組成物を細胞にデリバリーするための医学用システム及び方法
本発明は、組成物を細胞にデリバリーするための医学用装置と方法を提供する。組成物は、人工ウイルスベクター、特に好ましくは人工アデノ随伴ウイルスベクターを含む。そのような組成物は、人工ウイルスベクターを血液−脳バリヤーを通してデリバリーするのに有用であり得る。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
この出願は、その全体を引用により本明細書に編入する、２００４年６月２１日出願の米国仮出願連続番号６０／５８１，７３０の利益を主張する。
背景
脳への生物学上活性な因子のデリバリーは、様々な神経障害を治療する重要且つ挑戦的な側面である。いくつかの神経障害の治療のために、脳細胞が、ＤＮＡ、例えば失われた遺伝子を発現する（即ち、遺伝子治療）、及び／又はＲＮＡ、例えば小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現することを誘導する生物学上活性な因子（例えば、治療剤）を脳にデリバリーすることが望まれる。
【０００２】
神経障害の治療のための遺伝子治療に対するいくつかのアプローチは、非ウイルス又はウイルスベクターの脳組織への直接の外科的デリバリーを含むが、非ウイルス及びウイルスベクターは一般に血液−脳バリヤー（ＢＢＢ）を通過しないため、通常は必要とされる。これらのアプローチは、脳の標的化されたエリアへのウイルスベクターの十分な分配と拡散を達成する困難により、そして患者内で免疫反応を生じさせるウイルスベクターの可能性により、制限される。ベクターの脳組織への拡散の増強を達成するための一つのアプローチは、「対流増強デリバリー（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」の技術を用いることであり、それにより、非ウイルス又はウイルスベクターは、低い流速にて長い期間にわたり、ベクターを組織へ分配することを増強するための圧力と流量を提供するポンプを用いて投与される。対流増強デリバリーは、齧歯類及び霊長類の脳の実質上の三次元領域への分子及びウイルス粒子のデリバリーを生じることが示されたが、ヒトの脳の三次元体積へのこのデリバリーアプローチのスケールアップは、技術的挑戦として残されたままである。特定の神経疾患（例えば、アルツハイマー病）の遺伝子又は蛋白質デリバリー又は抑圧デリバリーを用いた有効な治療は、ヒト大脳のほとんどへの生物学上活性な因子のデリバリーを、おそらくは必要とする。他の神経障害、例えば、パーキンソン病及びハンチントン病においては、疾患のプロセスにより本質的には影響される脳の解剖組織の制限された領域、例えば、黒質又は線条体があるとしても、そして疾患の主要な兆候をもたらすとしても（例えば、運動異常、硬直（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）等）、患者は、疾患プロセスが追加の兆候を誘導する、脳の広い領域の処置からさらに利益をおそらくは得ることになる（例えば、機能低下及び認識不足）。
【０００３】
例えば、視床下核への遺伝子治療のデリバリーのためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用を含む、定位神経外科手術を用いて脳へ遺伝子又は遺伝子抑圧剤をデリバリーするためのウイルスベクターを用いたアプローチは、相当有望であることが示された。しかしながら、遺伝子又は蛋白質抑圧治療を運ぶウイルスベクターをデリバリーするための定位神経外科手術の有用性は、以下の因子の一つ又はそれ以上により制限され得る。定位神経外科手術は、いつも低レベルの外科手術の危険性を含み、例えば、血管を偶発的に穿孔することであり、脳出血及び死をもたらし得る。ウイルスベクターの脳組織の大きな領域への分散は、対流増強デリバリー及び最適のベクター、カテーテルデザイン、及び外科手術の技術を用いてさえも、何が血流、例えば分配系を用いて達成され得るかに関して、おそらくは制限される。治療用の十分な量のウイルス粒子（例えば、キャプシッドプラスＤＮＡ有効搭載量）の製造は、ありそうであるが、ＤＮＡのみの生産に比較してコストがかかる。ウイルス粒子（即ち、キャプシッド蛋白質）は免疫原性であるかもしれず、感作された個体において逆の作用を引き起こす。脳に投与されたときのいくつかのウイルス（例えば、ＡＡＶ）に対しての免疫応答は最小らしいが、繰り返しの治療投与に特別な有力な限界を残す。
【０００４】
単なる皮下注射よりも非侵入性の経路により生物学上活性な因子を投与することは、有利である。このアプローチにより、生物学上活性な因子はＢＢＢを通して内生ＢＢＢ輸送系により脳に対して生物学上活性な因子を標的化することにより、デリバリーすることができる。脳中のＤＮＡ又はＲＮＡの発現は、血液に注射された生物学上活性な因子がＢＢＢ、例えば受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＡ）によってのみならず、脳細胞膜（ＢＣＭ）、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシス（ＲＭＥ）を通して脳中の標的細胞に輸送されることを必要とする。さらに、内生ＢＢＢ輸送系を、脳に対して非侵入性に生物学上活性な因子を標的化するために用いることは、血流中で安定な生物学上活性な因子の適切な製剤の開発も必要とする。
【０００５】
プラスミドＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡを含む組成物を用いて、血液−脳バリヤーを通って脳細胞へ、全霊長類の脳に遺伝子治療をデリバリーするための有効な方法は、最近、米国特許番号６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）により開示された。プラスミドＤＮＡを全霊長類の脳にデリバリーするためのこの方法の報告された能力は、印象的な技術的ブレイクスルーからなる。しかしながら、開示された方法の治療用途は本明細書において以下に示す因子の一つ又はそれより多くにより制限されるかもしれない。プラスミド又はＤＮＡからの遺伝子発現は、一般に一時的である（例えば、日又は週の期間に制限される）。開示された組成物の皮下デリバリーは、全てのからだの器官の意図されない処置をもたらし得るので、副作用をもたらす可能性がある。最後に、皮下デリバリーは、脳に意図された用量がからだの他の部分へデリバリーされるために、用量の損失をもたらし得る。
【０００６】
即ち、生物学上活性な因子を脳へデリバリーするための新規な組成物及び方法が必要とされる。
発明の概要
一つの側面において、本発明は、血液−脳バリヤーを通して生物学上活性な因子をコードするＤＮＡをデリバリーするための医学的システムを提供する。
【０００７】
一つの態様において、上記システムは、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテル；及びカテーテルへ、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を輸送する手段；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む。
【０００８】
別の態様において、上記システムは、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテル；及びカテーテルへ受容体特異的リポソームを含む組成物をデリバリーするための手段を含むが、受容体特異的リポソームは、外部表面及び内部区画を有し、リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤を含み、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっている。
【０００９】
別の側面において、本発明は、脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための方法を提供する。当該方法は、受容体特異リポソームであって、リポソームは外部表面及び内部区画を有し、リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているものを含む組成物を患者に投与することを含む。
【００１０】
別の側面において、本発明は、ＤＮＡを細胞にデリバリーするための方法を提供する。当該方法は、受容体特異的ナノコンテナーを含む組成物であって、受容体特異的ナノコンテナーは外部表面及び内部区画を有し、ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっている、組成物を患者に投与することを含む。
【００１１】
別の側面において、本発明は、脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための方法を提供する。当該方法は、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む組成物を患者に投与することを含む。
【００１２】
別の側面において、本発明は、病原性蛋白質により引き起こされる神経変性障害を治療する方法を提供する。
一つの態様において、上記方法は、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含む。
【００１３】
別の態様において、上記方法は、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして受容体特異リポソーム及び受容体特異リポソームのための薬学上受容可能な担体を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含むが、但し、受容体特異的リポソームは外部表面及び内部区画を有し、リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているものを含む。
【００１４】
別の側面において、本発明は、蛋白質不在下で引き起こされる神経疾患を治療する方法を提供する。
一つの態様において、上記方法は、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイウス（ＡＡＶ）ベクター、及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含む。
【００１５】
別の態様において、上記方法は、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして受容体特異的リポソーム及び受容体特異リポソームのための薬学上受容可能な担体を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含むが、但し、受容体特異的リポソームは外部表面及び内部区画を有し、リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているものを含む。
【００１６】
別の側面において、本発明は、脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための組成物を提供する。当該組成物は、受容体特異リポソームであって、外部表面及び内部区画を有するリポソームであり、但し、リポソームの内部区画内に人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが位置し；ＡＡＶベクターは、生物学上活性な因子をコードし、一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているものを含む。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ＤＮＡを細胞にデリバリーするための組成物を提供する。当該組成物は、受容体特異的ナノコンテナーであって、但し、受容体特異的ナノコンテナーは外部表面及び内部区画を有し、ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含み；細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤を含む。
【００１８】
別の側面において、本発明は、脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための組成物を提供する。当該組成物は、生物学上活性な因子をコードする人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む。
【００１９】
別の側面において、本発明は、生物学上活性な因子をコードする人工ＡＡＶベクター；及びそのようなベクターを作成して使用するための方法を提供する。
一つの態様において、本発明は、５プライムから３プライムの方向に向かって、５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含む人工ＡＡＶベクターを提供する。そのようなベクターを作成する方法も提供される。
【００２０】
別の側面において、本発明は、生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡのデリバリーのための人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、各鎖の５プライムエンド及び３プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲを有する直鎖状ＤＮＡを含む人工ＡＡＶベクターを提供する。
【００２１】
本発明は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの対流増強デリバリー、定位神経外科手術デリバリー、及び／又はプラスミドＤＮＡ又はＲＮＡを有する組成物の血液−脳バリヤーを通した皮下デリバリーを含む、生物学上活性な因子のデリバリーのための他の方法を超えた利点を提供することができる。
【００２２】
遺伝子又は遺伝子抑圧因子を患者の脳へデリバリーするための人工ＡＡＶベクターの使用は、プラスミドＤＮＡをデリバリーすること、又は実際のＡＡＶウイルス粒子をデリバリーすることを超えた多数の利点を有し得る。プラスミドＤＮＡよりも、ＡＡＶベクターのＤＮＡを脳へデリバリーする一つの可能な利点は、霊長類の脳内でのＡＡＶによりデリバリーされた遺伝子構築物の発現が少なくとも３から４年は継続することが知られていることであり、一方、プラスミドからの遺伝子構築物の発現は一時的である。ＡＡＶウイルス粒子のデリバリーを超えた合成ＡＡＶベクターのＤＮＡをデリバリーする利点は、いくつかあり得る。第１に、まさにＤＮＡのデリバリーはＡＡＶウイルスキャプシッドの患者脳へのデリバリーを回避できる。ＡＡＶウイルスキャプシッド蛋白質が免疫応答をおそらくは誘導するから、ウイルス粒子をデリバリーする必要が無しで済むということが、治療に対する逆免疫反応の危険のほとんどを回避することができる。さらに、ＤＮＡのデリバリーは、ＡＡＶキャプシッドを作成してＤＮＡをウイルスキャプシッドにパッケージするための操作されて且つ培養された細胞の使用を必要とする難しい製造工程である、完全なＡＡＶ粒子を生産する必要性を回避できる。最後に、ＡＡＶ粒子よりもＤＮＡをデリバリーすることは、約４，７００塩基のＤＮＡという、ＡＡＶキャプシッド内にパッケージできるＤＮＡの長さに対する自然の制限を回避できる。このサイズの制限は遺伝子抑圧のための構築物のデリバリーに関する問題ではないが（例えば、小干渉ＲＮＡをコードするＤＮＡ）、欠落した遺伝子の配列が４，７００塩基を超えるなら、それは欠落した遺伝子のデリバリーの制限になり得て、ＡＡＶの遺伝子治療のためのベクターとしての使用に関する制限として注目された。
定義
「アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン−１、アタキシン−３、及び／又はアトロピン−１蛋白質」は、それぞれ、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病）、ベータ部位ＡＰＰ−分割酵素（ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む））（アルツハイマー病）、ハンチンチン（ハンチントン病）、アタキシン−１（脊髄小脳変形症１型）、アタキシン−３（脊髄小脳変形症３型）、及び／又は歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）遺伝子により発現され及び／又はコードされるアミノ酸配列を含む、蛋白質又はその変異蛋白質誘導体を意味する。
【００２３】
本明細書において使用される「細胞」は、その生物学上の意味にて使用され、そして多細胞生物全体を意味しない。細胞は生物中に存在してよく、ヒトであってよいが、好ましくは哺乳類起源、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、サル（ａｐｅ）、モンキー、ブタ、イヌ、ネコ、等が好ましい。しかしながら、小干渉ＲＮＡを生成するためのいくつかの工程は、原核生物（例えば、細菌細胞）又は真核生物（例えば、哺乳類細胞）の使用を必要とするかもしれず、それにより、用語「細胞」の範囲にも含まれる。
【００２４】
「相補性」は、一つ又はそれより多くの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む分子がワトソンクリック対又は他の非伝統的種類の何れかにより一つ又はそれより多くの核酸を含む別の分子と水素結合を形成できることを意味する。
【００２５】
用語「均等な」ＤＮＡは、異なる生物（例えば、ヒト、齧歯類、霊長類、ウサギ、ブタ及び微生物）中の同じ蛋白質をコードするＤＮＡに対して相同性（一部又は全体）を有する天然に生じるＤＮＡを含むことを意味する。均等なＤＮＡ配列は、例えば、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、イントロン、イントロン−エクソンジャンクション、小干渉ＲＮＡ標的化部位及び等などの領域も含むことができ、任意に、感染性ウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のＤＮＡに取り込まれる。
【００２６】
用語「機能上均等な」は、参照配列又は蛋白質に機能上類似あらゆる誘導体を意味する。特に、用語「機能上均等な」は、生物学上の機能には顕著な逆作用なしにヌクレオチド塩基が付加されるか、欠失するか、又は置換された誘導体を含む。
【００２７】
本明細書において使用される用語「生物学上活性な」は、「因子（ａｇｅｎｔ）」又は「ｓｉＲＮＡ」と共に使用され、因子又はｓｉＲＮＡが例えば細胞の代謝、細胞の構造、細胞の機能を修飾することを含むあらゆる様式にて細胞を修飾し、及び／又は、因子又はｓｉＲＮＡを含む細胞が検出されることを可能にさせ得ることを意味する。生物学上活性な因子及び／又はｓｉＲＮＡの例は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びその混合物を含む。生物学上活性な因子又はｓｉＲＮＡは、治療用（即ち、疾患を治療又は予防できる）又は非治療用（即ち、疾患の治療又は予防には向けられない）であってよい。非治療用の生物学上活性な化合物は、例えば、特定の細胞の存在を検出し、細胞を識別し、そして／又は標的グループが特定の組織を標的とするように機能するか否かを検出するために使用することができるマーカーを含む、検出用因子又は診断用因子を含む。本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの何れかのあらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、そして二重鎖及び単鎖のＤＮＡ及びＲＮＡ、その混合物を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、コーディング配列及びノンコーディング配列、例えば、制御配列を含む異なる機能を有するヌクレオチド配列を含んでよい。コーディング配列、ノンコーディング配列、及び制御配列は、以下に定義される。ポリヌクレオチドは、天然源から直接得ることができ、あるいは、組換え、酵素的又は化学的技術の助けを借りて製造することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ベクターの一部又は断片であり得る。
【００２８】
「コーディング配列」又は「コーディング領域」は、ポリペプチドをコードし、そして適切なプロモーターの下に配置されたときに、コードされたポリペプチドを発現するポリヌクレオチドである。コーディング領域の境界は、一般には、その５−プライムエンドの翻訳開始コドンと３プライムエンドの翻訳停止コドンにより決定される。制御配列は、作動可能なように連結されたコーディング領域の発現を制御するヌクレオチド配列である。制御配列の非現定例は、プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳停止部位、転写終結因子（例えば、ポリアデニル化シグナルを含む）、及び介在配列（イントロン）を含む。「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、そう記載された成分がそれらの意図された様式にて機能するようにそれらを許容する関係にある並列を意味する。制御配列は、コーディング領域の発現が制御配列とに適合可能な条件下で達成されるような様式にて連結される（ｊｏｉｎｅｄ）場合に、コーディング配列に作動可能に連結される。用語「遺伝子」は、コーディング配列又はコーディング領域を含むポリヌクレオチドを含むことを意味する。
【００２９】
用語「ベクター」は、当業界で一般に知られており、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、等を含み、本発明のＤＮＡが挿入され得て、そしてＲＮＡが転写され得る、ＤＮＡ媒体として機能することができる。用語「ベクター」は、所望の核酸をデリバリーするのに使用されるこれらの核酸及び／又はウイルスに基づく技術の何れかを意味する。莫大な種類のベクターが存在して、当業界で公知である。
【００３０】
用語「発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写されるプロセスを規定する；ＲＮＡはさらに成熟小干渉ＲＮＡ又は細胞が蛋白質を生成し得るｍＲＮＡにさらに加工されてよい。
用語「発現ベクター」は、上で記載されたようなベクター又は媒体を規定するが、細胞への形質転換後に挿入された配列の発現を可能にするようにデザインされる。クローン化された遺伝子（挿入された配列）は、通常、プロモーターのようなコントロール要素配列のコントロール下に配置される。そのようなコントロール配列下のクローン化された遺伝子の配置は、しばしば、コントロール要素又は配列に作動可能に連結されたと称される。
【００３１】
「プロモーター」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを直接又は間接に結合することができて且つ下流の（３−プライム方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域を意味する。本発明の目的のためには、プロモーターは、その３プライム末端において転写開始部位により結合されて、上流に伸びることにより（５−プライム方向）、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルにて転写を開始するのに必要な塩基又は要素の最小の数を含む。プロモーターは、転写開始部位（Ｓ１ヌクレアーゼにより都合よく規定される）並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に必須の蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）において見いだされる。真核生物のプロモーターは、しばしば、いつもではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、−１０及び−３５コンセンサス配列を含み、転写を開始するために機能する。
【００３２】
「相同性」は、２つ又はそれより多い核酸分子のヌクレオチド配列が部分的又は全体に同一であることを意味する。
「高度に保存された配列領域」は、標的遺伝子内の一つ又はそれより多くの領域のヌクレオチド配列が１つの世代が他方とは顕著に異ならないか又は一つの生物システムが他方とは顕著に異ならないことを意味する。
【００３３】
「阻害する」又は「阻害的（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）」は、標的遺伝子の活性又は標的遺伝子をコードするｍＲＮＡｓ又は均等なＲＮＡｓのレベルが用意された小干渉ＲＮＡの不在下で観察されるのよりも低く低下することを意味する。好ましくは、阻害は、小干渉ＲＮＡの不在下よりも少なくとも１０％未満、２５％未満、５０％未満、７５％未満、８５％未満、又は９５％未満である。
【００３４】
「阻害された発現」又は「蛋白質の抑圧」は、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン−１、アタキシン−３、及び／又はアトロピン−１蛋白質のｍＲＮＡレベルの低下を意味し、即ち、各蛋白質のレベルの疾患又は症状の兆候のある程度の回復までの低下を意味する。
【００３５】
「ＲＮＡ」は、リン酸−リボース（糖）バックボーンによりつながれたリボヌクレオチドからなる分子であるリボ核酸を意味する。「リボヌクレオチド」は、グアニン、シトシン、ウラシル又はアデニン又はベータ−Ｄ−リボ−フラノースモイエティの２’位においてヒドロキシル基を有するいくつかのヌクレオチドを意味する。当業界では知られているとおり、遺伝子コードは、チミジンをＤＮＡ塩基中の塩基として用い、そしてＲＮＡ中ではウラシルを用いる。当業者は、書かれたＤＮＡ配列を書かれたＲＮＡ配列に変換するために、又はその逆において、書かれた核酸配列中においてチミジンをウラシルに如何に置換するかを知っている。
【００３６】
「患者」は生物を意味し、外植された（ｅｘｐｌａｎｔｅｄ）細胞のドナー又はレシピエント又は細胞自身である。「患者」は、発明の核酸分子が投与され得る生物も意味する。好ましくは、患者は、哺乳類又は哺乳類細胞、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、サル、モンキー、ブタ、イヌ、ネコ、等であるか、又は移植のために使用されるこれら動物の細胞である。より好ましくは、患者はヒト又はヒト細胞である。
【００３７】
用語「シヌクレイン」は、アルファ−シヌクレイン（特に、ヒト又はマウス）又はベータ−シヌクレイン（特に、ヒト又はマウス）を意味してよい。ヒトアルファ−シヌクレインをコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＡＦ１６３８６４にて利用可能である。ヒトアルファ−シヌクレイン配列の２つのバリアントが、受け入れ番号ＮＭ０００３４５及び受け入れ番号ＮＭ＿００７３０８にて利用可能である。マウスアルファ−シヌクレインは受け入れ番号ＡＦ１６３８６５にて利用可能である。
【００３８】
用語「ＢＡＣＥ１」は、ベータ部位アミロイド前駆体蛋白質分割酵素タイプ１（特に、人又はマウス）を意味してよい。ＢＡＣＥ１のいくつかのバリアントは配列決定され、バリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む。いくつかの科学文献においては、ＢＡＣＥ１はＡＳＰ２及びメンパシン２（Ｍｅｍｐａｓｉｎ２）としても知られる。ヒトＢＡＣＥ１、及びそれに近縁のバリアントをコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＮＭ＿１３８９７１、受け入れ番号ＮＭ＿１３８９７２、受け入れ番号ＮＭ＿１３８９７３、及び受け入れ番号ＮＭ＿０１２１０４にて利用可能である。マウス相同体の配列は受け入れ番号ＮＭ＿０１１７９２にて利用可能である。
【００３９】
用語「ハンチンチン」はハンチントン病遺伝子（ＩＴ−１５）（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＩＴ−１５をコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＡＨ００３０４５にて利用可能である。マウスの配列は受け入れ番号Ｕ２４２３３にて利用可能である。
【００４０】
用語「アタキシン−１」は、脊髄小脳変形症１型遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＳＣＡ−１をコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＮＭ＿０００３３２にて利用可能である。マウスのｓｃａ１は受け入れ番号ＮＭ＿００９１２４にて利用可能である。
【００４１】
用語「アタキシン−３」は、脊髄小脳変形症３型遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＳＣＡ−３をコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＮＭ＿００４９９３（スプライスバリアント１）及び受け入れ番号ＮＭ＿０３０６６０（スプライスバリアント２）にて利用可能である。（マウスの相同体の配列はまだ利用可能ではない。）
用語「アトロピン−１」は、歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＤＲＰＬＡをコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＸＭ＿０３２５８８にて利用可能である。マウスの配列は受け入れ番号ＸＭ＿１３２８４６にて利用可能である。
【００４２】
用語「代謝の先天的エラー」は、からだが通常は食物をエネルギーに変換（即ち、食物を代謝）できない稀な遺伝的障害を意味する。当該障害は、通常、食物の成分を分解する生化学経路に関与する酵素の欠陥により引き起こされる。
【００４３】
用語「リソソーム蓄積症」（ＬＳＤ）は、リソソームの酵素の何れかの機能発現の欠陥により特徴付けされる遺伝的疾患を意味する。
用語「リソソーム」は、多くの物質を分解することができる多数の異なる消化酵素を含む真核生物の膜結合器官を意味する。
【００４４】
用語「修飾」は、参照配列又は蛋白質に実質上類似の誘導体を含む。
「小干渉ＲＮＡ」は、特定の遺伝子標的に対して基質結合領域中に相補性を有する分子であって、標的ＲＮＡを分割するように宿主細胞中で特異的に酵素をガイドするように作用する分子である。即ち、その配列の特異性及びそのＲＮＡ標的に対する相同性のために、小干渉ＲＮＡはＲＮＡ鎖の分割を誘導することができて、それにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができるが、なぜならばもはや転写されないからである。これらの相補領域は、小干渉ＲＮＡの標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションを可能にさせ、即ち分割を許容する。１００％の相補性が生物活性にはしばしば必要であり、よって好まれるが、９０％ほどの相補性も、この発明においては有用である。本出願において記載された特定の小干渉ＲＮＡは限定することを意味せず、そして当業者は、この発明の小干渉ＲＮＡにおいて重要な全ては、一つ又はそれより多い標的核酸領域に相補な特定の基質結合部位を有することであることを認識する。対立遺伝子間を選択する場合に、長さの選択ももっとも重要な因子であるが、なぜならば、パーセント相補性及び対立遺伝子の相違を識別する能力に関与する他の因子だからである。
【００４５】
小干渉ＲＮＡｓは、標的ＲＮＡ（通常はメッセンジャーＲＮＡ）の一部に相補性を有する（即ち、塩基対を形成できる）二重鎖ＲＮＡ因子である。通常、そのような相補性は、１００％であるが、所望ならそれより低く、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。例えば、２１塩基のうちの１９塩基が塩基対合してよい。いくつかの例においては、様々な対立遺伝子バリアント間の選択が望まれる場合、標的遺伝子に対する１００％相補性が必要とされ、それにより、他の対立遺伝子配列から標的配列を有効に識別される。対立遺伝子間で選択される場合、長さの選択も重要な因子であるが、なぜならばそれはパーセント相補性及び対立遺伝子の相違を識別する能力に関係する他の因子だからである。
【００４６】
小核酸ＲＮＡ配列は、相補塩基対相互作用を通して小干渉ＲＮＡと標的ＲＮＡを結び合わせるのに十分な長さである必要がある。発明の小干渉ＲＮＡは、長さを変えてよい。小干渉ＲＮＡの長さは、好ましくは、１０ヌクレオチドより長いか又は等しく、標的ＲＮＡと安定に相互作用するのに十分な長さであり；特定すれば１５−３０ヌクレオチド；より特定すれば１５から３０ヌクレオチドの間のあらゆる整数、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０である。「十分な長さ」は、予測された条件下で意図された機能を提供するのに十分長い長さである１５ヌクレオチドより長いか又は等しいオリゴヌクレオチドを意味する。「安定に相互作用する」は、小干渉ＲＮＡと標的核酸との相互作用を意味する（例えば、生理条件下で標的内の相補ヌクレオチドと水素結合を形成することにより）。
【００４７】
５プライムから３プライム方向へのＤＮＡ鎖中の「逆相補性」は、ワトソン−クリック又は他の塩基対ルールに従い対応する相補塩基と逆の配置にあるＤＮＡ鎖である。
特定の態様の詳細な説明
本発明は、ＤＮＡを標的部位（例えば、細胞へ又は血液−脳バリヤーを通して）へデリバリーするための医学用のシステムと方法を提供する。当該細胞はインビボ又はエクスビボであってよい。本明細書にて使用される用語「エクスビボ」は、被験者の体から除去された、例えば、単離された細胞を意味する。エクスビボ細胞は、例えば、初代細胞（例えば、被験者から最近単離され且つ組織培養培地中で限定された成長又は保持が可能な細胞）、及び培養細胞（例えば、組織培養培地中で継続した成長又は保持が可能な細胞）を含む。本明細書にて使用される用語「インビボ」は、被験者の体の中の細胞を意味する。
【００４８】
医学用システムは、患者の脳を供給する血管内に位置するその遠位エンドを有する神経血管カテーテルを含む。任意に、上記システムは、上記組成物を患者の血流にデリバリーための移植可能なポンプをさらに含む。医学用システムは、本明細書にて記載される組成物をカテーテルにデリバリーするための手段をさらに含む。そのような組成物を細胞へ又は血液−脳バリヤーを通して脳内での発現のためにデリバリーする方法も、本明細書にて記載される。
【００４９】
簡単に言えば、本発明において開示されて使用された組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（単鎖また二重鎖ベクター；好ましくは単鎖ベクター）であって、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーする成分（例えば、本明細書にて記載された受容体−特異的リポソーム）を含む。いくつかの態様において、人工ＡＡＶベクターは、５プライムから３プライム方向に、５プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）；生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ；及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含む。別の態様において、人工ＡＡＶベクターは、５プライムから３プライム方向に、５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補鎖；及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含む。また別の態様において、人工ＡＡＶベクターは、各鎖の５プライム及び３プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む。好ましくは、人工ＡＡＶベクターは、キャプシッドをコードするためのコーディング配列を含まず、即ち、好ましいベクターはウイルスキャプシッド構造内に封入されない。人工ＡＡＶベクターを作成する方法も開示される。
【００５０】
ＤＮＡが小干渉ＲＮＡをコードする態様に関して、上記組成物は、とりわけ、病原性蛋白質により誘導される様々な神経変性障害を治療するのに有用であり得る。ＤＮＡが蛋白質をコードする態様に関して、上記組成物は、とりわけ、蛋白質の不在により誘導される様々な神経変性障害を治療するのに有用であり得る。
【００５１】
いくつかの態様において、上記組成物は、受容体特異的リポソーム及び受容体特異的リポソームに関して薬学上受容可能な担体を含み、受容可能特異的リポソームは：外部表面と内部区画を有するリポソーム；リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜を標的とする因子；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤を含み、但し、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面に接続されている。
【００５２】
別の態様において、上記組成物は、受容体特異的ナノコンテナー（即ち、数ナノメートルまたはそれ未満の桁で少なくとも一つの寸法を有するコンテナー）及び受容体特異的ナノコンテナーのための薬学上受容可能な担体を含み、但し、受容可能特異的ナノコンテナーは、外部表面と内部区画を有するナノコンテナー；ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的因子；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤を含み、但し、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりナノコンテナーの外部表面に接続されている。
医学用装置
本発明は、患者の血流に組成物をデリバリーするための神経血管カテーテル及び任意の移植可能なポンプを含む医学用装置を提供する。神経血管カテーテルの遠位のデリバリーエンドは、脳を供給する血管の中に配置される。急な使用のためには、神経血管カテーテルの近位エンドを導入点（例えば、大腿動脈）にて患者のからだの外に残し、そして適切な液体溶液中の組成物を患者の脳にデリバリーするように外科医により使用される。この場合のデリバリーは急であるが、それにもかかわらず、本明細書の以下において記載されるとおり、治療は長く続くかもしれない。
【００５３】
あるいは、神経血管カテーテルの近位エンドは任意の移植可能なポンプに取り付けることができ、そしてポンプとカテーテルの両方を長期にわたりからだに移植する。後者の場合、外科医が経皮により組成物の丸剤注射を患者の脳を供給する血管へのカテーテルを通して繰り返すことにより、ポンプは「カテーテルアクセス点」を提供する。ポンプは、ヘパリン化塩溶液を供給するか、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｐＴＡ）、又は丸剤注射のためのカテーテルの使用の間において神経血管カテーテルを通して低速で連続してポンプ注入される類似の因子を希釈するために使用される液体リザーバーを提供する。目的は、カテーテルの遠位エンドに血液クロットが形成されてカテーテルの内腔を塞いで患者に塞栓症ストロークの危険をポーズする（ｐｏｓｉｎｇ）ことを阻止するためである。
病原性蛋白質により誘導される神経変性障害
いくつかの神経変性障害、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型及び３型、及び歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）に関して、疾患の全体の病理の進行に関与する蛋白質は同定されている。これらの神経変性疾患に関して現在治療法はない。これらの疾患は段々と衰弱し、最後には死に至る。
【００５４】
これらの神経変性疾患（特に、アルツハイマー病及びパーキンソン病）のさらなる問題は、それらの罹患率が増加し続け、即ち、重大な好適な健康問題を巻き起こしている。最近の研究は、それぞれ、これらの疾患の各々の病理における主要な因子として、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病）、ベータ−アミロイド分割酵素１（ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む））（アルツハイマー病）、ハンチンチン（ハンチントン病）、及びアタキシン−１（脊髄小脳変形症１型）に焦点が注がれている。
【００５５】
パーキンソン病及びアルツハイマー病の神経変性の進行は、シナプスの損傷及びアストログリオーシスに付随する選択された神経細胞集団の広範囲の損失により特徴付けされる。アルツハイマー病の病理上の顕著な特徴は、アミロイドプラークの形成、神経繊維のもつれ（ｔａｎｇｌｅｓ）及び神経の糸（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌ ｔｈｒｅａｄ）の形成を含む；パーキンソン病の病理上顕著な特徴は、レビー小体と呼ばれる神経内含有物の形成及び黒質中のドーパミン作用性ニューロンの損失を含む。細胞の機能不全と死を誘発する機構は不明であるが、一般的見解は、神経の変性が特定の神経細胞蛋白質、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病）及びアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）（アルツハイマー病−ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）によりベータ−アミロイドにプロセシングされる）の蓄積に続く毒性作用によりもたらされるということである。
【００５６】
アルファ−シヌクレインはパーキンソン病において影響を及ぼすが、なぜならばそれがレビ小体において豊富に見いだされ、トランスジェニックマウス内でのその過剰発現がパーキンソン病様の病理を導き、そしてこの分子内の変異が家族性パーキンソン病に関連するからである。アルファシヌクレインはベータ及びガンマシヌクレインを含む大きなファミリーの分子に属し、１４０アミノ酸の非アミロイドシナプス蛋白質であり、アミロイドプラークに見いだされる３５アミノ酸の非アミロイド成分蛋白質の前駆体である。
【００５７】
アルツハイマー病は、知力の低下、記憶喪失、錯乱及び失見当により特徴付けされる脳の進行性の変性障害である。この病理に寄与する細胞機構のうち２種類の原繊維（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）蛋白質が脳内に沈着する：ポリマー化されたｔａｕ蛋白質から構成される細胞内神経原繊維のもつれ、及び主としてベータアミロイドから構成される豊富な細胞外フィブリル（ｆｉｂｒｉｌｓ）。ベータアミロイドはＡｂｅｔａとしても知られており、ベータ及びガンマのセクレターゼ分割部位においてアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）の蛋白質分解プロセシングにより生じて、２つの主要な形態のＡｂｅｔａ（Ａｂｅｔａ４０及びＡｂｅｔａ４２）の細胞障害性及びアミロイド形成能力を生じさせる。即ち、Ａｂｅｔａのプラーク生産形態のアミロイドへのプロセシングを阻止することは、この疾患を抑制するか又は阻止する臨床上の標的であるＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）をつくる疾患の形成及び進行に決定的に影響するかもしれない。類似の報告は、プレセニリンが異常なプロセシングを再度指図する（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）候補の標的であることを示唆する。
【００５８】
ハンチントン病は、致死性で遺伝性の神経変性障害であり、不随意の「衝撃性」動作、鬱病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、及び痴呆により特徴付けられる。原因は、ＤＮＡ中のＣＡＧトリヌクレオチドの広範囲に長いシリーズからなる単一の遺伝子内の変異であると確認された。このＣＡＧリピートは、遺伝子が生産する蛋白質をコードする遺伝子の領域内にある。即ち、結果のハンチンチン蛋白質も、「ＣＡＧ」がコードするアミノ酸グルタミンから構成される広く長い領域を含む。簡単に言うと、ハンチントン病の原因としてこの変異が正確に位置決めされた（ｐｉｎｐｏｉｎｔｅｄ）後には、他の遺伝子内での類似のＣＡＧリピートの拡張が探索されて、多数の他の致死性で遺伝性の神経変性疾患の原因であることがわかった。これらのいわば「ポリグルタミン」疾患のリストは、今、少なくとも１１より多くのものを含み、脊髄小脳変形症１型、２型、及び３型、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ又はケネディー病）及び歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）を含む。拡張されたＣＡＧリピートを含む特定の遺伝子は各疾患において異なるが、それが、各疾患を引き起こす脳中の拡張されたポリグルタミン蛋白質の生産物である。兆候は、一般に、若いころから（ｉｎ ｅａｒｌｙ）中年期の成人までに出現し、そのごの１０年から１５年後に死ぬ。これらの致死性の疾患の有効な治療法は現在存在しない。
【００５９】
ニューロン中の異常な蛋白質の生産をシャットオフすることがポリグルタミン疾患において治療法となることを示唆する相当な証拠が存在する。これらの疾患の原因は、変異蛋白質による新規な機能の獲得であることが知られており、当該蛋白質のオリジナルの機能の損失はない。脊髄小脳変形症１型（ＳＣＡ１）に関するヒトの拡張されたトランス遺伝子を有するマウスは、若い成人において重度の萎縮症になる（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １７：７３８５−７３９５（１９９７））が、対応するマウスの遺伝子がノックアウトされたマウスは萎縮症にならず、そして他の主要な異常性を示さない（Ｍａｔｉｌｌａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １８：５５０８−５５１６（１９９８））。異常なアタキシン１蛋白質が生成されるが細胞核に入れないように遺伝子操作されたＳＣＡ１のトランスジェニックマウスは、萎縮症を発症しない（Ｋｌｅｍｅｎｔ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９５：４１−５３（１９９８））。最後に、テトラサイクリンを投与することにより（通常は、マウス及びヒトにおいて、当該抗生物質の投与は上記疾患に効果がない）変異体ヒトトランス遺伝子が人工的に「ターンオフ」し得るように操作されたハンチントン病のトランスジェニックマウスモデルが作成された。これらのマウスが兆候を発症し始めた後で、テトラサイクリンの長期の投与による異常性蛋白質生産のシャットオフ生産がそれらの挙動において改善を導く（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０１：５７−６６（２０００））。これは、異常なハンチンチン蛋白質のヒトにおける発現の低下がハンチントン病の新たに診断された患者における進行を阻止したかもしれないというのみならず、その兆候を既に罹患している患者の生活の質を改善するかもしれないことを示唆する。
【００６０】
様々なグループが、ｓｉＲＮＡｓの有効性を最近研究している。Ｃａｌｐｅｎら（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１（２）：１７５−１８４（２００２））は、別のＣＡＧリピートを含むヒトアンドロジェン受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写物の細胞発現を阻害するそれらの能力に関して様々な異なる二重鎖ＲＮＡｓを評定した。かれらの仕事は、ＣＡＧリピートに対してフランキング配列が二重鎖ＲＮＡｓ中に存在したときにのみ、ＣＡＧリピートを含む二重鎖ＲＮＡｓにより遺伝子特異的阻害が起こったことを見いだした。かれらは、拡張されたポリグルタミン領域による蛋白質の発現により誘導されたカスパーゼ−３活性化を、構築された二重鎖ＲＮＡｓが救済できたことを示すこともできた。Ｘｉａ，Ｍａｏら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１００６−１０１０（２００２））は、緑色蛍光蛋白質をコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡｓを発現する構築された組換えアデノウイルスを用いて、融合されたポリグルタミン蛍光蛋白質を発現する、工作された神経ＰＣ１２クローン細胞のポリグルタミン（ＣＡＧ）発現の阻害を証明した。
【００６１】
特定の蛋白質を生産するｍＲＮＡ標的に対して相補な小干渉ＲＮＡのデザインと使用が、特定のｍＲＮＡｓの翻訳を阻止するための分子生物学者により採用される最近の手段である。翻訳の前に蛋白質の発現を干渉するための分子生物学者により用いられる他の手段は、アルツハイマー病（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０１／１６３１２ Ａ２（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．）を参照）及びパーキンソン病（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／５０３００Ａ１（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）及びＷＯ０１／６０７９４Ａ２（Ｅｌｉｅｚｅｒ）を参照）に関する治療標的に対するリボザイムを用いたｍＲＮＡ配列の分割を含む。ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００４／０４７８７２ Ａ２（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）及び米国特許出願番号２００４／０２２０１３２ Ａ１（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）は、カテーテルの放出部分が脳の予め決定された注入部位に隣接するように留まるように外科手術によりカテーテルを移植し、そして少なくとも一つの神経変性蛋白質の生産を阻害する少なくとも一つの物質を予め決定された用量にてカテーテルの放出部分を通して放出する工程を含む、神経変性障害を治療するための、装置、小干渉ＲＮＡ、及び方法を開示する。ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００４／０４７８７２ Ａ２（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）及び米国特許出願番号２００４／０２２０１３２ Ａ１（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）は、さらに、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型及び３型、及び歯状核赤核のような神経変性障害を治療するための、小干渉ＲＮＡベクター、及び方法を開示する。
小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
以前に示されたとおり、本明細書に記載される小干渉ＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ）は、１５から３０ヌクレオチドの長さの二重鎖ＲＮＡのセグメントである。それは、ＲＮＡ干渉として知られる細胞反応を誘導するために使用される。ＲＮＡ干渉においては、二重鎖ＲＮＡをダイサーと呼ばれる細胞内酵素で消化し、ｓｉＲＮＡ二重鎖を生成する。当該ｓｉＲＮＡ二重鎖は別の細胞内酵素複合体に結合して、それにより如何なるｍＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ配列に相同（又は相補）なものは何でも標的化するように活性化される。活性化された酵素複合体は標的化ｍＲＮＡを分割し、それを破壊し、そしてその相当する蛋白質生成物の合成を指示するために使用されることを阻止する。最近の証拠は、ＲＮＡ干渉がウイルス感染に対する防御（多くのウイルスが外来ＲＮＡを細胞へ導入する）のためのみならず、極めて基礎的なレベルにおける遺伝子制御のためでもある、古来の内在的機構であることを示唆する。ＲＮＡ干渉は、植物、昆虫、下等動物、及び哺乳類において起こることが示され、そして他の遺伝子サイレンシング技術、例えばアンチセンス又はリボザイムよりも劇的に効率よいことが見いだされた。バイオテクノロジーを用いれば、ｓｉＲＮＡは、細胞へ、侵入する二重鎖ＲＮＡウイルスからダイサーにより生産されるはずのものと類似のＲＮＡの短い二重鎖分子を導入する（又は細胞が生産するように誘導する）ことを含む。人工の誘導されたＲＮＡ干渉プロセスが、次にその点から続く。
【００６２】
小干渉ＲＮＡを患者の脳にデリバリーするために、好ましい方法は、ｓｉＲＮＡ分子自体よりもｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを脳の細胞内へ導入することになる。特定の生物学上活性なｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、（ａ）標的ｍＲＮＡの小さくて接近可能な部分に関する配列（公的なヒトゲノムデータベース内で利用可能；また、Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：６３４３−６３４６（２００３）およびｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｌａｂｈｅａｄｓ／ｔｕｓｃｈｌ／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌ及びｄａｒｍａｃｏｎ ｄｏｔ ｃｏｍにてワールドワイドウエブも参照）、及び（ｂ）ＤＮＡが細胞により転写されたときに対応するＲＮＡ配列の生産をもたらすＤＮＡを如何にして特定するかについてのよく知られた科学上の規則を知った際に、特定され得る。
【００６３】
ＤＮＡ配列が一度特定されたなら、実験室の供給者からオーダーされた合成分子から実験室内で構築でき、そしてＤＮＡの細胞へのデリバリーのためのいくつかの別の「ベクター」の一つに標準生物学手法を用いて挿入することができる。患者の脳のニューロンにデリバリーされたなら、それらのニューロン自体が、挿入されたＤＮＡをＲＮＡに転写することにより、治療用のｓｉＲＮＡになるＲＮＡを生産することになる。結果は、細胞自身が標的化遺伝子を沈黙化するｓｉＲＮＡを生産する、ということになる。結果は、細胞により生産された標的化蛋白質の量の低下になる。
【００６４】
本発明によれば、冒された細胞内で生産された特定のｍＲＮＡに対する小干渉ＲＮＡがニューロン内の疾患に関連する蛋白質の生産を阻止する。本発明によれば、標的細胞に小干渉ＲＮＡをデリバリーするようにデザインされた特別にあつらえられたベクターの使用である。デザインされた小干渉ＲＮＡの成功は、神経変性疾患を治療するための脳の標的化された細胞へのそれらのデリバリーの成功に基づいて予測される。
【００６５】
小干渉ＲＮＡはヒト細胞へ特定のｍＲＮＡ分子を標的化可能であることが示された。ヒト細胞をトランスフェクトし、そして標的ＲＮＡの分割を誘導してコードされた蛋白質の生産を妨害する小干渉ＲＮＡを生産するための、小干渉ＲＮＡを構築することができる。
【００６６】
本発明の小干渉ＲＮＡベクターは、神経病原蛋白質自体の生産を抑圧するか、又は神経病原蛋白質の生産又はプロセシングに関与する蛋白質の生産を抑圧することにより、病原性蛋白質の生産を阻止する。治療剤の患者への繰り返しの投与は、患者の生活の質を改善するために十分多い数のニューロンの変化を成し遂げることが必要かもしれない。個々のニューロン内では、しかしながら、治療上の利益を提供するに十分な変化は長年にわたる。神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は脊髄小脳変形症１型に冒された多くの患者の絶望的な状況は、治療からの利益が治療のデリバリーと投与の危険よりも勝るような強い見込みを提供する他の治療剤及び投与の経路により神経病原性蛋白質の生産のいくらかの低下を成し遂げることは可能かもしれないが、ニューロンのインビボにおける直接のトランスフェクションを含む成功した治療法の開発は、小干渉ＲＮＡベクターの標的細胞へのデリバリーに基づいた最良のアプローチを提供するかもしれない。
【００６７】
ｓｉＲＮＡをコードする例示のＤＮＡ配列を表１に掲載する。
【００６８】
【表１】
【００６９】
細胞培養実験により、上記配列の各々がヒト細胞により発現される対応遺伝子のｍＲＮＡのレベルを抑圧することにおいて有効であるｓｉＲＮＡをコードすることが確認された。
重要なことは、本明細書に例示された抗−アタキシン−１小干渉ＲＮＡ、抗−ＢＡＣＥ１小干渉ＲＮＡ、及び抗−ハンチンチン小干渉ＲＮＡ、並びに神経変性疾患を治療するための他の小干渉ＲＮＡは、発明の態様の当然のいくつかの例（ｊｕｓｔ ｂｕｔ ｓｏｍｅ ｅｘａｍｐｌｅｓ）である。神経科学において経験をした者には知られている、神経外科手法を動物と共に用いる実験は、候補の小干渉ＲＮＡを同定するために使用することができる。ｍＲＮＡ及びこれらの経験的な方法により同定された対応する小干渉ＲＮＡの標的部位は、主題の神経変性疾患の患者に投与されたときに多大な治療効果を導くものになる。
【００７０】
本発明の核酸分子に関して、小干渉ＲＮＡは、実際の蛋白質コーディング配列内か又は５プライム非翻訳領域あるいは３プライム非翻訳領域内の何れかにおいて、標的蛋白質の生産をコードするｍＲＮＡ配列内の相補配列を標的とする。ハイブリダイゼーションの後に、ｓｉＲＮＡによりガイドされた宿主の酵素がｍＲＮＡ配列を分割することができる。パーフェクトか又は高度の相補性が、小干渉ＲＮＡが有効になるのには必要である。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対）を形成できる核酸分子内の連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補性）。「パーフェクトの相補性」は、核酸配列の連続する残基全てが第２の核酸配列中の連続する残基の同じ数と水素結合することを意味する。しかしながら、ｓｉＲＮＡ配列中の単一のミスマッチ又は塩基置換は小干渉ＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を実質上低下させ得ることに注目するべきである。
【００７１】
アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン−３及び／又はアトロピン−１のＲＮＡｓ内の特定の部位を標的とする小干渉ＲＮＡは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、脊髄小脳変形症３型及び／又は歯状核赤核を細胞又は組織中で治療するための新規な治療上のアプローチを代表する。
【００７２】
本発明の好ましい態様において、小干渉ＲＮＡは、１５から３０ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、核酸分子は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０である。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ配列の長さは、１９−３０塩基対の間であり得て、より好ましくは、２１から２５塩基対の間であり、そしてより好ましくは、２１から２３塩基対の間であり得る。
【００７３】
好ましい態様において、発明は、所望の標的のＲＮＡに関して高い程度の特異性を呈する、核酸に基づく遺伝子阻害剤のクラスを生成するための方法を提供する。例えば、小干渉ＲＮＡは、好ましくは、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン−１、アタキシン−３及び／又はアトロピン−１のＲＮＡをコードする標的ＲＮＡの高保存配列領域を標的とし、疾患又は症状の特異的な処置が発明の一つ又はいくつかの核酸分子に提供され得るようにする。さらに、一般には、アデニン塩基の対（ＡＡ）で始まる標的配列内の領域を同定することにより（実施例を参照）、干渉ＲＮＡ配列が選択される。ｓｉＲＮＡｓは適切な転写酵素又は発現ベクターを用いてインビトロ又はインビボにおいて構築することができる。
【００７４】
脳内のニューロンへの外来のＤＮＡのデリバリーのための好ましいベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、例えば組換えアデノ随伴ウイルス血清型２又は組換えアデノ随伴ウイルス血清型５である。あるいは、他のウイルスベクター、例えば、ヘルペスシンプレックスウイルスを外来ＤＮＡの中枢神経系ニューロンへのデリバリーに使用してよい。
【００７５】
ｓｉＲＮＡｓは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてインビトロにおいて構築することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、サイレンサーｓｉＲＮＡ内に含まれるＴ７プロモーターのプライマーの５’エンドに相補な８塩基の配列を含むように構築することができる（アンビオンコンストラクションキット１６２０）。各遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを供給されたＴ７プロモータープライマーにアニールさせ、そして、クレノー断片によるフィルイン反応がＲＮＡへの転写のための完全長ＤＮＡ鋳型を生成する。インビトロ転写反応により、２つのインビトロ転写されたＲＮＡｓ（一方が他方に対してアンチセンス）が生成され、そして二重鎖ＲＮＡを作成するために互いにハイブリダイズされる。二重鎖ＲＮＡ産物はＤＮａｓｅ（ＤＮＡ転写鋳型を除去するため）及びＲＮａｓｅ（二重鎖ＲＮＡのエンドをポリッシュするため）により処理されて、カラム精製されることにより、細胞内にデリバリーされて試験できるｓｉＲＮＡが提供される。
【００７６】
哺乳類細胞内でｓｉＲＮＡｓを発現するｓｉＲＮＡベクターの構築は、一般には、ｓｉＲＮＡの構造を模した短いヘアピンＲＮＡの発現を推進するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いる。このヘアピンをコードする挿入物は、短いスペーサー配列により分離された２つのインバーテッドリピートを有するようにデザインされる。一つのインバーテッドリピートは、ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡに相補性である。３’エンドに付加された６つの連続するチミジンの糸は、ｐｏｌ ＩＩＩ転写鋳型部位として機能する。細胞内部に入ったら、当該ベクターは構成的にヘアピンＲＮＡを発現する。ヘアピンＲＮＡは標的遺伝子の発現のサイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡに加工されて、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる。
【００７７】
あらゆる適切なＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを、小さなヘアピンｓｉＲＮＡの発現を推進するためにｓｉＲＮＡ発現ベクター中で用いてよい。例示のプロモーターは、限定ではないが、よく特性決定されたヒト及びマウスのＵ６プロモーター及びヒトＨ１プロモーターを含む。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩは、哺乳類細胞において小さなＲＮＡｓを相対的に大量に発現し、そして３−６ウリジンの糸を取り込んだ際に転写を終結させるから、ｓｉＲＮＡの発現を推進するために用いられた。
【００７８】
ｓｉＲＮＡ発現プラスミド及び／又はウイルスベクターの構築に使用されるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、公知の技術を用いて実施することができる。例えば、米国特許番号４，６８３，１９５（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）：４，６８３，２０２（Ｍｕｌｌｉｓ）；４，８００，１５９（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）；及び４，９６５，１８８（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）を参照。一般に、ＰＣＲは、ハイブリダイズ条件下での核酸サンプルの処理（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ存在下）を含み、検出される特定の配列の各鎖のための一つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。合成される各プライマーの伸長産物は、２つの核酸鎖の各々に相補であり、プライマーはハイブリダイズする特定の配列の各鎖に相補である。各プライマーから伸長合成された産物は、同じプライマーを用いた伸長産物の次の合成のための鋳型としても機能し得る。十分な数の伸長産物の合成のラウンドの後に、検出されるべき配列が存在するか否かについて、サンプルを分析する。増幅された配列の検出は、電気泳動後のＤＮＡのＥｔＢｒ染色による可視化によるか、又は公知技術により検出可能な標識等を用いて実施してよい。ＰＣＲ技術に関する総説（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ，Ａｃａｄ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照）。
蛋白質の不在下で誘導される神経性疾患
代謝の先天的エラーとして知られる稀な遺伝的障害は、からだが食物をエネルギーに変換する（即ち、食物を代謝する）ことが不可能になる。当該障害は、通常、食物の成分を分解する生化学経路に関与する酵素の欠陥により引き起こされる。さらに、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソームの酵素の何れかの機能発現の欠陥により特徴付けされる遺伝的疾患を意味する。
【００７９】
そのような疾患は、遺伝子治療により治療されるかもしれない。特に、欠陥のある遺伝子又は失われた遺伝子は当業者には知られている方法により同定されるかもしれず、のちに、置換遺伝子を用意して失われた部位へ供給されるかもしれない。
【００８０】
欠陥のある酵素をコードする例示のポリヌクレオチド、及び欠陥酵素に付随する疾患を表２に掲載する。
【００８１】
【表２】
【００８２】
【表３】
【００８３】
【表４】
【００８４】
【表５】
【００８５】
【表６】
【００８６】
【表７】
【００８７】
【表８】
【００８８】
【表９】
【００８９】
【表１０】
【００９０】
【表１１】
【００９１】
表２に掲載された欠陥酵素をコードするポリヌクレオチドは、本発明の人工ＡＡＶベクターに含まれ得るポリヌクレオチドの例である。しかしながら、表２に掲載されたポリヌクレオチドに限定されることを意図しないものであり、当業者は、蛋白質の不在により誘導される追加の疾患を同定し、そして欠陥酵素をコードする追加のポリヌクレオチドを同定することができる。
【００９２】
さらに、当業者は、本明細書に掲載された（例えば、表２）に相同なポリヌクレオチドが本発明の人工ＡＡＶベクター内に含まれ得ることを認識するはずである。例えば、一次構造の顕著なレベルを表２に掲載されたポリヌクレオチド中に存在するコーディング領域と分かち合うコーディング領域を有するポリヌクレオチド（例えば、顕著なレベルの同一性）を使用することができる。同一性のレベルは、コードされた蛋白質の仮想活性部位をコードする残基が見当に合っているように２つのヌクレオチド配列を一直線に並べる（ａｌｉｇｎｅｄ）ことにより決定され、そしてさらにそれらの配列の長さに沿ってそれらが共通に有するヌクレオチドの数を最大にするように一直線に並べる；見当の合ったコード蛋白質の仮想活性部位をコードする残基を配置するため且つ共有するヌクレオチドの数を最大にするためにアラインメントを作成することにおいて、片方か又は両方のギャップが許容されるが、それでもなお各配列中のヌクレオチドはそれらの正確な順序にて保持されなければならない。好ましくは、ＢＬＡＳＴ検索計算式のｂｌａｓｔｎプログラムを用いて２つのヌクレオチド配列を比較され、Ａｌｔｓｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７））に記載され、そしてナショナルキャンサーフォーバイオテクノロジーインフォメーションにて利用可能である（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／にてワールドウエブサイト上）。好ましくは、全てのＢＬＡＳＴ検索パラメーターの欠損値を用いる。ＢＬＡＳＴ欠損計算式を用いた２つのヌクレオチド配列の比較においては、構造上の類似性を「同一性」と呼ぶ。好ましくは、２つのヌクレオチド配列は、好適さが増す順に、好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、そして９９％同一性を有する。
人工ＡＡＶベクター
人工ＡＡＶベクターは、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含み、そして遺伝子又は遺伝子抑圧剤を患者のニューロンにデリバリーするのに使用することができる。即ち、人工ＡＡＶベクターは遺伝子をデリバリーするためのカセット、又は遺伝子抑圧剤をデリバリーするためのカセットを含むのが好ましい。例えば、失われた遺伝子を患者の脳に供給するために意図された遺伝子治療の場合、発現カセットは、プロモーター要素、失われた遺伝子をコードする配列、及びポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。別の例において、患者の脳内で内生遺伝子の発現を抑圧することを意図された遺伝子抑圧する治療の場合、発現カセットは、プロモーター要素、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードする配列、及び終結配列を含むことができる。
【００９３】
一つの態様において、人工ＡＡＶベクターは、二重鎖ベクターである。二重鎖ベクターはいずれかの種類の発現カセットを含んでよく、アデノ随伴ウイルスゲノムからのインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）の５プライムコピー、続く遺伝子又は遺伝子抑圧剤に関する発現カセット（その同一性は治療される神経障害しだいである）、続くＡＡＶ−ＩＴＲの３プライムコピーによる３プライムエンドを含む。
【００９４】
別の態様において、人工ＡＡＶベクターは、何れかの種類の発現カセットを含んでよく、単鎖ベクターである。単鎖ベクターは、アデノ随伴ウイルスゲノムからのインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）の５プライムコピー、続く遺伝子又は遺伝子抑圧剤に関する発現カセット（その同一性は治療される神経障害しだいである）、続くＡＡＶ−ＩＴＲの３プライムコピーによる３プライムエンドを含む単鎖ＤＮＡセグメントを含む。任意に及び好ましくは、何れかの種類の発現カセットを含む全ＤＮＡ配列は逆相補の順序で繰り返され、それにより、ＤＮＡ配列が５プライムＡＡＶ−Ｉ、発現カセット、内部ＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセットの逆相補体、及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含む。３プライムＡＡＶ−ＩＴＲは５プライムＡＡＶ−ＩＴＲの逆相補体であり（例えば、本明細書中の実施例１に例示されるとおり）、そして３プライム又は５プライムの何れかのＡＡＶ−Ｉを内部ＡＡＶ−ＩＴＲとして用いることができる。結果の「自己相補性」人工ＡＡＶベクターが好ましいが、なぜならば、それがＤＮＡによりニューロンのより有効なトランスフェクションを生じさせるかもしれないからである。例えば、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：９１１−９１７（２００３）を参照。
【００９５】
当業者には、二重鎖の人工ＡＡＶベクターの態様と単鎖自己相補性人工ＡＡＶベクターの態様が、単鎖自己相補ベクターが発現カセットの相補鎖をつなぐ単一の単鎖ＡＡＶ−ＩＴＲを有する（一方の鎖の３プライムエンドを相補鎖の５プライムエンドに共有結合させる−図２に模式的に示される）ために完全な人工ＡＡＶベクターが、発現カセットの相補鎖間で水素結合によりそれ自身の上に「フォールドバック」した一つの単ＤＮＡ鎖である、ということのみにおいて相違することを認識する。二重鎖人工ＡＡＶベクターの場合には、各エンドにおいて鎖をつなぐ非共有結合により発現カセットの５プライムエンドと３プライムエンドにおいて二重鎖のＡＡＶ−ＩＴＲｓが存在する（図３に模式的に例示されるとおり）。
【００９６】
二重鎖の人工ＡＡＶベクターを製造する例示の方法が開示される。当該方法は、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをあらゆる適当なＤＮＡプラスミド中に標準ＤＮＡクローニング方法を用いて集合させ；５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをプラスミドから解放するが、ＤＮＡを５プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ５プライムの位置及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ３プライムの位置において切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより解放し；そして標準の方法を用いて５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲからなる直鎖状ＤＮＡ断片を精製する工程を含む。任意に、結果の直鎖状二重鎖人工ＡＡＶベクターをさらに加熱処理工程により加工してよく、例えば、精製された直鎖状ＤＮＡ断片を加熱し（例えば、６５℃又はそれ以上に１０分間又はそれより長く加熱）、次に冷却する（例えば、１０分間又はそれより長い時間をかけてＤＮＡ断片をゆっくりと室温に冷却する）ことを含む。図４に模式的に例示されるとおり、これらの加熱及び冷却の工程は、ＡＡＶ ＩＴＲｓが二次構造に集合することを許容し、この二重鎖人工ＡＡＶベクターからの長期間の遺伝子発現を助ける。
【００９７】
上で本明細書に記載された単鎖ＤＮＡを製造する例示の方法も開示される。一つの方法は、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをあらゆる適当なＤＮＡプラスミド中に標準ＤＮＡクローニング方法を用いて集合させ；標準インビトロ転写方法を用いてＤＮＡプラスミドから所望の単鎖ＤＮＡの単鎖ＲＮＡ転写物を生成させ；標準逆転写反応方法を用いて逆転写によりＲＮＡ転写物から単鎖ＤＮＡを生成させ；ＲＮａｓｅ酵素を用いたＲＮＡ消化により反応産物からＲＮＡ転写物を取り出し；そして標準ＤＮＡ精製方法、例えばゲル精製又はカラム親和法により反応産物から結果の単鎖ＤＮＡ産物を精製する工程を含む。
【００９８】
別の方法は、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをあらゆる適当なＤＮＡプラスミド中に標準ＤＮＡクローニング方法を用いて集合させ；５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ５−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより環状プラスミドを直鎖状化し；直鎖状化されたプラスミドの各鎖の５−プライムエンドに親和性タグ（例えば、ビオチン分子）を化学的にコンジュゲートし；３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ３−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりＤＮＡ配列を切断するが、制限酵素が異なるサイズの２つの直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子をもたらすようにし；サイズによりあらゆる適切なサイズ分離方法（例えば、カラム濾過又はゲル電気泳動）を用いてＤＮＡ分子の集団を分離して所望の二重鎖ＤＮＡを回収し；そしてＤＮＡを融解することにより、その２つの相補鎖を２つの単鎖に分離し、そして混合物をタグのための親和性カラムに通す（例えば、ビオチン分子を親和性タグとして用いたときはストレプトアビジン親和性カラム）が、工程３においてタグを付加された鎖がカラム上に捕捉されて、一方タグのない単鎖は所望の最終産物としてフロースルーするようにする。この方法は、最終産物中の配列エラーを導入するかもしれない如何なるＤＮＡ又はＲＮＡ重合工程も含まないので有利で有り得る。
【００９９】
自己相補性ＡＡＶの場合、上記方法は、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、内部ＡＡＶ−ＩＴＲ、同じ発現カセットの逆相補体、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをあらゆる適当なＤＮＡプラスミド中に標準ＤＮＡクローニング方法を用いて集合させ；（５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲから３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲまでの）ＤＮＡ配列を切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより環状プラスミドを直鎖状化し；サイズによりあらゆる適切なサイズ分離方法を用いて工程２からの所望のＤＮＡ配列を回収し；二重鎖ＤＮＡを融解することにより、その２つの相補鎖を２つの単鎖に分離し；そして融解されたＤＮＡの温度を（好ましくはゆっくりと）低下させることにより、単鎖が自己アニールによりヘアピン形態になることを許容する工程を含む。結果の単鎖（「センス」又は「アンチセンス」鎖）は最終産物として有用であるが、何れかの鎖が５−プライムから３−プライム方向へ所望の発現カセットのコピーを含むからである。
組成物
組成物が血液−脳バリヤーを通してデリバリーされる態様に関して、当該組成物は、例えば、米国特許番号６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｇｅ）に例えば記載されたようなリポソーム、及び薬学上受容可能な担体を含む。好ましくは、当該リポソームは受容体特異的リポソームであって、当該受容体特異的リポソームは：外部表面及び内部区画を有し；リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖）を含み、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっている。リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む受容体特異的リポソームは、人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをプラスミドＤＮＡの代わりに用いること以外、米国特許番号６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｇｅ）に記載された一般法により製造することができる。
【０１００】
本明細書にて使用される「標的化剤」は、直接に又は間接に細胞の表面へ、例えば細胞表面に存在する分子、例えば受容体に相互作用する化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）を意味する。当該相互作用は、例えば、イオン結合、水素結合、ファンデルワース力、又はそれらの組み合わせであり得る。標的化剤の例は、例えば、サッカライド、ポリペプチド（ホルモンを含む）、ポリヌクレオチド、脂肪酸、及びカテコールアミンを含む。本明細書にて使用される用語「サッカライド」は、単独の糖質モノマー、単独の、グルコース、又は２つ又はそれより多い共有結合された糖質モノマー、即ちオリゴサッカライドを意味する。４またはそれより多い糖質モノマーを含むオリゴサッカライドは、直鎖状であるか分枝し得る。オリゴサッカライドの例は、ラクトース、マルトース、及びマンノースを含む。本明細書にて使用される「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを意味し、特定の長さのアミノ酸ポリマーを意味しない。即ち、例えば、用語ペプチド、オリゴペプチド、蛋白質、抗体、及び酵素はポリペプチドの定義に含まれる。この用語はポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化（例えば、サッカライドの付加）、アセチル化、リン酸化などなども含む。
【０１０１】
本明細書にて記載されるリポソームは、血液−脳バリヤーを通して生物学上活性な因子をデリバリーすることができ、脳の中で発現される。リポソームとナノ粒子は因子の封入のために普通に使用されるナノコンテナーの例示の形態である。リポソームは、好ましくは、２００ナノメーター未満の直径を有する５０から１５０ナノメーターの間の直径を有するナノコンテナーが好ましい。特に好ましいのは、約８０ナノメーターの外部直径を有するリポソーム又は他のナノコンテナーである。適切な種類のリポソームが、中性脂質、例えば１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、又はコレステロールと、少量（１％）のカチオン酸、例えばジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）により作成される。
【０１０２】
発明は好ましいナノコンテナーとしてリポソームを用いて記載されてきたが、当業者は、他のナノコンテナーを用いてよいことを認識する。例えば、上記リポソームは、ナノ粒子、又はＤＮＡを封入して核酸をヌクレアーゼから防御することができるが製剤がなお血液中にあるか又は血液中から標的細胞の細胞内区画への移動中にある直径＜２００ｎｍのあらゆる他の分子ナノコンテナーに置き換えてよい。また、コンジュゲート剤、例えばＰＥＧ鎖を用いる代わりに、一つ又はそれより多くの他のポリマー物質、例えば、スフィンゴミエリンをリポソーム又はナノコンテナーの表面に接続することができ、そして「輸送可能なペプチド」のコンジュゲートのため及び血液からの製剤の除去を遅延させて血漿のファーマコキネティクスを最適化するための骨格を提供する二重の目的にかなう。さらに、本発明は、特定の標的受容体を有する細胞又は器官のあらゆる群にＤＮＡをデリバリーすることを意図する。当該リポソームはＤＮＡを器官、例えば肝臓、肺及び膵臓にデリバリーするために使用してよい。
【０１０３】
当該リポソームは静脈内投与のためのあらゆる適切な薬学担体と組み合わせてよい。組成物の静脈内投与は最小限の侵入性であるから好ましい経路である。他の投与経路が望まれるなら可能である。適切な薬学上受容可能な担体は、塩水、Ｔｒｉｓバッファー、リン酸バッファー、又は他の水性溶液を含む。適切な用量は、当業者によく知られている手法により確立することができる。
【０１０４】
当業者は、レミントンズファーマシューティカルサイエンス（１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（１９８５）及びグッドマンアンドギルマンズザファーマシューティカルベーシスオブセラピュティクス（８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹｍ１９９０）として広く知られており利用可能な源にて論じられる原理及び手法を熟知している。
【０１０５】
本発明の好ましい態様において、組成物又は前駆体又はその誘導体は、ヒト又は他の動物へデリバリーされた投与に適合された薬学組成物として標準法に従い製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は滅菌アイソトニック水性バッファー中の溶液である。
【０１０６】
必要なら、組成物は、可溶化剤と注射のための部位においてあらゆる痛みを改善するための局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、当該成分は、別々に又は混合されて、ユニット用量形態にて、例えば、乾燥凍結粉末として又は水不含濃縮物として密封封入されたコンテナー、例えば、活性因子の量を示すアンプル又はｓａｃｈｅｔｔｅ中に供給する。組成物が注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）により投与されるなら、滅菌薬学グレードの水又は塩水を含む注入ボトル中に調合することができる。組成物を注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により投与するなら、投与の前に成分が混合されるように、注射のための滅菌水又は塩水のアンプルを用意することができる。
【０１０７】
静脈内投与以外の場合、組成物は、湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤をマイナーな量にて含むことができる。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、ゲル、ポリマー又は徐放性製剤であり得る。組成物は当業界で知られている伝統的な結合剤及び担体と共に製剤化することができる。製剤は標準の担体、例えば、薬学グレードのマニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカライドナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等、因子の製造においてよく確立された官能性を有する不活性担体を含むことができる。様々な伝統的なシステムが公知であり、本発明の組成物を投与するために使用することができ、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル等への封入を含む。
【０１０８】
また別の好ましい態様において、組成物は中性又は塩形態として製剤化することができる。薬学上受容可能な塩は、遊離アミノ基、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、オキサロ酸、酒石酸等に由来するものにより形成されたもの、及び遊離カルボキシル基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン又は類似物により形成されたものを含む。
【０１０９】
特定の障害又は症状の治療に有効な本発明の組成物の量は、障害又は症状の性質に依存し、そして組成物の投与においてよく確立された標準臨床技術により決定することができる。製剤に用いられる正確な用量は投与経路及び疾患又は障害の重度にも依存することになり、医師（ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）の判断及び患者の要求に従い決定されるべきである。頭蓋内投与のための適切な用量範囲は、一般に、単一注射容量の１から３０００マイクロリットルにてデリバリーされるマイクロリットルあたり、ウイルスベクター約１０３から１０１５感染ユニットである。マイクロリットルあたりの追加量の感染ユニットのベクターは、一般に、約１０、５０、１００、２００、５００、１０００又は２０００マイクロリットルにてデリバリーされるウイルスベクターの約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４感染ユニットを含む。適切な用量はインビトロ又はインビボ試験システム由来の用量応答曲線から推定してよい。
【０１１０】
他に規定しない限り、本明細書にて使用される化学用語及び命名は、発明の属する分野の当業者により共通に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学の手法等は当業界で用いられる共通の方法である。そのような標準技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のような文献のマニュアル見いだすことができる。
【０１１１】
実施例
実施例１：
出願人は、ベータ−アミロイド分割酵素（ＢＡＣＥ１）の発現を抑圧するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを開発した。神経細胞中でのＢＡＣＥ１の抑圧は、アミロイド前駆体蛋白質からのベータ−アミロイド断片の生産を完全に破壊することが知られている。溶解性ベータ−アミロイド断片はアルツハイマー病の認識に関する機能不全と神経変性の原因であると信じられており、そしてこれらの断片の不溶性凝集物はアルツハイマー脳の中に特徴的なプラークの中に含まれることが知られている。抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの発現カセットが、ＡＡＶ−ＩＴＲｓを周囲に含む構築物中に工作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。本明細書中に例示された態様において、ＩＴＲｓはＡＡＶ２由来である。しかしながら、当業者には、他の血清型由来のＩＴＲｓも使用可能なはずであることが明らかである。ＢＡＣＥ１メッセンジャーＲＮＡの発現の低下と細胞培養におけるＢＡＣＥ１酵素の活性の低下をこの抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが事実もたらすことを示すデータが得られている。（この明細書中の以下の実施例２−４を参照）。
【０１１２】
開示された方法に従うと、抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡをコードするＡＡＶ−ＩＴＲを周囲にもつＤＮＡが血液−脳バリヤーを通して脳細胞中へ輸送のために製剤化されたリポソーム内部へパッケージされ得る。結果の組成物は、アルツハイマー病の患者の脳を供給する血管の一つ又はそれより多くに、神経血管カテーテルによりデリバリーされるはずである。ベータ−アミロイド及びベータ−アミロイドプラーク自体を脳が逃れるための浄化（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）機構はアルツハイマー病を阻止するのに十分なほど明らかではないが、「源における」ベータ−アミロイドの生産により浄化機構が良好にベータ−アミロイドの患者の脳に対して有する作用を低下させ得ると予測される。結果として、疾患の進行が遅延するか又は停止し、そして患者が安定して恐らくは改善すると仮定される。
【０１１３】
即ち、神経血管による脳全域のこのＤＮＡのデリバリーは患者におけるアルツハイマー病の治療のための手段を提供し得る。治療が安全で副作用のないことが証明されたら、予防治療としても有力になるかもしれない。即ち、アルツハイマー病の可能な未来の発生に対して集団中の全ての加齢する（ａｇｉｎｇ）人々に予防的に「接種する」ために使用されるかもしれない。
【０１１４】
本発明の生物学上の成分の合成ＡＡＶのＤＮＡ配列の様々な態様はそれがアルツハイマー病の治療に関するように、以下のとおりである。「ＡＡＶ−Ｕ６−ＭＢ１７４９」（配列番号：８）はＭＢ１７４９のＤＮＡコードを含む合成ＡＡＶの配列であり、アルツハイマー病の治療法としてのベータ−アミロイド分割酵素タイプ１（ＢＡＣＥ１）の発現を抑圧するのに有効なｓｉＲＮＡである。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】
「ＡＡＶ−Ｈ１−ＭＢ１７４９」（配列番号：９）はＭＢ１７４９のＤＮＡコードを含む合成ＡＡＶの配列であり、Ｕ６よりむしろヒトＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより推進される発現を伴う。
【０１１８】
【表１４】
【０１１９】
【表１５】
【０１２０】
「ＳＣ−ＡＡＶ−Ｕ６−ＭＢ１７４９」（配列番号：１０）はＭＢ１７４９のＤＮＡコードを含む合成自己相補性ＡＡＶの配列であり、ヒトＵ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより推進される発現を伴う。
【０１２１】
【表１６】
【０１２２】
【表１７】
【０１２３】
【表１８】
【０１２４】
【表１９】
【０１２５】
「ＳＣ−ＡＡＶ−Ｈ１−ＭＢ１７４９」（配列番号：１１）はＭＢ１７４９のＤＮＡコードを含む合成自己相補性ＡＡＶの配列であり、ヒトＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより推進される発現を伴う。
【０１２６】
【表２０】
【０１２７】
【表２１】
【０１２８】
【表２２】
【０１２９】
ＡＡＶ−Ｕ６−ＭＢ１７４９ ＤＮＡ構築物（配列番号：８）が生成されてＡＡＶウイルス粒子中にパッケージされ、そしてアミロイド−前駆体蛋白質に関するヒト遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスの脳に定位に注射された。ウイルス媒介性遺伝子治療がこれらのマウスにおいてアルツハイマー病のマニフェステーションを低下させるかもしれない。
実施例２：ｓｉＲＮＡを用いたインビトロのＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡの抑圧
Ｎｅｕｒｏ２ａマウス神経細胞系においてＢＡＣＥ１のメッセンジャーＲＮＡの発現をインビトロにて有効に抑圧するｓｉＲＮＡ配列を同定して、ＭＢ１７４９と命名した。ＭＢ１７４９は「マウスＢａｃｅ１配列位置１７４９」を意味し、マウスＢＡＣＥ１ ｃＤＮＡ配列（ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ＿０１１７９２．２）中のヌクレオチド１７４９から１７６９に相当する。ヌクレオチド配列は以下のとおりである。
配列番号：１２：５’−ＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＴＣ−３’
この配列はＢＡＣＥ１のヒトｃＤＮＡ配列の４つのバリアント全て（Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤ）に同一（１００％相同）であり、そしてジェンバンクの様々なヒトＢＡＣＥ１ ｃＤＮＡ配列内の以下の位置に見いだされる：
【０１３０】
【表２３】
【０１３１】
ＢＡＣＥ１発現を沈黙化させる候補のｓｉＲＮＡとしてＭＢ１７４９配列を選択する部分において、当該配列を、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ ｄｏｔ ｇｏｖにてＢＬＡＳＴサイトにてワールドウエブサイト上でヘルスナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーションにより提供されるＢＬＡＳＴソフトウエアを用いて、ホモサピエンスの全ての他の公知のゲノミックＤＮＡ配列と比較した。
【０１３２】
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞培養による試験のために、二重鎖ＭＢ１７４９ｓｉＲＮＡをインビトロ転写方法を用いて構築した。以下の２つの合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドをＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社から得た（ＤＮＡ合成サービス）：
【０１３３】
【化１】
【０１３４】
当該ｓｉＲＮＡを、これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドから、アンビオン社（サイレンサーｓｉＲＮＡ構築キット、カタログ番号１６２０）により市販されて提供される試薬を用いて製造者に指示書に従い以下のとおりに生成した：供給されたＴ７プロモータープライマーを上記の２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド転写鋳型にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたオリゴの３−プライムをＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片により伸長することにより、二重鎖のｓｉＲＮＡ転写鋳型を創製した。センス及びアンチセンスのｓｉＲＮＡ鋳型をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写し、そして結果のＲＮＡ転写物をハイブリダイズさせることにより、二重鎖ＲＮＡを創製した（リーダー配列、二重鎖ＲＮＡの１９マー、及び２つの３−プライム末端ウリジンからなる）。リーダー配列はリボヌクレアーゼ消化により除去し、そしてＤＮＡ鋳型はデオキシリボヌクレアーゼ処理により除去した。結果の二重鎖ｓｉＲＮＡ産物を供給されたガラスファイバーカラムに結合及び溶出して精製した。
【０１３５】
ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡを、インビトロにおいて、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞に、ＭＢ１７４９抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡと共にこれらの試験目的のために構築されたＤＮＡプラスミド（ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ）による同時トランスフェクション培養物により試験した。ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドは、ヒトＢＡＣＥ１ ｃＤＮＡのカセット及び増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）の追加の発現カセットを含む。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を６ウエルのプレート上に植えて、標準培養条件（１０％子ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地、３７℃にて湿潤加湿器中で５％二酸化炭素）下で５０％−７０％コンフルエントまで生育させた。次に、細胞にＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯトランスフェクション試薬（ミルスカタログ番号２１５４）を用いてトランスフェクトし、そしてｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドをＴｒａｎｓｉｔ−Ｎｅｕｒｏトランスフェクション試薬（ミルスカタログ番号２１４４）を用いて製造者の推奨に従いトランスフェクトした。細胞にさらなる生育培地を２４時間後に与えた（ｆｅｄ）。約４２時間後に、全細胞ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン、カタログ番号７４１０４）を製造者のプロトコルに従い回収したが、可能性のある汚染ゲノミックＤＮＡのＤＮａｓｅＩを用いた消化を含んだ。
【０１３６】
ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡの抑圧は、定量性逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを用いて評価した。１０マイクログラム（１０μｇ）の全細胞ＲＮＡを５０マイクロリットル反応にてｃＤＮＡに逆転写した（ストラタジーンＰｒｏＳＴＡＲ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲキット、カタログ番号２００４２０）。逆転写酵素を省いた平行の反応を用いて次のＰＣＲ反応へのゲノミックＤＮＡのキャリーオーバーのないことを確認した。６マイクロリットルの反応産物をＴａｑＭａｎ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ反応試薬と混合し、次に、等しく３つの別々のチューブに分割し、ＢＡＣＥ１のｃＤＮＡの臓腑供養のＰＣＲプライマー、齧歯類ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ、又はｅＧＦＰ ｃＤＮＡをそれぞれ加えた。ＰＣＲ反応を稼動させ、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ ３０００（リアルタイムＰＣＲマシン（コルベットリサーチ、モートレイクＮＳＷ，オーストラリア）を用いて増幅データを回収した。ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドのみ（ｓｉＲＮＡなし）をトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞からの反応産物の希釈シリーズを用いて、各ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ１，ＧＡＰＤＨ，及びｅＧＦＰ）に関して標準曲線を制定し（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ）、そしてプラスミドプラスＭＢ１７４９抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞内の各遺伝子のｃＤＮＡの量を各標準のパーセンテージとして計算した。
【０１３７】
この実験は別々の細胞培養を用いて別々の実験室職員により３つの別々の機会に実施した。
【０１３８】
【表２４】
【０１３９】
これらの結果は、ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡ配列がマウス神経細胞系においてＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの発現をインビトロにて実質上抑圧することを示す。
実施例３：ＡＡＶ−抗Ｂａｃｅ１を用いたＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡのインビトロにおける抑圧
トランスフェクトされた細胞中でのＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡの生産をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを遺伝子工作した。このベクターは、以下のＤＮＡ配列をｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６プラスミド（アンビオン，カタログ番号７２０７）に、ＡｐａＩとＥｃｏＲＩ制限部位の間に挿入することにより生成した。
【０１４０】
【化２】
【０１４１】
結果のプラスミドは、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＭＢ１７４９に相当する短いヘアピン転写物をコードするＤＮＡ配列、及び６つのチミンヌクレアーゼの連続からなるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列からなる発現カセットを含む。形質導入された細胞が内部でＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡを発現してそれによりＢＡＣＥ１メッセンジャーＲＮＡの発現を抑圧することを誘導することにおけるこのＤＮＡ配列の有効性を、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞の培養物において試験した。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞培養物にｐＳｉｌｅｎｃｅｒＭＢ１７４９プラスミドとｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドをＴｒａｎｓｉｔ−Ｎｅｕｒａｌトランスフェクション試薬及び上記の手法を用いて同時トランスフェクトした。約４２時間後に、全細胞ＲＮＡを細胞から回収し、そして上記のとおり定量性リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。この分析は３通り実施して、以下の結果を得た：
【０１４２】
【表２５】
【０１４３】
これらのデータは、ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡ配列がｐＳｉｌｅｎｃｅｒＭＢ１７４９プラスミドをトランスフェクトされた細胞内でＭＢ１７４９発現カセットから生成されたことを示し、そしてこの発現カセットはインビトロにおいてＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの発現を実質上抑圧することを示す。
【０１４４】
ＭＢ１７４９発現カセット（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＭＢ１７４９に相当する短いヘアピン転写物をコードするＤＮＡ配列、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列からなる）を、アデノ随伴ウイルスベクター（ジーンディテクト社、オークランド、ニュージーランド、カタログ番号ＧＤ１００１−ＲＶ）へ、キメラＡＡＶ血清型１／２と共に工作した。ＭＤＴ１７４９．４を形質導入された細胞がＭＢ１７４９ｓｉＲＮＡを内部で生産してそれによりＢＡＣＥ１メッセンジャーＲＮＡの発現を抑圧するように導入されることを確認するため、ＨＥＫ２９３細胞（標準的実験室細胞系）の培養物にＭＤＴ１７４９．４ウイルスを感染させ、そして次にｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドを１日後にトランスフェクトした（２日目）。全細胞ＲＮＡをこれらの細胞から約４８時間後に回収して（４日目）、定量性リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて上記の通りに分析した。陰性対照として、他のＨＥＫ２９３細胞培養物にｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドと、ＭＢ１７４９のコーディング配列がスクランブルされ、即ちＢＡＣＥ１に対するｓｉＲＮＡとして不活性であることを除いてＭＤＴ１７４９．４に同一の比較用ＡＡＶウイルスベクターをトランスフェクトした。この分析は、２つの別のロットのＭＤＴ１７４９．４ウイルスストック及び２つの別々のロットのスクランブル対照ウイルスストックを用いて実施したところ、結果は以下のとおりであった：
【０１４５】
【表２６】
【０１４６】
これらのデータは、ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡ配列がＭＤＴ１７４９．４アデノ随伴ウイルスを感染させた細胞内で生成されたことを示し、そしてこの発現がインビトロにおいてＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの実質上の発現をもたらすことを示す。ＭＤＴ１７４９．４アデノ随伴ウイルスのＢＡＣＥ１酵素の生産及びベータ−アミロイド生成に対する効果の試験として、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにて神経病理が現在進行中である。
実施例４：ｓｉＲＮＡを用いたインビトロにおけるＢＡＣＥ１蛋白質酵素の抑圧
細胞へのＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが事実ＢＡＣＥ１蛋白質発現の抑圧並びにＢＡＣＥ１メッセンジャーＲＮＡ生産の抑圧をもたらすことを確認するために、ＢＡＣＥ活性をＨＥＫ２９３細胞からの蛋白質抽出物中にて測定した。ＨＥＫ２９３細胞を３５ｍｍのディッシュに植え、そしてｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドとｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＭＢ１７４９（ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡを生産するためのＤＮＡコードを含む）又は製造者（アンビオン、カタログ番号７２０７、挿入された如何なるｓｉＲＮＡもない）から得たオリジナルのｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミドの何れかを、Ｔｒａｎｓｉｔ−Ｎｅｕｒａｌトランスフェクション試薬を用いて同時トランスフェクトした。４８時間後に、細胞を回収して、細胞溶解物から抽出された蛋白質をＢｅｔａ−Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ活性キット（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＦＰ００２）を用いてＢＡＣＥ酵素活性に関してアッセイした。簡単に言えば、このアッセイは、ＢＡＣＥ分割活性に関する基質である標識されたペプチドを蛋白質抽出物に加えることを含む。当該ペプチド基質は蛍光リポーター分子（ＥＤＡＮＳ）と蛍光クエンチング分子（ＤＡＢＣＹＬ）にコンジュゲートされており、ペプチド上での２つの分子の物理的近接が蛍光放射を阻止するようになっている。ＢＡＣＥによりペプチド基質の分割は物理的にＥＤＡＮＳとＤＡＢＳＹＬ分子を分離させ、蛍光シグナルの放出を可能にする。
【０１４７】
細胞サンプルから得られた蛋白質抽出物は均等な蛋白質濃度（ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ及びｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＭＢ１７４９をトランスフェクトされた細胞に関して０．１３ｍｇ／ｍＬ、そしてｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ及び「空の」ｐＳｉｌｅｎｃｅｒをトランスフェクトされた細胞に関して０．１１ｍｇ／ｍＬ）である。これらの蛋白質抽出物の３通りのサンプルをマイクロプレートのウエルに入れ（Ｒ＆Ｄシステムズキットにより供給された）たが、ウエルあたり５０マイクロリットルで、５０マイクロリットルの反応バッファーと５マイクロリットルの標識されたペプチド基質をそれに加え、製造者のプロトコルに従った。サンプルを３７℃においてインキュベートし、そしてフェニックス蛍光マイクロプレートリーダーを用いてウエルから放射された蛍光を１０分間隔で測定した。結果を図１に示す。
【０１４８】
このアッセイ方法はＢＡＣＥ１酵素活性に特異的ではないが、ＢＡＣＥ２酵素活性を反映することに注目するのは重要である。ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡがＢＡＣＥ１（ＢＡＣＥ２配列に対してたった５８％の相同性しかない［１９塩基のうちの８がミスマッチ］）に特異的であるから、細胞中のあらゆるＢＡＣＥ２蛋白質の生産がＭＢ１７４９トランスフェクションにより影響されていないらしく、このアッセイにおいて測定された全ＢＡＣＥ酵素活性に寄与し続けるらしい。結果的に、当該アッセイは、これらの細胞中でのＭＢ１７４９によるＢＡＣＥ１蛋白質の量を過小評価するらしい。
【０１４９】
これらの結果は、活性なＢＡＣＥ１蛋白質の生産がＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞においては低下することを示す。
さらに、アルツハイマー病の動物モデルにおけるいくつかの前臨床研究は、脳のベータ−アミロイドレベルを低下させる治療が認識の実行の改善ももたらすことを示した（例えば、Ｓｃｈｅｎｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３：８２４−８２８（２００２）を参照）。これらの研究は免疫のアプローチを用いており、ベータ−アミロイド形成を阻止するよりも、ベータ−アミロイドに対する免疫応答によりベータ−アミロイドの低下を誘発する。これらの前臨床結果に基づいて、抗−ベータ−アミロイドワクチンのヒト臨床試験が開始された；しかし、これらの試験は、治療に対する反応として数人の患者が脳の炎症を発したとき（髄膜脳炎）に中止された。
【０１５０】
ＢＡＣＥ１の抑圧が実行可能であること、及びそれがアルツハイマー病を治療するのに安全で有効な方法であるかもしれないという様々なインビトロ研究及び動物研究からの証拠が存在する。Ｒｏｂｅｒｔｓらは、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１３１７−２４（２００１）において、ＢＡＣＥ１発現を欠くマウス（ＢＡＣＥ１ノックアウトマウス）がそれらの脳中においてベータ−アミロイドを生産できないが、表現型上は正常であることを示した。さらに、Ｌｕｏらは、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ４：２３１−２３２（２００１）において、ＢＡＣＥ１ノックアウトマウスをヒトアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）を過剰発現するＴｇ２５７６トランスジェニックマウスと交配したときに、子孫がベータ−アミロイドを生産できないことを示した。顕著なのは、Ｏｈｎｏらが、Ｎｅｕｒｏｎ，４１：２７−３３（２００４）において、Ｔｇ２５７６マウスとＢＡＣＥ１ノックアウトの交配もベータ−アミロイド依存性の病理から子孫を救済する結果をもたらし、海馬の記憶の欠損と神経の興奮の機能しない制御からの救済を含む。
【０１５１】
Ｂａｓｉらは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７８：３１５１２−２０（２００３）において、ｓｉＲＮＡを用いることにより標準実験室細胞系（ヒト胚腎臓細胞ＨＥＫ２９３）においてＢＡＣＥ１発現を抑圧できることを示し、そしてＫａｏらは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９：１９４２−４９（２００４）において、ｓｉＲＮＡを用いることにより野生型とＡＰＰトランスジェニックマウスの両方からの一次皮質ニューロンの培養においてインビトロにてＢＡＣＥ１の発現を抑圧できることを示した。
実施例５：
以下の実施例は、生物学上活性なＲＮＡ転写物をコードする人工の自己相補性アデノ随伴ウイルスベクター（ｓｃＡＡＶ）を含む端鎖ＤＮＡが作成できる、プラスミドＤＮＡを構築するための例示の方法である。この実施例において、プラスミドＤＮＡを作成するプロセスは８工程を含む。プラスミドＤＮＡがこれらの８つの工程により作成できたら、次に、大量のプラスミドＤＮＡ（例えば、マイクログラム、ミリグラム、又はグラムのプラスミドＤＮＡ）を当業者に知られている方法により、例えば、細菌を当該プラスミドで形質転換し、大量の細菌を生育させ、次に細菌培養液から大量のプラスミドＤＮＡを回収することにより、作成することができる。大量のプラスミドＤＮＡから、大量の人工の自己相補ＡＡＶをさらなる２つの工程により作成することができる。これらの工程の全ては、以下に記載される。
材料
ｓｃＡＡＶを含む単鎖ＤＮＡが生成され得る「ｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕ」と呼ばれるプラスミドＤＮＡを以下の出発物質を用いて作成する：
１）ストラタジーン社（ラホーヤ、ＣＡ）から市販されているファージミッドプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ，カタログ＃２１２２０７。
【０１５２】
２）インビトロジェン（カールスバッド、ＣＡ）から市販されているプラスミドｐＣＭＶ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ＧＦＰ，カタログ＃Ｖ８２０−２０。
３）ストラタジーン社（ラホーヤ、ＣＡ）から市販されているプラスミドｐＡＡＶ−ＬａｃＺ，カタログ＃２４００７１。
【０１５３】
４）アンビオン社（オースチン、ＴＸ）から市販されているプラスミドｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０，カタログ＃７２０７。
本明細書において以下に記載されるとおり、当業者に知られている方法を用いて、制限酵素を用いてこれらのプラスミドを切断する。用いられた制限酵素は：ＡｌｗＮＩ，ＰｖｕＩＩ，ＡｖａＩＩ，ＰｓｔＩ，ＫｐｎＩ，Ｂｓｕ３６Ｉ，ＳｃａＩ，ＳｆｉＩ，ＮｈｅＩ，ＢｓｓＳＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｂｓｔ１１０７Ｉ，ＳｐｅＩ，及びＳｓｐＩであり、ニューイングランドバイオラブズ社（ベヴァリー、ＭＡ）から入手可能である。
【０１５４】
本明細書において以下に記載されるとおり、ＤＮＡ修飾酵素及びＤＮＡ連結酵素を用いて、ＤＮＡ断片を当業者に知られている方法を用いて集合させる（ａｓｓｅｍｂｌｅ）。これらの酵素は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ４リガーゼであり、プロメガ社（マジソン、ＷＩ）からそれぞれカタログ＃Ｍ４２１１及びカタログ＃Ｍ１８０１にて入手可能である。
【０１５５】
さらに、以下のカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドへのライゲーションのためのＤＮＡ断片を構築する。
【０１５６】
【化３】
【０１５７】
さらに、以下のカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして、上記の工程の結果を評価し、そしてあとの工程に進む成功したプラスミドクローンを選択するために使用される。
【０１５８】
【化４】
【０１５９】
また、以下のカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プラスミドとして、ｐＰｖｕＡＢと呼ばれるプラスミドを生成するためにｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩと呼ばれるプラスミドへの挿入のためにＰＣＲ産物を生成するために使用され、以下に記載されるとおりである。
【０１６０】
【化５】
【０１６１】
プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＰｖｕを構築するための方法：
工程１−１：これは、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋に見いだされる予め存在するＡｌｗＮＩ制限部位を除去するために必要な２つの工程の最初である。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋を、９つのヌクレオチド「．．．ＣＡＧＮＮＮＣＴＧ．．．（式中、「Ｎ」はあらゆるデオキシリボヌクレオチドを表す）」の二重鎖ＤＮＡ配列を認識して切断する、制限酵素ＡｌｗＮＩにより直鎖状化する。プラスミドをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、直鎖状化されたプラスミドの突出した５−プライムエンド及び３−プライムエンドを平滑化する。結果は、切断されたエンドから３つの「ＮＮＮ」ヌクレオチドの損失である。プラスミドのエンドを、次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。結果はプラスミドのエンドの再接合であり、今、配列「．．．ＣＡＧＣＴＧ．．．」が形成される。結果のプラスミドはｐＢｌｕｅＭｏｄ１と呼ばれる。
【０１６２】
工程１−２：予め存在するＡｌｗＮＩにおけるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋のＤＮＡ配列がヌクレオチドの別の「ＣＡＧ」配列が５−プライム方向において前に来るので、プラスミドｐＢｌｕｅＭｏｄ１は、なおも、ＡｌｗＮＩ制限部位「．．．ＣＡＧＣＡＧＣＴＧ．．．」を含む。このＡｌｗＮＩ制限部位を除くため、プラスミドｐＢｌｕｅＭｏｄ１を用いて工程１の手法を再び実施する。即ち、ｐＢｌｕｅＭｏｄ１を酵素ＡｌｗＮＩにより直鎖状化する。プラスミドをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、直鎖状化されたプラスミドの突出した５−プライムエンド及び３−プライムエンドを平滑化する。結果は、切断されたエンドから３つの中間の「ＣＡＧ」ヌクレオチドの損失である。プラスミドのエンドを、次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。結果はプラスミドのエンドの再接合であり、配列「．．．ＣＡＧＣＴＧ．．．」が形成される。この配列は前にＴＧＧがあり、後ろにＧＴＡが続き、結果の「ＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡ」配列（配列番号：２４）はもはやＡｌｗＮＩ酵素の認識部位を形成しない。結果のプラスミドは、もはやＡｌｗＮＩにより切断することができず、ｐＢｌｕｅＭｏｄ２と呼ばれる。
【０１６３】
工程２：この工程の目的は、追加のＤＮＡ断片がのちの工程において挿入できるようにｐＢｌｕｅＭｏｄ２に制限部位を挿入するためである。挿入された制限部位は酵素ＡｌｗＮＩ及びＢｓｕ３６Ｉのための部位である。挿入物を構築するため、Ｏｌｉｇｏ２ＡｆとＯｌｉｇｏ２Ａｒ（上で掲載）を共に単一の試験管内で混合し、摂氏６５度に５分間加熱し、次に、冷却して室温にすることにより、各種類の２つのオリゴがアニールして短い二重鎖ＤＮＡ分子の形成を誘導する。二重鎖ＤＮＡのエンドをキナーゼで処理することにより、エンドをリン酸化し、次に、二重鎖ＤＮＡを、ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素による切断により直鎖状化されていたｐＢｌｕｅＭｏｄ２プラスミドＤＮＡに連結する。結果のプラスミドをｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩと呼ぶ。ｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩの構築の成功は、プライマーＰＣＲ２Ｃｆ及びＰＣＲ２Ｃｒを用いたＰＣＲにより仮想ｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩプライマーからのＰＣＲ産物を増幅して確認することができる。４３３塩基対のＰＣＲ産物のサイズが正確なｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩプラスミドクローンによりもたらされる。
【０１６４】
工程３：この工程の目的は、プラスミドｐＣＭＶ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ＧＦＰ中の緑色蛍光蛋白質をコードする配列内からの制限酵素ＰｓｔＩとＢｓｓＳＩの制限部位を除去することである。これは、緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を保存するが異なるＤＮＡ配列を使用するＤＮＡ挿入物であって、ＰｓｔＩ及びＢｓｓＳＩ認識配列により適合される如何なる配列をも欠く挿入物を構築することにより行われる。当該挿入物を構築するために、Ｏｌｉｇｏ３ＡｆとＯｌｉｇｏ３Ａｒ（上で掲載）を共に単一の試験管内で混合し、摂氏６５度に５分間加熱し、次に、冷却して室温にすることにより、各種類の２つのオリゴがアニールして短い二重鎖ＤＮＡ分子の形成を誘導する。二重鎖ＤＮＡのエンドをキナーゼで処理することにより、エンドをリン酸化し、次に、二重鎖ＤＮＡを、ＳｆｉＩ及びＮｈｅＩ制限酵素による切断により直鎖状化されていたｐＣＭＶ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡに連結する。結果のプラスミドをｐＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｍｏｄと呼ぶ。ｐＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｍｏｄの構築の成功は３つの様式により確認することができる：ａ）プラスミドをＰｓｔＩとＢｓｓＳＩにより切断してサイズ１３０、５５５、及び４９２６塩基対の３つのＤＮＡ断片をもたらす（ＢｓｓＳＩは上記プラスミドを３カ所で切断するが、ＰｓｔＩは全く切断しないからである）、ｂ）プラスミドをＰＶｕＩＩにより切断してサイズ１０５５及び４５５６塩基対の２つのＤＮＡ断片をもたらすが、ｐＣＭＶ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ＧＦＰ中の＃６７０位のＰｖｕＩＩ部位が除去されているからであり、及びｃ）ｐＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｍｏｄをトランスフェクトされた細胞が蛍光顕微鏡により見える緑色蛍光蛋白質を発現することを確認することによる。
【０１６５】
工程４：この工程の目的は、プラスミドｐＣＭＶ−ＧＦＰ−ＭｏｄからのＣＭＶ−ＧＦＰコーディング配列を得て、そしてそれをｐＡＡＶ−ＬａｃＺプラスミドに挿入することである。これは、プラスミドｐＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｍｏｄを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩＩを用いて切断して、結果の１７１４塩基対断片を電気泳動及びゲルからのＤＮＡ断片の溶出により、当業者に知られている方法を用いて行う。１７１４塩基対断片のエンドはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑化し、そして平滑化されたエンドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｔ１１０７１により直鎖状化されたｐＡＡＶ−ＬａｃＺへ連結する。ＣＡＧ−ＧＦＰの３−プライムエンドとポリＡ発現カセットがＥｃｏＲＩ制限部位に位置するように並べて挿入物が連結されたプラスミドを同定するために、結果のクローンをふるいにかける。結果のプラスミドをｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶと呼ぶ。ｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶの構築の成功は、予測によれば１８９６塩基対及び３２９１塩基対のＤＮＡ断片をそれぞれ生じるＥｃｏＲＩとＳｃａＩにより候補プラスミドを切断することにより確認することができる。逆の不所望の向きの挿入物を含むクローンはＥｃｏＲＩにより切断されず、サイズ５１８７塩基対の単一のＤＮＡ断片をもたらす。
【０１６６】
工程５：工程５の目的は、ＢＡＣＥ１を標的とするｓｉＲＮＡを構成する短いヘアピンＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列（アルツハイマー病の治療法として患者内でＢＡＣＥ１酵素の発現を抑圧するため）をｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶプラスミドへ挿入することである。これは、ＢＡＣＥ１を標的とするヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡが先に構築されたプラスミドｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−抗ＢＡＣＥ１を酵素ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩにより切断し、そして結果の３８６塩基対の断片をゲル電気泳動及びゲルからのＤＮＡ断片の溶出により行う。ＢＡＣＥ１を標的とするヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡの構築は、米国特許出願公開番号２００４／０２２０１３２ Ａ１（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）に開示されている。断片をプラスミドｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶ（工程４において構築された）へ、ｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶに見いだされる唯一のＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位の間に連結する。結果のプラスミドをｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰと呼ぶ。それは、今、２つのＰｖｕＩＩ制限部位の間に、５−プライムから３−プライムに向かって以下をコードするＤＮＡ配列を含む：ＰｖｕＩＩ部位、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、Ｕ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、抗ＢＡＣＥ１ヘアピン配列、Ｕ６転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体、ＧＦＰ蛋白質コードの逆相補体、ＣＭＶプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、ＰｖｕＩＩ部位。即ち、それは、５−プライムから３−プライムに向かって、抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡの発現カセット、及び逆方向にリポーター遺伝子ＧＦＰの発現カセットを含む。
【０１６７】
工程６：この工程の目的は、ｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰから、５−プライムＰｖｕＩＩ部位から伸長するＤＮＡ断片及び５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列を、ＣＭＶプロモーターの逆相補体を通して得ることであるが、３−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピートは含まない。この断片を次にｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩへＰｓｔＩ制限部位とＢｓｕ３６Ｉ制限部位の間に挿入することにより、ｐＰｖｕＡＢと呼ぶプラスミドを生成する。ｐＡＡＶ−抗Ｂｓｕ１−ＧＦＰからの断片は、ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅により、ＰＣＲ６Ａｆ及びＰＣＲ６Ａｒをプライマー（上記）として用いて得る。結果の２５４９塩基対のＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマーＰＣＲ６Ａｆ及びＰＣＲ６Ａｒのデザインのため、そのエンドにＰｓｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉ制限部位を含む。当該断片をこれらの酵素で切断して、次に、ＰｓｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉにより直鎖状化されてあったｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩ内に連結する。ｐＰｖｕＡＢの構築の成功は、候補のプラスミドを、成功クローンに関してはサイズ１３０、９４２、及び４３３５の３つの断片をもたらし、不所望の方向に挿入物を有する不成功のクローンに関してはサイズ１３０、２３５０、及び２９２７の３つの断片をもたらし、そして挿入物を獲得しなかった不成功のクローンに関してはサイズ１３０と２７８０の２つの断片をもたらす制限酵素ＳｓｐＩにより切断することにより確認できる。
【０１６８】
工程７：この工程の目的は、ｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰからの断片をプラスミドｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩに挿入し、今度は（ｔｈｉｓ ｔｉｍｅ）、断片がｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰ中のＰｖｕＩＩ制限部位の間に全ＤＮＡ配列からなる。これは、プラスミドｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰを制限酵素ＰｖｕＩＩにより切断し、そして２５９０塩基対のＤＮＡ断片をゲル電気泳動及びゲルからのＤＮＡ断片の溶出により行う。当該断片を、次に、工程２において導入された唯一の制限部位においてＡｌｗＮＩ酵素を用いて直鎖状化されていたｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩプラスミドへ平滑末端連結する。所望の方向に挿入物を有するプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩによる切断により確認するが、所望の方向で挿入物を有するプラスミドにおいてはサイズ５３９及び４９７５塩基対の２つの断片をもたらすが、不所望の方向に挿入物を含むプラスミドにおいてはサイズ２０５９及び３４５５の断片をもたらし、そして挿入物を有さないプラスミドにおいてはサイズ２９２４の一つの断片をもたらす。所望の方向において挿入物を含む結果として生じたプラスミドをｐＰｖｕＡＢＣと呼ぶ。それは、５−プライムから３−プライムの方向に、以下をコードするＤＮＡ配列を含む：ＰｖｕＩＩ部位、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、Ｕ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、抗ＢＡＣＥ１ヘアピン配列、Ｕ６転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体、ＧＦＰ蛋白質コードの逆相補体、ＣＭＶプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、ＡｌｗＮＩ部位。ｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩ中のオリジナルＡｌｗＮＩ部位の３−プライム半分は挿入物の連結により復元されたが、挿入物の３−プライムエンドがＡｌｗＮＩ認識部位の「ＣＡＧ．．．．．．．」部分を再供給したからである。
【０１６９】
工程８：プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕの製造における最終工程は、プラスミドｐＰｖｕＡＢからのＰｖｕＡＢ部分をプラスミドｐＰｖｕＡＢＣへ平滑クローン化（ｂｌｕｎｔ ｃｌｏｎｅ）して、所望のプラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕを生成することである。これは、プラスミドｐＰｖｕＡＢを酵素ＰｓｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉにより切断し、そしてサイズ２４７９塩基対の結果の断片を回収することにより達成される。この挿入物のエンドを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑化する。挿入物を、次に、制限酵素ＡｌｗＮＩにより切断されて直鎖状化されていたプラスミドｐＰｖｕＡＢＣへ平滑末端連結される。ＰｖｕＩＩによる切断により挿入物の所望の方向を有するプラスミドを同定するため、結果のプラスミドをふるいにかける。ＰｖｕＩＩによる切断の場合、所望の挿入物を有するプラスミドクローンは、サイズ１８２、２３７、５８６、１９２１、及び５０８５塩基対の５つのＤＮＡ断片を生じる。不所望の方向に挿入物を有するプラスミドクローンは、サイズ１８２、５８６、１９２１、２５９５、及び２７２７塩基対の長さの５つの断片を生じる。挿入物を有さないプラスミドクローンは、サイズ１８２、２３２、５８６、１９２１、及び２５９０塩基対の長さの５つの断片を生じる。所望の方向に挿入物を有する結果のプラスミドは、５−プライムから３−プライムの方向に、以下をコードする５０８５塩基対のＤＮＡ配列を含む：ＰｖｕＩＩ部位、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、Ｕ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、抗ＢＡＣＥ１ヘアピン配列、Ｕ６転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体、ＧＦＰ蛋白質コードの逆相補体、ＣＭＶプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、ＣＭＶプロモーター、ＧＦＰ蛋白質コード、ポリアデニル化シグナル配列、Ｕ６転写終結配列の逆相補体、抗ＢＡＣＥ１ヘアピン配列の逆相補体、Ｕ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、ＰｖｕＩＩ部位。
プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕから人工ＡＡＶを構築する方法：
プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕからの抗−ＢＡＣＥ１ ＲＮＡ転写物をコードする人工の自己相補アデノ随伴ウイルスベクター（ｓｃＡＡＶ）を含む単鎖ＤＮＡを得るためには、２つの工程しか必要ない。
【０１７０】
工程１：プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕを制限酵素ＰｖｕＩＩにより切断し、そしてサイズ５０８５塩基対のＤＮＡ断片を当業者に知られている方法、例えば、ゲル電気泳動及びゲルからの溶出により、回収して精製する。
【０１７１】
工程２：５０８５の二重鎖ＤＮＡ断片を希釈水溶液に注ぎ、９９℃に５から１０分間温め、次に、室温に冷却する。加熱は二重鎖ＤＮＡの２つの鎖が分離するか又は「融解」して離れることを引き起こす。分離して希釈溶液中にあると、これらの２つの鎖各々が、それらの相補鎖と再アニールしてサイズ５０８５塩基対の二重らせんを形成するより、たぶん自己アニールして、約２５４２塩基対の長さの大きなＤＮＡヘアピンを形成する。オリジナルの二重鎖ＤＮＡの各鎖からの、結果の大きなＤＮＡヘアピン分子は同一であり、そして各々は所望の単鎖自己相補性の人工ＡＡＶベクターである。
【０１７２】
本発明の一つの態様においては、結果の単鎖ＤＮＡを次に動物又はヒト患者への静脈内又は動脈内投与のためペギル化イムノリポソームへパッケージされて、動物又はヒト患者の血液−脳バリヤーを通って中枢神経系内の細胞へ輸送され、中枢神経系の疾患の治療を提供する。例えば、ＢＡＣＥ１酵素を標的とする小干渉ＲＮＡへ細胞が加工するするＲＮＡヘアピンをコードするＤＮＡ配列を含むｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕプラスミドにより生産された、結果の単鎖ＤＮＡを、アルツハイマー病の治療法としてヒト患者において血液−脳バリヤーを通してデリバリーできる。
【０１７３】
匹敵する様式において、遺伝子産物の不在又は欠損により引き起こされる疾患（先天性代謝異常、リソソーム貯蔵障害を含む）の治療がなされて、５−プライムエンドにプロモーターを作動可能に連結され、そして３−プライムエンドにポリアデニル化シグナル配列を作動可能に連結された、欠落したか又は欠損している遺伝子産物をコードする配列を、ｓｉＲＮＡ及び緑色蛍光蛋白質のコード配列の代わりに、プラスミドｐＰｖｕＡＢ及びｐＰｖｕＡＢＣへ挿入することにより、本発明の態様として動物又はヒト患者へデリバリーされ得る。これらの２つのプラスミドから、フォームｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕの単一のプラスミドを次に上記の工程８に記載された方法により作成してよい。次に、自己相補性ＡＡＶをそのｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕプラスミドから上記の方法を用いて生産し、そして動物又はヒト患者への静脈内又は動脈内投与のためペギル化イムノリポソームへパッケージされて、当該単鎖ＤＮＡが血液−脳バリヤーを通って中枢神経系内の細胞へ輸送される原因となる。この投与治療法は、遺伝子欠損により引き起こされた疾患の中枢神経系の表明（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ）、並びに当該疾患の組織的表明の治療を提供する。
実施例６
実施例５に記載された人工アデノ随伴ウイルスベクターを米国特許番号６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）に記載されたのと類似の様式にて製造してリポソーム内にパッケージされることにより、組成物を提供する。当該組成物をヒトアルツハイマー病の認められた動物モデルであるＴｇ２５７６トランスジェニックマウスの尾部の静脈に注射する。当該マウスを実質上のベータ−アミロイドプラークが非投与対象において観察されると予測される齢までフォローアップする。当該マウスを次に犠牲にしたところ、非投与マウスよりも投与マウスにおいて、より少ないベータ−アミロイドプラークが観察される。
実施例７
以下の実施例は本発明の一つの態様により二重鎖人工ＡＡＶベクターを製造するための例示の方法である。この実施例においては、本明細書に開示された実施例５の工程１から工程５の方法に従い、プラスミドｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰを構築した。結果のプラスミドは、２つのＰｖｕＩＩ制限部位の間に所望のＤＮＡセグメント含む。特に、プラスミドは、５−プライムから３−プライムに向かって、ＰｖｕＩＩ部位、ＡＡＶヘアピン配列、Ｕ６転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体、ＧＦＰ蛋白質コードの逆相補体、ＣＭＶプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列及びＰｖｕＩＩ部位をコードするＤＮＡ配列を含む。即ち、それは、５−プライムから３−プライムの方向に、抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡの発現カセット、及びリポーター遺伝子ＧＦＰの発現カセットを逆の方向に含む（図５参照）。
【０１７４】
プラスミドｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰ中のＡＡＶ ＩＴＲｓを周囲に有する発現カセットを単離するために、７５μｇのプラスミドを制限酵素ＰｖｕＩＩとＳｃａＩにより、当業者によく知られた方法を用いて消化した。ＳｃａＩは当該プラスミドバックボーンを２つの類似の断片に消化して、プラスミドバックボーンと所望の挿入物の間にさらなる識別を可能にさせた。直鎖状断片をキアゲンのキアゲンＩＩゲル精製キットを用いてゲル精製した。直鎖状断片のパーセント回収及び質を２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸収を測定することにより分光測光法により測定した。この定量を通して、出発製品（ｐｒｏｄｕｃｔ）の６０％が回収されて精製された直鎖状断片が十分な質であった（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．９）ことが確定された。
【０１７５】
ＡＡＶ ＩＴＲｓが二次構造をとることを許容するため、４．５μｇの直鎖状断片（９０ｎｇ／μｌ）を６５℃に１０分間加熱することにより温度処理し、そして最短で１０分かけて室温にゆっくりと冷却した。次のインビトロ実験における使用のための対照として、未処理の直鎖状断片を室温に１０分間そのままにして加熱された断片を冷却した。未処理の直鎖状断片及び処理された（加熱されて冷却された）断片の予測されるコンフォメーションをそれぞれ図３と図４に示す。室温におけるインキュベーションの直後に、これらの人工ＡＡＶベクターを一時的にＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。
【０１７６】
トランスフェクション実験の目的は、人工ＡＡＶベクターをトランスフェクトされた細胞内でのＥＧＦＰ発現の長命性（ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）を、ＥＧＦＰ発現カセット（ｐＴＲＡＣＥＲ−ＣＭＡ２，インビトロジェンコーポレーション、カールスバッド、ＣＡ、により入手可能）を含む環状プラスミドをトランスフェクトされた細胞内のＥＧＦＰ発現の長命性と比較することであった。この実験は、本発明の人工ＡＡＶベクターで処理された細胞内でのＥＧＦＰ発現が環状プラスミドｐＴＲＡＣＥＲ−ＣＭＶ２で処理された細胞内でのＥＧＦＰ発現よりも長く続いき得たか否かを観察するためにデザインされた。
方法：ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション：
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１１２６８）を、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含み、そして１０％ＦＢＳ及びペニシリンとストレプトマイシンを追加されたＤＭＥＭ中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションの前日に６ウエル組織培養プレートに５ｘ１０５細胞／ウエルの密度にて接種した。この接種密度は、トランスフェクションの日に約８０％コンフルエントのウエルを生じた。
【０１７７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＴｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ（ミルス）をトランスフェクトし、製造者の推奨に従った。簡単に言えば、６μＬのＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯを２００μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ還元血清培地に５ｍＬポリスチレンチューブ中で加えた、ボルテックス混合した。希釈されたトランスフェクション試薬を室温において１５分間インキュベーションした。１マイクログラムの適切なＤＮＡを各チューブに加え、ＤＮＡを穏やかに混合して室温において２０分間インキュベーションした。サンプルは：（１）偽トランスフェクトされた（Ｈ２Ｏ）；（２）ｐＴＲＡＣＥＲプラスミド（１μｇ）；（３）人工ＡＡＶベクター（１μｇ）；及び（４）温度処理された（例えば、加熱されて冷却された）人工ＡＡＶベクター（１μｇ）を含んだ。インキュベーション後に、細胞上の培地を除去し、そして２ｍＬの正常な生育培地（ＤＭＥＭ，高グルコース、１０％ＦＢＳ，ペニシリン／ストレプトマイシン）に置き換えた。ＤＮＡ複合体をゆっくりと細胞に滴下により加え、穏やかな振動により混合した。トランスフェクトされた細胞を３７℃において５％ＣＯ２を含む湿潤加湿器中でインキュベートした。ＥＧＦＰ発現後に、トランスフェクトされた細胞の写真を２−４日ごとにトランスフェクションの３０日後まで撮った。全ウエルを表すエリアを写真に撮った。写真を撮った日に、全てのトランスフェクト細胞上の培地を新鮮な正常生育培地に置き換えた。
【０１７８】
トランスフェクトされた細胞中のＥＧＦＰ発現の比較を可能にするため、デジタル写真の全てを同じパラメーターで撮った。イメージの分析は、人工ＡＡＶベクターからのＥＧＦＰ発現の持続を明らかにした。さらに、加熱して冷却した人工ＡＡＶベクターは、細胞をトランスフェクトしてＥＧＦＰ発現を持続することに関して、実質上はいっそう有効であった。これは、図６に示すとおりトランスフェクションの６日及び２３日後に回収されたイメージにて明らかである。
【０１７９】
図６において観察され得るとおり、９５％を超えるプラスミド由来のＥＧＦＰ発現がトランスフェクションの１２日後に消失した。最後の温度処理工程（例えば、加熱及び冷却）なしに生産された人工ＡＡＶベクターはほんの僅かな細胞においてのみＥＧＦＰ発現を生じた；しかしながら、ＥＧＦＰ発現はそれらの細胞中で持続した。観察された持続は、トランスフェクトされた細胞の少数においてＡＡＶ−ＩＴＲｓの二次構造の形成、続いて二次構造が上記細胞中でＩＴＲｓを達成したためにＥＧＦＰの発現が持続する指標として解釈され得る。温度処理工程（例えば、加熱及び冷却）を含む開示方法に従い製造された人工ＡＡＶベクターは、トランスフェクションの２７日後に連続するＥＧＦＰ発現をもたらした。連続する発現は温度処理工程（例えば、加熱及び冷却）によるＡＡＶ−ＩＴＲｓの二次構造の形成の指標として解釈でき、ＥＧＦＰの持続する発現に資するこれらの構造が人工ＡＡＶベクターによりトランスフェクトされた実質上全ての細胞に存在した。
【０１８０】
実験はトランスフェクションの２７日後に終了したが、顕著な細胞の損失がこの時間点の後に起こり始めたからであった。温度処理された人工ＡＡＶベクターからの発現を上記プラスミドからの発現と比較すると、発現の持続における１００％を超える増加（日数）が人工ＡＡＶベクターから得られた。
【０１８１】
この実施例は、顕著で安定な発現が主題の発明の態様である人工ＡＡＶベクターから得られて、開示された方法に従い生産できることを例示する。この人工ＡＡＶベクターからの発現は、環状プラスミドからの発現よりも長く持続すると観察された。
【０１８２】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物、及び電子上利用可能なマテリアル（例えば、ジェンバンクアミノ酸及びヌクレオチド配列サブミッション；及び蛋白質データバンク（ｐｄｂ）サブミッション）は、引用により本明細書に取り込まれる。前記の詳細な説明及び実施例は、理解の明確化のためのみに提供された。不必要な限定はそこから理解されるべきでない。発明は、特許請求の範囲により規定された発明の範囲内に含まれる当業者には自明の様々なバリエーションに関して示されて記載された正確な詳細に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、実施例４に記載されたとおりに、測定された蛍光（ｙ軸、蛍光ユニット）対時間（ｘ軸、分）のグラフ描写による、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの蛋白質抽出物中の全ＢＡＣＥ酵素活性を示す。バックグラウンド値（アッセイ試薬のみ、細胞なし）をシンボル「◆」で表す。ＭＢ１７４９のｓｉＲＮＡ及びｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅの値をシンボル「●」で表す。ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照及びｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅの値をシンボル「△」で表す。
【図２】図２は、単鎖ＤＮＡのデリバリーのための自己相補性人工ＡＡＶベクターの一つの態様を模式的に表す。人工ＡＡＶベクターは、５プライムから３プライム方向に向かって、５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）；単鎖ＤＮＡ（α−ＢＡＣＥ１／ｐＣＭＶ＾ＥＧＦＰ）；内部ＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）；単鎖ＤＮＡの逆相補体（α−ＢＡＣＥ１／ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）；及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）を含む。
【図３】図３は、直鎖の二重鎖ＤＮＡのデリバリーのための人工ＡＡＶベクターの一つの態様を模式的に表す。直鎖の二重鎖のＤＮＡ（α−ＢＡＣＥ１／ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）は、ＡＡ−ＩＴＲｓ（ＩＴＲ）を各鎖の５プライムエンド及び３プライムエンドに有する。
【図４】図４は、少なくとも１回の加熱及び冷却サイクルにおいて加熱処理された図３中に示された直鎖の二重鎖ＤＮＡのデリバリーのための人工ＡＡＶベクターの一つの態様を模式的に表す。模式図は、内部ハイブリダイズするように各ＩＴＲの自己相補部分を許容するようにＩＴＲｓが折り畳まれる、ＩＴＲｓの二次構造を示す。
【図５】図５は、実施例７の工程１から５により生産されて実施例７において使用されたとおりの、プラスミドｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰの一つの態様の模式的描写を表す。当該プラスミドは、２つのＰｖｕＩＩ制限部位の間に、５プライムから３プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）、ＤＮＡセグメント（α−ＢＡＣＥ１／ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）、及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）を含む。
【図６】図６は、ｐＴＲＡＣＥＲ ＣＭＶ２環状プラスミド（図６ａ及び６ｄ）；本発明の直鎖状二重鎖人工ＡＡＶベクター（図６ｂ及び６ｅ）；又は６５度に加熱して室温に冷却した本発明の直鎖状二重鎖人工ＡＡＶベクター（図６ｃ及び６ｆ）をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡イメージの写真を示す。当該写真は、実施例７に記載された、トランスフェクション６日後（図６ａ−６ｃ）とトランスフェクション２３日後（図６ｄ−６ｆ）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＥＧＦＰの発現を示す。
【発明の開示】
【０００１】
この出願は、その全体を引用により本明細書に編入する、２００４年６月２１日出願の米国仮出願連続番号６０／５８１，７３０の利益を主張する。
背景
脳への生物学上活性な因子のデリバリーは、様々な神経障害を治療する重要且つ挑戦的な側面である。いくつかの神経障害の治療のために、脳細胞が、ＤＮＡ、例えば失われた遺伝子を発現する（即ち、遺伝子治療）、及び／又はＲＮＡ、例えば小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現することを誘導する生物学上活性な因子（例えば、治療剤）を脳にデリバリーすることが望まれる。
【０００２】
神経障害の治療のための遺伝子治療に対するいくつかのアプローチは、非ウイルス又はウイルスベクターの脳組織への直接の外科的デリバリーを含むが、非ウイルス及びウイルスベクターは一般に血液−脳バリヤー（ＢＢＢ）を通過しないため、通常は必要とされる。これらのアプローチは、脳の標的化されたエリアへのウイルスベクターの十分な分配と拡散を達成する困難により、そして患者内で免疫反応を生じさせるウイルスベクターの可能性により、制限される。ベクターの脳組織への拡散の増強を達成するための一つのアプローチは、「対流増強デリバリー（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」の技術を用いることであり、それにより、非ウイルス又はウイルスベクターは、低い流速にて長い期間にわたり、ベクターを組織へ分配することを増強するための圧力と流量を提供するポンプを用いて投与される。対流増強デリバリーは、齧歯類及び霊長類の脳の実質上の三次元領域への分子及びウイルス粒子のデリバリーを生じることが示されたが、ヒトの脳の三次元体積へのこのデリバリーアプローチのスケールアップは、技術的挑戦として残されたままである。特定の神経疾患（例えば、アルツハイマー病）の遺伝子又は蛋白質デリバリー又は抑圧デリバリーを用いた有効な治療は、ヒト大脳のほとんどへの生物学上活性な因子のデリバリーを、おそらくは必要とする。他の神経障害、例えば、パーキンソン病及びハンチントン病においては、疾患のプロセスにより本質的には影響される脳の解剖組織の制限された領域、例えば、黒質又は線条体があるとしても、そして疾患の主要な兆候をもたらすとしても（例えば、運動異常、硬直（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）等）、患者は、疾患プロセスが追加の兆候を誘導する、脳の広い領域の処置からさらに利益をおそらくは得ることになる（例えば、機能低下及び認識不足）。
【０００３】
例えば、視床下核への遺伝子治療のデリバリーのためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用を含む、定位神経外科手術を用いて脳へ遺伝子又は遺伝子抑圧剤をデリバリーするためのウイルスベクターを用いたアプローチは、相当有望であることが示された。しかしながら、遺伝子又は蛋白質抑圧治療を運ぶウイルスベクターをデリバリーするための定位神経外科手術の有用性は、以下の因子の一つ又はそれ以上により制限され得る。定位神経外科手術は、いつも低レベルの外科手術の危険性を含み、例えば、血管を偶発的に穿孔することであり、脳出血及び死をもたらし得る。ウイルスベクターの脳組織の大きな領域への分散は、対流増強デリバリー及び最適のベクター、カテーテルデザイン、及び外科手術の技術を用いてさえも、何が血流、例えば分配系を用いて達成され得るかに関して、おそらくは制限される。治療用の十分な量のウイルス粒子（例えば、キャプシッドプラスＤＮＡ有効搭載量）の製造は、ありそうであるが、ＤＮＡのみの生産に比較してコストがかかる。ウイルス粒子（即ち、キャプシッド蛋白質）は免疫原性であるかもしれず、感作された個体において逆の作用を引き起こす。脳に投与されたときのいくつかのウイルス（例えば、ＡＡＶ）に対しての免疫応答は最小らしいが、繰り返しの治療投与に特別な有力な限界を残す。
【０００４】
単なる皮下注射よりも非侵入性の経路により生物学上活性な因子を投与することは、有利である。このアプローチにより、生物学上活性な因子はＢＢＢを通して内生ＢＢＢ輸送系により脳に対して生物学上活性な因子を標的化することにより、デリバリーすることができる。脳中のＤＮＡ又はＲＮＡの発現は、血液に注射された生物学上活性な因子がＢＢＢ、例えば受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＡ）によってのみならず、脳細胞膜（ＢＣＭ）、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシス（ＲＭＥ）を通して脳中の標的細胞に輸送されることを必要とする。さらに、内生ＢＢＢ輸送系を、脳に対して非侵入性に生物学上活性な因子を標的化するために用いることは、血流中で安定な生物学上活性な因子の適切な製剤の開発も必要とする。
【０００５】
プラスミドＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡを含む組成物を用いて、血液−脳バリヤーを通って脳細胞へ、全霊長類の脳に遺伝子治療をデリバリーするための有効な方法は、最近、米国特許番号６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）により開示された。プラスミドＤＮＡを全霊長類の脳にデリバリーするためのこの方法の報告された能力は、印象的な技術的ブレイクスルーからなる。しかしながら、開示された方法の治療用途は本明細書において以下に示す因子の一つ又はそれより多くにより制限されるかもしれない。プラスミド又はＤＮＡからの遺伝子発現は、一般に一時的である（例えば、日又は週の期間に制限される）。開示された組成物の皮下デリバリーは、全てのからだの器官の意図されない処置をもたらし得るので、副作用をもたらす可能性がある。最後に、皮下デリバリーは、脳に意図された用量がからだの他の部分へデリバリーされるために、用量の損失をもたらし得る。
【０００６】
即ち、生物学上活性な因子を脳へデリバリーするための新規な組成物及び方法が必要とされる。
発明の概要
一つの側面において、本発明は、血液−脳バリヤーを通して生物学上活性な因子をコードするＤＮＡをデリバリーするための医学的システムを提供する。
【０００７】
一つの態様において、上記システムは、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテル；及びカテーテルへ、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を輸送する手段；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む。
【０００８】
別の態様において、上記システムは、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテル；及びカテーテルへ受容体特異的リポソームを含む組成物をデリバリーするための手段を含むが、受容体特異的リポソームは、外部表面及び内部区画を有し、リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤を含み、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっている。
【０００９】
別の側面において、本発明は、脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための方法を提供する。当該方法は、受容体特異リポソームであって、リポソームは外部表面及び内部区画を有し、リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているものを含む組成物を患者に投与することを含む。
【００１０】
別の側面において、本発明は、ＤＮＡを細胞にデリバリーするための方法を提供する。当該方法は、受容体特異的ナノコンテナーを含む組成物であって、受容体特異的ナノコンテナーは外部表面及び内部区画を有し、ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっている、組成物を患者に投与することを含む。
【００１１】
別の側面において、本発明は、脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための方法を提供する。当該方法は、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む組成物を患者に投与することを含む。
【００１２】
別の側面において、本発明は、病原性蛋白質により引き起こされる神経変性障害を治療する方法を提供する。
一つの態様において、上記方法は、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含む。
【００１３】
別の態様において、上記方法は、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして受容体特異リポソーム及び受容体特異リポソームのための薬学上受容可能な担体を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含むが、但し、受容体特異的リポソームは外部表面及び内部区画を有し、リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているものを含む。
【００１４】
別の側面において、本発明は、蛋白質不在下で引き起こされる神経疾患を治療する方法を提供する。
一つの態様において、上記方法は、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイウス（ＡＡＶ）ベクター、及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含む。
【００１５】
別の態様において、上記方法は、患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして受容体特異的リポソーム及び受容体特異リポソームのための薬学上受容可能な担体を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含むが、但し、受容体特異的リポソームは外部表面及び内部区画を有し、リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているものを含む。
【００１６】
別の側面において、本発明は、脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための組成物を提供する。当該組成物は、受容体特異リポソームであって、外部表面及び内部区画を有するリポソームであり、但し、リポソームの内部区画内に人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが位置し；ＡＡＶベクターは、生物学上活性な因子をコードし、一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているものを含む。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ＤＮＡを細胞にデリバリーするための組成物を提供する。当該組成物は、受容体特異的ナノコンテナーであって、但し、受容体特異的ナノコンテナーは外部表面及び内部区画を有し、ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含み；細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤を含む。
【００１８】
別の側面において、本発明は、脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための組成物を提供する。当該組成物は、生物学上活性な因子をコードする人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む。
【００１９】
別の側面において、本発明は、生物学上活性な因子をコードする人工ＡＡＶベクター；及びそのようなベクターを作成して使用するための方法を提供する。
一つの態様において、本発明は、５プライムから３プライムの方向に向かって、５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含む人工ＡＡＶベクターを提供する。そのようなベクターを作成する方法も提供される。
【００２０】
別の側面において、本発明は、生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡのデリバリーのための人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、各鎖の５プライムエンド及び３プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲを有する直鎖状ＤＮＡを含む人工ＡＡＶベクターを提供する。
【００２１】
本発明は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの対流増強デリバリー、定位神経外科手術デリバリー、及び／又はプラスミドＤＮＡ又はＲＮＡを有する組成物の血液−脳バリヤーを通した皮下デリバリーを含む、生物学上活性な因子のデリバリーのための他の方法を超えた利点を提供することができる。
【００２２】
遺伝子又は遺伝子抑圧因子を患者の脳へデリバリーするための人工ＡＡＶベクターの使用は、プラスミドＤＮＡをデリバリーすること、又は実際のＡＡＶウイルス粒子をデリバリーすることを超えた多数の利点を有し得る。プラスミドＤＮＡよりも、ＡＡＶベクターのＤＮＡを脳へデリバリーする一つの可能な利点は、霊長類の脳内でのＡＡＶによりデリバリーされた遺伝子構築物の発現が少なくとも３から４年は継続することが知られていることであり、一方、プラスミドからの遺伝子構築物の発現は一時的である。ＡＡＶウイルス粒子のデリバリーを超えた合成ＡＡＶベクターのＤＮＡをデリバリーする利点は、いくつかあり得る。第１に、まさにＤＮＡのデリバリーはＡＡＶウイルスキャプシッドの患者脳へのデリバリーを回避できる。ＡＡＶウイルスキャプシッド蛋白質が免疫応答をおそらくは誘導するから、ウイルス粒子をデリバリーする必要が無しで済むということが、治療に対する逆免疫反応の危険のほとんどを回避することができる。さらに、ＤＮＡのデリバリーは、ＡＡＶキャプシッドを作成してＤＮＡをウイルスキャプシッドにパッケージするための操作されて且つ培養された細胞の使用を必要とする難しい製造工程である、完全なＡＡＶ粒子を生産する必要性を回避できる。最後に、ＡＡＶ粒子よりもＤＮＡをデリバリーすることは、約４，７００塩基のＤＮＡという、ＡＡＶキャプシッド内にパッケージできるＤＮＡの長さに対する自然の制限を回避できる。このサイズの制限は遺伝子抑圧のための構築物のデリバリーに関する問題ではないが（例えば、小干渉ＲＮＡをコードするＤＮＡ）、欠落した遺伝子の配列が４，７００塩基を超えるなら、それは欠落した遺伝子のデリバリーの制限になり得て、ＡＡＶの遺伝子治療のためのベクターとしての使用に関する制限として注目された。
定義
「アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン−１、アタキシン−３、及び／又はアトロピン−１蛋白質」は、それぞれ、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病）、ベータ部位ＡＰＰ−分割酵素（ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む））（アルツハイマー病）、ハンチンチン（ハンチントン病）、アタキシン−１（脊髄小脳変形症１型）、アタキシン−３（脊髄小脳変形症３型）、及び／又は歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）遺伝子により発現され及び／又はコードされるアミノ酸配列を含む、蛋白質又はその変異蛋白質誘導体を意味する。
【００２３】
本明細書において使用される「細胞」は、その生物学上の意味にて使用され、そして多細胞生物全体を意味しない。細胞は生物中に存在してよく、ヒトであってよいが、好ましくは哺乳類起源、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、サル（ａｐｅ）、モンキー、ブタ、イヌ、ネコ、等が好ましい。しかしながら、小干渉ＲＮＡを生成するためのいくつかの工程は、原核生物（例えば、細菌細胞）又は真核生物（例えば、哺乳類細胞）の使用を必要とするかもしれず、それにより、用語「細胞」の範囲にも含まれる。
【００２４】
「相補性」は、一つ又はそれより多くの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む分子がワトソンクリック対又は他の非伝統的種類の何れかにより一つ又はそれより多くの核酸を含む別の分子と水素結合を形成できることを意味する。
【００２５】
用語「均等な」ＤＮＡは、異なる生物（例えば、ヒト、齧歯類、霊長類、ウサギ、ブタ及び微生物）中の同じ蛋白質をコードするＤＮＡに対して相同性（一部又は全体）を有する天然に生じるＤＮＡを含むことを意味する。均等なＤＮＡ配列は、例えば、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、イントロン、イントロン−エクソンジャンクション、小干渉ＲＮＡ標的化部位及び等などの領域も含むことができ、任意に、感染性ウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のＤＮＡに取り込まれる。
【００２６】
用語「機能上均等な」は、参照配列又は蛋白質に機能上類似あらゆる誘導体を意味する。特に、用語「機能上均等な」は、生物学上の機能には顕著な逆作用なしにヌクレオチド塩基が付加されるか、欠失するか、又は置換された誘導体を含む。
【００２７】
本明細書において使用される用語「生物学上活性な」は、「因子（ａｇｅｎｔ）」又は「ｓｉＲＮＡ」と共に使用され、因子又はｓｉＲＮＡが例えば細胞の代謝、細胞の構造、細胞の機能を修飾することを含むあらゆる様式にて細胞を修飾し、及び／又は、因子又はｓｉＲＮＡを含む細胞が検出されることを可能にさせ得ることを意味する。生物学上活性な因子及び／又はｓｉＲＮＡの例は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びその混合物を含む。生物学上活性な因子又はｓｉＲＮＡは、治療用（即ち、疾患を治療又は予防できる）又は非治療用（即ち、疾患の治療又は予防には向けられない）であってよい。非治療用の生物学上活性な化合物は、例えば、特定の細胞の存在を検出し、細胞を識別し、そして／又は標的グループが特定の組織を標的とするように機能するか否かを検出するために使用することができるマーカーを含む、検出用因子又は診断用因子を含む。本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの何れかのあらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、そして二重鎖及び単鎖のＤＮＡ及びＲＮＡ、その混合物を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、コーディング配列及びノンコーディング配列、例えば、制御配列を含む異なる機能を有するヌクレオチド配列を含んでよい。コーディング配列、ノンコーディング配列、及び制御配列は、以下に定義される。ポリヌクレオチドは、天然源から直接得ることができ、あるいは、組換え、酵素的又は化学的技術の助けを借りて製造することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ベクターの一部又は断片であり得る。
【００２８】
「コーディング配列」又は「コーディング領域」は、ポリペプチドをコードし、そして適切なプロモーターの下に配置されたときに、コードされたポリペプチドを発現するポリヌクレオチドである。コーディング領域の境界は、一般には、その５−プライムエンドの翻訳開始コドンと３プライムエンドの翻訳停止コドンにより決定される。制御配列は、作動可能なように連結されたコーディング領域の発現を制御するヌクレオチド配列である。制御配列の非現定例は、プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳停止部位、転写終結因子（例えば、ポリアデニル化シグナルを含む）、及び介在配列（イントロン）を含む。「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、そう記載された成分がそれらの意図された様式にて機能するようにそれらを許容する関係にある並列を意味する。制御配列は、コーディング領域の発現が制御配列とに適合可能な条件下で達成されるような様式にて連結される（ｊｏｉｎｅｄ）場合に、コーディング配列に作動可能に連結される。用語「遺伝子」は、コーディング配列又はコーディング領域を含むポリヌクレオチドを含むことを意味する。
【００２９】
用語「ベクター」は、当業界で一般に知られており、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、等を含み、本発明のＤＮＡが挿入され得て、そしてＲＮＡが転写され得る、ＤＮＡ媒体として機能することができる。用語「ベクター」は、所望の核酸をデリバリーするのに使用されるこれらの核酸及び／又はウイルスに基づく技術の何れかを意味する。莫大な種類のベクターが存在して、当業界で公知である。
【００３０】
用語「発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写されるプロセスを規定する；ＲＮＡはさらに成熟小干渉ＲＮＡ又は細胞が蛋白質を生成し得るｍＲＮＡにさらに加工されてよい。
用語「発現ベクター」は、上で記載されたようなベクター又は媒体を規定するが、細胞への形質転換後に挿入された配列の発現を可能にするようにデザインされる。クローン化された遺伝子（挿入された配列）は、通常、プロモーターのようなコントロール要素配列のコントロール下に配置される。そのようなコントロール配列下のクローン化された遺伝子の配置は、しばしば、コントロール要素又は配列に作動可能に連結されたと称される。
【００３１】
「プロモーター」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを直接又は間接に結合することができて且つ下流の（３−プライム方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域を意味する。本発明の目的のためには、プロモーターは、その３プライム末端において転写開始部位により結合されて、上流に伸びることにより（５−プライム方向）、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルにて転写を開始するのに必要な塩基又は要素の最小の数を含む。プロモーターは、転写開始部位（Ｓ１ヌクレアーゼにより都合よく規定される）並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に必須の蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）において見いだされる。真核生物のプロモーターは、しばしば、いつもではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、−１０及び−３５コンセンサス配列を含み、転写を開始するために機能する。
【００３２】
「相同性」は、２つ又はそれより多い核酸分子のヌクレオチド配列が部分的又は全体に同一であることを意味する。
「高度に保存された配列領域」は、標的遺伝子内の一つ又はそれより多くの領域のヌクレオチド配列が１つの世代が他方とは顕著に異ならないか又は一つの生物システムが他方とは顕著に異ならないことを意味する。
【００３３】
「阻害する」又は「阻害的（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）」は、標的遺伝子の活性又は標的遺伝子をコードするｍＲＮＡｓ又は均等なＲＮＡｓのレベルが用意された小干渉ＲＮＡの不在下で観察されるのよりも低く低下することを意味する。好ましくは、阻害は、小干渉ＲＮＡの不在下よりも少なくとも１０％未満、２５％未満、５０％未満、７５％未満、８５％未満、又は９５％未満である。
【００３４】
「阻害された発現」又は「蛋白質の抑圧」は、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン−１、アタキシン−３、及び／又はアトロピン−１蛋白質のｍＲＮＡレベルの低下を意味し、即ち、各蛋白質のレベルの疾患又は症状の兆候のある程度の回復までの低下を意味する。
【００３５】
「ＲＮＡ」は、リン酸−リボース（糖）バックボーンによりつながれたリボヌクレオチドからなる分子であるリボ核酸を意味する。「リボヌクレオチド」は、グアニン、シトシン、ウラシル又はアデニン又はベータ−Ｄ−リボ−フラノースモイエティの２’位においてヒドロキシル基を有するいくつかのヌクレオチドを意味する。当業界では知られているとおり、遺伝子コードは、チミジンをＤＮＡ塩基中の塩基として用い、そしてＲＮＡ中ではウラシルを用いる。当業者は、書かれたＤＮＡ配列を書かれたＲＮＡ配列に変換するために、又はその逆において、書かれた核酸配列中においてチミジンをウラシルに如何に置換するかを知っている。
【００３６】
「患者」は生物を意味し、外植された（ｅｘｐｌａｎｔｅｄ）細胞のドナー又はレシピエント又は細胞自身である。「患者」は、発明の核酸分子が投与され得る生物も意味する。好ましくは、患者は、哺乳類又は哺乳類細胞、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、サル、モンキー、ブタ、イヌ、ネコ、等であるか、又は移植のために使用されるこれら動物の細胞である。より好ましくは、患者はヒト又はヒト細胞である。
【００３７】
用語「シヌクレイン」は、アルファ−シヌクレイン（特に、ヒト又はマウス）又はベータ−シヌクレイン（特に、ヒト又はマウス）を意味してよい。ヒトアルファ−シヌクレインをコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＡＦ１６３８６４にて利用可能である。ヒトアルファ−シヌクレイン配列の２つのバリアントが、受け入れ番号ＮＭ０００３４５及び受け入れ番号ＮＭ＿００７３０８にて利用可能である。マウスアルファ−シヌクレインは受け入れ番号ＡＦ１６３８６５にて利用可能である。
【００３８】
用語「ＢＡＣＥ１」は、ベータ部位アミロイド前駆体蛋白質分割酵素タイプ１（特に、人又はマウス）を意味してよい。ＢＡＣＥ１のいくつかのバリアントは配列決定され、バリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む。いくつかの科学文献においては、ＢＡＣＥ１はＡＳＰ２及びメンパシン２（Ｍｅｍｐａｓｉｎ２）としても知られる。ヒトＢＡＣＥ１、及びそれに近縁のバリアントをコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＮＭ＿１３８９７１、受け入れ番号ＮＭ＿１３８９７２、受け入れ番号ＮＭ＿１３８９７３、及び受け入れ番号ＮＭ＿０１２１０４にて利用可能である。マウス相同体の配列は受け入れ番号ＮＭ＿０１１７９２にて利用可能である。
【００３９】
用語「ハンチンチン」はハンチントン病遺伝子（ＩＴ−１５）（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＩＴ−１５をコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＡＨ００３０４５にて利用可能である。マウスの配列は受け入れ番号Ｕ２４２３３にて利用可能である。
【００４０】
用語「アタキシン−１」は、脊髄小脳変形症１型遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＳＣＡ−１をコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＮＭ＿０００３３２にて利用可能である。マウスのｓｃａ１は受け入れ番号ＮＭ＿００９１２４にて利用可能である。
【００４１】
用語「アタキシン−３」は、脊髄小脳変形症３型遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＳＣＡ−３をコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＮＭ＿００４９９３（スプライスバリアント１）及び受け入れ番号ＮＭ＿０３０６６０（スプライスバリアント２）にて利用可能である。（マウスの相同体の配列はまだ利用可能ではない。）
用語「アトロピン−１」は、歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＤＲＰＬＡをコードする全ヌクレオチド配列は、受け入れ番号ＸＭ＿０３２５８８にて利用可能である。マウスの配列は受け入れ番号ＸＭ＿１３２８４６にて利用可能である。
【００４２】
用語「代謝の先天的エラー」は、からだが通常は食物をエネルギーに変換（即ち、食物を代謝）できない稀な遺伝的障害を意味する。当該障害は、通常、食物の成分を分解する生化学経路に関与する酵素の欠陥により引き起こされる。
【００４３】
用語「リソソーム蓄積症」（ＬＳＤ）は、リソソームの酵素の何れかの機能発現の欠陥により特徴付けされる遺伝的疾患を意味する。
用語「リソソーム」は、多くの物質を分解することができる多数の異なる消化酵素を含む真核生物の膜結合器官を意味する。
【００４４】
用語「修飾」は、参照配列又は蛋白質に実質上類似の誘導体を含む。
「小干渉ＲＮＡ」は、特定の遺伝子標的に対して基質結合領域中に相補性を有する分子であって、標的ＲＮＡを分割するように宿主細胞中で特異的に酵素をガイドするように作用する分子である。即ち、その配列の特異性及びそのＲＮＡ標的に対する相同性のために、小干渉ＲＮＡはＲＮＡ鎖の分割を誘導することができて、それにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができるが、なぜならばもはや転写されないからである。これらの相補領域は、小干渉ＲＮＡの標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションを可能にさせ、即ち分割を許容する。１００％の相補性が生物活性にはしばしば必要であり、よって好まれるが、９０％ほどの相補性も、この発明においては有用である。本出願において記載された特定の小干渉ＲＮＡは限定することを意味せず、そして当業者は、この発明の小干渉ＲＮＡにおいて重要な全ては、一つ又はそれより多い標的核酸領域に相補な特定の基質結合部位を有することであることを認識する。対立遺伝子間を選択する場合に、長さの選択ももっとも重要な因子であるが、なぜならば、パーセント相補性及び対立遺伝子の相違を識別する能力に関与する他の因子だからである。
【００４５】
小干渉ＲＮＡｓは、標的ＲＮＡ（通常はメッセンジャーＲＮＡ）の一部に相補性を有する（即ち、塩基対を形成できる）二重鎖ＲＮＡ因子である。通常、そのような相補性は、１００％であるが、所望ならそれより低く、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。例えば、２１塩基のうちの１９塩基が塩基対合してよい。いくつかの例においては、様々な対立遺伝子バリアント間の選択が望まれる場合、標的遺伝子に対する１００％相補性が必要とされ、それにより、他の対立遺伝子配列から標的配列を有効に識別される。対立遺伝子間で選択される場合、長さの選択も重要な因子であるが、なぜならばそれはパーセント相補性及び対立遺伝子の相違を識別する能力に関係する他の因子だからである。
【００４６】
小核酸ＲＮＡ配列は、相補塩基対相互作用を通して小干渉ＲＮＡと標的ＲＮＡを結び合わせるのに十分な長さである必要がある。発明の小干渉ＲＮＡは、長さを変えてよい。小干渉ＲＮＡの長さは、好ましくは、１０ヌクレオチドより長いか又は等しく、標的ＲＮＡと安定に相互作用するのに十分な長さであり；特定すれば１５−３０ヌクレオチド；より特定すれば１５から３０ヌクレオチドの間のあらゆる整数、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０である。「十分な長さ」は、予測された条件下で意図された機能を提供するのに十分長い長さである１５ヌクレオチドより長いか又は等しいオリゴヌクレオチドを意味する。「安定に相互作用する」は、小干渉ＲＮＡと標的核酸との相互作用を意味する（例えば、生理条件下で標的内の相補ヌクレオチドと水素結合を形成することにより）。
【００４７】
５プライムから３プライム方向へのＤＮＡ鎖中の「逆相補性」は、ワトソン−クリック又は他の塩基対ルールに従い対応する相補塩基と逆の配置にあるＤＮＡ鎖である。
特定の態様の詳細な説明
本発明は、ＤＮＡを標的部位（例えば、細胞へ又は血液−脳バリヤーを通して）へデリバリーするための医学用のシステムと方法を提供する。当該細胞はインビボ又はエクスビボであってよい。本明細書にて使用される用語「エクスビボ」は、被験者の体から除去された、例えば、単離された細胞を意味する。エクスビボ細胞は、例えば、初代細胞（例えば、被験者から最近単離され且つ組織培養培地中で限定された成長又は保持が可能な細胞）、及び培養細胞（例えば、組織培養培地中で継続した成長又は保持が可能な細胞）を含む。本明細書にて使用される用語「インビボ」は、被験者の体の中の細胞を意味する。
【００４８】
医学用システムは、患者の脳を供給する血管内に位置するその遠位エンドを有する神経血管カテーテルを含む。任意に、上記システムは、上記組成物を患者の血流にデリバリーための移植可能なポンプをさらに含む。医学用システムは、本明細書にて記載される組成物をカテーテルにデリバリーするための手段をさらに含む。そのような組成物を細胞へ又は血液−脳バリヤーを通して脳内での発現のためにデリバリーする方法も、本明細書にて記載される。
【００４９】
簡単に言えば、本発明において開示されて使用された組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（単鎖また二重鎖ベクター；好ましくは単鎖ベクター）であって、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーする成分（例えば、本明細書にて記載された受容体−特異的リポソーム）を含む。いくつかの態様において、人工ＡＡＶベクターは、５プライムから３プライム方向に、５プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）；生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ；及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含む。別の態様において、人工ＡＡＶベクターは、５プライムから３プライム方向に、５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補鎖；及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含む。また別の態様において、人工ＡＡＶベクターは、各鎖の５プライム及び３プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む。好ましくは、人工ＡＡＶベクターは、キャプシッドをコードするためのコーディング配列を含まず、即ち、好ましいベクターはウイルスキャプシッド構造内に封入されない。人工ＡＡＶベクターを作成する方法も開示される。
【００５０】
ＤＮＡが小干渉ＲＮＡをコードする態様に関して、上記組成物は、とりわけ、病原性蛋白質により誘導される様々な神経変性障害を治療するのに有用であり得る。ＤＮＡが蛋白質をコードする態様に関して、上記組成物は、とりわけ、蛋白質の不在により誘導される様々な神経変性障害を治療するのに有用であり得る。
【００５１】
いくつかの態様において、上記組成物は、受容体特異的リポソーム及び受容体特異的リポソームに関して薬学上受容可能な担体を含み、受容可能特異的リポソームは：外部表面と内部区画を有するリポソーム；リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜を標的とする因子；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤を含み、但し、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面に接続されている。
【００５２】
別の態様において、上記組成物は、受容体特異的ナノコンテナー（即ち、数ナノメートルまたはそれ未満の桁で少なくとも一つの寸法を有するコンテナー）及び受容体特異的ナノコンテナーのための薬学上受容可能な担体を含み、但し、受容可能特異的ナノコンテナーは、外部表面と内部区画を有するナノコンテナー；ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的因子；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤を含み、但し、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりナノコンテナーの外部表面に接続されている。
医学用装置
本発明は、患者の血流に組成物をデリバリーするための神経血管カテーテル及び任意の移植可能なポンプを含む医学用装置を提供する。神経血管カテーテルの遠位のデリバリーエンドは、脳を供給する血管の中に配置される。急な使用のためには、神経血管カテーテルの近位エンドを導入点（例えば、大腿動脈）にて患者のからだの外に残し、そして適切な液体溶液中の組成物を患者の脳にデリバリーするように外科医により使用される。この場合のデリバリーは急であるが、それにもかかわらず、本明細書の以下において記載されるとおり、治療は長く続くかもしれない。
【００５３】
あるいは、神経血管カテーテルの近位エンドは任意の移植可能なポンプに取り付けることができ、そしてポンプとカテーテルの両方を長期にわたりからだに移植する。後者の場合、外科医が経皮により組成物の丸剤注射を患者の脳を供給する血管へのカテーテルを通して繰り返すことにより、ポンプは「カテーテルアクセス点」を提供する。ポンプは、ヘパリン化塩溶液を供給するか、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｐＴＡ）、又は丸剤注射のためのカテーテルの使用の間において神経血管カテーテルを通して低速で連続してポンプ注入される類似の因子を希釈するために使用される液体リザーバーを提供する。目的は、カテーテルの遠位エンドに血液クロットが形成されてカテーテルの内腔を塞いで患者に塞栓症ストロークの危険をポーズする（ｐｏｓｉｎｇ）ことを阻止するためである。
病原性蛋白質により誘導される神経変性障害
いくつかの神経変性障害、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型及び３型、及び歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）に関して、疾患の全体の病理の進行に関与する蛋白質は同定されている。これらの神経変性疾患に関して現在治療法はない。これらの疾患は段々と衰弱し、最後には死に至る。
【００５４】
これらの神経変性疾患（特に、アルツハイマー病及びパーキンソン病）のさらなる問題は、それらの罹患率が増加し続け、即ち、重大な好適な健康問題を巻き起こしている。最近の研究は、それぞれ、これらの疾患の各々の病理における主要な因子として、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病）、ベータ−アミロイド分割酵素１（ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む））（アルツハイマー病）、ハンチンチン（ハンチントン病）、及びアタキシン−１（脊髄小脳変形症１型）に焦点が注がれている。
【００５５】
パーキンソン病及びアルツハイマー病の神経変性の進行は、シナプスの損傷及びアストログリオーシスに付随する選択された神経細胞集団の広範囲の損失により特徴付けされる。アルツハイマー病の病理上の顕著な特徴は、アミロイドプラークの形成、神経繊維のもつれ（ｔａｎｇｌｅｓ）及び神経の糸（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌ ｔｈｒｅａｄ）の形成を含む；パーキンソン病の病理上顕著な特徴は、レビー小体と呼ばれる神経内含有物の形成及び黒質中のドーパミン作用性ニューロンの損失を含む。細胞の機能不全と死を誘発する機構は不明であるが、一般的見解は、神経の変性が特定の神経細胞蛋白質、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病）及びアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）（アルツハイマー病−ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）によりベータ−アミロイドにプロセシングされる）の蓄積に続く毒性作用によりもたらされるということである。
【００５６】
アルファ−シヌクレインはパーキンソン病において影響を及ぼすが、なぜならばそれがレビ小体において豊富に見いだされ、トランスジェニックマウス内でのその過剰発現がパーキンソン病様の病理を導き、そしてこの分子内の変異が家族性パーキンソン病に関連するからである。アルファシヌクレインはベータ及びガンマシヌクレインを含む大きなファミリーの分子に属し、１４０アミノ酸の非アミロイドシナプス蛋白質であり、アミロイドプラークに見いだされる３５アミノ酸の非アミロイド成分蛋白質の前駆体である。
【００５７】
アルツハイマー病は、知力の低下、記憶喪失、錯乱及び失見当により特徴付けされる脳の進行性の変性障害である。この病理に寄与する細胞機構のうち２種類の原繊維（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）蛋白質が脳内に沈着する：ポリマー化されたｔａｕ蛋白質から構成される細胞内神経原繊維のもつれ、及び主としてベータアミロイドから構成される豊富な細胞外フィブリル（ｆｉｂｒｉｌｓ）。ベータアミロイドはＡｂｅｔａとしても知られており、ベータ及びガンマのセクレターゼ分割部位においてアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）の蛋白質分解プロセシングにより生じて、２つの主要な形態のＡｂｅｔａ（Ａｂｅｔａ４０及びＡｂｅｔａ４２）の細胞障害性及びアミロイド形成能力を生じさせる。即ち、Ａｂｅｔａのプラーク生産形態のアミロイドへのプロセシングを阻止することは、この疾患を抑制するか又は阻止する臨床上の標的であるＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）をつくる疾患の形成及び進行に決定的に影響するかもしれない。類似の報告は、プレセニリンが異常なプロセシングを再度指図する（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）候補の標的であることを示唆する。
【００５８】
ハンチントン病は、致死性で遺伝性の神経変性障害であり、不随意の「衝撃性」動作、鬱病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、及び痴呆により特徴付けられる。原因は、ＤＮＡ中のＣＡＧトリヌクレオチドの広範囲に長いシリーズからなる単一の遺伝子内の変異であると確認された。このＣＡＧリピートは、遺伝子が生産する蛋白質をコードする遺伝子の領域内にある。即ち、結果のハンチンチン蛋白質も、「ＣＡＧ」がコードするアミノ酸グルタミンから構成される広く長い領域を含む。簡単に言うと、ハンチントン病の原因としてこの変異が正確に位置決めされた（ｐｉｎｐｏｉｎｔｅｄ）後には、他の遺伝子内での類似のＣＡＧリピートの拡張が探索されて、多数の他の致死性で遺伝性の神経変性疾患の原因であることがわかった。これらのいわば「ポリグルタミン」疾患のリストは、今、少なくとも１１より多くのものを含み、脊髄小脳変形症１型、２型、及び３型、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ又はケネディー病）及び歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）を含む。拡張されたＣＡＧリピートを含む特定の遺伝子は各疾患において異なるが、それが、各疾患を引き起こす脳中の拡張されたポリグルタミン蛋白質の生産物である。兆候は、一般に、若いころから（ｉｎ ｅａｒｌｙ）中年期の成人までに出現し、そのごの１０年から１５年後に死ぬ。これらの致死性の疾患の有効な治療法は現在存在しない。
【００５９】
ニューロン中の異常な蛋白質の生産をシャットオフすることがポリグルタミン疾患において治療法となることを示唆する相当な証拠が存在する。これらの疾患の原因は、変異蛋白質による新規な機能の獲得であることが知られており、当該蛋白質のオリジナルの機能の損失はない。脊髄小脳変形症１型（ＳＣＡ１）に関するヒトの拡張されたトランス遺伝子を有するマウスは、若い成人において重度の萎縮症になる（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １７：７３８５−７３９５（１９９７））が、対応するマウスの遺伝子がノックアウトされたマウスは萎縮症にならず、そして他の主要な異常性を示さない（Ｍａｔｉｌｌａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １８：５５０８−５５１６（１９９８））。異常なアタキシン１蛋白質が生成されるが細胞核に入れないように遺伝子操作されたＳＣＡ１のトランスジェニックマウスは、萎縮症を発症しない（Ｋｌｅｍｅｎｔ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９５：４１−５３（１９９８））。最後に、テトラサイクリンを投与することにより（通常は、マウス及びヒトにおいて、当該抗生物質の投与は上記疾患に効果がない）変異体ヒトトランス遺伝子が人工的に「ターンオフ」し得るように操作されたハンチントン病のトランスジェニックマウスモデルが作成された。これらのマウスが兆候を発症し始めた後で、テトラサイクリンの長期の投与による異常性蛋白質生産のシャットオフ生産がそれらの挙動において改善を導く（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０１：５７−６６（２０００））。これは、異常なハンチンチン蛋白質のヒトにおける発現の低下がハンチントン病の新たに診断された患者における進行を阻止したかもしれないというのみならず、その兆候を既に罹患している患者の生活の質を改善するかもしれないことを示唆する。
【００６０】
様々なグループが、ｓｉＲＮＡｓの有効性を最近研究している。Ｃａｌｐｅｎら（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１（２）：１７５−１８４（２００２））は、別のＣＡＧリピートを含むヒトアンドロジェン受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写物の細胞発現を阻害するそれらの能力に関して様々な異なる二重鎖ＲＮＡｓを評定した。かれらの仕事は、ＣＡＧリピートに対してフランキング配列が二重鎖ＲＮＡｓ中に存在したときにのみ、ＣＡＧリピートを含む二重鎖ＲＮＡｓにより遺伝子特異的阻害が起こったことを見いだした。かれらは、拡張されたポリグルタミン領域による蛋白質の発現により誘導されたカスパーゼ−３活性化を、構築された二重鎖ＲＮＡｓが救済できたことを示すこともできた。Ｘｉａ，Ｍａｏら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１００６−１０１０（２００２））は、緑色蛍光蛋白質をコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡｓを発現する構築された組換えアデノウイルスを用いて、融合されたポリグルタミン蛍光蛋白質を発現する、工作された神経ＰＣ１２クローン細胞のポリグルタミン（ＣＡＧ）発現の阻害を証明した。
【００６１】
特定の蛋白質を生産するｍＲＮＡ標的に対して相補な小干渉ＲＮＡのデザインと使用が、特定のｍＲＮＡｓの翻訳を阻止するための分子生物学者により採用される最近の手段である。翻訳の前に蛋白質の発現を干渉するための分子生物学者により用いられる他の手段は、アルツハイマー病（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０１／１６３１２ Ａ２（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．）を参照）及びパーキンソン病（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／５０３００Ａ１（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）及びＷＯ０１／６０７９４Ａ２（Ｅｌｉｅｚｅｒ）を参照）に関する治療標的に対するリボザイムを用いたｍＲＮＡ配列の分割を含む。ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００４／０４７８７２ Ａ２（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）及び米国特許出願番号２００４／０２２０１３２ Ａ１（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）は、カテーテルの放出部分が脳の予め決定された注入部位に隣接するように留まるように外科手術によりカテーテルを移植し、そして少なくとも一つの神経変性蛋白質の生産を阻害する少なくとも一つの物質を予め決定された用量にてカテーテルの放出部分を通して放出する工程を含む、神経変性障害を治療するための、装置、小干渉ＲＮＡ、及び方法を開示する。ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００４／０４７８７２ Ａ２（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）及び米国特許出願番号２００４／０２２０１３２ Ａ１（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）は、さらに、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型及び３型、及び歯状核赤核のような神経変性障害を治療するための、小干渉ＲＮＡベクター、及び方法を開示する。
小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
以前に示されたとおり、本明細書に記載される小干渉ＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ）は、１５から３０ヌクレオチドの長さの二重鎖ＲＮＡのセグメントである。それは、ＲＮＡ干渉として知られる細胞反応を誘導するために使用される。ＲＮＡ干渉においては、二重鎖ＲＮＡをダイサーと呼ばれる細胞内酵素で消化し、ｓｉＲＮＡ二重鎖を生成する。当該ｓｉＲＮＡ二重鎖は別の細胞内酵素複合体に結合して、それにより如何なるｍＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ配列に相同（又は相補）なものは何でも標的化するように活性化される。活性化された酵素複合体は標的化ｍＲＮＡを分割し、それを破壊し、そしてその相当する蛋白質生成物の合成を指示するために使用されることを阻止する。最近の証拠は、ＲＮＡ干渉がウイルス感染に対する防御（多くのウイルスが外来ＲＮＡを細胞へ導入する）のためのみならず、極めて基礎的なレベルにおける遺伝子制御のためでもある、古来の内在的機構であることを示唆する。ＲＮＡ干渉は、植物、昆虫、下等動物、及び哺乳類において起こることが示され、そして他の遺伝子サイレンシング技術、例えばアンチセンス又はリボザイムよりも劇的に効率よいことが見いだされた。バイオテクノロジーを用いれば、ｓｉＲＮＡは、細胞へ、侵入する二重鎖ＲＮＡウイルスからダイサーにより生産されるはずのものと類似のＲＮＡの短い二重鎖分子を導入する（又は細胞が生産するように誘導する）ことを含む。人工の誘導されたＲＮＡ干渉プロセスが、次にその点から続く。
【００６２】
小干渉ＲＮＡを患者の脳にデリバリーするために、好ましい方法は、ｓｉＲＮＡ分子自体よりもｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを脳の細胞内へ導入することになる。特定の生物学上活性なｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、（ａ）標的ｍＲＮＡの小さくて接近可能な部分に関する配列（公的なヒトゲノムデータベース内で利用可能；また、Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：６３４３−６３４６（２００３）およびｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｌａｂｈｅａｄｓ／ｔｕｓｃｈｌ／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌ及びｄａｒｍａｃｏｎ ｄｏｔ ｃｏｍにてワールドワイドウエブも参照）、及び（ｂ）ＤＮＡが細胞により転写されたときに対応するＲＮＡ配列の生産をもたらすＤＮＡを如何にして特定するかについてのよく知られた科学上の規則を知った際に、特定され得る。
【００６３】
ＤＮＡ配列が一度特定されたなら、実験室の供給者からオーダーされた合成分子から実験室内で構築でき、そしてＤＮＡの細胞へのデリバリーのためのいくつかの別の「ベクター」の一つに標準生物学手法を用いて挿入することができる。患者の脳のニューロンにデリバリーされたなら、それらのニューロン自体が、挿入されたＤＮＡをＲＮＡに転写することにより、治療用のｓｉＲＮＡになるＲＮＡを生産することになる。結果は、細胞自身が標的化遺伝子を沈黙化するｓｉＲＮＡを生産する、ということになる。結果は、細胞により生産された標的化蛋白質の量の低下になる。
【００６４】
本発明によれば、冒された細胞内で生産された特定のｍＲＮＡに対する小干渉ＲＮＡがニューロン内の疾患に関連する蛋白質の生産を阻止する。本発明によれば、標的細胞に小干渉ＲＮＡをデリバリーするようにデザインされた特別にあつらえられたベクターの使用である。デザインされた小干渉ＲＮＡの成功は、神経変性疾患を治療するための脳の標的化された細胞へのそれらのデリバリーの成功に基づいて予測される。
【００６５】
小干渉ＲＮＡはヒト細胞へ特定のｍＲＮＡ分子を標的化可能であることが示された。ヒト細胞をトランスフェクトし、そして標的ＲＮＡの分割を誘導してコードされた蛋白質の生産を妨害する小干渉ＲＮＡを生産するための、小干渉ＲＮＡを構築することができる。
【００６６】
本発明の小干渉ＲＮＡベクターは、神経病原蛋白質自体の生産を抑圧するか、又は神経病原蛋白質の生産又はプロセシングに関与する蛋白質の生産を抑圧することにより、病原性蛋白質の生産を阻止する。治療剤の患者への繰り返しの投与は、患者の生活の質を改善するために十分多い数のニューロンの変化を成し遂げることが必要かもしれない。個々のニューロン内では、しかしながら、治療上の利益を提供するに十分な変化は長年にわたる。神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は脊髄小脳変形症１型に冒された多くの患者の絶望的な状況は、治療からの利益が治療のデリバリーと投与の危険よりも勝るような強い見込みを提供する他の治療剤及び投与の経路により神経病原性蛋白質の生産のいくらかの低下を成し遂げることは可能かもしれないが、ニューロンのインビボにおける直接のトランスフェクションを含む成功した治療法の開発は、小干渉ＲＮＡベクターの標的細胞へのデリバリーに基づいた最良のアプローチを提供するかもしれない。
【００６７】
ｓｉＲＮＡをコードする例示のＤＮＡ配列を表１に掲載する。
【００６８】
【表１】
【００６９】
細胞培養実験により、上記配列の各々がヒト細胞により発現される対応遺伝子のｍＲＮＡのレベルを抑圧することにおいて有効であるｓｉＲＮＡをコードすることが確認された。
重要なことは、本明細書に例示された抗−アタキシン−１小干渉ＲＮＡ、抗−ＢＡＣＥ１小干渉ＲＮＡ、及び抗−ハンチンチン小干渉ＲＮＡ、並びに神経変性疾患を治療するための他の小干渉ＲＮＡは、発明の態様の当然のいくつかの例（ｊｕｓｔ ｂｕｔ ｓｏｍｅ ｅｘａｍｐｌｅｓ）である。神経科学において経験をした者には知られている、神経外科手法を動物と共に用いる実験は、候補の小干渉ＲＮＡを同定するために使用することができる。ｍＲＮＡ及びこれらの経験的な方法により同定された対応する小干渉ＲＮＡの標的部位は、主題の神経変性疾患の患者に投与されたときに多大な治療効果を導くものになる。
【００７０】
本発明の核酸分子に関して、小干渉ＲＮＡは、実際の蛋白質コーディング配列内か又は５プライム非翻訳領域あるいは３プライム非翻訳領域内の何れかにおいて、標的蛋白質の生産をコードするｍＲＮＡ配列内の相補配列を標的とする。ハイブリダイゼーションの後に、ｓｉＲＮＡによりガイドされた宿主の酵素がｍＲＮＡ配列を分割することができる。パーフェクトか又は高度の相補性が、小干渉ＲＮＡが有効になるのには必要である。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対）を形成できる核酸分子内の連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補性）。「パーフェクトの相補性」は、核酸配列の連続する残基全てが第２の核酸配列中の連続する残基の同じ数と水素結合することを意味する。しかしながら、ｓｉＲＮＡ配列中の単一のミスマッチ又は塩基置換は小干渉ＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を実質上低下させ得ることに注目するべきである。
【００７１】
アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン−３及び／又はアトロピン−１のＲＮＡｓ内の特定の部位を標的とする小干渉ＲＮＡは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、脊髄小脳変形症３型及び／又は歯状核赤核を細胞又は組織中で治療するための新規な治療上のアプローチを代表する。
【００７２】
本発明の好ましい態様において、小干渉ＲＮＡは、１５から３０ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、核酸分子は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０である。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ配列の長さは、１９−３０塩基対の間であり得て、より好ましくは、２１から２５塩基対の間であり、そしてより好ましくは、２１から２３塩基対の間であり得る。
【００７３】
好ましい態様において、発明は、所望の標的のＲＮＡに関して高い程度の特異性を呈する、核酸に基づく遺伝子阻害剤のクラスを生成するための方法を提供する。例えば、小干渉ＲＮＡは、好ましくは、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン−１、アタキシン−３及び／又はアトロピン−１のＲＮＡをコードする標的ＲＮＡの高保存配列領域を標的とし、疾患又は症状の特異的な処置が発明の一つ又はいくつかの核酸分子に提供され得るようにする。さらに、一般には、アデニン塩基の対（ＡＡ）で始まる標的配列内の領域を同定することにより（実施例を参照）、干渉ＲＮＡ配列が選択される。ｓｉＲＮＡｓは適切な転写酵素又は発現ベクターを用いてインビトロ又はインビボにおいて構築することができる。
【００７４】
脳内のニューロンへの外来のＤＮＡのデリバリーのための好ましいベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、例えば組換えアデノ随伴ウイルス血清型２又は組換えアデノ随伴ウイルス血清型５である。あるいは、他のウイルスベクター、例えば、ヘルペスシンプレックスウイルスを外来ＤＮＡの中枢神経系ニューロンへのデリバリーに使用してよい。
【００７５】
ｓｉＲＮＡｓは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてインビトロにおいて構築することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、サイレンサーｓｉＲＮＡ内に含まれるＴ７プロモーターのプライマーの５’エンドに相補な８塩基の配列を含むように構築することができる（アンビオンコンストラクションキット１６２０）。各遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを供給されたＴ７プロモータープライマーにアニールさせ、そして、クレノー断片によるフィルイン反応がＲＮＡへの転写のための完全長ＤＮＡ鋳型を生成する。インビトロ転写反応により、２つのインビトロ転写されたＲＮＡｓ（一方が他方に対してアンチセンス）が生成され、そして二重鎖ＲＮＡを作成するために互いにハイブリダイズされる。二重鎖ＲＮＡ産物はＤＮａｓｅ（ＤＮＡ転写鋳型を除去するため）及びＲＮａｓｅ（二重鎖ＲＮＡのエンドをポリッシュするため）により処理されて、カラム精製されることにより、細胞内にデリバリーされて試験できるｓｉＲＮＡが提供される。
【００７６】
哺乳類細胞内でｓｉＲＮＡｓを発現するｓｉＲＮＡベクターの構築は、一般には、ｓｉＲＮＡの構造を模した短いヘアピンＲＮＡの発現を推進するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いる。このヘアピンをコードする挿入物は、短いスペーサー配列により分離された２つのインバーテッドリピートを有するようにデザインされる。一つのインバーテッドリピートは、ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡに相補性である。３’エンドに付加された６つの連続するチミジンの糸は、ｐｏｌ ＩＩＩ転写鋳型部位として機能する。細胞内部に入ったら、当該ベクターは構成的にヘアピンＲＮＡを発現する。ヘアピンＲＮＡは標的遺伝子の発現のサイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡに加工されて、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる。
【００７７】
あらゆる適切なＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを、小さなヘアピンｓｉＲＮＡの発現を推進するためにｓｉＲＮＡ発現ベクター中で用いてよい。例示のプロモーターは、限定ではないが、よく特性決定されたヒト及びマウスのＵ６プロモーター及びヒトＨ１プロモーターを含む。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩは、哺乳類細胞において小さなＲＮＡｓを相対的に大量に発現し、そして３−６ウリジンの糸を取り込んだ際に転写を終結させるから、ｓｉＲＮＡの発現を推進するために用いられた。
【００７８】
ｓｉＲＮＡ発現プラスミド及び／又はウイルスベクターの構築に使用されるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、公知の技術を用いて実施することができる。例えば、米国特許番号４，６８３，１９５（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）：４，６８３，２０２（Ｍｕｌｌｉｓ）；４，８００，１５９（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）；及び４，９６５，１８８（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）を参照。一般に、ＰＣＲは、ハイブリダイズ条件下での核酸サンプルの処理（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ存在下）を含み、検出される特定の配列の各鎖のための一つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。合成される各プライマーの伸長産物は、２つの核酸鎖の各々に相補であり、プライマーはハイブリダイズする特定の配列の各鎖に相補である。各プライマーから伸長合成された産物は、同じプライマーを用いた伸長産物の次の合成のための鋳型としても機能し得る。十分な数の伸長産物の合成のラウンドの後に、検出されるべき配列が存在するか否かについて、サンプルを分析する。増幅された配列の検出は、電気泳動後のＤＮＡのＥｔＢｒ染色による可視化によるか、又は公知技術により検出可能な標識等を用いて実施してよい。ＰＣＲ技術に関する総説（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ，Ａｃａｄ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照）。
蛋白質の不在下で誘導される神経性疾患
代謝の先天的エラーとして知られる稀な遺伝的障害は、からだが食物をエネルギーに変換する（即ち、食物を代謝する）ことが不可能になる。当該障害は、通常、食物の成分を分解する生化学経路に関与する酵素の欠陥により引き起こされる。さらに、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソームの酵素の何れかの機能発現の欠陥により特徴付けされる遺伝的疾患を意味する。
【００７９】
そのような疾患は、遺伝子治療により治療されるかもしれない。特に、欠陥のある遺伝子又は失われた遺伝子は当業者には知られている方法により同定されるかもしれず、のちに、置換遺伝子を用意して失われた部位へ供給されるかもしれない。
【００８０】
欠陥のある酵素をコードする例示のポリヌクレオチド、及び欠陥酵素に付随する疾患を表２に掲載する。
【００８１】
【表２】
【００８２】
【表３】
【００８３】
【表４】
【００８４】
【表５】
【００８５】
【表６】
【００８６】
【表７】
【００８７】
【表８】
【００８８】
【表９】
【００８９】
【表１０】
【００９０】
【表１１】
【００９１】
表２に掲載された欠陥酵素をコードするポリヌクレオチドは、本発明の人工ＡＡＶベクターに含まれ得るポリヌクレオチドの例である。しかしながら、表２に掲載されたポリヌクレオチドに限定されることを意図しないものであり、当業者は、蛋白質の不在により誘導される追加の疾患を同定し、そして欠陥酵素をコードする追加のポリヌクレオチドを同定することができる。
【００９２】
さらに、当業者は、本明細書に掲載された（例えば、表２）に相同なポリヌクレオチドが本発明の人工ＡＡＶベクター内に含まれ得ることを認識するはずである。例えば、一次構造の顕著なレベルを表２に掲載されたポリヌクレオチド中に存在するコーディング領域と分かち合うコーディング領域を有するポリヌクレオチド（例えば、顕著なレベルの同一性）を使用することができる。同一性のレベルは、コードされた蛋白質の仮想活性部位をコードする残基が見当に合っているように２つのヌクレオチド配列を一直線に並べる（ａｌｉｇｎｅｄ）ことにより決定され、そしてさらにそれらの配列の長さに沿ってそれらが共通に有するヌクレオチドの数を最大にするように一直線に並べる；見当の合ったコード蛋白質の仮想活性部位をコードする残基を配置するため且つ共有するヌクレオチドの数を最大にするためにアラインメントを作成することにおいて、片方か又は両方のギャップが許容されるが、それでもなお各配列中のヌクレオチドはそれらの正確な順序にて保持されなければならない。好ましくは、ＢＬＡＳＴ検索計算式のｂｌａｓｔｎプログラムを用いて２つのヌクレオチド配列を比較され、Ａｌｔｓｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７））に記載され、そしてナショナルキャンサーフォーバイオテクノロジーインフォメーションにて利用可能である（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／にてワールドウエブサイト上）。好ましくは、全てのＢＬＡＳＴ検索パラメーターの欠損値を用いる。ＢＬＡＳＴ欠損計算式を用いた２つのヌクレオチド配列の比較においては、構造上の類似性を「同一性」と呼ぶ。好ましくは、２つのヌクレオチド配列は、好適さが増す順に、好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、そして９９％同一性を有する。
人工ＡＡＶベクター
人工ＡＡＶベクターは、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含み、そして遺伝子又は遺伝子抑圧剤を患者のニューロンにデリバリーするのに使用することができる。即ち、人工ＡＡＶベクターは遺伝子をデリバリーするためのカセット、又は遺伝子抑圧剤をデリバリーするためのカセットを含むのが好ましい。例えば、失われた遺伝子を患者の脳に供給するために意図された遺伝子治療の場合、発現カセットは、プロモーター要素、失われた遺伝子をコードする配列、及びポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。別の例において、患者の脳内で内生遺伝子の発現を抑圧することを意図された遺伝子抑圧する治療の場合、発現カセットは、プロモーター要素、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードする配列、及び終結配列を含むことができる。
【００９３】
一つの態様において、人工ＡＡＶベクターは、二重鎖ベクターである。二重鎖ベクターはいずれかの種類の発現カセットを含んでよく、アデノ随伴ウイルスゲノムからのインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）の５プライムコピー、続く遺伝子又は遺伝子抑圧剤に関する発現カセット（その同一性は治療される神経障害しだいである）、続くＡＡＶ−ＩＴＲの３プライムコピーによる３プライムエンドを含む。
【００９４】
別の態様において、人工ＡＡＶベクターは、何れかの種類の発現カセットを含んでよく、単鎖ベクターである。単鎖ベクターは、アデノ随伴ウイルスゲノムからのインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）の５プライムコピー、続く遺伝子又は遺伝子抑圧剤に関する発現カセット（その同一性は治療される神経障害しだいである）、続くＡＡＶ−ＩＴＲの３プライムコピーによる３プライムエンドを含む単鎖ＤＮＡセグメントを含む。任意に及び好ましくは、何れかの種類の発現カセットを含む全ＤＮＡ配列は逆相補の順序で繰り返され、それにより、ＤＮＡ配列が５プライムＡＡＶ−Ｉ、発現カセット、内部ＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセットの逆相補体、及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含む。３プライムＡＡＶ−ＩＴＲは５プライムＡＡＶ−ＩＴＲの逆相補体であり（例えば、本明細書中の実施例１に例示されるとおり）、そして３プライム又は５プライムの何れかのＡＡＶ−Ｉを内部ＡＡＶ−ＩＴＲとして用いることができる。結果の「自己相補性」人工ＡＡＶベクターが好ましいが、なぜならば、それがＤＮＡによりニューロンのより有効なトランスフェクションを生じさせるかもしれないからである。例えば、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：９１１−９１７（２００３）を参照。
【００９５】
当業者には、二重鎖の人工ＡＡＶベクターの態様と単鎖自己相補性人工ＡＡＶベクターの態様が、単鎖自己相補ベクターが発現カセットの相補鎖をつなぐ単一の単鎖ＡＡＶ−ＩＴＲを有する（一方の鎖の３プライムエンドを相補鎖の５プライムエンドに共有結合させる−図２に模式的に示される）ために完全な人工ＡＡＶベクターが、発現カセットの相補鎖間で水素結合によりそれ自身の上に「フォールドバック」した一つの単ＤＮＡ鎖である、ということのみにおいて相違することを認識する。二重鎖人工ＡＡＶベクターの場合には、各エンドにおいて鎖をつなぐ非共有結合により発現カセットの５プライムエンドと３プライムエンドにおいて二重鎖のＡＡＶ−ＩＴＲｓが存在する（図３に模式的に例示されるとおり）。
【００９６】
二重鎖の人工ＡＡＶベクターを製造する例示の方法が開示される。当該方法は、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをあらゆる適当なＤＮＡプラスミド中に標準ＤＮＡクローニング方法を用いて集合させ；５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをプラスミドから解放するが、ＤＮＡを５プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ５プライムの位置及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ３プライムの位置において切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより解放し；そして標準の方法を用いて５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲからなる直鎖状ＤＮＡ断片を精製する工程を含む。任意に、結果の直鎖状二重鎖人工ＡＡＶベクターをさらに加熱処理工程により加工してよく、例えば、精製された直鎖状ＤＮＡ断片を加熱し（例えば、６５℃又はそれ以上に１０分間又はそれより長く加熱）、次に冷却する（例えば、１０分間又はそれより長い時間をかけてＤＮＡ断片をゆっくりと室温に冷却する）ことを含む。図４に模式的に例示されるとおり、これらの加熱及び冷却の工程は、ＡＡＶ ＩＴＲｓが二次構造に集合することを許容し、この二重鎖人工ＡＡＶベクターからの長期間の遺伝子発現を助ける。
【００９７】
上で本明細書に記載された単鎖ＤＮＡを製造する例示の方法も開示される。一つの方法は、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをあらゆる適当なＤＮＡプラスミド中に標準ＤＮＡクローニング方法を用いて集合させ；標準インビトロ転写方法を用いてＤＮＡプラスミドから所望の単鎖ＤＮＡの単鎖ＲＮＡ転写物を生成させ；標準逆転写反応方法を用いて逆転写によりＲＮＡ転写物から単鎖ＤＮＡを生成させ；ＲＮａｓｅ酵素を用いたＲＮＡ消化により反応産物からＲＮＡ転写物を取り出し；そして標準ＤＮＡ精製方法、例えばゲル精製又はカラム親和法により反応産物から結果の単鎖ＤＮＡ産物を精製する工程を含む。
【００９８】
別の方法は、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをあらゆる適当なＤＮＡプラスミド中に標準ＤＮＡクローニング方法を用いて集合させ；５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ５−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより環状プラスミドを直鎖状化し；直鎖状化されたプラスミドの各鎖の５−プライムエンドに親和性タグ（例えば、ビオチン分子）を化学的にコンジュゲートし；３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ３−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりＤＮＡ配列を切断するが、制限酵素が異なるサイズの２つの直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子をもたらすようにし；サイズによりあらゆる適切なサイズ分離方法（例えば、カラム濾過又はゲル電気泳動）を用いてＤＮＡ分子の集団を分離して所望の二重鎖ＤＮＡを回収し；そしてＤＮＡを融解することにより、その２つの相補鎖を２つの単鎖に分離し、そして混合物をタグのための親和性カラムに通す（例えば、ビオチン分子を親和性タグとして用いたときはストレプトアビジン親和性カラム）が、工程３においてタグを付加された鎖がカラム上に捕捉されて、一方タグのない単鎖は所望の最終産物としてフロースルーするようにする。この方法は、最終産物中の配列エラーを導入するかもしれない如何なるＤＮＡ又はＲＮＡ重合工程も含まないので有利で有り得る。
【００９９】
自己相補性ＡＡＶの場合、上記方法は、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ、発現カセット、内部ＡＡＶ−ＩＴＲ、同じ発現カセットの逆相補体、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをあらゆる適当なＤＮＡプラスミド中に標準ＤＮＡクローニング方法を用いて集合させ；（５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲから３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲまでの）ＤＮＡ配列を切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより環状プラスミドを直鎖状化し；サイズによりあらゆる適切なサイズ分離方法を用いて工程２からの所望のＤＮＡ配列を回収し；二重鎖ＤＮＡを融解することにより、その２つの相補鎖を２つの単鎖に分離し；そして融解されたＤＮＡの温度を（好ましくはゆっくりと）低下させることにより、単鎖が自己アニールによりヘアピン形態になることを許容する工程を含む。結果の単鎖（「センス」又は「アンチセンス」鎖）は最終産物として有用であるが、何れかの鎖が５−プライムから３−プライム方向へ所望の発現カセットのコピーを含むからである。
組成物
組成物が血液−脳バリヤーを通してデリバリーされる態様に関して、当該組成物は、例えば、米国特許番号６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｇｅ）に例えば記載されたようなリポソーム、及び薬学上受容可能な担体を含む。好ましくは、当該リポソームは受容体特異的リポソームであって、当該受容体特異的リポソームは：外部表面及び内部区画を有し；リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖）を含み、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっている。リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む受容体特異的リポソームは、人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをプラスミドＤＮＡの代わりに用いること以外、米国特許番号６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｇｅ）に記載された一般法により製造することができる。
【０１００】
本明細書にて使用される「標的化剤」は、直接に又は間接に細胞の表面へ、例えば細胞表面に存在する分子、例えば受容体に相互作用する化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）を意味する。当該相互作用は、例えば、イオン結合、水素結合、ファンデルワース力、又はそれらの組み合わせであり得る。標的化剤の例は、例えば、サッカライド、ポリペプチド（ホルモンを含む）、ポリヌクレオチド、脂肪酸、及びカテコールアミンを含む。本明細書にて使用される用語「サッカライド」は、単独の糖質モノマー、単独の、グルコース、又は２つ又はそれより多い共有結合された糖質モノマー、即ちオリゴサッカライドを意味する。４またはそれより多い糖質モノマーを含むオリゴサッカライドは、直鎖状であるか分枝し得る。オリゴサッカライドの例は、ラクトース、マルトース、及びマンノースを含む。本明細書にて使用される「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを意味し、特定の長さのアミノ酸ポリマーを意味しない。即ち、例えば、用語ペプチド、オリゴペプチド、蛋白質、抗体、及び酵素はポリペプチドの定義に含まれる。この用語はポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化（例えば、サッカライドの付加）、アセチル化、リン酸化などなども含む。
【０１０１】
本明細書にて記載されるリポソームは、血液−脳バリヤーを通して生物学上活性な因子をデリバリーすることができ、脳の中で発現される。リポソームとナノ粒子は因子の封入のために普通に使用されるナノコンテナーの例示の形態である。リポソームは、好ましくは、２００ナノメーター未満の直径を有する５０から１５０ナノメーターの間の直径を有するナノコンテナーが好ましい。特に好ましいのは、約８０ナノメーターの外部直径を有するリポソーム又は他のナノコンテナーである。適切な種類のリポソームが、中性脂質、例えば１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、又はコレステロールと、少量（１％）のカチオン酸、例えばジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）により作成される。
【０１０２】
発明は好ましいナノコンテナーとしてリポソームを用いて記載されてきたが、当業者は、他のナノコンテナーを用いてよいことを認識する。例えば、上記リポソームは、ナノ粒子、又はＤＮＡを封入して核酸をヌクレアーゼから防御することができるが製剤がなお血液中にあるか又は血液中から標的細胞の細胞内区画への移動中にある直径＜２００ｎｍのあらゆる他の分子ナノコンテナーに置き換えてよい。また、コンジュゲート剤、例えばＰＥＧ鎖を用いる代わりに、一つ又はそれより多くの他のポリマー物質、例えば、スフィンゴミエリンをリポソーム又はナノコンテナーの表面に接続することができ、そして「輸送可能なペプチド」のコンジュゲートのため及び血液からの製剤の除去を遅延させて血漿のファーマコキネティクスを最適化するための骨格を提供する二重の目的にかなう。さらに、本発明は、特定の標的受容体を有する細胞又は器官のあらゆる群にＤＮＡをデリバリーすることを意図する。当該リポソームはＤＮＡを器官、例えば肝臓、肺及び膵臓にデリバリーするために使用してよい。
【０１０３】
当該リポソームは静脈内投与のためのあらゆる適切な薬学担体と組み合わせてよい。組成物の静脈内投与は最小限の侵入性であるから好ましい経路である。他の投与経路が望まれるなら可能である。適切な薬学上受容可能な担体は、塩水、Ｔｒｉｓバッファー、リン酸バッファー、又は他の水性溶液を含む。適切な用量は、当業者によく知られている手法により確立することができる。
【０１０４】
当業者は、レミントンズファーマシューティカルサイエンス（１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（１９８５）及びグッドマンアンドギルマンズザファーマシューティカルベーシスオブセラピュティクス（８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹｍ１９９０）として広く知られており利用可能な源にて論じられる原理及び手法を熟知している。
【０１０５】
本発明の好ましい態様において、組成物又は前駆体又はその誘導体は、ヒト又は他の動物へデリバリーされた投与に適合された薬学組成物として標準法に従い製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は滅菌アイソトニック水性バッファー中の溶液である。
【０１０６】
必要なら、組成物は、可溶化剤と注射のための部位においてあらゆる痛みを改善するための局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、当該成分は、別々に又は混合されて、ユニット用量形態にて、例えば、乾燥凍結粉末として又は水不含濃縮物として密封封入されたコンテナー、例えば、活性因子の量を示すアンプル又はｓａｃｈｅｔｔｅ中に供給する。組成物が注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）により投与されるなら、滅菌薬学グレードの水又は塩水を含む注入ボトル中に調合することができる。組成物を注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により投与するなら、投与の前に成分が混合されるように、注射のための滅菌水又は塩水のアンプルを用意することができる。
【０１０７】
静脈内投与以外の場合、組成物は、湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤をマイナーな量にて含むことができる。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、ゲル、ポリマー又は徐放性製剤であり得る。組成物は当業界で知られている伝統的な結合剤及び担体と共に製剤化することができる。製剤は標準の担体、例えば、薬学グレードのマニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカライドナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等、因子の製造においてよく確立された官能性を有する不活性担体を含むことができる。様々な伝統的なシステムが公知であり、本発明の組成物を投与するために使用することができ、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル等への封入を含む。
【０１０８】
また別の好ましい態様において、組成物は中性又は塩形態として製剤化することができる。薬学上受容可能な塩は、遊離アミノ基、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、オキサロ酸、酒石酸等に由来するものにより形成されたもの、及び遊離カルボキシル基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン又は類似物により形成されたものを含む。
【０１０９】
特定の障害又は症状の治療に有効な本発明の組成物の量は、障害又は症状の性質に依存し、そして組成物の投与においてよく確立された標準臨床技術により決定することができる。製剤に用いられる正確な用量は投与経路及び疾患又は障害の重度にも依存することになり、医師（ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）の判断及び患者の要求に従い決定されるべきである。頭蓋内投与のための適切な用量範囲は、一般に、単一注射容量の１から３０００マイクロリットルにてデリバリーされるマイクロリットルあたり、ウイルスベクター約１０３から１０１５感染ユニットである。マイクロリットルあたりの追加量の感染ユニットのベクターは、一般に、約１０、５０、１００、２００、５００、１０００又は２０００マイクロリットルにてデリバリーされるウイルスベクターの約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４感染ユニットを含む。適切な用量はインビトロ又はインビボ試験システム由来の用量応答曲線から推定してよい。
【０１１０】
他に規定しない限り、本明細書にて使用される化学用語及び命名は、発明の属する分野の当業者により共通に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学の手法等は当業界で用いられる共通の方法である。そのような標準技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のような文献のマニュアル見いだすことができる。
【０１１１】
実施例
実施例１：
出願人は、ベータ−アミロイド分割酵素（ＢＡＣＥ１）の発現を抑圧するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを開発した。神経細胞中でのＢＡＣＥ１の抑圧は、アミロイド前駆体蛋白質からのベータ−アミロイド断片の生産を完全に破壊することが知られている。溶解性ベータ−アミロイド断片はアルツハイマー病の認識に関する機能不全と神経変性の原因であると信じられており、そしてこれらの断片の不溶性凝集物はアルツハイマー脳の中に特徴的なプラークの中に含まれることが知られている。抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの発現カセットが、ＡＡＶ−ＩＴＲｓを周囲に含む構築物中に工作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。本明細書中に例示された態様において、ＩＴＲｓはＡＡＶ２由来である。しかしながら、当業者には、他の血清型由来のＩＴＲｓも使用可能なはずであることが明らかである。ＢＡＣＥ１メッセンジャーＲＮＡの発現の低下と細胞培養におけるＢＡＣＥ１酵素の活性の低下をこの抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが事実もたらすことを示すデータが得られている。（この明細書中の以下の実施例２−４を参照）。
【０１１２】
開示された方法に従うと、抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡをコードするＡＡＶ−ＩＴＲを周囲にもつＤＮＡが血液−脳バリヤーを通して脳細胞中へ輸送のために製剤化されたリポソーム内部へパッケージされ得る。結果の組成物は、アルツハイマー病の患者の脳を供給する血管の一つ又はそれより多くに、神経血管カテーテルによりデリバリーされるはずである。ベータ−アミロイド及びベータ−アミロイドプラーク自体を脳が逃れるための浄化（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）機構はアルツハイマー病を阻止するのに十分なほど明らかではないが、「源における」ベータ−アミロイドの生産により浄化機構が良好にベータ−アミロイドの患者の脳に対して有する作用を低下させ得ると予測される。結果として、疾患の進行が遅延するか又は停止し、そして患者が安定して恐らくは改善すると仮定される。
【０１１３】
即ち、神経血管による脳全域のこのＤＮＡのデリバリーは患者におけるアルツハイマー病の治療のための手段を提供し得る。治療が安全で副作用のないことが証明されたら、予防治療としても有力になるかもしれない。即ち、アルツハイマー病の可能な未来の発生に対して集団中の全ての加齢する（ａｇｉｎｇ）人々に予防的に「接種する」ために使用されるかもしれない。
【０１１４】
本発明の生物学上の成分の合成ＡＡＶのＤＮＡ配列の様々な態様はそれがアルツハイマー病の治療に関するように、以下のとおりである。「ＡＡＶ−Ｕ６−ＭＢ１７４９」（配列番号：８）はＭＢ１７４９のＤＮＡコードを含む合成ＡＡＶの配列であり、アルツハイマー病の治療法としてのベータ−アミロイド分割酵素タイプ１（ＢＡＣＥ１）の発現を抑圧するのに有効なｓｉＲＮＡである。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】
「ＡＡＶ−Ｈ１−ＭＢ１７４９」（配列番号：９）はＭＢ１７４９のＤＮＡコードを含む合成ＡＡＶの配列であり、Ｕ６よりむしろヒトＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより推進される発現を伴う。
【０１１８】
【表１４】
【０１１９】
【表１５】
【０１２０】
「ＳＣ−ＡＡＶ−Ｕ６−ＭＢ１７４９」（配列番号：１０）はＭＢ１７４９のＤＮＡコードを含む合成自己相補性ＡＡＶの配列であり、ヒトＵ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより推進される発現を伴う。
【０１２１】
【表１６】
【０１２２】
【表１７】
【０１２３】
【表１８】
【０１２４】
【表１９】
【０１２５】
「ＳＣ−ＡＡＶ−Ｈ１−ＭＢ１７４９」（配列番号：１１）はＭＢ１７４９のＤＮＡコードを含む合成自己相補性ＡＡＶの配列であり、ヒトＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより推進される発現を伴う。
【０１２６】
【表２０】
【０１２７】
【表２１】
【０１２８】
【表２２】
【０１２９】
ＡＡＶ−Ｕ６−ＭＢ１７４９ ＤＮＡ構築物（配列番号：８）が生成されてＡＡＶウイルス粒子中にパッケージされ、そしてアミロイド−前駆体蛋白質に関するヒト遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスの脳に定位に注射された。ウイルス媒介性遺伝子治療がこれらのマウスにおいてアルツハイマー病のマニフェステーションを低下させるかもしれない。
実施例２：ｓｉＲＮＡを用いたインビトロのＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡの抑圧
Ｎｅｕｒｏ２ａマウス神経細胞系においてＢＡＣＥ１のメッセンジャーＲＮＡの発現をインビトロにて有効に抑圧するｓｉＲＮＡ配列を同定して、ＭＢ１７４９と命名した。ＭＢ１７４９は「マウスＢａｃｅ１配列位置１７４９」を意味し、マウスＢＡＣＥ１ ｃＤＮＡ配列（ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ＿０１１７９２．２）中のヌクレオチド１７４９から１７６９に相当する。ヌクレオチド配列は以下のとおりである。
配列番号：１２：５’−ＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＴＣ−３’
この配列はＢＡＣＥ１のヒトｃＤＮＡ配列の４つのバリアント全て（Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤ）に同一（１００％相同）であり、そしてジェンバンクの様々なヒトＢＡＣＥ１ ｃＤＮＡ配列内の以下の位置に見いだされる：
【０１３０】
【表２３】
【０１３１】
ＢＡＣＥ１発現を沈黙化させる候補のｓｉＲＮＡとしてＭＢ１７４９配列を選択する部分において、当該配列を、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ ｄｏｔ ｇｏｖにてＢＬＡＳＴサイトにてワールドウエブサイト上でヘルスナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーションにより提供されるＢＬＡＳＴソフトウエアを用いて、ホモサピエンスの全ての他の公知のゲノミックＤＮＡ配列と比較した。
【０１３２】
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞培養による試験のために、二重鎖ＭＢ１７４９ｓｉＲＮＡをインビトロ転写方法を用いて構築した。以下の２つの合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドをＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社から得た（ＤＮＡ合成サービス）：
【０１３３】
【化１】
【０１３４】
当該ｓｉＲＮＡを、これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドから、アンビオン社（サイレンサーｓｉＲＮＡ構築キット、カタログ番号１６２０）により市販されて提供される試薬を用いて製造者に指示書に従い以下のとおりに生成した：供給されたＴ７プロモータープライマーを上記の２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド転写鋳型にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたオリゴの３−プライムをＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片により伸長することにより、二重鎖のｓｉＲＮＡ転写鋳型を創製した。センス及びアンチセンスのｓｉＲＮＡ鋳型をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写し、そして結果のＲＮＡ転写物をハイブリダイズさせることにより、二重鎖ＲＮＡを創製した（リーダー配列、二重鎖ＲＮＡの１９マー、及び２つの３−プライム末端ウリジンからなる）。リーダー配列はリボヌクレアーゼ消化により除去し、そしてＤＮＡ鋳型はデオキシリボヌクレアーゼ処理により除去した。結果の二重鎖ｓｉＲＮＡ産物を供給されたガラスファイバーカラムに結合及び溶出して精製した。
【０１３５】
ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡを、インビトロにおいて、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞に、ＭＢ１７４９抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡと共にこれらの試験目的のために構築されたＤＮＡプラスミド（ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ）による同時トランスフェクション培養物により試験した。ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドは、ヒトＢＡＣＥ１ ｃＤＮＡのカセット及び増強された緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）の追加の発現カセットを含む。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を６ウエルのプレート上に植えて、標準培養条件（１０％子ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地、３７℃にて湿潤加湿器中で５％二酸化炭素）下で５０％−７０％コンフルエントまで生育させた。次に、細胞にＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯトランスフェクション試薬（ミルスカタログ番号２１５４）を用いてトランスフェクトし、そしてｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドをＴｒａｎｓｉｔ−Ｎｅｕｒｏトランスフェクション試薬（ミルスカタログ番号２１４４）を用いて製造者の推奨に従いトランスフェクトした。細胞にさらなる生育培地を２４時間後に与えた（ｆｅｄ）。約４２時間後に、全細胞ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン、カタログ番号７４１０４）を製造者のプロトコルに従い回収したが、可能性のある汚染ゲノミックＤＮＡのＤＮａｓｅＩを用いた消化を含んだ。
【０１３６】
ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡの抑圧は、定量性逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを用いて評価した。１０マイクログラム（１０μｇ）の全細胞ＲＮＡを５０マイクロリットル反応にてｃＤＮＡに逆転写した（ストラタジーンＰｒｏＳＴＡＲ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲキット、カタログ番号２００４２０）。逆転写酵素を省いた平行の反応を用いて次のＰＣＲ反応へのゲノミックＤＮＡのキャリーオーバーのないことを確認した。６マイクロリットルの反応産物をＴａｑＭａｎ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ反応試薬と混合し、次に、等しく３つの別々のチューブに分割し、ＢＡＣＥ１のｃＤＮＡの臓腑供養のＰＣＲプライマー、齧歯類ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ、又はｅＧＦＰ ｃＤＮＡをそれぞれ加えた。ＰＣＲ反応を稼動させ、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ ３０００（リアルタイムＰＣＲマシン（コルベットリサーチ、モートレイクＮＳＷ，オーストラリア）を用いて増幅データを回収した。ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドのみ（ｓｉＲＮＡなし）をトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞からの反応産物の希釈シリーズを用いて、各ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ１，ＧＡＰＤＨ，及びｅＧＦＰ）に関して標準曲線を制定し（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ）、そしてプラスミドプラスＭＢ１７４９抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞内の各遺伝子のｃＤＮＡの量を各標準のパーセンテージとして計算した。
【０１３７】
この実験は別々の細胞培養を用いて別々の実験室職員により３つの別々の機会に実施した。
【０１３８】
【表２４】
【０１３９】
これらの結果は、ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡ配列がマウス神経細胞系においてＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの発現をインビトロにて実質上抑圧することを示す。
実施例３：ＡＡＶ−抗Ｂａｃｅ１を用いたＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡのインビトロにおける抑圧
トランスフェクトされた細胞中でのＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡの生産をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを遺伝子工作した。このベクターは、以下のＤＮＡ配列をｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６プラスミド（アンビオン，カタログ番号７２０７）に、ＡｐａＩとＥｃｏＲＩ制限部位の間に挿入することにより生成した。
【０１４０】
【化２】
【０１４１】
結果のプラスミドは、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＭＢ１７４９に相当する短いヘアピン転写物をコードするＤＮＡ配列、及び６つのチミンヌクレアーゼの連続からなるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列からなる発現カセットを含む。形質導入された細胞が内部でＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡを発現してそれによりＢＡＣＥ１メッセンジャーＲＮＡの発現を抑圧することを誘導することにおけるこのＤＮＡ配列の有効性を、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞の培養物において試験した。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞培養物にｐＳｉｌｅｎｃｅｒＭＢ１７４９プラスミドとｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドをＴｒａｎｓｉｔ−Ｎｅｕｒａｌトランスフェクション試薬及び上記の手法を用いて同時トランスフェクトした。約４２時間後に、全細胞ＲＮＡを細胞から回収し、そして上記のとおり定量性リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。この分析は３通り実施して、以下の結果を得た：
【０１４２】
【表２５】
【０１４３】
これらのデータは、ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡ配列がｐＳｉｌｅｎｃｅｒＭＢ１７４９プラスミドをトランスフェクトされた細胞内でＭＢ１７４９発現カセットから生成されたことを示し、そしてこの発現カセットはインビトロにおいてＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの発現を実質上抑圧することを示す。
【０１４４】
ＭＢ１７４９発現カセット（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＭＢ１７４９に相当する短いヘアピン転写物をコードするＤＮＡ配列、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列からなる）を、アデノ随伴ウイルスベクター（ジーンディテクト社、オークランド、ニュージーランド、カタログ番号ＧＤ１００１−ＲＶ）へ、キメラＡＡＶ血清型１／２と共に工作した。ＭＤＴ１７４９．４を形質導入された細胞がＭＢ１７４９ｓｉＲＮＡを内部で生産してそれによりＢＡＣＥ１メッセンジャーＲＮＡの発現を抑圧するように導入されることを確認するため、ＨＥＫ２９３細胞（標準的実験室細胞系）の培養物にＭＤＴ１７４９．４ウイルスを感染させ、そして次にｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドを１日後にトランスフェクトした（２日目）。全細胞ＲＮＡをこれらの細胞から約４８時間後に回収して（４日目）、定量性リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて上記の通りに分析した。陰性対照として、他のＨＥＫ２９３細胞培養物にｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドと、ＭＢ１７４９のコーディング配列がスクランブルされ、即ちＢＡＣＥ１に対するｓｉＲＮＡとして不活性であることを除いてＭＤＴ１７４９．４に同一の比較用ＡＡＶウイルスベクターをトランスフェクトした。この分析は、２つの別のロットのＭＤＴ１７４９．４ウイルスストック及び２つの別々のロットのスクランブル対照ウイルスストックを用いて実施したところ、結果は以下のとおりであった：
【０１４５】
【表２６】
【０１４６】
これらのデータは、ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡ配列がＭＤＴ１７４９．４アデノ随伴ウイルスを感染させた細胞内で生成されたことを示し、そしてこの発現がインビトロにおいてＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの実質上の発現をもたらすことを示す。ＭＤＴ１７４９．４アデノ随伴ウイルスのＢＡＣＥ１酵素の生産及びベータ−アミロイド生成に対する効果の試験として、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにて神経病理が現在進行中である。
実施例４：ｓｉＲＮＡを用いたインビトロにおけるＢＡＣＥ１蛋白質酵素の抑圧
細胞へのＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが事実ＢＡＣＥ１蛋白質発現の抑圧並びにＢＡＣＥ１メッセンジャーＲＮＡ生産の抑圧をもたらすことを確認するために、ＢＡＣＥ活性をＨＥＫ２９３細胞からの蛋白質抽出物中にて測定した。ＨＥＫ２９３細胞を３５ｍｍのディッシュに植え、そしてｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅプラスミドとｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＭＢ１７４９（ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡを生産するためのＤＮＡコードを含む）又は製造者（アンビオン、カタログ番号７２０７、挿入された如何なるｓｉＲＮＡもない）から得たオリジナルのｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミドの何れかを、Ｔｒａｎｓｉｔ−Ｎｅｕｒａｌトランスフェクション試薬を用いて同時トランスフェクトした。４８時間後に、細胞を回収して、細胞溶解物から抽出された蛋白質をＢｅｔａ−Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ活性キット（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＦＰ００２）を用いてＢＡＣＥ酵素活性に関してアッセイした。簡単に言えば、このアッセイは、ＢＡＣＥ分割活性に関する基質である標識されたペプチドを蛋白質抽出物に加えることを含む。当該ペプチド基質は蛍光リポーター分子（ＥＤＡＮＳ）と蛍光クエンチング分子（ＤＡＢＣＹＬ）にコンジュゲートされており、ペプチド上での２つの分子の物理的近接が蛍光放射を阻止するようになっている。ＢＡＣＥによりペプチド基質の分割は物理的にＥＤＡＮＳとＤＡＢＳＹＬ分子を分離させ、蛍光シグナルの放出を可能にする。
【０１４７】
細胞サンプルから得られた蛋白質抽出物は均等な蛋白質濃度（ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ及びｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＭＢ１７４９をトランスフェクトされた細胞に関して０．１３ｍｇ／ｍＬ、そしてｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ及び「空の」ｐＳｉｌｅｎｃｅｒをトランスフェクトされた細胞に関して０．１１ｍｇ／ｍＬ）である。これらの蛋白質抽出物の３通りのサンプルをマイクロプレートのウエルに入れ（Ｒ＆Ｄシステムズキットにより供給された）たが、ウエルあたり５０マイクロリットルで、５０マイクロリットルの反応バッファーと５マイクロリットルの標識されたペプチド基質をそれに加え、製造者のプロトコルに従った。サンプルを３７℃においてインキュベートし、そしてフェニックス蛍光マイクロプレートリーダーを用いてウエルから放射された蛍光を１０分間隔で測定した。結果を図１に示す。
【０１４８】
このアッセイ方法はＢＡＣＥ１酵素活性に特異的ではないが、ＢＡＣＥ２酵素活性を反映することに注目するのは重要である。ＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡがＢＡＣＥ１（ＢＡＣＥ２配列に対してたった５８％の相同性しかない［１９塩基のうちの８がミスマッチ］）に特異的であるから、細胞中のあらゆるＢＡＣＥ２蛋白質の生産がＭＢ１７４９トランスフェクションにより影響されていないらしく、このアッセイにおいて測定された全ＢＡＣＥ酵素活性に寄与し続けるらしい。結果的に、当該アッセイは、これらの細胞中でのＭＢ１７４９によるＢＡＣＥ１蛋白質の量を過小評価するらしい。
【０１４９】
これらの結果は、活性なＢＡＣＥ１蛋白質の生産がＭＢ１７４９ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞においては低下することを示す。
さらに、アルツハイマー病の動物モデルにおけるいくつかの前臨床研究は、脳のベータ−アミロイドレベルを低下させる治療が認識の実行の改善ももたらすことを示した（例えば、Ｓｃｈｅｎｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３：８２４−８２８（２００２）を参照）。これらの研究は免疫のアプローチを用いており、ベータ−アミロイド形成を阻止するよりも、ベータ−アミロイドに対する免疫応答によりベータ−アミロイドの低下を誘発する。これらの前臨床結果に基づいて、抗−ベータ−アミロイドワクチンのヒト臨床試験が開始された；しかし、これらの試験は、治療に対する反応として数人の患者が脳の炎症を発したとき（髄膜脳炎）に中止された。
【０１５０】
ＢＡＣＥ１の抑圧が実行可能であること、及びそれがアルツハイマー病を治療するのに安全で有効な方法であるかもしれないという様々なインビトロ研究及び動物研究からの証拠が存在する。Ｒｏｂｅｒｔｓらは、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１３１７−２４（２００１）において、ＢＡＣＥ１発現を欠くマウス（ＢＡＣＥ１ノックアウトマウス）がそれらの脳中においてベータ−アミロイドを生産できないが、表現型上は正常であることを示した。さらに、Ｌｕｏらは、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ４：２３１−２３２（２００１）において、ＢＡＣＥ１ノックアウトマウスをヒトアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）を過剰発現するＴｇ２５７６トランスジェニックマウスと交配したときに、子孫がベータ−アミロイドを生産できないことを示した。顕著なのは、Ｏｈｎｏらが、Ｎｅｕｒｏｎ，４１：２７−３３（２００４）において、Ｔｇ２５７６マウスとＢＡＣＥ１ノックアウトの交配もベータ−アミロイド依存性の病理から子孫を救済する結果をもたらし、海馬の記憶の欠損と神経の興奮の機能しない制御からの救済を含む。
【０１５１】
Ｂａｓｉらは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７８：３１５１２−２０（２００３）において、ｓｉＲＮＡを用いることにより標準実験室細胞系（ヒト胚腎臓細胞ＨＥＫ２９３）においてＢＡＣＥ１発現を抑圧できることを示し、そしてＫａｏらは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９：１９４２−４９（２００４）において、ｓｉＲＮＡを用いることにより野生型とＡＰＰトランスジェニックマウスの両方からの一次皮質ニューロンの培養においてインビトロにてＢＡＣＥ１の発現を抑圧できることを示した。
実施例５：
以下の実施例は、生物学上活性なＲＮＡ転写物をコードする人工の自己相補性アデノ随伴ウイルスベクター（ｓｃＡＡＶ）を含む端鎖ＤＮＡが作成できる、プラスミドＤＮＡを構築するための例示の方法である。この実施例において、プラスミドＤＮＡを作成するプロセスは８工程を含む。プラスミドＤＮＡがこれらの８つの工程により作成できたら、次に、大量のプラスミドＤＮＡ（例えば、マイクログラム、ミリグラム、又はグラムのプラスミドＤＮＡ）を当業者に知られている方法により、例えば、細菌を当該プラスミドで形質転換し、大量の細菌を生育させ、次に細菌培養液から大量のプラスミドＤＮＡを回収することにより、作成することができる。大量のプラスミドＤＮＡから、大量の人工の自己相補ＡＡＶをさらなる２つの工程により作成することができる。これらの工程の全ては、以下に記載される。
材料
ｓｃＡＡＶを含む単鎖ＤＮＡが生成され得る「ｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕ」と呼ばれるプラスミドＤＮＡを以下の出発物質を用いて作成する：
１）ストラタジーン社（ラホーヤ、ＣＡ）から市販されているファージミッドプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ，カタログ＃２１２２０７。
【０１５２】
２）インビトロジェン（カールスバッド、ＣＡ）から市販されているプラスミドｐＣＭＶ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ＧＦＰ，カタログ＃Ｖ８２０−２０。
３）ストラタジーン社（ラホーヤ、ＣＡ）から市販されているプラスミドｐＡＡＶ−ＬａｃＺ，カタログ＃２４００７１。
【０１５３】
４）アンビオン社（オースチン、ＴＸ）から市販されているプラスミドｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０，カタログ＃７２０７。
本明細書において以下に記載されるとおり、当業者に知られている方法を用いて、制限酵素を用いてこれらのプラスミドを切断する。用いられた制限酵素は：ＡｌｗＮＩ，ＰｖｕＩＩ，ＡｖａＩＩ，ＰｓｔＩ，ＫｐｎＩ，Ｂｓｕ３６Ｉ，ＳｃａＩ，ＳｆｉＩ，ＮｈｅＩ，ＢｓｓＳＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｂｓｔ１１０７Ｉ，ＳｐｅＩ，及びＳｓｐＩであり、ニューイングランドバイオラブズ社（ベヴァリー、ＭＡ）から入手可能である。
【０１５４】
本明細書において以下に記載されるとおり、ＤＮＡ修飾酵素及びＤＮＡ連結酵素を用いて、ＤＮＡ断片を当業者に知られている方法を用いて集合させる（ａｓｓｅｍｂｌｅ）。これらの酵素は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ４リガーゼであり、プロメガ社（マジソン、ＷＩ）からそれぞれカタログ＃Ｍ４２１１及びカタログ＃Ｍ１８０１にて入手可能である。
【０１５５】
さらに、以下のカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドへのライゲーションのためのＤＮＡ断片を構築する。
【０１５６】
【化３】
【０１５７】
さらに、以下のカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして、上記の工程の結果を評価し、そしてあとの工程に進む成功したプラスミドクローンを選択するために使用される。
【０１５８】
【化４】
【０１５９】
また、以下のカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プラスミドとして、ｐＰｖｕＡＢと呼ばれるプラスミドを生成するためにｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩと呼ばれるプラスミドへの挿入のためにＰＣＲ産物を生成するために使用され、以下に記載されるとおりである。
【０１６０】
【化５】
【０１６１】
プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＰｖｕを構築するための方法：
工程１−１：これは、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋に見いだされる予め存在するＡｌｗＮＩ制限部位を除去するために必要な２つの工程の最初である。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋を、９つのヌクレオチド「．．．ＣＡＧＮＮＮＣＴＧ．．．（式中、「Ｎ」はあらゆるデオキシリボヌクレオチドを表す）」の二重鎖ＤＮＡ配列を認識して切断する、制限酵素ＡｌｗＮＩにより直鎖状化する。プラスミドをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、直鎖状化されたプラスミドの突出した５−プライムエンド及び３−プライムエンドを平滑化する。結果は、切断されたエンドから３つの「ＮＮＮ」ヌクレオチドの損失である。プラスミドのエンドを、次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。結果はプラスミドのエンドの再接合であり、今、配列「．．．ＣＡＧＣＴＧ．．．」が形成される。結果のプラスミドはｐＢｌｕｅＭｏｄ１と呼ばれる。
【０１６２】
工程１−２：予め存在するＡｌｗＮＩにおけるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋のＤＮＡ配列がヌクレオチドの別の「ＣＡＧ」配列が５−プライム方向において前に来るので、プラスミドｐＢｌｕｅＭｏｄ１は、なおも、ＡｌｗＮＩ制限部位「．．．ＣＡＧＣＡＧＣＴＧ．．．」を含む。このＡｌｗＮＩ制限部位を除くため、プラスミドｐＢｌｕｅＭｏｄ１を用いて工程１の手法を再び実施する。即ち、ｐＢｌｕｅＭｏｄ１を酵素ＡｌｗＮＩにより直鎖状化する。プラスミドをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、直鎖状化されたプラスミドの突出した５−プライムエンド及び３−プライムエンドを平滑化する。結果は、切断されたエンドから３つの中間の「ＣＡＧ」ヌクレオチドの損失である。プラスミドのエンドを、次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。結果はプラスミドのエンドの再接合であり、配列「．．．ＣＡＧＣＴＧ．．．」が形成される。この配列は前にＴＧＧがあり、後ろにＧＴＡが続き、結果の「ＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡ」配列（配列番号：２４）はもはやＡｌｗＮＩ酵素の認識部位を形成しない。結果のプラスミドは、もはやＡｌｗＮＩにより切断することができず、ｐＢｌｕｅＭｏｄ２と呼ばれる。
【０１６３】
工程２：この工程の目的は、追加のＤＮＡ断片がのちの工程において挿入できるようにｐＢｌｕｅＭｏｄ２に制限部位を挿入するためである。挿入された制限部位は酵素ＡｌｗＮＩ及びＢｓｕ３６Ｉのための部位である。挿入物を構築するため、Ｏｌｉｇｏ２ＡｆとＯｌｉｇｏ２Ａｒ（上で掲載）を共に単一の試験管内で混合し、摂氏６５度に５分間加熱し、次に、冷却して室温にすることにより、各種類の２つのオリゴがアニールして短い二重鎖ＤＮＡ分子の形成を誘導する。二重鎖ＤＮＡのエンドをキナーゼで処理することにより、エンドをリン酸化し、次に、二重鎖ＤＮＡを、ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素による切断により直鎖状化されていたｐＢｌｕｅＭｏｄ２プラスミドＤＮＡに連結する。結果のプラスミドをｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩと呼ぶ。ｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩの構築の成功は、プライマーＰＣＲ２Ｃｆ及びＰＣＲ２Ｃｒを用いたＰＣＲにより仮想ｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩプライマーからのＰＣＲ産物を増幅して確認することができる。４３３塩基対のＰＣＲ産物のサイズが正確なｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩプラスミドクローンによりもたらされる。
【０１６４】
工程３：この工程の目的は、プラスミドｐＣＭＶ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ＧＦＰ中の緑色蛍光蛋白質をコードする配列内からの制限酵素ＰｓｔＩとＢｓｓＳＩの制限部位を除去することである。これは、緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列を保存するが異なるＤＮＡ配列を使用するＤＮＡ挿入物であって、ＰｓｔＩ及びＢｓｓＳＩ認識配列により適合される如何なる配列をも欠く挿入物を構築することにより行われる。当該挿入物を構築するために、Ｏｌｉｇｏ３ＡｆとＯｌｉｇｏ３Ａｒ（上で掲載）を共に単一の試験管内で混合し、摂氏６５度に５分間加熱し、次に、冷却して室温にすることにより、各種類の２つのオリゴがアニールして短い二重鎖ＤＮＡ分子の形成を誘導する。二重鎖ＤＮＡのエンドをキナーゼで処理することにより、エンドをリン酸化し、次に、二重鎖ＤＮＡを、ＳｆｉＩ及びＮｈｅＩ制限酵素による切断により直鎖状化されていたｐＣＭＶ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡに連結する。結果のプラスミドをｐＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｍｏｄと呼ぶ。ｐＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｍｏｄの構築の成功は３つの様式により確認することができる：ａ）プラスミドをＰｓｔＩとＢｓｓＳＩにより切断してサイズ１３０、５５５、及び４９２６塩基対の３つのＤＮＡ断片をもたらす（ＢｓｓＳＩは上記プラスミドを３カ所で切断するが、ＰｓｔＩは全く切断しないからである）、ｂ）プラスミドをＰＶｕＩＩにより切断してサイズ１０５５及び４５５６塩基対の２つのＤＮＡ断片をもたらすが、ｐＣＭＶ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ＧＦＰ中の＃６７０位のＰｖｕＩＩ部位が除去されているからであり、及びｃ）ｐＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｍｏｄをトランスフェクトされた細胞が蛍光顕微鏡により見える緑色蛍光蛋白質を発現することを確認することによる。
【０１６５】
工程４：この工程の目的は、プラスミドｐＣＭＶ−ＧＦＰ−ＭｏｄからのＣＭＶ−ＧＦＰコーディング配列を得て、そしてそれをｐＡＡＶ−ＬａｃＺプラスミドに挿入することである。これは、プラスミドｐＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｍｏｄを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩＩを用いて切断して、結果の１７１４塩基対断片を電気泳動及びゲルからのＤＮＡ断片の溶出により、当業者に知られている方法を用いて行う。１７１４塩基対断片のエンドはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑化し、そして平滑化されたエンドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｔ１１０７１により直鎖状化されたｐＡＡＶ−ＬａｃＺへ連結する。ＣＡＧ−ＧＦＰの３−プライムエンドとポリＡ発現カセットがＥｃｏＲＩ制限部位に位置するように並べて挿入物が連結されたプラスミドを同定するために、結果のクローンをふるいにかける。結果のプラスミドをｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶと呼ぶ。ｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶの構築の成功は、予測によれば１８９６塩基対及び３２９１塩基対のＤＮＡ断片をそれぞれ生じるＥｃｏＲＩとＳｃａＩにより候補プラスミドを切断することにより確認することができる。逆の不所望の向きの挿入物を含むクローンはＥｃｏＲＩにより切断されず、サイズ５１８７塩基対の単一のＤＮＡ断片をもたらす。
【０１６６】
工程５：工程５の目的は、ＢＡＣＥ１を標的とするｓｉＲＮＡを構成する短いヘアピンＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列（アルツハイマー病の治療法として患者内でＢＡＣＥ１酵素の発現を抑圧するため）をｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶプラスミドへ挿入することである。これは、ＢＡＣＥ１を標的とするヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡが先に構築されたプラスミドｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−抗ＢＡＣＥ１を酵素ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩにより切断し、そして結果の３８６塩基対の断片をゲル電気泳動及びゲルからのＤＮＡ断片の溶出により行う。ＢＡＣＥ１を標的とするヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡの構築は、米国特許出願公開番号２００４／０２２０１３２ Ａ１（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）に開示されている。断片をプラスミドｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶ（工程４において構築された）へ、ｐＡＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰ−ＣＭＶに見いだされる唯一のＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位の間に連結する。結果のプラスミドをｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰと呼ぶ。それは、今、２つのＰｖｕＩＩ制限部位の間に、５−プライムから３−プライムに向かって以下をコードするＤＮＡ配列を含む：ＰｖｕＩＩ部位、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、Ｕ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、抗ＢＡＣＥ１ヘアピン配列、Ｕ６転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体、ＧＦＰ蛋白質コードの逆相補体、ＣＭＶプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、ＰｖｕＩＩ部位。即ち、それは、５−プライムから３−プライムに向かって、抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡの発現カセット、及び逆方向にリポーター遺伝子ＧＦＰの発現カセットを含む。
【０１６７】
工程６：この工程の目的は、ｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰから、５−プライムＰｖｕＩＩ部位から伸長するＤＮＡ断片及び５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列を、ＣＭＶプロモーターの逆相補体を通して得ることであるが、３−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピートは含まない。この断片を次にｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩへＰｓｔＩ制限部位とＢｓｕ３６Ｉ制限部位の間に挿入することにより、ｐＰｖｕＡＢと呼ぶプラスミドを生成する。ｐＡＡＶ−抗Ｂｓｕ１−ＧＦＰからの断片は、ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅により、ＰＣＲ６Ａｆ及びＰＣＲ６Ａｒをプライマー（上記）として用いて得る。結果の２５４９塩基対のＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマーＰＣＲ６Ａｆ及びＰＣＲ６Ａｒのデザインのため、そのエンドにＰｓｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉ制限部位を含む。当該断片をこれらの酵素で切断して、次に、ＰｓｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉにより直鎖状化されてあったｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩ内に連結する。ｐＰｖｕＡＢの構築の成功は、候補のプラスミドを、成功クローンに関してはサイズ１３０、９４２、及び４３３５の３つの断片をもたらし、不所望の方向に挿入物を有する不成功のクローンに関してはサイズ１３０、２３５０、及び２９２７の３つの断片をもたらし、そして挿入物を獲得しなかった不成功のクローンに関してはサイズ１３０と２７８０の２つの断片をもたらす制限酵素ＳｓｐＩにより切断することにより確認できる。
【０１６８】
工程７：この工程の目的は、ｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰからの断片をプラスミドｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩに挿入し、今度は（ｔｈｉｓ ｔｉｍｅ）、断片がｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰ中のＰｖｕＩＩ制限部位の間に全ＤＮＡ配列からなる。これは、プラスミドｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰを制限酵素ＰｖｕＩＩにより切断し、そして２５９０塩基対のＤＮＡ断片をゲル電気泳動及びゲルからのＤＮＡ断片の溶出により行う。当該断片を、次に、工程２において導入された唯一の制限部位においてＡｌｗＮＩ酵素を用いて直鎖状化されていたｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩプラスミドへ平滑末端連結する。所望の方向に挿入物を有するプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩによる切断により確認するが、所望の方向で挿入物を有するプラスミドにおいてはサイズ５３９及び４９７５塩基対の２つの断片をもたらすが、不所望の方向に挿入物を含むプラスミドにおいてはサイズ２０５９及び３４５５の断片をもたらし、そして挿入物を有さないプラスミドにおいてはサイズ２９２４の一つの断片をもたらす。所望の方向において挿入物を含む結果として生じたプラスミドをｐＰｖｕＡＢＣと呼ぶ。それは、５−プライムから３−プライムの方向に、以下をコードするＤＮＡ配列を含む：ＰｖｕＩＩ部位、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、Ｕ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、抗ＢＡＣＥ１ヘアピン配列、Ｕ６転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体、ＧＦＰ蛋白質コードの逆相補体、ＣＭＶプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、ＡｌｗＮＩ部位。ｐＢｌｕｅＡｌｗＮＩ中のオリジナルＡｌｗＮＩ部位の３−プライム半分は挿入物の連結により復元されたが、挿入物の３−プライムエンドがＡｌｗＮＩ認識部位の「ＣＡＧ．．．．．．．」部分を再供給したからである。
【０１６９】
工程８：プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕの製造における最終工程は、プラスミドｐＰｖｕＡＢからのＰｖｕＡＢ部分をプラスミドｐＰｖｕＡＢＣへ平滑クローン化（ｂｌｕｎｔ ｃｌｏｎｅ）して、所望のプラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕを生成することである。これは、プラスミドｐＰｖｕＡＢを酵素ＰｓｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉにより切断し、そしてサイズ２４７９塩基対の結果の断片を回収することにより達成される。この挿入物のエンドを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑化する。挿入物を、次に、制限酵素ＡｌｗＮＩにより切断されて直鎖状化されていたプラスミドｐＰｖｕＡＢＣへ平滑末端連結される。ＰｖｕＩＩによる切断により挿入物の所望の方向を有するプラスミドを同定するため、結果のプラスミドをふるいにかける。ＰｖｕＩＩによる切断の場合、所望の挿入物を有するプラスミドクローンは、サイズ１８２、２３７、５８６、１９２１、及び５０８５塩基対の５つのＤＮＡ断片を生じる。不所望の方向に挿入物を有するプラスミドクローンは、サイズ１８２、５８６、１９２１、２５９５、及び２７２７塩基対の長さの５つの断片を生じる。挿入物を有さないプラスミドクローンは、サイズ１８２、２３２、５８６、１９２１、及び２５９０塩基対の長さの５つの断片を生じる。所望の方向に挿入物を有する結果のプラスミドは、５−プライムから３−プライムの方向に、以下をコードする５０８５塩基対のＤＮＡ配列を含む：ＰｖｕＩＩ部位、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、Ｕ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、抗ＢＡＣＥ１ヘアピン配列、Ｕ６転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体、ＧＦＰ蛋白質コードの逆相補体、ＣＭＶプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、ＣＭＶプロモーター、ＧＦＰ蛋白質コード、ポリアデニル化シグナル配列、Ｕ６転写終結配列の逆相補体、抗ＢＡＣＥ１ヘアピン配列の逆相補体、Ｕ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列、ＰｖｕＩＩ部位。
プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕから人工ＡＡＶを構築する方法：
プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕからの抗−ＢＡＣＥ１ ＲＮＡ転写物をコードする人工の自己相補アデノ随伴ウイルスベクター（ｓｃＡＡＶ）を含む単鎖ＤＮＡを得るためには、２つの工程しか必要ない。
【０１７０】
工程１：プラスミドｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕを制限酵素ＰｖｕＩＩにより切断し、そしてサイズ５０８５塩基対のＤＮＡ断片を当業者に知られている方法、例えば、ゲル電気泳動及びゲルからの溶出により、回収して精製する。
【０１７１】
工程２：５０８５の二重鎖ＤＮＡ断片を希釈水溶液に注ぎ、９９℃に５から１０分間温め、次に、室温に冷却する。加熱は二重鎖ＤＮＡの２つの鎖が分離するか又は「融解」して離れることを引き起こす。分離して希釈溶液中にあると、これらの２つの鎖各々が、それらの相補鎖と再アニールしてサイズ５０８５塩基対の二重らせんを形成するより、たぶん自己アニールして、約２５４２塩基対の長さの大きなＤＮＡヘアピンを形成する。オリジナルの二重鎖ＤＮＡの各鎖からの、結果の大きなＤＮＡヘアピン分子は同一であり、そして各々は所望の単鎖自己相補性の人工ＡＡＶベクターである。
【０１７２】
本発明の一つの態様においては、結果の単鎖ＤＮＡを次に動物又はヒト患者への静脈内又は動脈内投与のためペギル化イムノリポソームへパッケージされて、動物又はヒト患者の血液−脳バリヤーを通って中枢神経系内の細胞へ輸送され、中枢神経系の疾患の治療を提供する。例えば、ＢＡＣＥ１酵素を標的とする小干渉ＲＮＡへ細胞が加工するするＲＮＡヘアピンをコードするＤＮＡ配列を含むｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕプラスミドにより生産された、結果の単鎖ＤＮＡを、アルツハイマー病の治療法としてヒト患者において血液−脳バリヤーを通してデリバリーできる。
【０１７３】
匹敵する様式において、遺伝子産物の不在又は欠損により引き起こされる疾患（先天性代謝異常、リソソーム貯蔵障害を含む）の治療がなされて、５−プライムエンドにプロモーターを作動可能に連結され、そして３−プライムエンドにポリアデニル化シグナル配列を作動可能に連結された、欠落したか又は欠損している遺伝子産物をコードする配列を、ｓｉＲＮＡ及び緑色蛍光蛋白質のコード配列の代わりに、プラスミドｐＰｖｕＡＢ及びｐＰｖｕＡＢＣへ挿入することにより、本発明の態様として動物又はヒト患者へデリバリーされ得る。これらの２つのプラスミドから、フォームｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕの単一のプラスミドを次に上記の工程８に記載された方法により作成してよい。次に、自己相補性ＡＡＶをそのｐＰｖｕＡＢＣＢＡＰｖｕプラスミドから上記の方法を用いて生産し、そして動物又はヒト患者への静脈内又は動脈内投与のためペギル化イムノリポソームへパッケージされて、当該単鎖ＤＮＡが血液−脳バリヤーを通って中枢神経系内の細胞へ輸送される原因となる。この投与治療法は、遺伝子欠損により引き起こされた疾患の中枢神経系の表明（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ）、並びに当該疾患の組織的表明の治療を提供する。
実施例６
実施例５に記載された人工アデノ随伴ウイルスベクターを米国特許番号６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）に記載されたのと類似の様式にて製造してリポソーム内にパッケージされることにより、組成物を提供する。当該組成物をヒトアルツハイマー病の認められた動物モデルであるＴｇ２５７６トランスジェニックマウスの尾部の静脈に注射する。当該マウスを実質上のベータ−アミロイドプラークが非投与対象において観察されると予測される齢までフォローアップする。当該マウスを次に犠牲にしたところ、非投与マウスよりも投与マウスにおいて、より少ないベータ−アミロイドプラークが観察される。
実施例７
以下の実施例は本発明の一つの態様により二重鎖人工ＡＡＶベクターを製造するための例示の方法である。この実施例においては、本明細書に開示された実施例５の工程１から工程５の方法に従い、プラスミドｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰを構築した。結果のプラスミドは、２つのＰｖｕＩＩ制限部位の間に所望のＤＮＡセグメント含む。特に、プラスミドは、５−プライムから３−プライムに向かって、ＰｖｕＩＩ部位、ＡＡＶヘアピン配列、Ｕ６転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体、ＧＦＰ蛋白質コードの逆相補体、ＣＭＶプロモーターの逆相補体、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピート配列及びＰｖｕＩＩ部位をコードするＤＮＡ配列を含む。即ち、それは、５−プライムから３−プライムの方向に、抗−ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡの発現カセット、及びリポーター遺伝子ＧＦＰの発現カセットを逆の方向に含む（図５参照）。
【０１７４】
プラスミドｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰ中のＡＡＶ ＩＴＲｓを周囲に有する発現カセットを単離するために、７５μｇのプラスミドを制限酵素ＰｖｕＩＩとＳｃａＩにより、当業者によく知られた方法を用いて消化した。ＳｃａＩは当該プラスミドバックボーンを２つの類似の断片に消化して、プラスミドバックボーンと所望の挿入物の間にさらなる識別を可能にさせた。直鎖状断片をキアゲンのキアゲンＩＩゲル精製キットを用いてゲル精製した。直鎖状断片のパーセント回収及び質を２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸収を測定することにより分光測光法により測定した。この定量を通して、出発製品（ｐｒｏｄｕｃｔ）の６０％が回収されて精製された直鎖状断片が十分な質であった（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．９）ことが確定された。
【０１７５】
ＡＡＶ ＩＴＲｓが二次構造をとることを許容するため、４．５μｇの直鎖状断片（９０ｎｇ／μｌ）を６５℃に１０分間加熱することにより温度処理し、そして最短で１０分かけて室温にゆっくりと冷却した。次のインビトロ実験における使用のための対照として、未処理の直鎖状断片を室温に１０分間そのままにして加熱された断片を冷却した。未処理の直鎖状断片及び処理された（加熱されて冷却された）断片の予測されるコンフォメーションをそれぞれ図３と図４に示す。室温におけるインキュベーションの直後に、これらの人工ＡＡＶベクターを一時的にＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。
【０１７６】
トランスフェクション実験の目的は、人工ＡＡＶベクターをトランスフェクトされた細胞内でのＥＧＦＰ発現の長命性（ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）を、ＥＧＦＰ発現カセット（ｐＴＲＡＣＥＲ−ＣＭＡ２，インビトロジェンコーポレーション、カールスバッド、ＣＡ、により入手可能）を含む環状プラスミドをトランスフェクトされた細胞内のＥＧＦＰ発現の長命性と比較することであった。この実験は、本発明の人工ＡＡＶベクターで処理された細胞内でのＥＧＦＰ発現が環状プラスミドｐＴＲＡＣＥＲ−ＣＭＶ２で処理された細胞内でのＥＧＦＰ発現よりも長く続いき得たか否かを観察するためにデザインされた。
方法：ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション：
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１１２６８）を、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含み、そして１０％ＦＢＳ及びペニシリンとストレプトマイシンを追加されたＤＭＥＭ中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションの前日に６ウエル組織培養プレートに５ｘ１０５細胞／ウエルの密度にて接種した。この接種密度は、トランスフェクションの日に約８０％コンフルエントのウエルを生じた。
【０１７７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＴｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ（ミルス）をトランスフェクトし、製造者の推奨に従った。簡単に言えば、６μＬのＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯを２００μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ還元血清培地に５ｍＬポリスチレンチューブ中で加えた、ボルテックス混合した。希釈されたトランスフェクション試薬を室温において１５分間インキュベーションした。１マイクログラムの適切なＤＮＡを各チューブに加え、ＤＮＡを穏やかに混合して室温において２０分間インキュベーションした。サンプルは：（１）偽トランスフェクトされた（Ｈ２Ｏ）；（２）ｐＴＲＡＣＥＲプラスミド（１μｇ）；（３）人工ＡＡＶベクター（１μｇ）；及び（４）温度処理された（例えば、加熱されて冷却された）人工ＡＡＶベクター（１μｇ）を含んだ。インキュベーション後に、細胞上の培地を除去し、そして２ｍＬの正常な生育培地（ＤＭＥＭ，高グルコース、１０％ＦＢＳ，ペニシリン／ストレプトマイシン）に置き換えた。ＤＮＡ複合体をゆっくりと細胞に滴下により加え、穏やかな振動により混合した。トランスフェクトされた細胞を３７℃において５％ＣＯ２を含む湿潤加湿器中でインキュベートした。ＥＧＦＰ発現後に、トランスフェクトされた細胞の写真を２−４日ごとにトランスフェクションの３０日後まで撮った。全ウエルを表すエリアを写真に撮った。写真を撮った日に、全てのトランスフェクト細胞上の培地を新鮮な正常生育培地に置き換えた。
【０１７８】
トランスフェクトされた細胞中のＥＧＦＰ発現の比較を可能にするため、デジタル写真の全てを同じパラメーターで撮った。イメージの分析は、人工ＡＡＶベクターからのＥＧＦＰ発現の持続を明らかにした。さらに、加熱して冷却した人工ＡＡＶベクターは、細胞をトランスフェクトしてＥＧＦＰ発現を持続することに関して、実質上はいっそう有効であった。これは、図６に示すとおりトランスフェクションの６日及び２３日後に回収されたイメージにて明らかである。
【０１７９】
図６において観察され得るとおり、９５％を超えるプラスミド由来のＥＧＦＰ発現がトランスフェクションの１２日後に消失した。最後の温度処理工程（例えば、加熱及び冷却）なしに生産された人工ＡＡＶベクターはほんの僅かな細胞においてのみＥＧＦＰ発現を生じた；しかしながら、ＥＧＦＰ発現はそれらの細胞中で持続した。観察された持続は、トランスフェクトされた細胞の少数においてＡＡＶ−ＩＴＲｓの二次構造の形成、続いて二次構造が上記細胞中でＩＴＲｓを達成したためにＥＧＦＰの発現が持続する指標として解釈され得る。温度処理工程（例えば、加熱及び冷却）を含む開示方法に従い製造された人工ＡＡＶベクターは、トランスフェクションの２７日後に連続するＥＧＦＰ発現をもたらした。連続する発現は温度処理工程（例えば、加熱及び冷却）によるＡＡＶ−ＩＴＲｓの二次構造の形成の指標として解釈でき、ＥＧＦＰの持続する発現に資するこれらの構造が人工ＡＡＶベクターによりトランスフェクトされた実質上全ての細胞に存在した。
【０１８０】
実験はトランスフェクションの２７日後に終了したが、顕著な細胞の損失がこの時間点の後に起こり始めたからであった。温度処理された人工ＡＡＶベクターからの発現を上記プラスミドからの発現と比較すると、発現の持続における１００％を超える増加（日数）が人工ＡＡＶベクターから得られた。
【０１８１】
この実施例は、顕著で安定な発現が主題の発明の態様である人工ＡＡＶベクターから得られて、開示された方法に従い生産できることを例示する。この人工ＡＡＶベクターからの発現は、環状プラスミドからの発現よりも長く持続すると観察された。
【０１８２】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物、及び電子上利用可能なマテリアル（例えば、ジェンバンクアミノ酸及びヌクレオチド配列サブミッション；及び蛋白質データバンク（ｐｄｂ）サブミッション）は、引用により本明細書に取り込まれる。前記の詳細な説明及び実施例は、理解の明確化のためのみに提供された。不必要な限定はそこから理解されるべきでない。発明は、特許請求の範囲により規定された発明の範囲内に含まれる当業者には自明の様々なバリエーションに関して示されて記載された正確な詳細に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、実施例４に記載されたとおりに、測定された蛍光（ｙ軸、蛍光ユニット）対時間（ｘ軸、分）のグラフ描写による、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの蛋白質抽出物中の全ＢＡＣＥ酵素活性を示す。バックグラウンド値（アッセイ試薬のみ、細胞なし）をシンボル「◆」で表す。ＭＢ１７４９のｓｉＲＮＡ及びｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅの値をシンボル「●」で表す。ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照及びｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅの値をシンボル「△」で表す。
【図２】図２は、単鎖ＤＮＡのデリバリーのための自己相補性人工ＡＡＶベクターの一つの態様を模式的に表す。人工ＡＡＶベクターは、５プライムから３プライム方向に向かって、５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）；単鎖ＤＮＡ（α−ＢＡＣＥ１／ｐＣＭＶ＾ＥＧＦＰ）；内部ＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）；単鎖ＤＮＡの逆相補体（α−ＢＡＣＥ１／ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）；及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）を含む。
【図３】図３は、直鎖の二重鎖ＤＮＡのデリバリーのための人工ＡＡＶベクターの一つの態様を模式的に表す。直鎖の二重鎖のＤＮＡ（α−ＢＡＣＥ１／ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）は、ＡＡ−ＩＴＲｓ（ＩＴＲ）を各鎖の５プライムエンド及び３プライムエンドに有する。
【図４】図４は、少なくとも１回の加熱及び冷却サイクルにおいて加熱処理された図３中に示された直鎖の二重鎖ＤＮＡのデリバリーのための人工ＡＡＶベクターの一つの態様を模式的に表す。模式図は、内部ハイブリダイズするように各ＩＴＲの自己相補部分を許容するようにＩＴＲｓが折り畳まれる、ＩＴＲｓの二次構造を示す。
【図５】図５は、実施例７の工程１から５により生産されて実施例７において使用されたとおりの、プラスミドｐＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＧＦＰの一つの態様の模式的描写を表す。当該プラスミドは、２つのＰｖｕＩＩ制限部位の間に、５プライムから３プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）、ＤＮＡセグメント（α−ＢＡＣＥ１／ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）、及び３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ（ＩＴＲ）を含む。
【図６】図６は、ｐＴＲＡＣＥＲ ＣＭＶ２環状プラスミド（図６ａ及び６ｄ）；本発明の直鎖状二重鎖人工ＡＡＶベクター（図６ｂ及び６ｅ）；又は６５度に加熱して室温に冷却した本発明の直鎖状二重鎖人工ＡＡＶベクター（図６ｃ及び６ｆ）をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡イメージの写真を示す。当該写真は、実施例７に記載された、トランスフェクション６日後（図６ａ−６ｃ）とトランスフェクション２３日後（図６ｄ−６ｆ）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＥＧＦＰの発現を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテル；及び
カテーテルへ、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を輸送する手段；及び
血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分
を含むカテーテルに組成物をデリバリーするための手段
を含む、血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための医学用システム。
【請求項２】
患者の血流への組成物のデリバリーのための移植可能なポンプをさらに含む、請求項１記載の医学用システム。
【請求項３】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡのデリバリーのためであり、そして、人工ＡＡＶベクターが５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する単鎖ＤＮＡを含む、請求項１記載の医学用システム。
【請求項４】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡのデリバリーのためであり、そして、人工ＡＡＶベクターが５−プライムから３−プライムの方向に向かって、
５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；
内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び
３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ
を含む、請求項１記載の医学用システム。
【請求項５】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡのデリバリーのためであって、人工ＡＡＶベクターが、各鎖の５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む、請求項１記載の医学用システム。
【請求項６】
人工ＡＡＶベクターが少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理される、請求項５記載の医学用システム。
【請求項７】
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテル；及び
カテーテルへ受容体特異的リポソームを含む組成物をデリバリーするための手段であって、
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているもの
を含む上記組成物デリバリー手段を含む
血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための医学用システム。
【請求項８】
患者の血流への組成物のデリバリーのための移植可能なポンプをさらに含む、請求項７記載の医学用システム。
【請求項９】
リポソームの外部表面が最大２００ナノメーターの直径を有する球を規定する、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１０】
少なくとも５で最大で１０００の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１１】
少なくとも２５で最大で４０の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１２】
コンジュゲーション剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、ビオチン、ストレプトアビジン、有機ポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１３】
コンジュゲーション剤の分子量が少なくとも１０００ドルトンから最大で５０，０００ドルトンである、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１４】
人工ＡＡＶベクターが配列番号：８−１１からなる群から選択される配列を含む、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１５】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１６】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１７】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１８】
脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための方法であって、受容体特異的リポソームを含む組成物を患者の脳に投与することを含み、但し、当該受容体当該リポソームは、
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているもの
を含む、上記方法。
【請求項１９】
組成物を静脈内又は動脈内投与する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
リポソームの外部表面が最大で２００ナノメートルの直径を有する球を規定する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも５で最大で１０００の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも２５で最大で４０の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
コンジュゲーション剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、ビオチン、ストレプトアビジン、有機ポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
コンジュゲーション剤の分子量が少なくとも１０００ドルトンから最大で５０，０００ドルトンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
ＤＮＡを細胞にデリバリーするための方法であって、受容体特異的ナノコンテナーを含む組成物を患者に投与することを含み、但し、当該受容体ナノコンテナーは、
外部表面及び内部区画を有する受容体ナノコンテナー；
ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、人工ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードする；
細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記方法。
【請求項２６】
組成物を静脈内又は動脈内投与する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
リポソームの外部表面が最大で２００ナノメートルの直径を有する球を規定する、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
細胞が脳細胞、肝臓細胞、肺細胞、及び膵臓細胞からなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡのデリバリーのためであり、そして、人工ＡＡＶベクターが５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する単鎖ＤＮＡを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡのデリバリーのためであり、そして、人工ＡＡＶベクターが５−プライムから３−プライムの方向に向かって、
５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；
内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び
３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ
を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡのデリバリーのためであって、人工ＡＡＶベクターが、各鎖の５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
人工ＡＡＶベクターが少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項２５記載の方法。
【請求項３４】
短いヘアピンＲＮＡが細胞内で発現される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項２５記載の方法。
【請求項３６】
蛋白質が細胞内で発現される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための方法であって、患者に組成物を投与することを含み、組成物が、
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む、上記方法。
【請求項３８】
組成物が静脈内又は動脈内投与される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
人工ＡＡＶベクターが配列番号：８−１１からなる群から選択される配列を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
短いヘアピンＲＮＡが脳内で発現される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
蛋白質が脳内で発現される、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
病原性蛋白質により引き起こされる神経変性障害を治療する方法であって、当該方法は、
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び
血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分
を含む組成物をカテーテルにデリバリーすること
を含む、上記方法。
【請求項４６】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
短いヘアピンＲＮＡが脳内で発現される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
病原性蛋白質により引き起こされる神経変性障害を治療する方法であって、当該方法は、
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして
受容体特異リポソーム及び受容体特異リポソームのための薬学上受容可能な担体を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含むが、
但し、受容体特異的リポソームは、
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで、あって、但し、人工ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記方法。
【請求項４９】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
短いヘアピンＲＮＡが脳内で発現される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
蛋白質不在下で引き起こされる神経疾患を治療する方法であって、当該方法は、
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイウス（ＡＡＶ）ベクター；及び
血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分
を含む組成物をカテーテルにデリバリーすること
を含む方法。
【請求項５２】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
蛋白質が脳内で発現される、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
神経疾患が代謝の先天的エラーである、請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
蛋白質不在下で引き起こされる神経疾患を治療する方法であって、当該方法は、
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして
受容体特異的リポソーム及び受容体特異リポソームのための薬学上受容可能な担体を含む組成物をカテーテルにデリバリーすること
を含むが、但し、受容体特異的リポソームは
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、人工ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含み；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記方法。
【請求項５６】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
蛋白質が脳内で発現される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
神経疾患が代謝の先天的エラーである、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための組成物であて、当該組成物は受容体特異的リポソームを含み、但し、受容体特異的リポソームは
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードし；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記組成物。
【請求項６０】
リポソームの外部表面が最大２００ナノメーターの直径を有する球を規定する、請求項５９記載の組成物。
【請求項６１】
少なくとも５で最大で１０００の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項５９記載の組成物。
【請求項６２】
少なくとも２５で最大で４０の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項５９記載の組成物。
【請求項６３】
コンジュゲーション剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、ビオチン、ストレプトアビジン、有機ポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５９記載の組成物。
【請求項６４】
コンジュゲーション剤の分子量が少なくとも１０００ドルトンから最大で５０，０００ドルトンである、請求項５９記載の組成物。
【請求項６５】
ＤＮＡを細胞にデリバリーするための組成物であって、当該組成物は受容体特異的ナノコンテナーを含み、但し、受容体特異的ナノコンテナーは
外部表面及び内部区画を有するナノコンテナー；
ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含み；
細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記組成物。
【請求項６６】
リポソームの外部表面が最大２００ナノメーターの直径を有する球を規定する、請求項６５記載の組成物。
【請求項６７】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡをデリバリーするためのものであって、当該人工ＡＡＶベクターは５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する単鎖ＤＮＡを含む、請求項６５記載の組成物。
【請求項６８】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡをデリバリーするためのものであって、当該人工ＡＡＶベクターは５−プライムから３−プライムの方向に向かって：
５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；
内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び
３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ
を含む、請求項６５記載の組成物。
【請求項６９】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡをデリバリーするためのものであって、当該人工ＡＡＶベクターは各鎖の５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む、請求項６５記載の組成物。
【請求項７０】
人工ＡＡＶベクターが少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理される、請求項６９記載の組成物。
【請求項７１】
血液−脳バリヤーを通して脳内での発現のためにＤＮＡをデリバリーするための組成物であって、
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び
血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分
を含む、上記組成物。
【請求項７２】
人工ＡＡＶベクターが配列番号：８−１１からなる群から選択される配列を含む、請求項７１記載の組成物。
【請求項７３】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項７１記載の組成物。
【請求項７４】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項７１記載の組成物。
【請求項７５】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項７１記載の組成物。
【請求項７６】
人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、５−プライムから３−プライムの方向に向かって：
５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；
内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び
３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ
を含むベクター。
【請求項７７】
人工ＡＡＶベクターが配列番号：１０−１１からなる群から選択される配列を含む、請求項７６記載のベクター。
【請求項７８】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項７６記載のベクター。
【請求項７９】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項７６記載のベクター。
【請求項８０】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項７６記載のベクター。
【請求項８１】
生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡのデリバリーのための人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、各鎖の５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む、人工ＡＡＶベクター。
【請求項８２】
人工ＡＡＶベクターが少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理される、請求項８１記載のベクター。
【請求項８３】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項８１記載のベクター。
【請求項８４】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項８１記載のベクター。
【請求項８５】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項８１記載のベクター。
【請求項８６】
人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを作成するための方法であって、
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをＤＮＡプラスミド中にＤＮＡクローニング方法により集合させ；
インビトロ転写方法を用いてＤＮＡプラスミドから単鎖ＤＮＡの単鎖ＲＮＡ転写物を生成させ；
逆転写反応方法を用いて逆転写によりＲＮＡ転写物から単鎖ＤＮＡを生成させ；
ＲＮａｓｅ酵素を用いたＲＮＡの消化により反応産物からＲＮＡ転写物を取り出すこと
を含む方法。
【請求項８７】
ゲル精製、カラム親和法、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＤＮＡ精製方法により反応産物から単鎖ＤＮＡ産物を精製することをさらに含む、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを作成するための方法であって、
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをＤＮＡプラスミド中にＤＮＡクローニング方法により集合させ；
５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ５−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより環状プラスミドを直鎖状化し；
直鎖状化されたプラスミドの各鎖の５−プライムエンドに親和性タグを化学的にコンジュゲートし；
３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ３−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりＤＮＡ配列を切断するが、制限酵素が異なるサイズの２つの直鎖状二重鎖ＤＮＡセグメントをもたらすようにし；
サイズによりサイズ分離方法を用いてＤＮＡ分子の集団を分離して二重鎖ＤＮＡを回収し；そして
ＤＮＡを融解することにより、その２つの相補鎖を２つの単鎖に分離し、そして混合物をタグのための親和性カラムに通すが、タグを付加された鎖がカラム上に捕捉されて、一方タグのない単鎖は所望の最終産物としてフロースルーするようにすること
を含む方法。
【請求項８９】
親和性タグがビオチン分子を含み、そして親和性カラムがストレプトアビジン親和性カラムを含む、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
サイズ分離方法が、カラム濾過又はゲル電気泳動、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８８記載の方法。
【請求項９１】
人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを作成するための方法であって、
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをＤＮＡプラスミド中にＤＮＡクローニング方法により集合させ；
５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ５−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより環状プラスミドを直鎖状化し；
直鎖状化されたプラスミドの各鎖の５−プライムエンドに親和性タグを化学的にコンジュゲートし；
３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ３−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりＤＮＡ配列を切断するが、制限酵素が異なるサイズの２つの直鎖状二重鎖ＤＮＡセグメントをもたらすようにし；
サイズによりサイズ分離方法を用いてＤＮＡ分子の集団を分離して二重鎖ＤＮＡを回収すること
を含む方法。
【請求項９２】
サイズ分離方法が、カラム濾過又はゲル電気泳動、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
回収された二重鎖ＤＮＡを少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理する、請求項９１記載のベクター。
【請求項９４】
自己相補性人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを作成するための方法であって、
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、内部ＡＡＶ−ＩＴＲ、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡの逆相補体、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをＤＮＡプラスミド中にＤＮＡクローニング方法により集合させ；
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、内部ＡＡＶ−ＩＴＲ、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡの逆相補体、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含むＤＮＡ配列を制限酵素により切り出すことにより環状プラスミドを直鎖状化し；
サイズによりサイズ分離方法を用いて二重鎖ＤＮＡを回収し；
二重鎖ＤＮＡを融解することにより、その２つの相補鎖を２つの単鎖に分離し；そして
融解されたＤＮＡの温度を低下させることにより、単鎖が自己アニールによりヘアピン形態になることを許容すること
を含む方法。
【請求項９５】
サイズ分離方法が、カラム濾過又はゲル電気泳動、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９４記載の方法。
【請求項１】
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテル；及び
カテーテルへ、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を輸送する手段；及び
血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分
を含むカテーテルに組成物をデリバリーするための手段
を含む、血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための医学用システム。
【請求項２】
患者の血流への組成物のデリバリーのための移植可能なポンプをさらに含む、請求項１記載の医学用システム。
【請求項３】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡのデリバリーのためであり、そして、人工ＡＡＶベクターが５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する単鎖ＤＮＡを含む、請求項１記載の医学用システム。
【請求項４】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡのデリバリーのためであり、そして、人工ＡＡＶベクターが５−プライムから３−プライムの方向に向かって、
５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；
内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び
３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ
を含む、請求項１記載の医学用システム。
【請求項５】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡのデリバリーのためであって、人工ＡＡＶベクターが、各鎖の５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む、請求項１記載の医学用システム。
【請求項６】
人工ＡＡＶベクターが少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理される、請求項５記載の医学用システム。
【請求項７】
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテル；及び
カテーテルへ受容体特異的リポソームを含む組成物をデリバリーするための手段であって、
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているもの
を含む上記組成物デリバリー手段を含む
血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための医学用システム。
【請求項８】
患者の血流への組成物のデリバリーのための移植可能なポンプをさらに含む、請求項７記載の医学用システム。
【請求項９】
リポソームの外部表面が最大２００ナノメーターの直径を有する球を規定する、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１０】
少なくとも５で最大で１０００の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１１】
少なくとも２５で最大で４０の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１２】
コンジュゲーション剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、ビオチン、ストレプトアビジン、有機ポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１３】
コンジュゲーション剤の分子量が少なくとも１０００ドルトンから最大で５０，０００ドルトンである、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１４】
人工ＡＡＶベクターが配列番号：８−１１からなる群から選択される配列を含む、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１５】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１６】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１７】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項７記載の医学用システム。
【請求項１８】
脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための方法であって、受容体特異的リポソームを含む組成物を患者の脳に投与することを含み、但し、当該受容体当該リポソームは、
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているもの
を含む、上記方法。
【請求項１９】
組成物を静脈内又は動脈内投与する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
リポソームの外部表面が最大で２００ナノメートルの直径を有する球を規定する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも５で最大で１０００の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも２５で最大で４０の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
コンジュゲーション剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、ビオチン、ストレプトアビジン、有機ポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
コンジュゲーション剤の分子量が少なくとも１０００ドルトンから最大で５０，０００ドルトンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
ＤＮＡを細胞にデリバリーするための方法であって、受容体特異的ナノコンテナーを含む組成物を患者に投与することを含み、但し、当該受容体ナノコンテナーは、
外部表面及び内部区画を有する受容体ナノコンテナー；
ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、人工ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードする；
細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記方法。
【請求項２６】
組成物を静脈内又は動脈内投与する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
リポソームの外部表面が最大で２００ナノメートルの直径を有する球を規定する、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
細胞が脳細胞、肝臓細胞、肺細胞、及び膵臓細胞からなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡのデリバリーのためであり、そして、人工ＡＡＶベクターが５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する単鎖ＤＮＡを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡのデリバリーのためであり、そして、人工ＡＡＶベクターが５−プライムから３−プライムの方向に向かって、
５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；
内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び
３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ
を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡのデリバリーのためであって、人工ＡＡＶベクターが、各鎖の５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
人工ＡＡＶベクターが少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項２５記載の方法。
【請求項３４】
短いヘアピンＲＮＡが細胞内で発現される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項２５記載の方法。
【請求項３６】
蛋白質が細胞内で発現される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための方法であって、患者に組成物を投与することを含み、組成物が、
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分を含む、上記方法。
【請求項３８】
組成物が静脈内又は動脈内投与される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
人工ＡＡＶベクターが配列番号：８−１１からなる群から選択される配列を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
短いヘアピンＲＮＡが脳内で発現される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
蛋白質が脳内で発現される、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
病原性蛋白質により引き起こされる神経変性障害を治療する方法であって、当該方法は、
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び
血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分
を含む組成物をカテーテルにデリバリーすること
を含む、上記方法。
【請求項４６】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
短いヘアピンＲＮＡが脳内で発現される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
病原性蛋白質により引き起こされる神経変性障害を治療する方法であって、当該方法は、
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして
受容体特異リポソーム及び受容体特異リポソームのための薬学上受容可能な担体を含む組成物をカテーテルにデリバリーすることを含むが、
但し、受容体特異的リポソームは、
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで、あって、但し、人工ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記方法。
【請求項４９】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
短いヘアピンＲＮＡが脳内で発現される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
蛋白質不在下で引き起こされる神経疾患を治療する方法であって、当該方法は、
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイウス（ＡＡＶ）ベクター；及び
血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分
を含む組成物をカテーテルにデリバリーすること
を含む方法。
【請求項５２】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
蛋白質が脳内で発現される、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
神経疾患が代謝の先天的エラーである、請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
蛋白質不在下で引き起こされる神経疾患を治療する方法であって、当該方法は、
患者の脳に供給する血管内に配置された遠位エンドを有する神経血管カテーテルを用意し；そして
受容体特異的リポソーム及び受容体特異リポソームのための薬学上受容可能な担体を含む組成物をカテーテルにデリバリーすること
を含むが、但し、受容体特異的リポソームは
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、人工ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含み；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記方法。
【請求項５６】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
蛋白質が脳内で発現される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
神経疾患が代謝の先天的エラーである、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
脳中での発現のための血液−脳バリヤーを通してＤＮＡをデリバリーするための組成物であて、当該組成物は受容体特異的リポソームを含み、但し、受容体特異的リポソームは
外部表面及び内部区画を有するリポソーム；
リポソームの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードし；
一つ又はそれより多い血液−脳バリヤー及び脳細胞膜標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記組成物。
【請求項６０】
リポソームの外部表面が最大２００ナノメーターの直径を有する球を規定する、請求項５９記載の組成物。
【請求項６１】
少なくとも５で最大で１０００の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項５９記載の組成物。
【請求項６２】
少なくとも２５で最大で４０の血液−脳バリヤー又は脳細胞膜標的化因子がリポソーム表面上にコンジュゲートされている、請求項５９記載の組成物。
【請求項６３】
コンジュゲーション剤がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、ビオチン、ストレプトアビジン、有機ポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５９記載の組成物。
【請求項６４】
コンジュゲーション剤の分子量が少なくとも１０００ドルトンから最大で５０，０００ドルトンである、請求項５９記載の組成物。
【請求項６５】
ＤＮＡを細胞にデリバリーするための組成物であって、当該組成物は受容体特異的ナノコンテナーを含み、但し、受容体特異的ナノコンテナーは
外部表面及び内部区画を有するナノコンテナー；
ナノコンテナーの内部区画内に位置する人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＡＡＶベクターは生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含み；
細胞上に位置する受容体を標的とする一つ又はそれより多い受容体特異的標的剤；及び
一つ又はそれより多いコンジュゲーション剤であって、各標的剤はコンジュゲーション剤の少なくとも一つによりリポソームの外部表面につながっているコンジュゲーション剤
を含む、上記組成物。
【請求項６６】
リポソームの外部表面が最大２００ナノメーターの直径を有する球を規定する、請求項６５記載の組成物。
【請求項６７】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡをデリバリーするためのものであって、当該人工ＡＡＶベクターは５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する単鎖ＤＮＡを含む、請求項６５記載の組成物。
【請求項６８】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡをデリバリーするためのものであって、当該人工ＡＡＶベクターは５−プライムから３−プライムの方向に向かって：
５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；
内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び
３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ
を含む、請求項６５記載の組成物。
【請求項６９】
人工ＡＡＶベクターが生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡをデリバリーするためのものであって、当該人工ＡＡＶベクターは各鎖の５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む、請求項６５記載の組成物。
【請求項７０】
人工ＡＡＶベクターが少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理される、請求項６９記載の組成物。
【請求項７１】
血液−脳バリヤーを通して脳内での発現のためにＤＮＡをデリバリーするための組成物であって、
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡを含む人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；及び
血液−脳バリヤーを通して少なくともＤＮＡをデリバリーするための成分
を含む、上記組成物。
【請求項７２】
人工ＡＡＶベクターが配列番号：８−１１からなる群から選択される配列を含む、請求項７１記載の組成物。
【請求項７３】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項７１記載の組成物。
【請求項７４】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項７１記載の組成物。
【請求項７５】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項７１記載の組成物。
【請求項７６】
人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、５−プライムから３−プライムの方向に向かって：
５プライムＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡ；
内部ＡＡＶ−ＩＴＲ；
生物学上活性な因子をコードする単鎖ＤＮＡの逆相補体；及び
３プライムＡＡＶ−ＩＴＲ
を含むベクター。
【請求項７７】
人工ＡＡＶベクターが配列番号：１０−１１からなる群から選択される配列を含む、請求項７６記載のベクター。
【請求項７８】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項７６記載のベクター。
【請求項７９】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項７６記載のベクター。
【請求項８０】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項７６記載のベクター。
【請求項８１】
生物学上活性な因子をコードする直鎖状二重鎖ＤＮＡのデリバリーのための人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、各鎖の５−プライムエンド及び３−プライムエンドにＡＡＶ−ＩＴＲｓを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡを含む、人工ＡＡＶベクター。
【請求項８２】
人工ＡＡＶベクターが少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理される、請求項８１記載のベクター。
【請求項８３】
生物学上活性な因子をコードするＤＮＡが配列番号：１−７からなる群から選択される配列を含む、請求項８１記載のベクター。
【請求項８４】
ＤＮＡが短いヘアピンＲＮＡをコードする、請求項８１記載のベクター。
【請求項８５】
ＤＮＡが蛋白質をコードする、請求項８１記載のベクター。
【請求項８６】
人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを作成するための方法であって、
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをＤＮＡプラスミド中にＤＮＡクローニング方法により集合させ；
インビトロ転写方法を用いてＤＮＡプラスミドから単鎖ＤＮＡの単鎖ＲＮＡ転写物を生成させ；
逆転写反応方法を用いて逆転写によりＲＮＡ転写物から単鎖ＤＮＡを生成させ；
ＲＮａｓｅ酵素を用いたＲＮＡの消化により反応産物からＲＮＡ転写物を取り出すこと
を含む方法。
【請求項８７】
ゲル精製、カラム親和法、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＤＮＡ精製方法により反応産物から単鎖ＤＮＡ産物を精製することをさらに含む、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを作成するための方法であって、
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをＤＮＡプラスミド中にＤＮＡクローニング方法により集合させ；
５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ５−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより環状プラスミドを直鎖状化し；
直鎖状化されたプラスミドの各鎖の５−プライムエンドに親和性タグを化学的にコンジュゲートし；
３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ３−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりＤＮＡ配列を切断するが、制限酵素が異なるサイズの２つの直鎖状二重鎖ＤＮＡセグメントをもたらすようにし；
サイズによりサイズ分離方法を用いてＤＮＡ分子の集団を分離して二重鎖ＤＮＡを回収し；そして
ＤＮＡを融解することにより、その２つの相補鎖を２つの単鎖に分離し、そして混合物をタグのための親和性カラムに通すが、タグを付加された鎖がカラム上に捕捉されて、一方タグのない単鎖は所望の最終産物としてフロースルーするようにすること
を含む方法。
【請求項８９】
親和性タグがビオチン分子を含み、そして親和性カラムがストレプトアビジン親和性カラムを含む、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
サイズ分離方法が、カラム濾過又はゲル電気泳動、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８８記載の方法。
【請求項９１】
人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを作成するための方法であって、
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをＤＮＡプラスミド中にＤＮＡクローニング方法により集合させ；
５−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ５−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりプラスミドを消化することにより環状プラスミドを直鎖状化し；
直鎖状化されたプラスミドの各鎖の５−プライムエンドに親和性タグを化学的にコンジュゲートし；
３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲのすぐ３−プライムにてプラスミド配列中の公知の一カ所にてＤＮＡを切断する制限酵素によりＤＮＡ配列を切断するが、制限酵素が異なるサイズの２つの直鎖状二重鎖ＤＮＡセグメントをもたらすようにし；
サイズによりサイズ分離方法を用いてＤＮＡ分子の集団を分離して二重鎖ＤＮＡを回収すること
を含む方法。
【請求項９２】
サイズ分離方法が、カラム濾過又はゲル電気泳動、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
回収された二重鎖ＤＮＡを少なくとも１回の加熱及び冷却のサイクルにより加熱処理する、請求項９１記載のベクター。
【請求項９４】
自己相補性人工アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを作成するための方法であって、
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、内部ＡＡＶ−ＩＴＲ、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡの逆相補体、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲをＤＮＡプラスミド中にＤＮＡクローニング方法により集合させ；
５−プライムから３−プライム方向に向かって、５−プライムＡＡＶインバーテッドターミナルリピート（ＡＡＶ−ＩＴＲ）、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡ、内部ＡＡＶ−ＩＴＲ、生物学上活性な因子をコードするＤＮＡの逆相補体、及び３−プライムＡＡＶ−ＩＴＲを含むＤＮＡ配列を制限酵素により切り出すことにより環状プラスミドを直鎖状化し；
サイズによりサイズ分離方法を用いて二重鎖ＤＮＡを回収し；
二重鎖ＤＮＡを融解することにより、その２つの相補鎖を２つの単鎖に分離し；そして
融解されたＤＮＡの温度を低下させることにより、単鎖が自己アニールによりヘアピン形態になることを許容すること
を含む方法。
【請求項９５】
サイズ分離方法が、カラム濾過又はゲル電気泳動、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０３５９０（Ｐ２００８−５０３５９０Ａ）
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１８２５２（Ｐ２００７−５１８２５２）
【出願日】平成１７年６月２１日（２００５．６．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２２１５６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２２８３
【国際公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【出願人】（５９１００７８０４）メドトロニック・インコーポレーテッド (243)
【住所又は居所原語表記】７１０Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｐａｒｋｗａｙ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ５５４３２，Ｕ．Ｓ．Ａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２１日（２００５．６．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２２１５６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２２８３
【国際公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【出願人】（５９１００７８０４）メドトロニック・インコーポレーテッド (243)
【住所又は居所原語表記】７１０Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｐａｒｋｗａｙ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ５５４３２，Ｕ．Ｓ．Ａ
【Ｆターム（参考）】
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