病原性ウイルスからの別のリーディングフレームによりコードされる抗原
【課題】本発明の目的は、ウイルス病原体に対する有効なＴ細胞エピトープを提供することである。
【解決手段】本発明は、病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、メチオニンアミノ酸残基から開始し、抗原決定基を含み、７を超えるアミノ酸残基を含むもの、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片を提供する。
【解決手段】本発明は、病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、メチオニンアミノ酸残基から開始し、抗原決定基を含み、７を超えるアミノ酸残基を含むもの、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性ウイルスに由来するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
幾つかのウイルス感染については、宿主からウイルス感染を克服ないし排除するには大抵のコードされたウイルスタンパク質に対する初期の有効で強力なＣＴＬ応答が重要であることがますます明らかになってきている。
【０００３】
ＨＩＶのＣＴＬエピトープ内の変異に対する選択はＣＴＬがウイルス複製に対してインビボで圧力を及ぼすことを示しており、またマカークザルにおける研究は急性および慢性の両シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染におけるウイルス血症を制御するうえでのＣＤ８＋Ｔ細胞の役割についての興味深い（compelling）インビボデータを提供している。急性感染の際に治療を受けたＨＩＶ感染個体は、治療の中断後にその後のウイルス制御と関連してＨＩＶに対するＣＴＬおよびＴヘルパー細胞の両応答の亢進を示す。
【０００４】
それゆえ、大抵の（全てではないにしても）ウイルスタンパク質の正確なエピトープの同定は宿主の免疫応答を理解する観点からの主たる目標であり、これら病原体に対する新規かつ有効なワクチンをデザインするうえで最も重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでのところ、これらエピトープの同定のための大抵の研究は、実際に転写されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）でコードされるウイルスタンパク質、すなわち構造タンパク質およびウイルスの何らかの機能（たとえば制御、複製または再生産）を有するタンパク質に主として向けられていた。
【０００６】
病原体の可能な別のリーディングフレームを調べるべくある種の研究はなされてはきたが、ＨＣＶ（Walewskiら（RNA 7 (2001) 710-721）およびＷＯ９９／６３９４１を参照）および他のウイルスまたは抗原（Bullockら（J. Exp. Med. 186(7)(1997), 1051-1058）、Malarkannanら（Immunity 10 (1999) 681-690）およびShastriら（J. Biol. Chem. 270 (3)(1995) 1088-1091））での重複リーディングフレームに関する幾つかの報告にもかかわらず、これまでのそのような別のリーディングフレームについての話題は、ウイルス病原体にではなく腫瘍抗原に関連のあるものとしか認められてこなかった。これら報告されたウイルスポリペプチドはすべてＡＵＧまたはＡＴＧ以外の開始コドンを有しており、たとえばＡｌａ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｙで開始されるペプチドに導く。さらに、これら従来技術によるウイルスペプチドはＴ細胞エピトープではなく、せいぜい抗体応答を惹起しうるのみであった。
【０００７】
本発明の目的は、ウイルス感染に対抗するためのさらなる手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、ウイルス病原体、とりわけヒト病原体に対する既存のまたは提唱されたワクチンを置換または改善する手段を提供することである。本発明の特別の目的は、ウイルス病原体に対する有効なＴ細胞エピトープを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それゆえ、本発明は、病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、
メチオニンアミノ酸残基から開始され、
抗原決定基を含み、かつ
７を超えるアミノ酸残基を含む
ことを特徴とするポリペプチド、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片を提供する。
【０００９】
驚くべきことに、そのようなエピトープ（抗原決定基）は病原性ウイルスによる感染と極めて関係が深いことがわかった。実際、そのような別にコードされたエピトープに対するＴ細胞応答をそのような感染を患う患者において検出することができる。ウイルスが宿主細胞に感染すると、ウイルスタンパク質を生成するウイルスゲノムのＯＲＦが転写されるのみならず、ゲノムの他のフレームによりコードされるある種のタンパク質または断片もまた転写されるように思われる。
【００１０】
そのような本発明によるポリペプチドは、ゲノムのＯＲＦ内ではあるが所定の病原性ウイルスで主として（主）転写されるＯＲＦの範囲外にある抗原性配列として定義することができる。
【００１１】
本発明との関連において使用する別のリーディングフレームとは、たとえば構造タンパク質や非構造タンパク質の発現のために使用される生物やウイルスのコドンをコードするオープンリーディングフレーム（主フレーム）とは異なるリーディングフレームとして定義することができる。
【００１２】
典型的に、しかし必ずしも全ての場合にそうではないが、主フレームは、たとえばメッセンジャーＲＮＡや（＋）／（−）鎖ＲＮＡウイルスからのＲＮＡの核酸の最初のコード開始コドン、たとえばＡＵＧやＧＵＧから開始する。本発明において記載する別のフレームは、それぞれ主フレームによって使用されるこれら開始コドンまたは他のいかなるコドンを使用することはない。
【００１３】
本発明は、５つのそのような別のリーディングフレームを想定しており、これらは上記の主フレームと区別して第二の呼び方として非コードオープンリーディングフレーム（ｎｃＯＲＦ）とも称する。そのような別のリーディングフレームの１つは＋１フレームであり、このものは主フレームコドンの５’プライムヌクレオチドの３’プライムのつぎのヌクレオチドから開始するコドンを使用する。そのような第二のフレームは＋２フレームであり、このものは５’プライムヌクレオチドが主コードフレームのコドンの３’プライムヌクレオチドと同一であるコドンを使用する。別のリーディングフレーム４、５および６は、それぞれ別のリーディングフレーム１および２をコードする核酸に相補的な核酸によりコードされる。フレーム４コドンの５’プライムヌクレオチドは＋１フレームのコドンの真中のヌクレオチドに相補的である。フレーム５コドンの５’プライムヌクレオチドは＋１フレームコドンの５’プライムヌクレオチドに相補的であり、フレーム６コドンの５’プライムヌクレオチドは＋２フレームコドンの３’プライムヌクレオチドに相補的である。
【００１４】
さらに、別のリーディングフレームは、主フレームの翻訳に関与しないゲノムの領域、たとえば、いわゆる非翻訳５’プライムまたは３’プライム領域に位置していてよい。
【００１５】
これら「ｎｃＯｒｆ」（「非コードＯＲＦ」）は病原体について（これまで）知られた機能を示さないが、これら「ｎｃＯｒｆ」は抗原決定基（Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープ）をコードする。
【００１６】
ＨＣＶ（Walewskiら、ＷＯ９９／６３９４１を参照）および他のウイルスまたは抗原（Bullockら、Malarkannanら、Shastriら）での別にコードされたＯＲＦに関する全ての使用可能な報告と対照的に、本発明によるポリペプチドはすべて開始コドンとしてＡＵＧまたはＡＴＧ（メチオニンをコードする）を有する。さらに、本発明により提供されるペプチドはＴ細胞エピトープを含み、抗体応答を生起させるもののみに限られることを意図するものではない。
【００１７】
本発明により提供される原理はウイルス感染において一般的なものであると思われる。それゆえ、本発明はある種のウイルスまたはウイルス群に限定されるものではない。この点に関し、本発明による好ましいポリペプチドまたは断片は、主要なおよび著名な（ヒト）病原性ウイルスまたは現在のところ適切な治療または活性な免疫プロトコールの存在しない病原性ウイルス、たとえば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウイルス（ＨＦＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（たとえば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、エボラウイルス、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＳＩＶ、パルボウイルス、パピローマウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶ）、麻疹ウイルスおよび発癌ウイルスからのものである。
【００１８】
本発明では全く新規な世代の免疫原性エピトープが提供され、該エピトープは本発明の好ましい態様によれば本発明によるポリペプチドおよび断片が少なくとも１つの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、本発明によるポリペプチドまたは断片は、Ａ０２０１、Ａ１、Ａ２４、Ａ３、Ａ３１、Ｂ３５０１、Ｂ４４０３、Ｂ７、Ｂ８、とりわけＡ０２０１、またはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。
【００２０】
好ましい態様によれば、本発明によるポリペプチドまたは断片は少なくとも１つのＴヘルパー細胞エピトープを含む。
【００２１】
好ましくは、本発明によるポリペプチドまたは断片は、ＤＰ、ＤＱ、ＤＲまたはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対するＴヘルパー細胞エピトープを含む。
【００２２】
本発明による好ましいエピトープは、表２ａ）〜２ｎ）（配列番号１〜８２２）に列挙した群から選ばれるかまたは７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片および／または表４ａ）〜４ｎ）に列挙した群から選ばれた断片、好ましくは５０またはそれ以上のスコアを有する断片、さらに好ましくは２００を超えるスコアを有する断片、とりわけ５００を超えるスコア（表に示したスコア（Parkerら（J. Immunol. 152 (1994) 163）により報告されたアルゴリズムにより決定した）による）を有する断片を含むかまたは該断片からなるエピトープである。
【００２３】
本発明によるさらに好ましいエピトープは、表６に列挙され７を超えるアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号８２３〜８７４）または７を超えるアミノ酸残基を含む該ポリペプチドの断片である。
【００２４】
本発明によるポリペプチドまたは断片は、担体、とりわけ免疫修飾（immunomodulating）物質にコンジュゲートすることができる。ある種の応用においては、そのような結合はこれらペプチドの作用の改善という結果となる。また、ＷＯ０１／７８７６７に記載のように、これらペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に選択した疎水性（Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｃ）または酸性（ＤまたはＥ）アミノ酸残基を結合させるのが好ましい。
【００２５】
それゆえ、好ましいポリペプチドまたは断片は、Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸（該アミノ酸はＦ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、ＷまたはＣから選ばれる）からなるテール；またはＮ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸（該アミノ酸はＤまたはＥから選ばれる）からなるテールを含む。
【００２６】
特に好ましいコンジュゲートでは、本発明のポリペプチドまたは断片は、ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択される免疫修飾物質にコンジュゲートする。
【００２７】
好ましくは、ポリカチオン性物質は、ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンまたは抗菌性ペプチドである。
【００２８】
本発明に従って用いるポリカチオン性化合物は、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すあらゆるポリカチオン性化合物であってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない。特に好ましいのは、ポリリシン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは２０〜５００アミノ酸残基、とりわけ３０〜２００残基を含む。
【００２９】
これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
【００３０】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、ポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい。ペプチドはまたデフェンシンのクラスに属していてもよい。そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシン（defensives）もまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を最終生成物として活性化（またはダウンレギュレーション）することを可能にする化合物はポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００３１】
本発明においてポリカチオン性物質として使用するのに特に好ましいのは、カテリシジン（cathelicidin）由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（ＷＯ０２／１３８５７、参照のため本明細書中に引用する）、とりわけ哺乳動物、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチド、または（ヒト）成長ホルモンなどの神経刺激性の化合物である（たとえば、ＷＯ０１／２４８２２に記載）。
【００３２】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ（由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体）または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはカテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質、とりわけマウス、ウシまたは特にヒトのカテリンおよび／またはカテリシジンである。カテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、本発明による抗原／ワクチン組成物と組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫促進性物質を用いまたは用いることなく、本発明の医薬において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００３３】
本発明に従って用いることのできる他の好ましいポリカチオン性物質は、３〜７の疎水性アミノ酸、とりわけＬのリンカーによって隔てられた少なくとも２つのＫＬＫモチーフを含む合成ペプチドである（ＷＯ０２／３２４５１、参照のため本明細書中に引用する）。
【００３４】
本発明に従って用いる免疫修飾核酸は、合成したもの、原核生物および真核生物由来のものであってよい。真核生物由来である場合は、ＤＮＡは系統樹に基づいて進化の遅れた種（たとえば昆虫、しかし他の種も可能）からのものでなければならない。本発明の好ましい態様において、免疫原性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は合成により製造したＤＮＡ分子またはそのような分子の混合物である。たとえば米国特許第５,７２３,３３５号および同第５,６６３,１５３号に記載されているようなチオホスフェート置換アナログ（チオホスフェート残基がホスフェートを置換する）などのＯＤＮの誘導体または修飾物、および好ましくは免疫促進組成物を安定化させるがその免疫学的特性は変化させない他の誘導体および修飾物も含まれる。好ましい配列モチーフは、２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンによりフランキングされた（非メチル化）ＣｐＧジヌクレオチドを含む６塩基ＤＮＡモチーフ（５’−Ｐｕｒ−Ｐｕｒ−Ｃ−Ｇ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒ−３’）である。本発明によるＯＤＮに含まれるＣｐＧモチーフは高等脊椎動物ＤＮＡよりも微生物において一般的であり、メチル化のパターンにおいて差異を示す。驚くべきことに、マウスＡＰＣを促進する配列はヒトの細胞に対しては特に有効というわけではない。本発明に従って用いる好ましいパリンドローム性または非パリンドローム性ＯＤＮは、たとえばオーストリア特許出願Ａ１９７３／２０００、Ａ８０５／２００１、ＥＰ０４６８５２０Ａ２、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／３７９１９、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５２５８１、ＷＯ９８／５２９６２、ＷＯ９９／５１２５９およびＷＯ９９／５６７５５（すべて参照のため本明細書に引用する）に開示されている。免疫系を促進させることとは別に、ある種のＯＤＮはある種の免疫応答を中和する。これら配列もまた、たとえば自己免疫疾患の治療に応用するために本発明に含まれる。ＯＤＮ／ＤＮＡは、化学的にまたは組換えにより製造することができ、または天然源に由来するものであってよい。好ましい天然源は昆虫である。
【００３５】
あるいは、ヒポキサンチンおよびシトシンに基づく核酸（たとえばＷＯ０１／９３９０５に記載のようなもの）やデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（ＰＣＴ／ＥＰ０２／０５４４８（参照のため本明細書に引用する）に記載）を本発明の免疫促進核酸として用いるのが好ましい。
【００３６】
もちろん、異なる免疫原性核酸の混合物も本発明に従って用いることができる。
【００３７】
上記の物質は、本発明のペプチドまたは断片または混合物とのコンジュゲートとして用いることができる。混合物は、すでに混合した形態かまたは適用前に混合することを意図した単一成分のキットとして提供できる。
【００３８】
本発明による好ましいポリペプチドまたは断片はＴ細胞エピトープを含む。
【００３９】
驚くべきことに、本発明により、シフトしたリーディングフレーム（すなわち、リーディングフレーム２および３）を有するポリペプチドまたは断片のみならず、該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレーム、すなわち本明細書において一般にリーディングフレーム４〜６と称するものによってコードされるペプチドおよび断片もまた臨床的に関連するペプチドとして提供される。このことは、既知の（機能的または構造）遺伝子の反対の端に位置する、たとえばその調節配列に位置するリーディングフレームも重要であることを意味する。
【００４０】
それゆえ、本発明の１つのさらなる側面は、該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレーム、すなわち一般にリーディングフレーム４〜６と称するものによってコードされる全ての抗原からなる。
【００４１】
本発明による好ましいポリペプチドまたは断片は、表４ａ、４ｃ、４ｅ、４ｇ、４ｉ、４ｋおよび４ｍに列挙され、５０またはそれ以上のスコア、より好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有するペプチドの群から選択される少なくとも１のペプチドを含む。
【００４２】
本発明の好ましい側面によれば、ポリペプチドまたは断片は治療剤として使用する。とりわけＴ細胞エピトープが予防的な使用のためのワクチンとして使用できることが知られている。しかしながら、本発明によるペプチドおよび断片を用い、とりわけリーディングフレーム２および３のＨＣＶ由来ペプチドを用い、ＨＣＶなどの病原性ウイルスの（慢性）感染症を克服するための治療手段が提供される。
【００４３】
本発明によるペプチドおよび断片はまた、所定のエピトープの好ましくは１または２のアミノ酸がたとえばTourdotら（Eur.J.Immunol. 30 (2000), 3411-3421）に開示の法則に従って修飾または置換されている修飾エピトープ、並びにそのような修飾エピトープをコードする核酸配列をも含む。
【００４４】
好ましい側面によれば、本発明はまた本発明による１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を含む医薬組成物にも関する。この医薬組成物は、予防および治療の両目的に使用できる。
【００４５】
上記に記載したように、本発明の医薬組成物は、免疫修飾物質、好ましくはポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択されるものをさらに含むのが好ましい。
【００４６】
本発明の医薬組成物においては、本発明のペプチドまたは断片は単独または所定の病原性ウイルス（または異なる病原体の抗原の組み合わせ）の「通常の」ポリペプチド（エピトープ、抗原決定基）と組み合わせて用いることができる。それゆえ、好ましい態様は、病原性ウイルスの構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片、とりわけ抗原決定基を含む構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片を包含する。
【００４７】
本発明による医薬組成物の投与は、他の既知のポリペプチドワクチンの投与に従って行うことができる。好ましくは、該組成物は、本発明による１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を単位投与当たり１ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０μｇ〜１ｍｇ含む。
【００４８】
好ましくは医薬組成物はワクチンとして調合する。
【００４９】
本発明による医薬組成物は、さらなる活性成分、とりわけ免疫強化サイトカイン、抗炎症物質、抗菌物質またはそれらの組み合わせを含んでいるのが好ましい。
【００５０】
本発明の医薬組成物はさらに、ポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンよりなる群から選ばれたポリカチオン性ポリマー、または抗菌ペプチド、とりわけカテリシジン由来の抗菌ペプチド、または成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンを含んでいるのがさらに好ましい。
【００５１】
さらに、補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝物質、安定化剤またはそれらの組み合わせが医薬組成物に提供される。
【００５２】
他の側面によれば、本発明はまた、該病原性ウイルスの感染の治療または予防用医薬の製造のための本発明によるポリペプチドまたは断片の使用にも関する。
【００５３】
ウイルスが宿主細胞に感染したときに、ウイルスタンパク質を生じるウイルスゲノムのＯＲＦが転写されるのみならず、該ゲノムの他のフレームによってコードされるタンパク質または断片の幾つかもまた転写されることは、従来技術の範囲では予測できなかった。このことは、リーディングフレーム４〜６についてはさらに一層驚くべきことであった。
【００５４】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれら特定の態様に限られるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｔｇマウス＋ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ１１、１３、２７由来ペプチドを用いた実験からのＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【００５６】
【図２】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｔｇマウス＋ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ３６由来ペプチドを用いた実験からのＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【００５７】
【図３】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ＨＣＶ陽性患者のＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【００５８】
【図４】トランスジェニックマウスにおけるＨＣＶ１ｂリーディングフレーム４〜６からのペプチドの免疫原性を示す。
【００５９】
【図５ａ】インフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドをＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３と組み合わせて用いたワクチン接種は、強力なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞およびウイルスの攻撃に対する防御を誘発することを示す。
【００６０】
【図５ｂ】インフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドをＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３と組み合わせて用いたワクチン接種は、強力なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞およびウイルスの攻撃に対する防御を誘発することを示す。
【００６１】
実施例：
実施例１：ＨＣＶ
ＨＣＶを本発明のモデルウイルスとして用いた。しかしながら、本実施例に記載する原理はいかなるウイルスにも応用できる。
【００６２】
ＨＣＶポリプロテインのリーディングフレーム以外の全てのリーディングフレームにおいて７アミノ酸残基よりも長くＡＵＧ（Ｍｅｔ）コドンで開始される全てのＯＲＦを決定するため、ＨＣＶの７つの臨床的に関連のある株（１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂおよびＨ７７）の全ゲノムを分析した。ＨＣＶゲノム配列は、ジーンバンクデータベース（アクセッション番号：ＡＦ３８７８０６（１ａ）、Ｄ１１３５５（１ｂ）、ＡＦ２３８４８５（２ａ）、ＡＢ０３０９０７（２ｂ）、ＡＦ０４６８６６（３ａ）、Ｄ４９３７４（Ｄ２６５５６）（３ｂ）、ＡＦ０１１７５１（Ｈ７７））から得た。全部で８２２の新規なＯＲＦがこの研究で同定された（表１の要約を参照）。
【００６３】
【表１】
【００６４】
以下の表２は、ポリペプチドの全配列を含む。
【００６５】
本実施例に適合させるのが好ましい他のＨＣＶサブタイプとしては、サブタイプ１ｃ、２ｃ、２ｄ、３ｃ〜ｆ、４ａ〜ｊ、５ａまたは６ａが挙げられる。
【００６６】
表２ａ（配列番号１〜４２）
ＨＣＶ１ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ３８７８０６
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
表２ｂ（配列番号４３〜１１０）
ＨＣＶ１ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表４】
【００６９】
【表５】
【００７０】
【表６】
【００７１】
表２ｃ（配列番号１１１〜１６６）
ＨＣＶ１ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ
【表７】
【００７２】
【表８】
【００７３】
表２ｄ（配列番号１６７〜２４１）
ＨＣＶ１ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表９】
【００７４】
【表１０】
【００７５】
【表１１】
【００７６】
表２ｅ（配列番号２４２〜２８８）
ＨＣＶ２ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ２３８４８５
【表１２】
【００７７】
【表１３】
【００７８】
表２ｆ（配列番号２８９〜３５９）
ＨＣＶ２ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表１４】
【００７９】
【表１５】
【００８０】
【表１６】
【００８１】
表２ｇ（配列番号３６０〜４０４）
ＨＣＶ２ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＢ０３０９０７
【表１７】
【００８２】
【表１８】
【００８３】
表２ｈ（配列番号４０５〜４７９）
ＨＣＶ２ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表１９】
【００８４】
【表２０】
【００８５】
【表２１】
【００８６】
表２ｉ（配列番号４８０〜５１７）
ＨＣＶ３ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ０４６８６６
【表２２】
【００８７】
【表２３】
【００８８】
表２ｊ（配列番号５１８〜５８７）
ＨＣＶ３ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表２４】
【００８９】
【表２５】
【００９０】
【表２６】
【００９１】
表２ｋ（配列番号５８８〜６４０）
ＨＣＶ３ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：Ｄ４９３７４，Ｄ２６５５６
【表２７】
【００９２】
【表２８】
【００９３】
表２ｌ（配列番号６４１〜７１２）
ＨＣＶ３ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表２９】
【００９４】
【表３０】
【００９５】
【表３１】
【００９６】
表２ｍ（配列番号７１３〜７５２）
ＨＣＶＨ７７ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ０１１７５１
【表３２】
【００９７】
【表３３】
【００９８】
表２ｎ（配列番号７５３〜８２２）
ＨＣＶＨ７７ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表３４】
【００９９】
【表３５】
【０１００】
【表３６】
【０１０１】
異なるＨＬＡ対立遺伝子について可能なＣＴＬエピトープの予測のためにウエブベースのコンピューターソフトウエアを用い、１０またはそれ以上の（相対的）カットオフ値となる（Parkerら（上記）により）（おそらく）コードされているエピトープの存在について単一のＯＲＦをすべて分析した。
【０１０２】
【表３７】
【０１０３】
以下の表４には、試験したＨＬＡ対立遺伝子に関して認められたエピトープの正確な（最小の）配列を、所定のエピトープが所定のＨＬＡ型に有効に結合する能力を同定する（相対的）スコアとともに示す。
【０１０４】
表４ａ
１ａ（１〜３）
【表３８】
【０１０５】
【表３９】
【０１０６】
【表４０】
【０１０７】
【表４１】
【０１０８】
【表４２】
【０１０９】
表４ｂ
１ａ（４〜６）
【表４３】
【０１１０】
【表４４】
【０１１１】
【表４５】
【０１１２】
【表４６】
【０１１３】
【表４７】
【０１１４】
【表４８】
【０１１５】
【表４９】
【０１１６】
【表５０】
【０１１７】
【表５１】
【０１１８】
【表５２】
【０１１９】
【表５３】
【０１２０】
表４ｃ
１ｂ（１〜３）
【表５４】
【０１２１】
【表５５】
【０１２２】
【表５６】
【０１２３】
【表５７】
【０１２４】
【表５８】
【０１２５】
表４ｄ
１ｂ（４〜６）
【表５９】
【０１２６】
【表６０】
【０１２７】
【表６１】
【０１２８】
【表６２】
【０１２９】
【表６３】
【０１３０】
【表６４】
【０１３１】
【表６５】
【０１３２】
【表６６】
【０１３３】
【表６７】
【０１３４】
【表６８】
【０１３５】
【表６９】
【０１３６】
表４ｅ
２ａ（１〜３）
【表７０】
【０１３７】
【表７１】
【０１３８】
【表７２】
【０１３９】
【表７３】
【０１４０】
【表７４】
【０１４１】
表４ｆ
２ａ（４〜６）
【表７５】
【０１４２】
【表７６】
【０１４３】
【表７７】
【０１４４】
【表７８】
【０１４５】
【表７９】
【０１４６】
【表８０】
【０１４７】
【表８１】
【０１４８】
【表８２】
【０１４９】
【表８３】
【０１５０】
【表８４】
【０１５１】
【表８５】
【０１５２】
【表８６】
【０１５３】
【表８７】
【０１５４】
表４ｇ
２ｂ（１〜３）
【表８８】
【０１５５】
【表８９】
【０１５６】
【表９０】
【０１５７】
【表９１】
【０１５８】
【表９２】
【０１５９】
【表９３】
【０１６０】
表４ｈ
２ｂ（４〜６）
【表９４】
【０１６１】
【表９５】
【０１６２】
【表９６】
【０１６３】
【表９７】
【０１６４】
【表９８】
【０１６５】
【表９９】
【０１６６】
【表１００】
【０１６７】
【表１０１】
【０１６８】
【表１０２】
【０１６９】
【表１０３】
【０１７０】
【表１０４】
【０１７１】
【表１０５】
【０１７２】
表４ｉ
３ａ（１〜３）
【表１０６】
【０１７３】
【表１０７】
【０１７４】
【表１０８】
【０１７５】
【表１０９】
【０１７６】
【表１１０】
【０１７７】
表４ｊ
３ａ（４〜６）
【表１１１】
【０１７８】
【表１１２】
【０１７９】
【表１１３】
【０１８０】
【表１１４】
【０１８１】
【表１１５】
【０１８２】
【表１１６】
【０１８３】
【表１１７】
【０１８４】
【表１１８】
【０１８５】
【表１１９】
【０１８６】
【表１２０】
【０１８７】
【表１２１】
【０１８８】
表４ｋ
３ｂ（１〜３）
【表１２２】
【０１８９】
【表１２３】
【０１９０】
【表１２４】
【０１９１】
【表１２５】
【０１９２】
【表１２６】
【０１９３】
表４ｌ
３ｂ（４〜６）
【表１２７】
【０１９４】
【表１２８】
【０１９５】
【表１２９】
【０１９６】
【表１３０】
【０１９７】
【表１３１】
【０１９８】
【表１３２】
【０１９９】
【表１３３】
【０２００】
【表１３４】
【０２０１】
【表１３５】
【０２０２】
【表１３６】
【０２０３】
【表１３７】
【０２０４】
表４ｍ
Ｈ７７（１〜３）
【表１３８】
【０２０５】
【表１３９】
【０２０６】
【表１４０】
【０２０７】
【表１４１】
【０２０８】
【表１４２】
【０２０９】
【表１４３】
【０２１０】
表４ｎ
Ｈ７７（４〜６）
【表１４４】
【０２１１】
【表１４５】
【０２１２】
【表１４６】
【０２１３】
【表１４７】
【０２１４】
【表１４８】
【０２１５】
【表１４９】
【０２１６】
【表１５０】
【０２１７】
【表１５１】
【０２１８】
【表１５２】
【０２１９】
【表１５３】
【０２２０】
【表１５４】
【０２２１】
【表１５５】
【０２２２】
【表１５６】
【０２２３】
【表１５７】
【０２２４】
【表１５８】
【０２２５】
実施例１.２：本発明によるｎｃＨＣＶペプチドの免疫原性
本発明により提供されるペプチドが免疫原性を有する可能性があるか否かを決定するため、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子についてＨＣＶ１ｂからの３つのペプチドを選び、これらペプチドでＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（ＨＨＤ）にワクチン接種した。
【０２２６】
実施例１.２.１：本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１３７１、Ｉｐｅｐ１３７２、Ｉｐｅｐ１３７３）によるマウスのワクチン接種
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１３７１（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１１ ＴＬＷＡＧＰＬＫＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（２）１３７２（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１３ ＬＬＬＱＲＷＡＬＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（３）１３７３（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）２７ ＦＭＬＧＡＬＬＰＩ） ＋ ＣｐＧ１６６８
【０２２７】
ワクチン接種の７日後、水切りしたリンパ節を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図１からわかるように、全てのペプチドが多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した（「バックグラウンド」は「培地対照」、すなわちペプチドなしで培養した細胞を意味する）。
【０２２８】
実施例１.２.２：本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１４４５、Ｉｐｅｐ１４４７）によるマウスのワクチン接種
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１４４５（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（１−３）３６ ＲＬＬＱＬＫＹＣＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（２）１４４７（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（１−３）３６ ＦＬＹＬＰＬＳＦＡＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
【０２２９】
ワクチン接種の７日後、脾臓を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図２からわかるように、両ペプチドが多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した（「バックグラウンド」は「培地対照」、すなわちペプチドなしで培養した細胞を意味する）。
【０２３０】
実施例１.３：本発明によるｎｃＨＣＶペプチドのＨＣＶ患者のインビボ関連性
本発明によるｎｃＯＲＦペプチドはｔｇ−マウスにおいて免疫原性であるので、本発明のペプチドをＨＣＶ＋患者からのＰＢＬでＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【０２３１】
実施例１.３.１：ＨＣＶ患者由来細胞および本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１３７１、Ｉｐｅｐ１３７２、Ｉｐｅｐ１３７３）を用いたＥｌｉｓｐｏｔ
患者は１９９２年に慢性ＨＣＶに感染しており、１９９３年から１９９４年にＩＦＮ−アルファ単一療法で治療した。１９９６年に凍結した患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍して以下のペプチドを用いてＩＦＮ−ｇ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを行った：
（１）１３７１（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１１ ＴＬＷＡＧＰＬＫＶ）
（２）１３７２（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１３ ＬＬＬＱＲＷＡＬＶ）
（３）１３７３（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）２７ ＦＭＬＧＡＬＬＰＩ）
（４）１００６（ＨＣＶ由来） ＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ
（５）８４（ＨＣＶ由来） ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ
（６）ＣＭＶｐｐ６５ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ
（７）インフルエンザＡマトリックス（アミノ酸５８〜６７） ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ
【０２３２】
表５および図３からわかるように、ペプチド１３７１、１３７２および１３７３は、正の対照ペプチド（ＣＭＶ由来、インフルエンザ由来）と同様に多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した。
【０２３３】
【表１５９】
【０２３４】
実施例１.４：フレーム４〜６からのペプチドはトランスジェニックマウスにおいて免疫原性である
（Ｉｐｅｐ１４９０；Ｉｐｅｐ１４９１；Ｉｐｅｐ１４９２；Ｉｐｅｐ１４９３；Ｉｐｅｐ１４９４；Ｉｐｅｐ８２）
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１４９０（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＫＭＬＮＲＲＶＬＷＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（２）１４９１（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＶＬＬＭＣＱＬＰＬＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（３）１４９２（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＭＬＮＲＲＶＬＷＶＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（４）１４９３（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＴＩＬＥＬＥＱＳＦＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（５）１４９４（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＫＭＭＳＰＨＡＡＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（６） ８２（ＥＢＶ、対照 ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ） ＋ ＣｐＧ１６６８
【０２３５】
ワクチン接種の７日後、脾臓を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図４からわかるように、４つのペプチドのうちの２つ（＃１４９１、＃１４９４）が多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発する。
【０２３６】
実施例１による本発明のＨＣＶモデルを用い、以下のことを明らかに示すことができた：
ウイルスゲノムの異なるＯＲＦ内に、可能なコードされたＣＴＬエピトープを同定することができる；
これらＯＲＦのペプチドは、とりわけリーディングフレーム４〜６においても、ｔｇ−マウスで免疫原性である；
ＨＣＶ＋患者において陽性のＥＬＩｓｐｏｔの結果を与える、すなわちＨＣＶ感染において関連のある病理学的パラメーターである。
【０２３７】
実施例２：ＨＩＶ
本実施例ではＨＩＶのゲノムをその非コードＯＲＦに関して本発明に従って分析した。その結果を表６に示す。これらから、ＨＩＶワクチンの製造に抗原として用いるのが好ましい最小長の７アミノ酸残基を有するＨＩＶ−ｎｃＯＲＦまたは７アミノ酸残基よりも長いＨＩＶ−ｎｃＯＲＦを得ることができる。
【０２３８】
さらに好ましくは、最小長の９アミノ酸残基を有するＯＲＦが、とりわけＴ細胞抗原、Ｂ細胞抗原またはその両者である場合に表６から選択される。
【０２３９】
それゆえ、ＨＩＶ−ＯＲＦは表６中のＯＲＦ−Ｎｏ．１３、２３、２７、６９および８０から選択するのが好ましい。
【０２４０】
【表１６０】
【０２４１】
【表１６１】
【０２４２】
【表１６２】
表６：非コードＨＩＶ−ＯＲＦ ＝ ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦ、ＶＰＲ、ＴＡＴ、ＲＥＶ、ＶＰＵ、ＥＮＶおよびＮＥＦ（表６中のＯＲＦ番号１、１４、１６、４９、５５、５９、６０、６２、６３および８７）以外はすべてのＯＲＦ
【０２４３】
ＨＩＶの選択したＯＲＦ：表６中のＯＲＦ番号２、３、６、９、１１、１２、１３、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４３、４４、４６、４８、５０、５６、５７、５８、６４、６７、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、８９、９０および９１。
【０２４４】
実施例３．ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
本実施例では、実施例１でＨＣＶエピトープについて記載したのと同様にしてＨＰＶの優れた免疫特性を備えた可能なｎｃＯＲＦエピトープを同定する。その結果を以下の表７に示す。
【０２４５】
【表１６３】
【０２４６】
【表１６４】
【０２４７】
【表１６５】
【０２４８】
【表１６６】
【０２４９】
【表１６７】
【０２５０】
【表１６８】
【０２５１】
【表１６９】
【０２５２】
【表１７０】
【０２５３】
【表１７１】
【０２５４】
【表１７２】
【０２５５】
【表１７３】
【０２５６】
【表１７４】
【０２５７】
【表１７５】
【０２５８】
【表１７６】
【０２５９】
【表１７７】
【０２６０】
【表１７８】
【０２６１】
【表１７９】
【０２６２】
【表１８０】
【０２６３】
【表１８１】
【０２６４】
【表１８２】
【０２６５】
【表１８３】
【０２６６】
【表１８４】
【０２６７】
【表１８５】
【０２６８】
【表１８６】
【０２６９】
【表１８７】
【０２７０】
【表１８８】
【０２７１】
【表１８９】
【０２７２】
【表１９０】
【０２７３】
【表１９１】
【０２７４】
【表１９２】
【０２７５】
【表１９３】
【０２７６】
【表１９４】
【０２７７】
【表１９５】
【０２７８】
【表１９６】
【０２７９】
【表１９７】
【０２８０】
【表１９８】
表７
【０２８１】
実施例４．インフルエンザ
ＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３とともにインフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドを用いたマウスのワクチン接種。ワクチン接種の７日後に特異的なＴ細胞応答を測定し、その後、被験動物を致死量のマウス適合インフルエンザＡウイルス（×３１）で攻撃する。生存を１５日間モニターする。
【０２８２】
材料
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan-Winkelmann、ドイツ）
ペプチド：ｐ８２（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）：ＥＢＶ；ＨＬＡ−Ａ＊０２０１；アミノ酸開始２８０からの対照ペプチド
ｐ１５７４（ＩＡＳＮＥＮＭＥＴＭ）：インフルエンザ核タンパク質、アミノ酸開始３６５からの対照ペプチド
ｐ１５６９（ＴＭＬＹＮＫＭＥＦ）：セグメント１、フレーム１、ＯＲＦ１、アミノ酸開始５６９からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
ｐ１６００（ＳＳＩＡＡＱＤＡＬ）：セグメント３、フレーム６、ＯＲＦ２、アミノ酸開始８３からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
ｐ１６６４（ＶＴＩＬＮＬＡＬＬ）：セグメント４、フレーム５、ＯＲＦ６、アミノ酸開始９からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
投与量：１００μｇ／ペプチド／マウス。
【０２８３】
ｏ−ｄ（ＩＣ）１３（＝ＯＤＮ１ａ）：ＯＤＮ ５’ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣ３’をPurimex Nucleic Acids Technology、ゲッチンゲンにより合成した。
投与量：５ナノモル／マウス。
【０２８４】
ＫＬＫ：ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ−ＣＯＯＨをMPS（Multiple Peptide System、米国）により合成した。
投与量：１２７ナノモル／マウス。
調合：２７０ｍＭソルビトール／１０ｍＭ Hepes
【０２８５】
インフルエンザＡウイルス：×３１、マウス適合インフルエンザＡウイルス、Ａ／Ｐｒ／８／３４（セグメント１、２、３、５、７、８）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（セグメント４、６）からの組換え（rec.）ウイルス
【０２８６】
実験条件（１５匹のマウス／群）
１．ｐ１５７４ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
２．ｐ１５６９ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
３．ｐ１６００ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
４．ｐ１６６４ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
５．ｐ１６００ ＋ ｐ１５６９ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
【０２８７】
第０日目にマウスの両後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（５０μｌ／足）を皮下注射した。第７日目に、各実験群についてペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生細胞の数を計数するために５匹のマウスからの分離していない脾細胞を９６ウエルＥＬＩｓｐｏｔプレートで刺激した。残りの１０匹のマウスはマウス適合×３１インフルエンザＡウイルス（５＊１０Ｅ５ ｐｆｕ）で攻撃した。生存を１５日間モニターした。
【０２８８】
結果（ＥＬＩｓｐｏｔ；図５ａ）
１群および３群（ペプチドｐ１５７４およびｐ１６００）の脾細胞は、各ペプチドで再刺激した後に特異的なスポットを示さない。２群および４群（ｐ１５６９およびｐ１６６４）は再刺激後にＩＦＮ−γを特異的に放出する。５群は２つの個々のペプチド（混合物としてではなく、ｐ１６００およびｐ１５６９）でワクチン接種した。両ペプチドの混合物かまたはｐ１５６９のいずれかで再刺激すると特異的なサイトカイン放出が検出される。対照的に、ｐ１６００単独で再刺激するとＩＦＮ−γスポットは検出できない。これは３群（ｐ１６００単独）と一致するものである。
【０２８９】
結果（攻撃；図５ｂ）
図５ｂは、致死量のマウス適合インフルエンザＡウイルス×３１で攻撃したマウスの生存率を示す。１群（ｐ１５７４、Ｈ２−Ｄｂについて報告された防御ペプチド）は攻撃した全マウスの３０％を防御する。ペプチドｐ１５６９は全く防御を与えない。対照的に、ペプチドｐ１６００およびｐ１６６４は、それぞれ攻撃した動物の５０％および６２％を防御する。動物を２つの異なるペプチドでワクチン接種すると（５群、ペプチドｐ１６００およびｐ１６６４）、動物の７０％が防御される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性ウイルスに由来するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
幾つかのウイルス感染については、宿主からウイルス感染を克服ないし排除するには大抵のコードされたウイルスタンパク質に対する初期の有効で強力なＣＴＬ応答が重要であることがますます明らかになってきている。
【０００３】
ＨＩＶのＣＴＬエピトープ内の変異に対する選択はＣＴＬがウイルス複製に対してインビボで圧力を及ぼすことを示しており、またマカークザルにおける研究は急性および慢性の両シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染におけるウイルス血症を制御するうえでのＣＤ８＋Ｔ細胞の役割についての興味深い（compelling）インビボデータを提供している。急性感染の際に治療を受けたＨＩＶ感染個体は、治療の中断後にその後のウイルス制御と関連してＨＩＶに対するＣＴＬおよびＴヘルパー細胞の両応答の亢進を示す。
【０００４】
それゆえ、大抵の（全てではないにしても）ウイルスタンパク質の正確なエピトープの同定は宿主の免疫応答を理解する観点からの主たる目標であり、これら病原体に対する新規かつ有効なワクチンをデザインするうえで最も重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでのところ、これらエピトープの同定のための大抵の研究は、実際に転写されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）でコードされるウイルスタンパク質、すなわち構造タンパク質およびウイルスの何らかの機能（たとえば制御、複製または再生産）を有するタンパク質に主として向けられていた。
【０００６】
病原体の可能な別のリーディングフレームを調べるべくある種の研究はなされてはきたが、ＨＣＶ（Walewskiら（RNA 7 (2001) 710-721）およびＷＯ９９／６３９４１を参照）および他のウイルスまたは抗原（Bullockら（J. Exp. Med. 186(7)(1997), 1051-1058）、Malarkannanら（Immunity 10 (1999) 681-690）およびShastriら（J. Biol. Chem. 270 (3)(1995) 1088-1091））での重複リーディングフレームに関する幾つかの報告にもかかわらず、これまでのそのような別のリーディングフレームについての話題は、ウイルス病原体にではなく腫瘍抗原に関連のあるものとしか認められてこなかった。これら報告されたウイルスポリペプチドはすべてＡＵＧまたはＡＴＧ以外の開始コドンを有しており、たとえばＡｌａ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｙで開始されるペプチドに導く。さらに、これら従来技術によるウイルスペプチドはＴ細胞エピトープではなく、せいぜい抗体応答を惹起しうるのみであった。
【０００７】
本発明の目的は、ウイルス感染に対抗するためのさらなる手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、ウイルス病原体、とりわけヒト病原体に対する既存のまたは提唱されたワクチンを置換または改善する手段を提供することである。本発明の特別の目的は、ウイルス病原体に対する有効なＴ細胞エピトープを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それゆえ、本発明は、病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、
メチオニンアミノ酸残基から開始され、
抗原決定基を含み、かつ
７を超えるアミノ酸残基を含む
ことを特徴とするポリペプチド、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片を提供する。
【０００９】
驚くべきことに、そのようなエピトープ（抗原決定基）は病原性ウイルスによる感染と極めて関係が深いことがわかった。実際、そのような別にコードされたエピトープに対するＴ細胞応答をそのような感染を患う患者において検出することができる。ウイルスが宿主細胞に感染すると、ウイルスタンパク質を生成するウイルスゲノムのＯＲＦが転写されるのみならず、ゲノムの他のフレームによりコードされるある種のタンパク質または断片もまた転写されるように思われる。
【００１０】
そのような本発明によるポリペプチドは、ゲノムのＯＲＦ内ではあるが所定の病原性ウイルスで主として（主）転写されるＯＲＦの範囲外にある抗原性配列として定義することができる。
【００１１】
本発明との関連において使用する別のリーディングフレームとは、たとえば構造タンパク質や非構造タンパク質の発現のために使用される生物やウイルスのコドンをコードするオープンリーディングフレーム（主フレーム）とは異なるリーディングフレームとして定義することができる。
【００１２】
典型的に、しかし必ずしも全ての場合にそうではないが、主フレームは、たとえばメッセンジャーＲＮＡや（＋）／（−）鎖ＲＮＡウイルスからのＲＮＡの核酸の最初のコード開始コドン、たとえばＡＵＧやＧＵＧから開始する。本発明において記載する別のフレームは、それぞれ主フレームによって使用されるこれら開始コドンまたは他のいかなるコドンを使用することはない。
【００１３】
本発明は、５つのそのような別のリーディングフレームを想定しており、これらは上記の主フレームと区別して第二の呼び方として非コードオープンリーディングフレーム（ｎｃＯＲＦ）とも称する。そのような別のリーディングフレームの１つは＋１フレームであり、このものは主フレームコドンの５’プライムヌクレオチドの３’プライムのつぎのヌクレオチドから開始するコドンを使用する。そのような第二のフレームは＋２フレームであり、このものは５’プライムヌクレオチドが主コードフレームのコドンの３’プライムヌクレオチドと同一であるコドンを使用する。別のリーディングフレーム４、５および６は、それぞれ別のリーディングフレーム１および２をコードする核酸に相補的な核酸によりコードされる。フレーム４コドンの５’プライムヌクレオチドは＋１フレームのコドンの真中のヌクレオチドに相補的である。フレーム５コドンの５’プライムヌクレオチドは＋１フレームコドンの５’プライムヌクレオチドに相補的であり、フレーム６コドンの５’プライムヌクレオチドは＋２フレームコドンの３’プライムヌクレオチドに相補的である。
【００１４】
さらに、別のリーディングフレームは、主フレームの翻訳に関与しないゲノムの領域、たとえば、いわゆる非翻訳５’プライムまたは３’プライム領域に位置していてよい。
【００１５】
これら「ｎｃＯｒｆ」（「非コードＯＲＦ」）は病原体について（これまで）知られた機能を示さないが、これら「ｎｃＯｒｆ」は抗原決定基（Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープ）をコードする。
【００１６】
ＨＣＶ（Walewskiら、ＷＯ９９／６３９４１を参照）および他のウイルスまたは抗原（Bullockら、Malarkannanら、Shastriら）での別にコードされたＯＲＦに関する全ての使用可能な報告と対照的に、本発明によるポリペプチドはすべて開始コドンとしてＡＵＧまたはＡＴＧ（メチオニンをコードする）を有する。さらに、本発明により提供されるペプチドはＴ細胞エピトープを含み、抗体応答を生起させるもののみに限られることを意図するものではない。
【００１７】
本発明により提供される原理はウイルス感染において一般的なものであると思われる。それゆえ、本発明はある種のウイルスまたはウイルス群に限定されるものではない。この点に関し、本発明による好ましいポリペプチドまたは断片は、主要なおよび著名な（ヒト）病原性ウイルスまたは現在のところ適切な治療または活性な免疫プロトコールの存在しない病原性ウイルス、たとえば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウイルス（ＨＦＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（たとえば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、エボラウイルス、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＳＩＶ、パルボウイルス、パピローマウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶ）、麻疹ウイルスおよび発癌ウイルスからのものである。
【００１８】
本発明では全く新規な世代の免疫原性エピトープが提供され、該エピトープは本発明の好ましい態様によれば本発明によるポリペプチドおよび断片が少なくとも１つの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、本発明によるポリペプチドまたは断片は、Ａ０２０１、Ａ１、Ａ２４、Ａ３、Ａ３１、Ｂ３５０１、Ｂ４４０３、Ｂ７、Ｂ８、とりわけＡ０２０１、またはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。
【００２０】
好ましい態様によれば、本発明によるポリペプチドまたは断片は少なくとも１つのＴヘルパー細胞エピトープを含む。
【００２１】
好ましくは、本発明によるポリペプチドまたは断片は、ＤＰ、ＤＱ、ＤＲまたはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対するＴヘルパー細胞エピトープを含む。
【００２２】
本発明による好ましいエピトープは、表２ａ）〜２ｎ）（配列番号１〜８２２）に列挙した群から選ばれるかまたは７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片および／または表４ａ）〜４ｎ）に列挙した群から選ばれた断片、好ましくは５０またはそれ以上のスコアを有する断片、さらに好ましくは２００を超えるスコアを有する断片、とりわけ５００を超えるスコア（表に示したスコア（Parkerら（J. Immunol. 152 (1994) 163）により報告されたアルゴリズムにより決定した）による）を有する断片を含むかまたは該断片からなるエピトープである。
【００２３】
本発明によるさらに好ましいエピトープは、表６に列挙され７を超えるアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号８２３〜８７４）または７を超えるアミノ酸残基を含む該ポリペプチドの断片である。
【００２４】
本発明によるポリペプチドまたは断片は、担体、とりわけ免疫修飾（immunomodulating）物質にコンジュゲートすることができる。ある種の応用においては、そのような結合はこれらペプチドの作用の改善という結果となる。また、ＷＯ０１／７８７６７に記載のように、これらペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に選択した疎水性（Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｃ）または酸性（ＤまたはＥ）アミノ酸残基を結合させるのが好ましい。
【００２５】
それゆえ、好ましいポリペプチドまたは断片は、Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸（該アミノ酸はＦ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、ＷまたはＣから選ばれる）からなるテール；またはＮ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸（該アミノ酸はＤまたはＥから選ばれる）からなるテールを含む。
【００２６】
特に好ましいコンジュゲートでは、本発明のポリペプチドまたは断片は、ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択される免疫修飾物質にコンジュゲートする。
【００２７】
好ましくは、ポリカチオン性物質は、ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンまたは抗菌性ペプチドである。
【００２８】
本発明に従って用いるポリカチオン性化合物は、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すあらゆるポリカチオン性化合物であってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない。特に好ましいのは、ポリリシン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは２０〜５００アミノ酸残基、とりわけ３０〜２００残基を含む。
【００２９】
これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
【００３０】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、ポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい。ペプチドはまたデフェンシンのクラスに属していてもよい。そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシン（defensives）もまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を最終生成物として活性化（またはダウンレギュレーション）することを可能にする化合物はポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００３１】
本発明においてポリカチオン性物質として使用するのに特に好ましいのは、カテリシジン（cathelicidin）由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（ＷＯ０２／１３８５７、参照のため本明細書中に引用する）、とりわけ哺乳動物、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチド、または（ヒト）成長ホルモンなどの神経刺激性の化合物である（たとえば、ＷＯ０１／２４８２２に記載）。
【００３２】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ（由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体）または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはカテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質、とりわけマウス、ウシまたは特にヒトのカテリンおよび／またはカテリシジンである。カテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、本発明による抗原／ワクチン組成物と組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫促進性物質を用いまたは用いることなく、本発明の医薬において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００３３】
本発明に従って用いることのできる他の好ましいポリカチオン性物質は、３〜７の疎水性アミノ酸、とりわけＬのリンカーによって隔てられた少なくとも２つのＫＬＫモチーフを含む合成ペプチドである（ＷＯ０２／３２４５１、参照のため本明細書中に引用する）。
【００３４】
本発明に従って用いる免疫修飾核酸は、合成したもの、原核生物および真核生物由来のものであってよい。真核生物由来である場合は、ＤＮＡは系統樹に基づいて進化の遅れた種（たとえば昆虫、しかし他の種も可能）からのものでなければならない。本発明の好ましい態様において、免疫原性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は合成により製造したＤＮＡ分子またはそのような分子の混合物である。たとえば米国特許第５,７２３,３３５号および同第５,６６３,１５３号に記載されているようなチオホスフェート置換アナログ（チオホスフェート残基がホスフェートを置換する）などのＯＤＮの誘導体または修飾物、および好ましくは免疫促進組成物を安定化させるがその免疫学的特性は変化させない他の誘導体および修飾物も含まれる。好ましい配列モチーフは、２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンによりフランキングされた（非メチル化）ＣｐＧジヌクレオチドを含む６塩基ＤＮＡモチーフ（５’−Ｐｕｒ−Ｐｕｒ−Ｃ−Ｇ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒ−３’）である。本発明によるＯＤＮに含まれるＣｐＧモチーフは高等脊椎動物ＤＮＡよりも微生物において一般的であり、メチル化のパターンにおいて差異を示す。驚くべきことに、マウスＡＰＣを促進する配列はヒトの細胞に対しては特に有効というわけではない。本発明に従って用いる好ましいパリンドローム性または非パリンドローム性ＯＤＮは、たとえばオーストリア特許出願Ａ１９７３／２０００、Ａ８０５／２００１、ＥＰ０４６８５２０Ａ２、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／３７９１９、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５２５８１、ＷＯ９８／５２９６２、ＷＯ９９／５１２５９およびＷＯ９９／５６７５５（すべて参照のため本明細書に引用する）に開示されている。免疫系を促進させることとは別に、ある種のＯＤＮはある種の免疫応答を中和する。これら配列もまた、たとえば自己免疫疾患の治療に応用するために本発明に含まれる。ＯＤＮ／ＤＮＡは、化学的にまたは組換えにより製造することができ、または天然源に由来するものであってよい。好ましい天然源は昆虫である。
【００３５】
あるいは、ヒポキサンチンおよびシトシンに基づく核酸（たとえばＷＯ０１／９３９０５に記載のようなもの）やデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（ＰＣＴ／ＥＰ０２／０５４４８（参照のため本明細書に引用する）に記載）を本発明の免疫促進核酸として用いるのが好ましい。
【００３６】
もちろん、異なる免疫原性核酸の混合物も本発明に従って用いることができる。
【００３７】
上記の物質は、本発明のペプチドまたは断片または混合物とのコンジュゲートとして用いることができる。混合物は、すでに混合した形態かまたは適用前に混合することを意図した単一成分のキットとして提供できる。
【００３８】
本発明による好ましいポリペプチドまたは断片はＴ細胞エピトープを含む。
【００３９】
驚くべきことに、本発明により、シフトしたリーディングフレーム（すなわち、リーディングフレーム２および３）を有するポリペプチドまたは断片のみならず、該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレーム、すなわち本明細書において一般にリーディングフレーム４〜６と称するものによってコードされるペプチドおよび断片もまた臨床的に関連するペプチドとして提供される。このことは、既知の（機能的または構造）遺伝子の反対の端に位置する、たとえばその調節配列に位置するリーディングフレームも重要であることを意味する。
【００４０】
それゆえ、本発明の１つのさらなる側面は、該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレーム、すなわち一般にリーディングフレーム４〜６と称するものによってコードされる全ての抗原からなる。
【００４１】
本発明による好ましいポリペプチドまたは断片は、表４ａ、４ｃ、４ｅ、４ｇ、４ｉ、４ｋおよび４ｍに列挙され、５０またはそれ以上のスコア、より好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有するペプチドの群から選択される少なくとも１のペプチドを含む。
【００４２】
本発明の好ましい側面によれば、ポリペプチドまたは断片は治療剤として使用する。とりわけＴ細胞エピトープが予防的な使用のためのワクチンとして使用できることが知られている。しかしながら、本発明によるペプチドおよび断片を用い、とりわけリーディングフレーム２および３のＨＣＶ由来ペプチドを用い、ＨＣＶなどの病原性ウイルスの（慢性）感染症を克服するための治療手段が提供される。
【００４３】
本発明によるペプチドおよび断片はまた、所定のエピトープの好ましくは１または２のアミノ酸がたとえばTourdotら（Eur.J.Immunol. 30 (2000), 3411-3421）に開示の法則に従って修飾または置換されている修飾エピトープ、並びにそのような修飾エピトープをコードする核酸配列をも含む。
【００４４】
好ましい側面によれば、本発明はまた本発明による１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を含む医薬組成物にも関する。この医薬組成物は、予防および治療の両目的に使用できる。
【００４５】
上記に記載したように、本発明の医薬組成物は、免疫修飾物質、好ましくはポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択されるものをさらに含むのが好ましい。
【００４６】
本発明の医薬組成物においては、本発明のペプチドまたは断片は単独または所定の病原性ウイルス（または異なる病原体の抗原の組み合わせ）の「通常の」ポリペプチド（エピトープ、抗原決定基）と組み合わせて用いることができる。それゆえ、好ましい態様は、病原性ウイルスの構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片、とりわけ抗原決定基を含む構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片を包含する。
【００４７】
本発明による医薬組成物の投与は、他の既知のポリペプチドワクチンの投与に従って行うことができる。好ましくは、該組成物は、本発明による１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を単位投与当たり１ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０μｇ〜１ｍｇ含む。
【００４８】
好ましくは医薬組成物はワクチンとして調合する。
【００４９】
本発明による医薬組成物は、さらなる活性成分、とりわけ免疫強化サイトカイン、抗炎症物質、抗菌物質またはそれらの組み合わせを含んでいるのが好ましい。
【００５０】
本発明の医薬組成物はさらに、ポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンよりなる群から選ばれたポリカチオン性ポリマー、または抗菌ペプチド、とりわけカテリシジン由来の抗菌ペプチド、または成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンを含んでいるのがさらに好ましい。
【００５１】
さらに、補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝物質、安定化剤またはそれらの組み合わせが医薬組成物に提供される。
【００５２】
他の側面によれば、本発明はまた、該病原性ウイルスの感染の治療または予防用医薬の製造のための本発明によるポリペプチドまたは断片の使用にも関する。
【００５３】
ウイルスが宿主細胞に感染したときに、ウイルスタンパク質を生じるウイルスゲノムのＯＲＦが転写されるのみならず、該ゲノムの他のフレームによってコードされるタンパク質または断片の幾つかもまた転写されることは、従来技術の範囲では予測できなかった。このことは、リーディングフレーム４〜６についてはさらに一層驚くべきことであった。
【００５４】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれら特定の態様に限られるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｔｇマウス＋ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ１１、１３、２７由来ペプチドを用いた実験からのＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【００５６】
【図２】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｔｇマウス＋ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ３６由来ペプチドを用いた実験からのＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【００５７】
【図３】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ＨＣＶ陽性患者のＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【００５８】
【図４】トランスジェニックマウスにおけるＨＣＶ１ｂリーディングフレーム４〜６からのペプチドの免疫原性を示す。
【００５９】
【図５ａ】インフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドをＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３と組み合わせて用いたワクチン接種は、強力なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞およびウイルスの攻撃に対する防御を誘発することを示す。
【００６０】
【図５ｂ】インフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドをＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３と組み合わせて用いたワクチン接種は、強力なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞およびウイルスの攻撃に対する防御を誘発することを示す。
【００６１】
実施例：
実施例１：ＨＣＶ
ＨＣＶを本発明のモデルウイルスとして用いた。しかしながら、本実施例に記載する原理はいかなるウイルスにも応用できる。
【００６２】
ＨＣＶポリプロテインのリーディングフレーム以外の全てのリーディングフレームにおいて７アミノ酸残基よりも長くＡＵＧ（Ｍｅｔ）コドンで開始される全てのＯＲＦを決定するため、ＨＣＶの７つの臨床的に関連のある株（１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂおよびＨ７７）の全ゲノムを分析した。ＨＣＶゲノム配列は、ジーンバンクデータベース（アクセッション番号：ＡＦ３８７８０６（１ａ）、Ｄ１１３５５（１ｂ）、ＡＦ２３８４８５（２ａ）、ＡＢ０３０９０７（２ｂ）、ＡＦ０４６８６６（３ａ）、Ｄ４９３７４（Ｄ２６５５６）（３ｂ）、ＡＦ０１１７５１（Ｈ７７））から得た。全部で８２２の新規なＯＲＦがこの研究で同定された（表１の要約を参照）。
【００６３】
【表１】
【００６４】
以下の表２は、ポリペプチドの全配列を含む。
【００６５】
本実施例に適合させるのが好ましい他のＨＣＶサブタイプとしては、サブタイプ１ｃ、２ｃ、２ｄ、３ｃ〜ｆ、４ａ〜ｊ、５ａまたは６ａが挙げられる。
【００６６】
表２ａ（配列番号１〜４２）
ＨＣＶ１ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ３８７８０６
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
表２ｂ（配列番号４３〜１１０）
ＨＣＶ１ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表４】
【００６９】
【表５】
【００７０】
【表６】
【００７１】
表２ｃ（配列番号１１１〜１６６）
ＨＣＶ１ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ
【表７】
【００７２】
【表８】
【００７３】
表２ｄ（配列番号１６７〜２４１）
ＨＣＶ１ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表９】
【００７４】
【表１０】
【００７５】
【表１１】
【００７６】
表２ｅ（配列番号２４２〜２８８）
ＨＣＶ２ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ２３８４８５
【表１２】
【００７７】
【表１３】
【００７８】
表２ｆ（配列番号２８９〜３５９）
ＨＣＶ２ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表１４】
【００７９】
【表１５】
【００８０】
【表１６】
【００８１】
表２ｇ（配列番号３６０〜４０４）
ＨＣＶ２ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＢ０３０９０７
【表１７】
【００８２】
【表１８】
【００８３】
表２ｈ（配列番号４０５〜４７９）
ＨＣＶ２ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表１９】
【００８４】
【表２０】
【００８５】
【表２１】
【００８６】
表２ｉ（配列番号４８０〜５１７）
ＨＣＶ３ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ０４６８６６
【表２２】
【００８７】
【表２３】
【００８８】
表２ｊ（配列番号５１８〜５８７）
ＨＣＶ３ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表２４】
【００８９】
【表２５】
【００９０】
【表２６】
【００９１】
表２ｋ（配列番号５８８〜６４０）
ＨＣＶ３ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：Ｄ４９３７４，Ｄ２６５５６
【表２７】
【００９２】
【表２８】
【００９３】
表２ｌ（配列番号６４１〜７１２）
ＨＣＶ３ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表２９】
【００９４】
【表３０】
【００９５】
【表３１】
【００９６】
表２ｍ（配列番号７１３〜７５２）
ＨＣＶＨ７７ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ０１１７５１
【表３２】
【００９７】
【表３３】
【００９８】
表２ｎ（配列番号７５３〜８２２）
ＨＣＶＨ７７ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表３４】
【００９９】
【表３５】
【０１００】
【表３６】
【０１０１】
異なるＨＬＡ対立遺伝子について可能なＣＴＬエピトープの予測のためにウエブベースのコンピューターソフトウエアを用い、１０またはそれ以上の（相対的）カットオフ値となる（Parkerら（上記）により）（おそらく）コードされているエピトープの存在について単一のＯＲＦをすべて分析した。
【０１０２】
【表３７】
【０１０３】
以下の表４には、試験したＨＬＡ対立遺伝子に関して認められたエピトープの正確な（最小の）配列を、所定のエピトープが所定のＨＬＡ型に有効に結合する能力を同定する（相対的）スコアとともに示す。
【０１０４】
表４ａ
１ａ（１〜３）
【表３８】
【０１０５】
【表３９】
【０１０６】
【表４０】
【０１０７】
【表４１】
【０１０８】
【表４２】
【０１０９】
表４ｂ
１ａ（４〜６）
【表４３】
【０１１０】
【表４４】
【０１１１】
【表４５】
【０１１２】
【表４６】
【０１１３】
【表４７】
【０１１４】
【表４８】
【０１１５】
【表４９】
【０１１６】
【表５０】
【０１１７】
【表５１】
【０１１８】
【表５２】
【０１１９】
【表５３】
【０１２０】
表４ｃ
１ｂ（１〜３）
【表５４】
【０１２１】
【表５５】
【０１２２】
【表５６】
【０１２３】
【表５７】
【０１２４】
【表５８】
【０１２５】
表４ｄ
１ｂ（４〜６）
【表５９】
【０１２６】
【表６０】
【０１２７】
【表６１】
【０１２８】
【表６２】
【０１２９】
【表６３】
【０１３０】
【表６４】
【０１３１】
【表６５】
【０１３２】
【表６６】
【０１３３】
【表６７】
【０１３４】
【表６８】
【０１３５】
【表６９】
【０１３６】
表４ｅ
２ａ（１〜３）
【表７０】
【０１３７】
【表７１】
【０１３８】
【表７２】
【０１３９】
【表７３】
【０１４０】
【表７４】
【０１４１】
表４ｆ
２ａ（４〜６）
【表７５】
【０１４２】
【表７６】
【０１４３】
【表７７】
【０１４４】
【表７８】
【０１４５】
【表７９】
【０１４６】
【表８０】
【０１４７】
【表８１】
【０１４８】
【表８２】
【０１４９】
【表８３】
【０１５０】
【表８４】
【０１５１】
【表８５】
【０１５２】
【表８６】
【０１５３】
【表８７】
【０１５４】
表４ｇ
２ｂ（１〜３）
【表８８】
【０１５５】
【表８９】
【０１５６】
【表９０】
【０１５７】
【表９１】
【０１５８】
【表９２】
【０１５９】
【表９３】
【０１６０】
表４ｈ
２ｂ（４〜６）
【表９４】
【０１６１】
【表９５】
【０１６２】
【表９６】
【０１６３】
【表９７】
【０１６４】
【表９８】
【０１６５】
【表９９】
【０１６６】
【表１００】
【０１６７】
【表１０１】
【０１６８】
【表１０２】
【０１６９】
【表１０３】
【０１７０】
【表１０４】
【０１７１】
【表１０５】
【０１７２】
表４ｉ
３ａ（１〜３）
【表１０６】
【０１７３】
【表１０７】
【０１７４】
【表１０８】
【０１７５】
【表１０９】
【０１７６】
【表１１０】
【０１７７】
表４ｊ
３ａ（４〜６）
【表１１１】
【０１７８】
【表１１２】
【０１７９】
【表１１３】
【０１８０】
【表１１４】
【０１８１】
【表１１５】
【０１８２】
【表１１６】
【０１８３】
【表１１７】
【０１８４】
【表１１８】
【０１８５】
【表１１９】
【０１８６】
【表１２０】
【０１８７】
【表１２１】
【０１８８】
表４ｋ
３ｂ（１〜３）
【表１２２】
【０１８９】
【表１２３】
【０１９０】
【表１２４】
【０１９１】
【表１２５】
【０１９２】
【表１２６】
【０１９３】
表４ｌ
３ｂ（４〜６）
【表１２７】
【０１９４】
【表１２８】
【０１９５】
【表１２９】
【０１９６】
【表１３０】
【０１９７】
【表１３１】
【０１９８】
【表１３２】
【０１９９】
【表１３３】
【０２００】
【表１３４】
【０２０１】
【表１３５】
【０２０２】
【表１３６】
【０２０３】
【表１３７】
【０２０４】
表４ｍ
Ｈ７７（１〜３）
【表１３８】
【０２０５】
【表１３９】
【０２０６】
【表１４０】
【０２０７】
【表１４１】
【０２０８】
【表１４２】
【０２０９】
【表１４３】
【０２１０】
表４ｎ
Ｈ７７（４〜６）
【表１４４】
【０２１１】
【表１４５】
【０２１２】
【表１４６】
【０２１３】
【表１４７】
【０２１４】
【表１４８】
【０２１５】
【表１４９】
【０２１６】
【表１５０】
【０２１７】
【表１５１】
【０２１８】
【表１５２】
【０２１９】
【表１５３】
【０２２０】
【表１５４】
【０２２１】
【表１５５】
【０２２２】
【表１５６】
【０２２３】
【表１５７】
【０２２４】
【表１５８】
【０２２５】
実施例１.２：本発明によるｎｃＨＣＶペプチドの免疫原性
本発明により提供されるペプチドが免疫原性を有する可能性があるか否かを決定するため、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子についてＨＣＶ１ｂからの３つのペプチドを選び、これらペプチドでＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（ＨＨＤ）にワクチン接種した。
【０２２６】
実施例１.２.１：本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１３７１、Ｉｐｅｐ１３７２、Ｉｐｅｐ１３７３）によるマウスのワクチン接種
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１３７１（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１１ ＴＬＷＡＧＰＬＫＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（２）１３７２（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１３ ＬＬＬＱＲＷＡＬＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（３）１３７３（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）２７ ＦＭＬＧＡＬＬＰＩ） ＋ ＣｐＧ１６６８
【０２２７】
ワクチン接種の７日後、水切りしたリンパ節を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図１からわかるように、全てのペプチドが多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した（「バックグラウンド」は「培地対照」、すなわちペプチドなしで培養した細胞を意味する）。
【０２２８】
実施例１.２.２：本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１４４５、Ｉｐｅｐ１４４７）によるマウスのワクチン接種
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１４４５（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（１−３）３６ ＲＬＬＱＬＫＹＣＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（２）１４４７（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（１−３）３６ ＦＬＹＬＰＬＳＦＡＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
【０２２９】
ワクチン接種の７日後、脾臓を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図２からわかるように、両ペプチドが多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した（「バックグラウンド」は「培地対照」、すなわちペプチドなしで培養した細胞を意味する）。
【０２３０】
実施例１.３：本発明によるｎｃＨＣＶペプチドのＨＣＶ患者のインビボ関連性
本発明によるｎｃＯＲＦペプチドはｔｇ−マウスにおいて免疫原性であるので、本発明のペプチドをＨＣＶ＋患者からのＰＢＬでＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【０２３１】
実施例１.３.１：ＨＣＶ患者由来細胞および本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１３７１、Ｉｐｅｐ１３７２、Ｉｐｅｐ１３７３）を用いたＥｌｉｓｐｏｔ
患者は１９９２年に慢性ＨＣＶに感染しており、１９９３年から１９９４年にＩＦＮ−アルファ単一療法で治療した。１９９６年に凍結した患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍して以下のペプチドを用いてＩＦＮ−ｇ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを行った：
（１）１３７１（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１１ ＴＬＷＡＧＰＬＫＶ）
（２）１３７２（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１３ ＬＬＬＱＲＷＡＬＶ）
（３）１３７３（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）２７ ＦＭＬＧＡＬＬＰＩ）
（４）１００６（ＨＣＶ由来） ＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ
（５）８４（ＨＣＶ由来） ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ
（６）ＣＭＶｐｐ６５ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ
（７）インフルエンザＡマトリックス（アミノ酸５８〜６７） ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ
【０２３２】
表５および図３からわかるように、ペプチド１３７１、１３７２および１３７３は、正の対照ペプチド（ＣＭＶ由来、インフルエンザ由来）と同様に多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した。
【０２３３】
【表１５９】
【０２３４】
実施例１.４：フレーム４〜６からのペプチドはトランスジェニックマウスにおいて免疫原性である
（Ｉｐｅｐ１４９０；Ｉｐｅｐ１４９１；Ｉｐｅｐ１４９２；Ｉｐｅｐ１４９３；Ｉｐｅｐ１４９４；Ｉｐｅｐ８２）
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１４９０（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＫＭＬＮＲＲＶＬＷＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（２）１４９１（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＶＬＬＭＣＱＬＰＬＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（３）１４９２（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＭＬＮＲＲＶＬＷＶＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（４）１４９３（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＴＩＬＥＬＥＱＳＦＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（５）１４９４（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＫＭＭＳＰＨＡＡＶ） ＋ ＣｐＧ１６６８
（６） ８２（ＥＢＶ、対照 ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ） ＋ ＣｐＧ１６６８
【０２３５】
ワクチン接種の７日後、脾臓を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図４からわかるように、４つのペプチドのうちの２つ（＃１４９１、＃１４９４）が多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発する。
【０２３６】
実施例１による本発明のＨＣＶモデルを用い、以下のことを明らかに示すことができた：
ウイルスゲノムの異なるＯＲＦ内に、可能なコードされたＣＴＬエピトープを同定することができる；
これらＯＲＦのペプチドは、とりわけリーディングフレーム４〜６においても、ｔｇ−マウスで免疫原性である；
ＨＣＶ＋患者において陽性のＥＬＩｓｐｏｔの結果を与える、すなわちＨＣＶ感染において関連のある病理学的パラメーターである。
【０２３７】
実施例２：ＨＩＶ
本実施例ではＨＩＶのゲノムをその非コードＯＲＦに関して本発明に従って分析した。その結果を表６に示す。これらから、ＨＩＶワクチンの製造に抗原として用いるのが好ましい最小長の７アミノ酸残基を有するＨＩＶ−ｎｃＯＲＦまたは７アミノ酸残基よりも長いＨＩＶ−ｎｃＯＲＦを得ることができる。
【０２３８】
さらに好ましくは、最小長の９アミノ酸残基を有するＯＲＦが、とりわけＴ細胞抗原、Ｂ細胞抗原またはその両者である場合に表６から選択される。
【０２３９】
それゆえ、ＨＩＶ−ＯＲＦは表６中のＯＲＦ−Ｎｏ．１３、２３、２７、６９および８０から選択するのが好ましい。
【０２４０】
【表１６０】
【０２４１】
【表１６１】
【０２４２】
【表１６２】
表６：非コードＨＩＶ−ＯＲＦ ＝ ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦ、ＶＰＲ、ＴＡＴ、ＲＥＶ、ＶＰＵ、ＥＮＶおよびＮＥＦ（表６中のＯＲＦ番号１、１４、１６、４９、５５、５９、６０、６２、６３および８７）以外はすべてのＯＲＦ
【０２４３】
ＨＩＶの選択したＯＲＦ：表６中のＯＲＦ番号２、３、６、９、１１、１２、１３、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４３、４４、４６、４８、５０、５６、５７、５８、６４、６７、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、８９、９０および９１。
【０２４４】
実施例３．ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
本実施例では、実施例１でＨＣＶエピトープについて記載したのと同様にしてＨＰＶの優れた免疫特性を備えた可能なｎｃＯＲＦエピトープを同定する。その結果を以下の表７に示す。
【０２４５】
【表１６３】
【０２４６】
【表１６４】
【０２４７】
【表１６５】
【０２４８】
【表１６６】
【０２４９】
【表１６７】
【０２５０】
【表１６８】
【０２５１】
【表１６９】
【０２５２】
【表１７０】
【０２５３】
【表１７１】
【０２５４】
【表１７２】
【０２５５】
【表１７３】
【０２５６】
【表１７４】
【０２５７】
【表１７５】
【０２５８】
【表１７６】
【０２５９】
【表１７７】
【０２６０】
【表１７８】
【０２６１】
【表１７９】
【０２６２】
【表１８０】
【０２６３】
【表１８１】
【０２６４】
【表１８２】
【０２６５】
【表１８３】
【０２６６】
【表１８４】
【０２６７】
【表１８５】
【０２６８】
【表１８６】
【０２６９】
【表１８７】
【０２７０】
【表１８８】
【０２７１】
【表１８９】
【０２７２】
【表１９０】
【０２７３】
【表１９１】
【０２７４】
【表１９２】
【０２７５】
【表１９３】
【０２７６】
【表１９４】
【０２７７】
【表１９５】
【０２７８】
【表１９６】
【０２７９】
【表１９７】
【０２８０】
【表１９８】
表７
【０２８１】
実施例４．インフルエンザ
ＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３とともにインフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドを用いたマウスのワクチン接種。ワクチン接種の７日後に特異的なＴ細胞応答を測定し、その後、被験動物を致死量のマウス適合インフルエンザＡウイルス（×３１）で攻撃する。生存を１５日間モニターする。
【０２８２】
材料
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan-Winkelmann、ドイツ）
ペプチド：ｐ８２（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）：ＥＢＶ；ＨＬＡ−Ａ＊０２０１；アミノ酸開始２８０からの対照ペプチド
ｐ１５７４（ＩＡＳＮＥＮＭＥＴＭ）：インフルエンザ核タンパク質、アミノ酸開始３６５からの対照ペプチド
ｐ１５６９（ＴＭＬＹＮＫＭＥＦ）：セグメント１、フレーム１、ＯＲＦ１、アミノ酸開始５６９からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
ｐ１６００（ＳＳＩＡＡＱＤＡＬ）：セグメント３、フレーム６、ＯＲＦ２、アミノ酸開始８３からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
ｐ１６６４（ＶＴＩＬＮＬＡＬＬ）：セグメント４、フレーム５、ＯＲＦ６、アミノ酸開始９からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
投与量：１００μｇ／ペプチド／マウス。
【０２８３】
ｏ−ｄ（ＩＣ）１３（＝ＯＤＮ１ａ）：ＯＤＮ ５’ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣ３’をPurimex Nucleic Acids Technology、ゲッチンゲンにより合成した。
投与量：５ナノモル／マウス。
【０２８４】
ＫＬＫ：ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ−ＣＯＯＨをMPS（Multiple Peptide System、米国）により合成した。
投与量：１２７ナノモル／マウス。
調合：２７０ｍＭソルビトール／１０ｍＭ Hepes
【０２８５】
インフルエンザＡウイルス：×３１、マウス適合インフルエンザＡウイルス、Ａ／Ｐｒ／８／３４（セグメント１、２、３、５、７、８）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（セグメント４、６）からの組換え（rec.）ウイルス
【０２８６】
実験条件（１５匹のマウス／群）
１．ｐ１５７４ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
２．ｐ１５６９ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
３．ｐ１６００ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
４．ｐ１６６４ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
５．ｐ１６００ ＋ ｐ１５６９ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
【０２８７】
第０日目にマウスの両後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（５０μｌ／足）を皮下注射した。第７日目に、各実験群についてペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生細胞の数を計数するために５匹のマウスからの分離していない脾細胞を９６ウエルＥＬＩｓｐｏｔプレートで刺激した。残りの１０匹のマウスはマウス適合×３１インフルエンザＡウイルス（５＊１０Ｅ５ ｐｆｕ）で攻撃した。生存を１５日間モニターした。
【０２８８】
結果（ＥＬＩｓｐｏｔ；図５ａ）
１群および３群（ペプチドｐ１５７４およびｐ１６００）の脾細胞は、各ペプチドで再刺激した後に特異的なスポットを示さない。２群および４群（ｐ１５６９およびｐ１６６４）は再刺激後にＩＦＮ−γを特異的に放出する。５群は２つの個々のペプチド（混合物としてではなく、ｐ１６００およびｐ１５６９）でワクチン接種した。両ペプチドの混合物かまたはｐ１５６９のいずれかで再刺激すると特異的なサイトカイン放出が検出される。対照的に、ｐ１６００単独で再刺激するとＩＦＮ−γスポットは検出できない。これは３群（ｐ１６００単独）と一致するものである。
【０２８９】
結果（攻撃；図５ｂ）
図５ｂは、致死量のマウス適合インフルエンザＡウイルス×３１で攻撃したマウスの生存率を示す。１群（ｐ１５７４、Ｈ２−Ｄｂについて報告された防御ペプチド）は攻撃した全マウスの３０％を防御する。ペプチドｐ１５６９は全く防御を与えない。対照的に、ペプチドｐ１６００およびｐ１６６４は、それぞれ攻撃した動物の５０％および６２％を防御する。動物を２つの異なるペプチドでワクチン接種すると（５群、ペプチドｐ１６００およびｐ１６６４）、動物の７０％が防御される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、
メチオニンアミノ酸残基から開始され、
抗原決定基を含み、かつ
７を超えるアミノ酸残基を含む
ことを特徴とするポリペプチド、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項２】
該病原性ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウイルス（ＨＦＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、エボラウイルス、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＳＩＶ、パルボウイルス、パピローマウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶ）、麻疹ウイルスおよび発癌ウイルスよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項３】
少なくとも１の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項４】
Ａ０２０１、Ａ１、Ａ２４、Ａ３、Ａ３１、Ｂ３５０１、Ｂ４４０３、Ｂ７、Ｂ８、とりわけＡ０２０１、またはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項５】
少なくとも１のＴヘルパー細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項６】
ＤＰ、ＤＱ、ＤＲまたはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対するＴヘルパー細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項７】
表２ａ）〜２ｎ）（配列番号１〜８２２）に列挙した群から選ばれるポリペプチドまたは７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項８】
表４ａ）〜４ｎ）に列挙した群から選ばれた断片、好ましくは５０またはそれ以上のスコアを有する断片、さらに好ましくは２００を超えるスコアを有する断片、とりわけ５００を超えるスコアを有する断片を含むかまたは該断片からなるポリペプチド。
【請求項９】
表６に列挙され７を超えるアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号８２３〜８７４）または７を超えるアミノ酸残基を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項１０】
担体、とりわけ免疫修飾物質にコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項１ないし９のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１１】
ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択される免疫修飾物質にコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１２】
少なくとも１のＴ細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１３】
該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレームによってコードされることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１４】
表４ａ、４ｃ、４ｅ、４ｇ、４ｉ、４ｋおよび４ｍに列挙され、５０またはそれ以上のスコア、より好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有するペプチドの群から選択される少なくとも１のペプチドを含むことを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１５】
治療剤として使用することを特徴とする、請求項１ないし１４のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１６】
Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸からなるテールを含み、該アミノ酸がＦ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、ＷまたはＣから選ばれることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１７】
Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸からなるテールを含み、該アミノ酸がＥまたはＤから選ばれることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１８】
５０またはそれ以上のスコア、さらに好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有し、表７に列挙したペプチドの群から選ばれるペプチドを含むことを特徴とする、請求項１ないし１７のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれかに記載の１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を含む医薬組成物。
【請求項２０】
ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から好ましくは選択される免疫修飾物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
病原性ウイルスの構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片、とりわけ抗原決定基を含む構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片をさらに含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１ないし１８のいずれかに記載の１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を単位投与当たり１ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０μｇ〜１ｍｇ含むことを特徴とする、請求項１９ないし２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ワクチンとして調合することを特徴とする、請求項１９ないし２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
さらなる活性成分、とりわけ免疫強化サイトカイン、抗炎症物質、抗菌物質またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１９ないし２３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンよりなる群から選ばれたポリカチオン性ポリマー、または抗菌ペプチド、とりわけカテリシジン由来の抗菌ペプチド、または成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンをさらに含むことを特徴とする、請求項１９ないし２４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝物質、安定化剤またはそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項１９ないし２５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該病原性ウイルスの感染の治療または予防用医薬を製造するための請求項１ないし１８のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片の使用。
【請求項１】
病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、
メチオニンアミノ酸残基から開始され、
抗原決定基を含み、かつ
７を超えるアミノ酸残基を含む
ことを特徴とするポリペプチド、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項２】
該病原性ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウイルス（ＨＦＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、エボラウイルス、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＳＩＶ、パルボウイルス、パピローマウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶ）、麻疹ウイルスおよび発癌ウイルスよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項３】
少なくとも１の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項４】
Ａ０２０１、Ａ１、Ａ２４、Ａ３、Ａ３１、Ｂ３５０１、Ｂ４４０３、Ｂ７、Ｂ８、とりわけＡ０２０１、またはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項５】
少なくとも１のＴヘルパー細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項６】
ＤＰ、ＤＱ、ＤＲまたはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対するＴヘルパー細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項７】
表２ａ）〜２ｎ）（配列番号１〜８２２）に列挙した群から選ばれるポリペプチドまたは７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項８】
表４ａ）〜４ｎ）に列挙した群から選ばれた断片、好ましくは５０またはそれ以上のスコアを有する断片、さらに好ましくは２００を超えるスコアを有する断片、とりわけ５００を超えるスコアを有する断片を含むかまたは該断片からなるポリペプチド。
【請求項９】
表６に列挙され７を超えるアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号８２３〜８７４）または７を超えるアミノ酸残基を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項１０】
担体、とりわけ免疫修飾物質にコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項１ないし９のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１１】
ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択される免疫修飾物質にコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１２】
少なくとも１のＴ細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１３】
該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレームによってコードされることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１４】
表４ａ、４ｃ、４ｅ、４ｇ、４ｉ、４ｋおよび４ｍに列挙され、５０またはそれ以上のスコア、より好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有するペプチドの群から選択される少なくとも１のペプチドを含むことを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１５】
治療剤として使用することを特徴とする、請求項１ないし１４のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１６】
Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸からなるテールを含み、該アミノ酸がＦ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、ＷまたはＣから選ばれることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１７】
Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸からなるテールを含み、該アミノ酸がＥまたはＤから選ばれることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１８】
５０またはそれ以上のスコア、さらに好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有し、表７に列挙したペプチドの群から選ばれるペプチドを含むことを特徴とする、請求項１ないし１７のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれかに記載の１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を含む医薬組成物。
【請求項２０】
ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から好ましくは選択される免疫修飾物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
病原性ウイルスの構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片、とりわけ抗原決定基を含む構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片をさらに含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１ないし１８のいずれかに記載の１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を単位投与当たり１ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０μｇ〜１ｍｇ含むことを特徴とする、請求項１９ないし２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ワクチンとして調合することを特徴とする、請求項１９ないし２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
さらなる活性成分、とりわけ免疫強化サイトカイン、抗炎症物質、抗菌物質またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１９ないし２３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンよりなる群から選ばれたポリカチオン性ポリマー、または抗菌ペプチド、とりわけカテリシジン由来の抗菌ペプチド、または成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンをさらに含むことを特徴とする、請求項１９ないし２４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝物質、安定化剤またはそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項１９ないし２５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該病原性ウイルスの感染の治療または予防用医薬を製造するための請求項１ないし１８のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【公開番号】特開２００９−２９８８２１（Ｐ２００９−２９８８２１Ａ）
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２７６２７（Ｐ２００９−２２７６２７）
【出願日】平成２１年９月３０日（２００９．９．３０）
【分割の表示】特願２００４−５２３７７８（Ｐ２００４−５２３７７８）の分割
【原出願日】平成１５年７月２４日（２００３．７．２４）
【出願人】（５０２２７０７１８）インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト (26)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＲＣＥＬＬ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月３０日（２００９．９．３０）
【分割の表示】特願２００４−５２３７７８（Ｐ２００４−５２３７７８）の分割
【原出願日】平成１５年７月２４日（２００３．７．２４）
【出願人】（５０２２７０７１８）インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト (26)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＲＣＥＬＬ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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