脂肪細胞のホスホイノシトールグリカン（ＰＩＧ）結合蛋白質
本発明は、脂肪細胞の原形質膜由来の蛋白質に関するものである。当該蛋白質は、ホスホイノシトールグリカンに対する特異的結合親和性を有している。当該蛋白質は、インスリンのシグナル伝達カスケードを迂回することにより、グルコース取込みを調節する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホイノシトールグリカンに対する特異的結合親和性を有する脂肪細胞の原形質膜由来の蛋白質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
膜貫通シグナル化におけるリン脂質及びホスホリパーゼの役割は、十分に解明されている。同様に、共有結合により結合しているグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を通して、細胞膜中の結合蛋白質の概念もまた十分に解明されている。そして、ＧＰＩ結合の詳細な化学構造も、ヒト赤血球、ラットＴhy−1、及び、トリパノゾーマ ブルセイ(Trypanosoma brucei)由来のバリアント表面糖蛋白質（ＶＳＧ）に類似する寄生虫の幾つかの外殻蛋白質のようなＧＰＩ結合蛋白質の数種類について研究されている。脂質結合は、ジアシル−又はアルキルアシルグリセロール型リン脂質から成るホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を通して起こる。後者は、とりわけ哺乳類アンカーにおいて起こり、そして膜に存在している巨大ＰＩとは異なることにより、ＧＰＩから誘導される第二メッセンジャーの発生に関与する新規な分子種を供給することができる。ＧＰＩによるシグナル化は、これら脂質結合分子が膜を結び付けることはないが、しかしながら、多くの場合、脂質二重層の外側半分中に埋め込まれていることより、特に興味がある。ＧＰＩの細胞膜からのシグナル仲介放出が、ホルモンから成長因子に至る種々の内分泌及び傍分泌分子を実証している。膜貫通シグナル化におけるＧＰＩの関与、及びその細胞内効果は、今日では解明されているようではあるが、しかしながら、観察された代謝効果に導くシグナル経路については、ほとんど知られていない。
【０００３】
インスリンの受容体結合がＧＰＩの加水分解を活性化することを示した初期の実験から得られたシグナル化特性を、ＧＰＩ結合分子が有しているということは注目すべきことである。或る低分子量の物質が、代謝酵素に対するインスリンの或る作用に類似しているものと同定された。この物質はイノシトールグリカン構造を有し、そして原形質膜中におけるＧＰＩのインスリン感受性の加水分解によって生成する。イノシトールグリカン酵素修飾因子（モジュレーター）のＧＰＩ前駆体が、ＧＰＩ膜蛋白質アンカーに構造的に類似するものと最初は思われていたが、シグナル伝達ＧＰＩと膜蛋白質のＧＰＩアンカーの間にある炭化水素残基において顕著な相違がみられる。ＧＰＩ−膜蛋白質アンカーは、必ず接触する蛋白質のＣ−末端アミノ酸との結合を供給するエタノールアミンホスフェートに続くトリマンノースコアから構成されている。
【０００４】
制御されたＧＰＩ加水分解は、インスリンに限らず、他の多くのホルモンについても観察されている。
【０００５】
実際多くの場合、ホルモン又は成長因子による細胞の賦活は、細胞表面からのＧＰＩ−結合蛋白質の一過性放出を導くものである。これらのアゴニストの受容体の多くは、チロシンキナーゼ受容体又はチロシンキナーゼに共役した受容体である。
【０００６】
インスリン作用に関与する多くの蛋白質は、分子レベルで同定されている。インスリン受容体は、膜貫通型のチロシンキナーゼであり、インスリン結合により活性化され、すみやかに自己リン酸化を受け、そしてその中には、Shcを含む一つ又はそれ以上の５０〜６０kDa蛋白質、１５kDa脂肪酸結合蛋白質、及び幾つかの、いわゆるインスリン受容体基質蛋白質と呼ばれる、ＩＲＳ−１／２／３／４のようなものを含む多くの細胞内物質をリン酸化する。チロシンリン酸化の後、ＩＲＳポリペプチドは、幾つかのSrcホモロジー２ドメインを含んでいるアダプター分子、及びホスファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ ３−Ｋ）、Grb２、SHP２、Nck、及びFynを含む酵素に対するドッキング蛋白質として作用する。ＩＲＳ蛋白質とＰＩ ３−Ｋ間の相互作用は、酵素のｐ８５調節サブユニットを通して起こり、そしてｐ１１０サブユニットの触媒活性の増加となる。ＰＩ ３−Ｋは、グルコース輸送及びグリコーゲン合成の促進を含む、多くのインスリン感受性代謝経路にとって必須である。ＩＲＳ蛋白質のチロシンリン酸化促進が起こる全ての場合において、これらの蛋白質がＰＩ ３−Ｋのｐ８５サブユニットに相伴ってドッキングするが、例外は、インスリンとアンジオテンシンのシグナルシステム間のクロストークであり、この場合は、当該ドッキングは、ＰＩ ３−Ｋの賦活と関連している。
【０００７】
インスリン受容体から下流標的までに直接導くシグナル伝達経路の同定に加えて、幾つかのクロストークが、インスリンによるシグナル伝達と他のホルモン／成長因子又は多様な外的刺激との間で記述されているが、それは、種々の細胞系においてインスリンのポジテイブな又はネガテイブな代謝及び／又は分裂促進作用についての或る程度の類似又は変異である。これらのリガンドの如何なるものも、インスリン受容体キナーゼを直接的には活性化しないことより、それらのシグナル化経路は、より末端のシグナル化段階におけるインスリンのシグナル化経路に集中するのかも知れない。この特性は、例えば、インスリン受容体キナーゼ活性の随伴する誘導なしに、かなりの程度代謝的インスリン作用に類似する酵母Ｇce1pのグリコシルホスファチジルイノシトール アンカー由来のＰＩＧ−Ｐのような異なる型のホスホイノシトールグリカン−ペプチド（ＰＩＧ−Ｐ）分子と共通する。
【０００８】
インスリンが作用する標的細胞におけるインスリン情報伝達カスケードに対するホスホイノシトールグリカン（ＰＩＧ）及びＰＩＧ−ペプチド（ＰＩＧ−Ｐ）のポジテイブクロストークは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−結合の原形質膜蛋白質（ＧＰＩ蛋白質）、及び二元的に、界面活性剤不溶性の糖脂質に富んだ原形質膜の高コレステロール(hcDIGs)のraftドメインから低コレステロール(lcDIGs)のraftドメインまでの、アシル化された非受容体チロシンキナーゼの再分布に関与している。
【０００９】
単離したラット脂肪細胞においては、ＰＩＧ−Ｐの第一標的はhcDIGsに局在している。放射能標識ＰＩＧ−Ｐ、Ｔyr−Ｃys−Ａsn−ＮＨ−(ＣＨ2)2−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）Ｏ−６Ｍanα１−２）−２Ｍanα1−６Ｍanα１−４ＧluＮ１−６Ino−１,２−(サイクリック)−リン酸塩（ＹＣＮ−ＰＩＧ）、並びに、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae）由来の放射能標識及び脂肪分解ＧＰＩ蛋白質(lcＧce1p)は、（それからＹＣＮ−ＰＩＧが誘導される。）、飽和の状態でhcDIGsに結合しているが、しかしながら、lcDIGs、ミクロソーム又は全原形質膜には結合しない。化学的に合成された無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの過剰により、又は脂肪細胞をトリプシン、続いてＮａＣｌ又はＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で前処理をすることによって完全に結合しなくなったことより、ＹＣＮ−ＰＩＧは細胞表面の受容体によって認識されるものであると指摘でき、ＹＣＮ−ＰＩＧ及びlcＧce1の結合は、双方共に特異的であるといえる。
【００１０】
ＰＩＧ−Ｐの結合は、ＧＰＩ蛋白質／脂質のような内因性リガンドの脂肪分解による除去に適切な、ＧＰＩ特異性ホスホリパーゼＣで前処理した脂肪細胞由来のhcDIGsにおいては、かなり増加していた。結合親和性は、ＹＣＮ−ＰＩＧで最高であり、個々の構成成分Ｔyr−Ｃys−Ａsn−ＮＨ−(ＣＨ2)2−ＯＨ（ＹＣＮ）プラスＨＯ−ＰＯ(Ｈ)Ｏ−６Ｍanα１（Ｍanα１−２）−２−Ｍanα1−６Ｍanα１−４ＧluＮ１−６Ino−1,2−(サイクリック)−リン酸塩（ＰＩＧ３７）の組合せ、及びそのペプチド変異体、ＹＭＮ−ＰIＧ、がそれに次ぐものであった。ＰＩＧ３７及びＹＣＮ単独では、中間的で低位の結合親和性であった。脂肪細胞のＹＣＮ−ＰＩＧとのインキュベーションは、後続するトリプシン／ＮａＣｌの逐次処理により細胞表面から放出される１１５kDaポリペプチドの[14Ｃ]ＮＥＭ標識を減少した。これらの実験データより、ラット脂肪細胞においては、インスリン類似ＰＩＧ（−Ｐ）は、ＧＰＩ蛋白質の受容体として作用するhcDIGsのトリプシン／ＮａＣｌ／ＮＥＭ−感受性の１１５kDa蛋白質により認識されるものであることが明らかとなった。
【００１１】
種々のDIGs型が同一の細胞中に存在していると思われる。カベオラ（caveolae）は、マーカー及び構造蛋白質、カベオリン 1−3の豊富な発現により誘導したフラスコ形の嵌入を形成する最終的に分化した細胞における特殊なDIGsを代表するものである。
【００１２】
脂肪細胞における原形質膜表面の２０％にも及ぶカベオラは、受容体仲介ポトサイトーシス、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス及びシグナル伝達に関与する。単離したラット脂肪細胞において、高い浮力密度（蔗糖密度勾配遠心分離に基づき）を示す低コレステロール／カベオリン量のlcDIGsは、低い浮力密度により特徴づけられる高コレステロール／カベオリン量の典型的なhcDIGsから識別することができる。Ｇce1及びＮuc、並びにNRTK、非受容体チロシンキナーゼ（Non Recepter Tyrosine Kinase）pp59Lynのように二重にアシル化した蛋白質のようなＧＰＩ蛋白質の主要画分は、hcDIGsに配置している。合成ＰＩＧ又はスルホニルウレア、グリメピリド(glimepiride)のようなインスリン類似刺激に応答して、ＧＰＩ蛋白質及びＮＲＴＫｓの双方は、hcDIGsからlcDIGsへと移動する。この再分布は、脂質修飾の欠失によって起こるものではない。
【００１３】
ＧＰＩ蛋白質ポリペプチド残基のカルボキシ末端から隣接のアミノ酸を有さない（ＰＩＧ）又は有する（ＰＩＧ−Ｐ）極性のコアグリカン頭残基は、基底状態においてhcDIGsとlcDIGsとの間のＧＰＩ蛋白質の分布、及びインスリン類似刺激に対する応答におけるそれらの再分布の分子的基礎を与える。
【００１４】
ＧＰＩ蛋白質は、酵母からヒトに至るまでの真核細胞で発現される、細胞表面抗原、エクトエンザイム(ectoenzyme)、受容体又は細胞接着分子であり、共有結合で結合しているグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質残基により、原形質膜の外層に結合している。そして、膜貫通ドメインを欠失しているにも拘らず、原形質膜を貫通したシグナル伝達に関与している。
【００１５】
ＧＰＩ蛋白質が、全く異なった膜貫通結合／リンカー蛋白質にではなく、いわゆる界面活性剤不溶性の糖脂質に富む、raft, DIGs、と呼ばれる特異な脂質raftドメインに結合するという事実より、ＧＰＩ蛋白質により媒介されるシグナル伝達の主要な共役機構として、脂質−脂質相互作用の可能性を実証するものである。
【００１６】
DIGsの基本的構造要素は、（グリコ）スフィンゴ脂質及びコレステロールの横方向の組立てであり、それにより膜脂質二重層における近傍の液体無秩序（Ｉd）領域とは異なった液体秩序（Ｉo）構造となることができる。哺乳類細胞の原形質膜は、コレステロール（３０〜５０ mol ％）及びＩdドメイン脂質（即ち、未飽和末端を有するホスファチジルコリン）及びＩoドメイン飽和アシル鎖を有する脂質（即ち、[グリコ] スフィンゴ脂質及びＧＰＩ脂質）の混合物を含んでいる。コレステロールは、脂質分子間の間質空間を充填することにより、Ｉoドメインにおける脂質パッキングを堅くすることに貢献しているものと思われ、そしてＩoドメインの形成は、コレステロール濃度の或る一定の範囲においてのみ認められる。
【００１７】
インスリンは、極めて重要なホルモンであり、身体の代謝に対し重要な影響を与える。一般的に言って、インスリンは同化作用を促進し、そして異化作用を阻害する。特異的にインスリンはグリコーゲン、脂肪酸及び蛋白質の合成速度を増大し、そして蛋白質及びグリコーゲンの分解を阻害する。このホルモンの重要な役割は、血液からグルコース、その他の糖類及びアミノ酸を、肝臓、筋肉及び脂肪組織へ移送して、細胞を賦活することである。
【００１８】
ウシのインスリンは、二本のポリペプチド鎖、２１アミノ酸を含んでいるポリペプチドＡ及び３０アミノ酸を含んでいるポリペプチドＢから成り、それらは二つの、−Ｓ−Ｓ−（ジスルフィド架橋）で結合している。これと同様の構造パターンが、ヒトを含む多くの哺乳類のインスリンに存在している。
【００１９】
当該構造は、コンパクトなシリンダー様であり、Ｂ鎖のカルボキシル末端のみが、蛋白質の残部から突出している。多くの疎水性残基があり、それらは中心の疎水性コアを形成するように相互作用し、そして両サイドの幾つかの極性残基が分子間で分散することにより、蛋白質をより安定化している。３個のジスルフィド架橋、即ち、２個の分子間鎖及び１個の分子内鎖が、当該構造を締め付けている。
【００２０】
多くの蛋白質の生合成における一般的なものとして、しかし特に細胞から輸送される蛋白質においては、蛋白質は前駆体の型で生成され、その後、貯蔵中に及び放出前に修飾されて、最終型が生成される。インスリンは、膵臓におけるランゲルハンス島と呼ばれる細胞群によって合成されて顆粒中に貯蔵され、その後、必要に応じて血液中に放出される。
【００２１】
インスリンが最初に合成された時は、１６アミノ酸のシグナル配列であるＢ鎖、結合鎖と呼ばれる３３アミノ酸のＣ鎖、及びＡ鎖から成る１００アミノ酸の一本鎖ポリペプチドで構成されている。この構造は、プレプロインスリン（ＰＰＩ）と呼ばれている。シグナル領域は、合成部位からインスリンを集めてパッキングし、貯蔵顆粒を形成する細胞内のＥＲ（小胞体）へ、ＰＰＩを向かわせる役目を担う。小胞体において、シグナルペプチドは、プロテアーゼ酵素により除去される。
【００２２】
糖尿病は、重大な合併症の発生を抑制し、及び一旦発病したときは、それを管理するため長期の治療が必要とされる慢性病である。糖尿病は、低血糖症、糖尿病性ケトアシドーシス及び高浸透圧性非ケトン性症候群のような急性及び慢性の合併症を伴う病気である。
【００２３】
Ｉ型糖尿病は、一般的に若い細身の患者に発病し、そして、自己免疫によるベータ細胞の破壊により起こる、顕著な膵臓のインスリン分泌不能により特徴付けられる。Ｉ型糖尿病患者を見分ける特徴は、もしインスリンを与えないと、ケトーシスそして遂には、ケトアシドーシスを発生することである。それ故、これらの患者は、生命維持のために外因性インスリンに依存する。
【００２４】
II型糖尿病は、典型的には、糖尿病家系を持つ４０歳以上の者に発病する。II型糖尿病は、種々の程度のインスリン分泌異常を伴う末梢のインスリン抵抗性により特徴付けられる。これらの異常は、肝臓の糖新生増加を導き、絶食高血糖症を引き起こす。II型糖尿病を発病した多くの患者（９０％）は肥満であり、またインスリン抵抗性により肥満症に結びつき、糖尿病状態を悪化する。
【００２５】
他の型の種々の糖尿病は、以前には、二次性糖尿病と呼ばれていたが、他の病気又は薬物治療に原因を有するものである。関連する最初の症状により（膵臓のベータ細胞の破壊、又は抹消のインスリン抵抗性の発生）、これらの糖尿病は、Ｉ型又はII型糖尿病とよく似ている。最もよく見られるものは、膵臓のベータ細胞が破壊された膵臓病（例えば、ヘモクロマトーシス、膵臓炎、嚢胞性線維症、膵臓癌）、又はインスリン分泌を撹乱するホルモン症候群（例えば、クロム親和性細胞腫）、又は抹消のインスリン抵抗性を原因とするもの（例えば、末端巨大症、クッシング症候群、クロム親和性細胞腫）、及び薬剤で誘導された糖尿病（例えば、フェニトイン、グルココルチコイド、エストロゲン）を挙げることができる。
【００２６】
糖尿病は、血清グルコースのレベル調節が不適切であることが特徴である。Ｉ型糖尿病の場合は、内分泌性の膵臓に対する自己免疫の攻撃により、インスリン分泌ベータ細胞が進行性でそして不可逆的に破壊された結果によるものである。その結果、グルコース取込み及びその代謝に関与するインスリン感受性標的細胞に対するインスリン作用が損なわれる。II型糖尿病の場合は、最も頻繁には、インスリン作用に対する細胞抵抗性に反映される、血清グルコースのレベル調節における付随的変異を伴う種々の疾患原因が挙げられる。
【００２７】
インスリンは、ジスルフィドにより貫通膜及び細胞内ベータサブユニットに結合した細胞外アルファサブユニットから成る、ジスルフィド結合したヘテロ四量体の細胞表面受容体を通して作用する。
【００２８】
Ｉ型糖尿病の場合は、正常な細胞受容体構造と結合するリガンド、及びその作用の欠損が、最も多く後続の代謝不全の原因となる。毎日のインスリン注射でのホルモン置換療法では、正常な生理状態では必要とされない、受容体作用のためのリガンドを供給する。
【００２９】
II型糖尿病の場合は、インスリン作用に対する抵抗性が、高頻度で受容体作用の不全に由来するある種の抵抗性を有する当該病気の原因となる。インスリン抵抗性の場合は、インスリン受容体がインスリンのシグナル化カスケードを開始するためにより多くのインスリンが必要とされる。本発明は、シグナル化経路を開始するインスリン受容体を回避することにより、グルコースの取込みを促進することを可能とする、脂肪細胞の細胞膜蛋白質に関するものである。このことは、インスリンに対し代替物として作用することができる化合物を同定するためのスクリーニング手段を持ち合わせていない、当該課題の強力な解決策を提供するものとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
それ故、本発明は、同時に存在する原形質膜及び／又は脂質小胞及び／又は高コレステロールを伴なうraftドメイン及び／又は脂質小胞によって安定化される可能性があり、そしてホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドに対する特異的結合親和性を有し、
(ａ) 当該蛋白質にホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドの特異的結合の後に、脂肪細胞におけるインスリン受容体基質１又は２のｔｙｒリン酸化を開始する能力、及び
(ｂ) 当該蛋白質にホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドの特異的結合の後に、脂肪細胞におけるグルコースの取込みを促進する能力、に特徴を有する脂肪細胞の原形質膜由来の蛋白質に関するものである。
【００３１】
他の蛋白質及び／又は安定化成分及び／又は他の化合物（例えば、塩、イオン、パフ）を考慮した当該蛋白質の量は、湿式質量％で、０.０１から１０％の間の範囲である。
【００３２】
当該蛋白質の量は、好ましくは、湿式質量％で、０.１から５％の間の範囲、そして最も好ましくは、湿式質量％で、０.１から１％の間の範囲である。
【００３３】
自然条件下では、原形質膜中の当該蛋白質の量は、湿式質量％で、１０-6 ％以下の範囲である。
【００３４】
本発明の好適な変法において、ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドは、下記の化合物：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１の少なくとも一つの化合物を含んでいる。
【００３５】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドの当該蛋白質への結合は、０.００１から１０μＭの結合定数（ＫD）で起こることが好ましい。
【００３６】
当該結合定数は、ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドと蛋白質との複合体の解離と非解離型間の平衡を定量的に記載するための熱力学的次数である。
【００３７】
当該結合定数は、準方向及び逆方向の速度定数の指数により作成される。当該結合定数の高い値（例えば、１０ｍＭ以上）は、弱くかつ非特異的な結合を、そして低い値（例えば、１００μＭを超えない）は、強くかつ特異的な結合を意味する。
【００３８】
当該結合定数は、例えば、平衡透析、分光学、又は図式アプローチ（スカッチャード プロット）（Scatchard−Plot）のような異なる方法で測定することができる。
【００３９】
脂肪細胞の原形質膜として挙げられるものは、好ましくは、ラット、マウス又はヒト由来のものである。
【００４０】
当該蛋白質の分子量は、１００から１２０kDaの間であり、好ましくは、１１０から１２０の間、そして最も好ましくは、１１５kDaである。当該蛋白質の分子量の決定は、如何なる方法であれ、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる場合は、±５〜１０％の不確定性を有することは、言及すべきことである。
【００４１】
更に、本発明は、本発明に係る前述の蛋白質、及び次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１の少なくとも一つの化合物から形成される複合体に関するものである。
【００４２】
当該複合体形成の要件は、リガンドの当該蛋白質に対する特異的な結合である。当該複合体は、リガンドと蛋白質間のイオン又は共有結合の形成によっておそらく安定化するものと思われる。
【００４３】
本発明は、また本発明に係る蛋白質の製法に関するものであり、そこにおいては、
(ａ) 脂肪細胞をラット、マウス又はヒト組織から供給し、
(ｂ) 上記(ａ)由来の脂肪細胞の原形質膜を単離し、
(ｃ) 高コレステロールのraftドメイン（hcDIGs）を(ｂ)で単離した原形質膜から調製し、
(ｄ) 上記(ｃ)由来のhcDIGsをトリプシン／ＮａＣｌ溶液で処理し、
(ｅ) 上記(ｄ)由来のインキュベーション混合物を遠心分離に掛け、そして上清画分の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動）で分離し、
(ｆ) 大きさ１００から１２０ｋＤａの蛋白質画分をゲルから溶出し、そして場合によって、界面活性剤又は生体膜を含んでいる溶液又は懸濁液で可溶化する。
【００４４】
更に、本発明は、本発明に係る蛋白質に特異的に結合する化合物を同定するための方法に関するものであり、そこにおいては、
(ａ) 本発明に係る蛋白質を含んでいる細胞画分を供給し
(ｂ) 化合物を供給し、
(ｃ) 上記(ａ)由来の細胞画分を、(ｂ)で供給された化合物に接触させ、
(ｄ) 上記(ａ)由来の細胞画分への当該化合物の結合を測定し、
(ｅ) 上記(ｄ)で得た結果を、(ｂ)で供給された化合物と同一の化合物を、(ａ)由来の
細胞と同一種及び／又は同一の組織特異性を有しているが、本発明に係る蛋白質を含んでいない細胞画分と接触させた実験から得た結果と比較することにより、結合特異性を推定し、それにより、本発明に係る蛋白質を含んでいない細胞画分と比較して、(ｂ)で供給された化合物のより多くの量が、本発明に係る蛋白質を含んでいる細胞画分と結合した場合、より高い結合特異性を有する、と示すことができる。
【００４５】
細胞画分は、好ましくは、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞から作成する。これらの細胞のそれぞれは、好ましくは、マウス、ラット又はヒトに由来することができる。細胞画分は、好ましくは、細胞の細胞膜から、更に好ましくは、高コレステロール含量のraftドメイン（hcDIGs）から構成される。本発明に係る蛋白質と特異的に結合する化合物を同定するための方法を実施するために用いられる化合物は、放射能核種（例えば、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、121Ｉ及びその他）又は蛍光マーカーで標識することができる。
【００４６】
本発明は、更に、本発明に係る蛋白質と特異的に結合する化合物を同定するための方法に関するものであり、そこにおいては、
(ａ)本発明に係る蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞を供給し、
(ｂ)化合物を供給し、
(ｃ)上記(ａ)由来の細胞を、(ｂ)で供給された化合物に接触させ、
(ｄ)上記(ａ)由来のグルコース輸送細胞への当該化合物の結合を測定し、
(ｅ)上記(ｄ)で得た結果を、(ｂ)で供給された化合物と同一の化合物を、(ａ)由来の細胞と同一種及び／又は同一の組織特異性を有しているが、本発明に係る蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞と接触させた実験から得た結果と比較することにより、結合特異性を推定し、それにより、本発明に係る蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞と比較して、(ｂ)で供給された化合物のより多くの量が、本発明に係る蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞と結合した場合、より高い結合特異性を有する、と示すことができる。
【００４７】
本発明に係る蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞は、本発明に係る蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞をトリプシン／ＮａＣｌ溶液及び／又はグリコシダーゼで処理することにより、本発明に係る蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞から、作成することができる。
【００４８】
グルコース輸送細胞は、好ましくは、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞である。これらの細胞は、好ましくは、ヒトの組織又は培養細胞、マウス又はヒト起源である。
【００４９】
使用した化合物は、好ましくは、放射能核種又は蛍光マーカーで標識されている。
【００５０】
更に、本発明は、本発明に係る蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方法に関するものであり、そこにおいては、
(ａ) 本発明に係る蛋白質が存在しているグルコース輸送細胞を供給し、
(ｂ) 本発明に係る蛋白質の天然のリガンドを供給し、
(ｃ) 化合物を供給し、
(ｄ) 上記(ａ)由来のグルコース輸送細胞を、(ｂ)で供給されたリガンド及び(ｃ)の化合物に接触させ、
(ｅ) 上記(ｄ)由来のグルコース輸送細胞によるグルコースの取込みを測定し、
(ｆ) 上記(ｄ)由来のグルコース輸送細胞によるグルコースの取込みを測定し、それにより、(ｃ)由来の化合物がグルコースの取込みを促進すればアゴニスト活性を有し、そしてグルコースの取込みを阻害すれば、アンタゴニスト活性を有する。
【００５１】
前述の本発明に係る蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方
法のリガンドは、好ましくは、ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１である。本発明に係る蛋白質とアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方法のグルコース輸送細胞は、好ましくは、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞であり、また好ましくは、ヒト、マウス又はラット種起源である。
【００５２】
更に、本発明は、本発明に係る蛋白質と結合する化合物を同定するための方法、又は本発明に係る蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方法で同定される化合物、並びに医薬品の製剤のための補助剤を含んでいる医薬品に関するものである。当該医薬品は、好ましい実施態様として、次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択した少なくとも一つの化合物を含んでいる。
【００５３】
当該医薬品は、また、次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択した少なくとも一種の化合物の部分又は誘導体を含んでいる。
【００５４】
更に、本発明は、本発明に係る蛋白質に結合するものと同定された、又は本発明に係る蛋白質とアゴニスト又はアンタゴニストであると同定された化合物を、インスリン抵抗性又は糖尿病の治療のための医薬品を製造するための使用に関するものである。
【００５５】
そのような化合物は、好ましくは、ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ若しくはｌｃＧｃｅ１、又はこれらの化合物の部分又は誘導体である。
【００５６】
実施態様
ＰＩＧ（−Ｐ）の化学合成：ＹＣＮ−ＰＩＧの合成（一般的方法については、図１、２、３を参照）
化合物２の合成（図４；ｉ，ii）のために、Bachem (Heidelberg, Germany) からの化合物１（８.０ｇ、２０.６mmol）を、ピリジン２００ｍｌに溶解し、そしてエタノールアミン５ｇ（８１.８mmol）及びＮ−エチルモルホリン５ｍｌを添加した。静置後（１６時間、室温）、無水酢酸５０ｍｌを５℃で撹拌しつつ滴下した。反応混合物を、撹拌し（２時間、室温）、その後、高真空下で、濃縮した。残留物を熱メタノール１５０ｍｌに溶解し、そして当該溶液を濃縮した。生成物は、塩化メチレン／メタノール（１５／１）１００ｍｌ及びｎ−ヘプタン／酢酸エチル（２／１）２００ｍｌを添加して結晶化させた。化合物２の収率は、６.１ｇ（８４％）、白色結晶、m.p. １７５℃であった。ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）：塩化メチレン／メタノール（９／１）、Ｒf＝０.７。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝３５８.２、計算式は、Ｃ16Ｈ21Ｎ3Ｏ6，Ｍ＝３５１.３６であった。
【００５７】
化合物３の合成（図４；iii）のために、パラジウム−炭（１０％Ｐｄ）２.０ｇを、化合物２（１２.０ｇ、３４.０mmol）のメタノール／酢酸（１／１）溶液２００ｍｌ中に添加し、混合物に水素添加した（２時間、室温）。溶液をシリカゲルで濾過し、濃縮し、そして残留物を、フラッシュ クロマトグラフィーで精製した（塩化メチレン／メタノール／濃縮アンモニア：３０／５／１）。化合物３の収率は、７.３ｇ（９８％）、黄色油であった。ＴＬＣ：塩化メチレン／メタノール／濃縮アンモニア（３０／５／１）、Ｒf＝０.５。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝２２４.２、計算式は、Ｃ8Ｈ15Ｎ3Ｏ4、Ｍ＝２１７.２３であった。
【００５８】
化合物４の合成（図４；iv）のために、テトラフルオロホウ酸 1(ｏ−(シアノ（エトキシカルボニル）メチリデン）アミノ−１，１，３，３−テトラメチルウロン（ＴＯＴＵ）の１.５ｇ（４.５mmol）、エチル−（ヒドロキシイミノ）−シアノ酢酸（オキシム）の０.６４ｇ（４.５mmol）、及びＮ−エチルモルホリン１.７ｍｌ（１３.５mmol）、を０℃で、撹拌しながら、化合物３の０.８ｇ（３.７mmol）及びTrtCys（Trt）OHの２.８ｇ（４.５mmol）、のジメチルホルムアミド溶液中に添加し、その混合物を撹拌した（２時間、０℃）。酢酸エチル２００ｍｌを添加した後、その混合物を飽和NaHCO3溶液で３回洗浄し、MgSO4で乾燥し、そして濃縮した。残留物を、ｎ−ヘプタン／酢酸エチル（６／１）で粉砕し、次に結晶化させた。化合物４の収率：２.２ｇ（７４％）、白色結晶、m.p．１８５℃。TLC：塩化メチレン／メタノール（１５／１）、Ｒf＝０.４。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝８１１.７、計算式は、Ｃ49Ｈ48Ｎ4Ｏ5Ｓ、Ｍ＝８０５.０であった。
【００５９】
化合物６の合成（図４；ｖ, vi）のため、化合物４の４.０ｇ（５.０mmol）を塩化メチレン２００ｍｌ中に溶解し、水４ｍｌ及びトリフルオロ酢酸３ｍｌを添加した。１５分後に、混合物を飽和NaHCO3溶液で３回洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮し、そして粗生成物５を収率９９％で得た。この粗生成物をメタノール５０ｍｌに溶解し、１Ｍナトリウムメタノラート溶液中に滴下した。１５分後に塩化メチレン５０ｍｌを添加し、そして混合物をシリカゲルで濾過した。溶媒を濃縮した後、残留物をフラッシュ クロマトグラフィーで精製した（塩化メチレン／メタノール（９／１））。化合物６の収率：２.２ｇ（８５％）、白色の非晶性固体。TLC：塩化メチレン／メタノール（５／１）、Ｒf＝０.７、ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝５２７.３、計算式は、Ｃ28Ｈ32Ｎ4Ｏ4Ｓ、Ｍ＝５２０.６であった。
【００６０】
化合物７の合成（図４；vii）のため、化合物６の２.７ｇ（５.２mmol）、Ztyr（Bn）OHの４.２ｇ（１０.４mmol）、ＴＯＴＵ３.４ｇ（１０.４mmol）、オキシム１.５ｇ（１０.４mmol）、Ｎ−エチルモルホリン２ｍｌを添加したジメチルホルムアミド５０ｍｌを、化合物４の合成と同様に、反応させた。化合物７の収率：４.２ｇ（８９％）、白色結晶。TLC：塩化メチレン／メタノール（１５／１）、Ｒf＝０.２５。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝９１４.８、計算式は、Ｃ25Ｈ53Ｎ5Ｏ8Ｓ、Ｍ＝９０８.１であった。
【００６１】
化合物８の合成（図５； viii）のため、亜リン酸６.０ｇ（７３mmol）をピリジンで4回濃縮した後、乾燥ピリジン１８０ｍｌ中に溶解した。塩化ピバロイル(pivaloyl chloride)の１３ｍｌを１０℃で滴下した。この反応溶液を静置した（４５分、室温）。生成物７の１６.４ｇ（１８.１mmol）、を上述したように、反応溶液に加えた。５時間後、トルエン２００ｍｌ及び塩化メチレン／メタノール／３３％アンモニア（３０／１０／３）１５０ｍｌで希釈した。濃縮後、残留したピリジンをトルエン２００ｍｌで更に３回蒸留除去した。残留物を塩化メチレン／メタノール（２０／１）の２００ｍｌに懸濁した。非溶解性成分を濾過し、そして塩化メチレン／メタノール（２０／１）の５０ｍｌで２回洗浄した。濾液を濃縮し、そしてフラッシュ クロマトグラフィーで精製した。化合物８の収率：１１.６ｇ（６６％）、白色結晶。ＴＬＣ：塩化メチレン／メタノール／３３％アンモニア（３０／５／１）、Ｒf＝０.２５。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝９７８.４、計算式は、Ｃ52Ｈ54Ｎ5Ｏ10ＳＰ、Ｍ＝９７２.０８であった。
【００６２】
化合物１０の合成（図６； ix, ｘ）のため、化合物８の４.５ｇ（４.６mmol）及び化合物９の６.０ｇ（２.３mmol；前述の参考文献４７に基づいて合成）を、乾燥ピリジン８０ｍｌ中に溶解した。室温で３０分後、反応混合物を０℃で冷却し、そして水５ｍｌ及びイオジン１.３ｇを添加した。反応混合物を撹拌し（３０分、１０℃）、その後、塩化メチレン５００ｍｌ、飽和NaCl溶液１５０ｍｌ、及び飽和チオ硫酸塩溶液３０ｍｌで希釈し、そして５分間撹拌した。有機相をMgSO4で乾燥して、そして濃縮した。残留物を、塩化メチレン／メタノール／濃縮アンモニア（３０／５／１〜３０／１０／３）を用いてフラッシュ クロマトグラフィーで精製した。化合物１０の収率：８.０ｇ、非結晶性固体。TLC：塩化メチレン／メタノール（２０／１）、Ｒf＝０.５。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝３５８３.６、計算式は、Ｃ207Ｈ214Ｎ8Ｏ42ＳＰ2、Ｍ＝３５８０.０であった。
【００６３】
化合物１１の合成（図６；xi）のため、アンモニア３００ｍｌを−７８℃で濃縮した
。そこに、ナトリウム２.１ｇ（９１mmol）を溶解した。この溶液を乾燥テトラヒドロフラン１５０ｍｌで希釈し、そして乾燥テトラヒドロフラン５０ｍｌに溶解した保護基を有する最終生成物である化合物１０の８.０ｇ（２.２mmol）を、反応温度−７８℃でゆっくりと滴下した。反応時間１５分後（青色が消失してはならない）、混合物は塩化アンモニウム５ｇで注意深く処理した。青色が消失したとき、混合物を水５０ｍｌ及びメタノール１５０ｍｌで注意深く希釈した。解凍後、約１００ｍｌに濃縮した。この溶液を５００ｍｌのを塩化メチレン／メタノール／３３％アンモニア（３／３／１）で希釈し、そしてフラッシュ シリカゲルカラムに添加した（シリカゲル：５００ｍｌ）。それを、塩化メチレン／メタノール／３３％アンモニア（３／３／２）及び（３／３.５／３）の各々１リットルを用いて続けて溶離させた。溶離した生成物は、ｎ−ブタノール／エタノール／水／３３％アンモニア（２／２／２／１）を用いて、クロマトグラフィーで精製した。化合物１１の収率：２.４ｇ、（化合物９から６７％）、白色結晶。TLC：ｎ−ブタノール／エタノール／水／３３％アンモニア（２／２／２／１）、Ｒf＝０.５．ＭＳ：（Ｍ+ＮＨ3）+＝１５７２.６、計算式は、Ｃ54Ｈ88Ｎ6Ｏ40Ｐ2Ｓ、Ｍ＝１５５５.３１であった。31P−NMR(D2O)＝１５.３ ppm（環状リン酸塩）及び０.３（リン酸ジエステル）。1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲの測定値は、表１に表示してある。
【００６４】
化合物YCNの合成（図７； xii）のため、化合物７の１１.０ｇ（１１.３mmol）を、化合物１１の合成と同様にして脱保護した。化合物YCNの収率：４.５ｇ（９０％）、白色結晶。TLC：塩化メチレン／メタノール／濃縮アンモニア（３０／１５／５）、Ｒf＝０.２５．ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝４４８.３、計算式は、Ｃ18Ｈ27Ｎ5Ｏ6Ｓ、Ｍ＝４４１.５１であった。
【００６５】
化合物YMN−PIGの合成のため、YMN−PIGを、図２に示したものと同様な反応系列を用いて合成した。TrtCys（Trt）OHの代わりに、BocMetOHを使用して、同様な収率で、白色固体のYMN−PIGを得た。TLC：n−ブタノール／エタノール／水／３３％アンモニア（２／２／２／１）、Ｒf＝０.５．ＭＳ：（Ｍ+ＮＨ3）+＝１６００.６；計算式は、Ｃ56Ｈ92Ｎ6Ｏ40P2S、Ｍ＝１５８３.３８であった。31P−NMR(D2O)=１５.３ ppm（環状リン酸塩）及び０.３（リン酸ジエステル）。
【００６６】
放射能標識及び脂肪分解Ｇce1p(lcＧce1p)の合成
インタクトなGPIアンカーを有しているＧce1pを、ミオ−[14Ｃ]イノシトールで代謝的に標識し、そして酵素的にスフェロプラストに変換した乳酸生育の酵母細胞から精製し、原形質膜を調製した。Ｆicoll密度勾配遠心分離で精製し、β−アミドタウロコール酸塩０.３５％を用いて可溶化し、そしてTX−１１４分配付した。界面活性剤濃縮相に含まれているＧce1pを、セファデックス(Sephadex) S−300を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、Ｎ6−（２−アミノエチル）−ｃＡＭＰセファローズ(Sepharose)を用いたアフィニテイクロマトグラフィー、及びフェニルセファローズ クロマトグラフィーで精製した。カラムからの溶離は、3Ｈ−放射能をオンライン測定により測定した。部分的に精製したＧce1pを沈殿させ（ポリエチレングリコール６０００の１２％）、０.２ｍｇ蛋白質／ｍｌの濃度で緩衝液Ｇ（２５ｍＭ Ｔris／酢酸塩、ｐＨ７.４、１４４ｍＭ ＮａＣｌ，０.１％ β−アミドタウロコール酸塩、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、０.１ｍＭ ＰＭＳＦ、５μＭ ロイペプチン、１ｍＭ ヨードアセトアミド、１０μｇ／ｍｌ 大豆トリプシンインヒビター）に懸濁し、続いてＰＩ−特異的ＰＬＣ（Ｂ．Cereus）の６Ｕ／ｍｌの存在下でインキュベートした（３時間、２５℃）。２％ トライトン（Ｔriton）Ｘ−114、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１４４ｍＭ ＮａＣｌの氷冷却溶液の１０倍量を添加し相分画（３７℃で２分間インキュベーション、そして２５℃で１分間、１２,０００ｘｇで遠心分離）の後、lcＧce1pを上部の界面活性剤低濃度相から回収した。
【００６７】
下部の界面活性剤高濃度相を、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１４４ｍＭ ＮａＣｌの等量を添加して２回再抽出した後、氷上で再解凍し、続いて相分画した後、一緒にした界面活性剤低濃度相を沈殿させた（１２％ ポリエチレングリコール６０００）。
【００６８】
放射能標識したlcＧce1pを、２００〜１０００ｄｐｍ／μｌのβ−アミドタウロコール酸塩を含んでいない緩衝液中に懸濁した。
【００６９】
放射能標識したYCN−PIGの合成
放射能標識したYCN−PIGは、Ｖ８プロテアーゼ（Ｓ．aureus）及びＰＩ−ＰＬＣ（Ｂ．cereus）による連続的消化により、Gce1pから誘導した。YCN−PIGを、ＴＸ−１１４による分配後の界面活性剤低濃度層から回収し、そして陽イオン交換クロマトグラフィー（Dowex 50W−X8）、ＢioGel−P4を用いたゲル濾過、ＳＡＸ ＨＰＬＣカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、異なる溶媒系を用いたSi−60 ＨＰＴＬＣプレートによる２回の薄層クロマトグラフィー、そして最終的に、ＢioGel−P4を用いたゲル濾過により、連続的に精製した。各クロマトグラフィー分離中の溶離物は、3Ｈ−放射能、ＵＶ吸収（Ａ220）、及び、単離ラット脂肪細胞におけるグルコース輸送促進に基づくインスリン−類似活性の測定により追跡した。
【００７０】
放射化学純度の測定のため、YCN−PIGの最終標品を、グルコースオリゴマーの標準混合物の含量によるジオネックス単位（Dionex units）で補正したDionex−CarboPac PA−1陰イオン交換ＨＰＬＣ（ｐＨ１３）に供した。内部標準は、パルス電流滴定測定器を用いて測定した。14Ｃ−標識フラグメントは、レイテスト ラモナ（Raytest Ramona）オンライン放射能測定器で測定した。濃度測定には、YCN−PIGを加水分解（６Ｍ ＨＣｌ、１６時間、１１０℃）し、そして無機リンの量（２モル／分子）及びチロシンの量（１モル／分子）を測定した。乾燥したYCN−PIGを使用するまで、−８０℃で保存し、そしてその後、最終濃度が１００μＭとなるように、２ｍＭ ＤＴＴを含んでいる水中に懸濁した。
【００７１】
ラット脂肪細胞の調製及びＰＩＧ（−Ｐ）／ＹＣＮとのインキュベーション
脂肪細胞は、雄のスプラーグ ダウレイ（Sprague Dawley）ラット（１４０〜１６０ｇ、通常飼育）の副睾丸（精巣上体）の脂肪体からコラーゲン消化により単離し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，１００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン、１００ｍＭ １−メチルー２−フェニルエチルアデノシン、０.５Ｕ／ｍｌ アデノシンデアミナーゼ、０.５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、及び５ｍＭ Ｄ−グルコースを含んでいる、ＫＲＨ緩衝液（０.１４ｍＭ ＮａＣｌ，４.７ｍＭ ＫＣｌ，２.５ｍＭ ＣａＣｌ2，１.２ｍＭ ＭｇＳＯ4、１.２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２０ｍＭ ヘペス／ＫＯＨ、ｐＨ７.４）中で、ＰＩＧ（−Ｐ）／ＹＣＮ（２０ｍＭ ヘペス／ＫＯＨに溶解、ｐＨ７.４、２ｍＭ ＤＴＴ）の存在下で、３７℃、振とう湯槽中、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2の継続的通気下で、所定の時間インキュベートした。
【００７２】
ラット脂肪細胞のトリプシン／ＮａＣｌ又はＮＥＭの処理
トリプシン／ＮａＣｌ処理のため、５ｍＭ グルコースを含んでいるＫＲＨ中の脂肪細胞の懸濁液（３.５×１０6細胞／ｍｌ）の２ｍｌを、トリプシン１００μｇ／ｍｌ存在下で、インキュベートした（２０分、３０℃）。大豆トリプシンインヒビター（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ）、及び１Ｍ ＮａＣｌ及び０.５％ＢＳＡを含んでいるＫＲＨの２ｍｌを添加し、インキュベーションを継続した（１０分、２２℃）。ＮＥＭ処理のため、５ｍＭ グルコースを含んでいるＫＲＨ中の脂肪細胞懸濁液（３.５×１０6細胞／ｍｌ）の１ｍｌを、ＮＥＭ（最終濃度：１.５ｍＭ）とインキュベートし（３０分、２５℃）、そしてその後、ＤＴＴ（最終濃度：１５ｍＭ、５分間）とインキュベートした。
【００７３】
処理後、細胞を遠心分離し（１５００ｘｇ、５分間、スウィング−アウト ローター）、そして下澄液（infranatant）を吸引して除去した。残った細胞懸濁液（約０.５ｍｌ）、を０.５％ＢＳＡを含んでいるＫＲＨの１０ｍｌを補充し、再度遠心分離した（５００ｘｇ、１分間、スウィング−アウト ローター）。追加的に２回洗浄した後、最終細胞懸濁液を、０.５％ ＢＳＡ、５０μＭ グルコース、及び１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含んでいるＫＲＨで、２５ｍｌとした。その０.２ｍｌを、ＰＩＧ４１に対する機能喪失を測定するため、脂質新生を検定した。対照細胞を同様に遠心分離し、洗浄した細胞をトリプシン／ＮａＣｌの代わりに、水で処理した。[14Ｃ]ＮＥＭで脂肪細胞を放射性標識するため、細胞懸濁液を、遠心分離し（５００ｘｇ、１分間）、そして下澄液を除去した。５０μｌ毎（７×１０6細胞／ｍｌ）を総量６０μｌの２.５μＣｉ[14Ｃ]ＮＥＭと一緒にインキュベートした（１０分、３０℃）。
【００７４】
１０ｍＭ ＤＴＴの５μｌ及び１０ｍＭ グルコースを含んでいるＫＲＨの５５μｌを添加した後、上述したように、総量２００μｌ中で、トリプシン／ＮａＣｌの処理をした。
【００７５】
５０μｌ毎を、０.４ｍｌ遠心分離管中、フタル酸ジノニルを含んでいる２００μｌの油層上に注意深く積載した。遠心分離（５０００ｘｇ、１５秒間）の後、遠心分離管を油層中で切断した。遠心分離管の下部に含まれている培地の蛋白質を沈殿させ（１０％ＴＣＡ，アセトンで２回洗浄）、レムリ(Laemmli)標品緩衝液に懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００７６】
原形質膜、全細胞溶解物及びミクロソームの調製
除核後の下澄液を、単離したラット脂肪細胞から、前述したようにして調製した。原形質膜の調製のため、蛋白質１ｍｌを、３８％（ｗ／ｖ）スクロース、２５ｍＭ Tris／HCl
（ｐＨ７.４），１ｍＭ ＥＤＴＡの５ｍｌ溶液の上層に積載し、そして遠心分離した（１１０，０００ｘｇ、１時間）。
【００７７】
二層（０.５ｍｌ）間の境界面にある膜を、吸引して取り出し、ホモジナイズ緩衝液の４倍量で希釈し、そして、２８％ペルコール（Percoll）、０.２５Ｍスクロース、１ｍＭ
ＥＤＴＡ，２５ｍＭ Tris／HCl （ｐＨ７.０）の８ｍｌ溶液の上層に積載した。遠心分離（４５，０００ｘｇ、３０分）の後、原形質膜を、下層三段目の勾配（０.５ｍｌ）から、パスツールピペットで取り出し、ホモジナイズ緩衝液の１０倍量で希釈し、そして遠心分離した（２００，０００ｘｇ、９０分）。結合実験のため、洗浄したペレットを、結合用緩衝液に、１〜２ｍｇ蛋白質／ｍｌの濃度で懸濁した。
【００７８】
全細胞溶解物の調製のため、除核後の下澄液に、デオキシコール酸塩及びノニデット(Nonidet)Ｐ−４０（最終濃度：各々０.３及び０.２％）を添加して、インキュベートし（１時間、４℃）、そして遠心分離した（１１０,０００ｘｇ、１時間、４℃）。上清画分は免疫沈降法に使用した。ミクロソーム調製のため、除核後の上清画分を遠心分離した（１００,０００ｘｇ、１時間、４℃）。得られたペレットは、結合用緩衝液に、１〜２ｍｇ蛋白質／ｍｌの濃度で懸濁した。
【００７９】
hcDIGs／lcDIGsの調製
精製した原形質膜のペレット（０.５〜１ｍｇ）を、５０ｍＭ ＮａＦ，５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１０μＭ オカダ酸、１ｍＭ 正バナジン酸ナトリウム、２０μＭ ロイペプチン、５μＭ ペプスタチン、１μＭ アプロチニン、５ｍＭ ヨード酢酸塩、２００μＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる、氷冷却の０.５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ１１）に懸濁し、そしてインキュベートした（１時間、４℃、ボルテックス(vortex)による振動及びピペトでの吸引を繰り返しつつ）。その後、懸濁液を、１５ｍＭ ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６.５）、７５ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる８５％スクロース溶液の等量と混合した。
【００８０】
同様の培地の各々４２.５、３５、２８、２２、１５及び５％のスクロース溶液の１.５ｍｌの上層に積載し、そして遠心分離した（２３０,０００ｘｇ、Beckman SW41 ローター、１８時間）。１５〜２２％（画分４及び５）及び２８〜３５％（画分８及び９）スクロースの境界面における、羊毛状物質の光分散の乳白色を発するバンド、並びに４２.５％クッションの物質（画分１２−１５）を、それぞれ、hcDIGs、lcDIGs及び可溶化した原形質膜の蛋白質として、１９−ゲージの針及びシリンジを用いて集めた（画分当たり、０.７５ｍｌ）。密度は、画分の比旋光度を測定して求めた。hc／lcDIGsは、前述したように、適切なマーカーの増加／減少により、特徴付けられる。結合実験のため、hc／lcDIGsを、結合懸濁液（１５ｍＭ Ｍｅｓ／ＫＯＨ、ｐＨ６.５、０.２５Ｍ スクロース、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビター）に懸濁した。
【００８１】
放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧ又はlcGce1p のサブセルラー画分との結合
放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧ又はlcＧce1pの１０μｌ（６０,０００〜８０,０００dpm／nmol、最終濃度：５μＭ）を、非標識の競合物質（図の説明において指摘）の存在下又は非存在下で、原形質膜、ミクロソーム又はhc／lcDIGs（蛋白質：４０〜８０μｇ）を懸濁した結合用緩衝液の４０μｌに添加し、総量を１００μｌとして、インキュベートした（３０分、４℃）。インキュベーション培地から原形質膜を分離するため、４５μｌを、原形質膜／ミクロソームの場合は、フタル酸ジブチル及びフタル酸ジオクチル（１／１容積比、最終密度１.０１２）、又は、０.４ｍｌ前冷却（４℃）遠心分離管（ミクロチューブ番号：７２.７００、Sarstedt, Germany）中のhc／lcDIGsの場合は、フタル酸ジブチル及びフタル酸ジノニル（１／９容積比、最終密度９.８６３）を含んでいる、２００μｌの油層上に、注意深く積載した。
【００８２】
遠心分離（４８,０００ｘｇ、２分）の後、蓋で密閉してある遠心分離管の蓋をはずしてから、油層で切り取り、それぞれ、原形質膜／ミクロソームのペレット、及びhc／lcDIGsの上清画分を含んでいる（蓋をはずした）遠心分離管の下部及び上部を（それは油層中に浸透しているか或いは浸透していないが）、１０％ＳＤＳの１ｍｌを含んでいるシンチレーション管（１０ｍｌ）に移した。激しく振とうした後（１６時間、２５℃）、放射能をＡＣＳII シンチレーション溶媒(Beckman) の９ｍｌ中で測定した。これらの条件下では、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧ及びlcＧce1pの管壁に付着した及び油層中に拡散したものは、５０〜１２０dpmであり（即ち、インキュベーションに用いた全放射能の０.５％以下）、それ故、結合データの計算には、考慮しないこととした。
【００８３】
蛋白質測定の結果、原形質膜及びミクロソームの典型的な回収は、それぞれ７８〜８５％、及び６５〜８０％であり、hcDIGs及びlcDIGsでは、それぞれ８３〜９２％、及び７０〜７８％であった。
【００８４】
ＰＩＧ（−Ｐ）の化学合成
親水性ＧＰＩ構造は、次の二つの実験的アプローチによる天然の材料から調製される：(ｉ)ＧＰＩ特異的なＰＬＣ／Ｄによる、遊離ＧＰＩ脂質から、極性コアグリカン頭残基として、放出されたＰＩＧで、それ故、如何なるアミノ酸をも欠損する。及び、(ii)脂質分解及び蛋白質分解の組合わせにより、残存するＧＰＩ蛋白質のカルボキシ末端に由来する一つ又はそれ以上のアミノ酸と一緒になった極性コアグリカン頭残基を生成する、ＧＰＩ蛋白質から生ずるＰＩＧ−Ｐ。
【００８５】
ＧＰＩ脂質及びＧＰＩ蛋白質は、真核細胞の原形質膜の外側層に、酵母からヒトに至るまで保存されているコアグリカン頭残基と一緒に存在している。ＧＰＩコアグリカン頭残基の結合を検定するため、放射能標識した純粋なＰＩＧ（−Ｐ）構造の合成は、「Muller
et al., Endocrinology 138, 3459−3475, 1997」に記載されているような、既に公開さ
れている方法を用いた。即ち、ＹＣＮ−ＰＩＧは、ミオ[14Ｃ]イノシトールで代謝的に標識した酵母Ｓ．セレビシア(S.cerevisiae）由来の、原形質膜の放射化学的に純粋なＧＰＩ蛋白質、Ｇce1pから、In vitroにおける連続的な蛋白質分解及び脂質分解により調製した。
【００８６】
結合の構造−活性相関関係の検定には、化学的に合成したＹＣＮ−ＰＩＧ及びそれらの誘導体を使用した（図１：ＹＣＮ−ＰＩＧ；図２：ＹＭＮ−ＰＩＧ；図３：ＰＩＧ３７；図４：ＹＣＮ）。
【００８７】
ＹＣＮ−ＰＩＧのトリペプチドの合成は、ペプチド合成の技術常識的手段で行なった。ヘキササッカライドは、「Frick et al., Biochemistry 37, 13421−13436; 1998」に記載されている、トリクロロアセトイミド法を用いて合成した。ＰＩＧ−Ｐの合成における重要な工程は、ホスホジエステル結合の形成であることが明らかとなった。実験した種々の方法のうち、Ｈ−ホスホネート法が、最も良い収率で合成することが分かった。
【００８８】
最終化合物の保護基脱離は、システイン（パラジウムで水素化されない）及び酸不安定な環状リン酸塩の存在で強化した、液体アンモニア中のナトリウムで行なった。全化合物について、質量分析、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、及び、31Ｐ−ＮＭＲ分光法を用いて特性決定をした。
【００８９】
hcDIGsに特異的に結合するＰＩＧ（−Ｐ）
賦活化されていない脂肪細胞から勾配遠心分離により調製した全原形質膜を、原形質膜の特異的マーカー酵素を標識として濃縮した（全細胞溶解物との比較）。ウアバイン(ouabain) 感受性ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ（ナトリウム／カリウム−ＡＴＰアーゼ（Ｎａ+／Ｋ+−ＡＴＰase）の触媒サブユニットに対応）を９.５倍に濃縮し、及び、Ｎｕｃに対して１.９倍（酵素活性に基づき）、β1−インテグリンに対して１３.９倍、シンタキシン−１(syntaxin−1)に対して１６.４倍（免疫ブロット法（immunoblotting)に基づき）、及びＧce1に対して７.８倍（フォトアフィニテイ標識に基づき）濃縮した。
【００９０】
同時に、原形質膜調製は、筋小胞体マーカー、ＥＧＴＡ感受性Ｃａ2+−アデノシントリホスファターゼに対しては５.７倍、エンドソームマーカー、ＳＣＡＭＰ（分泌担体膜蛋白質(Secretary Carrier Membrane Protein)）３７／３９に対しては８.５倍、及びＧＬＵＴ４（グルコーストランスポーター４）に対しては１６.９倍（免疫ブロット法（immunoblotting)に基づき）減少した（全細胞溶解物との比較）。
【００９１】
賦活化されていない脂肪細胞由来のミクロソームは、全細胞溶解物に比較して、ＧＬＵＴ４に対しては１４.４倍、ＳＣＡＭＰ３７／３９に対しては８.５倍、トランスフェリン受容体に対しては６.９倍、及びＩＧＦIIに対しては９.７倍濃縮し、また、全細胞溶解物に比較して、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼに対しては２４.６倍、Ｇce1に対しては１２.５倍、Ｎｕｃに対しては１５.８倍、β1−インテグリンに対しては３９.５倍、及び、シンタキシン−１(syntaxin−1)に対しては４８.５倍（免疫ブロット法（immunoblotting)に基づき）、及び、Ｃａ2+−感受性アデノシントリホスファターゼ活性に対しては１９.９倍減少した。このことより、この画分は、基本的に、小胞体及びエンドソーム構造を含んでいるものであり、そして事実上、原形質膜及び筋小胞体フラグメントを含んでいないことを示唆している。
【００９２】
hcDIGs及びlcDIGsは、賦活化されていない脂肪細胞から、０.５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ１１）には不溶解で、かつ蔗糖密度勾配遠心分離においては低容積密度であることに基づいて調製した。それらは、（全原形質膜と比較して）、ＧＬＵＴ４及びインスリン受容体β−サブユニットの活性減少によって特徴づけられる。lcDIGsと比較した場合、hcDIGsの方が、カベオリン(caveolin)、ｐｐ５９Lyn、及びＧce1に対して、有意義により高い増加を示すことによって、hcDIGsとlcDIGsは、互いに相異することが分かった。
【００９３】
単離したサブセルラー膜画分は、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧの段階的増加量でインキュベートし、そしてインキュベーションは、適当な密度の油層遠心分離により、インキュベーション培地から急速に分離することによって終了させた。
【００９４】
膜結合のＹＣＮ−ＰＩＧは、主に濃度依存性及び飽和性の態様としてのhcDIGsから、そして、微量には、lcDIGsから回収したが、そこにおいては、原形質膜及びミクロソームは実際には放射能標識はされていなかった（図５）。直線の範囲では、hcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧの非特異的結合は、無標識の合成ＹＣＮ−ＰＩＧ又は他の競合化合物の５００倍過剰量の存在により検定した結果、２０％以下であった（図５）。以下の実験は、結合の直線範囲の末端に対応するＹＣＮ−ＰＩＧ濃度を用いて行なった。
【００９５】
密度に基づくよりは沈降に基づく急速な濾過及び遠心分離のような、受容体−リガンド相互作用の測定の他の方法は、いかなる脂肪細胞膜の細胞画分に対するＹＣＮ−ＰＩＧの特異的結合の測定についても失敗したが（データは未表示）、それは多分に、培地結合の親和性及び／又は高い解離乗数によるものと思われる。ＹＣＮ−ＰＩＧに対するスカッチャード プロット分析の結果、hcDIGsの蛋白質１ｍｇ当たり、Ｋdは、５０〜５００ｎＭの範囲、Ｂmaxは、５０〜２００ｐmolの範囲であった。hcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧの特異的結合は、ペプチジルエタノールアミジン残基の欠損によるペプチド変異体、ＹＣＮ−ＰＩＧ及びＰＩＧ３７の活性の有意義な減少、並びに、競合検定におけるペプチジルエタノールアミジン残基、ＹＣＮ単独の極度に低い活性によって実証された（図６）。
【００９６】
無標識ＹＣＮとＰＩＧ３７の組合せ（等モル比）は、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧのhcDIGsに対する結合を、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧよりわずかに低効果で、及び、ＰＩＧ又はペプチジルエタノールアミジン残基単独、及びＹＭＮ−ＰＩＧより強力に、置換した。この事実より、ＰＩＧとペプチジルエタノールアミジン残基の同時かつ相乗的認識が実証された。ＹＣＮとＰＩＧ３７とを組合せた競合のＩＣ50は、共有結合のＹＣＮ−ＰＩＧに比較して、３から４倍ほど高いものであった（図６）。次に、同定されたＰＩＧ（−Ｐ）の結合部位が、蛋白質様の性質を示すか否かを調べた。
【００９７】
hcDIGsを、トリプシン／ＮaＣl 又はＮＥＭで前処理した後、無標識の合成ＹＣＮ−ＰＩＧの過剰量の存在下又は非存在下において、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧの段階的増加量でインキュベートした（非特異的結合を調べるため）。トリプシン及び０.５ＭのＮaＣlの継続処理、又はＮＥＭの処理により、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧのhcDIGsに対する特異的結合は、完全に停止したが、一方、トリプシン又はＮaＣl単独、或いは、ＤＴＴ存在下でのＮＥＭ処理では、有意義な影響はみられなかった（図７）。
【００９８】
同様な不活性化が、lcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧの、低親和性相互作用においても観察された。これらの結果から、脂肪細胞表面のDIGsにおけるＰＩＧ（−Ｐ）に対する、トリプシン／ＮaＣl及びＮＥＭ感受性の結合蛋白質の存在が実証された。lcDIGsに比較して、ＹＣＮ−ＰＩＧのhcDIGsに対するより好適な結合は、ｍ−βＣＤを使用した脂肪細胞の原形質膜のコレステロール減少過程における変換、及びそれに続く、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧのhc／lcDIGsに対する特異的結合の分析により確認された。対照脂肪細胞においては、２０％がlcDIGsに結合して残留したものの、ＹＣＮ−ＰＩＧの大部分は、hcDIGsと一緒に回収された（図８）。
【００９９】
しかしながら、インタクトなラット脂肪細胞のｍ−βＣＤ（１〜１０ｍＭ）処理により、lcDIGsとの結合が増加するのに伴い、hcDIGsに結合するＹＣＮ−ＰＩＧの量が濃度依存的に減少することが明らかとなった。
【０１００】
コレステロール減少後で、しかしDIGsの調製前において、脂肪細胞をトリプシン／ＮaＣl 又はＮＥＭで処理した場合、hcDIGs及びlcDIGs双方に対するＹＣＮ−ＰＩＧの特異的結合は有意義に減少した（データは未表示）。これらの事実から、ラット脂肪細胞のhcDIGsにおけるＰＩＧ（−Ｐ）受容体の有利な位置の形成は、コレステロールに極めて強く依存していることが実証された。
【０１０１】
hcDIGsに特異的に結合するＧＰＩ蛋白質の脂質分解
ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、及びＰＩＧ３７のＰＩＧ残基、−ＮＨ−(ＣＨ2)2−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）Ｏ−６Ｍanα１(Ｍanα１−２）−２Ｍanα1−６Ｍanα１−４ＧluＮ１−６Ino−１,２−(サイクリック)−リン酸塩（図１、２及び３）は、全ての真核細胞ＧＰＩ蛋白質の極性コアグリカン頭残基と同一であった。その結果、ＰＩＧ−Ｐの蛋白質結合部位が、lcGPI蛋白質と相互作用するか否か、即ち、ＧＰＩ蛋白質の完全なポリペプチド部分に接触したときに、ＰＩＧ（−Ｐ）残基を認識するか否かについて調べることとした。
【０１０２】
放射能標識したlcGPI蛋白質を得るために、代謝的に標識したＳ．セレビシエ(S.cerevisiae）細胞由来のＧce1pを、ＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus）で処理し、そして、親水的分解産物を精製して、放射化学的に均一なものを得た。ＰＩＧ（−Ｐ）に用いたのと同様の油層遠心分離法の実験の結果、lcDIGsと比較した場合、１１から１５倍もより効率的に、hcDIGsとの濃度依存性及び飽和性の態様において、lcＧce1pは、単離したラット脂肪細胞由来のDIGsと結合することが分かった。
【０１０３】
２００倍モル過剰の無標識lcＧce1pの存在下における非特異的結合は、lcＧce1pの非飽和濃度でDIGsを用いて回収した全lcＧce1pの１５％未満であった。スカッチャード プロット分析の結果、hcDIGsに結合するlcＧce1pのＫdは、hcDIGsの１ｍｇ蛋白質当たり、０.１〜１μＭであり、Ｂmaxは、７０〜２００pmolであった。一方、全ての原形質膜及びミクロソームは、lcＧce1pの特異的結合を示さなかった。このように、脂肪細胞原形質膜のhcDIGsは、明らかに酵母由来のlcＧce1pの特異的結合部位を保持していることが分かった。
【０１０４】
そこで更に、同様なＫd及びＢmax値により指摘されるように、ＰＩＧ（−Ｐ）及びlcＧＰＩ蛋白質に対する結合部位の同定の分析のため、hcDIGsにおけるlcＧce1pの結合部位に対する合成ＰＩＧ（−Ｐ）化合物の相対的な親和性を、競合的研究において比較した（図９）。
【０１０５】
放射能標識したlcＧce1pのhcDIGsに対する結合が、標識した合成ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、及びＹＣＮプラスＰＩＧ３７の過剰（５００倍以上）により、結合した全lcＧce1pの７５％以上も置換することより、lcＧce1pとhcDIGsの特異的相互作用が確認された。ＰＩＧ３７およびＹＣＮとのlcＧce1pの結合の競合性は、かなり効率が低かった。hcDIGsからlcＧce1pに置換する見かけ上のＩＣ50に影響を与える、異なるＰＩＧ（−Ｐ）の相対的ランキングは、ＹＣＮ−ＰＩＧ＞ＹＣＮ＋ＰＩＧ３７＞ＹＭＮ−ＰＩＧ＞ＰＩＧ３７＞ＹＣＮの順であり、これは、ＹＣＮ−ＰＩＧ結合に対する影響の相対的ランキングと同一であった（図６）。
【０１０６】
更に、この見かけ上のＩＣ50は、lcＧce1pとＹＣＮ−ＰＩＧとの競合的結合にも極めてよく似ており、両者の場合、同一の決定基が認識され、そしてＧＰＩ蛋白質の他の蛋白質残基（カルボキシ末端のトリペプチジルエタノールアミジン残基を除いて）は、結合に寄与していないことが分かった。
【０１０７】
次に、インタクトなラット脂肪細胞のトリプシン／ＮaＣl 及びＮＥＭ処理に対する、lcＧce1pとhcDIGsとの相互作用の感受性について、放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧの結合を殆ど完全に破壊するような条件下で調べた（図７）。
【０１０８】
トリプシン／ＮaＣl 及びＮＥＭ処理の脂肪細胞からのhcDIGsは、放射能標識lcＧce1ｐとの親和性を示した。非標識ＹＣＮ−ＰＩＧの５００倍過剰の存在下における非特異的結合（無処理の対照細胞由来のhcDIGsから回収した全Ｇce1pの約３０％）を超えるものではなかった（図１０）。
【０１０９】
これとは対照的に、過剰のＤＴＴの存在下（図１０）又は、トリプシン又はＮaＣl単独（データは未表示）でのＮＥＭと脂肪細胞のインキュベーションは、放射能標識したlcＧce1pの結合も、そしてその３μＭ ＹＣＮ＋ＰＩＧ３７、５μＭ ＰＩＧ３７、及び１０μＭ ＹＣＮによる競合も、無処理の細胞に比較して減少しなかった。これらを総合して考えると、脂肪細胞の原形質膜のhcDIGsにおける局在、絶対的又は相対的親和性（構造的誘導体に対する）、発現レベル、トリプシン／ＮaＣl 及びＮＥＭに対する感受性を考慮した場合、ＹＣＮ−ＰＩＧ及びlcＧce1pの特異的結合部位は、極めてよく似た特徴を示していることが分かった。
【０１１０】
ＰＩＧ（−Ｐ）及びlcＧＰＩ蛋白質の受容体に対する内因性リガンド
ＰＩＧ（−Ｐ）及びlcＧＰＩ蛋白質に対する表面上同一の結合部位の生理的リガンドの候補物は、無破壊のＧＰＩ構造、即ち、ＧＰＩ脂質及び／又はＧＰＩ蛋白質アンカーである。この可能性を実証するために、受容体と相互作用をし、それ故に、ＹＣＮ−ＰＩＧ／lcＧce1pの結合部位を隠蔽する内因性ＧＰＩ分子と推定されるものを特異的に除去するため、hcDIGsの調製前に、単離したラット脂肪細胞を、種々のＧＰＩ特異的なＰＬで処理し、そして続いて塩洗浄（０.５Ｍ ＮａＣｌ）をした。
【０１１１】
ラット脂肪細胞を段階的増加量のＢ．セレウス(B. cereus）由来のＰＩ特異的ＰＬＣ又はヒト血清由来のＧＰＩ特異的ＰＬＤとインキュベートした結果、特異的にhcDIGsに結合する放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧ及びＧce1pの量が、濃度依存的に増加した（図１１）。平行実験により、脂質消化の効果は、hcDIGsからのＧce1p及びNｕｃの喪失によって実証された。
【０１１２】
hcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧ又はlcＧce1pの結合が、それぞれ２００及び２６０％増加したのに相関して、それぞれ７５及び６５％の喪失であった。ＧＰＩ分解の特異性は、ＰＣ特異的なＰＬＣ(B. cereus）及びキャベツ由来のＰＬＤ（ＧＰＩ構造に作用しない）が、hcDIGsからＧce1及びNucを有意に置換すること、及び、hcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧ（lcＧce1p）結合を促進することを、完全に喪失したことによって実証された（図１１、１２）。
【０１１３】
脂肪細胞から調製したＰＩ特異的なＰＬＣ由来のhcDIGsに対する特異的結合（非特異的結合には、有意義な変化はなかった。）のスカッチャード プロット分析の結果、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧ／lcＧce1pの親和性増加は、主に、Ｋdは殆ど変化せずに、Ｂmaxが２から３倍ほど高くなったことによるものであることが分かった。これらの事実から、単離したラット脂肪細胞の基底状態のhcDIGsにおける、ＰＩＧ（−Ｐ）又はlcＧＰＩ蛋白質に対する結合部位の約５０％が、（Ｇ）ＰＩ特異的ＰＬＣ／Ｄによって分解される内因性ＧＰＩ構造によって、占められたことによるものであることが分かった。
【０１１４】
特に顕著には、ラット脂肪細胞のＧＰＩ特異的ＰＬＣ／Ｄの処理が、hcDIGsにおけるＧce1p及びNucの量を、ある一定の程度、緩和にしかし有意義に減少させるという効果を、
生理的濃度のインスリンが示した（模倣した）ことである。インスリンにより誘導された、hcDIGsからのＧＰＩ蛋白質の喪失が、ＹＣＮ−ＰＩＧ又はlcＧce1pの結合能力を顕著に増大する方に導いたことによるものである（図１１、１２）。
【０１１５】
更に、ＰＩＧ（−Ｐ）及びlcＧＰＩ蛋白質の受容体が、ＣＩＲと呼ばれる、トリプシン／ＮaＣl及びＮＥＭ感受性の１１５ｋDa蛋白質と同一であることが実証された。
【０１１６】
受容体に対するＰＩＧ−Ｐの結合は、後続するＮＥＭによる共有結合の変化及び／又はトリプシン／NaClによる脂肪細胞表面からの切断と放出への接近可能性（accessibility）に影響を与える。
【０１１７】
ラット脂肪細胞をＰＩＧ（−Ｐ）とインキュベートし、続いて、[14Ｃ]ＮＥＭ標識、及びトリプシン／NaCl処理に供した。
【０１１８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる放射能標識ポリペプチドの放出の分析、及び蛍光像(phoshorimage)（図１３）により、[14Ｃ]ＮＥＭによる１１５kDaポリペプチドの乗換え、及び／又はトリプシン／NaCl処理後の脂肪細胞の下澄からの回収が、ＰＩＧ（−Ｐ）により減少することが明らかとなった。
【０１１９】
その減少は、対照細胞と比較して、３μＭにおけるＹＣＮ−ＰＩＧ及びＰＩＧ３７、及び３０μＭにおけるＹＣＮでは、それぞれ８３、６５及び２８％であった。この蛋白質は、トリプシン／NaCl処理により原形質膜から遊離した主要なＮＥＭ標識成分であるが、しかしながら、個々の処理によるものではなく（図１３）、そしてそれはＣＩＲと同一であった。
【０１２０】
内因性リガンド（例えば、ＧＰＩ蛋白質）の存在、及び脂質分解による対応する結合部位からの除去（図１１、１２参照）、の実験事実と一致して、外因性ＰＩ特異的ＰＬＣ(B. cereus）又はインスリンによる脂肪細胞の処理は、微少ではあるが、再現性をもって、[14C]ＮＥＭ標識ＣＩＲのトリプシン／NaCl処理依存性の遊離を、それぞれ、３０及び２０％促進した（図１３）。
【０１２１】
トリプシン／NaCl処理、トリプシン処理、NaCl処理による脂肪細胞表面からのＣＩＲの遊離の相対的比率（１００／２０／１０）が、対照、ＰＩＧ（−Ｐ）賦活細胞、及びＰＬＣ／インスリン処理細胞と概略平行であったことより、hcDIGsに対するＰＩＧ（−Ｐ）及び外因性ＧＰＩリガンドの結合が、トリプシン分解よりは、ＮＥＭによるＣＩＲの標識を減少したものと思われる。これは、脂肪細胞の原形質膜のhcDIGsにおける、リガンドとＰＩＧ（−Ｐ）受容体との相互作用により生じたＣＩＲ中の立体配座の変化によるものであると思われる。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
図のリスト
図１：ＰＩＧ合成の全体図、パート１
図２：ＰＩＧ合成の全体図、パート２
図３：ＰＩＧ合成の全体図、パート３
図４：ＹＣＮ−ＰＩＧの合成、パート１
図５：ＹＣＮ−ＰＩＧの合成、パート２
図６：ＹＣＮ−ＰＩＧの合成、パート３
図７：ＹＣＮの合成
図８：ＹＣＮ−ＰＩＧの化学式
図９：ＹＭＮ−ＰＩＧの化学式
図１０：ＰＩＧ３７の化学式
図１１：ＹＣＮの化学式
【０１２５】
図１２：ｈｃＤＩＧｓに対するＰＩＧ（−Ｐ）の特異的結合。
Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から単離した放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧの段階的増加量を、ｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）、ｌｃＤＩＧｓ（６.５μｇ）、原形質膜（４７.５μｇ）、及び単離したラットの脂肪細胞由来のミクロソーム（６８μｇ）と一緒にインキュベートした（１時間、４℃）。膜画分／ＤＩＧｓを、油層遠心分離に掛け、油層上部／沈殿相から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。特異的結合は、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの１０μＭの存在下及び非存在下で測定した放射能の差異として計算した。各点は、少なくとも４つの異なる膜標品を用いた３連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１２６】
図１３：ｈｃＤＩＧｓに対するＰＩＧ−Ｐの特異的結合。
放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧ（１８,０００〜２２,０００dpm）を、段階的増加量の無標識ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＣＮ+ＰＩＧ３７、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７及びＹＣＮ（競合）の存在下及び非存在下で、ｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）と一緒にインキュベートした（１時間、４℃）。膜画分／ＤＩＧｓを、油層遠心分離に掛け、油層上部／沈殿相から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。
【０１２７】
図１４：ｈｃＤＩＧｓにおけるＰＩＧ−Ｐの結合部位の特性決定
Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から単離した放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧの増加する量を、単離したラットの脂肪細胞由来のｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）で、トリプシン／ＮａＣｌ，トリプシン、ＮＥＭ＋ＤＴＴ，ＮａＣｌ若しくはＮＥＭで前処理をしたもの、又は無処理のもの（対照）と一緒にインキュベートした（１時間、４℃）。ＤＩＧｓを、油層遠心分離に掛け、油層上部から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。特異的結合は、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの１０μＭの存在下及び非存在下で測定した放射能の差異として計算した。各点は、少なくとも３つの異なる脂肪細胞前処理を用いた３連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１２８】
図１５：ｈｃＤＩＧｓにおけるＰＩＧ−Ｐの結合部位の特性決定
放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧ（１２,０００〜１８,０００dpm）を、（正比例）量のｈｃＤＩＧｓ、及び単離したラットの脂肪細胞から調製したｈｃＤＩＧｓで、段階的増加量のｍ−βＣＤで前処理（５０分、３０℃）したもの、又は無処理のものと一緒にインキュベートした（１時間、４℃）。ＤＩＧｓを、油層遠心分離に掛け、油層上部から回収し、溶解し、そして無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの１０μＭの存在下及び非存在下で放射能を測定した。各点は、少なくとも３つの異なる脂肪細胞前処理を用いた３連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１２９】
図１６：ｈｃＤＩＧｓに対するｌｃＧｃｅ１ｐの特異的結合。
Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から単離し、そしてＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus）で処理をした放射能標識Ｇｃｅ１ｐを、無処理のラットの脂肪細胞から単離したｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）と一緒に、無標識ＰＩＧ−Ｐの存在下及び非存在下で、インキュベートした（１時間、４℃）。ｈｃＤＩＧｓを油層遠心分離にかけ、溶解し、そして放射能を測定した。各点は、少なくとも３つの異なるｈｃＤＩＧ標品を、それぞれ独立に脂肪細胞前処理をしたものを用いた４連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１３０】
図１７：ｈｃＤＩＧｓに対するｌｃＧｃｅ１ｐの特異的結合。
Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から単離し、そしてＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus
）で処理をした放射能標識Ｇｃｅ１ｐを、トリプシン／ＮａＣｌ、ＮＥＭ、ＮＥＭ＋ＤＴＴで前処理した、又は無処理の（対照）脂肪細胞から単離し、ｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）と一緒に、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧ（最終濃度：３μＭ）、ＹＣＮ＋ＰＩＧ３７（３μＭ）、ＰＩＧ３７（５μＭ）及びＹＣＮ（１０μＭ）の存在下及び非存在下でインキュベートした（１時間、４℃）。ｈｃＤＩＧｓを油層遠心分離にかけ、溶解し、そして放射能を測定した。各点は、少なくとも３つの異なるｈｃＤＩＧ標品を、それぞれ独立に脂肪細胞前処理をしたものを用いた、４連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１３１】
図１８：脂肪細胞のＰＬ及びインスリン処理によるＹＣＮ−ＰＩＧ及びｌｃＧｃｅ１ｐのｈｃＤＩＧｓへの結合に対する効果。
単離したラットの脂肪細胞（７×１０7細胞／ｍｌ）を、ＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus）、ＰＣ特異的ＰＬＣ（B. cereus）、ＧＰＩ特異的ＰＬＤ（ヒト血清）若しくはＰＬＤ（キャベツ）又はヒトインスリンの指摘量を、全容量２ｍｌとし、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2中、低速回転でインキュベートした（３０分、３０℃）。
１ＭのＮａＣｌを２ｍｌ添加後に、脂肪細胞を浮揚させて洗浄した。ｈｃＤＩＧｓを単離し、そしてその６.５μｇを、Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から調製した放射能標識ｌｃＧｃｅ１ｐ及びＹＣＮ−ＰＩＧ（１５,０００〜２５,０００dpm）と一緒に、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧ（最終濃度：１０μＭ）の存在下及び非存在下で、インキュベートし（１時間、４℃）、油層遠心分離に掛け、油層上部から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。特異的結合は、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの存在下及び非存在下で測定した放射能の差異として計算した。
各点は、少なくとも２つの異なるｈｃＤＩＧｓ標品を用いた３連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１３２】
図１９：脂肪細胞のＰＬ及びインスリン処理によるＹＣＮ−ＰＩＧ及びｌｃＧｃｅ１ｐのｈｃＤＩＧｓへの結合に対する効果。
単離したラットの脂肪細胞（７×１０7細胞／ｍｌ）を、ＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus）、ＰＣ特異的ＰＬＣ（B. cereus）、ＧＰＩ特異的ＰＬＤ（ヒト血清）若しくはＰＬＤ（キャベツ）又はヒトインスリンの指摘量を、全容量２ｍｌとし、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2中、低速回転でインキュベートした（３０分、３０℃）。
１ＭのＮａＣｌを２ｍｌ添加後に、脂肪細胞を浮揚させて洗浄した。ｈｃＤＩＧｓを単離し、そしてその６.５μｇを、Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から調製した放射能標識ｌｃＧｃｅ１ｐ及びＹＣＮ−ＰＩＧ（１５,０００〜２５,０００dpm）と一緒に、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧ（最終濃度：１０μＭ）の存在下及び非存在下でインキュベートし（１時間、４℃）、油層遠心分離に掛け、油層上部から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。
【０１３３】
図２０：ＣＩＲのＮＥＭ−標識におけるＰＩＧ（−Ｐ）、ＰＩ特異的ＰＬＣ及びインスリンの効果。
単離したラットの脂肪細胞を、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＣＮ、ＰＩ−ＰＬＣ（B. cereus）又はインスリンを指摘濃度でインキュベートし（３０分、３７℃）、そして[14Ｃ]−ＮＥＭで標識した。トリプシン／ＮａＣｌで指摘したように処理した後に、脂肪細胞を油層遠心分離に掛け、インキュベーション培地から単離した。蛋白質は、その培地（油層下部）から回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで再可溶化した。
【０１３４】
蛍光像(phoshorimage)は、同様な結果を示す３連の典型的な実験からのものを表示している。４つの異なる脂肪細胞のインキュベーションの定量的検定は、トリプシン／ＮａＣｌで処理した対照細胞から遊離したＣＩＲの量を１００とする不定単位（平均値±ＳＤ）で与えられる３連の測定値として表示している。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】ＰＩＧ合成の全体図（パート１）を示す。
【図２】ＰＩＧ合成の全体図（パート２）を示す。
【図３】ＰＩＧ合成の全体図（パート３）を示す。
【図４】ＹＣＮ−ＰＩＧの合成（パート１）を示す。
【図５】ＹＣＮ−ＰＩＧの合成（パート２）を示す。
【図６】ＹＣＮ−ＰＩＧの合成（パート３）を示す。
【図７】ＹＣＮの合成を示す。
【図８】ＹＣＮ−ＰＩＧの化学式を示す。
【図９】ＹＭＮ−ＰＩＧの化学式を示す。
【図１０】ＰＩＧ３７の化学式を示す。
【図１１】ＹＣＮの化学式を示す。
【図１２】ｈｃＤＩＧｓに対するＰＩＧ（−Ｐ）の特異的結合を示す。
【図１３】ｈｃＤＩＧｓに対するＰＩＧ−Ｐの特異的結合を示す。
【図１４】ｈｃＤＩＧｓにおけるＰＩＧ−Ｐの結合部位の特性づけを示す。
【図１５】ｈｃＤＩＧｓにおけるＰＩＧ−Ｐの結合部位の特性づけを示す。
【図１６】ｈｃＤＩＧｓに対するｌｃＧｃｅ１ｐの特異的結合を示す。
【図１７】ｈｃＤＩＧｓに対するｌｃＧｃｅ１ｐの特異的結合を示す。
【図１８】脂肪細胞のＰＬ及びインスリン処理によるＹＣＮ−ＰＩＧ及びｌｃＧｃｅ１ｐのｈｃＤＩＧｓへの結合に対する効果を示す。
【図１９】脂肪細胞のＰＬ及びインスリン処理によるＹＣＮ−ＰＩＧ及びｌｃＧｃｅ１ｐのｈｃＤＩＧｓへの結合に対する効果を示す。
【図２０】ＣＩＲのＮＥＭ−標識におけるＰＩＧ（−Ｐ）、ＰＩ特異的ＰＬＣ及びインスリンの効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホイノシトールグリカンに対する特異的結合親和性を有する脂肪細胞の原形質膜由来の蛋白質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
膜貫通シグナル化におけるリン脂質及びホスホリパーゼの役割は、十分に解明されている。同様に、共有結合により結合しているグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を通して、細胞膜中の結合蛋白質の概念もまた十分に解明されている。そして、ＧＰＩ結合の詳細な化学構造も、ヒト赤血球、ラットＴhy−1、及び、トリパノゾーマ ブルセイ(Trypanosoma brucei)由来のバリアント表面糖蛋白質（ＶＳＧ）に類似する寄生虫の幾つかの外殻蛋白質のようなＧＰＩ結合蛋白質の数種類について研究されている。脂質結合は、ジアシル−又はアルキルアシルグリセロール型リン脂質から成るホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を通して起こる。後者は、とりわけ哺乳類アンカーにおいて起こり、そして膜に存在している巨大ＰＩとは異なることにより、ＧＰＩから誘導される第二メッセンジャーの発生に関与する新規な分子種を供給することができる。ＧＰＩによるシグナル化は、これら脂質結合分子が膜を結び付けることはないが、しかしながら、多くの場合、脂質二重層の外側半分中に埋め込まれていることより、特に興味がある。ＧＰＩの細胞膜からのシグナル仲介放出が、ホルモンから成長因子に至る種々の内分泌及び傍分泌分子を実証している。膜貫通シグナル化におけるＧＰＩの関与、及びその細胞内効果は、今日では解明されているようではあるが、しかしながら、観察された代謝効果に導くシグナル経路については、ほとんど知られていない。
【０００３】
インスリンの受容体結合がＧＰＩの加水分解を活性化することを示した初期の実験から得られたシグナル化特性を、ＧＰＩ結合分子が有しているということは注目すべきことである。或る低分子量の物質が、代謝酵素に対するインスリンの或る作用に類似しているものと同定された。この物質はイノシトールグリカン構造を有し、そして原形質膜中におけるＧＰＩのインスリン感受性の加水分解によって生成する。イノシトールグリカン酵素修飾因子（モジュレーター）のＧＰＩ前駆体が、ＧＰＩ膜蛋白質アンカーに構造的に類似するものと最初は思われていたが、シグナル伝達ＧＰＩと膜蛋白質のＧＰＩアンカーの間にある炭化水素残基において顕著な相違がみられる。ＧＰＩ−膜蛋白質アンカーは、必ず接触する蛋白質のＣ−末端アミノ酸との結合を供給するエタノールアミンホスフェートに続くトリマンノースコアから構成されている。
【０００４】
制御されたＧＰＩ加水分解は、インスリンに限らず、他の多くのホルモンについても観察されている。
【０００５】
実際多くの場合、ホルモン又は成長因子による細胞の賦活は、細胞表面からのＧＰＩ−結合蛋白質の一過性放出を導くものである。これらのアゴニストの受容体の多くは、チロシンキナーゼ受容体又はチロシンキナーゼに共役した受容体である。
【０００６】
インスリン作用に関与する多くの蛋白質は、分子レベルで同定されている。インスリン受容体は、膜貫通型のチロシンキナーゼであり、インスリン結合により活性化され、すみやかに自己リン酸化を受け、そしてその中には、Shcを含む一つ又はそれ以上の５０〜６０kDa蛋白質、１５kDa脂肪酸結合蛋白質、及び幾つかの、いわゆるインスリン受容体基質蛋白質と呼ばれる、ＩＲＳ−１／２／３／４のようなものを含む多くの細胞内物質をリン酸化する。チロシンリン酸化の後、ＩＲＳポリペプチドは、幾つかのSrcホモロジー２ドメインを含んでいるアダプター分子、及びホスファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ ３−Ｋ）、Grb２、SHP２、Nck、及びFynを含む酵素に対するドッキング蛋白質として作用する。ＩＲＳ蛋白質とＰＩ ３−Ｋ間の相互作用は、酵素のｐ８５調節サブユニットを通して起こり、そしてｐ１１０サブユニットの触媒活性の増加となる。ＰＩ ３−Ｋは、グルコース輸送及びグリコーゲン合成の促進を含む、多くのインスリン感受性代謝経路にとって必須である。ＩＲＳ蛋白質のチロシンリン酸化促進が起こる全ての場合において、これらの蛋白質がＰＩ ３−Ｋのｐ８５サブユニットに相伴ってドッキングするが、例外は、インスリンとアンジオテンシンのシグナルシステム間のクロストークであり、この場合は、当該ドッキングは、ＰＩ ３−Ｋの賦活と関連している。
【０００７】
インスリン受容体から下流標的までに直接導くシグナル伝達経路の同定に加えて、幾つかのクロストークが、インスリンによるシグナル伝達と他のホルモン／成長因子又は多様な外的刺激との間で記述されているが、それは、種々の細胞系においてインスリンのポジテイブな又はネガテイブな代謝及び／又は分裂促進作用についての或る程度の類似又は変異である。これらのリガンドの如何なるものも、インスリン受容体キナーゼを直接的には活性化しないことより、それらのシグナル化経路は、より末端のシグナル化段階におけるインスリンのシグナル化経路に集中するのかも知れない。この特性は、例えば、インスリン受容体キナーゼ活性の随伴する誘導なしに、かなりの程度代謝的インスリン作用に類似する酵母Ｇce1pのグリコシルホスファチジルイノシトール アンカー由来のＰＩＧ−Ｐのような異なる型のホスホイノシトールグリカン−ペプチド（ＰＩＧ−Ｐ）分子と共通する。
【０００８】
インスリンが作用する標的細胞におけるインスリン情報伝達カスケードに対するホスホイノシトールグリカン（ＰＩＧ）及びＰＩＧ−ペプチド（ＰＩＧ−Ｐ）のポジテイブクロストークは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−結合の原形質膜蛋白質（ＧＰＩ蛋白質）、及び二元的に、界面活性剤不溶性の糖脂質に富んだ原形質膜の高コレステロール(hcDIGs)のraftドメインから低コレステロール(lcDIGs)のraftドメインまでの、アシル化された非受容体チロシンキナーゼの再分布に関与している。
【０００９】
単離したラット脂肪細胞においては、ＰＩＧ−Ｐの第一標的はhcDIGsに局在している。放射能標識ＰＩＧ−Ｐ、Ｔyr−Ｃys−Ａsn−ＮＨ−(ＣＨ2)2−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）Ｏ−６Ｍanα１−２）−２Ｍanα1−６Ｍanα１−４ＧluＮ１−６Ino−１,２−(サイクリック)−リン酸塩（ＹＣＮ−ＰＩＧ）、並びに、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae）由来の放射能標識及び脂肪分解ＧＰＩ蛋白質(lcＧce1p)は、（それからＹＣＮ−ＰＩＧが誘導される。）、飽和の状態でhcDIGsに結合しているが、しかしながら、lcDIGs、ミクロソーム又は全原形質膜には結合しない。化学的に合成された無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの過剰により、又は脂肪細胞をトリプシン、続いてＮａＣｌ又はＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で前処理をすることによって完全に結合しなくなったことより、ＹＣＮ−ＰＩＧは細胞表面の受容体によって認識されるものであると指摘でき、ＹＣＮ−ＰＩＧ及びlcＧce1の結合は、双方共に特異的であるといえる。
【００１０】
ＰＩＧ−Ｐの結合は、ＧＰＩ蛋白質／脂質のような内因性リガンドの脂肪分解による除去に適切な、ＧＰＩ特異性ホスホリパーゼＣで前処理した脂肪細胞由来のhcDIGsにおいては、かなり増加していた。結合親和性は、ＹＣＮ−ＰＩＧで最高であり、個々の構成成分Ｔyr−Ｃys−Ａsn−ＮＨ−(ＣＨ2)2−ＯＨ（ＹＣＮ）プラスＨＯ−ＰＯ(Ｈ)Ｏ−６Ｍanα１（Ｍanα１−２）−２−Ｍanα1−６Ｍanα１−４ＧluＮ１−６Ino−1,2−(サイクリック)−リン酸塩（ＰＩＧ３７）の組合せ、及びそのペプチド変異体、ＹＭＮ−ＰIＧ、がそれに次ぐものであった。ＰＩＧ３７及びＹＣＮ単独では、中間的で低位の結合親和性であった。脂肪細胞のＹＣＮ−ＰＩＧとのインキュベーションは、後続するトリプシン／ＮａＣｌの逐次処理により細胞表面から放出される１１５kDaポリペプチドの[14Ｃ]ＮＥＭ標識を減少した。これらの実験データより、ラット脂肪細胞においては、インスリン類似ＰＩＧ（−Ｐ）は、ＧＰＩ蛋白質の受容体として作用するhcDIGsのトリプシン／ＮａＣｌ／ＮＥＭ−感受性の１１５kDa蛋白質により認識されるものであることが明らかとなった。
【００１１】
種々のDIGs型が同一の細胞中に存在していると思われる。カベオラ（caveolae）は、マーカー及び構造蛋白質、カベオリン 1−3の豊富な発現により誘導したフラスコ形の嵌入を形成する最終的に分化した細胞における特殊なDIGsを代表するものである。
【００１２】
脂肪細胞における原形質膜表面の２０％にも及ぶカベオラは、受容体仲介ポトサイトーシス、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス及びシグナル伝達に関与する。単離したラット脂肪細胞において、高い浮力密度（蔗糖密度勾配遠心分離に基づき）を示す低コレステロール／カベオリン量のlcDIGsは、低い浮力密度により特徴づけられる高コレステロール／カベオリン量の典型的なhcDIGsから識別することができる。Ｇce1及びＮuc、並びにNRTK、非受容体チロシンキナーゼ（Non Recepter Tyrosine Kinase）pp59Lynのように二重にアシル化した蛋白質のようなＧＰＩ蛋白質の主要画分は、hcDIGsに配置している。合成ＰＩＧ又はスルホニルウレア、グリメピリド(glimepiride)のようなインスリン類似刺激に応答して、ＧＰＩ蛋白質及びＮＲＴＫｓの双方は、hcDIGsからlcDIGsへと移動する。この再分布は、脂質修飾の欠失によって起こるものではない。
【００１３】
ＧＰＩ蛋白質ポリペプチド残基のカルボキシ末端から隣接のアミノ酸を有さない（ＰＩＧ）又は有する（ＰＩＧ−Ｐ）極性のコアグリカン頭残基は、基底状態においてhcDIGsとlcDIGsとの間のＧＰＩ蛋白質の分布、及びインスリン類似刺激に対する応答におけるそれらの再分布の分子的基礎を与える。
【００１４】
ＧＰＩ蛋白質は、酵母からヒトに至るまでの真核細胞で発現される、細胞表面抗原、エクトエンザイム(ectoenzyme)、受容体又は細胞接着分子であり、共有結合で結合しているグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質残基により、原形質膜の外層に結合している。そして、膜貫通ドメインを欠失しているにも拘らず、原形質膜を貫通したシグナル伝達に関与している。
【００１５】
ＧＰＩ蛋白質が、全く異なった膜貫通結合／リンカー蛋白質にではなく、いわゆる界面活性剤不溶性の糖脂質に富む、raft, DIGs、と呼ばれる特異な脂質raftドメインに結合するという事実より、ＧＰＩ蛋白質により媒介されるシグナル伝達の主要な共役機構として、脂質−脂質相互作用の可能性を実証するものである。
【００１６】
DIGsの基本的構造要素は、（グリコ）スフィンゴ脂質及びコレステロールの横方向の組立てであり、それにより膜脂質二重層における近傍の液体無秩序（Ｉd）領域とは異なった液体秩序（Ｉo）構造となることができる。哺乳類細胞の原形質膜は、コレステロール（３０〜５０ mol ％）及びＩdドメイン脂質（即ち、未飽和末端を有するホスファチジルコリン）及びＩoドメイン飽和アシル鎖を有する脂質（即ち、[グリコ] スフィンゴ脂質及びＧＰＩ脂質）の混合物を含んでいる。コレステロールは、脂質分子間の間質空間を充填することにより、Ｉoドメインにおける脂質パッキングを堅くすることに貢献しているものと思われ、そしてＩoドメインの形成は、コレステロール濃度の或る一定の範囲においてのみ認められる。
【００１７】
インスリンは、極めて重要なホルモンであり、身体の代謝に対し重要な影響を与える。一般的に言って、インスリンは同化作用を促進し、そして異化作用を阻害する。特異的にインスリンはグリコーゲン、脂肪酸及び蛋白質の合成速度を増大し、そして蛋白質及びグリコーゲンの分解を阻害する。このホルモンの重要な役割は、血液からグルコース、その他の糖類及びアミノ酸を、肝臓、筋肉及び脂肪組織へ移送して、細胞を賦活することである。
【００１８】
ウシのインスリンは、二本のポリペプチド鎖、２１アミノ酸を含んでいるポリペプチドＡ及び３０アミノ酸を含んでいるポリペプチドＢから成り、それらは二つの、−Ｓ−Ｓ−（ジスルフィド架橋）で結合している。これと同様の構造パターンが、ヒトを含む多くの哺乳類のインスリンに存在している。
【００１９】
当該構造は、コンパクトなシリンダー様であり、Ｂ鎖のカルボキシル末端のみが、蛋白質の残部から突出している。多くの疎水性残基があり、それらは中心の疎水性コアを形成するように相互作用し、そして両サイドの幾つかの極性残基が分子間で分散することにより、蛋白質をより安定化している。３個のジスルフィド架橋、即ち、２個の分子間鎖及び１個の分子内鎖が、当該構造を締め付けている。
【００２０】
多くの蛋白質の生合成における一般的なものとして、しかし特に細胞から輸送される蛋白質においては、蛋白質は前駆体の型で生成され、その後、貯蔵中に及び放出前に修飾されて、最終型が生成される。インスリンは、膵臓におけるランゲルハンス島と呼ばれる細胞群によって合成されて顆粒中に貯蔵され、その後、必要に応じて血液中に放出される。
【００２１】
インスリンが最初に合成された時は、１６アミノ酸のシグナル配列であるＢ鎖、結合鎖と呼ばれる３３アミノ酸のＣ鎖、及びＡ鎖から成る１００アミノ酸の一本鎖ポリペプチドで構成されている。この構造は、プレプロインスリン（ＰＰＩ）と呼ばれている。シグナル領域は、合成部位からインスリンを集めてパッキングし、貯蔵顆粒を形成する細胞内のＥＲ（小胞体）へ、ＰＰＩを向かわせる役目を担う。小胞体において、シグナルペプチドは、プロテアーゼ酵素により除去される。
【００２２】
糖尿病は、重大な合併症の発生を抑制し、及び一旦発病したときは、それを管理するため長期の治療が必要とされる慢性病である。糖尿病は、低血糖症、糖尿病性ケトアシドーシス及び高浸透圧性非ケトン性症候群のような急性及び慢性の合併症を伴う病気である。
【００２３】
Ｉ型糖尿病は、一般的に若い細身の患者に発病し、そして、自己免疫によるベータ細胞の破壊により起こる、顕著な膵臓のインスリン分泌不能により特徴付けられる。Ｉ型糖尿病患者を見分ける特徴は、もしインスリンを与えないと、ケトーシスそして遂には、ケトアシドーシスを発生することである。それ故、これらの患者は、生命維持のために外因性インスリンに依存する。
【００２４】
II型糖尿病は、典型的には、糖尿病家系を持つ４０歳以上の者に発病する。II型糖尿病は、種々の程度のインスリン分泌異常を伴う末梢のインスリン抵抗性により特徴付けられる。これらの異常は、肝臓の糖新生増加を導き、絶食高血糖症を引き起こす。II型糖尿病を発病した多くの患者（９０％）は肥満であり、またインスリン抵抗性により肥満症に結びつき、糖尿病状態を悪化する。
【００２５】
他の型の種々の糖尿病は、以前には、二次性糖尿病と呼ばれていたが、他の病気又は薬物治療に原因を有するものである。関連する最初の症状により（膵臓のベータ細胞の破壊、又は抹消のインスリン抵抗性の発生）、これらの糖尿病は、Ｉ型又はII型糖尿病とよく似ている。最もよく見られるものは、膵臓のベータ細胞が破壊された膵臓病（例えば、ヘモクロマトーシス、膵臓炎、嚢胞性線維症、膵臓癌）、又はインスリン分泌を撹乱するホルモン症候群（例えば、クロム親和性細胞腫）、又は抹消のインスリン抵抗性を原因とするもの（例えば、末端巨大症、クッシング症候群、クロム親和性細胞腫）、及び薬剤で誘導された糖尿病（例えば、フェニトイン、グルココルチコイド、エストロゲン）を挙げることができる。
【００２６】
糖尿病は、血清グルコースのレベル調節が不適切であることが特徴である。Ｉ型糖尿病の場合は、内分泌性の膵臓に対する自己免疫の攻撃により、インスリン分泌ベータ細胞が進行性でそして不可逆的に破壊された結果によるものである。その結果、グルコース取込み及びその代謝に関与するインスリン感受性標的細胞に対するインスリン作用が損なわれる。II型糖尿病の場合は、最も頻繁には、インスリン作用に対する細胞抵抗性に反映される、血清グルコースのレベル調節における付随的変異を伴う種々の疾患原因が挙げられる。
【００２７】
インスリンは、ジスルフィドにより貫通膜及び細胞内ベータサブユニットに結合した細胞外アルファサブユニットから成る、ジスルフィド結合したヘテロ四量体の細胞表面受容体を通して作用する。
【００２８】
Ｉ型糖尿病の場合は、正常な細胞受容体構造と結合するリガンド、及びその作用の欠損が、最も多く後続の代謝不全の原因となる。毎日のインスリン注射でのホルモン置換療法では、正常な生理状態では必要とされない、受容体作用のためのリガンドを供給する。
【００２９】
II型糖尿病の場合は、インスリン作用に対する抵抗性が、高頻度で受容体作用の不全に由来するある種の抵抗性を有する当該病気の原因となる。インスリン抵抗性の場合は、インスリン受容体がインスリンのシグナル化カスケードを開始するためにより多くのインスリンが必要とされる。本発明は、シグナル化経路を開始するインスリン受容体を回避することにより、グルコースの取込みを促進することを可能とする、脂肪細胞の細胞膜蛋白質に関するものである。このことは、インスリンに対し代替物として作用することができる化合物を同定するためのスクリーニング手段を持ち合わせていない、当該課題の強力な解決策を提供するものとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
それ故、本発明は、同時に存在する原形質膜及び／又は脂質小胞及び／又は高コレステロールを伴なうraftドメイン及び／又は脂質小胞によって安定化される可能性があり、そしてホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドに対する特異的結合親和性を有し、
(ａ) 当該蛋白質にホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドの特異的結合の後に、脂肪細胞におけるインスリン受容体基質１又は２のｔｙｒリン酸化を開始する能力、及び
(ｂ) 当該蛋白質にホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドの特異的結合の後に、脂肪細胞におけるグルコースの取込みを促進する能力、に特徴を有する脂肪細胞の原形質膜由来の蛋白質に関するものである。
【００３１】
他の蛋白質及び／又は安定化成分及び／又は他の化合物（例えば、塩、イオン、パフ）を考慮した当該蛋白質の量は、湿式質量％で、０.０１から１０％の間の範囲である。
【００３２】
当該蛋白質の量は、好ましくは、湿式質量％で、０.１から５％の間の範囲、そして最も好ましくは、湿式質量％で、０.１から１％の間の範囲である。
【００３３】
自然条件下では、原形質膜中の当該蛋白質の量は、湿式質量％で、１０-6 ％以下の範囲である。
【００３４】
本発明の好適な変法において、ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドは、下記の化合物：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１の少なくとも一つの化合物を含んでいる。
【００３５】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドの当該蛋白質への結合は、０.００１から１０μＭの結合定数（ＫD）で起こることが好ましい。
【００３６】
当該結合定数は、ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドと蛋白質との複合体の解離と非解離型間の平衡を定量的に記載するための熱力学的次数である。
【００３７】
当該結合定数は、準方向及び逆方向の速度定数の指数により作成される。当該結合定数の高い値（例えば、１０ｍＭ以上）は、弱くかつ非特異的な結合を、そして低い値（例えば、１００μＭを超えない）は、強くかつ特異的な結合を意味する。
【００３８】
当該結合定数は、例えば、平衡透析、分光学、又は図式アプローチ（スカッチャード プロット）（Scatchard−Plot）のような異なる方法で測定することができる。
【００３９】
脂肪細胞の原形質膜として挙げられるものは、好ましくは、ラット、マウス又はヒト由来のものである。
【００４０】
当該蛋白質の分子量は、１００から１２０kDaの間であり、好ましくは、１１０から１２０の間、そして最も好ましくは、１１５kDaである。当該蛋白質の分子量の決定は、如何なる方法であれ、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる場合は、±５〜１０％の不確定性を有することは、言及すべきことである。
【００４１】
更に、本発明は、本発明に係る前述の蛋白質、及び次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１の少なくとも一つの化合物から形成される複合体に関するものである。
【００４２】
当該複合体形成の要件は、リガンドの当該蛋白質に対する特異的な結合である。当該複合体は、リガンドと蛋白質間のイオン又は共有結合の形成によっておそらく安定化するものと思われる。
【００４３】
本発明は、また本発明に係る蛋白質の製法に関するものであり、そこにおいては、
(ａ) 脂肪細胞をラット、マウス又はヒト組織から供給し、
(ｂ) 上記(ａ)由来の脂肪細胞の原形質膜を単離し、
(ｃ) 高コレステロールのraftドメイン（hcDIGs）を(ｂ)で単離した原形質膜から調製し、
(ｄ) 上記(ｃ)由来のhcDIGsをトリプシン／ＮａＣｌ溶液で処理し、
(ｅ) 上記(ｄ)由来のインキュベーション混合物を遠心分離に掛け、そして上清画分の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動）で分離し、
(ｆ) 大きさ１００から１２０ｋＤａの蛋白質画分をゲルから溶出し、そして場合によって、界面活性剤又は生体膜を含んでいる溶液又は懸濁液で可溶化する。
【００４４】
更に、本発明は、本発明に係る蛋白質に特異的に結合する化合物を同定するための方法に関するものであり、そこにおいては、
(ａ) 本発明に係る蛋白質を含んでいる細胞画分を供給し
(ｂ) 化合物を供給し、
(ｃ) 上記(ａ)由来の細胞画分を、(ｂ)で供給された化合物に接触させ、
(ｄ) 上記(ａ)由来の細胞画分への当該化合物の結合を測定し、
(ｅ) 上記(ｄ)で得た結果を、(ｂ)で供給された化合物と同一の化合物を、(ａ)由来の
細胞と同一種及び／又は同一の組織特異性を有しているが、本発明に係る蛋白質を含んでいない細胞画分と接触させた実験から得た結果と比較することにより、結合特異性を推定し、それにより、本発明に係る蛋白質を含んでいない細胞画分と比較して、(ｂ)で供給された化合物のより多くの量が、本発明に係る蛋白質を含んでいる細胞画分と結合した場合、より高い結合特異性を有する、と示すことができる。
【００４５】
細胞画分は、好ましくは、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞から作成する。これらの細胞のそれぞれは、好ましくは、マウス、ラット又はヒトに由来することができる。細胞画分は、好ましくは、細胞の細胞膜から、更に好ましくは、高コレステロール含量のraftドメイン（hcDIGs）から構成される。本発明に係る蛋白質と特異的に結合する化合物を同定するための方法を実施するために用いられる化合物は、放射能核種（例えば、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、121Ｉ及びその他）又は蛍光マーカーで標識することができる。
【００４６】
本発明は、更に、本発明に係る蛋白質と特異的に結合する化合物を同定するための方法に関するものであり、そこにおいては、
(ａ)本発明に係る蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞を供給し、
(ｂ)化合物を供給し、
(ｃ)上記(ａ)由来の細胞を、(ｂ)で供給された化合物に接触させ、
(ｄ)上記(ａ)由来のグルコース輸送細胞への当該化合物の結合を測定し、
(ｅ)上記(ｄ)で得た結果を、(ｂ)で供給された化合物と同一の化合物を、(ａ)由来の細胞と同一種及び／又は同一の組織特異性を有しているが、本発明に係る蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞と接触させた実験から得た結果と比較することにより、結合特異性を推定し、それにより、本発明に係る蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞と比較して、(ｂ)で供給された化合物のより多くの量が、本発明に係る蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞と結合した場合、より高い結合特異性を有する、と示すことができる。
【００４７】
本発明に係る蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞は、本発明に係る蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞をトリプシン／ＮａＣｌ溶液及び／又はグリコシダーゼで処理することにより、本発明に係る蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞から、作成することができる。
【００４８】
グルコース輸送細胞は、好ましくは、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞である。これらの細胞は、好ましくは、ヒトの組織又は培養細胞、マウス又はヒト起源である。
【００４９】
使用した化合物は、好ましくは、放射能核種又は蛍光マーカーで標識されている。
【００５０】
更に、本発明は、本発明に係る蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方法に関するものであり、そこにおいては、
(ａ) 本発明に係る蛋白質が存在しているグルコース輸送細胞を供給し、
(ｂ) 本発明に係る蛋白質の天然のリガンドを供給し、
(ｃ) 化合物を供給し、
(ｄ) 上記(ａ)由来のグルコース輸送細胞を、(ｂ)で供給されたリガンド及び(ｃ)の化合物に接触させ、
(ｅ) 上記(ｄ)由来のグルコース輸送細胞によるグルコースの取込みを測定し、
(ｆ) 上記(ｄ)由来のグルコース輸送細胞によるグルコースの取込みを測定し、それにより、(ｃ)由来の化合物がグルコースの取込みを促進すればアゴニスト活性を有し、そしてグルコースの取込みを阻害すれば、アンタゴニスト活性を有する。
【００５１】
前述の本発明に係る蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方
法のリガンドは、好ましくは、ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１である。本発明に係る蛋白質とアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方法のグルコース輸送細胞は、好ましくは、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞であり、また好ましくは、ヒト、マウス又はラット種起源である。
【００５２】
更に、本発明は、本発明に係る蛋白質と結合する化合物を同定するための方法、又は本発明に係る蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方法で同定される化合物、並びに医薬品の製剤のための補助剤を含んでいる医薬品に関するものである。当該医薬品は、好ましい実施態様として、次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択した少なくとも一つの化合物を含んでいる。
【００５３】
当該医薬品は、また、次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択した少なくとも一種の化合物の部分又は誘導体を含んでいる。
【００５４】
更に、本発明は、本発明に係る蛋白質に結合するものと同定された、又は本発明に係る蛋白質とアゴニスト又はアンタゴニストであると同定された化合物を、インスリン抵抗性又は糖尿病の治療のための医薬品を製造するための使用に関するものである。
【００５５】
そのような化合物は、好ましくは、ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ若しくはｌｃＧｃｅ１、又はこれらの化合物の部分又は誘導体である。
【００５６】
実施態様
ＰＩＧ（−Ｐ）の化学合成：ＹＣＮ−ＰＩＧの合成（一般的方法については、図１、２、３を参照）
化合物２の合成（図４；ｉ，ii）のために、Bachem (Heidelberg, Germany) からの化合物１（８.０ｇ、２０.６mmol）を、ピリジン２００ｍｌに溶解し、そしてエタノールアミン５ｇ（８１.８mmol）及びＮ−エチルモルホリン５ｍｌを添加した。静置後（１６時間、室温）、無水酢酸５０ｍｌを５℃で撹拌しつつ滴下した。反応混合物を、撹拌し（２時間、室温）、その後、高真空下で、濃縮した。残留物を熱メタノール１５０ｍｌに溶解し、そして当該溶液を濃縮した。生成物は、塩化メチレン／メタノール（１５／１）１００ｍｌ及びｎ−ヘプタン／酢酸エチル（２／１）２００ｍｌを添加して結晶化させた。化合物２の収率は、６.１ｇ（８４％）、白色結晶、m.p. １７５℃であった。ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）：塩化メチレン／メタノール（９／１）、Ｒf＝０.７。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝３５８.２、計算式は、Ｃ16Ｈ21Ｎ3Ｏ6，Ｍ＝３５１.３６であった。
【００５７】
化合物３の合成（図４；iii）のために、パラジウム−炭（１０％Ｐｄ）２.０ｇを、化合物２（１２.０ｇ、３４.０mmol）のメタノール／酢酸（１／１）溶液２００ｍｌ中に添加し、混合物に水素添加した（２時間、室温）。溶液をシリカゲルで濾過し、濃縮し、そして残留物を、フラッシュ クロマトグラフィーで精製した（塩化メチレン／メタノール／濃縮アンモニア：３０／５／１）。化合物３の収率は、７.３ｇ（９８％）、黄色油であった。ＴＬＣ：塩化メチレン／メタノール／濃縮アンモニア（３０／５／１）、Ｒf＝０.５。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝２２４.２、計算式は、Ｃ8Ｈ15Ｎ3Ｏ4、Ｍ＝２１７.２３であった。
【００５８】
化合物４の合成（図４；iv）のために、テトラフルオロホウ酸 1(ｏ−(シアノ（エトキシカルボニル）メチリデン）アミノ−１，１，３，３−テトラメチルウロン（ＴＯＴＵ）の１.５ｇ（４.５mmol）、エチル−（ヒドロキシイミノ）−シアノ酢酸（オキシム）の０.６４ｇ（４.５mmol）、及びＮ−エチルモルホリン１.７ｍｌ（１３.５mmol）、を０℃で、撹拌しながら、化合物３の０.８ｇ（３.７mmol）及びTrtCys（Trt）OHの２.８ｇ（４.５mmol）、のジメチルホルムアミド溶液中に添加し、その混合物を撹拌した（２時間、０℃）。酢酸エチル２００ｍｌを添加した後、その混合物を飽和NaHCO3溶液で３回洗浄し、MgSO4で乾燥し、そして濃縮した。残留物を、ｎ−ヘプタン／酢酸エチル（６／１）で粉砕し、次に結晶化させた。化合物４の収率：２.２ｇ（７４％）、白色結晶、m.p．１８５℃。TLC：塩化メチレン／メタノール（１５／１）、Ｒf＝０.４。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝８１１.７、計算式は、Ｃ49Ｈ48Ｎ4Ｏ5Ｓ、Ｍ＝８０５.０であった。
【００５９】
化合物６の合成（図４；ｖ, vi）のため、化合物４の４.０ｇ（５.０mmol）を塩化メチレン２００ｍｌ中に溶解し、水４ｍｌ及びトリフルオロ酢酸３ｍｌを添加した。１５分後に、混合物を飽和NaHCO3溶液で３回洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮し、そして粗生成物５を収率９９％で得た。この粗生成物をメタノール５０ｍｌに溶解し、１Ｍナトリウムメタノラート溶液中に滴下した。１５分後に塩化メチレン５０ｍｌを添加し、そして混合物をシリカゲルで濾過した。溶媒を濃縮した後、残留物をフラッシュ クロマトグラフィーで精製した（塩化メチレン／メタノール（９／１））。化合物６の収率：２.２ｇ（８５％）、白色の非晶性固体。TLC：塩化メチレン／メタノール（５／１）、Ｒf＝０.７、ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝５２７.３、計算式は、Ｃ28Ｈ32Ｎ4Ｏ4Ｓ、Ｍ＝５２０.６であった。
【００６０】
化合物７の合成（図４；vii）のため、化合物６の２.７ｇ（５.２mmol）、Ztyr（Bn）OHの４.２ｇ（１０.４mmol）、ＴＯＴＵ３.４ｇ（１０.４mmol）、オキシム１.５ｇ（１０.４mmol）、Ｎ−エチルモルホリン２ｍｌを添加したジメチルホルムアミド５０ｍｌを、化合物４の合成と同様に、反応させた。化合物７の収率：４.２ｇ（８９％）、白色結晶。TLC：塩化メチレン／メタノール（１５／１）、Ｒf＝０.２５。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝９１４.８、計算式は、Ｃ25Ｈ53Ｎ5Ｏ8Ｓ、Ｍ＝９０８.１であった。
【００６１】
化合物８の合成（図５； viii）のため、亜リン酸６.０ｇ（７３mmol）をピリジンで4回濃縮した後、乾燥ピリジン１８０ｍｌ中に溶解した。塩化ピバロイル(pivaloyl chloride)の１３ｍｌを１０℃で滴下した。この反応溶液を静置した（４５分、室温）。生成物７の１６.４ｇ（１８.１mmol）、を上述したように、反応溶液に加えた。５時間後、トルエン２００ｍｌ及び塩化メチレン／メタノール／３３％アンモニア（３０／１０／３）１５０ｍｌで希釈した。濃縮後、残留したピリジンをトルエン２００ｍｌで更に３回蒸留除去した。残留物を塩化メチレン／メタノール（２０／１）の２００ｍｌに懸濁した。非溶解性成分を濾過し、そして塩化メチレン／メタノール（２０／１）の５０ｍｌで２回洗浄した。濾液を濃縮し、そしてフラッシュ クロマトグラフィーで精製した。化合物８の収率：１１.６ｇ（６６％）、白色結晶。ＴＬＣ：塩化メチレン／メタノール／３３％アンモニア（３０／５／１）、Ｒf＝０.２５。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝９７８.４、計算式は、Ｃ52Ｈ54Ｎ5Ｏ10ＳＰ、Ｍ＝９７２.０８であった。
【００６２】
化合物１０の合成（図６； ix, ｘ）のため、化合物８の４.５ｇ（４.６mmol）及び化合物９の６.０ｇ（２.３mmol；前述の参考文献４７に基づいて合成）を、乾燥ピリジン８０ｍｌ中に溶解した。室温で３０分後、反応混合物を０℃で冷却し、そして水５ｍｌ及びイオジン１.３ｇを添加した。反応混合物を撹拌し（３０分、１０℃）、その後、塩化メチレン５００ｍｌ、飽和NaCl溶液１５０ｍｌ、及び飽和チオ硫酸塩溶液３０ｍｌで希釈し、そして５分間撹拌した。有機相をMgSO4で乾燥して、そして濃縮した。残留物を、塩化メチレン／メタノール／濃縮アンモニア（３０／５／１〜３０／１０／３）を用いてフラッシュ クロマトグラフィーで精製した。化合物１０の収率：８.０ｇ、非結晶性固体。TLC：塩化メチレン／メタノール（２０／１）、Ｒf＝０.５。ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝３５８３.６、計算式は、Ｃ207Ｈ214Ｎ8Ｏ42ＳＰ2、Ｍ＝３５８０.０であった。
【００６３】
化合物１１の合成（図６；xi）のため、アンモニア３００ｍｌを−７８℃で濃縮した
。そこに、ナトリウム２.１ｇ（９１mmol）を溶解した。この溶液を乾燥テトラヒドロフラン１５０ｍｌで希釈し、そして乾燥テトラヒドロフラン５０ｍｌに溶解した保護基を有する最終生成物である化合物１０の８.０ｇ（２.２mmol）を、反応温度−７８℃でゆっくりと滴下した。反応時間１５分後（青色が消失してはならない）、混合物は塩化アンモニウム５ｇで注意深く処理した。青色が消失したとき、混合物を水５０ｍｌ及びメタノール１５０ｍｌで注意深く希釈した。解凍後、約１００ｍｌに濃縮した。この溶液を５００ｍｌのを塩化メチレン／メタノール／３３％アンモニア（３／３／１）で希釈し、そしてフラッシュ シリカゲルカラムに添加した（シリカゲル：５００ｍｌ）。それを、塩化メチレン／メタノール／３３％アンモニア（３／３／２）及び（３／３.５／３）の各々１リットルを用いて続けて溶離させた。溶離した生成物は、ｎ−ブタノール／エタノール／水／３３％アンモニア（２／２／２／１）を用いて、クロマトグラフィーで精製した。化合物１１の収率：２.４ｇ、（化合物９から６７％）、白色結晶。TLC：ｎ−ブタノール／エタノール／水／３３％アンモニア（２／２／２／１）、Ｒf＝０.５．ＭＳ：（Ｍ+ＮＨ3）+＝１５７２.６、計算式は、Ｃ54Ｈ88Ｎ6Ｏ40Ｐ2Ｓ、Ｍ＝１５５５.３１であった。31P−NMR(D2O)＝１５.３ ppm（環状リン酸塩）及び０.３（リン酸ジエステル）。1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲの測定値は、表１に表示してある。
【００６４】
化合物YCNの合成（図７； xii）のため、化合物７の１１.０ｇ（１１.３mmol）を、化合物１１の合成と同様にして脱保護した。化合物YCNの収率：４.５ｇ（９０％）、白色結晶。TLC：塩化メチレン／メタノール／濃縮アンモニア（３０／１５／５）、Ｒf＝０.２５．ＭＳ：（Ｍ+Ｌｉ）+＝４４８.３、計算式は、Ｃ18Ｈ27Ｎ5Ｏ6Ｓ、Ｍ＝４４１.５１であった。
【００６５】
化合物YMN−PIGの合成のため、YMN−PIGを、図２に示したものと同様な反応系列を用いて合成した。TrtCys（Trt）OHの代わりに、BocMetOHを使用して、同様な収率で、白色固体のYMN−PIGを得た。TLC：n−ブタノール／エタノール／水／３３％アンモニア（２／２／２／１）、Ｒf＝０.５．ＭＳ：（Ｍ+ＮＨ3）+＝１６００.６；計算式は、Ｃ56Ｈ92Ｎ6Ｏ40P2S、Ｍ＝１５８３.３８であった。31P−NMR(D2O)=１５.３ ppm（環状リン酸塩）及び０.３（リン酸ジエステル）。
【００６６】
放射能標識及び脂肪分解Ｇce1p(lcＧce1p)の合成
インタクトなGPIアンカーを有しているＧce1pを、ミオ−[14Ｃ]イノシトールで代謝的に標識し、そして酵素的にスフェロプラストに変換した乳酸生育の酵母細胞から精製し、原形質膜を調製した。Ｆicoll密度勾配遠心分離で精製し、β−アミドタウロコール酸塩０.３５％を用いて可溶化し、そしてTX−１１４分配付した。界面活性剤濃縮相に含まれているＧce1pを、セファデックス(Sephadex) S−300を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、Ｎ6−（２−アミノエチル）−ｃＡＭＰセファローズ(Sepharose)を用いたアフィニテイクロマトグラフィー、及びフェニルセファローズ クロマトグラフィーで精製した。カラムからの溶離は、3Ｈ−放射能をオンライン測定により測定した。部分的に精製したＧce1pを沈殿させ（ポリエチレングリコール６０００の１２％）、０.２ｍｇ蛋白質／ｍｌの濃度で緩衝液Ｇ（２５ｍＭ Ｔris／酢酸塩、ｐＨ７.４、１４４ｍＭ ＮａＣｌ，０.１％ β−アミドタウロコール酸塩、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、０.１ｍＭ ＰＭＳＦ、５μＭ ロイペプチン、１ｍＭ ヨードアセトアミド、１０μｇ／ｍｌ 大豆トリプシンインヒビター）に懸濁し、続いてＰＩ−特異的ＰＬＣ（Ｂ．Cereus）の６Ｕ／ｍｌの存在下でインキュベートした（３時間、２５℃）。２％ トライトン（Ｔriton）Ｘ−114、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１４４ｍＭ ＮａＣｌの氷冷却溶液の１０倍量を添加し相分画（３７℃で２分間インキュベーション、そして２５℃で１分間、１２,０００ｘｇで遠心分離）の後、lcＧce1pを上部の界面活性剤低濃度相から回収した。
【００６７】
下部の界面活性剤高濃度相を、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１４４ｍＭ ＮａＣｌの等量を添加して２回再抽出した後、氷上で再解凍し、続いて相分画した後、一緒にした界面活性剤低濃度相を沈殿させた（１２％ ポリエチレングリコール６０００）。
【００６８】
放射能標識したlcＧce1pを、２００〜１０００ｄｐｍ／μｌのβ−アミドタウロコール酸塩を含んでいない緩衝液中に懸濁した。
【００６９】
放射能標識したYCN−PIGの合成
放射能標識したYCN−PIGは、Ｖ８プロテアーゼ（Ｓ．aureus）及びＰＩ−ＰＬＣ（Ｂ．cereus）による連続的消化により、Gce1pから誘導した。YCN−PIGを、ＴＸ−１１４による分配後の界面活性剤低濃度層から回収し、そして陽イオン交換クロマトグラフィー（Dowex 50W−X8）、ＢioGel−P4を用いたゲル濾過、ＳＡＸ ＨＰＬＣカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、異なる溶媒系を用いたSi−60 ＨＰＴＬＣプレートによる２回の薄層クロマトグラフィー、そして最終的に、ＢioGel−P4を用いたゲル濾過により、連続的に精製した。各クロマトグラフィー分離中の溶離物は、3Ｈ−放射能、ＵＶ吸収（Ａ220）、及び、単離ラット脂肪細胞におけるグルコース輸送促進に基づくインスリン−類似活性の測定により追跡した。
【００７０】
放射化学純度の測定のため、YCN−PIGの最終標品を、グルコースオリゴマーの標準混合物の含量によるジオネックス単位（Dionex units）で補正したDionex−CarboPac PA−1陰イオン交換ＨＰＬＣ（ｐＨ１３）に供した。内部標準は、パルス電流滴定測定器を用いて測定した。14Ｃ−標識フラグメントは、レイテスト ラモナ（Raytest Ramona）オンライン放射能測定器で測定した。濃度測定には、YCN−PIGを加水分解（６Ｍ ＨＣｌ、１６時間、１１０℃）し、そして無機リンの量（２モル／分子）及びチロシンの量（１モル／分子）を測定した。乾燥したYCN−PIGを使用するまで、−８０℃で保存し、そしてその後、最終濃度が１００μＭとなるように、２ｍＭ ＤＴＴを含んでいる水中に懸濁した。
【００７１】
ラット脂肪細胞の調製及びＰＩＧ（−Ｐ）／ＹＣＮとのインキュベーション
脂肪細胞は、雄のスプラーグ ダウレイ（Sprague Dawley）ラット（１４０〜１６０ｇ、通常飼育）の副睾丸（精巣上体）の脂肪体からコラーゲン消化により単離し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，１００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン、１００ｍＭ １−メチルー２−フェニルエチルアデノシン、０.５Ｕ／ｍｌ アデノシンデアミナーゼ、０.５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、及び５ｍＭ Ｄ−グルコースを含んでいる、ＫＲＨ緩衝液（０.１４ｍＭ ＮａＣｌ，４.７ｍＭ ＫＣｌ，２.５ｍＭ ＣａＣｌ2，１.２ｍＭ ＭｇＳＯ4、１.２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２０ｍＭ ヘペス／ＫＯＨ、ｐＨ７.４）中で、ＰＩＧ（−Ｐ）／ＹＣＮ（２０ｍＭ ヘペス／ＫＯＨに溶解、ｐＨ７.４、２ｍＭ ＤＴＴ）の存在下で、３７℃、振とう湯槽中、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2の継続的通気下で、所定の時間インキュベートした。
【００７２】
ラット脂肪細胞のトリプシン／ＮａＣｌ又はＮＥＭの処理
トリプシン／ＮａＣｌ処理のため、５ｍＭ グルコースを含んでいるＫＲＨ中の脂肪細胞の懸濁液（３.５×１０6細胞／ｍｌ）の２ｍｌを、トリプシン１００μｇ／ｍｌ存在下で、インキュベートした（２０分、３０℃）。大豆トリプシンインヒビター（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ）、及び１Ｍ ＮａＣｌ及び０.５％ＢＳＡを含んでいるＫＲＨの２ｍｌを添加し、インキュベーションを継続した（１０分、２２℃）。ＮＥＭ処理のため、５ｍＭ グルコースを含んでいるＫＲＨ中の脂肪細胞懸濁液（３.５×１０6細胞／ｍｌ）の１ｍｌを、ＮＥＭ（最終濃度：１.５ｍＭ）とインキュベートし（３０分、２５℃）、そしてその後、ＤＴＴ（最終濃度：１５ｍＭ、５分間）とインキュベートした。
【００７３】
処理後、細胞を遠心分離し（１５００ｘｇ、５分間、スウィング−アウト ローター）、そして下澄液（infranatant）を吸引して除去した。残った細胞懸濁液（約０.５ｍｌ）、を０.５％ＢＳＡを含んでいるＫＲＨの１０ｍｌを補充し、再度遠心分離した（５００ｘｇ、１分間、スウィング−アウト ローター）。追加的に２回洗浄した後、最終細胞懸濁液を、０.５％ ＢＳＡ、５０μＭ グルコース、及び１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含んでいるＫＲＨで、２５ｍｌとした。その０.２ｍｌを、ＰＩＧ４１に対する機能喪失を測定するため、脂質新生を検定した。対照細胞を同様に遠心分離し、洗浄した細胞をトリプシン／ＮａＣｌの代わりに、水で処理した。[14Ｃ]ＮＥＭで脂肪細胞を放射性標識するため、細胞懸濁液を、遠心分離し（５００ｘｇ、１分間）、そして下澄液を除去した。５０μｌ毎（７×１０6細胞／ｍｌ）を総量６０μｌの２.５μＣｉ[14Ｃ]ＮＥＭと一緒にインキュベートした（１０分、３０℃）。
【００７４】
１０ｍＭ ＤＴＴの５μｌ及び１０ｍＭ グルコースを含んでいるＫＲＨの５５μｌを添加した後、上述したように、総量２００μｌ中で、トリプシン／ＮａＣｌの処理をした。
【００７５】
５０μｌ毎を、０.４ｍｌ遠心分離管中、フタル酸ジノニルを含んでいる２００μｌの油層上に注意深く積載した。遠心分離（５０００ｘｇ、１５秒間）の後、遠心分離管を油層中で切断した。遠心分離管の下部に含まれている培地の蛋白質を沈殿させ（１０％ＴＣＡ，アセトンで２回洗浄）、レムリ(Laemmli)標品緩衝液に懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００７６】
原形質膜、全細胞溶解物及びミクロソームの調製
除核後の下澄液を、単離したラット脂肪細胞から、前述したようにして調製した。原形質膜の調製のため、蛋白質１ｍｌを、３８％（ｗ／ｖ）スクロース、２５ｍＭ Tris／HCl
（ｐＨ７.４），１ｍＭ ＥＤＴＡの５ｍｌ溶液の上層に積載し、そして遠心分離した（１１０，０００ｘｇ、１時間）。
【００７７】
二層（０.５ｍｌ）間の境界面にある膜を、吸引して取り出し、ホモジナイズ緩衝液の４倍量で希釈し、そして、２８％ペルコール（Percoll）、０.２５Ｍスクロース、１ｍＭ
ＥＤＴＡ，２５ｍＭ Tris／HCl （ｐＨ７.０）の８ｍｌ溶液の上層に積載した。遠心分離（４５，０００ｘｇ、３０分）の後、原形質膜を、下層三段目の勾配（０.５ｍｌ）から、パスツールピペットで取り出し、ホモジナイズ緩衝液の１０倍量で希釈し、そして遠心分離した（２００，０００ｘｇ、９０分）。結合実験のため、洗浄したペレットを、結合用緩衝液に、１〜２ｍｇ蛋白質／ｍｌの濃度で懸濁した。
【００７８】
全細胞溶解物の調製のため、除核後の下澄液に、デオキシコール酸塩及びノニデット(Nonidet)Ｐ−４０（最終濃度：各々０.３及び０.２％）を添加して、インキュベートし（１時間、４℃）、そして遠心分離した（１１０,０００ｘｇ、１時間、４℃）。上清画分は免疫沈降法に使用した。ミクロソーム調製のため、除核後の上清画分を遠心分離した（１００,０００ｘｇ、１時間、４℃）。得られたペレットは、結合用緩衝液に、１〜２ｍｇ蛋白質／ｍｌの濃度で懸濁した。
【００７９】
hcDIGs／lcDIGsの調製
精製した原形質膜のペレット（０.５〜１ｍｇ）を、５０ｍＭ ＮａＦ，５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１０μＭ オカダ酸、１ｍＭ 正バナジン酸ナトリウム、２０μＭ ロイペプチン、５μＭ ペプスタチン、１μＭ アプロチニン、５ｍＭ ヨード酢酸塩、２００μＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる、氷冷却の０.５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ１１）に懸濁し、そしてインキュベートした（１時間、４℃、ボルテックス(vortex)による振動及びピペトでの吸引を繰り返しつつ）。その後、懸濁液を、１５ｍＭ ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６.５）、７５ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる８５％スクロース溶液の等量と混合した。
【００８０】
同様の培地の各々４２.５、３５、２８、２２、１５及び５％のスクロース溶液の１.５ｍｌの上層に積載し、そして遠心分離した（２３０,０００ｘｇ、Beckman SW41 ローター、１８時間）。１５〜２２％（画分４及び５）及び２８〜３５％（画分８及び９）スクロースの境界面における、羊毛状物質の光分散の乳白色を発するバンド、並びに４２.５％クッションの物質（画分１２−１５）を、それぞれ、hcDIGs、lcDIGs及び可溶化した原形質膜の蛋白質として、１９−ゲージの針及びシリンジを用いて集めた（画分当たり、０.７５ｍｌ）。密度は、画分の比旋光度を測定して求めた。hc／lcDIGsは、前述したように、適切なマーカーの増加／減少により、特徴付けられる。結合実験のため、hc／lcDIGsを、結合懸濁液（１５ｍＭ Ｍｅｓ／ＫＯＨ、ｐＨ６.５、０.２５Ｍ スクロース、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビター）に懸濁した。
【００８１】
放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧ又はlcGce1p のサブセルラー画分との結合
放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧ又はlcＧce1pの１０μｌ（６０,０００〜８０,０００dpm／nmol、最終濃度：５μＭ）を、非標識の競合物質（図の説明において指摘）の存在下又は非存在下で、原形質膜、ミクロソーム又はhc／lcDIGs（蛋白質：４０〜８０μｇ）を懸濁した結合用緩衝液の４０μｌに添加し、総量を１００μｌとして、インキュベートした（３０分、４℃）。インキュベーション培地から原形質膜を分離するため、４５μｌを、原形質膜／ミクロソームの場合は、フタル酸ジブチル及びフタル酸ジオクチル（１／１容積比、最終密度１.０１２）、又は、０.４ｍｌ前冷却（４℃）遠心分離管（ミクロチューブ番号：７２.７００、Sarstedt, Germany）中のhc／lcDIGsの場合は、フタル酸ジブチル及びフタル酸ジノニル（１／９容積比、最終密度９.８６３）を含んでいる、２００μｌの油層上に、注意深く積載した。
【００８２】
遠心分離（４８,０００ｘｇ、２分）の後、蓋で密閉してある遠心分離管の蓋をはずしてから、油層で切り取り、それぞれ、原形質膜／ミクロソームのペレット、及びhc／lcDIGsの上清画分を含んでいる（蓋をはずした）遠心分離管の下部及び上部を（それは油層中に浸透しているか或いは浸透していないが）、１０％ＳＤＳの１ｍｌを含んでいるシンチレーション管（１０ｍｌ）に移した。激しく振とうした後（１６時間、２５℃）、放射能をＡＣＳII シンチレーション溶媒(Beckman) の９ｍｌ中で測定した。これらの条件下では、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧ及びlcＧce1pの管壁に付着した及び油層中に拡散したものは、５０〜１２０dpmであり（即ち、インキュベーションに用いた全放射能の０.５％以下）、それ故、結合データの計算には、考慮しないこととした。
【００８３】
蛋白質測定の結果、原形質膜及びミクロソームの典型的な回収は、それぞれ７８〜８５％、及び６５〜８０％であり、hcDIGs及びlcDIGsでは、それぞれ８３〜９２％、及び７０〜７８％であった。
【００８４】
ＰＩＧ（−Ｐ）の化学合成
親水性ＧＰＩ構造は、次の二つの実験的アプローチによる天然の材料から調製される：(ｉ)ＧＰＩ特異的なＰＬＣ／Ｄによる、遊離ＧＰＩ脂質から、極性コアグリカン頭残基として、放出されたＰＩＧで、それ故、如何なるアミノ酸をも欠損する。及び、(ii)脂質分解及び蛋白質分解の組合わせにより、残存するＧＰＩ蛋白質のカルボキシ末端に由来する一つ又はそれ以上のアミノ酸と一緒になった極性コアグリカン頭残基を生成する、ＧＰＩ蛋白質から生ずるＰＩＧ−Ｐ。
【００８５】
ＧＰＩ脂質及びＧＰＩ蛋白質は、真核細胞の原形質膜の外側層に、酵母からヒトに至るまで保存されているコアグリカン頭残基と一緒に存在している。ＧＰＩコアグリカン頭残基の結合を検定するため、放射能標識した純粋なＰＩＧ（−Ｐ）構造の合成は、「Muller
et al., Endocrinology 138, 3459−3475, 1997」に記載されているような、既に公開さ
れている方法を用いた。即ち、ＹＣＮ−ＰＩＧは、ミオ[14Ｃ]イノシトールで代謝的に標識した酵母Ｓ．セレビシア(S.cerevisiae）由来の、原形質膜の放射化学的に純粋なＧＰＩ蛋白質、Ｇce1pから、In vitroにおける連続的な蛋白質分解及び脂質分解により調製した。
【００８６】
結合の構造−活性相関関係の検定には、化学的に合成したＹＣＮ−ＰＩＧ及びそれらの誘導体を使用した（図１：ＹＣＮ−ＰＩＧ；図２：ＹＭＮ−ＰＩＧ；図３：ＰＩＧ３７；図４：ＹＣＮ）。
【００８７】
ＹＣＮ−ＰＩＧのトリペプチドの合成は、ペプチド合成の技術常識的手段で行なった。ヘキササッカライドは、「Frick et al., Biochemistry 37, 13421−13436; 1998」に記載されている、トリクロロアセトイミド法を用いて合成した。ＰＩＧ−Ｐの合成における重要な工程は、ホスホジエステル結合の形成であることが明らかとなった。実験した種々の方法のうち、Ｈ−ホスホネート法が、最も良い収率で合成することが分かった。
【００８８】
最終化合物の保護基脱離は、システイン（パラジウムで水素化されない）及び酸不安定な環状リン酸塩の存在で強化した、液体アンモニア中のナトリウムで行なった。全化合物について、質量分析、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、及び、31Ｐ−ＮＭＲ分光法を用いて特性決定をした。
【００８９】
hcDIGsに特異的に結合するＰＩＧ（−Ｐ）
賦活化されていない脂肪細胞から勾配遠心分離により調製した全原形質膜を、原形質膜の特異的マーカー酵素を標識として濃縮した（全細胞溶解物との比較）。ウアバイン(ouabain) 感受性ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ（ナトリウム／カリウム−ＡＴＰアーゼ（Ｎａ+／Ｋ+−ＡＴＰase）の触媒サブユニットに対応）を９.５倍に濃縮し、及び、Ｎｕｃに対して１.９倍（酵素活性に基づき）、β1−インテグリンに対して１３.９倍、シンタキシン−１(syntaxin−1)に対して１６.４倍（免疫ブロット法（immunoblotting)に基づき）、及びＧce1に対して７.８倍（フォトアフィニテイ標識に基づき）濃縮した。
【００９０】
同時に、原形質膜調製は、筋小胞体マーカー、ＥＧＴＡ感受性Ｃａ2+−アデノシントリホスファターゼに対しては５.７倍、エンドソームマーカー、ＳＣＡＭＰ（分泌担体膜蛋白質(Secretary Carrier Membrane Protein)）３７／３９に対しては８.５倍、及びＧＬＵＴ４（グルコーストランスポーター４）に対しては１６.９倍（免疫ブロット法（immunoblotting)に基づき）減少した（全細胞溶解物との比較）。
【００９１】
賦活化されていない脂肪細胞由来のミクロソームは、全細胞溶解物に比較して、ＧＬＵＴ４に対しては１４.４倍、ＳＣＡＭＰ３７／３９に対しては８.５倍、トランスフェリン受容体に対しては６.９倍、及びＩＧＦIIに対しては９.７倍濃縮し、また、全細胞溶解物に比較して、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼに対しては２４.６倍、Ｇce1に対しては１２.５倍、Ｎｕｃに対しては１５.８倍、β1−インテグリンに対しては３９.５倍、及び、シンタキシン−１(syntaxin−1)に対しては４８.５倍（免疫ブロット法（immunoblotting)に基づき）、及び、Ｃａ2+−感受性アデノシントリホスファターゼ活性に対しては１９.９倍減少した。このことより、この画分は、基本的に、小胞体及びエンドソーム構造を含んでいるものであり、そして事実上、原形質膜及び筋小胞体フラグメントを含んでいないことを示唆している。
【００９２】
hcDIGs及びlcDIGsは、賦活化されていない脂肪細胞から、０.５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ１１）には不溶解で、かつ蔗糖密度勾配遠心分離においては低容積密度であることに基づいて調製した。それらは、（全原形質膜と比較して）、ＧＬＵＴ４及びインスリン受容体β−サブユニットの活性減少によって特徴づけられる。lcDIGsと比較した場合、hcDIGsの方が、カベオリン(caveolin)、ｐｐ５９Lyn、及びＧce1に対して、有意義により高い増加を示すことによって、hcDIGsとlcDIGsは、互いに相異することが分かった。
【００９３】
単離したサブセルラー膜画分は、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧの段階的増加量でインキュベートし、そしてインキュベーションは、適当な密度の油層遠心分離により、インキュベーション培地から急速に分離することによって終了させた。
【００９４】
膜結合のＹＣＮ−ＰＩＧは、主に濃度依存性及び飽和性の態様としてのhcDIGsから、そして、微量には、lcDIGsから回収したが、そこにおいては、原形質膜及びミクロソームは実際には放射能標識はされていなかった（図５）。直線の範囲では、hcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧの非特異的結合は、無標識の合成ＹＣＮ−ＰＩＧ又は他の競合化合物の５００倍過剰量の存在により検定した結果、２０％以下であった（図５）。以下の実験は、結合の直線範囲の末端に対応するＹＣＮ−ＰＩＧ濃度を用いて行なった。
【００９５】
密度に基づくよりは沈降に基づく急速な濾過及び遠心分離のような、受容体−リガンド相互作用の測定の他の方法は、いかなる脂肪細胞膜の細胞画分に対するＹＣＮ−ＰＩＧの特異的結合の測定についても失敗したが（データは未表示）、それは多分に、培地結合の親和性及び／又は高い解離乗数によるものと思われる。ＹＣＮ−ＰＩＧに対するスカッチャード プロット分析の結果、hcDIGsの蛋白質１ｍｇ当たり、Ｋdは、５０〜５００ｎＭの範囲、Ｂmaxは、５０〜２００ｐmolの範囲であった。hcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧの特異的結合は、ペプチジルエタノールアミジン残基の欠損によるペプチド変異体、ＹＣＮ−ＰＩＧ及びＰＩＧ３７の活性の有意義な減少、並びに、競合検定におけるペプチジルエタノールアミジン残基、ＹＣＮ単独の極度に低い活性によって実証された（図６）。
【００９６】
無標識ＹＣＮとＰＩＧ３７の組合せ（等モル比）は、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧのhcDIGsに対する結合を、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧよりわずかに低効果で、及び、ＰＩＧ又はペプチジルエタノールアミジン残基単独、及びＹＭＮ−ＰＩＧより強力に、置換した。この事実より、ＰＩＧとペプチジルエタノールアミジン残基の同時かつ相乗的認識が実証された。ＹＣＮとＰＩＧ３７とを組合せた競合のＩＣ50は、共有結合のＹＣＮ−ＰＩＧに比較して、３から４倍ほど高いものであった（図６）。次に、同定されたＰＩＧ（−Ｐ）の結合部位が、蛋白質様の性質を示すか否かを調べた。
【００９７】
hcDIGsを、トリプシン／ＮaＣl 又はＮＥＭで前処理した後、無標識の合成ＹＣＮ−ＰＩＧの過剰量の存在下又は非存在下において、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧの段階的増加量でインキュベートした（非特異的結合を調べるため）。トリプシン及び０.５ＭのＮaＣlの継続処理、又はＮＥＭの処理により、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧのhcDIGsに対する特異的結合は、完全に停止したが、一方、トリプシン又はＮaＣl単独、或いは、ＤＴＴ存在下でのＮＥＭ処理では、有意義な影響はみられなかった（図７）。
【００９８】
同様な不活性化が、lcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧの、低親和性相互作用においても観察された。これらの結果から、脂肪細胞表面のDIGsにおけるＰＩＧ（−Ｐ）に対する、トリプシン／ＮaＣl及びＮＥＭ感受性の結合蛋白質の存在が実証された。lcDIGsに比較して、ＹＣＮ−ＰＩＧのhcDIGsに対するより好適な結合は、ｍ−βＣＤを使用した脂肪細胞の原形質膜のコレステロール減少過程における変換、及びそれに続く、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧのhc／lcDIGsに対する特異的結合の分析により確認された。対照脂肪細胞においては、２０％がlcDIGsに結合して残留したものの、ＹＣＮ−ＰＩＧの大部分は、hcDIGsと一緒に回収された（図８）。
【００９９】
しかしながら、インタクトなラット脂肪細胞のｍ−βＣＤ（１〜１０ｍＭ）処理により、lcDIGsとの結合が増加するのに伴い、hcDIGsに結合するＹＣＮ−ＰＩＧの量が濃度依存的に減少することが明らかとなった。
【０１００】
コレステロール減少後で、しかしDIGsの調製前において、脂肪細胞をトリプシン／ＮaＣl 又はＮＥＭで処理した場合、hcDIGs及びlcDIGs双方に対するＹＣＮ−ＰＩＧの特異的結合は有意義に減少した（データは未表示）。これらの事実から、ラット脂肪細胞のhcDIGsにおけるＰＩＧ（−Ｐ）受容体の有利な位置の形成は、コレステロールに極めて強く依存していることが実証された。
【０１０１】
hcDIGsに特異的に結合するＧＰＩ蛋白質の脂質分解
ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、及びＰＩＧ３７のＰＩＧ残基、−ＮＨ−(ＣＨ2)2−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）Ｏ−６Ｍanα１(Ｍanα１−２）−２Ｍanα1−６Ｍanα１−４ＧluＮ１−６Ino−１,２−(サイクリック)−リン酸塩（図１、２及び３）は、全ての真核細胞ＧＰＩ蛋白質の極性コアグリカン頭残基と同一であった。その結果、ＰＩＧ−Ｐの蛋白質結合部位が、lcGPI蛋白質と相互作用するか否か、即ち、ＧＰＩ蛋白質の完全なポリペプチド部分に接触したときに、ＰＩＧ（−Ｐ）残基を認識するか否かについて調べることとした。
【０１０２】
放射能標識したlcGPI蛋白質を得るために、代謝的に標識したＳ．セレビシエ(S.cerevisiae）細胞由来のＧce1pを、ＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus）で処理し、そして、親水的分解産物を精製して、放射化学的に均一なものを得た。ＰＩＧ（−Ｐ）に用いたのと同様の油層遠心分離法の実験の結果、lcDIGsと比較した場合、１１から１５倍もより効率的に、hcDIGsとの濃度依存性及び飽和性の態様において、lcＧce1pは、単離したラット脂肪細胞由来のDIGsと結合することが分かった。
【０１０３】
２００倍モル過剰の無標識lcＧce1pの存在下における非特異的結合は、lcＧce1pの非飽和濃度でDIGsを用いて回収した全lcＧce1pの１５％未満であった。スカッチャード プロット分析の結果、hcDIGsに結合するlcＧce1pのＫdは、hcDIGsの１ｍｇ蛋白質当たり、０.１〜１μＭであり、Ｂmaxは、７０〜２００pmolであった。一方、全ての原形質膜及びミクロソームは、lcＧce1pの特異的結合を示さなかった。このように、脂肪細胞原形質膜のhcDIGsは、明らかに酵母由来のlcＧce1pの特異的結合部位を保持していることが分かった。
【０１０４】
そこで更に、同様なＫd及びＢmax値により指摘されるように、ＰＩＧ（−Ｐ）及びlcＧＰＩ蛋白質に対する結合部位の同定の分析のため、hcDIGsにおけるlcＧce1pの結合部位に対する合成ＰＩＧ（−Ｐ）化合物の相対的な親和性を、競合的研究において比較した（図９）。
【０１０５】
放射能標識したlcＧce1pのhcDIGsに対する結合が、標識した合成ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、及びＹＣＮプラスＰＩＧ３７の過剰（５００倍以上）により、結合した全lcＧce1pの７５％以上も置換することより、lcＧce1pとhcDIGsの特異的相互作用が確認された。ＰＩＧ３７およびＹＣＮとのlcＧce1pの結合の競合性は、かなり効率が低かった。hcDIGsからlcＧce1pに置換する見かけ上のＩＣ50に影響を与える、異なるＰＩＧ（−Ｐ）の相対的ランキングは、ＹＣＮ−ＰＩＧ＞ＹＣＮ＋ＰＩＧ３７＞ＹＭＮ−ＰＩＧ＞ＰＩＧ３７＞ＹＣＮの順であり、これは、ＹＣＮ−ＰＩＧ結合に対する影響の相対的ランキングと同一であった（図６）。
【０１０６】
更に、この見かけ上のＩＣ50は、lcＧce1pとＹＣＮ−ＰＩＧとの競合的結合にも極めてよく似ており、両者の場合、同一の決定基が認識され、そしてＧＰＩ蛋白質の他の蛋白質残基（カルボキシ末端のトリペプチジルエタノールアミジン残基を除いて）は、結合に寄与していないことが分かった。
【０１０７】
次に、インタクトなラット脂肪細胞のトリプシン／ＮaＣl 及びＮＥＭ処理に対する、lcＧce1pとhcDIGsとの相互作用の感受性について、放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧの結合を殆ど完全に破壊するような条件下で調べた（図７）。
【０１０８】
トリプシン／ＮaＣl 及びＮＥＭ処理の脂肪細胞からのhcDIGsは、放射能標識lcＧce1ｐとの親和性を示した。非標識ＹＣＮ−ＰＩＧの５００倍過剰の存在下における非特異的結合（無処理の対照細胞由来のhcDIGsから回収した全Ｇce1pの約３０％）を超えるものではなかった（図１０）。
【０１０９】
これとは対照的に、過剰のＤＴＴの存在下（図１０）又は、トリプシン又はＮaＣl単独（データは未表示）でのＮＥＭと脂肪細胞のインキュベーションは、放射能標識したlcＧce1pの結合も、そしてその３μＭ ＹＣＮ＋ＰＩＧ３７、５μＭ ＰＩＧ３７、及び１０μＭ ＹＣＮによる競合も、無処理の細胞に比較して減少しなかった。これらを総合して考えると、脂肪細胞の原形質膜のhcDIGsにおける局在、絶対的又は相対的親和性（構造的誘導体に対する）、発現レベル、トリプシン／ＮaＣl 及びＮＥＭに対する感受性を考慮した場合、ＹＣＮ−ＰＩＧ及びlcＧce1pの特異的結合部位は、極めてよく似た特徴を示していることが分かった。
【０１１０】
ＰＩＧ（−Ｐ）及びlcＧＰＩ蛋白質の受容体に対する内因性リガンド
ＰＩＧ（−Ｐ）及びlcＧＰＩ蛋白質に対する表面上同一の結合部位の生理的リガンドの候補物は、無破壊のＧＰＩ構造、即ち、ＧＰＩ脂質及び／又はＧＰＩ蛋白質アンカーである。この可能性を実証するために、受容体と相互作用をし、それ故に、ＹＣＮ−ＰＩＧ／lcＧce1pの結合部位を隠蔽する内因性ＧＰＩ分子と推定されるものを特異的に除去するため、hcDIGsの調製前に、単離したラット脂肪細胞を、種々のＧＰＩ特異的なＰＬで処理し、そして続いて塩洗浄（０.５Ｍ ＮａＣｌ）をした。
【０１１１】
ラット脂肪細胞を段階的増加量のＢ．セレウス(B. cereus）由来のＰＩ特異的ＰＬＣ又はヒト血清由来のＧＰＩ特異的ＰＬＤとインキュベートした結果、特異的にhcDIGsに結合する放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧ及びＧce1pの量が、濃度依存的に増加した（図１１）。平行実験により、脂質消化の効果は、hcDIGsからのＧce1p及びNｕｃの喪失によって実証された。
【０１１２】
hcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧ又はlcＧce1pの結合が、それぞれ２００及び２６０％増加したのに相関して、それぞれ７５及び６５％の喪失であった。ＧＰＩ分解の特異性は、ＰＣ特異的なＰＬＣ(B. cereus）及びキャベツ由来のＰＬＤ（ＧＰＩ構造に作用しない）が、hcDIGsからＧce1及びNucを有意に置換すること、及び、hcDIGsに対するＹＣＮ−ＰＩＧ（lcＧce1p）結合を促進することを、完全に喪失したことによって実証された（図１１、１２）。
【０１１３】
脂肪細胞から調製したＰＩ特異的なＰＬＣ由来のhcDIGsに対する特異的結合（非特異的結合には、有意義な変化はなかった。）のスカッチャード プロット分析の結果、放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧ／lcＧce1pの親和性増加は、主に、Ｋdは殆ど変化せずに、Ｂmaxが２から３倍ほど高くなったことによるものであることが分かった。これらの事実から、単離したラット脂肪細胞の基底状態のhcDIGsにおける、ＰＩＧ（−Ｐ）又はlcＧＰＩ蛋白質に対する結合部位の約５０％が、（Ｇ）ＰＩ特異的ＰＬＣ／Ｄによって分解される内因性ＧＰＩ構造によって、占められたことによるものであることが分かった。
【０１１４】
特に顕著には、ラット脂肪細胞のＧＰＩ特異的ＰＬＣ／Ｄの処理が、hcDIGsにおけるＧce1p及びNucの量を、ある一定の程度、緩和にしかし有意義に減少させるという効果を、
生理的濃度のインスリンが示した（模倣した）ことである。インスリンにより誘導された、hcDIGsからのＧＰＩ蛋白質の喪失が、ＹＣＮ−ＰＩＧ又はlcＧce1pの結合能力を顕著に増大する方に導いたことによるものである（図１１、１２）。
【０１１５】
更に、ＰＩＧ（−Ｐ）及びlcＧＰＩ蛋白質の受容体が、ＣＩＲと呼ばれる、トリプシン／ＮaＣl及びＮＥＭ感受性の１１５ｋDa蛋白質と同一であることが実証された。
【０１１６】
受容体に対するＰＩＧ−Ｐの結合は、後続するＮＥＭによる共有結合の変化及び／又はトリプシン／NaClによる脂肪細胞表面からの切断と放出への接近可能性（accessibility）に影響を与える。
【０１１７】
ラット脂肪細胞をＰＩＧ（−Ｐ）とインキュベートし、続いて、[14Ｃ]ＮＥＭ標識、及びトリプシン／NaCl処理に供した。
【０１１８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる放射能標識ポリペプチドの放出の分析、及び蛍光像(phoshorimage)（図１３）により、[14Ｃ]ＮＥＭによる１１５kDaポリペプチドの乗換え、及び／又はトリプシン／NaCl処理後の脂肪細胞の下澄からの回収が、ＰＩＧ（−Ｐ）により減少することが明らかとなった。
【０１１９】
その減少は、対照細胞と比較して、３μＭにおけるＹＣＮ−ＰＩＧ及びＰＩＧ３７、及び３０μＭにおけるＹＣＮでは、それぞれ８３、６５及び２８％であった。この蛋白質は、トリプシン／NaCl処理により原形質膜から遊離した主要なＮＥＭ標識成分であるが、しかしながら、個々の処理によるものではなく（図１３）、そしてそれはＣＩＲと同一であった。
【０１２０】
内因性リガンド（例えば、ＧＰＩ蛋白質）の存在、及び脂質分解による対応する結合部位からの除去（図１１、１２参照）、の実験事実と一致して、外因性ＰＩ特異的ＰＬＣ(B. cereus）又はインスリンによる脂肪細胞の処理は、微少ではあるが、再現性をもって、[14C]ＮＥＭ標識ＣＩＲのトリプシン／NaCl処理依存性の遊離を、それぞれ、３０及び２０％促進した（図１３）。
【０１２１】
トリプシン／NaCl処理、トリプシン処理、NaCl処理による脂肪細胞表面からのＣＩＲの遊離の相対的比率（１００／２０／１０）が、対照、ＰＩＧ（−Ｐ）賦活細胞、及びＰＬＣ／インスリン処理細胞と概略平行であったことより、hcDIGsに対するＰＩＧ（−Ｐ）及び外因性ＧＰＩリガンドの結合が、トリプシン分解よりは、ＮＥＭによるＣＩＲの標識を減少したものと思われる。これは、脂肪細胞の原形質膜のhcDIGsにおける、リガンドとＰＩＧ（−Ｐ）受容体との相互作用により生じたＣＩＲ中の立体配座の変化によるものであると思われる。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
図のリスト
図１：ＰＩＧ合成の全体図、パート１
図２：ＰＩＧ合成の全体図、パート２
図３：ＰＩＧ合成の全体図、パート３
図４：ＹＣＮ−ＰＩＧの合成、パート１
図５：ＹＣＮ−ＰＩＧの合成、パート２
図６：ＹＣＮ−ＰＩＧの合成、パート３
図７：ＹＣＮの合成
図８：ＹＣＮ−ＰＩＧの化学式
図９：ＹＭＮ−ＰＩＧの化学式
図１０：ＰＩＧ３７の化学式
図１１：ＹＣＮの化学式
【０１２５】
図１２：ｈｃＤＩＧｓに対するＰＩＧ（−Ｐ）の特異的結合。
Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から単離した放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧの段階的増加量を、ｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）、ｌｃＤＩＧｓ（６.５μｇ）、原形質膜（４７.５μｇ）、及び単離したラットの脂肪細胞由来のミクロソーム（６８μｇ）と一緒にインキュベートした（１時間、４℃）。膜画分／ＤＩＧｓを、油層遠心分離に掛け、油層上部／沈殿相から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。特異的結合は、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの１０μＭの存在下及び非存在下で測定した放射能の差異として計算した。各点は、少なくとも４つの異なる膜標品を用いた３連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１２６】
図１３：ｈｃＤＩＧｓに対するＰＩＧ−Ｐの特異的結合。
放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧ（１８,０００〜２２,０００dpm）を、段階的増加量の無標識ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＣＮ+ＰＩＧ３７、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７及びＹＣＮ（競合）の存在下及び非存在下で、ｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）と一緒にインキュベートした（１時間、４℃）。膜画分／ＤＩＧｓを、油層遠心分離に掛け、油層上部／沈殿相から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。
【０１２７】
図１４：ｈｃＤＩＧｓにおけるＰＩＧ−Ｐの結合部位の特性決定
Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から単離した放射能標識ＹＣＮ−ＰＩＧの増加する量を、単離したラットの脂肪細胞由来のｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）で、トリプシン／ＮａＣｌ，トリプシン、ＮＥＭ＋ＤＴＴ，ＮａＣｌ若しくはＮＥＭで前処理をしたもの、又は無処理のもの（対照）と一緒にインキュベートした（１時間、４℃）。ＤＩＧｓを、油層遠心分離に掛け、油層上部から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。特異的結合は、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの１０μＭの存在下及び非存在下で測定した放射能の差異として計算した。各点は、少なくとも３つの異なる脂肪細胞前処理を用いた３連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１２８】
図１５：ｈｃＤＩＧｓにおけるＰＩＧ−Ｐの結合部位の特性決定
放射能標識したＹＣＮ−ＰＩＧ（１２,０００〜１８,０００dpm）を、（正比例）量のｈｃＤＩＧｓ、及び単離したラットの脂肪細胞から調製したｈｃＤＩＧｓで、段階的増加量のｍ−βＣＤで前処理（５０分、３０℃）したもの、又は無処理のものと一緒にインキュベートした（１時間、４℃）。ＤＩＧｓを、油層遠心分離に掛け、油層上部から回収し、溶解し、そして無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの１０μＭの存在下及び非存在下で放射能を測定した。各点は、少なくとも３つの異なる脂肪細胞前処理を用いた３連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１２９】
図１６：ｈｃＤＩＧｓに対するｌｃＧｃｅ１ｐの特異的結合。
Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から単離し、そしてＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus）で処理をした放射能標識Ｇｃｅ１ｐを、無処理のラットの脂肪細胞から単離したｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）と一緒に、無標識ＰＩＧ−Ｐの存在下及び非存在下で、インキュベートした（１時間、４℃）。ｈｃＤＩＧｓを油層遠心分離にかけ、溶解し、そして放射能を測定した。各点は、少なくとも３つの異なるｈｃＤＩＧ標品を、それぞれ独立に脂肪細胞前処理をしたものを用いた４連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１３０】
図１７：ｈｃＤＩＧｓに対するｌｃＧｃｅ１ｐの特異的結合。
Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から単離し、そしてＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus
）で処理をした放射能標識Ｇｃｅ１ｐを、トリプシン／ＮａＣｌ、ＮＥＭ、ＮＥＭ＋ＤＴＴで前処理した、又は無処理の（対照）脂肪細胞から単離し、ｈｃＤＩＧｓ（６.５μｇ蛋白質）と一緒に、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧ（最終濃度：３μＭ）、ＹＣＮ＋ＰＩＧ３７（３μＭ）、ＰＩＧ３７（５μＭ）及びＹＣＮ（１０μＭ）の存在下及び非存在下でインキュベートした（１時間、４℃）。ｈｃＤＩＧｓを油層遠心分離にかけ、溶解し、そして放射能を測定した。各点は、少なくとも３つの異なるｈｃＤＩＧ標品を、それぞれ独立に脂肪細胞前処理をしたものを用いた、４連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１３１】
図１８：脂肪細胞のＰＬ及びインスリン処理によるＹＣＮ−ＰＩＧ及びｌｃＧｃｅ１ｐのｈｃＤＩＧｓへの結合に対する効果。
単離したラットの脂肪細胞（７×１０7細胞／ｍｌ）を、ＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus）、ＰＣ特異的ＰＬＣ（B. cereus）、ＧＰＩ特異的ＰＬＤ（ヒト血清）若しくはＰＬＤ（キャベツ）又はヒトインスリンの指摘量を、全容量２ｍｌとし、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2中、低速回転でインキュベートした（３０分、３０℃）。
１ＭのＮａＣｌを２ｍｌ添加後に、脂肪細胞を浮揚させて洗浄した。ｈｃＤＩＧｓを単離し、そしてその６.５μｇを、Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から調製した放射能標識ｌｃＧｃｅ１ｐ及びＹＣＮ−ＰＩＧ（１５,０００〜２５,０００dpm）と一緒に、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧ（最終濃度：１０μＭ）の存在下及び非存在下で、インキュベートし（１時間、４℃）、油層遠心分離に掛け、油層上部から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。特異的結合は、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧの存在下及び非存在下で測定した放射能の差異として計算した。
各点は、少なくとも２つの異なるｈｃＤＩＧｓ標品を用いた３連のインキュベーションの平均値±ＳＤを表示している。
【０１３２】
図１９：脂肪細胞のＰＬ及びインスリン処理によるＹＣＮ−ＰＩＧ及びｌｃＧｃｅ１ｐのｈｃＤＩＧｓへの結合に対する効果。
単離したラットの脂肪細胞（７×１０7細胞／ｍｌ）を、ＰＩ特異的ＰＬＣ（B. cereus）、ＰＣ特異的ＰＬＣ（B. cereus）、ＧＰＩ特異的ＰＬＤ（ヒト血清）若しくはＰＬＤ（キャベツ）又はヒトインスリンの指摘量を、全容量２ｍｌとし、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2中、低速回転でインキュベートした（３０分、３０℃）。
１ＭのＮａＣｌを２ｍｌ添加後に、脂肪細胞を浮揚させて洗浄した。ｈｃＤＩＧｓを単離し、そしてその６.５μｇを、Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae）から調製した放射能標識ｌｃＧｃｅ１ｐ及びＹＣＮ−ＰＩＧ（１５,０００〜２５,０００dpm）と一緒に、無標識ＹＣＮ−ＰＩＧ（最終濃度：１０μＭ）の存在下及び非存在下でインキュベートし（１時間、４℃）、油層遠心分離に掛け、油層上部から回収し、溶解し、そして放射能を測定した。
【０１３３】
図２０：ＣＩＲのＮＥＭ−標識におけるＰＩＧ（−Ｐ）、ＰＩ特異的ＰＬＣ及びインスリンの効果。
単離したラットの脂肪細胞を、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＣＮ、ＰＩ−ＰＬＣ（B. cereus）又はインスリンを指摘濃度でインキュベートし（３０分、３７℃）、そして[14Ｃ]−ＮＥＭで標識した。トリプシン／ＮａＣｌで指摘したように処理した後に、脂肪細胞を油層遠心分離に掛け、インキュベーション培地から単離した。蛋白質は、その培地（油層下部）から回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで再可溶化した。
【０１３４】
蛍光像(phoshorimage)は、同様な結果を示す３連の典型的な実験からのものを表示している。４つの異なる脂肪細胞のインキュベーションの定量的検定は、トリプシン／ＮａＣｌで処理した対照細胞から遊離したＣＩＲの量を１００とする不定単位（平均値±ＳＤ）で与えられる３連の測定値として表示している。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】ＰＩＧ合成の全体図（パート１）を示す。
【図２】ＰＩＧ合成の全体図（パート２）を示す。
【図３】ＰＩＧ合成の全体図（パート３）を示す。
【図４】ＹＣＮ−ＰＩＧの合成（パート１）を示す。
【図５】ＹＣＮ−ＰＩＧの合成（パート２）を示す。
【図６】ＹＣＮ−ＰＩＧの合成（パート３）を示す。
【図７】ＹＣＮの合成を示す。
【図８】ＹＣＮ−ＰＩＧの化学式を示す。
【図９】ＹＭＮ−ＰＩＧの化学式を示す。
【図１０】ＰＩＧ３７の化学式を示す。
【図１１】ＹＣＮの化学式を示す。
【図１２】ｈｃＤＩＧｓに対するＰＩＧ（−Ｐ）の特異的結合を示す。
【図１３】ｈｃＤＩＧｓに対するＰＩＧ−Ｐの特異的結合を示す。
【図１４】ｈｃＤＩＧｓにおけるＰＩＧ−Ｐの結合部位の特性づけを示す。
【図１５】ｈｃＤＩＧｓにおけるＰＩＧ−Ｐの結合部位の特性づけを示す。
【図１６】ｈｃＤＩＧｓに対するｌｃＧｃｅ１ｐの特異的結合を示す。
【図１７】ｈｃＤＩＧｓに対するｌｃＧｃｅ１ｐの特異的結合を示す。
【図１８】脂肪細胞のＰＬ及びインスリン処理によるＹＣＮ−ＰＩＧ及びｌｃＧｃｅ１ｐのｈｃＤＩＧｓへの結合に対する効果を示す。
【図１９】脂肪細胞のＰＬ及びインスリン処理によるＹＣＮ−ＰＩＧ及びｌｃＧｃｅ１ｐのｈｃＤＩＧｓへの結合に対する効果を示す。
【図２０】ＣＩＲのＮＥＭ−標識におけるＰＩＧ（−Ｐ）、ＰＩ特異的ＰＬＣ及びインスリンの効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドに対する特異的結合親和性を有する脂肪細胞の原形質膜由来の蛋白質であって、
(ａ) 当該蛋白質にホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが特異的に結合した後に、脂肪細胞中のインスリン受容体基質１又は２のｔｙｒリン酸化を引き起こす能力、及び
(ｂ) 当該蛋白質にホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが特異的に結合した後に、脂肪細胞中にグルコース取込みを促進する能力、
を特徴とする蛋白質。
【請求項２】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが、次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１の少なくとも一つの化合物からなるものである、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが、０.００１から１０μＭの結合定数で蛋白質に結合する、請求項１又は２に記載の蛋白質。
【請求項４】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが、０.００１から１μＭの結合定数で結合する、請求項３に記載の蛋白質。
【請求項５】
脂肪細胞がラット、マウス又はヒト起源である、請求項１〜４の何れかの項に記載の蛋白質。
【請求項６】
分子量が１１５kDaである請求項１〜５の何れかの項に記載の蛋白質。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質及び次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１の少なくとも一つの化合物から形成される複合体。
【請求項８】
(ａ) 脂肪細胞をラット、マウス又はヒト組織から用意し、
(ｂ) 上記(ａ)由来の脂肪細胞の原形質膜を単離し、
(ｃ) 高コレステロールのraftドメイン（hcDIGs）を(ｂ)の原形質膜から調製し、
(ｄ) 上記(ｃ)由来のhcDIGsをトリプシン／ＮａＣｌ溶液で処理し、
(ｅ) 上記(ｄ)由来のインキュベーション混合物を遠心分離に掛け、そして上清画分の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動）で分離し、
(ｆ) 大きさ１１５kDaの蛋白質画分をゲルから溶出し、そして場合によって、界面活性剤又は生体膜を含んでいる溶液又は懸濁液で可溶化し、
(ｇ) そして場合によって、次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選んだ一つの化合物を添加する、
請求項１〜７の何れかの項に記載の蛋白質の製法。
【請求項９】
(ａ) 請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいる細胞画分を用意し、
(ｂ) 化合物を用意し、
(ｃ) 上記(ａ)由来の細胞画分を、(ｂ)の化合物に接触させ、
(ｄ) 上記(ａ)由来の細胞画分への当該化合物の結合を測定し、
(ｅ) 上記(ｄ)から得た結果を、(ｂ)で用意された化合物と同一の化合物を、(ａ)で用意された細胞と同一種及び／又は組織特異性を有しているが、請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいない細胞画分と接触させた実験から得た結果と比較することに
より、結合特異性を推定し、
それにより、請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいない細胞画分と比較して、(ｂ)で用意された化合物のより多くの量が、当該請求項に記載の蛋白質を含んでいる細胞画分と結合した場合、より高い結合特異性を示す、
請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質に特異的に結合する化合物を同定する方法。
【請求項１０】
細胞画分が、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞から得られたことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、ヒト、マウス又はラット種起源である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞画分が、細胞の細胞膜から成る、請求項９〜１１の何れかの項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞画分が、高コレステロール含量のraftドメイン（hcDIGs）から成る、請求項９〜１２の何れかの項に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が放射能核種又は蛍光マーカーで標識されている、請求項９〜１３の何れかの項に記載の方法。
【請求項１５】
(ａ) 請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞を用意し、
(ｂ) 化合物を用意し、
(ｃ) 上記(ａ)由来の細胞を、(ｂ)で用意された化合物に接触させ、
(ｄ) 当該グルコース輸送細胞への当該化合物の結合を測定し、
(ｅ) 上記(ｄ)で得た結果を、(ｂ)で供給された化合物と同一の化合物を、(ａ)由来の細胞と同一種及び／又は組織特異性を有しているが、請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞と接触させた実験から得た結果と比較することにより、結合特異性を推定し、
それにより、当該発明の蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞と比較して、(ｂ)で用意された化合物のより多くの量が、請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞と結合した場合、より高い結合特異性を有すると示すことができる、
請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質に特異的に結合する化合物を同定する方法。
【請求項１６】
細胞が脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、ヒト、マウス又はラット種起源とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
化合物が放射能核種又は蛍光マーカーで標識されている、請求項１５〜１７の何れかの項に記載の方法。
【請求項１９】
(ａ) 請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞を用意し、
(ｂ) 請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質の天然のリガンドを用意し、
(ｃ) 化合物を用意し、
(ｄ) 上記(ａ)由来のグルコース輸送細胞を、(ｂ)のリガンド及び(ｃ)の化合物に接触させ、
(ｅ) 上記(ｄ)由来のグルコース輸送細胞によるグルコースの取込みを測定し、
それにより、(ｃ)由来の化合物がアゴニスト活性としてグルコースの取込みを促進し、そしてアンタゴニスト活性としてグルコースの取込みを阻害する、
請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方法。
【請求項２０】
天然のリガンドが次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
グルコース輸送細胞が脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞が、ヒト、マウス又はラット種起源である、請求項１９〜２１の何れかの項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項９〜２１の何れかの項に記載の方法によって同定された化合物、及び医薬品の製剤のための補助剤を含んでいる医薬品。
【請求項２４】
少なくとも一つの化合物が次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択される、請求項２３に記載の医薬品。
【請求項２５】
化合物が次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択した少なくとも一種の部分又は誘導体から成る、請求項２３に記載の医薬品。
【請求項２６】
インスリン抵抗性又は糖尿病の治療用医薬品の製造のための、請求項９〜２２の何れかの項に記載の方法により同定された、化合物の使用。
【請求項２７】
化合物が次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
化合物が次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択した少なくとも一種の部分又は誘導体から成る、請求項２６に記載の使用。
【請求項１】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドに対する特異的結合親和性を有する脂肪細胞の原形質膜由来の蛋白質であって、
(ａ) 当該蛋白質にホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが特異的に結合した後に、脂肪細胞中のインスリン受容体基質１又は２のｔｙｒリン酸化を引き起こす能力、及び
(ｂ) 当該蛋白質にホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが特異的に結合した後に、脂肪細胞中にグルコース取込みを促進する能力、
を特徴とする蛋白質。
【請求項２】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが、次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１の少なくとも一つの化合物からなるものである、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが、０.００１から１０μＭの結合定数で蛋白質に結合する、請求項１又は２に記載の蛋白質。
【請求項４】
ホスホイノシトールグリカン又はホスホイノシトールグリカン−ペプチドが、０.００１から１μＭの結合定数で結合する、請求項３に記載の蛋白質。
【請求項５】
脂肪細胞がラット、マウス又はヒト起源である、請求項１〜４の何れかの項に記載の蛋白質。
【請求項６】
分子量が１１５kDaである請求項１〜５の何れかの項に記載の蛋白質。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質及び次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１の少なくとも一つの化合物から形成される複合体。
【請求項８】
(ａ) 脂肪細胞をラット、マウス又はヒト組織から用意し、
(ｂ) 上記(ａ)由来の脂肪細胞の原形質膜を単離し、
(ｃ) 高コレステロールのraftドメイン（hcDIGs）を(ｂ)の原形質膜から調製し、
(ｄ) 上記(ｃ)由来のhcDIGsをトリプシン／ＮａＣｌ溶液で処理し、
(ｅ) 上記(ｄ)由来のインキュベーション混合物を遠心分離に掛け、そして上清画分の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動）で分離し、
(ｆ) 大きさ１１５kDaの蛋白質画分をゲルから溶出し、そして場合によって、界面活性剤又は生体膜を含んでいる溶液又は懸濁液で可溶化し、
(ｇ) そして場合によって、次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選んだ一つの化合物を添加する、
請求項１〜７の何れかの項に記載の蛋白質の製法。
【請求項９】
(ａ) 請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいる細胞画分を用意し、
(ｂ) 化合物を用意し、
(ｃ) 上記(ａ)由来の細胞画分を、(ｂ)の化合物に接触させ、
(ｄ) 上記(ａ)由来の細胞画分への当該化合物の結合を測定し、
(ｅ) 上記(ｄ)から得た結果を、(ｂ)で用意された化合物と同一の化合物を、(ａ)で用意された細胞と同一種及び／又は組織特異性を有しているが、請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいない細胞画分と接触させた実験から得た結果と比較することに
より、結合特異性を推定し、
それにより、請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいない細胞画分と比較して、(ｂ)で用意された化合物のより多くの量が、当該請求項に記載の蛋白質を含んでいる細胞画分と結合した場合、より高い結合特異性を示す、
請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質に特異的に結合する化合物を同定する方法。
【請求項１０】
細胞画分が、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞から得られたことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、ヒト、マウス又はラット種起源である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞画分が、細胞の細胞膜から成る、請求項９〜１１の何れかの項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞画分が、高コレステロール含量のraftドメイン（hcDIGs）から成る、請求項９〜１２の何れかの項に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が放射能核種又は蛍光マーカーで標識されている、請求項９〜１３の何れかの項に記載の方法。
【請求項１５】
(ａ) 請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞を用意し、
(ｂ) 化合物を用意し、
(ｃ) 上記(ａ)由来の細胞を、(ｂ)で用意された化合物に接触させ、
(ｄ) 当該グルコース輸送細胞への当該化合物の結合を測定し、
(ｅ) 上記(ｄ)で得た結果を、(ｂ)で供給された化合物と同一の化合物を、(ａ)由来の細胞と同一種及び／又は組織特異性を有しているが、請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞と接触させた実験から得た結果と比較することにより、結合特異性を推定し、
それにより、当該発明の蛋白質を含んでいないグルコース輸送細胞と比較して、(ｂ)で用意された化合物のより多くの量が、請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞と結合した場合、より高い結合特異性を有すると示すことができる、
請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質に特異的に結合する化合物を同定する方法。
【請求項１６】
細胞が脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、ヒト、マウス又はラット種起源とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
化合物が放射能核種又は蛍光マーカーで標識されている、請求項１５〜１７の何れかの項に記載の方法。
【請求項１９】
(ａ) 請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質を含んでいるグルコース輸送細胞を用意し、
(ｂ) 請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質の天然のリガンドを用意し、
(ｃ) 化合物を用意し、
(ｄ) 上記(ａ)由来のグルコース輸送細胞を、(ｂ)のリガンド及び(ｃ)の化合物に接触させ、
(ｅ) 上記(ｄ)由来のグルコース輸送細胞によるグルコースの取込みを測定し、
それにより、(ｃ)由来の化合物がアゴニスト活性としてグルコースの取込みを促進し、そしてアンタゴニスト活性としてグルコースの取込みを阻害する、
請求項１〜６の何れかの項に記載の蛋白質に対するアゴニスト又はアンタゴニストである化合物を同定する方法。
【請求項２０】
天然のリガンドが次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
グルコース輸送細胞が脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞又は肝細胞である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞が、ヒト、マウス又はラット種起源である、請求項１９〜２１の何れかの項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項９〜２１の何れかの項に記載の方法によって同定された化合物、及び医薬品の製剤のための補助剤を含んでいる医薬品。
【請求項２４】
少なくとも一つの化合物が次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択される、請求項２３に記載の医薬品。
【請求項２５】
化合物が次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択した少なくとも一種の部分又は誘導体から成る、請求項２３に記載の医薬品。
【請求項２６】
インスリン抵抗性又は糖尿病の治療用医薬品の製造のための、請求項９〜２２の何れかの項に記載の方法により同定された、化合物の使用。
【請求項２７】
化合物が次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
化合物が次の一群：ＹＣＮ−ＰＩＧ、ＹＭＮ−ＰＩＧ、ＰＩＧ３７、ＹＣＮ又はｌｃＧｃｅ１から選択した少なくとも一種の部分又は誘導体から成る、請求項２６に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００６−５１４９１６（Ｐ２００６−５１４９１６Ａ）
【公表日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１８５７６（Ｐ２００４−５１８５７６）
【出願日】平成１５年６月２６日（２００３．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００６７２５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００５３３７
【国際公開日】平成１６年１月１５日（２００４．１．１５）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年６月２６日（２００３．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００６７２５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００５３３７
【国際公開日】平成１６年１月１５日（２００４．１．１５）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
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