組み換えタンパク質のマンノース含量を調節するための方法
本発明は、マンノース含量、詳細には組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を調節（例えば、減少）する方法に関する。１局面では、本発明は、細胞培養条件を操作することによって、哺乳動物宿主細胞において生成された組み換え糖タンパク質のマンノース含量（すなわち、オリゴサッカライド側鎖上）を調節し、その結果その細胞によって産生される糖タンパク質が低マンノース含量を有するような方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法で生成された組成物は、その組成物中の糖タンパク質の約１０％未満が、４つを超えるマンノース残基を有する（すなわち、Ｍ５以上の種である）。この低マンノース含量は、低浸透圧重量モル濃度（例えば、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、または約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、または約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、例えば、約３８０〜２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ）で細胞培養条件を維持することによって達成される。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
高等な真核生物は、種々の翻訳後修飾を行い、これには、メチル化、硫酸化、リン酸化、脂質付加およびグリコシル化が挙げられる。このような修飾は、タンパク質の機能にとって決定に重要なものであり得る。分泌されるタンパク質、膜タンパク質、および小胞または特定の細胞内オルガネラに標的されるタンパク質は、グリコシル化される可能性が高い。
【０００２】
Ｎ連結グリコシル化は、タンパク質中の認識配列（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に見出されるアスパラギン残基に対するオリゴサッカライドの付加を含むグリコシル化の形態である。Ｎ連結糖タンパク質は、標準的な分枝された構造を含み、この構造は、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびノイラミン酸から構成される。タンパク質のＮグリコシル化は代表的には、小胞体（ＥＲ）から始まり、ここでドリコール（脂質担体の中間体）上にアセンブルしたＮ連結したオリゴサッカライド（例えば、Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）が新生タンパク質の適切なアスパラギン（Ａｓｎ）に移される。これは、全ての真核生物のＮ連結糖タンパク質に共通の事象である。２つの主要なタイプのＮ連結サッカライドである：高マンノースオリゴサッカライドおよび複合オリゴサッカライドが存在する。
【０００３】
高マンノースオリゴサッカライドは代表的には、多くのマンノース残基（例えば、４より大きい）を有する２つのＮアセチルグルコサミンを含む。複合オリゴサッカライドは、それらがほとんど、もとの２つのＮアセチルグルコサミンよりも多くを含む、多数の他のタイプのサッカライド（糖類）を含み得るために、そのように名付けられる。タンパク質は、そのタンパク質の種々の部分上の両方のタイプのオリゴサッカライドによってグリコシル化され得る。オリゴサッカライドが高マンノースであるか、または複合体であるかは、ゴルジ体における糖類（サッカライド）修飾タンパク質に対するその接近性に依存すると考えられる。サッカライドが比較的接近し難い場合、それはもとの高マンノース型であり続ける可能性が最も高い。それが接近可能であるならば、多くのマンノース残基は、切断され、そしてサッカライドはさらに、上記で考察されたような他のタイプの基の付加によって修飾される。
【０００４】
オリゴサッカライド鎖が、タンパク質に付加された後、３つのグルコースおよび１つのマンノース残基が、固定された順序で３つの異なる酵素によって除去される。この事象は、ＥＲで生じ、そしてタンパク質が、さらなるプロセシングのためにゴルジに輸送され得るシグナルである。ＥＲでのプロセシング後、高マンノース型のオリゴサッカライドが形成される。３つのグルコース残基および１つの特異的なα−１，２−連結したマンノース残基は、ＥＲにおいて特異的なグリコシダーゼおよびα−１，２−マンノシダーゼによって除去され、その結果コアのオリゴサッカライド構造、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡＣ２が生じる。コアの糖構造を有するタンパク質は、ゴルジ体に輸送され、ここで糖部分は、種々の修飾を受ける。
【０００５】
哺乳動物細胞では、糖鎖の修飾は、付加されるタンパク質部分に依存して３つの異なる経路を介して進行する。３つの異なる経路とは以下である：（１）コアの糖鎖は変化しない；（２）コアの糖鎖は、コアの糖鎖におけるマンノースの６位置に対してＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）におけるＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェート部分（ＧｌｃＮａｃ−１−Ｐ）を付加すること、続いてＧｌｃＮＡｃ部分を取り除いて、糖タンパク質における酸性糖鎖を形成することによって変化される；または（３）コアの糖鎖は、マンノシダーゼＩを用いて３マンノース残基を除去することによってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に最初に変換され；Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２はさらに、ＧｌｃＮａｃを付加すること、およびさらに２つのマンノース残基を除去すること、続いて連続してＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（Ｇａｌ）およびＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸（ＮｅｕＮａｃ）とも呼ばれる）を添加して、種々のハイブリッドまたは複合糖鎖を形成することによって修飾される（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
組み換えタンパク質のオリゴサッカライド含量は、治療用糖タンパク質の安全性および有効性に影響し得る。従って、このような糖タンパク質のオリゴサッカライド含量、特にマンノース含量を制御するための方法は、有益である。
【０００７】
糖タンパク質組成物、特に治療用抗体の高マンノース含量は、治療的な使用の間のこのようなタンパク質の安全性および有効性に有意に影響し得る。特定の理論には拘束されないが、高マンノース糖タンパク質が、例えば、マクロファージおよび樹状細胞上のマンノースレセプターに起因して、その低マンノース対応物よりも速く循環から排出されるということが、証拠によって示唆される。さらに、高マンノース糖タンパク質は、より免疫原性であると期待される。従って、治療用糖タンパク質、例えば、低マンノース含量を有する治療抗体などを生成することが所望され得る。
【０００８】
本発明者らは、組み換え産生されたタンパク質およびペプチドのマンノース含量を調節する（例えば、制御するかまたは減少させる）ための方法を提供することによって当該分野におけるこの必要性を解決する。
【非特許文献１】Ｒ．ＫｏｒｎｆｅｌｄおよびＳ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）５４：６３１〜６６４
【非特許文献２】Ｃｈｉｂａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３：２６２９８〜２６３０４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、組み換え発現された糖タンパク質のマンノース含量、そして詳細には、高マンノース含量に影響する要因の発見に少なくとも一部は基づく。
【００１０】
従って、１局面では、本発明は、細胞培養条件を操作することによって、哺乳動物宿主細胞において生成された組み換え糖タンパク質のマンノース含量（すなわち、オリゴサッカライド側鎖上）を調節し、その結果その細胞によって産生される糖タンパク質が低マンノース含量を有するような方法を提供する。本明細書において用いる場合、「低マンノース含量（ｌｏｗ−ｍａｎｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、糖タンパク質組成物であって、その組成物中の糖タンパク質の約１０％未満、または約８％未満、または約５％未満（例えば、約４％未満）が、４つを超えるマンノース残基を有する（すなわち、Ｍ５以上の種である）糖タンパク質組成物をいう。本明細書において用いる場合、「低マンノース含量（ｌｏｗ−ｍａｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語はまた、糖タンパク質組成物であって、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、またはこれらの任意の前述の範囲の間の任意の値、またはゼロでさえある、糖タンパク質組成物をいう。
【００１１】
本発明の１実施形態では、低マンノース含量は、低浸透圧重量モル濃度（例えば、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、または約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、または約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、例えば、約３８０〜２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ）で細胞培養条件を維持することによって達成される。これによって細胞培養物は、低マンノース含量を有する糖タンパク質、すなわち、糖タンパク質のオリゴサッカライド側鎖上に４以下のマンノース残基を有する糖タンパク質について富化される。従って、特定の実施形態では、本発明は、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を産生するための方法を提供し、この方法は、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度（約２００〜６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、例えば、約２５０〜５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、約２５０〜５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、約２５０〜４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、約２５０〜４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、約２５０〜３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇの範囲）を有する培地中で、糖タンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養する（例えば、培養の増殖期または産生期において）工程を包含する。
【００１２】
前述の浸透圧重量モル濃度の範囲は、限定はしないが、細胞培養培地中の塩、ビタミン、糖、ペプトンおよびアミノ酸のうちの１つ以上の濃度を含む、多数の細胞培養パラメーターを操作することによって達成され得る。従って、特定の実施形態では、本発明は、約７０ｍＭ以下（例えば、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ）の濃度のカリウム；および／または約２００ｍＭ以下（例えば、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ）の濃度のナトリウムを含有する培地中で、糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること、ならびに細胞培養物の浸透圧重量モル濃度を約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下で維持することによって、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【００１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を実質的に含まない培地中で糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること、ならびにこの細胞培養物の浸透圧重量モル濃度を約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下で維持することによって、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【００１４】
さらに、なお別の実施形態では、この培地は、ビオチン、Ｄ−カルシウムパントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、ターミン（ｔｈａｍｉｎｅ）ＨＣｌおよびシアノコバラミンからなる群より選択される１つ以上のビタミンを、約０．００００５ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの濃度で含んでもよい。さらに別の実施形態では、この培地は、グルコースを約１ｍＭ〜約９０ｍＭの濃度で含む。さらなる実施形態では、この培地は、酵母抽出物、酵母加水分解物、ダイズペプトン、ダイズ加水分解物、コムギペプトンおよびコムギ加水分解物からなる群より選択される１つ以上のペプトンを、約０．５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの濃度で含む。
【００１５】
本発明のなおさらなる実施形態では、この細胞培養培地は、浸透圧重量モル濃度を所望のレベルで、例えば、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下で維持するために必要な量で１つ以上の浸透圧維持剤（ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含んでもよい。適切な浸透圧維持剤は、当該分野で公知であって、そしてこれには例えば、ベタイン、グリシン、Ｌ−トレオニン、およびＬ−プロリン、ならびにその誘導体、例えば、グリシンベタインおよびベタインアルデヒドなどが挙げられる。特定の実施形態では、この浸透圧維持剤（例えば、ベタイン）が、約２０ｍＭ以上の濃度で細胞培養培地中に存在する。特定の実施形態では、この浸透圧維持剤（例えば、ベタイン）は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する。
【００１６】
単独で、または本明細書に記載される１つ以上のパラメーターと組み合わせて、制御され得るさらなる細胞培養パラメーターとしては、例えば、細胞が培養される温度および期間が挙げられる。特定の実施形態では、組み換え糖タンパク質を発現する宿主細胞は、約３１℃〜約３８℃の温度で培養される。特定の他の実施形態では、組み換え糖タンパク質を発現する宿主細胞は、約５日〜約１４日の範囲の期間培養される。
【００１７】
本発明に従う組み換え糖タンパク質を発現するための適切な宿主細胞は、当該分野で周知であって、本明細書に記載される任意の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞（例えば、ＮＳＯ細胞）および種々の他の哺乳動物細胞を包含する。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載されるような低マンノース含量を有する広範な種々の糖タンパク質を産生するために使用され得る。特定の実施形態では、本発明は、低マンノース含量を有する、組み換えモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するために用いられる。適切な抗体としては、例えば、マウス、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体、ならびに当該分野で公知の他の抗体型を挙げることができる。別の特定の実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１５に結合し、これには限定はしないが、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００３−０１３８４２１号に開示される抗体が挙げられる。別の特定の実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１５に結合する完全ヒトモノクローナル抗体であって、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびにＩＬ−１５に結合する相同な配列（例えば、それぞれ、配列番号４または配列番号２に対して約８０、８５、９０、９５％以上同一性のアミノ酸配列を有する）を有する。さらなる特定の実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１５に結合するヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号８〜１０に示される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域、ならびに、ＩＬ−１５に結合する相同な配列（例えば、それぞれ、配列番号８〜１０のいずれかに対して約８０、８５、９０、９５％以上の同一性のアミノ酸配列を有する）、および配列番号５〜７に示される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、ならびに、ＩＬ−１５に結合する相同な配列（例えば、それぞれ、配列番号５〜７のいずれかに対して約８０、８５、９０、９５％以上の同一性のアミノ酸配列を有する）を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントとしては、配列番号８〜１０に示される３つ全てのＣＤＲを含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号５〜７に示される３つ全てのＣＤＲを含む重鎖可変領域、またはその保存的なアミノ酸置換が挙げられる。
【００１９】
さらに別の局面では、本発明は、本明細書に記載される方法によって生成される低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を提供する。従って、このような糖タンパク質としては、任意の上述の治療用糖タンパク質、例えば、抗体、ホルモン、酵素、ペプチド、および他の糖タンパク質を挙げることができる。
【００２０】
また、低マンノース含量を有する任意の前述の糖タンパク質を含む組成物も、本発明によって包含される。特定の実施形態では、この組成物は、低マンノース含量を有する単離された糖タンパク質（例えば、ＩＬ−１５に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント）、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。
【００２１】
従って、さらに別の局面では、本発明は、ヒトＩＬ−１５の過剰発現に関連するか、および／またはヒトＩＬ−１５誘発性作用の下方制御もしくは阻害が有益である、障害を処置または予防する方法であって、低マンノース含量を有する単離されたＩＬ−１５抗体を被験体に投与することによって提供される方法を提供する。例示的な障害としては限定はしないが、脈管炎、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患（例えば、クーロン病またはセリアック病）、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、Ｔ細胞リンパ腫、およびＴ細胞白血病が挙げられる。
【００２２】
従って、さらに別の局面では、本発明は、ヒトＩＬ−１５の過剰発現に関連するか、および／またはヒトＩＬ−１５誘発性作用の下方制御もしくは阻害が有益である、障害を処置または予防する方法であって、低マンノース含量を有する単離されたＩＬ−１５抗体を被験体に投与することによって提供される方法を提供する。例示的な障害としては限定はしないが、関節炎、結合組織病、眼科的障害、神経学的障害、胃腸および肝臓の障害、アレルギー障害、血液学的障害、皮膚障害、肺障害、悪性疾患、移植由来障害、内分泌学的障害、血管障害、婦人科的障害および感染性疾患が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
従って、治療用糖タンパク質、例えば、低マンノース含量を有する治療用抗体などを産生することが所望される。
【００２４】
本開示がさらに容易に理解され得るように、特定の用語を最初に規定する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通じて説明される。
【００２５】
Ｉ．定義
炭水化物成分は、本明細書においては、オリゴサッカライドについて通常用いられる命名法を参照して記載される。この命名法を用いる炭水化物化学の概説は、例えば、ＨｕｂｂａｒｄおよびＩｖａｔｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：５５５〜５８３（１９８１）に見出され得る。この命名法としては例えば、以下が挙げられる：Ｍａｎ、これはマンノースを示す；ＧｌｃＮａｃ、これは２−Ｎ−アセチルグルコサミンを示す；Ｇａｌ、これはガラクトースを示す；そしてＧｌｃ，これは、グルコースを示す。シアル酸は、簡易表記に準拠して、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸についてはＮｅｕＮａｃ、そして５−グリコリルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＧｃで記載される。
【００２６】
「浸透圧重量モル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）」という用語は、本明細書において用いる場合、水溶液中の溶解した溶質粒子の浸透圧の指標をいう。溶質粒子としては、イオンおよび非イオン化分子の両方が挙げられる。浸透圧重量モル濃度は、１ｋｇの溶液に溶解された浸透圧的に活性な粒子の濃度（すなわち、オスモル）として表わされる（３８℃での１ｍＯｓｍ／ｋｇのＨ２Ｏは、１９ｍｍＨｇの浸透圧と等価である）。本明細書において用いる場合、「ｍＯｓｍ」という略号は、「ミリオスモル／溶液のｋｇ（溶液１ｋｇあたりのミリオスモル）（ｍｉｌｌｉｏｓｍｏｌｅｓ／ｋｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」を意味する。例示的な実施形態では、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度は、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約２００ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇで維持される。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、ペプチドおよびタンパク質をいい、これは、マンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴサッカライド側鎖を有する抗体を包含する。糖タンパク質は、宿主細胞に対して同種であってもよく、または例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生されるヒト糖タンパク質のように、利用されている宿主細胞に対して異種、すなわち外来であってもよい。このような糖タンパク質は一般に、「組み換え糖タンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）」と呼ばれる。特定の実施形態では、宿主細胞によって発現される糖タンパク質は直接培地中に分泌される。哺乳動物糖タンパク質の例としては、以下の分子およびそれに対する抗体が挙げられる：サイトカイン、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１５、およびそれらのレセプター；ケモカイン、例えば、ＴＮＦ、ＴＥＣＫおよびそれらのレセプター、例えば、ＴＮＦＲ、ＣＣＲ９；成長ホルモン、これには、ヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンを含む；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ビルブラント因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒトの尿または組織型プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；エンケファリナーゼ：ＲＡＮＴＥＳ（活性化正常Ｔ細胞発現および分泌に対して調節（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ））；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、βラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子についてのレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、ウシ由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、これには、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロンα、−β、および−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１５；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子（ｄｅｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体（ｈｏｍｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）；および調節タンパク質。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「細胞培養培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」および「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、以下のカテゴリーのうち１つ以上に由来する少なくとも１つの成分を代表的には提供する、成長中の哺乳動物細胞のために用いられる栄養溶液をいう：１）エネルギー源、通常は、炭水化物の形態、例えば、グルコースなど；２）全ての必須アミノ酸のうちの１つ以上、および通常基本的なセットの２０のアミノ酸に加えてシステイン；３）ビタミンおよび／または低濃度で必要な他の有機化合物；４）遊離脂肪酸；および５）微量元素であって、代表的には極めて低濃度で、通常はマイクロモルの範囲で必要である、無機化合物または天然に存在する元素として規定される微量元素。この栄養溶液は必要に応じて、細胞の成長を最適化するためにさらなる成分を補充されてもよい。
【００２９】
本発明の哺乳動物細胞培養物は、培養されている特定の細胞に適切な培地中で調製される。特定の細胞タイプを培養するために用いられ得る適切な細胞培養培地は、当業者に明らかである。例示的な市販の培地としては、例えば、ＨａｍのＦ１０（ＳＩＧＭＡ）、最少必須培地（ＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ）、ＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ）、およびダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ）が挙げられる。任意のこれらまたは他の適切な培地は、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシンＴＭ）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として規定される）脂質（例えば、リノール酸または他の脂肪酸）、およびそれらの適切なキャリア、およびグルコースまたは等価なエネルギー供給源を補充されてもよいし、そして／または、本明細書に記載されるように改変して低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質の産生を容易にしてもよい。特定の実施形態では、この細胞培養培地は血清を含まない。
【００３０】
特定の実施形態では、細胞培養培地は、このような培地中で培養される宿主細胞によって発現される組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を調節する（例えば、減少する）ように最適化される。特定の実施形態では、この哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であり、そして適切な培地は、このような培地中で培養されるＣＨＯ細胞によって発現される組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を調節する（例えば、減少する）ように、例えば、アミノ酸、塩、糖、ペプトンおよびビタミンのような１つ以上の成分の濃度を改変している、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ−１２基礎処方物（ｂａｓｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）のような基礎培地成分（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含む。
【００３１】
細胞培養の「増殖期（ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）」という用語は、指数関数的細胞増殖の期間（すなわち、対数期）をいい、ここではこの細胞は、一般に急速に分裂している。細胞は、約１日の間、または約２日、または約３日、または約４日、または４日より長く、増殖期に維持される。細胞が増殖期で維持される期間は、例えば、細胞のタイプ、および細胞の増殖速度、および培養条件に基づいて変化する。
【００３２】
「移行期（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）」という用語は、増殖期と産生期との間の期間をいう。一般には、移行期とは、培養条件が増殖期から産生期へのシフトを支持するように制御され得る時間である。制御され得る種々の細胞培養パラメーターとしては限定はしないが、温度、浸透圧重量モル濃度、ビタミン、アミノ酸、糖、ペプトン、アンモニウムおよび塩のうちの１つ以上が挙げられる。
【００３３】
細胞培養の「産生期（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）」という用語は、細胞増殖がプラトーに達している期間をいう。対数的な細胞増殖は代表的には、この期の前または間に終わり、そしてタンパク質産生が優勢になる。この段階で所望のタンパク質産生を達成するために、細胞培養培地を補充することが所望される。
【００３４】
「哺乳動物宿主細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」、「宿主細胞（ｈｏｓｔ−ｃｅｌｌ）」および「哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）」という用語は、適切な栄養および増殖因子を含有する培地中で単層培養物または懸濁培養物のいずれかに入れられた場合、増殖かつ生存し得る、哺乳動物由来の細胞株をいう。代表的には、このような細胞は、培養培地中へ目的の特定の糖タンパク質を大量に発現かつ分泌し得る。適切な哺乳動物宿主細胞の例としては限定はしないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；ｄｐ１２ＣＨＯ細胞（欧州特許第３０７２４７号）；ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎細胞株（懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ｓｅｒｔｏｌｉ ｃｅｌｌｓ）（ＴＭ４）（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｂｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３〜２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２ ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞およびヒト肝細胞腫株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。
【００３５】
「組み換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」（または単に「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」）という用語は、本明細書において用いられる場合、組み換え発現ベクターが導入されている細胞をいうものとする。このような用語は、特定の被験細胞をいうだけでなく、このような細胞の子孫も指すものであることが理解されるべきである。特定の改変は、変異または環境の影響のいずれかに起因して後継世代に存在し得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書において用いられるような「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」という用語の範囲内にやはり包含される。
【００３６】
「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」という用語は一般に、宿主細胞内で生じる転写および翻訳をいう。宿主細胞における遺伝子産物の発現のレベルは、その細胞に存在する対応するｍＲＮＡの量、またはその遺伝子によってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、産物の遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーションによって定量され得る。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．７．３−７．５７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。ある遺伝子によってコードされるタンパク質は、そのタンパク質の生物学的活性についてアッセイすることによって、またはこのような活性と独立したアッセイ、例えば、タンパク質と反応し得る抗体を用いるウエスタンブロット分析またはラジオイムノアッセイなどを使用することによって定量され得る。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．１８．１〜１８．８８ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。ある実施形態では、「発現」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」という用語は、本発明の方法によって産生される低マンノース含量を有する組み換えタンパク質について用いられる。
【００３７】
「低マンノース（ｌｏｗ−ｍａｎｎｎｏｓｅ）」、および「低マンノース含量（ｌｏｗ−ｍａｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、本明細書において用いる場合、糖タンパク質組成物であって、その組成物の約１０％以下が、４マンノース残基より多く、すなわちＭ５またはそれ以上の種を有する糖タンパク質組成物をいう。逆に、高マンノース含量（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」とは、糖タンパク質組成物であって、その組成物の約１０％より多くが、４マンノース残基より多くを有する糖タンパク質を含む糖タンパク質組成物をいう。「低マンノース」、および「低マンノース含量」という用語はまた、糖タンパク質組成物であって、その組成物の約９０％より多く、または約９５％より多くが４以下のマンノース残基を含む糖タンパク質を有する、糖タンパク質組成物を指しても用いられる。
【００３８】
「低マンノース含量を有する糖タンパク質（ａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｖｉｎｇ ｌｏｗ−ｍａｎｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、組み換え糖タンパク質組成物であって、宿主細胞を培養することによって生成される場合、限定はしないが、その組成物中の糖タンパク質の約４％以下、約５％以下、約４％〜約５％以下、約６％以下、約５％〜６％以下、約７％以下、約６％〜７％以下、約８％以下、約７％および８％以下、約９％以下、約８％〜９％以下、約１０％以下、または約９％〜１０％以下が４より大きい（すなわち、Ｍ５またはそれ以上の種）マンノース残基を有する糖タンパク質組成物を指して用いられる。従って、「低マンノース含量を有する糖タンパク質（ａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｖｉｎｇ ｌｏｗ−ｍａｎｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、組み換え糖タンパク質組成物であって、宿主細胞を培養することによって生成される場合、その組成物中の糖タンパク質の約９０％より多く、または約９５％より多くが４以下のマンノース残基（すなわち、０〜４のマンノース残基）を有する糖タンパク質組成物をいう。
【００３９】
高マンノース含量は、例えば、Ｗｕｈｒｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ第８２５巻：１２４〜１３３、２００５）およびＤｅｌｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ第２９１巻：２３５１〜２３５６）に記載されるように、当該分野で周知の１つ以上の方法、ならびに本明細書に記載される方法、例えば、糖タンパク質のＮ−グリカンマッピングのための分析方法を含む方法によって測定され得る。要するに、Ｎ−グリカンは、組み換え糖タンパク質、例えば、組み換えモノクローナル抗体から酵素的に除去され、そして還元末端で蛍光タグ（２−アミノベンズアミド）で標識される。蛍光Ｎ−グリカンは、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分離され、そして蛍光検出を用いて検出される。天然のＮグリカンの分離は一般に、Ｎグリカン構造における複雑性の増大に基づく。荷電されたＮ−グリカンの分離は、シアル酸、硫酸塩の数およびタイプ、または電荷数が由来し得る存在する他の改変に基づく。試験サンプルのこれらのグリカンプロフィールは、適切な標準に対して視覚的に比較される。
【００４０】
高マンノース含量はまた、本明細書に直ちに開示される方法を用いて測定されてもよい：限定はしないが抗体またはそのフラグメント、例えば、真核生物宿主細胞で発現される場合、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメントおよびペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）を含む融合タンパク質を含む、糖タンパク質の高マンノース含量を検出および／または定量するためのハイスループットの方法。抗体は代表的には、Ｆｃ領域上に単一のＮ連結グリカンを有する。グリカンの部分的に包埋された構造のせいで、これはしばしば部分的にしかプロセシングされず、その結果、過剰の高マンノースおよびハイブリッドタイプが生じる。クローン選択、細胞の変異もしくは他の遺伝子操作、または細胞培養操作によって、その細胞によって産生されるグリカンのタイプを変更し得る。多数の条件／細胞が調査され、従って多くのグリカン試験がスクリーニングの間に必要である。伝統的なグリカンマッピングは、遅くかつ、労働集約的であり、何日も要する。本発明の高マンノース／ハイブリッドグリカンアッセイによって、かなり少ないオペレーターの労力で、かなり迅速にグリカンタイプの比が得られる。
【００４１】
詳細には、本発明は、糖タンパク質を含有するサンプルまたは組成物中の糖タンパク質の高マンノース含量を検出および／または定量するための方法を提供し、この方法は、糖タンパク質を含有するサンプルまたは組成物をエンドグリコシダーゼ消化に供する工程と、還元剤（必要であれば）を用いてこの消化された糖タンパク質を還元する工程と、この消化された糖タンパク質を変性電気泳動によって分離し、それによって高マンノース／ハイブリッドタイプのグリカンの比を、脱グリコシル化重鎖の画分（エンドグリコシダーゼ消化後のピーク）から非グリコシル化重鎖の画分（エンドグリコシダーゼ処理なしのピーク画分）を差引きすることによって決定する工程とを包含する。この非グリコシル化重鎖画分またはエンドグリコシダーゼ処理なしのピーク画分は、同じサンプルまたは組成物を、エンドグリコシダーゼがそこに存在しないこと以外は同じ消化条件に供することによって生成される。この工程は、エンドグリコシダーゼ消化工程と同時に行われても、または別々に行われてもよい。
【００４２】
コアグリカン上のＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＮＡｃ２との間で高マンノースおよびハイブリッドのグリカンを選択的に切断する（またはタンパク質上で短いグリカンを生成する）が、複雑なＮ連結グリカンをインタクトなままで残す任意のエンドグリコシダーゼが本発明において用いられ得る。適切な定量のために、エンドグリコシダーゼは、限られた量であってはならない。酵素の濃度、インキュベーション温度および消化時間を含む、エンドグリコシダーゼ消化を行うための特定の状態は、用いられるエンドグリコシダーゼのタイプに依存する。本発明に関連するエンドグリコシダーゼの例としては、限定はしないが、エンドグリコシダーゼＨおよびエンドグリコシダーゼＦ１が挙げられる。本発明の１実施形態では、糖タンパク質を含むサンプルを、エンドグリコシダーゼＨを用いて３７℃で約２時間処理し、βメルカプトエタノールで還元し、そしてＣＥ−ＳＤＳ分析に供する。
【００４３】
グリコシル化糖タンパク質、例えば、グリコシル化抗体から、脱グリコシル化糖タンパク質、例えば、脱グリコシル化抗体を分離するための例示的な方法としては限定はしないが、以下の２つの方法が挙げられる：
１）還元条件下のＣＥ−ＳＤＳ。グリコシル化糖タンパク質、例えば、抗体は、ＳＤＳおよび還元剤で変性され、そしてグリカンを有するその重鎖（ＨＣ）は、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ（ＣＥ−ＳＤＳ）によって切断ＨＣ（脱グリコシル化ＨＣ）から分離される。エレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）はＵＶシグナルで生成される。ピーク下面積は、相対的な量に対して比例する。従って、高マンノース／ハイブリッド型の量は、早期に脱グリコシル化ＨＣ位置で溶出する画分から決定される。ＧｌｃＮＡｃ−ＨＣは、脱グリコシル化ＨＣと同時に泳動するので、未消化のサンプルからの脱グリコシル化ＨＣの％が消化されたサンプルのプレ−ピークから差引きされて、高マンノース値％が得られる。分離には、立体配置次第で、１５〜３０分を要する。
【００４４】
２）マイクロ流体（微小流体）ベースのＣＥ−ＳＤＳ。糖タンパク質は、１）においてと同様に、ただしＣａｌｉｐｅｒによるＬＣ９０のような「ラボ・オン・チップ（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ）」装置を用いて分離される。同じ原理をこのアッセイおよび分離で用いるが、タンパク質を検出するためには蛍光色素を用いる。分離時間は、１アッセイあたり約３０秒に短縮され、そしてマイクロタイタープレートからサンプリングされ得る。
【００４５】
上記されるような本発明の方法は、精製されたタンパク質でおこなわれても、ただし粗細胞培養サンプルでも行われてもよい。組み換え抗体を用いれば、このシグナルは、精製が必要ないほど強力である。
【００４６】
特定の実施形態では、４を超えるマンノース残基を有する糖タンパク質は、５〜９のマンノース残基を有する糖タンパク質（すなわち、種Ｍ５〜Ｍ９）を包含する。特定の理論で拘束されることは望まないが、当業者は、宿主細胞によって発現される糖タンパク質組成物が、種々の数のマンノース残基を有する糖タンパク質を含むということを理解する。例えば、低マンノース糖タンパク質は、４個以下のマンノース残基（例えば、０〜４個のマンノース残基）を有し、そして高マンノース糖タンパク質は、４を超えるマンノース残基を有する（例えば、Ｍ５種またはそれ以上）。
【００４７】
本発明の特定の実施形態では、低マンノース含量を有する糖タンパク質は、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。本発明の別の特定の実施形態では、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質は、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。
【００４８】
「実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｂｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、細胞培養培地の調製物であって、特定の成分を含まないかまたはその量が減少している（未改変の培養培地に対して）調製物をいう。例えば、１実施形態では、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を産生するために用いられる培養培地は、特定のアミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸）を実質的に含まない。ある実施形態では、１つ以上の成分を実質的に含まない培養培地は、未修飾の培養培地に対して１つ以上のこのような成分の約１％未満、または約３％未満、または約５％未満、または約１０％未満を含むように改変される。
【００４９】
「ＩＬ−１５」、「ＩＬ−１５抗原」および「インターロイキン１５」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、そして細胞によって天然に発現される任意の改変体またはアイソフォーム（イソ型）を含む。
【００５０】
本明細書において言及されるような「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、抗体全体、および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原−結合部分（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」）またはその単鎖を包含する。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ジスルフィド結合によって内部連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部位をいう。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてはＶＨと略称される）および重鎖定常領域からなる。その重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてはＶＬと略称される）および軽鎖定常領域からなる。その軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。このＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられる、さらに保存的な領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変の領域に小分割され得る。各々のＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主の組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００５１】
本明細書において用いる場合、抗体の「抗原結合部分（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」および「抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」（または単に「抗体部分（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語は、抗原（例えば、ＩＬ−１５）に選択的に結合する抗体の１つ以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される抗原結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる単価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単独アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６（１９８９））；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｖｉｉ）合成リンカーによって必要に応じて連結され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ、が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって単価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）として公知である；例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６（１９８８）；およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照のこと）を形成する、単一のタンパク質鎖としてそれらを作成し得る合成リンカーによって、組み換え方法を用いて連結されてもよい。このような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」および「抗原結合フラグメント」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、そしてそのフラグメントは、インタクトな抗体と同じ方式で有用性についてスクリーニングされる。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、特定のエピトープについての単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。従って、「ヒトモノクローナル抗体（ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、単一の結合特異性を示し、そしてヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体をいう。１実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成される。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「組み換えヒト抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、作製または単離される全てのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマについてトランスジェニックまたはトランスクロモゾーマル（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、（ｃ）組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体を包含する。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。しかし、特定の実施形態では、このような組み換えヒト抗体は、インビトロの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボの体細胞突然変異誘発）に供されてもよく、従って、組み換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、かつそれに関連するが、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然には存在し得ない配列である。
【００５４】
本明細書において用いる場合、「異種抗体（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、このような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物体に関して規定される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物から構成されない生物体で見出されるものに対応するアミノ酸配列またはコードする核酸配列を有する抗体であって、そして一般には、トランスジェニック非ヒト動物のものとは異なる種に由来する抗体を指す。
【００５５】
「単離された抗体（ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、本明細書において用いる場合、異なる抗原性特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう（例えば、ＩＬ−１５に特異的に結合する単離された抗体とは、ＩＬ−１５以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＩＬ−１５のエピトープに特異的に結合する単離された抗体とは、他の関連のサイトカインに対して、または異なる種由来の他のＩＬ−１５タンパク質に対して交差反応性を有してもよい。しかし、この抗体は好ましくは常にヒトＩＬ−１５に結合する。さらに、単離された抗体は代表的には、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。特定の実施形態では、異なるＩＬ−１５特異性を有する「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」モノクローナル抗体の組み合わせは、十分に規定された組成物中で組み合わされる。
【００５６】
本明細書において用いる場合、「特異的な結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「選択的な結合（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）」および「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄｓ）」とは、予め決められた抗原に対して結合する抗体またはそのフラグメントをいう。例えば、１実施形態では、この抗体は、組み換えヒトＩＬ−１５を分析物として、そしてその抗体をリガンドとして用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ ３０００装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、ほぼ１０−７Ｍ未満、例えば、ほぼ１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満、またはさらに低い親和性（ＫＤ）でさえ結合し、そして予め決められた抗原に対して、その予め決められた抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合についての親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、「抗原に選択的に結合する抗体」という句と交換可能に用いられる。
【００５７】
本明細書において用いる場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数をいうものとする。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。
【００５９】
本明細書において用いる場合、「アイソタイプ・スイッチ（ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」とは、抗体のこのクラスまたはアイソタイプが、あるＩｇクラスから１つの他のＩｇクラスに変化するという現象をいう。
【００６０】
本明細書において用いる場合、「ノン・スイッチ・アイソタイプ（ｎｏｎ−ｓｗｉｔｃｈｅｄ ｉｓｏｔｙｐｅ）」とは、アイソタイプのスイッチが起こっていないときに生成される重鎖のアイソタイプクラスをいう；ノン・スイッチ・アイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は代表的には、機能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子からすぐ下流の最初のＣＨ遺伝子である。アイソタイプのスイッチは、古典的または非古典的なアイソタイプ・スイッチと分類されている。古典的なアイソタイプ・スイッチは、導入遺伝子における少なくとも１つのスイッチ配列に関与する組み換え事象によって起こる。非古典的なアイソタイプ・スイッチは、例えば、ヒトσμとヒトΣμ（δ関連欠失）との間の相同組み換えによって生じ得る。別の非古典的なスイッチ機構、例えば、とりわけ、導入遺伝子間および／または染色体間の組み換えが生じてアイソタイプ・スイッチを達成してもよい。
【００６１】
本明細書において用いる場合、「スイッチ配列（ｓｗｉｔｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、スイッチ組み換えを担うＤＮＡ配列を指す。「スイッチ・ドナー（ｓｗｉｔｃｈ ｄｏｎｏｒ）」配列は代表的には、μのスイッチ領域であって、スイッチ組み換えの間に欠失されるべき構築領域の５’（すなわち、上流）である。「スイッチ・アクセプター（ｓｗｉｔｃｈ ａｃｃｅｐｔｏｒ）」領域は、欠失されるべき構築領域と置換定常領域（例えば、γ、εなど）との間である。組み換えが常に生じる非特異的な部位が存在するので、最終の遺伝子配列は代表的には、構築物からは予測可能ではない。
【００６２】
本明細書において用いる場合、「グルコシル化パターン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒ）」とは、タンパク質に対して、さらに詳細には免疫グロブリンタンパク質に対して共有結合される炭水化物単位のパターンとして規定される。導入遺伝子のＣＨ遺伝子が由来する種に対してよりも非ヒトトランスジェニック動物の種におけるグリコシル化パターンとさらに類似しているとして、当業者が異種抗体のグリコシル化のこのパターンを認識する場合、異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって生成される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質的に同様であるとして特徴付けられ得る。
【００６３】
ある物体に適用する場合、「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」という用語は、本明細書において用いる場合、ある物体が天然に見出され得る事実をいう。例えば、ある供給源から天然に単離され得る生物体（ウイルスを含む）に存在し、かつ実験室でヒトによって故意に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。
【００６４】
「再配列された、再配置された（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）」という用語は本明細書において用いる場合、重鎖または軽鎖の免疫グロブリン遺伝子座の構成（配置）であって、それぞれ、本質的に完全なＶＨまたはＶＬドメインをコードする構成であるＤ−ＪまたはＪセグメントにすぐ隣接してＶセグメントが配置されている構成をいう。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡに比較することによって決定され得；再配列された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えのヘプタマー／ノナマーの相同なエレメントを有する。
【００６５】
「再配列されていない、再配置されていない（ｕｎｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）」または「生殖系列構成（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）」という用語はＶセグメントに関して本明細書において用いる場合、このＶセグメントが、ＤまたはＪセグメントに直ちに隣接するように再組み換えされていない構成（配置）をいう。
【００６６】
「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子をいう。核酸分子は、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６７】
「単離された核酸分子（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、ＩＬ−１５に選択的に結合する抗体または抗体の一部（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸について本明細書において用いる場合、この抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ＩＬ−１５以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含ない核酸分子であって、他の配列がヒトゲノムＤＮＡにおける核酸に天然に隣接してもよい、核酸分子をいう。配列番号１〜４は、ヒト抗ＩＬ−１５抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含むヌクレオチドおよびアミノ酸配列に相当する。詳細には、配列番号１および２は、この抗体のＶＨに相当し、そして配列番号３および４は、この抗体のＶＬに相当する。
【００６８】
特定の実施形態では、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８〜１０に示される１つ以上のそして好ましくは３つ全てのＣＤＲを含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号５〜７に示される１つ以上のそして好ましくは３つ全てのＣＤＲを含む重鎖可変領域を包含する。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明はまた、配列番号１〜１０に示される配列の「保存的配列改変（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」または「保存的配列置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」、すなわち、このヌクレオチド配列によってコードされる抗体の結合特徴にも含有するアミノ酸配列にも、有意に影響することも変更することもないヌクレオチドおよびアミノ酸の配列の改変を包含する。このような保存的配列改変としては、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、当該分野で公知の標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって配列番号１〜１０に導入され得る。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換が挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ヒト抗ＩＬ−１５抗体における予想される非必須アミノ酸残基は好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。
【００７０】
あるいは、別の実施形態では、変異は、例えば、飽和突然変異誘発によって抗ＩＬ−１５抗体コード配列の全てまたは一部にそって無作為に導入されてもよく、そして得られた改変抗ＩＬ−１５抗体は、結合活性についてスクリーニングされ得る。
【００７１】
従って、本明細書に開示される（重鎖および軽鎖可変領域）ヌクレオチド配列によってコードされるか、および／または本明細書に開示される（重鎖および軽鎖可変領域）アミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜４）を含有する抗体としては、保存的に改変されている類似の配列によってコードされるか、またはその類似の配列を含む実質的に同様の抗体が挙げられる。さらに、このような実質的に類似の抗体が、配列番号１〜４のように本明細書に開示される部分的（すなわち、重鎖および軽鎖可変領域の）配列に基づいて生成され得る方法についての考察は下に提供される。
【００７２】
核酸について、「実質的な相同性（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、２つの核酸またはその命名された配列が、必要に応じて整列および比較される場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失によって、そのヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜９５％、そしてさらに好ましくはそのヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９．５％が同一であることを意味する。あるいは、実質的な相同性は、そのセグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で、その鎖の相補体とハイブリダイズする場合に、存在する。
【００７３】
アミノ酸配列については、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度であって、適切な挿入または欠失と最適に配列および比較される場合の同一性の程度を示す。
【００７４】
２つの配列の間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち、相同性％＝一致する位置の数／位置の総数×１００）、これはこの２つの配列の最適配列のために導入するのに必要であるギャップの数および各々のギャップの長さを考慮している。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを用いて達成され得る。
【００７５】
２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０または８０というギャップウェイト、および１、２、３、４、５または６という長さウェイトを用いて決定され得る。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１〜１７（１９８９））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２というギャップ長ペナルティー、および４というギャップペナルティーを用いて決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、そして１６、１４、１２、１０、８、６または４というギャップウェイト、および１、２、３、４、５または６という長さウェイトを用いて決定され得る。
【００７６】
本発明の核酸およびタンパク質配列はさらに、例えば、関連の配列を特定するために、公的なデータベースに対する検索を行うための「クエリー（問い合わせ）配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として用いられてもよい。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行われてもよい。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に対するヌクレオチド配列相同性を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に対するアミノ酸配列相同性を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行われてもよい。比較目的のためのギャップのあるアラインメントを得るために、ギャップ化（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）に記載のように利用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォールトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を用いてもよい。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
【００７７】
核酸は、細胞全体に存在してもよいし、細胞溶解物に存在してもよいし、または部分的に精製されるかもしくは実質的に精製された形態であってもよい。核酸は、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該分野で周知のその他の技術を含む標準的な技術によって、精製されている場合、「単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」かまたは「実質的に純粋である（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｓｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと。
【００７８】
本発明の核酸組成物は、しばしば天然の配列（修飾された制限部位などを除いて）中で、ｃＤＮＡ、ゲノムまたはその混合物のいずれかから標準的な技術に従って、遺伝子配列を得るように変異され得る。コーディング配列については、これらの変異は、必要に応じて、アミノ酸配列に影響し得る。詳細には、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび他の本明細書で記載されるこのような配列に対して実質的に相同であるか、またはそれに由来する、ＤＮＡ配列が考慮される（ここで「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」とは、ある配列が、別の配列と同一であるかまたはそれから改変されることを示す）。
【００７９】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係におかれる場合、「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響する場合、そのコード配列に対して作動可能に連結されている。転写制御配列に関して、作動可能に連結されるとは、連結されているそのＤＮＡ配列が、連続しており、そして２つのタンパク質コード領域に連結する必要がある場合、連続してかつリーディングフレームにあるということを意味する。スイッチ配列については、作動可能に連結されるとは、この配列がスイッチ組み換えを達成し得るということを示す。
【００８０】
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、本明細書において用いる場合、別の核酸を輸送し得る核酸分子であって、その別の核酸に連結されている核酸分子をいうものとする。１つのタイプのベクターは、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」であって、これは、細胞の二本鎖ＤＮＡループであって、そこにさらなるＤＮＡセグメントが連結され得るＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントがそのウイルスゲノムに連結されてもよい。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において、「組み換え発現ベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ」（または単に、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）」と呼ばれる。一般には、組み換えＤＮＡ技術において有用である発現ベクターとはしばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」および「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は交換可能に用いられ得る。なぜなら、プラスミドは、ベクターの最も一般的に用いられる形態であるからである。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、組み換え欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むものとする。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を包含する。例えば、本発明の方法および組成物は、炎症性疾患、例えば、関節炎、例えば、間接リウマチのような炎症性疾患を有する被験体を処置するために用いられてもよい。「非ヒト動物（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ａｎｉｍａｌ）」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを包含する。
【００８２】
本発明の種々の局面は、以下の小区分にさらに詳細に記載される。
【００８３】
ＩＩ．マンノース含量に影響する要因
（ａ）浸透圧重量モル濃度
種々の細胞培養パラメーターが、哺乳動物細胞培養物で発現される組み換え糖タンパク質のマンノース含量に影響し得る。詳細には、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度が高いほど、４マンノース残基より多く（すなわち、Ｍ５の種またはそれ以上）を有する組成物中の糖タンパク質の割合が高くなることが本発明の方法によって発見された。従って、本発明の１実施形態では、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度は、発現される糖タンパク質のマンノース含量を減少または制御するために、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満（例えば、約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ）に維持される。
【００８４】
哺乳動物細胞培養のためには、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度は、約５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約２００ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇで維持される。
【００８５】
浸透圧重量モル濃度を所望の範囲で達成するために、培養培地中の種々の成分の濃度が調節され得る。例えば、培養培地に対してその浸透圧重量モル濃度を増大するために添加され得る溶質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、加水分解された動物のタンパク質、例えば、ペプトン、代謝されないポリマー、ビタミン、イオン、塩、糖、代謝産物、有機酸、脂質などが挙げられる。しかし、培養培地中の他の成分の濃度が、所望の浸透圧重量モル濃度を達成するために改変されてもよいことが理解される。
【００８６】
他の実施形態では、浸透圧重量モル濃度は、培養培地に１つ以上の浸透圧維持剤を添加することによって、上述の範囲に調節され得る。例示的な浸透圧維持剤は、当該分野で周知であって、限定はしないが、ベタイン、グリシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−プロリンおよびその誘導体が挙げられ、これには限定はしないが、グリシン、ベタイン、ベタインアルデヒドが挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養培地は、ベタインを約２０ｍＭ以上、または約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、そして最も好ましくは約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含む。
【００８７】
浸透圧重量モル濃度は、当該分野で周知の任意の手段および本明細書に記載される任意の手段によって測定され得る。例えば、浸透圧計、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡによって、ブランド名ＯＳＭＥＴＴＥとして販売されるような浸透圧計が、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度を測定するために用いられ得る。あるいは、Ｏｓｍｅｔｔｅモデル２００７（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）が用いられてもよい。
【００８８】
本発明の他の実施形態では、浸透圧重量モル濃度は、細胞培養培地中の塩、糖、ペプトン、アミノ酸およびアンモニウムのうちの１つ以上の濃度を改変することによって調節され得る。
【００８９】
さらに他の実施形態では、浸透圧重量モル濃度に影響する上述のパラメーターは、細胞がマンノース含量を調節（例えば、減少）するように培養され得る、温度および期間の操作と、組み合されてもよい。従って、本明細書に記載される種々の細胞培養パラメーターは、組み換え糖タンパク質のマンノース含量を調節するように、単独でまたは組み合わせて調節されてもよいことが理解されるべきである。
【００９０】
（ｉ）カリウムおよびナトリウムの濃度
本発明の準備となる実験では、培養培地中のカリウム（Ｋ＋）濃度の増大が、糖タンパク質の高マンノース含量に寄与することが実証された。従って、１実施形態では、本発明は、約７０ｍＭ以下のＫ＋濃度（例えば、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ）を有する細胞培養培地を使用する。
【００９１】
上記で考察されるとおり、細胞培養培地単独のカリウム濃度が制御されてもよいし、または浸透圧重量モル濃度に影響する本明細書に記載される１つ以上の他の要因と組み合わせて制御されてもよい。特定の実施形態では、この培養培地はさらに、約２００ｍＭ以下（例えば、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ）のナトリウム濃度を含む。
【００９２】
（ｉｉ）アミノ酸
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響するか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された他の要因は、培地中のアミノ酸の濃度およびタイプである。例えば、特定の実施形態では、培地中の２０全てのアミノ酸の濃度を倍にすれば、マンノース含量が増大する。従って、本発明の特定の実施形態では、細胞培養培地は、アミノ酸濃度が低下するように調節される。特定の培地では、アミノ酸濃度は、約半分まで減らされる。
【００９３】
別の特定の実施形態では、細胞培養培地は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を実質的に含まない。
【００９４】
（ｉｉｉ）糖
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響するか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された他の要因は、培地中の糖の濃度およびタイプである。特定の実施形態では、細胞培養培地は、グルコースを、約１ｍＭ〜約９０ｍＭの濃度で含む。
【００９５】
（ｉｖ）アンモニウム
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響し得るか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与し得る別の要因は、約３０ｍＭ以下の濃度のアンモニウムである（例えば、約０ｍＭ〜約１０ｍＭ）。１実施形態では、アンモニウム濃度は、約１０ｍＭ以下である。
【００９６】
（ｖ）ペプトン
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響するか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された他の要因は、培地中で用いられるペプトンの濃度およびタイプである。ペプトンは、加水分解された動物のタンパク質から生成される培地補充物である。ペプトンの供給源は、当該分野で周知であり、そして例えば、動物の副産物、ゼラチンおよび植物性物質を包含する。ペプトンの例としては、限定はしないが、酵母抽出物、酵母加水分解産物、ダイズペプトン、ダイズ加水分解産物、コムギペプトン、およびコムギ加水分解産物が、約０．５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの濃度で挙げられる。
【００９７】
（ｖｉ）ビタミン
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響するか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された他の要因は、培地中で用いられるビタミンの濃度およびタイプである。特定の実施形態では、細胞培養培地は、ビオチン、Ｄ−カルシウム、パントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、シアノコバラミンからなる群より選択される１つ以上のビタミンを、約０．００００５ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの濃度で含む。
【００９８】
（ｂ）温度
組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された別の要因は、細胞培養物が維持される温度である。従って、本発明の別の実施形態では、宿主細胞が培養される温度はまた、組み換え発現される糖タンパク質のマンノース含量を調節する（例えば、減少する）ために、単独でまたは前述の因子と組み合わせて調節される（例えば、細胞培養のタイミングおよび浸透圧重量モル濃度に影響する因子の調節）。特定の実施形態では、宿主細胞は、約３１℃で、または約３２℃で、または約３３℃で、または約３４℃で、または約３５℃で、または約３６℃で、または約３７℃で、または約３８℃で培養される。
【００９９】
ＩＩＩ．細胞培養手順
本発明の方法に従って、宿主細胞は、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質の発現を可能にする培地中で培養される。適切な細胞培養手順および条件は、当該分野で周知である。宿主細胞（例えば、ＣＨＯおよびＮＳＯ細胞）は、広範な種々の形式および培養容器中で培養されてもよい。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質の大規模生産または小規模生産のために設計された方式で培養されてもよい。さらに、宿主細胞は培養フラスコまたはディッシュの底に接着して培養されてもよく、またはそれらは、攪拌フラスコ、バイオリアクターまたはローラーボトル培養において懸濁液中であってもよい。特定の実施形態では、商業的な量で組み換え糖タンパク質を生成するために、宿主細胞をバイオリアクター中で、そして好ましくは、約２リットル以上、または約５リットル以上、または約１０リットル以上、または約５０リットル以上、または約１００リットル以上、または約５００リットル以上、または約１０００リットル以上、または約１５００リットル以上、または約２０００リットル以上の容量を有するバイオリアクター中で増殖してもよい。
【０１００】
特定の実施形態では、宿主細胞は、液体培地中で培養（例えば、維持および／または増殖）されてもよく、そして好ましくは、静置培養、試験管培養、振盪培養（例えば、ロータリー振盪培養、振盪フラスコ培養など）、曝気攪拌（エアレーション・スピンナー）（ａｅｒａｔｉｏｎ ｓｐｉｎｎｅｒ）培養または発酵などの従来の培養方法によって、連続して、または間欠的に培養される。特定の実施形態では、宿主細胞は、振盪フラスコで培養される。さらに他の実施形態では、宿主細胞は、発酵槽中で（例えば、発酵・プロセスで）培養される。発酵・プロセスとしては、限定はしないが、バッチ、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）および連続方法が挙げられる。「バッチ・プロセス（ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）」および「バッチ・発酵（ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、閉鎖系であって、培地、栄養物、補充添加物などの組成が発酵の開始でセットされて、発酵の間の変更には供されない閉鎖系をいう；ただし、過度の培地酸性化および／または微生物の死亡を妨げるためにｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御する試みはなされてもよい。「流加培養プロセス（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）」および「流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）」発酵という用語は、１つ以上の基質または補充物が添加される（例えば、段階的にまたは連続して）か、または細胞培養条件が発酵の進行につれて変化されることを除く、バッチ発酵をいう。「連続的プロセス（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｃｅｓｓ）」および「連続発酵（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、規定の発酵培地が発酵槽に連続して添加され、そして等量の用いられるかまたは「馴化された（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）」培地が、所望の産物（例えば、組み換え糖タンパク質）の回収のために連続して取り出される系をいう。種々のこのようなプロセスが開発されており、そして当該分野で周知である。
【０１０１】
特定の実施形態では、ＩＬ−１５に結合する組み換えヒトモノクローナル抗体を発現する宿主細胞は、ローラーボトル、２リットルのスピナー・フラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ−ｆｌａｓｋ）、または別の適切な培養系において増殖される。
【０１０２】
ＩＶ．糖タンパク質の回収
ポリペプチド産生期の後、本発明の組み換え糖タンパク質は、当該分野で十分確立されている技術を用いて培養培地から回収され得る。目的の糖タンパク質は好ましくは、別個のポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それはまた宿主細胞溶解物から回収されてもよい。
【０１０３】
特定の実施形態では、培養培地または溶解液を、粒子状の細胞細片を除去するために遠心分離する。その後、糖タンパク質を混入した可溶性タンパク質およびポリペプチドから、適切な精製手順を用いて精製する。例示的な精製手順としては、限定はしないが、免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカゲルでのまたは陽イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を用いるゲル濾過；ならびにＩｇＧのような混入物を除去するためのプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムが挙げられる。プロテアーゼインヒビター、例えば、フェニル・メチル・スルホニル・フルオライド（ＰＭＳＦ）がまた、精製の間タンパク質分解性の分解を阻害するために有用であり得る。当業者は、目的の組み換え糖タンパク質に適切な精製方法は、組み換え細胞の培養における発現の際に糖タンパク質の特徴における変化を相殺するために改変を要するかもしれないということを理解する。
【０１０４】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法を用いて発現される組み換え糖タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。一般には、この抗体は、ＥＬＩＳＡによって最初に特徴付けられる。例えば、マイクロタイタープレートは、例えば、ＰＢＳ中におけるＩＬ−１５のような精製抗原でコーティングされ、次いで、ＰＢＳ中に希釈されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような関係のないタンパク質でブロックされ得る。培養された細胞由来の抽出物の希釈物を各々のウェルに添加して、１〜２時間３７℃でインキュベートする。そのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで、アルカリホスファターゼに結合体化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、そのプレートをＡＢＴＳ基質で発色させ、４０５のＯＤで分析する。
【０１０５】
本発明の方法によって生成される抗体が固有のエンベロープに結合するか否かを決定するために、各々の抗体を市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてビオチン化してもよい。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識プローブで検出され得る。精製された抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、当該分野で認識される技術を用いて行ってもよい。例えば、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇを用いてマイクロタイタープレートのウェルを４℃で一晩コーティングしてもよい。５％のＢＳＡを用いるブロッキング後、そのプレートを１０μｇ／ｍｌの抗体または精製されたアイソタイプコントロールと、周囲温度で２時間、反応させる。次いで、そのウェルをヒトＩｇＧ１または他のヒトアイソタイプ特異的な結合体化プローブと反応させてもよい。プレートを発色させて、上記のように分析する。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明の方法を用いて生成される組み換え糖タンパク質は、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。ＩＬ−１５を発現する生きた細胞に対するＩＬ−１５モノクローナル抗体の結合を試験するために、フローサイトメトリーを用いてもよい。要するに、膜結合したＩＬ−１５を発現する細胞株および／またはヒトＰＢＭＣ（標準的な増殖条件下で増殖）を、０．１％のＢＳＡおよび０．０１％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ中で、種々の濃度のモノクローナル抗体とともに４℃で１時間混合する。洗浄後、その細胞を、一次抗体染色と同じ条件下でフルオレセイン標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。そのサンプルを、単一細胞上のゲートに対する光および側方散乱特性を用いてＦＡＣＳｃａｎ装置によって分析し、そして標識抗体の結合を決定する。蛍光顕微鏡を用いる代替的アッセイを、フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、またはその代わりに）用いてもよい。細胞は、正確に上記のように染色され、そして蛍光顕微鏡によって試験され得る。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能になるが、ただし抗原の密度に依存して感度は低下しているかもしれない。
【０１０７】
抗ＩＬ−１５ヒトＩｇＧは、ウエスタンブロッティングによってＩＬ−１５抗原との反応性についてさらに試験され得る。要するに、ＩＬ−１５を発現する宿主細胞由来の細胞抽出物を、調製して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供してもよい。電気泳動後、その分離された抗原は、ニトロセルロース膜に転写されて、２０％のマウス血清でブロックされ、そして試験されるべきモノクローナル抗体でプローブされる。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出され、そしてＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて発色され得る。
【０１０８】
Ｖ．薬学的組成物
別の局面では、本発明は、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質の１つまたは組み合わせを含有する、組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、この薬学的組成物は、低マンノース含量を有する少なくとも１つの治療用タンパク質、例えば、低マンノース含量を有する治療用抗体、またはその抗原結合フラグメント（例えば、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント）を含む。別の特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと一緒に処方された、低マンノース含量を有する１つ以上の組み換え糖タンパク質を含む。
【０１０９】
本発明の薬学的組成物はまた、併用療法で、すなわち、他の因子と組み合わせて投与されてもよい。例えば、併用療法としては、本発明の組成物と、少なくとも１つ以上のさらなる治療剤、例えば、抗炎症剤、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、免疫抑制剤、化学療法剤、および乾癬剤との組み合わせをあげることができる。本発明の薬学的組成物はまた、放射線療法と組み合わせて投与され得る。他の抗体、例えば、ＣＤ４特異的抗体およびＩＬ−２特異的抗体との同時投与も、本発明によって包含される。ＣＤ４特異的抗体またはＩＬ−２特異的抗体とのこのような組み合わせは、自己免疫疾患および移植片拒絶を処置するために特に有用とみなされる。
【０１１０】
本明細書において用いる場合、「薬学的に受容可能なキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」としては、生理学的に適合する、任意のかつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくはこのキャリアは、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口的投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適切である。投与の経路に依存して、組み換え糖タンパク質、例えば、抗体、二価特異的および多価特異的分子は、酸の作用およびこの化合物を不活性化し得る他の天然の条件からこの化合物を防御するために物質中でコーティングされてもよい。
【０１１１】
「薬学的に受容可能な塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔ）」とは、親の化合物の所望の生物学的活性を保持し、そして所望されない毒性学的影響を与えない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９（１９７７）を参照のこと）。このような塩の例としては、酸付加塩、および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など由来の酸付加塩、ならびに非毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪酸、および芳香族スルホン酸など由来の酸付加塩が挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど由来の塩基付加塩、ならびに非毒性有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなど由来の塩基付加塩が挙げられる。
【０１１２】
本発明の組成物は、当該分野で公知の種々の方法によって投与され得る。当業者によって理解されるとおり、投与の経路および／または方式は、所望の結果に依存して変化する。活性化合物は、インプラント（移植物）、経皮パッチおよび微小カプセル化送達システムを含む徐放性処方物のように、急速な放出に対して化合物を保護するキャリアとともに調製され得る。生体分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン・ビニル・アセテート、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられてもよい。このような処方の調製のための多くの方法は、特許されるかまたは当業者に一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【０１１３】
特定の投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、この化合物を、その不活性化を妨げるための物質でコーティングするか、またはその物質とこの化合物を同時投与することが必要であり得る。例えば、この化合物は、適切なキャリア、例えば、リポソームまたは希釈剤中で被験体に投与され得る。薬学的に受容可能な希釈剤としては、生理食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）ＣＧＦエマルジョン、および従来のリポソームが挙げられる（Ｓｔｒｅｊａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７（１９８４））。
【０１１４】
薬学的に受容可能なキャリアとしては、滅菌水溶液または分散、および滅菌注射用溶液または分散の即時調整のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野で公知である。任意の従来の培地または因子が活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の薬学的組成物においてその使用が考慮される。補充される活性な化合物もその組成物に組み込まれてもよい。
【０１１５】
治療組成物は代表的には、製造および貯蔵の条件のもとで無菌かつ安定でなければならない。その組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬物濃度に適切な他の規則的な構造として処方され得る。そのキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、およびサーファクタントの使用によって維持され得る。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の吸収の遅延は、吸収を遅らせる因子、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１１６】
滅菌注射溶液は、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要な量で活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、続いて滅菌マイクロフィルトレーションによって、調製され得る。一般には、分散は、塩基性分散媒体および上記で列挙されたものに由来する必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルにこの活性化合物を組み込むことによって、調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））であって、これによって活性成分に加えて、以前に滅菌濾過されたその溶液由来のさらなる所望の成分の粉末、を生じる。
【０１１７】
投薬レジメンは、最適の所望の応答（例えば、治療応答）を得るように調節される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよいし、数回分割用量が経時的に投与されてもよいし、または用量は治療状況の危急によって指示される場合は比例して減少されるかもしくは増大されてもよい。例えば、本発明のヒト抗体は、毎週１〜２回皮下注射されてもよいし、または毎月１〜２回皮下注射されてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で処方することが特に有利である。本明細書において用いられる単位剤形とは、処置されるべき被験体の単位投薬量に適切な物理的に別個の単位をいい；各々の単位は、必要な薬学的なキャリアと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された、予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形についての仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感度の処置のためにこのような活性化合物を配合するという当該分野に固有の制限によって決められ、かつそれに直接依存する。
【０１１８】
薬学的に受容可能な抗酸化剤の例としては以下が挙げられる：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、αトコフェノールなど；ならびに（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
【０１１９】
治療組成物のためには、本発明の処方物は、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口の投与に適切な処方物を含む。この処方物は、単位剤形で適宜与えられてもよいし、そして薬学の当該分野で公知の任意の方法によって調製されてもよい。単位剤形を生成するためにキャリア物質と組合され得る活性成分の量は、処置されている被験体、および特定の投与方式に依存して変化する。単回剤形を生成するためにキャリア物質と組合され得る活性成分の量は一般には、治療効果を生じる組成物の量である。一般には、１００パーセントのうち、この量は、活性成分の約０．００１％〜約９０％、好ましくは、約０．００５％〜約７０％、最も好ましくは約０．０１％〜約３０％におよぶ。
【０１２０】
膣投与に適切である本発明の処方物としてはまた、ペッサリー（膣坐薬）、タンポン、クリーム、ジェル（ゲル）、ペースト、泡状物または噴霧の処方物であって、適切であることが当該分野で公知であるようなキャリアを含む処方物が挙げられる。本発明の組成物の局所投与または経皮投与のための剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル（ジェル）、溶液、パッチおよび吸入薬が挙げられる。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に受容可能なキャリアと、そして必要であり得る任意の防腐剤、緩衝液または噴霧剤と混合されてもよい。
【０１２１】
本明細書において用いる場合、「非経口投与（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「非経口的に投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）」という句は、通常は、注射による、腸内および局所投与以外の投与の方式を意味し、そしてこれには限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内に、嚢内に（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内に、心臓内に、皮内に、腹腔内に、経器官的に、皮下に、表皮下に、関節内に、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物に使用され得る適切な水性および非水性のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、など）、およびその適切な混合物、植物油、例えば、オリーブオイル、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そしてサーファクタントの使用によって、維持され得る。
【０１２３】
これらの組成物はまた、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤を含んでもよい。微生物の存在の防止は、前出の滅菌手順によって、そして種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって、確実にされ得る。組成物中に、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことも所望され得る。さらに、注射用の薬学的形態の長期にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延する因子の包含によって達成され得る。
【０１２４】
本発明の化合物が、ヒトおよび動物に対する薬剤として投与される場合、それらは、単独で与えられてもよいし、または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、例えば、０．００１〜９０％（さらに好ましくは、０．００５〜７０％、例えば、０．０１〜３０％）の活性成分を含む薬学的組成物として与えられてもよい。
【０１２５】
選択される投与の経路にかかわらず、本発明の化合物は、適切な水和型で用いられてもよいし、そして／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に受容可能な剤形に処方される。
【０１２６】
本発明の薬学的組成物における活性成分の正確な投薬量レベルは、患者に対する毒性なしに、特定の患者、組成物および投与方式について所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために変更されてもよい。選択された投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物および／または物質、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態および以前の病歴、などの医学分野で周知の要因を含む種々の薬物動態学的な要因に依存する。当該分野で通常の技術を有する医師または獣医師は必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定および規定し得る。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要であるより低レベルで、薬学的組成物中で使用される本発明の組成物の用量を開始して、所望の効果が達成されるまでその投薬量を徐々に増大する。一般には、本発明の組成物の適切な１日量は、治療効果を得るのに有効な最低用量である化合物の量である。このような有効用量は一般に、上記の要因に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であることが好ましく、好ましくは標的の部位に近位に投与される。所望の場合、治療用組成物の有効１日量は、必要に応じて単位剤形で、１日にわたって適切な間隔で、２、３、４、５、６またはそれ以上の別々に投与される小用量として投与されてもよい。本発明の化合物は単独で投与されることが可能であるが、その化合物は薬学的処方物（組成物）として投与されることが好ましい。
【０１２７】
治療組成物は、当該分野で公知の医学的デバイスを用いて投与され得る。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、ニードルレス皮下注射デバイス（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイスを用いて投与されてもよい。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては以下が挙げられる：制御された速度で医薬を分配するための注射用マイクロ注入ポンプを開示する、米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通じて医薬を投与するための治療用デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する、米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための可変流量移植可能注入装置（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｌｏｗ ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチ・チャンバ区画（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｍｂｅｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を有する浸透圧薬物送達システムを開示する、米国特許第４，４３９，１９６号；ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号。多くのこのような移植物、送達系およびモジュールが当業者に公知である。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明の治療用糖タンパク質は、インビボにおいて適切な分布を確実にするように処方され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢ（所望の場合）を横切ることを確実にするために、それらは例えば、リポソーム中に処方され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；同第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、選択的に特定の細胞または器官に輸送され、従って標的薬物送達を増強する１つ以上の部分を含んでもよい（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５（１９８９）を参照のこと。例示的な標的部分としては、葉酸塩またはビオチン（例えば、Ｌｏｗの米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８（１９８８））；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０（１９９５）；Ｍ．Ｏｗａｉｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０（１９９５））；サーファクタントタンパク質Ａレセプター（Ｂｒｉｓｃｏｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４（１９９５））、本発明の処方物を含み得る種々の種、および本発明の分子の成分；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０（１９９４））が挙げられる；また、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３（１９９４）；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３（１９９４）も参照のこと。本発明の１実施形態では、本発明の治療化合物は、リポソーム中に処方され；より好ましい実施形態では、このリポソームは、標的部分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソーム中の治療用化合物は、腫瘍または感染に対して近位である部位へのボーラス注射によって送達される。この組成物は、容易に注射可能になる程度まで液体でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入の作用に対して保存されなければならない。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明の組み換え糖タンパク質は、胎盤を横切った輸送を妨げるかまたは減少するように処方され得る。これは、当該分野で公知の方法によって、例えば、抗体のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）によって、またはＦ（ａｂ）２’フラグメントの使用によって、おこなわれ得る。さらなる参照は、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ Ｃ，Ｚｈｏｕ Ｚ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｂ，Ｋｅｅｎａｎ Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１５２：１７７〜１９０に対して；そしてＬａｎｄｏｒ Ｍ．（１９９５）Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｆｅｔａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｅｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７４：２７９〜２８３に対して、なされ得る。これは、糖タンパク質が反復自然流産を処置または予防するために用いられる抗体である場合は特に関係する。
【０１３０】
関節リウマチの「治療有効用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓａｇｅ）」は好ましくは、患者においてＡＣＲ２０という改善の予備的定義（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）を、さらに好ましくはＡＣＲ５０というＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、そしてさらにより好ましくは、ＡＣＲ７０というＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔを生じる。
【０１３１】
ＡＣＲ２０という改善の予備的定義は以下のように規定される：以下における２０％以上の改善：圧痛のある関節カウント（Ｔｅｎｄｅｒ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｕｎｔ）（ＴＣＪ）および腫れた関節カウント（Ｓｗｏｌｌｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｕｎｔ）（ＳＷＪ）、そして以下の５つの評価のうちの３つにおける２０％以上の改善：患者疼痛評価（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｐａｉｎ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＶＡＳ）、患者の全体的な評価（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｇｌｏｂａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＶＡＳ）、医師の全体的な評価（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＶＡＳ）、患者の自己評価した障害（Ｐａｔｅｎｔ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｓｓｅｄ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）（ＨＡＱ）、急性期反応物（Ａｃｕｔｅ Ｐｈａｓｅ Ｒｅａｃｔａｎｔ）（ＣＲＰまたはＥＳＲ）。
【０１３２】
ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０は、同じ方法で、それぞれ５０％以上および７０％以上の改善があると規定される。さらに詳細については、Ｆｅｌｓｏｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３８：７２７〜７３５（１９９５）を参照のこと。
【０１３３】
ある化合物がガンを阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予想する動物モデル系で評価され得る。あるいは、ある組成物のこの特性は、この化合物が阻害する能力を検査することによって評価され得、このようなインビトロにおける阻害は、当業者に公知のアッセイによる。治療化合物の治療上有効な量とは、腫瘍のサイズを減少するか、そうでなければ被験体における症状を改善し得る。当業者は、被験体のサイズ、被験体の症状の重篤度、および選択される特定の組成物または投与経路のような要因に基づいてこのような量を決定し得る。
【０１３４】
抗体が乾癬を処置または予防する能力はまた、当該分野で周知の方法に従って評価され得る。
【０１３５】
この組成物は、無菌であって、かつこの組成物がシリンジで送達可能である程度まで液体でなければならない。水に加えて、キャリアは、等張性緩衝化生理食塩水溶液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そしてサーファクタントの使用によって維持され得る。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる因子、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含むことによって達成され得る。
【０１３６】
上記のように、活性化合物が適切に保護される場合、その化合物は、例えば、不活性希釈液または同化可能な食用キャリアとともに経口投与されてもよい。
【０１３７】
本発明の他の実施形態は、以下の実施例に記載されるが、この実施例はさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体にわたって引用される、配列表、図面および全ての引用文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照によって明らかに本明細書に援用される。
【実施例】
【０１３８】
下に考察される全ての実施例では、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するＩＬ−１５に結合する、完全ヒトモノクローナル抗体は、例示的な組み換え糖タンパク質（「例示的な組み換え糖タンパク質」として実施例に言及される）として用いられた。しかし、任意の組み換え糖タンパク質のマンノース含量が、本明細書に考察されるように調整され得るということは当業者に明らかである。
【０１３９】
実施例１：浸透圧重量モル濃度は組み換え糖タンパク質のマンノース含量に影響する
糖タンパク質のマンノース含量に対する浸透圧重量モル濃度の影響を検討するために、例示的な組み換え糖タンパク質のマンノース含量を、シェーカーフラスコおよびバイオリアクター培養の両方において浸透圧重量モル濃度を変化させて分析した。図１に実証されるように、高マンノース含量は、培地の浸透圧重量モル濃度が約５００〜約５８０ｍＯｓｍｏ／Ｋｇと増大するにつれて、約１４％〜約２４％に増大した。
【０１４０】
さらなる実験では、２０ｍＭの浸透圧維持剤、ベタインを細胞培養物に添加して、浸透圧重量モル濃度と高マンノース含量との間の関係に関するさらなる証拠を提供する。以下の表は、このような実験の結果をまとめている。
【０１４１】
【表１】
高マンノース含量と浸透圧重量モル濃度との間の関係についてのさらなる証拠を図２に示す。細胞培養培地に対する約２０ｍＭのベタインの添加は、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を劇的に低下した。例えば、浸透圧重量モル濃度が約３００ｍＯｓｍ／Ｋｇであった場合、高マンノース含量は、約０ｍＭのベタインでの約９．５％から２０ｍＭのベタインの添加の際の約４．５％まで低下した（すなわち、高マンノース含量において約５％の低下）。同様に、浸透圧重量モル濃度が約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇであった場合、高マンノース含量は、約０ｍＭのベタインでの約１６．５％から２０ｍＭのベタインの添加の際の約７．５％まで低下した（すなわち、高マンノース含量において約９％の低下）。さらに、約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧重量モル濃度では、高マンノース含量は、約０ｍＭのベタインでの約２５％から約２０ｍＭのベタインの添加の際の約９．５％まで低下した（すなわち、高マンノース含量において約１５．５％の低下）。
【０１４２】
実施例２：培養物中のＫ＋の濃度は、組み換え糖タンパク質のマンノース含量を調節するために制御され得る
さらなる実験では、細胞培養培地における１つ以上の塩の濃度を制御して、例示的な組み換え糖タンパク質のマンノース含量（例えば、高マンノース含量）を調節（例えば、減少）した。例示的な実験では、細胞培養培地におけるＫ＋の濃度を制御して、マンノース含量、そして詳細には例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に影響することが示された。詳細には、糖タンパク質を１５ｍＭまたは４５ｍＭのいずれかで発現する宿主細胞を培養することによって生成される、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量（すなわち、Ｍ５種またはそれ以上）を検査した。
【０１４３】
図３および４に示されるとおり、高マンノース含量のパーセンテージは、浸透圧重量モル濃度において混入物の増大につれて約３％〜約１３％に増大した。約３７０〜約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇの間の浸透圧重量モル濃度によって、糖タンパク質組成物の１０％を超える高マンノース含量の増大がもたらされた。
【０１４４】
さらなる実験では、図５に示されるように、細胞培養培地におけるＫ＋濃度についての最適濃度は、組み換え糖タンパク質の高マンノース含量の割合を１０％未満に維持するために約０ｍＭ〜約７０ｍＭであるということが実証された。
【０１４５】
実施例３：細胞培養培地におけるＮａ＋の濃度は、組み換え糖タンパク質のマンノース含量を調節するために制御され得る
さらなる実験では、Ｎａ＋の濃度は、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を調節する（例えば、減少する）ように制御した。例示的な実験では、細胞培養培地におけるＮａ＋濃度の増大は、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量の割合の増大に寄与することが示された。
【０１４６】
図６は、高マンノース含量の割合を１０％未満に維持するためには、Ｎａ＋の最適濃度範囲が約０ｍＭ〜約２００ｍＭであることを示す。
【０１４７】
実施例４：アミノ酸は、組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に寄与する
別の実験では、細胞培養培地に存在するアミノ酸の影響を、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に対して検査した。図７に示されるように、組み換え糖タンパク質の高マンノース含量の割合は、供給培地における２０アミノ酸の濃度を倍にすることによって約４％から約１０％に増大する。この実験によって、アミノ酸の富化された培地は、このような培地で培養される宿主細胞によって発現される高マンノース糖タンパク質の含量の増大を生じることが実証された。
【０１４８】
実施例５：供給培地組成物の全体的な組成は、組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に寄与し得る
この実験では、種々のタイプの供給培地の影響を、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に対して検査した。詳細には、アミノ酸、Ｌアラニン、ＬアルギニンＨＣＬ、Ｌアスパラギン酸およびＬグルタミン酸を実質的に含まず、かつ未改変の培地に対して低濃度のＣａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌおよびピルビン酸ナトリウムを有する改変供給培地の効果を、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に対して検討した。図８に示されるとおり、高マンノース含量は、改変された供給培地が用いられる場合、約４％であって、そしてこの割合は、この未改変の供給培地が用いられる場合、約１３％まで増大した。
【０１４９】
実施例６：高マンノース含量に対する温度の影響
高マンノース含量に対する４つの異なる温度の影響を、２つの異なる供給培地を用いて検査した。表ＩＩの下のデータは、高マンノース含量の割合が温度の増大につれて増大したということを示す。
【０１５０】
【表２】
本明細書は、参照によって本明細書に援用される、本明細書内に援用される引用文献の教示を参照してほとんど完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本開示における実施形態の例示を提供しており、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本開示に包含されることを容易に認識する。引用される全ての刊行物および特許、ならびに本開示におけるアクセッション番号またはデータベース引用番号によって特定される配列は、その全体が参照によって援用される。参照によって援用される材料が本明細書と矛盾するかまたは一致しない程度までは、本明細書は、任意のこのような材料に優先する。本明細書における任意の引用文献の引用は、このような引用文献が本開示に対する先行技術であると承認するものではない。
【０１５１】
他に示さない限り、特許請求の範囲を含む本明細書に用いられる成分、細胞培養物、処理条件などの量を表す全ての数は、全ての場合に「約（ａｂｏｕｔ）」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。従って、逆に示さない限り、数的なパラメーターは、近似であって、本発明によって得られると考えられる所望の特性に依存して変化してもよい。他に示さない限り、一連の要素に先行する「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」という用語は、その一連におけるあらゆる要素を指すと理解されるべきである。当業者は、単なる慣用的な実験を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確定することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、シェーカーのコントロール（５０ｍＬ）およびバイオリアクター（１５０Ｌおよび５００Ｌ）において、抗体を発現する細胞を培養することによって産生されたＩＬ−１５に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の浸透圧重量モル濃度と高マンノース含量との間の相関を示すグラフである。
【図２】図２は、浸透圧維持剤、ベタインの添加と、ＩＬ−１５に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の高マンノース含量との間の相関を示すグラフである。
【図３】図３は、培養培地の浸透圧重量モル濃度と、Ｋ＋濃度との間の相関を示すグラフである。
【図４】図４は、１５ｍＭまたは４５ｍＭのいずれかのＫＣｌを含有する培地中で細胞を培養することによる、ＩＬ−１５に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の高マンノース含量と浸透圧重量モル濃度との間の相関を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｋ＋濃度と高マンノース含量との間の相関のグラフ表示であって、これは、高マンノース含量を１０％より低く維持するためのＫ＋の最適濃度が約０〜約７０ｍＭであるということを示している。
【図６】図６は、Ｎａ＋濃度と高マンノース含量との間の相関を示すグラフであって、これは、高マンノース含量を１０％より低く維持するためのＮａ＋の最適濃度が約０ｍＭ〜約２００ｍＭであるということを示している。
【図７】図７は、アミノ酸濃度と高マンノース含量との間の相関を示すグラフである。
【図８】図８は、用いられる供給培地のタイプと高マンノース含量との間の相関を示すグラフである。
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
高等な真核生物は、種々の翻訳後修飾を行い、これには、メチル化、硫酸化、リン酸化、脂質付加およびグリコシル化が挙げられる。このような修飾は、タンパク質の機能にとって決定に重要なものであり得る。分泌されるタンパク質、膜タンパク質、および小胞または特定の細胞内オルガネラに標的されるタンパク質は、グリコシル化される可能性が高い。
【０００２】
Ｎ連結グリコシル化は、タンパク質中の認識配列（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に見出されるアスパラギン残基に対するオリゴサッカライドの付加を含むグリコシル化の形態である。Ｎ連結糖タンパク質は、標準的な分枝された構造を含み、この構造は、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびノイラミン酸から構成される。タンパク質のＮグリコシル化は代表的には、小胞体（ＥＲ）から始まり、ここでドリコール（脂質担体の中間体）上にアセンブルしたＮ連結したオリゴサッカライド（例えば、Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）が新生タンパク質の適切なアスパラギン（Ａｓｎ）に移される。これは、全ての真核生物のＮ連結糖タンパク質に共通の事象である。２つの主要なタイプのＮ連結サッカライドである：高マンノースオリゴサッカライドおよび複合オリゴサッカライドが存在する。
【０００３】
高マンノースオリゴサッカライドは代表的には、多くのマンノース残基（例えば、４より大きい）を有する２つのＮアセチルグルコサミンを含む。複合オリゴサッカライドは、それらがほとんど、もとの２つのＮアセチルグルコサミンよりも多くを含む、多数の他のタイプのサッカライド（糖類）を含み得るために、そのように名付けられる。タンパク質は、そのタンパク質の種々の部分上の両方のタイプのオリゴサッカライドによってグリコシル化され得る。オリゴサッカライドが高マンノースであるか、または複合体であるかは、ゴルジ体における糖類（サッカライド）修飾タンパク質に対するその接近性に依存すると考えられる。サッカライドが比較的接近し難い場合、それはもとの高マンノース型であり続ける可能性が最も高い。それが接近可能であるならば、多くのマンノース残基は、切断され、そしてサッカライドはさらに、上記で考察されたような他のタイプの基の付加によって修飾される。
【０００４】
オリゴサッカライド鎖が、タンパク質に付加された後、３つのグルコースおよび１つのマンノース残基が、固定された順序で３つの異なる酵素によって除去される。この事象は、ＥＲで生じ、そしてタンパク質が、さらなるプロセシングのためにゴルジに輸送され得るシグナルである。ＥＲでのプロセシング後、高マンノース型のオリゴサッカライドが形成される。３つのグルコース残基および１つの特異的なα−１，２−連結したマンノース残基は、ＥＲにおいて特異的なグリコシダーゼおよびα−１，２−マンノシダーゼによって除去され、その結果コアのオリゴサッカライド構造、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡＣ２が生じる。コアの糖構造を有するタンパク質は、ゴルジ体に輸送され、ここで糖部分は、種々の修飾を受ける。
【０００５】
哺乳動物細胞では、糖鎖の修飾は、付加されるタンパク質部分に依存して３つの異なる経路を介して進行する。３つの異なる経路とは以下である：（１）コアの糖鎖は変化しない；（２）コアの糖鎖は、コアの糖鎖におけるマンノースの６位置に対してＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）におけるＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェート部分（ＧｌｃＮａｃ−１−Ｐ）を付加すること、続いてＧｌｃＮＡｃ部分を取り除いて、糖タンパク質における酸性糖鎖を形成することによって変化される；または（３）コアの糖鎖は、マンノシダーゼＩを用いて３マンノース残基を除去することによってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に最初に変換され；Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２はさらに、ＧｌｃＮａｃを付加すること、およびさらに２つのマンノース残基を除去すること、続いて連続してＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（Ｇａｌ）およびＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸（ＮｅｕＮａｃ）とも呼ばれる）を添加して、種々のハイブリッドまたは複合糖鎖を形成することによって修飾される（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
組み換えタンパク質のオリゴサッカライド含量は、治療用糖タンパク質の安全性および有効性に影響し得る。従って、このような糖タンパク質のオリゴサッカライド含量、特にマンノース含量を制御するための方法は、有益である。
【０００７】
糖タンパク質組成物、特に治療用抗体の高マンノース含量は、治療的な使用の間のこのようなタンパク質の安全性および有効性に有意に影響し得る。特定の理論には拘束されないが、高マンノース糖タンパク質が、例えば、マクロファージおよび樹状細胞上のマンノースレセプターに起因して、その低マンノース対応物よりも速く循環から排出されるということが、証拠によって示唆される。さらに、高マンノース糖タンパク質は、より免疫原性であると期待される。従って、治療用糖タンパク質、例えば、低マンノース含量を有する治療抗体などを生成することが所望され得る。
【０００８】
本発明者らは、組み換え産生されたタンパク質およびペプチドのマンノース含量を調節する（例えば、制御するかまたは減少させる）ための方法を提供することによって当該分野におけるこの必要性を解決する。
【非特許文献１】Ｒ．ＫｏｒｎｆｅｌｄおよびＳ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）５４：６３１〜６６４
【非特許文献２】Ｃｈｉｂａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３：２６２９８〜２６３０４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、組み換え発現された糖タンパク質のマンノース含量、そして詳細には、高マンノース含量に影響する要因の発見に少なくとも一部は基づく。
【００１０】
従って、１局面では、本発明は、細胞培養条件を操作することによって、哺乳動物宿主細胞において生成された組み換え糖タンパク質のマンノース含量（すなわち、オリゴサッカライド側鎖上）を調節し、その結果その細胞によって産生される糖タンパク質が低マンノース含量を有するような方法を提供する。本明細書において用いる場合、「低マンノース含量（ｌｏｗ−ｍａｎｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、糖タンパク質組成物であって、その組成物中の糖タンパク質の約１０％未満、または約８％未満、または約５％未満（例えば、約４％未満）が、４つを超えるマンノース残基を有する（すなわち、Ｍ５以上の種である）糖タンパク質組成物をいう。本明細書において用いる場合、「低マンノース含量（ｌｏｗ−ｍａｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語はまた、糖タンパク質組成物であって、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、またはこれらの任意の前述の範囲の間の任意の値、またはゼロでさえある、糖タンパク質組成物をいう。
【００１１】
本発明の１実施形態では、低マンノース含量は、低浸透圧重量モル濃度（例えば、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、または約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、または約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満、例えば、約３８０〜２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ）で細胞培養条件を維持することによって達成される。これによって細胞培養物は、低マンノース含量を有する糖タンパク質、すなわち、糖タンパク質のオリゴサッカライド側鎖上に４以下のマンノース残基を有する糖タンパク質について富化される。従って、特定の実施形態では、本発明は、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を産生するための方法を提供し、この方法は、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度（約２００〜６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、例えば、約２５０〜５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、約２５０〜５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、約２５０〜４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、約２５０〜４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、約２５０〜３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇの範囲）を有する培地中で、糖タンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞を培養する（例えば、培養の増殖期または産生期において）工程を包含する。
【００１２】
前述の浸透圧重量モル濃度の範囲は、限定はしないが、細胞培養培地中の塩、ビタミン、糖、ペプトンおよびアミノ酸のうちの１つ以上の濃度を含む、多数の細胞培養パラメーターを操作することによって達成され得る。従って、特定の実施形態では、本発明は、約７０ｍＭ以下（例えば、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ）の濃度のカリウム；および／または約２００ｍＭ以下（例えば、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ）の濃度のナトリウムを含有する培地中で、糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること、ならびに細胞培養物の浸透圧重量モル濃度を約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下で維持することによって、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【００１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を実質的に含まない培地中で糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること、ならびにこの細胞培養物の浸透圧重量モル濃度を約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下で維持することによって、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を産生する方法を提供する。
【００１４】
さらに、なお別の実施形態では、この培地は、ビオチン、Ｄ−カルシウムパントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、ターミン（ｔｈａｍｉｎｅ）ＨＣｌおよびシアノコバラミンからなる群より選択される１つ以上のビタミンを、約０．００００５ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの濃度で含んでもよい。さらに別の実施形態では、この培地は、グルコースを約１ｍＭ〜約９０ｍＭの濃度で含む。さらなる実施形態では、この培地は、酵母抽出物、酵母加水分解物、ダイズペプトン、ダイズ加水分解物、コムギペプトンおよびコムギ加水分解物からなる群より選択される１つ以上のペプトンを、約０．５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの濃度で含む。
【００１５】
本発明のなおさらなる実施形態では、この細胞培養培地は、浸透圧重量モル濃度を所望のレベルで、例えば、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下で維持するために必要な量で１つ以上の浸透圧維持剤（ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含んでもよい。適切な浸透圧維持剤は、当該分野で公知であって、そしてこれには例えば、ベタイン、グリシン、Ｌ−トレオニン、およびＬ−プロリン、ならびにその誘導体、例えば、グリシンベタインおよびベタインアルデヒドなどが挙げられる。特定の実施形態では、この浸透圧維持剤（例えば、ベタイン）が、約２０ｍＭ以上の濃度で細胞培養培地中に存在する。特定の実施形態では、この浸透圧維持剤（例えば、ベタイン）は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する。
【００１６】
単独で、または本明細書に記載される１つ以上のパラメーターと組み合わせて、制御され得るさらなる細胞培養パラメーターとしては、例えば、細胞が培養される温度および期間が挙げられる。特定の実施形態では、組み換え糖タンパク質を発現する宿主細胞は、約３１℃〜約３８℃の温度で培養される。特定の他の実施形態では、組み換え糖タンパク質を発現する宿主細胞は、約５日〜約１４日の範囲の期間培養される。
【００１７】
本発明に従う組み換え糖タンパク質を発現するための適切な宿主細胞は、当該分野で周知であって、本明細書に記載される任意の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞（例えば、ＮＳＯ細胞）および種々の他の哺乳動物細胞を包含する。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載されるような低マンノース含量を有する広範な種々の糖タンパク質を産生するために使用され得る。特定の実施形態では、本発明は、低マンノース含量を有する、組み換えモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するために用いられる。適切な抗体としては、例えば、マウス、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体、ならびに当該分野で公知の他の抗体型を挙げることができる。別の特定の実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１５に結合し、これには限定はしないが、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００３−０１３８４２１号に開示される抗体が挙げられる。別の特定の実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１５に結合する完全ヒトモノクローナル抗体であって、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびにＩＬ−１５に結合する相同な配列（例えば、それぞれ、配列番号４または配列番号２に対して約８０、８５、９０、９５％以上同一性のアミノ酸配列を有する）を有する。さらなる特定の実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１５に結合するヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号８〜１０に示される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域、ならびに、ＩＬ−１５に結合する相同な配列（例えば、それぞれ、配列番号８〜１０のいずれかに対して約８０、８５、９０、９５％以上の同一性のアミノ酸配列を有する）、および配列番号５〜７に示される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、ならびに、ＩＬ−１５に結合する相同な配列（例えば、それぞれ、配列番号５〜７のいずれかに対して約８０、８５、９０、９５％以上の同一性のアミノ酸配列を有する）を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントとしては、配列番号８〜１０に示される３つ全てのＣＤＲを含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号５〜７に示される３つ全てのＣＤＲを含む重鎖可変領域、またはその保存的なアミノ酸置換が挙げられる。
【００１９】
さらに別の局面では、本発明は、本明細書に記載される方法によって生成される低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を提供する。従って、このような糖タンパク質としては、任意の上述の治療用糖タンパク質、例えば、抗体、ホルモン、酵素、ペプチド、および他の糖タンパク質を挙げることができる。
【００２０】
また、低マンノース含量を有する任意の前述の糖タンパク質を含む組成物も、本発明によって包含される。特定の実施形態では、この組成物は、低マンノース含量を有する単離された糖タンパク質（例えば、ＩＬ−１５に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント）、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。
【００２１】
従って、さらに別の局面では、本発明は、ヒトＩＬ−１５の過剰発現に関連するか、および／またはヒトＩＬ−１５誘発性作用の下方制御もしくは阻害が有益である、障害を処置または予防する方法であって、低マンノース含量を有する単離されたＩＬ−１５抗体を被験体に投与することによって提供される方法を提供する。例示的な障害としては限定はしないが、脈管炎、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患（例えば、クーロン病またはセリアック病）、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、Ｔ細胞リンパ腫、およびＴ細胞白血病が挙げられる。
【００２２】
従って、さらに別の局面では、本発明は、ヒトＩＬ−１５の過剰発現に関連するか、および／またはヒトＩＬ−１５誘発性作用の下方制御もしくは阻害が有益である、障害を処置または予防する方法であって、低マンノース含量を有する単離されたＩＬ−１５抗体を被験体に投与することによって提供される方法を提供する。例示的な障害としては限定はしないが、関節炎、結合組織病、眼科的障害、神経学的障害、胃腸および肝臓の障害、アレルギー障害、血液学的障害、皮膚障害、肺障害、悪性疾患、移植由来障害、内分泌学的障害、血管障害、婦人科的障害および感染性疾患が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
従って、治療用糖タンパク質、例えば、低マンノース含量を有する治療用抗体などを産生することが所望される。
【００２４】
本開示がさらに容易に理解され得るように、特定の用語を最初に規定する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通じて説明される。
【００２５】
Ｉ．定義
炭水化物成分は、本明細書においては、オリゴサッカライドについて通常用いられる命名法を参照して記載される。この命名法を用いる炭水化物化学の概説は、例えば、ＨｕｂｂａｒｄおよびＩｖａｔｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：５５５〜５８３（１９８１）に見出され得る。この命名法としては例えば、以下が挙げられる：Ｍａｎ、これはマンノースを示す；ＧｌｃＮａｃ、これは２−Ｎ−アセチルグルコサミンを示す；Ｇａｌ、これはガラクトースを示す；そしてＧｌｃ，これは、グルコースを示す。シアル酸は、簡易表記に準拠して、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸についてはＮｅｕＮａｃ、そして５−グリコリルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＧｃで記載される。
【００２６】
「浸透圧重量モル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）」という用語は、本明細書において用いる場合、水溶液中の溶解した溶質粒子の浸透圧の指標をいう。溶質粒子としては、イオンおよび非イオン化分子の両方が挙げられる。浸透圧重量モル濃度は、１ｋｇの溶液に溶解された浸透圧的に活性な粒子の濃度（すなわち、オスモル）として表わされる（３８℃での１ｍＯｓｍ／ｋｇのＨ２Ｏは、１９ｍｍＨｇの浸透圧と等価である）。本明細書において用いる場合、「ｍＯｓｍ」という略号は、「ミリオスモル／溶液のｋｇ（溶液１ｋｇあたりのミリオスモル）（ｍｉｌｌｉｏｓｍｏｌｅｓ／ｋｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」を意味する。例示的な実施形態では、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度は、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下、または約２００ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇで維持される。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、ペプチドおよびタンパク質をいい、これは、マンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴサッカライド側鎖を有する抗体を包含する。糖タンパク質は、宿主細胞に対して同種であってもよく、または例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生されるヒト糖タンパク質のように、利用されている宿主細胞に対して異種、すなわち外来であってもよい。このような糖タンパク質は一般に、「組み換え糖タンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）」と呼ばれる。特定の実施形態では、宿主細胞によって発現される糖タンパク質は直接培地中に分泌される。哺乳動物糖タンパク質の例としては、以下の分子およびそれに対する抗体が挙げられる：サイトカイン、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１５、およびそれらのレセプター；ケモカイン、例えば、ＴＮＦ、ＴＥＣＫおよびそれらのレセプター、例えば、ＴＮＦＲ、ＣＣＲ９；成長ホルモン、これには、ヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンを含む；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ビルブラント因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒトの尿または組織型プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；エンケファリナーゼ：ＲＡＮＴＥＳ（活性化正常Ｔ細胞発現および分泌に対して調節（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ））；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、βラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子についてのレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、ウシ由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、これには、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロンα、−β、および−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１５；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子（ｄｅｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体（ｈｏｍｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）；および調節タンパク質。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「細胞培養培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」および「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、以下のカテゴリーのうち１つ以上に由来する少なくとも１つの成分を代表的には提供する、成長中の哺乳動物細胞のために用いられる栄養溶液をいう：１）エネルギー源、通常は、炭水化物の形態、例えば、グルコースなど；２）全ての必須アミノ酸のうちの１つ以上、および通常基本的なセットの２０のアミノ酸に加えてシステイン；３）ビタミンおよび／または低濃度で必要な他の有機化合物；４）遊離脂肪酸；および５）微量元素であって、代表的には極めて低濃度で、通常はマイクロモルの範囲で必要である、無機化合物または天然に存在する元素として規定される微量元素。この栄養溶液は必要に応じて、細胞の成長を最適化するためにさらなる成分を補充されてもよい。
【００２９】
本発明の哺乳動物細胞培養物は、培養されている特定の細胞に適切な培地中で調製される。特定の細胞タイプを培養するために用いられ得る適切な細胞培養培地は、当業者に明らかである。例示的な市販の培地としては、例えば、ＨａｍのＦ１０（ＳＩＧＭＡ）、最少必須培地（ＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ）、ＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ）、およびダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ）が挙げられる。任意のこれらまたは他の適切な培地は、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシンＴＭ）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として規定される）脂質（例えば、リノール酸または他の脂肪酸）、およびそれらの適切なキャリア、およびグルコースまたは等価なエネルギー供給源を補充されてもよいし、そして／または、本明細書に記載されるように改変して低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質の産生を容易にしてもよい。特定の実施形態では、この細胞培養培地は血清を含まない。
【００３０】
特定の実施形態では、細胞培養培地は、このような培地中で培養される宿主細胞によって発現される組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を調節する（例えば、減少する）ように最適化される。特定の実施形態では、この哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であり、そして適切な培地は、このような培地中で培養されるＣＨＯ細胞によって発現される組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を調節する（例えば、減少する）ように、例えば、アミノ酸、塩、糖、ペプトンおよびビタミンのような１つ以上の成分の濃度を改変している、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ−１２基礎処方物（ｂａｓｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）のような基礎培地成分（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含む。
【００３１】
細胞培養の「増殖期（ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）」という用語は、指数関数的細胞増殖の期間（すなわち、対数期）をいい、ここではこの細胞は、一般に急速に分裂している。細胞は、約１日の間、または約２日、または約３日、または約４日、または４日より長く、増殖期に維持される。細胞が増殖期で維持される期間は、例えば、細胞のタイプ、および細胞の増殖速度、および培養条件に基づいて変化する。
【００３２】
「移行期（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）」という用語は、増殖期と産生期との間の期間をいう。一般には、移行期とは、培養条件が増殖期から産生期へのシフトを支持するように制御され得る時間である。制御され得る種々の細胞培養パラメーターとしては限定はしないが、温度、浸透圧重量モル濃度、ビタミン、アミノ酸、糖、ペプトン、アンモニウムおよび塩のうちの１つ以上が挙げられる。
【００３３】
細胞培養の「産生期（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）」という用語は、細胞増殖がプラトーに達している期間をいう。対数的な細胞増殖は代表的には、この期の前または間に終わり、そしてタンパク質産生が優勢になる。この段階で所望のタンパク質産生を達成するために、細胞培養培地を補充することが所望される。
【００３４】
「哺乳動物宿主細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」、「宿主細胞（ｈｏｓｔ−ｃｅｌｌ）」および「哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）」という用語は、適切な栄養および増殖因子を含有する培地中で単層培養物または懸濁培養物のいずれかに入れられた場合、増殖かつ生存し得る、哺乳動物由来の細胞株をいう。代表的には、このような細胞は、培養培地中へ目的の特定の糖タンパク質を大量に発現かつ分泌し得る。適切な哺乳動物宿主細胞の例としては限定はしないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；ｄｐ１２ＣＨＯ細胞（欧州特許第３０７２４７号）；ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎細胞株（懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ｓｅｒｔｏｌｉ ｃｅｌｌｓ）（ＴＭ４）（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｂｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３〜２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２ ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞およびヒト肝細胞腫株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。
【００３５】
「組み換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」（または単に「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」）という用語は、本明細書において用いられる場合、組み換え発現ベクターが導入されている細胞をいうものとする。このような用語は、特定の被験細胞をいうだけでなく、このような細胞の子孫も指すものであることが理解されるべきである。特定の改変は、変異または環境の影響のいずれかに起因して後継世代に存在し得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書において用いられるような「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」という用語の範囲内にやはり包含される。
【００３６】
「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」という用語は一般に、宿主細胞内で生じる転写および翻訳をいう。宿主細胞における遺伝子産物の発現のレベルは、その細胞に存在する対応するｍＲＮＡの量、またはその遺伝子によってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、産物の遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーションによって定量され得る。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．７．３−７．５７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。ある遺伝子によってコードされるタンパク質は、そのタンパク質の生物学的活性についてアッセイすることによって、またはこのような活性と独立したアッセイ、例えば、タンパク質と反応し得る抗体を用いるウエスタンブロット分析またはラジオイムノアッセイなどを使用することによって定量され得る。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．１８．１〜１８．８８ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。ある実施形態では、「発現」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」という用語は、本発明の方法によって産生される低マンノース含量を有する組み換えタンパク質について用いられる。
【００３７】
「低マンノース（ｌｏｗ−ｍａｎｎｎｏｓｅ）」、および「低マンノース含量（ｌｏｗ−ｍａｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、本明細書において用いる場合、糖タンパク質組成物であって、その組成物の約１０％以下が、４マンノース残基より多く、すなわちＭ５またはそれ以上の種を有する糖タンパク質組成物をいう。逆に、高マンノース含量（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」とは、糖タンパク質組成物であって、その組成物の約１０％より多くが、４マンノース残基より多くを有する糖タンパク質を含む糖タンパク質組成物をいう。「低マンノース」、および「低マンノース含量」という用語はまた、糖タンパク質組成物であって、その組成物の約９０％より多く、または約９５％より多くが４以下のマンノース残基を含む糖タンパク質を有する、糖タンパク質組成物を指しても用いられる。
【００３８】
「低マンノース含量を有する糖タンパク質（ａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｖｉｎｇ ｌｏｗ−ｍａｎｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、組み換え糖タンパク質組成物であって、宿主細胞を培養することによって生成される場合、限定はしないが、その組成物中の糖タンパク質の約４％以下、約５％以下、約４％〜約５％以下、約６％以下、約５％〜６％以下、約７％以下、約６％〜７％以下、約８％以下、約７％および８％以下、約９％以下、約８％〜９％以下、約１０％以下、または約９％〜１０％以下が４より大きい（すなわち、Ｍ５またはそれ以上の種）マンノース残基を有する糖タンパク質組成物を指して用いられる。従って、「低マンノース含量を有する糖タンパク質（ａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｖｉｎｇ ｌｏｗ−ｍａｎｎｎｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、組み換え糖タンパク質組成物であって、宿主細胞を培養することによって生成される場合、その組成物中の糖タンパク質の約９０％より多く、または約９５％より多くが４以下のマンノース残基（すなわち、０〜４のマンノース残基）を有する糖タンパク質組成物をいう。
【００３９】
高マンノース含量は、例えば、Ｗｕｈｒｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ第８２５巻：１２４〜１３３、２００５）およびＤｅｌｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ第２９１巻：２３５１〜２３５６）に記載されるように、当該分野で周知の１つ以上の方法、ならびに本明細書に記載される方法、例えば、糖タンパク質のＮ−グリカンマッピングのための分析方法を含む方法によって測定され得る。要するに、Ｎ−グリカンは、組み換え糖タンパク質、例えば、組み換えモノクローナル抗体から酵素的に除去され、そして還元末端で蛍光タグ（２−アミノベンズアミド）で標識される。蛍光Ｎ−グリカンは、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分離され、そして蛍光検出を用いて検出される。天然のＮグリカンの分離は一般に、Ｎグリカン構造における複雑性の増大に基づく。荷電されたＮ−グリカンの分離は、シアル酸、硫酸塩の数およびタイプ、または電荷数が由来し得る存在する他の改変に基づく。試験サンプルのこれらのグリカンプロフィールは、適切な標準に対して視覚的に比較される。
【００４０】
高マンノース含量はまた、本明細書に直ちに開示される方法を用いて測定されてもよい：限定はしないが抗体またはそのフラグメント、例えば、真核生物宿主細胞で発現される場合、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメントおよびペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）を含む融合タンパク質を含む、糖タンパク質の高マンノース含量を検出および／または定量するためのハイスループットの方法。抗体は代表的には、Ｆｃ領域上に単一のＮ連結グリカンを有する。グリカンの部分的に包埋された構造のせいで、これはしばしば部分的にしかプロセシングされず、その結果、過剰の高マンノースおよびハイブリッドタイプが生じる。クローン選択、細胞の変異もしくは他の遺伝子操作、または細胞培養操作によって、その細胞によって産生されるグリカンのタイプを変更し得る。多数の条件／細胞が調査され、従って多くのグリカン試験がスクリーニングの間に必要である。伝統的なグリカンマッピングは、遅くかつ、労働集約的であり、何日も要する。本発明の高マンノース／ハイブリッドグリカンアッセイによって、かなり少ないオペレーターの労力で、かなり迅速にグリカンタイプの比が得られる。
【００４１】
詳細には、本発明は、糖タンパク質を含有するサンプルまたは組成物中の糖タンパク質の高マンノース含量を検出および／または定量するための方法を提供し、この方法は、糖タンパク質を含有するサンプルまたは組成物をエンドグリコシダーゼ消化に供する工程と、還元剤（必要であれば）を用いてこの消化された糖タンパク質を還元する工程と、この消化された糖タンパク質を変性電気泳動によって分離し、それによって高マンノース／ハイブリッドタイプのグリカンの比を、脱グリコシル化重鎖の画分（エンドグリコシダーゼ消化後のピーク）から非グリコシル化重鎖の画分（エンドグリコシダーゼ処理なしのピーク画分）を差引きすることによって決定する工程とを包含する。この非グリコシル化重鎖画分またはエンドグリコシダーゼ処理なしのピーク画分は、同じサンプルまたは組成物を、エンドグリコシダーゼがそこに存在しないこと以外は同じ消化条件に供することによって生成される。この工程は、エンドグリコシダーゼ消化工程と同時に行われても、または別々に行われてもよい。
【００４２】
コアグリカン上のＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＮＡｃ２との間で高マンノースおよびハイブリッドのグリカンを選択的に切断する（またはタンパク質上で短いグリカンを生成する）が、複雑なＮ連結グリカンをインタクトなままで残す任意のエンドグリコシダーゼが本発明において用いられ得る。適切な定量のために、エンドグリコシダーゼは、限られた量であってはならない。酵素の濃度、インキュベーション温度および消化時間を含む、エンドグリコシダーゼ消化を行うための特定の状態は、用いられるエンドグリコシダーゼのタイプに依存する。本発明に関連するエンドグリコシダーゼの例としては、限定はしないが、エンドグリコシダーゼＨおよびエンドグリコシダーゼＦ１が挙げられる。本発明の１実施形態では、糖タンパク質を含むサンプルを、エンドグリコシダーゼＨを用いて３７℃で約２時間処理し、βメルカプトエタノールで還元し、そしてＣＥ−ＳＤＳ分析に供する。
【００４３】
グリコシル化糖タンパク質、例えば、グリコシル化抗体から、脱グリコシル化糖タンパク質、例えば、脱グリコシル化抗体を分離するための例示的な方法としては限定はしないが、以下の２つの方法が挙げられる：
１）還元条件下のＣＥ−ＳＤＳ。グリコシル化糖タンパク質、例えば、抗体は、ＳＤＳおよび還元剤で変性され、そしてグリカンを有するその重鎖（ＨＣ）は、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ（ＣＥ−ＳＤＳ）によって切断ＨＣ（脱グリコシル化ＨＣ）から分離される。エレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）はＵＶシグナルで生成される。ピーク下面積は、相対的な量に対して比例する。従って、高マンノース／ハイブリッド型の量は、早期に脱グリコシル化ＨＣ位置で溶出する画分から決定される。ＧｌｃＮＡｃ−ＨＣは、脱グリコシル化ＨＣと同時に泳動するので、未消化のサンプルからの脱グリコシル化ＨＣの％が消化されたサンプルのプレ−ピークから差引きされて、高マンノース値％が得られる。分離には、立体配置次第で、１５〜３０分を要する。
【００４４】
２）マイクロ流体（微小流体）ベースのＣＥ−ＳＤＳ。糖タンパク質は、１）においてと同様に、ただしＣａｌｉｐｅｒによるＬＣ９０のような「ラボ・オン・チップ（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ）」装置を用いて分離される。同じ原理をこのアッセイおよび分離で用いるが、タンパク質を検出するためには蛍光色素を用いる。分離時間は、１アッセイあたり約３０秒に短縮され、そしてマイクロタイタープレートからサンプリングされ得る。
【００４５】
上記されるような本発明の方法は、精製されたタンパク質でおこなわれても、ただし粗細胞培養サンプルでも行われてもよい。組み換え抗体を用いれば、このシグナルは、精製が必要ないほど強力である。
【００４６】
特定の実施形態では、４を超えるマンノース残基を有する糖タンパク質は、５〜９のマンノース残基を有する糖タンパク質（すなわち、種Ｍ５〜Ｍ９）を包含する。特定の理論で拘束されることは望まないが、当業者は、宿主細胞によって発現される糖タンパク質組成物が、種々の数のマンノース残基を有する糖タンパク質を含むということを理解する。例えば、低マンノース糖タンパク質は、４個以下のマンノース残基（例えば、０〜４個のマンノース残基）を有し、そして高マンノース糖タンパク質は、４を超えるマンノース残基を有する（例えば、Ｍ５種またはそれ以上）。
【００４７】
本発明の特定の実施形態では、低マンノース含量を有する糖タンパク質は、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。本発明の別の特定の実施形態では、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質は、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。
【００４８】
「実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｂｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、細胞培養培地の調製物であって、特定の成分を含まないかまたはその量が減少している（未改変の培養培地に対して）調製物をいう。例えば、１実施形態では、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質を産生するために用いられる培養培地は、特定のアミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸）を実質的に含まない。ある実施形態では、１つ以上の成分を実質的に含まない培養培地は、未修飾の培養培地に対して１つ以上のこのような成分の約１％未満、または約３％未満、または約５％未満、または約１０％未満を含むように改変される。
【００４９】
「ＩＬ−１５」、「ＩＬ−１５抗原」および「インターロイキン１５」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、そして細胞によって天然に発現される任意の改変体またはアイソフォーム（イソ型）を含む。
【００５０】
本明細書において言及されるような「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、抗体全体、および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原−結合部分（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」）またはその単鎖を包含する。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ジスルフィド結合によって内部連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部位をいう。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてはＶＨと略称される）および重鎖定常領域からなる。その重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてはＶＬと略称される）および軽鎖定常領域からなる。その軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。このＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられる、さらに保存的な領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変の領域に小分割され得る。各々のＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主の組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００５１】
本明細書において用いる場合、抗体の「抗原結合部分（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」および「抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」（または単に「抗体部分（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語は、抗原（例えば、ＩＬ−１５）に選択的に結合する抗体の１つ以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される抗原結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる単価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単独アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６（１９８９））；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｖｉｉ）合成リンカーによって必要に応じて連結され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ、が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって単価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）として公知である；例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６（１９８８）；およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照のこと）を形成する、単一のタンパク質鎖としてそれらを作成し得る合成リンカーによって、組み換え方法を用いて連結されてもよい。このような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」および「抗原結合フラグメント」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、そしてそのフラグメントは、インタクトな抗体と同じ方式で有用性についてスクリーニングされる。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、特定のエピトープについての単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。従って、「ヒトモノクローナル抗体（ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、単一の結合特異性を示し、そしてヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体をいう。１実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成される。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「組み換えヒト抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、作製または単離される全てのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマについてトランスジェニックまたはトランスクロモゾーマル（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、（ｃ）組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体を包含する。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。しかし、特定の実施形態では、このような組み換えヒト抗体は、インビトロの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボの体細胞突然変異誘発）に供されてもよく、従って、組み換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、かつそれに関連するが、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然には存在し得ない配列である。
【００５４】
本明細書において用いる場合、「異種抗体（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、このような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物体に関して規定される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物から構成されない生物体で見出されるものに対応するアミノ酸配列またはコードする核酸配列を有する抗体であって、そして一般には、トランスジェニック非ヒト動物のものとは異なる種に由来する抗体を指す。
【００５５】
「単離された抗体（ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、本明細書において用いる場合、異なる抗原性特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう（例えば、ＩＬ−１５に特異的に結合する単離された抗体とは、ＩＬ−１５以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＩＬ−１５のエピトープに特異的に結合する単離された抗体とは、他の関連のサイトカインに対して、または異なる種由来の他のＩＬ−１５タンパク質に対して交差反応性を有してもよい。しかし、この抗体は好ましくは常にヒトＩＬ−１５に結合する。さらに、単離された抗体は代表的には、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。特定の実施形態では、異なるＩＬ−１５特異性を有する「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」モノクローナル抗体の組み合わせは、十分に規定された組成物中で組み合わされる。
【００５６】
本明細書において用いる場合、「特異的な結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「選択的な結合（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）」および「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄｓ）」とは、予め決められた抗原に対して結合する抗体またはそのフラグメントをいう。例えば、１実施形態では、この抗体は、組み換えヒトＩＬ−１５を分析物として、そしてその抗体をリガンドとして用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ ３０００装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、ほぼ１０−７Ｍ未満、例えば、ほぼ１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満、またはさらに低い親和性（ＫＤ）でさえ結合し、そして予め決められた抗原に対して、その予め決められた抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合についての親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、「抗原に選択的に結合する抗体」という句と交換可能に用いられる。
【００５７】
本明細書において用いる場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数をいうものとする。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。
【００５９】
本明細書において用いる場合、「アイソタイプ・スイッチ（ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」とは、抗体のこのクラスまたはアイソタイプが、あるＩｇクラスから１つの他のＩｇクラスに変化するという現象をいう。
【００６０】
本明細書において用いる場合、「ノン・スイッチ・アイソタイプ（ｎｏｎ−ｓｗｉｔｃｈｅｄ ｉｓｏｔｙｐｅ）」とは、アイソタイプのスイッチが起こっていないときに生成される重鎖のアイソタイプクラスをいう；ノン・スイッチ・アイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は代表的には、機能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子からすぐ下流の最初のＣＨ遺伝子である。アイソタイプのスイッチは、古典的または非古典的なアイソタイプ・スイッチと分類されている。古典的なアイソタイプ・スイッチは、導入遺伝子における少なくとも１つのスイッチ配列に関与する組み換え事象によって起こる。非古典的なアイソタイプ・スイッチは、例えば、ヒトσμとヒトΣμ（δ関連欠失）との間の相同組み換えによって生じ得る。別の非古典的なスイッチ機構、例えば、とりわけ、導入遺伝子間および／または染色体間の組み換えが生じてアイソタイプ・スイッチを達成してもよい。
【００６１】
本明細書において用いる場合、「スイッチ配列（ｓｗｉｔｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、スイッチ組み換えを担うＤＮＡ配列を指す。「スイッチ・ドナー（ｓｗｉｔｃｈ ｄｏｎｏｒ）」配列は代表的には、μのスイッチ領域であって、スイッチ組み換えの間に欠失されるべき構築領域の５’（すなわち、上流）である。「スイッチ・アクセプター（ｓｗｉｔｃｈ ａｃｃｅｐｔｏｒ）」領域は、欠失されるべき構築領域と置換定常領域（例えば、γ、εなど）との間である。組み換えが常に生じる非特異的な部位が存在するので、最終の遺伝子配列は代表的には、構築物からは予測可能ではない。
【００６２】
本明細書において用いる場合、「グルコシル化パターン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒ）」とは、タンパク質に対して、さらに詳細には免疫グロブリンタンパク質に対して共有結合される炭水化物単位のパターンとして規定される。導入遺伝子のＣＨ遺伝子が由来する種に対してよりも非ヒトトランスジェニック動物の種におけるグリコシル化パターンとさらに類似しているとして、当業者が異種抗体のグリコシル化のこのパターンを認識する場合、異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって生成される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質的に同様であるとして特徴付けられ得る。
【００６３】
ある物体に適用する場合、「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」という用語は、本明細書において用いる場合、ある物体が天然に見出され得る事実をいう。例えば、ある供給源から天然に単離され得る生物体（ウイルスを含む）に存在し、かつ実験室でヒトによって故意に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。
【００６４】
「再配列された、再配置された（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）」という用語は本明細書において用いる場合、重鎖または軽鎖の免疫グロブリン遺伝子座の構成（配置）であって、それぞれ、本質的に完全なＶＨまたはＶＬドメインをコードする構成であるＤ−ＪまたはＪセグメントにすぐ隣接してＶセグメントが配置されている構成をいう。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡに比較することによって決定され得；再配列された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えのヘプタマー／ノナマーの相同なエレメントを有する。
【００６５】
「再配列されていない、再配置されていない（ｕｎｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）」または「生殖系列構成（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）」という用語はＶセグメントに関して本明細書において用いる場合、このＶセグメントが、ＤまたはＪセグメントに直ちに隣接するように再組み換えされていない構成（配置）をいう。
【００６６】
「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子をいう。核酸分子は、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６７】
「単離された核酸分子（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、ＩＬ−１５に選択的に結合する抗体または抗体の一部（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸について本明細書において用いる場合、この抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ＩＬ−１５以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含ない核酸分子であって、他の配列がヒトゲノムＤＮＡにおける核酸に天然に隣接してもよい、核酸分子をいう。配列番号１〜４は、ヒト抗ＩＬ−１５抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含むヌクレオチドおよびアミノ酸配列に相当する。詳細には、配列番号１および２は、この抗体のＶＨに相当し、そして配列番号３および４は、この抗体のＶＬに相当する。
【００６８】
特定の実施形態では、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８〜１０に示される１つ以上のそして好ましくは３つ全てのＣＤＲを含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号５〜７に示される１つ以上のそして好ましくは３つ全てのＣＤＲを含む重鎖可変領域を包含する。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明はまた、配列番号１〜１０に示される配列の「保存的配列改変（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」または「保存的配列置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」、すなわち、このヌクレオチド配列によってコードされる抗体の結合特徴にも含有するアミノ酸配列にも、有意に影響することも変更することもないヌクレオチドおよびアミノ酸の配列の改変を包含する。このような保存的配列改変としては、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、当該分野で公知の標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって配列番号１〜１０に導入され得る。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換が挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ヒト抗ＩＬ−１５抗体における予想される非必須アミノ酸残基は好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。
【００７０】
あるいは、別の実施形態では、変異は、例えば、飽和突然変異誘発によって抗ＩＬ−１５抗体コード配列の全てまたは一部にそって無作為に導入されてもよく、そして得られた改変抗ＩＬ−１５抗体は、結合活性についてスクリーニングされ得る。
【００７１】
従って、本明細書に開示される（重鎖および軽鎖可変領域）ヌクレオチド配列によってコードされるか、および／または本明細書に開示される（重鎖および軽鎖可変領域）アミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜４）を含有する抗体としては、保存的に改変されている類似の配列によってコードされるか、またはその類似の配列を含む実質的に同様の抗体が挙げられる。さらに、このような実質的に類似の抗体が、配列番号１〜４のように本明細書に開示される部分的（すなわち、重鎖および軽鎖可変領域の）配列に基づいて生成され得る方法についての考察は下に提供される。
【００７２】
核酸について、「実質的な相同性（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、２つの核酸またはその命名された配列が、必要に応じて整列および比較される場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失によって、そのヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜９５％、そしてさらに好ましくはそのヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９．５％が同一であることを意味する。あるいは、実質的な相同性は、そのセグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で、その鎖の相補体とハイブリダイズする場合に、存在する。
【００７３】
アミノ酸配列については、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度であって、適切な挿入または欠失と最適に配列および比較される場合の同一性の程度を示す。
【００７４】
２つの配列の間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち、相同性％＝一致する位置の数／位置の総数×１００）、これはこの２つの配列の最適配列のために導入するのに必要であるギャップの数および各々のギャップの長さを考慮している。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを用いて達成され得る。
【００７５】
２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０または８０というギャップウェイト、および１、２、３、４、５または６という長さウェイトを用いて決定され得る。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１〜１７（１９８９））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２というギャップ長ペナルティー、および４というギャップペナルティーを用いて決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、そして１６、１４、１２、１０、８、６または４というギャップウェイト、および１、２、３、４、５または６という長さウェイトを用いて決定され得る。
【００７６】
本発明の核酸およびタンパク質配列はさらに、例えば、関連の配列を特定するために、公的なデータベースに対する検索を行うための「クエリー（問い合わせ）配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として用いられてもよい。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行われてもよい。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に対するヌクレオチド配列相同性を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に対するアミノ酸配列相同性を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行われてもよい。比較目的のためのギャップのあるアラインメントを得るために、ギャップ化（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）に記載のように利用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォールトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を用いてもよい。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
【００７７】
核酸は、細胞全体に存在してもよいし、細胞溶解物に存在してもよいし、または部分的に精製されるかもしくは実質的に精製された形態であってもよい。核酸は、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該分野で周知のその他の技術を含む標準的な技術によって、精製されている場合、「単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」かまたは「実質的に純粋である（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｓｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと。
【００７８】
本発明の核酸組成物は、しばしば天然の配列（修飾された制限部位などを除いて）中で、ｃＤＮＡ、ゲノムまたはその混合物のいずれかから標準的な技術に従って、遺伝子配列を得るように変異され得る。コーディング配列については、これらの変異は、必要に応じて、アミノ酸配列に影響し得る。詳細には、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび他の本明細書で記載されるこのような配列に対して実質的に相同であるか、またはそれに由来する、ＤＮＡ配列が考慮される（ここで「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」とは、ある配列が、別の配列と同一であるかまたはそれから改変されることを示す）。
【００７９】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係におかれる場合、「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響する場合、そのコード配列に対して作動可能に連結されている。転写制御配列に関して、作動可能に連結されるとは、連結されているそのＤＮＡ配列が、連続しており、そして２つのタンパク質コード領域に連結する必要がある場合、連続してかつリーディングフレームにあるということを意味する。スイッチ配列については、作動可能に連結されるとは、この配列がスイッチ組み換えを達成し得るということを示す。
【００８０】
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、本明細書において用いる場合、別の核酸を輸送し得る核酸分子であって、その別の核酸に連結されている核酸分子をいうものとする。１つのタイプのベクターは、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」であって、これは、細胞の二本鎖ＤＮＡループであって、そこにさらなるＤＮＡセグメントが連結され得るＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントがそのウイルスゲノムに連結されてもよい。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において、「組み換え発現ベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ」（または単に、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）」と呼ばれる。一般には、組み換えＤＮＡ技術において有用である発現ベクターとはしばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」および「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は交換可能に用いられ得る。なぜなら、プラスミドは、ベクターの最も一般的に用いられる形態であるからである。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、組み換え欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むものとする。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を包含する。例えば、本発明の方法および組成物は、炎症性疾患、例えば、関節炎、例えば、間接リウマチのような炎症性疾患を有する被験体を処置するために用いられてもよい。「非ヒト動物（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ａｎｉｍａｌ）」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを包含する。
【００８２】
本発明の種々の局面は、以下の小区分にさらに詳細に記載される。
【００８３】
ＩＩ．マンノース含量に影響する要因
（ａ）浸透圧重量モル濃度
種々の細胞培養パラメーターが、哺乳動物細胞培養物で発現される組み換え糖タンパク質のマンノース含量に影響し得る。詳細には、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度が高いほど、４マンノース残基より多く（すなわち、Ｍ５の種またはそれ以上）を有する組成物中の糖タンパク質の割合が高くなることが本発明の方法によって発見された。従って、本発明の１実施形態では、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度は、発現される糖タンパク質のマンノース含量を減少または制御するために、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満（例えば、約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ）に維持される。
【００８４】
哺乳動物細胞培養のためには、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度は、約５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ未満で、または約２００ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約５５０ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇで、または約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇで維持される。
【００８５】
浸透圧重量モル濃度を所望の範囲で達成するために、培養培地中の種々の成分の濃度が調節され得る。例えば、培養培地に対してその浸透圧重量モル濃度を増大するために添加され得る溶質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、加水分解された動物のタンパク質、例えば、ペプトン、代謝されないポリマー、ビタミン、イオン、塩、糖、代謝産物、有機酸、脂質などが挙げられる。しかし、培養培地中の他の成分の濃度が、所望の浸透圧重量モル濃度を達成するために改変されてもよいことが理解される。
【００８６】
他の実施形態では、浸透圧重量モル濃度は、培養培地に１つ以上の浸透圧維持剤を添加することによって、上述の範囲に調節され得る。例示的な浸透圧維持剤は、当該分野で周知であって、限定はしないが、ベタイン、グリシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−プロリンおよびその誘導体が挙げられ、これには限定はしないが、グリシン、ベタイン、ベタインアルデヒドが挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養培地は、ベタインを約２０ｍＭ以上、または約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、そして最も好ましくは約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含む。
【００８７】
浸透圧重量モル濃度は、当該分野で周知の任意の手段および本明細書に記載される任意の手段によって測定され得る。例えば、浸透圧計、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡによって、ブランド名ＯＳＭＥＴＴＥとして販売されるような浸透圧計が、細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度を測定するために用いられ得る。あるいは、Ｏｓｍｅｔｔｅモデル２００７（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）が用いられてもよい。
【００８８】
本発明の他の実施形態では、浸透圧重量モル濃度は、細胞培養培地中の塩、糖、ペプトン、アミノ酸およびアンモニウムのうちの１つ以上の濃度を改変することによって調節され得る。
【００８９】
さらに他の実施形態では、浸透圧重量モル濃度に影響する上述のパラメーターは、細胞がマンノース含量を調節（例えば、減少）するように培養され得る、温度および期間の操作と、組み合されてもよい。従って、本明細書に記載される種々の細胞培養パラメーターは、組み換え糖タンパク質のマンノース含量を調節するように、単独でまたは組み合わせて調節されてもよいことが理解されるべきである。
【００９０】
（ｉ）カリウムおよびナトリウムの濃度
本発明の準備となる実験では、培養培地中のカリウム（Ｋ＋）濃度の増大が、糖タンパク質の高マンノース含量に寄与することが実証された。従って、１実施形態では、本発明は、約７０ｍＭ以下のＫ＋濃度（例えば、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ）を有する細胞培養培地を使用する。
【００９１】
上記で考察されるとおり、細胞培養培地単独のカリウム濃度が制御されてもよいし、または浸透圧重量モル濃度に影響する本明細書に記載される１つ以上の他の要因と組み合わせて制御されてもよい。特定の実施形態では、この培養培地はさらに、約２００ｍＭ以下（例えば、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ）のナトリウム濃度を含む。
【００９２】
（ｉｉ）アミノ酸
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響するか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された他の要因は、培地中のアミノ酸の濃度およびタイプである。例えば、特定の実施形態では、培地中の２０全てのアミノ酸の濃度を倍にすれば、マンノース含量が増大する。従って、本発明の特定の実施形態では、細胞培養培地は、アミノ酸濃度が低下するように調節される。特定の培地では、アミノ酸濃度は、約半分まで減らされる。
【００９３】
別の特定の実施形態では、細胞培養培地は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を実質的に含まない。
【００９４】
（ｉｉｉ）糖
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響するか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された他の要因は、培地中の糖の濃度およびタイプである。特定の実施形態では、細胞培養培地は、グルコースを、約１ｍＭ〜約９０ｍＭの濃度で含む。
【００９５】
（ｉｖ）アンモニウム
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響し得るか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与し得る別の要因は、約３０ｍＭ以下の濃度のアンモニウムである（例えば、約０ｍＭ〜約１０ｍＭ）。１実施形態では、アンモニウム濃度は、約１０ｍＭ以下である。
【００９６】
（ｖ）ペプトン
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響するか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された他の要因は、培地中で用いられるペプトンの濃度およびタイプである。ペプトンは、加水分解された動物のタンパク質から生成される培地補充物である。ペプトンの供給源は、当該分野で周知であり、そして例えば、動物の副産物、ゼラチンおよび植物性物質を包含する。ペプトンの例としては、限定はしないが、酵母抽出物、酵母加水分解産物、ダイズペプトン、ダイズ加水分解産物、コムギペプトン、およびコムギ加水分解産物が、約０．５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの濃度で挙げられる。
【００９７】
（ｖｉ）ビタミン
細胞培養培地の浸透圧重量モル濃度に影響するか、および／または組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された他の要因は、培地中で用いられるビタミンの濃度およびタイプである。特定の実施形態では、細胞培養培地は、ビオチン、Ｄ−カルシウム、パントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、シアノコバラミンからなる群より選択される１つ以上のビタミンを、約０．００００５ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの濃度で含む。
【００９８】
（ｂ）温度
組み換え発現されるタンパク質の高マンノース含量に寄与することが発見された別の要因は、細胞培養物が維持される温度である。従って、本発明の別の実施形態では、宿主細胞が培養される温度はまた、組み換え発現される糖タンパク質のマンノース含量を調節する（例えば、減少する）ために、単独でまたは前述の因子と組み合わせて調節される（例えば、細胞培養のタイミングおよび浸透圧重量モル濃度に影響する因子の調節）。特定の実施形態では、宿主細胞は、約３１℃で、または約３２℃で、または約３３℃で、または約３４℃で、または約３５℃で、または約３６℃で、または約３７℃で、または約３８℃で培養される。
【００９９】
ＩＩＩ．細胞培養手順
本発明の方法に従って、宿主細胞は、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質の発現を可能にする培地中で培養される。適切な細胞培養手順および条件は、当該分野で周知である。宿主細胞（例えば、ＣＨＯおよびＮＳＯ細胞）は、広範な種々の形式および培養容器中で培養されてもよい。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質の大規模生産または小規模生産のために設計された方式で培養されてもよい。さらに、宿主細胞は培養フラスコまたはディッシュの底に接着して培養されてもよく、またはそれらは、攪拌フラスコ、バイオリアクターまたはローラーボトル培養において懸濁液中であってもよい。特定の実施形態では、商業的な量で組み換え糖タンパク質を生成するために、宿主細胞をバイオリアクター中で、そして好ましくは、約２リットル以上、または約５リットル以上、または約１０リットル以上、または約５０リットル以上、または約１００リットル以上、または約５００リットル以上、または約１０００リットル以上、または約１５００リットル以上、または約２０００リットル以上の容量を有するバイオリアクター中で増殖してもよい。
【０１００】
特定の実施形態では、宿主細胞は、液体培地中で培養（例えば、維持および／または増殖）されてもよく、そして好ましくは、静置培養、試験管培養、振盪培養（例えば、ロータリー振盪培養、振盪フラスコ培養など）、曝気攪拌（エアレーション・スピンナー）（ａｅｒａｔｉｏｎ ｓｐｉｎｎｅｒ）培養または発酵などの従来の培養方法によって、連続して、または間欠的に培養される。特定の実施形態では、宿主細胞は、振盪フラスコで培養される。さらに他の実施形態では、宿主細胞は、発酵槽中で（例えば、発酵・プロセスで）培養される。発酵・プロセスとしては、限定はしないが、バッチ、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）および連続方法が挙げられる。「バッチ・プロセス（ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）」および「バッチ・発酵（ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、閉鎖系であって、培地、栄養物、補充添加物などの組成が発酵の開始でセットされて、発酵の間の変更には供されない閉鎖系をいう；ただし、過度の培地酸性化および／または微生物の死亡を妨げるためにｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御する試みはなされてもよい。「流加培養プロセス（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）」および「流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）」発酵という用語は、１つ以上の基質または補充物が添加される（例えば、段階的にまたは連続して）か、または細胞培養条件が発酵の進行につれて変化されることを除く、バッチ発酵をいう。「連続的プロセス（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｃｅｓｓ）」および「連続発酵（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、規定の発酵培地が発酵槽に連続して添加され、そして等量の用いられるかまたは「馴化された（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）」培地が、所望の産物（例えば、組み換え糖タンパク質）の回収のために連続して取り出される系をいう。種々のこのようなプロセスが開発されており、そして当該分野で周知である。
【０１０１】
特定の実施形態では、ＩＬ−１５に結合する組み換えヒトモノクローナル抗体を発現する宿主細胞は、ローラーボトル、２リットルのスピナー・フラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ−ｆｌａｓｋ）、または別の適切な培養系において増殖される。
【０１０２】
ＩＶ．糖タンパク質の回収
ポリペプチド産生期の後、本発明の組み換え糖タンパク質は、当該分野で十分確立されている技術を用いて培養培地から回収され得る。目的の糖タンパク質は好ましくは、別個のポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それはまた宿主細胞溶解物から回収されてもよい。
【０１０３】
特定の実施形態では、培養培地または溶解液を、粒子状の細胞細片を除去するために遠心分離する。その後、糖タンパク質を混入した可溶性タンパク質およびポリペプチドから、適切な精製手順を用いて精製する。例示的な精製手順としては、限定はしないが、免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカゲルでのまたは陽イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を用いるゲル濾過；ならびにＩｇＧのような混入物を除去するためのプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムが挙げられる。プロテアーゼインヒビター、例えば、フェニル・メチル・スルホニル・フルオライド（ＰＭＳＦ）がまた、精製の間タンパク質分解性の分解を阻害するために有用であり得る。当業者は、目的の組み換え糖タンパク質に適切な精製方法は、組み換え細胞の培養における発現の際に糖タンパク質の特徴における変化を相殺するために改変を要するかもしれないということを理解する。
【０１０４】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法を用いて発現される組み換え糖タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。一般には、この抗体は、ＥＬＩＳＡによって最初に特徴付けられる。例えば、マイクロタイタープレートは、例えば、ＰＢＳ中におけるＩＬ−１５のような精製抗原でコーティングされ、次いで、ＰＢＳ中に希釈されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような関係のないタンパク質でブロックされ得る。培養された細胞由来の抽出物の希釈物を各々のウェルに添加して、１〜２時間３７℃でインキュベートする。そのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで、アルカリホスファターゼに結合体化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、そのプレートをＡＢＴＳ基質で発色させ、４０５のＯＤで分析する。
【０１０５】
本発明の方法によって生成される抗体が固有のエンベロープに結合するか否かを決定するために、各々の抗体を市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてビオチン化してもよい。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識プローブで検出され得る。精製された抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、当該分野で認識される技術を用いて行ってもよい。例えば、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇを用いてマイクロタイタープレートのウェルを４℃で一晩コーティングしてもよい。５％のＢＳＡを用いるブロッキング後、そのプレートを１０μｇ／ｍｌの抗体または精製されたアイソタイプコントロールと、周囲温度で２時間、反応させる。次いで、そのウェルをヒトＩｇＧ１または他のヒトアイソタイプ特異的な結合体化プローブと反応させてもよい。プレートを発色させて、上記のように分析する。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明の方法を用いて生成される組み換え糖タンパク質は、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。ＩＬ−１５を発現する生きた細胞に対するＩＬ−１５モノクローナル抗体の結合を試験するために、フローサイトメトリーを用いてもよい。要するに、膜結合したＩＬ−１５を発現する細胞株および／またはヒトＰＢＭＣ（標準的な増殖条件下で増殖）を、０．１％のＢＳＡおよび０．０１％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ中で、種々の濃度のモノクローナル抗体とともに４℃で１時間混合する。洗浄後、その細胞を、一次抗体染色と同じ条件下でフルオレセイン標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。そのサンプルを、単一細胞上のゲートに対する光および側方散乱特性を用いてＦＡＣＳｃａｎ装置によって分析し、そして標識抗体の結合を決定する。蛍光顕微鏡を用いる代替的アッセイを、フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、またはその代わりに）用いてもよい。細胞は、正確に上記のように染色され、そして蛍光顕微鏡によって試験され得る。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能になるが、ただし抗原の密度に依存して感度は低下しているかもしれない。
【０１０７】
抗ＩＬ−１５ヒトＩｇＧは、ウエスタンブロッティングによってＩＬ−１５抗原との反応性についてさらに試験され得る。要するに、ＩＬ−１５を発現する宿主細胞由来の細胞抽出物を、調製して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供してもよい。電気泳動後、その分離された抗原は、ニトロセルロース膜に転写されて、２０％のマウス血清でブロックされ、そして試験されるべきモノクローナル抗体でプローブされる。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出され、そしてＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて発色され得る。
【０１０８】
Ｖ．薬学的組成物
別の局面では、本発明は、低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質の１つまたは組み合わせを含有する、組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、この薬学的組成物は、低マンノース含量を有する少なくとも１つの治療用タンパク質、例えば、低マンノース含量を有する治療用抗体、またはその抗原結合フラグメント（例えば、ＩＬ−１５に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント）を含む。別の特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと一緒に処方された、低マンノース含量を有する１つ以上の組み換え糖タンパク質を含む。
【０１０９】
本発明の薬学的組成物はまた、併用療法で、すなわち、他の因子と組み合わせて投与されてもよい。例えば、併用療法としては、本発明の組成物と、少なくとも１つ以上のさらなる治療剤、例えば、抗炎症剤、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、免疫抑制剤、化学療法剤、および乾癬剤との組み合わせをあげることができる。本発明の薬学的組成物はまた、放射線療法と組み合わせて投与され得る。他の抗体、例えば、ＣＤ４特異的抗体およびＩＬ−２特異的抗体との同時投与も、本発明によって包含される。ＣＤ４特異的抗体またはＩＬ−２特異的抗体とのこのような組み合わせは、自己免疫疾患および移植片拒絶を処置するために特に有用とみなされる。
【０１１０】
本明細書において用いる場合、「薬学的に受容可能なキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」としては、生理学的に適合する、任意のかつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくはこのキャリアは、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口的投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適切である。投与の経路に依存して、組み換え糖タンパク質、例えば、抗体、二価特異的および多価特異的分子は、酸の作用およびこの化合物を不活性化し得る他の天然の条件からこの化合物を防御するために物質中でコーティングされてもよい。
【０１１１】
「薬学的に受容可能な塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔ）」とは、親の化合物の所望の生物学的活性を保持し、そして所望されない毒性学的影響を与えない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９（１９７７）を参照のこと）。このような塩の例としては、酸付加塩、および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など由来の酸付加塩、ならびに非毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪酸、および芳香族スルホン酸など由来の酸付加塩が挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど由来の塩基付加塩、ならびに非毒性有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなど由来の塩基付加塩が挙げられる。
【０１１２】
本発明の組成物は、当該分野で公知の種々の方法によって投与され得る。当業者によって理解されるとおり、投与の経路および／または方式は、所望の結果に依存して変化する。活性化合物は、インプラント（移植物）、経皮パッチおよび微小カプセル化送達システムを含む徐放性処方物のように、急速な放出に対して化合物を保護するキャリアとともに調製され得る。生体分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン・ビニル・アセテート、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられてもよい。このような処方の調製のための多くの方法は、特許されるかまたは当業者に一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【０１１３】
特定の投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、この化合物を、その不活性化を妨げるための物質でコーティングするか、またはその物質とこの化合物を同時投与することが必要であり得る。例えば、この化合物は、適切なキャリア、例えば、リポソームまたは希釈剤中で被験体に投与され得る。薬学的に受容可能な希釈剤としては、生理食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）ＣＧＦエマルジョン、および従来のリポソームが挙げられる（Ｓｔｒｅｊａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７（１９８４））。
【０１１４】
薬学的に受容可能なキャリアとしては、滅菌水溶液または分散、および滅菌注射用溶液または分散の即時調整のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野で公知である。任意の従来の培地または因子が活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の薬学的組成物においてその使用が考慮される。補充される活性な化合物もその組成物に組み込まれてもよい。
【０１１５】
治療組成物は代表的には、製造および貯蔵の条件のもとで無菌かつ安定でなければならない。その組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬物濃度に適切な他の規則的な構造として処方され得る。そのキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、およびサーファクタントの使用によって維持され得る。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の吸収の遅延は、吸収を遅らせる因子、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１１６】
滅菌注射溶液は、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要な量で活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、続いて滅菌マイクロフィルトレーションによって、調製され得る。一般には、分散は、塩基性分散媒体および上記で列挙されたものに由来する必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルにこの活性化合物を組み込むことによって、調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））であって、これによって活性成分に加えて、以前に滅菌濾過されたその溶液由来のさらなる所望の成分の粉末、を生じる。
【０１１７】
投薬レジメンは、最適の所望の応答（例えば、治療応答）を得るように調節される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよいし、数回分割用量が経時的に投与されてもよいし、または用量は治療状況の危急によって指示される場合は比例して減少されるかもしくは増大されてもよい。例えば、本発明のヒト抗体は、毎週１〜２回皮下注射されてもよいし、または毎月１〜２回皮下注射されてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で処方することが特に有利である。本明細書において用いられる単位剤形とは、処置されるべき被験体の単位投薬量に適切な物理的に別個の単位をいい；各々の単位は、必要な薬学的なキャリアと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された、予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形についての仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感度の処置のためにこのような活性化合物を配合するという当該分野に固有の制限によって決められ、かつそれに直接依存する。
【０１１８】
薬学的に受容可能な抗酸化剤の例としては以下が挙げられる：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、αトコフェノールなど；ならびに（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
【０１１９】
治療組成物のためには、本発明の処方物は、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口の投与に適切な処方物を含む。この処方物は、単位剤形で適宜与えられてもよいし、そして薬学の当該分野で公知の任意の方法によって調製されてもよい。単位剤形を生成するためにキャリア物質と組合され得る活性成分の量は、処置されている被験体、および特定の投与方式に依存して変化する。単回剤形を生成するためにキャリア物質と組合され得る活性成分の量は一般には、治療効果を生じる組成物の量である。一般には、１００パーセントのうち、この量は、活性成分の約０．００１％〜約９０％、好ましくは、約０．００５％〜約７０％、最も好ましくは約０．０１％〜約３０％におよぶ。
【０１２０】
膣投与に適切である本発明の処方物としてはまた、ペッサリー（膣坐薬）、タンポン、クリーム、ジェル（ゲル）、ペースト、泡状物または噴霧の処方物であって、適切であることが当該分野で公知であるようなキャリアを含む処方物が挙げられる。本発明の組成物の局所投与または経皮投与のための剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル（ジェル）、溶液、パッチおよび吸入薬が挙げられる。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に受容可能なキャリアと、そして必要であり得る任意の防腐剤、緩衝液または噴霧剤と混合されてもよい。
【０１２１】
本明細書において用いる場合、「非経口投与（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「非経口的に投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）」という句は、通常は、注射による、腸内および局所投与以外の投与の方式を意味し、そしてこれには限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内に、嚢内に（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内に、心臓内に、皮内に、腹腔内に、経器官的に、皮下に、表皮下に、関節内に、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物に使用され得る適切な水性および非水性のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、など）、およびその適切な混合物、植物油、例えば、オリーブオイル、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そしてサーファクタントの使用によって、維持され得る。
【０１２３】
これらの組成物はまた、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤を含んでもよい。微生物の存在の防止は、前出の滅菌手順によって、そして種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって、確実にされ得る。組成物中に、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことも所望され得る。さらに、注射用の薬学的形態の長期にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延する因子の包含によって達成され得る。
【０１２４】
本発明の化合物が、ヒトおよび動物に対する薬剤として投与される場合、それらは、単独で与えられてもよいし、または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、例えば、０．００１〜９０％（さらに好ましくは、０．００５〜７０％、例えば、０．０１〜３０％）の活性成分を含む薬学的組成物として与えられてもよい。
【０１２５】
選択される投与の経路にかかわらず、本発明の化合物は、適切な水和型で用いられてもよいし、そして／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に受容可能な剤形に処方される。
【０１２６】
本発明の薬学的組成物における活性成分の正確な投薬量レベルは、患者に対する毒性なしに、特定の患者、組成物および投与方式について所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために変更されてもよい。選択された投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物および／または物質、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態および以前の病歴、などの医学分野で周知の要因を含む種々の薬物動態学的な要因に依存する。当該分野で通常の技術を有する医師または獣医師は必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定および規定し得る。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要であるより低レベルで、薬学的組成物中で使用される本発明の組成物の用量を開始して、所望の効果が達成されるまでその投薬量を徐々に増大する。一般には、本発明の組成物の適切な１日量は、治療効果を得るのに有効な最低用量である化合物の量である。このような有効用量は一般に、上記の要因に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であることが好ましく、好ましくは標的の部位に近位に投与される。所望の場合、治療用組成物の有効１日量は、必要に応じて単位剤形で、１日にわたって適切な間隔で、２、３、４、５、６またはそれ以上の別々に投与される小用量として投与されてもよい。本発明の化合物は単独で投与されることが可能であるが、その化合物は薬学的処方物（組成物）として投与されることが好ましい。
【０１２７】
治療組成物は、当該分野で公知の医学的デバイスを用いて投与され得る。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、ニードルレス皮下注射デバイス（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイスを用いて投与されてもよい。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては以下が挙げられる：制御された速度で医薬を分配するための注射用マイクロ注入ポンプを開示する、米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通じて医薬を投与するための治療用デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する、米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための可変流量移植可能注入装置（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｌｏｗ ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチ・チャンバ区画（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｍｂｅｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を有する浸透圧薬物送達システムを開示する、米国特許第４，４３９，１９６号；ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号。多くのこのような移植物、送達系およびモジュールが当業者に公知である。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明の治療用糖タンパク質は、インビボにおいて適切な分布を確実にするように処方され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢ（所望の場合）を横切ることを確実にするために、それらは例えば、リポソーム中に処方され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；同第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、選択的に特定の細胞または器官に輸送され、従って標的薬物送達を増強する１つ以上の部分を含んでもよい（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５（１９８９）を参照のこと。例示的な標的部分としては、葉酸塩またはビオチン（例えば、Ｌｏｗの米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８（１９８８））；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０（１９９５）；Ｍ．Ｏｗａｉｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０（１９９５））；サーファクタントタンパク質Ａレセプター（Ｂｒｉｓｃｏｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４（１９９５））、本発明の処方物を含み得る種々の種、および本発明の分子の成分；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０（１９９４））が挙げられる；また、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３（１９９４）；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３（１９９４）も参照のこと。本発明の１実施形態では、本発明の治療化合物は、リポソーム中に処方され；より好ましい実施形態では、このリポソームは、標的部分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソーム中の治療用化合物は、腫瘍または感染に対して近位である部位へのボーラス注射によって送達される。この組成物は、容易に注射可能になる程度まで液体でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入の作用に対して保存されなければならない。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明の組み換え糖タンパク質は、胎盤を横切った輸送を妨げるかまたは減少するように処方され得る。これは、当該分野で公知の方法によって、例えば、抗体のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）によって、またはＦ（ａｂ）２’フラグメントの使用によって、おこなわれ得る。さらなる参照は、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ Ｃ，Ｚｈｏｕ Ｚ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｂ，Ｋｅｅｎａｎ Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１５２：１７７〜１９０に対して；そしてＬａｎｄｏｒ Ｍ．（１９９５）Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｆｅｔａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｅｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７４：２７９〜２８３に対して、なされ得る。これは、糖タンパク質が反復自然流産を処置または予防するために用いられる抗体である場合は特に関係する。
【０１３０】
関節リウマチの「治療有効用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓａｇｅ）」は好ましくは、患者においてＡＣＲ２０という改善の予備的定義（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）を、さらに好ましくはＡＣＲ５０というＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、そしてさらにより好ましくは、ＡＣＲ７０というＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔを生じる。
【０１３１】
ＡＣＲ２０という改善の予備的定義は以下のように規定される：以下における２０％以上の改善：圧痛のある関節カウント（Ｔｅｎｄｅｒ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｕｎｔ）（ＴＣＪ）および腫れた関節カウント（Ｓｗｏｌｌｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｕｎｔ）（ＳＷＪ）、そして以下の５つの評価のうちの３つにおける２０％以上の改善：患者疼痛評価（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｐａｉｎ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＶＡＳ）、患者の全体的な評価（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｇｌｏｂａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＶＡＳ）、医師の全体的な評価（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＶＡＳ）、患者の自己評価した障害（Ｐａｔｅｎｔ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｓｓｅｄ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）（ＨＡＱ）、急性期反応物（Ａｃｕｔｅ Ｐｈａｓｅ Ｒｅａｃｔａｎｔ）（ＣＲＰまたはＥＳＲ）。
【０１３２】
ＡＣＲ５０およびＡＣＲ７０は、同じ方法で、それぞれ５０％以上および７０％以上の改善があると規定される。さらに詳細については、Ｆｅｌｓｏｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３８：７２７〜７３５（１９９５）を参照のこと。
【０１３３】
ある化合物がガンを阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予想する動物モデル系で評価され得る。あるいは、ある組成物のこの特性は、この化合物が阻害する能力を検査することによって評価され得、このようなインビトロにおける阻害は、当業者に公知のアッセイによる。治療化合物の治療上有効な量とは、腫瘍のサイズを減少するか、そうでなければ被験体における症状を改善し得る。当業者は、被験体のサイズ、被験体の症状の重篤度、および選択される特定の組成物または投与経路のような要因に基づいてこのような量を決定し得る。
【０１３４】
抗体が乾癬を処置または予防する能力はまた、当該分野で周知の方法に従って評価され得る。
【０１３５】
この組成物は、無菌であって、かつこの組成物がシリンジで送達可能である程度まで液体でなければならない。水に加えて、キャリアは、等張性緩衝化生理食塩水溶液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そしてサーファクタントの使用によって維持され得る。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる因子、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含むことによって達成され得る。
【０１３６】
上記のように、活性化合物が適切に保護される場合、その化合物は、例えば、不活性希釈液または同化可能な食用キャリアとともに経口投与されてもよい。
【０１３７】
本発明の他の実施形態は、以下の実施例に記載されるが、この実施例はさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体にわたって引用される、配列表、図面および全ての引用文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照によって明らかに本明細書に援用される。
【実施例】
【０１３８】
下に考察される全ての実施例では、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するＩＬ−１５に結合する、完全ヒトモノクローナル抗体は、例示的な組み換え糖タンパク質（「例示的な組み換え糖タンパク質」として実施例に言及される）として用いられた。しかし、任意の組み換え糖タンパク質のマンノース含量が、本明細書に考察されるように調整され得るということは当業者に明らかである。
【０１３９】
実施例１：浸透圧重量モル濃度は組み換え糖タンパク質のマンノース含量に影響する
糖タンパク質のマンノース含量に対する浸透圧重量モル濃度の影響を検討するために、例示的な組み換え糖タンパク質のマンノース含量を、シェーカーフラスコおよびバイオリアクター培養の両方において浸透圧重量モル濃度を変化させて分析した。図１に実証されるように、高マンノース含量は、培地の浸透圧重量モル濃度が約５００〜約５８０ｍＯｓｍｏ／Ｋｇと増大するにつれて、約１４％〜約２４％に増大した。
【０１４０】
さらなる実験では、２０ｍＭの浸透圧維持剤、ベタインを細胞培養物に添加して、浸透圧重量モル濃度と高マンノース含量との間の関係に関するさらなる証拠を提供する。以下の表は、このような実験の結果をまとめている。
【０１４１】
【表１】
高マンノース含量と浸透圧重量モル濃度との間の関係についてのさらなる証拠を図２に示す。細胞培養培地に対する約２０ｍＭのベタインの添加は、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を劇的に低下した。例えば、浸透圧重量モル濃度が約３００ｍＯｓｍ／Ｋｇであった場合、高マンノース含量は、約０ｍＭのベタインでの約９．５％から２０ｍＭのベタインの添加の際の約４．５％まで低下した（すなわち、高マンノース含量において約５％の低下）。同様に、浸透圧重量モル濃度が約４００ｍＯｓｍ／Ｋｇであった場合、高マンノース含量は、約０ｍＭのベタインでの約１６．５％から２０ｍＭのベタインの添加の際の約７．５％まで低下した（すなわち、高マンノース含量において約９％の低下）。さらに、約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧重量モル濃度では、高マンノース含量は、約０ｍＭのベタインでの約２５％から約２０ｍＭのベタインの添加の際の約９．５％まで低下した（すなわち、高マンノース含量において約１５．５％の低下）。
【０１４２】
実施例２：培養物中のＫ＋の濃度は、組み換え糖タンパク質のマンノース含量を調節するために制御され得る
さらなる実験では、細胞培養培地における１つ以上の塩の濃度を制御して、例示的な組み換え糖タンパク質のマンノース含量（例えば、高マンノース含量）を調節（例えば、減少）した。例示的な実験では、細胞培養培地におけるＫ＋の濃度を制御して、マンノース含量、そして詳細には例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に影響することが示された。詳細には、糖タンパク質を１５ｍＭまたは４５ｍＭのいずれかで発現する宿主細胞を培養することによって生成される、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量（すなわち、Ｍ５種またはそれ以上）を検査した。
【０１４３】
図３および４に示されるとおり、高マンノース含量のパーセンテージは、浸透圧重量モル濃度において混入物の増大につれて約３％〜約１３％に増大した。約３７０〜約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇの間の浸透圧重量モル濃度によって、糖タンパク質組成物の１０％を超える高マンノース含量の増大がもたらされた。
【０１４４】
さらなる実験では、図５に示されるように、細胞培養培地におけるＫ＋濃度についての最適濃度は、組み換え糖タンパク質の高マンノース含量の割合を１０％未満に維持するために約０ｍＭ〜約７０ｍＭであるということが実証された。
【０１４５】
実施例３：細胞培養培地におけるＮａ＋の濃度は、組み換え糖タンパク質のマンノース含量を調節するために制御され得る
さらなる実験では、Ｎａ＋の濃度は、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量を調節する（例えば、減少する）ように制御した。例示的な実験では、細胞培養培地におけるＮａ＋濃度の増大は、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量の割合の増大に寄与することが示された。
【０１４６】
図６は、高マンノース含量の割合を１０％未満に維持するためには、Ｎａ＋の最適濃度範囲が約０ｍＭ〜約２００ｍＭであることを示す。
【０１４７】
実施例４：アミノ酸は、組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に寄与する
別の実験では、細胞培養培地に存在するアミノ酸の影響を、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に対して検査した。図７に示されるように、組み換え糖タンパク質の高マンノース含量の割合は、供給培地における２０アミノ酸の濃度を倍にすることによって約４％から約１０％に増大する。この実験によって、アミノ酸の富化された培地は、このような培地で培養される宿主細胞によって発現される高マンノース糖タンパク質の含量の増大を生じることが実証された。
【０１４８】
実施例５：供給培地組成物の全体的な組成は、組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に寄与し得る
この実験では、種々のタイプの供給培地の影響を、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に対して検査した。詳細には、アミノ酸、Ｌアラニン、ＬアルギニンＨＣＬ、Ｌアスパラギン酸およびＬグルタミン酸を実質的に含まず、かつ未改変の培地に対して低濃度のＣａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌおよびピルビン酸ナトリウムを有する改変供給培地の効果を、例示的な組み換え糖タンパク質の高マンノース含量に対して検討した。図８に示されるとおり、高マンノース含量は、改変された供給培地が用いられる場合、約４％であって、そしてこの割合は、この未改変の供給培地が用いられる場合、約１３％まで増大した。
【０１４９】
実施例６：高マンノース含量に対する温度の影響
高マンノース含量に対する４つの異なる温度の影響を、２つの異なる供給培地を用いて検査した。表ＩＩの下のデータは、高マンノース含量の割合が温度の増大につれて増大したということを示す。
【０１５０】
【表２】
本明細書は、参照によって本明細書に援用される、本明細書内に援用される引用文献の教示を参照してほとんど完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本開示における実施形態の例示を提供しており、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本開示に包含されることを容易に認識する。引用される全ての刊行物および特許、ならびに本開示におけるアクセッション番号またはデータベース引用番号によって特定される配列は、その全体が参照によって援用される。参照によって援用される材料が本明細書と矛盾するかまたは一致しない程度までは、本明細書は、任意のこのような材料に優先する。本明細書における任意の引用文献の引用は、このような引用文献が本開示に対する先行技術であると承認するものではない。
【０１５１】
他に示さない限り、特許請求の範囲を含む本明細書に用いられる成分、細胞培養物、処理条件などの量を表す全ての数は、全ての場合に「約（ａｂｏｕｔ）」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。従って、逆に示さない限り、数的なパラメーターは、近似であって、本発明によって得られると考えられる所望の特性に依存して変化してもよい。他に示さない限り、一連の要素に先行する「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」という用語は、その一連におけるあらゆる要素を指すと理解されるべきである。当業者は、単なる慣用的な実験を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確定することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、シェーカーのコントロール（５０ｍＬ）およびバイオリアクター（１５０Ｌおよび５００Ｌ）において、抗体を発現する細胞を培養することによって産生されたＩＬ−１５に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の浸透圧重量モル濃度と高マンノース含量との間の相関を示すグラフである。
【図２】図２は、浸透圧維持剤、ベタインの添加と、ＩＬ−１５に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の高マンノース含量との間の相関を示すグラフである。
【図３】図３は、培養培地の浸透圧重量モル濃度と、Ｋ＋濃度との間の相関を示すグラフである。
【図４】図４は、１５ｍＭまたは４５ｍＭのいずれかのＫＣｌを含有する培地中で細胞を培養することによる、ＩＬ−１５に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の高マンノース含量と浸透圧重量モル濃度との間の相関を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｋ＋濃度と高マンノース含量との間の相関のグラフ表示であって、これは、高マンノース含量を１０％より低く維持するためのＫ＋の最適濃度が約０〜約７０ｍＭであるということを示している。
【図６】図６は、Ｎａ＋濃度と高マンノース含量との間の相関を示すグラフであって、これは、高マンノース含量を１０％より低く維持するためのＮａ＋の最適濃度が約０ｍＭ〜約２００ｍＭであるということを示している。
【図７】図７は、アミノ酸濃度と高マンノース含量との間の相関を示すグラフである。
【図８】図８は、用いられる供給培地のタイプと高マンノース含量との間の相関を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質の組成物を生成する方法であって、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度を有する培養培地中において、該組み換え糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項２】
低マンノース含量を有する、組み換え抗体、またはその抗原結合フラグメントの組成物を生成する方法であって、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度を有する培養培地中において、該組み換え抗体、またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項３】
ＩＬ−１５に結合する、組み換えヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントの組成物を生成する方法であって、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度を有する培養培地中において、該抗体、またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞を培養する工程を包含し、該抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその保存的アミノ酸置換を含む軽鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその保存的アミノ酸置換を含む重鎖可変領域とを含む、方法。
【請求項４】
前記培養培地の浸透圧重量モル濃度が約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇと約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇとの間である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地の浸透圧重量モル濃度が約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇと約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇとの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地の浸透圧重量モル濃度が約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇと約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇとの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地が、約７０ｍＭ以下の濃度のカリウム、約２００ｍＭ以下の濃度のナトリウム、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される塩を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記培養培地が、
（ａ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度のカリウム；
（ｂ）約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度のナトリウム；ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組み合わせ
からなる群より選択される塩を含む、方法。
【請求項９】
前記培養培地が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を実質的に含まない、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養培地が、ビオチン、Ｄ−カルシウムパントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌおよびシアノコバラミンからなる群より選択される１つ以上のビタミンを、約０．００００５ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの濃度で含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地が、グルコースを約１ｍＭ〜約９０ｍＭの濃度で含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養培地が、酵母抽出物、酵母加水分解物、ダイズペプトン、ダイズ加水分解物、コムギペプトンおよびコムギ加水分解物からなる群より選択される１つ以上のペプトンを、約０．５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの濃度で含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養培地が、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度を維持するために必要な量で少なくとも１つの浸透圧維持剤を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１４】
前記浸透圧維持剤が、ベタイン、グリシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−プロリンおよびその誘導体からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記浸透圧維持剤が、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度のベタインである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベタインが、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、約５〜約１４日間培養される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、約３１℃〜約３８℃の温度で培養される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法によって生成される組み換え糖タンパク質の組成物。
【請求項２２】
請求項２の方法によって生成される組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントの組成物。
【請求項２３】
請求項３に記載の方法によって生成される、ＩＬ−１５に結合する、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの組成物。
【請求項２４】
低マンノース含量を有する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項２５】
低マンノース含量を有する、ＩＬ−１５に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項２６】
低マンノース含量を有する、ヒトモノクローナル抗体の組成物であって、該抗体が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む軽鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む重鎖可変領域とを含む、ヒトモノクローナル抗体の組成物。
【請求項２７】
低マンノース含量を有する、ヒトモノクローナル抗体の組成物であって、該抗体が、配列番号８〜１０に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域と、配列番号５〜７に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む１つ以上のＣＤＲを含む重鎖可変領域とを含む、ヒトモノクローナル抗体の組成物。
【請求項２８】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
ヒトＩＬ−１５の過剰発現に関連するか、および／またはヒトＩＬ−１５誘発性作用の下方制御もしくは阻害が有益である、障害を処置または予防する方法であって、請求項３に記載の方法によって生成される単離された抗体を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記障害が、脈管炎、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、Ｔ細胞リンパ腫、およびＴ細胞白血病からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記障害が、炎症性腸疾患である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記炎症性腸疾患がクローン病またはセリアック病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記障害が、関節炎、結合組織病、眼科的障害、神経学的障害、胃腸および肝臓の障害、アレルギー障害、血液学的障害、皮膚障害、肺障害、悪性疾患、移植由来障害、内分泌学的障害、血管障害、婦人科的障害および感染性疾患からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物中の前記抗体の約１０％以下がＭ５またはそれ以上を含む、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物中の前記抗体の約５％以下がＭ５またはそれ以上を含む、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物中の前記抗体の約４％がＭ５またはそれ以上を含む、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３７】
サンプル中の糖タンパク質の高マンノース含量を検出、および／または定量する方法であって、該方法は、該サンプルをエンドグリコシダーゼ消化に供する工程、続いて該消化された糖タンパク質を電気泳動によって分離する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記エンドグリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＨを含み、かつ前記消化が３７℃で約２時間行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記電気泳動が、変性キャピラリー電気泳動を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記分離工程の前に、前記消化されたサンプルが還元剤を用いて還元される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記還元剤が、βメルカプトエタノールを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記糖タンパク質が、ハイブリドーマまたは真核生物宿主細胞から産生される抗体を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
低マンノース含量を有する組み換え糖タンパク質の組成物を生成する方法であって、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度を有する培養培地中において、該組み換え糖タンパク質を発現する宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項２】
低マンノース含量を有する、組み換え抗体、またはその抗原結合フラグメントの組成物を生成する方法であって、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度を有する培養培地中において、該組み換え抗体、またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項３】
ＩＬ−１５に結合する、組み換えヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントの組成物を生成する方法であって、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度を有する培養培地中において、該抗体、またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞を培養する工程を包含し、該抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその保存的アミノ酸置換を含む軽鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその保存的アミノ酸置換を含む重鎖可変領域とを含む、方法。
【請求項４】
前記培養培地の浸透圧重量モル濃度が約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇと約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇとの間である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地の浸透圧重量モル濃度が約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇと約５００ｍＯｓｍ／Ｋｇとの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地の浸透圧重量モル濃度が約２５０ｍＯｓｍ／Ｋｇと約３８０ｍＯｓｍ／Ｋｇとの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地が、約７０ｍＭ以下の濃度のカリウム、約２００ｍＭ以下の濃度のナトリウム、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される塩を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記培養培地が、
（ａ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度のカリウム；
（ｂ）約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度のナトリウム；ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組み合わせ
からなる群より選択される塩を含む、方法。
【請求項９】
前記培養培地が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を実質的に含まない、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養培地が、ビオチン、Ｄ−カルシウムパントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌおよびシアノコバラミンからなる群より選択される１つ以上のビタミンを、約０．００００５ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの濃度で含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地が、グルコースを約１ｍＭ〜約９０ｍＭの濃度で含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養培地が、酵母抽出物、酵母加水分解物、ダイズペプトン、ダイズ加水分解物、コムギペプトンおよびコムギ加水分解物からなる群より選択される１つ以上のペプトンを、約０．５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの濃度で含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養培地が、約６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ以下の浸透圧重量モル濃度を維持するために必要な量で少なくとも１つの浸透圧維持剤を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項１４】
前記浸透圧維持剤が、ベタイン、グリシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−プロリンおよびその誘導体からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記浸透圧維持剤が、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度のベタインである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベタインが、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、約５〜約１４日間培養される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、約３１℃〜約３８℃の温度で培養される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法によって生成される組み換え糖タンパク質の組成物。
【請求項２２】
請求項２の方法によって生成される組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントの組成物。
【請求項２３】
請求項３に記載の方法によって生成される、ＩＬ−１５に結合する、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの組成物。
【請求項２４】
低マンノース含量を有する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項２５】
低マンノース含量を有する、ＩＬ−１５に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項２６】
低マンノース含量を有する、ヒトモノクローナル抗体の組成物であって、該抗体が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む軽鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む重鎖可変領域とを含む、ヒトモノクローナル抗体の組成物。
【請求項２７】
低マンノース含量を有する、ヒトモノクローナル抗体の組成物であって、該抗体が、配列番号８〜１０に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域と、配列番号５〜７に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む１つ以上のＣＤＲを含む重鎖可変領域とを含む、ヒトモノクローナル抗体の組成物。
【請求項２８】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
ヒトＩＬ−１５の過剰発現に関連するか、および／またはヒトＩＬ−１５誘発性作用の下方制御もしくは阻害が有益である、障害を処置または予防する方法であって、請求項３に記載の方法によって生成される単離された抗体を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記障害が、脈管炎、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、Ｔ細胞リンパ腫、およびＴ細胞白血病からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記障害が、炎症性腸疾患である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記炎症性腸疾患がクローン病またはセリアック病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記障害が、関節炎、結合組織病、眼科的障害、神経学的障害、胃腸および肝臓の障害、アレルギー障害、血液学的障害、皮膚障害、肺障害、悪性疾患、移植由来障害、内分泌学的障害、血管障害、婦人科的障害および感染性疾患からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物中の前記抗体の約１０％以下がＭ５またはそれ以上を含む、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物中の前記抗体の約５％以下がＭ５またはそれ以上を含む、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物中の前記抗体の約４％がＭ５またはそれ以上を含む、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３７】
サンプル中の糖タンパク質の高マンノース含量を検出、および／または定量する方法であって、該方法は、該サンプルをエンドグリコシダーゼ消化に供する工程、続いて該消化された糖タンパク質を電気泳動によって分離する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記エンドグリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＨを含み、かつ前記消化が３７℃で約２時間行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記電気泳動が、変性キャピラリー電気泳動を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記分離工程の前に、前記消化されたサンプルが還元剤を用いて還元される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記還元剤が、βメルカプトエタノールを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記糖タンパク質が、ハイブリドーマまたは真核生物宿主細胞から産生される抗体を含む、請求項３７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５２３４５０（Ｐ２００９−５２３４５０Ａ）
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５１４８２（Ｐ２００８−５５１４８２）
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００２００７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８７３８４
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００２００７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８７３８４
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
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