経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子
【課題】経口投与によって薬効を発揮できないか、または吸収性、副作用等で欠点を有する薬物、さらには吸収性、副作用などの点で改善を要する薬物について、粘膜経由の投与方法により局所も含め生体内への吸収性に優れ、高いバイオアベイラビリティを発揮し得る技術を提供すること。
【解決手段】表面にカルボキシル基を有するコアからなり、コアの内部に２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上および薬物を封入した経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子であり、特に表面にカルボキシル基を有するコアが、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、乳酸重合体（ＰＬＡ）などの生分解性ポリマーであるナノ粒子。
【解決手段】表面にカルボキシル基を有するコアからなり、コアの内部に２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上および薬物を封入した経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子であり、特に表面にカルボキシル基を有するコアが、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、乳酸重合体（ＰＬＡ）などの生分解性ポリマーであるナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物を封入したナノ粒子に関し、詳しくは経粘膜吸収用の薬物封入ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物を経粘膜投与する目的は、経口投与の欠陥である、例えば、（１）消化管からの薬物の吸収が悪く、吸収がばらつき、肝で不活化される、（２）薬物が消化管の酵素によって不活化される、（３）急激な薬物の吸収で副作用が発現し、特に胃腸管や肝における副作用が強く出る、（４）薬物の徐放効果が得られない、などを改善するためである。
【０００３】
薬物の皮膚および粘膜適用に関しては、すでに多くの技術が実用化されている。それらの問題点として、局所作用を目的としたものでは皮膚・粘膜への吸収・分布が不十分であること、皮下・粘膜下組織への浸透が十分でないことなどが挙げられ、また全身への吸収を目的として用いられる場合には、全身への吸収が十分でない薬物が多い。
【０００４】
近年、経口投与では不活性化してしまい、注射投与を余儀なくされている生理活性蛋白質、ペプチドについて、経皮・経粘膜投与が試みられているが、吸収率の改善を確保するまでには到っていないのが現状である。
【０００５】
生理活性蛋白質の一つとして、比較的低分子で、しかも化学的に安定なインスリンを用いて皮膚、粘膜経由の投与法について種々の研究が行われているが、その吸収率は確実なデータでは数パーセント程度にすぎず、皮膚経由の投与ではほとんど吸収されないとされている（非特許文献１）。
【０００６】
また、生理活性物質をカルシウム含有水難溶性無機物粒子に封入した製剤（特許文献１）、生理活性蛋白質あるいはペプチドと亜鉛イオンとの沈殿物による水不溶性徐放性組成物（特許文献２）などが提案されている。しかしながら、これらの製剤は、薬物の吸収性、あるいは局所刺激等の点で十分なものとは言い難く、未だ実用化に至ったものはない。また、本発明が目的とする、表面にカルボキシル基を有するコアからなる薬物を封入した経粘膜吸収用ナノ粒子は知られていない。
【０００７】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ ０２／０９６３９６号公報
【特許文献２】特開２００３−０８１８６５号公報
【非特許文献１】DRUG DELIVERY SYSTEM 今日のＤＤＳ 薬物送達システム（医薬ジャーナル）325〜331頁、1999年
【非特許文献２】臨床薬理（Jpn. J. Clin. Pharmacol. Ther.）:26(1), p.127〜128(1995)
【非特許文献３】Yakugaku Zasshi:121(12), p.929〜948 (2001)
【非特許文献４】J. Controlled Release:79, p.81〜91(2002)
【０００８】
上述したように、経口投与により不活性化する、あるいは吸収性が悪い、副作用が発現するなどの欠陥を有する非吸収性または難吸収性の薬物を、経粘膜投与に適用することができ、かつ薬物の吸収性に優れ、十分な活性を発揮し、副作用を最小限にする薬剤の開発が望まれている。特に、近年進歩が著しい抗原や抗体を含む蛋白医薬品や薬効を有する核酸関連物質の経口投与が可能になることは、医療の著しい飛躍に繋がる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって本発明は、経口投与によって薬効を発揮できないか、または吸収性、副作用等で欠点を有する薬物、さらには注射剤、皮膚外用剤として使用されているが、吸収性、副作用などの点で改善を要する薬物について、粘膜経由の投与方法により局所も含め生体内への吸収性に優れ、高いバイオアベイラビリティを発揮し得る技術を提供することを課題とする。
【００１０】
かかる課題を解決するべく、本発明者らは鋭意検討した結果、ナノテクノロジーを応用し、赤血球よりも遥かに小さい特殊なナノ粒子を作製し、それに薬物を封入させることに成功し、かくして得られた薬物封入ナノ粒子を粘膜経由による投与を行った場合、ナノ粒子が粘膜から吸収されることにより薬物の高いバイオアベイラビリティを発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明者らは、先に、生理活性タンパク質またはペプチドのナノ粒子を発明し、特許出願を行っている（特願２００３−３１２０３１号）。また、脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物のナノ粒子を発明し、特許出願を行っている（特願２００３−４２８４６２号）。本発明者らは、さらに、表面にカルボキシル基を有するコアからなる粒子に薬物を封入することに成功し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、経粘膜吸収を目的とし、優れた吸収性およびバイオアベイラビリティを有する、薬物含有ナノ粒子を提供する。
より具体的には、本発明は、
（１）表面にカルボキシル基を有するコアからなり、コアの内部に２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上および薬物を封入した経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子、
（２）表面にカルボキシル基を有するコアが、生分解性ポリマーまたは排泄型ポリマーである前記（１）に記載のナノ粒子、
（３）生分解性ポリマーが、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）または乳酸重合体（ＰＬＡ）であり、排泄型ポリマーが、カルボキシル基が置換されたスチレンモノポリマー、ポリスチレン、メタクリル酸−スチレン共重合体またはジビニルベンゼン−スチレン共重合体である前記（２）に記載のナノ粒子、
（４）表面にカルボキシル基を有するコアが、カルボキシル基を有する脂質およびイオン性または非イオン性界面活性剤から形成される粒子である前記（１）に記載のナノ粒子、
（５）さらに２価の金属イオンを加えた前記（４）に記載のナノ粒子、
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のナノ粒子に２価または３価の金属イオンが結合された二次ナノ粒子、
（７）２価または３価の金属イオンがカルシウムイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである前記（６）記載の二次ナノ粒子、
（８）前記（６）に記載の二次ナノ粒子に１価〜３価の塩基イオンが結合された三次ナノ粒子、
（９）１価〜３価の塩基イオンが炭酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、シュウ酸イオン、乳酸イオンおよび尿酸イオンから選択されるものである前記（８）に記載の三次ナノ粒子、
（１０）粒子径が１５０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下、さらに好ましくは２０〜５０ｎｍである前記（１）〜（９）のいずれかに記載のナノ粒子、
（１１）前記（１）から（１０）のいずれかに記載のナノ粒子からなることを特徴とする経粘膜吸収用製剤、
（１２）製剤が経口投与剤、口腔内投与剤、鼻腔内投与剤および坐剤から選択されるものである前記（１１）に記載の経粘膜吸収用製剤、
（１３）封入される薬物が経口投与によって非吸収性または難吸収性の薬物である前記（１）に記載のナノ粒子、
（１４）非吸収性または難吸収性の薬物が蛋白質、ペプチド、多糖類、低分子糖類、極性の強い薬物および高度脂溶性の薬物から選択されるものである前記（１３）に記載のナノ粒子、
（１５）蛋白質またはペプチドが、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒求コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、抗ＴＮＦ−α抗体、エタネルセプト、インフリキシマブ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レプチン、ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、バソプレッシン、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、脳下垂体ペプチドホルモン、抗体、抗原および酵素から選択されるものである前記（１４）に記載のナノ粒子、
（１６）高度脂溶性の薬物が、エナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール，酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メソトレキセート、カルモフール、デカフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ビタミンＡ類（レチノール、レチノイン酸）、ジタミンＤ類、ビタミンＥ類およびビタミンＫ類から選択されるものである前記（１４）に記載のナノ粒子、
（１７）非吸収性または難吸収性の薬物が前記（１５）および（１６）に記載の薬物以外の抗炎症薬、抗微生物薬、抗癌薬、血管作動薬、脳循環・代謝改善薬、抗動脈硬化薬、免疫抑制薬および核酸関連物質から選択されるものである前記（１４）に記載のナノ粒子、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明が提供するナノ粒子は、そこに含有される薬物を粘膜経由により生体内吸収させるものであり、その吸収性、バイオアベイラビリティに優れる。含有される薬物が経口投与によって非吸収性、難吸収性なので、経口投与が不可能あるいは可能であっても十分に目的を達成できない薬物を経口投与製剤、口腔内投与製剤、経鼻投与製剤、坐剤などの経粘膜製剤形態にすることにより目的を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、表面にカルボキシル基を有するコアの内部に２価の金属塩、疎水性物質、糖質の１種または２種以上および薬物を封入したナノ粒子（一次ナノ粒子）、それに２価または３価の金属イオンが結合された二次ナノ粒子、さらに二次ナノ粒子に１価〜３価の塩基イオンが結合した三次ナノ粒子からなり、これら一次ナノ粒子、二次ナノ粒子及び三次ナノ粒子のそれぞれからなる経粘膜吸収用製剤からなる。ここでコアとはナノ粒子と同義を表す。
【００１５】
本発明の表面にカルボキシル基を有するコアの素材としては、生分解性ポリマーおよびカルボキシル基が置換された排泄型ポリマーであり、それ自体で粒子を形成しその内部に２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上および薬物を封入することができる空間を有し、かつ生体内で分解するポリマー、または生体内で分解しなくても体内から排泄されるポリマーであればいずれでもよい。また、あらかじめ粒子状を形成しているポリマーであっても良い。このようにして形成された生分解性ポリマーまたは排泄型ポリマー粒子は表面に複数個、好ましくは多数個のカルボキシル基を有している。
【００１６】
本発明における生分解性ポリマーとしては、例えばポリエステル［例えばα−ヒドロキシ酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ヒドロキシカプロン酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、２−ヒドロキシカプリル酸等）、α−ヒドロキシ酸の環状二量体類（例えば、グリコリド、ラクチド等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸）、ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸）等の単独重合体（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等）またはこれらの２種以上の共重合体（例えば、乳酸／グリコール酸共重合体，２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸共重合体等）、あるいはこれら単独重合体および／または共重合体の混合物（例、乳酸重合体と２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸共重合体との混合物等）］、ポリグリコシド（例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、酸化セルロース等）、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸，ポリ−Ｌ−アラニン，ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸等）、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、無水マレイン酸系共重合体（例、スチレン／マレイン酸共重合体等）等が用いられる。これらの中では、ポリエステル、ポリグリコシドが好ましい。さらに、脂肪族のポリエステルが特に好ましい。脂肪族ポリエステルの中でα−ヒドロキシモノカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）、α−ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸）、α−ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸）等のα−ヒドロキシカルボン酸類の１種以上から合成され、遊離の末端カルボキシル基を有する重合体、共重合体、またはこれらの混合物などが用いられる。
【００１７】
モノマーの結合様式としては、ランダム、ブロックあるいはグラフト結合のいずれでもよい。また、前記α−ヒドロキシモノカルボン酸類、α−ヒドロキシジカルボン酸類、α−ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−、Ｌ−、ＤＬ−体のいずれを用いてもよい。
【００１８】
本発明の生分解性ポリマーとしては、カルボキシル基の数を考慮した場合、例えば乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、または乳酸重合体（ＰＬＡ）が好ましく使用される。また、排泄型ポリマーとしては、体内へ取り入れたとき人体に害を与えず、体内から通常の排泄物と同様に排泄されるポリマーであればいずれでもよく、スチレンを主成分とするポリマーが好ましい。より具体的には、カルボキシル基が置換されたスチレンモノポリマー、ポリスチレン、メタクリル酸−スチレン共重合体、ジビニルベンゼン−スチレン共重合体などが好ましい。
【００１９】
コアの内部に封入される２価の金属塩は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩；酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩；塩化銅、硫化銅などの銅塩から選ばれる。なかでも亜鉛塩、特に塩化亜鉛が好ましい。疎水性物質は、脂質、非イオン性界面活性剤などであり、糖質としては、多糖、ムコ多糖、単糖などである。
【００２０】
本発明における、表面にカルボキシル基を有するもうひとつのコアとしては、カルボキシル基を有する脂質およびイオン性または非イオン性界面活性剤から形成される粒子である。この場合、使用する薬物が水溶性である場合はさらに２価の金属イオンを加えるとよい。ここで、加えられる２価の金属イオンは亜鉛イオン、カルシウムイオン、鉄イオンまたは銅イオンのいずれかであり、亜鉛イオンが好ましく使用できる。
【００２１】
さらに、カルボキシル基を有する脂質としては、炭素数６〜２４の脂肪酸であり、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸などの飽和脂肪酸から選択される。イオン性または非イオン性界面活性剤としては、グリセリン、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（Tween80）、ポリオキシエチレン（２０）モノラウレート（Tween20）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（Tween60）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（Tween40）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート（Tween85）、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油および脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体などの非イオン性界面活性剤、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリルスルホン酸塩、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムなどのイオン性界面活性剤が挙げられる。
【００２２】
これらの界面活性剤は１種または２種以上を選択して使用することができる。なかでも、グリセリン、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（Tween80）、脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体が好ましく、この場合の脂肪酸としてはオレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸；ラウリン酸、ミリスチン酸、パミルチン酸などの飽和脂肪酸を挙げることができる。
【００２３】
こうして得られた、表面にカルボキシル基を有するコアからなる粒子が一次ナノ粒子となる。この一次ナノ粒子を製造する段階で微細な粒子を含有する良好な乳化状態を得るために、乳化器として超音波発振器、フレンチプレッシャー、マントンゴーリンなどを使用し、圧力を強めることにより行うとよい。
【００２４】
得られた一次ナノ粒子に２価または３価の金属イオンを結合させることにより二次ナノ粒子が得られる。２価または３価の金属イオンとしてはカルシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンまたは銅イオンであり、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩；酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩；塩化銅、硫化銅などの銅塩から導かれる。なかでもカルシウム塩、特に塩化カルシウムが好ましい。金属塩の配合量は一概に限定し得ないが、有効成分となる薬物に対し重量比で３．０〜０．０１程度が好ましい。
【００２５】
また、この二次ナノ粒子に１価〜３価の塩基イオンを結合させることにより三次ナノ粒子が得られる。１価〜３価の塩基イオンとしては炭酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、シュウ酸イオン、乳酸イオンまたは尿酸イオンなどであり、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの炭酸水素塩：リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウムなどのリン酸水素塩；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどの炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウムなどのリン酸塩；シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウムなどのシュウ酸塩；乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウムなどの乳酸塩；尿酸ナトリウム、尿酸カリウム、尿酸カルシウムなどの尿酸塩などの塩基性塩から導かれ、なかでも炭酸塩、特に炭酸ナトリウムが好ましく使用される。塩基性塩の配合量は一概に限定し得ないが、前記金属塩に対してモル比で１．０〜０．０５であることが好ましい。
【００２６】
このようにして得られた一次ナノ粒子、二次ナノ粒子および三次ナノ粒子の粒子径は、粘膜からの吸収の点から１５０ｎｍ以下であれば良く、好ましくは１００ｎｍ以下、さらに好ましく２０〜５０ｎｍである。粒子径が２００ｎｍを超えると腸管から吸収しないことが判明した。
【００２７】
本発明の経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子は、それを投与した場合、５０％以上、好ましい薬物においては９０％以上の薬物が小腸から吸収する。
【００２８】
また、本発明の経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子は、脳血管関門を通過するので、脳循環・代謝改善薬などにも使用することが可能である。
【００２９】
以下に、本発明が提供するナノ粒子の製造方法について説明する。
先ず、生分解性ポリマーを有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液に薬物、および２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上の基をそのまま、または溶媒に溶解して加え撹拌することにより一次ナノ粒子を得る。排泄型ポリマーを使用する場合は、該ポリマーの製造工程において薬物を封入することにより、薬物封入ポリマー粒子とすることができる。
【００３０】
もうひとつのコアからなる一次ナノ粒子は、薬物と、カルボキシル基を有する脂質と界面活性剤とを有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を多量の水に分散させ、この溶液を１〜３０分間撹拌することにより得ることができる。一次ナノ粒子を製造する段階で微細な粒子を含有する良好な乳化状態を得るために、乳化器として超音波発振器、フレンチプレッシャー、マントンゴーリンなどを使用し、圧力を強めることにより行うとよい。
【００３１】
かくして作製された一次ナノ粒子を含有する溶液に、２価または３価の金属塩を加え、１〜３０分間撹拌して二次ナノ粒子を作製する。次いで、得られた二次粒子の溶液に１価〜３価の塩基性塩を加え、１分ないし２４時間撹拌することにより三次ナノ粒子を得ることができる。
【００３２】
かくして得られた一次ナノ粒子、二次ナノ粒子および三次ナノ粒子の溶液を、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等をすることにより溶媒を除去し、製剤用組成物として適宜製剤基剤、添加剤等を使用することにより、所望の経粘膜吸収用製剤を調製することができる。ナノ粒子を含有する溶液にマンニトール、トレハロースなどの糖類を加えると分散性が良くなる。
【００３３】
本発明の経粘膜吸収用製剤は、薬物を封入したナノ粒子が体内の粘膜部位に直接到達できる製剤形態であればいずれでもよく、経口投与剤、口腔内投与剤、鼻腔内投与剤および坐剤に大別される。
【００３４】
経口投与剤としては、通常の経口投与製剤、例えば錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤などであるが、小腸内で薬物が放出されるように工夫された剤型、例えば腸溶性錠剤、腸溶性顆粒剤、腸溶性カプセル剤、腸溶性細粒剤が好ましい。
【００３５】
また、口腔内投与剤および鼻腔内投与剤としては、口腔錠剤、口腔スプレー、点鼻剤、エアゾール、ゲル剤、クリーム剤、液剤、ローション剤などが挙げられ、さらに坐剤も経粘膜吸収用剤として有効に使用できる。
【００３６】
これらの製剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、上記の本発明の経粘膜吸収用製剤を製造するために、製剤学的に使用されている基剤、成分を適宜選択、組合せて使用することができる。なお、点鼻剤の場合、ヒドロキシプロピルセルロースなどの経鼻吸収促進剤を配合すると好ましい。
【００３７】
本発明のナノ粒子に封入する薬物としては、経口投与によって非吸収性であり、難吸収性の薬物を使用するのがよい。このような非吸収性、難吸収性とは、経口投与により不活性化したり、薬効を発揮し難くかったり、体内への吸収性が悪いことを意味し、蛋白質、ペプチド、多糖類、低分子糖類、極性の強い薬物、高度脂溶性の薬物などが該当する。
【００３８】
蛋白質またはペプチドとしては、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、抗ＴＮＦ−α抗体、エタネルセプト、インフリキシマブ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レプチン、ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、バソプレッシン、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、脳下垂体ペプチドホルモン、抗体、抗原および酵素などが挙げられる。
【００３９】
また、高度脂溶性の薬物としては、エナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール，酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メソトレキセート、カルモフール、デカフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ビタミンＡ類（レチノール、レチノイン酸）、ジタミンＤ類、ビタミンＥ類およびビタミンＫ類などが挙げられる。
【００４０】
非吸収性、難吸収性の薬物としては、上記に具体的に示した以外の薬物として、非吸収性または難吸収性の抗炎症薬、抗微生物薬、抗癌薬、血管作動薬、脳循環・代謝改善薬、抗動脈硬化薬、免疫抑制薬および核酸関連物質を挙げることができる。
【実施例】
【００４１】
本発明を以下の実施例、試験例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
実施例１：排泄型ポリマーナノ粒子を使用した経粘膜吸収試験
排泄型ポリマーであるポリスチレンのナノ粒子を用いて経粘膜吸収試験を行った。
【００４３】
（１）ナノ粒子の調製
（イ）蛍光色素ローダミンを封入したポリスチレンナノ粒子Fluoresbrite（Polysciences社製）を使用し、粒子表面をカルボキシル基で修飾していない未修飾粒子を０次ナノ粒子とし、粒子表面をカルボキシル基で修飾した粒子を一次ナノ粒子とした。
（ロ）一次ナノ粒子を水に分散した液５００μＬ（４ｍｇ／ｍＬ）に１Ｍ塩化カルシウム溶液２０μＬを加え３０分間撹拌することにより、二次ナノ粒子を作製した。
（ハ）上記で得た二次ナノ粒子溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム溶液４μＬを添加し、３０分間撹拌することにより、三次ナノ粒子を得た。
このようにして作製した０次ないし三次ナノ粒子を以下の実験に使用した。
【００４４】
（２）粒子経の影響
３日間、水とグルコースを投与して腸内を空にしたｄｄｙマウスを使用した。マウスの空腸に、粒子径が５０ｎｍ、１００ｎｍおよび２００ｎｍの二次ナノ粒子溶液（０．４ｍｇ）を投与した。投与１０分後および４０分後に投与部位の組織切片を作成し、蛍光顕微鏡により蛍光強度を観察した。結果を図１〜図３に示す。
図１は５０ｎｍのナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図１．１は投与１０分後の結果を、図１．２は投与４０分後の結果を示した。図２は１００ｎｍのナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図２．１は投与１０分後の結果を、図２．２は投与４０分後の結果を示した。また、図３は２００ｎｍのナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図３．１は投与１０分後の結果を、図３．２は投与４０分後の結果を示した。
図１．１および１．２から判明するように、５０ｎｍのナノ粒子では腸絨毛組織への高い吸収が認められた。一方、１００ｎｍは吸収される（図２．１および２．２）が、２００ｎｍの粒子では腸管からの吸収は見られなかった（図３．１および３．２）。
【００４５】
（３）ナノ粒子表面の修飾による影響
ｄｄｙマウスの空腸に、粒子径が５０ｎｍの０次ないし三次ナノ粒子溶液（０．４ｍｇ）をそれぞれ投与した。投与１０分後および２５分後に投与部位の組織切片を作成し、蛍光顕微鏡により蛍光強度を観察した。結果を図４〜図７に示す。
図４は０次ナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図４．１は投与１０分後の結果を、図４．２は投与２５分後の結果を示した。図５は一次ナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図５．１は投与１０分後の結果を、図５．２は投与２５分後の結果を示した。図６は二次ナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図６．１は投与１０分後の結果を、図６．２は投与２５分後の結果を示した。また、図７は三次ナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図７．１は投与１０分後の結果を、図７．２は投与４０分後の結果を示した。
図４．１および４．２から判明するように０次ナノ粒子はほとんど吸収されず、一次ナノ粒子（図５．１および５．２）は吸収されるもののその度合いは少なく、二次ナノ粒子（図６．１および６．２）および三次ナノ粒子（図７．１および７．２）は高い吸収が見られた。
【００４６】
（４）吸収速度
５０ｎｍの二次ナノ粒子を用いて、上記（３）と同様にｄｄｙマウスの空腸に投与し、組織切片の蛍光強度の時間変化を観察した。結果を図８に示す。
図８．１は投与１０分後、図８．２は投与２５分後、図８．３は投与４０分後および図８．４は投与７０分後の変化であるが、図から判明するように、蛍光強度が１０分後で最高となり、その後時間とともに強度が低下し、７０分後ではほぼ消失していた。すなわち、５０ｎｍの二次ナノ粒子は、投与後１０分後において腸管で最高になり、７０分後にはほぼ全て腸管から吸収されて行くことが判明した。
【００４７】
（５）小腸粘膜からの吸収の確認
上記（２）の実験例で使用した二次ナノ粒子の３倍量および５倍量を同様に投与したところ、肝臓および腎臓に強い蛍光が観察された。これは二次ナノ粒子が腸壁から吸収され体内に十分に移行していることが確認された。
それらの結果を図９〜図１１に示した。図９は二次ナノ粒子の１倍量投与における結果を示すものであり、図９．１は腸管での結果を、図９．２は肝での結果を、図９．３は腎での結果を示した。図１０は二次ナノ粒子の３倍量投与における結果を示すものであり、図１０．１は腸管での結果を、図１０．２は肝での結果を、図１０．３は腎での結果を示した。また、図１１は二次ナノ粒子の５倍量投与における結果を示すものであり、図１１．１は腸管での結果を、図１１．２は肝での結果を、図１１．３は腎での結果を示した。
【００４８】
（６）腸管からの吸収部位
上記（２）と同様に、５０ｎｍの二次ナノ粒子をマウスの空腸に投与し、実体蛍光顕微鏡で投与部位の下部を観察した。粒子を０．３ｍｇ投与した場合には、回腸部分に蛍光は全く認められず、ほぼ全ての粒子は上部小腸で吸収されていることが判明した。
それらの結果を、図１２および図１３に示した。図１２は投与６０分後および９０分後における投与部位下部の腸管の状態を示したものであり、図中矢印が注射部位である。また、図１３は投与部位から深さの異なる部位での状態を示したものであり、図１３．１は投与部位直下の１０分後における状態を、図１３．２は投与部位１ｃｍ下の２５分後における状態を、図１３．３は投与部位２．５ｃｍ下の４０分後における状態を、また、図１３．４は投与部位５ｃｍ下の７０分後における状態を示した。
【００４９】
一方、２００ｎｍの二次次ナノ粒子を同様に投与した場合では、下部小腸に強い蛍光が観察され、ほとんど吸収されていないことが判明した。
【００５０】
実施例２：ヒトインスリンの二次ナノ粒子
ヒトインスリン（シグマ社製）１ｍｇを０．０１Ｎ塩酸１００μＬに溶解し、塩化亜鉛溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加えて撹拌した。さらにミリスチン酸アセトン溶液（１４ｍｇ／ｍＬ）２７．７μＬおよび蛍光標識脂肪酸（Molecular Probes、12-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)dodecanoic acid）のアセトン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）８．３μＬを加え、撹拌した。２％Tween80溶液を１００μＬ加えた後撹拌を行い、一次ナノ粒子を得た。この溶液に脱イオン水を加えて５ｍＬとし、５Ｍ塩化カルシウム溶液１５μＬを加え、高圧ホモジナイザーで均一化処理を行い、二次ナノ粒子を作製した。粒子の大きさを動的光散乱粒子径測定装置（大塚電子 ELS-6000）で測定したところ、重量換算平均粒系は８５ｎｍであった。
【００５１】
この二次ナノ粒子を実施例１の（２）に記載の方法と同様に行って、インスリン含有の二次ナノ粒子をマウスの空腸に投与し、投与部位を蛍光顕微鏡で観察したところ、粒子が腸管へ吸収されていることが確認された。図１４参照。図１４において、腸管（グリーンに着色）に粒子が吸着していることが判明した。
【００５２】
実施例３：ヒトインスリンの三次ナノ粒子
実施例２で得られたインスリン封入の二次ナノ粒子を含む溶液に、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液２ｍＬを加え、１時間撹拌して三次ナノ粒子を作製した。粒子径は重量換算平均で９０ｎｍであった。
【００５３】
実施例４：乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を用いたインスリンナノ粒子
ヒトインスリン（シグマ社製）１ｍｇを０．０１Ｎ塩酸１００μＬに溶解し、この溶液に０．５Ｍ塩化第二鉄水溶液１６０μＬを加えて撹拌した。この溶液を遠心分離した後上清を捨て、ＰＬＧＡ２０ｍｇをアセトン５００μＬに溶解した溶液を加え、強く撹拌した。さらに０．５Ｍ塩化亜鉛水溶液２０μＬを加えて撹拌後、１時間放置した。この溶液を５ｍＬの精製水に撹拌させることにより１００ｎｍ以下の一次ナノ粒子を得た。
【００５４】
この一次ナノ粒子溶液に１Ｍ塩化カルシウム溶液２０μＬを加え３０分間撹拌することにより、二次ナノ粒子を作製した。次いで、この二次ナノ粒子溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム溶液４μＬを添加し３０分間撹拌することにより、三次ナノ粒子を得た。
【００５５】
実施例５：レチノール（ビタミンＡ）のナノ粒子
レチノール（ビタミンＡ）６ｍｇを溶解したエタノールまたはアセトン溶液１０μＬと大豆油１００ｍｇを混合した。この混合液を、グリセリン２２ｍｇ、レシチン１０ｍｇ、オレイン酸ナトリウム１０ｍｇおよびオレイン酸−ポリエチレングリコール共重合体１２ｍｇの水懸濁液中に添加し、総量で１０ｍＬとなるように調整した。この混合液を超音波発振器またはフレンチプレッシャーで乳化して、レチノール含有の一次ナノ粒子を作製した。次いで、オレイン酸ナトリウムに対し等モル量の塩化カルシウム水溶液を添加し、室温で１時間撹拌することにより二次ナノ粒子を作製した。次いで、塩化カルシウムに対し０．２〜２．０倍モル量の炭酸水素ナトリウムを添加し、３時間から一晩撹拌して三次ナノ粒子を作製した。
【００５６】
実施例６：軟膏剤／ハイドロゲル剤の製造
実施例３で得られたヒトインスリン封入の三次ナノ粒子、白色ワセリン、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびパラオキシ安息香酸メチルの適量をとり、全量が均質になるまで混和し、軟膏剤およびハイドロゲル剤とした。
【００５７】
実施例７：腸溶性錠剤の製造
実施例４で得られたヒトインスリン封入の三次ナノ粒子、乳糖、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、５％ヒドロキシプロピルセルロースおよびステアリン酸マグネシウムを適量とり、常法により練合、造粒、乾燥後打錠し、得られた錠剤に腸溶性コーティング皮膜を施し、腸溶性錠剤を製造した。
【００５８】
実施例８：点鼻剤の製造
実施例４で得られたヒトインスリン封入の三次ナノ粒子を注射用蒸留水と均一に懸濁し、そこにカルボキシメチルセルロースナトリウムおよびパラオキシ安息香酸メチルの適量を加え、全量が均質になるまで混和し点鼻剤とした。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、表面にカルボキシル基を有するコアに薬物を封入したナノ粒子であり、経口投与によって非吸収性、難吸収性な薬物を粘膜経由によって優れた吸収性およびバイオアベイラビリティをもたらすので、医療上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１．１】実施例１における５０ｎｍのナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図１．２】実施例１における５０ｎｍのナノ粒子を投与し、投与４０分後の結果を示す写真である。
【図２．１】実施例１における１００ｎｍのナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図２．２】実施例１における１００ｎｍのナノ粒子を投与し、投与４０分後の結果を示す写真である。
【図３．１】実施例１における２００ｎｍのナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図３．２】実施例１における２００ｎｍのナノ粒子を投与し、投与４０分後の結果を示す写真である。
【図４．１】実施例１における０次ナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図４．２】実施例１における０次ナノ粒子を投与し、投与２５分後の結果を示す写真である。
【図５．１】実施例１における一次ナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図５．２】実施例１における一次ナノ粒子を投与し、投与２５分後の結果を示す写真である。
【図６．１】実施例１における二次ナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図６．２】実施例１における二次ナノ粒子を投与し、投与２５分後の結果を示す写真である。
【図７．１】実施例１における三次ナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図７．２】実施例１における三次ナノ粒子を投与し、投与４０分後の結果を示す写真である。
【図８．１】実施例１における吸収速度を検討した結果を示し、投与１０分後における変化を示す写真である。
【図８．２】実施例１における吸収速度を検討した結果を示し、投与２５分後における変化を示す写真である。
【図８．３】実施例１における吸収速度を検討した結果を示し、投与４０分後における変化を示す写真である。
【図８．４】実施例１における吸収速度を検討した結果を示し、投与７０分後における変化を示す写真である。
【図９．１】実施例１における二次ナノ粒子の１倍量投与における腸管での結果を示す写真である。
【図９．２】実施例１における二次ナノ粒子の１倍量投与における肝での結果を示す写真である。
【図９．３】実施例１における二次ナノ粒子の１倍量投与における腎での結果を示す写真である。
【図１０．１】実施例１における二次ナノ粒子の３倍量投与における腸管での結果を示す写真である。
【図１０．２】実施例１における二次ナノ粒子の３倍量投与における肝での結果を示す写真である。
【図１０．３】実施例１における二次ナノ粒子の３倍量投与における腎での結果を示す写真である。
【図１１．１】実施例１における二次ナノ粒子の５倍量投与における腸管での結果を示す写真である。
【図１１．２】実施例１における二次ナノ粒子の５倍量投与における肝での結果を示す写真である。
【図１１．３】実施例１における二次ナノ粒子の５倍量投与における腎での結果を示す写真である。
【図１２】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与６０分後および９０分後における投与部位下部の腸管の状態を示す写真である。
【図１３．１】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与部位直下の１０分後における状態を示す写真である。
【図１３．２】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与部位１ｃｍ下の２５分後における状態を示す写真である。
【図１３．３】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与部位２．５ｃｍ下の４０分後における状態を示す写真である。
【図１３．４】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与部位５ｃｍ下の７０分後における状態を示す写真である。
【図１４】実施例２におけるインスリン含有の二次ナノ粒子をマウスの空腸に投与し、投与部位における蛍光顕微鏡の写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物を封入したナノ粒子に関し、詳しくは経粘膜吸収用の薬物封入ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物を経粘膜投与する目的は、経口投与の欠陥である、例えば、（１）消化管からの薬物の吸収が悪く、吸収がばらつき、肝で不活化される、（２）薬物が消化管の酵素によって不活化される、（３）急激な薬物の吸収で副作用が発現し、特に胃腸管や肝における副作用が強く出る、（４）薬物の徐放効果が得られない、などを改善するためである。
【０００３】
薬物の皮膚および粘膜適用に関しては、すでに多くの技術が実用化されている。それらの問題点として、局所作用を目的としたものでは皮膚・粘膜への吸収・分布が不十分であること、皮下・粘膜下組織への浸透が十分でないことなどが挙げられ、また全身への吸収を目的として用いられる場合には、全身への吸収が十分でない薬物が多い。
【０００４】
近年、経口投与では不活性化してしまい、注射投与を余儀なくされている生理活性蛋白質、ペプチドについて、経皮・経粘膜投与が試みられているが、吸収率の改善を確保するまでには到っていないのが現状である。
【０００５】
生理活性蛋白質の一つとして、比較的低分子で、しかも化学的に安定なインスリンを用いて皮膚、粘膜経由の投与法について種々の研究が行われているが、その吸収率は確実なデータでは数パーセント程度にすぎず、皮膚経由の投与ではほとんど吸収されないとされている（非特許文献１）。
【０００６】
また、生理活性物質をカルシウム含有水難溶性無機物粒子に封入した製剤（特許文献１）、生理活性蛋白質あるいはペプチドと亜鉛イオンとの沈殿物による水不溶性徐放性組成物（特許文献２）などが提案されている。しかしながら、これらの製剤は、薬物の吸収性、あるいは局所刺激等の点で十分なものとは言い難く、未だ実用化に至ったものはない。また、本発明が目的とする、表面にカルボキシル基を有するコアからなる薬物を封入した経粘膜吸収用ナノ粒子は知られていない。
【０００７】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ ０２／０９６３９６号公報
【特許文献２】特開２００３−０８１８６５号公報
【非特許文献１】DRUG DELIVERY SYSTEM 今日のＤＤＳ 薬物送達システム（医薬ジャーナル）325〜331頁、1999年
【非特許文献２】臨床薬理（Jpn. J. Clin. Pharmacol. Ther.）:26(1), p.127〜128(1995)
【非特許文献３】Yakugaku Zasshi:121(12), p.929〜948 (2001)
【非特許文献４】J. Controlled Release:79, p.81〜91(2002)
【０００８】
上述したように、経口投与により不活性化する、あるいは吸収性が悪い、副作用が発現するなどの欠陥を有する非吸収性または難吸収性の薬物を、経粘膜投与に適用することができ、かつ薬物の吸収性に優れ、十分な活性を発揮し、副作用を最小限にする薬剤の開発が望まれている。特に、近年進歩が著しい抗原や抗体を含む蛋白医薬品や薬効を有する核酸関連物質の経口投与が可能になることは、医療の著しい飛躍に繋がる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって本発明は、経口投与によって薬効を発揮できないか、または吸収性、副作用等で欠点を有する薬物、さらには注射剤、皮膚外用剤として使用されているが、吸収性、副作用などの点で改善を要する薬物について、粘膜経由の投与方法により局所も含め生体内への吸収性に優れ、高いバイオアベイラビリティを発揮し得る技術を提供することを課題とする。
【００１０】
かかる課題を解決するべく、本発明者らは鋭意検討した結果、ナノテクノロジーを応用し、赤血球よりも遥かに小さい特殊なナノ粒子を作製し、それに薬物を封入させることに成功し、かくして得られた薬物封入ナノ粒子を粘膜経由による投与を行った場合、ナノ粒子が粘膜から吸収されることにより薬物の高いバイオアベイラビリティを発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明者らは、先に、生理活性タンパク質またはペプチドのナノ粒子を発明し、特許出願を行っている（特願２００３−３１２０３１号）。また、脂溶性薬物または脂溶性化された水溶性薬物のナノ粒子を発明し、特許出願を行っている（特願２００３−４２８４６２号）。本発明者らは、さらに、表面にカルボキシル基を有するコアからなる粒子に薬物を封入することに成功し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、経粘膜吸収を目的とし、優れた吸収性およびバイオアベイラビリティを有する、薬物含有ナノ粒子を提供する。
より具体的には、本発明は、
（１）表面にカルボキシル基を有するコアからなり、コアの内部に２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上および薬物を封入した経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子、
（２）表面にカルボキシル基を有するコアが、生分解性ポリマーまたは排泄型ポリマーである前記（１）に記載のナノ粒子、
（３）生分解性ポリマーが、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）または乳酸重合体（ＰＬＡ）であり、排泄型ポリマーが、カルボキシル基が置換されたスチレンモノポリマー、ポリスチレン、メタクリル酸−スチレン共重合体またはジビニルベンゼン−スチレン共重合体である前記（２）に記載のナノ粒子、
（４）表面にカルボキシル基を有するコアが、カルボキシル基を有する脂質およびイオン性または非イオン性界面活性剤から形成される粒子である前記（１）に記載のナノ粒子、
（５）さらに２価の金属イオンを加えた前記（４）に記載のナノ粒子、
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のナノ粒子に２価または３価の金属イオンが結合された二次ナノ粒子、
（７）２価または３価の金属イオンがカルシウムイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである前記（６）記載の二次ナノ粒子、
（８）前記（６）に記載の二次ナノ粒子に１価〜３価の塩基イオンが結合された三次ナノ粒子、
（９）１価〜３価の塩基イオンが炭酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、シュウ酸イオン、乳酸イオンおよび尿酸イオンから選択されるものである前記（８）に記載の三次ナノ粒子、
（１０）粒子径が１５０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下、さらに好ましくは２０〜５０ｎｍである前記（１）〜（９）のいずれかに記載のナノ粒子、
（１１）前記（１）から（１０）のいずれかに記載のナノ粒子からなることを特徴とする経粘膜吸収用製剤、
（１２）製剤が経口投与剤、口腔内投与剤、鼻腔内投与剤および坐剤から選択されるものである前記（１１）に記載の経粘膜吸収用製剤、
（１３）封入される薬物が経口投与によって非吸収性または難吸収性の薬物である前記（１）に記載のナノ粒子、
（１４）非吸収性または難吸収性の薬物が蛋白質、ペプチド、多糖類、低分子糖類、極性の強い薬物および高度脂溶性の薬物から選択されるものである前記（１３）に記載のナノ粒子、
（１５）蛋白質またはペプチドが、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒求コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、抗ＴＮＦ−α抗体、エタネルセプト、インフリキシマブ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レプチン、ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、バソプレッシン、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、脳下垂体ペプチドホルモン、抗体、抗原および酵素から選択されるものである前記（１４）に記載のナノ粒子、
（１６）高度脂溶性の薬物が、エナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール，酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メソトレキセート、カルモフール、デカフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ビタミンＡ類（レチノール、レチノイン酸）、ジタミンＤ類、ビタミンＥ類およびビタミンＫ類から選択されるものである前記（１４）に記載のナノ粒子、
（１７）非吸収性または難吸収性の薬物が前記（１５）および（１６）に記載の薬物以外の抗炎症薬、抗微生物薬、抗癌薬、血管作動薬、脳循環・代謝改善薬、抗動脈硬化薬、免疫抑制薬および核酸関連物質から選択されるものである前記（１４）に記載のナノ粒子、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明が提供するナノ粒子は、そこに含有される薬物を粘膜経由により生体内吸収させるものであり、その吸収性、バイオアベイラビリティに優れる。含有される薬物が経口投与によって非吸収性、難吸収性なので、経口投与が不可能あるいは可能であっても十分に目的を達成できない薬物を経口投与製剤、口腔内投与製剤、経鼻投与製剤、坐剤などの経粘膜製剤形態にすることにより目的を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、表面にカルボキシル基を有するコアの内部に２価の金属塩、疎水性物質、糖質の１種または２種以上および薬物を封入したナノ粒子（一次ナノ粒子）、それに２価または３価の金属イオンが結合された二次ナノ粒子、さらに二次ナノ粒子に１価〜３価の塩基イオンが結合した三次ナノ粒子からなり、これら一次ナノ粒子、二次ナノ粒子及び三次ナノ粒子のそれぞれからなる経粘膜吸収用製剤からなる。ここでコアとはナノ粒子と同義を表す。
【００１５】
本発明の表面にカルボキシル基を有するコアの素材としては、生分解性ポリマーおよびカルボキシル基が置換された排泄型ポリマーであり、それ自体で粒子を形成しその内部に２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上および薬物を封入することができる空間を有し、かつ生体内で分解するポリマー、または生体内で分解しなくても体内から排泄されるポリマーであればいずれでもよい。また、あらかじめ粒子状を形成しているポリマーであっても良い。このようにして形成された生分解性ポリマーまたは排泄型ポリマー粒子は表面に複数個、好ましくは多数個のカルボキシル基を有している。
【００１６】
本発明における生分解性ポリマーとしては、例えばポリエステル［例えばα−ヒドロキシ酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ヒドロキシカプロン酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、２−ヒドロキシカプリル酸等）、α−ヒドロキシ酸の環状二量体類（例えば、グリコリド、ラクチド等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸）、ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸）等の単独重合体（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等）またはこれらの２種以上の共重合体（例えば、乳酸／グリコール酸共重合体，２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸共重合体等）、あるいはこれら単独重合体および／または共重合体の混合物（例、乳酸重合体と２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸共重合体との混合物等）］、ポリグリコシド（例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、酸化セルロース等）、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸，ポリ−Ｌ−アラニン，ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸等）、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、無水マレイン酸系共重合体（例、スチレン／マレイン酸共重合体等）等が用いられる。これらの中では、ポリエステル、ポリグリコシドが好ましい。さらに、脂肪族のポリエステルが特に好ましい。脂肪族ポリエステルの中でα−ヒドロキシモノカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）、α−ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸）、α−ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸）等のα−ヒドロキシカルボン酸類の１種以上から合成され、遊離の末端カルボキシル基を有する重合体、共重合体、またはこれらの混合物などが用いられる。
【００１７】
モノマーの結合様式としては、ランダム、ブロックあるいはグラフト結合のいずれでもよい。また、前記α−ヒドロキシモノカルボン酸類、α−ヒドロキシジカルボン酸類、α−ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−、Ｌ−、ＤＬ−体のいずれを用いてもよい。
【００１８】
本発明の生分解性ポリマーとしては、カルボキシル基の数を考慮した場合、例えば乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、または乳酸重合体（ＰＬＡ）が好ましく使用される。また、排泄型ポリマーとしては、体内へ取り入れたとき人体に害を与えず、体内から通常の排泄物と同様に排泄されるポリマーであればいずれでもよく、スチレンを主成分とするポリマーが好ましい。より具体的には、カルボキシル基が置換されたスチレンモノポリマー、ポリスチレン、メタクリル酸−スチレン共重合体、ジビニルベンゼン−スチレン共重合体などが好ましい。
【００１９】
コアの内部に封入される２価の金属塩は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩；酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩；塩化銅、硫化銅などの銅塩から選ばれる。なかでも亜鉛塩、特に塩化亜鉛が好ましい。疎水性物質は、脂質、非イオン性界面活性剤などであり、糖質としては、多糖、ムコ多糖、単糖などである。
【００２０】
本発明における、表面にカルボキシル基を有するもうひとつのコアとしては、カルボキシル基を有する脂質およびイオン性または非イオン性界面活性剤から形成される粒子である。この場合、使用する薬物が水溶性である場合はさらに２価の金属イオンを加えるとよい。ここで、加えられる２価の金属イオンは亜鉛イオン、カルシウムイオン、鉄イオンまたは銅イオンのいずれかであり、亜鉛イオンが好ましく使用できる。
【００２１】
さらに、カルボキシル基を有する脂質としては、炭素数６〜２４の脂肪酸であり、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸などの飽和脂肪酸から選択される。イオン性または非イオン性界面活性剤としては、グリセリン、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（Tween80）、ポリオキシエチレン（２０）モノラウレート（Tween20）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（Tween60）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（Tween40）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート（Tween85）、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油および脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体などの非イオン性界面活性剤、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリルスルホン酸塩、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムなどのイオン性界面活性剤が挙げられる。
【００２２】
これらの界面活性剤は１種または２種以上を選択して使用することができる。なかでも、グリセリン、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（Tween80）、脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体が好ましく、この場合の脂肪酸としてはオレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸；ラウリン酸、ミリスチン酸、パミルチン酸などの飽和脂肪酸を挙げることができる。
【００２３】
こうして得られた、表面にカルボキシル基を有するコアからなる粒子が一次ナノ粒子となる。この一次ナノ粒子を製造する段階で微細な粒子を含有する良好な乳化状態を得るために、乳化器として超音波発振器、フレンチプレッシャー、マントンゴーリンなどを使用し、圧力を強めることにより行うとよい。
【００２４】
得られた一次ナノ粒子に２価または３価の金属イオンを結合させることにより二次ナノ粒子が得られる。２価または３価の金属イオンとしてはカルシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンまたは銅イオンであり、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩；酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩；塩化銅、硫化銅などの銅塩から導かれる。なかでもカルシウム塩、特に塩化カルシウムが好ましい。金属塩の配合量は一概に限定し得ないが、有効成分となる薬物に対し重量比で３．０〜０．０１程度が好ましい。
【００２５】
また、この二次ナノ粒子に１価〜３価の塩基イオンを結合させることにより三次ナノ粒子が得られる。１価〜３価の塩基イオンとしては炭酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、シュウ酸イオン、乳酸イオンまたは尿酸イオンなどであり、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの炭酸水素塩：リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウムなどのリン酸水素塩；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどの炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウムなどのリン酸塩；シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウムなどのシュウ酸塩；乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウムなどの乳酸塩；尿酸ナトリウム、尿酸カリウム、尿酸カルシウムなどの尿酸塩などの塩基性塩から導かれ、なかでも炭酸塩、特に炭酸ナトリウムが好ましく使用される。塩基性塩の配合量は一概に限定し得ないが、前記金属塩に対してモル比で１．０〜０．０５であることが好ましい。
【００２６】
このようにして得られた一次ナノ粒子、二次ナノ粒子および三次ナノ粒子の粒子径は、粘膜からの吸収の点から１５０ｎｍ以下であれば良く、好ましくは１００ｎｍ以下、さらに好ましく２０〜５０ｎｍである。粒子径が２００ｎｍを超えると腸管から吸収しないことが判明した。
【００２７】
本発明の経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子は、それを投与した場合、５０％以上、好ましい薬物においては９０％以上の薬物が小腸から吸収する。
【００２８】
また、本発明の経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子は、脳血管関門を通過するので、脳循環・代謝改善薬などにも使用することが可能である。
【００２９】
以下に、本発明が提供するナノ粒子の製造方法について説明する。
先ず、生分解性ポリマーを有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液に薬物、および２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上の基をそのまま、または溶媒に溶解して加え撹拌することにより一次ナノ粒子を得る。排泄型ポリマーを使用する場合は、該ポリマーの製造工程において薬物を封入することにより、薬物封入ポリマー粒子とすることができる。
【００３０】
もうひとつのコアからなる一次ナノ粒子は、薬物と、カルボキシル基を有する脂質と界面活性剤とを有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を多量の水に分散させ、この溶液を１〜３０分間撹拌することにより得ることができる。一次ナノ粒子を製造する段階で微細な粒子を含有する良好な乳化状態を得るために、乳化器として超音波発振器、フレンチプレッシャー、マントンゴーリンなどを使用し、圧力を強めることにより行うとよい。
【００３１】
かくして作製された一次ナノ粒子を含有する溶液に、２価または３価の金属塩を加え、１〜３０分間撹拌して二次ナノ粒子を作製する。次いで、得られた二次粒子の溶液に１価〜３価の塩基性塩を加え、１分ないし２４時間撹拌することにより三次ナノ粒子を得ることができる。
【００３２】
かくして得られた一次ナノ粒子、二次ナノ粒子および三次ナノ粒子の溶液を、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等をすることにより溶媒を除去し、製剤用組成物として適宜製剤基剤、添加剤等を使用することにより、所望の経粘膜吸収用製剤を調製することができる。ナノ粒子を含有する溶液にマンニトール、トレハロースなどの糖類を加えると分散性が良くなる。
【００３３】
本発明の経粘膜吸収用製剤は、薬物を封入したナノ粒子が体内の粘膜部位に直接到達できる製剤形態であればいずれでもよく、経口投与剤、口腔内投与剤、鼻腔内投与剤および坐剤に大別される。
【００３４】
経口投与剤としては、通常の経口投与製剤、例えば錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤などであるが、小腸内で薬物が放出されるように工夫された剤型、例えば腸溶性錠剤、腸溶性顆粒剤、腸溶性カプセル剤、腸溶性細粒剤が好ましい。
【００３５】
また、口腔内投与剤および鼻腔内投与剤としては、口腔錠剤、口腔スプレー、点鼻剤、エアゾール、ゲル剤、クリーム剤、液剤、ローション剤などが挙げられ、さらに坐剤も経粘膜吸収用剤として有効に使用できる。
【００３６】
これらの製剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、上記の本発明の経粘膜吸収用製剤を製造するために、製剤学的に使用されている基剤、成分を適宜選択、組合せて使用することができる。なお、点鼻剤の場合、ヒドロキシプロピルセルロースなどの経鼻吸収促進剤を配合すると好ましい。
【００３７】
本発明のナノ粒子に封入する薬物としては、経口投与によって非吸収性であり、難吸収性の薬物を使用するのがよい。このような非吸収性、難吸収性とは、経口投与により不活性化したり、薬効を発揮し難くかったり、体内への吸収性が悪いことを意味し、蛋白質、ペプチド、多糖類、低分子糖類、極性の強い薬物、高度脂溶性の薬物などが該当する。
【００３８】
蛋白質またはペプチドとしては、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、抗ＴＮＦ−α抗体、エタネルセプト、インフリキシマブ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レプチン、ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、バソプレッシン、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、脳下垂体ペプチドホルモン、抗体、抗原および酵素などが挙げられる。
【００３９】
また、高度脂溶性の薬物としては、エナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール，酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メソトレキセート、カルモフール、デカフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ビタミンＡ類（レチノール、レチノイン酸）、ジタミンＤ類、ビタミンＥ類およびビタミンＫ類などが挙げられる。
【００４０】
非吸収性、難吸収性の薬物としては、上記に具体的に示した以外の薬物として、非吸収性または難吸収性の抗炎症薬、抗微生物薬、抗癌薬、血管作動薬、脳循環・代謝改善薬、抗動脈硬化薬、免疫抑制薬および核酸関連物質を挙げることができる。
【実施例】
【００４１】
本発明を以下の実施例、試験例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
実施例１：排泄型ポリマーナノ粒子を使用した経粘膜吸収試験
排泄型ポリマーであるポリスチレンのナノ粒子を用いて経粘膜吸収試験を行った。
【００４３】
（１）ナノ粒子の調製
（イ）蛍光色素ローダミンを封入したポリスチレンナノ粒子Fluoresbrite（Polysciences社製）を使用し、粒子表面をカルボキシル基で修飾していない未修飾粒子を０次ナノ粒子とし、粒子表面をカルボキシル基で修飾した粒子を一次ナノ粒子とした。
（ロ）一次ナノ粒子を水に分散した液５００μＬ（４ｍｇ／ｍＬ）に１Ｍ塩化カルシウム溶液２０μＬを加え３０分間撹拌することにより、二次ナノ粒子を作製した。
（ハ）上記で得た二次ナノ粒子溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム溶液４μＬを添加し、３０分間撹拌することにより、三次ナノ粒子を得た。
このようにして作製した０次ないし三次ナノ粒子を以下の実験に使用した。
【００４４】
（２）粒子経の影響
３日間、水とグルコースを投与して腸内を空にしたｄｄｙマウスを使用した。マウスの空腸に、粒子径が５０ｎｍ、１００ｎｍおよび２００ｎｍの二次ナノ粒子溶液（０．４ｍｇ）を投与した。投与１０分後および４０分後に投与部位の組織切片を作成し、蛍光顕微鏡により蛍光強度を観察した。結果を図１〜図３に示す。
図１は５０ｎｍのナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図１．１は投与１０分後の結果を、図１．２は投与４０分後の結果を示した。図２は１００ｎｍのナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図２．１は投与１０分後の結果を、図２．２は投与４０分後の結果を示した。また、図３は２００ｎｍのナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図３．１は投与１０分後の結果を、図３．２は投与４０分後の結果を示した。
図１．１および１．２から判明するように、５０ｎｍのナノ粒子では腸絨毛組織への高い吸収が認められた。一方、１００ｎｍは吸収される（図２．１および２．２）が、２００ｎｍの粒子では腸管からの吸収は見られなかった（図３．１および３．２）。
【００４５】
（３）ナノ粒子表面の修飾による影響
ｄｄｙマウスの空腸に、粒子径が５０ｎｍの０次ないし三次ナノ粒子溶液（０．４ｍｇ）をそれぞれ投与した。投与１０分後および２５分後に投与部位の組織切片を作成し、蛍光顕微鏡により蛍光強度を観察した。結果を図４〜図７に示す。
図４は０次ナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図４．１は投与１０分後の結果を、図４．２は投与２５分後の結果を示した。図５は一次ナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図５．１は投与１０分後の結果を、図５．２は投与２５分後の結果を示した。図６は二次ナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図６．１は投与１０分後の結果を、図６．２は投与２５分後の結果を示した。また、図７は三次ナノ粒子を投与した場合の結果を示すものであり、図７．１は投与１０分後の結果を、図７．２は投与４０分後の結果を示した。
図４．１および４．２から判明するように０次ナノ粒子はほとんど吸収されず、一次ナノ粒子（図５．１および５．２）は吸収されるもののその度合いは少なく、二次ナノ粒子（図６．１および６．２）および三次ナノ粒子（図７．１および７．２）は高い吸収が見られた。
【００４６】
（４）吸収速度
５０ｎｍの二次ナノ粒子を用いて、上記（３）と同様にｄｄｙマウスの空腸に投与し、組織切片の蛍光強度の時間変化を観察した。結果を図８に示す。
図８．１は投与１０分後、図８．２は投与２５分後、図８．３は投与４０分後および図８．４は投与７０分後の変化であるが、図から判明するように、蛍光強度が１０分後で最高となり、その後時間とともに強度が低下し、７０分後ではほぼ消失していた。すなわち、５０ｎｍの二次ナノ粒子は、投与後１０分後において腸管で最高になり、７０分後にはほぼ全て腸管から吸収されて行くことが判明した。
【００４７】
（５）小腸粘膜からの吸収の確認
上記（２）の実験例で使用した二次ナノ粒子の３倍量および５倍量を同様に投与したところ、肝臓および腎臓に強い蛍光が観察された。これは二次ナノ粒子が腸壁から吸収され体内に十分に移行していることが確認された。
それらの結果を図９〜図１１に示した。図９は二次ナノ粒子の１倍量投与における結果を示すものであり、図９．１は腸管での結果を、図９．２は肝での結果を、図９．３は腎での結果を示した。図１０は二次ナノ粒子の３倍量投与における結果を示すものであり、図１０．１は腸管での結果を、図１０．２は肝での結果を、図１０．３は腎での結果を示した。また、図１１は二次ナノ粒子の５倍量投与における結果を示すものであり、図１１．１は腸管での結果を、図１１．２は肝での結果を、図１１．３は腎での結果を示した。
【００４８】
（６）腸管からの吸収部位
上記（２）と同様に、５０ｎｍの二次ナノ粒子をマウスの空腸に投与し、実体蛍光顕微鏡で投与部位の下部を観察した。粒子を０．３ｍｇ投与した場合には、回腸部分に蛍光は全く認められず、ほぼ全ての粒子は上部小腸で吸収されていることが判明した。
それらの結果を、図１２および図１３に示した。図１２は投与６０分後および９０分後における投与部位下部の腸管の状態を示したものであり、図中矢印が注射部位である。また、図１３は投与部位から深さの異なる部位での状態を示したものであり、図１３．１は投与部位直下の１０分後における状態を、図１３．２は投与部位１ｃｍ下の２５分後における状態を、図１３．３は投与部位２．５ｃｍ下の４０分後における状態を、また、図１３．４は投与部位５ｃｍ下の７０分後における状態を示した。
【００４９】
一方、２００ｎｍの二次次ナノ粒子を同様に投与した場合では、下部小腸に強い蛍光が観察され、ほとんど吸収されていないことが判明した。
【００５０】
実施例２：ヒトインスリンの二次ナノ粒子
ヒトインスリン（シグマ社製）１ｍｇを０．０１Ｎ塩酸１００μＬに溶解し、塩化亜鉛溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加えて撹拌した。さらにミリスチン酸アセトン溶液（１４ｍｇ／ｍＬ）２７．７μＬおよび蛍光標識脂肪酸（Molecular Probes、12-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)dodecanoic acid）のアセトン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）８．３μＬを加え、撹拌した。２％Tween80溶液を１００μＬ加えた後撹拌を行い、一次ナノ粒子を得た。この溶液に脱イオン水を加えて５ｍＬとし、５Ｍ塩化カルシウム溶液１５μＬを加え、高圧ホモジナイザーで均一化処理を行い、二次ナノ粒子を作製した。粒子の大きさを動的光散乱粒子径測定装置（大塚電子 ELS-6000）で測定したところ、重量換算平均粒系は８５ｎｍであった。
【００５１】
この二次ナノ粒子を実施例１の（２）に記載の方法と同様に行って、インスリン含有の二次ナノ粒子をマウスの空腸に投与し、投与部位を蛍光顕微鏡で観察したところ、粒子が腸管へ吸収されていることが確認された。図１４参照。図１４において、腸管（グリーンに着色）に粒子が吸着していることが判明した。
【００５２】
実施例３：ヒトインスリンの三次ナノ粒子
実施例２で得られたインスリン封入の二次ナノ粒子を含む溶液に、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液２ｍＬを加え、１時間撹拌して三次ナノ粒子を作製した。粒子径は重量換算平均で９０ｎｍであった。
【００５３】
実施例４：乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を用いたインスリンナノ粒子
ヒトインスリン（シグマ社製）１ｍｇを０．０１Ｎ塩酸１００μＬに溶解し、この溶液に０．５Ｍ塩化第二鉄水溶液１６０μＬを加えて撹拌した。この溶液を遠心分離した後上清を捨て、ＰＬＧＡ２０ｍｇをアセトン５００μＬに溶解した溶液を加え、強く撹拌した。さらに０．５Ｍ塩化亜鉛水溶液２０μＬを加えて撹拌後、１時間放置した。この溶液を５ｍＬの精製水に撹拌させることにより１００ｎｍ以下の一次ナノ粒子を得た。
【００５４】
この一次ナノ粒子溶液に１Ｍ塩化カルシウム溶液２０μＬを加え３０分間撹拌することにより、二次ナノ粒子を作製した。次いで、この二次ナノ粒子溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム溶液４μＬを添加し３０分間撹拌することにより、三次ナノ粒子を得た。
【００５５】
実施例５：レチノール（ビタミンＡ）のナノ粒子
レチノール（ビタミンＡ）６ｍｇを溶解したエタノールまたはアセトン溶液１０μＬと大豆油１００ｍｇを混合した。この混合液を、グリセリン２２ｍｇ、レシチン１０ｍｇ、オレイン酸ナトリウム１０ｍｇおよびオレイン酸−ポリエチレングリコール共重合体１２ｍｇの水懸濁液中に添加し、総量で１０ｍＬとなるように調整した。この混合液を超音波発振器またはフレンチプレッシャーで乳化して、レチノール含有の一次ナノ粒子を作製した。次いで、オレイン酸ナトリウムに対し等モル量の塩化カルシウム水溶液を添加し、室温で１時間撹拌することにより二次ナノ粒子を作製した。次いで、塩化カルシウムに対し０．２〜２．０倍モル量の炭酸水素ナトリウムを添加し、３時間から一晩撹拌して三次ナノ粒子を作製した。
【００５６】
実施例６：軟膏剤／ハイドロゲル剤の製造
実施例３で得られたヒトインスリン封入の三次ナノ粒子、白色ワセリン、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびパラオキシ安息香酸メチルの適量をとり、全量が均質になるまで混和し、軟膏剤およびハイドロゲル剤とした。
【００５７】
実施例７：腸溶性錠剤の製造
実施例４で得られたヒトインスリン封入の三次ナノ粒子、乳糖、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、５％ヒドロキシプロピルセルロースおよびステアリン酸マグネシウムを適量とり、常法により練合、造粒、乾燥後打錠し、得られた錠剤に腸溶性コーティング皮膜を施し、腸溶性錠剤を製造した。
【００５８】
実施例８：点鼻剤の製造
実施例４で得られたヒトインスリン封入の三次ナノ粒子を注射用蒸留水と均一に懸濁し、そこにカルボキシメチルセルロースナトリウムおよびパラオキシ安息香酸メチルの適量を加え、全量が均質になるまで混和し点鼻剤とした。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、表面にカルボキシル基を有するコアに薬物を封入したナノ粒子であり、経口投与によって非吸収性、難吸収性な薬物を粘膜経由によって優れた吸収性およびバイオアベイラビリティをもたらすので、医療上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１．１】実施例１における５０ｎｍのナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図１．２】実施例１における５０ｎｍのナノ粒子を投与し、投与４０分後の結果を示す写真である。
【図２．１】実施例１における１００ｎｍのナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図２．２】実施例１における１００ｎｍのナノ粒子を投与し、投与４０分後の結果を示す写真である。
【図３．１】実施例１における２００ｎｍのナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図３．２】実施例１における２００ｎｍのナノ粒子を投与し、投与４０分後の結果を示す写真である。
【図４．１】実施例１における０次ナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図４．２】実施例１における０次ナノ粒子を投与し、投与２５分後の結果を示す写真である。
【図５．１】実施例１における一次ナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図５．２】実施例１における一次ナノ粒子を投与し、投与２５分後の結果を示す写真である。
【図６．１】実施例１における二次ナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図６．２】実施例１における二次ナノ粒子を投与し、投与２５分後の結果を示す写真である。
【図７．１】実施例１における三次ナノ粒子を投与し、投与１０分後の結果を示す写真である。
【図７．２】実施例１における三次ナノ粒子を投与し、投与４０分後の結果を示す写真である。
【図８．１】実施例１における吸収速度を検討した結果を示し、投与１０分後における変化を示す写真である。
【図８．２】実施例１における吸収速度を検討した結果を示し、投与２５分後における変化を示す写真である。
【図８．３】実施例１における吸収速度を検討した結果を示し、投与４０分後における変化を示す写真である。
【図８．４】実施例１における吸収速度を検討した結果を示し、投与７０分後における変化を示す写真である。
【図９．１】実施例１における二次ナノ粒子の１倍量投与における腸管での結果を示す写真である。
【図９．２】実施例１における二次ナノ粒子の１倍量投与における肝での結果を示す写真である。
【図９．３】実施例１における二次ナノ粒子の１倍量投与における腎での結果を示す写真である。
【図１０．１】実施例１における二次ナノ粒子の３倍量投与における腸管での結果を示す写真である。
【図１０．２】実施例１における二次ナノ粒子の３倍量投与における肝での結果を示す写真である。
【図１０．３】実施例１における二次ナノ粒子の３倍量投与における腎での結果を示す写真である。
【図１１．１】実施例１における二次ナノ粒子の５倍量投与における腸管での結果を示す写真である。
【図１１．２】実施例１における二次ナノ粒子の５倍量投与における肝での結果を示す写真である。
【図１１．３】実施例１における二次ナノ粒子の５倍量投与における腎での結果を示す写真である。
【図１２】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与６０分後および９０分後における投与部位下部の腸管の状態を示す写真である。
【図１３．１】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与部位直下の１０分後における状態を示す写真である。
【図１３．２】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与部位１ｃｍ下の２５分後における状態を示す写真である。
【図１３．３】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与部位２．５ｃｍ下の４０分後における状態を示す写真である。
【図１３．４】実施例１における腸管からの吸収部位を検討した結果を示し、投与部位５ｃｍ下の７０分後における状態を示す写真である。
【図１４】実施例２におけるインスリン含有の二次ナノ粒子をマウスの空腸に投与し、投与部位における蛍光顕微鏡の写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にカルボキシル基を有するコアからなり、コアの内部に２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上および薬物を封入した経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子。
【請求項２】
表面にカルボキシル基を有するコアが、生分解性ポリマーまたは排泄型ポリマーである請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
生分解性ポリマーが、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）または乳酸重合体（ＰＬＡ）であり、排泄型ポリマーが、カルボキシル基が置換されたスチレンモノポリマー、ポリスチレン、メタクリル酸−スチレン共重合体またはジビニルベンゼン−スチレン共重合体である請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
表面にカルボキシル基を有するコアが、カルボキシル基を有する脂質およびイオン性または非イオン性界面活性剤から形成される粒子である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
さらに２価の金属イオンを加えた請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のナノ粒子に２価または３価の金属イオンが結合された二次ナノ粒子。
【請求項７】
２価または３価の金属イオンが、カルシウムイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである請求項６記載の二次ナノ粒子。
【請求項８】
請求項６に記載の二次ナノ粒子に１価〜３価の塩基イオンが結合された三次ナノ粒子。
【請求項９】
１価〜３価の塩基イオンが、炭酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、シュウ酸イオン、乳酸イオンおよび尿酸イオンから選択されるものである請求項８に記載の三次ナノ粒子。
【請求項１０】
粒子径が１５０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下、さらに好ましくは２０〜５０ｎｍである請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のナノ粒子からなることを特徴とする経粘膜吸収用製剤。
【請求項１２】
製剤が経口投与剤、口腔内投与剤、鼻腔内投与剤および坐剤から選択されるものである請求項１１に記載の経粘膜吸収用製剤
【請求項１３】
封入される薬物が経口投与によって非吸収性または難吸収性の薬物である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
非吸収性または難吸収性の薬物が蛋白質、ペプチド、多糖類、低分子糖類、極性の強い薬物および高度脂溶性の薬物から選択されるものである請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
蛋白質またはペプチドが、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒求コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、抗ＴＮＦ−α抗体、エタネルセプト、インフリキシマブ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レプチン、ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、バソプレッシン、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、脳下垂体ペプチドホルモン、抗体、抗原および酵素から選択されるものである請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
高度脂溶性の薬物が、エナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール，酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メソトレキセート、カルモフール、デカフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ビタミンＡ類（レチノール、レチノイン酸）、ジタミンＤ類、ビタミンＥ類およびビタミンＫ類から選択されるものである請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
非吸収性または難吸収性の薬物が請求項１５および１６に記載の薬物以外の抗炎症薬、抗微生物薬、抗癌薬、血管作動薬、脳循環・代謝改善薬、抗動脈硬化薬、免疫抑制薬および核酸関連物質から選択されるものである請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１】
表面にカルボキシル基を有するコアからなり、コアの内部に２価の金属塩、疎水性物質もしくは糖質の１種または２種以上および薬物を封入した経粘膜吸収用薬物封入ナノ粒子。
【請求項２】
表面にカルボキシル基を有するコアが、生分解性ポリマーまたは排泄型ポリマーである請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
生分解性ポリマーが、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）または乳酸重合体（ＰＬＡ）であり、排泄型ポリマーが、カルボキシル基が置換されたスチレンモノポリマー、ポリスチレン、メタクリル酸−スチレン共重合体またはジビニルベンゼン−スチレン共重合体である請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
表面にカルボキシル基を有するコアが、カルボキシル基を有する脂質およびイオン性または非イオン性界面活性剤から形成される粒子である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
さらに２価の金属イオンを加えた請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のナノ粒子に２価または３価の金属イオンが結合された二次ナノ粒子。
【請求項７】
２価または３価の金属イオンが、カルシウムイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、鉄イオンおよび銅イオンから選択されるものである請求項６記載の二次ナノ粒子。
【請求項８】
請求項６に記載の二次ナノ粒子に１価〜３価の塩基イオンが結合された三次ナノ粒子。
【請求項９】
１価〜３価の塩基イオンが、炭酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、シュウ酸イオン、乳酸イオンおよび尿酸イオンから選択されるものである請求項８に記載の三次ナノ粒子。
【請求項１０】
粒子径が１５０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下、さらに好ましくは２０〜５０ｎｍである請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のナノ粒子からなることを特徴とする経粘膜吸収用製剤。
【請求項１２】
製剤が経口投与剤、口腔内投与剤、鼻腔内投与剤および坐剤から選択されるものである請求項１１に記載の経粘膜吸収用製剤
【請求項１３】
封入される薬物が経口投与によって非吸収性または難吸収性の薬物である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
非吸収性または難吸収性の薬物が蛋白質、ペプチド、多糖類、低分子糖類、極性の強い薬物および高度脂溶性の薬物から選択されるものである請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
蛋白質またはペプチドが、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒求コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、抗ＴＮＦ−α抗体、エタネルセプト、インフリキシマブ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レプチン、ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、バソプレッシン、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、脳下垂体ペプチドホルモン、抗体、抗原および酵素から選択されるものである請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
高度脂溶性の薬物が、エナント酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン、エストラジオール、吉草酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール，酢酸デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、シクロスポリン、タクロリムス、パクリタキセル、塩酸イリノテカン、シスプラチン、メソトレキセート、カルモフール、デカフール、ドキソルビシン、クラリスロマイシン、アズトレオナム、セフニジル、ナリジクス酸、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、クロルプロマジン、ジアゼパム、ニフェジピン、塩酸ニカルジピン、ベシル酸アムロジン、カンデサルタンシレキセチル、アシクロビル、ビダラビン、エファビレンツ、アルプロスタジル、ジノプロストン、ビタミンＡ類（レチノール、レチノイン酸）、ジタミンＤ類、ビタミンＥ類およびビタミンＫ類から選択されるものである請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
非吸収性または難吸収性の薬物が請求項１５および１６に記載の薬物以外の抗炎症薬、抗微生物薬、抗癌薬、血管作動薬、脳循環・代謝改善薬、抗動脈硬化薬、免疫抑制薬および核酸関連物質から選択されるものである請求項１４に記載のナノ粒子。
【図１．１】
【図１．２】
【図２．１】
【図２．２】
【図３．１】
【図３．２】
【図４．１】
【図４．２】
【図５．１】
【図５．２】
【図６．１】
【図６．２】
【図７．１】
【図７．２】
【図８．１】
【図８．２】
【図８．３】
【図８．４】
【図９．１】
【図９．２】
【図９．３】
【図１０．１】
【図１０．２】
【図１０．３】
【図１１．１】
【図１１．２】
【図１１．３】
【図１２】
【図１３．１】
【図１３．２】
【図１３．３】
【図１３．４】
【図１４】
【図１．２】
【図２．１】
【図２．２】
【図３．１】
【図３．２】
【図４．１】
【図４．２】
【図５．１】
【図５．２】
【図６．１】
【図６．２】
【図７．１】
【図７．２】
【図８．１】
【図８．２】
【図８．３】
【図８．４】
【図９．１】
【図９．２】
【図９．３】
【図１０．１】
【図１０．２】
【図１０．３】
【図１１．１】
【図１１．２】
【図１１．３】
【図１２】
【図１３．１】
【図１３．２】
【図１３．３】
【図１３．４】
【図１４】
【公開番号】特開２００６−２８０３１（Ｐ２００６−２８０３１Ａ）
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２０５２５９（Ｐ２００４−２０５２５９）
【出願日】平成１６年７月１２日（２００４．７．１２）
【出願人】（３０３０１０４５２）株式会社ＬＴＴバイオファーマ (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１２日（２００４．７．１２）
【出願人】（３０３０１０４５２）株式会社ＬＴＴバイオファーマ (27)
【Ｆターム（参考）】
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