癌開始細胞のミトコンドリア活性阻害剤及びその使用
本発明は、腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかに有用な化合物に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に関する。本発明は、更に、本発明の阻害剤を含有する医薬組成物、及び本発明の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかにおいて有用な化合物に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に関する。本発明は更に、本発明の阻害剤を含有する医薬組成物及び本発明の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
グリオーマは成人における脳腫瘍の中で依然、最も頻度の高いものである。グリオーマの悪性型である、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）とも呼ばれるグレードＩＶは治療が困難であることで悪名高い。多形性膠芽腫は、手術、放射線治療、及び化学療法を含む現在の治療法の事実上全てにおいて多くの場合、再発する。生存率は、例えば、化学療法を放射線治療と組み合わせた場合であっても平均で１４．６ヶ月と極めて低い。環境危険因子は特定されておらず、これらの脳腫瘍の発病及び進行段階に関与する生物学的機構については、ほとんど解明されていない。
【０００３】
１９３０年にオットー・ワールブルクは、癌が、（１）呼吸が不可逆的に障害され、更に（２）回復不能な呼吸の損失が解糖系に置き換わる、という２つの連続した段階の後、非腫瘍性細胞が嫌気的代謝を獲得する場合に生じることを提唱した。この理論によれば、癌細胞の大半は、好気的条件下でグルコースから乳酸を生成することによって選択的にエネルギーを生産しているものと考えられる。これは、「好気的解糖」と一般に名付けられている現象であり、ワールブルク効果と呼ばれる。したがって、この好気的解糖代謝経路を標的とした癌の治療法を開発することは、活動的呼吸及びミトコンドリアによるエネルギー生産へと代謝プロセスを再構成することを可能とするものであり、この１０年間、注目を集めてきた。
【０００４】
幾つかの文献において、グリオーマ細胞のミトコンドリアを癌の化学療法の潜在的な標的とすることが示唆されている（非特許文献１及び２）。これらの文献では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤、ひいてはグリオーマ細胞（癌細胞）に対する潜在的な化学療法としてクロミプラミン又は一般的には三環系抗うつ薬を使用する、更なる放射線治療又は手術を伴わない治療法について開示している。この阻害剤は、ミトコンドリア経路の活性化、即ちシトクロムＣの放出及びカスパーゼ３の活性化によって媒介されるアポトーシスを誘導する。この種の治療法は、グリオーマ細胞（癌細胞）が正常細胞とは異なる代謝を有するために可能である。
【０００５】
特許文献１（グリフィス大学）もまた、幾つかの抗癌性化合物及び癌の治療又は予防法について開示している。詳細には、癌細胞のミトコンドリア呼吸鎖の複合体ＩＩ（コハク酸−ユビキノン酸化還元酵素）と選択的に相互作用し、活性酸素種を生成してこれらの細胞のアポトーシスを誘導するビタミンＥのプロオキシダント型などのプロオキシダント抗癌性化合物について開示されている。
【０００６】
しかしながら、この治療方法は、全ての癌細胞（例えばグリオーマ細胞）が同様の生物学的性質及び代謝を有するという仮定に基づいたものであり、残念ながらグリオーマの治療に大きな進展を与えるものではなかった。
【０００７】
グリオーマの正確な細胞起源については依然、解明されていないが、癌幹細胞（ＣＳＣ）と通常呼ばれる、幹細胞の性質を有する一部の癌細胞のみが真の腫瘍形成能を有し、グリオーマにおける癌開始細胞の独立した細胞巣を構成しているものと提唱されている。最近になって、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌、卵巣癌、及び脳腫瘍などの多くのヒトの癌において幹様細胞（ＣＳ）が特定されたことにより、癌は、成人の幹細胞／始原細胞における体細胞突然変異によって生じうるという仮説が再び注目を集めることとなった。
【０００８】
グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）として知られる脳腫瘍の癌開始細胞は、最初にＣＤ１３３＋細胞として同定されたが、最近の研究によりこのマーカーの特異性を比較的欠いていることが示されている。これらの細胞は、腫瘍形成能が異なる異種細胞の集団であり、一部の腫瘍細胞は、高い腫瘍開始能及び増殖能を有している。グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）は、グリオーマの発生及び再発を引き起こす。幹細胞の性質を有するグリオーマ開始細胞の役割については未だに深く研究されていない。これらの細胞は、単一細胞レベルでの自己更新能、インビトロでのアストログリア、神経細胞、及びオリゴデンドログリアへの分化によって示される多能性、並びにインビボでの腫瘍形成能といった特徴的な幹細胞の性質を示す。他のヒトの癌と同様、グリオーマは、幹細胞の性質を有する腫瘍開始及び増殖細胞（癌幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれる）をその頂点として腫瘍の増殖が調節されると考えられる細胞階層を有している。この癌幹様細胞の少数集団であるＧＩＣは、腫瘍細胞（グリオーマ）の約５％を占めるのみに過ぎず、腫瘍細胞の増加、再発、及び転移の要因となっているものと考えられ、増殖、進行、ひいては治療に対する反応といった腫瘍の生物学的挙動を決定する。
【０００９】
グリオーマ開始細胞を標的とすることは、その希少性、培養における不安定性、及び安定的なトレーサー物質がないことによって困難である。これまでのところ、同所性異種移植及び／又は形質転換マウスモデルのいずれにおいてもグリオーマの増殖の完全な根絶、又は再発の防止効果を示したグリオーマ開始細胞に対する有効な治療法は、存在していない。グリオーマ由来の腫瘍開始細胞は、従来の放射線治療に対して耐性を示すことが示されている（Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。例えば、グリオーマ開始細胞は、テモゾロミドなどの化学療法薬に対して耐性を示すことが知られている。これらのデータは、グリオーマの再発が避けられないことを説明しているものと考えられ、この疾患における従来の治療法に対する耐性を克服するための新たな標的としてグリオーマ開始細胞を定義しうるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／０３１１７１号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ３２８（２）：６２３−６３２
【非特許文献２】Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｎｇｌａｎｄ， １８（３）：２２６−２３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
さしあたって現在のところ、グリオーマの再発に対する有効な治療法は、存在していない。グリオーマ開始細胞を特に対象とした有効な治療法を見出すことが求められている。しかしながら、グリオーマ開始細胞に対する有効な分子を特定し、グリオーマ治療における大きな改善策を得るのに先立って、グリオーマ開始細胞の細胞及び分子的機構をより一層、深く理解することが不可欠である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、本出願人らは、グリオーマ開始細胞がグリオーマなどの他の癌細胞とは異なる代謝を有していることを証明した。
【００１４】
したがって、本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者において、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤であって、以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすことにより前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤がＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害するような阻害剤を提供する。
【００１５】
更に、本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための医薬組成物であって、本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の少なくとも１種類の阻害剤、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明の別の目的は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法であって、電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量を投与することを含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、を満たすことにより、
前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤がＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害するような方法である。
【００１７】
更に本発明は、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法であって、腫瘍細胞試料から単離されたＦＬ１＋細胞及び正常な脳細胞を、スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすようなスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
本発明には更に、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たし、更に、グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の治療に有用であり、初代ＣＩＣ培養、原発性接着性グリオーマ細胞、正常細胞、並びに、ロテノン及びアンチマイシンＡからなる群から選択されるミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）又は複合体（ＩＩＩ）の活性の少なくとも１種類の標準的な阻害剤を含むようなキットが包含される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、哺乳動物細胞における嫌気的及び好気的経路を示した模式図である（Ｌｅｍｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ｖｏｌ．３ （２）， ｅ１２５０より改変）。
【図２】図２は、癌幹細胞におけるミトコンドリア活性を示すパラメータを示した図である。Ａ：ＦＬ１＋（白地に黒の破線）及びＦＬ１０細胞集団（白）におけるＭｉｔｏ＋細胞の比率（Ｍ７５−１３色素の取り込み後にＦＬ３陽性細胞の数を定量することにより求めた）、並びに、ＦＡＣＳによりＦＬ１−Ｈ及びＦＬ３−Ｈチャネルにおいて測定されたＦＬ１＋細胞のＦＬ１自家蛍光のレベル（黒）。
【図３Ａ】図３Ａは、ＦＬ１０、初代グリオーマ、及び正常な脳細胞と比較して低下したＦＬ１＋細胞の解糖活性を示した図であり、ＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞の代謝産物の濃度を示す（ＬＡＣ：乳酸、ＰＹＲ：ピルビン酸、ＧＬＵＣ：グルコース）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、位相差イメージングによるＦＬ１＋細胞の形態を示す（非処理（ＮＴ）；スケールバー：１５０μＭ）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＦＬ１０細胞の比率に対する乳酸（ＬＡＣ）添加の影響を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、精製されたＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞における活性乳酸デヒドロゲナーゼの濃度を示す（ＬＤは、ＵＩ／Ｌで表されている）。
【図４Ａ】図４Ａは、溶媒コントロールで処理した場合の試料と比較した、上記の薬剤で処理した試料中の死んだＦＬ１＋細胞の比率の比に基づくＦＬ１＋細胞に対するＤＣＡ処理（酸化的経路の活性化因子）の影響を示した図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、溶媒コントロールで処理した場合の試料と比較した、上記の薬剤で処理した試料中の死んだＦＬ１＋細胞の比率の比に基づくＦＬ１＋細胞に対するオキサミン酸処理（細胞質の乳酸デヒドロゲナーゼ３〜５（ＬＤＨ３〜５）の阻害剤）の影響を示した図である。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例２で述べられる抗癌幹細胞物質を試験するのに用いるプロトコールであり、処理及び回復期間の実験手順を示す。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣＩＣを有効な抗ＣＳＣ剤（黒い太線）又は効果のないＣＳＣ剤（黒い破線）で処理した後の模式的な生存反応曲線を示す。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ａ１】図６Ａ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、２５Ｇｙのγ線を照射したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ａ２】図６Ａ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、２５Ｇｙのγ線を照射したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｂ１】図６Ｂ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、テモゾロミド２５μＭ（ＴＭＺ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｃ１】図６Ｃ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、ロテノン５μＭ（Ｒｏｔ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｃ２】図６Ｃ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、ロテノン５μＭ（Ｒｏｔ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｄ１】図６Ｄ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、アンチマイシンＡ ５μＭ（ＡＡ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｄ２】図６Ｄ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、アンチマイシンＡ ５μＭ（ＡＡ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｅ１】図６Ｅ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、オリゴマイシンＡ／Ｂ ５μＭ（ＯｌｉｇｏＡ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｅ２】図６Ｅ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、オリゴマイシンＡ／Ｂ ５μＭ（ＯｌｉｇｏＡ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｆ１】図６Ｆ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、クロミプラミンまたの名をアナフラニール（１０μＭ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｆ２】図６Ｆ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、クロミプラミンまたの名をアナフラニール（１０μＭ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図７】図７は、各種の阻害剤で処理した細胞のインビボの腫瘍形成性を示した図である。グラフは、移植に先立ってインビトロで１０日間、各種の分子で処理した初代ＧＢＭ−２細胞を注射した後の無症状のマウスの全数の比率を示す。コントロールマウスは、移植４週後に症状を呈したため屠殺した。組織学的分析により大きな腫瘍の存在が判明した。ＡＡ、ロテノン又はアナフラニールで前処理した細胞を移植したマウスは、症状を呈することなく生存した。移植１７週後に実験を停止した。組織学的分析によって視認される腫瘍は、認められなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施又は試験においては、本明細書で述べるものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができるが、適当な方法及び材料については下記に述べる。本明細書において触れる刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、いずれもその全容を援用するものである。本明細書において述べられる刊行物及び出願は、本願の出願日に先立つそれらの開示のみを目的として与えられるものである。本明細書の一切の記載内容は、先行する発明によって本発明がこうした刊行物に先行する資格を有さないことを容認するものとして解釈されるべきではない。更に、材料、方法、及び実施例は、あくまで説明を目的としたものであって、限定を目的としたものではない。
【００２１】
記載に矛盾が生じた場合には、定義を含めた本明細書が優先するものとする。特に断らないかぎり、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本明細書の主題が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものである。本明細書において使用する以下の定義は、本発明の理解を助けるために与えられるものである。
【００２２】
「含む」なる用語は、包含の意味、即ち、１以上の特徴又は要素が存在することを許容する意味で一般的に用いられる。
【００２３】
明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに示されないかぎりは複数の対象物を含むものである。
【００２４】
本明細書で使用するところの「被験者」又は「患者」なる用語は、当該技術分野では、広く認識されたものであり、本明細書においては、イヌ、ネコ、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、及び最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を指して互換可能に使用される。実施形態によっては、患者は、治療を要する患者、又は癌、好ましくはグリオーマなどの疾病又は疾患を有する患者である。しかしながら、患者は、正常な患者、又は例えば腫瘍グリオーマのバルクを以前除去するなどの治療を既に行った患者であってもよい。この用語は、特定の年齢又は性別を意味するものではない。したがって、成人及び新生児患者を男性、女性を問わずに網羅するものである。
【００２５】
グリオーマ開始細胞を呈する癌の治療において有用な阻害剤などの薬剤の同定とは、癌開始細胞（ＣＩＣ）巣の全体を同定、単離、及び特性評価するうえで確実な選択法を使用することを意味する。正常な幹細胞の生物学的性質（Ｂｕｒｄｓａｌｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， ２１， １４５−１５２）から一般的に推定された任意のマーカー（幹細胞性の指標としてのＣＤ１３３など）によって予め決定されたグリオーマ細胞株などの癌細胞株を選択的に使用する方法は、偏向したものであることが知られている。
【００２６】
したがって、本出願人らは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられる出願人らにより最近開発された手法を用いて自己更新性及び腫瘍開始性を示す細胞の亜集団を単離及び濃縮した。この方法は、ヒト試料に由来する初代細胞培養をその基礎とし、腫瘍細胞の単純かつ安定した表現型特性に依存したものであり、ＣＤ１３３などのあらゆる細胞表面マーカーと無関係に非腫瘍形成性グリオーマ細胞（この方法では、ＦＬ１０細胞と呼ばれる）からの癌開始細胞（ＣＩＣ）（ＦＬ１＋細胞と呼ばれる）の速やかな同定及び単離を可能とするものである。
【００２７】
本出願人らは、グリオーマ開始細胞（より詳細には、本明細書で使用するところのＦＬ１＋細胞集団）などの癌開始細胞（ＣＩＣ）が、好気的経路（ＴＣＡ回路／酸化的リン酸化−電子伝達系）によってエネルギーを生産し、分裂、生存することを期せずして見出した。本出願人らは、更に、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）が好気的な解糖系（ワールブルグ効果）を選択的に用いる腫瘍バルクに由来する他のグリオーマ細胞（癌細胞）とは異なる代謝を有することも期せずして見出した。実際、本出願人らは、ＦＬ１＋細胞集団（ＣＩＣ）がＮＡＤＨ、活性ミトコンドリア、及び活性ＬＤについて濃縮されているという、興味深くかつ予想外の知見を得た。更にＦＬ１＋細胞は、ＦＬ１０細胞と比較して乳酸の濃度が低く、このことは、ＦＬ１＋細胞がＡＴＰを生産するうえで好気的ミトコンドリア経路を選択的に使用している可能性を示唆するものである。
【００２８】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号において開示される方法は、
（ａ）腫瘍細胞の試料を与える工程と、
（ｂ）与えられた細胞を必要に応じて培地中で培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）又は（ｂ）で与えられた細胞から、蛍光活性化細胞選別によって４８８ｎｍ又は約４８８ｍｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて検出される自家蛍光発光を与える細胞（ＦＬ１＋細胞）をサブ試料中に単離する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において蛍光性を示さず、かつＦＬ３及びＦＬ４チャネルの少なくともいずれかにおいて検出される蛍光においてわずかな正方向へのシフトを示す細胞（ＦＬ１０細胞）を蛍光活性化細胞選別によって別のサブ試料中に単離する工程と、
（ｅ）工程（ｃ）及び（ｄ）において得られた単離された細胞のサブ試料のそれぞれから死細胞を除外する工程と、
（ｆ）工程（ｃ）で得られた細胞のサブ試料を工程（ｅ）における処理後にプールする工程と、
（ｇ）工程（ｄ）で得られた細胞のサブ試料を工程（ｅ）における処理後にプールする工程と、を含む。
【００２９】
ＦＬ１＋グリオーマ細胞集団とＦＬ１０グリオーマ細胞集団との間のインビトロ及びインビボでの表現型及び挙動における相違は、ＦＬ１＋細胞は、幹細胞性に関連した遺伝子に富み、多能性を有し、ＦＬ１０細胞を生成可能であり、更に長期にわたる自己更新能の維持の要因となっていることを証明した更なる特性評価によって支持されている。ＦＬ１０由来培養ではＦＬ１＋細胞は、一切生成しないことから、このことは、ＦＬ１０細胞がＦＬ１＋細胞集団から誘導され、数代にわたって生存可能であるが、ＦＬ１＋からＦＬ１０状態に一旦切り替わると自家蛍光性を再び獲得することはできないことの更なる証拠を与えるものである。したがって、この方法及びこの単離された細胞集団は、グリオーマ開始細胞を呈する癌の治療において有用となりうる阻害剤などの薬剤を試験するための確実な方法を与えるものである。
【００３０】
本出願人らが設計した抗ＧＩＣ薬剤をスクリーニングするための特定の新規なインビトロ再発アッセイ（図５）を用い、本出願人らは、酸化的な細胞のエネルギー生産過程を標的とした阻害剤などの薬剤が、ＣＩＣを根絶するうえで確実で長期間持続する効果を示すことを見出した。したがって、ミトコンドリア複合体Ｉ又はＩＩＩにおいてＮＡＤＨが細胞のＡＴＰに変換されることを防止し、Ｈ２Ｏ２の生成を誘導する阻害剤は、グリオーマ開始細胞に対する新規かつ特異的な治療方法と考えられる。
【００３１】
ＧＩＣを同定するための上記に述べた安定的な技術を用い、本出願人らは、特異的かつ有効な抗ＧＩＣ薬剤を同定するための安定的かつ確実なスクリーニングツールを更に開発した。
【００３２】
本出願人らの上記に述べた技術、並びに特異的な抗ＣＳＣ薬剤（抗癌幹細胞薬剤）を試験及び評価するために設計された本出願人らのインビトロアッセイを利用することにより、本出願人らは、好気的経路によって生成されるエネルギーの生産を阻害することがＣＩＣ集団の全体を殺滅するうえで充分である（殺滅は、アポトーシスによってではなくＣＩＣを餓死させることによって行われる）ことを示した。ミトコンドリアの複合体Ｉ及びＩＩＩのレベルにおけるような電子伝達系を妨害する阻害剤は、インビトロ及びインビボで全てのグリオーマ開始細胞を殺滅する非常に優れた能力を示す。複合体Ｉ及びＩＩＩの阻害により活性酸素種（ＲＯＳ）及びフリーラジカルが大量に生成することから、ＣＩＣは、ＲＯＳが蓄積すること、又は解毒システムが飽和することによっても殺滅される可能性が高い。
【００３３】
癌細胞株及び幹細胞性の指標としてＣＤ１３３などの幹細胞株マーカーを選択的に使用する他の方法とは異なり、本出願人らの技術は、一切のマーカーの使用とは無関係にヒト試料から誘導される初代培養細胞及びＣＩＣの単純かつ偏向のない検出に依存したものである。したがって、本出願人らは、このような方法を利用してグリオーマの癌幹細胞を根絶するための潜在的な治療薬をスクリーニング及び評価するためのインビトロ再発アッセイを設計及び開発したものである。ＣＩＣ、原発性グリオーマ細胞、及び正常な脳細胞を、最大で２０日間、好ましくは１０日間又は２０日間にわたって阻害剤などの薬剤に曝露した（処理：Ｔ）後、阻害剤などの薬剤を加えない回復段階（回復：Ｒ）に移す。この場合の新規性は、任意の薬剤の有効性を試験するために用いられる幹細胞性の指標、及び、特異的な抗ＣＳＣ薬剤が同定される可能性にある。
【００３４】
基本的には、以下の条件を満たすものであればいかなる薬剤又は阻害剤も有効な抗ＣＳＣ薬剤であると考えられる。即ち、
１）ＧＩＣ（ＦＬ１＋細胞）の生存率が、前記薬剤又は阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣ（ＦＬ１＋細胞）の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、
３）正常な脳細胞の生存率が、前記薬剤又は阻害剤に曝露される間又は曝露後に維持可能且つ回復可能である。
【００３５】
好ましくは前記薬剤又は阻害剤は、電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤である。
【００３６】
本出願人らのインビトロ再発アッセイの概念の証明及び検証として、γ線照射、及びＧＢＭに対して現在使用されている主要な細胞毒性薬であるテモゾロミドの効果について試験を行った。ＦＢＳで培養したグリオーマ細胞と異なり、約４０％のＦＬ１＋細胞が２５Ｇｙの照射に対して耐性を示して生存し、したがって遺伝毒性ストレス後３０日以内に回復し、これにより、放射線は、ＧＩＣの亜集団をほとんど標的とせず、むしろ腫瘍バルクからの活発に分裂している細胞を標的とすることが確認された。グリオーマスフェア細胞（ｇｌｉｏｍａｓｐｈｅｒｅ ｃｅｌｌ）のＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態についてＨｅｇｉ ｅｔ ａｌ， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ２００５， ３５２ （１０） ９９７−１００３に述べられるように最初に試験が行われ、グリオーマスフェア細胞は、テモゾロミドに対する感受性を有することが予測されている。しかしながら、臨床的に使用される用量の５倍に当たる２５μＭのテモゾロミドにより最大で２０日間処理した後であっても、ＦＬ１＋細胞の３０％は依然生存しており、２０日間以内に回復可能であった（０．２＜Ｒ＜１）。
【００３７】
ＧＢＭは、表現型的及び分子的な観点から本質的に高度に異種性の腫瘍である。活性化又は抑制のされ方の異なるシグナル伝達経路のうち、約６０％のＧＢＭにおいて上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達カスケードが増幅／過剰発現され、約６５％のＧＢＭにおいてＰ１３Ｋ／ＡＫＴ／ＰＴＥＮシグナル伝達カスケードがＰＴＥＮの発現量の変化を示す。同様に、予後の不良及び放射線治療に対する耐性にはＰＴＥＮの消失を伴うようである。５μＭのエルロチニブによる長期の治療は、ＥＧＦＲの状態とは無関係に２／６のＧＢＭのみにおいて５０％よりも多くのＦＬ１＋細胞に細胞死を誘導し、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅がゲフィニチブ又はエルロチニブなどのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する反応性とは相関していないことが確認された。更に、全てのグリオーマスフェア培養が１０日間以内に治療から回復し、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を受容体のレベルで阻害することは有効ではないことが示唆された。
【００３８】
グリオーマなどの幾つかのヒトの腫瘍一般においてＮｏｔｃｈ、ＳＨＨ−Ｇｌｉ及びＷＮＴ、ｍＴＯＲなどの主要な発生経路が示唆されているが、ヒト癌幹細胞におけるこれらの役割を体系的に示した研究は希有である。より詳細には、シクロパミンを用いてＳＨＨ−Ｇｌｉの活性を阻害するか、又はγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴを用いてＮＯＴＣＨシグナル伝達経路の活性を阻害することにより、癌開始細胞集団の増殖及び自己更新性に潜在的に影響を及ぼすことによって腫瘍の増殖が低減される。同じではないが同様にして、テムシロリムスを用いたｍＴＯＲの阻害、又は５μＭのシクロパミン若しくは５μＭのＤＡＰＴを用いてＳＨＨ−Ｇｌｉ及びＮｏｔｃｈなどの発生経路を標的とすることはそれぞれ生存ＦＬ１＋細胞の数の減少を引き起こす。この場合もやはり、残留したＣＩＣが２０日間の治療後の後であっても認められ、ＣＩＣ集団が速やかに回復したことから、これらの薬剤は有効ではないものと考えられる。
【００３９】
活性ミトコンドリアの数、代謝産物の含量、及び嫌気的エネルギー生産経路の阻害剤の影響に基づけば、ＦＬ１＋細胞は、ＦＬ１０細胞と異なり、好気的経路を使用してエネルギーを選択的に生産する傾向にある。したがって、本出願人らは、ミトコンドリア活性を阻害する高い能力を有するいかなる薬剤もＣＩＣ内におけるエネルギー生産を阻害するはずであり、これによりＣＩＣが殺滅される可能性が高いという概念を提唱した。この概念を、本発明のインビトロ再発アッセイを用い、電子伝達系の阻害剤（レトノン、アンチマイシンＡ、アナフラニールなど）及びプロトンポンプの阻害剤（オリゴマイシンＡ／Ｂ）についてスクリーニングすることによって検証した。５μＭのレトノン又はアンチマイシンＡ又はアナフラニール（クロミプラミン）又はオリゴマイシンＡ／Ｂへの２０日間にわたる曝露により、全てのＦＬ１＋細胞が殺滅される。治療法の開発及び治療方法の設計に関し、本出願人らは、好気的経路を阻害する薬剤への曝露期間を短縮したところ、１０日間の曝露であってもＣＩＣの細胞巣の殺滅には充分であることを観察した。このような阻害剤のＣＩＣに対する特異性を試験するため、正常脳細胞及び原発性グリオーマ細胞（ＦＢＳ培養）を上記に述べたミトコンドリア薬剤に１０日間曝露した。正常脳細胞及び原発性グリオーマ細胞もやはりオリゴマイシンＡ／Ｂに感受性を有することが見出されたが、このことは、ミトコンドリアの複合体ＩＶの活性の阻害は正常な脳細胞の生存率に影響することから適切ではない可能性を示唆するものである。アンチマイシンＡ又はアナフラニールへの曝露、及び程度はより低いがロタニンへの曝露は、増殖性及び分裂性にわずかに影響するものの、正常脳細胞の生存を可能とし、したがって治療薬としてより良好な展望が開けている。興味深い点として、ＦＢＳ中で培養された原発性グリオーマ細胞は、こうした薬剤に対する耐性を示し、このことは腫瘍バルクからの細胞がＣＩＣとは異なる代謝を有しているという観察を更に裏付けるものである。
【００４０】
本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤であって、以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすことにより、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤がＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害するような阻害剤を提供する。
【００４１】
好ましくは前記腫瘍グリオーマの除去は、腫瘍グリオーマのバルクの区域切除である。
【００４２】
好ましくは、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）における前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ＩＣ２用量の最大で１０倍に相当する用量で投与される。最も好ましくは、前記ＩＣ２用量は、０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００４３】
前記グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍は、グリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、再発癌、及び転移性癌からなる群から好ましくは選択される。
【００４４】
「試料」なる用語は、例えば、ヒトグリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、及び上衣腫などの癌を罹患しているか、再発癌を有しているか、あるいは癌を罹患していることが疑われる患者（哺乳動物の患者、より詳細にはヒト患者など）からの組織又は体液試料などの、任意の供給源からの組織又は体液試料を含む。別の実施形態では、試料は、転移性癌を罹患しているか、又は例えばメラノーマ、乳癌、結腸癌、肺癌から脳への転移などの癌を罹患していることが疑われる患者（哺乳動物の患者、より詳細にはヒト患者など）からの組織又は体液試料などの、任意の供給源からの組織又は体液試料を含む。
【００４５】
「癌幹細胞試料」なる用語は、本発明に基づくＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞の混合物を含むグリオーマスフェア培養（実施例で述べるようにして培養したもの）、又は本発明に基づく方法によって細胞を単離した、２種類の単離ＦＬ１＋又はＦＬ１０細胞集団を含む試料から選択される試料を意味する。
【００４６】
「腫瘍細胞試料」なる用語は、腫瘍試料から新鮮に解離させた細胞試料、又は、例えば幹細胞培地及びこれに類する培地中で培養されたものなどのグリオーマスフェア培養、高血清培地及びこれに類する培地中で培養されたものなどの接着細胞培養、及び、分化培地及びこれに類する培地中で培養されたものなどの分化細胞培地などの、細胞を腫瘍試料から解離させた後に培養した細胞試料を含む。
【００４７】
本明細書で用いるところの「腫瘍」なる用語は、細胞の異常増殖によって形成された新生物又は充実性病変のことを指す。腫瘍は良性、前悪性、又は悪性でありうる。腫瘍は、中枢及び末梢神経系、脳への転移、肺転移、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌、結腸癌及び卵巣癌などと関連しうる。更に、腫瘍なる用語には、グリオーマ、神経鞘腫、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、メラノーマなどの腫瘍が含まれる。
【００４８】
「幹細胞培地及びこれに類する培地」なる用語には、新鮮に解離させた組織試料から誘導された癌幹細胞（グリオーマスフェアとも呼ばれる）を増殖させた培地が含まれる。例えば、神経幹細胞培地には、１／１０００のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、Ｂ２７（１／５０、ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））又はＢＩＴ９５００（２０％、ステムセルテクノロジーズ社（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））、ヒト組換えＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、及び塩基性ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））が含まれる。
【００４９】
「高血清培地及びこれに類する培地」なる用語には、新鮮に解離させた組織試料から誘導された接着性培養物を増殖させた培養（例えばＦＢＳ１０％、１／１０００のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）））が含まれる。
【００５０】
「分化培地及びこれに類する培地」なる用語には、癌幹細胞をその多能性を分析するために播種する培地が含まれる（例えば、３７℃で一晩、Ｈ２Ｏ中に１：１００で希釈したポリＬオルニチン及びラミニン（シグマ社（ｓｉｇｍａ））の混合物でコーティングしたプレート。細胞は、解離させ、１／１，０００のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、Ｂ２７（１／５０、ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））又はＢＩＴ９５００（２０％、ステムセルテクノロジーズ社（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）中に１０細胞／μＬの密度で播種した。）。
【００５１】
「ＦＬ１チャネル」なる用語は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．に述べられるような蛍光の縦方向の検出チャネルである。通常、４８８ｎｍの励起波長では、自家蛍光は、５２０ｎｍ又は約５２０ｎｍの波長のＦＬ１チャネルにおいて検出される。
【００５２】
「ＦＬ３チャネル」なる用語は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．に述べられるような蛍光の側方方向（４５℃）の検出チャネルである。通常、４８８ｎｍの励起波長では、蛍光は、６３０ｎｍよりも大きな波長のＦＬ３チャネルにおいて検出される。
【００５３】
「ＦＬ４チャネル」なる用語は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．に述べられるような蛍光の側方方向の検出チャネルである。通常、６３２ｎｍ又は約６３２ｎｍ、又は５４６ｎｍ又は約５４６ｎｍの励起波長では、蛍光は、６３０ｎｍよりも大きな波長のＦＬ４チャネルにおいて検出される。
【００５４】
「正常な脳細胞」なる用語は、正常な生物学的機能を有し、腫瘍などのいかなる疾病にも疾患にも罹患していない健康な脳細胞のことを指す。「正常な脳細胞の生存率が維持可能かつ回復可能である」なる用語は、正常な脳細胞がその正常な生物学的機能を維持し、本発明の阻害剤に曝露される間、及びその後に障害されないことを意味する。
【００５５】
「ＦＬ１＋細胞」若しくは「ＦＬ１−Ｈ細胞」又は「ＧＩＣ」若しくは「ＣＩＣ」なる用語は、本発明に基づく方法による蛍光活性化細胞選別により、特に特定の形態（高いＦＳＣ及び低い／中度のＳＳＣ）、及び細胞のサブ試料中へのレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて検出される自家蛍光発光を与える細胞を選択的に検出及び選別することによって選別される細胞のことを指す。このサブ試料では、ＦＬ１チャネルにおいて検出されるこうした自家蛍光発光を与える細胞の亜集団が、４８８ｎｍ（例えばアルゴンなどの青色レーザー光線）の波長での励起時に約５２０ｎｍにおいて検出される。より詳細には、ＦＬ１チャネルにおけるＦＬ１自家蛍光がダイクロイックミラーにより５３０ｎｍ±１５、より厳密にはダイクロイックミラーにより５１５ｎｍ±５で検出され、ＦＬ１自家蛍光発光のスペクトルの特異性が確認される。
【００５６】
「ＦＬ１０細胞」若しくは「非ＦＬ１−Ｈ細胞」又は「非自家蛍光細胞」なる用語は、本発明に基づく方法による蛍光活性化細胞選別により、特に特定の形態（低い／中度のＦＳＣ及び中度の／高いＳＳＣ）を与える細胞を選択的に検出及び選別することによって選別される細胞であり、ＦＬ１チャネルにおいて蛍光性を示さず、ＦＬ３又はＦＬ４チャネルにおいて検出される蛍光がわずかに正方向にシフトする細胞のことを指す。
【００５７】
「ＦＬ１−細胞」又は「原発性グリオーマ細胞」若しくは「ＦＢＳ培養グリオーマ細胞」なる用語は、１０％ＦＢＳ培地中で培養され、接着性を有し、本発明に基づく方法による蛍光活性化細胞選別によって選別されない細胞のことを指す。これらの細胞は、特定の形態（中度のＦＳＣ及び高いＳＳＣ）、高い細胞質／核比（＞１）を示し、ＦＬ３又はＦＬ４チャネルのいずれにおいてもＦＬ１チャネルの蛍光が検出されない細胞である。
【００５８】
「高いＦＳＣ」又は「高いＦＳＣ−Ｈ」又は「高いＦＳＣ−Ａ」なる用語は、前方散乱を意味し、粒子サイズ及び速度測定（細胞の直径が５μｍ〜７μｍ）に相当する。
【００５９】
「低い／中度のＦＳＣ」又は「低い／中度のＦＳＣ−Ｈ」又は「低い／中度のＦＳＣ−Ａ」なる用語は、前方のサイズ散乱を意味し、細胞の大きさ（細胞の直径＜５μｍ〜７μｍ）に相当する。
【００６０】
「中度の／高いＳＳＣ」又は「中度の／高いＳＳＣ−Ｈ」又は「中度の／高いＳＳＣ−Ａ」なる用語は、側方又は直交散乱を意味し、細胞の複雑度及び顆粒含有量（細胞質が多く、顆粒状）に相当する。
【００６１】
「低い／中度のＳＳＣ」又は「低い／中度のＳＳＣ−Ｈ」又は「低い／中度のＳＳＣ−Ａ」なる用語は、側方又は直交散乱を意味し、細胞の複雑度及び顆粒含有量（細胞核の周囲に非顆粒状の拘束された細胞質）に相当する。
【００６２】
通常、ＦＬ１＋又はＦＬ１−Ｈ細胞は、「高いＦＳＣ」又は「高いＦＳＣ−Ｈ」又は「高いＦＳＣ−Ａ」と、「低い／中度のＳＳＣ」又は「低い／中度のＳＳＣ−Ｈ」又は「低い／中度のＳＳＣ−Ａ」との組み合わせを有し、したがって１よりも大きい核／細胞質の直径比を有する。
【００６３】
通常、ＦＬ１０又は非ＦＬ１−Ｈ細胞は、「低い／中度のＦＳＣ」又は「低い／中度のＦＳＣ−Ｈ」又は「低い／中度のＦＳＣ−Ａ」と、「中度の／高いＳＳＣ」又は「中度の／高いＳＳＣ−Ｈ」又は「中度の／高いＳＳＣ−Ａ」との組み合わせを有し、したがって１よりも小さい核／細胞質の直径比を有する。
【００６４】
「幹細胞培地」なる用語は、幹細胞の培養に適した培地である。通常、幹細胞培地は、例えば分裂促進因子（塩基性ＦＧＦ−２、ＥＧＦ）、及び無添加培地（Ｂ２７又はＢＩＴ９５００）を含む。
【００６５】
「スフェア形成性」なる用語は、対称的又は非対称的に分裂してクローンを形成する単一の幹細胞の能力のことである。このクローンは、スフェアと呼ばれ、スフェアがグリオーマ腫瘍から誘導される場合には、より正確にグリオーマスフェアと呼ばれる。この能力は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるような自己更新アッセイとも呼ばれるクローンアッセイによって測定することができる。自己更新アッセイは、クローンを形成する単一の細胞の能力を測定するものであるが、全てのクローンがスフェアを形成するわけではない。幹細胞又は正常な発生過程にある初期の幹細胞又は特定の癌のタイプのみがこのようなスフェア形成能を示し、この特異性は、神経幹細胞及びグリオーマ幹細胞において存在している。
【００６６】
「多能性」なる用語は、複数の細胞型に分化する細胞の能力のことであり、例えば中枢神経系からの細胞では、多能性とはＧＦＡＰ（星状細胞）、ＮＥＳＴＩＮ（神経前駆細胞）、ＴＵＪ１（神経細胞）などの細胞に分化する能力のことを指す。
【００６７】
「回復段階」なる用語は、ＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞を処理後に幹細胞培地中に再び移すことである。
【００６８】
「再発」なる用語は、薬剤による治療後に癌幹細胞が生存し、その内在的性質（例えばＦＬ１チャネルにおける自家蛍光、スフェア形成能）、その分割能を維持し、更に場合により更なる性質（例えば、分化マーカーの発現によって測定される分化能、幹細胞性マーカーの発現によって測定される幹細胞性、及び、酸化還元比色アッセイ（ＭＴＳ）ＮＡＤ／ＮＡＤＰＨ＋酵素の活性及び比によって測定される代謝特性）を維持する能力のことを意味する。再発の測定は、本発明に基づくスクリーニングアッセイによって行われ、図５にまとめて示すように治療後のＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の存在及び比率の分析を行う。再発レベルは、回復期間において治療後に生存している癌幹細胞の比率、及び癌幹細胞の再発が観察されない回復期間の長さに基づいて評価される。
【００６９】
本明細書において使用するところの「有効量」なる用語は、対象とされる組織、システム、動物又はヒトにおいて生物学的又は医学的反応を引き起こす本発明に基づいた少なくとも１種類の化合物又はその医薬配合物の量のことを指す。一実施形態では、有効量は、治療される疾患又は状態の症状を緩和するための「治療上の有効量」である。本明細書においては、この用語は、疾患の進行を低減するうえで、特に再発プロセスを低減又は阻害するうえで（例えば再発の発生を予防、又は再発プロセスの頻度又は程度を低下させる）、及び／又は対象とする反応を生じ、引き起こすうえで充分な量の活性化合物を含む（即ち「阻害有効量」）。特定の実施形態では、本発明に基づく阻害剤、方法、及び使用は、腫瘍、腫瘍の増殖、再発及び転移の起点となるＦＬ１＋細胞集団を減少又は更には根絶することが可能である。
【００７０】
本発明に基づく治療の「有効性」なる用語は、本発明に基づく使用又は方法に応じた疾患の経過の変化に基づいて測定することができる。例えば、本発明に基づく治療の有効性は、以下の２つの基準に依存する。即ち、
− １０又は２０日後に生存ＦＬ１＋細胞の少なくとも５０％の低減によって測定されるＦＬ１＋細胞を殺滅する能力、
− 治療後、最小で２０日間までの生存ＦＬ１＋細胞の数によって測定される回復ＦＬ１＋細胞が存在しないこと（ｒ＜０．２）、である。
本発明に基づく治療の有効性は、患者の状態の改善、及び本発明に基づく治療の患者に対する正の影響によって測定することができる。
【００７１】
「癌幹細胞再発を阻害する能力」なる用語は、治療後、及びこの治療後の回復期間の観察後の癌幹細胞試料中の癌幹細胞の数を減少させることが可能な薬剤の性質のことを指す。好ましくは、癌幹細胞の再発を阻害する能力とは、癌幹細胞試料から癌幹細胞を死滅させ、回復期間の観察後にこれらの細胞の再発を防止する薬剤の能力のことである。
【００７２】
本明細書において互換可能に用いられる「抗腫瘍剤」又は「治療剤」又は「薬剤」なる用語には、例えば、腫瘍の増殖を低減又は阻止する、癌の再発を予防、低減又は阻止するといった、腫瘍の治療において有効な、腫瘍における治療活性を有しうる分子又は化合物が含まれる。これには、癌におけるその治療活性が知られる薬剤、又は癌における治療活性を有する可能性について研究されている薬剤が含まれる。「抗腫瘍剤」又は「治療剤」又は「薬剤」なる用語には、任意の分子（例えば化学的、生物学的）、又は任意の外因性／環境因子（例えば機械的因子、放射線）が更に含まれる。
【００７３】
本明細書において使用するところの「治療」及び「治療する」並びにこれに類する語は、所望の薬学的及び生理学的効果を得ることを一般的に意味する。効果は、癌（グリオーマ）などの疾患、その症状又は状態を予防又は部分的に予防するという意味において予防的なものであってもよく、かつ／又は疾患、状態、症状、又は疾患に帰する副作用の部分的又は完全な治癒という意味において治療的なものであってもよい。本明細書において使用するところの「治療」なる用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療法を網羅するものであり、（ａ）例えば手術（切除又は部分切除）、放射線治療、及び化学療法の少なくともいずれかのような治療を既に行っているか、あるいは既に疾患に罹患している可能性があるが疾患を有するとの診断は下されていない患者において癌（グリオーマ）などの疾患が発生することを予防し、（ｂ）癌（グリオーマ）などの疾患を阻害する、即ちその成長を阻止するか、あるいは疾患を緩和する、即ち疾患及びその症状又は状態の少なくともいずれかの退行を引き起こすことが含まれる。
【００７４】
本発明の文脈において使用される「阻害剤」なる用語は、生体分子の活性を完全又は部分的に阻害する分子として定義される。
【００７５】
「ミトコンドリア活性の阻害剤」なる用語は、酸化的な細胞のエネルギー生産プロセスの阻害剤、通常は、好気的な細胞代謝の阻害剤として定義される。酸化的な細胞のエネルギー生産プロセスの阻害剤には、細胞のトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路即ちクエン酸回路（炭水化物、脂肪及びタンパク質を二酸化炭素と水に化学的に変換して利用可能なエネルギーの形態とする）の阻害剤、又は細胞の酸化的（好気的）解糖系（細胞質中でのグルコースのピルビン酸への代謝）又は解糖系の基質（ピルビン酸）の酸化的リン酸化の阻害剤が含まれる。一般的に、ミトコンドリア活性の阻害剤は、電子伝達系又は酸化的リン酸化の阻害能を示すことにより、インビトロ及びインビボの再発アッセイにおいて活性酸素種（ＲＯＡ）の生成につながる薬剤である。
【００７６】
本明細書において使用するところの電子伝達系の活性の阻害剤は、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）又はその誘導体であってよい。ＤＰＩは、フラボタンパク質に強力に結合することから、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、ＮＡＤＰＨ−ユビキノン酸化還元酵素、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、及びＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０酸化還元酵素などの幾つかの重要な酵素の強力かつ特異的な阻害剤である。
【００７７】
好ましくは前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）及びその誘導体である。
【００７８】
更に好ましくは、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤である。
【００７９】
「ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）の活性の阻害剤」なる用語には、ミトコンドリアの複合体Ｉの活性を阻害する薬剤が含まれる。例えば、酸化的リン酸化複合体（Ｉ）の阻害剤には、公知の殺虫剤であるロテノン及びその誘導体などの、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの結合部位においてミトコンドリアの複合体Ｉに結合する薬剤（Ｈｏｇａｎ ＆ Ｓｉｎｇｅｒ， １９６７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２７（３）： ３５６−６０）が含まれる。ロテノン誘導体としては、アリールアジドアモルフィゲニン、アモルフィスピロノン、テフロシン、アモルフィゲニン、１２ａ−ヒドロキシアモルフィゲニン、１２ａ−ヒドロキシダルパノール］及び６’−Ｏ−Ｄ−グルコピラノシルダルパノールが挙げられる。
【００８０】
「ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（ＩＩＩ）の活性の阻害剤」には、ミトコンドリアの複合体（ＩＩＩ）の活性を阻害する薬剤が含まれる。例えば酸化的リン酸化複合体（ＩＩＩ）の阻害剤としては、公知の抗真菌剤であるアンチマイチンＡ及びその誘導体などの複合体ＩＩＩの触媒活性を阻害する薬剤がある。アンチマイシンＡの誘導体としては、ミクソチアゾール、スティグマテリンのトリデシル類似体（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ， ４９（３５）： ５１９２−５１９５）が挙げられる。酸化的リン酸化複合体（ＩＩＩ）の阻害剤の他の例としては、セロトニン／ノルアドレナリン二重再取り込み阻害剤であるクロミプラミン（アナフラニール（登録商標））又はその誘導体、並びにイミプラミン及びクロルプロマジンなどの類似体などの公知の抗うつ剤であるあらゆるジベンゼピン誘導体が含まれる。イミプラミン及びその塩酸塩については米国特許第２，５５４，７３６号に、及びそのパモ酸塩については米国特許第３，３２６，８９６号に開示されている。イミプラミン及びその塩は、経口投与で有効なジベンゾアゼピン三環系抗うつ剤である。酸化的リン酸化複合体（ＩＩＩ）の阻害剤の更なる例は、リコシャルコン（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ）Ａ、アスコクロリン及びストロビルリンＢである。
【００８１】
セロトニン／ノルアドレナリン二重再取り込み阻害剤（ＤＳＮＲＩ）は、セロトニン及びノルエピネルフリンの両方の再取り込みを阻害するものであり、ベンラファキシン（エフェキソール（登録商標）、ベンラファキシン代謝物質のＯ−デスメチルベンラファキシン、クロミプラミン（アナフラニール（登録商標））、クロルプラミン代謝物質のデスメチルクロミプラミン、デュロキセチン（サインバルタ（登録商標））、ミルナシプラン及びイミプラミン（トフラニール（登録商標）又はジャニミン（登録商標））がある。
【００８２】
それらの化学名、商品名、構造、治療及び薬理に関する情報、及び治療上の分類は、例えばＭｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ， ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９７６， Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９６， ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ２００４ などの文献に見ることができる。
【００８３】
本発明に基づけば一般的には、阻害剤は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化複合体（Ｉ）の活性又はミトコンドリアの酸化的リン酸化複合体（ＩＩＩ）の活性のいずれかを阻害する。
【００８４】
しかしながら、スティグマテリン、ミクソチアゾール、ピエリシジン又はこれらの誘導体及び類似体などの一部の阻害剤は、複合体（Ｉ）及び（ＩＩＩ）の両方のミトコンドリア酸化的リン酸化の活性を同時に阻害することができる。上記の二重阻害剤は、より強力な阻害剤、ひいてはより低い濃度しか必要としないより強力な抗ＧＩＣ剤となりうるものである。
【００８５】
表１は、放射線治療及び化学療法において、又は臨床試験において使用される典型的な薬剤、文献における参照、及びインビトロ再発アッセイにおける用量を示す。
【００８６】
表２〜３は、好気的／嫌気的経路を標的とした薬剤、文献における参照、及びインビトロ再発アッセイにおける用量を示す。
【００８７】
好ましくは、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ロテノン、アンチマイシンＡ、イミプラミン、クロミプラミン、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ストロビルリンｂ、リコシャルコンＡ、アスコクロリン、ピエリシジン、及び／又はこれらの組み合わせ、及び／又はこれらの誘導体、及び／又は薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される。
【００８８】
例えば、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の活性の阻害剤の前記組み合わせは、ロテノンをアンチマイチンＡと組み合わせるか、又はロテノンをクロミプラミンと組み合わせたものからなる。
【００８９】
最も好ましくは、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ピエリシジン及び／又はこれらの誘導体、及び／又はこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００９０】
「ミトコンドリアのＴＣＡ回路の活性の阻害剤」なる用語には、基質の存在、内因性及び／又は外因性の最終生成物によって通常決定される化合物が含まれる。ミトコンドリアのＴＣＡ回路の活性の阻害剤は例えば、ＮＡＤＨ及びＡＴＰ、クエン酸塩、アセチルＣｏＡがある。カルシウムは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、αケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、及び更にクエン酸シンターゼなどのＴＣＡの主要な酵素を阻害する。本発明に基づけば好ましくはミトコンドリアのＴＣＡ回路の活性は、ロテノン、アンチマイシンＡ、イミプラミン、クロミプラミン、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ストロビルリンｂ、リコシャルコンＡ、アスコクロリン、ピエリシジン、及び／又はこれらの組み合わせ、及び／又はこれらの誘導体、及び／又は薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択されるミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の阻害剤などの電子伝達系の阻害剤によって間接的に阻害することもできる。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【表２】
【００９３】
【表３】
【００９４】
更なる実施形態では、本発明は、相乗効果及び累積効果の少なくともいずれかを与える本発明の異なる阻害剤の組み合わせを提供する。例えば、レトノンとアンチマイシン又はレトノンとアナフラニールといったミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の阻害剤の組み合わせとすることによって、ＧＩＣ細胞巣の全体が根絶されるように治療の効果を最適化することができる。上記で観察したように、こうした阻害剤の組み合わせによって、ＧＩＣを殺滅するうえで相乗的又は累積的に作用しうる各阻害剤の個々の用量を低減させることが可能である。このような組み合わせ及び相乗効果の例が、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ， ２００７ ａｎｄ Ｓｔｅｃｃａ ｅｔ ａｌ， ２００７に示されている。
【００９５】
「ＲＯＳ生成剤」なる用語は、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）及びフリーラジカルの濃度の増大を誘導することが可能な薬剤のことである。一般的にこうした薬剤としては、シンナムアルデヒド、過酸化水素、アクチノマイシンＤ及びカンプトテシンが挙げられる。
【００９６】
本明細書で使用するところの「電子伝達系」（ＥＴＣ）とは、一群の介在する生化学反応によって、電子供与体（ＮＡＤＨなど）と電子受容体（Ｏ２など）との間の化学反応を、膜をはさんだＨ＋イオンの移動と共役させるものである。Ｈ＋イオンは膜を逆に通過する際に生物における主要なエネルギー中間体であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生産するために用いられる。例えば酸素を細胞呼吸の一部として用いる多くの真核細胞は、クレブス回路、脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化の生成物からＡＴＰを生産するミトコンドリアを含んでいる。ミトコンドリアの内膜では、ＮＡＤＨ及びコハク酸からの電子が電子伝達系を通って酸素に受け渡され、酸素は水に還元される。ミトコンドリアの内部で電子伝達系に関与している４種類の膜結合複合体が特定されている。各複合体は、内膜に埋め込まれた極めて複雑な膜貫通構造である。これら４種類の複合体は、複合体（Ｉ）（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素とも呼ばれる）、複合体（ＩＩ）（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、複合体（ＩＩＩ）（シトクロムｂｃ１複合体）、及び複合体（ＩＶ）（シトクロムｃオキシダーゼ）である。
【００９７】
電子伝達系は、酸素への早期の電子漏出が生じる主要な場でもあることから、スーパーオキシド生成の主要な場であり、酸化ストレスの駆動源である。
【００９８】
本発明において使用するところの「ＴＣＡ回路（トリカルボン酸回路）」は、クエン酸回路としても知られ、酵素によって触媒される一連の化学反応であり、細胞呼吸の一部として酸素を用いる全ての生きた細胞において極めて重要である。真核細胞では、ＴＣＡ回路はミトコンドリアの基質に存在している。
【００９９】
「腫瘍グリオーマのバルクの除去」なる用語は、患者からの腫瘍グリオーマのバルクのあらゆる除去、剥離、又は切除のことを指す。除去は化学的、放射線又は外科的なものでありうる。好ましくはこの除去は、剥離又は切除などの外科的なものである。切除は、患者から臓器又は分泌腺の一部を除去する手術である「区域切除」（又は区域切除術）であってよい。区域切除は腫瘍及びその周囲の正常組織を除去するために用いられる場合もある。
【０１００】
「ＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害する」なる用語は、栄養素からの生化学的エネルギーをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換するためのグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）内で起きる代謝反応及びプロセスを阻害することを指す。通常、エネルギーの生産を阻害することは細胞が飢餓状態にあることを意味する。
【０１０１】
「再発癌」又は「再発腫瘍」なる用語は、通常は癌が検出されない一定期間の後に再発した（再び生じた）例えばグリオーマなどの癌のことを指す。癌は最初の（原発）腫瘍と同じ場所、又は患者の体内の別の場所に再発しうる。
【０１０２】
「腫瘍減量因子」（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）なる用語には、腫瘍バルク（例えばＦＬ１０及びＦＬ１−細胞）から癌細胞を殺滅することを可能とする任意の分子（例えば化学的、生物学的）若しくは任意の外因性／環境性因子（例えばγ線照射）又は従来の手術が含まれる。
【０１０３】
「標準的放射線治療」なる用語は、悪性細胞を駆逐するための癌治療の一環としての電離放射線の使用のことを指す。好ましくは電離放射線は、γ線照射である。放射線治療を手術、化学療法、ホルモン療法、又はこれらの組み合わせと組み合わせることも一般的に行われる。最も一般的な種類の癌は、放射線治療で通常治療することができる。正確な治療の意図は（治療、アジュバント、ネオアジュバント、姑息的治療）、腫瘍のタイプ、場所、及びステージ、並びに治療を必要とする患者の一般的な健康状態に応じて決まる。
【０１０４】
「標準的化学療法」なる用語は、一般的に特定の化学療法／化学的薬剤を使用した癌の治療法のことを指す。化学療法薬とは、癌を治療する目的で一般的に使用される医薬品のことを指す。癌の治療を目的とした化学療法薬としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、イフォスファミド、パクリタキセル、ゲムシタビン、ドセタキセル、及びイリノテカン、並びにシスプラチン及びカルボプラチンなどの白金系抗癌剤が挙げられる。他の化学療法のクラスには、ゲフィチニブ、イマチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤、ロナファルニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、エベロリムスなどの哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の阻害剤、ベバシズマブ、スニチビド（ｓｕｎｉｔｉｂｉｄ）及びシレンジチドなどの血管新生阻害剤、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴの阻害剤が含まれる。より詳細には、本発明の化学療法薬としてテモゾロミド又はカルムスチンなどのアルキル化剤が挙げられる。本発明に基づけば、標準的な化学療法用の好ましい薬剤は、テモゾロミド及びベバシズマブである。
【０１０５】
グリオーマの標準的放射線治療及び化学療法は、同時併用化学放射線療法であってもよい。「同時併用化学放射線療法」なる用語は、これら２つの治療法（化学療法及び放射線治療）が同時に、又は例えば順次若しくは同日などにほぼ同時に行われる場合に用いられる。グリオーマの別の標準的放射線治療及び化学療法は、テモゾロミドと放射線治療を同時併用した補助的な複合化学放射線療法であってもよい（ＴＭＺ／ＲＴ→ＴＭＺ）（Ｓｔｕｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２００５， ２００９）。
【０１０６】
グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかに関連した本発明の方法においては、患者は腫瘍グリオーマのバルクを以前除去していることが重要である。実際、初期の主症状（発作、局所神経障害、頭蓋内圧亢進の兆候、人格変化）に応じて、特別な経過観察を計画し、画像診断を行うことで頭蓋内腫瘤の放射線医学的な発見にしばしばつながる。放射線医学的所見及び患者履歴は、腫瘍のタイプ及び病因を示唆するものであるが、確定診断は生検又は、完全摘出後の病理学的検査によって下されるものである。したがって、例えば部分切除（生検又は完全摘出）による腫瘍グリオーマのバルクの除去は、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与に常に先立って行われる。例えば、腫瘍グリオーマのバルクの除去は、標準的な手術方法によって行うことが可能である。この腫瘍減量工程により、グリオーマ開始細胞（高グレードグリオーマでは腫瘍グリオーマのバルクの最大で５％〜７％）、及び基本的に腫瘍グリオーマ細胞、マクロファージ、内皮細胞を含む腫瘍の残部（腫瘍グリオーマのバルクの約９３％〜９５％）を除去することが可能である。
【０１０７】
更なる実施形態では、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与は、腫瘍グリオーマのバルクを除去する手術の後に再発の予防又は防止策として行われる。
【０１０８】
グリオーマ開始細胞の代謝は、グリオーマのバルクの細胞及び正常な脳細胞とは異なることから、腫瘍減量を目的とした特定の因子（ＦＬ１０細胞及びＦＬ１−細胞を根絶する）とグリオーマ開始細胞の特定の阻害剤（ＦＬ１＋細胞を根絶する）との組み合わせは、グリオーマの増殖及び再発を根絶するための有利な方法となりうるものである。したがって場合に応じて、標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与の前、同時又はその後で行うことができる。標準的な化学療法が、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与と同時に行われる場合、化学療法薬は同じか又は異なる組成物中で、同じか又は異なる投与経路によって投与することができる。好ましくは標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与の前又は後に行うことができる。
【０１０９】
例えば、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与後に放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを適用することは、腫瘍形成状態（ＦＬ１＋細胞）から非腫瘍形成状態（ＦＬ１０細胞）への表現型の変化が不可逆的なものであり、分化及び細胞死に向かう運命決定と相関していることを本出願人らが観察したという事実によって支持されるものである。したがって、代替的な治療方法の１つとして、最初に、ＧＩＣにおいて好気的から好気的解糖に代謝スイッチを誘導することによって全てのＦＬ１＋細胞をＦＬ１０の表現型に変化させ、次に腫瘍減量因子（即ち放射線治療及び化学療法の少なくともいずれか）を場合に応じて神経外科手術と組み合わせて用いることによってＦＬ１０細胞及びＦＬ１＋細胞集団の全体を根絶する、というものがありうる。本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与後に放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを適用することは、ＧＩＣが標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかに耐性を示し、その後に回復するという事実によっても支持される（図６）。
【０１１０】
別の例では、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与の前に標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを適用することは、再発性グリオーマの治療及び予防の少なくともいずれかにおいて有用でありうる。
【０１１１】
本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、投与計画を更に提供する。
【０１１２】
短期間の用量反応では、ＧＩＣを増加する用量の阻害剤に４８時間曝露する。次いでＧＩＣの生存率、細胞死及び回復率を本発明に述べられる方法によって分析する。長期の治療（即ち１０〜２０日間の後に回復）用に選択される用量は、対照分子と比較して細胞死の全数の２倍の増加（即ち倍増）を誘発する阻害剤の用量に相当し、この用量をＩＣ２と称する。４８時間後に最小で５０％の細胞死を誘発する用量に相当する標準的なＩＣ５０と異なり、本出願人らのＩＣ２は、極めて低く、したがって毒性のない用量を決定することを可能とするものである。
【０１１３】
本発明に基づけば、ＩＣ２は、阻害剤に応じて０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲に好ましくは相当する。本発明に基づく投与計画は、毒性の兆候が認められない場合には、最大でＩＣ２用量の１０倍、即ち１．５７ｍｇ／ｋｇ〜３．１５ｍｇ／ｋｇとすることができる。この用量は、阻害剤の適切かつ充分な用量が血液脳関門を通過して腫瘍部位内に拡散する確率を最大とすることができる。
【０１１４】
単回投与又は複数回投与によって患者に投与される用量は、薬物動態特性、患者の状態及び特性（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、同時併用される治療、治療の頻度、及び所望の効果などの様々な因子に応じて変化しうる。
【０１１５】
治療は、通常、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物を、通常、数時間、数日、又は数週間の間隔で複数回投与することによって行うことができる。
【０１１６】
本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者、好ましくは哺乳動物患者、最も好ましくはグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍又はグリオーマ開始細胞を呈する再発腫瘍、特定の実施形態ではヒトグリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、再発性グリオーマなどの再発癌、例えばメラノーマ、乳癌、結腸癌又は肺癌などの転移性癌を罹患したヒト患者を治療するための阻害剤、医薬組成物、及び方法を提供する。
【０１１７】
本発明は更に、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法であって、電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量を投与することを含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすことにより、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤がＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害するような方法を提供する。
【０１１８】
好ましくは前記腫瘍グリオーマのバルクの除去は、腫瘍グリオーマのバルクの部分切除である。
【０１１９】
好ましくは前記治療上の有効量は、最大でＩＣ２用量の１０倍である。最も好ましくは前記ＩＣ２用量は、０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１２０】
代替的な一実施形態では、本発明の腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法は、更に、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与の前又は後に、標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかによって治療する工程を更に含む。
【０１２１】
好ましくは、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）及びその誘導体である。更なる一実施形態では、好ましくは前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤である。
【０１２２】
好ましくは、前記グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍は、グリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、再発癌、及び転移性癌からなる群から選択される。
【０１２３】
本発明は、更に、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための医薬組成物であって、少なくとも１種類の、本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１２４】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、１種類のミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）の阻害剤と、１種類のミトコンドリアの電子伝達系の複合体（ＩＩＩ）の阻害剤との組み合わせ、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含む。
【０１２５】
本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、少なくとも１種類の、本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を本明細書に述べられる任意の形態で含有しうる医薬組成物として製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、ミョウバン、安定剤、抗微生物剤、緩衝剤、着色剤、香味剤、賦形剤、アジュバントなどの１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を更に含みうる。
【０１２６】
非経口及び腸内投与用の本発明の医薬組成物は、賦形剤、アジュバント、結合剤、崩壊剤、分散剤、潤滑剤、希釈剤、吸収促進剤、緩衝剤、界面活性剤、可溶化剤、防腐剤、乳化剤、等張化剤、安定剤、注射用可溶化剤、ｐＨ調整剤などの任意の従来の添加剤を含有することができる。
【０１２７】
本発明の阻害剤を医薬上用いることが可能な医薬組成物に加工することを容易にする許容される担体、希釈剤、及び賦形剤は、使用される用量及び濃度で被験者（患者）に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍクレゾールなど）；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンなどの単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎタンパク質複合体）；及びＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤の少なくともいずれかを含みうる。
【０１２８】
本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、従来用いられているアジュバント、担体、希釈剤又は賦形剤とともに医薬組成物及びその単位用量の形態とすることが可能であり、こうした形態では、いずれも経口投与用の、錠剤若しくは充填カプセルなどの固体、又は溶液、懸濁液、乳濁液、エリキシル若しくはこれらで充填されたカプセルなどの液体、又は非経口投与（皮下投与を含む）用の滅菌注射溶液の形態とすることができる。このような医薬組成物及びその単位投与形態は、更なる活性化合物又は元素とともに、又はそれなしで各成分を従来の割合で含んでよく、こうした単位剤形は使用される所望の日用量の範囲に見合った任意の適当な有効量の有効成分を含むことができる。本発明に基づく組成物は好ましくは非経口組成物である。
【０１２９】
少なくとも１種類の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を含有する本発明の医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、水性又は油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、及びエリキシルなどの液体製剤であってもよい。経口投与に適した液体剤形は、好適な水性又は非水性溶媒を、緩衝剤、懸濁及び分散剤、着色剤、香味剤などとともに含みうる。本発明の医薬組成物は、使用前に水又は他の適当な溶媒によって還元するための乾燥製品として製剤化することもできる。このような液体製剤は、これらに限定されるものではないが、懸濁剤、乳化剤、非水性溶媒及び防腐剤などの添加剤を含有しうる。懸濁剤としては、これらに限定されるものではないが、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／シュガーシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、及び水添食用脂が挙げられる。乳化剤としては、これらに限定されるものではないが、レシチン、ソルビタンモノオレエート、及びアカシアゴムなどが挙げられる。非水性溶媒としては、これらに限定されるものではないが、食用油、アーモンド油、ヤシ油、油状エステル、プロピレングリコール、及びエチルアルコールが挙げられる。防腐剤としては、これらに限定されるものではないが、パラヒドロキシ安息香酸メチル又はプロプル及びソルビン酸が挙げられる。更なる材料及び加工方法などについては、本明細書に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０００， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの第５部に記載されている。
【０１３０】
一実施形態では、本発明に基づく患者は、グリオーマ開始細胞を呈する癌を罹患した患者である。特定の一実施形態では、本発明に基づく患者は、ヒトグリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、又は上衣腫を罹患している。別の特定の実施形態では、本発明に基づく患者は、再発性グリオーマなどの再発癌を罹患している。更なる実施形態では、本発明に基づく患者は、例えばメラノーマ、乳癌、結腸癌又は肺癌などの転移性癌を罹患している。
【０１３１】
本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物は、非経口又は腸内経路などの様々な経路から投与することができる。非経口投与には、静脈内、筋内、動脈内、又は脳内投与が含まれる。腸内投与には、あらゆる経口、胃内、又は直腸内投与が含まれる。本発明の組成物の投与方法には、静脈内末梢注入、腫瘍内注入、又は対流促進投与（ＣＥＤ）（Ｂｏｂｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４， ＰＮＡＳ， ９１ （６）， ２０７６−２０８０； Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２１， ３１１−３１６）などのあらゆる種類の頭蓋内投与などの公知の抗癌剤の投与方法が含まれる。
【０１３２】
本発明の更なる実施形態に基づけば、本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、及びこれを含有する医薬組成物は、単独で、又は充実性腫瘍を対象とした標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかにおいて使用される物質などの癌の治療に有用な補助剤と組み合わせて投与することができる。例えば補助剤は、テモゾリミド及びγ線照射などの腫瘍減量因子から選択される。
【０１３３】
本発明は更に、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法であって、腫瘍細胞試料から単離されたＦＬ１＋細胞及び正常な脳細胞を、スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすようなスクリーニング方法を提供する。
【０１３４】
本発明のスクリーニング方法は、原発性グリオーマ細胞を、前記スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を更に含む。
【０１３５】
本発明は更に、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たし、更に、グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の治療に有用であり、初代ＣＩＣ培養、原発性接着性グリオーマ細胞、正常細胞、並びに、ロテノン及びアンチマイシンＡからなる群から選択されるミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）又は複合体（ＩＩＩ）の活性の少なくとも１種類の標準的な阻害剤を含むキットを提供する。
【０１３６】
本明細書において提供されるキットは更に、前記阻害剤のスクリーニングを行うための方法について記載した情報資料を含んでもよい。該情報資料は更に、試験した阻害剤が本明細書の基準を満たすか否かを判定する方法についての使用説明書を含んでもよい。キットの情報資料の形態は、限定されない。多くの場合、例えば使用説明書などの情報資料は、印刷物、例えば印刷された文字、図、及び写真の少なくともいずれか、例えばラベル又は印刷シートとして提供される。しかしながら、情報資料は、点字、コンピュータ読み込み可能な資料、ビデオ録画又は音声録音などの他のフォーマットで提供することもできる。言うまでもなく、情報資料は、任意のフォーマットの組み合わせで提供することもできる。
【０１３７】
キットは、更に、試薬及び情報資料用の別々の容器、分割要素、又は区画を含んでもよい。容器は、適宜ラベリングすることができる。
【０１３８】
本明細書の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、その使用、方法、及びキットは、癌幹細胞の集団全体を殺滅し、標準的な手術、放射線治療及び化学療法といった標準的な癌治療後の癌幹細胞の再発を防止することを可能にするという利点を有している。これらの特定の性質は、腫瘍の予防及び／又は治療との関連において特に有用な特定の利点を与えるものであり、標準的な癌の腫瘍減量因子と組み合わせて使用することが可能であることから、グリオーマ細胞及び癌開始細胞（グリオーマ開始細胞など）などの両方の癌細胞を殺滅することが可能であり、標準的な癌治療後に残存する癌幹細胞による癌の再発を防止するものである。
【０１３９】
当業者であれば、本明細書に述べられる発明には、具体的に述べられたもの以外の変形及び改変が可能である点は認識されるであろう。本発明は、こうした変形及び改変の全てを、本発明の趣旨又は本質的特徴から逸脱することなく包含するものである点は理解されるはずである。本発明は、更に、個別又はまとめて本明細書において参照、又は示した工程、特徴、組成物、及び化合物の全て、並びに前記工程又は特徴のあらゆる組み合わせ、又は任意の２以上を包含するものである。したがって本開示は、全ての態様において説明的かつ非限定的なものとみなされるべきであり、発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、均等の意味及び範囲内に含まれる全ての変更は、特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１４０】
以上の説明は、以下の実施例を参照することでより完全な理解がなされよう。しかしながらこれらの実施例は、本発明を実施する方法を例示したものであって、発明の範囲を限定することを目的としたものではない。
【実施例】
【０１４１】
一般的手順及び条件
以下の実施例は、癌開始細胞における好気的エネルギー生産経路の役割、及び癌の治療に対する癌幹細胞のミトコンドリア活性の阻害剤の潜在的な活性を確認するものである。
【０１４２】
以下の略語は、それぞれ以下の定義を示す。
Ｇｙ（グレイ）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、ｎｍ（ナノメートル）、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＢＩＴ９５００（ウシ血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＣＩＣ（癌開始細胞）、ＤＡＰＴ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェニルアセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル）、ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＦＳＣ（前方散乱）、ＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子２）、ＧＢＭ（グリオブラストーマ）、ＧＬＣ（グルコース）、ＬＤ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、ＭＧＭＴ（Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、ＭＴＳ（［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩）、ＭＴＳ（［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩）、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＢ（正常脳細胞）、ＯＤ（光学密度）、ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）、ＲＯＳ（活性酸素種）、Ｒ（回復）、ｒ（部分的回復）、ＳＣ（幹細胞）、ＳＳＣ（側方散乱）、Ｔ（治療）。
【０１４３】
使用するスクリーニング方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるものであり、以下の工程を含む。即ち、
ａ）癌幹細胞の試料を提供する工程と、
ｂ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料を薬剤で処理する工程と、
ｃ）処理された幹細胞試料を幹細胞培地中で、処理を行わずに所定のインキュベーション期間にわたってインキュベートする工程と、
ｄ）工程（ｃ）でインキュベートされた幹細胞試料から生存細胞集団を選択する工程と、
ｅ）４８８ｎｍ又は約４８８ｎｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与える細胞を蛍光活性細胞選別によって検出することによって、工程（ｄ）で単離された生存細胞集団の自家蛍光の平均レベルを測定する工程と、
ｆ）特定の形態（高いＦＳＣ及び低い／中度のＳＳＣ）を有し、工程（ｄ）で単離された生存細胞集団の４８８ｎｍ又は約４８８ｎｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与える細胞を蛍光活性細胞選別によって単離する工程と、
ｇ）特定の形態（低い／中度のＦＳＣ及び中度の／高いＳＳＣ）を有し、工程（ｄ）でＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与えず、工程（ｄ）で単離された生存細胞集団のレーザー光線による励起時にＦＬ３及びＦＬ４チャネルの少なくともいずれかにおいて細胞蛍光発光にわずかな正方向へのシフトを示す細胞を蛍光活性細胞選別によって単離する工程と、
ｈ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料の自家蛍光の平均レベルと、工程（ｅ）で測定された自家蛍光の平均レベルとを比較することによって自家蛍光性の生存細胞の比率を計算する工程と、
ｉ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期の細胞数と、工程（ｄ）で単離して得られた生存細胞集団とを比較することによって細胞死の比率を計算する工程と、
ｊ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期のＦＬ１＋細胞数と、工程（ｆ）で単離して得られた生存ＦＬ１＋細胞集団とを比較することによって生存ＦＬ１＋細胞の比率を計算する工程と、
ｋ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期のＦＬ１０細胞数と、工程（ｇ）で単離して得られた生存ＦＬ１０細胞集団とを比較することによって生存ＦＬ１０細胞の比率を計算する工程と、
ｌ）工程（ｆ）及び（ｇ）で検出された細胞集団のスフェア形成性を検出する工程と、
ｍ）癌幹細胞の再発を阻害する前記薬剤の能力によって前記薬剤の活性を判定する工程と、を含む。
【０１４４】
以下の材料を使用した。即ち、
・国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられる方法にしたがって作製された６個の初代ＣＩＣ細胞培養。
・癌細胞と呼ばれる２個の原発性接着性グリオーマ細胞、及び２個の正常脳細胞を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有し、１／１，０００ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＦＢＳ培地中で培養した。
【０１４５】
特定の薬剤がＣＩＣを殺滅する有効性を試験するための更なる条件的パラメータ（スクリーニングキットに含まれるオプション）としては、以下が含まれる。
・以下のようにして分裂細胞（Ｋｉ６７＋細胞など）の比率を調べた。処理及び回復の少なくともいずれかの後、細胞を収穫、洗浄し、ＰＦＡ４％を用いて固定した。細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％を用いて透過化処理した後、ＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％中で抗ヒトＫｉ６７抗体により染色した（回転下で３０分間、氷上でインキュベート）。細胞をＰＢＳ１ｘで２回洗浄した後、二次抗体とインキュベートし、再びＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％中で希釈した（回転下で３０分間、４℃）。最後にＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞集団内のＫｉ６７＋細胞の比率をＦＡＣＳによって求めた。
・リアルタイムＰＣＲにより以下のようにして幹細胞性遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ又はＮＯＴＣＨ１など）を発現させた。処理及び回復の少なくともいずれかの後、細胞を収穫した。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏキット（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて逆転写を行った。ＳＹＢＥＲ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、試料を７９００ＨＴ配列決定システム装置（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にかけた。プライマー配列については、Ｃｌｅｍｅｎｔ， ２００７， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ， １７， １６５−１７２を参照。
・以下のようにして少なくとも１種類の分化マーカー（ＴＵＪ１、ＭＡＰ２又はＧＦＡＰ）を発現させた。処理及び回復の少なくともいずれかの後、細胞を収穫、洗浄し、ＰＦＡ４％を用いて固定した。細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％を用いて透過化処理した後、ＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％中で抗ヒトＭＡＰ２又は抗ヒトＧＦＡＰ又は抗ヒトＴＵＪ１抗体により染色した（回転下で３０分間、氷上でインキュベート）。細胞をＰＢＳ１ｘで２回洗浄した後、二次抗体とインキュベートし、再びＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％中で希釈した（回転下で３０分間、４℃）。最後にＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞集団内の陽性細胞の比率をＦＡＣＳによって求めた。
【０１４６】
本発明に基づく方法の工程（ａ）で使用するための腫瘍細胞試料（例えばヒト由来のもの）は、採取しようとする特定の細胞に適合された標準的方法を用いて滅菌条件下で得られた対応する腫瘍組織の生検を得ることによって調製した。使用した腫瘍及び正常な脳の試料の例を下記表４及び表５に示す。
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
【表５】
【０１４９】
実施例１ 癌開始ＦＬ１＋細胞集団の酸化的細胞エネルギー生産プロセス及びミトコンドリア活性を支持するアッセイ
【０１５０】
細胞における嫌気的及び好気的経路を図１に示す。解糖系は、細胞質中でグルコースをピルビン酸に代謝するプロセスである。低酸素条件下ではピルビン酸は、ＬＤＨによって乳酸に変換される（１分子のグルコースから２分子のＡＴＰ）。
【０１５１】
トリカルボン酸（ＴＣＡ）は、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）と併せて、解糖系からのピルビン酸を使用し、ＮＡＤＨ及びＦＡＤＨ２を介してミトコンドリア内の呼吸鎖複合体に電子を伝達し、プロトン勾配ポンプによってＡＤＰからＡＴＰを生成するプロセスである（１分子のグルコースから３６分子のＡＴＰ）。
【０１５２】
癌開始細胞の代謝経路を以下のパラメータを求めることによって調べた。
【０１５３】
・活性ミトコンドリア（Ｍ７５−１３など）の数：細胞を収穫して、解離させ、洗浄した後、Ｍ７５−１３をＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘ １／１，０００ペニシリン／ストレプトマイシン中で２５０ｎＭの最終濃度に希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。染色した後、細胞をＰＢＳ１ｘで２回洗浄し、ＦａｃｓＣａｎのＦｌ１及びＦＬ３チャネルで分析した。最後にＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞集団中のＭｉｔｏ＋細胞（ＦＬ３＋細胞として同定）の比率を求めた。
【０１５４】
・ＭＴＳ酸化還元反応を用いたＮＡＤＨの濃度：解離させたグリオーマスフェアを国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞に基づいて精製した。ＮＡＤＨの濃度を、製造者の指示にしたがってＡＱｕｅｓｏｕｓ一液型細胞増殖アッセイ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて間接的に評価した。測定は、９６穴プレートリーダー（バイオラド社（Ｂｉｏｒａｄ））により４９０ｎｍで行った。
【０１５５】
・乳酸の濃度：国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるプロトコールにしたがってＣＩＣを選別した。１．５×１０５個の精製したＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の少なくともいずれかを以下の凍結融解サイクル（−８０℃で５分、３７℃で２分）を２回繰り返すことによって１００μＬの滅菌水中で溶解した。次いで溶解物を４℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。３μＬを乳酸オキシダーゼ（７００Ｕ／Ｌ）、ペルオキシダーゼ（５０８Ｕ／Ｌ）、ＤＣＢＳＡ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）及び４−アミノアンチピリン（１．１６ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合し、製造者の指示にしたがってＳＹＮＣＨＲＯＮシステム（ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて分析した。
【０１５６】
・グルコースの濃度：国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるプロトコールにしたがってＣＩＣを選別した。１．５×１０５個の精製したＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の少なくともいずれかを以下の凍結融解サイクル（−８０℃で５分、３７℃で２分）を２回繰り返すことによって１００μＬの滅菌水中で溶解した。次いで溶解物を４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。１０μＬをグルコースオキシダーゼ（１５０Ｕ／Ｌ）、変性エタノール（５％）、ヨウ化カリウム（０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ）及びモリブデン酸アンモニウム（０．０３６ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合し、製造者の指示にしたがってＳＹＮＣＨＲＯＮシステム（ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて分析した。
【０１５７】
・ピルビン酸の濃度：国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるプロトコールにしたがってＣＩＣを選別した。１．５×１０５個の精製したＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の少なくともいずれかを以下の凍結融解サイクル（−８０℃で５分、３７℃で２分）を２回繰り返すことによって１００μＬの滅菌水中で溶解した。次いで溶解物を４℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。乳酸の濃度をＨＰＬＣによって求めた。
【０１５８】
・ＬＤの濃度：国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるプロトコールにしたがってＣＩＣを選別した。１．５×１０５個の精製したＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の少なくともいずれかを以下の凍結融解サイクル（−８０℃で５分、３７℃で２分）を２回繰り返すことによって１００μＬの滅菌水中で溶解した。次いで溶解物を４℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。１３μＬを乳酸（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）及びＮＡＤ（１１ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合し、製造者の指示にしたがってＳＹＮＣＨＲＯＮシステム（ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて分析した。
【０１５９】
各アッセイについて、選別された細胞の３つの独立した組で３重の分析を行った。これらの実験は、ＦＬ１＋細胞がＮＡＤＨ濃度について濃縮されており、ＦＬ１０細胞と比較してより多くの活性ミトコンドリアを含んでいることから、高い代謝活性を有しうることを示すものであった（図２）。更に、ＦＬ１＋細胞では、ＦＬ１０細胞と比較してインビトロ及びインビボの乳酸濃度が低くなっている（図３Ａ）。１０日間にわたる外因性の乳酸の添加が細胞の接着性を誘導するうえで充分であり（図３Ｂ）、ＦＬ１０の表現型の方向に細胞の運命を決定した（図３Ｃ）。ＣＩＣは、ＦＬ１０と比較してＬＤ活性のレベルが高い（図３Ｄ）。
【０１６０】
細胞の酸化的経路を活性化することが知られている化合物（酸化的経路を活性化することが知られているＤＣＡ、及び細胞質のＬＤＨ３〜５を阻害することが知られているオキサミン酸、Ｍｉｃｈｅｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ９９， ９８９−９９４ ａｎｄ Ｌｅｍｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８， ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ３， ｅ１５５０を参照。）のＣＩＣに対する影響を以下のようにして試験した。
【０１６１】
短期／用量反応（４８時間）については、解離させたグリオーマスフェア細胞、接着性グリオーマ、及び正常細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１０００中に、１ｎｇ／ｍＬの低濃度の分裂促進因子、又は低濃度（２．５％）の血清とともに１０細胞／μＬで播種した。
【０１６２】
長期の処理／回復アッセイ（Ｔ１０及びＴ２０の少なくともいずれか）については、解離させたグリオーマスフェア細胞、接着性グリオーマ、及び正常細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１，０００中に、１ｎｇ／ｍＬの低濃度の分裂促進因子、又は低濃度（２．５％）の血清とともに２細胞／μＬで播種した。
【０１６３】
回復については、細胞を収穫し、ＰＢＳ１ｘで洗浄し、それぞれの標準的培地に戻した（例えばグリオーマスフェアでは、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン １％に、１０ｎｇ／ｍＬの分裂促進因子を加えたもの。原発性グリオーマ細胞及び正常脳細胞では、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン １％）。
【０１６４】
結果は、用量を増大させたＤＣＡ又はオキサミン酸への曝露後では、１０日間後であってもＦＬ１＋細胞の比に大きな変化が見られないことによって示されるように、活性な好気的経路の方向に細胞を向かわせる、即ち嫌気的経路を阻害する薬剤によってはＦＬ１＋細胞が殺滅されないことを示している（図４）。これと対照的に、ＦＬ１＋細胞は、こうした処理後に更に健康となり、分化しなくなる傾向を示した。したがって、ＦＬ１＋細胞は、好気的な解糖系に依存したＦＬ１０又はＦＬ１−細胞とは異なり、好気的経路（ＴＣＡ及び酸化的リン酸化−電子伝達系）を用いてエネルギーを選択的に生産するものと結論づけることができる。更に、好気的から好気的解糖への代謝スイッチと分化への運命決定とは密接に関係しており、両者とも不可逆的な運命である。
【０１６５】
実施例２ 潜在的な抗癌幹細胞剤（阻害剤）の試験
【０１６６】
ミトコンドリアの活性、代謝産物の含量、及び嫌気的なエネルギー生産経路の阻害剤の効果（実施例１において述べた）についての結果に基づけば、ＦＬ１＋細胞は、好気的な解糖系に依存したＦＬ１０又はＦＬ１−細胞とは異なり、好気的経路を用いてエネルギーを選択的に生産する傾向を有している。したがって、ミトコンドリアの活性の効果的な阻害能を有するあらゆる薬剤は、ＣＩＣ内のエネルギー生産を阻害するはずであり、これによりＣＩＣが殺滅されるものと考えられる。これについて、図５に示されるようなインビトロ再発アッセイにおいて以下に述べるように試験を行った。
【０１６７】
短期／用量反応（４８時間）については、解離させたグリオーマスフェア細胞、接着性グリオーマ、及び正常細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＬ、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１，０００中に、１ｎｇ／ｍＬの低濃度の分裂促進因子、又は低濃度（２．５％）の血清とともに１０細胞／μＬで播種した。
【０１６８】
長期の処理／回復アッセイ（Ｔ１０及びＴ２０の少なくともいずれか）については、解離させたグリオーマスフェア細胞、接着性グリオーマ、及び正常細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１，０００中に、１ｎｇ／ｍＬの低濃度の分裂促進因子、又は低濃度（２．５％）の血清とともに２細胞／μＬで播種した。
【０１６９】
回復については、細胞を収穫し、ＰＢＳ１ｘで洗浄し、それぞれの標準的培地に戻した（例えばグリオーマスフェアでは、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１，０００に、１０ｎｇ／ｍＬの分裂促進因子を加えたもの。原発性グリオーマ細胞及び正常脳細胞では、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン １，０００／１）。
【０１７０】
癌幹細胞（例えば癌幹細胞の再発）を減少及び／又は根絶するために用いられる化合物の効果は、例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられる方法により、本発明に基づいた薬剤又は阻害剤による処理後に細胞試料中の幹細胞の存在を検出することによってアッセイすることができる。即ち以下の工程を含む方法である。
ａ）本発明に基づく化合物又は方法によって処理された癌幹細胞の試料を提供する工程と、
ｂ）処理された幹細胞試料を幹細胞培地中で、処理を行わずに所定のインキュベーション期間にわたってインキュベートする工程と、
ｃ）工程（ｂ）でインキュベートされた幹細胞試料から生存細胞集団を選択する工程と、
ｄ）４８８ｎｍ又は約４８８ｎｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与える細胞を蛍光活性細胞選別によって検出することによって、工程（ｃ）で単離された生存細胞集団の自家蛍光の平均レベルを測定する工程と、
ｅ）特定の形態（高いＦＳＣ及び低い／中度のＳＳＣ）を有し、工程（ｃ）で単離された生存細胞集団の４８８ｎｍ又は約４８８ｎｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与える細胞を蛍光活性細胞選別によって単離する工程と、
ｆ）特定の形態（低い／中度のＦＳＣ及び中度の／高いＳＳＣ）を有し、工程（ｃ）でＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与えず、工程（ｃ）で単離された生存細胞集団のレーザー光線による励起時にＦＬ３及びＦＬ４チャネルの少なくともいずれかにおいて細胞蛍光発光にわずかな正方向へのシフトを示す細胞を蛍光活性細胞選別によって単離する工程と、
ｇ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料の自家蛍光の平均レベルと、工程（ｄ）で測定された自家蛍光の平均レベルとを比較することによって自家蛍光性の生存細胞の比率を計算する工程と、
ｈ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期の細胞数と、工程（ｃ）で単離して得られた生存細胞集団とを比較することによって細胞死の比率を計算する工程と、
ｉ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期のＦＬ１＋細胞数と、工程（ｅ）で単離して得られた生存ＦＬ１＋細胞集団とを比較することによって生存ＦＬ１＋細胞の比率を計算する工程と、
ｊ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期のＦＬ１０細胞数と、工程（ｆ）で単離して得られた生存ＦＬ１０細胞集団とを比較することによって生存ＦＬ１０細胞の比率を計算する工程と、
ｋ）工程（ｅ）及び（ｆ）で検出された細胞集団のスフェア形成性を検出する工程と、
ｌ）癌幹細胞の再発を阻害する前記薬剤の能力によって前記薬剤の活性を判定する工程と、を含む。
【０１７１】
試験した化合物を表２及び３にまとめる。
【０１７２】
γ線照射（図６、Ｂ１）及びＧＢＭに対して現在使用されている主要な細胞毒性薬であるテモゾロミド（図６、Ａ１及びＡ２）の効果について試験した。ＦＢＳで培養したグリオーマ細胞と異なり、ＦＬ１＋細胞の約４０％が２５Ｇｙの照射に耐性を示して生存し、したがって遺伝毒性ストレス後３０日以内に回復し、これにより放射線は、ＣＩＣの亜集団をほとんど標的とせず、腫瘍バルクからの活発に分裂している細胞を標的とすることが確認された。テモゾロミド処理に先立ってグリオーマスフェア細胞のＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態についてＨｅｇｉ ｅｔ ａｌ， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ２００５， ３５２ （１０） ９９７−１００３に述べられるようにして試験を行ったところ、グリオーマスフェア細胞は、テモゾロミドに対する感受性を有するはずであると予測された。しかしながら、２５μＭのテモゾロミドによる２０日間の処理後であっても、ＦＬ１＋細胞の３０％は、依然生存しており、したがって２０日間以内に回復可能であった（０．２＜Ｒ＜１）。
【０１７３】
５μＭのエルロチニブ（非小細胞性肺癌、膵臓癌、及び他の幾つかのタイプの癌の治療薬として知られるＥＧＦＲシグナル伝達経路の阻害剤）による長期の治療は、ＥＧＦＲの状態とは無関係に２／６のＧＢＭのみにおいて５０％よりも多くのＦＬ１＋細胞に細胞死を誘導し、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅がゲフィニチブ又はエルロチニブなどのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する反応性とは相関していないことが確認された。更に、全てのグリオーマスフェア培養が１０日間以内に治療から回復し、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を受容体のレベルで阻害することは有効ではない可能性が示唆された。同じではないが同様にして、１μＭのテムシロリムスを用いたｍＴＯＲの阻害、又はＳＨＨ−Ｇｌｉ若しくはＮｏｔｃｈなどの発生経路を（それぞれ５μＭのシクロパミン若しくは５μＭのＤＡＰＴを用いて）標的とすることにより、生存ＦＬ１＋細胞の数の減少を引き起こす。この場合もやはり、これらの薬剤ではＦＬ１＋細胞集団全体を根絶することはできず、ＦＬ１＋細胞集団は、２０日間の治療の後であっても容易に回復した。
【０１７４】
ミトコンドリアの複合体Ｉ（ロテノン）、ＩＩＩ（アンチマシンＡ）、又はＩＶ（オリゴマイシンＡ／Ｂ）のいずれかの阻害によって、ＦＬ１＋細胞集団は、殺滅される（図６Ａ〜Ｃ）。オリゴマイシンＡ／Ｂを用いて複合体ＩＶを阻害すると、複合体Ｉ（図６Ａ１及びＡ２）及びＩＩＩ（図６Ｂ１及びＢ２）を阻害した場合と異なり、正常細胞及びグリオーマ細胞を含むあらゆる種類の脳細胞が根絶される（図６Ｃ１及びＣ２）。より詳細には、複合体ＩＩＩの阻害（例えばアンチマイシンＡを用いた）は、正常な脳細胞の生存率に大きく影響しないため、ＣＩＣに対してより適切でありうる。
【０１７５】
ＣＩＣの代謝は、腫瘍バルクの細胞及び正常な脳細胞とは異なることから、腫瘍減量を目的とした特定の薬剤（ＦＬ１０及びＦＬ１−細胞を根絶する）と、ＣＩＣに対する特定の薬剤（ＦＬ１＋細胞を根絶する）とを組み合わせることは、ヒトグリオーマの増殖及び再発を根絶するうえで有利な戦略となるものと思われる。
【０１７６】
治療及び回復期間の条件培地、並びにＣＩＣを殺滅する薬剤の有効性を評価するうえで必要とされる基準については、図５Ａを参照されたい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかにおいて有用な化合物に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に関する。本発明は更に、本発明の阻害剤を含有する医薬組成物及び本発明の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
グリオーマは成人における脳腫瘍の中で依然、最も頻度の高いものである。グリオーマの悪性型である、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）とも呼ばれるグレードＩＶは治療が困難であることで悪名高い。多形性膠芽腫は、手術、放射線治療、及び化学療法を含む現在の治療法の事実上全てにおいて多くの場合、再発する。生存率は、例えば、化学療法を放射線治療と組み合わせた場合であっても平均で１４．６ヶ月と極めて低い。環境危険因子は特定されておらず、これらの脳腫瘍の発病及び進行段階に関与する生物学的機構については、ほとんど解明されていない。
【０００３】
１９３０年にオットー・ワールブルクは、癌が、（１）呼吸が不可逆的に障害され、更に（２）回復不能な呼吸の損失が解糖系に置き換わる、という２つの連続した段階の後、非腫瘍性細胞が嫌気的代謝を獲得する場合に生じることを提唱した。この理論によれば、癌細胞の大半は、好気的条件下でグルコースから乳酸を生成することによって選択的にエネルギーを生産しているものと考えられる。これは、「好気的解糖」と一般に名付けられている現象であり、ワールブルク効果と呼ばれる。したがって、この好気的解糖代謝経路を標的とした癌の治療法を開発することは、活動的呼吸及びミトコンドリアによるエネルギー生産へと代謝プロセスを再構成することを可能とするものであり、この１０年間、注目を集めてきた。
【０００４】
幾つかの文献において、グリオーマ細胞のミトコンドリアを癌の化学療法の潜在的な標的とすることが示唆されている（非特許文献１及び２）。これらの文献では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤、ひいてはグリオーマ細胞（癌細胞）に対する潜在的な化学療法としてクロミプラミン又は一般的には三環系抗うつ薬を使用する、更なる放射線治療又は手術を伴わない治療法について開示している。この阻害剤は、ミトコンドリア経路の活性化、即ちシトクロムＣの放出及びカスパーゼ３の活性化によって媒介されるアポトーシスを誘導する。この種の治療法は、グリオーマ細胞（癌細胞）が正常細胞とは異なる代謝を有するために可能である。
【０００５】
特許文献１（グリフィス大学）もまた、幾つかの抗癌性化合物及び癌の治療又は予防法について開示している。詳細には、癌細胞のミトコンドリア呼吸鎖の複合体ＩＩ（コハク酸−ユビキノン酸化還元酵素）と選択的に相互作用し、活性酸素種を生成してこれらの細胞のアポトーシスを誘導するビタミンＥのプロオキシダント型などのプロオキシダント抗癌性化合物について開示されている。
【０００６】
しかしながら、この治療方法は、全ての癌細胞（例えばグリオーマ細胞）が同様の生物学的性質及び代謝を有するという仮定に基づいたものであり、残念ながらグリオーマの治療に大きな進展を与えるものではなかった。
【０００７】
グリオーマの正確な細胞起源については依然、解明されていないが、癌幹細胞（ＣＳＣ）と通常呼ばれる、幹細胞の性質を有する一部の癌細胞のみが真の腫瘍形成能を有し、グリオーマにおける癌開始細胞の独立した細胞巣を構成しているものと提唱されている。最近になって、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌、卵巣癌、及び脳腫瘍などの多くのヒトの癌において幹様細胞（ＣＳ）が特定されたことにより、癌は、成人の幹細胞／始原細胞における体細胞突然変異によって生じうるという仮説が再び注目を集めることとなった。
【０００８】
グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）として知られる脳腫瘍の癌開始細胞は、最初にＣＤ１３３＋細胞として同定されたが、最近の研究によりこのマーカーの特異性を比較的欠いていることが示されている。これらの細胞は、腫瘍形成能が異なる異種細胞の集団であり、一部の腫瘍細胞は、高い腫瘍開始能及び増殖能を有している。グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）は、グリオーマの発生及び再発を引き起こす。幹細胞の性質を有するグリオーマ開始細胞の役割については未だに深く研究されていない。これらの細胞は、単一細胞レベルでの自己更新能、インビトロでのアストログリア、神経細胞、及びオリゴデンドログリアへの分化によって示される多能性、並びにインビボでの腫瘍形成能といった特徴的な幹細胞の性質を示す。他のヒトの癌と同様、グリオーマは、幹細胞の性質を有する腫瘍開始及び増殖細胞（癌幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれる）をその頂点として腫瘍の増殖が調節されると考えられる細胞階層を有している。この癌幹様細胞の少数集団であるＧＩＣは、腫瘍細胞（グリオーマ）の約５％を占めるのみに過ぎず、腫瘍細胞の増加、再発、及び転移の要因となっているものと考えられ、増殖、進行、ひいては治療に対する反応といった腫瘍の生物学的挙動を決定する。
【０００９】
グリオーマ開始細胞を標的とすることは、その希少性、培養における不安定性、及び安定的なトレーサー物質がないことによって困難である。これまでのところ、同所性異種移植及び／又は形質転換マウスモデルのいずれにおいてもグリオーマの増殖の完全な根絶、又は再発の防止効果を示したグリオーマ開始細胞に対する有効な治療法は、存在していない。グリオーマ由来の腫瘍開始細胞は、従来の放射線治療に対して耐性を示すことが示されている（Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。例えば、グリオーマ開始細胞は、テモゾロミドなどの化学療法薬に対して耐性を示すことが知られている。これらのデータは、グリオーマの再発が避けられないことを説明しているものと考えられ、この疾患における従来の治療法に対する耐性を克服するための新たな標的としてグリオーマ開始細胞を定義しうるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／０３１１７１号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ３２８（２）：６２３−６３２
【非特許文献２】Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｎｇｌａｎｄ， １８（３）：２２６−２３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
さしあたって現在のところ、グリオーマの再発に対する有効な治療法は、存在していない。グリオーマ開始細胞を特に対象とした有効な治療法を見出すことが求められている。しかしながら、グリオーマ開始細胞に対する有効な分子を特定し、グリオーマ治療における大きな改善策を得るのに先立って、グリオーマ開始細胞の細胞及び分子的機構をより一層、深く理解することが不可欠である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、本出願人らは、グリオーマ開始細胞がグリオーマなどの他の癌細胞とは異なる代謝を有していることを証明した。
【００１４】
したがって、本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者において、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤であって、以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすことにより前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤がＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害するような阻害剤を提供する。
【００１５】
更に、本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための医薬組成物であって、本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の少なくとも１種類の阻害剤、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明の別の目的は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法であって、電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量を投与することを含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、を満たすことにより、
前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤がＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害するような方法である。
【００１７】
更に本発明は、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法であって、腫瘍細胞試料から単離されたＦＬ１＋細胞及び正常な脳細胞を、スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすようなスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
本発明には更に、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たし、更に、グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の治療に有用であり、初代ＣＩＣ培養、原発性接着性グリオーマ細胞、正常細胞、並びに、ロテノン及びアンチマイシンＡからなる群から選択されるミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）又は複合体（ＩＩＩ）の活性の少なくとも１種類の標準的な阻害剤を含むようなキットが包含される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、哺乳動物細胞における嫌気的及び好気的経路を示した模式図である（Ｌｅｍｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ｖｏｌ．３ （２）， ｅ１２５０より改変）。
【図２】図２は、癌幹細胞におけるミトコンドリア活性を示すパラメータを示した図である。Ａ：ＦＬ１＋（白地に黒の破線）及びＦＬ１０細胞集団（白）におけるＭｉｔｏ＋細胞の比率（Ｍ７５−１３色素の取り込み後にＦＬ３陽性細胞の数を定量することにより求めた）、並びに、ＦＡＣＳによりＦＬ１−Ｈ及びＦＬ３−Ｈチャネルにおいて測定されたＦＬ１＋細胞のＦＬ１自家蛍光のレベル（黒）。
【図３Ａ】図３Ａは、ＦＬ１０、初代グリオーマ、及び正常な脳細胞と比較して低下したＦＬ１＋細胞の解糖活性を示した図であり、ＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞の代謝産物の濃度を示す（ＬＡＣ：乳酸、ＰＹＲ：ピルビン酸、ＧＬＵＣ：グルコース）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、位相差イメージングによるＦＬ１＋細胞の形態を示す（非処理（ＮＴ）；スケールバー：１５０μＭ）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＦＬ１０細胞の比率に対する乳酸（ＬＡＣ）添加の影響を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、精製されたＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞における活性乳酸デヒドロゲナーゼの濃度を示す（ＬＤは、ＵＩ／Ｌで表されている）。
【図４Ａ】図４Ａは、溶媒コントロールで処理した場合の試料と比較した、上記の薬剤で処理した試料中の死んだＦＬ１＋細胞の比率の比に基づくＦＬ１＋細胞に対するＤＣＡ処理（酸化的経路の活性化因子）の影響を示した図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、溶媒コントロールで処理した場合の試料と比較した、上記の薬剤で処理した試料中の死んだＦＬ１＋細胞の比率の比に基づくＦＬ１＋細胞に対するオキサミン酸処理（細胞質の乳酸デヒドロゲナーゼ３〜５（ＬＤＨ３〜５）の阻害剤）の影響を示した図である。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例２で述べられる抗癌幹細胞物質を試験するのに用いるプロトコールであり、処理及び回復期間の実験手順を示す。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣＩＣを有効な抗ＣＳＣ剤（黒い太線）又は効果のないＣＳＣ剤（黒い破線）で処理した後の模式的な生存反応曲線を示す。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ａ１】図６Ａ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、２５Ｇｙのγ線を照射したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ａ２】図６Ａ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、２５Ｇｙのγ線を照射したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｂ１】図６Ｂ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、テモゾロミド２５μＭ（ＴＭＺ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｃ１】図６Ｃ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、ロテノン５μＭ（Ｒｏｔ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｃ２】図６Ｃ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、ロテノン５μＭ（Ｒｏｔ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｄ１】図６Ｄ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、アンチマイシンＡ ５μＭ（ＡＡ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｄ２】図６Ｄ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、アンチマイシンＡ ５μＭ（ＡＡ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｅ１】図６Ｅ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、オリゴマイシンＡ／Ｂ ５μＭ（ＯｌｉｇｏＡ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｅ２】図６Ｅ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、オリゴマイシンＡ／Ｂ ５μＭ（ＯｌｉｇｏＡ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｆ１】図６Ｆ１は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロールＦＬ１＋に対する生存した処理ＦＬ１＋の比率の比として表した図であり、クロミプラミンまたの名をアナフラニール（１０μＭ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図６Ｆ２】図６Ｆ２は、実施例２で述べられるようなインビトロ再発アッセイにおける薬剤の効果を、生存したコントロール細胞に対する生存した処理細胞の比率の比として表した図であり、クロミプラミンまたの名をアナフラニール（１０μＭ）で処理したときの図である。Ｔｘは、時間ｘにわたる処理を示す。例えば１０日間（Ｔ１０）、２０日間（Ｔ２０）であり、Ｒは、１０日間（Ｒ１０）及び２０日間（Ｒ２０）といった所定期間にわたる回復段階を示す。
【図７】図７は、各種の阻害剤で処理した細胞のインビボの腫瘍形成性を示した図である。グラフは、移植に先立ってインビトロで１０日間、各種の分子で処理した初代ＧＢＭ−２細胞を注射した後の無症状のマウスの全数の比率を示す。コントロールマウスは、移植４週後に症状を呈したため屠殺した。組織学的分析により大きな腫瘍の存在が判明した。ＡＡ、ロテノン又はアナフラニールで前処理した細胞を移植したマウスは、症状を呈することなく生存した。移植１７週後に実験を停止した。組織学的分析によって視認される腫瘍は、認められなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施又は試験においては、本明細書で述べるものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができるが、適当な方法及び材料については下記に述べる。本明細書において触れる刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、いずれもその全容を援用するものである。本明細書において述べられる刊行物及び出願は、本願の出願日に先立つそれらの開示のみを目的として与えられるものである。本明細書の一切の記載内容は、先行する発明によって本発明がこうした刊行物に先行する資格を有さないことを容認するものとして解釈されるべきではない。更に、材料、方法、及び実施例は、あくまで説明を目的としたものであって、限定を目的としたものではない。
【００２１】
記載に矛盾が生じた場合には、定義を含めた本明細書が優先するものとする。特に断らないかぎり、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本明細書の主題が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものである。本明細書において使用する以下の定義は、本発明の理解を助けるために与えられるものである。
【００２２】
「含む」なる用語は、包含の意味、即ち、１以上の特徴又は要素が存在することを許容する意味で一般的に用いられる。
【００２３】
明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに示されないかぎりは複数の対象物を含むものである。
【００２４】
本明細書で使用するところの「被験者」又は「患者」なる用語は、当該技術分野では、広く認識されたものであり、本明細書においては、イヌ、ネコ、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、及び最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を指して互換可能に使用される。実施形態によっては、患者は、治療を要する患者、又は癌、好ましくはグリオーマなどの疾病又は疾患を有する患者である。しかしながら、患者は、正常な患者、又は例えば腫瘍グリオーマのバルクを以前除去するなどの治療を既に行った患者であってもよい。この用語は、特定の年齢又は性別を意味するものではない。したがって、成人及び新生児患者を男性、女性を問わずに網羅するものである。
【００２５】
グリオーマ開始細胞を呈する癌の治療において有用な阻害剤などの薬剤の同定とは、癌開始細胞（ＣＩＣ）巣の全体を同定、単離、及び特性評価するうえで確実な選択法を使用することを意味する。正常な幹細胞の生物学的性質（Ｂｕｒｄｓａｌｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， ２１， １４５−１５２）から一般的に推定された任意のマーカー（幹細胞性の指標としてのＣＤ１３３など）によって予め決定されたグリオーマ細胞株などの癌細胞株を選択的に使用する方法は、偏向したものであることが知られている。
【００２６】
したがって、本出願人らは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられる出願人らにより最近開発された手法を用いて自己更新性及び腫瘍開始性を示す細胞の亜集団を単離及び濃縮した。この方法は、ヒト試料に由来する初代細胞培養をその基礎とし、腫瘍細胞の単純かつ安定した表現型特性に依存したものであり、ＣＤ１３３などのあらゆる細胞表面マーカーと無関係に非腫瘍形成性グリオーマ細胞（この方法では、ＦＬ１０細胞と呼ばれる）からの癌開始細胞（ＣＩＣ）（ＦＬ１＋細胞と呼ばれる）の速やかな同定及び単離を可能とするものである。
【００２７】
本出願人らは、グリオーマ開始細胞（より詳細には、本明細書で使用するところのＦＬ１＋細胞集団）などの癌開始細胞（ＣＩＣ）が、好気的経路（ＴＣＡ回路／酸化的リン酸化−電子伝達系）によってエネルギーを生産し、分裂、生存することを期せずして見出した。本出願人らは、更に、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）が好気的な解糖系（ワールブルグ効果）を選択的に用いる腫瘍バルクに由来する他のグリオーマ細胞（癌細胞）とは異なる代謝を有することも期せずして見出した。実際、本出願人らは、ＦＬ１＋細胞集団（ＣＩＣ）がＮＡＤＨ、活性ミトコンドリア、及び活性ＬＤについて濃縮されているという、興味深くかつ予想外の知見を得た。更にＦＬ１＋細胞は、ＦＬ１０細胞と比較して乳酸の濃度が低く、このことは、ＦＬ１＋細胞がＡＴＰを生産するうえで好気的ミトコンドリア経路を選択的に使用している可能性を示唆するものである。
【００２８】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号において開示される方法は、
（ａ）腫瘍細胞の試料を与える工程と、
（ｂ）与えられた細胞を必要に応じて培地中で培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）又は（ｂ）で与えられた細胞から、蛍光活性化細胞選別によって４８８ｎｍ又は約４８８ｍｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて検出される自家蛍光発光を与える細胞（ＦＬ１＋細胞）をサブ試料中に単離する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において蛍光性を示さず、かつＦＬ３及びＦＬ４チャネルの少なくともいずれかにおいて検出される蛍光においてわずかな正方向へのシフトを示す細胞（ＦＬ１０細胞）を蛍光活性化細胞選別によって別のサブ試料中に単離する工程と、
（ｅ）工程（ｃ）及び（ｄ）において得られた単離された細胞のサブ試料のそれぞれから死細胞を除外する工程と、
（ｆ）工程（ｃ）で得られた細胞のサブ試料を工程（ｅ）における処理後にプールする工程と、
（ｇ）工程（ｄ）で得られた細胞のサブ試料を工程（ｅ）における処理後にプールする工程と、を含む。
【００２９】
ＦＬ１＋グリオーマ細胞集団とＦＬ１０グリオーマ細胞集団との間のインビトロ及びインビボでの表現型及び挙動における相違は、ＦＬ１＋細胞は、幹細胞性に関連した遺伝子に富み、多能性を有し、ＦＬ１０細胞を生成可能であり、更に長期にわたる自己更新能の維持の要因となっていることを証明した更なる特性評価によって支持されている。ＦＬ１０由来培養ではＦＬ１＋細胞は、一切生成しないことから、このことは、ＦＬ１０細胞がＦＬ１＋細胞集団から誘導され、数代にわたって生存可能であるが、ＦＬ１＋からＦＬ１０状態に一旦切り替わると自家蛍光性を再び獲得することはできないことの更なる証拠を与えるものである。したがって、この方法及びこの単離された細胞集団は、グリオーマ開始細胞を呈する癌の治療において有用となりうる阻害剤などの薬剤を試験するための確実な方法を与えるものである。
【００３０】
本出願人らが設計した抗ＧＩＣ薬剤をスクリーニングするための特定の新規なインビトロ再発アッセイ（図５）を用い、本出願人らは、酸化的な細胞のエネルギー生産過程を標的とした阻害剤などの薬剤が、ＣＩＣを根絶するうえで確実で長期間持続する効果を示すことを見出した。したがって、ミトコンドリア複合体Ｉ又はＩＩＩにおいてＮＡＤＨが細胞のＡＴＰに変換されることを防止し、Ｈ２Ｏ２の生成を誘導する阻害剤は、グリオーマ開始細胞に対する新規かつ特異的な治療方法と考えられる。
【００３１】
ＧＩＣを同定するための上記に述べた安定的な技術を用い、本出願人らは、特異的かつ有効な抗ＧＩＣ薬剤を同定するための安定的かつ確実なスクリーニングツールを更に開発した。
【００３２】
本出願人らの上記に述べた技術、並びに特異的な抗ＣＳＣ薬剤（抗癌幹細胞薬剤）を試験及び評価するために設計された本出願人らのインビトロアッセイを利用することにより、本出願人らは、好気的経路によって生成されるエネルギーの生産を阻害することがＣＩＣ集団の全体を殺滅するうえで充分である（殺滅は、アポトーシスによってではなくＣＩＣを餓死させることによって行われる）ことを示した。ミトコンドリアの複合体Ｉ及びＩＩＩのレベルにおけるような電子伝達系を妨害する阻害剤は、インビトロ及びインビボで全てのグリオーマ開始細胞を殺滅する非常に優れた能力を示す。複合体Ｉ及びＩＩＩの阻害により活性酸素種（ＲＯＳ）及びフリーラジカルが大量に生成することから、ＣＩＣは、ＲＯＳが蓄積すること、又は解毒システムが飽和することによっても殺滅される可能性が高い。
【００３３】
癌細胞株及び幹細胞性の指標としてＣＤ１３３などの幹細胞株マーカーを選択的に使用する他の方法とは異なり、本出願人らの技術は、一切のマーカーの使用とは無関係にヒト試料から誘導される初代培養細胞及びＣＩＣの単純かつ偏向のない検出に依存したものである。したがって、本出願人らは、このような方法を利用してグリオーマの癌幹細胞を根絶するための潜在的な治療薬をスクリーニング及び評価するためのインビトロ再発アッセイを設計及び開発したものである。ＣＩＣ、原発性グリオーマ細胞、及び正常な脳細胞を、最大で２０日間、好ましくは１０日間又は２０日間にわたって阻害剤などの薬剤に曝露した（処理：Ｔ）後、阻害剤などの薬剤を加えない回復段階（回復：Ｒ）に移す。この場合の新規性は、任意の薬剤の有効性を試験するために用いられる幹細胞性の指標、及び、特異的な抗ＣＳＣ薬剤が同定される可能性にある。
【００３４】
基本的には、以下の条件を満たすものであればいかなる薬剤又は阻害剤も有効な抗ＣＳＣ薬剤であると考えられる。即ち、
１）ＧＩＣ（ＦＬ１＋細胞）の生存率が、前記薬剤又は阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣ（ＦＬ１＋細胞）の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、
３）正常な脳細胞の生存率が、前記薬剤又は阻害剤に曝露される間又は曝露後に維持可能且つ回復可能である。
【００３５】
好ましくは前記薬剤又は阻害剤は、電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤である。
【００３６】
本出願人らのインビトロ再発アッセイの概念の証明及び検証として、γ線照射、及びＧＢＭに対して現在使用されている主要な細胞毒性薬であるテモゾロミドの効果について試験を行った。ＦＢＳで培養したグリオーマ細胞と異なり、約４０％のＦＬ１＋細胞が２５Ｇｙの照射に対して耐性を示して生存し、したがって遺伝毒性ストレス後３０日以内に回復し、これにより、放射線は、ＧＩＣの亜集団をほとんど標的とせず、むしろ腫瘍バルクからの活発に分裂している細胞を標的とすることが確認された。グリオーマスフェア細胞（ｇｌｉｏｍａｓｐｈｅｒｅ ｃｅｌｌ）のＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態についてＨｅｇｉ ｅｔ ａｌ， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ２００５， ３５２ （１０） ９９７−１００３に述べられるように最初に試験が行われ、グリオーマスフェア細胞は、テモゾロミドに対する感受性を有することが予測されている。しかしながら、臨床的に使用される用量の５倍に当たる２５μＭのテモゾロミドにより最大で２０日間処理した後であっても、ＦＬ１＋細胞の３０％は依然生存しており、２０日間以内に回復可能であった（０．２＜Ｒ＜１）。
【００３７】
ＧＢＭは、表現型的及び分子的な観点から本質的に高度に異種性の腫瘍である。活性化又は抑制のされ方の異なるシグナル伝達経路のうち、約６０％のＧＢＭにおいて上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達カスケードが増幅／過剰発現され、約６５％のＧＢＭにおいてＰ１３Ｋ／ＡＫＴ／ＰＴＥＮシグナル伝達カスケードがＰＴＥＮの発現量の変化を示す。同様に、予後の不良及び放射線治療に対する耐性にはＰＴＥＮの消失を伴うようである。５μＭのエルロチニブによる長期の治療は、ＥＧＦＲの状態とは無関係に２／６のＧＢＭのみにおいて５０％よりも多くのＦＬ１＋細胞に細胞死を誘導し、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅がゲフィニチブ又はエルロチニブなどのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する反応性とは相関していないことが確認された。更に、全てのグリオーマスフェア培養が１０日間以内に治療から回復し、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を受容体のレベルで阻害することは有効ではないことが示唆された。
【００３８】
グリオーマなどの幾つかのヒトの腫瘍一般においてＮｏｔｃｈ、ＳＨＨ−Ｇｌｉ及びＷＮＴ、ｍＴＯＲなどの主要な発生経路が示唆されているが、ヒト癌幹細胞におけるこれらの役割を体系的に示した研究は希有である。より詳細には、シクロパミンを用いてＳＨＨ−Ｇｌｉの活性を阻害するか、又はγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴを用いてＮＯＴＣＨシグナル伝達経路の活性を阻害することにより、癌開始細胞集団の増殖及び自己更新性に潜在的に影響を及ぼすことによって腫瘍の増殖が低減される。同じではないが同様にして、テムシロリムスを用いたｍＴＯＲの阻害、又は５μＭのシクロパミン若しくは５μＭのＤＡＰＴを用いてＳＨＨ−Ｇｌｉ及びＮｏｔｃｈなどの発生経路を標的とすることはそれぞれ生存ＦＬ１＋細胞の数の減少を引き起こす。この場合もやはり、残留したＣＩＣが２０日間の治療後の後であっても認められ、ＣＩＣ集団が速やかに回復したことから、これらの薬剤は有効ではないものと考えられる。
【００３９】
活性ミトコンドリアの数、代謝産物の含量、及び嫌気的エネルギー生産経路の阻害剤の影響に基づけば、ＦＬ１＋細胞は、ＦＬ１０細胞と異なり、好気的経路を使用してエネルギーを選択的に生産する傾向にある。したがって、本出願人らは、ミトコンドリア活性を阻害する高い能力を有するいかなる薬剤もＣＩＣ内におけるエネルギー生産を阻害するはずであり、これによりＣＩＣが殺滅される可能性が高いという概念を提唱した。この概念を、本発明のインビトロ再発アッセイを用い、電子伝達系の阻害剤（レトノン、アンチマイシンＡ、アナフラニールなど）及びプロトンポンプの阻害剤（オリゴマイシンＡ／Ｂ）についてスクリーニングすることによって検証した。５μＭのレトノン又はアンチマイシンＡ又はアナフラニール（クロミプラミン）又はオリゴマイシンＡ／Ｂへの２０日間にわたる曝露により、全てのＦＬ１＋細胞が殺滅される。治療法の開発及び治療方法の設計に関し、本出願人らは、好気的経路を阻害する薬剤への曝露期間を短縮したところ、１０日間の曝露であってもＣＩＣの細胞巣の殺滅には充分であることを観察した。このような阻害剤のＣＩＣに対する特異性を試験するため、正常脳細胞及び原発性グリオーマ細胞（ＦＢＳ培養）を上記に述べたミトコンドリア薬剤に１０日間曝露した。正常脳細胞及び原発性グリオーマ細胞もやはりオリゴマイシンＡ／Ｂに感受性を有することが見出されたが、このことは、ミトコンドリアの複合体ＩＶの活性の阻害は正常な脳細胞の生存率に影響することから適切ではない可能性を示唆するものである。アンチマイシンＡ又はアナフラニールへの曝露、及び程度はより低いがロタニンへの曝露は、増殖性及び分裂性にわずかに影響するものの、正常脳細胞の生存を可能とし、したがって治療薬としてより良好な展望が開けている。興味深い点として、ＦＢＳ中で培養された原発性グリオーマ細胞は、こうした薬剤に対する耐性を示し、このことは腫瘍バルクからの細胞がＣＩＣとは異なる代謝を有しているという観察を更に裏付けるものである。
【００４０】
本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤であって、以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすことにより、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤がＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害するような阻害剤を提供する。
【００４１】
好ましくは前記腫瘍グリオーマの除去は、腫瘍グリオーマのバルクの区域切除である。
【００４２】
好ましくは、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）における前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ＩＣ２用量の最大で１０倍に相当する用量で投与される。最も好ましくは、前記ＩＣ２用量は、０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００４３】
前記グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍は、グリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、再発癌、及び転移性癌からなる群から好ましくは選択される。
【００４４】
「試料」なる用語は、例えば、ヒトグリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、及び上衣腫などの癌を罹患しているか、再発癌を有しているか、あるいは癌を罹患していることが疑われる患者（哺乳動物の患者、より詳細にはヒト患者など）からの組織又は体液試料などの、任意の供給源からの組織又は体液試料を含む。別の実施形態では、試料は、転移性癌を罹患しているか、又は例えばメラノーマ、乳癌、結腸癌、肺癌から脳への転移などの癌を罹患していることが疑われる患者（哺乳動物の患者、より詳細にはヒト患者など）からの組織又は体液試料などの、任意の供給源からの組織又は体液試料を含む。
【００４５】
「癌幹細胞試料」なる用語は、本発明に基づくＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞の混合物を含むグリオーマスフェア培養（実施例で述べるようにして培養したもの）、又は本発明に基づく方法によって細胞を単離した、２種類の単離ＦＬ１＋又はＦＬ１０細胞集団を含む試料から選択される試料を意味する。
【００４６】
「腫瘍細胞試料」なる用語は、腫瘍試料から新鮮に解離させた細胞試料、又は、例えば幹細胞培地及びこれに類する培地中で培養されたものなどのグリオーマスフェア培養、高血清培地及びこれに類する培地中で培養されたものなどの接着細胞培養、及び、分化培地及びこれに類する培地中で培養されたものなどの分化細胞培地などの、細胞を腫瘍試料から解離させた後に培養した細胞試料を含む。
【００４７】
本明細書で用いるところの「腫瘍」なる用語は、細胞の異常増殖によって形成された新生物又は充実性病変のことを指す。腫瘍は良性、前悪性、又は悪性でありうる。腫瘍は、中枢及び末梢神経系、脳への転移、肺転移、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌、結腸癌及び卵巣癌などと関連しうる。更に、腫瘍なる用語には、グリオーマ、神経鞘腫、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、メラノーマなどの腫瘍が含まれる。
【００４８】
「幹細胞培地及びこれに類する培地」なる用語には、新鮮に解離させた組織試料から誘導された癌幹細胞（グリオーマスフェアとも呼ばれる）を増殖させた培地が含まれる。例えば、神経幹細胞培地には、１／１０００のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、Ｂ２７（１／５０、ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））又はＢＩＴ９５００（２０％、ステムセルテクノロジーズ社（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））、ヒト組換えＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、及び塩基性ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））が含まれる。
【００４９】
「高血清培地及びこれに類する培地」なる用語には、新鮮に解離させた組織試料から誘導された接着性培養物を増殖させた培養（例えばＦＢＳ１０％、１／１０００のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）））が含まれる。
【００５０】
「分化培地及びこれに類する培地」なる用語には、癌幹細胞をその多能性を分析するために播種する培地が含まれる（例えば、３７℃で一晩、Ｈ２Ｏ中に１：１００で希釈したポリＬオルニチン及びラミニン（シグマ社（ｓｉｇｍａ））の混合物でコーティングしたプレート。細胞は、解離させ、１／１，０００のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、Ｂ２７（１／５０、ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））又はＢＩＴ９５００（２０％、ステムセルテクノロジーズ社（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｈａｍ’ｓ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）中に１０細胞／μＬの密度で播種した。）。
【００５１】
「ＦＬ１チャネル」なる用語は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．に述べられるような蛍光の縦方向の検出チャネルである。通常、４８８ｎｍの励起波長では、自家蛍光は、５２０ｎｍ又は約５２０ｎｍの波長のＦＬ１チャネルにおいて検出される。
【００５２】
「ＦＬ３チャネル」なる用語は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．に述べられるような蛍光の側方方向（４５℃）の検出チャネルである。通常、４８８ｎｍの励起波長では、蛍光は、６３０ｎｍよりも大きな波長のＦＬ３チャネルにおいて検出される。
【００５３】
「ＦＬ４チャネル」なる用語は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．に述べられるような蛍光の側方方向の検出チャネルである。通常、６３２ｎｍ又は約６３２ｎｍ、又は５４６ｎｍ又は約５４６ｎｍの励起波長では、蛍光は、６３０ｎｍよりも大きな波長のＦＬ４チャネルにおいて検出される。
【００５４】
「正常な脳細胞」なる用語は、正常な生物学的機能を有し、腫瘍などのいかなる疾病にも疾患にも罹患していない健康な脳細胞のことを指す。「正常な脳細胞の生存率が維持可能かつ回復可能である」なる用語は、正常な脳細胞がその正常な生物学的機能を維持し、本発明の阻害剤に曝露される間、及びその後に障害されないことを意味する。
【００５５】
「ＦＬ１＋細胞」若しくは「ＦＬ１−Ｈ細胞」又は「ＧＩＣ」若しくは「ＣＩＣ」なる用語は、本発明に基づく方法による蛍光活性化細胞選別により、特に特定の形態（高いＦＳＣ及び低い／中度のＳＳＣ）、及び細胞のサブ試料中へのレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて検出される自家蛍光発光を与える細胞を選択的に検出及び選別することによって選別される細胞のことを指す。このサブ試料では、ＦＬ１チャネルにおいて検出されるこうした自家蛍光発光を与える細胞の亜集団が、４８８ｎｍ（例えばアルゴンなどの青色レーザー光線）の波長での励起時に約５２０ｎｍにおいて検出される。より詳細には、ＦＬ１チャネルにおけるＦＬ１自家蛍光がダイクロイックミラーにより５３０ｎｍ±１５、より厳密にはダイクロイックミラーにより５１５ｎｍ±５で検出され、ＦＬ１自家蛍光発光のスペクトルの特異性が確認される。
【００５６】
「ＦＬ１０細胞」若しくは「非ＦＬ１−Ｈ細胞」又は「非自家蛍光細胞」なる用語は、本発明に基づく方法による蛍光活性化細胞選別により、特に特定の形態（低い／中度のＦＳＣ及び中度の／高いＳＳＣ）を与える細胞を選択的に検出及び選別することによって選別される細胞であり、ＦＬ１チャネルにおいて蛍光性を示さず、ＦＬ３又はＦＬ４チャネルにおいて検出される蛍光がわずかに正方向にシフトする細胞のことを指す。
【００５７】
「ＦＬ１−細胞」又は「原発性グリオーマ細胞」若しくは「ＦＢＳ培養グリオーマ細胞」なる用語は、１０％ＦＢＳ培地中で培養され、接着性を有し、本発明に基づく方法による蛍光活性化細胞選別によって選別されない細胞のことを指す。これらの細胞は、特定の形態（中度のＦＳＣ及び高いＳＳＣ）、高い細胞質／核比（＞１）を示し、ＦＬ３又はＦＬ４チャネルのいずれにおいてもＦＬ１チャネルの蛍光が検出されない細胞である。
【００５８】
「高いＦＳＣ」又は「高いＦＳＣ−Ｈ」又は「高いＦＳＣ−Ａ」なる用語は、前方散乱を意味し、粒子サイズ及び速度測定（細胞の直径が５μｍ〜７μｍ）に相当する。
【００５９】
「低い／中度のＦＳＣ」又は「低い／中度のＦＳＣ−Ｈ」又は「低い／中度のＦＳＣ−Ａ」なる用語は、前方のサイズ散乱を意味し、細胞の大きさ（細胞の直径＜５μｍ〜７μｍ）に相当する。
【００６０】
「中度の／高いＳＳＣ」又は「中度の／高いＳＳＣ−Ｈ」又は「中度の／高いＳＳＣ−Ａ」なる用語は、側方又は直交散乱を意味し、細胞の複雑度及び顆粒含有量（細胞質が多く、顆粒状）に相当する。
【００６１】
「低い／中度のＳＳＣ」又は「低い／中度のＳＳＣ−Ｈ」又は「低い／中度のＳＳＣ−Ａ」なる用語は、側方又は直交散乱を意味し、細胞の複雑度及び顆粒含有量（細胞核の周囲に非顆粒状の拘束された細胞質）に相当する。
【００６２】
通常、ＦＬ１＋又はＦＬ１−Ｈ細胞は、「高いＦＳＣ」又は「高いＦＳＣ−Ｈ」又は「高いＦＳＣ−Ａ」と、「低い／中度のＳＳＣ」又は「低い／中度のＳＳＣ−Ｈ」又は「低い／中度のＳＳＣ−Ａ」との組み合わせを有し、したがって１よりも大きい核／細胞質の直径比を有する。
【００６３】
通常、ＦＬ１０又は非ＦＬ１−Ｈ細胞は、「低い／中度のＦＳＣ」又は「低い／中度のＦＳＣ−Ｈ」又は「低い／中度のＦＳＣ−Ａ」と、「中度の／高いＳＳＣ」又は「中度の／高いＳＳＣ−Ｈ」又は「中度の／高いＳＳＣ−Ａ」との組み合わせを有し、したがって１よりも小さい核／細胞質の直径比を有する。
【００６４】
「幹細胞培地」なる用語は、幹細胞の培養に適した培地である。通常、幹細胞培地は、例えば分裂促進因子（塩基性ＦＧＦ−２、ＥＧＦ）、及び無添加培地（Ｂ２７又はＢＩＴ９５００）を含む。
【００６５】
「スフェア形成性」なる用語は、対称的又は非対称的に分裂してクローンを形成する単一の幹細胞の能力のことである。このクローンは、スフェアと呼ばれ、スフェアがグリオーマ腫瘍から誘導される場合には、より正確にグリオーマスフェアと呼ばれる。この能力は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるような自己更新アッセイとも呼ばれるクローンアッセイによって測定することができる。自己更新アッセイは、クローンを形成する単一の細胞の能力を測定するものであるが、全てのクローンがスフェアを形成するわけではない。幹細胞又は正常な発生過程にある初期の幹細胞又は特定の癌のタイプのみがこのようなスフェア形成能を示し、この特異性は、神経幹細胞及びグリオーマ幹細胞において存在している。
【００６６】
「多能性」なる用語は、複数の細胞型に分化する細胞の能力のことであり、例えば中枢神経系からの細胞では、多能性とはＧＦＡＰ（星状細胞）、ＮＥＳＴＩＮ（神経前駆細胞）、ＴＵＪ１（神経細胞）などの細胞に分化する能力のことを指す。
【００６７】
「回復段階」なる用語は、ＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞を処理後に幹細胞培地中に再び移すことである。
【００６８】
「再発」なる用語は、薬剤による治療後に癌幹細胞が生存し、その内在的性質（例えばＦＬ１チャネルにおける自家蛍光、スフェア形成能）、その分割能を維持し、更に場合により更なる性質（例えば、分化マーカーの発現によって測定される分化能、幹細胞性マーカーの発現によって測定される幹細胞性、及び、酸化還元比色アッセイ（ＭＴＳ）ＮＡＤ／ＮＡＤＰＨ＋酵素の活性及び比によって測定される代謝特性）を維持する能力のことを意味する。再発の測定は、本発明に基づくスクリーニングアッセイによって行われ、図５にまとめて示すように治療後のＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の存在及び比率の分析を行う。再発レベルは、回復期間において治療後に生存している癌幹細胞の比率、及び癌幹細胞の再発が観察されない回復期間の長さに基づいて評価される。
【００６９】
本明細書において使用するところの「有効量」なる用語は、対象とされる組織、システム、動物又はヒトにおいて生物学的又は医学的反応を引き起こす本発明に基づいた少なくとも１種類の化合物又はその医薬配合物の量のことを指す。一実施形態では、有効量は、治療される疾患又は状態の症状を緩和するための「治療上の有効量」である。本明細書においては、この用語は、疾患の進行を低減するうえで、特に再発プロセスを低減又は阻害するうえで（例えば再発の発生を予防、又は再発プロセスの頻度又は程度を低下させる）、及び／又は対象とする反応を生じ、引き起こすうえで充分な量の活性化合物を含む（即ち「阻害有効量」）。特定の実施形態では、本発明に基づく阻害剤、方法、及び使用は、腫瘍、腫瘍の増殖、再発及び転移の起点となるＦＬ１＋細胞集団を減少又は更には根絶することが可能である。
【００７０】
本発明に基づく治療の「有効性」なる用語は、本発明に基づく使用又は方法に応じた疾患の経過の変化に基づいて測定することができる。例えば、本発明に基づく治療の有効性は、以下の２つの基準に依存する。即ち、
− １０又は２０日後に生存ＦＬ１＋細胞の少なくとも５０％の低減によって測定されるＦＬ１＋細胞を殺滅する能力、
− 治療後、最小で２０日間までの生存ＦＬ１＋細胞の数によって測定される回復ＦＬ１＋細胞が存在しないこと（ｒ＜０．２）、である。
本発明に基づく治療の有効性は、患者の状態の改善、及び本発明に基づく治療の患者に対する正の影響によって測定することができる。
【００７１】
「癌幹細胞再発を阻害する能力」なる用語は、治療後、及びこの治療後の回復期間の観察後の癌幹細胞試料中の癌幹細胞の数を減少させることが可能な薬剤の性質のことを指す。好ましくは、癌幹細胞の再発を阻害する能力とは、癌幹細胞試料から癌幹細胞を死滅させ、回復期間の観察後にこれらの細胞の再発を防止する薬剤の能力のことである。
【００７２】
本明細書において互換可能に用いられる「抗腫瘍剤」又は「治療剤」又は「薬剤」なる用語には、例えば、腫瘍の増殖を低減又は阻止する、癌の再発を予防、低減又は阻止するといった、腫瘍の治療において有効な、腫瘍における治療活性を有しうる分子又は化合物が含まれる。これには、癌におけるその治療活性が知られる薬剤、又は癌における治療活性を有する可能性について研究されている薬剤が含まれる。「抗腫瘍剤」又は「治療剤」又は「薬剤」なる用語には、任意の分子（例えば化学的、生物学的）、又は任意の外因性／環境因子（例えば機械的因子、放射線）が更に含まれる。
【００７３】
本明細書において使用するところの「治療」及び「治療する」並びにこれに類する語は、所望の薬学的及び生理学的効果を得ることを一般的に意味する。効果は、癌（グリオーマ）などの疾患、その症状又は状態を予防又は部分的に予防するという意味において予防的なものであってもよく、かつ／又は疾患、状態、症状、又は疾患に帰する副作用の部分的又は完全な治癒という意味において治療的なものであってもよい。本明細書において使用するところの「治療」なる用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療法を網羅するものであり、（ａ）例えば手術（切除又は部分切除）、放射線治療、及び化学療法の少なくともいずれかのような治療を既に行っているか、あるいは既に疾患に罹患している可能性があるが疾患を有するとの診断は下されていない患者において癌（グリオーマ）などの疾患が発生することを予防し、（ｂ）癌（グリオーマ）などの疾患を阻害する、即ちその成長を阻止するか、あるいは疾患を緩和する、即ち疾患及びその症状又は状態の少なくともいずれかの退行を引き起こすことが含まれる。
【００７４】
本発明の文脈において使用される「阻害剤」なる用語は、生体分子の活性を完全又は部分的に阻害する分子として定義される。
【００７５】
「ミトコンドリア活性の阻害剤」なる用語は、酸化的な細胞のエネルギー生産プロセスの阻害剤、通常は、好気的な細胞代謝の阻害剤として定義される。酸化的な細胞のエネルギー生産プロセスの阻害剤には、細胞のトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路即ちクエン酸回路（炭水化物、脂肪及びタンパク質を二酸化炭素と水に化学的に変換して利用可能なエネルギーの形態とする）の阻害剤、又は細胞の酸化的（好気的）解糖系（細胞質中でのグルコースのピルビン酸への代謝）又は解糖系の基質（ピルビン酸）の酸化的リン酸化の阻害剤が含まれる。一般的に、ミトコンドリア活性の阻害剤は、電子伝達系又は酸化的リン酸化の阻害能を示すことにより、インビトロ及びインビボの再発アッセイにおいて活性酸素種（ＲＯＡ）の生成につながる薬剤である。
【００７６】
本明細書において使用するところの電子伝達系の活性の阻害剤は、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）又はその誘導体であってよい。ＤＰＩは、フラボタンパク質に強力に結合することから、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、ＮＡＤＰＨ−ユビキノン酸化還元酵素、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、及びＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０酸化還元酵素などの幾つかの重要な酵素の強力かつ特異的な阻害剤である。
【００７７】
好ましくは前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）及びその誘導体である。
【００７８】
更に好ましくは、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤である。
【００７９】
「ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）の活性の阻害剤」なる用語には、ミトコンドリアの複合体Ｉの活性を阻害する薬剤が含まれる。例えば、酸化的リン酸化複合体（Ｉ）の阻害剤には、公知の殺虫剤であるロテノン及びその誘導体などの、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの結合部位においてミトコンドリアの複合体Ｉに結合する薬剤（Ｈｏｇａｎ ＆ Ｓｉｎｇｅｒ， １９６７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２７（３）： ３５６−６０）が含まれる。ロテノン誘導体としては、アリールアジドアモルフィゲニン、アモルフィスピロノン、テフロシン、アモルフィゲニン、１２ａ−ヒドロキシアモルフィゲニン、１２ａ−ヒドロキシダルパノール］及び６’−Ｏ−Ｄ−グルコピラノシルダルパノールが挙げられる。
【００８０】
「ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（ＩＩＩ）の活性の阻害剤」には、ミトコンドリアの複合体（ＩＩＩ）の活性を阻害する薬剤が含まれる。例えば酸化的リン酸化複合体（ＩＩＩ）の阻害剤としては、公知の抗真菌剤であるアンチマイチンＡ及びその誘導体などの複合体ＩＩＩの触媒活性を阻害する薬剤がある。アンチマイシンＡの誘導体としては、ミクソチアゾール、スティグマテリンのトリデシル類似体（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ， ４９（３５）： ５１９２−５１９５）が挙げられる。酸化的リン酸化複合体（ＩＩＩ）の阻害剤の他の例としては、セロトニン／ノルアドレナリン二重再取り込み阻害剤であるクロミプラミン（アナフラニール（登録商標））又はその誘導体、並びにイミプラミン及びクロルプロマジンなどの類似体などの公知の抗うつ剤であるあらゆるジベンゼピン誘導体が含まれる。イミプラミン及びその塩酸塩については米国特許第２，５５４，７３６号に、及びそのパモ酸塩については米国特許第３，３２６，８９６号に開示されている。イミプラミン及びその塩は、経口投与で有効なジベンゾアゼピン三環系抗うつ剤である。酸化的リン酸化複合体（ＩＩＩ）の阻害剤の更なる例は、リコシャルコン（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ）Ａ、アスコクロリン及びストロビルリンＢである。
【００８１】
セロトニン／ノルアドレナリン二重再取り込み阻害剤（ＤＳＮＲＩ）は、セロトニン及びノルエピネルフリンの両方の再取り込みを阻害するものであり、ベンラファキシン（エフェキソール（登録商標）、ベンラファキシン代謝物質のＯ−デスメチルベンラファキシン、クロミプラミン（アナフラニール（登録商標））、クロルプラミン代謝物質のデスメチルクロミプラミン、デュロキセチン（サインバルタ（登録商標））、ミルナシプラン及びイミプラミン（トフラニール（登録商標）又はジャニミン（登録商標））がある。
【００８２】
それらの化学名、商品名、構造、治療及び薬理に関する情報、及び治療上の分類は、例えばＭｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ， ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９７６， Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９６， ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ２００４ などの文献に見ることができる。
【００８３】
本発明に基づけば一般的には、阻害剤は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化複合体（Ｉ）の活性又はミトコンドリアの酸化的リン酸化複合体（ＩＩＩ）の活性のいずれかを阻害する。
【００８４】
しかしながら、スティグマテリン、ミクソチアゾール、ピエリシジン又はこれらの誘導体及び類似体などの一部の阻害剤は、複合体（Ｉ）及び（ＩＩＩ）の両方のミトコンドリア酸化的リン酸化の活性を同時に阻害することができる。上記の二重阻害剤は、より強力な阻害剤、ひいてはより低い濃度しか必要としないより強力な抗ＧＩＣ剤となりうるものである。
【００８５】
表１は、放射線治療及び化学療法において、又は臨床試験において使用される典型的な薬剤、文献における参照、及びインビトロ再発アッセイにおける用量を示す。
【００８６】
表２〜３は、好気的／嫌気的経路を標的とした薬剤、文献における参照、及びインビトロ再発アッセイにおける用量を示す。
【００８７】
好ましくは、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ロテノン、アンチマイシンＡ、イミプラミン、クロミプラミン、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ストロビルリンｂ、リコシャルコンＡ、アスコクロリン、ピエリシジン、及び／又はこれらの組み合わせ、及び／又はこれらの誘導体、及び／又は薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される。
【００８８】
例えば、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の活性の阻害剤の前記組み合わせは、ロテノンをアンチマイチンＡと組み合わせるか、又はロテノンをクロミプラミンと組み合わせたものからなる。
【００８９】
最も好ましくは、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ピエリシジン及び／又はこれらの誘導体、及び／又はこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００９０】
「ミトコンドリアのＴＣＡ回路の活性の阻害剤」なる用語には、基質の存在、内因性及び／又は外因性の最終生成物によって通常決定される化合物が含まれる。ミトコンドリアのＴＣＡ回路の活性の阻害剤は例えば、ＮＡＤＨ及びＡＴＰ、クエン酸塩、アセチルＣｏＡがある。カルシウムは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、αケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、及び更にクエン酸シンターゼなどのＴＣＡの主要な酵素を阻害する。本発明に基づけば好ましくはミトコンドリアのＴＣＡ回路の活性は、ロテノン、アンチマイシンＡ、イミプラミン、クロミプラミン、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ストロビルリンｂ、リコシャルコンＡ、アスコクロリン、ピエリシジン、及び／又はこれらの組み合わせ、及び／又はこれらの誘導体、及び／又は薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択されるミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の阻害剤などの電子伝達系の阻害剤によって間接的に阻害することもできる。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【表２】
【００９３】
【表３】
【００９４】
更なる実施形態では、本発明は、相乗効果及び累積効果の少なくともいずれかを与える本発明の異なる阻害剤の組み合わせを提供する。例えば、レトノンとアンチマイシン又はレトノンとアナフラニールといったミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の阻害剤の組み合わせとすることによって、ＧＩＣ細胞巣の全体が根絶されるように治療の効果を最適化することができる。上記で観察したように、こうした阻害剤の組み合わせによって、ＧＩＣを殺滅するうえで相乗的又は累積的に作用しうる各阻害剤の個々の用量を低減させることが可能である。このような組み合わせ及び相乗効果の例が、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ， ２００７ ａｎｄ Ｓｔｅｃｃａ ｅｔ ａｌ， ２００７に示されている。
【００９５】
「ＲＯＳ生成剤」なる用語は、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）及びフリーラジカルの濃度の増大を誘導することが可能な薬剤のことである。一般的にこうした薬剤としては、シンナムアルデヒド、過酸化水素、アクチノマイシンＤ及びカンプトテシンが挙げられる。
【００９６】
本明細書で使用するところの「電子伝達系」（ＥＴＣ）とは、一群の介在する生化学反応によって、電子供与体（ＮＡＤＨなど）と電子受容体（Ｏ２など）との間の化学反応を、膜をはさんだＨ＋イオンの移動と共役させるものである。Ｈ＋イオンは膜を逆に通過する際に生物における主要なエネルギー中間体であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生産するために用いられる。例えば酸素を細胞呼吸の一部として用いる多くの真核細胞は、クレブス回路、脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化の生成物からＡＴＰを生産するミトコンドリアを含んでいる。ミトコンドリアの内膜では、ＮＡＤＨ及びコハク酸からの電子が電子伝達系を通って酸素に受け渡され、酸素は水に還元される。ミトコンドリアの内部で電子伝達系に関与している４種類の膜結合複合体が特定されている。各複合体は、内膜に埋め込まれた極めて複雑な膜貫通構造である。これら４種類の複合体は、複合体（Ｉ）（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素とも呼ばれる）、複合体（ＩＩ）（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、複合体（ＩＩＩ）（シトクロムｂｃ１複合体）、及び複合体（ＩＶ）（シトクロムｃオキシダーゼ）である。
【００９７】
電子伝達系は、酸素への早期の電子漏出が生じる主要な場でもあることから、スーパーオキシド生成の主要な場であり、酸化ストレスの駆動源である。
【００９８】
本発明において使用するところの「ＴＣＡ回路（トリカルボン酸回路）」は、クエン酸回路としても知られ、酵素によって触媒される一連の化学反応であり、細胞呼吸の一部として酸素を用いる全ての生きた細胞において極めて重要である。真核細胞では、ＴＣＡ回路はミトコンドリアの基質に存在している。
【００９９】
「腫瘍グリオーマのバルクの除去」なる用語は、患者からの腫瘍グリオーマのバルクのあらゆる除去、剥離、又は切除のことを指す。除去は化学的、放射線又は外科的なものでありうる。好ましくはこの除去は、剥離又は切除などの外科的なものである。切除は、患者から臓器又は分泌腺の一部を除去する手術である「区域切除」（又は区域切除術）であってよい。区域切除は腫瘍及びその周囲の正常組織を除去するために用いられる場合もある。
【０１００】
「ＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害する」なる用語は、栄養素からの生化学的エネルギーをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換するためのグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）内で起きる代謝反応及びプロセスを阻害することを指す。通常、エネルギーの生産を阻害することは細胞が飢餓状態にあることを意味する。
【０１０１】
「再発癌」又は「再発腫瘍」なる用語は、通常は癌が検出されない一定期間の後に再発した（再び生じた）例えばグリオーマなどの癌のことを指す。癌は最初の（原発）腫瘍と同じ場所、又は患者の体内の別の場所に再発しうる。
【０１０２】
「腫瘍減量因子」（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）なる用語には、腫瘍バルク（例えばＦＬ１０及びＦＬ１−細胞）から癌細胞を殺滅することを可能とする任意の分子（例えば化学的、生物学的）若しくは任意の外因性／環境性因子（例えばγ線照射）又は従来の手術が含まれる。
【０１０３】
「標準的放射線治療」なる用語は、悪性細胞を駆逐するための癌治療の一環としての電離放射線の使用のことを指す。好ましくは電離放射線は、γ線照射である。放射線治療を手術、化学療法、ホルモン療法、又はこれらの組み合わせと組み合わせることも一般的に行われる。最も一般的な種類の癌は、放射線治療で通常治療することができる。正確な治療の意図は（治療、アジュバント、ネオアジュバント、姑息的治療）、腫瘍のタイプ、場所、及びステージ、並びに治療を必要とする患者の一般的な健康状態に応じて決まる。
【０１０４】
「標準的化学療法」なる用語は、一般的に特定の化学療法／化学的薬剤を使用した癌の治療法のことを指す。化学療法薬とは、癌を治療する目的で一般的に使用される医薬品のことを指す。癌の治療を目的とした化学療法薬としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、イフォスファミド、パクリタキセル、ゲムシタビン、ドセタキセル、及びイリノテカン、並びにシスプラチン及びカルボプラチンなどの白金系抗癌剤が挙げられる。他の化学療法のクラスには、ゲフィチニブ、イマチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤、ロナファルニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、エベロリムスなどの哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の阻害剤、ベバシズマブ、スニチビド（ｓｕｎｉｔｉｂｉｄ）及びシレンジチドなどの血管新生阻害剤、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴの阻害剤が含まれる。より詳細には、本発明の化学療法薬としてテモゾロミド又はカルムスチンなどのアルキル化剤が挙げられる。本発明に基づけば、標準的な化学療法用の好ましい薬剤は、テモゾロミド及びベバシズマブである。
【０１０５】
グリオーマの標準的放射線治療及び化学療法は、同時併用化学放射線療法であってもよい。「同時併用化学放射線療法」なる用語は、これら２つの治療法（化学療法及び放射線治療）が同時に、又は例えば順次若しくは同日などにほぼ同時に行われる場合に用いられる。グリオーマの別の標準的放射線治療及び化学療法は、テモゾロミドと放射線治療を同時併用した補助的な複合化学放射線療法であってもよい（ＴＭＺ／ＲＴ→ＴＭＺ）（Ｓｔｕｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２００５， ２００９）。
【０１０６】
グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかに関連した本発明の方法においては、患者は腫瘍グリオーマのバルクを以前除去していることが重要である。実際、初期の主症状（発作、局所神経障害、頭蓋内圧亢進の兆候、人格変化）に応じて、特別な経過観察を計画し、画像診断を行うことで頭蓋内腫瘤の放射線医学的な発見にしばしばつながる。放射線医学的所見及び患者履歴は、腫瘍のタイプ及び病因を示唆するものであるが、確定診断は生検又は、完全摘出後の病理学的検査によって下されるものである。したがって、例えば部分切除（生検又は完全摘出）による腫瘍グリオーマのバルクの除去は、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与に常に先立って行われる。例えば、腫瘍グリオーマのバルクの除去は、標準的な手術方法によって行うことが可能である。この腫瘍減量工程により、グリオーマ開始細胞（高グレードグリオーマでは腫瘍グリオーマのバルクの最大で５％〜７％）、及び基本的に腫瘍グリオーマ細胞、マクロファージ、内皮細胞を含む腫瘍の残部（腫瘍グリオーマのバルクの約９３％〜９５％）を除去することが可能である。
【０１０７】
更なる実施形態では、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与は、腫瘍グリオーマのバルクを除去する手術の後に再発の予防又は防止策として行われる。
【０１０８】
グリオーマ開始細胞の代謝は、グリオーマのバルクの細胞及び正常な脳細胞とは異なることから、腫瘍減量を目的とした特定の因子（ＦＬ１０細胞及びＦＬ１−細胞を根絶する）とグリオーマ開始細胞の特定の阻害剤（ＦＬ１＋細胞を根絶する）との組み合わせは、グリオーマの増殖及び再発を根絶するための有利な方法となりうるものである。したがって場合に応じて、標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与の前、同時又はその後で行うことができる。標準的な化学療法が、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与と同時に行われる場合、化学療法薬は同じか又は異なる組成物中で、同じか又は異なる投与経路によって投与することができる。好ましくは標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与の前又は後に行うことができる。
【０１０９】
例えば、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与後に放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを適用することは、腫瘍形成状態（ＦＬ１＋細胞）から非腫瘍形成状態（ＦＬ１０細胞）への表現型の変化が不可逆的なものであり、分化及び細胞死に向かう運命決定と相関していることを本出願人らが観察したという事実によって支持されるものである。したがって、代替的な治療方法の１つとして、最初に、ＧＩＣにおいて好気的から好気的解糖に代謝スイッチを誘導することによって全てのＦＬ１＋細胞をＦＬ１０の表現型に変化させ、次に腫瘍減量因子（即ち放射線治療及び化学療法の少なくともいずれか）を場合に応じて神経外科手術と組み合わせて用いることによってＦＬ１０細胞及びＦＬ１＋細胞集団の全体を根絶する、というものがありうる。本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与後に放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを適用することは、ＧＩＣが標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかに耐性を示し、その後に回復するという事実によっても支持される（図６）。
【０１１０】
別の例では、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物の治療上の有効量の投与の前に標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかを適用することは、再発性グリオーマの治療及び予防の少なくともいずれかにおいて有用でありうる。
【０１１１】
本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、投与計画を更に提供する。
【０１１２】
短期間の用量反応では、ＧＩＣを増加する用量の阻害剤に４８時間曝露する。次いでＧＩＣの生存率、細胞死及び回復率を本発明に述べられる方法によって分析する。長期の治療（即ち１０〜２０日間の後に回復）用に選択される用量は、対照分子と比較して細胞死の全数の２倍の増加（即ち倍増）を誘発する阻害剤の用量に相当し、この用量をＩＣ２と称する。４８時間後に最小で５０％の細胞死を誘発する用量に相当する標準的なＩＣ５０と異なり、本出願人らのＩＣ２は、極めて低く、したがって毒性のない用量を決定することを可能とするものである。
【０１１３】
本発明に基づけば、ＩＣ２は、阻害剤に応じて０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲に好ましくは相当する。本発明に基づく投与計画は、毒性の兆候が認められない場合には、最大でＩＣ２用量の１０倍、即ち１．５７ｍｇ／ｋｇ〜３．１５ｍｇ／ｋｇとすることができる。この用量は、阻害剤の適切かつ充分な用量が血液脳関門を通過して腫瘍部位内に拡散する確率を最大とすることができる。
【０１１４】
単回投与又は複数回投与によって患者に投与される用量は、薬物動態特性、患者の状態及び特性（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、同時併用される治療、治療の頻度、及び所望の効果などの様々な因子に応じて変化しうる。
【０１１５】
治療は、通常、本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物を、通常、数時間、数日、又は数週間の間隔で複数回投与することによって行うことができる。
【０１１６】
本発明は、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者、好ましくは哺乳動物患者、最も好ましくはグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍又はグリオーマ開始細胞を呈する再発腫瘍、特定の実施形態ではヒトグリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、再発性グリオーマなどの再発癌、例えばメラノーマ、乳癌、結腸癌又は肺癌などの転移性癌を罹患したヒト患者を治療するための阻害剤、医薬組成物、及び方法を提供する。
【０１１７】
本発明は更に、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法であって、電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量を投与することを含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすことにより、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤がＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害するような方法を提供する。
【０１１８】
好ましくは前記腫瘍グリオーマのバルクの除去は、腫瘍グリオーマのバルクの部分切除である。
【０１１９】
好ましくは前記治療上の有効量は、最大でＩＣ２用量の１０倍である。最も好ましくは前記ＩＣ２用量は、０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１２０】
代替的な一実施形態では、本発明の腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法は、更に、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与の前又は後に、標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかによって治療する工程を更に含む。
【０１２１】
好ましくは、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）及びその誘導体である。更なる一実施形態では、好ましくは前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤である。
【０１２２】
好ましくは、前記グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍は、グリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、再発癌、及び転移性癌からなる群から選択される。
【０１２３】
本発明は、更に、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための医薬組成物であって、少なくとも１種類の、本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１２４】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、１種類のミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）の阻害剤と、１種類のミトコンドリアの電子伝達系の複合体（ＩＩＩ）の阻害剤との組み合わせ、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含む。
【０１２５】
本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、少なくとも１種類の、本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を本明細書に述べられる任意の形態で含有しうる医薬組成物として製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、ミョウバン、安定剤、抗微生物剤、緩衝剤、着色剤、香味剤、賦形剤、アジュバントなどの１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を更に含みうる。
【０１２６】
非経口及び腸内投与用の本発明の医薬組成物は、賦形剤、アジュバント、結合剤、崩壊剤、分散剤、潤滑剤、希釈剤、吸収促進剤、緩衝剤、界面活性剤、可溶化剤、防腐剤、乳化剤、等張化剤、安定剤、注射用可溶化剤、ｐＨ調整剤などの任意の従来の添加剤を含有することができる。
【０１２７】
本発明の阻害剤を医薬上用いることが可能な医薬組成物に加工することを容易にする許容される担体、希釈剤、及び賦形剤は、使用される用量及び濃度で被験者（患者）に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍクレゾールなど）；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンなどの単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎタンパク質複合体）；及びＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤の少なくともいずれかを含みうる。
【０１２８】
本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤は、従来用いられているアジュバント、担体、希釈剤又は賦形剤とともに医薬組成物及びその単位用量の形態とすることが可能であり、こうした形態では、いずれも経口投与用の、錠剤若しくは充填カプセルなどの固体、又は溶液、懸濁液、乳濁液、エリキシル若しくはこれらで充填されたカプセルなどの液体、又は非経口投与（皮下投与を含む）用の滅菌注射溶液の形態とすることができる。このような医薬組成物及びその単位投与形態は、更なる活性化合物又は元素とともに、又はそれなしで各成分を従来の割合で含んでよく、こうした単位剤形は使用される所望の日用量の範囲に見合った任意の適当な有効量の有効成分を含むことができる。本発明に基づく組成物は好ましくは非経口組成物である。
【０１２９】
少なくとも１種類の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を含有する本発明の医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、水性又は油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、及びエリキシルなどの液体製剤であってもよい。経口投与に適した液体剤形は、好適な水性又は非水性溶媒を、緩衝剤、懸濁及び分散剤、着色剤、香味剤などとともに含みうる。本発明の医薬組成物は、使用前に水又は他の適当な溶媒によって還元するための乾燥製品として製剤化することもできる。このような液体製剤は、これらに限定されるものではないが、懸濁剤、乳化剤、非水性溶媒及び防腐剤などの添加剤を含有しうる。懸濁剤としては、これらに限定されるものではないが、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／シュガーシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、及び水添食用脂が挙げられる。乳化剤としては、これらに限定されるものではないが、レシチン、ソルビタンモノオレエート、及びアカシアゴムなどが挙げられる。非水性溶媒としては、これらに限定されるものではないが、食用油、アーモンド油、ヤシ油、油状エステル、プロピレングリコール、及びエチルアルコールが挙げられる。防腐剤としては、これらに限定されるものではないが、パラヒドロキシ安息香酸メチル又はプロプル及びソルビン酸が挙げられる。更なる材料及び加工方法などについては、本明細書に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０００， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの第５部に記載されている。
【０１３０】
一実施形態では、本発明に基づく患者は、グリオーマ開始細胞を呈する癌を罹患した患者である。特定の一実施形態では、本発明に基づく患者は、ヒトグリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、又は上衣腫を罹患している。別の特定の実施形態では、本発明に基づく患者は、再発性グリオーマなどの再発癌を罹患している。更なる実施形態では、本発明に基づく患者は、例えばメラノーマ、乳癌、結腸癌又は肺癌などの転移性癌を罹患している。
【０１３１】
本発明の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、又はこれを含有する医薬組成物は、非経口又は腸内経路などの様々な経路から投与することができる。非経口投与には、静脈内、筋内、動脈内、又は脳内投与が含まれる。腸内投与には、あらゆる経口、胃内、又は直腸内投与が含まれる。本発明の組成物の投与方法には、静脈内末梢注入、腫瘍内注入、又は対流促進投与（ＣＥＤ）（Ｂｏｂｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４， ＰＮＡＳ， ９１ （６）， ２０７６−２０８０； Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２１， ３１１−３１６）などのあらゆる種類の頭蓋内投与などの公知の抗癌剤の投与方法が含まれる。
【０１３２】
本発明の更なる実施形態に基づけば、本発明に基づく電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、及びこれを含有する医薬組成物は、単独で、又は充実性腫瘍を対象とした標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかにおいて使用される物質などの癌の治療に有用な補助剤と組み合わせて投与することができる。例えば補助剤は、テモゾリミド及びγ線照射などの腫瘍減量因子から選択される。
【０１３３】
本発明は更に、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法であって、腫瘍細胞試料から単離されたＦＬ１＋細胞及び正常な脳細胞を、スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすようなスクリーニング方法を提供する。
【０１３４】
本発明のスクリーニング方法は、原発性グリオーマ細胞を、前記スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を更に含む。
【０１３５】
本発明は更に、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たし、更に、グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の治療に有用であり、初代ＣＩＣ培養、原発性接着性グリオーマ細胞、正常細胞、並びに、ロテノン及びアンチマイシンＡからなる群から選択されるミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）又は複合体（ＩＩＩ）の活性の少なくとも１種類の標準的な阻害剤を含むキットを提供する。
【０１３６】
本明細書において提供されるキットは更に、前記阻害剤のスクリーニングを行うための方法について記載した情報資料を含んでもよい。該情報資料は更に、試験した阻害剤が本明細書の基準を満たすか否かを判定する方法についての使用説明書を含んでもよい。キットの情報資料の形態は、限定されない。多くの場合、例えば使用説明書などの情報資料は、印刷物、例えば印刷された文字、図、及び写真の少なくともいずれか、例えばラベル又は印刷シートとして提供される。しかしながら、情報資料は、点字、コンピュータ読み込み可能な資料、ビデオ録画又は音声録音などの他のフォーマットで提供することもできる。言うまでもなく、情報資料は、任意のフォーマットの組み合わせで提供することもできる。
【０１３７】
キットは、更に、試薬及び情報資料用の別々の容器、分割要素、又は区画を含んでもよい。容器は、適宜ラベリングすることができる。
【０１３８】
本明細書の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤、その使用、方法、及びキットは、癌幹細胞の集団全体を殺滅し、標準的な手術、放射線治療及び化学療法といった標準的な癌治療後の癌幹細胞の再発を防止することを可能にするという利点を有している。これらの特定の性質は、腫瘍の予防及び／又は治療との関連において特に有用な特定の利点を与えるものであり、標準的な癌の腫瘍減量因子と組み合わせて使用することが可能であることから、グリオーマ細胞及び癌開始細胞（グリオーマ開始細胞など）などの両方の癌細胞を殺滅することが可能であり、標準的な癌治療後に残存する癌幹細胞による癌の再発を防止するものである。
【０１３９】
当業者であれば、本明細書に述べられる発明には、具体的に述べられたもの以外の変形及び改変が可能である点は認識されるであろう。本発明は、こうした変形及び改変の全てを、本発明の趣旨又は本質的特徴から逸脱することなく包含するものである点は理解されるはずである。本発明は、更に、個別又はまとめて本明細書において参照、又は示した工程、特徴、組成物、及び化合物の全て、並びに前記工程又は特徴のあらゆる組み合わせ、又は任意の２以上を包含するものである。したがって本開示は、全ての態様において説明的かつ非限定的なものとみなされるべきであり、発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、均等の意味及び範囲内に含まれる全ての変更は、特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１４０】
以上の説明は、以下の実施例を参照することでより完全な理解がなされよう。しかしながらこれらの実施例は、本発明を実施する方法を例示したものであって、発明の範囲を限定することを目的としたものではない。
【実施例】
【０１４１】
一般的手順及び条件
以下の実施例は、癌開始細胞における好気的エネルギー生産経路の役割、及び癌の治療に対する癌幹細胞のミトコンドリア活性の阻害剤の潜在的な活性を確認するものである。
【０１４２】
以下の略語は、それぞれ以下の定義を示す。
Ｇｙ（グレイ）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、ｎｍ（ナノメートル）、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＢＩＴ９５００（ウシ血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＣＩＣ（癌開始細胞）、ＤＡＰＴ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェニルアセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル）、ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＦＳＣ（前方散乱）、ＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子２）、ＧＢＭ（グリオブラストーマ）、ＧＬＣ（グルコース）、ＬＤ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、ＭＧＭＴ（Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、ＭＴＳ（［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩）、ＭＴＳ（［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩）、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＢ（正常脳細胞）、ＯＤ（光学密度）、ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）、ＲＯＳ（活性酸素種）、Ｒ（回復）、ｒ（部分的回復）、ＳＣ（幹細胞）、ＳＳＣ（側方散乱）、Ｔ（治療）。
【０１４３】
使用するスクリーニング方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるものであり、以下の工程を含む。即ち、
ａ）癌幹細胞の試料を提供する工程と、
ｂ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料を薬剤で処理する工程と、
ｃ）処理された幹細胞試料を幹細胞培地中で、処理を行わずに所定のインキュベーション期間にわたってインキュベートする工程と、
ｄ）工程（ｃ）でインキュベートされた幹細胞試料から生存細胞集団を選択する工程と、
ｅ）４８８ｎｍ又は約４８８ｎｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与える細胞を蛍光活性細胞選別によって検出することによって、工程（ｄ）で単離された生存細胞集団の自家蛍光の平均レベルを測定する工程と、
ｆ）特定の形態（高いＦＳＣ及び低い／中度のＳＳＣ）を有し、工程（ｄ）で単離された生存細胞集団の４８８ｎｍ又は約４８８ｎｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与える細胞を蛍光活性細胞選別によって単離する工程と、
ｇ）特定の形態（低い／中度のＦＳＣ及び中度の／高いＳＳＣ）を有し、工程（ｄ）でＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与えず、工程（ｄ）で単離された生存細胞集団のレーザー光線による励起時にＦＬ３及びＦＬ４チャネルの少なくともいずれかにおいて細胞蛍光発光にわずかな正方向へのシフトを示す細胞を蛍光活性細胞選別によって単離する工程と、
ｈ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料の自家蛍光の平均レベルと、工程（ｅ）で測定された自家蛍光の平均レベルとを比較することによって自家蛍光性の生存細胞の比率を計算する工程と、
ｉ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期の細胞数と、工程（ｄ）で単離して得られた生存細胞集団とを比較することによって細胞死の比率を計算する工程と、
ｊ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期のＦＬ１＋細胞数と、工程（ｆ）で単離して得られた生存ＦＬ１＋細胞集団とを比較することによって生存ＦＬ１＋細胞の比率を計算する工程と、
ｋ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期のＦＬ１０細胞数と、工程（ｇ）で単離して得られた生存ＦＬ１０細胞集団とを比較することによって生存ＦＬ１０細胞の比率を計算する工程と、
ｌ）工程（ｆ）及び（ｇ）で検出された細胞集団のスフェア形成性を検出する工程と、
ｍ）癌幹細胞の再発を阻害する前記薬剤の能力によって前記薬剤の活性を判定する工程と、を含む。
【０１４４】
以下の材料を使用した。即ち、
・国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられる方法にしたがって作製された６個の初代ＣＩＣ細胞培養。
・癌細胞と呼ばれる２個の原発性接着性グリオーマ細胞、及び２個の正常脳細胞を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有し、１／１，０００ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＦＢＳ培地中で培養した。
【０１４５】
特定の薬剤がＣＩＣを殺滅する有効性を試験するための更なる条件的パラメータ（スクリーニングキットに含まれるオプション）としては、以下が含まれる。
・以下のようにして分裂細胞（Ｋｉ６７＋細胞など）の比率を調べた。処理及び回復の少なくともいずれかの後、細胞を収穫、洗浄し、ＰＦＡ４％を用いて固定した。細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％を用いて透過化処理した後、ＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％中で抗ヒトＫｉ６７抗体により染色した（回転下で３０分間、氷上でインキュベート）。細胞をＰＢＳ１ｘで２回洗浄した後、二次抗体とインキュベートし、再びＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％中で希釈した（回転下で３０分間、４℃）。最後にＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞集団内のＫｉ６７＋細胞の比率をＦＡＣＳによって求めた。
・リアルタイムＰＣＲにより以下のようにして幹細胞性遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ又はＮＯＴＣＨ１など）を発現させた。処理及び回復の少なくともいずれかの後、細胞を収穫した。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏキット（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて逆転写を行った。ＳＹＢＥＲ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、試料を７９００ＨＴ配列決定システム装置（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にかけた。プライマー配列については、Ｃｌｅｍｅｎｔ， ２００７， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ， １７， １６５−１７２を参照。
・以下のようにして少なくとも１種類の分化マーカー（ＴＵＪ１、ＭＡＰ２又はＧＦＡＰ）を発現させた。処理及び回復の少なくともいずれかの後、細胞を収穫、洗浄し、ＰＦＡ４％を用いて固定した。細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％を用いて透過化処理した後、ＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％中で抗ヒトＭＡＰ２又は抗ヒトＧＦＡＰ又は抗ヒトＴＵＪ１抗体により染色した（回転下で３０分間、氷上でインキュベート）。細胞をＰＢＳ１ｘで２回洗浄した後、二次抗体とインキュベートし、再びＰＢＳ１ｘ−ＢＳＡ１％中で希釈した（回転下で３０分間、４℃）。最後にＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞集団内の陽性細胞の比率をＦＡＣＳによって求めた。
【０１４６】
本発明に基づく方法の工程（ａ）で使用するための腫瘍細胞試料（例えばヒト由来のもの）は、採取しようとする特定の細胞に適合された標準的方法を用いて滅菌条件下で得られた対応する腫瘍組織の生検を得ることによって調製した。使用した腫瘍及び正常な脳の試料の例を下記表４及び表５に示す。
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
【表５】
【０１４９】
実施例１ 癌開始ＦＬ１＋細胞集団の酸化的細胞エネルギー生産プロセス及びミトコンドリア活性を支持するアッセイ
【０１５０】
細胞における嫌気的及び好気的経路を図１に示す。解糖系は、細胞質中でグルコースをピルビン酸に代謝するプロセスである。低酸素条件下ではピルビン酸は、ＬＤＨによって乳酸に変換される（１分子のグルコースから２分子のＡＴＰ）。
【０１５１】
トリカルボン酸（ＴＣＡ）は、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）と併せて、解糖系からのピルビン酸を使用し、ＮＡＤＨ及びＦＡＤＨ２を介してミトコンドリア内の呼吸鎖複合体に電子を伝達し、プロトン勾配ポンプによってＡＤＰからＡＴＰを生成するプロセスである（１分子のグルコースから３６分子のＡＴＰ）。
【０１５２】
癌開始細胞の代謝経路を以下のパラメータを求めることによって調べた。
【０１５３】
・活性ミトコンドリア（Ｍ７５−１３など）の数：細胞を収穫して、解離させ、洗浄した後、Ｍ７５−１３をＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘ １／１，０００ペニシリン／ストレプトマイシン中で２５０ｎＭの最終濃度に希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。染色した後、細胞をＰＢＳ１ｘで２回洗浄し、ＦａｃｓＣａｎのＦｌ１及びＦＬ３チャネルで分析した。最後にＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞集団中のＭｉｔｏ＋細胞（ＦＬ３＋細胞として同定）の比率を求めた。
【０１５４】
・ＭＴＳ酸化還元反応を用いたＮＡＤＨの濃度：解離させたグリオーマスフェアを国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるＦＬ１＋及びＦＬ１０細胞に基づいて精製した。ＮＡＤＨの濃度を、製造者の指示にしたがってＡＱｕｅｓｏｕｓ一液型細胞増殖アッセイ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて間接的に評価した。測定は、９６穴プレートリーダー（バイオラド社（Ｂｉｏｒａｄ））により４９０ｎｍで行った。
【０１５５】
・乳酸の濃度：国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるプロトコールにしたがってＣＩＣを選別した。１．５×１０５個の精製したＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の少なくともいずれかを以下の凍結融解サイクル（−８０℃で５分、３７℃で２分）を２回繰り返すことによって１００μＬの滅菌水中で溶解した。次いで溶解物を４℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。３μＬを乳酸オキシダーゼ（７００Ｕ／Ｌ）、ペルオキシダーゼ（５０８Ｕ／Ｌ）、ＤＣＢＳＡ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）及び４−アミノアンチピリン（１．１６ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合し、製造者の指示にしたがってＳＹＮＣＨＲＯＮシステム（ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて分析した。
【０１５６】
・グルコースの濃度：国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるプロトコールにしたがってＣＩＣを選別した。１．５×１０５個の精製したＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の少なくともいずれかを以下の凍結融解サイクル（−８０℃で５分、３７℃で２分）を２回繰り返すことによって１００μＬの滅菌水中で溶解した。次いで溶解物を４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。１０μＬをグルコースオキシダーゼ（１５０Ｕ／Ｌ）、変性エタノール（５％）、ヨウ化カリウム（０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ）及びモリブデン酸アンモニウム（０．０３６ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合し、製造者の指示にしたがってＳＹＮＣＨＲＯＮシステム（ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて分析した。
【０１５７】
・ピルビン酸の濃度：国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるプロトコールにしたがってＣＩＣを選別した。１．５×１０５個の精製したＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の少なくともいずれかを以下の凍結融解サイクル（−８０℃で５分、３７℃で２分）を２回繰り返すことによって１００μＬの滅菌水中で溶解した。次いで溶解物を４℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。乳酸の濃度をＨＰＬＣによって求めた。
【０１５８】
・ＬＤの濃度：国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられるプロトコールにしたがってＣＩＣを選別した。１．５×１０５個の精製したＦＬ１＋細胞及びＦＬ１０細胞の少なくともいずれかを以下の凍結融解サイクル（−８０℃で５分、３７℃で２分）を２回繰り返すことによって１００μＬの滅菌水中で溶解した。次いで溶解物を４℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。１３μＬを乳酸（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）及びＮＡＤ（１１ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合し、製造者の指示にしたがってＳＹＮＣＨＲＯＮシステム（ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて分析した。
【０１５９】
各アッセイについて、選別された細胞の３つの独立した組で３重の分析を行った。これらの実験は、ＦＬ１＋細胞がＮＡＤＨ濃度について濃縮されており、ＦＬ１０細胞と比較してより多くの活性ミトコンドリアを含んでいることから、高い代謝活性を有しうることを示すものであった（図２）。更に、ＦＬ１＋細胞では、ＦＬ１０細胞と比較してインビトロ及びインビボの乳酸濃度が低くなっている（図３Ａ）。１０日間にわたる外因性の乳酸の添加が細胞の接着性を誘導するうえで充分であり（図３Ｂ）、ＦＬ１０の表現型の方向に細胞の運命を決定した（図３Ｃ）。ＣＩＣは、ＦＬ１０と比較してＬＤ活性のレベルが高い（図３Ｄ）。
【０１６０】
細胞の酸化的経路を活性化することが知られている化合物（酸化的経路を活性化することが知られているＤＣＡ、及び細胞質のＬＤＨ３〜５を阻害することが知られているオキサミン酸、Ｍｉｃｈｅｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ９９， ９８９−９９４ ａｎｄ Ｌｅｍｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８， ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ３， ｅ１５５０を参照。）のＣＩＣに対する影響を以下のようにして試験した。
【０１６１】
短期／用量反応（４８時間）については、解離させたグリオーマスフェア細胞、接着性グリオーマ、及び正常細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１０００中に、１ｎｇ／ｍＬの低濃度の分裂促進因子、又は低濃度（２．５％）の血清とともに１０細胞／μＬで播種した。
【０１６２】
長期の処理／回復アッセイ（Ｔ１０及びＴ２０の少なくともいずれか）については、解離させたグリオーマスフェア細胞、接着性グリオーマ、及び正常細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１，０００中に、１ｎｇ／ｍＬの低濃度の分裂促進因子、又は低濃度（２．５％）の血清とともに２細胞／μＬで播種した。
【０１６３】
回復については、細胞を収穫し、ＰＢＳ１ｘで洗浄し、それぞれの標準的培地に戻した（例えばグリオーマスフェアでは、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン １％に、１０ｎｇ／ｍＬの分裂促進因子を加えたもの。原発性グリオーマ細胞及び正常脳細胞では、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン １％）。
【０１６４】
結果は、用量を増大させたＤＣＡ又はオキサミン酸への曝露後では、１０日間後であってもＦＬ１＋細胞の比に大きな変化が見られないことによって示されるように、活性な好気的経路の方向に細胞を向かわせる、即ち嫌気的経路を阻害する薬剤によってはＦＬ１＋細胞が殺滅されないことを示している（図４）。これと対照的に、ＦＬ１＋細胞は、こうした処理後に更に健康となり、分化しなくなる傾向を示した。したがって、ＦＬ１＋細胞は、好気的な解糖系に依存したＦＬ１０又はＦＬ１−細胞とは異なり、好気的経路（ＴＣＡ及び酸化的リン酸化−電子伝達系）を用いてエネルギーを選択的に生産するものと結論づけることができる。更に、好気的から好気的解糖への代謝スイッチと分化への運命決定とは密接に関係しており、両者とも不可逆的な運命である。
【０１６５】
実施例２ 潜在的な抗癌幹細胞剤（阻害剤）の試験
【０１６６】
ミトコンドリアの活性、代謝産物の含量、及び嫌気的なエネルギー生産経路の阻害剤の効果（実施例１において述べた）についての結果に基づけば、ＦＬ１＋細胞は、好気的な解糖系に依存したＦＬ１０又はＦＬ１−細胞とは異なり、好気的経路を用いてエネルギーを選択的に生産する傾向を有している。したがって、ミトコンドリアの活性の効果的な阻害能を有するあらゆる薬剤は、ＣＩＣ内のエネルギー生産を阻害するはずであり、これによりＣＩＣが殺滅されるものと考えられる。これについて、図５に示されるようなインビトロ再発アッセイにおいて以下に述べるように試験を行った。
【０１６７】
短期／用量反応（４８時間）については、解離させたグリオーマスフェア細胞、接着性グリオーマ、及び正常細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＬ、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１，０００中に、１ｎｇ／ｍＬの低濃度の分裂促進因子、又は低濃度（２．５％）の血清とともに１０細胞／μＬで播種した。
【０１６８】
長期の処理／回復アッセイ（Ｔ１０及びＴ２０の少なくともいずれか）については、解離させたグリオーマスフェア細胞、接着性グリオーマ、及び正常細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１，０００中に、１ｎｇ／ｍＬの低濃度の分裂促進因子、又は低濃度（２．５％）の血清とともに２細胞／μＬで播種した。
【０１６９】
回復については、細胞を収穫し、ＰＢＳ１ｘで洗浄し、それぞれの標準的培地に戻した（例えばグリオーマスフェアでは、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＩＴ２０％又はＢ２７（１／５０）、Ｈｅｐｅｓ ３０ｍＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン １／１，０００に、１０ｎｇ／ｍＬの分裂促進因子を加えたもの。原発性グリオーマ細胞及び正常脳細胞では、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン １，０００／１）。
【０１７０】
癌幹細胞（例えば癌幹細胞の再発）を減少及び／又は根絶するために用いられる化合物の効果は、例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４８７２号に述べられる方法により、本発明に基づいた薬剤又は阻害剤による処理後に細胞試料中の幹細胞の存在を検出することによってアッセイすることができる。即ち以下の工程を含む方法である。
ａ）本発明に基づく化合物又は方法によって処理された癌幹細胞の試料を提供する工程と、
ｂ）処理された幹細胞試料を幹細胞培地中で、処理を行わずに所定のインキュベーション期間にわたってインキュベートする工程と、
ｃ）工程（ｂ）でインキュベートされた幹細胞試料から生存細胞集団を選択する工程と、
ｄ）４８８ｎｍ又は約４８８ｎｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与える細胞を蛍光活性細胞選別によって検出することによって、工程（ｃ）で単離された生存細胞集団の自家蛍光の平均レベルを測定する工程と、
ｅ）特定の形態（高いＦＳＣ及び低い／中度のＳＳＣ）を有し、工程（ｃ）で単離された生存細胞集団の４８８ｎｍ又は約４８８ｎｍの波長のレーザー光線による励起時にＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与える細胞を蛍光活性細胞選別によって単離する工程と、
ｆ）特定の形態（低い／中度のＦＳＣ及び中度の／高いＳＳＣ）を有し、工程（ｃ）でＦＬ１チャネルにおいて自家蛍光発光を与えず、工程（ｃ）で単離された生存細胞集団のレーザー光線による励起時にＦＬ３及びＦＬ４チャネルの少なくともいずれかにおいて細胞蛍光発光にわずかな正方向へのシフトを示す細胞を蛍光活性細胞選別によって単離する工程と、
ｇ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料の自家蛍光の平均レベルと、工程（ｄ）で測定された自家蛍光の平均レベルとを比較することによって自家蛍光性の生存細胞の比率を計算する工程と、
ｈ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期の細胞数と、工程（ｃ）で単離して得られた生存細胞集団とを比較することによって細胞死の比率を計算する工程と、
ｉ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期のＦＬ１＋細胞数と、工程（ｅ）で単離して得られた生存ＦＬ１＋細胞集団とを比較することによって生存ＦＬ１＋細胞の比率を計算する工程と、
ｊ）工程（ａ）で提供された癌幹細胞試料中に存在する初期のＦＬ１０細胞数と、工程（ｆ）で単離して得られた生存ＦＬ１０細胞集団とを比較することによって生存ＦＬ１０細胞の比率を計算する工程と、
ｋ）工程（ｅ）及び（ｆ）で検出された細胞集団のスフェア形成性を検出する工程と、
ｌ）癌幹細胞の再発を阻害する前記薬剤の能力によって前記薬剤の活性を判定する工程と、を含む。
【０１７１】
試験した化合物を表２及び３にまとめる。
【０１７２】
γ線照射（図６、Ｂ１）及びＧＢＭに対して現在使用されている主要な細胞毒性薬であるテモゾロミド（図６、Ａ１及びＡ２）の効果について試験した。ＦＢＳで培養したグリオーマ細胞と異なり、ＦＬ１＋細胞の約４０％が２５Ｇｙの照射に耐性を示して生存し、したがって遺伝毒性ストレス後３０日以内に回復し、これにより放射線は、ＣＩＣの亜集団をほとんど標的とせず、腫瘍バルクからの活発に分裂している細胞を標的とすることが確認された。テモゾロミド処理に先立ってグリオーマスフェア細胞のＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態についてＨｅｇｉ ｅｔ ａｌ， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ２００５， ３５２ （１０） ９９７−１００３に述べられるようにして試験を行ったところ、グリオーマスフェア細胞は、テモゾロミドに対する感受性を有するはずであると予測された。しかしながら、２５μＭのテモゾロミドによる２０日間の処理後であっても、ＦＬ１＋細胞の３０％は、依然生存しており、したがって２０日間以内に回復可能であった（０．２＜Ｒ＜１）。
【０１７３】
５μＭのエルロチニブ（非小細胞性肺癌、膵臓癌、及び他の幾つかのタイプの癌の治療薬として知られるＥＧＦＲシグナル伝達経路の阻害剤）による長期の治療は、ＥＧＦＲの状態とは無関係に２／６のＧＢＭのみにおいて５０％よりも多くのＦＬ１＋細胞に細胞死を誘導し、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅がゲフィニチブ又はエルロチニブなどのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する反応性とは相関していないことが確認された。更に、全てのグリオーマスフェア培養が１０日間以内に治療から回復し、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を受容体のレベルで阻害することは有効ではない可能性が示唆された。同じではないが同様にして、１μＭのテムシロリムスを用いたｍＴＯＲの阻害、又はＳＨＨ−Ｇｌｉ若しくはＮｏｔｃｈなどの発生経路を（それぞれ５μＭのシクロパミン若しくは５μＭのＤＡＰＴを用いて）標的とすることにより、生存ＦＬ１＋細胞の数の減少を引き起こす。この場合もやはり、これらの薬剤ではＦＬ１＋細胞集団全体を根絶することはできず、ＦＬ１＋細胞集団は、２０日間の治療の後であっても容易に回復した。
【０１７４】
ミトコンドリアの複合体Ｉ（ロテノン）、ＩＩＩ（アンチマシンＡ）、又はＩＶ（オリゴマイシンＡ／Ｂ）のいずれかの阻害によって、ＦＬ１＋細胞集団は、殺滅される（図６Ａ〜Ｃ）。オリゴマイシンＡ／Ｂを用いて複合体ＩＶを阻害すると、複合体Ｉ（図６Ａ１及びＡ２）及びＩＩＩ（図６Ｂ１及びＢ２）を阻害した場合と異なり、正常細胞及びグリオーマ細胞を含むあらゆる種類の脳細胞が根絶される（図６Ｃ１及びＣ２）。より詳細には、複合体ＩＩＩの阻害（例えばアンチマイシンＡを用いた）は、正常な脳細胞の生存率に大きく影響しないため、ＣＩＣに対してより適切でありうる。
【０１７５】
ＣＩＣの代謝は、腫瘍バルクの細胞及び正常な脳細胞とは異なることから、腫瘍減量を目的とした特定の薬剤（ＦＬ１０及びＦＬ１−細胞を根絶する）と、ＣＩＣに対する特定の薬剤（ＦＬ１＋細胞を根絶する）とを組み合わせることは、ヒトグリオーマの増殖及び再発を根絶するうえで有利な戦略となるものと思われる。
【０１７６】
治療及び回復期間の条件培地、並びにＣＩＣを殺滅する薬剤の有効性を評価するうえで必要とされる基準については、図５Ａを参照されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した被験者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤であって、以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、を満たすことにより、
前記阻害剤が、ＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害することを特徴とする阻害剤。
【請求項２】
腫瘍グリオーマのバルクの除去が、腫瘍グリオーマのバルクの部分切除である請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
阻害剤が、最大でＩＣ２用量の１０倍に相当する用量で投与される請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
ＩＣ２用量が、０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲である請求項１及び３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項５】
阻害剤が、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）及びその誘導体である請求項１から４のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項６】
阻害剤が、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤である請求項１から５のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項７】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ロテノン、アンチマイシンＡ、イミプラミン、クロミプラミン、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ストロビルリンｂ、リコシャルコンＡ、アスコクロリン、ピエリシジン、これらの組み合わせ、これらの誘導体、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される請求項６に記載の阻害剤。
【請求項８】
組み合わせが、ロテノンをアンチマイチンＡと組み合わせるか、又はロテノンをクロミプラミンと組み合わせてなる請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ピエリシジン、これらの誘導体、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される請求項６に記載の阻害剤。
【請求項１０】
グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍が、グリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、再発癌、及び転移性癌からなる群から選択される請求項１から９に記載の阻害剤。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の少なくとも１種類の阻害剤、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含むことを特徴とする、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した被験者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための医薬組成物。
【請求項１２】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）の１種類の阻害剤と、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（ＩＩＩ）の１種類の阻害剤との組み合わせ、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法であって、グリオーマ開始細胞の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量を投与することを含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、を満たすことにより、
前記阻害剤が、ＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害することを特徴とする方法。
【請求項１４】
腫瘍グリオーマのバルクの除去が、腫瘍グリオーマのバルクの部分切除である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療上の有効量が、最大でＩＣ２用量の１０倍である、請求項１３及び１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＩＣ２用量が、０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与の前又は後に、標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかによる治療工程を更に含む、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）及びその誘導体である請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤である請求項１３から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ロテノン、アンチマイシンＡ、イミプラミン、クロミプラミン、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ストロビルリンｂ、リコシャルコンＡ、アスコクロリン、ピエリシジン、これらの組み合わせ、これらの誘導体、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組み合わせが、ロテノンをアンチマイチンＡと組み合わせるか、又はロテノンをクロミプラミンと組み合わせてなる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ピエリシジン、これらの誘導体、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍が、グリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、再発癌、及び転移性癌からなる群から選択される請求項１３から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法であって、腫瘍細胞試料から単離されたＦＬ１＋細胞及び正常な脳細胞を、スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を含み、前記阻害剤が、以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２５】
原発性グリオーマ細胞を、スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を更に含む、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法。
【請求項２６】
グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、前記阻害剤が、以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たし、且つ、グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の治療に有用であり、前記キットは、初代ＣＩＣ培養、原発性接着性グリオーマ細胞、正常細胞、並びに、ロテノン及びアンチマイシンＡからなる群から選択されるミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）又は複合体（ＩＩＩ）の活性の少なくとも１種類の標準的な阻害剤を含むことを特徴とするキット。
【請求項１】
腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した被験者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法に使用するための、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤であって、以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、を満たすことにより、
前記阻害剤が、ＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害することを特徴とする阻害剤。
【請求項２】
腫瘍グリオーマのバルクの除去が、腫瘍グリオーマのバルクの部分切除である請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
阻害剤が、最大でＩＣ２用量の１０倍に相当する用量で投与される請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
ＩＣ２用量が、０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲である請求項１及び３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項５】
阻害剤が、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）及びその誘導体である請求項１から４のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項６】
阻害剤が、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤である請求項１から５のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項７】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ロテノン、アンチマイシンＡ、イミプラミン、クロミプラミン、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ストロビルリンｂ、リコシャルコンＡ、アスコクロリン、ピエリシジン、これらの組み合わせ、これらの誘導体、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される請求項６に記載の阻害剤。
【請求項８】
組み合わせが、ロテノンをアンチマイチンＡと組み合わせるか、又はロテノンをクロミプラミンと組み合わせてなる請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ピエリシジン、これらの誘導体、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される請求項６に記載の阻害剤。
【請求項１０】
グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍が、グリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、再発癌、及び転移性癌からなる群から選択される請求項１から９に記載の阻害剤。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の少なくとも１種類の阻害剤、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含むことを特徴とする、腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した被験者においてグリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための医薬組成物。
【請求項１２】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）の１種類の阻害剤と、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（ＩＩＩ）の１種類の阻害剤との組み合わせ、及び１以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体を含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍グリオーマのバルクを以前除去した患者においてグリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行うための方法であって、グリオーマ開始細胞の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量を投与することを含み、前記阻害剤が以下の基準、即ち、
１）ＧＩＣの生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＧＩＣの回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、を満たすことにより、
前記阻害剤が、ＧＩＣによるエネルギーの生産を阻害することを特徴とする方法。
【請求項１４】
腫瘍グリオーマのバルクの除去が、腫瘍グリオーマのバルクの部分切除である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療上の有効量が、最大でＩＣ２用量の１０倍である、請求項１３及び１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＩＣ２用量が、０．１５７ｍｇ／ｋｇ〜０．３１５ｍｇ／ｋｇの範囲である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤の治療上の有効量の投与の前又は後に、標準的な放射線治療及び化学療法の少なくともいずれかによる治療工程を更に含む、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）及びその誘導体である請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤である請求項１３から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ロテノン、アンチマイシンＡ、イミプラミン、クロミプラミン、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ストロビルリンｂ、リコシャルコンＡ、アスコクロリン、ピエリシジン、これらの組み合わせ、これらの誘導体、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組み合わせが、ロテノンをアンチマイチンＡと組み合わせるか、又はロテノンをクロミプラミンと組み合わせてなる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）及び複合体（ＩＩＩ）の少なくともいずれかの活性の阻害剤が、ミクソチアゾール、スティグマテリン、ピエリシジン、これらの誘導体、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍が、グリオーマ、神経鞘腫、脳への転移、髄膜腫、上衣腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、再発癌、及び転移性癌からなる群から選択される請求項１３から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法であって、腫瘍細胞試料から単離されたＦＬ１＋細胞及び正常な脳細胞を、スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を含み、前記阻害剤が、以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たすことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２５】
原発性グリオーマ細胞を、スクリーニングしようとする阻害剤と接触させる工程を更に含む、グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法。
【請求項２６】
グリオーマ開始細胞（ＧＩＣ）の電子伝達系及びミトコンドリアのＴＣＡ回路の少なくともいずれかの活性の阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、前記阻害剤が、以下の基準、即ち、
１）ＦＬ１＋細胞の生存率が、前記阻害剤に最大で２０日間曝露される間に５０％よりも大きく低下する、
２）ＦＬ１＋細胞の回復率が、最大で２０日間の回復段階において０．２倍未満である、及び
３）正常な脳細胞の生存率が、前記阻害剤に曝露される間及び曝露後に、維持可能且つ回復可能である、
を満たし、且つ、グリオーマ開始細胞を呈する腫瘍の治療に有用であり、前記キットは、初代ＣＩＣ培養、原発性接着性グリオーマ細胞、正常細胞、並びに、ロテノン及びアンチマイシンＡからなる群から選択されるミトコンドリアの電子伝達系の複合体（Ｉ）又は複合体（ＩＩＩ）の活性の少なくとも１種類の標準的な阻害剤を含むことを特徴とするキット。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ１】
【図６Ａ２】
【図６Ｂ１】
【図６Ｃ１】
【図６Ｃ２】
【図６Ｄ１】
【図６Ｄ２】
【図６Ｅ１】
【図６Ｅ２】
【図６Ｆ１】
【図６Ｆ２】
【図７】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ１】
【図６Ａ２】
【図６Ｂ１】
【図６Ｃ１】
【図６Ｃ２】
【図６Ｄ１】
【図６Ｄ２】
【図６Ｅ１】
【図６Ｅ２】
【図６Ｆ１】
【図６Ｆ２】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５２７２３１（Ｐ２０１２−５２７２３１Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１３９８（Ｐ２０１２−５１１３９８）
【出願日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５２２３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４０３９
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２８１０１７）ユニヴァーシテ ド ジュネーヴ (1)
【出願人】（５１１２８１０２８）ホピトー ユニヴァーシテアーズ ド ジュネーヴ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５２２３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４０３９
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２８１０１７）ユニヴァーシテ ド ジュネーヴ (1)
【出願人】（５１１２８１０２８）ホピトー ユニヴァーシテアーズ ド ジュネーヴ (1)
【Ｆターム（参考）】
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