糖尿病治療の組成物と方法
【課題】生体膜を通したインスリンの輸送を促進させるキメラペプチド類と組成物、該キメラペプチド類の調製法および糖尿病患者を治療する方法の提供。
【解決手段】第１のドメインと第２のドメインを有するキメラペプチドを提供する。第１ドメインは、生体膜を越えた能動輸送を促進するトランスロケーション配列であり、第２ドメインは、インスリンペプチドの少なくとも一部である。また、キメラペプチドは、原形質膜、ミトコンドリア膜、または核膜などの生体膜をトランスロケーションさせることができる。他に、キメラペプチドは、胃腸関門、血液脳関門、皮膚関門、気道上皮関門、経膜関門、鼻内関門および眼関門などの生理学的関門をトランスロケーションする。
【解決手段】第１のドメインと第２のドメインを有するキメラペプチドを提供する。第１ドメインは、生体膜を越えた能動輸送を促進するトランスロケーション配列であり、第２ドメインは、インスリンペプチドの少なくとも一部である。また、キメラペプチドは、原形質膜、ミトコンドリア膜、または核膜などの生体膜をトランスロケーションさせることができる。他に、キメラペプチドは、胃腸関門、血液脳関門、皮膚関門、気道上皮関門、経膜関門、鼻内関門および眼関門などの生理学的関門をトランスロケーションする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に糖尿病治療の組成物と方法に関し、より具体的には、血中インスリン濃度を増加させる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、１６００万人近いアメリカ人が患っている疾病である。Ｉ型糖尿病、もしくは若年性糖尿病は、インスリンの絶対的不足と生命維持のための外因性インスリンへの依存により特徴づけられる。おおよそ８０万人〜１６０万人の人々がＩ型糖尿病と診断されている。ＩＩ型糖尿病は、身体が自己の産生したインスリンを適切に使用しない代謝障害から生じる。おおよそ１５００万人の人々がＩＩ型糖尿病を有している。費用の合計（間接的および直接的）は９８０億ドルを超えている。
【０００３】
現在、Ｉ型糖尿病の長期治療は、主に外因性インスリンを皮下注射することに頼っている。しかし、この治療法は、通常、食事、運動などに関連して生じるインスリン分布の分刻みの微妙な調節を模することができないため、至適な代謝コントロールを提供していない。バイオテクノロジーの出現により、多くの異なったタイプのインスリンが生産され、それらの発現、ピーク、および作用継続時間を変えられるようになっても、１日を通して適切にブドウ糖濃度をコントロールするのは依然として難しい。糖尿病患者がインスリン注射を行うと、末梢組織が高濃度のインスリンに晒されるため、これらの患者において肝臓の代謝を適切に調節することはより困難となる。１日に複数回（２〜４回）の注射を用いることにより、正常に近い血糖を有する良好な代謝コントロールが立証されたとしても、このような多数回注射による不便さによって、この療法の広範な使用が妨げられる。
【０００４】
最も便利で快適、受容可能でかつ容易な送達経路は経口であると考えられる。投与部位として胃腸（ＧＩ）粘膜は、他の粘膜より大きな利点を幾つか与える。これらの利点としては、以下のものが挙げられる：（１）多くの人々にとって、経口投与は馴染み深く便利で受容できる投与手段である；（２）ＧＩ上皮は吸収にとって広い表面積を提供する；（３）ＧＩ上皮は多量の血液供給に密接な関連性を提供する。インスリンのようなホルモンは、上部胃腸管の苛酷な環境を通過することができないため皮下経路によって投与される。皮下注射とは異なり、インスリンの経口送達は、健康な非糖尿病者に見られる膵臓から肝門循環への生理的インスリン輸送を模することができると考えられる。しかしながら、インスリンを完全に経口送達することは実際上不可能であると考えられる。経口投与されたインスリンの吸収は、最良の実験条件下でも０．５％以下である。たとえ少量のインスリンが奇跡的に上部胃腸管を通過できたとしても、このホルモンは相当大型で親水性であるため、腸関門を通過することが不可能となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血清インスリン濃度の増加と血清ブドウ糖濃度の減少に有用なキメラインスリンペプチド類に関する。また、本発明により、糖尿病、すなわちタイプＩまたはタイプＩＩの糖尿病を患っている患者を治療する方法が提供される。
【０００６】
本発明の組成物は、ディアトス（Ｄｉａｔｏｓ）ペプチドベクター（ＤＰＶ）類が、通常は生理学的関門、より具体的には腸上皮関門を越えて輸送されることのできない分子の輸送を可能にするという発見に一部基いている。例えば、インスリンなどの高分子類を本明細書に記載されているＤＰＶ類を用い、腸上皮関門を越えて輸送することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
種々の態様において、本発明はキメラペプチドを提供する。キメラペプチドは、原形質膜、ミトコンドリア膜、または核膜などの生体膜をトランスロケーションさせることができる。他に、キメラペプチドは、胃腸関門、血液脳関門、皮膚関門、気道上皮関門、経膜関門、鼻内関門および眼関門などの生理学的関門をトランスロケーションする。
【０００８】
一態様において、本発明は、第１のドメインと第２のドメインを有するキメラペプチドを提供する。第１ドメインは、生体膜を越えた能動輸送を促進するトランスロケーション配列であり、第２ドメインは、インスリンペプチドの少なくとも一部である。
【０００９】
トランスロケーション配列はリポ蛋白の一部である。また、トランスロケーション配列は、少なくとも４個の塩基性アミノ酸、例えば、リジンまたはアルギニンである。トランスロケーション配列は、ヘパリン、または硫酸コンドロイチンなどのアミノグリカンに結合していることが好ましい。
【００１０】
第１ドメインは、（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；（ｃ）
（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；および（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｘは非塩基性アミノ酸であり；ｍの各々は独立してゼロから５までの整数であり；ｎの各々は独立して１から１０の間の整数であり；ｏの各々は独立してゼロから５の間の整数である）よりなる群から選択されるアミノ酸配列である。ある一定の実施形態において、ｎは２または３であり得、Ｘは疎水性アミノ酸であり得る。
【００１１】
第１ドメインのアミノ酸配列は、１００個未満のアミノ酸長であり；５０個未満のアミノ酸長であり；２５個未満のアミノ酸長である。第１ドメインのアミノ酸配列は、ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ（配列番号：３０、ＤＰＶ７）またはＳＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ（配列番号：３５、ＤＰＶ１０）であることが好ましい。
【００１２】
前記キメラペプチドは、（ａ）ヒト抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域；（ｂ）ヒト抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域；（ｃ）マウス抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域；および（ｄ）マウス抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域などの抗体断片のアミノ酸配列をさらに含んでなってもよい。
【００１３】
他の態様において、本発明は、第１ドメイン、第２ドメインおよび第３ドメインを有するキメラペプチドを提供する。第１ドメインと第２ドメインは、（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；（ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎまたはｆ）（抗体断片）ｎ（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｘは非塩基性アミノ酸であり；ｍの各々は独立してゼロから５までの整数であり；ｎの各々は独立して１から１０の間の整数であり；ｏの各々は独立してゼロから５の間の整数である）のアミノ酸配列を含んでなる。第１ドメインは第２ドメインとは異なる。第３ドメインは、インスリンポリペプチドの少なくとも一部である。前記キメラペプチドは、生体膜または生理学的関門を越えてトランスロケーションする。
【００１４】
さらに、他の態様で、本発明は、（ａ）抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域の少なくとも一部；（ｂ）抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域の少なくとも一部；および（ｃ）インスリンポリペプチドの少なくとも一部を含んでなり、ペプチドが生体膜にトランスロケーションするキメラペプチドを提供する。
【００１５】
本発明はまた、前記キメラペプチドと担体との組成物を提供する。前記組成物は経口投与に好適である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、本発明の組成物を含んでなるキットを提供する。
【００１７】
本発明はまた、細胞と本発明の組成物とを接触させることによって、細胞内のブドウ糖濃度を減少またはインスリン濃度を増加させる方法を提供する。他に、血清中ブドウ糖濃度の減少とインスリン濃度の増加を必要とする患者に本発明の組成物を投与させることにより、患者の血清中ブドウ糖濃度を減少させ、インスリン濃度を増加させる。
【００１８】
他に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有している。本明細書中に記載されているものと同様の、または等価の方法と材料が本発明の実践または試験において使用できるが、好適な方法と材料が以下に記載されている。本明細書中に挙げられた全ての出版物、特許出願、特許および他の文献は、その内容全体が本明細書に援用されている。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が規制することになる。なお、材料、方法および例は、ただ例示のためであって限定する意図はない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、血清インスリン濃度の増加と血清ブドウ糖濃度の減少に有用なキメラインスリンペプチド類を含有する組成物を提供する。キメラペプチド類は、患者におけるインスリンの生物学的利用能を調節するために使用できる。本発明のキメラペプチド類、または、これらのキメラペプチド類をコードする核酸類は、薬剤組成物中に組み込まれ、糖尿病、すなわち、タイプＩまたはタイプＩＩ糖尿病の治療のために、患者に投与することができる。
【００２０】
種々の態様において、本発明は、インスリンポリペプチドの少なくとも一部を含有する第２ドメインと操作可能に結合したトランスロケーション配列を含有する第１ドメインを含むキメラペプチドを提供する。第１ドメインと第２ドメインは前記ペプチド中いずれの順序においても生成でき、また、前記ペプチドは各ドメインの１個以上を含むことができる。
【００２１】
本明細書中で用いられる「キメラ蛋白質」または「キメラペプチド」は、非インスリンポリペプチドに操作可能に結合したインスリンポリペプチドの少なくとも一部を含む。「インスリンポリペプチド」とは、インスリンポリペプチドのアミノ酸配列またはインスリンポリペプチドの少なくとも一部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはインスリンポリペプチドのアミノ酸配列またはインスリンポリペプチドの少なくとも一部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を言い、一方、「非インスリンポリペプチド」とは、インスリンと実質的に相同ではない蛋白質、例えば、インスリンポリペプチドまたは断片とは異なり、同一または異なる生物に由来する蛋白質に対応するアミノ酸を有するポリペプチドを言う。インスリンキメラペプチド内で、インスリンポリペプチドはインスリンポリペプチドの全体、または一部に対応し得る。
【００２２】
用語の「操作可能に結合した」は、第１ドメインと第２ドメインが、インスリンポリペプチドと少なくとも１つの機能との関連を可能にするような様式で、化学的に結合している（最も典型的には、ペプチド結合などの共有結合により）ことを示すことが意図されている。キメラペプチドをコードする核酸を言うために用いられる場合は、操作可能に連結したと言う用語は、第１ドメインをコードする核酸とインスリンポリペプチドとが互いにフレーム内で融合していることを意味する。第１ドメインはインスリンポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合し得る。
【００２３】
「トランスロケーション配列」とは、それが存在するペプチドに所望の細胞目的地を指令するいずれかのアミノ酸配列を言う。したがって、トランスロケーション配列は、生体膜、例えば、リン脂質膜、ミトコンドリア膜、または核膜を越えてペプチドが浸透することを指令または促進することができる。例えば、トランスロケーション配列は、ペプチドを細胞の外側から、原形質膜を通し、また、細胞質内へ、または細胞内の所望の場所、例えば、核、リボソーム、ミトコンドリア、ＥＲ、リソソーム、またはペルオキシソームへと指令する。他に、またはそれに追加して、トランスロケーション配列は、血液脳関門、経膜関門、または血液脳血管関門、血液腎関門、胃腸関門、肺関門などの生理学的関門を越えて、ペプチドを指令することができる。
【００２４】
トランスロケーション、すなわち生体膜または生理学的関門を越えた浸透は、種々の方法、例えば、培養細胞の存在下、キメラペプチドの第１の温置ステップに続く固定化ステップ、およびそれらの細胞の透過性増加、次に細胞内キメラペプチドの存在の明示を行う細胞浸透試験によって測定できる。前記明示ステップは、キメラペプチドに対して標識化され指令された抗体の存在下、もう一度温置してから、細胞質中、または細胞核の直近、またはさらに細胞核中で前記配列と標識化抗体との間の免疫反応を検出することによって行われる。明示はまた、本発明におけるアミノ酸配列を標識化し、細胞分画中のこの標識の存在を検出することによっても行われる。細胞貫通試験は上記の国際公開第９７／０２８４０号に記載された。
【００２５】
トランスロケーション配列は、エネルギーを要する、すなわち能動輸送であり得る。あるいは、トランスロケーションは、エネルギーを要しない、すなわち受動輸送である。
【００２６】
トランスロケーション配列は、いかなる長さでもよい。例えば、トランスロケーション配列は、６００個未満のアミノ酸長、例えば、５００、２５０、１５０、１００、５０、２５または１０個以下のアミノ酸長である。トランスロケーション配列は、少なくとも４個の塩基性アミノ酸からなる。
【００２７】
トランスロケーション配列は、公知の配列から誘導される。例えば、トランスロケーション配列は、ヒトリポ蛋白Ｂ、ヒトリポ蛋白Ｅなどのリポ蛋白；ＣＤＲ２領域またはＣＤＲ３領域などの免疫グロブリン分子；アグリン（ａｇｒｉｎｅ）；ＦＧＦ；またはＰＧＦの配列を含み得る。
【００２８】
トランスロケーションは、さらに、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、およびそれらの誘導体と反応する能力によって特徴づけることが好ましい。グリコサミノグリカン類（ＧＡＧ）、より一般的にはアミノグリカン類、特にヘパリン、硫酸ヘパリンおよび硫酸コンドロイチンと結合しているペプチド類は、上記のペプチド類のように元々天然物であることも、あるいは人工物であることもある。それらは、天然の形態またはポリマー（ダイマー、トリマーなど）の形態で使用できる。「ヘパリンまたは硫酸コンドロイチン誘導体」または「ヘパリン様アミノグリカン類または硫酸コンドロイチン」とは、参照に引用した刊行物（カージンおよびウェイントラウブ（Ｃａｒｄｉｎ ＆ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ９：２１頁（１９８９）；マートンら（Ｍｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３６５頁（１９９２）；デイビッド（Ｄａｖｉｄ）、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：１０２３頁（１９９３））に記載されているような生成物または副生成物を意味すると解される。
【００２９】
トランスロケーション配列の例としては、以下の式：
（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；（ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎまたは（ｆ）（抗体断片）ｎ（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｘは非塩基性、好ましくはアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンなどの疎水性アミノ酸であり；ｍはゼロから５の間の整数であり；ｎは１から１０の間、好ましくは１から３の間の整数であり；ｏはゼロから５の間の整数である）のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。
【００３０】
抗体断片は、完全長免疫グロブリンポリペプチドより小さい、例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＦｖまたはＦｃを含むことを意味する。前記抗体は、例えばヒトまたはマウスであり得る。前記抗体は、抗−ＤＮＡ抗体であることが好ましい。前記抗体フラグメントは、ある抗体のＣＤＲ２領域の全部または部分を含有することが好ましい。あるいは、前記抗体は、ある抗体のＣＤＲ３領域の全部または部分を含有する。より具体的には、前記抗体断片はＲＴＴ７９、ＮＥ−１およびＲＴ７２などの、抗−ＤＮＡヒト抗体のＣＤＲ３領域の少なくとも１つを含有する。
【００３１】
「全部または部分」により、ベクターが細胞内部へ進入する能力を維持する条件で、抗体断片が対象ＣＤＲ領域の全体またはその部分のみのいずれかを含有し得る（機能的相同体）ことが解される。「ＣＤＲ領域の部分」により、１個以上の末端アミノ酸から誘導されたＣＤＲ領域が解される。それはまた、１個以上の内部残基が欠失した、または他のアミノ酸、好ましくは同じ性質のアミノ酸（例えば、塩基性アミノ酸）に置換されたＣＤＲ領域でもあり得る。
【００３２】
トランスロケーション可能な配列の例としては、配列番号：１〜４８が挙げられる。トランスロケーション可能な好ましいアミノ酸配列は、ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ（配列番号：３０）およびＳＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ（配列番号：３５）である。一般的に、第１ドメインのアミノ酸配列は１００個未満のアミノ酸長；５０個未満のアミノ酸長；または２５個未満のアミノ酸長である。第１ドメインは６個から２５個のアミノ酸であることが好ましい。
【００３３】
本明細書中に用いられる用語の「インスリン」は、生物学的に活性なインスリン類似体、天然抽出インスリン、または組換えにより生産されたインスリンを包含すると解される。生物学的に活性とは、該分子が糖尿病の疾患症状を抑制または予防する、例えば、血清ブドウ糖を減少させる能力を有することを意味する。生物学的に活性なインスリンとしては、プレプロインスリン、プロインスリン、インスリンのアルファ鎖、インスリンのベータ鎖、および成熟インスリン、例えば、アルファ鎖、ベータ鎖が挙げられる。インスリンは、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、イヌまたはマウスなどの任意の種から誘導し得る。
【００３４】
用語は、実質的に精製された形態における、通常、糖尿病の治療に用いられるポリペプチドを包含することが意図されるが、さらに商品として入手できる賦形剤を含む薬剤形態における用語の使用を包含する。本発明において使用するインスリンは、ノボ・ラボラトリーズ社（Ｎｏｖｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（コネチカット州ダンベリー）、米国ノルディスク社（Ｎｏｒｄｉｓｋ−ＵＳＡ）（メリーランド州ロックビレ）およびイーライ・リリー社（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）（インディアナ州インディアナポリス）などの多数の商業的供給元から入手可能である。
【００３５】
本発明の方法を実施する場合には、ブタ由来インスリン、ヒト半合成インスリン（米国ノルディスク）およびクローン化組換えインスリン（イーライ・リリー）が使用可能である。前記インスリンは、組換え生産されることが好ましく、また、加水分解されているか、溶液中であり得る。
【００３６】
用語の「インスリン類似体」などは、本明細書中では、交換可能に用いられ、ポリペプチド鎖内の１個以上のアミノ酸が替わりのアミノ酸で置換されている、および／または１個以上のアミノ酸が欠失している、またはさらに１個以上の追加のアミノ酸がポリペプチド鎖またはアミノ酸配列に付加されている、上記に定義した「インスリン」の任意の形態であって、天然インスリンの、例えば、血中ブドウ糖濃度を低下させるなどの少なくとも１つの機能を依然として有しているものを包含することが意図されている。一般に、本発明の用語の「インスリン類似体」は、米国特許第５，５４７，９２９号に開示され、その内容全体が本明細書に援用されている「インスリンリスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）類似体」；ＬｙｓＰｒｏインスリンおよびヒトインスリンを含むインスリン類似体、および他の「スーパーインスリン類似体」を含み、前記インスリン類似体の血清ブドウ糖濃度に作用する能力は、従来のインスリンならびに脂肪組織におけるよりも肝臓においてより活性である肝選択的インスリン類似体に比較して、実質的に増大している。好ましい類似体は、インスリンリスプロ、すなわち、血中ブドウ糖濃度を低下させるために投与される化合物などの、インスリンと同じ一般的目的のために使用されるインスリン様化合物である単量体インスリン類似体である。
【００３７】
新規のインスリンＡ鎖変異体もまた、本発明に有用である。ヒトインスリンＡ鎖類似体は、ＣｙｓＡ６残基とＣｙｓＡ１１残基との間の本来の分子内ジスルフィド結合を保存し、７位と３０位の２つのセリンが、天然インスリンのＢ鎖によって形成された２つの鎖間ジスルフィドブリッジに含まれるシステインに取って代わられている。
【００３８】
インスリンポリペプチド、および／またはインスリンポリペプチドをコードする核酸は、当業界に知られているインスリンをコードする配列を利用して構成可能である。インスリンポリペプチド、およびインスリンポリペプチドをコードする核酸の供給元としては、ジーンバンク受け入れ番号６００１６５Ａ；５５００８５Ａ；ＡＡＨ０５２５５；ＡＡＡ５９１７９が挙げられ、それらの内容全体が本明細書に援用されている。
【００３９】
インスリン分子の例としては、限定はしないが、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号：５２、ヒトインスリン）；
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号：５３、ヒトリスプロインスリン）；
ＧＩＶＥＱＣＳＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＳＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号：５４、ヒト「ミニインスリン」）；
ＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ（配列番号：５５、ウシインスリン）；および
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ（配列番号：５６、ブタインスリン）が挙げられる。
【００４０】
所望の場合、１個以上のアミノ酸が、トランスロケーション配列を含んでなる第１のペプチド部分と、インスリンを含んでなる第２のポリペプチド部分との間に挿入可能である。幾つかの実施形態において、第１のドメインまたは第２のドメインは、トランスロケーション配列とインスリンとの会合を促進する配列を含む。
【００４１】
一実施形態において、キメラペプチドは、インスリンポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性部分を含んでなる。他の実施形態において、キメラペプチドは、インスリンポリペプチドの少なくとも２つの生物学的活性部分を含んでなる。さらに他の実施形態において、キメラペプチドは、インスリンポリペプチドの少なくとも３つの生物学的活性部分を含んでなる。
【００４２】
トランスロケーション配列とインスリン配列とは、当業界に知られたいずれかの好適な方法で、化学的カップリングにより結合可能である。多くの知られた化学的架橋法は非特異的である。すなわち、それらはカップリングの位置をトランスロケーション配列上、またはインスリン上の特定の部位に指令しない。その結果、非特異的架橋剤の使用によって機能的部位または立体的ブロック活性部位が攻撃され、共役蛋白質は生物学的に不活性となり得る。
【００４３】
カップリングの特異性を高める１つの方法は、架橋されるポリペプチドの１つまたは両方において、わずか１度か２〜３度見出される官能基に直接化学的カップリングを行うことである。例えば、多くの蛋白質において、チオ基を含有する唯一の蛋白質アミノ酸であるシステインは、２〜３度しか見出されない。また、例えばポリペプチドがリジン残基を含有しない場合、第一級アミンに特異的な架橋剤は、そのポリペプチドのアミノ末端に選択的となる。カップリング特異性を高めるために、この方法を首尾良く利用するには、ポリペプチドが分子の生物学的活性を失うことなく変更し得るその分子領域にほどよく希少で反応性の残基を有することが必要である。
【００４４】
システイン残基が、ポリペプチド配列の部分に見出される場合は置換し得るが、そうでない場合は、架橋反応におけるそれらの関与により、生物学的活性が妨害され易いと考えられる。システイン残基が置換される場合は、その結果生じるポリペプチドの折りたたみにおける変化を最少にすることが典型的に望ましい。ポリペプチドの折りたたみにおける変化は、前記置換が化学的および立体的にシステインと同様である場合に最小化される。これらの理由で、システインの置換としては、セリンが好ましい。下記の例で説明されるように、システイン残基は架橋を目的としてポリペプチドのアミノ酸配列中へ導入し得る。システイン残基を導入する場合は、アミノ末端またはカルボキシ末端、またはその近辺への導入が好ましい。関心対象のポリペプチドの生産が化学合成によるものとしても、組換えＤＮＡの発現によるにしても、このようなアミノ酸配列の修飾には慣例的方法が利用できる。
【００４５】
２つの構成要素のカップリングは、カップリング剤または共役化剤によって達成可能である。利用可能ないくつかの分子間架橋試薬がある。例えば、ミーンズおよびフィーニー（Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ）、「ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、ホールデン・デイ（Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ）、１９７４年、３９〜４３頁を参照されたい。それらの試薬の中では、例えば、プロピオン酸Ｊ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（双方ともスルフヒドリル基に対して特異性が高く、非可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６個から１１個の炭素メチレンブリッジを有する他のそのような試薬（スルフヒドリル基に対して、比較的特異性がある）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノ基およびチロシン基と非可逆的結合を形成する）がある。この目的のために有用な他の架橋試薬としては、Ｐ，Ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基およびフェノール基と非可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（アミノ基に対して特異的）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアナートまたはジイソチオシアナート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアナート（主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（いくつかの異なった側鎖と反応する）およびジスジアゾベンジジン（主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）が挙げられる。
【００４６】
架橋試薬はホモ二官能性であり得る。すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有し得る。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは緩和条件（ｐＨ６．５〜７．７）下で、スルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含有する。この２つのマレイミド基は炭化水素鎖によって連結している。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含有するポリペプチドの非可逆的架橋にとって有用である。
【００４７】
架橋試薬はヘテロ二官能性でもあり得る。ヘテロ二官能性架橋試薬は、２つの異なる官能基、例えば、それぞれ遊離アミン類とチオール類を有する２つの蛋白質を架橋するアミン反応性基とチオール反応性基とを有する。ヘテロ二官能性架橋試薬の例として、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）および、ＭＢＳの伸長鎖類似体である４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミド（「ＳＭＰＢ」）がある。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、第一級アミンと反応し、チオール反応性のマレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００４８】
架橋試薬は水に低溶解性であることが多い。その水溶性を改善するために、スルホン酸エステル基などの親水性部分を架橋試薬に添加し得る。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性に関して修飾された架橋試薬の例である。
【００４９】
多くの架橋試薬は、細胞条件下で本質的に非開裂的な共役体を生成する。しかし、細胞条件下で開裂可能なジスルフィドなどの共有結合を含有する架橋試薬もいくつかある。例えば、トラウト（Ｔｒａｕｔ）の試薬、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（「ＤＳＰ」）および３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（「ＳＰＤＰ」）は周知の開裂可能な架橋剤である。開裂可能な架橋剤の使用により、標的細胞内への送達後にインスリンをトランスロケーション配列から分離することが可能になる。直接ジスルフィド結合もまた、有用であり得る。
【００５０】
上記で検討したものを含む多数の架橋試薬が商品として入手可能である。それらの使用に関する詳細な説明は商品供給者から容易に入手可能である。蛋白質架橋剤および蛋白質共役剤についての一般的参考文献は、ウォング（Ｗｏｎｇ）、「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ」、ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）（１９９１）である。
【００５１】
化学的架橋は、スペーサアームの使用を含む。スペーサアームは、分子内柔軟性を提供するか、または、共役部分間の分子内距離を調整し、それによって、生物学的活性の保持を補助し得る。スペーサアームは、スペーサアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形態であり得る。他にスペーサアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（イリノイ州ロックフォードのピアス・ケム社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）、カタログ番号２１６５１Ｈ）内など、架橋試薬の部分であり得る。
【００５２】
キメラペプチドは、１つ以上の追加部分に結合し得る。例えば、キメラペプチドはＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）蛋白質に結合し得るが、ここでキメラペプチドはＧＳＴ配列のＣ末端に融合している。このような融合蛋白質はキメラペプチドの精製を促進し得る。
【００５３】
他にキメラペプチドは、公知の好適な宿主細胞内に簡便に発現し得るトランスロケーション配列とインスリン配列とを含む融合ペプチドとして生産し得る。本明細書中に記載された融合ペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ法と類似した、またはそれから容易に適合し得る方法で形成し、使用し得る。
【００５４】
一般に、本発明のアミノ酸配列（配列番号：１〜４８）は、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンにおける場合のように、塩基性アミノ酸を多数含む。「多数」とは、少なくとも３に等しいと解すべきである。
【００５５】
１つの特に興味深いアミノ酸配列は、以下の点で配列番号：１の配列である。（１）少なくとも二量体の状態で、それは所望の性質を有する。（２）モノマー、またはポリマーの状態で、それがカップリングしている他のアミノ酸配列に前記性質を与えるか、またはそのアミノ酸配列がすでにそれらの性質を有している場合は、それらを大幅に増強する。同様に、ＤＰＶ３、（ＤＰＶ３）２、ＤＰＶ６、ＤＰＶ７、ＤＰＶ１０およびＤＰＶ１３と称されるペプチド類はこの増強能力を有している。
【００５６】
本発明はまた、血清インスリン濃度を増加させるか、または血清または細胞内ブドウ糖濃度を減少させる方法を提供する。必要としている患者において、血清ブドウ糖濃度を減少させるか、またはインスリン濃度を増加させる。本発明のキメラペプチドを含有する組成物を投与することによって、血清または細胞内のインスリン濃度を増加させること、または血清または細胞内のブドウ糖濃度を減少させること。患者は当業界で公知の方法により、血清ブドウ糖濃度または血清インスリン濃度を測定することにより同定される。前記患者のインスリン濃度またはブドウ糖濃度が正常範囲にない場合、前記患者は血清インスリン濃度の増加または血清ブドウ糖濃度の減少を必要としている。正常なブドウ糖濃度は、６０〜１２０ｍｇ／ｄｌである。正常なインスリン濃度は、７ｍＵ／ｍＬ±３ｍＵである。例えば、患者の血清ブドウ糖濃度が１２０ｍｇ／ｄｌを超える場合、その患者は、血清ブドウ糖濃度を減少させる必要がある。対照的に、ブドウ糖濃度が６０〜１２０ｍｇ／ｄｌの間にある患者は血清ブドウ糖濃度を低下させる必要はない。投与後、患者の血清ブドウ糖は、少なくとも６０〜１２０ｍｇ／ｄｌの間にあることが好ましい。例えば、血清インスリン濃度が４ｍＵ／ｍＬ未満である場合、患者はインスリン濃度を増加させる必要がある。投与後、血清インスリン濃度は、７ｍＵ／ｍＬ±３ｍＵであることが好ましい。
【００５７】
さらに、本発明は、そのような治療または予防が望まれる患者に、患者における糖尿病を治療または予防する十分な量で、本発明のキメラペプチドを含有する組成物を投与することにより、糖尿病を治療または予防する方法を提供する。治療の有効性は、糖尿病を診断または治療するいずれかの公知の方法と関連して決定される。糖尿病は、例えば、過度の排尿、強い口渇と空腹、強度の疲労、皮膚の乾燥、または原因不明の体重減少により診断される。
【００５８】
前記患者は、例えばいずれかの哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタであり得る。
【００５９】
本発明のキメラペプチドまたはこれらのキメラペプチドをコードする核酸分子（本明細書では、「治療剤」または「活性化合物」とも称される）、およびそれらの誘導体、断片、類似体および相同体を投与に好適な薬剤組成物内へ組み入れることが可能である。このような組成物は、典型的に核酸分子、蛋白質、または抗体および薬剤的に許容し得る担体を含んでなる。本明細書で用いられる「薬剤的に許容できる担体」は、薬剤としての投与に適合する任意の、および全ての溶媒、分散媒体、被覆物、抗菌剤および抗真菌剤、等張性の吸着遅延化剤などを含むことが意図されている。好適な担体は、この分野の標準的な参考文献であるレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）の「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の最新版に記載されており、本明細書に援用されている。このような担体または希釈剤の好ましい例としては、限定はしないが、水、塩類液、フィンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームや不揮発性油などの非水性担体もまた使用し得る。薬剤活性物質に対するそのような担体および試剤の使用は当業界に周知である。従来の任意の媒体または試剤は活性物質と不相溶性でない限り、組成物におけるそれらの使用が考慮される。補足的な活性化合物もまた、該組成物に組み入れ可能である。
【００６０】
本明細書中に開示された活性試剤は、リポソーム類としても製剤化し得る。リポソーム類は、エプスタインら（Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８頁（１９８５）；ワングら（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０頁（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号に記載されているような当業界に公知の方法によって調製される。循環時間を延長化したリポソーム類は、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００６１】
特に有用なリポソーム類は、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含んでなる脂質組成物による逆相蒸発法により生成し得る。リポソーム類は、細孔サイズのフィルタを通して押出され、所望の直径のリポソーム類が得られる。
【００６２】
本発明の薬剤組成物は、意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口的、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経膜および直腸投与が挙げられる。非経口的、経皮または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は以下の成分を含み得る：注射用水などの滅菌希釈剤、塩類溶液、非揮発性油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類などの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調製剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整し得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル類、使い捨て注射器類、または複数回投与容器に封入し得る。
【００６３】
注射使用に好適な薬剤組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即席調製用滅菌粉体が挙げられる。静脈内投与に好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォルＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標））（ニュージャージー州パルシッパニーのＢＡＳＦ）またはリン酸塩緩衝塩類（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合に、前記組成物は滅菌されていなければならず、また、容易な注射可能性が存在する程度に流動性である必要がある。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒、または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆物の使用により、分散液の場合は要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持される。微生物作用の防止は、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗真菌剤によって達成し得る。多くの場合、組成物中に糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の吸収延長化は、前記組成物に吸収を遅延化する試剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを含めることによって達成し得る。
【００６４】
滅菌注射用溶液は、要求される量の活性化合物（例えば、グリコプロテインＩｂα融合蛋白質）を、適切な溶媒中必要ならば、上に挙げた成分の１種または組合わせとと共に組み入れ、引き続き、ろ過滅菌を行うことによって調製し得る。一般に、分散液は、塩基性分散媒体と他の上に挙げた成分のうちの必要とされる成分を含有する滅菌担体中へ活性化合物を組入れることによって調製される。滅菌注射用溶液調製用の滅菌粉体の場合、調製法は活性成分の粉体プラス先に滅菌ろ過されたその溶液の所望の追加成分を与える真空乾燥および凍結乾燥である。
【００６５】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与を目的とした前記活性化合物は、賦形剤と共に組入れられ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用し得る。経口組成物はまた、嗽薬としての使用のため、流動性担体を用いて調製可能であり、ここで流動性担体中の化合物は、経口的に適用され、うがいして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬剤として適合可能な結合剤および／または補助剤物質を組成物の部分として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含有し得る：微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤、アルギニン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素などの滑剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料などの香味料。
【００６６】
吸入による投与のためには、前記化合物は好適な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器またはディスペンサからのエアゾールスプレーまたはネブライザの形態で送達される。
【００６７】
全身投与はまた、経膜または経皮手段であり得る。経膜または経皮投与のために、浸透すべき関門に適切な浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は一般に当業界で公知であり、例えば、経膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経膜投与は、鼻用スプレー剤、または坐薬の使用によって達成し得る。経皮投与のために、前記活性化合物は当業界に公知の軟膏、軟膏剤、ゲル剤またはクリーム剤に製剤化できる。
【００６８】
前記化合物はまた、直腸送達のために坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド類などの慣例的な坐薬基剤と共に）、または停留浣腸の形態で調製し得る。
【００６９】
一実施形態において、前記活性化合物は、移植およびミクロカプセル化送達システムを含む放出制御剤など、前記化合物を身体からの急速な排出から防ぐ担体と共に調製される。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ酢酸などの生物分解性、生体適合性ポリマー類を使用し得る。このような製剤の調製法は、当業者には明らかであろう。前記物質はまた、アルザ社（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ・ファーマシューティカルズ社（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）から商品として入手し得る。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されたリポソーム類を含む）もまた、薬剤的に許容できる担体として使用し得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように当業界に公知の方法に従って調製し得る。
【００７０】
幾つかの実施形態において、経口または非経口組成物は、投与の容易さと用量の均一性のため、用量単位形態で製剤化される。本明細書中で用いられる用量単位形態とは、治療を受ける患者にとって単一用量として適した物理的に個別の単位であって、各単位が必要とされる薬剤担体と関連して、所望の治療効果を生み出すように計算された活性化合物の予め決められた量を含有する単位を言う。本発明の用量単位形態の明細は、前記活性化合物の独自の特徴や達成すべき特定の治療効果および個人の治療用に、このような活性化合物を調合する技術固有の限界により規定され、また直接依存する。
【００７１】
本発明の核酸分子をベクター類の中へ挿入し、遺伝子療法ベクター類として使用し得る。遺伝子療法ベクター類は、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照）または定位注射（例えば、チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４〜３０５７頁を参照）により患者に送達し得る。遺伝子療法ベクター類の薬剤調製物は、許容できる希釈剤中に遺伝子療法ベクター類を含み得るか、または遺伝子送達媒体が埋め込まれている徐放マトリックスを含んでなる。他に、完全遺伝子送達ベクターが組換え細胞、例えば、レトロウィルスベクターからそのまま生産し得る場合、薬剤調製物は遺伝子送達システムを生産する１種以上の細胞を含み得る。
【００７２】
所望の場合、徐放性製剤を調製できる。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの成形品、例えば、薄膜またはミクロカプセルの形態の半透過性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸γ−エチルとのコポリマー、非分解性酢酸エチレン−ビニル、ルプロン・デポー（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標））（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）からなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。酢酸エチレン−ビニルや乳酸−グリコール酸などのポリマー類は、１００日間を超える期間、分子の放出を可能にするが、あるヒドロゲル酸の蛋白質放出期間はより短い。
【００７３】
例えば、本発明のキメラペプチドの経口用量は、示された効果を目的として使用される場合、経口経路で約０．０５ｍｇ／日から１０００ｍｇ／日の間となり、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０および１，０００．０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態にすることが好ましい。少なくとも１種の関心対象物質を入れたベクター類または輸送体の有効血漿濃度は、体重１キログラム、１日につき、０．００２ｍｇから５０ｍｇの範囲となる。
【００７４】
本発明のキメラペプチド類、またはこれらのキメラペプチドをコードする核酸は、１日用量の形態で投与され得るか、または合計１日用量を１日２回、３回または４回投与にして投与できる。
【００７５】
前記薬剤組成物は、投与説明書と共に容器、キット、箱またはディスペンサに包含できる。
【００７６】
１つの特定の適用において、本発明は、本発明による少なくとも１種のキメラペプチドおよび／または１種の細胞からなる、またはそれらを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ使用のための診断用試剤に関する。このような診断用試剤は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても使用できる。
【００７７】
したがって、本発明の課題はまた、診断用試剤を含む診断用キットでもある。より具体的には、前記診断用キットは、１つ以上の容器内に、本発明における組成物の予め決められた量を含む。
【００７８】
他の実施形態において、本発明は、関心対象物質を真核細胞の生体膜を通してトランスロケーションする方法を提供し、前記方法は、本発明のキメラペプチドを準備すること、および前記キメラペプチドの存在下、細胞培養液に接触させることを含んでなる。一実施
形態において、真核細胞の活性代謝を促進する条件下で細胞培養液を前記キメラペプチドと接触させる。
【００７９】
本発明はまた、真核細胞の活性代謝を促進する条件下で、前記細胞を本発明のキメラペプチドと接触させることにより、前記真核細胞内の細胞内インスリン濃度を増加させる、または細胞内ブドウ糖濃度を減少させる方法を提供する。
【００８０】
他の実施態様において、本発明は、発現制御配列に操作可能に結合したペプチドをコードする核酸分子を含んでなるベクターを有する産生細胞を移入すること、前記ペプチドの産生を可能にする条件下で前記産生細胞を培養すること、および前記ペプチドを単離することを含んでなる、本発明のペプチドの生産方法を提供する。
【００８１】
本発明は、上記のキメラペプチドのペプチドベクターとしての使用を含む。本明細書中に用いられる用語の「キメラペプチド」、「ベクター」および「ペプチドベクター」は交換可能に使用し得る。これらのベクター類は、それらと共有的に、または非共有的に結合しているインスリンを細胞内に輸送する能力があり、したがって、インスリンの細胞内輸送にとって効果的なベクター類である。
【００８２】
この目的を達成するために、ベクターが比較的大量の分子を細胞内に輸送する能力を有すること、またそのために、ヒトの免疫系によって外来抗原として認識されないことが必要である。
【００８３】
これらのキメラペプチドは、インスリンを細胞内へ内部化するための試剤としてｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ双方において使用できることが判明した。
【００８４】
変法として、前記ベクターは、一方でアミノグリカン類と反応するアミノ酸配列のカップリングに基き、他方ではヒト抗ＤＮＡ抗体の可変部分から誘導された新規ペプチド類のカップリングに基いている。「カップリング」とは、インスリンポリペプチドとディアトス（ｄｉａｔｏｓ）ペプチドベクターとの間の物理的会合を可能にする任意のタイプの相互作用を意味すると解される。それは、生物学的媒体および／または本発明のペプチド類により輸送される関心対象物質によって開裂性または非開裂性であり得るか、または、活性物質にカップリングしたベクターを投与した生物に適用された物理的手段によって開裂性であり得る。このように、前記物質の生物学的効果発現のためには、それがベクターから放出されることが必要の場合もある。
【００８５】
１種または同一分子内のヒト抗ＤＮＡ抗体の種々の部分から誘導されたアミノグリカン類およびペプチド類と反応するアミノ酸配列のカップリングにより、インスリンのトランスロケーションおよび細胞内転移において、とりわけ、アミノグリカンと反応するアミノ酸配列がヒト由来である場合には、特に効果的なペプチドベクターの調製をもたらす。
【００８６】
この組合わせは、また、特にヒトの使用に適合したトランスロケーションベクターおよび転移ベクターを生み出す。実際、上記のように国際公開第９７／０２８４０号から公知のマウス由来のペプチドベクターは胚系によりコードされ、変異を伴わないので、その結果、抗原の点では、ヒトに見られるものに近いはずであり、それらをヒトに注射することにより、免疫反応を誘発する可能性がある。本発明によるＤＰＶから形成されたペプチドベクター、および抗ＤＮＡ抗体より誘導されたペプチド類から形成されたペプチドベクターは、双方ともヒト由来であり、胚系によりコードされ、変異を伴わないためこの問題を防ぐ。
【００８７】
ヒト抗ＤＮＡ抗体から誘導されたこれらのペプチドの一般的特徴は、国際公開第９９／０７４１４号に記載されているマウス由来のペプチドの特徴に近いが、それらを後者と区別するさらなる性質を有している。すなわち：
（１）細胞内部へ浸透する能力、それらは活性細胞代謝を有する必要がある（培養温度は
２５℃から３９℃まで、好ましくは３７℃までの間）が、一方、マウスのペプチドは明らかに依存性が低い；
（２）それらは、マウスのベクターよりもはるかにＤＮＡとの反応性が弱い；
（３）それらの浸透能力は、それらが細胞内部へ輸送しようとする分子によって著しく影響される；
（４）それらは、ヒト由来の細胞内部へ、他のものに由来する細胞内部よりも、より良好に浸透する。
【００８８】
本発明は、ヘパリン結合ペプチドおよび１種以上の好ましくは多反応性である抗体断片、より具体的には、抗体の高頻度可変領域由来の１種以上の断片からなるディアトス（ｄｉａｔｏｓ）ペプチドベクターを提供する。本発明の課題であるベクターは、抗体のＨ鎖の断片を含有することにより特徴づけられていることが好ましい。
【００８９】
上記の国際公開第９９／０７４１４号では、サイズが小型で分子量の低いモノマーの免疫グロブリンであるモノクローナルＩｇＧの断片のみが使用された。本発明は、非常に高分子量を有する五量体の免疫グロブリンであるＩｇＭ由来の断片を使用することも可能であることを示している。
【００９０】
上記に示したように、本発明のベクターは、インスリンの細胞内および核内輸送および転移のために、特によく適合している。
【００９１】
関心対象物質の細胞内への内部化における他の方法とは異なり、本発明の方法はエネルギーに依存する。ペプチドの浸透は、細胞を４℃で培養することにより完全に阻害される。それはまた、アジ化ナトリウム（ＡＴＰアーゼの阻害剤）やゲニステイン（チロシンキナーゼおよびＡＴＰへの結合阻害剤）のような細胞代謝阻害剤によって部分的に阻害される。したがって、本発明のペプチドおよびペプチドにカップリングしている関心対象物質の内部化機構はエンルギーに依存する。それゆえ、本発明のペプチドを用いたベクター化は、細胞表面の結合部位を介してなされる。したがって、本発明のアミノ酸配列は、細胞膜上に位置する結合部位にそれらが固定される能力、および細胞膜を通過する能力によって特徴づけられている。このように、本発明のアミノ酸配列は活性機構によって細胞膜を通過する能力、次に細胞質および／または細胞核の中に留まる能力によって特徴づけられている。したがって、それらは、受動的方法で細胞膜を通過することのできた先行技術におけるペプチド輸送体とは区別される。
【００９２】
このように、ベクターが細胞内へ通過する際、その使用が輸送されている物質のサイズに限定されないベクターを有することが可能である。実際、本発明のベクター類は、小さな化学分子（低分子量）から蛋白質またはプラスミド型核酸類（高分子量）の範囲の薬物を輸送することができる。浸透に関する本発明のベクター類のこの特殊な能力は、好ましい方法で「薬物」を細胞内へと標的化することを可能にし、したがって、薬物毒性の潜在的低下および有効性指標の潜在的増大に寄与する。
【００９３】
したがって、本発明は、細胞内へ、および／または細胞の核内へ組入れ可能な関心対象物質を天然、または非天然に含有するという事実によって特徴づけられる、上述したベクターなどのベクターを供給することを目的としている。
【００９４】
より具体的には、本発明の課題は、その浸透能力がカップリングしている関心対象物質の性質から全く独立しているベクターである。マウスのベクター類に比べて、これらのヒトのベクター類に特有なこの特徴が、これらベクター類の企図された使用法における主要な関心事である。しかし、本発明は、ベクターにカップリングしている関心対象物質に適合したベクター類もまた、関心対象としている。
【００９５】
しかし、ベクターが細胞浸透前または浸透中に解離しないように相互作用は十分に確実でなければならない。このために本発明におけるカップリングは、非共有カップリングもあり得るが、好ましいカップリングは共有カップリングである。前記インスリンポリペプチドはそれらの末端のうちのいずれか一方、または側鎖上にあるペプチドに直接、またはアミノ酸の１つにカップリングが可能である。前記インスリンポリペプチドはまた、前記ペプチドの末端のいずれか一方に、またはアミノ酸の１つの側鎖にアームを結合させることによって間接的にカップリング可能である。
【００９６】
本発明のベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞のトランスフェクションを可能にすることもまた示された。
【００９７】
本発明の一実施形態において、前記ベクターは、インスリンポリペプチドに対して元々
強力な親和性を有する少なくとも１種の分子（「アンカリング分子」と称される）により、インスリンポリペプチドにカップリングしている。インスリンポリペプチドに対するアンカリング分子の生来の親和性は、輸送体とインスリンポリペプチドとの非共有的相互作用を可能にし、そのため、インスリンポリペプチドの細胞内移動が行われる。
【００９８】
このタイプの輸送体の特に興味のある他の利点は、インスリンポリペプチドに対するアンカリング分子の生来の親和性により、この２つの要素が、化学的または生化学的相互作用なしに全く自然的方法でカップリングするという事実からなる。
【００９９】
関心対象物質がその大きさにより、および／またはその構造により、前記アミノ酸配列に直接カップリングすることが難しい場合、このタイプの輸送体は特に興味深い。また、関心対象物質があまり安定でない場合、また、それとカップリングするための化学的相互作用がいずれもそれを分解させる、またはその活性を変化させる恐れがある場合、このタイプの輸送体は特に有用であり得る。
【０１００】
本発明の他の態様は、キメラペプチド、またはその誘導体、断片、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター類、好ましくは発現ベクター類に関する。本明細書中に用いられる用語の「ベクター」は、結合した他の核酸を輸送する能力のある核酸分子を言う。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントを内に結合することのできる線状または環状の二本鎖ＤＮＡループである。ベクターの他のタイプは、追加のＤＮＡセグメントがウィルスのゲノム内に結合可能なウィルスベクターである。ある一定のベクター類は、それらが導入された宿主細胞内で自動複製する能力がある（例えば、細菌の複製源を有する細菌ベクター類およびエピソーム性哺乳動物ベクター類）。他のベクター類（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター類）は、宿主細胞内へ導入される際に宿主細胞のゲノム内へ組入れられることによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある一定のベクター類は、それらが操作可能に結合している遺伝子の発現を指令する能力がある。このようなベクター類は、本明細書中で「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ法において利用される発現ベクター類は、プラスミドの形態であることが多い。本明細書中において、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であることから、「プラスミド」と「ベクター」とは交換可能に使用し得る。しかしながら、本発明は、等しい機能を働かせるウィルスベクター類（例えば、複製を欠くレトロウィルス類、アデノウィルス類およびアデノ関連ウィルス類）などの他の形態の発現ベクター類を含むように意図されている。さらに、幾つかのウィルスベクター類は、特異的にまたは非特異的に、特定の細胞タイプを標的にする能力がある。
【０１０１】
本発明の組換え発現ベクター類は、宿主細胞内における核酸の発現に好適な形態にある本発明の核酸を含んでなるが、このことは、前記組換え発現ベクター類が、発現に用いられる宿主細胞に基いて選択された１つ以上の調節配列を含み、この調節配列が発現されるべき核酸配列に操作可能に結合していることを意味する。組替え発現ベクター内部に、「操作可能に結合している」とは、関心対象の核酸配列が、この核酸配列の発現が可能になる様式で（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システム内に、またはベクターが宿主細胞内に導入される場合は宿主細胞内に）、調節配列（単一または複数）に結合していることを意味するように意図されている。用語の「調節配列」は、プロモーター類、エンハンサー類、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル類）を含むことが意図されている。このような調節配列は、例えば、ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）；「ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５」、カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（１９９０）に記載されている。調節配列は、宿主細胞の多くのタイプにおいてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、およびある一定の宿主細胞においてのみ、ヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望の蛋白質レベルなどの因子に依存し得る。本発明の発現ベクター類は宿主細胞内へ導入可能であり、それによって、本明細書中に記載された核酸によってコードされた融合蛋白質類またはペプチド類を含む蛋白質類またはペプチド類を生産する。
【０１０２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞中のキメラペプチドの発現用にデザインできる。例えば、キメラペプチドを、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞または哺乳動物細胞中に発現できる。好適な宿主細胞は、さらにゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、「ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に検討されている。他に、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳し得る。
【０１０３】
原核細胞における蛋白質の発現は、融合蛋白質または非融合蛋白質のいずれかの発現を指令する構成的または誘導的プロモーター類を含有するベクター類により大腸菌において最もよく実施される。融合ベクター類は、多くのアミノ酸類をその中にコードされる蛋白質、通常、組換え蛋白質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクター類は、典型的に以下の３つの目的に役立つ：（１）組換え蛋白質の発現を増すこと；（２）組換え蛋白質の溶解性を増加すること；および（３）親和性精製においてリガンドとして作用させることにより組換え蛋白質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクター類において、蛋白分解開裂部位は、組換え部分の融合部分からの分離に続いて融合蛋白質の精製を可能にするために、融合部分と組換え蛋白質との接合部に導入される。このような酵素およびそれらの共役認識配列としては、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクター類としては、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）；スミスおよびジョンソン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）（１９８８）Ｇｅｎｅ６７：３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（マサチューセッツ州ビバリーのニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））およびｐＲＩＴ５（ニュージャージー州ピスキャタウェイのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白質、または蛋白質Ａを標的組換え蛋白質に融合する。
【０１０４】
好適な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（アムランら（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、（１９８８）Ｇｅｎｅ６９：３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ１ｌｄ（スタディアら（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．）、「ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５」、カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、（１９９０）６０〜８９頁）が挙げられる。
【０１０５】
大腸菌において組換え蛋白質発現を最大にする方策は、組換え蛋白質を蛋白分解する能力を欠いている宿主細菌において蛋白質を発現することである。ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）、「ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５」、カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、（１９９０）１１９〜１２８頁を参照されたい。他の方策は、発現ベクターに挿入するために、核酸の核酸配列を変更し、その結果、各アミノ酸の個々のコドンを、優先的に大腸菌において利用されるものにすることである（ワダら（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．）、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８頁）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的ＤＮＡ合成法により実施できる。
【０１０６】
他の実施形態において、キメラペプチド発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母エス−セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（バルダリら（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．）、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ６：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（クルジャンおよびヘルスコビッツ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（シュルツら（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．）、（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびｐｉｃＺ（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））が挙げられる。
【０１０７】
他に、キメラペプチドを、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現ベクター類を用いて昆虫細胞に発現できる。培養昆虫細胞（ｅ．ｇ．、ＳＦ９細胞）中の蛋白質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．）、（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２１５６〜２１６５頁）およびｐＶＬシリーズ（ラックロウおよびサマーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ）（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１〜３９頁）が挙げられる。
【０１０８】
さらに他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞に発現される。哺乳動物発現ベクター類の例としては、ｐＣＤＭ８（シード（Ｓｅｅｄ）（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（カウフマンら（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．）（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ６：１８７〜１９５頁）が挙げられる。哺乳動物細胞中で用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、ウィルス調節要素により提供されることが多い。例えば、通常使用されるプロモーター類は、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から誘導される。原核細胞および真核細胞の双方に好適な他の発現系に関しては、例えば、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、１６章および１７章を参照されたい。
【０１０９】
他の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指令できる（例えば、組織特異的調節要素が、核酸を発現するために使用される）。組織特異的調節要素は当業界に知られている。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝特異的；ピンカートら（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．）（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：２６８〜２７７頁）、リンパ球特異的プロモーター類（キャラメおよびイートン（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ）（１９８８）Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ４３：２３５〜２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター類（ウィンノートおよびボルチモア（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）（１９８９）ＥＭＢＯＪ８：７２９〜７３３頁）および免疫グロブリン類（バネルジら（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．）（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９〜７４０頁；クイーンおよびボルチモア（Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１〜７４８頁）、神経特異的プロモーター類（例えば、神経細線維プロモーター；バイルンおよびラッドル（Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ）（１９８９）ＰＮＡＳ８６：５４７３〜５４７７頁）、膵臓特異的プロモーター類（エドルンドら（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．）（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２〜９１６頁）、および乳腺特異的プロモーター類（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号およびヨーロッパ特許出願公報第２６４，１６６号）が挙げられる。また、発生調節プロモーター類、例えば、マウスホックスプロモーター類（ケッセルおよびグルス（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ）（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４〜３７９頁）およびα−フェトプロテインプロモーター（キャンペスおよびチルグマン（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ）（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３：５３７〜５４６頁）も含まれる。
【０１１０】
本発明の他の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語の「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に用いられる。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の後代または可能性のある後代を言う。変異または環境影響のいずれかのため、ある一定の変更が後続世代に生じ得ることから、このような後代は、実際、親細胞と一致しない可能性もあるが、本明細書中で使用される用語の範囲内にやはり含まれる。さらに、宿主細胞は、一旦キメラペプチドを発現すると変調を受ける可能性があり、元の特性を維持することも、またはゆるめることもある。
【０１１１】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、キメラペプチドは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞など）において発現できる。他に、宿主細胞は、未熟哺乳動物細胞、すなわち、多分化能性幹細胞であり得る。宿主細胞はまた、他のヒト組織から誘導できる。他の好適な宿主細胞は、当業者に知られている。
【０１１２】
ベクターＤＮＡは、従来のトランスフォーメーション法、トランスダクション法、感染法、トランスフェクション法により原核細胞または真核細胞に導入できる。本明細書中に用いられる用語の「トランスフォーメーション」、「トランスダクション」、「感染」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなど、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための種々の当業界で認められた方法を言うことを意図している。さらにトランスフェクションは、トランスフェクション剤により媒介できる。「トランスフェクション剤」とは、宿主細胞、例えばリポソーム内へのＤＮＡの組み込みを媒介する任意の化合物を含むことを意味する。宿主細胞をトランスフォームするかまたはトランスフェクションするのに好適な方法は、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、（「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年）および他の実験室マニュアルに見ることができる。
【０１１３】
トランスフェクションは、「安定」（すなわち、外来ＤＮＡの宿主ゲノムへの組込み）
または「一過性」（すなわち、ＤＮＡは宿主細胞内でエピソーム的に発現される）であり得る。
【０１１４】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関しては、発現ベクターおよび用いられるトランスフェクション法に依存して、細胞の小さなフラクションだけが、外来ＤＮＡをゲノムに組み込むことができ、残りのＤＮＡはエピソームに留まることが知られている。これらの組込み体を同定および選択するために、選択性マーカ（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子を、一般に関心対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。種々の選択性マーカ類には、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤耐性を与えるものが含まれる。選択性マーカをコードする核酸を、コードするベクターと同一のベクターにおいて宿主細胞に導入できるか、または別のベクターにおいて導入できる。導入された核酸により安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定できる（例えば、選択性マーカ遺伝子を導入した細胞は生存するが、その他の細胞は死滅する）。他の実施形態において、キメラペプチドまたはトランスフェクトされた細胞により変調された細胞は、内因性レポーター遺伝子発現の誘導により同定される。ある特定の実施形態において、プロモーターは、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現を駆動するインスリンプロモーターである。
【０１１５】
本発明の他の利点と特性は、以下の実施形態の実施例から明らかとなり、また添付の図面を参照とする。
【実施例】
【０１１６】
本発明を、以下の非限定的実施例においてさらに説明する。
【０１１７】
実施例１：キメラペプチド類およびディアトス（ＤＩＡＴＯＳ）ペプチドベクター（ＤＰＶ）類の合成
化学合成： ペプチド合成は、当業者に知られた方法によりなされる（オルターゲンおよびネオシステム（Ａｌｔｅｒｇｅｎ ａｎｄ Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ））。それらは、Ｆｍｏｃ樹脂上の固相中で用いられる。開裂は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりなされ、ペプチド類は、半分取ＨＰＬＣ−ＣＲＣ５カラム上で精製し、０．１％ＴＦＡ溶液で希釈し、ＴＦＡ中アセトニトリル勾配（１０％〜７０％）を用いた。凍結乾燥ペプチド類をＮａＣｌ０．１５Ｍに溶解した。
【０１１８】
本発明のペプチド類を含有する蛋白質の調製を可能にする分子構築：
分子生物学法により、一旦適切な細胞に導入し、ベクター化高分子合成を可能にするプラスミド類を構築することができる。
【０１１９】
組換え蛋白質発現のためのベクター類の構築：
図１は、本発明のペプチド配列を含有する組替え蛋白質の発現を可能にするベクター類の調製を示す。原核細胞ベクターｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））は、配列６ＸＨｉｓを有する融合蛋白質（または組換え蛋白質）の形態で遺伝子発現を可能にする。このベクターは、標識６ＸＨｉｓをコードする配列の３’に、複製ＣｏＩＥ１の源、ＩＰＴＧにより誘導可能なファージＴ５の強力プロモーター、アンピシリン耐性を供与するβ−ラクターゼの遺伝子、および複数クローン化部位を運び、６ＸＨｉｓ配列の相内で相補的ＤＮＡのクローン化を可能にする。
【０１２０】
６３−ｍｅｒの相補的オリゴヌクレオチド類：
ＰＡＶ１Ｕ：（配列番号：４９）
５’ｇａｔｃｃｇｔａａａａｃｇａｇｇａｃｔａａａａｃｔａｃｇａｃａｃｇｔａｃｇａｃｃａｃｇａｇｔａａｃａｃｇａａｔｇｇａｃｇｔａａ３’
ＰＡＶ１Ｌ：（配列番号：５０）
５’ｇａｔｃｔｔａｃｇｔｃｃａｔｔｃｇｔｇｔｔａｃｔｃｇｔｇｇｔｃｇｔａｃｇｔｇｔｃｇｔａｇｔｔｔｔａｇｔｃｃｔｃｇｔｔｔｔａｃｇ−３’をハイブリッド形成する。得られたＤＮＡセグメントは、５’にＢａｍＨＩ部位、および３’にＢｇｌＩＩ部位を有する。それは、ペプチド配列ＰＡＶ１：ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ（配列番号：５１）をコードする。この断片をベクターｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ部位にクローン化する。エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス（ＥＢＶ）のゼブラ（Ｚｅｂｒａ）ウィルス蛋白質（ＢＺＬＦ１）または核局在部位（ｎｌｓ）から３５個のアミノ酸が欠失したゼブラ蛋白質をコードする相補的ＤＮＡ（ＤＮＡｃ）が、ＰＣＲにより得られた。それらを、ベクターＨｉｓ−ＰＡＶ１またはｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。生じたプラスミド類は、大腸菌のトランスフォーメーション後、組換え蛋白質Ｈｉｓ６−ゼブラ−ＰＡＶ１、Ｈｉｓ６−ゼブラΔｎｌｓ−ＰＡＶ１、Ｈｉｓ６−ゼブラおよびＨｉｓ６−ゼブラΔｎｌｓの発現を可能にする。
【０１２１】
組換え蛋白質の誘導、抽出および精製：
組換えペプチドの生成は、４０μｇ／ｍｌのアンピシリンで補足されたルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）媒体中の指数増殖期における細菌培養液に１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加することにより３７℃で誘導される。ＩＰＴＧ添加１２時間後、細菌を４℃で５７００ｇ、１５分間遠心分離する。細菌残渣を５容量の変性溶菌緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．８；０．５ＭＮａＣＩ；１０％グリセロール；６Ｍグアニジン−ＨＣｌ）中に入れる。緩やかに攪拌しながら周囲温度で２０分温置後、溶解産物を、４℃で１５０００ｇ、３０分間遠心分離することにより澄明にする。組換え蛋白質を含有する上澄液を−８０℃で保存する。
【０１２２】
６ＸＨｉｓ組換え蛋白質を、変性溶菌緩衝液で予め較正した「タロン（ＴＡＬＯＮ）」樹脂カラム（クロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））上のアフィニティクロマトグラフィにより精製する。１０ｍＭイミダゾールを含有する１０容量の変性溶菌緩衝液で樹脂を３回連続洗浄後、カラムに結合した組換え蛋白質を２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．８；０．５ＭＮａＣＩ；１０％グリセロール；０．５ｍＭＰＭＳＦの緩衝液中の６Ｍから０Ｍのグアニジン−ＨＣｌの勾配により再変性させる。組換え蛋白質を、ｐＨ８．０、イミダゾールの２０ｍＭから１Ｍの勾配で溶出させる。種々の溶出液を１２％ＳＤＳ−アクリルアミド変性ゲル上で分析する。精製蛋白質を含有するフラクションを集め、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣＩ緩衝液に対して４℃で２時間透析する。該蛋白質を濃縮し、分割し、液体窒素中迅速凍結し、−８０℃で保存する。
【０１２３】
使用ペプチド類：
非官能性ペプチド類：
配列番号：１。ヒトリポ蛋白Ｂのアミノ酸配列（３３５８−３３７２）由来のヘパリンと反応するペプチド、カージンら（Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１５４：７４１頁（１９８８）、ＤＰＶ１とも称される。
配列番号：２。配列番号：１のヘパリン二量体と反応するペプチド、（ＤＰＶ１）２とも称される。
配列番号：３。配列番号：１のヘパリン三量体と反応するペプチド、（ＤＰＶ１）３とも称される。
配列番号：４。抗ＤＮＡモノクローナルマウス抗体Ｆ４．１の高頻度可変領域ＣＤ３に相当するペプチド（アブラミアスら（Ａｖｒａｍｅａｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５６０１頁（１９９８））。
配列番号：５。配列番号：１および配列番号：４を含有するペプチド。
配列番号：６。モノクローナルマウス抗体のＦ４．１のＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の一部を含有するペプチド（アブラミアスら（Ａｖｒａｍｅａｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５６０１頁（１９９８））。
配列番号：７。配列番号：１および配列番号：６を含有するペプチド。
配列番号：８。ヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＲＴＴ７９の高頻度可変ＣＤ３領域に相当するペプチド（スティーブンソンら（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ６：８０９頁（１９９３））。
配列番号：９。配列番号：１および配列番号：８を含有するペプチド。
配列番号：１０。ヘパリンと反応し、配列番号：１およびヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＮＥ−１の高頻度可変領域ＣＤＲ３に相当するペプチド配列を含有するペプチド（ヒラバヤシら（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：５３３頁（１９９３））、１０４７番とも称される。
配列番号：１１。配列番号：１およびヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＲＴ７２の高頻度可変領域ＣＤＲ３に相当するペプチド配列を含有するペプチド（カルシら（Ｋａｌｓｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｌｕｐｕｓ４：３７５頁（１９９５））。
配列番号：１２。細胞３Ｔ３および配列番号：６のＮＬＳ（核局在シグナル）配列を含有するペプチド。
配列番号：１３。配列番号：１および抗ＤＮＡヒトモノクローナル抗体ＮＥ−１のＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の配列を含有するペプチド。
配列番号：１４。マウスモノクローナル抗体Ｆ４．１のＣＤＲ３領域の一部および配列番号：６を含有するペプチド。
配列番号：１５。抗ＤＮＡヒトモノクローナル抗体ＮＥ−１の高頻度可変ＣＤＲ３領域に相当するペプチド配列を２倍含有するペプチド。
配列番号：１６。配列番号：１５中の１３〜１９位に配列番号：１を含有することから生じるペプチド。
配列番号：１７。ヘパリンと反応し、ヒトリポ蛋白Ｅのアミ酸配列から誘導されるペプチド（カージンら（Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｓｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１５４：７４１頁（１９８８））、ＤＰＶ４とも称される。
配列番号：１８。ヘパリンと反応し、アルギニンのアミノ酸配列から誘導されるペプチド（キャンパネリら（Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２２：１６６３〜１６７２頁（１９９６））、神経筋接合部の分化を調節する細胞外マトリックスの蛋白質。
配列番号：１９。配列番号：１８の二量体。
配列番号：２０。ヘパリンと反応し、インスリン成長因子結合蛋白質のアミノ酸配列から誘導されるペプチド、ＤＰＶ２とも称される（フォールケスら（Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：２２８０〜２２８５頁（１９９７））。
配列番号：２１。ヘパリンと反応し、血小板成長因子のＡ鎖のＣ末端部のアミノ酸配列から誘導されるペプチド（マーヘルら（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２２５１〜２２５３頁（１９８９））、ＤＰＶ６とも称される。
配列番号：２２。１２個のリジン（Ｋ）および配列番号：６を含有するペプチド。
配列番号：２３。１２個のリジン（Ｋ）および配列番号：５を含有するペプチド。
配列番号：２４。抗菌活性を有するペプチド（ジャバドプアら（Ｊａｖａｄｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３１０７〜３１１３頁（１９９６））。
配列番号：２５。ヘパリンと反応し、インスリン様成長因子結合蛋白質の配列に相当するペプチド（フォールケスら（Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：２２８０〜２２８５頁（１９９７））。
配列番号：２６。ヘパリンと反応し、ヒトジスムターゼスーパーオキシド配列のＣ末端部から誘導されるペプチドの二量体のペプチド（イノウエら（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ２６９：８９〜９２頁（１９９０））、（ＤＰＶ３）２とも称される。
配列番号：２７。ヘパリンと反応し、アミノ酸が立体配置Ｄにある配列番号：２６の配列に相当するペプチド。
配列番号：２８。ヘパリンと反応し、配列が配列番号：２６から誘導され、αｖインテグリン類（２１）を選択的に結合するモチーフＲＧＤを含有するペプチド。
配列番号：２９。ヘパリンと反応し、配列番号：１および配列番号：１７のペプチドよりなるペプチド、ＤＰＶ１〜ＤＰＶ４とも称される。
配列番号：３０。ヘパリンと反応し、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）の配列のＣ末端部から誘導されるペプチド（アーコナックら（Ａｒｋｏｎａｃ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４４００〜４４０５頁（１９９８））、ＤＰＶ７とも呼ばれる。
配列番号：３１。ヘパリンと反応し、アミノ酸がフロント−バック位にある配列が配列番号：１２であるペプチドに相当するペプチド。
配列番号：３２。ヘパリンと反応し、アミノ酸が立体配置Ｄにある配列番号：３０に相当するペプチド。
配列番号：３３。ヘパリンと反応し、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）の配列の一部を含有するペプチド（フロムら（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．３４３：９２頁（１９９７））、ＤＰＶ８とも称される。
配列番号：３４。ヘパリンと反応し、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の配列の一部を含有するペプチド、ＤＰＶ９とも称される（ヤヨンら（Ｙａｙｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ６４：８４１〜８４８頁（１９９１））。
配列番号：３５。ヘパリンと反応し、マウス腸管配列のＣ末端部に相当するペプチド（ゴ
ングキアオ（Ｇｏｎｇｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｌｙｃｏｎｊｕｇ Ｊ．１３：８１〜９０頁（１９９６））、ＤＰＶ１０とも称される。
配列番号：３６：ヘパリンと反応し、ヒトγインターフェロンのＣ末端配列の一部を含有するペプチド（ロルタ・ジャコブおよびグリマウド（Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ ＆ Ｇｒｉｍａｕｄ）、ＦＥＢＳ２８０：１５２〜１５４頁（１９９１））、ＤＰＶ１１とも称される。
配列番号：３７：ヘパリンと反応し、ヒトインターロイキン１２のサブユニットｐ４０配列の一部を含有するペプチド（ハサンら（Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．）、 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１０６４〜１０７０頁（１９９９））、ＤＰＶ１２とも称される。
配列番号：３８：ヘパリンと反応し、間質細胞から誘導される因子１α配列の一部を含有するペプチド（アマラら（Ａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２００〜２０４頁（１９９９））、ＤＰＶ１３とも称される。
配列番号：３９：ヘパリンと反応し、「ヘパリン結合蛋白質」（ＣＡＰ３７）の配列の一部を含有するペプチド（ポ−ルら（Ｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ２７２：２００〜２０４（１９９０））、ＤＰＶ１５とも称される。
配列番号：４０：ヘパリンと反応し、配列番号：１０（１０４７）の配列内のペプチドに加えて１３個のＮ末端リジンに相当するペプチド。
配列番号：４１：ヘパリンと反応し、配列番号：２８（（ＤＰＶ３）２）の配列内のペプチドに加えて１３個のＮ末端リジンに相当するペプチド。
配列番号：４２：ヘパリンと反応し、配列番号：３９（ＤＰＶ１０）の配列内のペプチドに加えて１３個のＮ末端リジンに相当するペプチド。
配列番号：４３：配列番号：１０（１０４７）および配列番号：２４の配列内のペプチドを含有する、抗菌活性を有するペプチド。
配列番号：４４：配列番号：２４および配列番号：３０（ＤＰＶ７）の配列内のペプチドを含有する、抗菌活性を有するペプチド。
配列番号：４５：配列番号：２４および配列番号：３８（ＤＰＶ１３）の配列内のペプチドを含有する、抗菌活性を有するペプチド。
配列番号：４６：配列番号：２６（ＤＰＶ３）２の配列内のペプチドに加えてＮ末端におけるグリシン−フタロシルを含有するペプチド。
配列番号：４７：配列番号：２１（ＤＰＶ６）の配列内のペプチドに加えてＮ末端におけるサリシリルモチーフを含有するペプチド。
配列番号：４８：配列番号：２１（ＤＰＶ６）の配列内のペプチドに加えてＣ末端におけるサリシリルモチーフを含有するペプチド。
【０１２４】
官能基化ペプチド類：
これらのペプチド類は、上記の配列番号：１から４８に相当するが、Ｎ末端側に、関心対象の幾つかの物質に共役カップリンングを可能にするシステイン、またはペプチド類と、ストレプトアビジンまたはペルオキシダーゼと共役したアビジンとの非共有的組合わせを可能にするビオチンのいずれかを運搬する。
【０１２５】
実施例２：カコ（Ｃａｃｏ）−２関門モデルの完全性
カコ−２細胞を、血清のない合成培地（基礎合成培地、ＢＤＭ）中に、ウシ皮膚コラーゲンで前もって被覆した、テレフタル酸ポリエチレン製ミクロ多孔性膜上に１６００００個の細胞／ｃｍ２の密度で接種した。前記培養培地を週に３回変えて、細胞を、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で１８日間維持した。カコ−２関門モデルの完全性をチェックするための陰性対照として、１０６ｄｐｍ／ｍｌＤ−［１４Ｃ］−マンニトールを用いた。陽性対照として、Ｌ−［３Ｈ］−プロリンを用いた：能動輸送−１０６ｄｐｍ／ｍｌ、最終濃度として１０μＭ。その他の対照としては、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトール／Ｌ−［３Ｈ］−プロリン＋ＤＰＶ７ ３０μｇ／ｍｌおよびＤ−［１４Ｃ］−マンニトール／Ｌ−［３Ｈ］−プロリン＋ＤＰＶ１０ ３０μｇ／ｍｌが挙げられた。
【０１２６】
経上皮輸送実験を実施した。カコ−２細胞単層の完全性をチェックするために経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。細胞単層を、ハンクス液（ＨＢＳＳ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭＨｅｐｅｓで補足）中、３７℃で８時間、予め温置した。１時間、２時間、４時間および８時間の時点で、１００μｌの培地を低区画部から集め、新鮮なＨＢＳＳにより置き換えた。実験終末時に（８時間）、細胞単層をＰＢＳで３回洗浄し、ＴＥＥＲを測定した。次に、細胞を４００μｌのトリスＨＣｌ０．１ＭｐＨ８．０、０．５％トリトンＸ１００中に集め、超音波により粉砕した。１００μｌの細胞ホモジネートに含まれた放射活性を測定した。放射活性物質量は、２ｍｌのアクアルマ（Ａｑｕａｌｕｍａ）カクテル（オランダ国シェスバーグのルマック（Ｌｕｍａｃ）／３Ｍｂｖ）中で光分散後、パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）トリカーブ（Ｔｒｉ−ｃａｒｂ）１６００ＣＡ装置（米国コネチカット州メリデンのパッカード・インスツルメント社（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて液体シンチレーション分光測定法により分析した。
【０１２７】
図２は、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトールおよびＬ−［３Ｈ］−プロリンの輸送を示す。
この結果は、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトールおよびＬ−［３Ｈ］−プロリンの経上皮輸送が最初の４時間は実験時間に比例することを示す。Ｌ−［３Ｈ］−プロリンの輸送（陽性対照）が、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトール（陰性対照）の輸送よりも高く、カコ−２腸管関門モデルが、ＤＰＶインスリン化合物の輸送を推定するために使用できることを示した。温置の４時間から８時間の間は、Ｌ−［３Ｈ］−プロリンの輸送は遅速し、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトールの輸送は有意に増加した。この観察は、ＨＢＳＳにおける長い温置による細胞単層の変化によるものである。輸送実験の終末時（ＨＢＳＳ中に温置８時間後）に測定されたＴＥＥＲ値の急激な減少は、これらの観察と相関性がある（表１）。
【０１２８】
３０μｇ／ｍｌのＤＰＶ７またはＤＰＶ１０の存在は、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトールまたはＬ−［３Ｈ］−プロリンの輸送に影響を与えず（図３）、実験の終末時に細胞と会合しているＤ−［１４Ｃ］−マンニトールおよびＬ−［３Ｈ］−プロリンの量にも影響を与えなかった（図４）。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
実施例３：インスリンおよびＤＰＶ−インスリン共役体の経上皮輸送
ＤＰＶ−インスリン共役体を合成した。手短に説明すると、インスリンを１０モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤、ＳＭＣＣにより活性化した。数回の洗浄ステップ後、ＤＰＶ７またはＤＰＶ１０を５倍モル過剰で加えた。サンプルを再度洗浄して、未結合物質を除去し、共役体をＳＤＳページ電気泳動分析によりチェックした。インスリン、ＤＰＶ７−インスリンおよびＤＰＶ１０−インスリンをＮａＣｌ０．１５Ｍで希釈し、最終濃度の０．６５ｍｇ／ｍｌを得た。各分子の３０μｇをカコ−２細胞単層上で温置した。
【０１３１】
経上皮輸送実験を実施した。カコ−２細胞単層の完全性をチェックするために経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。細胞単層を、ハンクス液（ＨＢＳＳ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭＨｅｐｅｓで補足）中、３７℃で３０分間、予め温置した。インスリン化合物を、細胞の先端側に面して、挿入物の上部区画に０．５ｍｌのＨＢＳＳ培地中、６０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。上部および下部区画は、それぞれ、０．５ｍｌおよび１．２５ｍｌのＨＢＳＳを含んでいた。該細胞単層をインスリン化合物と共に３７℃で１時間、４時間または８時間温置した。上部および下部区画の培地を集めた。細胞単層をＰＢＳで３回洗浄し、ＴＥＥＲを測定した。細胞を４００μｌのトリスＨＣｌ０．１ＭｐＨ８．０、０．５％トリトンＸ１００中に集めた。各条件で、３つの挿入体を用いた（三重体）。
【０１３２】
表２は、化合物との温置前後に測定されたＴＥＥＲ値を示している。この結果は、ＤＰＶ７−インスリンが、温置１時間および４時間後にＴＥＥＲの有意な減少を誘導したことを示し、カコ−２細胞単層の完全性がこれら２つの時点でＤＰＶ７−インスリンにより影響を受けたことを示した。ＴＥＥＲの崩壊と細胞形態における変化は、インスリンとＤＰＶ１０−インスリンでは観察されなかった。この結果はまた、３種の化合物との温置８時間後におけるＴＥＥＲの有意な減少を示した。これは、実施例１の結果と一致し、ＨＢＳＳ中、４時間より長い温置時間は、カコ−２細胞関門を変化させることを示している。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
実施例４：インスリン組成物の検出および定量
遊離インスリン濃度を、デイコ（Ｄａｋｏ）（引用文献Ｋ６２１９）からのＥＬＩＳＡキットにより測定した。ＤＰＶ−インスリン共役体を自己製造アッセイにより検出した。手短に説明すると、ＤＰＶ−インスリン共役体を、９６ウェルのミクロ滴定プレートのヘパリン被覆ウェル上に吸収させた。ＤＰＶ−インスリン共役体の濃度を、マウス抗インスリンモノクローナル抗体およびペルオキシダーゼ−結合副次抗体を用いてＥＬＩＳＡ誘導アッセイにより定量された。
【０１３５】
カコ−２細胞と共に温置後集めたサンプルを、ＢＳＡ被覆ミクロ管に移し、インスリン濃度を測定するまで−２０℃に保存した。この実験全体を通して、遊離インスリン濃度は頂点媒体中、安定に留まった。対照として、ＤＰＶ−インスリン共役体の頂点濃度は、時間の関数として減少した。８時間において、ＤＰＶ７−インスリンおよびＤＰＶ１０−インスリンの濃度は、それぞれ、最初の充填の２５％と３５％に相当した（図５）。ＤＰＶ−インスリン共役体の濃度における有意な減少は、１時間と４時間の時点でも観察された（図５）。これら２つの時点において、ＤＰＶ−インスリン共役体の濃度は、両共役体に関して１時間の時点で最初の充填の７０％であり、４時間の時点でＤＰＶ７−インスリンおよびＤＰＶ１０−インスリンに関して、それぞれ、最初の充填の５４％と６４％であった。
【０１３６】
少量の遊離インスリンを、基底外側培地中に検出した（充填物の０．２％）。可能性としてＤＰＶ−インスリン共役体の有意な量は、基底外側培地中に検出されなかったが、これは恐らくＤＰＶ−インスリン共役体検出のためのアッセイは、遊離インスリン検出のためのデイコ（Ｄａｋｏ）アッセイよりも１０００倍感度が低いためと思われる。この感度の差を考慮すると、このような少量のＤＰＶ−インスリン共役体を検出するのは困難であったと思われる。
【０１３７】
極少量の遊離インスリンが、細胞溶解産物中に見出された（最初の充填の０．００４％）。対照として、輸送の１時間後、細胞溶解産物中に検出されたＤＰＶ７−インスリンおよびＤＰＶ１０−インスリンの量は、それぞれ、最初の充填の１％と４％に達した（図６）。これらの濃度は、実験全体を通して安定であり、化合物が細胞内に蓄積されず、カコ−２細胞から出ていったことを示唆した。
【０１３８】
カコ−２細胞を増殖させたフィルタもまた、インスリンおよびＤＰＶ−インスリン共役体の存在下で分析した。遊離およびＤＰＶ−インスリン共役体を、同一の定量アッセイを用いてフィルタ上で検出し、フィルタ上に残存した化合物量の直接比較を可能にした。
【０１３９】
結果は、少量の遊離インスリンだけがフィルタ上に残存していたことを示した。対照的に、ＤＰＶ１０またはＤＰＶ７とカップリングしている場合、インスリン共役体は、明らかに細胞培養挿入体上に捕捉されて滞留した。
【０１４０】
実施例５：ＤＰＶ−インスリン共役体のｉｎ ｖｉｔｒｏ定量
ＤＰＶ−インスリン共役体を、実施例２に記載されたとおり合成した。共役体濃度の測定を検定するために、幾つかの試験を実施する。インスリン−ＤＰＶ共役体の認識は、ＲＩＡ試験を用いて確認されている。共役体が抗インスリン抗体によって認識されることを確認し、また共役体がＲＩＡ試験を用いて正確な感度で定量できるかどうかを確かめるために、遊離インスリンと平行して、各共役体に関しｉｎ ｖｉｔｒｏで標準濃度曲線を確立する。
【０１４１】
実施例６：ＤＰＶ−インスリン共役体のｉｎ ｖｉｖｏ定量
ＤＰＶ−インスリン共役体を、実施例２に記載されたとおり合成した。高血糖ラットへの適切な濃度の共役体の皮下注射後、ＤＰＶ−インスリン共役体の活性を、ｉｎ ｖｉｖｏ評価する。対照は、遊離インスリンまたはＮａＣｌのいずれかを注射する。血液サンプルを、予め決められた時点で採取し、インスリン濃度およびブドウ糖濃度の双方をそれぞれ、ＥＬＩＳＡおよびブドウ糖酸化酵素法を用いて分析した。血中インスリン濃度の増加、およびその後の血糖濃度の減少により、ＤＰＶ−インスリン共役体が生物学的に活性であることが示される。
【０１４２】
実施例７：経口投与後のＤＰＶ−インスリン共役体のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＤＰＶ−インスリン共役体による腸管関門の通過を評価するために、化合物を高血糖ラットの回腸管腔に挿入する。処理ラットの血中インスリン通過の評価前に、対照に遊離インスリンまたはＮａＣｌを投与する。
【０１４３】
投与後少なくとも３時間の間１５分ごとに、次いで、次の１２時間は１時間ごとに全動物について糖血を管理する。血液サンプルは、予め決められた時点で採取し、ブドウ糖酸化酵素法を用いてブドウ糖濃度を分析した。血糖濃度の減少は、インスリンの腸管関門通過を示す。
【０１４４】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験で、インスリンの生物学的活性を示さない動物に関しても、ｉｎ ｖｉｔｒｏ定量が、ＲＩＡ試験を用いて可能であり、皮下注射後、１時点で全ラットから血液を採取し、インスリン共役体の濃度を、各血液サンプル中のＲＩＡにより測定する。インスリンのこの直接検出により、共役体が腸管関門を通過したかどうかの決定が可能となる。
【０１４５】
実施例８：形態学的および免疫細胞化学試験
密着結合の完全性を立証するために、ＤＰＶ−インスリン共役体と接触させた高血糖ラットの小腸回腸組織を採取する。インスリンの経細胞輸送を証明するために、免疫細胞化学試験を、単一時点（３０分または６０分）後に実施する。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】本発明のペプチド類を含有する組換え蛋白質発現のためのベクター類調製の図式的説明を示す図である。
【図２】Ｄ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリン輸送の動力学を示す線グラフである。
【図３Ａ】３０μｇ／ｍｌのＤＶＰ７−インスリンの存在下、Ｄ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリン輸送の動力学を示す線グラフである。
【図３Ｂ】３０μｇ／ｍｌのＤＶＰ１０−インスリンの存在下、Ｄ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリン輸送の動力学を示す線グラフである。
【図４】Ｄ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリンを単独で（対照）、または３０μｇ／ｍｌのＤＶＰ７またはＤＶＰ１０の存在下、温置した場合の温置８時間後、細胞と会合したＤ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリンを示す棒グラフである。
【図５】頂点培地におけるインスリンおよびＤＰＶ−インスリン共役体の濃度を示す棒グラフである。
【図６】細胞溶解産物中のＤＰＶ−インスリン共役体濃度を時間の関数として示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に糖尿病治療の組成物と方法に関し、より具体的には、血中インスリン濃度を増加させる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、１６００万人近いアメリカ人が患っている疾病である。Ｉ型糖尿病、もしくは若年性糖尿病は、インスリンの絶対的不足と生命維持のための外因性インスリンへの依存により特徴づけられる。おおよそ８０万人〜１６０万人の人々がＩ型糖尿病と診断されている。ＩＩ型糖尿病は、身体が自己の産生したインスリンを適切に使用しない代謝障害から生じる。おおよそ１５００万人の人々がＩＩ型糖尿病を有している。費用の合計（間接的および直接的）は９８０億ドルを超えている。
【０００３】
現在、Ｉ型糖尿病の長期治療は、主に外因性インスリンを皮下注射することに頼っている。しかし、この治療法は、通常、食事、運動などに関連して生じるインスリン分布の分刻みの微妙な調節を模することができないため、至適な代謝コントロールを提供していない。バイオテクノロジーの出現により、多くの異なったタイプのインスリンが生産され、それらの発現、ピーク、および作用継続時間を変えられるようになっても、１日を通して適切にブドウ糖濃度をコントロールするのは依然として難しい。糖尿病患者がインスリン注射を行うと、末梢組織が高濃度のインスリンに晒されるため、これらの患者において肝臓の代謝を適切に調節することはより困難となる。１日に複数回（２〜４回）の注射を用いることにより、正常に近い血糖を有する良好な代謝コントロールが立証されたとしても、このような多数回注射による不便さによって、この療法の広範な使用が妨げられる。
【０００４】
最も便利で快適、受容可能でかつ容易な送達経路は経口であると考えられる。投与部位として胃腸（ＧＩ）粘膜は、他の粘膜より大きな利点を幾つか与える。これらの利点としては、以下のものが挙げられる：（１）多くの人々にとって、経口投与は馴染み深く便利で受容できる投与手段である；（２）ＧＩ上皮は吸収にとって広い表面積を提供する；（３）ＧＩ上皮は多量の血液供給に密接な関連性を提供する。インスリンのようなホルモンは、上部胃腸管の苛酷な環境を通過することができないため皮下経路によって投与される。皮下注射とは異なり、インスリンの経口送達は、健康な非糖尿病者に見られる膵臓から肝門循環への生理的インスリン輸送を模することができると考えられる。しかしながら、インスリンを完全に経口送達することは実際上不可能であると考えられる。経口投与されたインスリンの吸収は、最良の実験条件下でも０．５％以下である。たとえ少量のインスリンが奇跡的に上部胃腸管を通過できたとしても、このホルモンは相当大型で親水性であるため、腸関門を通過することが不可能となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血清インスリン濃度の増加と血清ブドウ糖濃度の減少に有用なキメラインスリンペプチド類に関する。また、本発明により、糖尿病、すなわちタイプＩまたはタイプＩＩの糖尿病を患っている患者を治療する方法が提供される。
【０００６】
本発明の組成物は、ディアトス（Ｄｉａｔｏｓ）ペプチドベクター（ＤＰＶ）類が、通常は生理学的関門、より具体的には腸上皮関門を越えて輸送されることのできない分子の輸送を可能にするという発見に一部基いている。例えば、インスリンなどの高分子類を本明細書に記載されているＤＰＶ類を用い、腸上皮関門を越えて輸送することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
種々の態様において、本発明はキメラペプチドを提供する。キメラペプチドは、原形質膜、ミトコンドリア膜、または核膜などの生体膜をトランスロケーションさせることができる。他に、キメラペプチドは、胃腸関門、血液脳関門、皮膚関門、気道上皮関門、経膜関門、鼻内関門および眼関門などの生理学的関門をトランスロケーションする。
【０００８】
一態様において、本発明は、第１のドメインと第２のドメインを有するキメラペプチドを提供する。第１ドメインは、生体膜を越えた能動輸送を促進するトランスロケーション配列であり、第２ドメインは、インスリンペプチドの少なくとも一部である。
【０００９】
トランスロケーション配列はリポ蛋白の一部である。また、トランスロケーション配列は、少なくとも４個の塩基性アミノ酸、例えば、リジンまたはアルギニンである。トランスロケーション配列は、ヘパリン、または硫酸コンドロイチンなどのアミノグリカンに結合していることが好ましい。
【００１０】
第１ドメインは、（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；（ｃ）
（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；および（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｘは非塩基性アミノ酸であり；ｍの各々は独立してゼロから５までの整数であり；ｎの各々は独立して１から１０の間の整数であり；ｏの各々は独立してゼロから５の間の整数である）よりなる群から選択されるアミノ酸配列である。ある一定の実施形態において、ｎは２または３であり得、Ｘは疎水性アミノ酸であり得る。
【００１１】
第１ドメインのアミノ酸配列は、１００個未満のアミノ酸長であり；５０個未満のアミノ酸長であり；２５個未満のアミノ酸長である。第１ドメインのアミノ酸配列は、ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ（配列番号：３０、ＤＰＶ７）またはＳＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ（配列番号：３５、ＤＰＶ１０）であることが好ましい。
【００１２】
前記キメラペプチドは、（ａ）ヒト抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域；（ｂ）ヒト抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域；（ｃ）マウス抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域；および（ｄ）マウス抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域などの抗体断片のアミノ酸配列をさらに含んでなってもよい。
【００１３】
他の態様において、本発明は、第１ドメイン、第２ドメインおよび第３ドメインを有するキメラペプチドを提供する。第１ドメインと第２ドメインは、（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；（ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎまたはｆ）（抗体断片）ｎ（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｘは非塩基性アミノ酸であり；ｍの各々は独立してゼロから５までの整数であり；ｎの各々は独立して１から１０の間の整数であり；ｏの各々は独立してゼロから５の間の整数である）のアミノ酸配列を含んでなる。第１ドメインは第２ドメインとは異なる。第３ドメインは、インスリンポリペプチドの少なくとも一部である。前記キメラペプチドは、生体膜または生理学的関門を越えてトランスロケーションする。
【００１４】
さらに、他の態様で、本発明は、（ａ）抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域の少なくとも一部；（ｂ）抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域の少なくとも一部；および（ｃ）インスリンポリペプチドの少なくとも一部を含んでなり、ペプチドが生体膜にトランスロケーションするキメラペプチドを提供する。
【００１５】
本発明はまた、前記キメラペプチドと担体との組成物を提供する。前記組成物は経口投与に好適である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、本発明の組成物を含んでなるキットを提供する。
【００１７】
本発明はまた、細胞と本発明の組成物とを接触させることによって、細胞内のブドウ糖濃度を減少またはインスリン濃度を増加させる方法を提供する。他に、血清中ブドウ糖濃度の減少とインスリン濃度の増加を必要とする患者に本発明の組成物を投与させることにより、患者の血清中ブドウ糖濃度を減少させ、インスリン濃度を増加させる。
【００１８】
他に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有している。本明細書中に記載されているものと同様の、または等価の方法と材料が本発明の実践または試験において使用できるが、好適な方法と材料が以下に記載されている。本明細書中に挙げられた全ての出版物、特許出願、特許および他の文献は、その内容全体が本明細書に援用されている。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が規制することになる。なお、材料、方法および例は、ただ例示のためであって限定する意図はない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、血清インスリン濃度の増加と血清ブドウ糖濃度の減少に有用なキメラインスリンペプチド類を含有する組成物を提供する。キメラペプチド類は、患者におけるインスリンの生物学的利用能を調節するために使用できる。本発明のキメラペプチド類、または、これらのキメラペプチド類をコードする核酸類は、薬剤組成物中に組み込まれ、糖尿病、すなわち、タイプＩまたはタイプＩＩ糖尿病の治療のために、患者に投与することができる。
【００２０】
種々の態様において、本発明は、インスリンポリペプチドの少なくとも一部を含有する第２ドメインと操作可能に結合したトランスロケーション配列を含有する第１ドメインを含むキメラペプチドを提供する。第１ドメインと第２ドメインは前記ペプチド中いずれの順序においても生成でき、また、前記ペプチドは各ドメインの１個以上を含むことができる。
【００２１】
本明細書中で用いられる「キメラ蛋白質」または「キメラペプチド」は、非インスリンポリペプチドに操作可能に結合したインスリンポリペプチドの少なくとも一部を含む。「インスリンポリペプチド」とは、インスリンポリペプチドのアミノ酸配列またはインスリンポリペプチドの少なくとも一部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはインスリンポリペプチドのアミノ酸配列またはインスリンポリペプチドの少なくとも一部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を言い、一方、「非インスリンポリペプチド」とは、インスリンと実質的に相同ではない蛋白質、例えば、インスリンポリペプチドまたは断片とは異なり、同一または異なる生物に由来する蛋白質に対応するアミノ酸を有するポリペプチドを言う。インスリンキメラペプチド内で、インスリンポリペプチドはインスリンポリペプチドの全体、または一部に対応し得る。
【００２２】
用語の「操作可能に結合した」は、第１ドメインと第２ドメインが、インスリンポリペプチドと少なくとも１つの機能との関連を可能にするような様式で、化学的に結合している（最も典型的には、ペプチド結合などの共有結合により）ことを示すことが意図されている。キメラペプチドをコードする核酸を言うために用いられる場合は、操作可能に連結したと言う用語は、第１ドメインをコードする核酸とインスリンポリペプチドとが互いにフレーム内で融合していることを意味する。第１ドメインはインスリンポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合し得る。
【００２３】
「トランスロケーション配列」とは、それが存在するペプチドに所望の細胞目的地を指令するいずれかのアミノ酸配列を言う。したがって、トランスロケーション配列は、生体膜、例えば、リン脂質膜、ミトコンドリア膜、または核膜を越えてペプチドが浸透することを指令または促進することができる。例えば、トランスロケーション配列は、ペプチドを細胞の外側から、原形質膜を通し、また、細胞質内へ、または細胞内の所望の場所、例えば、核、リボソーム、ミトコンドリア、ＥＲ、リソソーム、またはペルオキシソームへと指令する。他に、またはそれに追加して、トランスロケーション配列は、血液脳関門、経膜関門、または血液脳血管関門、血液腎関門、胃腸関門、肺関門などの生理学的関門を越えて、ペプチドを指令することができる。
【００２４】
トランスロケーション、すなわち生体膜または生理学的関門を越えた浸透は、種々の方法、例えば、培養細胞の存在下、キメラペプチドの第１の温置ステップに続く固定化ステップ、およびそれらの細胞の透過性増加、次に細胞内キメラペプチドの存在の明示を行う細胞浸透試験によって測定できる。前記明示ステップは、キメラペプチドに対して標識化され指令された抗体の存在下、もう一度温置してから、細胞質中、または細胞核の直近、またはさらに細胞核中で前記配列と標識化抗体との間の免疫反応を検出することによって行われる。明示はまた、本発明におけるアミノ酸配列を標識化し、細胞分画中のこの標識の存在を検出することによっても行われる。細胞貫通試験は上記の国際公開第９７／０２８４０号に記載された。
【００２５】
トランスロケーション配列は、エネルギーを要する、すなわち能動輸送であり得る。あるいは、トランスロケーションは、エネルギーを要しない、すなわち受動輸送である。
【００２６】
トランスロケーション配列は、いかなる長さでもよい。例えば、トランスロケーション配列は、６００個未満のアミノ酸長、例えば、５００、２５０、１５０、１００、５０、２５または１０個以下のアミノ酸長である。トランスロケーション配列は、少なくとも４個の塩基性アミノ酸からなる。
【００２７】
トランスロケーション配列は、公知の配列から誘導される。例えば、トランスロケーション配列は、ヒトリポ蛋白Ｂ、ヒトリポ蛋白Ｅなどのリポ蛋白；ＣＤＲ２領域またはＣＤＲ３領域などの免疫グロブリン分子；アグリン（ａｇｒｉｎｅ）；ＦＧＦ；またはＰＧＦの配列を含み得る。
【００２８】
トランスロケーションは、さらに、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、およびそれらの誘導体と反応する能力によって特徴づけることが好ましい。グリコサミノグリカン類（ＧＡＧ）、より一般的にはアミノグリカン類、特にヘパリン、硫酸ヘパリンおよび硫酸コンドロイチンと結合しているペプチド類は、上記のペプチド類のように元々天然物であることも、あるいは人工物であることもある。それらは、天然の形態またはポリマー（ダイマー、トリマーなど）の形態で使用できる。「ヘパリンまたは硫酸コンドロイチン誘導体」または「ヘパリン様アミノグリカン類または硫酸コンドロイチン」とは、参照に引用した刊行物（カージンおよびウェイントラウブ（Ｃａｒｄｉｎ ＆ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ９：２１頁（１９８９）；マートンら（Ｍｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３６５頁（１９９２）；デイビッド（Ｄａｖｉｄ）、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：１０２３頁（１９９３））に記載されているような生成物または副生成物を意味すると解される。
【００２９】
トランスロケーション配列の例としては、以下の式：
（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；（ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎまたは（ｆ）（抗体断片）ｎ（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｘは非塩基性、好ましくはアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンなどの疎水性アミノ酸であり；ｍはゼロから５の間の整数であり；ｎは１から１０の間、好ましくは１から３の間の整数であり；ｏはゼロから５の間の整数である）のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。
【００３０】
抗体断片は、完全長免疫グロブリンポリペプチドより小さい、例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＦｖまたはＦｃを含むことを意味する。前記抗体は、例えばヒトまたはマウスであり得る。前記抗体は、抗−ＤＮＡ抗体であることが好ましい。前記抗体フラグメントは、ある抗体のＣＤＲ２領域の全部または部分を含有することが好ましい。あるいは、前記抗体は、ある抗体のＣＤＲ３領域の全部または部分を含有する。より具体的には、前記抗体断片はＲＴＴ７９、ＮＥ−１およびＲＴ７２などの、抗−ＤＮＡヒト抗体のＣＤＲ３領域の少なくとも１つを含有する。
【００３１】
「全部または部分」により、ベクターが細胞内部へ進入する能力を維持する条件で、抗体断片が対象ＣＤＲ領域の全体またはその部分のみのいずれかを含有し得る（機能的相同体）ことが解される。「ＣＤＲ領域の部分」により、１個以上の末端アミノ酸から誘導されたＣＤＲ領域が解される。それはまた、１個以上の内部残基が欠失した、または他のアミノ酸、好ましくは同じ性質のアミノ酸（例えば、塩基性アミノ酸）に置換されたＣＤＲ領域でもあり得る。
【００３２】
トランスロケーション可能な配列の例としては、配列番号：１〜４８が挙げられる。トランスロケーション可能な好ましいアミノ酸配列は、ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ（配列番号：３０）およびＳＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ（配列番号：３５）である。一般的に、第１ドメインのアミノ酸配列は１００個未満のアミノ酸長；５０個未満のアミノ酸長；または２５個未満のアミノ酸長である。第１ドメインは６個から２５個のアミノ酸であることが好ましい。
【００３３】
本明細書中に用いられる用語の「インスリン」は、生物学的に活性なインスリン類似体、天然抽出インスリン、または組換えにより生産されたインスリンを包含すると解される。生物学的に活性とは、該分子が糖尿病の疾患症状を抑制または予防する、例えば、血清ブドウ糖を減少させる能力を有することを意味する。生物学的に活性なインスリンとしては、プレプロインスリン、プロインスリン、インスリンのアルファ鎖、インスリンのベータ鎖、および成熟インスリン、例えば、アルファ鎖、ベータ鎖が挙げられる。インスリンは、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、イヌまたはマウスなどの任意の種から誘導し得る。
【００３４】
用語は、実質的に精製された形態における、通常、糖尿病の治療に用いられるポリペプチドを包含することが意図されるが、さらに商品として入手できる賦形剤を含む薬剤形態における用語の使用を包含する。本発明において使用するインスリンは、ノボ・ラボラトリーズ社（Ｎｏｖｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（コネチカット州ダンベリー）、米国ノルディスク社（Ｎｏｒｄｉｓｋ−ＵＳＡ）（メリーランド州ロックビレ）およびイーライ・リリー社（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）（インディアナ州インディアナポリス）などの多数の商業的供給元から入手可能である。
【００３５】
本発明の方法を実施する場合には、ブタ由来インスリン、ヒト半合成インスリン（米国ノルディスク）およびクローン化組換えインスリン（イーライ・リリー）が使用可能である。前記インスリンは、組換え生産されることが好ましく、また、加水分解されているか、溶液中であり得る。
【００３６】
用語の「インスリン類似体」などは、本明細書中では、交換可能に用いられ、ポリペプチド鎖内の１個以上のアミノ酸が替わりのアミノ酸で置換されている、および／または１個以上のアミノ酸が欠失している、またはさらに１個以上の追加のアミノ酸がポリペプチド鎖またはアミノ酸配列に付加されている、上記に定義した「インスリン」の任意の形態であって、天然インスリンの、例えば、血中ブドウ糖濃度を低下させるなどの少なくとも１つの機能を依然として有しているものを包含することが意図されている。一般に、本発明の用語の「インスリン類似体」は、米国特許第５，５４７，９２９号に開示され、その内容全体が本明細書に援用されている「インスリンリスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）類似体」；ＬｙｓＰｒｏインスリンおよびヒトインスリンを含むインスリン類似体、および他の「スーパーインスリン類似体」を含み、前記インスリン類似体の血清ブドウ糖濃度に作用する能力は、従来のインスリンならびに脂肪組織におけるよりも肝臓においてより活性である肝選択的インスリン類似体に比較して、実質的に増大している。好ましい類似体は、インスリンリスプロ、すなわち、血中ブドウ糖濃度を低下させるために投与される化合物などの、インスリンと同じ一般的目的のために使用されるインスリン様化合物である単量体インスリン類似体である。
【００３７】
新規のインスリンＡ鎖変異体もまた、本発明に有用である。ヒトインスリンＡ鎖類似体は、ＣｙｓＡ６残基とＣｙｓＡ１１残基との間の本来の分子内ジスルフィド結合を保存し、７位と３０位の２つのセリンが、天然インスリンのＢ鎖によって形成された２つの鎖間ジスルフィドブリッジに含まれるシステインに取って代わられている。
【００３８】
インスリンポリペプチド、および／またはインスリンポリペプチドをコードする核酸は、当業界に知られているインスリンをコードする配列を利用して構成可能である。インスリンポリペプチド、およびインスリンポリペプチドをコードする核酸の供給元としては、ジーンバンク受け入れ番号６００１６５Ａ；５５００８５Ａ；ＡＡＨ０５２５５；ＡＡＡ５９１７９が挙げられ、それらの内容全体が本明細書に援用されている。
【００３９】
インスリン分子の例としては、限定はしないが、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号：５２、ヒトインスリン）；
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号：５３、ヒトリスプロインスリン）；
ＧＩＶＥＱＣＳＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＳＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号：５４、ヒト「ミニインスリン」）；
ＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ（配列番号：５５、ウシインスリン）；および
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ（配列番号：５６、ブタインスリン）が挙げられる。
【００４０】
所望の場合、１個以上のアミノ酸が、トランスロケーション配列を含んでなる第１のペプチド部分と、インスリンを含んでなる第２のポリペプチド部分との間に挿入可能である。幾つかの実施形態において、第１のドメインまたは第２のドメインは、トランスロケーション配列とインスリンとの会合を促進する配列を含む。
【００４１】
一実施形態において、キメラペプチドは、インスリンポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性部分を含んでなる。他の実施形態において、キメラペプチドは、インスリンポリペプチドの少なくとも２つの生物学的活性部分を含んでなる。さらに他の実施形態において、キメラペプチドは、インスリンポリペプチドの少なくとも３つの生物学的活性部分を含んでなる。
【００４２】
トランスロケーション配列とインスリン配列とは、当業界に知られたいずれかの好適な方法で、化学的カップリングにより結合可能である。多くの知られた化学的架橋法は非特異的である。すなわち、それらはカップリングの位置をトランスロケーション配列上、またはインスリン上の特定の部位に指令しない。その結果、非特異的架橋剤の使用によって機能的部位または立体的ブロック活性部位が攻撃され、共役蛋白質は生物学的に不活性となり得る。
【００４３】
カップリングの特異性を高める１つの方法は、架橋されるポリペプチドの１つまたは両方において、わずか１度か２〜３度見出される官能基に直接化学的カップリングを行うことである。例えば、多くの蛋白質において、チオ基を含有する唯一の蛋白質アミノ酸であるシステインは、２〜３度しか見出されない。また、例えばポリペプチドがリジン残基を含有しない場合、第一級アミンに特異的な架橋剤は、そのポリペプチドのアミノ末端に選択的となる。カップリング特異性を高めるために、この方法を首尾良く利用するには、ポリペプチドが分子の生物学的活性を失うことなく変更し得るその分子領域にほどよく希少で反応性の残基を有することが必要である。
【００４４】
システイン残基が、ポリペプチド配列の部分に見出される場合は置換し得るが、そうでない場合は、架橋反応におけるそれらの関与により、生物学的活性が妨害され易いと考えられる。システイン残基が置換される場合は、その結果生じるポリペプチドの折りたたみにおける変化を最少にすることが典型的に望ましい。ポリペプチドの折りたたみにおける変化は、前記置換が化学的および立体的にシステインと同様である場合に最小化される。これらの理由で、システインの置換としては、セリンが好ましい。下記の例で説明されるように、システイン残基は架橋を目的としてポリペプチドのアミノ酸配列中へ導入し得る。システイン残基を導入する場合は、アミノ末端またはカルボキシ末端、またはその近辺への導入が好ましい。関心対象のポリペプチドの生産が化学合成によるものとしても、組換えＤＮＡの発現によるにしても、このようなアミノ酸配列の修飾には慣例的方法が利用できる。
【００４５】
２つの構成要素のカップリングは、カップリング剤または共役化剤によって達成可能である。利用可能ないくつかの分子間架橋試薬がある。例えば、ミーンズおよびフィーニー（Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ）、「ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、ホールデン・デイ（Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ）、１９７４年、３９〜４３頁を参照されたい。それらの試薬の中では、例えば、プロピオン酸Ｊ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（双方ともスルフヒドリル基に対して特異性が高く、非可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６個から１１個の炭素メチレンブリッジを有する他のそのような試薬（スルフヒドリル基に対して、比較的特異性がある）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノ基およびチロシン基と非可逆的結合を形成する）がある。この目的のために有用な他の架橋試薬としては、Ｐ，Ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基およびフェノール基と非可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（アミノ基に対して特異的）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアナートまたはジイソチオシアナート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアナート（主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（いくつかの異なった側鎖と反応する）およびジスジアゾベンジジン（主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）が挙げられる。
【００４６】
架橋試薬はホモ二官能性であり得る。すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有し得る。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは緩和条件（ｐＨ６．５〜７．７）下で、スルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含有する。この２つのマレイミド基は炭化水素鎖によって連結している。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含有するポリペプチドの非可逆的架橋にとって有用である。
【００４７】
架橋試薬はヘテロ二官能性でもあり得る。ヘテロ二官能性架橋試薬は、２つの異なる官能基、例えば、それぞれ遊離アミン類とチオール類を有する２つの蛋白質を架橋するアミン反応性基とチオール反応性基とを有する。ヘテロ二官能性架橋試薬の例として、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）および、ＭＢＳの伸長鎖類似体である４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミド（「ＳＭＰＢ」）がある。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、第一級アミンと反応し、チオール反応性のマレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００４８】
架橋試薬は水に低溶解性であることが多い。その水溶性を改善するために、スルホン酸エステル基などの親水性部分を架橋試薬に添加し得る。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性に関して修飾された架橋試薬の例である。
【００４９】
多くの架橋試薬は、細胞条件下で本質的に非開裂的な共役体を生成する。しかし、細胞条件下で開裂可能なジスルフィドなどの共有結合を含有する架橋試薬もいくつかある。例えば、トラウト（Ｔｒａｕｔ）の試薬、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（「ＤＳＰ」）および３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（「ＳＰＤＰ」）は周知の開裂可能な架橋剤である。開裂可能な架橋剤の使用により、標的細胞内への送達後にインスリンをトランスロケーション配列から分離することが可能になる。直接ジスルフィド結合もまた、有用であり得る。
【００５０】
上記で検討したものを含む多数の架橋試薬が商品として入手可能である。それらの使用に関する詳細な説明は商品供給者から容易に入手可能である。蛋白質架橋剤および蛋白質共役剤についての一般的参考文献は、ウォング（Ｗｏｎｇ）、「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ」、ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）（１９９１）である。
【００５１】
化学的架橋は、スペーサアームの使用を含む。スペーサアームは、分子内柔軟性を提供するか、または、共役部分間の分子内距離を調整し、それによって、生物学的活性の保持を補助し得る。スペーサアームは、スペーサアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形態であり得る。他にスペーサアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（イリノイ州ロックフォードのピアス・ケム社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）、カタログ番号２１６５１Ｈ）内など、架橋試薬の部分であり得る。
【００５２】
キメラペプチドは、１つ以上の追加部分に結合し得る。例えば、キメラペプチドはＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）蛋白質に結合し得るが、ここでキメラペプチドはＧＳＴ配列のＣ末端に融合している。このような融合蛋白質はキメラペプチドの精製を促進し得る。
【００５３】
他にキメラペプチドは、公知の好適な宿主細胞内に簡便に発現し得るトランスロケーション配列とインスリン配列とを含む融合ペプチドとして生産し得る。本明細書中に記載された融合ペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ法と類似した、またはそれから容易に適合し得る方法で形成し、使用し得る。
【００５４】
一般に、本発明のアミノ酸配列（配列番号：１〜４８）は、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンにおける場合のように、塩基性アミノ酸を多数含む。「多数」とは、少なくとも３に等しいと解すべきである。
【００５５】
１つの特に興味深いアミノ酸配列は、以下の点で配列番号：１の配列である。（１）少なくとも二量体の状態で、それは所望の性質を有する。（２）モノマー、またはポリマーの状態で、それがカップリングしている他のアミノ酸配列に前記性質を与えるか、またはそのアミノ酸配列がすでにそれらの性質を有している場合は、それらを大幅に増強する。同様に、ＤＰＶ３、（ＤＰＶ３）２、ＤＰＶ６、ＤＰＶ７、ＤＰＶ１０およびＤＰＶ１３と称されるペプチド類はこの増強能力を有している。
【００５６】
本発明はまた、血清インスリン濃度を増加させるか、または血清または細胞内ブドウ糖濃度を減少させる方法を提供する。必要としている患者において、血清ブドウ糖濃度を減少させるか、またはインスリン濃度を増加させる。本発明のキメラペプチドを含有する組成物を投与することによって、血清または細胞内のインスリン濃度を増加させること、または血清または細胞内のブドウ糖濃度を減少させること。患者は当業界で公知の方法により、血清ブドウ糖濃度または血清インスリン濃度を測定することにより同定される。前記患者のインスリン濃度またはブドウ糖濃度が正常範囲にない場合、前記患者は血清インスリン濃度の増加または血清ブドウ糖濃度の減少を必要としている。正常なブドウ糖濃度は、６０〜１２０ｍｇ／ｄｌである。正常なインスリン濃度は、７ｍＵ／ｍＬ±３ｍＵである。例えば、患者の血清ブドウ糖濃度が１２０ｍｇ／ｄｌを超える場合、その患者は、血清ブドウ糖濃度を減少させる必要がある。対照的に、ブドウ糖濃度が６０〜１２０ｍｇ／ｄｌの間にある患者は血清ブドウ糖濃度を低下させる必要はない。投与後、患者の血清ブドウ糖は、少なくとも６０〜１２０ｍｇ／ｄｌの間にあることが好ましい。例えば、血清インスリン濃度が４ｍＵ／ｍＬ未満である場合、患者はインスリン濃度を増加させる必要がある。投与後、血清インスリン濃度は、７ｍＵ／ｍＬ±３ｍＵであることが好ましい。
【００５７】
さらに、本発明は、そのような治療または予防が望まれる患者に、患者における糖尿病を治療または予防する十分な量で、本発明のキメラペプチドを含有する組成物を投与することにより、糖尿病を治療または予防する方法を提供する。治療の有効性は、糖尿病を診断または治療するいずれかの公知の方法と関連して決定される。糖尿病は、例えば、過度の排尿、強い口渇と空腹、強度の疲労、皮膚の乾燥、または原因不明の体重減少により診断される。
【００５８】
前記患者は、例えばいずれかの哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタであり得る。
【００５９】
本発明のキメラペプチドまたはこれらのキメラペプチドをコードする核酸分子（本明細書では、「治療剤」または「活性化合物」とも称される）、およびそれらの誘導体、断片、類似体および相同体を投与に好適な薬剤組成物内へ組み入れることが可能である。このような組成物は、典型的に核酸分子、蛋白質、または抗体および薬剤的に許容し得る担体を含んでなる。本明細書で用いられる「薬剤的に許容できる担体」は、薬剤としての投与に適合する任意の、および全ての溶媒、分散媒体、被覆物、抗菌剤および抗真菌剤、等張性の吸着遅延化剤などを含むことが意図されている。好適な担体は、この分野の標準的な参考文献であるレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）の「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の最新版に記載されており、本明細書に援用されている。このような担体または希釈剤の好ましい例としては、限定はしないが、水、塩類液、フィンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームや不揮発性油などの非水性担体もまた使用し得る。薬剤活性物質に対するそのような担体および試剤の使用は当業界に周知である。従来の任意の媒体または試剤は活性物質と不相溶性でない限り、組成物におけるそれらの使用が考慮される。補足的な活性化合物もまた、該組成物に組み入れ可能である。
【００６０】
本明細書中に開示された活性試剤は、リポソーム類としても製剤化し得る。リポソーム類は、エプスタインら（Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８頁（１９８５）；ワングら（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０頁（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号に記載されているような当業界に公知の方法によって調製される。循環時間を延長化したリポソーム類は、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００６１】
特に有用なリポソーム類は、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含んでなる脂質組成物による逆相蒸発法により生成し得る。リポソーム類は、細孔サイズのフィルタを通して押出され、所望の直径のリポソーム類が得られる。
【００６２】
本発明の薬剤組成物は、意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口的、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経膜および直腸投与が挙げられる。非経口的、経皮または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は以下の成分を含み得る：注射用水などの滅菌希釈剤、塩類溶液、非揮発性油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類などの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調製剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整し得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル類、使い捨て注射器類、または複数回投与容器に封入し得る。
【００６３】
注射使用に好適な薬剤組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即席調製用滅菌粉体が挙げられる。静脈内投与に好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォルＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標））（ニュージャージー州パルシッパニーのＢＡＳＦ）またはリン酸塩緩衝塩類（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合に、前記組成物は滅菌されていなければならず、また、容易な注射可能性が存在する程度に流動性である必要がある。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒、または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆物の使用により、分散液の場合は要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持される。微生物作用の防止は、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗真菌剤によって達成し得る。多くの場合、組成物中に糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の吸収延長化は、前記組成物に吸収を遅延化する試剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを含めることによって達成し得る。
【００６４】
滅菌注射用溶液は、要求される量の活性化合物（例えば、グリコプロテインＩｂα融合蛋白質）を、適切な溶媒中必要ならば、上に挙げた成分の１種または組合わせとと共に組み入れ、引き続き、ろ過滅菌を行うことによって調製し得る。一般に、分散液は、塩基性分散媒体と他の上に挙げた成分のうちの必要とされる成分を含有する滅菌担体中へ活性化合物を組入れることによって調製される。滅菌注射用溶液調製用の滅菌粉体の場合、調製法は活性成分の粉体プラス先に滅菌ろ過されたその溶液の所望の追加成分を与える真空乾燥および凍結乾燥である。
【００６５】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与を目的とした前記活性化合物は、賦形剤と共に組入れられ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用し得る。経口組成物はまた、嗽薬としての使用のため、流動性担体を用いて調製可能であり、ここで流動性担体中の化合物は、経口的に適用され、うがいして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬剤として適合可能な結合剤および／または補助剤物質を組成物の部分として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含有し得る：微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤、アルギニン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素などの滑剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料などの香味料。
【００６６】
吸入による投与のためには、前記化合物は好適な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器またはディスペンサからのエアゾールスプレーまたはネブライザの形態で送達される。
【００６７】
全身投与はまた、経膜または経皮手段であり得る。経膜または経皮投与のために、浸透すべき関門に適切な浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は一般に当業界で公知であり、例えば、経膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経膜投与は、鼻用スプレー剤、または坐薬の使用によって達成し得る。経皮投与のために、前記活性化合物は当業界に公知の軟膏、軟膏剤、ゲル剤またはクリーム剤に製剤化できる。
【００６８】
前記化合物はまた、直腸送達のために坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド類などの慣例的な坐薬基剤と共に）、または停留浣腸の形態で調製し得る。
【００６９】
一実施形態において、前記活性化合物は、移植およびミクロカプセル化送達システムを含む放出制御剤など、前記化合物を身体からの急速な排出から防ぐ担体と共に調製される。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ酢酸などの生物分解性、生体適合性ポリマー類を使用し得る。このような製剤の調製法は、当業者には明らかであろう。前記物質はまた、アルザ社（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ・ファーマシューティカルズ社（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）から商品として入手し得る。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されたリポソーム類を含む）もまた、薬剤的に許容できる担体として使用し得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように当業界に公知の方法に従って調製し得る。
【００７０】
幾つかの実施形態において、経口または非経口組成物は、投与の容易さと用量の均一性のため、用量単位形態で製剤化される。本明細書中で用いられる用量単位形態とは、治療を受ける患者にとって単一用量として適した物理的に個別の単位であって、各単位が必要とされる薬剤担体と関連して、所望の治療効果を生み出すように計算された活性化合物の予め決められた量を含有する単位を言う。本発明の用量単位形態の明細は、前記活性化合物の独自の特徴や達成すべき特定の治療効果および個人の治療用に、このような活性化合物を調合する技術固有の限界により規定され、また直接依存する。
【００７１】
本発明の核酸分子をベクター類の中へ挿入し、遺伝子療法ベクター類として使用し得る。遺伝子療法ベクター類は、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照）または定位注射（例えば、チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４〜３０５７頁を参照）により患者に送達し得る。遺伝子療法ベクター類の薬剤調製物は、許容できる希釈剤中に遺伝子療法ベクター類を含み得るか、または遺伝子送達媒体が埋め込まれている徐放マトリックスを含んでなる。他に、完全遺伝子送達ベクターが組換え細胞、例えば、レトロウィルスベクターからそのまま生産し得る場合、薬剤調製物は遺伝子送達システムを生産する１種以上の細胞を含み得る。
【００７２】
所望の場合、徐放性製剤を調製できる。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの成形品、例えば、薄膜またはミクロカプセルの形態の半透過性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸γ−エチルとのコポリマー、非分解性酢酸エチレン−ビニル、ルプロン・デポー（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標））（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）からなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。酢酸エチレン−ビニルや乳酸−グリコール酸などのポリマー類は、１００日間を超える期間、分子の放出を可能にするが、あるヒドロゲル酸の蛋白質放出期間はより短い。
【００７３】
例えば、本発明のキメラペプチドの経口用量は、示された効果を目的として使用される場合、経口経路で約０．０５ｍｇ／日から１０００ｍｇ／日の間となり、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０および１，０００．０ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形態にすることが好ましい。少なくとも１種の関心対象物質を入れたベクター類または輸送体の有効血漿濃度は、体重１キログラム、１日につき、０．００２ｍｇから５０ｍｇの範囲となる。
【００７４】
本発明のキメラペプチド類、またはこれらのキメラペプチドをコードする核酸は、１日用量の形態で投与され得るか、または合計１日用量を１日２回、３回または４回投与にして投与できる。
【００７５】
前記薬剤組成物は、投与説明書と共に容器、キット、箱またはディスペンサに包含できる。
【００７６】
１つの特定の適用において、本発明は、本発明による少なくとも１種のキメラペプチドおよび／または１種の細胞からなる、またはそれらを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ使用のための診断用試剤に関する。このような診断用試剤は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても使用できる。
【００７７】
したがって、本発明の課題はまた、診断用試剤を含む診断用キットでもある。より具体的には、前記診断用キットは、１つ以上の容器内に、本発明における組成物の予め決められた量を含む。
【００７８】
他の実施形態において、本発明は、関心対象物質を真核細胞の生体膜を通してトランスロケーションする方法を提供し、前記方法は、本発明のキメラペプチドを準備すること、および前記キメラペプチドの存在下、細胞培養液に接触させることを含んでなる。一実施
形態において、真核細胞の活性代謝を促進する条件下で細胞培養液を前記キメラペプチドと接触させる。
【００７９】
本発明はまた、真核細胞の活性代謝を促進する条件下で、前記細胞を本発明のキメラペプチドと接触させることにより、前記真核細胞内の細胞内インスリン濃度を増加させる、または細胞内ブドウ糖濃度を減少させる方法を提供する。
【００８０】
他の実施態様において、本発明は、発現制御配列に操作可能に結合したペプチドをコードする核酸分子を含んでなるベクターを有する産生細胞を移入すること、前記ペプチドの産生を可能にする条件下で前記産生細胞を培養すること、および前記ペプチドを単離することを含んでなる、本発明のペプチドの生産方法を提供する。
【００８１】
本発明は、上記のキメラペプチドのペプチドベクターとしての使用を含む。本明細書中に用いられる用語の「キメラペプチド」、「ベクター」および「ペプチドベクター」は交換可能に使用し得る。これらのベクター類は、それらと共有的に、または非共有的に結合しているインスリンを細胞内に輸送する能力があり、したがって、インスリンの細胞内輸送にとって効果的なベクター類である。
【００８２】
この目的を達成するために、ベクターが比較的大量の分子を細胞内に輸送する能力を有すること、またそのために、ヒトの免疫系によって外来抗原として認識されないことが必要である。
【００８３】
これらのキメラペプチドは、インスリンを細胞内へ内部化するための試剤としてｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ双方において使用できることが判明した。
【００８４】
変法として、前記ベクターは、一方でアミノグリカン類と反応するアミノ酸配列のカップリングに基き、他方ではヒト抗ＤＮＡ抗体の可変部分から誘導された新規ペプチド類のカップリングに基いている。「カップリング」とは、インスリンポリペプチドとディアトス（ｄｉａｔｏｓ）ペプチドベクターとの間の物理的会合を可能にする任意のタイプの相互作用を意味すると解される。それは、生物学的媒体および／または本発明のペプチド類により輸送される関心対象物質によって開裂性または非開裂性であり得るか、または、活性物質にカップリングしたベクターを投与した生物に適用された物理的手段によって開裂性であり得る。このように、前記物質の生物学的効果発現のためには、それがベクターから放出されることが必要の場合もある。
【００８５】
１種または同一分子内のヒト抗ＤＮＡ抗体の種々の部分から誘導されたアミノグリカン類およびペプチド類と反応するアミノ酸配列のカップリングにより、インスリンのトランスロケーションおよび細胞内転移において、とりわけ、アミノグリカンと反応するアミノ酸配列がヒト由来である場合には、特に効果的なペプチドベクターの調製をもたらす。
【００８６】
この組合わせは、また、特にヒトの使用に適合したトランスロケーションベクターおよび転移ベクターを生み出す。実際、上記のように国際公開第９７／０２８４０号から公知のマウス由来のペプチドベクターは胚系によりコードされ、変異を伴わないので、その結果、抗原の点では、ヒトに見られるものに近いはずであり、それらをヒトに注射することにより、免疫反応を誘発する可能性がある。本発明によるＤＰＶから形成されたペプチドベクター、および抗ＤＮＡ抗体より誘導されたペプチド類から形成されたペプチドベクターは、双方ともヒト由来であり、胚系によりコードされ、変異を伴わないためこの問題を防ぐ。
【００８７】
ヒト抗ＤＮＡ抗体から誘導されたこれらのペプチドの一般的特徴は、国際公開第９９／０７４１４号に記載されているマウス由来のペプチドの特徴に近いが、それらを後者と区別するさらなる性質を有している。すなわち：
（１）細胞内部へ浸透する能力、それらは活性細胞代謝を有する必要がある（培養温度は
２５℃から３９℃まで、好ましくは３７℃までの間）が、一方、マウスのペプチドは明らかに依存性が低い；
（２）それらは、マウスのベクターよりもはるかにＤＮＡとの反応性が弱い；
（３）それらの浸透能力は、それらが細胞内部へ輸送しようとする分子によって著しく影響される；
（４）それらは、ヒト由来の細胞内部へ、他のものに由来する細胞内部よりも、より良好に浸透する。
【００８８】
本発明は、ヘパリン結合ペプチドおよび１種以上の好ましくは多反応性である抗体断片、より具体的には、抗体の高頻度可変領域由来の１種以上の断片からなるディアトス（ｄｉａｔｏｓ）ペプチドベクターを提供する。本発明の課題であるベクターは、抗体のＨ鎖の断片を含有することにより特徴づけられていることが好ましい。
【００８９】
上記の国際公開第９９／０７４１４号では、サイズが小型で分子量の低いモノマーの免疫グロブリンであるモノクローナルＩｇＧの断片のみが使用された。本発明は、非常に高分子量を有する五量体の免疫グロブリンであるＩｇＭ由来の断片を使用することも可能であることを示している。
【００９０】
上記に示したように、本発明のベクターは、インスリンの細胞内および核内輸送および転移のために、特によく適合している。
【００９１】
関心対象物質の細胞内への内部化における他の方法とは異なり、本発明の方法はエネルギーに依存する。ペプチドの浸透は、細胞を４℃で培養することにより完全に阻害される。それはまた、アジ化ナトリウム（ＡＴＰアーゼの阻害剤）やゲニステイン（チロシンキナーゼおよびＡＴＰへの結合阻害剤）のような細胞代謝阻害剤によって部分的に阻害される。したがって、本発明のペプチドおよびペプチドにカップリングしている関心対象物質の内部化機構はエンルギーに依存する。それゆえ、本発明のペプチドを用いたベクター化は、細胞表面の結合部位を介してなされる。したがって、本発明のアミノ酸配列は、細胞膜上に位置する結合部位にそれらが固定される能力、および細胞膜を通過する能力によって特徴づけられている。このように、本発明のアミノ酸配列は活性機構によって細胞膜を通過する能力、次に細胞質および／または細胞核の中に留まる能力によって特徴づけられている。したがって、それらは、受動的方法で細胞膜を通過することのできた先行技術におけるペプチド輸送体とは区別される。
【００９２】
このように、ベクターが細胞内へ通過する際、その使用が輸送されている物質のサイズに限定されないベクターを有することが可能である。実際、本発明のベクター類は、小さな化学分子（低分子量）から蛋白質またはプラスミド型核酸類（高分子量）の範囲の薬物を輸送することができる。浸透に関する本発明のベクター類のこの特殊な能力は、好ましい方法で「薬物」を細胞内へと標的化することを可能にし、したがって、薬物毒性の潜在的低下および有効性指標の潜在的増大に寄与する。
【００９３】
したがって、本発明は、細胞内へ、および／または細胞の核内へ組入れ可能な関心対象物質を天然、または非天然に含有するという事実によって特徴づけられる、上述したベクターなどのベクターを供給することを目的としている。
【００９４】
より具体的には、本発明の課題は、その浸透能力がカップリングしている関心対象物質の性質から全く独立しているベクターである。マウスのベクター類に比べて、これらのヒトのベクター類に特有なこの特徴が、これらベクター類の企図された使用法における主要な関心事である。しかし、本発明は、ベクターにカップリングしている関心対象物質に適合したベクター類もまた、関心対象としている。
【００９５】
しかし、ベクターが細胞浸透前または浸透中に解離しないように相互作用は十分に確実でなければならない。このために本発明におけるカップリングは、非共有カップリングもあり得るが、好ましいカップリングは共有カップリングである。前記インスリンポリペプチドはそれらの末端のうちのいずれか一方、または側鎖上にあるペプチドに直接、またはアミノ酸の１つにカップリングが可能である。前記インスリンポリペプチドはまた、前記ペプチドの末端のいずれか一方に、またはアミノ酸の１つの側鎖にアームを結合させることによって間接的にカップリング可能である。
【００９６】
本発明のベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞のトランスフェクションを可能にすることもまた示された。
【００９７】
本発明の一実施形態において、前記ベクターは、インスリンポリペプチドに対して元々
強力な親和性を有する少なくとも１種の分子（「アンカリング分子」と称される）により、インスリンポリペプチドにカップリングしている。インスリンポリペプチドに対するアンカリング分子の生来の親和性は、輸送体とインスリンポリペプチドとの非共有的相互作用を可能にし、そのため、インスリンポリペプチドの細胞内移動が行われる。
【００９８】
このタイプの輸送体の特に興味のある他の利点は、インスリンポリペプチドに対するアンカリング分子の生来の親和性により、この２つの要素が、化学的または生化学的相互作用なしに全く自然的方法でカップリングするという事実からなる。
【００９９】
関心対象物質がその大きさにより、および／またはその構造により、前記アミノ酸配列に直接カップリングすることが難しい場合、このタイプの輸送体は特に興味深い。また、関心対象物質があまり安定でない場合、また、それとカップリングするための化学的相互作用がいずれもそれを分解させる、またはその活性を変化させる恐れがある場合、このタイプの輸送体は特に有用であり得る。
【０１００】
本発明の他の態様は、キメラペプチド、またはその誘導体、断片、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター類、好ましくは発現ベクター類に関する。本明細書中に用いられる用語の「ベクター」は、結合した他の核酸を輸送する能力のある核酸分子を言う。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントを内に結合することのできる線状または環状の二本鎖ＤＮＡループである。ベクターの他のタイプは、追加のＤＮＡセグメントがウィルスのゲノム内に結合可能なウィルスベクターである。ある一定のベクター類は、それらが導入された宿主細胞内で自動複製する能力がある（例えば、細菌の複製源を有する細菌ベクター類およびエピソーム性哺乳動物ベクター類）。他のベクター類（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター類）は、宿主細胞内へ導入される際に宿主細胞のゲノム内へ組入れられることによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある一定のベクター類は、それらが操作可能に結合している遺伝子の発現を指令する能力がある。このようなベクター類は、本明細書中で「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ法において利用される発現ベクター類は、プラスミドの形態であることが多い。本明細書中において、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であることから、「プラスミド」と「ベクター」とは交換可能に使用し得る。しかしながら、本発明は、等しい機能を働かせるウィルスベクター類（例えば、複製を欠くレトロウィルス類、アデノウィルス類およびアデノ関連ウィルス類）などの他の形態の発現ベクター類を含むように意図されている。さらに、幾つかのウィルスベクター類は、特異的にまたは非特異的に、特定の細胞タイプを標的にする能力がある。
【０１０１】
本発明の組換え発現ベクター類は、宿主細胞内における核酸の発現に好適な形態にある本発明の核酸を含んでなるが、このことは、前記組換え発現ベクター類が、発現に用いられる宿主細胞に基いて選択された１つ以上の調節配列を含み、この調節配列が発現されるべき核酸配列に操作可能に結合していることを意味する。組替え発現ベクター内部に、「操作可能に結合している」とは、関心対象の核酸配列が、この核酸配列の発現が可能になる様式で（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システム内に、またはベクターが宿主細胞内に導入される場合は宿主細胞内に）、調節配列（単一または複数）に結合していることを意味するように意図されている。用語の「調節配列」は、プロモーター類、エンハンサー類、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル類）を含むことが意図されている。このような調節配列は、例えば、ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）；「ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５」、カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（１９９０）に記載されている。調節配列は、宿主細胞の多くのタイプにおいてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、およびある一定の宿主細胞においてのみ、ヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望の蛋白質レベルなどの因子に依存し得る。本発明の発現ベクター類は宿主細胞内へ導入可能であり、それによって、本明細書中に記載された核酸によってコードされた融合蛋白質類またはペプチド類を含む蛋白質類またはペプチド類を生産する。
【０１０２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞中のキメラペプチドの発現用にデザインできる。例えば、キメラペプチドを、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞または哺乳動物細胞中に発現できる。好適な宿主細胞は、さらにゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、「ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に検討されている。他に、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳し得る。
【０１０３】
原核細胞における蛋白質の発現は、融合蛋白質または非融合蛋白質のいずれかの発現を指令する構成的または誘導的プロモーター類を含有するベクター類により大腸菌において最もよく実施される。融合ベクター類は、多くのアミノ酸類をその中にコードされる蛋白質、通常、組換え蛋白質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクター類は、典型的に以下の３つの目的に役立つ：（１）組換え蛋白質の発現を増すこと；（２）組換え蛋白質の溶解性を増加すること；および（３）親和性精製においてリガンドとして作用させることにより組換え蛋白質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクター類において、蛋白分解開裂部位は、組換え部分の融合部分からの分離に続いて融合蛋白質の精製を可能にするために、融合部分と組換え蛋白質との接合部に導入される。このような酵素およびそれらの共役認識配列としては、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクター類としては、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）；スミスおよびジョンソン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）（１９８８）Ｇｅｎｅ６７：３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（マサチューセッツ州ビバリーのニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））およびｐＲＩＴ５（ニュージャージー州ピスキャタウェイのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白質、または蛋白質Ａを標的組換え蛋白質に融合する。
【０１０４】
好適な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（アムランら（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、（１９８８）Ｇｅｎｅ６９：３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ１ｌｄ（スタディアら（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．）、「ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５」、カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、（１９９０）６０〜８９頁）が挙げられる。
【０１０５】
大腸菌において組換え蛋白質発現を最大にする方策は、組換え蛋白質を蛋白分解する能力を欠いている宿主細菌において蛋白質を発現することである。ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）、「ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５」、カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、（１９９０）１１９〜１２８頁を参照されたい。他の方策は、発現ベクターに挿入するために、核酸の核酸配列を変更し、その結果、各アミノ酸の個々のコドンを、優先的に大腸菌において利用されるものにすることである（ワダら（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．）、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８頁）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的ＤＮＡ合成法により実施できる。
【０１０６】
他の実施形態において、キメラペプチド発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母エス−セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（バルダリら（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．）、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ６：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（クルジャンおよびヘルスコビッツ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（シュルツら（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．）、（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびｐｉｃＺ（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））が挙げられる。
【０１０７】
他に、キメラペプチドを、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現ベクター類を用いて昆虫細胞に発現できる。培養昆虫細胞（ｅ．ｇ．、ＳＦ９細胞）中の蛋白質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．）、（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２１５６〜２１６５頁）およびｐＶＬシリーズ（ラックロウおよびサマーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ）（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１〜３９頁）が挙げられる。
【０１０８】
さらに他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞に発現される。哺乳動物発現ベクター類の例としては、ｐＣＤＭ８（シード（Ｓｅｅｄ）（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（カウフマンら（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．）（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ６：１８７〜１９５頁）が挙げられる。哺乳動物細胞中で用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、ウィルス調節要素により提供されることが多い。例えば、通常使用されるプロモーター類は、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から誘導される。原核細胞および真核細胞の双方に好適な他の発現系に関しては、例えば、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、１６章および１７章を参照されたい。
【０１０９】
他の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指令できる（例えば、組織特異的調節要素が、核酸を発現するために使用される）。組織特異的調節要素は当業界に知られている。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝特異的；ピンカートら（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．）（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：２６８〜２７７頁）、リンパ球特異的プロモーター類（キャラメおよびイートン（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ）（１９８８）Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ４３：２３５〜２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター類（ウィンノートおよびボルチモア（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）（１９８９）ＥＭＢＯＪ８：７２９〜７３３頁）および免疫グロブリン類（バネルジら（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．）（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９〜７４０頁；クイーンおよびボルチモア（Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１〜７４８頁）、神経特異的プロモーター類（例えば、神経細線維プロモーター；バイルンおよびラッドル（Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ）（１９８９）ＰＮＡＳ８６：５４７３〜５４７７頁）、膵臓特異的プロモーター類（エドルンドら（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．）（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２〜９１６頁）、および乳腺特異的プロモーター類（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号およびヨーロッパ特許出願公報第２６４，１６６号）が挙げられる。また、発生調節プロモーター類、例えば、マウスホックスプロモーター類（ケッセルおよびグルス（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ）（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４〜３７９頁）およびα−フェトプロテインプロモーター（キャンペスおよびチルグマン（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ）（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３：５３７〜５４６頁）も含まれる。
【０１１０】
本発明の他の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語の「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に用いられる。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の後代または可能性のある後代を言う。変異または環境影響のいずれかのため、ある一定の変更が後続世代に生じ得ることから、このような後代は、実際、親細胞と一致しない可能性もあるが、本明細書中で使用される用語の範囲内にやはり含まれる。さらに、宿主細胞は、一旦キメラペプチドを発現すると変調を受ける可能性があり、元の特性を維持することも、またはゆるめることもある。
【０１１１】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、キメラペプチドは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞など）において発現できる。他に、宿主細胞は、未熟哺乳動物細胞、すなわち、多分化能性幹細胞であり得る。宿主細胞はまた、他のヒト組織から誘導できる。他の好適な宿主細胞は、当業者に知られている。
【０１１２】
ベクターＤＮＡは、従来のトランスフォーメーション法、トランスダクション法、感染法、トランスフェクション法により原核細胞または真核細胞に導入できる。本明細書中に用いられる用語の「トランスフォーメーション」、「トランスダクション」、「感染」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなど、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための種々の当業界で認められた方法を言うことを意図している。さらにトランスフェクションは、トランスフェクション剤により媒介できる。「トランスフェクション剤」とは、宿主細胞、例えばリポソーム内へのＤＮＡの組み込みを媒介する任意の化合物を含むことを意味する。宿主細胞をトランスフォームするかまたはトランスフェクションするのに好適な方法は、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、（「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年）および他の実験室マニュアルに見ることができる。
【０１１３】
トランスフェクションは、「安定」（すなわち、外来ＤＮＡの宿主ゲノムへの組込み）
または「一過性」（すなわち、ＤＮＡは宿主細胞内でエピソーム的に発現される）であり得る。
【０１１４】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関しては、発現ベクターおよび用いられるトランスフェクション法に依存して、細胞の小さなフラクションだけが、外来ＤＮＡをゲノムに組み込むことができ、残りのＤＮＡはエピソームに留まることが知られている。これらの組込み体を同定および選択するために、選択性マーカ（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子を、一般に関心対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。種々の選択性マーカ類には、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤耐性を与えるものが含まれる。選択性マーカをコードする核酸を、コードするベクターと同一のベクターにおいて宿主細胞に導入できるか、または別のベクターにおいて導入できる。導入された核酸により安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定できる（例えば、選択性マーカ遺伝子を導入した細胞は生存するが、その他の細胞は死滅する）。他の実施形態において、キメラペプチドまたはトランスフェクトされた細胞により変調された細胞は、内因性レポーター遺伝子発現の誘導により同定される。ある特定の実施形態において、プロモーターは、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現を駆動するインスリンプロモーターである。
【０１１５】
本発明の他の利点と特性は、以下の実施形態の実施例から明らかとなり、また添付の図面を参照とする。
【実施例】
【０１１６】
本発明を、以下の非限定的実施例においてさらに説明する。
【０１１７】
実施例１：キメラペプチド類およびディアトス（ＤＩＡＴＯＳ）ペプチドベクター（ＤＰＶ）類の合成
化学合成： ペプチド合成は、当業者に知られた方法によりなされる（オルターゲンおよびネオシステム（Ａｌｔｅｒｇｅｎ ａｎｄ Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ））。それらは、Ｆｍｏｃ樹脂上の固相中で用いられる。開裂は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりなされ、ペプチド類は、半分取ＨＰＬＣ−ＣＲＣ５カラム上で精製し、０．１％ＴＦＡ溶液で希釈し、ＴＦＡ中アセトニトリル勾配（１０％〜７０％）を用いた。凍結乾燥ペプチド類をＮａＣｌ０．１５Ｍに溶解した。
【０１１８】
本発明のペプチド類を含有する蛋白質の調製を可能にする分子構築：
分子生物学法により、一旦適切な細胞に導入し、ベクター化高分子合成を可能にするプラスミド類を構築することができる。
【０１１９】
組換え蛋白質発現のためのベクター類の構築：
図１は、本発明のペプチド配列を含有する組替え蛋白質の発現を可能にするベクター類の調製を示す。原核細胞ベクターｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））は、配列６ＸＨｉｓを有する融合蛋白質（または組換え蛋白質）の形態で遺伝子発現を可能にする。このベクターは、標識６ＸＨｉｓをコードする配列の３’に、複製ＣｏＩＥ１の源、ＩＰＴＧにより誘導可能なファージＴ５の強力プロモーター、アンピシリン耐性を供与するβ−ラクターゼの遺伝子、および複数クローン化部位を運び、６ＸＨｉｓ配列の相内で相補的ＤＮＡのクローン化を可能にする。
【０１２０】
６３−ｍｅｒの相補的オリゴヌクレオチド類：
ＰＡＶ１Ｕ：（配列番号：４９）
５’ｇａｔｃｃｇｔａａａａｃｇａｇｇａｃｔａａａａｃｔａｃｇａｃａｃｇｔａｃｇａｃｃａｃｇａｇｔａａｃａｃｇａａｔｇｇａｃｇｔａａ３’
ＰＡＶ１Ｌ：（配列番号：５０）
５’ｇａｔｃｔｔａｃｇｔｃｃａｔｔｃｇｔｇｔｔａｃｔｃｇｔｇｇｔｃｇｔａｃｇｔｇｔｃｇｔａｇｔｔｔｔａｇｔｃｃｔｃｇｔｔｔｔａｃｇ−３’をハイブリッド形成する。得られたＤＮＡセグメントは、５’にＢａｍＨＩ部位、および３’にＢｇｌＩＩ部位を有する。それは、ペプチド配列ＰＡＶ１：ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ（配列番号：５１）をコードする。この断片をベクターｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ部位にクローン化する。エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス（ＥＢＶ）のゼブラ（Ｚｅｂｒａ）ウィルス蛋白質（ＢＺＬＦ１）または核局在部位（ｎｌｓ）から３５個のアミノ酸が欠失したゼブラ蛋白質をコードする相補的ＤＮＡ（ＤＮＡｃ）が、ＰＣＲにより得られた。それらを、ベクターＨｉｓ−ＰＡＶ１またはｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。生じたプラスミド類は、大腸菌のトランスフォーメーション後、組換え蛋白質Ｈｉｓ６−ゼブラ−ＰＡＶ１、Ｈｉｓ６−ゼブラΔｎｌｓ−ＰＡＶ１、Ｈｉｓ６−ゼブラおよびＨｉｓ６−ゼブラΔｎｌｓの発現を可能にする。
【０１２１】
組換え蛋白質の誘導、抽出および精製：
組換えペプチドの生成は、４０μｇ／ｍｌのアンピシリンで補足されたルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）媒体中の指数増殖期における細菌培養液に１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加することにより３７℃で誘導される。ＩＰＴＧ添加１２時間後、細菌を４℃で５７００ｇ、１５分間遠心分離する。細菌残渣を５容量の変性溶菌緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．８；０．５ＭＮａＣＩ；１０％グリセロール；６Ｍグアニジン−ＨＣｌ）中に入れる。緩やかに攪拌しながら周囲温度で２０分温置後、溶解産物を、４℃で１５０００ｇ、３０分間遠心分離することにより澄明にする。組換え蛋白質を含有する上澄液を−８０℃で保存する。
【０１２２】
６ＸＨｉｓ組換え蛋白質を、変性溶菌緩衝液で予め較正した「タロン（ＴＡＬＯＮ）」樹脂カラム（クロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））上のアフィニティクロマトグラフィにより精製する。１０ｍＭイミダゾールを含有する１０容量の変性溶菌緩衝液で樹脂を３回連続洗浄後、カラムに結合した組換え蛋白質を２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．８；０．５ＭＮａＣＩ；１０％グリセロール；０．５ｍＭＰＭＳＦの緩衝液中の６Ｍから０Ｍのグアニジン−ＨＣｌの勾配により再変性させる。組換え蛋白質を、ｐＨ８．０、イミダゾールの２０ｍＭから１Ｍの勾配で溶出させる。種々の溶出液を１２％ＳＤＳ−アクリルアミド変性ゲル上で分析する。精製蛋白質を含有するフラクションを集め、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣＩ緩衝液に対して４℃で２時間透析する。該蛋白質を濃縮し、分割し、液体窒素中迅速凍結し、−８０℃で保存する。
【０１２３】
使用ペプチド類：
非官能性ペプチド類：
配列番号：１。ヒトリポ蛋白Ｂのアミノ酸配列（３３５８−３３７２）由来のヘパリンと反応するペプチド、カージンら（Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１５４：７４１頁（１９８８）、ＤＰＶ１とも称される。
配列番号：２。配列番号：１のヘパリン二量体と反応するペプチド、（ＤＰＶ１）２とも称される。
配列番号：３。配列番号：１のヘパリン三量体と反応するペプチド、（ＤＰＶ１）３とも称される。
配列番号：４。抗ＤＮＡモノクローナルマウス抗体Ｆ４．１の高頻度可変領域ＣＤ３に相当するペプチド（アブラミアスら（Ａｖｒａｍｅａｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５６０１頁（１９９８））。
配列番号：５。配列番号：１および配列番号：４を含有するペプチド。
配列番号：６。モノクローナルマウス抗体のＦ４．１のＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の一部を含有するペプチド（アブラミアスら（Ａｖｒａｍｅａｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５６０１頁（１９９８））。
配列番号：７。配列番号：１および配列番号：６を含有するペプチド。
配列番号：８。ヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＲＴＴ７９の高頻度可変ＣＤ３領域に相当するペプチド（スティーブンソンら（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ６：８０９頁（１９９３））。
配列番号：９。配列番号：１および配列番号：８を含有するペプチド。
配列番号：１０。ヘパリンと反応し、配列番号：１およびヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＮＥ−１の高頻度可変領域ＣＤＲ３に相当するペプチド配列を含有するペプチド（ヒラバヤシら（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：５３３頁（１９９３））、１０４７番とも称される。
配列番号：１１。配列番号：１およびヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＲＴ７２の高頻度可変領域ＣＤＲ３に相当するペプチド配列を含有するペプチド（カルシら（Ｋａｌｓｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｌｕｐｕｓ４：３７５頁（１９９５））。
配列番号：１２。細胞３Ｔ３および配列番号：６のＮＬＳ（核局在シグナル）配列を含有するペプチド。
配列番号：１３。配列番号：１および抗ＤＮＡヒトモノクローナル抗体ＮＥ−１のＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の配列を含有するペプチド。
配列番号：１４。マウスモノクローナル抗体Ｆ４．１のＣＤＲ３領域の一部および配列番号：６を含有するペプチド。
配列番号：１５。抗ＤＮＡヒトモノクローナル抗体ＮＥ−１の高頻度可変ＣＤＲ３領域に相当するペプチド配列を２倍含有するペプチド。
配列番号：１６。配列番号：１５中の１３〜１９位に配列番号：１を含有することから生じるペプチド。
配列番号：１７。ヘパリンと反応し、ヒトリポ蛋白Ｅのアミ酸配列から誘導されるペプチド（カージンら（Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｓｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１５４：７４１頁（１９８８））、ＤＰＶ４とも称される。
配列番号：１８。ヘパリンと反応し、アルギニンのアミノ酸配列から誘導されるペプチド（キャンパネリら（Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２２：１６６３〜１６７２頁（１９９６））、神経筋接合部の分化を調節する細胞外マトリックスの蛋白質。
配列番号：１９。配列番号：１８の二量体。
配列番号：２０。ヘパリンと反応し、インスリン成長因子結合蛋白質のアミノ酸配列から誘導されるペプチド、ＤＰＶ２とも称される（フォールケスら（Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：２２８０〜２２８５頁（１９９７））。
配列番号：２１。ヘパリンと反応し、血小板成長因子のＡ鎖のＣ末端部のアミノ酸配列から誘導されるペプチド（マーヘルら（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２２５１〜２２５３頁（１９８９））、ＤＰＶ６とも称される。
配列番号：２２。１２個のリジン（Ｋ）および配列番号：６を含有するペプチド。
配列番号：２３。１２個のリジン（Ｋ）および配列番号：５を含有するペプチド。
配列番号：２４。抗菌活性を有するペプチド（ジャバドプアら（Ｊａｖａｄｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３１０７〜３１１３頁（１９９６））。
配列番号：２５。ヘパリンと反応し、インスリン様成長因子結合蛋白質の配列に相当するペプチド（フォールケスら（Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：２２８０〜２２８５頁（１９９７））。
配列番号：２６。ヘパリンと反応し、ヒトジスムターゼスーパーオキシド配列のＣ末端部から誘導されるペプチドの二量体のペプチド（イノウエら（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ２６９：８９〜９２頁（１９９０））、（ＤＰＶ３）２とも称される。
配列番号：２７。ヘパリンと反応し、アミノ酸が立体配置Ｄにある配列番号：２６の配列に相当するペプチド。
配列番号：２８。ヘパリンと反応し、配列が配列番号：２６から誘導され、αｖインテグリン類（２１）を選択的に結合するモチーフＲＧＤを含有するペプチド。
配列番号：２９。ヘパリンと反応し、配列番号：１および配列番号：１７のペプチドよりなるペプチド、ＤＰＶ１〜ＤＰＶ４とも称される。
配列番号：３０。ヘパリンと反応し、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）の配列のＣ末端部から誘導されるペプチド（アーコナックら（Ａｒｋｏｎａｃ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４４００〜４４０５頁（１９９８））、ＤＰＶ７とも呼ばれる。
配列番号：３１。ヘパリンと反応し、アミノ酸がフロント−バック位にある配列が配列番号：１２であるペプチドに相当するペプチド。
配列番号：３２。ヘパリンと反応し、アミノ酸が立体配置Ｄにある配列番号：３０に相当するペプチド。
配列番号：３３。ヘパリンと反応し、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）の配列の一部を含有するペプチド（フロムら（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．３４３：９２頁（１９９７））、ＤＰＶ８とも称される。
配列番号：３４。ヘパリンと反応し、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の配列の一部を含有するペプチド、ＤＰＶ９とも称される（ヤヨンら（Ｙａｙｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ６４：８４１〜８４８頁（１９９１））。
配列番号：３５。ヘパリンと反応し、マウス腸管配列のＣ末端部に相当するペプチド（ゴ
ングキアオ（Ｇｏｎｇｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｌｙｃｏｎｊｕｇ Ｊ．１３：８１〜９０頁（１９９６））、ＤＰＶ１０とも称される。
配列番号：３６：ヘパリンと反応し、ヒトγインターフェロンのＣ末端配列の一部を含有するペプチド（ロルタ・ジャコブおよびグリマウド（Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ ＆ Ｇｒｉｍａｕｄ）、ＦＥＢＳ２８０：１５２〜１５４頁（１９９１））、ＤＰＶ１１とも称される。
配列番号：３７：ヘパリンと反応し、ヒトインターロイキン１２のサブユニットｐ４０配列の一部を含有するペプチド（ハサンら（Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．）、 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１０６４〜１０７０頁（１９９９））、ＤＰＶ１２とも称される。
配列番号：３８：ヘパリンと反応し、間質細胞から誘導される因子１α配列の一部を含有するペプチド（アマラら（Ａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２００〜２０４頁（１９９９））、ＤＰＶ１３とも称される。
配列番号：３９：ヘパリンと反応し、「ヘパリン結合蛋白質」（ＣＡＰ３７）の配列の一部を含有するペプチド（ポ−ルら（Ｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ２７２：２００〜２０４（１９９０））、ＤＰＶ１５とも称される。
配列番号：４０：ヘパリンと反応し、配列番号：１０（１０４７）の配列内のペプチドに加えて１３個のＮ末端リジンに相当するペプチド。
配列番号：４１：ヘパリンと反応し、配列番号：２８（（ＤＰＶ３）２）の配列内のペプチドに加えて１３個のＮ末端リジンに相当するペプチド。
配列番号：４２：ヘパリンと反応し、配列番号：３９（ＤＰＶ１０）の配列内のペプチドに加えて１３個のＮ末端リジンに相当するペプチド。
配列番号：４３：配列番号：１０（１０４７）および配列番号：２４の配列内のペプチドを含有する、抗菌活性を有するペプチド。
配列番号：４４：配列番号：２４および配列番号：３０（ＤＰＶ７）の配列内のペプチドを含有する、抗菌活性を有するペプチド。
配列番号：４５：配列番号：２４および配列番号：３８（ＤＰＶ１３）の配列内のペプチドを含有する、抗菌活性を有するペプチド。
配列番号：４６：配列番号：２６（ＤＰＶ３）２の配列内のペプチドに加えてＮ末端におけるグリシン−フタロシルを含有するペプチド。
配列番号：４７：配列番号：２１（ＤＰＶ６）の配列内のペプチドに加えてＮ末端におけるサリシリルモチーフを含有するペプチド。
配列番号：４８：配列番号：２１（ＤＰＶ６）の配列内のペプチドに加えてＣ末端におけるサリシリルモチーフを含有するペプチド。
【０１２４】
官能基化ペプチド類：
これらのペプチド類は、上記の配列番号：１から４８に相当するが、Ｎ末端側に、関心対象の幾つかの物質に共役カップリンングを可能にするシステイン、またはペプチド類と、ストレプトアビジンまたはペルオキシダーゼと共役したアビジンとの非共有的組合わせを可能にするビオチンのいずれかを運搬する。
【０１２５】
実施例２：カコ（Ｃａｃｏ）−２関門モデルの完全性
カコ−２細胞を、血清のない合成培地（基礎合成培地、ＢＤＭ）中に、ウシ皮膚コラーゲンで前もって被覆した、テレフタル酸ポリエチレン製ミクロ多孔性膜上に１６００００個の細胞／ｃｍ２の密度で接種した。前記培養培地を週に３回変えて、細胞を、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で１８日間維持した。カコ−２関門モデルの完全性をチェックするための陰性対照として、１０６ｄｐｍ／ｍｌＤ−［１４Ｃ］−マンニトールを用いた。陽性対照として、Ｌ−［３Ｈ］−プロリンを用いた：能動輸送−１０６ｄｐｍ／ｍｌ、最終濃度として１０μＭ。その他の対照としては、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトール／Ｌ−［３Ｈ］−プロリン＋ＤＰＶ７ ３０μｇ／ｍｌおよびＤ−［１４Ｃ］−マンニトール／Ｌ−［３Ｈ］−プロリン＋ＤＰＶ１０ ３０μｇ／ｍｌが挙げられた。
【０１２６】
経上皮輸送実験を実施した。カコ−２細胞単層の完全性をチェックするために経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。細胞単層を、ハンクス液（ＨＢＳＳ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭＨｅｐｅｓで補足）中、３７℃で８時間、予め温置した。１時間、２時間、４時間および８時間の時点で、１００μｌの培地を低区画部から集め、新鮮なＨＢＳＳにより置き換えた。実験終末時に（８時間）、細胞単層をＰＢＳで３回洗浄し、ＴＥＥＲを測定した。次に、細胞を４００μｌのトリスＨＣｌ０．１ＭｐＨ８．０、０．５％トリトンＸ１００中に集め、超音波により粉砕した。１００μｌの細胞ホモジネートに含まれた放射活性を測定した。放射活性物質量は、２ｍｌのアクアルマ（Ａｑｕａｌｕｍａ）カクテル（オランダ国シェスバーグのルマック（Ｌｕｍａｃ）／３Ｍｂｖ）中で光分散後、パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）トリカーブ（Ｔｒｉ−ｃａｒｂ）１６００ＣＡ装置（米国コネチカット州メリデンのパッカード・インスツルメント社（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて液体シンチレーション分光測定法により分析した。
【０１２７】
図２は、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトールおよびＬ−［３Ｈ］−プロリンの輸送を示す。
この結果は、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトールおよびＬ−［３Ｈ］−プロリンの経上皮輸送が最初の４時間は実験時間に比例することを示す。Ｌ−［３Ｈ］−プロリンの輸送（陽性対照）が、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトール（陰性対照）の輸送よりも高く、カコ−２腸管関門モデルが、ＤＰＶインスリン化合物の輸送を推定するために使用できることを示した。温置の４時間から８時間の間は、Ｌ−［３Ｈ］−プロリンの輸送は遅速し、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトールの輸送は有意に増加した。この観察は、ＨＢＳＳにおける長い温置による細胞単層の変化によるものである。輸送実験の終末時（ＨＢＳＳ中に温置８時間後）に測定されたＴＥＥＲ値の急激な減少は、これらの観察と相関性がある（表１）。
【０１２８】
３０μｇ／ｍｌのＤＰＶ７またはＤＰＶ１０の存在は、Ｄ−［１４Ｃ］−マンニトールまたはＬ−［３Ｈ］−プロリンの輸送に影響を与えず（図３）、実験の終末時に細胞と会合しているＤ−［１４Ｃ］−マンニトールおよびＬ−［３Ｈ］−プロリンの量にも影響を与えなかった（図４）。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
実施例３：インスリンおよびＤＰＶ−インスリン共役体の経上皮輸送
ＤＰＶ−インスリン共役体を合成した。手短に説明すると、インスリンを１０モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤、ＳＭＣＣにより活性化した。数回の洗浄ステップ後、ＤＰＶ７またはＤＰＶ１０を５倍モル過剰で加えた。サンプルを再度洗浄して、未結合物質を除去し、共役体をＳＤＳページ電気泳動分析によりチェックした。インスリン、ＤＰＶ７−インスリンおよびＤＰＶ１０−インスリンをＮａＣｌ０．１５Ｍで希釈し、最終濃度の０．６５ｍｇ／ｍｌを得た。各分子の３０μｇをカコ−２細胞単層上で温置した。
【０１３１】
経上皮輸送実験を実施した。カコ−２細胞単層の完全性をチェックするために経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。細胞単層を、ハンクス液（ＨＢＳＳ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭＨｅｐｅｓで補足）中、３７℃で３０分間、予め温置した。インスリン化合物を、細胞の先端側に面して、挿入物の上部区画に０．５ｍｌのＨＢＳＳ培地中、６０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。上部および下部区画は、それぞれ、０．５ｍｌおよび１．２５ｍｌのＨＢＳＳを含んでいた。該細胞単層をインスリン化合物と共に３７℃で１時間、４時間または８時間温置した。上部および下部区画の培地を集めた。細胞単層をＰＢＳで３回洗浄し、ＴＥＥＲを測定した。細胞を４００μｌのトリスＨＣｌ０．１ＭｐＨ８．０、０．５％トリトンＸ１００中に集めた。各条件で、３つの挿入体を用いた（三重体）。
【０１３２】
表２は、化合物との温置前後に測定されたＴＥＥＲ値を示している。この結果は、ＤＰＶ７−インスリンが、温置１時間および４時間後にＴＥＥＲの有意な減少を誘導したことを示し、カコ−２細胞単層の完全性がこれら２つの時点でＤＰＶ７−インスリンにより影響を受けたことを示した。ＴＥＥＲの崩壊と細胞形態における変化は、インスリンとＤＰＶ１０−インスリンでは観察されなかった。この結果はまた、３種の化合物との温置８時間後におけるＴＥＥＲの有意な減少を示した。これは、実施例１の結果と一致し、ＨＢＳＳ中、４時間より長い温置時間は、カコ−２細胞関門を変化させることを示している。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
実施例４：インスリン組成物の検出および定量
遊離インスリン濃度を、デイコ（Ｄａｋｏ）（引用文献Ｋ６２１９）からのＥＬＩＳＡキットにより測定した。ＤＰＶ−インスリン共役体を自己製造アッセイにより検出した。手短に説明すると、ＤＰＶ−インスリン共役体を、９６ウェルのミクロ滴定プレートのヘパリン被覆ウェル上に吸収させた。ＤＰＶ−インスリン共役体の濃度を、マウス抗インスリンモノクローナル抗体およびペルオキシダーゼ−結合副次抗体を用いてＥＬＩＳＡ誘導アッセイにより定量された。
【０１３５】
カコ−２細胞と共に温置後集めたサンプルを、ＢＳＡ被覆ミクロ管に移し、インスリン濃度を測定するまで−２０℃に保存した。この実験全体を通して、遊離インスリン濃度は頂点媒体中、安定に留まった。対照として、ＤＰＶ−インスリン共役体の頂点濃度は、時間の関数として減少した。８時間において、ＤＰＶ７−インスリンおよびＤＰＶ１０−インスリンの濃度は、それぞれ、最初の充填の２５％と３５％に相当した（図５）。ＤＰＶ−インスリン共役体の濃度における有意な減少は、１時間と４時間の時点でも観察された（図５）。これら２つの時点において、ＤＰＶ−インスリン共役体の濃度は、両共役体に関して１時間の時点で最初の充填の７０％であり、４時間の時点でＤＰＶ７−インスリンおよびＤＰＶ１０−インスリンに関して、それぞれ、最初の充填の５４％と６４％であった。
【０１３６】
少量の遊離インスリンを、基底外側培地中に検出した（充填物の０．２％）。可能性としてＤＰＶ−インスリン共役体の有意な量は、基底外側培地中に検出されなかったが、これは恐らくＤＰＶ−インスリン共役体検出のためのアッセイは、遊離インスリン検出のためのデイコ（Ｄａｋｏ）アッセイよりも１０００倍感度が低いためと思われる。この感度の差を考慮すると、このような少量のＤＰＶ−インスリン共役体を検出するのは困難であったと思われる。
【０１３７】
極少量の遊離インスリンが、細胞溶解産物中に見出された（最初の充填の０．００４％）。対照として、輸送の１時間後、細胞溶解産物中に検出されたＤＰＶ７−インスリンおよびＤＰＶ１０−インスリンの量は、それぞれ、最初の充填の１％と４％に達した（図６）。これらの濃度は、実験全体を通して安定であり、化合物が細胞内に蓄積されず、カコ−２細胞から出ていったことを示唆した。
【０１３８】
カコ−２細胞を増殖させたフィルタもまた、インスリンおよびＤＰＶ−インスリン共役体の存在下で分析した。遊離およびＤＰＶ−インスリン共役体を、同一の定量アッセイを用いてフィルタ上で検出し、フィルタ上に残存した化合物量の直接比較を可能にした。
【０１３９】
結果は、少量の遊離インスリンだけがフィルタ上に残存していたことを示した。対照的に、ＤＰＶ１０またはＤＰＶ７とカップリングしている場合、インスリン共役体は、明らかに細胞培養挿入体上に捕捉されて滞留した。
【０１４０】
実施例５：ＤＰＶ−インスリン共役体のｉｎ ｖｉｔｒｏ定量
ＤＰＶ−インスリン共役体を、実施例２に記載されたとおり合成した。共役体濃度の測定を検定するために、幾つかの試験を実施する。インスリン−ＤＰＶ共役体の認識は、ＲＩＡ試験を用いて確認されている。共役体が抗インスリン抗体によって認識されることを確認し、また共役体がＲＩＡ試験を用いて正確な感度で定量できるかどうかを確かめるために、遊離インスリンと平行して、各共役体に関しｉｎ ｖｉｔｒｏで標準濃度曲線を確立する。
【０１４１】
実施例６：ＤＰＶ−インスリン共役体のｉｎ ｖｉｖｏ定量
ＤＰＶ−インスリン共役体を、実施例２に記載されたとおり合成した。高血糖ラットへの適切な濃度の共役体の皮下注射後、ＤＰＶ−インスリン共役体の活性を、ｉｎ ｖｉｖｏ評価する。対照は、遊離インスリンまたはＮａＣｌのいずれかを注射する。血液サンプルを、予め決められた時点で採取し、インスリン濃度およびブドウ糖濃度の双方をそれぞれ、ＥＬＩＳＡおよびブドウ糖酸化酵素法を用いて分析した。血中インスリン濃度の増加、およびその後の血糖濃度の減少により、ＤＰＶ−インスリン共役体が生物学的に活性であることが示される。
【０１４２】
実施例７：経口投与後のＤＰＶ−インスリン共役体のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＤＰＶ−インスリン共役体による腸管関門の通過を評価するために、化合物を高血糖ラットの回腸管腔に挿入する。処理ラットの血中インスリン通過の評価前に、対照に遊離インスリンまたはＮａＣｌを投与する。
【０１４３】
投与後少なくとも３時間の間１５分ごとに、次いで、次の１２時間は１時間ごとに全動物について糖血を管理する。血液サンプルは、予め決められた時点で採取し、ブドウ糖酸化酵素法を用いてブドウ糖濃度を分析した。血糖濃度の減少は、インスリンの腸管関門通過を示す。
【０１４４】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験で、インスリンの生物学的活性を示さない動物に関しても、ｉｎ ｖｉｔｒｏ定量が、ＲＩＡ試験を用いて可能であり、皮下注射後、１時点で全ラットから血液を採取し、インスリン共役体の濃度を、各血液サンプル中のＲＩＡにより測定する。インスリンのこの直接検出により、共役体が腸管関門を通過したかどうかの決定が可能となる。
【０１４５】
実施例８：形態学的および免疫細胞化学試験
密着結合の完全性を立証するために、ＤＰＶ−インスリン共役体と接触させた高血糖ラットの小腸回腸組織を採取する。インスリンの経細胞輸送を証明するために、免疫細胞化学試験を、単一時点（３０分または６０分）後に実施する。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】本発明のペプチド類を含有する組換え蛋白質発現のためのベクター類調製の図式的説明を示す図である。
【図２】Ｄ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリン輸送の動力学を示す線グラフである。
【図３Ａ】３０μｇ／ｍｌのＤＶＰ７−インスリンの存在下、Ｄ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリン輸送の動力学を示す線グラフである。
【図３Ｂ】３０μｇ／ｍｌのＤＶＰ１０−インスリンの存在下、Ｄ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリン輸送の動力学を示す線グラフである。
【図４】Ｄ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリンを単独で（対照）、または３０μｇ／ｍｌのＤＶＰ７またはＤＶＰ１０の存在下、温置した場合の温置８時間後、細胞と会合したＤ−[１４Ｃ]−マンニトールおよびＬ−[３Ｈ]プロリンを示す棒グラフである。
【図５】頂点培地におけるインスリンおよびＤＰＶ−インスリン共役体の濃度を示す棒グラフである。
【図６】細胞溶解産物中のＤＰＶ−インスリン共役体濃度を時間の関数として示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ドメインおよび第２ドメインを含んでなるキメラペプチドであって、第１ドメインが、生体膜を通って能動輸送を促進するトランスロケーション配列を含んでなり、第２ドメインが、インスリンポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなるキメラペプチド。
【請求項２】
トランスロケーション配列がアミノグリカンと結合する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノグリカンがヘパリンまたは硫酸コンドロイチンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
第１ドメインが、
（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；
（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；
（ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；
（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；および
（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ
（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；
Ｘは非塩基性アミノ酸であり；
ｍの各々は独立してゼロから５までの整数であり；
ｎの各々は独立して１から１０の間の整数であり；
ｏの各々は独立してゼロから５の間の整数である）、よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
キメラ蛋白質が生理学的関門をトランスロケーションする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
生理学的関門が胃腸関門または血液脳関門である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
トランスロケーション配列がリポ蛋白の一部分である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
トランスロケーション配列が少なくとも４個の塩基アミノ酸を含んでなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ｎが２である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１０】
ｎが３である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘが疎水性アミノ酸である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１２】
第１ドメインのアミノ酸配列がＸＢＢＢＸＸＢＸである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１３】
第１ドメインのアミノ酸配列がＸＢＢＸＢＸである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１４】
第１ドメインのアミノ酸配列がＢＢＸｍＢＢＸｏである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１５】
第１ドメインのアミノ酸配列がＸＢＢＸＸＢＸである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１６】
第１ドメインのアミノ酸配列がＢＸＢＢである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１７】
第１ドメインのアミノ酸配列が配列番号：３０または配列番号：３５を含んでなる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１８】
第１ドメインのアミノ酸配列が１００個未満のアミノ酸長である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１９】
第１ドメインのアミノ酸配列が５０個未満のアミノ酸長である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項２０】
第１ドメインのアミノ酸配列が２５個未満のアミノ酸長である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項２１】
（ａ）ヒト抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域；
（ｂ）ヒト抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域；
（ｃ）マウス抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域；および
（ｄ）マウス抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域、
よりなる群から選択される第３ドメインをさらに含んでなる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項２２】
第１ドメイン、第２ドメインおよび第３ドメインを含んでなるペプチドであって；第１ドメインおよび第２ドメインが、
（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；
（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；
（ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；
（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；および
（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ；
（ｆ）抗体断片、
（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；
Ｘは非塩基性アミノ酸であり；
ｍの各々は独立してゼロから５までの整数であり；
ｎの各々は独立して１から１０の間の整数であり；
ｏの各々は独立してゼロから５の間の整数である）、よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、第１ドメインが第２ドメインとは異なり、第３ドメインがインスリンポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなり、キメラペプチドが生体膜をトランスロケーションするペプチド。
【請求項２３】
ペプチドがさらに生理学的関門をトランスロケーションする、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
生理学的関門が胃腸関門または血液脳関門よりなる群から選択される、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
第１ドメインおよび第２ドメインを含んでなるキメラペプチドであって、第１ドメインが配列番号：３０のアミノ酸配列を含んでなり、第２ドメインがインスリンポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなるキメラペプチド。
【請求項２６】
第１ドメインおよび第２ドメインを含んでなるキメラペプチドであって、第１ドメインが配列番号：３５のアミノ酸配列を含んでなり、第２ドメインがインスリンポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなるキメラペプチド。
【請求項２７】
（ａ）抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域の少なくとも一部；
（ｂ）抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域の少なくとも一部；および
（ｃ）インスリンポリペプチドの少なくとも一部を含んでなり、ペプチドが生体膜にトランスロケーションするキメラペプチド。
【請求項２８】
ペプチドがさらに生理学的関門をトランスロケーションする、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
生理学的関門が胃腸関門または血液脳関門である、請求項２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬剤的に許容できる希釈剤、担体またはアジュバントを含んでなる組成物。
【請求項３１】
経口投与に好適な製剤における、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
１個以上の容器に請求項３０に記載の組成物を含んでなるキット。
【請求項３３】
請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含んでなる細胞。
【請求項３６】
請求項３３に記載の核酸および担体を含んでなる組成物。
【請求項３７】
請求項３０または３６に記載の組成物を患者に投与することを含んでなる、患者の糖尿病を治療する方法。
【請求項３８】
ペプチドを調製する方法であって、
（ａ）本発明のペプチド発現を準備する条件下で請求項３３に記載の核酸を含有する細胞を培養すること；および
（ｂ）発現したペプチドを回収すること、
を含んでなる方法。
【請求項３９】
真核細胞中の細胞内インスリン濃度を増加させる方法であって、
（ａ）請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載のペプチドを準備すること；および
（ｂ）真核細胞の活性代謝を促進させる条件下で、該細胞と該ペプチドとを接触させること、
を含んでなる方法。
【請求項４０】
真核細胞中の細胞内ブドウ糖濃度を減少させる方法であって、
（ａ）請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載のペプチドを準備すること；および
（ｂ）真核細胞の活性代謝を促進させる条件下で、該細胞と該ペプチドとを接触させること、
を含んでなる方法。
【請求項４１】
請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載の任意のペプチドを患者に投与することを含んでなる、患者の血清インスリン濃度を増加させる方法。
【請求項４２】
請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載の任意のペプチドを患者に投与することを含んでなる、患者の血清ブドウ糖濃度を減少させる方法。
【請求項１】
第１ドメインおよび第２ドメインを含んでなるキメラペプチドであって、第１ドメインが、生体膜を通って能動輸送を促進するトランスロケーション配列を含んでなり、第２ドメインが、インスリンポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなるキメラペプチド。
【請求項２】
トランスロケーション配列がアミノグリカンと結合する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノグリカンがヘパリンまたは硫酸コンドロイチンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
第１ドメインが、
（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；
（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；
（ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；
（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；および
（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ
（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；
Ｘは非塩基性アミノ酸であり；
ｍの各々は独立してゼロから５までの整数であり；
ｎの各々は独立して１から１０の間の整数であり；
ｏの各々は独立してゼロから５の間の整数である）、よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
キメラ蛋白質が生理学的関門をトランスロケーションする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
生理学的関門が胃腸関門または血液脳関門である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
トランスロケーション配列がリポ蛋白の一部分である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
トランスロケーション配列が少なくとも４個の塩基アミノ酸を含んでなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ｎが２である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１０】
ｎが３である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘが疎水性アミノ酸である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１２】
第１ドメインのアミノ酸配列がＸＢＢＢＸＸＢＸである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１３】
第１ドメインのアミノ酸配列がＸＢＢＸＢＸである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１４】
第１ドメインのアミノ酸配列がＢＢＸｍＢＢＸｏである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１５】
第１ドメインのアミノ酸配列がＸＢＢＸＸＢＸである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１６】
第１ドメインのアミノ酸配列がＢＸＢＢである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１７】
第１ドメインのアミノ酸配列が配列番号：３０または配列番号：３５を含んでなる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１８】
第１ドメインのアミノ酸配列が１００個未満のアミノ酸長である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１９】
第１ドメインのアミノ酸配列が５０個未満のアミノ酸長である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項２０】
第１ドメインのアミノ酸配列が２５個未満のアミノ酸長である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項２１】
（ａ）ヒト抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域；
（ｂ）ヒト抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域；
（ｃ）マウス抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域；および
（ｄ）マウス抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域、
よりなる群から選択される第３ドメインをさらに含んでなる、請求項４に記載のペプチド。
【請求項２２】
第１ドメイン、第２ドメインおよび第３ドメインを含んでなるペプチドであって；第１ドメインおよび第２ドメインが、
（ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；
（ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；
（ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｏ）ｎ；
（ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；および
（ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ；
（ｆ）抗体断片、
（式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり；
Ｘは非塩基性アミノ酸であり；
ｍの各々は独立してゼロから５までの整数であり；
ｎの各々は独立して１から１０の間の整数であり；
ｏの各々は独立してゼロから５の間の整数である）、よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、第１ドメインが第２ドメインとは異なり、第３ドメインがインスリンポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなり、キメラペプチドが生体膜をトランスロケーションするペプチド。
【請求項２３】
ペプチドがさらに生理学的関門をトランスロケーションする、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
生理学的関門が胃腸関門または血液脳関門よりなる群から選択される、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
第１ドメインおよび第２ドメインを含んでなるキメラペプチドであって、第１ドメインが配列番号：３０のアミノ酸配列を含んでなり、第２ドメインがインスリンポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなるキメラペプチド。
【請求項２６】
第１ドメインおよび第２ドメインを含んでなるキメラペプチドであって、第１ドメインが配列番号：３５のアミノ酸配列を含んでなり、第２ドメインがインスリンポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなるキメラペプチド。
【請求項２７】
（ａ）抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域の少なくとも一部；
（ｂ）抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域の少なくとも一部；および
（ｃ）インスリンポリペプチドの少なくとも一部を含んでなり、ペプチドが生体膜にトランスロケーションするキメラペプチド。
【請求項２８】
ペプチドがさらに生理学的関門をトランスロケーションする、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
生理学的関門が胃腸関門または血液脳関門である、請求項２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬剤的に許容できる希釈剤、担体またはアジュバントを含んでなる組成物。
【請求項３１】
経口投与に好適な製剤における、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
１個以上の容器に請求項３０に記載の組成物を含んでなるキット。
【請求項３３】
請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含んでなる細胞。
【請求項３６】
請求項３３に記載の核酸および担体を含んでなる組成物。
【請求項３７】
請求項３０または３６に記載の組成物を患者に投与することを含んでなる、患者の糖尿病を治療する方法。
【請求項３８】
ペプチドを調製する方法であって、
（ａ）本発明のペプチド発現を準備する条件下で請求項３３に記載の核酸を含有する細胞を培養すること；および
（ｂ）発現したペプチドを回収すること、
を含んでなる方法。
【請求項３９】
真核細胞中の細胞内インスリン濃度を増加させる方法であって、
（ａ）請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載のペプチドを準備すること；および
（ｂ）真核細胞の活性代謝を促進させる条件下で、該細胞と該ペプチドとを接触させること、
を含んでなる方法。
【請求項４０】
真核細胞中の細胞内ブドウ糖濃度を減少させる方法であって、
（ａ）請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載のペプチドを準備すること；および
（ｂ）真核細胞の活性代謝を促進させる条件下で、該細胞と該ペプチドとを接触させること、
を含んでなる方法。
【請求項４１】
請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載の任意のペプチドを患者に投与することを含んでなる、患者の血清インスリン濃度を増加させる方法。
【請求項４２】
請求項１、４、２１、２２または２５〜２７のいずれか一項に記載の任意のペプチドを患者に投与することを含んでなる、患者の血清ブドウ糖濃度を減少させる方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２７１９７０（Ｐ２００８−２７１９７０Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１１０７５（Ｐ２００８−１１１０７５）
【出願日】平成２０年４月２２日（２００８．４．２２）
【分割の表示】特願２００３−５２３４９５（Ｐ２００３−５２３４９５）の分割
【原出願日】平成１４年８月３０日（２００２．８．３０）
【出願人】（５０１０４６７８５）ディアトス （ソシエテ アノニム） (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２２日（２００８．４．２２）
【分割の表示】特願２００３−５２３４９５（Ｐ２００３−５２３４９５）の分割
【原出願日】平成１４年８月３０日（２００２．８．３０）
【出願人】（５０１０４６７８５）ディアトス （ソシエテ アノニム） (5)
【Ｆターム（参考）】
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