細胞生育促進機能を有する経皮吸収可能な低分子絹ペプチドの製造と利用
【課題】安心安全な天然物であるフィブロイン由来の低分子化物から細胞生育促進機能を有する物を分離回収する。該回収物には経皮吸収可能な分子量３，０００以下の低分子ペプチドが含有する。これを健康な皮膚の維持、回復を目的としたスキンケア素材として提供することが課題である。
【解決手段】絹糸を溶解することなく、絹糸フィブロインの分子量を低下し、細胞生育促進機能成分と細胞生育阻害成分に分ける。その方法として、結晶性絹粉末を水に浸漬した上清液から低分子化物を抽出する。得られた抽出物には細胞生育促進機能があり、経皮吸収が可能な分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドを５０〜９９％含有している。
【解決手段】絹糸を溶解することなく、絹糸フィブロインの分子量を低下し、細胞生育促進機能成分と細胞生育阻害成分に分ける。その方法として、結晶性絹粉末を水に浸漬した上清液から低分子化物を抽出する。得られた抽出物には細胞生育促進機能があり、経皮吸収が可能な分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドを５０〜９９％含有している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
フィブロイン由来で、ヒト皮膚細胞生育促進機能を有し、かつ経皮吸収可能な低分子ペプチドをスキンケア用素材として医薬品、医薬部外品および化粧品等の分野に利用する。
【背景技術】
【０００２】
絹フィブロイン由来で、皮膚再生機能を有する経皮吸収可能な低分子ペプチドの提供を目的としている。先ず、技術背景について述べる。
絹はフィブロインとセリシンの２つのタンパク質からなっている。従来、フィブロイン繊維である絹糸は手術糸として古くから使われてきたことから、フィブロインは分子量に関係なく生体適合性素材と考えられ、スキンケア素材として使われてきた。一方、本発明者は絹タンパクの内、特にフィブロインの有するヒト皮膚細胞生育機能に注目し、絹糸を粉末、フィルム、ゲル等に変え、これらをスキンケア素材として利用するための開発と機能解明の研究を進めてきた（特許文献１−５）。
【特許文献１】特許第2997758号
【特許文献２】特許第3362778号
【特許文献３】特開2004-339189
【特許文献４】特開2004-123683
【特許文献５】特開平6-292595
【特許文献６】特許第3659352号
【非特許文献１】医学大辞典 （株）医学書院発行 P.689、2003年3月出版
【非特許文献２】ゲノムバンク（Gen Bank accession no. AF226688）
【非特許文献３】加藤弘 絹繊維の加工技術とその応用 P.66
【非特許文献４】玉田靖 まてりあ 第42巻 第1号 2003年
【非特許文献５】繊維便覧（原料編）、繊維学会編、Ｐ．５３
【０００３】
最近、フィブロインとセリシンからなっている繭糸や生糸、または繭糸や生糸からセリシンを除いた絹糸等の加工工程で、分子量約３７万のフィブロインの分子量低下にともなって、フィブロインは細胞生育促進機能も低下する。さらに、フィブロインの分子量が２万程度以下に低下すれば細胞生育促進性がほとんどないか、あるいは細胞生育を阻害することが分かってきた（特許文献４）。
その後、フィブロインの細胞生育促進機能はフィブロインの非結晶部位に、フィブロインの結晶部位には細胞生育を阻害する部分のあることが分かった。また、ペプチドが細胞生育性を促進するにはペプチドのアミノ酸残基数が４残基以上になるとよい（特許文献３）。１残基当たりの分子量を約１００とすれば、４残基の分子量は約４００となる。
【０００４】
ところで、美容の一つとして、損傷のない表皮の一部を剥ぎ取り、損傷を造り、外用剤で皮膚再生を促し、若々しい皮膚を得ようとすることが行われている。しかし、皮膚再生を積極的に行う場合、表皮の一部を剥ぎ取るより、表皮表面から皮膚再生成分を直接経皮吸収させるほうが負担が少なく、容易である。しかし、従来、絹タンパクを経皮吸収させるような利用は行われていなかった。
【０００５】
経皮吸収とは（非特許文献１）損傷の無い皮膚から直接物質が体内に吸収されることを言う。フィブロインは蛋白質として酸性、塩基性の性質、また疎水性や親水性アミノ酸からなっているので、脂溶性や水溶性も備え、乳化作用も有る（特許文献３，６）ので、フィブロイン低分子化物の経皮吸収としては分子の大きさが重要である。
皮膚は外部からよけいなものが入ってこないようにバリアを作っているため、容易には経皮吸収されない。特に、天然成分は分子量が大きいため経皮吸収されないが、分子量が小さい化学物質は簡単に経皮吸収される。
通常、市販されている外用剤には分子量１，０００程度以下の機能性化学物質が添加され、これを経皮吸収させている。また、分子量がおよそ３，０００以下のものは皮膚浸透すると言われている。経皮吸収の容易さとしては、汗腺や毛穴を介する方が角質層経路より有利であり、分子量５，０００程度でも通過可能と考えられる。
【０００６】
スキンケア素材として、安心して使用でき、健康で生き生きとした皮膚となる素材が求められている。そこで、広く使われ、よく知られた絹タンパクから、ヒトの皮膚細胞を生育促進する機能を有し、経皮吸収可能な分子量４００〜５，０００、好ましくは４００〜３，０００の低分子ペプチドが得られれば、スキンケア素材として、極めて有用となる。しかし、これまで使われてこなかった。その理由を以下に述べる。
まず、フィブロインの細胞生育促進機能は分子量３７万の時が最も高い。各種の加工工程での分子量低下は細胞生育促進機能の低下となり、分子量１万以下では細胞生育を阻害するようになる（特許文献４）ので、皮膚再生素材として使えなかった。
【０００７】
スキンケア素材として使われているフィブロインの分子量、特に低分子量に関して述べる。
絹糸を非結晶性フィルムに変え、創傷被覆材とする方法がある（特許文献１）。この場合、絹糸を中性塩で溶解し、溶解液を水で透析（脱塩）した後に非結晶性の水溶性フィブロインフィルムとしている。絹糸を中性塩で溶解する工程でフィブロインの分子量は低下するが、分子量が１万以下に低分子化したものは非常に少ない。それでも透析過程で、通常は分子量１万程度以下が通過できる半透膜を使うため、分子量約１万以下のものは中性塩とともに除去される。
したがって、一般に、絹糸を溶解、透析して得られるフィブロインには経皮吸収されるようなフィブロイン由来の低分子は含まれない。
【０００８】
ところが、特許文献５では、絹糸を溶解、透析して得たフィブロイン水溶液に酵素を作用させた分子量２００〜４，０００のフィブロインの低分子化下物について言及している。しかし、該特許の目的は、フィブロインは高分子量であるため、食用として消化しやすいように、酵素処理で低分子化しているのみである。従って、得られた物のアミノ酸組成は元のフィブロインと同じである。
本発明では、前記したような、フィブロインの低分子化による細胞生育阻害を避けたい。従って、本発明の低分子化物は元のフィブロインとは異なるアミノ酸組成であり、細胞生育促進性を有している。また、酵素の含有を避けたい。
【０００９】
一般に、タンパク質も含め、有機化合物の固体としての材料物性は分子量依存性を示し、分子量が低い場合は弾力性に乏しく、もろくて割れやすく、取り扱い難い。一方、分子量が大きくなるにつれて弾力性が高くなり、柔軟で、割れ難くなるため、扱い易くなる。フィブロインの場合も、分子量１万程度以下のフィルムは割れやすく、分子量５，０００程度以下ではフィルム化自体が困難である。
【００１０】
ところで、絹糸の繊維構造はフィブロインのβ型微結晶が１軸配向した構造である。非特許文献２によれば、フィブロインはアミノ酸組成から結晶部位と非結晶部位の繰り返しからなっている。絹糸の繊維構造が形成されるとき、グリシン（Ｇ）やアラニン（Ａ）など疎水性側鎖のアミノ酸が多いフィブロインの結晶部位は、結晶化しやすく、これらが部分的に集合して微細な結晶（β型結晶）を繊維軸方向に形成し、これらの微結晶が絹糸の骨格となっていると考えられている。
吐糸直後の絹糸フィブロインは高分子量で、絹糸は柔軟であるが、絹糸フィブロインが低分子化すると脆くなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
細胞生育促進機能を有し、経皮吸収可能で、安心安全な天然物であるフィブロイン由来の低分子ペプチドを、健康な皮膚の維持、回復を目的としたスキンケア素材として提供することが課題である。ところで、フィブロイン由来の低分子ペプチドを得る方法はある（特許文献３、５）。特許文献３では、酵素を使うため工程が複雑で、高価であること、また低分子ペプチドに酵素が残ることなどのため使われなかった。特許文献５では食用のため、分子量を単に小さくすることが目的であった。
【００１２】
そこで、フィブロイン以外のものを含まず。細胞生育促進性に優れた、また皮膚再生を促し、フィブロイン由来の経皮吸収可能な低分子ペプチドをさらに容易に得る方法を提供する。つまり、課題は細胞生育促進性に優れた絹フィブロイン由来の低分子ペプチドを効率よく得て、これを経皮吸収させ、損傷の無い部分の皮膚も再生を促すことにある。そのため、酵素を使わないでフィブロインを低分子化する。
本発明で言う細胞生育促進性に優れた機能とは、本発明の実施例２で示すように、絹粉末や絹粉末から得られたフィブロイン低分子化物の濃度を変えた細胞生育率測定で、生育率が１００％を超え、しかも濃度の濃い方の生育率が濃度の薄い方の生育率より高い場合を言う。濃度の高い方が濃度の薄い方より生育率が低いことは細胞生育を阻害していると考える。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
絹糸を溶解しない方法で得る結晶性絹粉末の製造において、粉末の微細化ほど絹糸の低分子化処理を強くしなければならない。その結果、得られる結晶性絹粉末は細胞生育性がないか阻害するようになる。従って、結晶性絹粉末の細胞生育促進機能を高めるため、細胞生育促進機能の高いフィブロインで絹粉末をコーティングし、結晶性絹粉末の細胞生育促進機能を高める（特許文献４）必要があった。その後、フィブロイン分子の非結晶部位に細胞生育促進機能、結晶部位に細胞生育阻害のあることを突き止め、現在出願中である（特許文献３）。
【００１４】
これらの知見から、フィブロインの低分子化物から細胞生育を促進する物と阻害する物とに分けることを考え、鋭意研究した結果、絹糸を溶解することなく、絹糸フィブロインの分子量を低下し、分子量の低下した絹糸の粉末から、フィブロインの低分子化物を水で抽出する。得られた抽出物の分子量は１万程度以下であり、抽出物には経皮吸収が可能な分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドを５０〜９９％含有している。また、抽出物は細胞生育促進機能を有し、該低分子ペプチドは該抽出物以上に優れた細胞生育促進機能を有していることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
【００１５】
すなわち、本願の第１の発明は、結晶性絹粉末を水に浸漬して、上層と該粉末を含有する沈殿物の下層とを形成せしめ、細胞生育促進機能成分を含有する該上層を分離し、採取することを特徴とする抽出物に存する。
本願の第２の発明は、請求項１に記載の抽出物を得る方法に存する。
本願の第３の発明は、請求項１に記載の抽出物に含有する分子量４００〜３、０００の細胞生育促進機能を有する低分子ペプチド抽出物に存する。
本願の第４の発明は、請求項１に記載の抽出物を含有する化粧料に存する。
本願の第５の発明は、請求項３に記載の低分子ペプチドを含有する化粧料に存する。
本願の第６の発明は、請求項３に記載の低分子ペプチドを含有する創傷被覆材に存する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の低分子ペプチドはフィブロイン由来のもので、分子量４００〜３，０００であるため経皮吸収可能で、しかも細胞生育促進機能を有する。そのために、該低分子ペプチドはそれ自体がスキンケア素材として、また該低分子ペプチドを他の素材に添加し、スキンケア素材として、医薬品、医薬部外品、化粧品などに極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
フィブロイン由来で、細胞生育促進機能を有し、中性塩などの絹糸溶解剤や酵素など、フィブロイン由来以外のものを含まず、分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドを得るには、結晶性絹粉末から水溶性成分を抽出することで得られる。
結晶性絹粉末の製造方法は、絹糸をアルカリ処理してフィブロインを低分子化し、これを水洗し乾燥した後に粉砕して、絹粉末を得る（特許文献２）。水洗によって、絹糸（フィブロイン）以外の物が除かれる。このようにして得られる結晶性絹粉末は、絹糸が有する繊維構造をしているが、フィブロインは低分子化されているため、細胞生育性が無いか、阻害すると考えられていた。
【００１８】
低分子ペプチドの作出について述べる。
１．結晶性絹粉末から低分子ペプチドを得る。
結晶性絹粉末とは、繭糸、生糸、絹糸を原料とし、粉末化工程でセリシンが除かれた絹糸を溶解することなく加工して得た粉末をいい、該粉末は絹糸の繊維構造を残している。 結晶性絹粉末の製造方法としては、（１）絹糸をアルカリ処理する、（２）絹糸に光（放射線、紫外線など）を照射する、（３）絹糸を裁断する、（４）絹糸を爆砕する、などの加工後に、粉砕して粉末化することが知られている。本発明の場合、粉末を作る方法としては（１）や（２）の方法が好ましい。
結晶性絹粉末の原料には、家蚕および野蚕（エリ蚕、クリキュラ蚕、天蚕、タサール蚕、ムガ蚕、ヨナクニ蚕、サク蚕）の繭糸、生糸、絹糸が用いられる。野蚕の中ではではエリ蚕、クリキュラ蚕の繭糸は細いので粉末原料として好ましいが、家蚕の原料は白く、タンニンなどの不純物が少ないので野蚕の原料より粉末化が容易なため、さらに好ましい。
【００１９】
絹糸をアルカリ処理や光照射でフィブロインの分子量を低下した場合は、フィブロインのペプチド結合が加水分解される。フィブロインの低分子化した断片の内で、非結晶部位の断片は、低分子化していることと親水性側鎖のアミノ酸が多いことから、水溶性成分として抽出される。一方、細胞生育に係らない、あるいは阻害すると考えられるフィブロインの結晶部位は非結晶部位と比べてグリシン、アラニン等の疎水性側鎖のアミノ酸が多い。これら疎水性アミノ酸を主とした微結晶が網の目状に一軸配向して繊維構造を形成し、絹糸の骨格となっている。このような絹糸の構造（非特許文献３、４）は粉末となっても残っている（特許文献２）。
【００２０】
フィブロインはＨ鎖とＬ鎖からなる。非特許文献２によればＨ鎖とＬ鎖の全アミノ酸数は５５６７となる、またＨ鎖はＮ末端部位、結晶部位と非結晶部位の繰り返し部位、Ｃ末端部位からなっている。これらのアミノ酸組成からＬ鎖およびＨ鎖のＮ末端部位、非結晶部位、Ｃ末端部位を非結晶部（特許文献３）とすれば、非結晶部のアミノ酸数は７７８となり、非結晶部のアミノ酸数の割合はＨ鎖とＬ鎖の合計の１３．９％となる。一方、フィブロインの非結晶部におけるグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）の数は前記ゲノムバンクから１１０，７５，１１５となるので、それらの非結晶部に占める割合はＧ：１４．１％、Ａ：９．６％、Ｓ：１４．８％と計算される。
【００２１】
結晶性絹粉末から低分子化物を得るには、粉末粒子が小さいほど粉末表面積の合計は大きくなり、粉末から水溶性成分が抽出しやすい。（平均）粒子径が１０ミクロン程度以下では、結晶性絹粉末から低分子化物を得やすいが、粒子径が０．５ミクロン程度以下では粉末製造過程で低分子化物の多くが除かれてしまうと考えられ、粒子経は０．５〜１０ミクロン程度が好ましい。
【００２２】
また、低分子化物を抽出物として得るには結晶性絹粉末を水に浸漬し、攪拌した後にろ過するとか、遠心分離のような方法で、粉末と上清液（抽出液）を分離する。遠心分離する場合の回転数は少ない方が回収量は多くなるが、少なすぎると粉末が混入する。
一方、回転数が１万rpm以上では上清液の含有物の分子量にほとんど差が無くなってくる。従って、回転数は２，０００〜１０，０００rpm程度、好ましくは３，０００〜８，０００rpm程度で、３〜２０分間遠心分離すれば、得られた上清液からの抽出物には細胞生育促進性に優れたフィブロイン由来で、分子量１万程度以下の低分子化物からなっている。さらに、該低分子化物には経皮吸収可能な分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドが５０〜９９％含有されている。
【００２３】
２．低分子ペプチドの利用
結晶性絹粉末から抽出した抽出物（低分子化物）および低分子ペプチドは、経皮吸収可能なスキンケア素材として溶液状態で皮膚に塗布して使う。抽出物には低分子ペプチドが５０〜９９％含有しているため、抽出物から低分子ペプチドを分離しなくてもスキンケア素材として有用であり、抽出液（濃度０．０１％〜１．０％）を毎日、１ヶ月程度以上続けて皮膚に塗布すると、徐々に皮膚の改善が進み、肌を生き生きとさせる。
その他の使用方法としては、他のスキンケア素材（乳液やクリームなど）に添加して使う。他のスキンケア素材としては高分子フィブロインが好ましい。
【００２４】
３．低分子ペプチドを含有した高分子フィブロインの作成
フィブロイン由来の細胞生育促進性に優れた抽出物（低分子化物）および低分子ペプチドは、溶液の状態ではそのまま使える。低分子化しているため、固体として使うには脆く、粉末化し易いが、フィルム化は難しい。フィルムとして使う場合は抽出物（低分子化物）または低分子ペプチドを高分子フィブロインに添加し、フィルム化すると使いやすくなる。
高分子フィブロインフィルムの作成はすでに知られているように、絹糸を中性塩で溶解する方法を用いてもよい（特許文献１）。このような方法で得たフィブロインの分子量は５万〜２０万程度の高分子フィブロインとなり、その非結晶性フィルムは弾力性に富んだ材料で、取り扱いやすい。
【００２５】
低分子ペプチドを含有した高分子フィブロインフィルムを使うときには水、化粧水、乳液などのスキンケア用の液体に溶かし、溶液状態にして皮膚に塗布する。該フィルムの溶解液は化粧水、乳液などより水が好ましい。
外観上は傷のない皮膚であっても、該低分子ペプチドやその添加物の塗布を１ヶ月程度以上続けることで、塗布しない部分より手触りが滑らかで、張りがあり、弾力的な生き生きとした肌になる。
本発明はフィブロイン又はフィブロイン由来の物のみの使用を目的としているが、スキンケアとして通常に使用される成分（絹セリシンはもちろん、油成分や香料等、また皮膚再生促進剤など）を適宜配合することができることは言うまでもない。
【実施例１】
【００２６】
〈結晶性絹粉末を水に浸漬して得た抽出液（上清液）の濃度と粉末粒子径〉
絹糸のアルカリ処理はいづれの場合も、絹糸２０ｇ、炭酸ソーダ４．５ｇ、ハイドロサルファイトナトリウム２．０ｇ、水４００ｇを同時に密閉容器に入れ、１２０℃で３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分処理した。アルカリ処理後にこれらを水洗、乾燥して、粉砕した。粉砕するとき、３種類の粉砕機（１．回転式衝撃粉砕機（不二電気工業社（製）サンプルミルKI-1）、２．攪拌雷漬装置（石川式）、３．気流式粉砕機（日清製粉社（製）カレントジェットCJ-１０））で粉砕した。その結果、粒子径の異なる５種類の粉末を得た。
各粉末の１ｇを１００ｇの水に入れ、よく攪拌して粉末を分散させて、遠心分離（８、０００rpm、１０分）し、沈殿物を回収し、乾燥後に重量減を測定した。また、遠心分離して得た上清液の濃度を吸光度で算出した。２７５nmにおける吸光度と濃度は、一般に、吸光度≒１／１０（％）として知られているので、これを用いた。結果を表１に示す。
【表１】
【実施例２】
【００２７】
〈結晶性絹粉末から水で抽出した抽出物と抽出後の粉末の細胞生育性、分子量、アミノ酸組成〉
前記の実施例で得た絹粉末（粉末番号２）１ｇを水１００ｇに浸漬し、攪拌した後、これを遠心分離機（８，０００rpm、１０分）で遠心分離し、粉末（沈殿物）と上清液（抽出液）に分けた。粉末と上清液に分けた内の粉末を乾燥後、その０．３ｇを９モルLiSCN（チオシアン酸リチウム）５mlに溶かし、溶解液を３、０００rpmで１０分間遠心分離した。遠心分離後の上清液を５０倍の水で３０分間、４回透析した。透析後、再び遠心分離してフィブロイン水溶液を得た。
一方、上清液はすでにフィブロイン水溶液となっているので、そのまま細胞生育測定に使った。
【００２８】
結晶性絹粉末から水で抽出して得た上清液と水で抽出後の粉末を溶解して得た水溶液とを０．０２５％および０．００２５％の濃度に、７０％エタノールで調整し、それらをポリスチレンの細胞培養容器（シャーレ、３５mmφ）に１mlずつ入れて風乾した。細胞は三光純薬（株）から購入した凍結ヒト皮膚線維芽細胞（成人由来）を使用した。培地はクラボウ（株）から購入したヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地を使用した。培養はシャーレ１枚につき倍地２ml、７万の細胞を接種して３日間培養した。
細胞数の測定はシャーレ１枚につき培地２ml、アラマーブルー（IWAKI（株））０．１mlの割合で入れ、３７℃、２時間培養した後に５７０nm、６００nmの吸光度から計算した色素の還元量を生細胞数とし、培養容器に結晶性絹粉末に関する成分が無添加の場合（対照区）を１００％とした。結果を表２に示す。
【表２】
【００２９】
表２で、濃度が濃い場合（０．０２５％）と薄い場合（０．００２５％）との生育率を比較する。先ず、水に浸漬した後の粉末について、細胞生育率は濃度の濃い方が低く、粉末から水で抽出して得た抽出物では、細胞生育率は濃度の濃い方が高くなっている。これは、粉末を水に浸漬するとフィブロインの非結晶部位のペプチドは溶出し、上清液に含有され、結晶部位のペプチドは粉末の骨格として残ることが原因と考えられる。従って、表２でフィブロイン結晶部位が主となっている粉末は細胞生育を阻害し、フィブロインの非結晶部位が主となっている抽出物には細胞を生育促進する機能がある。抽出物は結晶性絹粉末を水に浸漬し、上清液と沈殿物に分けたときの上清液に含有しているフィブロインの低分子化物を言う。
【００３０】
また、粉末から抽出した上清液に含有して入るフィブロインの分子量をクロマトグラフィーで測定した。カラムはSuperdex peptide HR10/30（ファルマシア）を使用した。バッファーは１０ミリモルPBSを使用し、流速０．６ml／minで行った。結果を図１に示す。
図１の縦軸は２１４nmの吸光度、横軸は時間と分子量である。図１は次のことを示す。結晶性絹粉末を水に浸漬して得られたフィブロイン由来の分子量は、ほぼ９９％が分子量１万以下で、分子量５，０００以下は約８７％、分子量３，０００以下は約７１％、分子量１，０００以下は約２８％、分子量４００未満は約３％である。（図１）
【００３１】
次に、結晶性絹粉末から抽出した抽出物と沈殿物（抽出後の結晶性絹粉末）のアミノ酸組成の違いを見るため、アミノ酸分析を行った。抽出物および沈殿物を乾燥後に２００倍量の６Ｎ塩酸を加え、減圧封管した後に１１０℃で２４時間加熱した。その後、ロータリーエバポレーターを使い、塩酸を除いた後に、１，０００倍のクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝２．２）で希釈し、アミノ酸分析を行った。アミノ酸分析は高速液体クロマトグラフィー装置（シマズ社製、Ｍ１０Ａ）を用い、カラムはPhenomenex 社製のＬＵＮＡ（Ｃ１８，４．６×１００mm）で行った。結果を表３に示す。
【表３】
【００３２】
先ず、表３では抽出物と沈殿物でアミノ酸組成が異なる。引用文献５では抽出物と沈殿物のアミノ酸組成は同じである。次に、フィブロインのアミノ酸組成（非特許文献５）は、アラニン３０．７％、グリシン４２．８％、セリン１０．０％となっている。そこで、フィブロイン、表３の抽出物、および前述段落００２０のフィブロイン非結晶部位のアミノ酸組成を比較する。アミノ酸の内でアラニン、グリシン、セリンの組成について比較すると、表３の抽出物はフィブロインの非結晶部位の組成に類似していて、段落００２０で述べたアラニン、グリシン、セリンの比率から、沈殿物の７０〜１００％はフィブロインの非結晶部位からの断片であると考えられる。
【実施例３】
【００３３】
〈低分子ペプチドの細胞生育率〉
図１に示す分子量測定試験において、分子量が（イ）４００〜３，０００の部分と（ロ）約１万以下で３，０００を超えた部分を回収し、回収した（イ）と（ロ）について実施例２と同様の細胞生育試験を回収物の濃度０．０２５％について行った。その結果、細胞生育率は（イ）では２４１％、（ロ）では１８７％となり、分子量４００〜３，０００の方が高い細胞生育率を示した。
【実施例４】
【００３４】
〈抽出液（上清液）の塗布試験〉
結晶性絹粉末を水に浸漬して得た上清液（実施例１の粉末番号２の上清液）を、正常な皮膚を呈した成人３人の腕の表面に０．５ccを毎日、２回塗布し、塗布しなかった部分と塗布した部分とを手触りと肉眼観察で比較したところ、３週間から１ヶ月程度経過後から塗布した部分の方が、手触りでは滑らかさに優れ、肉眼観察では透明感があり、生き生きとしていた。
［参考例１］
【００３５】
〈非結晶性高分子フィブロインフィルムの製造〉
水１，０００cc中に炭酸ソーダ０．５ｇを入れ、煮沸（１００℃）し、煮沸中に家蚕の繭１０．０ｇを浸漬、攪拌して９０分間精練し、絹糸とした。その練減は２５．５％、であった。絹糸は９９％以上がフィブロインと考えられる。
得られた絹糸６ｇを９モル LiSCN １５０mlに溶解し、溶解液を５０倍量の水で４回透析し、フィブロイン水溶液（濃度８．３％）を得た。これを実施例２と同じ方法で分子量を測定した。その結果、分子量は約１０万であった。また、このフィブロイン水溶液をプラスチック平板上で、室温で送風しながら乾燥し、フィルムを得た。これをフィルムＡとする。フィルムＡ（約１cm×２cm）を水（約２０℃、１００ｇ）に浸漬したところ、フィルムは１分程度で１００％溶解し、水溶性のフィルムを得た。
【実施例５】
【００３６】
〈低分子ペプチドを含有した非結晶性高分子フィブロインフィルムの塗布試験〉
低分子ペプチドは実施例２において、結晶性絹粉末を水に浸漬攪拌し、これを遠心分離して得た上清液または抽出液（分子量３，０００以下の低分子ペプチドを７１％含有、濃度０．１４７％）である。この上清液１０ｇと［参考例２］で得た（高分子）フィブロイン水溶液（濃度８．３％）１０ｇを混合した。また、これを平板上で送風しながら乾燥し、分子量３，０００以下の低分子ペプチドを１．２％含有するフィルムを得た。これをフィルムＢとする。得られたフィルムＢから水溶性試験片（約１cm×２cm）を切り出し水（約２０℃、１００ｇ）に浸漬したところ、フィルムは１分程度で１００％溶解した。
【００３７】
次に、フィルムＡとフィルムＢに水を添加し、皮膚に塗布した。先ず、フィルムＡとフィルムＢから塗布試験片（約１cm×１cm）を切り出し、これらを正常な皮膚をした成人３人の腕に置き、水約０．３ccを加えて、腕上でフィルムを溶かし、皮膚によく塗布した。１日２回の塗布を１ヶ月続けたところ、フィルムＡを塗布した部分は手触りが滑らかとなった。フィルムＢを塗布した部分は手触りが滑らかであることに加えて、透明感があり生き生きとしていた。フィルムＡとＢとでは塗布後の皮膚の透明感に僅かな違いがあり、フィルムＢの方がより良い結果であった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明に必要な結晶性絹粉末はすでに生産されている。また、本発明の抽出物は安心で安全なフィブロイン由来のもので、経皮吸収可能な分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドを含有し、しかも細胞生育促進機能を有する。また、フィブロイン由来のもの以外は含まない。そのために、アレルギー性皮膚でこれまで化粧がしにくかった人の多くに使えること、皮膚を剥離することなく皮膚再生の促進が可能であることなどから、これまで以上の多くの人にスキンケア素材として利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】結晶性絹粉末を水に浸漬して抽出した抽出液（上清液）に含有しているフィブロイン由来低分子化物のクロマトグラフィーによる分子量分析
【技術分野】
【０００１】
フィブロイン由来で、ヒト皮膚細胞生育促進機能を有し、かつ経皮吸収可能な低分子ペプチドをスキンケア用素材として医薬品、医薬部外品および化粧品等の分野に利用する。
【背景技術】
【０００２】
絹フィブロイン由来で、皮膚再生機能を有する経皮吸収可能な低分子ペプチドの提供を目的としている。先ず、技術背景について述べる。
絹はフィブロインとセリシンの２つのタンパク質からなっている。従来、フィブロイン繊維である絹糸は手術糸として古くから使われてきたことから、フィブロインは分子量に関係なく生体適合性素材と考えられ、スキンケア素材として使われてきた。一方、本発明者は絹タンパクの内、特にフィブロインの有するヒト皮膚細胞生育機能に注目し、絹糸を粉末、フィルム、ゲル等に変え、これらをスキンケア素材として利用するための開発と機能解明の研究を進めてきた（特許文献１−５）。
【特許文献１】特許第2997758号
【特許文献２】特許第3362778号
【特許文献３】特開2004-339189
【特許文献４】特開2004-123683
【特許文献５】特開平6-292595
【特許文献６】特許第3659352号
【非特許文献１】医学大辞典 （株）医学書院発行 P.689、2003年3月出版
【非特許文献２】ゲノムバンク（Gen Bank accession no. AF226688）
【非特許文献３】加藤弘 絹繊維の加工技術とその応用 P.66
【非特許文献４】玉田靖 まてりあ 第42巻 第1号 2003年
【非特許文献５】繊維便覧（原料編）、繊維学会編、Ｐ．５３
【０００３】
最近、フィブロインとセリシンからなっている繭糸や生糸、または繭糸や生糸からセリシンを除いた絹糸等の加工工程で、分子量約３７万のフィブロインの分子量低下にともなって、フィブロインは細胞生育促進機能も低下する。さらに、フィブロインの分子量が２万程度以下に低下すれば細胞生育促進性がほとんどないか、あるいは細胞生育を阻害することが分かってきた（特許文献４）。
その後、フィブロインの細胞生育促進機能はフィブロインの非結晶部位に、フィブロインの結晶部位には細胞生育を阻害する部分のあることが分かった。また、ペプチドが細胞生育性を促進するにはペプチドのアミノ酸残基数が４残基以上になるとよい（特許文献３）。１残基当たりの分子量を約１００とすれば、４残基の分子量は約４００となる。
【０００４】
ところで、美容の一つとして、損傷のない表皮の一部を剥ぎ取り、損傷を造り、外用剤で皮膚再生を促し、若々しい皮膚を得ようとすることが行われている。しかし、皮膚再生を積極的に行う場合、表皮の一部を剥ぎ取るより、表皮表面から皮膚再生成分を直接経皮吸収させるほうが負担が少なく、容易である。しかし、従来、絹タンパクを経皮吸収させるような利用は行われていなかった。
【０００５】
経皮吸収とは（非特許文献１）損傷の無い皮膚から直接物質が体内に吸収されることを言う。フィブロインは蛋白質として酸性、塩基性の性質、また疎水性や親水性アミノ酸からなっているので、脂溶性や水溶性も備え、乳化作用も有る（特許文献３，６）ので、フィブロイン低分子化物の経皮吸収としては分子の大きさが重要である。
皮膚は外部からよけいなものが入ってこないようにバリアを作っているため、容易には経皮吸収されない。特に、天然成分は分子量が大きいため経皮吸収されないが、分子量が小さい化学物質は簡単に経皮吸収される。
通常、市販されている外用剤には分子量１，０００程度以下の機能性化学物質が添加され、これを経皮吸収させている。また、分子量がおよそ３，０００以下のものは皮膚浸透すると言われている。経皮吸収の容易さとしては、汗腺や毛穴を介する方が角質層経路より有利であり、分子量５，０００程度でも通過可能と考えられる。
【０００６】
スキンケア素材として、安心して使用でき、健康で生き生きとした皮膚となる素材が求められている。そこで、広く使われ、よく知られた絹タンパクから、ヒトの皮膚細胞を生育促進する機能を有し、経皮吸収可能な分子量４００〜５，０００、好ましくは４００〜３，０００の低分子ペプチドが得られれば、スキンケア素材として、極めて有用となる。しかし、これまで使われてこなかった。その理由を以下に述べる。
まず、フィブロインの細胞生育促進機能は分子量３７万の時が最も高い。各種の加工工程での分子量低下は細胞生育促進機能の低下となり、分子量１万以下では細胞生育を阻害するようになる（特許文献４）ので、皮膚再生素材として使えなかった。
【０００７】
スキンケア素材として使われているフィブロインの分子量、特に低分子量に関して述べる。
絹糸を非結晶性フィルムに変え、創傷被覆材とする方法がある（特許文献１）。この場合、絹糸を中性塩で溶解し、溶解液を水で透析（脱塩）した後に非結晶性の水溶性フィブロインフィルムとしている。絹糸を中性塩で溶解する工程でフィブロインの分子量は低下するが、分子量が１万以下に低分子化したものは非常に少ない。それでも透析過程で、通常は分子量１万程度以下が通過できる半透膜を使うため、分子量約１万以下のものは中性塩とともに除去される。
したがって、一般に、絹糸を溶解、透析して得られるフィブロインには経皮吸収されるようなフィブロイン由来の低分子は含まれない。
【０００８】
ところが、特許文献５では、絹糸を溶解、透析して得たフィブロイン水溶液に酵素を作用させた分子量２００〜４，０００のフィブロインの低分子化下物について言及している。しかし、該特許の目的は、フィブロインは高分子量であるため、食用として消化しやすいように、酵素処理で低分子化しているのみである。従って、得られた物のアミノ酸組成は元のフィブロインと同じである。
本発明では、前記したような、フィブロインの低分子化による細胞生育阻害を避けたい。従って、本発明の低分子化物は元のフィブロインとは異なるアミノ酸組成であり、細胞生育促進性を有している。また、酵素の含有を避けたい。
【０００９】
一般に、タンパク質も含め、有機化合物の固体としての材料物性は分子量依存性を示し、分子量が低い場合は弾力性に乏しく、もろくて割れやすく、取り扱い難い。一方、分子量が大きくなるにつれて弾力性が高くなり、柔軟で、割れ難くなるため、扱い易くなる。フィブロインの場合も、分子量１万程度以下のフィルムは割れやすく、分子量５，０００程度以下ではフィルム化自体が困難である。
【００１０】
ところで、絹糸の繊維構造はフィブロインのβ型微結晶が１軸配向した構造である。非特許文献２によれば、フィブロインはアミノ酸組成から結晶部位と非結晶部位の繰り返しからなっている。絹糸の繊維構造が形成されるとき、グリシン（Ｇ）やアラニン（Ａ）など疎水性側鎖のアミノ酸が多いフィブロインの結晶部位は、結晶化しやすく、これらが部分的に集合して微細な結晶（β型結晶）を繊維軸方向に形成し、これらの微結晶が絹糸の骨格となっていると考えられている。
吐糸直後の絹糸フィブロインは高分子量で、絹糸は柔軟であるが、絹糸フィブロインが低分子化すると脆くなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
細胞生育促進機能を有し、経皮吸収可能で、安心安全な天然物であるフィブロイン由来の低分子ペプチドを、健康な皮膚の維持、回復を目的としたスキンケア素材として提供することが課題である。ところで、フィブロイン由来の低分子ペプチドを得る方法はある（特許文献３、５）。特許文献３では、酵素を使うため工程が複雑で、高価であること、また低分子ペプチドに酵素が残ることなどのため使われなかった。特許文献５では食用のため、分子量を単に小さくすることが目的であった。
【００１２】
そこで、フィブロイン以外のものを含まず。細胞生育促進性に優れた、また皮膚再生を促し、フィブロイン由来の経皮吸収可能な低分子ペプチドをさらに容易に得る方法を提供する。つまり、課題は細胞生育促進性に優れた絹フィブロイン由来の低分子ペプチドを効率よく得て、これを経皮吸収させ、損傷の無い部分の皮膚も再生を促すことにある。そのため、酵素を使わないでフィブロインを低分子化する。
本発明で言う細胞生育促進性に優れた機能とは、本発明の実施例２で示すように、絹粉末や絹粉末から得られたフィブロイン低分子化物の濃度を変えた細胞生育率測定で、生育率が１００％を超え、しかも濃度の濃い方の生育率が濃度の薄い方の生育率より高い場合を言う。濃度の高い方が濃度の薄い方より生育率が低いことは細胞生育を阻害していると考える。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
絹糸を溶解しない方法で得る結晶性絹粉末の製造において、粉末の微細化ほど絹糸の低分子化処理を強くしなければならない。その結果、得られる結晶性絹粉末は細胞生育性がないか阻害するようになる。従って、結晶性絹粉末の細胞生育促進機能を高めるため、細胞生育促進機能の高いフィブロインで絹粉末をコーティングし、結晶性絹粉末の細胞生育促進機能を高める（特許文献４）必要があった。その後、フィブロイン分子の非結晶部位に細胞生育促進機能、結晶部位に細胞生育阻害のあることを突き止め、現在出願中である（特許文献３）。
【００１４】
これらの知見から、フィブロインの低分子化物から細胞生育を促進する物と阻害する物とに分けることを考え、鋭意研究した結果、絹糸を溶解することなく、絹糸フィブロインの分子量を低下し、分子量の低下した絹糸の粉末から、フィブロインの低分子化物を水で抽出する。得られた抽出物の分子量は１万程度以下であり、抽出物には経皮吸収が可能な分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドを５０〜９９％含有している。また、抽出物は細胞生育促進機能を有し、該低分子ペプチドは該抽出物以上に優れた細胞生育促進機能を有していることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
【００１５】
すなわち、本願の第１の発明は、結晶性絹粉末を水に浸漬して、上層と該粉末を含有する沈殿物の下層とを形成せしめ、細胞生育促進機能成分を含有する該上層を分離し、採取することを特徴とする抽出物に存する。
本願の第２の発明は、請求項１に記載の抽出物を得る方法に存する。
本願の第３の発明は、請求項１に記載の抽出物に含有する分子量４００〜３、０００の細胞生育促進機能を有する低分子ペプチド抽出物に存する。
本願の第４の発明は、請求項１に記載の抽出物を含有する化粧料に存する。
本願の第５の発明は、請求項３に記載の低分子ペプチドを含有する化粧料に存する。
本願の第６の発明は、請求項３に記載の低分子ペプチドを含有する創傷被覆材に存する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の低分子ペプチドはフィブロイン由来のもので、分子量４００〜３，０００であるため経皮吸収可能で、しかも細胞生育促進機能を有する。そのために、該低分子ペプチドはそれ自体がスキンケア素材として、また該低分子ペプチドを他の素材に添加し、スキンケア素材として、医薬品、医薬部外品、化粧品などに極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
フィブロイン由来で、細胞生育促進機能を有し、中性塩などの絹糸溶解剤や酵素など、フィブロイン由来以外のものを含まず、分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドを得るには、結晶性絹粉末から水溶性成分を抽出することで得られる。
結晶性絹粉末の製造方法は、絹糸をアルカリ処理してフィブロインを低分子化し、これを水洗し乾燥した後に粉砕して、絹粉末を得る（特許文献２）。水洗によって、絹糸（フィブロイン）以外の物が除かれる。このようにして得られる結晶性絹粉末は、絹糸が有する繊維構造をしているが、フィブロインは低分子化されているため、細胞生育性が無いか、阻害すると考えられていた。
【００１８】
低分子ペプチドの作出について述べる。
１．結晶性絹粉末から低分子ペプチドを得る。
結晶性絹粉末とは、繭糸、生糸、絹糸を原料とし、粉末化工程でセリシンが除かれた絹糸を溶解することなく加工して得た粉末をいい、該粉末は絹糸の繊維構造を残している。 結晶性絹粉末の製造方法としては、（１）絹糸をアルカリ処理する、（２）絹糸に光（放射線、紫外線など）を照射する、（３）絹糸を裁断する、（４）絹糸を爆砕する、などの加工後に、粉砕して粉末化することが知られている。本発明の場合、粉末を作る方法としては（１）や（２）の方法が好ましい。
結晶性絹粉末の原料には、家蚕および野蚕（エリ蚕、クリキュラ蚕、天蚕、タサール蚕、ムガ蚕、ヨナクニ蚕、サク蚕）の繭糸、生糸、絹糸が用いられる。野蚕の中ではではエリ蚕、クリキュラ蚕の繭糸は細いので粉末原料として好ましいが、家蚕の原料は白く、タンニンなどの不純物が少ないので野蚕の原料より粉末化が容易なため、さらに好ましい。
【００１９】
絹糸をアルカリ処理や光照射でフィブロインの分子量を低下した場合は、フィブロインのペプチド結合が加水分解される。フィブロインの低分子化した断片の内で、非結晶部位の断片は、低分子化していることと親水性側鎖のアミノ酸が多いことから、水溶性成分として抽出される。一方、細胞生育に係らない、あるいは阻害すると考えられるフィブロインの結晶部位は非結晶部位と比べてグリシン、アラニン等の疎水性側鎖のアミノ酸が多い。これら疎水性アミノ酸を主とした微結晶が網の目状に一軸配向して繊維構造を形成し、絹糸の骨格となっている。このような絹糸の構造（非特許文献３、４）は粉末となっても残っている（特許文献２）。
【００２０】
フィブロインはＨ鎖とＬ鎖からなる。非特許文献２によればＨ鎖とＬ鎖の全アミノ酸数は５５６７となる、またＨ鎖はＮ末端部位、結晶部位と非結晶部位の繰り返し部位、Ｃ末端部位からなっている。これらのアミノ酸組成からＬ鎖およびＨ鎖のＮ末端部位、非結晶部位、Ｃ末端部位を非結晶部（特許文献３）とすれば、非結晶部のアミノ酸数は７７８となり、非結晶部のアミノ酸数の割合はＨ鎖とＬ鎖の合計の１３．９％となる。一方、フィブロインの非結晶部におけるグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）の数は前記ゲノムバンクから１１０，７５，１１５となるので、それらの非結晶部に占める割合はＧ：１４．１％、Ａ：９．６％、Ｓ：１４．８％と計算される。
【００２１】
結晶性絹粉末から低分子化物を得るには、粉末粒子が小さいほど粉末表面積の合計は大きくなり、粉末から水溶性成分が抽出しやすい。（平均）粒子径が１０ミクロン程度以下では、結晶性絹粉末から低分子化物を得やすいが、粒子径が０．５ミクロン程度以下では粉末製造過程で低分子化物の多くが除かれてしまうと考えられ、粒子経は０．５〜１０ミクロン程度が好ましい。
【００２２】
また、低分子化物を抽出物として得るには結晶性絹粉末を水に浸漬し、攪拌した後にろ過するとか、遠心分離のような方法で、粉末と上清液（抽出液）を分離する。遠心分離する場合の回転数は少ない方が回収量は多くなるが、少なすぎると粉末が混入する。
一方、回転数が１万rpm以上では上清液の含有物の分子量にほとんど差が無くなってくる。従って、回転数は２，０００〜１０，０００rpm程度、好ましくは３，０００〜８，０００rpm程度で、３〜２０分間遠心分離すれば、得られた上清液からの抽出物には細胞生育促進性に優れたフィブロイン由来で、分子量１万程度以下の低分子化物からなっている。さらに、該低分子化物には経皮吸収可能な分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドが５０〜９９％含有されている。
【００２３】
２．低分子ペプチドの利用
結晶性絹粉末から抽出した抽出物（低分子化物）および低分子ペプチドは、経皮吸収可能なスキンケア素材として溶液状態で皮膚に塗布して使う。抽出物には低分子ペプチドが５０〜９９％含有しているため、抽出物から低分子ペプチドを分離しなくてもスキンケア素材として有用であり、抽出液（濃度０．０１％〜１．０％）を毎日、１ヶ月程度以上続けて皮膚に塗布すると、徐々に皮膚の改善が進み、肌を生き生きとさせる。
その他の使用方法としては、他のスキンケア素材（乳液やクリームなど）に添加して使う。他のスキンケア素材としては高分子フィブロインが好ましい。
【００２４】
３．低分子ペプチドを含有した高分子フィブロインの作成
フィブロイン由来の細胞生育促進性に優れた抽出物（低分子化物）および低分子ペプチドは、溶液の状態ではそのまま使える。低分子化しているため、固体として使うには脆く、粉末化し易いが、フィルム化は難しい。フィルムとして使う場合は抽出物（低分子化物）または低分子ペプチドを高分子フィブロインに添加し、フィルム化すると使いやすくなる。
高分子フィブロインフィルムの作成はすでに知られているように、絹糸を中性塩で溶解する方法を用いてもよい（特許文献１）。このような方法で得たフィブロインの分子量は５万〜２０万程度の高分子フィブロインとなり、その非結晶性フィルムは弾力性に富んだ材料で、取り扱いやすい。
【００２５】
低分子ペプチドを含有した高分子フィブロインフィルムを使うときには水、化粧水、乳液などのスキンケア用の液体に溶かし、溶液状態にして皮膚に塗布する。該フィルムの溶解液は化粧水、乳液などより水が好ましい。
外観上は傷のない皮膚であっても、該低分子ペプチドやその添加物の塗布を１ヶ月程度以上続けることで、塗布しない部分より手触りが滑らかで、張りがあり、弾力的な生き生きとした肌になる。
本発明はフィブロイン又はフィブロイン由来の物のみの使用を目的としているが、スキンケアとして通常に使用される成分（絹セリシンはもちろん、油成分や香料等、また皮膚再生促進剤など）を適宜配合することができることは言うまでもない。
【実施例１】
【００２６】
〈結晶性絹粉末を水に浸漬して得た抽出液（上清液）の濃度と粉末粒子径〉
絹糸のアルカリ処理はいづれの場合も、絹糸２０ｇ、炭酸ソーダ４．５ｇ、ハイドロサルファイトナトリウム２．０ｇ、水４００ｇを同時に密閉容器に入れ、１２０℃で３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分処理した。アルカリ処理後にこれらを水洗、乾燥して、粉砕した。粉砕するとき、３種類の粉砕機（１．回転式衝撃粉砕機（不二電気工業社（製）サンプルミルKI-1）、２．攪拌雷漬装置（石川式）、３．気流式粉砕機（日清製粉社（製）カレントジェットCJ-１０））で粉砕した。その結果、粒子径の異なる５種類の粉末を得た。
各粉末の１ｇを１００ｇの水に入れ、よく攪拌して粉末を分散させて、遠心分離（８、０００rpm、１０分）し、沈殿物を回収し、乾燥後に重量減を測定した。また、遠心分離して得た上清液の濃度を吸光度で算出した。２７５nmにおける吸光度と濃度は、一般に、吸光度≒１／１０（％）として知られているので、これを用いた。結果を表１に示す。
【表１】
【実施例２】
【００２７】
〈結晶性絹粉末から水で抽出した抽出物と抽出後の粉末の細胞生育性、分子量、アミノ酸組成〉
前記の実施例で得た絹粉末（粉末番号２）１ｇを水１００ｇに浸漬し、攪拌した後、これを遠心分離機（８，０００rpm、１０分）で遠心分離し、粉末（沈殿物）と上清液（抽出液）に分けた。粉末と上清液に分けた内の粉末を乾燥後、その０．３ｇを９モルLiSCN（チオシアン酸リチウム）５mlに溶かし、溶解液を３、０００rpmで１０分間遠心分離した。遠心分離後の上清液を５０倍の水で３０分間、４回透析した。透析後、再び遠心分離してフィブロイン水溶液を得た。
一方、上清液はすでにフィブロイン水溶液となっているので、そのまま細胞生育測定に使った。
【００２８】
結晶性絹粉末から水で抽出して得た上清液と水で抽出後の粉末を溶解して得た水溶液とを０．０２５％および０．００２５％の濃度に、７０％エタノールで調整し、それらをポリスチレンの細胞培養容器（シャーレ、３５mmφ）に１mlずつ入れて風乾した。細胞は三光純薬（株）から購入した凍結ヒト皮膚線維芽細胞（成人由来）を使用した。培地はクラボウ（株）から購入したヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地を使用した。培養はシャーレ１枚につき倍地２ml、７万の細胞を接種して３日間培養した。
細胞数の測定はシャーレ１枚につき培地２ml、アラマーブルー（IWAKI（株））０．１mlの割合で入れ、３７℃、２時間培養した後に５７０nm、６００nmの吸光度から計算した色素の還元量を生細胞数とし、培養容器に結晶性絹粉末に関する成分が無添加の場合（対照区）を１００％とした。結果を表２に示す。
【表２】
【００２９】
表２で、濃度が濃い場合（０．０２５％）と薄い場合（０．００２５％）との生育率を比較する。先ず、水に浸漬した後の粉末について、細胞生育率は濃度の濃い方が低く、粉末から水で抽出して得た抽出物では、細胞生育率は濃度の濃い方が高くなっている。これは、粉末を水に浸漬するとフィブロインの非結晶部位のペプチドは溶出し、上清液に含有され、結晶部位のペプチドは粉末の骨格として残ることが原因と考えられる。従って、表２でフィブロイン結晶部位が主となっている粉末は細胞生育を阻害し、フィブロインの非結晶部位が主となっている抽出物には細胞を生育促進する機能がある。抽出物は結晶性絹粉末を水に浸漬し、上清液と沈殿物に分けたときの上清液に含有しているフィブロインの低分子化物を言う。
【００３０】
また、粉末から抽出した上清液に含有して入るフィブロインの分子量をクロマトグラフィーで測定した。カラムはSuperdex peptide HR10/30（ファルマシア）を使用した。バッファーは１０ミリモルPBSを使用し、流速０．６ml／minで行った。結果を図１に示す。
図１の縦軸は２１４nmの吸光度、横軸は時間と分子量である。図１は次のことを示す。結晶性絹粉末を水に浸漬して得られたフィブロイン由来の分子量は、ほぼ９９％が分子量１万以下で、分子量５，０００以下は約８７％、分子量３，０００以下は約７１％、分子量１，０００以下は約２８％、分子量４００未満は約３％である。（図１）
【００３１】
次に、結晶性絹粉末から抽出した抽出物と沈殿物（抽出後の結晶性絹粉末）のアミノ酸組成の違いを見るため、アミノ酸分析を行った。抽出物および沈殿物を乾燥後に２００倍量の６Ｎ塩酸を加え、減圧封管した後に１１０℃で２４時間加熱した。その後、ロータリーエバポレーターを使い、塩酸を除いた後に、１，０００倍のクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝２．２）で希釈し、アミノ酸分析を行った。アミノ酸分析は高速液体クロマトグラフィー装置（シマズ社製、Ｍ１０Ａ）を用い、カラムはPhenomenex 社製のＬＵＮＡ（Ｃ１８，４．６×１００mm）で行った。結果を表３に示す。
【表３】
【００３２】
先ず、表３では抽出物と沈殿物でアミノ酸組成が異なる。引用文献５では抽出物と沈殿物のアミノ酸組成は同じである。次に、フィブロインのアミノ酸組成（非特許文献５）は、アラニン３０．７％、グリシン４２．８％、セリン１０．０％となっている。そこで、フィブロイン、表３の抽出物、および前述段落００２０のフィブロイン非結晶部位のアミノ酸組成を比較する。アミノ酸の内でアラニン、グリシン、セリンの組成について比較すると、表３の抽出物はフィブロインの非結晶部位の組成に類似していて、段落００２０で述べたアラニン、グリシン、セリンの比率から、沈殿物の７０〜１００％はフィブロインの非結晶部位からの断片であると考えられる。
【実施例３】
【００３３】
〈低分子ペプチドの細胞生育率〉
図１に示す分子量測定試験において、分子量が（イ）４００〜３，０００の部分と（ロ）約１万以下で３，０００を超えた部分を回収し、回収した（イ）と（ロ）について実施例２と同様の細胞生育試験を回収物の濃度０．０２５％について行った。その結果、細胞生育率は（イ）では２４１％、（ロ）では１８７％となり、分子量４００〜３，０００の方が高い細胞生育率を示した。
【実施例４】
【００３４】
〈抽出液（上清液）の塗布試験〉
結晶性絹粉末を水に浸漬して得た上清液（実施例１の粉末番号２の上清液）を、正常な皮膚を呈した成人３人の腕の表面に０．５ccを毎日、２回塗布し、塗布しなかった部分と塗布した部分とを手触りと肉眼観察で比較したところ、３週間から１ヶ月程度経過後から塗布した部分の方が、手触りでは滑らかさに優れ、肉眼観察では透明感があり、生き生きとしていた。
［参考例１］
【００３５】
〈非結晶性高分子フィブロインフィルムの製造〉
水１，０００cc中に炭酸ソーダ０．５ｇを入れ、煮沸（１００℃）し、煮沸中に家蚕の繭１０．０ｇを浸漬、攪拌して９０分間精練し、絹糸とした。その練減は２５．５％、であった。絹糸は９９％以上がフィブロインと考えられる。
得られた絹糸６ｇを９モル LiSCN １５０mlに溶解し、溶解液を５０倍量の水で４回透析し、フィブロイン水溶液（濃度８．３％）を得た。これを実施例２と同じ方法で分子量を測定した。その結果、分子量は約１０万であった。また、このフィブロイン水溶液をプラスチック平板上で、室温で送風しながら乾燥し、フィルムを得た。これをフィルムＡとする。フィルムＡ（約１cm×２cm）を水（約２０℃、１００ｇ）に浸漬したところ、フィルムは１分程度で１００％溶解し、水溶性のフィルムを得た。
【実施例５】
【００３６】
〈低分子ペプチドを含有した非結晶性高分子フィブロインフィルムの塗布試験〉
低分子ペプチドは実施例２において、結晶性絹粉末を水に浸漬攪拌し、これを遠心分離して得た上清液または抽出液（分子量３，０００以下の低分子ペプチドを７１％含有、濃度０．１４７％）である。この上清液１０ｇと［参考例２］で得た（高分子）フィブロイン水溶液（濃度８．３％）１０ｇを混合した。また、これを平板上で送風しながら乾燥し、分子量３，０００以下の低分子ペプチドを１．２％含有するフィルムを得た。これをフィルムＢとする。得られたフィルムＢから水溶性試験片（約１cm×２cm）を切り出し水（約２０℃、１００ｇ）に浸漬したところ、フィルムは１分程度で１００％溶解した。
【００３７】
次に、フィルムＡとフィルムＢに水を添加し、皮膚に塗布した。先ず、フィルムＡとフィルムＢから塗布試験片（約１cm×１cm）を切り出し、これらを正常な皮膚をした成人３人の腕に置き、水約０．３ccを加えて、腕上でフィルムを溶かし、皮膚によく塗布した。１日２回の塗布を１ヶ月続けたところ、フィルムＡを塗布した部分は手触りが滑らかとなった。フィルムＢを塗布した部分は手触りが滑らかであることに加えて、透明感があり生き生きとしていた。フィルムＡとＢとでは塗布後の皮膚の透明感に僅かな違いがあり、フィルムＢの方がより良い結果であった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明に必要な結晶性絹粉末はすでに生産されている。また、本発明の抽出物は安心で安全なフィブロイン由来のもので、経皮吸収可能な分子量４００〜３，０００の低分子ペプチドを含有し、しかも細胞生育促進機能を有する。また、フィブロイン由来のもの以外は含まない。そのために、アレルギー性皮膚でこれまで化粧がしにくかった人の多くに使えること、皮膚を剥離することなく皮膚再生の促進が可能であることなどから、これまで以上の多くの人にスキンケア素材として利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】結晶性絹粉末を水に浸漬して抽出した抽出液（上清液）に含有しているフィブロイン由来低分子化物のクロマトグラフィーによる分子量分析
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶性絹粉末を水に浸漬して、上層と該粉末を含有する沈殿物の下層とを形成せしめ、細胞生育促進機能成分を含有する該上層を分離し、採取することを特徴とする抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載の抽出物を得る方法。
【請求項３】
請求項１に記載の抽出物に含有する分子量４００〜３、０００の細胞生育促進機能を有する低分子ペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の抽出物を含有する化粧料。
【請求項５】
請求項３に記載の低分子ペプチドを含有する化粧料。
【請求項６】
請求項３に記載の低分子ペプチドを含有する創傷被覆材。
【請求項１】
結晶性絹粉末を水に浸漬して、上層と該粉末を含有する沈殿物の下層とを形成せしめ、細胞生育促進機能成分を含有する該上層を分離し、採取することを特徴とする抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載の抽出物を得る方法。
【請求項３】
請求項１に記載の抽出物に含有する分子量４００〜３、０００の細胞生育促進機能を有する低分子ペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の抽出物を含有する化粧料。
【請求項５】
請求項３に記載の低分子ペプチドを含有する化粧料。
【請求項６】
請求項３に記載の低分子ペプチドを含有する創傷被覆材。
【図１】
【公開番号】特開２００７−２４６４６１（Ｐ２００７−２４６４６１Ａ）
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７３７６９（Ｐ２００６−７３７６９）
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【出願人】（３０６０００３２６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【出願人】（３０６０００３２６）
【Ｆターム（参考）】
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