新規メタスチン同族体およびその用途
【課題】新規メタスチン同族体とその用途を提供する。
【解決手段】本発明は配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。本発明のペプチドはＣ末端がアミド化されている場合がある。本発明は、本発明のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを含み、本発明のペプチドを産生する発現コンストラクトと、該発現コンストラクトを含み、本発明のペプチドを産生する宿主細胞と、これらのうち少なくとも１つを含む、疾患を予防又は治療するための医薬品組成物とを提供する。本発明は、本発明のペプチドと特異的に結合する抗体と、該抗体を含む疾患の診断用キットと、ヒト又はヒト以外の動物の疾患の予防又は治療方法であって、本発明の医薬品組成物と、本発明の抗体とのうち少なくとも１つを投与するステップを含む、予防又は治療方法とを提供する。
【解決手段】本発明は配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。本発明のペプチドはＣ末端がアミド化されている場合がある。本発明は、本発明のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを含み、本発明のペプチドを産生する発現コンストラクトと、該発現コンストラクトを含み、本発明のペプチドを産生する宿主細胞と、これらのうち少なくとも１つを含む、疾患を予防又は治療するための医薬品組成物とを提供する。本発明は、本発明のペプチドと特異的に結合する抗体と、該抗体を含む疾患の診断用キットと、ヒト又はヒト以外の動物の疾患の予防又は治療方法であって、本発明の医薬品組成物と、本発明の抗体とのうち少なくとも１つを投与するステップを含む、予防又は治療方法とを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規メタスチン同族体に関し、具体的には、ＫｉＳＳ−２ペプチドと、該ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを含む発現コンストラクトと、これらを含む、疾患を治療するための組成物と、該組成物を投与するステップを含む疾患の治療方法と、前記ペプチドに対する抗体と、該抗体を含む疾患の診断用キットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
キスペプチンはオーファンレセプターのＧＰＲ５４の内因性リガンドとして発見された（非特許文献１、２及び３）。ＫｉＳＳ−１遺伝子には癌転移（metastasis）抑制作用があることから、当該遺伝子の産物であるキスペプチンは癌治療に役立つと当初考えられ、生体内から分離精製されたアミノ酸５４個からなるＫｉＳＳ−１遺伝子産物の部分断片でＣ末端がアミド化されたペプチドはメタスチンと命名された。しかし、ＧＰＲ５４レセプターの異常が低ゴナドトロピン・性腺機能低下症と密接に結びついていることが報告され、メタスチンは性成熟に重要なペプチドであることが示された（非特許文献４）。その後、メタスチンは中枢神経系、特に視床下部で強く発現しており、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のニューロンに直接働いてＧｎＲＨの発現・分泌を促進する作用があることが判明した（非特許文献５）。このようにメタスチンは視床下部−下垂体−性腺軸の生殖神経内分泌系において重要な働きを持つペプチドである。
【非特許文献１】Welch, D. R.ら、(1994) Oncogene 9: 255-262.
【非特許文献２】Lee, J.-H.ら、(1996) J. Nat. Cancer Inst. 88: 1731-1737, 1996.
【非特許文献３】Ohtaki, T.ら、(2001) Nature 411: 613-617.
【非特許文献４】Seminara, S. B.ら、(2003) New Eng. J. Med. 349: 1614-1627.
【非特許文献５】Kinoshita, M.ら、(2005) Endocrinology 146: 4431-4436, 2005. ヒトのＫｉＳＳ−１遺伝子は、１４５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしており、このうちＮ末端の１９個のアミノ酸はシグナルペプチドで、第６８番目から第１２１番目までの５４個のアミノ酸からなるタンパク質が切り出されたものがメタスチンである。以下では、ＫｉＳＳ遺伝子産物のタンパク質を「キスペプチン」といい、キスペプチンの第６８番目から第１２１番目までの５４個のアミノ酸からなるキスペプチン断片を「キスペプチン６８−１２１」と表す。同様にメタスチンについても第４５番目のアミノ酸から第５４番目のアミノ酸までの１０個のアミノ酸からなるペプチドを「メタスチン４５−５４」と表す（非特許文献６及び７）。キスペプチン６８−１２１はメタスチン１−５４と同一のペプチドであり、メタスチン４５−５４はキスペプチン１１２−１２１と同一のペプチドである。メタスチンのＣ末端がアミド化されない場合にはＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性は非常に減弱するが、Ｃ末端がアミド化されていればＮ末端アミノ酸が除去されていてもＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性を有する。実際、メタスチン４０−５４や、メタスチン４５−５４でもＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性はメタスチンよりも３倍ないし１０倍アゴニスト活性が高い（非特許文献３）。ＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性を有する最短のキスペプチン断片であるキスペプチン１１２−１２１又はメタスチン４５−５４をそれぞれキスペプチン−１０又はメタスチン−１０と表す。キスペプチン６８−１２１又はメタスチン１−５４をキスペプチン−５４又はメタスチン−５４と表す。
【非特許文献６】Seminara, S. B.（２００５）J. Clin. Endocr. Metab. 90: 6738-6740.
【非特許文献７】Dhillo, W. S.ら、（２００５）J. Clin. Endocr. Metab. 90: 6609-6615. メタスチン−１０又はメタスチン−５４はともにＣ末端がアルギニン−フェニルアラニン−ＮＨ２であるが、これと同一のＣ末端構造を有するペプチドのファミリーが存在する。アルギニン及びフェニルアラニンの１文字表記であるＲ及びＦと末端アミド基を有することからＲＦアミドペプチドと総称される。ＲＦアミドペプチドには、鳥類の脳ペプチド（gonadotropin-inhibitory hormone）のように生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制する作用を有するものがある（非特許文献８）が、摂食行動に関与するＲＦアミドペプチドも知られている（非特許文献９）。ＫｉＳＳ遺伝子及びＧＰＲ５４遺伝子はともに膵臓で強く発現する（非特許文献３）が、ＧＰＲ５４遺伝子のノックアウトマウスは生殖機能以外には異常がみられない（非特許文献４）。そこで、メタスチンとそのレセプターであるＧＰＲ５４遺伝子産物とが関与する経路には代替的な経路が存在し、未知の機能を担っている可能性がある。かかる代替的経路にはメタスチンと類似のアミノ酸配列を有するＣ末端がアミド化されたペプチドホルモン、すなわちメタスチンと同じファミリーに属する同族体が関与すると考えられる。
【非特許文献８】Tsutsui, K.ら、（２０００）Biochem. Biophys. Res. Commun. 275: 661-667.
【非特許文献９】Dockray, G.J.（２００４）Exp. Physiol. 89: 229-235.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、発明者らは新規メタスチン同族体を探索し、ＫｉＳＳ−１のサブファミリーであるＫｉＳＳ−１ａ及びＫｉＳＳ−１ｂと、ＫｉＳＳ−１とは異なる別のファミリーメンバーであるＫｉＳＳ−２の遺伝子及びその産物であるペプチドを発見した。本発明はこの発見に基づいて新規メタスチン同族体とその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【０００５】
本発明のペプチドはＣ末端がアミド化されている場合がある。
【０００６】
本発明は、本発明のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のペプチドを産生する発現コンストラクトを提供する。
【０００８】
本発明は、本発明の発現コンストラクトを含み、本発明のペプチドを産生する宿主細胞を提供する。
【０００９】
本発明は、本発明のペプチドと、該ペプチドの塩と、前記ペプチド又はその塩のプロドラッグと、本発明のポリヌクレオチドと、本発明の発現コンストラクトと、本発明の宿主細胞とからなるグループから選択される少なくとも１つを含む、疾患を予防又は治療するための医薬品組成物を提供する。
【００１０】
本発明の医薬品組成物において、前記疾患は生殖機能障害の場合がある。
【００１１】
本発明の医薬品組成物において、前記疾患は癌又は腫瘍の場合がある。
【００１２】
本発明は、本発明のペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。
【００１３】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体の場合がある。
【００１４】
本発明は、本発明の抗体を含む疾患の診断用キットを提供する。
【００１５】
本発明の診断用キットにおいて、前記疾患は生殖機能障害の場合がある。
【００１６】
本発明の診断用キットにおいて、前記疾患は癌又は腫瘍の場合がある。
【００１７】
本発明は、ヒト又はヒト以外の動物の疾患の予防又は治療方法であって、本発明の医薬品組成物と、本発明の抗体とのうち少なくとも１つを投与するステップを含む、予防又は治療方法を提供する。
【００１８】
本発明の予防又は治療方法において、前記疾患は生殖機能障害の場合がある。
【００１９】
本発明の予防又は治療方法において、前記疾患は癌又は腫瘍の場合がある。
【００２０】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００２１】
本明細書でアミノ酸を表す場合、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（Ｌ−又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、生体内でメッセンジャーＲＮＡからリボゾームで合成されるタンパク質の翻訳に用いられる２０種類のＬ−アミノ酸とこれらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むがこれらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。
【００２２】
また、本明細書でペプチドを表す場合、ペプチドを構成するアミノ酸残基は、慣用の３文字表記で示され、ハイフンで結んで表される。例えば２個のアミノ酸の３文字表記がハイフンで結ばれて表される場合には、左側のアミノ酸のカルボキシル基と右側のアミノ酸のアミノ基とがペプチド結合したジペプチドであることを表す。したがってＡｓｎ−Ａｌａは、Ｌ−アスパラギンのカルボキシル基とＬ−アラニンのアミノ基とがペプチド結合したジペプチドであって、Ｌ−アスパラギンのアミノ基とＬ−アラニンのカルボキシル基は修飾されていないことを意味する。本明細書において、Ｃ末端がアミド化されたペプチドは「Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２」のように表記する。アミノ酸配列を配列番号を示して引用するアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｃ末端がアミド化されている場合と、アミド化されていない場合とを含む。
【００２３】
本発明のペプチドは、動物の組織から精製して調製される場合がある。代替的には、本発明のペプチドのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明のペプチドは、ＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明の医薬品組成物に使用されてもよく、あるいは、精製された状態で本発明の医薬品組成物に使用されてもよい。
【００２４】
本発明の医薬品組成物と、診断用キットと、治療方法との対象となる疾患は、生殖機能障害と、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の調節異常と、走化性その他の細胞遊走の異常と、細胞外マトリクスの分解その他細胞の行動異常と、癌又は腫瘍と、糖尿病その他の糖代謝異常と、高脂血症その他の脂質代謝異常と、急性もしくは慢性膵炎と、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化その他の心臓循環器系疾患と、肥満、食欲減退、食欲亢進その他の摂食行動の異常とを含む。生殖機能障害には、１次性徴及び／又は２次性徴の異常を含む生殖腺の発生及び／又は分化の異常と、性行動の異常と、月経異常その他の排卵異常と、受精又は卵割の異常と、着床の異常を含む妊娠異常と、乳腺の絨毛癌、胞状奇胎、胎児の発育不全と、侵入奇胎その他の胎盤の形成及び／又は機能の異常と、切迫流産その他分娩誘発の異常とを含むがこれらに限られない。前記癌又は腫瘍は、絨毛癌、胞状奇胎、トロホブラストーマ、前立腺癌、精巣腫瘍、卵巣腫瘍、乳癌、子宮内膜症、子宮筋腫、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、悪性メラノーマ、骨肉腫、甲状腺乳頭癌を含むがこれらに限られない。
【００２５】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含むキメラ抗体又は組換え抗体とからなるグループから選択される場合がある。抗体の抗原結合断片は、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。
【００２６】
抗体は、当業者に知られたさまざまな技術によって調製される場合がある。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照せよ。
【００２７】
本発明で用いられるポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを免疫原として、ほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ）又は鳥類（例えばニワトリ）のいずれかの動物宿主に注射される。ウシ血清アルブミン又はスカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）のような担体タンパク質と連結される場合に優れた免疫応答が誘発される場合がある。前記免疫原は、１回又は２回以上のブースター免疫を取り込んだ予め定められたスケジュールに従って、前記動物宿主に注射されることが好ましい。前記免疫原は、完全又は不完全フロイントアジュバントその他の免疫増強剤に混合して前記動物宿主に注射される場合がある。本発明のポリクローナル抗体は、かかる抗血清から、例えば適当な固体支持体に結合された本発明のペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製される場合がある。
【００２８】
本発明で用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１-５１９、１９７６の技術と、その改良技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死性細胞株の調製を伴う。かかる細胞株は上記のとおり免疫された動物宿主由来の脾臓細胞から作成される場合がある。前記脾臓細胞は、さまざまな方法で不死化され、抗体産生能を有する不死化細胞株が調製される。前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された動物と同種かあるいは異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって不死化される。当業者に周知のさまざまな融合技術を用いる場合がある。例えば、前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは非イオン性界面活性剤と数分間混合され、それからハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度でプレートされる。好ましい選択技術はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。通常約１ないし２週間の十分な時間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、その培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。反応性及び特異性が高いハイブリドーマが好ましい。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異性が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。さらに、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマ細胞株を注射するような、収率を向上させるためのさまざまな技術が用いられる場合がある。モノクローナル抗体は前記ハイブリドーマ細胞腹水又は血液から回収される場合がある。汚染物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿及び抽出のような従来技術によって前記抗体から除去される場合がある。
【００２９】
本発明で用いられる抗体の抗原結合断片は、それぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンでインタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ及びＶＬ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。
【００３０】
本発明で用いられる組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換か、適当なほ乳類細胞宿主へのトランスフェクションかを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。本発明で用いられるキメラ抗体は、前記本発明の組換え抗体の抗原結合部位が本発明のペプチドと特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質である。本発明で用いられるキメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）とを含む。本発明の組換え抗体は原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。
【００３１】
本発明のペプチドの塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩等が挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等との塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等）等の無機塩、アンモニウム塩等が、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩が好ましい。
【００３２】
本発明のペプチド又はその塩のプロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により本発明のペプチドに変換するペプチド又はその誘導体、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明のペプチドに変化するペプチド又はその誘導体、例えば、胃酸等により加水分解等を起こして本発明のペプチド又はその塩に変化するペプチド又はその誘導体をいう。本発明のペプチド又はその塩のプロドラッグは、本発明のペプチドのアミノ基がアシル化、アルキル化、リン酸化されたペプチド又はその誘導体（例えば、本発明のペプチドのアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、tert−ブチル化されたペプチド誘導体等）と、本発明のペプチドの水酸基がアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化されたペプチド誘導体（例えば、本発明ペプチドの水酸基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化されたペプチド誘導体等）と、本発明のペプチドのカルボキシル基がエステル化、アミド化されたペプチド誘導体（例えば、本発明のペプチドのカルボキシル基がエチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化、メチルアミド化されたペプチド誘導体等）とを含むが、これらに限られない。これらのペプチド誘導体は公知の方法によって本発明のペプチドから製造することができる。本発明のプロドラッグは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような生理的条件で本発明のペプチドに変化するものであってもよい。
【００３３】
本発明の医薬品組成物は、毒性が低く、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている自体公知の手段に従って、本発明の化合物をそのままあるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤、（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等の医薬製剤として、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。本発明の化合物の本発明製剤中の含有量は、製剤全体の約０.０１ないし約１００重量％である。本発明の化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、癌患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常、癌患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００３４】
本発明の医薬品組成物の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体は、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を含み、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等を含む。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。賦形剤は、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等を含む。結合剤は、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を含む。崩壊剤は、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等を含む。溶剤は、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等を含む。溶解補助剤は、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を含む。懸濁化剤は、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等を含む。等張化剤は、例えばブドウ糖、 Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等を含む。緩衝剤は、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等を含む。無痛化剤は、例えばベンジルアルコール等を含む。防腐剤は、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を含む。抗酸化剤は、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等を含む。
【００３５】
さらに、本発明の医薬品組成物は、本発明の医薬品組成物以外の薬物と併用して使用することができる。本発明の医薬品組成物と併用し得る薬物（以下、併用薬物と略記する場合がある）としては、例えば、癌治療のための化学療法剤、ホルモン療法剤、免疫療法剤等の薬剤（以下、併用薬剤と略記する）と組み合わせて用いることができる。前記「化学療法剤」は、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来抗癌剤等を含む。「アルキル化剤」は、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、カルボコン、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシン等を含む。「代謝拮抗剤」は、例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５−ＦＵ系薬剤（例、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフールなど）、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチン等を含む。「抗癌性抗生物質」は、例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシン等を含む。「植物由来抗癌剤」は、例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビン等を含む。前記「ホルモン療法剤」は、例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、アリルエストレノール、ゲストリノン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキフェン、レボルメロキシフェン、抗エストロゲン（例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェンなど）、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬（例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタンなど）、抗アンドロゲン（例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミドなど）、５α-レダクターゼ阻害薬（例、フィナステリド、エプリステリドなど）、副腎皮質ホルモン系薬剤（例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンなど）、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロンなど）、レチノイドおよびレチノイドの代謝を遅らせる薬剤（例、リアロゾールなど）等を含み、なかでもＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど）が好ましい。前記「免疫療法剤（ＢＲＭ）」としては、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾール等を含む。
【００３６】
本発明の医薬品組成物と併用薬物とを組み合わせることにより、
（１）本発明の医薬品組成物又は併用薬物を単独で投与する場合に比べて、その投与量を軽減することができる、
（２）患者の症状（軽症、重症など）に応じて、本発明の医薬品組成物と併用する薬物を選択することができる、
（３）本発明の医薬品組成物と作用機序が異なる併用薬物を選択することにより、治療期間を長く設定することができる、
（４）本発明の医薬品組成物と作用機序が異なる併用薬物を選択することにより、治療効果の持続を図ることができる、
（５）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを併用することにより、相乗効果が得られる、などの優れた効果を得ることができる。
【００３７】
以下、本発明の医薬品組成物と併用薬物を併用して使用することを「本発明の併用剤」と称する。本発明の併用剤の使用に際しては、本発明の化合物と併用薬物の投与時期は限定されず、本発明の化合物またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬物の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することができる。本発明の併用剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明の医薬品組成物と併用薬物とが組み合わされていればよい。このような投与形態は、例えば、（１）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）本発明の医薬品組成物とを別々に製剤化して得られる２種２種の製剤の投与の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明の医薬品組成物；併用薬物の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等を含む。
【００３８】
本発明の医薬品組成物又は併用薬物は、固形製剤（例、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤）などの経口投与用製剤か、坐剤などの直腸投与用製剤か、注射用製剤かの剤形で製造される場合がある。本発明の医薬品組成物又は併用薬物は、徐放性マイクロカプセル剤等の徐放性製剤として製造される場合がある。あるいは、ポリエチレングリコール付加その他の薬物送達技術を適用した製剤として製造される場合がある。
【００３９】
本発明の疾患の治療方法は、ヒトに施される場合がある。あるいは、ヒト以外の動物に施される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００４１】
材料及び方法
（使用したペプチド）
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＫｉＳＳ−１０（Ｈ−１０；配列番号１のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、齧歯類のＫｉＳＳ−１０Ｙ（Ｒ−１０；配列番号２のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）のＫｉＳＳ−１０Ｆ（Ｘ２−１０；配列番号３のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−１２Ｆ（Ｘ２−１２Ｆ；配列番号４のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）のＺ１−１０（配列番号５のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュのＺ１−１５（配列番号６のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュのＺ１−ｐ１５（配列番号７のアミノ酸配列を有し、N末端がピログルタミン酸化され、Ｃ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュのＺ２−１０（配列番号８のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュのＺ２−１２（配列番号９のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ネッタイツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のＸ１ａ−１４（配列番号１０のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ネッタイツメガエルのＸ１ｂ−ｐ１５（配列番号１１のアミノ酸配列を有し、N末端がピログルタミン酸化され、Ｃ末端がアミド化されたペプチド）とを、Ａｎｙｇｅｎ（韓国）から購入した。
【００４２】
（使用したプラスミド）
ｐｃＤＮＡ３発現ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ｐＣＭＶβ−Ｇａｌベクターを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから取得した。シグナル伝達特異的レポーターベクターＣＲＥ−ｌｕｃ及びＳＲＥ−ｌｕｃを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｅ（ベルギー、ブリュッセル）のＭａｒｃ Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ博士から分譲されたｈＧＰＲ５４のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３発現ベクターにリクローニングした。
【００４３】
（動物及び組織の調製）
ネッタイツメガエルの成体と、アフリカツメガエルの成体とは、それぞれ、Ｘｅｎｏｐｕｓｏｎｅ（米国）と、ゼノパス養殖教材（茨城県古河市）とから入手した。メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）及びゼブラフィッシュの成魚は業者から購入した。ニホンカナヘビ（Ｔａｋｙｄｒｏｍｕｓ ｔａｃｈｙｄｒｏｍｏｉｄｅｓ）の成体は２００７年に東京郊外で採集した。前記動物は、水槽で飼育した。Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（高麗大学校医学部、韓国、ソウル市）及び早稲田大学で、実験動物管理規則に従って実施した。
【００４４】
（ゲノムデータベース解析）
ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル及びヒトのキスペプチンのアミノ酸配列をクエリー配列としてネッタイツメガエルのゲノムデータベースをＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）により検索した。さまざまな脊椎動物種におけるＧＰＲ５４遺伝子を特定するために、ヒト及びウシガエルのＧＰＲ５４のアミノ酸配列についてゼブラフィッシュ、メダカ、カモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｎａｔｉｎｕｓ）及びネッタイツメガエルのゲノムデータベースをＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにより検索した。クエリー配列とヒットしたゲノム配列との間のアミノ酸配列のアライメントはＢｌａｓｔ Ｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）を用いて行い、また、ＣＢＳ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅにより提供されるＨＭＭｇｅｎｅ（ｖ．１．１）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＨＭＭｇｅｎｅ／）を用いてエクソン及びイントロンの配列を予想した。ヒト、ネッタイツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ及びカモノハシの、ＧＰＲ５４遺伝子座を含むゲノム領域のコンティグ図の比較を行なった後、ゲノムシンテニー解析を実施した。
【００４５】
（ＫｉＳＳペプチド及びそのレセプターｃＤＮＡのクローニング）
アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２ペプチドをエンコードするｃＤＮＡのクローニングは以下のとおり行なった。ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ペプチドのｃＤＮＡ配列に基づき、２種類の順方向プライマーと、３種類の逆方向プライマーとを合成した（オペロンバイオテクノロジー株式会社）。前記２種類の順方向プライマーを配列番号１２及び１３に、前記３種類の逆方向プライマーを配列番号１４〜１６に、それぞれ示す。また、ゲノムデータベースからネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−２ペプチドのｃＤＮＡ配列を推定し、２種類の順方向プライマーと、３種類の逆方向プライマーとを合成した。前記２種類の順方向プライマーを配列番号１７及び１８に、前記３種類の逆方向プライマーを配列番号１９〜２１に、それぞれ示す。ｓｅｐａｓｏｌ抽出法により単離したアフリカツメガエルの脳の全ＲＮＡと、前記プライマーとを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により合成されたＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動とＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）とを用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。ＰＣＲ断片のＤＮＡ配列は、ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒより増幅したＤＮＡをＡＢＩ ３７３０ＸＬ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でサイクルシーケンシング反応により決定した。
ゼブラフィッシュ及びネッタイツメガエルのＧＰＲ５４及びそのファミリー遺伝子をエンコードするｃＤＮＡのクローニングは以下のとおり行なった。ゼブラフィッシュ及びネッタイツメガエルのＧＰＲ５４のｃＤＮＡ配列に基づき、３種類の順方向プライマーと、３種類の逆方向プライマーとを合成した。前記３種類の順方向プライマーを配列番号２２〜２４に、前記３種類の逆方向プライマーを配列番号２５〜２７に、それぞれ示す。ｓｅｐａｓｏｌ抽出法により単離した脳の全ＲＮＡと、前記プライマーとを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により合成されたＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動とＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎとを用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングした。ｃＤＮＡの構造を配列決定により確認した後、ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３発現ベクターにリクローニングした。
【００４６】
（抗体の調製）
Ａｚｕｍａｙａ，Ｙ．、Ｋｏｍｉｎａｍｉ，Ｓ．及びＴｓｕｔｓｕｉ，Ｋ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２８１：９０−９６に記載の方法に従い、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いてスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した合成ペプチドを抗原として使用して、抗血清を作成した。推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのＣ末端部分とＮ末端部分とに対する抗血清は、それぞれ、ＳＫＦＮＦＮＰＦＧＬＲＦ（配列番号２８）というアミノ酸配列のＣ末端のフェニルアラニンにシステインを付加したペプチド（配列番号２９）をＫＬＨに結合したものと、配列番号２８のアミノ酸配列のＮ末端のセリンにシステインを付加したペプチド（配列番号３０）をＫＬＨを結合したものとを抗原として作成された。１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液をフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と混合し、マウスに注射した。５０μｇのブースター注射の後、各々のマウスから血液を回収し、適切に希釈した抗血清を、ＥＬＩＳＡ法により分析した。推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのＣ末端部分に対する抗血清と、Ｎ末端部分に対する抗血清とは、それぞれ免疫組織化学的検査と、ＫｉＳＳ−２ペプチドのアフィニティー精製とに用いられた。
【００４７】
（ペプチドの抽出及びアフィニティー精製）
アフリカツメガエルの成体（５００匹）から回収した脳組織をドライアイスで凍結させ、使用するまで−８０°Ｃで保存した。Ｔｓｕｔｓｕｉ Ｋら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２７５：６６１−６６７、Ｋｏｄａ Ａら、（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３：４１１−４１９、及び、Ｕｋｅｎａ Ｋら、（２００３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４４：３８７９−３８８４に記載の方法に従い、脳組織を５％酢酸中で煮沸及びホモジナイズした。ホモジネートを１０，０００ｇ、４°Ｃで３０分間遠心分離し、得られた沈殿を再度ホモジナイズ及び遠心分離した。回収した遠心上清を、ロータリーエバポレーターを４５°Ｃで使用することにより濃縮した後、ディスポーサブルのＣ−１８カートリッジカラム（Ｍｅｇａ Ｂｏｎｄ−Ｅｌｕｔ；Ｖａｒｉａｎ）に適用した。Ｕｋｅｎａ Ｋら、（２００３）、Ｕｋｅｎａ Ｋら、（２００２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５１２：２５５−２５８、及び、Ｂｏｎｎａｒｄ Ｅら、（２００１）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２２：１０８５−１０９２に記載の方法に従い、前記カラムに保持された物質を６０％メタノールで溶出し、イムノアフィニティー精製に供した。イムノアフィニティーカラムは、推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのＣ末端側のアミノ酸配列に対する抗血清を臭化シアンで活性化してＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に結合して調製された。６０％メタノールで溶出した前記脳抽出物を前記イムノアフィニティーカラムに４°Ｃで適用し、０．１％の２−メルカプトエタノールを含む０．３Ｍ酢酸で溶出した。Ｋｏｄａ Ａら（２００２）、及び、Ｕｋｅｎａ Ｋら、（２００３）に記載の方法に従い、１ｍＬの分画を、前記推定ＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清を用いて、ドットイムノブロットアッセイにより分析した。
【００４８】
（ＨＰＬＣ分析及び構造決定）
前記ドットイムノブロットアッセイ陽性分画をＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ、東ソー株式会社）に適用し、１００分間で０．１％のトリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルから０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルまで溶離液組成を変化させる線形グラジエント、０．５ｍＬ／分の流速の設定で１００分間の溶出を行なった。溶出画分を２分ごとに回収した後、イムノブロッティングで陽性の画分を、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ、東ソー株式会社）にさらに適用し、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む３１．４％のアセトニトリルを使用するイソクラティック条件下、流速０．５ｍＬ／分で２５分間溶出を行なった。単離した物質を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）装置（
ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ ｐｌｕｓ、株式会社島津製作所）によるアミノ酸配列解析に供した。
【００４９】
（Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）
アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−２ペプチドのｍＲＮＡの発現の局在はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により解析した。簡潔には、アフリカツメガエルの成体の脳下垂体を含む脳組織を、冷却した４％のパラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液に２４時間浸漬し、冷却したスクロース溶液（３０％のスクロースを含むＮａＣｌ／Ｐｉ）中に浸漬した。前記脳組織をＯＣＴコンパウンド（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．）包埋後、−２０°Ｃでクライオスタットを用いて１０μｍの厚さに切断し、３−アミノプロピルトリエトキシシランでコーティングしたスライドの上に戴置した。Ｓａｗａｄａら、（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６９：６０００−６００８、
Ｕｋｅｎａ Ｋら、（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ４０：８０５−８１３、及び、Ｓａｗａｄａ Ｋら、（２００２）Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １７４：３９５−４０２に記載の方法に従い、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識アンチセンスＲＮＡプローブを使用して、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。前記ＤＩＧ標識アンチセンスＲＮＡプローブは、ＲＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ペプチド前駆体ｃＤＮＡの一部から作り出した。ＫｉＳＳ−２ペプチドｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの特異性についての対照実験は、ＤＩＧ標識アンチセンスＲＮＡプローブの共通配列に相補的なＤＩＧ標識センスＲＮＡプローブを使用することにより行った。
【００５０】
（免疫組織化学的検査）
アフリカツメガエルの脳組織を、ブアン液で固定し、−２０°Ｃで２０μｍの厚さの前頭断又は矢状断面を調製した。非特異的結合成分をブロッキングした後、前記切片を１：１，０００に希釈したＫｉＳＳ−２ペプチドのＮ末端側のペプチドに対する抗血清と４°Ｃで終夜反応させた後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させた。染色の特異性を評価するための対照実験には、飽和濃度（１ｍＬ当たり１０μｇのＫｉＳＳ−２ペプチド）の抗原と予め終夜インキュベーションして中和させた前記抗体（希釈比１：１，０００）を使用した。
【００５１】
（ルシフェラーゼアッセイ）
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞由来ＣＶ−１細胞は１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ルシフェラーゼアッセイの際は、トランスフェクションの１日前に、細胞を２４ウェルプレートに播種した。トランスフェクションは、１００ｎｇの内部標準プラスミドｐＣＭＶb−Ｇａｌとともに、１００ｎｇの各受容体ｃＤＮＡと、ＳＲＥ−ｌｕｃベクター又はＣＲＥ−ｌｕｃベクターの１００ｎｇをＳｕｐｅｒＦｅｃｔ ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）とともに使用して実施した。トランスフェクションの１日後、細胞を２４時間血清が欠乏した状態におき、その後、キスペプチンを６時間負荷した。細胞を回収し、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０１（ＥＧ ＆ Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる標準的な方法に従い決定した。ルシフェラーゼ活性は、β−Ｇａｌ値を使用して正規化した。
【００５２】
（データ解析）
全てのアッセイは、１回の実験では同一実験条件のサンプルを３個用意して並列して測定し、かつ、同じ実験を３回繰り返し行った。データ解析は、Ｓ字状用量応答曲線での非線形回帰を用いて行った。最大応答値の５０％の刺激を誘発させるアゴニスト濃度（ＥＣ５０）と、最大応答値を誘発させるアゴニスト濃度（Ｅｍａｘ）とを、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国、カリフォルニア州、サンジエゴ）を使用して算出した。全てのデータを、少なくとも２回の独立した実験結果の平均値±ＳＥＭとして表示した。
【００５３】
結果
メタスチンのアミノ酸配列をさまざまな動物種のゲノムデータベースを用いて解析したところ、従来推定されていた１０個のアミノ酸残基からなるＫｉＳＳ−１ペプチドとは別に、１２個のアミノ酸残基からなる新規メタスチン誘導体ペプチド（ＫｉＳＳ−２）をエンコードするＤＮＡ配列を発見した。次に、新規メタスチン同族体ペプチドＫｉＳＳ−２ペプチドが脳内の特定ニューロンで発現し、ＧＰＲ５４遺伝子ファミリーの内因性リガンドとして機能することが確かめた。また、ＫｉＳＳ−２ペプチドが実際にアフリカツメガエルの脳組織に存在すること、ＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清が脳の特定の領域と反応すること、及び、ＫｉＳＳ−２ペプチドがＫｉＳＳ−１ペプチドのレセプターとして知られているＧＰＲ５４に対してアゴニスト活性を示すことを確かめた。以下にその実験結果を説明する。
【実施例１】
【００５４】
ＫｉＳＳ相同ペプチドのゲノムデータベース解析の結果
図１−Ａは、従来ＧＲＰ５４レセプターの内因性リガンドとして知られていたヒトＫｉＳＳ−１ペプチド（キスペプチン−１０）との相同性が高い他の脊椎動物の相同ペプチドの推定アミノ酸配列のアライメント結果を示す。全ゲノム配列情報が得られる脊椎動物のうち、硬骨魚類のゼブラフィッシュではヒトＫｉＳＳ−１ペプチドと相同性のあるアミノ酸配列が２個見つかった。このうち一方はヒトＫｉＳＳ−１ペプチドと１０個のうち２個のアミノ酸が異なり、他方は３個のアミノ酸が異なる。そこで前者をゼブラフィッシュのＫｉＳＳ−１ペプチド、後者をＫｉＳＳ−２ペプチドと分類した。また、ネッタイツメガエルではヒトＫｉＳＳ−１ペプチドと相同性のあるアミノ酸配列が３個見つかったが、これらのうち１個はゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチドと同一のアミノ酸配列であるのでこれをネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−２ペプチドと分類し、残る２個の相同ペプチドのうちヒトＫｉＳＳ−１ペプチドとの相同性の高い方をＫｉＳＳ−１ａ、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１と相同性の高い方をＫｉＳＳ−１ｂと分類した。これらの分類をもとに無顎類のヤツメウナギ（ｌａｍｐｒｅｙ）、軟骨魚類のゾウザメ（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ）、硬骨魚類のメダカ、両生類のアフリカツメガエル、カモノハシ及びヒトのメタスタチン相同ペプチド、すなわち、ＫｉＳＳ−１ペプチド、ＫｉＳＳ−１ａペプチド、ＫｉＳＳ−１ｂペプチド及びＫｉＳＳ−２ペプチドのアミノ酸配列のアライメントを行った。図１−ＡではヒトＫｉＳＳ−１ペプチドに対応するアミノ酸配列と、アフリカツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドに対応するアミノ酸配列とをそれぞれ四角で囲んだ。ネッタイツメガエルの相同ペプチドのうちの一方はゼブラフィッシュの相同ペプチドと相同性を最大化するためにギャップを挿入し、該ギャップはハイフンで示した。保存アミノ酸残基には影をつけた。アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにより提供されるヒトＫｉＳＳ−１（ＮＰ＿００２２４７）、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１（ＥＦ６９０２７９）、ヤツメウナギＫｉＳＳ−１（ＥＢ７２２２９０及びＥＢ７２２２９１）のｃＤＮＡ配列から推定した。アフリカツメガエルＫｉＳＳ−１、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ａ、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ｂ、ニホンカナヘビＫｉＳＳ−２（ＡＢ４３５４３２）、アフリカツメガエルＫｉＳＳ−２（ＡＢ４３５３８９）、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２、メダカＫｉＳＳ−２（ＡＢ４３５３８６）のｃＤＮＡをクローニングされた。他の推定ｃＤＮＡ配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ又はＧｅｎＢａｎｋにより提供されるメダカＫｉＳＳ−１（ＢＡＡＦ０４０５６４５７、１−５９１５）、カモノハシＫｉＳＳ−１（ＡＡＰＮ０１２３９７５２，１６８８−１７３５）、カモノハシＫｉＳＳ−２（ＡＡＰＮ０１０４３２８０、１−５１５４）、ゾウサメＫｉＳＳ−１（ＡＡＶＸ０１１６２９７１、１−９２２）、ゾウサメＫｉＳＳ−２（ＡＡＶＸ０１１７２３８８、１−２５８７）、ヤツメウナギＫｉＳＳ−２のゲノム配列に基づいて取得した。クローニングしたｃＤＮＡ配列はアスタリスク（＊）で、部分的なｃＤＮＡ配列はシャープ（＃）で示した。推定シグナルペプチド（下線部）は、ＳｉｇｎａｌＰ ３．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を使用して推定した。
【００５５】
我々は、Ｂｌａｓｔ検索により、ＥｎｓｅｍｂｌｅゲノムデータベースとＮＣＢＩデータベースとからカモノハシ、ゾウサメ及びヤツメウナギにおいて類似のｃＤＮＡも見出した（図１−Ａ）。我々は、キスペプチンｃＤＮＡの３種類の形態をＫｉＳＳ−１、ＫｉＳＳ−１ｂ及びＫｉＳＳ−２に分類した。ＫｉＳＳ−１のｃＤＮＡは、１０番目のチロシン残基又はフェニルアラニン残基がアミド化されている場合がある１０個のアミノ酸残基からなる推定ペプチド（キスペプチン−１０）をエンコードした。キスペプチン−１０のアミノ酸配列は、脊椎動物において高度に保存される（図１−Ａのボックス内のキスペプチン−１０の配列を参照せよ。）。
【００５６】
図１−Ｂは、ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドと相同性のある遺伝子の分子進化についての模式図である。ＫｉＳＳ−１遺伝子及びＫｉＳＳ−２遺伝子は、遺伝子／染色体の重複と遺伝子の修復及び欠損とのような進化のメカニズムを通じて、共通の祖先遺伝子から分化したと予想される。両生類は２種類のＫｉＳＳ−１遺伝子を有する。アミノ酸配列の同一性を基準として、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ａは哺乳類のＫｉＳＳ−１（ｍＫｉＳＳ−１）と類似し、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ｂは魚類のＫｉＳＳ−１（ｆＫｉＳＳ−１）と類似する。
【実施例２】
【００５７】
ＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２ペプチドをエンコードするｃＤＮＡのクローニング及び特徴づけ
アフリカツメガエル、ネッタイツメガエル及びゼブラフィッシュのメタスチン相同ペプチドと推定されるペプチドをエンコードするｃＤＮＡのクローニングを行なった。アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３１及び３２と、図５−Ａとにそれぞれ示す。アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３３及び３４と、図５−Ｂとにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ａのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３５及び３６と、図６−Ａとにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３７及び３８と、図６−Ｂとにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３９及び４０と、図６−Ｃとにそれぞれ示す。ゼブラフィッシュのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号４１及び４２と、図７とにそれぞれ示す。
【００５８】
Ｂｌａｓｔ検索により、ＥｎｓｅｍｂｌｅゲノムデータベースとＮＣＢＩデータベースとからカモノハシ、ゾウサメ及びヤツメウナギにおいて類似のｃＤＮＡが見いだされた（図１−Ａ）。キスペプチンｃＤＮＡをＫｉＳＳ−１、ＫｉＳＳ−１ａ、ＫｉＳＳ−１ｂ及びＫｉＳＳ−２に分類した。ＫｉＳＳ−１又はＫｉＳＳ−１ａのｃＤＮＡは、１０番目のチロシン残基又はフェニルアラニン残基がアミド化されている場合がある１０個のアミノ酸残基からなる推定ペプチド（キスペプチン−１０）をエンコードした。キスペプチン−１０のアミノ酸配列は、脊椎動物において高度に保存される。（図１−Ａの四角で囲んだキスペプチン−１０の配列を参照せよ。）ＫｉＳＳ−１のｃＤＮＡに加えて、ネッタイツメガエルにおいて、キスペプチン−１０と類似する推定デカペプチドをエンコードする別のｃＤＮＡ（ＫｉＳＳ−１ｂ）がクローニングされた（図１−Ａ）。推定ＫｉＳＳ−１ｂペプチド（ＹＮＶＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号４３））のアミノ酸配列とキスペプチン−１０のアミノ酸配列との間には１個のアミノ酸残基の違いしかない（図１−Ａ）。そこで、Ｘ.ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのようにキスペプチン−１０と類似する推定デカペプチドをエンコードするｃＤＮＡが２種類存在する場合には、１種類しか存在しない生物におけるＫｉＳＳ−１と同じものをＫｉＳＳ−１ａとする。
【００５９】
一方でＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡは１２個のアミノ酸残基からなる新規な推定ペプチドをエンコードし、該推定ペプチドにおいて１２番目のフェニルアラニン残基はアミド化されている場合がある。ＫｉＳＳ−２ペプチドの推定配列とキスペプチン−１０の推定配列との間には６０％の相同性があった。（図１−Ａの四角で囲んだＫｉＳＳ−２ペプチド及びキスペプチン−１０の配列を参照せよ。）前記ＫｉＳＳ−２ペプチドのアミノ酸配列は、各々の末端に、細胞内タンパク質分解部位としてのグリシンＣ末端アミド化シグナル（ｇｌｙｃｉｎｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｍｉｄａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）及び塩基性アミノ酸と隣接している。この１２個のアミノ酸残基からなるペプチドの配列と、シグナルペプチドの配列とは、脊椎動物において高度に保存されている。
【実施例３】
【００６０】
両生類ＫｉＳＳ−２ペプチドの単離及び同定
ＫｉＳＳ−２推定ペプチドは内在の成熟リガンドとして働くことを確認する必要がある。そこで、脳からの成熟ペプチド単離と、その同定とを行った。アフリカツメガエルの脳における成熟ＫｉＳＳ−２ペプチドを特定するために、前記推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのＣ末端のアミノ酸配列に対する特異的な抗血清を使用するイムノアフィニティー精製を行った。図２−Ａは、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ）に保持された物質のＨＰＬＣプロファイルである。前記逆相カラムに適用され保持された物質を、１００分間で０．１％のトリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルから０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルまで溶離液組成を変化させる線形グラジエントと、０．５ｍＬ／分の流速との設定で１００分間溶出させ、１画分当たり１ｍＬの５０個の画分に分画した。各々の画分について一定分量（１／１００量）を蒸発乾固し、蒸留水に溶解し、ニトロセルロース膜上にスポットした。アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２推定ペプチドへの抗血清に対する免疫陽性の画分が、溶離液中のアセトニトリル含量が３４−３６％のとき、すなわち、溶出時間７０−７４分に対応する画分に溶出された。（水平のバーで示した。）これらの免疫陽性の画分は、３１．４％のアセトニトリルを使用するイソクラティック条件下で逆相ＨＰＬＣ精製を使用して再度クロマト分離された。
【００６１】
図２−Ｂは、図２−Ａに示したＨＰＬＣでの分画により得られた免疫陽性の画分を、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ）によりさらに精製したときのＨＰＬＣプロファイルである。０．１％のトリフルオロ酢酸を含む３１．４％のアセトニトリルを使用するイソクラティック条件下、流速０．２ｍＬ／分で３０分間溶出を行なった。免疫陽性の物質は保持時間１４分で溶出し、そのピークを矢印で示した。図２−Ｂに示されるように、精製した物質は単一のピークとして溶出された。前記精製した物質のアミノ酸配列を決定したところ、ＳＫＦＮＦＮＰＦＧＬＲＦ（配列番号２８）という配列であった。
【００６２】
単離したペプチドのＣ末端の構造を明らかにするために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用した。図２−Ｃは、イムノアフィニティ精製されたＫｉＳＳ−２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる検出を示す図である。タンデムＭＳ分析により、１４７２．７８ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］＋）という観測質量数を有する精製物質のフラグメンテーションパターンが得られた。観察されたスペクトルは、推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのフラグメントイオンの典型的な質量値を示した。この結果から、アフリカツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドは、１２個のアミノ酸からなる配列番号４に列挙されるアミノ酸配列を有し、Ｃ末端がアミド化されたペプチドであると同定された。このペプチドのスペクトルにおける分子イオンピークは、１４７２．８４ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］＋）であった。この値は、推定アミド化ペプチドについて算出した質量数１４７８．７８ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］＋）に近い値であった。得られたＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンにより、ＫｉＳＳ−２ペプチドは、アミノ酸配列がＳＫＦＮＦＮＰＦＧＬＲＦ（配列番号２８）であり、かつ、Ｃ末端のフェニルアラニンがアミド化された構造であると特定することができた。以上より、単離した天然ペプチドは、１２個のアミノ酸残基からなり、Ｃ末端のアミノ酸配列がＲＦであり、かつ、Ｃ末端のフェニルアラニンがアミド化された構造を有することが確認された。
【実施例４】
【００６３】
ＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２のペプチド及びｍＲＮＡの局在
図３−Ａは、アフリカツメガエルの脳組織におけるＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２のｍＲＮＡの局在をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した結果の顕微鏡写真である。図３−Ａ（１）は、アフリカツメガエルの脳の前頭断切片をジゴキシン標識したＫｉＳＳ−１アンチセンスＲＮＡプローブと反応させた後、酵素標識された抗ジゴキシン抗体を用いて発色反応により検出した結果である。図３−Ａ（３）及び（５）は、アフリカツメガエルの脳の前頭断切片をジゴキシン標識したＫｉＳＳ−２アンチセンスＲＮＡプローブと反応させた後、酵素標識された抗ジゴキシン抗体を用いて発色反応により検出した結果である。図３−Ａ（２）、（４）及び（６）は、対照実験としてセンスＲＮＡプローブを使用した結果である。スケールバーは１００μｍを表す。ＫｉＳＳ−１ペプチドのアンチセンスＲＮＡプローブは腹側視床下部（ＶＨ）で強く反応した（図３−Ａ（１））。ＫｉＳＳ−２ペプチドのアンチセンスＲＮＡプローブは、腹側視床下部（ＶＨ）に加えて、視索前野（ＰＯＡ）とも強く反応した（図３−Ａ（３）及び（５））。対照実験では発色はみられなかった。したがって、ＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２ペプチドのアンチセンスＲＮＡプローブの反応はこれらのｍＲＮＡに特異的であると結論された。
【００６４】
図３−Ｂは、アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−２ペプチドの細胞局在を示す顕微鏡写真である。図３−Ｂ（１）及び（３）は脳の前頭断切片を、Ｘ．ｌａｅｖｉｓのＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清と反応させ、その後、標識された２次抗体を用いて発色反応により検出した結果である。図３−Ｂ（２）及び（４）は、対照実験として、飽和濃度の合成ＫｉＳＳ−２ペプチドといっしょにプレインキュベーションした抗血清と反応させ、その後、標識された２次抗体を用いて発色反応により検出した結果である。スケールバーは１００μｍを表す。アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清はＰＯＡの細胞体に反応した。また、前記抗血清は前記ＰＯＡ及びＶＨから投射してその終末が正中隆起（ＭＥ）に達する神経繊維とも反応した。対照実験では発色はみられなかった。したがって、アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清の反応はＫｉＳＳ−２ペプチドに特異的であると結論された。
【００６５】
図３−Ｃは、背側からアフリカツメガエルの中枢神経系組織における前頭断切片の位置を示す模式図と、各切片でのＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清との反応がみられる部位を示した模式図とを示す。黒塗りの丸（●）は免疫陽性の細胞体を表し、黒塗りの星（★）は免疫陽性の線維を表す。Ａｃｃは側坐核を、ＢＮＳＴは分界条床核を、ＤＢはブローカー対角帯核を、ｄｐは背側外套を、ｉｇｌは内部顆粒細胞層を、Ｉｓは峡部核を、ＭＥは正中隆起を、ＭｅＡは内側扁桃核を、ＮＰｖは室傍核を、Ｐｄは末端部を、Ｐｉは中間部を、Ｐｎは後葉を、ＰＯＡは視索前野を、ＳＣは視交叉上核を、ＴＰは後側結節を、ＶＨは腹側視床下部核を、ＶＭは視床腹内側核をそれぞれ表す。図３−Ｃの各切片に示すとおり、免疫陽性の線維は、視床下部のいくつかの領域と、脳の他の領域とにも多数存在した。
【００６６】
ＫｉＳＳ−２ペプチド免疫陽性の神経軸索は正中隆起に観察された。ＰＯＡの巨細胞性のニューロンはその軸索を正中隆起の下垂体門脈に投射していることが知られているので、ＰＯＡに存在するＫｉＳＳ−２ペプチドニューロンが正中隆起の下垂体門脈を介して主要な下垂体前葉ホルモンを調節している可能性がある。
【００６７】
ＫｉＳＳ−２ペプチドはＰＯＡとＶＨのニューロンの他に、前脳の神経軸索で観察された。両生類のＰＯＡとＶＨに電気的な刺激を与える実験により、これらの神経核がゴナドトロピンと性ステロイドの分泌を調節していること、ＰＯＡを電気刺激することでカエルの交尾期の鳴き声を喚起すること、その中でも特に腹側のＰＯＡは交尾期の鳴き声ジェネレーターを活性化することが知られているため、ＫｉＳＳ−２ペプチドは、視床下部・下垂体の生殖内分泌系を制御するというＫｉＳＳ−１と類似の機能の他に、動物の繁殖行動を制御する神経ペプチドとしての機能も有すると考えられる。
【実施例５】
【００６８】
ＧＰＲ５４相同遺伝子のゲノムデータベース解析の結果
図４は、さまざまな脊椎動物種から同定されたＧＰＲ５４のアミノ酸配列のアライメントと、ＧＰＲ５４のｃＤＮＡの構造とを示す図である。図４−Ａは、さまざまな脊椎動物種から同定されたＧＰＲ５４のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。相同性を最大化するためにギャップを挿入し、該ギャップはハイフンで示した。保存アミノ酸残基には影をつけた。右側の数字は、アミノ酸残基の位置を示す。推定７回膜貫通ヘリックス（ＴＭＨ）を、整列させた配列の上側に示す。黒塗りの三角（▲）はスプライシングジャンクションを示す。シャープ（＃）はＥｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒにより提供されるゲノムデータベースから推定された推定アミノ酸配列を示す。Ｈｕｍａｎ；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９：８６８２０３：８７３７４５：１、Ｚｅｂｕｒａｆｉｓｈ−２；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２：２８２２４１１３：２８２７４２５０：１、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ−１：Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ５：６２０１１０５９：６２０１９７０２：−１、ｍｅｄａｋａ−２；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７：２９８３９７６１：２９８５５７０６：−１、ｍｅｄａｋａ−１；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ９：４４８０５２１：４５００７３３：−１、ＸＴ−１ａ；ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２８９：１０１０８９７：１０５１６３９：−１、ＸＴ−１ｂ；ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１２２：１２０３３０７：１２４３５５８：−１、ＸＴ−２；ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２５６７：３７０１８：３３１７６：１及びｓｃａｆｆｏｌｄ＿４：５１１１８６−５１８３８９：１、Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｎａｔｉｎｕｓ−１（Ｏｒｎ−１）；Ｕｌｔｒａ＿２６６：３９０１５０：３９５９２４：１、Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｎａｔｉｎｕｓ−２（Ｏｒｎ−２）；Ｃｏｎｔｉｇ＿１５６２９：１１００：６７８９：１。ＧＰＲ５４遺伝子のオープンリーディングフレームは、ゼブラフィッシュのＧＰＲ５４−１では３６４個のアミノ酸からなるタンパク質を、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａでは３６６個のアミノ酸からなるタンパク質を、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂでは３６７個のアミノ酸からなるタンパク質を、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２では３６９個のアミノ酸からなるタンパク質を、それぞれエンコードする。
【００６９】
図４−Ｂは、ＧＰＲ５４のｃＤＮＡの構造を示す図である。ＧＰＲ５４のｃＤＮＡは５個のエクソンからなる。影付きのボックスの中のローマ数字は膜貫通ヘリックスドメインの番号を表す。ゼブラフィッシュ及びネッタイツメガエル由来の推定ＧＰＲ５４の配列をＥｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースにおいて見出した。ゼブラフィッシュ（ｚ）についてはＧＰＲ５４−１はＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ５ ｌｏｃａｔｉｏｎ ６２，０１１，０５９−６２，０１９，７０２に見出された。ネッタイツメガエル（ｘｔ）についてはＧＰＲ５４−１ａ（ＸＴ−１ａ）はｓｃａｆｆｏｌｄ＿２８９ ｌｏｃａｔｉｏｎ １，０１０，８９７−１，０５１，６３９に、ＸＴ−１ｂはｓｃａｆｆｏｌｄ＿１２２ ｌｏｃａｔｉｏｎ １，２０３，３０７−１，２４３，５５８に、ＸＴ−２はｓｃａｆｆｏｌｄ＿２５６７ ｌｏｃａｔｉｏｎ ３７，０１８−３３，１７６とｓｃａｆｆｏｌｄ＿４ ｌｏｃａｔｉｏｎ ５１１，１８６−５１８，３８９とに、それぞれ見出された。ｂｆＦＰＲ５４のハイドロパシー分析により、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に典型的な疎水性アミノ酸残基からなる７種類の配列の存在が明らかとなった。ゲノム分析及びｃＤＮＡ分析により、全てのＧＰＲ５４が５個のエクソンを有し、かつ、スプライシングジャンクションの位置が保存されていることが明らかになった。
【００７０】
図４−Ｃは、ＧＰＲ５４遺伝子の分子進化についての仮説を示す模式図である。ＧＰＲ５４は、遺伝子／染色体の重複と遺伝子の修復及び欠損とのような進化のメカニズムを通じて、共通の祖先遺伝子から分化したと予想される。両生類は３種類の形態のＧＰＲ５４遺伝子を有する。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ａはヒト及びカモノハシのＧＰＲ５４−１のホモログであり、ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ｂは魚類のＧＰＲ５４−１の同族体である。アミノ酸配列の同一性を基準として、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２は魚類のＧＰＲ５４−２の同族体であると考えられる。
【００７１】
図１２は、ヒトと、ツメガエルと、ゼブラフィッシュとの間でのＫｉＳＳ−１遺伝子座のシンテニーを示す図である。ヒト、ネッタイツメガエル及びゼブラフィッシュのゲノム構成は、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから取得した。ＰＬＥＫＨＡ６はプレクストリン相同ドメイン含有ファミリーＡメンバー６であり、ＲＥＮはレニン前駆体である。
【００７２】
図１３は、カモノハシＧＰＲ５４−１と、ヒトＧＰＲ５４と、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａとの間でのシンテニーを示す図である。前記ＧＰＲ５４の遺伝子座のヌクレオチド配列データは、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから取得した。Ｃ１９ｏｒｆ２１は未特定タンパク質Ｃ１９ｏｒｆ２１であり、ＭＥＤ１６はＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写サブユニット１６のメディエーターであり、ＰＡＬＭはパラレミンであり、ＰＳＡＴ１はホスホセリンアミノトランスフェラーゼ１アイソフォームであり、ＰＴＢＰ１はポリピリミジントラクト結合タンパク質１（ＰＴＢ）であり、ＷＤＲ１８はＷＤ反復タンパク質１８であり、ＺＣＣＨ６はジンクフィンガーＣＣＨＣドメイン含有タンパク質６である
ゲノムシンテニー解析（図１３）及び相同性解析（表１）に基づき、ネッタイツメガエル及び魚類のＧＰＲ５４を分類した。ゲノムシンテニー解析により、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａと、ヒトＧＰＲ５４と、カモノハシＧＰＲ５４−１とが、未特定タンパク質Ｃ１９ｏｒｆ２１（Ｃ１９ｏｒｆ２１）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写サブユニット１６のメディエーター（ＭＥＤ１６）、パラレミン（ｐａｒａｌｅｍｍｉｎ、ＰＡＬＭ）、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１（ＰＴＢＰ１）、ＷＤ反復タンパク質（ＷＤＲ１８）を含む、共通の遺伝子座を含むゲノム領域に局在することが明らかとなった。したがってネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａは、ヒトＧＰＲ５４のホモログであるようである。ヒトＧＰＲ５４と、いずれかの魚類のＧＲＰ５４との間ではシンテニーは観察されなかった。ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂと、メダカのＧＰＲ５４−１とが、共通の遺伝子座のジンクフィンガーＣＣＨＣドメイン含有タンパク質６（ＺＣＣＨ６）を有するゲノム領域に局在した。ｚＧＰＲ５４−１を含むゲノム領域はＺＣＣＨ６を有しないが、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ１アイソフォーム（ＰＳＡＴ１）遺伝子座をメダカのゲノム領域と共有する。このシンテニー解析を支持して、魚類のＧＰＲ５４は、３種類のネッタイツメガエルＧＰＲ中でネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂと最も高い（５８〜６３％）アミノ酸配列の同一性を有する。したがってネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂは、魚類のＧＰＲ５４−１のホモログだと考えられる。ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２と、魚類のＧＲＰ５４−２との間では、非常に高いアミノ酸配列の同一性（６９〜７４％）を有していたが、シンテニーは観察されなかった。ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａは、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４（６０％）よりもネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂ（７０％）と高いアミノ酸配列同一性を有するので、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａ及びネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂは遺伝子の重複により生成されたと考えられる。したがってＧＰＲ５４遺伝子の進化の過程は、下で述べるようなものだと考えられる。全てのＧＰＲ５４遺伝子において、５個のエクソンが存在し、かつ、スプライシングジャンクションが保存されており、類似の遺伝子構造を有する。したがってこれらは、共通の祖先遺伝子の遺伝子／染色体の重複により発生し、ＧＰＲ５４−１及びＧＰＲ５４−２という２系列のＧＰＲ５４を生成したと考えられる。両生類ではＧＰＲ５４−１は、さらにもう１回の遺伝子／染色体の重複を受け、ＧＰＲ５４−１ａ及びＧＰＲ５４−１ｂを生成した。哺乳類では単孔類は２種類のＧＰＲ５４遺伝子を有する場合があるが、ヒトは、おそらく遺伝子欠損のために１種類のＧＰＲ５４のみを有する（図４−Ｃ）。
【００７３】
【表１】
【実施例６】
【００７４】
ＧＰＲ５４レセプター相同タンパク質をエンコードするｃＤＮＡのクローニング
ゼブラフィッシュ及びネッタイツメガエルのＧＰＲ５４ｃＤＮＡクローニング
ネッタイツメガエル及びゼブラフィッシュのＧＰＲ５４レセプター相同タンパク質と推定されるタンパク質をエンコードするｃＤＮＡのクローニングを行なった。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒにより提供されるゲノム配列に基づき、ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１（ＸＴ−１ａ）、ＧＰＲ５４−２（ＸＴ−１ｂ）及びＧＰＲ５４−３（ＸＴ−２）と、ゼブラフィッシュのＧＰＲ５４−１（Ｚｅｂｒａ−１）とのｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させた。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ａのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号４４及び４５と、図８とにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号４６及び４７と、図９とにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号４８及び４９と、図１０とにそれぞれ示す。ゼブラフィッシュのＧＰＲ５４−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号５０及び５１と、図１１とにそれぞれ示す。
【実施例７】
【００７５】
ＫｉＳＳ−２ペプチドのＧＰＲ５４レセプターに対するアゴニスト活性
ヒトＧＰＲ５４、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２又はネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２のレセプターｃＤＮＡの発現コンストラクトと、ＳＲＥ−ｌｕｃベクターとをＣＶ−１細胞に導入するトランスフェクションを行った。４８時間後、トランスフェクションされた細胞に、１０−１０モル（０．１ｎＭ）から１０−５モル（１０μＭ）の濃度のヒトＫｉＳＳ−１（Ｈ−１０）、齧歯類ＫｉＳＳ−１（Ｒ−１０）、ツメガエルのＫｉＳＳ−１ａ（Ｘ１ａ−１４）、ＫｉＳＳ−１ｂ（Ｘ１ｂ−ｐ１５）及びＫｉＳＳ−２（Ｘ２−１０、Ｘ２−１２）、ゼブラフィッシュのＫｉＳＳ−１（Ｚ１−１０、Ｚ１−１５、Ｚ１−ｐ１５）及びＫｉＳＳ−２（Ｚ２−１０、Ｚ２−１２）ペプチドを添加し、これらのＫｉＳＳペプチドによって誘導されたルシフェラーゼ活性を測定した。前記ルシフェラーゼ活性をレセプターのアゴニスト活性として各ＫｉＳＳペプチドごとにプロットした結果を図１４Ａ−Ｄにそれぞれ示す。各ＫｉＳＳペプチド濃度でのアゴニスト活性のプロットは、立ち上がりのＫｉＳＳペプチド濃度より１桁高い濃度でＥＣ５０に達し、さらに１桁高い濃度でプラトーに達するシグモイド曲線を示した。以下、ＥＣ５０の値で比較・検討を行なった。
【００７６】
ヒトＧＰＲ５４に対するＥＣ５０は、ヒト及び齧歯類ＫｉＳＳ−１ペプチドではともに１０−８モル、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドでは１０−７モル、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドでは１０−６モルであった（図１４−Ａ）。ヒト及び齧歯類のペプチドのヒトＧＰＲ５４レセプターに対するアゴニスト活性はほぼ同じ強さであるが、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドはヒト及び齧歯類よりも１桁低いアゴニスト活性を示し、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドは、さらに約１桁低いアゴニスト活性を示した。以上の結果から、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドはヒトでも薬理作用を示す可能性が明らかになった。
【００７７】
ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１に対するＥＣ５０は、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドは１０−７モル、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチド及びヒトＫｉＳＳ−１ペプチドは１０−６モルであった（図１４−Ｂ）。ＫｉＳＳ−１ペプチドもＫｉＳＳ−２ペプチドもゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１レセプターに対するアゴニスト活性を示した。しかし、ヒトＫｉＳＳ−１及びゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチドのアゴニスト活性は、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドのアゴニスト活性より１桁低かった。
【００７８】
ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２に対するＥＣ５０は、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドは１０−８モル、ヒトＫｉＳＳ−１ペプチド及びゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチドは１０−７モルであった（図１４−Ｃ）。ＫｉＳＳ−１ペプチドもＫｉＳＳ−２ペプチドもゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２レセプターに対するアゴニスト活性を示した。ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１レセプターと同様に、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２レセプターに対するヒトＫｉＳＳ−１及びゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチドのアゴニスト活性は、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドのアゴニスト活性より１桁低かった。しかし、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２レセプターに対するアゴニスト活性は、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１レセプターに対するアゴニスト活性より１桁高かった。本実験の結果から、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドとＫｉＳＳ−２ペプチドが共に、ゼブラフィッシュ等の魚類において、ＧＰＲ５４−２レセプターに対して薬理作用を示すアゴニストとして使用できる可能性が明らかになった。
【００７９】
ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２に対するＥＣ５０は、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２ペプチドは１０−７モルであった（図１４−Ｄ）。ツメガエルのＫｉＳＳ−１ａペプチド、ＫｉＳＳ−１ｂペプチド及びＫｉＳＳ−２ペプチドのネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２レセプターに対するアゴニスト活性は、ほぼ同程度であった。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−２レセプターに対するアゴニスト活性は、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１（図１４−Ｂ）と同程度であり、ヒトＧＰＲ５４レセプター（図１４−Ａ）及びゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２レセプター（図１４−Ｃ）よりも１桁低かった。本実験の結果から、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ａ、ＫｉＳＳ−１ｂペプチド及びＫｉＳＳ−２ペプチドがともに、ネッタイツメガエル等の両生類において、ＧＰＲ５４−２レセプターに対して薬理作用を示すアゴニストとして使用できる可能性が明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１−Ａ】脊椎動物におけるＫｉＳＳ−１ペプチド、ＫｉＳＳ−１ｂペプチド及びＫｉＳＳ−２ペプチドの推定アミノ酸配列のアライメントを示す図。
【図１−Ｂ】ＫｉＳＳ−１遺伝子の分子進化についての仮想的な模式図。
【図２−Ａ】逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ）に保持された物質のＨＰＬＣプロファイル。
【図２−Ｂ】図２−Ａに示したＨＰＬＣでの分画により得られた免疫陽性の画分を、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ）によりさらに精製したときのＨＰＬＣプロファイル。
【図２−Ｃ】イムノアフィニティ精製されたＫｉＳＳ−２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる検出を示す図。
【図３−Ａ】アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−１ ｍＲＮＡ及びＫｉＳＳ−２ ｍＲＮＡの細胞局在を示す顕微鏡写真。
【図３−Ｂ】アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−２ペプチドの細胞局在を示す顕微鏡写真。
【図３−Ｃ】アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−２ペプチドに対する免疫陽性部位を示した前頭断の模式図。
【図４−Ａ】さまざまな脊椎動物種から同定されたＧＰＲ５４のアミノ酸配列のアライメントを示す図。
【図４−Ｂ】ＧＰＲ５４のｃＤＮＡの構造を示す図。
【図４−Ｃ】ＧＰＲ５４遺伝子の分子進化についての仮想的な模式図。
【図５−Ａ】アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−１のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図５−Ｂ】アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図６−Ａ】ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ａのｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図６−Ｂ】ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ｂのｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図６−Ｃ】ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図７】ゼブラフィッシュのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図８】ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ａのｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図９】ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ｂのｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図１０】ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−２のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図１１】ゼブラフィッシュのＧＰＲ５４−１のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図１２】ヒトと、ネッタイツメガエルと、ゼブラフィッシュとの間でのＫｉＳＳ−１アレルのシンテニーを示す図。
【図１３】カモノハシＧＰＲ５４−１と、ヒトＧＰＲ５４と、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａとのアレルのシンテニーを示す図。
【図１４】ＧＰＲ５４のリガンド選択性を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規メタスチン同族体に関し、具体的には、ＫｉＳＳ−２ペプチドと、該ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを含む発現コンストラクトと、これらを含む、疾患を治療するための組成物と、該組成物を投与するステップを含む疾患の治療方法と、前記ペプチドに対する抗体と、該抗体を含む疾患の診断用キットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
キスペプチンはオーファンレセプターのＧＰＲ５４の内因性リガンドとして発見された（非特許文献１、２及び３）。ＫｉＳＳ−１遺伝子には癌転移（metastasis）抑制作用があることから、当該遺伝子の産物であるキスペプチンは癌治療に役立つと当初考えられ、生体内から分離精製されたアミノ酸５４個からなるＫｉＳＳ−１遺伝子産物の部分断片でＣ末端がアミド化されたペプチドはメタスチンと命名された。しかし、ＧＰＲ５４レセプターの異常が低ゴナドトロピン・性腺機能低下症と密接に結びついていることが報告され、メタスチンは性成熟に重要なペプチドであることが示された（非特許文献４）。その後、メタスチンは中枢神経系、特に視床下部で強く発現しており、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のニューロンに直接働いてＧｎＲＨの発現・分泌を促進する作用があることが判明した（非特許文献５）。このようにメタスチンは視床下部−下垂体−性腺軸の生殖神経内分泌系において重要な働きを持つペプチドである。
【非特許文献１】Welch, D. R.ら、(1994) Oncogene 9: 255-262.
【非特許文献２】Lee, J.-H.ら、(1996) J. Nat. Cancer Inst. 88: 1731-1737, 1996.
【非特許文献３】Ohtaki, T.ら、(2001) Nature 411: 613-617.
【非特許文献４】Seminara, S. B.ら、(2003) New Eng. J. Med. 349: 1614-1627.
【非特許文献５】Kinoshita, M.ら、(2005) Endocrinology 146: 4431-4436, 2005. ヒトのＫｉＳＳ−１遺伝子は、１４５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしており、このうちＮ末端の１９個のアミノ酸はシグナルペプチドで、第６８番目から第１２１番目までの５４個のアミノ酸からなるタンパク質が切り出されたものがメタスチンである。以下では、ＫｉＳＳ遺伝子産物のタンパク質を「キスペプチン」といい、キスペプチンの第６８番目から第１２１番目までの５４個のアミノ酸からなるキスペプチン断片を「キスペプチン６８−１２１」と表す。同様にメタスチンについても第４５番目のアミノ酸から第５４番目のアミノ酸までの１０個のアミノ酸からなるペプチドを「メタスチン４５−５４」と表す（非特許文献６及び７）。キスペプチン６８−１２１はメタスチン１−５４と同一のペプチドであり、メタスチン４５−５４はキスペプチン１１２−１２１と同一のペプチドである。メタスチンのＣ末端がアミド化されない場合にはＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性は非常に減弱するが、Ｃ末端がアミド化されていればＮ末端アミノ酸が除去されていてもＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性を有する。実際、メタスチン４０−５４や、メタスチン４５−５４でもＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性はメタスチンよりも３倍ないし１０倍アゴニスト活性が高い（非特許文献３）。ＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性を有する最短のキスペプチン断片であるキスペプチン１１２−１２１又はメタスチン４５−５４をそれぞれキスペプチン−１０又はメタスチン−１０と表す。キスペプチン６８−１２１又はメタスチン１−５４をキスペプチン−５４又はメタスチン−５４と表す。
【非特許文献６】Seminara, S. B.（２００５）J. Clin. Endocr. Metab. 90: 6738-6740.
【非特許文献７】Dhillo, W. S.ら、（２００５）J. Clin. Endocr. Metab. 90: 6609-6615. メタスチン−１０又はメタスチン−５４はともにＣ末端がアルギニン−フェニルアラニン−ＮＨ２であるが、これと同一のＣ末端構造を有するペプチドのファミリーが存在する。アルギニン及びフェニルアラニンの１文字表記であるＲ及びＦと末端アミド基を有することからＲＦアミドペプチドと総称される。ＲＦアミドペプチドには、鳥類の脳ペプチド（gonadotropin-inhibitory hormone）のように生殖腺刺激ホルモンの放出を抑制する作用を有するものがある（非特許文献８）が、摂食行動に関与するＲＦアミドペプチドも知られている（非特許文献９）。ＫｉＳＳ遺伝子及びＧＰＲ５４遺伝子はともに膵臓で強く発現する（非特許文献３）が、ＧＰＲ５４遺伝子のノックアウトマウスは生殖機能以外には異常がみられない（非特許文献４）。そこで、メタスチンとそのレセプターであるＧＰＲ５４遺伝子産物とが関与する経路には代替的な経路が存在し、未知の機能を担っている可能性がある。かかる代替的経路にはメタスチンと類似のアミノ酸配列を有するＣ末端がアミド化されたペプチドホルモン、すなわちメタスチンと同じファミリーに属する同族体が関与すると考えられる。
【非特許文献８】Tsutsui, K.ら、（２０００）Biochem. Biophys. Res. Commun. 275: 661-667.
【非特許文献９】Dockray, G.J.（２００４）Exp. Physiol. 89: 229-235.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、発明者らは新規メタスチン同族体を探索し、ＫｉＳＳ−１のサブファミリーであるＫｉＳＳ−１ａ及びＫｉＳＳ−１ｂと、ＫｉＳＳ−１とは異なる別のファミリーメンバーであるＫｉＳＳ−２の遺伝子及びその産物であるペプチドを発見した。本発明はこの発見に基づいて新規メタスチン同族体とその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【０００５】
本発明のペプチドはＣ末端がアミド化されている場合がある。
【０００６】
本発明は、本発明のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のペプチドを産生する発現コンストラクトを提供する。
【０００８】
本発明は、本発明の発現コンストラクトを含み、本発明のペプチドを産生する宿主細胞を提供する。
【０００９】
本発明は、本発明のペプチドと、該ペプチドの塩と、前記ペプチド又はその塩のプロドラッグと、本発明のポリヌクレオチドと、本発明の発現コンストラクトと、本発明の宿主細胞とからなるグループから選択される少なくとも１つを含む、疾患を予防又は治療するための医薬品組成物を提供する。
【００１０】
本発明の医薬品組成物において、前記疾患は生殖機能障害の場合がある。
【００１１】
本発明の医薬品組成物において、前記疾患は癌又は腫瘍の場合がある。
【００１２】
本発明は、本発明のペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。
【００１３】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体の場合がある。
【００１４】
本発明は、本発明の抗体を含む疾患の診断用キットを提供する。
【００１５】
本発明の診断用キットにおいて、前記疾患は生殖機能障害の場合がある。
【００１６】
本発明の診断用キットにおいて、前記疾患は癌又は腫瘍の場合がある。
【００１７】
本発明は、ヒト又はヒト以外の動物の疾患の予防又は治療方法であって、本発明の医薬品組成物と、本発明の抗体とのうち少なくとも１つを投与するステップを含む、予防又は治療方法を提供する。
【００１８】
本発明の予防又は治療方法において、前記疾患は生殖機能障害の場合がある。
【００１９】
本発明の予防又は治療方法において、前記疾患は癌又は腫瘍の場合がある。
【００２０】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００２１】
本明細書でアミノ酸を表す場合、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（Ｌ−又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、生体内でメッセンジャーＲＮＡからリボゾームで合成されるタンパク質の翻訳に用いられる２０種類のＬ−アミノ酸とこれらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むがこれらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。
【００２２】
また、本明細書でペプチドを表す場合、ペプチドを構成するアミノ酸残基は、慣用の３文字表記で示され、ハイフンで結んで表される。例えば２個のアミノ酸の３文字表記がハイフンで結ばれて表される場合には、左側のアミノ酸のカルボキシル基と右側のアミノ酸のアミノ基とがペプチド結合したジペプチドであることを表す。したがってＡｓｎ−Ａｌａは、Ｌ−アスパラギンのカルボキシル基とＬ−アラニンのアミノ基とがペプチド結合したジペプチドであって、Ｌ−アスパラギンのアミノ基とＬ−アラニンのカルボキシル基は修飾されていないことを意味する。本明細書において、Ｃ末端がアミド化されたペプチドは「Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２」のように表記する。アミノ酸配列を配列番号を示して引用するアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｃ末端がアミド化されている場合と、アミド化されていない場合とを含む。
【００２３】
本発明のペプチドは、動物の組織から精製して調製される場合がある。代替的には、本発明のペプチドのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明のペプチドは、ＧＰＲ５４レセプターへのアゴニスト活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明の医薬品組成物に使用されてもよく、あるいは、精製された状態で本発明の医薬品組成物に使用されてもよい。
【００２４】
本発明の医薬品組成物と、診断用キットと、治療方法との対象となる疾患は、生殖機能障害と、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の調節異常と、走化性その他の細胞遊走の異常と、細胞外マトリクスの分解その他細胞の行動異常と、癌又は腫瘍と、糖尿病その他の糖代謝異常と、高脂血症その他の脂質代謝異常と、急性もしくは慢性膵炎と、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化その他の心臓循環器系疾患と、肥満、食欲減退、食欲亢進その他の摂食行動の異常とを含む。生殖機能障害には、１次性徴及び／又は２次性徴の異常を含む生殖腺の発生及び／又は分化の異常と、性行動の異常と、月経異常その他の排卵異常と、受精又は卵割の異常と、着床の異常を含む妊娠異常と、乳腺の絨毛癌、胞状奇胎、胎児の発育不全と、侵入奇胎その他の胎盤の形成及び／又は機能の異常と、切迫流産その他分娩誘発の異常とを含むがこれらに限られない。前記癌又は腫瘍は、絨毛癌、胞状奇胎、トロホブラストーマ、前立腺癌、精巣腫瘍、卵巣腫瘍、乳癌、子宮内膜症、子宮筋腫、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、悪性メラノーマ、骨肉腫、甲状腺乳頭癌を含むがこれらに限られない。
【００２５】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含むキメラ抗体又は組換え抗体とからなるグループから選択される場合がある。抗体の抗原結合断片は、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。
【００２６】
抗体は、当業者に知られたさまざまな技術によって調製される場合がある。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照せよ。
【００２７】
本発明で用いられるポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを免疫原として、ほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ）又は鳥類（例えばニワトリ）のいずれかの動物宿主に注射される。ウシ血清アルブミン又はスカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）のような担体タンパク質と連結される場合に優れた免疫応答が誘発される場合がある。前記免疫原は、１回又は２回以上のブースター免疫を取り込んだ予め定められたスケジュールに従って、前記動物宿主に注射されることが好ましい。前記免疫原は、完全又は不完全フロイントアジュバントその他の免疫増強剤に混合して前記動物宿主に注射される場合がある。本発明のポリクローナル抗体は、かかる抗血清から、例えば適当な固体支持体に結合された本発明のペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製される場合がある。
【００２８】
本発明で用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１-５１９、１９７６の技術と、その改良技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死性細胞株の調製を伴う。かかる細胞株は上記のとおり免疫された動物宿主由来の脾臓細胞から作成される場合がある。前記脾臓細胞は、さまざまな方法で不死化され、抗体産生能を有する不死化細胞株が調製される。前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された動物と同種かあるいは異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって不死化される。当業者に周知のさまざまな融合技術を用いる場合がある。例えば、前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは非イオン性界面活性剤と数分間混合され、それからハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度でプレートされる。好ましい選択技術はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。通常約１ないし２週間の十分な時間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、その培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。反応性及び特異性が高いハイブリドーマが好ましい。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異性が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。さらに、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマ細胞株を注射するような、収率を向上させるためのさまざまな技術が用いられる場合がある。モノクローナル抗体は前記ハイブリドーマ細胞腹水又は血液から回収される場合がある。汚染物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿及び抽出のような従来技術によって前記抗体から除去される場合がある。
【００２９】
本発明で用いられる抗体の抗原結合断片は、それぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンでインタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ及びＶＬ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。
【００３０】
本発明で用いられる組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換か、適当なほ乳類細胞宿主へのトランスフェクションかを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。本発明で用いられるキメラ抗体は、前記本発明の組換え抗体の抗原結合部位が本発明のペプチドと特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質である。本発明で用いられるキメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）とを含む。本発明の組換え抗体は原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。
【００３１】
本発明のペプチドの塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩等が挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等との塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等）等の無機塩、アンモニウム塩等が、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩が好ましい。
【００３２】
本発明のペプチド又はその塩のプロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により本発明のペプチドに変換するペプチド又はその誘導体、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明のペプチドに変化するペプチド又はその誘導体、例えば、胃酸等により加水分解等を起こして本発明のペプチド又はその塩に変化するペプチド又はその誘導体をいう。本発明のペプチド又はその塩のプロドラッグは、本発明のペプチドのアミノ基がアシル化、アルキル化、リン酸化されたペプチド又はその誘導体（例えば、本発明のペプチドのアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、tert−ブチル化されたペプチド誘導体等）と、本発明のペプチドの水酸基がアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化されたペプチド誘導体（例えば、本発明ペプチドの水酸基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化されたペプチド誘導体等）と、本発明のペプチドのカルボキシル基がエステル化、アミド化されたペプチド誘導体（例えば、本発明のペプチドのカルボキシル基がエチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化、メチルアミド化されたペプチド誘導体等）とを含むが、これらに限られない。これらのペプチド誘導体は公知の方法によって本発明のペプチドから製造することができる。本発明のプロドラッグは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような生理的条件で本発明のペプチドに変化するものであってもよい。
【００３３】
本発明の医薬品組成物は、毒性が低く、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている自体公知の手段に従って、本発明の化合物をそのままあるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤、（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等の医薬製剤として、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。本発明の化合物の本発明製剤中の含有量は、製剤全体の約０.０１ないし約１００重量％である。本発明の化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、癌患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常、癌患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００３４】
本発明の医薬品組成物の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体は、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を含み、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等を含む。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。賦形剤は、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等を含む。結合剤は、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を含む。崩壊剤は、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等を含む。溶剤は、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等を含む。溶解補助剤は、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を含む。懸濁化剤は、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等を含む。等張化剤は、例えばブドウ糖、 Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等を含む。緩衝剤は、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等を含む。無痛化剤は、例えばベンジルアルコール等を含む。防腐剤は、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を含む。抗酸化剤は、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等を含む。
【００３５】
さらに、本発明の医薬品組成物は、本発明の医薬品組成物以外の薬物と併用して使用することができる。本発明の医薬品組成物と併用し得る薬物（以下、併用薬物と略記する場合がある）としては、例えば、癌治療のための化学療法剤、ホルモン療法剤、免疫療法剤等の薬剤（以下、併用薬剤と略記する）と組み合わせて用いることができる。前記「化学療法剤」は、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来抗癌剤等を含む。「アルキル化剤」は、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、カルボコン、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシン等を含む。「代謝拮抗剤」は、例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５−ＦＵ系薬剤（例、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフールなど）、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチン等を含む。「抗癌性抗生物質」は、例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシン等を含む。「植物由来抗癌剤」は、例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビン等を含む。前記「ホルモン療法剤」は、例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、アリルエストレノール、ゲストリノン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキフェン、レボルメロキシフェン、抗エストロゲン（例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェンなど）、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬（例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタンなど）、抗アンドロゲン（例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミドなど）、５α-レダクターゼ阻害薬（例、フィナステリド、エプリステリドなど）、副腎皮質ホルモン系薬剤（例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンなど）、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロンなど）、レチノイドおよびレチノイドの代謝を遅らせる薬剤（例、リアロゾールなど）等を含み、なかでもＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど）が好ましい。前記「免疫療法剤（ＢＲＭ）」としては、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾール等を含む。
【００３６】
本発明の医薬品組成物と併用薬物とを組み合わせることにより、
（１）本発明の医薬品組成物又は併用薬物を単独で投与する場合に比べて、その投与量を軽減することができる、
（２）患者の症状（軽症、重症など）に応じて、本発明の医薬品組成物と併用する薬物を選択することができる、
（３）本発明の医薬品組成物と作用機序が異なる併用薬物を選択することにより、治療期間を長く設定することができる、
（４）本発明の医薬品組成物と作用機序が異なる併用薬物を選択することにより、治療効果の持続を図ることができる、
（５）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを併用することにより、相乗効果が得られる、などの優れた効果を得ることができる。
【００３７】
以下、本発明の医薬品組成物と併用薬物を併用して使用することを「本発明の併用剤」と称する。本発明の併用剤の使用に際しては、本発明の化合物と併用薬物の投与時期は限定されず、本発明の化合物またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬物の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することができる。本発明の併用剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明の医薬品組成物と併用薬物とが組み合わされていればよい。このような投与形態は、例えば、（１）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）本発明の医薬品組成物とを別々に製剤化して得られる２種２種の製剤の投与の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）本発明の医薬品組成物と併用薬物とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明の医薬品組成物；併用薬物の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等を含む。
【００３８】
本発明の医薬品組成物又は併用薬物は、固形製剤（例、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤）などの経口投与用製剤か、坐剤などの直腸投与用製剤か、注射用製剤かの剤形で製造される場合がある。本発明の医薬品組成物又は併用薬物は、徐放性マイクロカプセル剤等の徐放性製剤として製造される場合がある。あるいは、ポリエチレングリコール付加その他の薬物送達技術を適用した製剤として製造される場合がある。
【００３９】
本発明の疾患の治療方法は、ヒトに施される場合がある。あるいは、ヒト以外の動物に施される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００４１】
材料及び方法
（使用したペプチド）
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＫｉＳＳ−１０（Ｈ−１０；配列番号１のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、齧歯類のＫｉＳＳ−１０Ｙ（Ｒ−１０；配列番号２のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）のＫｉＳＳ−１０Ｆ（Ｘ２−１０；配列番号３のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−１２Ｆ（Ｘ２−１２Ｆ；配列番号４のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）のＺ１−１０（配列番号５のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュのＺ１−１５（配列番号６のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュのＺ１−ｐ１５（配列番号７のアミノ酸配列を有し、N末端がピログルタミン酸化され、Ｃ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュのＺ２−１０（配列番号８のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ゼブラフィッシュのＺ２−１２（配列番号９のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ネッタイツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のＸ１ａ−１４（配列番号１０のアミノ酸配列を有しＣ末端がアミド化されたペプチド）と、ネッタイツメガエルのＸ１ｂ−ｐ１５（配列番号１１のアミノ酸配列を有し、N末端がピログルタミン酸化され、Ｃ末端がアミド化されたペプチド）とを、Ａｎｙｇｅｎ（韓国）から購入した。
【００４２】
（使用したプラスミド）
ｐｃＤＮＡ３発現ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ｐＣＭＶβ−Ｇａｌベクターを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから取得した。シグナル伝達特異的レポーターベクターＣＲＥ−ｌｕｃ及びＳＲＥ−ｌｕｃを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｅ（ベルギー、ブリュッセル）のＭａｒｃ Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ博士から分譲されたｈＧＰＲ５４のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３発現ベクターにリクローニングした。
【００４３】
（動物及び組織の調製）
ネッタイツメガエルの成体と、アフリカツメガエルの成体とは、それぞれ、Ｘｅｎｏｐｕｓｏｎｅ（米国）と、ゼノパス養殖教材（茨城県古河市）とから入手した。メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）及びゼブラフィッシュの成魚は業者から購入した。ニホンカナヘビ（Ｔａｋｙｄｒｏｍｕｓ ｔａｃｈｙｄｒｏｍｏｉｄｅｓ）の成体は２００７年に東京郊外で採集した。前記動物は、水槽で飼育した。Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（高麗大学校医学部、韓国、ソウル市）及び早稲田大学で、実験動物管理規則に従って実施した。
【００４４】
（ゲノムデータベース解析）
ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル及びヒトのキスペプチンのアミノ酸配列をクエリー配列としてネッタイツメガエルのゲノムデータベースをＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）により検索した。さまざまな脊椎動物種におけるＧＰＲ５４遺伝子を特定するために、ヒト及びウシガエルのＧＰＲ５４のアミノ酸配列についてゼブラフィッシュ、メダカ、カモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｎａｔｉｎｕｓ）及びネッタイツメガエルのゲノムデータベースをＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにより検索した。クエリー配列とヒットしたゲノム配列との間のアミノ酸配列のアライメントはＢｌａｓｔ Ｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）を用いて行い、また、ＣＢＳ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅにより提供されるＨＭＭｇｅｎｅ（ｖ．１．１）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＨＭＭｇｅｎｅ／）を用いてエクソン及びイントロンの配列を予想した。ヒト、ネッタイツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ及びカモノハシの、ＧＰＲ５４遺伝子座を含むゲノム領域のコンティグ図の比較を行なった後、ゲノムシンテニー解析を実施した。
【００４５】
（ＫｉＳＳペプチド及びそのレセプターｃＤＮＡのクローニング）
アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２ペプチドをエンコードするｃＤＮＡのクローニングは以下のとおり行なった。ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ペプチドのｃＤＮＡ配列に基づき、２種類の順方向プライマーと、３種類の逆方向プライマーとを合成した（オペロンバイオテクノロジー株式会社）。前記２種類の順方向プライマーを配列番号１２及び１３に、前記３種類の逆方向プライマーを配列番号１４〜１６に、それぞれ示す。また、ゲノムデータベースからネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−２ペプチドのｃＤＮＡ配列を推定し、２種類の順方向プライマーと、３種類の逆方向プライマーとを合成した。前記２種類の順方向プライマーを配列番号１７及び１８に、前記３種類の逆方向プライマーを配列番号１９〜２１に、それぞれ示す。ｓｅｐａｓｏｌ抽出法により単離したアフリカツメガエルの脳の全ＲＮＡと、前記プライマーとを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により合成されたＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動とＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）とを用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。ＰＣＲ断片のＤＮＡ配列は、ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒより増幅したＤＮＡをＡＢＩ ３７３０ＸＬ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でサイクルシーケンシング反応により決定した。
ゼブラフィッシュ及びネッタイツメガエルのＧＰＲ５４及びそのファミリー遺伝子をエンコードするｃＤＮＡのクローニングは以下のとおり行なった。ゼブラフィッシュ及びネッタイツメガエルのＧＰＲ５４のｃＤＮＡ配列に基づき、３種類の順方向プライマーと、３種類の逆方向プライマーとを合成した。前記３種類の順方向プライマーを配列番号２２〜２４に、前記３種類の逆方向プライマーを配列番号２５〜２７に、それぞれ示す。ｓｅｐａｓｏｌ抽出法により単離した脳の全ＲＮＡと、前記プライマーとを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により合成されたＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動とＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎとを用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングした。ｃＤＮＡの構造を配列決定により確認した後、ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３発現ベクターにリクローニングした。
【００４６】
（抗体の調製）
Ａｚｕｍａｙａ，Ｙ．、Ｋｏｍｉｎａｍｉ，Ｓ．及びＴｓｕｔｓｕｉ，Ｋ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２８１：９０−９６に記載の方法に従い、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いてスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した合成ペプチドを抗原として使用して、抗血清を作成した。推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのＣ末端部分とＮ末端部分とに対する抗血清は、それぞれ、ＳＫＦＮＦＮＰＦＧＬＲＦ（配列番号２８）というアミノ酸配列のＣ末端のフェニルアラニンにシステインを付加したペプチド（配列番号２９）をＫＬＨに結合したものと、配列番号２８のアミノ酸配列のＮ末端のセリンにシステインを付加したペプチド（配列番号３０）をＫＬＨを結合したものとを抗原として作成された。１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液をフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と混合し、マウスに注射した。５０μｇのブースター注射の後、各々のマウスから血液を回収し、適切に希釈した抗血清を、ＥＬＩＳＡ法により分析した。推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのＣ末端部分に対する抗血清と、Ｎ末端部分に対する抗血清とは、それぞれ免疫組織化学的検査と、ＫｉＳＳ−２ペプチドのアフィニティー精製とに用いられた。
【００４７】
（ペプチドの抽出及びアフィニティー精製）
アフリカツメガエルの成体（５００匹）から回収した脳組織をドライアイスで凍結させ、使用するまで−８０°Ｃで保存した。Ｔｓｕｔｓｕｉ Ｋら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２７５：６６１−６６７、Ｋｏｄａ Ａら、（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３：４１１−４１９、及び、Ｕｋｅｎａ Ｋら、（２００３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４４：３８７９−３８８４に記載の方法に従い、脳組織を５％酢酸中で煮沸及びホモジナイズした。ホモジネートを１０，０００ｇ、４°Ｃで３０分間遠心分離し、得られた沈殿を再度ホモジナイズ及び遠心分離した。回収した遠心上清を、ロータリーエバポレーターを４５°Ｃで使用することにより濃縮した後、ディスポーサブルのＣ−１８カートリッジカラム（Ｍｅｇａ Ｂｏｎｄ−Ｅｌｕｔ；Ｖａｒｉａｎ）に適用した。Ｕｋｅｎａ Ｋら、（２００３）、Ｕｋｅｎａ Ｋら、（２００２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５１２：２５５−２５８、及び、Ｂｏｎｎａｒｄ Ｅら、（２００１）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２２：１０８５−１０９２に記載の方法に従い、前記カラムに保持された物質を６０％メタノールで溶出し、イムノアフィニティー精製に供した。イムノアフィニティーカラムは、推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのＣ末端側のアミノ酸配列に対する抗血清を臭化シアンで活性化してＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に結合して調製された。６０％メタノールで溶出した前記脳抽出物を前記イムノアフィニティーカラムに４°Ｃで適用し、０．１％の２−メルカプトエタノールを含む０．３Ｍ酢酸で溶出した。Ｋｏｄａ Ａら（２００２）、及び、Ｕｋｅｎａ Ｋら、（２００３）に記載の方法に従い、１ｍＬの分画を、前記推定ＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清を用いて、ドットイムノブロットアッセイにより分析した。
【００４８】
（ＨＰＬＣ分析及び構造決定）
前記ドットイムノブロットアッセイ陽性分画をＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ、東ソー株式会社）に適用し、１００分間で０．１％のトリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルから０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルまで溶離液組成を変化させる線形グラジエント、０．５ｍＬ／分の流速の設定で１００分間の溶出を行なった。溶出画分を２分ごとに回収した後、イムノブロッティングで陽性の画分を、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ、東ソー株式会社）にさらに適用し、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む３１．４％のアセトニトリルを使用するイソクラティック条件下、流速０．５ｍＬ／分で２５分間溶出を行なった。単離した物質を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）装置（
ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ ｐｌｕｓ、株式会社島津製作所）によるアミノ酸配列解析に供した。
【００４９】
（Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）
アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−２ペプチドのｍＲＮＡの発現の局在はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により解析した。簡潔には、アフリカツメガエルの成体の脳下垂体を含む脳組織を、冷却した４％のパラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液に２４時間浸漬し、冷却したスクロース溶液（３０％のスクロースを含むＮａＣｌ／Ｐｉ）中に浸漬した。前記脳組織をＯＣＴコンパウンド（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．）包埋後、−２０°Ｃでクライオスタットを用いて１０μｍの厚さに切断し、３−アミノプロピルトリエトキシシランでコーティングしたスライドの上に戴置した。Ｓａｗａｄａら、（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６９：６０００−６００８、
Ｕｋｅｎａ Ｋら、（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ４０：８０５−８１３、及び、Ｓａｗａｄａ Ｋら、（２００２）Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １７４：３９５−４０２に記載の方法に従い、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識アンチセンスＲＮＡプローブを使用して、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。前記ＤＩＧ標識アンチセンスＲＮＡプローブは、ＲＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ペプチド前駆体ｃＤＮＡの一部から作り出した。ＫｉＳＳ−２ペプチドｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの特異性についての対照実験は、ＤＩＧ標識アンチセンスＲＮＡプローブの共通配列に相補的なＤＩＧ標識センスＲＮＡプローブを使用することにより行った。
【００５０】
（免疫組織化学的検査）
アフリカツメガエルの脳組織を、ブアン液で固定し、−２０°Ｃで２０μｍの厚さの前頭断又は矢状断面を調製した。非特異的結合成分をブロッキングした後、前記切片を１：１，０００に希釈したＫｉＳＳ−２ペプチドのＮ末端側のペプチドに対する抗血清と４°Ｃで終夜反応させた後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させた。染色の特異性を評価するための対照実験には、飽和濃度（１ｍＬ当たり１０μｇのＫｉＳＳ−２ペプチド）の抗原と予め終夜インキュベーションして中和させた前記抗体（希釈比１：１，０００）を使用した。
【００５１】
（ルシフェラーゼアッセイ）
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞由来ＣＶ−１細胞は１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ルシフェラーゼアッセイの際は、トランスフェクションの１日前に、細胞を２４ウェルプレートに播種した。トランスフェクションは、１００ｎｇの内部標準プラスミドｐＣＭＶb−Ｇａｌとともに、１００ｎｇの各受容体ｃＤＮＡと、ＳＲＥ−ｌｕｃベクター又はＣＲＥ−ｌｕｃベクターの１００ｎｇをＳｕｐｅｒＦｅｃｔ ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）とともに使用して実施した。トランスフェクションの１日後、細胞を２４時間血清が欠乏した状態におき、その後、キスペプチンを６時間負荷した。細胞を回収し、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０１（ＥＧ ＆ Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる標準的な方法に従い決定した。ルシフェラーゼ活性は、β−Ｇａｌ値を使用して正規化した。
【００５２】
（データ解析）
全てのアッセイは、１回の実験では同一実験条件のサンプルを３個用意して並列して測定し、かつ、同じ実験を３回繰り返し行った。データ解析は、Ｓ字状用量応答曲線での非線形回帰を用いて行った。最大応答値の５０％の刺激を誘発させるアゴニスト濃度（ＥＣ５０）と、最大応答値を誘発させるアゴニスト濃度（Ｅｍａｘ）とを、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国、カリフォルニア州、サンジエゴ）を使用して算出した。全てのデータを、少なくとも２回の独立した実験結果の平均値±ＳＥＭとして表示した。
【００５３】
結果
メタスチンのアミノ酸配列をさまざまな動物種のゲノムデータベースを用いて解析したところ、従来推定されていた１０個のアミノ酸残基からなるＫｉＳＳ−１ペプチドとは別に、１２個のアミノ酸残基からなる新規メタスチン誘導体ペプチド（ＫｉＳＳ−２）をエンコードするＤＮＡ配列を発見した。次に、新規メタスチン同族体ペプチドＫｉＳＳ−２ペプチドが脳内の特定ニューロンで発現し、ＧＰＲ５４遺伝子ファミリーの内因性リガンドとして機能することが確かめた。また、ＫｉＳＳ−２ペプチドが実際にアフリカツメガエルの脳組織に存在すること、ＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清が脳の特定の領域と反応すること、及び、ＫｉＳＳ−２ペプチドがＫｉＳＳ−１ペプチドのレセプターとして知られているＧＰＲ５４に対してアゴニスト活性を示すことを確かめた。以下にその実験結果を説明する。
【実施例１】
【００５４】
ＫｉＳＳ相同ペプチドのゲノムデータベース解析の結果
図１−Ａは、従来ＧＲＰ５４レセプターの内因性リガンドとして知られていたヒトＫｉＳＳ−１ペプチド（キスペプチン−１０）との相同性が高い他の脊椎動物の相同ペプチドの推定アミノ酸配列のアライメント結果を示す。全ゲノム配列情報が得られる脊椎動物のうち、硬骨魚類のゼブラフィッシュではヒトＫｉＳＳ−１ペプチドと相同性のあるアミノ酸配列が２個見つかった。このうち一方はヒトＫｉＳＳ−１ペプチドと１０個のうち２個のアミノ酸が異なり、他方は３個のアミノ酸が異なる。そこで前者をゼブラフィッシュのＫｉＳＳ−１ペプチド、後者をＫｉＳＳ−２ペプチドと分類した。また、ネッタイツメガエルではヒトＫｉＳＳ−１ペプチドと相同性のあるアミノ酸配列が３個見つかったが、これらのうち１個はゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチドと同一のアミノ酸配列であるのでこれをネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−２ペプチドと分類し、残る２個の相同ペプチドのうちヒトＫｉＳＳ−１ペプチドとの相同性の高い方をＫｉＳＳ−１ａ、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１と相同性の高い方をＫｉＳＳ−１ｂと分類した。これらの分類をもとに無顎類のヤツメウナギ（ｌａｍｐｒｅｙ）、軟骨魚類のゾウザメ（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ ｍｉｌｉｉ）、硬骨魚類のメダカ、両生類のアフリカツメガエル、カモノハシ及びヒトのメタスタチン相同ペプチド、すなわち、ＫｉＳＳ−１ペプチド、ＫｉＳＳ−１ａペプチド、ＫｉＳＳ−１ｂペプチド及びＫｉＳＳ−２ペプチドのアミノ酸配列のアライメントを行った。図１−ＡではヒトＫｉＳＳ−１ペプチドに対応するアミノ酸配列と、アフリカツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドに対応するアミノ酸配列とをそれぞれ四角で囲んだ。ネッタイツメガエルの相同ペプチドのうちの一方はゼブラフィッシュの相同ペプチドと相同性を最大化するためにギャップを挿入し、該ギャップはハイフンで示した。保存アミノ酸残基には影をつけた。アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにより提供されるヒトＫｉＳＳ−１（ＮＰ＿００２２４７）、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１（ＥＦ６９０２７９）、ヤツメウナギＫｉＳＳ−１（ＥＢ７２２２９０及びＥＢ７２２２９１）のｃＤＮＡ配列から推定した。アフリカツメガエルＫｉＳＳ−１、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ａ、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ｂ、ニホンカナヘビＫｉＳＳ−２（ＡＢ４３５４３２）、アフリカツメガエルＫｉＳＳ−２（ＡＢ４３５３８９）、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２、メダカＫｉＳＳ−２（ＡＢ４３５３８６）のｃＤＮＡをクローニングされた。他の推定ｃＤＮＡ配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ又はＧｅｎＢａｎｋにより提供されるメダカＫｉＳＳ−１（ＢＡＡＦ０４０５６４５７、１−５９１５）、カモノハシＫｉＳＳ−１（ＡＡＰＮ０１２３９７５２，１６８８−１７３５）、カモノハシＫｉＳＳ−２（ＡＡＰＮ０１０４３２８０、１−５１５４）、ゾウサメＫｉＳＳ−１（ＡＡＶＸ０１１６２９７１、１−９２２）、ゾウサメＫｉＳＳ−２（ＡＡＶＸ０１１７２３８８、１−２５８７）、ヤツメウナギＫｉＳＳ−２のゲノム配列に基づいて取得した。クローニングしたｃＤＮＡ配列はアスタリスク（＊）で、部分的なｃＤＮＡ配列はシャープ（＃）で示した。推定シグナルペプチド（下線部）は、ＳｉｇｎａｌＰ ３．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を使用して推定した。
【００５５】
我々は、Ｂｌａｓｔ検索により、ＥｎｓｅｍｂｌｅゲノムデータベースとＮＣＢＩデータベースとからカモノハシ、ゾウサメ及びヤツメウナギにおいて類似のｃＤＮＡも見出した（図１−Ａ）。我々は、キスペプチンｃＤＮＡの３種類の形態をＫｉＳＳ−１、ＫｉＳＳ−１ｂ及びＫｉＳＳ−２に分類した。ＫｉＳＳ−１のｃＤＮＡは、１０番目のチロシン残基又はフェニルアラニン残基がアミド化されている場合がある１０個のアミノ酸残基からなる推定ペプチド（キスペプチン−１０）をエンコードした。キスペプチン−１０のアミノ酸配列は、脊椎動物において高度に保存される（図１−Ａのボックス内のキスペプチン−１０の配列を参照せよ。）。
【００５６】
図１−Ｂは、ヒトＫｉＳＳ−１ペプチドと相同性のある遺伝子の分子進化についての模式図である。ＫｉＳＳ−１遺伝子及びＫｉＳＳ−２遺伝子は、遺伝子／染色体の重複と遺伝子の修復及び欠損とのような進化のメカニズムを通じて、共通の祖先遺伝子から分化したと予想される。両生類は２種類のＫｉＳＳ−１遺伝子を有する。アミノ酸配列の同一性を基準として、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ａは哺乳類のＫｉＳＳ−１（ｍＫｉＳＳ−１）と類似し、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ｂは魚類のＫｉＳＳ−１（ｆＫｉＳＳ−１）と類似する。
【実施例２】
【００５７】
ＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２ペプチドをエンコードするｃＤＮＡのクローニング及び特徴づけ
アフリカツメガエル、ネッタイツメガエル及びゼブラフィッシュのメタスチン相同ペプチドと推定されるペプチドをエンコードするｃＤＮＡのクローニングを行なった。アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３１及び３２と、図５−Ａとにそれぞれ示す。アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３３及び３４と、図５−Ｂとにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ａのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３５及び３６と、図６−Ａとにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３７及び３８と、図６−Ｂとにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号３９及び４０と、図６−Ｃとにそれぞれ示す。ゼブラフィッシュのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号４１及び４２と、図７とにそれぞれ示す。
【００５８】
Ｂｌａｓｔ検索により、ＥｎｓｅｍｂｌｅゲノムデータベースとＮＣＢＩデータベースとからカモノハシ、ゾウサメ及びヤツメウナギにおいて類似のｃＤＮＡが見いだされた（図１−Ａ）。キスペプチンｃＤＮＡをＫｉＳＳ−１、ＫｉＳＳ−１ａ、ＫｉＳＳ−１ｂ及びＫｉＳＳ−２に分類した。ＫｉＳＳ−１又はＫｉＳＳ−１ａのｃＤＮＡは、１０番目のチロシン残基又はフェニルアラニン残基がアミド化されている場合がある１０個のアミノ酸残基からなる推定ペプチド（キスペプチン−１０）をエンコードした。キスペプチン−１０のアミノ酸配列は、脊椎動物において高度に保存される。（図１−Ａの四角で囲んだキスペプチン−１０の配列を参照せよ。）ＫｉＳＳ−１のｃＤＮＡに加えて、ネッタイツメガエルにおいて、キスペプチン−１０と類似する推定デカペプチドをエンコードする別のｃＤＮＡ（ＫｉＳＳ−１ｂ）がクローニングされた（図１−Ａ）。推定ＫｉＳＳ−１ｂペプチド（ＹＮＶＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号４３））のアミノ酸配列とキスペプチン−１０のアミノ酸配列との間には１個のアミノ酸残基の違いしかない（図１−Ａ）。そこで、Ｘ.ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのようにキスペプチン−１０と類似する推定デカペプチドをエンコードするｃＤＮＡが２種類存在する場合には、１種類しか存在しない生物におけるＫｉＳＳ−１と同じものをＫｉＳＳ−１ａとする。
【００５９】
一方でＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡは１２個のアミノ酸残基からなる新規な推定ペプチドをエンコードし、該推定ペプチドにおいて１２番目のフェニルアラニン残基はアミド化されている場合がある。ＫｉＳＳ−２ペプチドの推定配列とキスペプチン−１０の推定配列との間には６０％の相同性があった。（図１−Ａの四角で囲んだＫｉＳＳ−２ペプチド及びキスペプチン−１０の配列を参照せよ。）前記ＫｉＳＳ−２ペプチドのアミノ酸配列は、各々の末端に、細胞内タンパク質分解部位としてのグリシンＣ末端アミド化シグナル（ｇｌｙｃｉｎｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｍｉｄａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）及び塩基性アミノ酸と隣接している。この１２個のアミノ酸残基からなるペプチドの配列と、シグナルペプチドの配列とは、脊椎動物において高度に保存されている。
【実施例３】
【００６０】
両生類ＫｉＳＳ−２ペプチドの単離及び同定
ＫｉＳＳ−２推定ペプチドは内在の成熟リガンドとして働くことを確認する必要がある。そこで、脳からの成熟ペプチド単離と、その同定とを行った。アフリカツメガエルの脳における成熟ＫｉＳＳ−２ペプチドを特定するために、前記推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのＣ末端のアミノ酸配列に対する特異的な抗血清を使用するイムノアフィニティー精製を行った。図２−Ａは、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ）に保持された物質のＨＰＬＣプロファイルである。前記逆相カラムに適用され保持された物質を、１００分間で０．１％のトリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルから０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルまで溶離液組成を変化させる線形グラジエントと、０．５ｍＬ／分の流速との設定で１００分間溶出させ、１画分当たり１ｍＬの５０個の画分に分画した。各々の画分について一定分量（１／１００量）を蒸発乾固し、蒸留水に溶解し、ニトロセルロース膜上にスポットした。アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２推定ペプチドへの抗血清に対する免疫陽性の画分が、溶離液中のアセトニトリル含量が３４−３６％のとき、すなわち、溶出時間７０−７４分に対応する画分に溶出された。（水平のバーで示した。）これらの免疫陽性の画分は、３１．４％のアセトニトリルを使用するイソクラティック条件下で逆相ＨＰＬＣ精製を使用して再度クロマト分離された。
【００６１】
図２−Ｂは、図２−Ａに示したＨＰＬＣでの分画により得られた免疫陽性の画分を、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ）によりさらに精製したときのＨＰＬＣプロファイルである。０．１％のトリフルオロ酢酸を含む３１．４％のアセトニトリルを使用するイソクラティック条件下、流速０．２ｍＬ／分で３０分間溶出を行なった。免疫陽性の物質は保持時間１４分で溶出し、そのピークを矢印で示した。図２−Ｂに示されるように、精製した物質は単一のピークとして溶出された。前記精製した物質のアミノ酸配列を決定したところ、ＳＫＦＮＦＮＰＦＧＬＲＦ（配列番号２８）という配列であった。
【００６２】
単離したペプチドのＣ末端の構造を明らかにするために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用した。図２−Ｃは、イムノアフィニティ精製されたＫｉＳＳ−２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる検出を示す図である。タンデムＭＳ分析により、１４７２．７８ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］＋）という観測質量数を有する精製物質のフラグメンテーションパターンが得られた。観察されたスペクトルは、推定ＫｉＳＳ−２ペプチドのフラグメントイオンの典型的な質量値を示した。この結果から、アフリカツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドは、１２個のアミノ酸からなる配列番号４に列挙されるアミノ酸配列を有し、Ｃ末端がアミド化されたペプチドであると同定された。このペプチドのスペクトルにおける分子イオンピークは、１４７２．８４ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］＋）であった。この値は、推定アミド化ペプチドについて算出した質量数１４７８．７８ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］＋）に近い値であった。得られたＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンにより、ＫｉＳＳ−２ペプチドは、アミノ酸配列がＳＫＦＮＦＮＰＦＧＬＲＦ（配列番号２８）であり、かつ、Ｃ末端のフェニルアラニンがアミド化された構造であると特定することができた。以上より、単離した天然ペプチドは、１２個のアミノ酸残基からなり、Ｃ末端のアミノ酸配列がＲＦであり、かつ、Ｃ末端のフェニルアラニンがアミド化された構造を有することが確認された。
【実施例４】
【００６３】
ＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２のペプチド及びｍＲＮＡの局在
図３−Ａは、アフリカツメガエルの脳組織におけるＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２のｍＲＮＡの局在をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した結果の顕微鏡写真である。図３−Ａ（１）は、アフリカツメガエルの脳の前頭断切片をジゴキシン標識したＫｉＳＳ−１アンチセンスＲＮＡプローブと反応させた後、酵素標識された抗ジゴキシン抗体を用いて発色反応により検出した結果である。図３−Ａ（３）及び（５）は、アフリカツメガエルの脳の前頭断切片をジゴキシン標識したＫｉＳＳ−２アンチセンスＲＮＡプローブと反応させた後、酵素標識された抗ジゴキシン抗体を用いて発色反応により検出した結果である。図３−Ａ（２）、（４）及び（６）は、対照実験としてセンスＲＮＡプローブを使用した結果である。スケールバーは１００μｍを表す。ＫｉＳＳ−１ペプチドのアンチセンスＲＮＡプローブは腹側視床下部（ＶＨ）で強く反応した（図３−Ａ（１））。ＫｉＳＳ−２ペプチドのアンチセンスＲＮＡプローブは、腹側視床下部（ＶＨ）に加えて、視索前野（ＰＯＡ）とも強く反応した（図３−Ａ（３）及び（５））。対照実験では発色はみられなかった。したがって、ＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２ペプチドのアンチセンスＲＮＡプローブの反応はこれらのｍＲＮＡに特異的であると結論された。
【００６４】
図３−Ｂは、アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−２ペプチドの細胞局在を示す顕微鏡写真である。図３−Ｂ（１）及び（３）は脳の前頭断切片を、Ｘ．ｌａｅｖｉｓのＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清と反応させ、その後、標識された２次抗体を用いて発色反応により検出した結果である。図３−Ｂ（２）及び（４）は、対照実験として、飽和濃度の合成ＫｉＳＳ−２ペプチドといっしょにプレインキュベーションした抗血清と反応させ、その後、標識された２次抗体を用いて発色反応により検出した結果である。スケールバーは１００μｍを表す。アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清はＰＯＡの細胞体に反応した。また、前記抗血清は前記ＰＯＡ及びＶＨから投射してその終末が正中隆起（ＭＥ）に達する神経繊維とも反応した。対照実験では発色はみられなかった。したがって、アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清の反応はＫｉＳＳ−２ペプチドに特異的であると結論された。
【００６５】
図３−Ｃは、背側からアフリカツメガエルの中枢神経系組織における前頭断切片の位置を示す模式図と、各切片でのＫｉＳＳ−２ペプチドに対する抗血清との反応がみられる部位を示した模式図とを示す。黒塗りの丸（●）は免疫陽性の細胞体を表し、黒塗りの星（★）は免疫陽性の線維を表す。Ａｃｃは側坐核を、ＢＮＳＴは分界条床核を、ＤＢはブローカー対角帯核を、ｄｐは背側外套を、ｉｇｌは内部顆粒細胞層を、Ｉｓは峡部核を、ＭＥは正中隆起を、ＭｅＡは内側扁桃核を、ＮＰｖは室傍核を、Ｐｄは末端部を、Ｐｉは中間部を、Ｐｎは後葉を、ＰＯＡは視索前野を、ＳＣは視交叉上核を、ＴＰは後側結節を、ＶＨは腹側視床下部核を、ＶＭは視床腹内側核をそれぞれ表す。図３−Ｃの各切片に示すとおり、免疫陽性の線維は、視床下部のいくつかの領域と、脳の他の領域とにも多数存在した。
【００６６】
ＫｉＳＳ−２ペプチド免疫陽性の神経軸索は正中隆起に観察された。ＰＯＡの巨細胞性のニューロンはその軸索を正中隆起の下垂体門脈に投射していることが知られているので、ＰＯＡに存在するＫｉＳＳ−２ペプチドニューロンが正中隆起の下垂体門脈を介して主要な下垂体前葉ホルモンを調節している可能性がある。
【００６７】
ＫｉＳＳ−２ペプチドはＰＯＡとＶＨのニューロンの他に、前脳の神経軸索で観察された。両生類のＰＯＡとＶＨに電気的な刺激を与える実験により、これらの神経核がゴナドトロピンと性ステロイドの分泌を調節していること、ＰＯＡを電気刺激することでカエルの交尾期の鳴き声を喚起すること、その中でも特に腹側のＰＯＡは交尾期の鳴き声ジェネレーターを活性化することが知られているため、ＫｉＳＳ−２ペプチドは、視床下部・下垂体の生殖内分泌系を制御するというＫｉＳＳ−１と類似の機能の他に、動物の繁殖行動を制御する神経ペプチドとしての機能も有すると考えられる。
【実施例５】
【００６８】
ＧＰＲ５４相同遺伝子のゲノムデータベース解析の結果
図４は、さまざまな脊椎動物種から同定されたＧＰＲ５４のアミノ酸配列のアライメントと、ＧＰＲ５４のｃＤＮＡの構造とを示す図である。図４−Ａは、さまざまな脊椎動物種から同定されたＧＰＲ５４のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。相同性を最大化するためにギャップを挿入し、該ギャップはハイフンで示した。保存アミノ酸残基には影をつけた。右側の数字は、アミノ酸残基の位置を示す。推定７回膜貫通ヘリックス（ＴＭＨ）を、整列させた配列の上側に示す。黒塗りの三角（▲）はスプライシングジャンクションを示す。シャープ（＃）はＥｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒにより提供されるゲノムデータベースから推定された推定アミノ酸配列を示す。Ｈｕｍａｎ；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９：８６８２０３：８７３７４５：１、Ｚｅｂｕｒａｆｉｓｈ−２；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２：２８２２４１１３：２８２７４２５０：１、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ−１：Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ５：６２０１１０５９：６２０１９７０２：−１、ｍｅｄａｋａ−２；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７：２９８３９７６１：２９８５５７０６：−１、ｍｅｄａｋａ−１；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ９：４４８０５２１：４５００７３３：−１、ＸＴ−１ａ；ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２８９：１０１０８９７：１０５１６３９：−１、ＸＴ−１ｂ；ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１２２：１２０３３０７：１２４３５５８：−１、ＸＴ−２；ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２５６７：３７０１８：３３１７６：１及びｓｃａｆｆｏｌｄ＿４：５１１１８６−５１８３８９：１、Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｎａｔｉｎｕｓ−１（Ｏｒｎ−１）；Ｕｌｔｒａ＿２６６：３９０１５０：３９５９２４：１、Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｎａｔｉｎｕｓ−２（Ｏｒｎ−２）；Ｃｏｎｔｉｇ＿１５６２９：１１００：６７８９：１。ＧＰＲ５４遺伝子のオープンリーディングフレームは、ゼブラフィッシュのＧＰＲ５４−１では３６４個のアミノ酸からなるタンパク質を、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａでは３６６個のアミノ酸からなるタンパク質を、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂでは３６７個のアミノ酸からなるタンパク質を、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２では３６９個のアミノ酸からなるタンパク質を、それぞれエンコードする。
【００６９】
図４−Ｂは、ＧＰＲ５４のｃＤＮＡの構造を示す図である。ＧＰＲ５４のｃＤＮＡは５個のエクソンからなる。影付きのボックスの中のローマ数字は膜貫通ヘリックスドメインの番号を表す。ゼブラフィッシュ及びネッタイツメガエル由来の推定ＧＰＲ５４の配列をＥｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースにおいて見出した。ゼブラフィッシュ（ｚ）についてはＧＰＲ５４−１はＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ５ ｌｏｃａｔｉｏｎ ６２，０１１，０５９−６２，０１９，７０２に見出された。ネッタイツメガエル（ｘｔ）についてはＧＰＲ５４−１ａ（ＸＴ−１ａ）はｓｃａｆｆｏｌｄ＿２８９ ｌｏｃａｔｉｏｎ １，０１０，８９７−１，０５１，６３９に、ＸＴ−１ｂはｓｃａｆｆｏｌｄ＿１２２ ｌｏｃａｔｉｏｎ １，２０３，３０７−１，２４３，５５８に、ＸＴ−２はｓｃａｆｆｏｌｄ＿２５６７ ｌｏｃａｔｉｏｎ ３７，０１８−３３，１７６とｓｃａｆｆｏｌｄ＿４ ｌｏｃａｔｉｏｎ ５１１，１８６−５１８，３８９とに、それぞれ見出された。ｂｆＦＰＲ５４のハイドロパシー分析により、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に典型的な疎水性アミノ酸残基からなる７種類の配列の存在が明らかとなった。ゲノム分析及びｃＤＮＡ分析により、全てのＧＰＲ５４が５個のエクソンを有し、かつ、スプライシングジャンクションの位置が保存されていることが明らかになった。
【００７０】
図４−Ｃは、ＧＰＲ５４遺伝子の分子進化についての仮説を示す模式図である。ＧＰＲ５４は、遺伝子／染色体の重複と遺伝子の修復及び欠損とのような進化のメカニズムを通じて、共通の祖先遺伝子から分化したと予想される。両生類は３種類の形態のＧＰＲ５４遺伝子を有する。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ａはヒト及びカモノハシのＧＰＲ５４−１のホモログであり、ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ｂは魚類のＧＰＲ５４−１の同族体である。アミノ酸配列の同一性を基準として、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２は魚類のＧＰＲ５４−２の同族体であると考えられる。
【００７１】
図１２は、ヒトと、ツメガエルと、ゼブラフィッシュとの間でのＫｉＳＳ−１遺伝子座のシンテニーを示す図である。ヒト、ネッタイツメガエル及びゼブラフィッシュのゲノム構成は、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから取得した。ＰＬＥＫＨＡ６はプレクストリン相同ドメイン含有ファミリーＡメンバー６であり、ＲＥＮはレニン前駆体である。
【００７２】
図１３は、カモノハシＧＰＲ５４−１と、ヒトＧＰＲ５４と、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａとの間でのシンテニーを示す図である。前記ＧＰＲ５４の遺伝子座のヌクレオチド配列データは、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから取得した。Ｃ１９ｏｒｆ２１は未特定タンパク質Ｃ１９ｏｒｆ２１であり、ＭＥＤ１６はＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写サブユニット１６のメディエーターであり、ＰＡＬＭはパラレミンであり、ＰＳＡＴ１はホスホセリンアミノトランスフェラーゼ１アイソフォームであり、ＰＴＢＰ１はポリピリミジントラクト結合タンパク質１（ＰＴＢ）であり、ＷＤＲ１８はＷＤ反復タンパク質１８であり、ＺＣＣＨ６はジンクフィンガーＣＣＨＣドメイン含有タンパク質６である
ゲノムシンテニー解析（図１３）及び相同性解析（表１）に基づき、ネッタイツメガエル及び魚類のＧＰＲ５４を分類した。ゲノムシンテニー解析により、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａと、ヒトＧＰＲ５４と、カモノハシＧＰＲ５４−１とが、未特定タンパク質Ｃ１９ｏｒｆ２１（Ｃ１９ｏｒｆ２１）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写サブユニット１６のメディエーター（ＭＥＤ１６）、パラレミン（ｐａｒａｌｅｍｍｉｎ、ＰＡＬＭ）、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１（ＰＴＢＰ１）、ＷＤ反復タンパク質（ＷＤＲ１８）を含む、共通の遺伝子座を含むゲノム領域に局在することが明らかとなった。したがってネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａは、ヒトＧＰＲ５４のホモログであるようである。ヒトＧＰＲ５４と、いずれかの魚類のＧＲＰ５４との間ではシンテニーは観察されなかった。ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂと、メダカのＧＰＲ５４−１とが、共通の遺伝子座のジンクフィンガーＣＣＨＣドメイン含有タンパク質６（ＺＣＣＨ６）を有するゲノム領域に局在した。ｚＧＰＲ５４−１を含むゲノム領域はＺＣＣＨ６を有しないが、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ１アイソフォーム（ＰＳＡＴ１）遺伝子座をメダカのゲノム領域と共有する。このシンテニー解析を支持して、魚類のＧＰＲ５４は、３種類のネッタイツメガエルＧＰＲ中でネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂと最も高い（５８〜６３％）アミノ酸配列の同一性を有する。したがってネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂは、魚類のＧＰＲ５４−１のホモログだと考えられる。ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２と、魚類のＧＲＰ５４−２との間では、非常に高いアミノ酸配列の同一性（６９〜７４％）を有していたが、シンテニーは観察されなかった。ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａは、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４（６０％）よりもネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂ（７０％）と高いアミノ酸配列同一性を有するので、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａ及びネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ｂは遺伝子の重複により生成されたと考えられる。したがってＧＰＲ５４遺伝子の進化の過程は、下で述べるようなものだと考えられる。全てのＧＰＲ５４遺伝子において、５個のエクソンが存在し、かつ、スプライシングジャンクションが保存されており、類似の遺伝子構造を有する。したがってこれらは、共通の祖先遺伝子の遺伝子／染色体の重複により発生し、ＧＰＲ５４−１及びＧＰＲ５４−２という２系列のＧＰＲ５４を生成したと考えられる。両生類ではＧＰＲ５４−１は、さらにもう１回の遺伝子／染色体の重複を受け、ＧＰＲ５４−１ａ及びＧＰＲ５４−１ｂを生成した。哺乳類では単孔類は２種類のＧＰＲ５４遺伝子を有する場合があるが、ヒトは、おそらく遺伝子欠損のために１種類のＧＰＲ５４のみを有する（図４−Ｃ）。
【００７３】
【表１】
【実施例６】
【００７４】
ＧＰＲ５４レセプター相同タンパク質をエンコードするｃＤＮＡのクローニング
ゼブラフィッシュ及びネッタイツメガエルのＧＰＲ５４ｃＤＮＡクローニング
ネッタイツメガエル及びゼブラフィッシュのＧＰＲ５４レセプター相同タンパク質と推定されるタンパク質をエンコードするｃＤＮＡのクローニングを行なった。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒにより提供されるゲノム配列に基づき、ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１（ＸＴ−１ａ）、ＧＰＲ５４−２（ＸＴ−１ｂ）及びＧＰＲ５４−３（ＸＴ−２）と、ゼブラフィッシュのＧＰＲ５４−１（Ｚｅｂｒａ−１）とのｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させた。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ａのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号４４及び４５と、図８とにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号４６及び４７と、図９とにそれぞれ示す。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号４８及び４９と、図１０とにそれぞれ示す。ゼブラフィッシュのＧＰＲ５４−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、配列番号５０及び５１と、図１１とにそれぞれ示す。
【実施例７】
【００７５】
ＫｉＳＳ−２ペプチドのＧＰＲ５４レセプターに対するアゴニスト活性
ヒトＧＰＲ５４、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２又はネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２のレセプターｃＤＮＡの発現コンストラクトと、ＳＲＥ−ｌｕｃベクターとをＣＶ−１細胞に導入するトランスフェクションを行った。４８時間後、トランスフェクションされた細胞に、１０−１０モル（０．１ｎＭ）から１０−５モル（１０μＭ）の濃度のヒトＫｉＳＳ−１（Ｈ−１０）、齧歯類ＫｉＳＳ−１（Ｒ−１０）、ツメガエルのＫｉＳＳ−１ａ（Ｘ１ａ−１４）、ＫｉＳＳ−１ｂ（Ｘ１ｂ−ｐ１５）及びＫｉＳＳ−２（Ｘ２−１０、Ｘ２−１２）、ゼブラフィッシュのＫｉＳＳ−１（Ｚ１−１０、Ｚ１−１５、Ｚ１−ｐ１５）及びＫｉＳＳ−２（Ｚ２−１０、Ｚ２−１２）ペプチドを添加し、これらのＫｉＳＳペプチドによって誘導されたルシフェラーゼ活性を測定した。前記ルシフェラーゼ活性をレセプターのアゴニスト活性として各ＫｉＳＳペプチドごとにプロットした結果を図１４Ａ−Ｄにそれぞれ示す。各ＫｉＳＳペプチド濃度でのアゴニスト活性のプロットは、立ち上がりのＫｉＳＳペプチド濃度より１桁高い濃度でＥＣ５０に達し、さらに１桁高い濃度でプラトーに達するシグモイド曲線を示した。以下、ＥＣ５０の値で比較・検討を行なった。
【００７６】
ヒトＧＰＲ５４に対するＥＣ５０は、ヒト及び齧歯類ＫｉＳＳ−１ペプチドではともに１０−８モル、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドでは１０−７モル、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドでは１０−６モルであった（図１４−Ａ）。ヒト及び齧歯類のペプチドのヒトＧＰＲ５４レセプターに対するアゴニスト活性はほぼ同じ強さであるが、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドはヒト及び齧歯類よりも１桁低いアゴニスト活性を示し、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドは、さらに約１桁低いアゴニスト活性を示した。以上の結果から、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−２ペプチドはヒトでも薬理作用を示す可能性が明らかになった。
【００７７】
ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１に対するＥＣ５０は、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドは１０−７モル、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチド及びヒトＫｉＳＳ−１ペプチドは１０−６モルであった（図１４−Ｂ）。ＫｉＳＳ−１ペプチドもＫｉＳＳ−２ペプチドもゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１レセプターに対するアゴニスト活性を示した。しかし、ヒトＫｉＳＳ−１及びゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチドのアゴニスト活性は、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドのアゴニスト活性より１桁低かった。
【００７８】
ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２に対するＥＣ５０は、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドは１０−８モル、ヒトＫｉＳＳ−１ペプチド及びゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチドは１０−７モルであった（図１４−Ｃ）。ＫｉＳＳ−１ペプチドもＫｉＳＳ−２ペプチドもゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２レセプターに対するアゴニスト活性を示した。ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１レセプターと同様に、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２レセプターに対するヒトＫｉＳＳ−１及びゼブラフィッシュＫｉＳＳ−２ペプチドのアゴニスト活性は、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドのアゴニスト活性より１桁低かった。しかし、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２レセプターに対するアゴニスト活性は、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１レセプターに対するアゴニスト活性より１桁高かった。本実験の結果から、ゼブラフィッシュＫｉＳＳ−１ペプチドとＫｉＳＳ−２ペプチドが共に、ゼブラフィッシュ等の魚類において、ＧＰＲ５４−２レセプターに対して薬理作用を示すアゴニストとして使用できる可能性が明らかになった。
【００７９】
ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２に対するＥＣ５０は、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１及びＫｉＳＳ−２ペプチドは１０−７モルであった（図１４−Ｄ）。ツメガエルのＫｉＳＳ−１ａペプチド、ＫｉＳＳ−１ｂペプチド及びＫｉＳＳ−２ペプチドのネッタイツメガエルＧＰＲ５４−２レセプターに対するアゴニスト活性は、ほぼ同程度であった。ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−２レセプターに対するアゴニスト活性は、ゼブラフィッシュＧＰＲ５４−１（図１４−Ｂ）と同程度であり、ヒトＧＰＲ５４レセプター（図１４−Ａ）及びゼブラフィッシュＧＰＲ５４−２レセプター（図１４−Ｃ）よりも１桁低かった。本実験の結果から、ネッタイツメガエルＫｉＳＳ−１ａ、ＫｉＳＳ−１ｂペプチド及びＫｉＳＳ−２ペプチドがともに、ネッタイツメガエル等の両生類において、ＧＰＲ５４−２レセプターに対して薬理作用を示すアゴニストとして使用できる可能性が明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１−Ａ】脊椎動物におけるＫｉＳＳ−１ペプチド、ＫｉＳＳ−１ｂペプチド及びＫｉＳＳ−２ペプチドの推定アミノ酸配列のアライメントを示す図。
【図１−Ｂ】ＫｉＳＳ−１遺伝子の分子進化についての仮想的な模式図。
【図２−Ａ】逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ）に保持された物質のＨＰＬＣプロファイル。
【図２−Ｂ】図２−Ａに示したＨＰＬＣでの分画により得られた免疫陽性の画分を、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ）によりさらに精製したときのＨＰＬＣプロファイル。
【図２−Ｃ】イムノアフィニティ精製されたＫｉＳＳ−２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる検出を示す図。
【図３−Ａ】アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−１ ｍＲＮＡ及びＫｉＳＳ−２ ｍＲＮＡの細胞局在を示す顕微鏡写真。
【図３−Ｂ】アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−２ペプチドの細胞局在を示す顕微鏡写真。
【図３−Ｃ】アフリカツメガエルの脳におけるＫｉＳＳ−２ペプチドに対する免疫陽性部位を示した前頭断の模式図。
【図４−Ａ】さまざまな脊椎動物種から同定されたＧＰＲ５４のアミノ酸配列のアライメントを示す図。
【図４−Ｂ】ＧＰＲ５４のｃＤＮＡの構造を示す図。
【図４−Ｃ】ＧＰＲ５４遺伝子の分子進化についての仮想的な模式図。
【図５−Ａ】アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−１のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図５−Ｂ】アフリカツメガエルのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図６−Ａ】ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ａのｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図６−Ｂ】ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−１ｂのｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図６−Ｃ】ネッタイツメガエルのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図７】ゼブラフィッシュのＫｉＳＳ−２のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図８】ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ａのｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図９】ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−１ｂのｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図１０】ネッタイツメガエルのＧＰＲ５４−２のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図１１】ゼブラフィッシュのＧＰＲ５４−１のｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を示す図。
【図１２】ヒトと、ネッタイツメガエルと、ゼブラフィッシュとの間でのＫｉＳＳ−１アレルのシンテニーを示す図。
【図１３】カモノハシＧＰＲ５４−１と、ヒトＧＰＲ５４と、ネッタイツメガエルＧＰＲ５４−１ａとのアレルのシンテニーを示す図。
【図１４】ＧＰＲ５４のリガンド選択性を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
Ｃ末端がアミド化されたことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをエンコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含み、請求項１又は２に記載のペプチドを産生することを特徴とする発現コンストラクト。
【請求項５】
請求項４に記載の発現コンストラクトを含み、請求項１又は２に記載のペプチドを産生することを特徴とする宿主細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のペプチドと、該ペプチドの塩と、前記ペプチド又はその塩のプロドラッグと、請求項３に記載のポリヌクレオチドと、請求項４に記載の発現コンストラクトと、請求項５に記載の宿主細胞とからなるグループから選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、疾患を予防又は治療するための医薬品組成物。
【請求項７】
前記疾患は生殖機能障害であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬品組成物。
【請求項８】
前記疾患は癌又は腫瘍であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬品組成物。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の抗体を含むことを特徴とする、疾患の診断用キット。
【請求項１２】
前記疾患は生殖機能障害であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断用キット。
【請求項１３】
前記疾患は癌又は腫瘍であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断用キット。
【請求項１】
配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
Ｃ末端がアミド化されたことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをエンコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含み、請求項１又は２に記載のペプチドを産生することを特徴とする発現コンストラクト。
【請求項５】
請求項４に記載の発現コンストラクトを含み、請求項１又は２に記載のペプチドを産生することを特徴とする宿主細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のペプチドと、該ペプチドの塩と、前記ペプチド又はその塩のプロドラッグと、請求項３に記載のポリヌクレオチドと、請求項４に記載の発現コンストラクトと、請求項５に記載の宿主細胞とからなるグループから選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、疾患を予防又は治療するための医薬品組成物。
【請求項７】
前記疾患は生殖機能障害であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬品組成物。
【請求項８】
前記疾患は癌又は腫瘍であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬品組成物。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の抗体を含むことを特徴とする、疾患の診断用キット。
【請求項１２】
前記疾患は生殖機能障害であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断用キット。
【請求項１３】
前記疾患は癌又は腫瘍であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断用キット。
【図３−Ｃ】
【図１４】
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図４−Ｃ】
【図５−Ａ】
【図５−Ｂ】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図６−Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図４−Ｃ】
【図５−Ａ】
【図５−Ｂ】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図６−Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−８３７９３（Ｐ２０１０−８３７９３Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５３８５９（Ｐ２００８−２５３８５９）
【出願日】平成２０年９月３０日（２００８．９．３０）
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月３０日（２００８．９．３０）
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
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