このＡＢＣＭブイヨン培地に、予め、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）で４８時間培養したコロニーを釣菌し、ＡＢＣＭブイヨン培地で２４時間のプレ培養したシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株培養液を０．２容量％接種し、３７℃、２４時間静置培養した。この培養液を３０００×ｇで遠心分離し集菌して湿重量約４ｇ／５Ｌの菌体ペレットを得た。
【００４９】
実 施 例 ２
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株含有微生物製剤の調製：
実施例１により得られた菌体ペレットを生理食塩水で洗浄した。その菌体ペレット
４ｇ（湿重量）を滅菌１０％スキムミルク４６ｍｌに懸濁し、凍結乾燥処理をして凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に５質量倍のスキムミルク粉末を加えて均一に混合して本発明の微生物製剤を得た。この微生物製剤は、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を４.５×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有するものであった。
【００５０】
試 験 例 １
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の消化管付着性試験１：
実施例１で得られた菌体ペレット４ｇ（湿重量）を、あらかじめ滅菌しておいた１０％スキムミルク溶液４６ｍｌに懸濁し−８５℃で急冷した。融解試験を行ったところ、１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌの生菌数が認められた。この懸濁液１ｍｌを１０ｍｌの滅菌１０％スキムミルク溶液に再懸濁して試料とした。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１１ｍｌを５日間連日、シリンジで経口投与した（試験区）。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、１１ｍｌの滅菌１０％スキムミルクを５日間連続で経口投与した。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
対照区では、ほとんど菌数の変化は見られなかったが、試験区では菌数が1オーダー増加していることから、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００５３】
試 験 例 ２
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の下痢症・疝痛予防効果：
試験例１において、それぞれの馬について試料投与開始から３０日間糞便の状態を観察し、各試験区について軟便が確認された延べ日数を調べた。対照区では、延べ８日間の軟便が確認されたのに対し、試験区では、軟便は認められなかった。また、対照区では、延べ５日間の疝痛の徴候が確認されたのに対し、試験区では疝痛の徴候はみられなかった。したがって、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が有する馬への下痢症・疝痛予防効果が認められた。
【００５４】
試 験 例 ３
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の消化管付着性試験２：
実施例２により得られた微生物製剤を試料として用いた。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１．５ｇを飼葉０．５ｋｇの上に置いて投与する方法により５日間連続投与した（試験区）。完食を確認後、飼葉を自由摂取させた。試験例６とは別の個体を用いた。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、５日間、飼葉を自由摂取させた。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
この結果から、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株は、乾燥粉末投与によっても、定着後増殖しているものと考えられた。
【００５７】
試 験 例 ４
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の馬のストレス軽減効果：
哺乳動物のストレス度合いは、血清中のアルブミンにおけるフリーＳＨ基保有率を指標とした。馬のストレスが高くなるとアルブミン中のフリーＳＨ基が酸化されこの割合が低下すると考えられる。測定方法は、Ｆａｂｓｉａｋらの方法に準じた（Ｆａｂｓｉａｋ Ｊ．Ｐ．， Ｓｅｄｅｌｏｖ Ａ． ａｎｄ Ｋａｇｏｎ Ｖ．Ｅ．， Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｄａｔｉｖｅ／ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＹＳ３４ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｍｉｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ａｓｓａｙ， Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ，５，８５５−８６５（２００２））。
【００５８】
すなわち、試験例１および３のシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を含有する試料を投与したうちの３馬について、馬用微生物製剤投与５日間の５日目、その５日間の投与終了の１日目、投与終了９日後、投与終了１５日後、投与終了２２日後及び投与終了３０日後の血液を採取しその血清を得た（ＳＴ１８株投与群）。それから得られた馬血清を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.４）により１００倍に希釈したものをサンプルとした。次に、このサンプルの２５０μｌに２４０μＭのＴｈｉｏ−Ｇｌｏ１（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ製）を２５μｌ（終濃度２０μＭ）と、３６０ｍＭのＳＤＳ（終濃度３０ｍＭ）またはＰＢＳの２５μｌを加え、分注器で混合した。これとは別にスタンダードとしてＤＴＴで還元したＢＳＡの５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌを同様に用意した後、６０℃で４５分間反応させる。続いて室温にて１５分間インキュベートし、これを３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの蛍光波長で蛍光強度を測定した。また、サンプルの６０μｌに（−）ＢＰＢの４×サンプルバッファー２０μｌを添加しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。
このサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動後のゲルのバンドをトランスイルミネーター（フナコシ社製）で写真を撮り、強度を数値化した。続いてＣＢＢＲにて染色し写真撮影後、アルブミンとしてのタンパク量もＮＩＨ−Ｉｍａｇｅで求めた。この蛍光強度を、ｓｔａｎｄａｒｄ ＢＳＡの蛍光強度に換算した血清量／通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白定量から、血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を求めた。通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で求めた。対照として、試験例１および３において、ＳＴ１８株を投与しなかった馬のうち３頭について同様に試験した（ＳＴ１８株無投与群）。結果を図３に示す。
【００５９】
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群は、無投与群に比べて血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率が有意に高く、ストレスが軽減されている結果が得られた。また、そのストレス軽減効果は、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与を止めた４週間後でも持続していることが認められた。
【００６０】
試 験 例 ５
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のラットに対する拘束ストレス軽減効果：
ラットに拘束ストレスを負荷し、血中コルチコステロンの濃度を測定することによりストレス軽減効果を評価した。金属製の拘束装置を用い、ラットを８時間（午前０時〜午前８時）拘束した。拘束の前後で尾静脈からの採血を行いコルチコステロンの血中濃度を測定した。コルチコステロン量の測定は、ＡＣＴＩＶＥ Ｒａｔ Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＤＳＬ社、１０−８１１００）を用いてイムノアッセイ法で測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。微生物を与えない群をコントロールとした。５日目に拘束ストレスをかけ、前日の血中コルチコステロン濃度と拘束ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図４に示す。
【００６１】
コントロール群および微生物投与群ともにストレス負荷をかける前は、１００ｎｇ／ｍｌ未満の範囲であった。コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群はコントロール群に比べて、ストレス付加後の血中コルチコステロン濃度は低くなり、ストレス軽減効果が認められた。
【００６２】
試 験 例 ６
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のラットに対する強制水泳ストレス軽
減効果：
直径２０ｃｍ、高さ５０ｃｍのプラスチック製の円筒に２７℃の水を４０ｃｍまで入れ、ラットを１５分間の強制的に水泳をさせ、強制水泳前後で尾静脈から採血し血中コルチコステロン量を測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。微生物を与えない群をコントロールとした。５日目に強制水泳させ、前日の血中コルチコステロン濃度と強制水泳ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図５に示す。
【００６３】
コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。ＳＴ１８株投与群は、コントロール群に比べ、ストレス負荷後の血中コルチコステロン量が抑制され、ラットに対するストレス軽減効果があることがわかった。
【００６４】
試 験 例 ７
馬腸内フローラにおけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の分布（１）
国内各地の生産牧場および厩舎における０（当歳）〜３３歳までの様々な年齢の牡７頭、牝９頭の糞便を採取し、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によりシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を保有しているか調べた。その結果、ＳＴ１８株は１６頭中１４頭から検出されたことから、生産牧場や厩舎には関係なく、健常な馬の腸内フローラに普遍的に存在している微生物であると考えられる。したがって、本発明のシャーペア属微生物は馬に投与しても安全性の高いものである。
【００６５】
試 験 例 ８
馬腸内フローラにおけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の分布（２）
下記表５に示した健常なサラブレッド１２頭（Ａ〜Ｌ）の新鮮な糞便について、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＰＣＲ−ＤＧＧＥ）法により、シャーペア・アザブエンシスの分布を調べた。これらのサラブレッドは、糞便の採取１ヶ月以内に、生菌剤は使用していない。Ｗａｌｔｅｒら（Ｗａｌｔｅｒ Ｊ．， Ｈｅｒｔｅｌ Ｃ．， Ｔａｎｎｏｃｋ Ｇ．Ｗ．， Ｌｉｓ Ｃ．Ｍ．， Ｍｕｎｒｏ Ｋ． ａｎｄ Ｈａｍｍｅｓ Ｗ．Ｐ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ， ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｃｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７，２５７８−２５８５（２００１））の文献に基づくＰＣＲ条件と、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のＮｏ．３４１−５３４領域で３４０ｂｐを増幅させる下記のプライマーＬａｃ１とＬａｃ２ＧＣを用いた。
【００６６】
＜ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｃ１＞
５′−ＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡ−３′
＜ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｃ２ＧＣ＞
５′−ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＡＣ
ＣＧＧＧＧＧＡＴＴＹＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧ−３′
【００６７】
【表４】
【００６８】
ＤＧＧＥ泳動には、ＤＣｏｄｅシステム装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、各種糞便からシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の検出を試みた。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の検出は次のようにして行った。変性剤（尿素とホルムアミド）で３７．５％から５２．５％の濃度勾配をつけた８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルを用いた。Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液に浸して、６０Ｖで１４時間、泳動した。泳動後のゲルは、１０ ｍｇ／ｍｌ 臭化エチジウム溶液２５ μｌを添加した２５０ ｍｌ ＴＡＥ緩衝液で染色した。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のバンドの特定は、純粋培養したシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の移動度、およびそのバンドを切り出しての１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定によって、９８％以上の相同性のあるものをシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株とした。１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列決定も上記と同様の方法により行った。結果を図６に示す。
【００６９】
図６に示すとおり、１２頭中１０頭（Ａ〜Ｈ、Ｋ、Ｌ）のサラブレットからシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が検出された。この結果から、この菌種は、健常なサラブレッドの消化管内に広く分布し、またバンドの濃さの強弱は菌数を反映していることから、腸内フローラの中で優勢に生育していることが認められた。
【００７０】
試 験 例 ９
ダイハイドロダイゼインおよびエクオール産生：
９９０ｍｌの蒸留水にＡＢＣＭブイヨン培地（栄研）４６ｇを溶解し、オートクレーヴで１２１℃、１５分間の滅菌を行なった。室温にもどしたＡＢＣＭブイヨン培地に、フィルター滅菌した１０ｍｌ水溶液のダイゼインを２００μｌになるように添加した。ＳＴ１８を予めＡＢＣＭブイヨン培地で培養し、その培養液０．２％を接種して、スチールウール法にて嫌気し、３７℃で３６時間培養した。
その培養液について、Ｗａｎｇらの方法（Ｗａｎｇ Ｘ．Ｌ．， Ｈｕｒ Ｈ．Ｇ．， Ｌｅｅ Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｋｉｍ Ｓ．Ｉ．， Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓ−ｅｑｕｏｌ ｆｒｏｍ ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｂｙ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７１， ２１４−２１９（２００５））に基づくＨＰＬＣ法により、ダイゼイン、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールを定量した。標品として用いたダイゼインはＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、ダイハイドロダイゼインはＴｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから、エクオールはＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからそれぞれ購入した。ＨＰＬＣのクロマトグラムを図７に示す。
【００７１】
ＳＴ１８培養前のクロマトグラムでは、培地に予め添加したダイゼインのピークのみが検出された。培養３６時間後のクロマトグラムでは、ダイゼインのピークは予め添加した量のほぼ半分になり、図７のとおり、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールのピークが検出されたことから、そのダイゼインのピーク減少分が、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールに転換されていた。さらに３日間以上培養すると、ダイゼインとダイハイドロダイゼインを示すピークは完全に消失し、エクオールを示すピークが、培養３６時間時の２倍を示していた。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株は、ダイゼインを資化し、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールを産生する能力を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の新属であるシャーペア属微生物は、消化管に対して良好な付着性および定着性を示し、下痢や疝痛など消化器疾患の予防・治療効果を有し、またにストレス軽減効果などプロバイオティクス効果をも有するとともに、エストロゲン受容体活性を示すダイハイドロダイゼインおよびエクオール産生能を有するものである。
【００７３】
ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、弱い女性ホルモン（エストロゲン）作用を示す。ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、腸内細菌によりダイゼインから産生されるが、その産生能力は個人差が大きい。ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、女性の乳がんなど性ホルモンが関連する病気に影響を与えているのではないかと考えられている。また男性においても、前立腺がんは、性ホルモンと関連するがんで、女性ホルモンの働きをする薬や男性ホルモンの働きを押さえる薬が治療に使われてきた。本菌の作るダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、上記のような効果にも貢献する。
【００７４】
哺乳動物の糞便を用いることにより、安価、簡便かつ迅速なエクオール検出法（特願２００５−５５０５８号：特開２００６−２４２６０２号公報）が開発された。それにより、エクオール産生菌の有無を試験できるので、消化管内でエクオールを産生していない個体ごとに本菌の投与を行なうことも可能となる。
【００７５】
したがって、本発明の微生物は、哺乳動物に投与する微生物製剤やその発酵物を含有する飲食品または医薬品として有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の光学顕微鏡写真である。
【図２】クロストリジウムクラスターＸＶ〜ＸＩＸに属する既知の種とシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０およびＤＩ４９との関係を示した系統樹である。
【図３】試験例４において、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群と無投与群との血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を示す図である。
【図４】試験例５における、拘束ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図５】試験例６における、強制水泳ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図６】試験例８における、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のＰＣＲ−ＤＧＧＥ電気泳動図である。
【図７】試験例９における、培養３６時間後のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス軽減効果を有する新属であるシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属に属する微生物および当該微生物を含有する微生物製剤並びに当該微生物の発酵物を含有する経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛や豚、馬などの哺乳動物の飼育においては、消化器疾患がしばしば問題となり、例えば、馬の飼育における、疝痛（せんつう）や下痢症などの消化器疾患は、消化吸収に影響を及ぼし栄養障害につながるため、馬の発育を阻害する要因となる。特に仔馬はこのような消化器疾患を発症しやすく、生後６ヶ月までに約７０〜８０％の仔馬が何らかの下痢を発症することが報告されている。このような下痢や腸炎の原因となる病原微生物の報告はあるが、仔馬の場合は不顕性保菌馬も多いため、効果的な治療法がとれず下痢状態が長期間に及ぶ場合もある。したがって、腸内フローラの状態を改善し下痢症などの消化器疾患を予防・治療することが望まれていた。
【０００３】
一方、馬は家畜として人に飼育され、競走用、使役用、ホースセラピー用などの用途に使用されており、様々なストレスに曝される。例えば競走馬であれば、調教や輸送などにおいて多大なストレスを受け、輸送熱などの症状となって顕れることもある。したがって、日常飼育の中でのストレスを軽減することも望まれていた。
【０００４】
近年、馬に対して下痢の予防や治療、増体重の促進を目的として、乳酸菌を添加した飼料が使用されている。しかしながら、従来の乳酸菌では、馬の有用な腸内フローラの形成には有効に働かず下痢症などを十分に予防、治療することができないものであった。さらに、馬に対してストレス軽減効果を有する乳酸菌に近縁の微生物はこれまで知られていなかった。
【０００５】
また、女性、男性共に存在するエストロゲンのもつ選択的エストロゲン受容体モヂュレーターは近年、骨粗鬆症の治療薬として、また動脈硬化に対する効果が示唆されている。植物中に含まれる植物エストロゲンの存在は以前より知られ、例えば大豆に豊富に含まれるゲニステインやダイゼインは代表的なイソフラボンであり、植物エストロゲンとして作用することが知られている。このダイゼインは摂取された後に腸内細菌叢によって代謝を受けてダイハイドロダイゼインを経てエクオールに変換される（非特許文献１）。
【０００６】
最近の研究において、これらダイゼインの代謝産物であるダイハイドロダイゼインやエクオールが、エストロゲン受容体α，βのいずれに対しても活性を有することが報告されている。しかしながら、ヒトにおいて、このダイゼインの代謝を司る腸内細菌叢を有する割合は約３０％程度にすぎないとされており、かかる腸内細菌叢を有さないヒトでは、ダイゼインを摂取してもその代謝産物による効果が得られないと考えられる（非特許文献２）。
【０００７】
したがって、ダイゼインからダイハイドロダイゼインやエクオールを産生する微生物を摂取するか、または産生されたダイハイドロダイゼインやエクオールを直接摂取することにより、これらの成分によるエストロゲン受容体活性作用を介し骨成分の増強効果などの種々の生理活性が期待できるが、このようなダイハイドロダイゼインやエクオールの産生能を有する微生物はこれまでほとんど知られていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇ Ｈ．Ｈ．， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ａ．Ｒ． ａｎｄ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒ．Ｈ．， Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｄａｉｚｅｉｎ ａｎｄ ｅｑｕｏｌ ａｓ ｍｏｎｏｓｕｌｆａｔｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｕｌｆａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｙｉｎｇ ｈｅｎ． Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，２２３−２３０（１９７５）．
【非特許文献２】大豆に含まれるゲニステイン、ダイゼインおよびその代謝産物エクオールの分子生物学的薬理作用の検討およびその生体内濃度の臨床的意義、大豆たん白質研究、９，１５３−１５７（２００６）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は、哺乳動物の消化管中に良好な付着性と定着性を有し、下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療することができ、さらにはストレス軽減効果などプロバイオティクス効果を有するとともに、ダイゼインを資化してダイヒドロダイゼインやエクオールを産生する能力を有する微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、馬の腸内に常在する乳酸菌の分布や構成を調べ、それらの馬の消化管由来株の分離同定を行う過程で、乳酸菌と類似の性質をもつが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統樹では、Ｍｏｌｉｃｕｔｅｓ綱に属する４種の未同定菌株を分離した。そしてその菌株を馬に投与することにより、馬の下痢や疝痛の発生を予防・治療することができ、また馬およびラットに対してストレス軽減効果を奏することを見出した。さらにこの菌株は、ダイゼインを資化し、ダイヒドロダイゼインおよびエクオール産生能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、ストレス軽減作用を有する下記菌学的性質を示すシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物である。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％
【００１２】
また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を含有する微生物製剤である。
【００１３】
また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有することを特徴とする経口組成物である。
【００１４】
また本発明は、上記シャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールの製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物は、消化管内での定着能が高く、馬などの哺乳動物に投与することにより有効に下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療できるとともに、ストレスを低減できるものである。また、ダイゼインを資化して、ダイヒドロダイゼインやエクオールを産生する能力を有するため、産生されたダイヒドロダイゼインやエクオールを摂取することによって、あるいはこのシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を摂取することにより、骨粗鬆症や動脈硬化などのエストロゲン受容体関連疾患を予防・治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の新属に属する微生物は、競走馬の糞便より分離されたものである。すなわち、健常なサラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない７℃以下の冷蔵で運搬した。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＬ寒天培地またはＬＢＳ寒天培地（ともに栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養して形成されたコロニーからＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９の４種の未同定株を分離した。
【００１７】
これらのうち、ＳＴ１８株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌
（２）細菌の大きさ： ０．７〜１×２〜１０μｍ
（３）運動性：無
（４）胞子：無
【００１８】
このＳＴ１８株の顕微鏡写真を図１に示す。
【００１９】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）ＡＢＣＭブイヨン寒天培地での培養：
３７℃、２４時間培養により、直径１〜２．５ｍｍ程度のやや不規則な円形状
で扁平状に隆起し、周縁は波状、表面は円滑で、露滴状の構造であって、褐色で
透明、硬度は脂状のコロニーを生じる。
（２）ＡＢＣＭブイヨン液体培地での培養：
３７℃、１５〜２４時間培養によって懸濁する。
（Ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（４）乳酸発酵：ヘテロ型
（５）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｄ型
（６）グルコースからのガス発生：あり
（７）生育の範囲
温度 １５℃ なし
４５℃ あり
（８）耐塩性 ３％耐塩性
（９）糖類からの酸生成の有無
ＡＰＩ ５０ ＣＨ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ社製）を用いた。
（＋酸生成あり、＋／−酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
Ｄ−アラビノース −
リボース −
Ｄ−キシロース −
ガラクトース ＋
グルコース ＋
フラクトース ＋
マンノース ＋
ラムノース −
マンニトール −
ソルビトール −
サリシン −
セロビオース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
トレハロース −
メレジトース −
ラフィノース −
デンプン ＋
グルコン酸 −
【００２０】
（ｄ）化学分類学的性質
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Ｍｅｓｂａｈらの方法（Ｍｅｓｂａｈ Ｍ．， Ｐｒｅｍａｃｈａｎｄｒａｎ Ｕ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｍａｎ Ｗ．Ｅ．， Ｐｒｅｃｉｓｅ ｍｅａｓｕｒｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｇ＋Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３９，１５９−１６７（１９８９）によって測定した。
Ｇ＋Ｃ含量：３７．４ｍｏｌ％
（２）細胞壁のアミノ酸組成
アミノ酸組成：アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、メソジ
アミノピメリン酸
ペプチドグリカンタイプ：Ａ１γ、（Ｌ−Ａｌａ）−Ｄ−Ｇｌｕ−ｍ−Ｄｐｍ
【００２１】
（３）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定）
コロニーＰＣＲにより、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いた。
【００２２】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００２３】
決定したＳＴ１８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列１に示す。
【００２４】
（相同性検索）
このＳＴ１８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁のＬ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔ（アクセッションナンバー：Ｍ２３７２９）との相同性は８９．９％であった。配列表の塩基配列１に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００２５】
（系統解析）
さらに解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ Ｗにより系統樹を作成した。図２は、クロストリジウムクラスターＸＶ〜ＸＩＸに属する既知の種とＳＴ１８株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、括弧内の記号はアクセッションナンバーである。
【００２６】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、Ｅｚａｋｉらの蛍光検出によるマイクロプレート法（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３９，２２４−２２９（１９８９））により行った。３株の近縁菌種の基準株（Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１Ｔ、Ｌ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔ、Ｃ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔ）を、ＳＴ１８株と比較するのに使用した。
【００２７】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
Ｃ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔ：１５．６％
Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１Ｔ：１４．３％
Ｌ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔ：０．７％
【００２８】
このように、ＳＴ１８株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が２０％未満の低い相同性しか示さなかった。本発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株（Ｃ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔ、Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１Ｔ、Ｌ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔ）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００２９】
以上の化学分類学的性質により、ＳＴ１８株は、クロストリジウムクラスターＸＶＩＩに含まれるいずれの属にも属さない新属の微生物であると判断され、シャーペア属（Ｓｈａｒｐｅａ）に属するシャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａ ａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）と命名された。このシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００として寄託した。
【００３０】
ＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９についても同様にして分類学的性質を調べた。Ｃ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔ、Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１Ｔ、Ｌ． ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ ＪＣＭ １１４３Ｔの結果も併せて表１に示す。
【００３１】
【表１】
＊ Ｌ． ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ＪＣＭ １１２１ＴおよびＣ． ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ＪＣＭ ０６０９Ｔについては、Ｓｈａｒｐｅａ Ｍ．Ｅ．， Ｌａｔｈａｍ Ｍ．Ｊ．， Ｇａｒｖｉｅ Ｅ．Ｉ． Ｚｉｒｎｇｉｂｌ Ｊ． ａｎｄ Ｋａｎｄｌｅｒ Ｏ．， Ｔｗｏ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｍｅｎ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ． ａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７７，３７−４９（１９７３）とＫａｇｅｙａｍａ Ａ． ａｎｄ Ｂｅｎｎｏ Ｙ．， Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ ｇｅｎ． ｎｏｖ．， ｓｐ． ｎｏｖ．， ａ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｆａｅｃｅｓ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｅｖｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０，１５９５−１５９９（２０００）のデータをそれぞれ用いた。
＋：陽性、−：陰性、ｗ：弱陽性、ＮＴ：試験せず
【００３２】
ＳＴ１８株とこれら３種の菌株は下記の共通する性質を有する。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％
【００３３】
また、ＳＴ１８のＨＭ２４４、ＨＭ２５０、ＤＩ４９に対するＤＮＡ−ＤＮＡ相同性は、それぞれ、８１．８、９３．１、８９．２％であった。一般にＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が７０％以上であると同種であるとされる（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ Ｅ．Ｇ． ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ Ｂ．Ｍ．， Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｎｏｔｅ： ａ ｐｌａｃｅ ｆｏｒ ＤＮＡ−ＤＮＡ ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４４：８４６−８４９（１９９４））。
【００３４】
さらにこれら４種の１６Ｓ ｒＲＮＡ相同性を調べたところ、９９％以上の相同性を示した。
【００３５】
以上より、ＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０およびＤＩ４９は、同種に属する微生物であると判断された。ＳＴ１８は、シャーペア・アザブエンシスの基準株である。
【００３６】
上記本発明のシャーペア属（Ｓｈａｒｐｅａ）微生物を得るには、通常の培養方法に準じて培養を行えばよい。例えば、ＡＢＣＭブイヨン培地に接種し、３７℃で２４時間培養して得ることができる。
【００３７】
本発明の微生物製剤は、上記のように培養した本発明の微生物の培養液をそのまま用いることもできるが、遠心分離等の手段を用いて集菌した菌体をスキムミルク等に分散して懸濁液として用いてもよい。さらに、培養液や懸濁液を凍結乾燥等により乾燥させた乾燥菌体として用いることもできる。
【００３８】
本発明の微生物製剤の剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができ、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等の賦形剤やその他フラクトオリゴ糖など各種のプロバイオティクス成分等の任意成分を配合することもできる。
【００３９】
かくして得られた本発明の新規微生物を馬などの哺乳動物に投与することにより、微生物が消化管に付着・定着し、下痢や疝痛等の消化器疾患を予防・治療することができ、またストレスを軽減させることができる。さらに、摂取したダイゼインを代謝して、ダイハイドロダイゼインやエクオールを産生することができるため、これらのエストロゲン受容体活性化作用により骨増強効果等を得ることができる。投与量は１頭当たり１日に１×１０６〜１×１０１１ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、特に１×１０７〜１×１０１０ｃｆｕ程度が好ましい。なお、本発明においてストレスの軽減とは、本発明製剤の投与前後で血清アルブミンのフリーのＳＨ基保有率が例えば、対照群３頭の平均から、試験群の平均が１．５倍以上増加することをいう。
【００４０】
本発明の微生物製剤は、哺乳動物に直接経口投与してもよく、飼料や餌等に混ぜて投与してもよい。なお、本発明の微生物製剤の投与対象である哺乳動物としては、ヒト、馬、牛、豚、ヒツジ、山羊等が例示できる。
【００４１】
本発明の経口組成物は、上記微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有するものである。このダイゼイン含有物としては、精製されたダイゼインだけでなく、ダイゼインを含有する大豆、その大豆を原料とした食品である豆乳、豆腐、納豆、そして、クズ、葛根、グワーオクルア、ザクロなども含まれる。
【００４２】
発酵にあたっては、上記ダイゼイン含有物を基質として通常の発酵方法に従って上記シャーペア属微生物を培養することにより行うことができる。すなわち、ＡＢＣＭブイヨン培地、ＭＲＳ液体培地（Ｏｘｏｉｄ）、ＧＡＭ液体培地（日水製薬）等の栄養培地または牛乳、豆乳などの食品素材に、滅菌したダイゼイン含有物およびシャーペア属微生物を添加し、３７℃程度で３〜５日間程度発酵させることにより行うことができる。基質となるダイゼイン含有物は、ダイゼインの含有量を２００ｍＭ以上添加することが好ましい。また、微生物の接種量は、０．２〜１．０％程度が好ましい。
【００４３】
本発明の経口組成物は上記発酵物をそのまま食品や医薬品の形態として用いることができるが、常法にしたがって、ダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールを分離・精製してもよい。分離・精製方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いる方法が例示できる。
【００４４】
上記発酵物または分離精製したダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールを、適当な飲食品原料または医薬用担体を用いて本発明の経口組成物を調製することができる、飲食品形態としては、例えば、乳酸菌飲料、ヨーグルト等の発酵乳、野菜の発酵物（漬物）等が例示できる。
【００４５】
医薬品形態とするための医薬用担体としては、例えばブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等が挙げられ、また剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができる。
【００４６】
医薬用経口組成物の投与量は、疾患の程度、被投与者の年齢等によって異なるが、一般には、大人１日当たりダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールとして１００ｎＭ〜１，０００ｎＭ程度となる量を投与すれば良い。本発明の医薬用経口組成物は、有効成分であるダイハイドロダイゼインおよび／またはエクオールのエストロゲン受容体活性作用により、動脈硬化や骨粗鬆症の予防・治療効果を奏する。
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
実 施 例 １
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の培養：
ＡＢＣＭブイヨン培地（栄研化学社製）５Ｌをフラスコに入れ、ｐＨを７．２に調整しオートクレーブで、１１５℃、１５分間の滅菌を行った。このＡＢＣＭブイヨン培地に、予め、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）で４８時間培養したコロニーを釣菌し、ＡＢＣＭブイヨン培地で２４時間のプレ培養したシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株培養液を０．２容量％接種し、３７℃、２４時間静置培養した。この培養液を３０００×ｇで遠心分離し集菌して湿重量約４ｇ／５Ｌの菌体ペレットを得た。
【００４９】
実 施 例 ２
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株含有微生物製剤の調製：
実施例１により得られた菌体ペレットを生理食塩水で洗浄した。その菌体ペレット
４ｇ（湿重量）を滅菌１０％スキムミルク４６ｍｌに懸濁し、凍結乾燥処理をして凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に５質量倍のスキムミルク粉末を加えて均一に混合して本発明の微生物製剤を得た。この微生物製剤は、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を４.５×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有するものであった。
【００５０】
試 験 例 １
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の消化管付着性試験１：
実施例１で得られた菌体ペレット４ｇ（湿重量）を、あらかじめ滅菌しておいた１０％スキムミルク溶液４６ｍｌに懸濁し−８５℃で急冷した。融解試験を行ったところ、１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌの生菌数が認められた。この懸濁液１ｍｌを１０ｍｌの滅菌１０％スキムミルク溶液に再懸濁して試料とした。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１１ｍｌを５日間連日、シリンジで経口投与した（試験区）。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、１１ｍｌの滅菌１０％スキムミルクを５日間連続で経口投与した。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
対照区では、ほとんど菌数の変化は見られなかったが、試験区では菌数が1オーダー増加していることから、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００５３】
試 験 例 ２
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の下痢症・疝痛予防効果：
試験例１において、それぞれの馬について試料投与開始から３０日間糞便の状態を観察し、各試験区について軟便が確認された延べ日数を調べた。対照区では、延べ８日間の軟便が確認されたのに対し、試験区では、軟便は認められなかった。また、対照区では、延べ５日間の疝痛の徴候が確認されたのに対し、試験区では疝痛の徴候はみられなかった。したがって、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が有する馬への下痢症・疝痛予防効果が認められた。
【００５４】
試 験 例 ３
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の消化管付着性試験２：
実施例２により得られた微生物製剤を試料として用いた。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１．５ｇを飼葉０．５ｋｇの上に置いて投与する方法により５日間連続投与した（試験区）。完食を確認後、飼葉を自由摂取させた。試験例６とは別の個体を用いた。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、５日間、飼葉を自由摂取させた。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
この結果から、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株は、乾燥粉末投与によっても、定着後増殖しているものと考えられた。
【００５７】
試 験 例 ４
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の馬のストレス軽減効果：
哺乳動物のストレス度合いは、血清中のアルブミンにおけるフリーＳＨ基保有率を指標とした。馬のストレスが高くなるとアルブミン中のフリーＳＨ基が酸化されこの割合が低下すると考えられる。測定方法は、Ｆａｂｓｉａｋらの方法に準じた（Ｆａｂｓｉａｋ Ｊ．Ｐ．， Ｓｅｄｅｌｏｖ Ａ． ａｎｄ Ｋａｇｏｎ Ｖ．Ｅ．， Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｄａｔｉｖｅ／ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＹＳ３４ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｍｉｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ａｓｓａｙ， Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ，５，８５５−８６５（２００２））。
【００５８】
すなわち、試験例１および３のシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を含有する試料を投与したうちの３馬について、馬用微生物製剤投与５日間の５日目、その５日間の投与終了の１日目、投与終了９日後、投与終了１５日後、投与終了２２日後及び投与終了３０日後の血液を採取しその血清を得た（ＳＴ１８株投与群）。それから得られた馬血清を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.４）により１００倍に希釈したものをサンプルとした。次に、このサンプルの２５０μｌに２４０μＭのＴｈｉｏ−Ｇｌｏ１（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ製）を２５μｌ（終濃度２０μＭ）と、３６０ｍＭのＳＤＳ（終濃度３０ｍＭ）またはＰＢＳの２５μｌを加え、分注器で混合した。これとは別にスタンダードとしてＤＴＴで還元したＢＳＡの５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌを同様に用意した後、６０℃で４５分間反応させる。続いて室温にて１５分間インキュベートし、これを３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの蛍光波長で蛍光強度を測定した。また、サンプルの６０μｌに（−）ＢＰＢの４×サンプルバッファー２０μｌを添加しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。
このサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動後のゲルのバンドをトランスイルミネーター（フナコシ社製）で写真を撮り、強度を数値化した。続いてＣＢＢＲにて染色し写真撮影後、アルブミンとしてのタンパク量もＮＩＨ−Ｉｍａｇｅで求めた。この蛍光強度を、ｓｔａｎｄａｒｄ ＢＳＡの蛍光強度に換算した血清量／通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白定量から、血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を求めた。通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で求めた。対照として、試験例１および３において、ＳＴ１８株を投与しなかった馬のうち３頭について同様に試験した（ＳＴ１８株無投与群）。結果を図３に示す。
【００５９】
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群は、無投与群に比べて血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率が有意に高く、ストレスが軽減されている結果が得られた。また、そのストレス軽減効果は、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与を止めた４週間後でも持続していることが認められた。
【００６０】
試 験 例 ５
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のラットに対する拘束ストレス軽減効果：
ラットに拘束ストレスを負荷し、血中コルチコステロンの濃度を測定することによりストレス軽減効果を評価した。金属製の拘束装置を用い、ラットを８時間（午前０時〜午前８時）拘束した。拘束の前後で尾静脈からの採血を行いコルチコステロンの血中濃度を測定した。コルチコステロン量の測定は、ＡＣＴＩＶＥ Ｒａｔ Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＤＳＬ社、１０−８１１００）を用いてイムノアッセイ法で測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。微生物を与えない群をコントロールとした。５日目に拘束ストレスをかけ、前日の血中コルチコステロン濃度と拘束ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図４に示す。
【００６１】
コントロール群および微生物投与群ともにストレス負荷をかける前は、１００ｎｇ／ｍｌ未満の範囲であった。コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群はコントロール群に比べて、ストレス付加後の血中コルチコステロン濃度は低くなり、ストレス軽減効果が認められた。
【００６２】
試 験 例 ６
シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のラットに対する強制水泳ストレス軽
減効果：
直径２０ｃｍ、高さ５０ｃｍのプラスチック製の円筒に２７℃の水を４０ｃｍまで入れ、ラットを１５分間の強制的に水泳をさせ、強制水泳前後で尾静脈から採血し血中コルチコステロン量を測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。微生物を与えない群をコントロールとした。５日目に強制水泳させ、前日の血中コルチコステロン濃度と強制水泳ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図５に示す。
【００６３】
コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。ＳＴ１８株投与群は、コントロール群に比べ、ストレス負荷後の血中コルチコステロン量が抑制され、ラットに対するストレス軽減効果があることがわかった。
【００６４】
試 験 例 ７
馬腸内フローラにおけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の分布（１）
国内各地の生産牧場および厩舎における０（当歳）〜３３歳までの様々な年齢の牡７頭、牝９頭の糞便を採取し、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によりシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株を保有しているか調べた。その結果、ＳＴ１８株は１６頭中１４頭から検出されたことから、生産牧場や厩舎には関係なく、健常な馬の腸内フローラに普遍的に存在している微生物であると考えられる。したがって、本発明のシャーペア属微生物は馬に投与しても安全性の高いものである。
【００６５】
試 験 例 ８
馬腸内フローラにおけるシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の分布（２）
下記表５に示した健常なサラブレッド１２頭（Ａ〜Ｌ）の新鮮な糞便について、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＰＣＲ−ＤＧＧＥ）法により、シャーペア・アザブエンシスの分布を調べた。これらのサラブレッドは、糞便の採取１ヶ月以内に、生菌剤は使用していない。Ｗａｌｔｅｒら（Ｗａｌｔｅｒ Ｊ．， Ｈｅｒｔｅｌ Ｃ．， Ｔａｎｎｏｃｋ Ｇ．Ｗ．， Ｌｉｓ Ｃ．Ｍ．， Ｍｕｎｒｏ Ｋ． ａｎｄ Ｈａｍｍｅｓ Ｗ．Ｐ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ， ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｃｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７，２５７８−２５８５（２００１））の文献に基づくＰＣＲ条件と、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のＮｏ．３４１−５３４領域で３４０ｂｐを増幅させる下記のプライマーＬａｃ１とＬａｃ２ＧＣを用いた。
【００６６】
＜ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｃ１＞
５′−ＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡ−３′
＜ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｃ２ＧＣ＞
５′−ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＡＣ
ＣＧＧＧＧＧＡＴＴＹＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧ−３′
【００６７】
【表４】
【００６８】
ＤＧＧＥ泳動には、ＤＣｏｄｅシステム装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、各種糞便からシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の検出を試みた。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の検出は次のようにして行った。変性剤（尿素とホルムアミド）で３７．５％から５２．５％の濃度勾配をつけた８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルを用いた。Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液に浸して、６０Ｖで１４時間、泳動した。泳動後のゲルは、１０ ｍｇ／ｍｌ 臭化エチジウム溶液２５ μｌを添加した２５０ ｍｌ ＴＡＥ緩衝液で染色した。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のバンドの特定は、純粋培養したシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の移動度、およびそのバンドを切り出しての１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定によって、９８％以上の相同性のあるものをシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株とした。１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列決定も上記と同様の方法により行った。結果を図６に示す。
【００６９】
図６に示すとおり、１２頭中１０頭（Ａ〜Ｈ、Ｋ、Ｌ）のサラブレットからシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株が検出された。この結果から、この菌種は、健常なサラブレッドの消化管内に広く分布し、またバンドの濃さの強弱は菌数を反映していることから、腸内フローラの中で優勢に生育していることが認められた。
【００７０】
試 験 例 ９
ダイハイドロダイゼインおよびエクオール産生：
９９０ｍｌの蒸留水にＡＢＣＭブイヨン培地（栄研）４６ｇを溶解し、オートクレーヴで１２１℃、１５分間の滅菌を行なった。室温にもどしたＡＢＣＭブイヨン培地に、フィルター滅菌した１０ｍｌ水溶液のダイゼインを２００μｌになるように添加した。ＳＴ１８を予めＡＢＣＭブイヨン培地で培養し、その培養液０．２％を接種して、スチールウール法にて嫌気し、３７℃で３６時間培養した。
その培養液について、Ｗａｎｇらの方法（Ｗａｎｇ Ｘ．Ｌ．， Ｈｕｒ Ｈ．Ｇ．， Ｌｅｅ Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｋｉｍ Ｓ．Ｉ．， Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓ−ｅｑｕｏｌ ｆｒｏｍ ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｂｙ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７１， ２１４−２１９（２００５））に基づくＨＰＬＣ法により、ダイゼイン、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールを定量した。標品として用いたダイゼインはＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、ダイハイドロダイゼインはＴｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから、エクオールはＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからそれぞれ購入した。ＨＰＬＣのクロマトグラムを図７に示す。
【００７１】
ＳＴ１８培養前のクロマトグラムでは、培地に予め添加したダイゼインのピークのみが検出された。培養３６時間後のクロマトグラムでは、ダイゼインのピークは予め添加した量のほぼ半分になり、図７のとおり、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールのピークが検出されたことから、そのダイゼインのピーク減少分が、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールに転換されていた。さらに３日間以上培養すると、ダイゼインとダイハイドロダイゼインを示すピークは完全に消失し、エクオールを示すピークが、培養３６時間時の２倍を示していた。シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株は、ダイゼインを資化し、ダイハイドロダイゼインおよびエクオールを産生する能力を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の新属であるシャーペア属微生物は、消化管に対して良好な付着性および定着性を示し、下痢や疝痛など消化器疾患の予防・治療効果を有し、またにストレス軽減効果などプロバイオティクス効果をも有するとともに、エストロゲン受容体活性を示すダイハイドロダイゼインおよびエクオール産生能を有するものである。
【００７３】
ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、弱い女性ホルモン（エストロゲン）作用を示す。ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、腸内細菌によりダイゼインから産生されるが、その産生能力は個人差が大きい。ダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、女性の乳がんなど性ホルモンが関連する病気に影響を与えているのではないかと考えられている。また男性においても、前立腺がんは、性ホルモンと関連するがんで、女性ホルモンの働きをする薬や男性ホルモンの働きを押さえる薬が治療に使われてきた。本菌の作るダイハイドロダイゼインおよびエクオールは、上記のような効果にも貢献する。
【００７４】
哺乳動物の糞便を用いることにより、安価、簡便かつ迅速なエクオール検出法（特願２００５−５５０５８号：特開２００６−２４２６０２号公報）が開発された。それにより、エクオール産生菌の有無を試験できるので、消化管内でエクオールを産生していない個体ごとに本菌の投与を行なうことも可能となる。
【００７５】
したがって、本発明の微生物は、哺乳動物に投与する微生物製剤やその発酵物を含有する飲食品または医薬品として有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株の光学顕微鏡写真である。
【図２】クロストリジウムクラスターＸＶ〜ＸＩＸに属する既知の種とシャーペア・アザブエンシスＳＴ１８、ＨＭ２４４、ＨＭ２５０およびＤＩ４９との関係を示した系統樹である。
【図３】試験例４において、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株投与群と無投与群との血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を示す図である。
【図４】試験例５における、拘束ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図５】試験例６における、強制水泳ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図６】試験例８における、シャーペア・アザブエンシスＳＴ１８株のＰＣＲ−ＤＧＧＥ電気泳動図である。
【図７】試験例９における、培養３６時間後のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス軽減作用を有する下記菌学的性質を示すシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％
【請求項２】
下記の化学分類学的性質を有するものである請求項１記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）ＪＣＭ ０６０９Ｔ株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）ＪＣＭ １１２１Ｔ株およびラクトバチルス・カテナフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ）ＪＣＭ １１４３Ｔ株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項３】
配列表の配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含むものである請求項１または２に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
【請求項４】
シャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａ ａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）である請求項１ないし３のいずれかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
【請求項５】
シャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａ ａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）ＳＴ１８株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００）である請求項１ないし４の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
【請求項６】
請求項１ないし５の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を含有することを特徴とする微生物製剤。
【請求項７】
哺乳動物用である請求項６に記載の微生物製剤。
【請求項８】
哺乳動物が馬である請求項７記載の微生物製剤。
【請求項９】
哺乳動物の下痢および／または疝痛の予防・治療用である請求項６ないし８の何れかの項に記載の微生物製剤。
【請求項１０】
哺乳動物が馬である請求項９記載の微生物製剤。
【請求項１１】
哺乳動物の抗ストレス用である請求項６ないし８の何れかの項に記載の微生物製剤。
【請求項１２】
哺乳動物が馬である請求項１１記載の微生物製剤。
【請求項１３】
非ヒト哺乳動物に請求項１ないし５の何れかの項記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を含有する微生物製剤を投与することを特徴とする非ヒト哺乳動物のストレス低減方法。
【請求項１４】
非ヒト哺乳動物が馬である請求項１３記載のストレス低減方法。
【請求項１５】
請求項１ないし５の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有することを特徴とする経口組成物。
【請求項１６】
ダイゼイン含有物が、大豆、豆乳、クズ、葛根、グワーオクルアおよびザクロよりなる群から選ばれたものである請求項１５記載の経口組成物。
【請求項１７】
飲食物である請求項１５または１６記載の経口組成物。
【請求項１８】
医薬品である請求項１５または１６記載の経口組成物。
【請求項１９】
骨粗鬆症または動脈硬化の予防・治療用である請求項１８記載の経口組成物。
【請求項２０】
請求項１ないし５の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするハイドロダイゼインおよび／またはエクオールの製造方法。
【請求項２１】
請求項１ないし４の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼインおよび／またはハイドロダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするエクオールの製造方法。
【請求項１】
ストレス軽減作用を有する下記菌学的性質を示すシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
（１）細菌の形態：桿菌
（２）運動性：無
（３）胞子形成：無
（４）グラム染色性：陽性
（５）カタラーゼ反応：陰性
（６）酸素に対する態度：絶対嫌気性
（７）Ｇ＋Ｃ含量：３６〜３８ｍｏｌ％
【請求項２】
下記の化学分類学的性質を有するものである請求項１記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）ＪＣＭ ０６０９Ｔ株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）ＪＣＭ １１２１Ｔ株およびラクトバチルス・カテナフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ）ＪＣＭ １１４３Ｔ株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項３】
配列表の配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含むものである請求項１または２に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
【請求項４】
シャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａ ａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）である請求項１ないし３のいずれかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
【請求項５】
シャーペア・アザブエンシス（Ｓｈａｒｐｅａ ａｚａｂｕｅｎｓｉｓ）ＳＴ１８株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００）である請求項１ないし４の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物。
【請求項６】
請求項１ないし５の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を含有することを特徴とする微生物製剤。
【請求項７】
哺乳動物用である請求項６に記載の微生物製剤。
【請求項８】
哺乳動物が馬である請求項７記載の微生物製剤。
【請求項９】
哺乳動物の下痢および／または疝痛の予防・治療用である請求項６ないし８の何れかの項に記載の微生物製剤。
【請求項１０】
哺乳動物が馬である請求項９記載の微生物製剤。
【請求項１１】
哺乳動物の抗ストレス用である請求項６ないし８の何れかの項に記載の微生物製剤。
【請求項１２】
哺乳動物が馬である請求項１１記載の微生物製剤。
【請求項１３】
非ヒト哺乳動物に請求項１ないし５の何れかの項記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物を含有する微生物製剤を投与することを特徴とする非ヒト哺乳動物のストレス低減方法。
【請求項１４】
非ヒト哺乳動物が馬である請求項１３記載のストレス低減方法。
【請求項１５】
請求項１ないし５の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させて得られる発酵物を含有することを特徴とする経口組成物。
【請求項１６】
ダイゼイン含有物が、大豆、豆乳、クズ、葛根、グワーオクルアおよびザクロよりなる群から選ばれたものである請求項１５記載の経口組成物。
【請求項１７】
飲食物である請求項１５または１６記載の経口組成物。
【請求項１８】
医薬品である請求項１５または１６記載の経口組成物。
【請求項１９】
骨粗鬆症または動脈硬化の予防・治療用である請求項１８記載の経口組成物。
【請求項２０】
請求項１ないし５の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするハイドロダイゼインおよび／またはエクオールの製造方法。
【請求項２１】
請求項１ないし４の何れかの項に記載のシャーペア（Ｓｈａｒｐｅａ）属微生物をダイゼインおよび／またはハイドロダイゼイン含有物に作用させることを特徴とするエクオールの製造方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１】
【図６】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−４１９４０（Ｐ２０１０−４１９４０Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０６８９７（Ｐ２００８−２０６８９７）
【出願日】平成２０年８月１１日（２００８．８．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月２７日 社団法人日本畜産学会発行の「日本畜産学会 第１０９回大会 講演要旨集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年４月３日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｃｏｒｅ＆ｉｄ＝１７２０５２５２３」に発表
【出願人】（５０７０４５８８９）クロスフィールドバイオ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１１日（２００８．８．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月２７日 社団法人日本畜産学会発行の「日本畜産学会 第１０９回大会 講演要旨集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年４月３日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｃｏｒｅ＆ｉｄ＝１７２０５２５２３」に発表
【出願人】（５０７０４５８８９）クロスフィールドバイオ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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