薬物動態が改善された四量体サイトカインをドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）技術により調製するためのモジュール法
本発明は、ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ‐ａｎｄ‐ｌｏｃｋ）技術を用いてサイトカイン‐抗体複合体を形成するための方法および組成物に関する。好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ複合体は、それぞれがＤＤＤ（ドッキング／二量体化ドメイン）部分に付加された２つのＡＤ（アンカードメイン）部分および４つのサイトカインに付加されたＩｇＧを含む。ＤＤＤ部分は、ＡＤ部分と結合する二量体を形成し、その結果、ＤＤＤとＡＤが２：１の比で結合する。当該サイトカイン‐ＭＡｂ複合体は、改善された薬物動態を示し、裸のサイトカインまたはペグ化サイトカインよりも有意に長い血中半減期を有する。当該サイトカイン‐ＭＡｂ複合体は、サイトカイン単独、抗体単独、非コンジュゲートサイトカインと抗体あるいは無関係抗体を組み込んだサイトカイン‐ＭＡｂに比べ、有意に改善されたインビトロおよびインビボ効果も示す。ＤＮＬ複合体を形成するために、他の抗体およびサイトカインおよびサイトカインが用いられてきたが、最も好ましくは、当該複合体は、４つのＩＦＮ〜α２ｂ部分とコンジュゲートした抗ＣＤ２０ＩｇＧ抗体を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００８年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／０４３，９３２号、２００８年１０月１３日に出願された同第６１／１０４，９１６号および２００８年１２月３日に出願された同第６１／１１９，５４２号の利益を主張する。本出願は、２００６年３月２８日に出願された米国特許出願第１１／３９１，５８４の分割出願であった、２００９年３月３日に出願された同第１２／３９６，９６５号；２００６年３月２４日に出願された同第１１／３８９，３５８号；２００６年６月２９日に出願された同第１１／４７８，０２１号；２００６年１２月５日に出願された第１１／６３３，７２９の分割出願であった、２００９年３月３日に出願された同第１２／３９６，６０５号；２００７年５月８日に出願された同第１１／７４５，６９２号；および２００７年１０月２６日に出願された同第１１／９２５，４０８号の一部継続出願である。これらの出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００５年４月６日に出願された米国仮特許出願第６０／６６８，６０３号；２００５年１０月２０日に出願された同第６０／７２８，２９２号；２００５年１２月１６日に出願された同第６０／７５１，１９６号、２００６年３月１４日に出願された同第６０／７８２，３３２号；２００６年５月１５日に出願された同第６０／８００，３４２号；および２００６年１１月６日に出願された同第６０／８６４，５３０号の利益を主張する。各優先出願の内容全体が、参照により本明細書で援用される。
【０００２】
本発明は、インビトロでの活性を保持しかつ増強されたインビボでの有効性を示す多量体サイトカインの設計および生成に関する。サイトカインベースのＤＤＤ部分と組換えＩｇＧとの部位特異的コンジュゲーションによりヒト化モノクローナル抗体（ＭＡｂ）に固定される四量体サイトカインを産生するために、２つの抗体重鎖がそれぞれＡＤ部分と融合されかつＤＤＤ部分の二量体が各ＡＤ部分と結合する、ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ‐ａｎｄ‐ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）法を使用する。好適な実施形態において、ヒト化抗ＣＤ２０ＭＡｂ（ｈＡ２０）をインターフェロン‐α２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）とコンジュゲートさせて、４コピーのＩＦＮα２ｂを含む２０‐２ｂＤＮＬ構築物を形成する。サイトカイン‐ＭＡｂ構築物は、様々な病態を治療するのに有用であり、腫瘍のような標的細胞に対して、親ＭＡｂ単独、サイトカイン単独、コンジュゲートされていないＭＡｂとサイトカインとの併用または対照ＭＡｂとコンジュゲートされたサイトカインよりも大きな効力を示す。
【背景技術】
【０００３】
関連技術
インターフェロン‐α（ＩＦＮα）は、癌の動物モデル（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３：４６０４‐１５）およびヒト癌患者（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎら、１９８０、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、９３：３９９‐４０６）の双方において抗腫瘍活性を有することが報告されている。ＩＦＮαは、癌遺伝子の下方制御、腫瘍抑制因子の上方制御、腫瘍表面のＭＨＣクラスIタンパク質発現の増加を介した免疫認識の増強、アポトーシスの増強および化学療法剤に対する感作を含めた、種々の直接的な抗腫瘍作用を発揮し得る（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎら、１９９４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：１１９８‐２０５；Ｍａｔａｒｒｅｓｅら、２００２、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１６０：１５０７‐２０；Ｍｅｃｃｈｉａら、２０００、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：１６７‐７９；Ｓａｂａａｗｙら、１９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、１４：１１４３‐５１；Ｔａｋａｏｋａら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ、４２４：５１６‐２３）。一部の腫瘍に対しては、ＩＦＮαは、ＳＴＡＴ１の活性化により直接的かつ強力な抗増殖性作用を有し得る（Ｇｒｉｍｌｅｙら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ、９１：３０１７‐２７）。間接的には、ＩＦＮαは、血管新生を阻害し（ＳｉｄｋｙおよびＢｏｒｄｅｎ、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７：５１５５‐６１）、宿主免疫細胞を刺激し得るが、このことは、抗腫瘍応答全体にとって重要であり得るにもかかわらず、ほとんど過小評価されてきた（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１７：３６９‐７２）。ＩＦＮαは、骨髄細胞（Ｒａｅｆｓｋｙら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５：２５０７‐１２；Ｌｕｆｔら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１９４７‐５３）、Ｔ細胞（Ｃａｒｒｅｒｏら、２００６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０３：９３３‐４０；Ｐｉｌｌｉｎｇら、１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｏｌ．，、２９：１０４１‐５０）およびＢ細胞（Ｌｅら、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１４：４６１‐７０）への作用を介した、免疫応答に対する多面的な影響を有する。自然免疫系の重要なモジュレーターとして、ＩＦＮαは、樹状細胞の急速な分化および活性化を誘導し（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６４：６８２７‐３０；Ｐａｑｕｅｔｔｅら、１９９８、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．ｂｉｏｌ．、６４：３５８‐６７；Ｓａｎｔｉｎｉら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１：１７７７‐８８）、ＮＫ細胞の細胞傷害性、遊走、サイトカイン産生および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強する（Ｂｉｒｏｎら、１９９９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７：１８９‐２２０；Ｂｒｕｎｄａら、１９８４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４４：５９７‐６０１）。
【０００４】
癌治療法としてのＩＦＮαの有望性は、主にその短い循環血中半減期および全身毒性により妨げられてきた。ペグ化形態のＩＦＮα２では、循環時間の増加が見られ、それによりその生物学的有効性が増強される（ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ、２００３、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、２：２１４‐２１；Ｏｓｂｏｒｎら、２００２、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、３０３：５４０‐８）。ＩＦＮαとモノクローナル抗体（ＭＡｂ）との融合により、腎クリアランスの減少、溶解性および安定性の向上ならびに循環血中半減期の顕著な増加を含めた、ペグ化と同様の効果をもたらすことができる。これによる直接的な臨床上の利点は、低頻度および低用量のための要件であり、治療濃度の延長を可能にする。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するＭＡｂを使用した、ＩＦＮαの腫瘍への標的化により、ＩＦＮαの全身濃度を制限すると同時に、腫瘍への付着および保持を有意に増進させ、それにより治療指数を増加させることができる。ＩＦＮαの腫瘍への集積度増加により、ＩＦＮαの直接的な抗増殖性、アポトーシス性および抗血管新生の活性を増強し、さらに抗腫瘍免疫応答を刺激しかつそれに焦点を当てることができる。実際、同系のマウスＩＦＮα分泌トランスジェニック腫瘍を用いたマウスにおける研究では、ＩＦＮαの局所的集積により誘発された免疫応答の増強が実証された（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉら、２００７、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８９：８８４‐９３）。
【０００５】
ＣＤ２０は、ＭＡｂ‐ＩＦＮαを用いたＢ細胞リンパ腫治療のための興味ある候補ＴＡＡである。リツキシマブによる抗ＣＤ２０免疫療法は、比較的毒性が低く、最も成功を収めたリンパ腫に対する治療法の１つである（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１６：２８２５‐３３）。リツキシマブは、一部の患者群において免疫原性を示す可能性があり、初回投与の注入時間がかなり長いため（Ｃｈｅｓｏｎら、２００８、ＮＥＪＭ、３５９：６１３‐２６）、より優れたＣＤ２０標的化の候補は、ヒト化ＭＡｂのベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）である（Ｓｔｅｉｎら、２００４、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１０：２８６８‐７８）。
【０００６】
現在臨床評価中のリツキシマブとＩＦＮαとの併用療法においては、リツキシマブ単独の場合よりも効果の向上が見られた（Ｋｉｍｂｙら、２００８、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ、４９：１０２‐１２；Ｓａｌｌｅｓら、２００８、Ｂｌｏｏｄ、１１２：４８２４‐３１）。これらの研究では、この併用のいくつかの利点とともに、ＩＦＮαに関連した欠点も実証されている。週１回のリツキシマブ注入に加え、患者は通常、ＩＦＮαを３回／週で数ヶ月間投与され、ＩＦＮα療法に付随する一般的な副作用である、インフルエンザ様の症状に悩まされる。そしてこのことにより、耐容量が制限される。抗ＣＤ２０ＭＡｂ‐ＩＦＮαコンジュゲートであれば、単一の薬剤をより少ない頻度と用量で投与して、副作用を制限または除去することが可能であり、はるかに優れた効果をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
インビボでの効果の改善、毒性の低下および優れた薬物動態特性を示す、改善された抗体‐サイトカインコンジュゲートが、当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法（Ｃｈａｎｇら、２００７、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１３：５５８６ｓ‐９１ｓ）を用いて調製される、サイトカインと抗体とのコンジュゲートのための方法および組成物を開示する。ドック・アンド・ロック法により、インビボ適用に適した、安定で明確なコンジュゲートが生成される。好適な実施形態において、ＤＮＬ複合体は、ＩＦＮα２ｂのようなサイトカインを４コピー含み、各サイトカインは、二量体化／ドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分に付加されている。ＤＤＤ部分は自発的に二量体化し、各ＤＤＤ二量体は、アンカードメイン（ＡＤ部分）と結合する。より好適な実施形態において、ＡＤ部分は、ＩｇＧ抗体の各重鎖の定常領域Ｃ末端に付加され、四量体のサイトカイン‐ＩｇＧ・ＤＮＬ複合体を生じる。
【０００９】
しかし、２００９年３月３日に出願された米国特許第１２／３９６，９６５号；２００６年３月２４日に出願された同第１１／３８９，３５８号；２００６年３月２８日に出願された同第１１／３９１，５８４号；２００６年６月２９日に出願された同第１１／４７８，０２１号、２００９年３月３日に出願された同第１２／３９６，６０５号、２００６年１２月５日に出願された同第１１／６３３，７２９号；および２００７年１０月２６日に出願された同第１１／９２５，４０８号（各特許の実施例の節は、参照により本明細書で援用される）に開示されるような、異なる構造および異なるサイトカイン／抗体（もしくは抗体フラグメント）比を有する他のタイプのＤＮＬ複合体が構築され、かつ本明細書で特許請求される方法および組成物の範囲内で使用され得ることを、当業者は理解するであろう。本明細書においては、便宜上、対象とするＤＮＬ構築物を、一般にサイトカイン‐ＭＡｂ構築物と称する。しかし、「ＭＡｂ」という名称は、抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を示す一般名称として使用されることを、当業者は理解する。
【００１０】
任意の既知の抗体またはその抗原結合フラグメントを、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物に組み込み得ることを、当業者はさらに理解されよう。好適な実施形態において、当該複合体は癌治療に有用であり、抗体が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合する。様々な腫瘍関連抗原が当該分野において公知であり、炭酸脱水酵素IX、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ‐ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣ ＡＭ‐６、Ｂ７、フィブロネクチンＥＤ‐Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子‐１（ＩＬＧＦ‐１）、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２５、ＩＰ‐１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ‐９５、ＮＣＡ‐９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、ＨＬＡ‐ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン‐フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ‐α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。異なる病態の抗体ベースの治療には、その他のタイプの標的抗原が有用であり、そのような別の任意の抗原を標的とする抗体を組み込んだサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物が、本明細書で特許請求される方法および組成物において使用され得る。
【００１１】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物に使用され得る抗癌抗体の例としては、ｈＲ１（抗ＩＧＦ‐１Ｒ、２００９年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／１４５，８９６号）、ｈＰＡＭ４（ａｎｔｉ‐ＭＵＣ１、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ‐９ （抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ‐ＤＲ、米国仮特許出願第１１／３６８，２９６号）、ｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡ、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡ、米国仮特許出願第１０／６７２，２７８号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ‐１、米国特許第７，２３８，７８５号）およびｈＭＮ‐３（抗ＣＥＡ、米国特許出願第１０／６７２，２７８号）が挙げられるが、これらに限定されない。引用された各特許または各特許出願の実施例の節は、参照により本明細書で援用される。ここに列記したものは限定的なものではなく、他の任意の既知の抗ＴＡＡ抗体が、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物に組み込まれ得ることを、当業者は理解されよう。
【００１２】
キメラ抗体はマウス抗体ほど強いヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しないため、キメラ抗体の使用が好ましい。ＨＡＭＡ反応誘発の可能性をさらに減少させるために、ヒト化抗体の使用がさらにより好ましい。以下で論じるように、マウスのフレームワークおよび定常領域配列と、対応するヒト抗体のフレームワークおよび定常領域配列との置換によるマウス抗体のヒト化技術は、当該分野で公知であり、多くのマウス抗癌抗体に応用されてきた。抗体のヒト化は、ヒトフレームワークの１つまたは複数のアミノ酸残基を、元のマウスフレームワーク領域配列由来の対応する残基と置換することも含み得る。以下でも論じるように、ヒト抗体の作製技術もまた公知であり、このような抗体は、本発明のサイトカイン‐ＭＡｂ構築物に組み込まれ得る。
【００１３】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物に組み込まれ得るサイトカインの例として、ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）、ＨＭＧＢ‐１（高移動度タンパク質１）、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１６、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐１９、ＩＬ‐２３、ＩＬ‐２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ‐８、ＭＣＰ‐１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＥＮＡ‐７８、ＭＣＰ‐１、ＩＰ‐１０、Ｇｒｏ‐β、エオタキシン、インターフェロン‐α、‐β、‐λ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＭＳＦ、Ｆｌｔ‐３リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＩＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびＬＩＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
ある実施形態は、少なくとも１つの治療剤または少なくとも１つの診断剤と結合した、治療または診断用のサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物コンジュゲートに関し得る。同じまたは異なるタイプの治療剤を複数有する構築物も包含される。あるいは、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を、サイトカイン‐ＭＡｂ構築物の前、同時または後に投与される少なくとも１つの治療剤との併用で投与してもよい。以下でより詳細に論じるように、放射性核種、免疫調節物質、抗血管新生剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス促進剤、光活性治療剤、細胞傷害剤、化学療法剤、毒素、その他の抗体またはその抗原結合フラグメントを非限定的に含めた当該分野で既知の任意の治療剤を、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物と併用して、または当該構築物に付加して使用してもよい。
【００１５】
サイトカイン‐ＭＡｂ複合体は、癌、自己免疫疾患、過形成、敗血症、糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、喘息およびオスラー‐ウェーバー症候群を非限定的に含めた様々な疾患または病状の治療に有用である。
【００１６】
特定の実施形態において、本明細書に開示する方法および組成物は、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、若年性糖尿病、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維性肺胞炎のような自己免疫疾患を治療するのに有用であり得る。
【００１７】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物で治療され得る癌のタイプの例として、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、神経膠腫、黒色腫、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経細胞芽腫、黒色腫、皮膚癌、肝臓癌、甲状腺髄様癌腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
さらに他の実施形態は、サイトカイン‐ＤＤＤ融合タンパク質またはＦａｂ‐ＡＤ融合タンパク質のような融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含有するベクターおよび宿主細胞ならびにサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を作製する方法に関する。
【００１９】
特に好適な実施形態は、ヒト化抗ＣＤ２０抗体（ｈＡ２０）に付加された４つのＩＦＮα２ｂグループを含むＩＦＮα‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物である、２０‐２ｂに関する。２０‐２ｂ構築物は、インビトロ増殖、エキソビボでのリンパ腫細胞減少およびインビボ治療の研究により、元の抗体単独、ＩＦＮαサイトカイン単独または非標的化ＩＦＮα‐ＭＡｂよりも優れた抗リンパ腫剤であることが見出された。２０‐２ｂ構築物は、リンパ腫、白血病、骨髄腫および関連状態の治療に特に有用である。
【００２０】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ」という用語は、文脈上明らかに単数のみを意味するものでない限り、単数または複数を指し得る。
【００２１】
本明細書において、「約」という用語は、ある数値プラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味する。例えば「約１００」であれば、９０から１１０の間の任意の数値を指す。
【００２２】
抗体は、完全長の（すなわち、天然に発生する、または通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメントの組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部位を指す。
【００２３】
抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ´、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような、抗体の一部分のことである。構造を問わず、抗体フラグメントは、インタクトな抗体により認識されるものと同じ抗原と結合する。「抗体フラグメント」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントのような可変領域からなる単離フラグメントならびに軽および重可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子も包含する。本明細書において「抗体フラグメント」という用語は、Ｆｃフラグメントまたは単一アミノ酸残基のような、抗原結合活性をもたない抗体の部分は包含しない。
【００２４】
抗体融合タンパク質という用語は、同一のまたは異なる特異性を有する、同一のまたは異なる一本鎖抗体または抗体フラグメントのセグメントが１つまたは複数結合した、組換えにより産生される抗原結合分子を指し得る。融合タンパク質の結合価、すなわち一価、二価、三価または多価は、その融合タンパク質が単一の抗原またはエピトープに対する結合腕または結合部位をいくつ有するかを示す。抗体融合タンパク質の多価性とは、１つの抗原と結合する際に、複数の相互作用を利用することができ、したがって抗原との結合の親和力を増大し得ることを意味する。特異性、すなわち単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性とは、抗体融合タンパク質がいくつの抗原またはエピトープと結合することができるかを示す。これらの定義を用いれば、天然の抗体、例えばＩｇＧは、２つの結合アームを有するが、１種類のエプトープと結合するので、二価である。単一特異性で多価の融合タンパク質は、１種類のエプトープに対して１つ以上の結合部位を有するが、１種類のエプトープのみと結合する。融合タンパク質は、単一の抗体成分、異なる抗体成分の多価または多重特異性の組合せ、あるいは同一抗体成分の複数のコピーを含み得る。融合タンパク質は、抗体または抗体フラグメントならびに治療剤をさらに含み得る。このような融合タンパク質に適する治療剤の例として、免疫調節物質および毒素が挙げられる。１つの好適な毒素には、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、好ましくは組換えＲＮａｓｅが含まれる。しかし、当該用語は限定的なものでなく、様々なタンパク質エフェクターまたはペプチドエフェクターが、融合タンパク質に組み込まれ得る。別の非限定的な例において、融合タンパク質は、以下で論じるように、ＤＮＬ構築物を作製するためのＡＤまたはＤＤＤ配列を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】サイトカイン‐ＤＤＤ２（Ｃ）発現のための遺伝子構造（ＡおよびＢ）ならびにＩｇＧ‐ＡＤ２（Ｄ）ＤＮＬモジュールを表した模式図である。これらのモジュールが結合して、ＩｇＧ（Ｅ）と融合した４つのサイトカインからなるＤＮＬ構造が形成される。
【図２】ペグ化または天然のＩＦＮαと比較した、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物におけるインビトロでのＩＦＮα活性を示す図である。比活性（ＩＵ／ｐｍｏｌ）を実施例に記載通り測定した。既知濃度の各被検試料の活性は、ｒｈＩＦＮα２ｂの標準曲線から推定した。濃度を増加させた２０‐２ｂ（●）、７３４‐２ｂ（■）、ｖ‐ｍａｂ（○）、ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂ（□）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（▼）、ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（▲）または１Ｒ‐２ｂ（▽）の存在下で培養物を増殖させ、相対的生細胞密度をＭＴＳで測定した。未治療の細胞から得られたシグナルの％を、モル濃度の対数に対してプロットした。用量反応曲線およびＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて算出した。エラーバーはＳＤを表す。図２（Ａ）は細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイの図である。図２（Ｂ）はＥＭＣウイルスおよびＡ５４９細胞によるウイルス防御アッセイの図である。図２（Ｃ）はＤａｕｄｉ細胞を用いたインビトロでのリンパ腫増殖アッセイの図である。図２（Ｄ）はＪｅｋｏ‐１細胞を用いたインビトロでのリンパ腫増殖アッセイの図である。
【図３】Ｓｗｉｓｓ‐Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける薬物動態解析の結果を表した図である。マウスに２０‐２ｂ、α２ｂ‐４１３、ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮまたはＰＥＧＡＳＹＳを投与し、血清試料のＩＦＮα２ｂ濃度を、ＥＬＩＳＡ法により９６時間にわたり解析した。血中消失曲線を示す。血中半減期（Ｔ１／２）消失率および平均滞留時間（ＭＲＴ）を、挿入した表にまとめる。
【図４】図４（Ａ）は２０‐２ｂのＡＤＣＣエフェクター機能を表した図である。ＤａｕｄｉまたはＲａｊｉ細胞を、新たに単離したＰＢＭＣの存在下で、５μｇ／ｍｌの２０‐２ｂ、２２‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂ、エピラツズマブ（ｅ‐ｍａｂ）またはｈ７３４と共に４時間インキュベートした後、細胞溶解の定量化を行った。図４（Ｂ）は２０‐２ｂのＣＤＣエフェクター機能を表した図である。Ｄａｕｄｉ細胞を、ヒト補体の存在下で、２０‐２ｂ（●）、７３４‐２ｂ（■）またはｖ‐ｍａｂ（○）の段階希釈によりインキュベートした。ｎＭ濃度の対数に対する％補体対照（補体のみで処置した細胞と比較した、試験試料中の生細胞数）をプロットした。エラーバーはＳＤを表す。
【図５】２０‐２ｂによる、全血からのＮＨＬ細胞枯渇の増強を示す図である。新鮮なヘパリン化ヒト血液をＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓと混合し、０．０１、０．１または１ｎＭの２０‐２ｂ（●）、ｖ‐ｍａｂ（○）、７３４‐２ｂ（■）またはｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂ（□）と共に２日間インキュベートした。これらの処置のリンパ腫および末梢血リンパ球に対する効果を、フローサイトメトリーを用いて評価した。エラーバーはＳＤを表す。
【図６】図６（Ａ）は播種性バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）異種移植モデルにおける２０‐２ｂの治療効果を示す生存曲線を描いた図である。０日目に、ＣＢ．１７ＳＣＩＤ雌マウスにＤａｕｄｉ細胞を静注投与した。処置は、単回皮下用量で投与された２０‐２ｂ（●）、７３４‐２ｂ（■）、ｖ‐ｍａｂ（○）、ＰＥＧＡＳＹＳ（▼）または生理食塩水（×）で構成された。処置日を矢印で示す。生存曲線は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析した。初期Ｄａｕｄｉモデルにおいて、１日目に、０．７ｐｍｏｌ（実線）または０．０７ｐｍｏｌ（破線）の１回量を、１０匹のマウスからなる各グループに投与した。図６（Ｂ）は進行Ｄａｕｄｉモデルにおける図６（Ａ）と同様の実験を示す図である。７日目に、０．７ｐｍｏｌ（実線）、７ｐｍｏｌ（破線）または７０ｐｍｏｌ（灰色線）の１回量を、１０匹のマウスからなる各グループに投与した。
【図７】図７（Ａ）は播種性バーキットリンパ腫（ＲａｊｉおよびＮＡＭＡＬＷＡ）異種移植モデルにおける２０‐２ｂの治療効果を示す生存曲線を表した図である。０日目に、ＣＢ．１７ＳＣＩＤ雌マウスにＮＨＬ細胞を静注投与した。処置は、単回皮下用量で投与された２０‐２ｂ（●）、７３４‐２ｂ（■）、ｖ‐ｍａｂ（○）または生理食塩水（×）で構成された。処置日を矢印で示す。生存曲線はＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析した。進行Ｒａｊｉモデルにおいて、５、７、９、１２、１４および１６日目に、２５０ｐｍｏｌの用量を、１０匹のマウスからなる各グループに投与した。図７（Ｂ）は初期ＮＡＭＡＬＷＡモデルにおける図７（Ａ）と同様の実験を示す図である。１、３、５、８、１０および１２日目に、２５０ｐｍｏｌ用量の２０‐２ｂもしくは７３４‐２ｂを、または１、５、９、１３、１７、２１および２５日目に、３．５ｎｍｏｌ用量のｖ‐ｍａｂを、６匹のマウスからなる各グループに投与した。
【図８】ＥＰＯ標準品、７３４‐ＥＰＯまたはＥＰＯ‐ＤＤＤ２で７２時間処置したＴＦ１細胞を用いた、ＥＰＯ活性に関する細胞ベースのアッセイの結果を示す図である。用量反応曲線およびＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて算出した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法
ＤＮＬ法は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットとＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰs）のアンカードメイン（ＡＤ）との間に生じる特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００５、５７９：３２６４；ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００４、５：９５９）。ＰＫＡは、セカンドメッセンジャーｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合により誘発される、最も研究されているシグナル伝達経路の１つにおいて中心的役割を果たし、１９６８年にウサギ骨格筋から最初に単離された（Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６８、２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性型に保持されている２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムには、２つのタイプのＲサブユニット（ＲIおよびＲII）が見出されており、各タイプにはαおよびβアイソフォームが存在する（Ｓｃｏｔｔ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９９１、５０：１２３）。Ｒサブユニットは、安定な二量体としてのみ単離されており、その二量体化ドメインは、最初の４４のアミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、６：２２２）。ｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合により、広範囲なセリン／スレオニンキナーゼ活性に向けて活性触媒サブユニットの解離が生じ、これらはＰＫＡとＡＫＡＰとのドッキングを介したＰＫＡの区画化により選択された基質へと向かう（ｃｏｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、２６５；２１５６１）。
【００２７】
１９８４年に、微小管結合タンパク質２である最初のＡＫＡＰが特徴付けられて以来（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１９８４、８１：６７２３）、細胞膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリアおよび小胞体を含めた様々な細胞内部位に局在する５０以上のＡＫＡＰが、酵母からヒトに至る種において多様な構造で同定されている（ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００４、５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性へリックスである（Ｃａｒｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰ間で非常に変化に富み、ＲII二量体に関しては、２〜９０ｎＭにわたる結合親和性が報告されている（Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００３、１００：４４４５）。興味深いことに、ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットとのみ結合する。ヒトＲIIαでは、ＡＤは２３アミノ末端残基により形成される疎水性表面と結合する（ＣｏｌｌｅｄｇｅおよびＳｃｏｔｔ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９９、６：２１６）。したがって、ヒトＲIIαの二量体化ドメインおよびＡＫＡＰ結合ドメインは共に、同じＮ末端４４アミノ酸配列内に存在し（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２００１、２０：１６５１）、本明細書ではこれをＤＤＤと称する、。
【００２８】
リンカーモジュールとしてのヒトＲIIα のＤＤＤおよびＡＫＡＰのＡＤ
本発明者らは、ヒトＲIIαのＤＤＤおよび特定のアミノ酸配列のＡＤを、任意の２つの要素（以下ＡおよびＢと呼ぶ）をドッキングさせて非共有結合複合体を形成するための優れたリンカーモジュールのペアとして用いるためのプラットフォーム技術を開発した。さらに当該技術では、ＤＤＤおよびＡＤの双方の枢要な位置へシステイン残基を導入して、ジスルフィド結合の形成を促進することにより、形成された複合体が安定なテザー構造内へロックされ得る。「ドック・アンド・ロック」アプローチの概略的な方法論は以下の通りである。ＤＤＤ配列と要素Ａの前駆体とを結合させて要素Ａを構築し、第１の構成要素（以下ａと呼ぶ）を生成する。ＤＤＤ配列は、自発的な二量体形成に作用するため、Ａはａ２で構成されることになる。ＡＤ配列と要素Ｂの前駆体とを結合させて要素Ｂを構築し、第２の構成要素（以下ｂと呼ぶ）を生成する。ａ２中に含まれる二量体ＤＤＤモチーフに、ｂ中に含まれるＡＤ配列と結合するためのドッキング部位が生じることで、ａ２とｂとの即時の結合が促進され、これによりａ２ｂで構成される２成分の三量体複合体が形成される。この結合事象は、それに続く反応により、ジスルフィド架橋を介した共有結合により２つの要素が固定されて、不可逆性となる。この反応は、有効局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に起こり、これは、最初の結合相互作用により、ＤＤＤおよびＡＤの双方上に存在する反応性チオール基が近接して（Ｃｈｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００１、９８：８４８０）、部位特異的に結合するためであると考えられる。
【００２９】
好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物は、ＩｇＧ免疫グロブリン分子がそのＣ末端で２コピーのＡＤ部分に付加される、ａ２ｂ構造の変異に基づく。各ＡＤ部分は、二量体の形態で２つのＤＤＤ部分と結合することができる。サイトカインを各ＤＤＤ部分に付加させることにより、各ＩｇＧ分子に４コピーのサイトカインがコンジュゲートする。より好適な実施形態において、ＤＮＬ構築物中の４つの各サイトカインは同一のものである。
【００３０】
２つの前駆体の官能基から離れたＤＤＤとＡＤとを付加させることにより、このような部位特異的結合が、２つの前駆体の元の活性を保持することも期待される。このアプローチは本来モジュール的であり、広範な物質を部位特異的かつ共有結合的に結合させることに応用可能である。ＤＮＬ法は、２００５年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／７２８，２９２号；２００５年１２月１６日に出願された同第６０／７５１，１９６号；および２００６年３月１４日に出願された同第６０／７８２，３３２；ならびに２００６年３月２４日に出願された米国特許出願第１１／３８９，３５８号；２００６年３月２８日に出願された同第１１／３９１，５８４号、２００６年６月２９日に出願された同第１１／４７８，０２１号；２００６年１２月５日に出願された同第１１／６３３，７２９号および２００７年１０月２６日に出願された同第１１／９２５，４０８に開示された。
【００３１】
好適な実施形態において、以下の実施例で説明するように、エフェクター部分は、ＤＤＤユニットまたはＡＤユニットと結合して融合タンパク質または融合ペプチドを形成することができるタンパク質またはペプチドである。核酸の合成、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅により、対象とする融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を生成することを含めた、融合タンパク質作製のための様々な方法が知られている。このような二本鎖核酸を、標準的な分子生物学的手法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９を参照のこと）により、融合タンパク質作製用の発現ベクターに挿入してもよい。このような好適な実施形態において、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分を、エフェクタータンパク質またはエフェクターペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加してもよい。しかし、ＡＤまたはＤＤＤ部分のエフェクター部分への付加部位は、生理活性に関与するエフェクター部分の化学的性質およびエフェクター部分の部位（単数または複数）によって異なり得ることを、当業者は理解されよう。様々なエフェクター部分の部位特異的付加は、二価架橋試薬の使用および／またはその他の化学的コンジュゲーション技術のような、当該分野で公知の技術を用いて行われ得る。
【００３２】
サイトカインおよびその他の免疫調節物質
ある好適な実施形態において、エフェクター部分は免疫調節物質である。免疫調節物質は、それが存在する場合、体の免疫系を変化させるか、抑制するか、または刺激する作用物質である。有用な免疫調節物質として、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチンおよびこれらの組合せが挙げられ得る。特に有用なものは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）のような造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子、インターフェロン‐α、‐βまたは‐γのようなインターフェロンならびに「ＳＩ因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子である。
【００３３】
より好適な実施形態において、エフェクター部分は、サイトカイン、例えばリンホカイン、モノカイン、増殖因子および伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインとして、ヒト成長ホルモン、Ｎ‐メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子‐αおよび‐β；ミューラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ‐βのような神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ‐αおよびＴＧＦ‐βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子‐Iおよび‐II；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン‐α、‐βおよび‐γ；マクロファージ‐ＣＳＦ（Ｍ‐ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ‐I、ＩＬ‐１α、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐10、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２； ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１４、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１６、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２１、ＩＬ‐２５のようなインターロイキン、ＬＩＦ、ｋｉｔ‐リガンドまたはＦＬＴ‐３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ‐αのようなＴＮＦ）およびＬＴが挙げられる。
【００３４】
サイトカインのようなタンパク質免疫調節物質またはペプチド免疫調節物質のアミノ酸配列は、当該分野で公知であり、そのような任意の既知の配列が、本発明の実施において使用され得る。サイトカインの配列に関する多くの公開情報源が当業者に既知である。例えば、ＮＣＢＩデータベースには、エリスロポエチン（ＧｅｎＢａｎｋ、ＮＭ０００７９９）、ＩＬ‐１β（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＡＡＨ０８６７８）、ＧＭ‐ＣＳＦ（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＡＡＡ５２５７８）、ＴＮＦ‐α（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＣＡＡ２６６６９）、インターフェロン‐α（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＡＡＡ５２７１６．１）、インターフェロン‐α２ｂ（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＡＡＰ２００９９．１）および実質上任意の上記ペプチド免疫調節物質またはタンパク質免疫調節物質のような、数多くのサイトカインおよび免疫調節物質に関するタンパク質およびコード核酸の配列が共に収められている。対象とする実質上任意のタンパク質エフェクターまたはペプチドエフェクター部分に対する適切なアミノ酸および／または核酸配列を同定することは、当業者にとって慣例となっていることである。
【００３５】
抗体および抗体フラグメント
様々な実施形態において、抗体または抗体の抗原結合フラグメントを、多量体サイトカインに付加し得る。抗原結合抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ´、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのように、当該分野で公知であり、任意のこのような既知のフラグメントを用い得る。本明細書において、抗原結合抗体フラグメントとは、インタクトまたは元の抗体により認識される抗原と同じ抗原と結合する、任意の抗体フラグメントを指す。対象とする実質上任意の抗体またはフラグメントのＡＤおよび／またはＤＤＤ複合体の調製技術は、公知である（例えば、米国特許出願第１１／６３３，７２９号）。
【００３６】
治療剤とコンジュゲートされていない抗体またはそのフラグメント（「裸の」抗体またはそのフラグメントと呼ぶ）を使用し得る。代替的実施形態において、抗体またはフラグメントを、１つまたは複数の治療剤および／または診断剤とコンジュゲートさせてもよい。種々のこのような治療剤および診断剤が当該分野で公知であり、以下でより詳細に論じるように、任意のこのような既知の治療剤および診断剤を用い得る。
【００３７】
実質上任意の標的抗原に対するモノクローナル抗体の調製技術は、当該分野で公知である。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、「Ｎａｔｕｒｅ」、２５６：４９５（１９７５）ならびにＣｏｌｉｇａｎら編、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」、第１巻、ｐ．２．５．１〜２．６．７ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ 、１９９１）を参照のこと。簡潔に述べれば、モノクローナル抗体は以下のようにして得ることができる。抗原を含む組成物をマウスに注射し、脾臓を取り出してＢリンパ球を採取する。このＢリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマをクローニングする。抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択して、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、このハイブリドーマ培養液から抗体を単離する。
【００３８】
ＭＡｂは、すでに確立された様々な技術によりハイブリドーマ培養液から単離および精製することができる。このような単離技術として、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ｐ．２．７．１〜２．７．１２およびｐ．２．９．１〜２．９．３を参照のこと。また、Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」、第１０巻、ｐ．７９‐１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９９２）も参照のこと。
【００３９】
免疫原に対する初回抗体産生の後、この抗体の配列を決定し、次いで組換え技術によりこれを調製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に公知である。ヒト化、キメラ化またはヒト抗体由来の抗体成分の使用により、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が未然に防がれる。
【００４０】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めたマウス抗体の可変領域と置換された、組換えタンパク質である。キメラ抗体は、被検体に投与された場合、免疫原性の減少および安定性の増加を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインの一般的なクローニング技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、８６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体の構築技術は当業者に公知である。一例として、Ｌｅｕｎｇらは、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体であるマウスＬＬ２のＶκおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれヒトκおよびＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることにより、ＬＬ２キメラを作製した（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９４、１３：４６９）。
【００４１】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂの作製技術は当該分野で公知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２：４３７（１９９２）およびＳｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１５０：２８４４（１９９３）を参照のこと）。マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖由来のマウスＣＤＲをヒト抗体の対応する可変ドメインへ移転することにより、キメラまたはマウスモノクローナル抗体をヒト化し得る。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もまた、ヒトＦＲ配列と置換される。単にマウスＣＤＲをヒトＦＲに移転するだけでは、抗体親和性の低下または喪失さえも生じる場合が多いため、マウス抗体本来の親和性を回復するために、さらなる改変が必要となり得る。このことは、ＦＲ領域中の１つまたは複数のヒト残基を、それらのマウスの対応部分と置換して、エピトープに対する十分な結合親和性を有する抗体を得ることにより達成され得る。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２３９：１５３４（１９８８）を参照のこと。一般に、マウスの対応部分とは異なりかつ１つまたは複数のＣＤＲアミノ酸残基と近接または接触しているヒトＦＲアミノ酸残基が置換の候補になるであろう。
【００４２】
ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座を移入したトランスジェニック動物を用いる完全ヒト抗体の作製方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉら、２００４、Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２７：３１５‐２８；ＣｏｎｒａｄおよびＳｃｈｅｌｌｅｒ、２００５、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．、８：１１７‐２６；ＢｒｅｋｋｅおよびＬｏｓｅｔ、２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．、３：５４４‐５０）。完全ヒト抗体は、遺伝子または染色体トランスフェクション法ならびにファージディスプレイ技術により構築することが可能であり、これらは全て当該分野で公知である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、「Ｎａｔｕｒｅ」、３４８：５５２‐５５３（１９９０）を参照のこと。このような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体に比べさらに少ない副作用を示ことおよびインビボにおいて実質的に内在性のヒト抗体として機能することが期待される。ある実施形態において、このような技術により作製されるヒト抗体が、本明細書で特許請求される方法および手順において使用され得る。
【００４３】
別の一方法において、ファージディスプレイ技術を用いてヒト抗体を生成し得る（例えば、Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａら、２００５、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．、４：１２６‐４０）。ヒト抗体は、正常なヒトまたは癌のような特定の病態を示すヒトから生成し得る（Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａら、２００５）。罹患個体からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが、疾患関連抗原に対する抗体へと偏り得ることである。
【００４４】
この方法論の非限定的な一例において、Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーを構築した。概略的には、循環血リンパ球から全ＲＮＡを得た（同上）。組換えＦａｂを、μ、γおよびκ鎖抗体レパートリーからクローニングして、ファージディスプレイライブラリーに挿入した（同上）。重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列に対して特異的なプライマーを用い、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＦａｂのｃＤＮＡライブラリー作製に使用した（Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１‐９７）。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ‐Ｗｉｄｈｏｐｆらに従い行った（２０００、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｂａｒｂａｓら編、第１版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ｐｐ．９．１‐９．２２に掲載）。最終的なＦａｂフラグメントを制限酵素で消化して、バクテリオファージゲノムへ挿入し、ファージディスプレイライブラリーを作製した。このようなライブラリーは、当該分野で公知の標準的なファージディスプレイ法によりスクリーニングし得る（例えば、ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：３６４‐３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９、Ｔｈｅ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、４３：１５９‐１６２を参照のこと）。
【００４５】
ファージディスプレイは様々な形式で行うことができ、総説としては、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３：５５６４‐５７１（１９９３）を参照のこと。ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞により生成してもよい。米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５（その内容全体が参照により本明細書で援用される）を参照のこと。これらの技術は、例示的なものであり、ヒト抗体および抗体フラグメントの作製およびスクリーニングの任意の既知の方法を用い得ることを、当業者は理解されよう。
【００４６】
別の方法において、標準的な免疫化プロトコールを用いて、実質上任意の免疫原性標的に対する抗体を生成するために、ヒト抗体を産生するよう遺伝子操作されたトランスジェニック動物を使用し得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら（１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、７：１３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６）およびＴａｙｌｏｒら（１９９４、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６：５７９）により開示されている。このような系の非限定的な一例は、Ａｂｇｅｎｉｘ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１１‐２３）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅおよび類似の動物では、マウス抗体遺伝子が不活性化されて、機能的なヒト抗体遺伝子と置換されているが、残りのマウス免疫系は元の状態に保たれている。
【００４７】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、可変領域の大部分を含むヒトＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座の一部をアクセサリー遺伝子および調節配列と共に含有する、生殖系列構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換されたものである。ヒト可変領域レパートリーを用いて抗体産生Ｂ細胞を作製してもよく、このＢ細胞を既知の技術で処理してハイブリドーマにしてもよい。標的抗原で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、通常の免疫応答によりヒト抗体を産生し、この抗体を上述の標準的な技術により収集および／または製造してもよい。様々な系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅが利用可能であり、それぞれの系統は異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子導入により産生されたヒト抗体は、通常のヒト抗体の薬物動態特性を保持しつつ治療能力を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。本明細書で特許請求される組成物および方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系の使用に限定されるものではなく、ヒト抗体を産生するよう遺伝子操作された任意のトランスジェニック動物を使用し得ることを、当業者は理解されよう。
【００４８】
抗体フラグメント
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを、既知の技術により生成することができる。抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどのような、抗体の抗原結合部分のことである。Ｆ（ａｂ´）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により作製することができ、Ｆａｂ´フラグメントは、Ｆ（ａｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成することができる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ´フラグメントの同定を迅速かつ簡便に行えるように、Ｆａｂ´発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７４‐１２８１）。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、抗体のパパイン消化により生成してもよく、Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィドの還元により得てもよい。
【００４９】
一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。このＶＬドメインとＶＨドメインが会合されて標的結合部位を形成する。これら２つのドメインはさらに、ペプチドリンカー（Ｌ）により共有結合する。ｓｃＦｖ分子の作製および適切なペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．ＲａａｇおよびＭ．Ｗｈｉｔｌｏｗ、「Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖｓ」ＦＡＳＥＢ、第９巻：７３‐８０（１９９５）ならびにＲ．Ｅ．ＢｉｒｄおよびＢ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ、「Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ」、ＴＩＢＴＥＣＨ、第９巻：１３２‐１３７（１９９１）に記載されている。
【００５０】
単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）の作製技術もまた当該分野で公知であり、例えば、Ｃｏｓｓｉｎｓら（２００６、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．、 ５１：２５３‐２５９）により開示されており、参照により本明細書で援用される。
【００５１】
抗体フラグメントを、完全長抗体のタンパク質分解性加水分解により、あるいはフラグメントをコードするＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または別の宿主内で発現させることにより調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法で完全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１ ，６４７号ならびにこれらに含まれる参考文献）により記載されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」、８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．」、７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎら、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」第１巻、ｐ．４２２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）ならびにＣｏｌｉｇａｎ、同書、ｐ．２．８．１‐２．８．１０および２．１０．‐２．１０．４．も参照のこと。
【００５２】
既知の抗体
使用する抗体は、広範な種々の既知の提供元から購入し得る。例えば、種々の抗体を分泌するハイブリドーマ系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能である。腫瘍関連抗原を非限定的に含む様々な疾患標的に対する数多くの抗体が、ＡＴＣＣに保管されおよび／または可変領域配列が公開されており、本明細書で特許請求される方法および組成物での使用のために入手可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；同第７，２８２，５６７号；同第７，１５１，１６４号；同第７，０７４，４０３号；同第７，０６０，８０２号；同第７，０５６，５０９号；同第７，０４９，０６０号；同第７，０４５，１３２号；同第７，０４１，８０３号；同第７，０４１，８０２号；同第７，０４１，２９３号；同第７，０３８，０１８号；同第７，０３７，４９８号；同第７，０１２，１３３号；同第７，００１，５９８号；同第６，９９８，４６８号；同第６，９９４，９７６号；同第６，９９４，８５２号；同第６，９８９，２４１号；同第６，９７４，８６３号；同第６，９６５，０１８号；同第６，９６４，８５４号；同第６，９６２，９８１号；同第６，９６２，８１３号；同第６，９５６，１０７号；同第６，９５１，９２４号；同第６，９４９，２４４号；同第６，９４６，１２９号；同第６，９４３，０２０号；同第６，９３９，５４７号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，５３３号；同第６，９１９，４３３号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９１６，４７５号；同第６，９０５，６８１号；同第６，８９９，８７９号；同第６，８９３，６２５号；同第６，８８７，４６８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，８８４，５９４号；同第６，８８１，４０５号；同第６，８７８，８１２号；同第６，８７５，５８０号；同第６，８７２，５６８号；同第６，８６７，００６号；同第６，８６４，０６２号；同第６，８６１，５１１号；同第６，８６１，２２７号；同第６，８６１，２２６号；同第６，８３８，２８２号；同第６，８３５，５４９号；同第６，８３５，３７０号；同第６，８２４，７８０号；同第６，８２４，７７８号；同第６，８１２，２０６号；同第６，７９３，９２４号；同第６，７８３，７５８号；同第６，７７０，４５０号；同第６，７６７，７１１号；同第６，７６４，６８８号；同第６，７６４，６８１号；同第６，７６４，６７９号；同第６，７４３，８９８号；同第６，７３３，９８１号；同第６，７３０，３０７号；同第６，７２０，１５号；同第６，７１６，９６６号；同第６，７０９，６５３号；同第６，６９３，１７６号；同第６，６９２，９０８号；同第６，６８９，６０７号；同第６，６８９，３６２号；同第６，６８９，３５５号；同第６，６８２，７３７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，６８２，７３４号；同第６，６７３，３４４号；同第６，６５３，１０４号；同第６，６５２，８５２号；同第６，６３５，４８２号；同第６，６３０，１４４号；同第６，６１０，８３３号；同第６，６１０，２９４号；同第６，６０５，４４１ 号；同第６，６０５，２７９号；同第６，５９６，８５２号；同第６，５９２，８６８号；同第６，５７６，７４５号；同第６，５７２；８５６号；同第６，５６６，０７６号；同第６，５６２，６１８号；同第６，５４５，１３０号；同第６，５４４，７４９号；同第６，５３４，０５８号；同第６，５２８，６２５号；同第６，５２８，２６９号；同第６，５２１，２２７号；同第６，５１８，４０４号；同第６，５１１，６６５号；同第６，４９１，９１５号；同第６，４８８，９３０号；同第６，４８２，５９８号；同第６，４８２，４０８号；同第６，４７９，２４７号；同第６，４６８，５３１号；同第６，４６８，５２９号；同第６，４６５，１７３号；同第６，４６１，８２３号；同第６，４５８，３５６号；同第６，４５５，０４４号；同第６，４５５，０４０， ６，４５１，３１０号；同第６，４４４，２０６' ６，４４１，１４３号；同第６，４３２，４０４号；同第６，４３２，４０２号；同第６，４１９，９２８号；同第６，４１３，７２６号；同第６，４０６，６９４号；同第６，４０３，７７０号；同第６，４０３，０９１号；同第６，３９５，２７６号；同第６，３９５，２７４号；同第６，３８７，３５０号；同第６，３８３，７５９号；同第６，３８３，４８４号；同第６，３７６，６５４号；同第６，３７２，２１５号；同第６，３５９，１２６号；同第６，３５５，４８１号；同第６，３５５，４４４号；同第６，３５５，２４５号；同第６，３５５，２４４号；同第６，３４６，２４６号；同第６，３４４，１９８号；同第６，３４０，５７１号；同第６，３４０，４５９号；同第６，３３１，１７５号；同第６，３０６，３９３号；同第６，２５４，８６８号；同第６，１８７，２８７号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１２９，９１４号；同第６，１２０，７６７号；同第６，０９６，２８９号；同第６，０７７，４９９号；同第５，９２２，３０２号；同第５，８７４，５４０号；同第５，８１４，４４０号；同第５，７９８，２２９号；同第５，７８９，５５４号；同第５，７７６，４５６号；同第５，７３６，１１９号；同第５，７１６，５９５号；同第５，６７７，１３６号；同第５，５８７，４５９号；同第５，４４３，９５３号；同第５，５２５，３３８を参照のこと。これらは例示的なもの過ぎず、広範な種々の他の抗体およびそのハイブリドーマが当該分野で公知である。ほぼどの疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマも、対象とする特定の疾患関連標的に対する抗体に関してＡＴＣＣ、ＮＣＢＩおよび／またはＵＳＰＴＯのデータベースを検索するだけで入手され得る。クローン抗体の抗原結合ドメインを、当該分野で公知の標準的な技術を用いて、増幅し、切り出し、発現ベクター内にライゲートし、適合した宿主細胞内にトランスフェクトして、タンパク質産生に使用し得る。
【００５３】
アミノ酸置換
ある実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物は、１つまたは複数の置換されたアミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの作製および使用を包含し得る。上述のように、実質上任意の標的抗原に対するモノクローナル抗体の作製方法は、当該分野で公知である。通常、これらの方法により、標的抗原に対するマウス抗体が作製される。当該分野で公知のように、マウスモノクローナル抗体の抗原結合特異性は、主として超可変性の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列により決定される。マウス抗体は一般に、抗体の軽鎖上に３つおよび重鎖上に３つ、つまり６つのＣＤＲ配列を含む。上で詳述したように、マウスＣＤＲ配列を、例えばヒト抗体のフレームワークおよび定常領域配列に挿入する、ＣＤＲ移植のような技術により、あるいはマウス可変領域配列全体をヒト抗体の定常領域配列に付加することにより、キメラ、ヒト化またはヒトバージョンのマウス抗体を構築し得る。別の実施形態において、抗体の可変領域配列を、例えば、抗体の軽および重鎖可変領域全体をコードするオリゴヌクレオチドの化学的合成およびアセンブリにより構築し得る。
【００５４】
様々な実施形態において、天然、キメラ、ヒト化またはヒト抗体の構造的、物理的および／または治療的特性を、１つまたは複数のアミノ酸残基を置換することにより最適化し得る。例えば、ヒト化抗体の機能的特性は、限定された数のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸を、元のマウス抗体の対応するＦＲアミノ酸と置換することにより改善され得る。このことは、フレームワーク領域のアミノ酸残基がＣＤＲ残基と非常に接近している場合に特に当てはまる。
【００５５】
別の場合には、標的抗原に対する結合親和性、標的抗原からの抗体解離速度またはオフ速度あるいは抗体によるＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）またはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の誘導効率さえのような抗体の治療的特性が、限定された数のアミノ酸置換により最適化され得る。
【００５６】
別の実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を作製するために使用されるＤＤＤおよび／またはＡＤ配列は、例えば、ＤＤＤ‐ＡＤ結合親和性を増加させるために最適化され得る。ＤＤＤまたはＡＤ配列において可能な配列バリエーションを以下の実施例で論じる。
【００５７】
一般に、アミノ酸置換は通常、あるアミノ酸を、特性が比較的類似した別のアミノ酸と置き換えること（すなわち、保存的アミノ酸置換）を包含することを、当業者は理解されよう。種々のアミノ酸の特性およびアミノ酸置換のタンパク質の構造および機能に及ぼす影響は、当該技術分野における広範な研究および知識の主題である。
【００５８】
例えば、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５‐１３２）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性が、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それによりタンパク質の他の分子との相互作用が決定される。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づきハイドロパシー指標が以下のように割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。保存的置換を行う場合、ハイドロパシー指標が±２以内のアミノ酸の使用が好ましく、より好ましくは±１以内のアミノ酸、さらにより好ましくは±０．５のアミノ酸の使用である。
【００５９】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性も考慮し得る（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。アミノ酸残基には以下のように親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン （０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５ ±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。親水性が類似した他のアミノ酸との置換が好ましい。
【００６０】
その他の考慮すべき事柄として、アミノ酸側鎖の大きさが挙げられる。例えば、グリシンまたはセリンのような小型の側鎖を有するアミノ酸を、例えば、トリプトファンまたはチロシンのような大型の側鎖を有するアミノ酸と置換するのは、一般に好ましくないであろう。タンパク質の二次構造に及ぼす様々なアミノ酸残基の影響も１つの考慮事項である。実証研究により、様々なアミノ酸残基が、α‐へリックス、β‐シートまたはリバースターンというタンパク質ドメインの二次構造の採用傾向に及ぼす影響が解明されており、当該分野で公知である（例えば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２‐２４５；１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１‐２７６；１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、２６：３６７‐３８４を参照のこと）。
【００６１】
このような考慮事項および広範な実証研究に基づいて、保存的アミノ酸置換表が作成されており、当該分野で公知である。例えば：アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシン。あるいは：Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｈｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ。
【００６２】
その他のアミノ酸置換に関する考慮事項として、残基がタンパク質の内側にあるか否か、あるいは溶媒に曝露されているか否かがある。内側の残基に関しては、保存的置換として：ＡｓｐとＡｓｎ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＳｅｒとＡｌａ；ＴｈｒとＡｌａ；ＡｌａとＧｌｙ；ＨｅとＶａｌ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＬｅｕとＭｅｔ；ＰｈｅとＴｙｒ；ＴｙｒとＴｒｐが挙げられるであろう（例えば、「ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ」にあるウェブサイト「ＰＲＯＷＬ」を参照のこと）。溶媒に曝露されている側鎖に関しては、保存的置換として： ＡｓｐとＡｓｎ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＧｌｕとＧｌｎ；ＧｌｕとＡｌａ；ＧｌｙとＡｓｎ；ＡｌａとＰｒｏ；ＡｌａとＧｌｙ；ＡｌａとＳｅｒ；ＡｌａとＬｙｓ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＬｙｓとＡｒｇ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＨｅとＶａｌ；ＰｈｅとＴｙｒが挙げられるであろう（同上）。アミノ酸置換の際に役立つように、ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、ＬｅｖｉｎマトリックスおよびＲｉｓｌｅｒマトリックスのような様々なマトリックスが作成されている（同上）。
【００６３】
アミノ酸置換を決定する際に、正荷電残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負荷電残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）との間のイオン結合（塩橋）または隣接するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成のような、分子間または分子内結合の存在も考慮され得る。
【００６４】
コードされたタンパク質配列において任意のアミノ酸を他の任意のアミノ酸と置換する方法は、公知でありかつ当業者にとってはルーティン化された実験方法であり、例えば、部位特異的突然変異誘発技術による方法、またはアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを合成およびアセンブリして、発現ベクター構築物内にスプライスすることによる方法がある。
【００６５】
治療剤
別の実施形態において、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素またはその他の薬剤を、本明細書に記載の多量体サイトカインに対する補完療法として使用し得る。有用な薬物は、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、抗代謝剤、抗生剤、アルカロイド、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤およびこれらの組合せからなる群より選択される薬剤特性を有し得る。
【００６６】
有用な薬物の例として、５‐フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオシタチン‐１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０‐ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ‐２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）、ＳＮ‐３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２‐ピロリノドキソルビシン（２Ｐ‐ＤＯＸ）、シアノ‐モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’‐Ｏ‐ジオレオイル‐ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ‐ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル‐タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ‐アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６‐メルカプトプリン、メソトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ‐３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンカアルカロイドを挙げ得る。
【００６７】
有用な毒素として、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（例えば、オンコナーゼ、ＤＮａｓｅI）、ブドウ球菌エンテロトキシン‐Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシンおよびシュードモナスエンドトキシンを挙げ得る。
【００６８】
有用なケモカインとして、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１‐α、ＭＩＰ１‐βおよびＩＰ‐１０を挙げ得る。
【００６９】
ある実施形態において、アンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＩＧＦペプチドおよび抗ＰＩＧＦ抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ‐１抗体、抗Ｆｉｔ‐１抗体および抗Ｆｉｔ‐１抗体ペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン‐１２、ＩＰ‐１０、 Ｇｒｏ‐β、トロンボスポンジン、２‐メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭｌＯｌ、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンジオポエチン‐２、インターフェロン‐α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ‐４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ‐１４７０、血小板因子４またはミノサイクリンのような抗血管新生剤が有用であり得る。
【００７０】
その他の有用な治療剤には、オリゴヌクレオチド、特に、好ましくは癌遺伝子および癌遺伝子産物に対する、ｂｃｌ‐２またはｐ５３のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ得る。好ましい形態の治療用オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００７１】
診断剤
診断剤は、好ましくは、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される。このような診断剤は公知であり、任意のこのような既知の診断剤を使用し得る。診断剤の非限定的な例として、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４‐１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒあるいはその他のガンマ、ベータまたは陽電子放射体を挙げ得る。有用な常磁性イオンとして、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）またはエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられ得る。金属造影剤として、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）またはビスマス（ＩＩＩ）を挙げ得る。超音波造影剤には、ガス封入リポソームのようなリポソームが包含され得る。放射線不透過性の診断剤は、バリウム化合物、ガリウム化合物およびタリウム化合物のような化合物から選択され得る。広範な種々の蛍光標識が当該分野で公知であり、フルオレセインイソチアシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ‐フタルデヒドおよびフルオレサミンが挙げられるが、これらに限定されない。有用な化学発光標識として、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩またはシュウ酸エステルを挙げ得るが、これらに限定されない。
【００７２】
イムノコンジュゲート
ある実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の抗体成分を、１つまたは複数の治療剤または診断剤とコンジュゲートし得る。複数の治療剤は同一である必要はなく、例えば、薬物と放射性同位元素のように、異なっていてもよい。例えば、１３１Ｉを抗体または融合タンパク質のチロシン中に組み込み、薬物をリジン残基のイプシロンアミノ基に付加してもよい。治療剤および診断剤を、例えば、還元ＳＨ基および／または炭化水素側鎖に付加してもよい。治療剤または診断剤と抗体または融合タンパク質との共有結合的または非共有結合的コンジュゲートを作製するための多くの方法が当該分野で公知であり、任意のこのような既知の方法を用いてもよい。
【００７３】
治療剤または診断剤を、ジスルフィド結合形成を介して、還元抗体成分のヒンジ領域に付加してもよい。あるいは、このような薬剤を、Ｎ‐スクシニル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて付加してもよい（Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５６：２４４（１９９４））。このようなコンジュゲーションのための一般的技術は、当該分野で公知である。例えば、Ｗｏｎｇ、「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ‐ＬＩＮＫＩＮＧ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、 １９９１）；「ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、Ｂｉｒｃｈら編、（Ｗｉｌｅｙ‐Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９５）に掲載の、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、ｐ．１８７‐２３０；「ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ， ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ」、Ｒｉｔｔｅｒら編、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）に掲載の、Ｐｒｉｃｅ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ‐Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 、ｐ．６０‐８４ を参照のこと。あるいは、治療剤または診断剤を、抗体のＦｃ領域中の炭水化物部分を介して、コンジュゲートしてもよい。チオール基と結合した同一薬剤の装薬量を増大させるために炭水化物基を用いてもよく、あるいは異なる治療剤または診断剤を結合させるために炭水化物部分を用いてもよい。
【００７４】
ペプチドを、抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にコンジュゲートするための方法は、当業者に公知である。例えば、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４６：１１０１（１９９０）；Ｓｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）を参照のこと。一般的な方法として、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、遊離アミン官能基を少なくとも１つ有する担体ポリマーと反応させることが挙げられる。この反応により、まずシッフ塩基（イミン）結合が形成され、これを第２級アミンに還元することで安定化させて、最終的なコンジュゲートを形成する。
【００７５】
イムノコンジュゲートの抗体成分として用いられる抗体が、抗体フラグメントである場合、Ｆｃ領域が欠如し得る。しかし、炭水化物部分を完全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することは可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎら、米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５）、Ｌｅｕｎｇら、米国特許第６，２５４，８６８号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）を参照のこと。改変された炭水化物部分を用いて、治療剤または診断剤を付加する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、キレート剤を抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質に付加して、放射性核種のような治療剤または診断剤をキレート化するために使用し得る。キレート剤の例として、ＤＴＰＡ（Ｍｘ‐ＤＴＰＡなど）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡまたはＮＯＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。コンジュゲーション法ならびにキレート剤を使用して金属またはその他のリガンドをタンパク質に付加する方法は、当該分野で公知である（例えば、その内容全体が参照により本明細書で援用される、米国特許出願第１２／１１２，２８９号を参照のこと）。
【００７７】
ある実施形態において、放射性金属または常磁性イオンを、イオンを結合させるための多様なキレート基を付加し得る長い尾部を有する試薬と反応させて、タンパク質またはペプチドに付加し得る。このような尾部は、ポリリジン、多糖または、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス‐チオセミカルバゾン、ポリオキシムおよびこの目的に有用であると知られている同様な基のようなキレート基が結合可能なペンダント基を有する他の誘導体化されたまたは誘導体化可能な鎖のような、ポリマーであってよい。
【００７８】
キレートを、例えば、米国特許第４，８２４，６５９号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）に開示されているように、抗体またはペプチドに直接結合させ得る。特に有用な金属‐キレートの組合せとして、１２５１、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４１、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５０、７６Ｂｒのような一般的エネルギー範囲が６０〜４０００ｋｅＶの診断用アイソトープとともに放射性イメージングに用いられる、２‐ベンジル‐ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレートが、マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体化した場合は、ＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡのような大環状キレートは、様々な金属および放射性金属とともに、最も具体的には、それぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種とともに用いられる。このような金属キレート錯体は、対象とする金属に環のサイズを合わせることにより、非常に安定させることができる。ＲＡＩＴに対する２２３Ｒａのような安定に結合する核種を対象とする、大環状ポリエーテルのような他の環型キレートが包含される。
【００７９】
ごく最近では、ＰＥＴスキャン技術で使用される１８Ｆ標識の方法、例えば、Ｆ‐１８とアルミニウムのような金属または他の原子との反応による方法が開示されている。１８Ｆ‐Ａｌコンジュゲートは、抗体に直接付加する、またはプレターゲティング法において標的となり得る構築物を標識するために使用される、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡまたはＮＥＴＡのようなキレート基と錯体化され得る。このようなＦ‐１８標識技術は、２００８年４月３０日に出願された米国特許出願第１２／１１２，２８９号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）に開示されている。
【００８０】
治療的処置の方法
様々な実施形態が、哺乳類、例えばヒトや、イヌおよびネコなどの飼い馴らされたまたは伴侶用のペットのような被検体における処置方法に関するものであり、治療有効量のサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を被検体に投与することを含む。好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物は、以下の実施例でさらに詳細に記載されるような、２０‐２ｂ構築物である。
【００８１】
標的細胞表面上の別の抗原と結合または反応する治療有効量の別の抗体を、同時にまたは逐次的に投与することにより、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の投与を補完することができる。好適な追加のＭＡｂは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＭ４抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、Ｉａ、ＭＩＦ、ＨＭｌ．２４、ＨＬＡ‐ＤＲ、テネイシン、Ｆｌｔ‐３、ＶＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐２５、テネイシン、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、補体因子Ｃ５、癌遺伝子産物またはこれらの組み合わせと反応するＭＡｂからなる群より選択される、ヒト化、キメラまたはヒトＭＡｂを少なくとも１つ含む。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ２２抗体のような種々の有用な抗体が当業者に既知である。例えば、Ｇｈｅｔｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：２６１０（１９８８）；Ｈｅｋｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３２：３６４（１９９１）；Ｌｏｎｇｏ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、５：３５３（１９９６）、米国特許第５，７９８，５５４号；同第６，１８７，２８７号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６７６，９２４号；同第７，１０９，３０４；同第７，１５１，１６４号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３０，０８５号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；ならびに米国特許出願公開第２００８／０１３１３６３号；同第２００８／００８９８３８号；同第２００７／０１７２９２０号；同第２００６／０１９３８６５号；同第２００６／０２１０４７５号；同第２００８／０１３８３３３号；および同第２００８／０１４６７８４号（それぞれが参照により本明細書で援用される）を参照のこと。
【００８２】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物療法は、少なくとも１つの治療剤の同時または逐次的投与によりさらに補完することができる。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ２シクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ２エトポシドおよび１５０〜２００ｍｇ／ｍ２カルムスチン）は、非ホジキンリンパ腫の治療に用いられるレジメンである（Ｐａｔｔｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、５７：１８（１９９３））。その他の適切な併用化学療法レジメンが当業者に公知である。例えば、「ＣＡＮＣＥＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ」、第２巻、第３版、Ｈｏｌｌａｎｄら編（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９３）に掲載のＦｒｅｅｄｍａｎら、「Ｎｏｎ‐Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」、ｐ．２０２８‐２０６８を参照のこと。例えば、中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）治療用の第一世代の化学療法レジメンとして、Ｃ‐ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）が挙げられる。有用な第二世代の化学療法レジメンは、ｍ‐ＢＡＣＯＤ（メソトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン）であり、一方、適切な第三世代のレジメンは、ＭＡＣＯＰ‐Ｂ（メソトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）である。有用な薬物として、さらにフェニルブチレート、ベンダムスチンおよびブリオシタチン‐１が挙げられる。
【００８３】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を既知の方法に従って製剤化して、薬学的に有用な組成物を調製することができ、これにより、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物が、薬学的に適切な添加剤との混合物に組み合わされる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水が薬学的に適切な添加剤の一例である。その他の適切な添加剤は当業者に公知である。例えば、Ａｎｓｅｌら、「ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ」、第５版（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９０）およびＧｅｎｎａｒｏ編、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）およびこれらの改訂版を参照のこと。
【００８４】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物は、例えば、ボーラス注入または持続注入による静脈内投与のために製剤化することができる。好ましくは、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を約４時間未満にわたり、より好ましくは、約３時間未満にわたり注入する。例えば、最初の２５‐５０ｍｇを３０分以内で、好ましくは１５分以内さえで注入し、残りは次の２〜３時間にわたり注入する。注入用の製剤は、単位剤形で、例えば、保存剤を添加したアンプルまたは多回用量容器に入れて、提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤用剤を含有することができる。あるいは使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌無パイロジェン水を用いて構成するために、有効成分は粉末形態であってもよい。
【００８５】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の作用持続時間を制御するために、さらなる薬学的方法を用い得る。ポリマーを使用してサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を複合体形成し、または吸着することにより、放出制御製剤を調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとして、ポリ（エチレン‐ｃｏ‐酢酸ビニル）のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ無水共重合体のマトリックスが挙げられる（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１４４６（１９９２））。このようなマトリックスからの放出速度は、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の分子量、マトリックス内のサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の量および分散粒子の大きさに依存する（Ｓａｌｔｚｍａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、同上）。その他の固形剤形は、Ａｎｓｅｌら、「ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ」、第５版、（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９０）およびＧｅｎｎａｒｏ編、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）およびこれらの改訂版に記載されている。
【００８６】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物は、哺乳動物に、皮下により、または他の非経口経路によってさえも投与し得る。さらに、投与は、持続注入によるあるいは単回のまたは複数回のボーラスによるものであってもよい。好ましくは、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を、約４時間未満にわたり、およびより好ましくは、約３時間未満にわたり注入する。
【００８７】
より一般的には、ヒトに対して投与されるサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的病状および既往歴のような因子により異なるであろう。受容者には、単回の静脈注射として約１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲のサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物用量を提供することが望まれ得るが、状況に応じてこれよりも低いまたは高い用量を投与してもよい。例えば、７０ｋｇの患者に対する１〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量は７０〜１，４００ｍｇであり、または１．７ｍの患者に対しては４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。この投与量は、必要に応じて、例えば、週１回で４〜１０週間、週１回で８週間または週１回で４週間繰り返してもよい。また、維持療法での必要に応じて、隔週で数ヶ月間あるいは毎月または３ヶ月毎に何ヶ月間もというように、より低頻度で投与してもよい。
【００８８】
あるいは、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を、１投与量を２週間または３週間毎に、少なくとも合計３投与量になるまで繰り返し投与してもよい。または、構築物を、週２回で４〜６週間投与してもよい。投与量を約２００〜３００ｍｇ／ｍ２まで（１．７ｍの患者に対して３４０ｍｇ／投与または７０ｋｇの患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）減らした場合、週に１回または２回でさえ４〜１０週間投与してもよい。あるいは、投与計画を減らす、すなわち２週間または３週間に１回で２〜３ヶ月間にしてもよい。しかし、２０ｍｇ／ｋｇを週１回または２〜３週間に１回のようなさらに高い用量でも、反復投与サイクルで緩徐な静注により投与できることが確認されている。用量および計画を適切に調節することにより、投与計画を他の間隔で任意に繰り返すことができかつ様々な非経口経路で投与してもよい。
【００８９】
好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂＤＮＬ構築物は、癌治療に有用である。癌の例として、癌腫、リンパ腫、膠芽腫、黒色腫、肉腫ならびに白血病、骨髄腫またはリンパ性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例が以下に記載され：扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌腫を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含めた胃癌、膵臓癌、多形膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、肝細胞癌腫、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化甲状腺癌腫、乳癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌腫、陰茎癌腫および頭頸部癌が挙げられる。「癌」という用語には、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、被検体の体において、元の悪性腫瘍部位または腫瘍部位以外に細胞がまだ移動していないもの）および続発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、つまり悪性細胞または腫瘍細胞が元の腫瘍部位と異なる第二の部位へ移動することから生じるもの）が包含される。本発明の治療法をもたらす癌には、ＩＧＦ‐１Ｒを発現するか、過剰発現するか、または異常に発現する細胞が包含される。
【００９０】
癌または悪性腫瘍のその他の例として、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂・尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原発性神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、胃腸管腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸癌、転移性原発性扁平上皮頸癌、転移性扁平上皮頸癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄球性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔・副鼻腔癌、上咽頭癌、神経細胞芽腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌、中咽頭癌、骨肉腫／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在性腫瘍、膵臓癌、異常タンパク血症、真性赤血球増加症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂・尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、テント上原発性神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂・尿管移行細胞癌、移行性腎盂・尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管・腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍および上記器官系に存在する新生物以外のその他の任意の高増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書において記載および特許請求される方法および組成物は、上記の疾患を非限定的に含む悪性または前悪性の状態を治療するためにならびに腫瘍性または悪性の状態への進行を阻止するために使用され得る。このような使用は、腫瘍または癌への進行前であることが分かる、または疑われる状態、特に、過形成、化生または最も特に異形成からなる非腫瘍性の細胞増殖が生じた状態において必要とされる（このような異常な増殖状態に関する総説として、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ、Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐｐ．６８‐７９（１９７６）を参照のこと）。
【００９２】
異形成は癌の前兆である場合が多く、主として上皮に見られる。異形成は、非腫瘍性細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造的配向の喪失を伴う。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する部位に生じるのが特徴である。治療可能な異形成疾患として、無汗性外胚様異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨線維性異形成、開花性骨性異形成、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少症性外胚葉異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖端セメント質異形成、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、眼中隔異形成、脊椎骨端異形成および心室橈骨異形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
さらに、治療可能な前腫瘍性疾患として、良性の異常増殖性疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープまたは腸腺腫および食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎および日光角化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
好適な実施形態において、本発明の方法は、癌、特に上記の癌の増殖、進行および／または転移を抑制するために使用される。
【００９５】
さらに、高増殖性の疾患、障害および／または症状として、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤血白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病ならびに線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎臓細胞癌腫、ヘパトーマ、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス癌腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経細胞芽腫および網膜芽細胞腫のような肉腫および癌腫を非限定的に含む固形腫瘍のような悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
キット
様々な実施形態が、患者における患部組織の治療または診断に適した成分を含むキットに関し得る。典型的なキットは、本明細書に記載のような少なくとも１つまたは複数のサイトカイン‐ＭＡｂ構築物を含み得る。投与のための成分を含有する組成物が、経口送達によるものなど、消化管を介した送達のために製剤化されていない場合、他の何らかの経路を通してキット成分を送達することが可能な装置が含まれ得る。非経口送達のような適用のための装置のタイプの１つは、組成物を被検体の体に注入するために使用される注射器である。吸入装置もまた使用され得る。ある実施形態において、治療剤を、滅菌された液剤または凍結乾燥調製物が充填された、注射器または自己注射ペンの形態で提供し得る。
【００９７】
キット成分を、一緒にあるいは２つまたはそれ以上の容器に分けて収容してもよい。いくつかの実施形態において、容器は、再構成に適する、滅菌された凍結乾燥剤形の組成物を収容できる、バイアルであり得る。キットは、再構成および／または他の試薬の希釈に適した１つまたは複数の緩衝剤も含有し得る。使用し得るその他の容器として、パウチ、トレイ、箱、チューブなどが挙げられるが、これらに限定されない。キット成分を、容器内に収容して滅菌状態を維持してもよい。含まれ得る他の構成要素は、キットを使用する者のための使用説明書である。
【００９８】
発現ベクター
さらに他の実施形態は、サイトカイン‐ＭＡｂ構築物またはその構成成分の融合タンパク質をコードする核酸を含むＤＮＡ配列に関し得る。融合タンパク質は、以下の実施例でより詳細に論じるように、ＤＮＬ構築物形成のために使用される、ＡＤおよびＤＤＤペプチドのような異なるペプチドまたはタンパク質に付加されている抗体またはサイトカインを含み得る。
【００９９】
様々な実施形態が、コードＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関し得る。ベクターは、キメラ、ヒト化またはヒト可変領域配列が付加され得るヒト免疫グロブリンの軽および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域をコードする配列を含み得る。ベクターは、コードされた１つまたは複数のタンパク質を、選択された宿主細胞内で発現するプロモーター、エンハンサーおよびシグナル配列もしくはリーダー配列をさらに含み得る。特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２またはＧＳである。より好ましくは、軽および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域は、ヒトＥＵ骨髄腫免疫グロブリンに由来してもよく、場合によっては、アロタイプの位置にある少なくとも１つのアミノ酸が、異なるＩｇＧ１アロタイプに見られるアミノ酸に変化し、そして場合によっては、ＥＵ番号システムに基づくＥＵ重鎖のアミノ酸２５３が、アラニンと置換され得る。Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、６３：７８‐８５（１９６９）を参照のこと。他の実施形態において、ＩｇＧ１配列は、ＩｇＧ４配列に変換し得る。
【０１００】
操作されたタンパク質を発現させるための、発現構築物の遺伝子操作および宿主細胞への挿入の方法は、当該分野で公知であり、ルーティン化された実験方法であることを、当業者は理解されよう。宿主細胞ならびにクローン抗体またはクローンフラグメントの発現方法は、例えば、２００５年７月２５日に出願された米国特許出願第１１／１８７，８６３号；２００５年１０月２０日に出願された同第１１／２５３，６６６号および２００６年７月１４日に出願された同第１１／４８７，２１５（それぞれその内容全体が参照により本明細書で援用される）に記載されている。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は説明ために提供されるものであり、本発明の特許請求の範囲を限定するためのものではない。
【０１０２】
一般的方法
細胞株
Ｓｐ２／０‐Ａｇ１４（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）の増強された変異株であるＳｐ／ＥＳＦ細胞を、２ｍＭのＬ‐グルタミンおよび１００単位／ｍＬのペニシリン‐ストレプトマイシンを添加したハイブリドーマ無血清培地（Ｈ‐ＳＦＭ）で維持した。Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、ＮＡＭＡＬＷＡおよびＪｅｋｏ‐１（ＡＴＣＣ）ヒトリンパ腫を、１０％ＦＢＳを含み、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＬ‐グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１００単位／ｍＬのペニシリン‐ストレプトマイシン添加したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。
【０１０３】
ＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物
それぞれＳｐ／ＥＳＦ内で発現させた２つのＤＮＬモジュールであるＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｖ‐ｍａｂとＩＦＮα２ｂ‐ＤＤＤ２との連結を介したＤＮＬにより、２０‐２ｂを作製した。ＤＮＬでさらに生成した、２０‐２ｂ（ヒト化ＩｇＧ１＋４つのＩＦＮα２ｂ）と類似した設計であるが、異なる標的化ＭＡｂを有するＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物を、対照としていくつかの実験で使用した：２２‐２ｂは、ＡＤ２モジュールとして、ＣＤ２２に対するものであり、リンパ腫と結合するＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｅ‐ｍａｂ（エピラツズマブ）を有し；７３４‐２ｂは、ＡＤ２モジュールとして、ハプテンであるＩｎ‐ＤＴＰＡに対するものであり、いかなる動物タンパク質または組織とも結合しないＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈ７３４を有し；およびＲｌ‐２ｂは、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ‐１Ｒ）と結合するＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１を使用する。
【０１０４】
分析方法
ＩＦＮα構築物のタンパク質濃度を、市販のヒトＩＦＮα２・ＥＬＩＳＡキットを用いて製造者の示すプロトコールに従い測定し（ＰＢＬ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｂｉｏ‐Ｓｉｌ ＳＥＣ ２５０カラム（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および移動相として０．０４ＭのＰＢＳ、ｐＨ６．８、１ｍＭのＥＤＴＡを用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ Ｍｏｄｅｌ １１６でサイズ排除ＨＰＬＣを行い確認した。還元および非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を、４〜２０％のトリス‐グリシン勾配ゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）を用いて行った。すべての比色（ＥＬＩＳＡおよびＭＴＳ）、発光（レポーター）および蛍光定量（ＣＤＣおよびＡＤＣＣ）アッセイを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１００マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により定量化した。
【０１０５】
ＩＦＮα活性の測定
ＩＦＮα２ｂの比活性を、ｉＬｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ Ｃｅｌｌ‐Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて製造者の示すプロトコールに従い測定した（ＰＢＬ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、２０‐２ｂおよびさらに７つのＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物を、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ中で１０、２．５および０．６２５ｎｇ／ｍＬに希釈した。ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）を、１、０．２５および０．０６２５ｎｇ／ｍＬに希釈した。各希釈液を、供給された細胞とともに一晩インキュベーションして、三重反復でアッセイした。付属の標準品で作成した標準曲線から、比活性を推定した。抗ウイルス活性を、Ａ５４９細胞に脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスを用いたインビトロでのウイルス曝露アッセイにより、独立分析機関（ＰＢＬ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）で測定した。
【０１０６】
インビトロ増殖
ＤａｕｄｉまたはＪｅｋｏ‐１を、９６ウェルプレートに５，０００細胞／ウェルで平板培養し、指示薬剤の濃度を増加させながら、４日（Ｄａｕｄｉ）または５日（Ｊｅｋｏ‐１）間、３７℃でインキュベートした。生細胞密度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて測定した。
【０１０７】
全血由来のＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓリンパ腫細胞のエキソビボ枯渇
健康な志願者由来のヒト全血中のＮＨＬ細胞および末梢血リンパ球に対する２０‐２ｂの効果を、フローサイトメトリーを用いてエキソビボで評価し、ｖ‐ｍａｂ、７３４‐２ｂまたはｖ‐ｍａｂと７３４‐２ｂとの組合せと比較した。ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ（５×１０４細胞）を、ヘパリン化した全血（１５０μｌ）と混合して、０．０１、０．１または１ｎＭの試験ＭＡｂとともに２日間３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９またはマウスＩｇＧ１アイソタイプの対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で細胞を染色した。赤血球溶解後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアで細胞を解析した。ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓ細胞は共にＣＤ１９＋であり、単球ゲート内にある。正常なＢ細胞およびＴ細胞はそれぞれＣＤ１９＋細胞およびＣＤ３＋細胞であり、リンパ球ゲートにある。スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性（ｐ＜０．０５）を評価した。マウスにおけるインビボでの効果。体重約２０ｇのＣ．Ｂ．１７ホモ接合型の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）雌マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）において実験を行った。０日目に、１．５×１０７個のＤａｕｄｉ細胞、２．５×１０６個のＲａｊｉ細胞または５×１０６個のＮＡＭＡＬＷＡ細胞を各マウスに静脈接種した。治療用量はすべて皮下注射により投与した。対照治療として生理食塩水を使用した。毎日監視した動物が、後肢麻痺を発症した時点でまたは瀕死の状態になった場合、人道的に動物を屠殺した。さらに、開始時の２０％を上回る体重を失った場合、マウスを屠殺した。Ｐｒｉｓｍ（ｖ４．０３）ソフトウェアパック（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して、Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロット（対数順位分析）により生存曲線を分析した。棄却ｚ検定により判定された異常値は、分析から切り捨てた。
【０１０８】
実施例１．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ発現ベクター
ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターが組換えＩｇＧ発現に用いられてきた（Ｑｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００５、３６：８４‐９５）。任意のＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２ベクターのＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２ベクターへの変換を促進するために、プラスミドシャトルベクターを作製した。Ｆｃ（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）の遺伝子を、ｐｄＨＬ２ベクターである鋳型および以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した：
Ｆｃ ＢｇｌＩＩ 左側
ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ （配列番号１）
Ｆｃ Ｂａｍ‐ＥｃｏＲＩ 右側
ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ （配列番号２）。
【０１０９】
アンプリマーを、ｐＧｅｍＴＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でクローニングした。Ｆｃ挿入フラグメントを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨIでｐＧｅｍＴから切り出し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨIによるｈ６７９‐Ｆａｂ‐ＡＤ２‐ｐｄＨＬ２ＡＤ２‐ｐｄＨＬ２の消化により調製したＡＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクター（Ｒｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００６、１０３：６８４１‐６）とライゲートして、シャトルベクターＦｃ‐ＡＤ２‐ｐｄＨＬ２を作製した。ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２発現ベクターをＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２発現ベクターに変換するために、８６１ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限酵素断片を前者から切り出し、Ｆｃ‐ＡＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクターから切り出した９５２ｂｐの ＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限酵素断片と置換した。以下は、組換えヒト化ＩｇＧ‐ＡＤ２モジュール作製のために生成され使用されたＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２発現ベクターの一部のリストである：
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＡ２０ （抗ＣＤ２０）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬＬ２ （抗ＣＤ２２）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬ２４３ （抗ＨＬＡ‐ＤＲ）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬＬ１ （抗ＣＤ７４）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１ （抗ＩＧＦ‐１Ｒ）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈ７３４ （抗インジウム‐ＤＴＰＡ）。
【０１１０】
実施例２．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ産生
トランスフェクションおよび安定なＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ分泌細胞株の選択
すべての細胞株をハイブリドーマＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で増殖させた。ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２ ベクター（３０μｇ）をＳａｌＩ制限酵素で消化して直線化し、エレクトロポレーション（４５０ボルト、２５μＦ）によりＳｐ２／０‐Ａｇ１４（２．８×１０６細胞）内にトランスフェクトした。ｐｄＨＬ２ベクターは、クローン選択およびメソトレキセート（ＭＴＸ）による遺伝子増幅を可能にする、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子を含む。
【０１１１】
トランスフェクションの後、細胞を９６ウェルプレートで平板培養し、０．２μＭのＭＴＸを含む培地中でトランスジェニッククローンを選択した。特異的抗イディオタイプＭＡｂでコートした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ産生能についてクローンをスクリーニングした。推定クローンからの条件培地をマイクロプレートウェルに移し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて融合タンパク質の検出を行った。最も高いシグナルを発するウェルを拡張して、最終的には産生に用いた。
【０１１２】
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧモジュールの産生および精製
融合タンパク質作製のために、ローラーボトル培養に２×１０５細胞／ｍｌで播種し、ローラーボトルインキュベーター中で５％ＣＯ２の下、３７℃で、細胞生存率が２５％を下回るまで（〜１０日）インキュベートした。培養ブロスを遠心分離により清澄して濾過し、限外濾過により５０倍にまで濃縮した。ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧモジュール精製のために、濃縮した上清液をプロテインＡ（ＭＡＢ Ｓｅｌｅｃｔ）アフィニティーカラムに負荷した。カラムをベースラインまでＰＢＳで洗浄し、ｐＨ２．５の０．１Ｍグリシンで融合タンパク質を溶出した。
【０１１３】
実施例３．インターフェロン（ＩＦＮ）‐α２ｂベースのＤＤＤモジュール生成
哺乳動物細胞内で発現するＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２の構築
ＩＦＮ‐α２ｂのｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅して、ＸｂａIおよびＢａｍＨIが制限部位であり、シグナルペプチドがＩＦＮ‐α２ｂ由来でありかつ６Ｈｉｓがヘキサヒスチジンタグであるという特徴を含む配列を得た：ＸｂａI―シグナルペプチド―ＩＦＮα２ｂ―６Ｈｉｓ―ＢａｍＨI（６Ｈｉｓは配列番号２８で開示される）。得られた分泌タンパク質は、そのＣ末端で、以下の配列：
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３）
のポリペプチドと融合しているＩＦＮ‐α２ｂで構成されていた。
【０１１４】
鋳型として完全長ヒトＩＦＮα２ｂのｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦ ヒトクローン、カタログ番号ＨＯＲＦ０１クローンＩＤ ＩＯＨ３５２２１）をおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ増幅を行った：
ＩＦＮＡ２ ＸｂａI 左側
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＣＴＧＧ （配列番号４）
ＩＦＮＡ２ ＢａｍＨI 右側
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣ （配列番号５）。
【０１１５】
ＰＣＲアンプリマーをｐＧｅｍＴベクター内にクローニングした。ＩＦＮ‐α２ｂとのライゲーション用に、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを以下のように調製した。ＣＨ１‐ＤＤＤ２‐Ｆａｂ‐ｈＭＮ‐１４‐ｐｄＨＬ２（Ｒｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００６、１０３：６８４１‐６）ベクターを、ＤＤＤ２コード配列を残しＦａｂ遺伝子配列をすべて除去するＸｂａＩおよびＢａｍＨIで消化した。ＩＦＮ‐α２ｂアンプリマーを、ｐＧｅｍＴからＸｂａＩおよびＢａｍＨIで切り出し、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクター内にライゲートして、発現ベクターＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１１６】
哺乳動物細胞によるＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２発現
ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２をＳａｌＩで消化して直線化し、エレクトロポレーションにより骨髄腫細胞内へ安定にトランスフェクトした（米国特許出願第１１／８７７，７２８号（実施例の節が参照により本明細書で援用される）を参照のこと）。ＥＬＩＳＡ法により、２つのクローンが、検出可能なレベルのＩＦＮ‐α２ｂを有することがわかった。２つのクローンのうち９５と称する一クローンが、実質的に産生能が低下することなく、無血清培地での増殖に適応した。次いで、このクローンを５週間にわたり、ＭＴＸ濃度を０．１から０．８μＭに増加させながら増幅した。この段階で、クローンを限界希釈によりサブクローニングし、最も産生能の高いサブクローン（９５‐５）を拡大した。振盪フラスコ中で増殖した９５‐５の産生能は、市販のｒＩＦＮ‐α２ｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＩＦ００７、ロット番号０６００８０３９０８４）を基準として用いて、２．５ｍｇ／Ｌであると推定された。
【０１１７】
ローラーボトル中で増殖したバッチ培養物からのＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２精製
クローン９５‐５を、０．８μＭのＭＴＸを含有する無血清ハイブリドーマＳＦＭ全２０Ｌを含む３４個のローラーボトルに拡大し、最終培養まで培養した。培養ブロスを処理して、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２を以下のように精製した。上清液を遠心分離により清澄し、０．２μＭで濾過し、１Ｘ結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．５）中へダイアフィルター濾過して、３１０ｍＬに濃縮し、最終濃度０．１％になるまでＴｗｅｅｎ２０を添加し、３０ｍＬＮｉ‐ＮＴＡカラムに負荷した。試料負荷の後、カラムを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０の１Ｘ結合緩衝液５００ｍＬ、次いで３０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．５の溶液２９０ｍＬで洗浄した。生成物を、２５０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５の溶液１１０ｍＬで溶出した。約６ｍｇのＩＦＮα２ｂ‐ＤＤＤ２が精製された。
【０１１８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２産生
ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２は、大腸菌においても、微生物発酵により、可溶性タンパク質として発現された。ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、コード配列を増幅した。アンプリマーを、Ｎｄｅ ＩおよびＸｈｏI制限部位を用いて、ＩｐＥＴ２６ｂ大腸菌発現ベクター内にクローニングした。１８℃で１２時間、１００μＭのＩＰＴＧを含むＬＢ振盪フラスコでの誘導により、タンパク質をＢＬ２１ｐＬｙｓＳ宿主細胞において細胞内発現させた。可溶性ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２を、上記ＩＭＡＣにより細胞溶解物から精製した。
【０１１９】
実施例４．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧと結合した４つのＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬコンジュゲートの生成
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧと結合した４つのＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬ複合体（図１）を以下のように作製した。簡潔に述べれば、選定したＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧを約２モル当量のＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２と混合し、この混合物に１ｍＭのＥＤＴＡおよび２ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加した後、穏やかな条件下で一晩室温で還元した。酸化型グルタチオンを２ｍＭになるまで添加し、この混合物をさらに１２〜２４時間、室温で保持した。ＤＮＬコンジュゲートをプロテインＡアフィニティーカラムで精製した。２０‐２ｂ、２２‐２ｂ、ｈＲ１‐２ｂおよび２４３‐２ｂと称するこのような４つのＤＮＬコンジュゲートを調製した。各コンジュゲートは、それぞれＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＡ２０（ＣＤ２０に対する特異性を有する）、ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬＬ２（ＣＤ２２に対する特異性を有する）、ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１（ＩＧＦ‐１Ｒに対する特異性を有する）およびＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬ２４３（ＨＬＡ‐ＤＲに対する特異性を有する）にアンカーされた、４コピーのＩＦＮ‐α２ｂを含んでいた。哺乳動物（ｍ）または大腸菌（ｅ）産生ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２から生成された２０‐２ｂのＳＥ‐ＨＰＬＣ分析では、それぞれが、１つのＩｇＧおよび４つのＩＦＮ‐α２ｂグループからなる共有結合複合体と一致した保持時間を有する主要ピークを示した（不掲載）。同様のＳＥ‐ＨＰＬＣプロファイルが、他の３つのＩＦＮ‐ＩｇＧコンジュゲートに関して見られた。
【０１２０】
実施例５．ＩＦＮ‐ＩｇＧコンジュゲートのインビトロ活性
２０‐２ｂのインビトロでのＩＦＮα生物学的活性を、細胞ベースのレポーター、ウイルス防御およびリンパ腫増殖の各アッセイを用いて、市販のペグ化ＩＦＮα２剤であるＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）およびＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）の生物学的活性と比較した。インターフェロン刺激応答エレメントと融合したレポーター遺伝子を含有するトランスジェニックヒト前単球細胞株を用いる細胞ベースのキットを使用して、比活性を測定した（図２Ａ〜２Ｄ）。２０‐２ｂの比活性（５３００ＩＵ／ｐｍｏｌ）は、ＰＥＧＡＳＹＳ（１７０ＩＵ／ｐｍｏｌ）およびＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（３４００ＩＵ／ｐｍｏｌ）双方よりも高かった（図２Ａ）。２０‐２ｂと同様に作製された７３４‐２ｂ、１Ｒ‐２ｂおよびさらに５つのＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物（データ不掲載）は、それぞれ同様の比活性（４０００〜８０００ＩＵ／ｐｍｏｌ）を示し、これにより、このような構造物を生成するためのＤＮＬ法に一貫性があることが実証された（図２Ａ）。４つのＩＦＮα２ｂグループを有することが、ＭＡｂ‐ＩＦＮαの効力増強に寄与した。ＩＦＮα当量に正規化すると、比活性／ＩＦＮαは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）よりも約１０倍高く、ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）よりも約２倍だけ低かった。
【０１２１】
インビトロでのウイルス防御アッセイにおけるＭＡｂ‐ＩＦＮα、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）およびＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）の比較により、ＭＡｂ‐ＩＦＮαが、比活性がＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）と同等のおよびＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）よりも１０倍高いＩＦＮα２ｂ抗ウイルス活性を保有することが実証された（図２Ｂ）。
【０１２２】
ＩＦＮα２ｂは、一部の腫瘍株に対して直接的な抗増殖性または細胞傷害性作用を有し得る。２０‐２ｂの活性を、ＩＦＮαに対して高感受性であるバーキットリンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ）を用いたインビトロ増殖アッセイで測定した（図２Ｃ）。各ＩＦＮα２剤は、インビトロにおいて強力（ＥＣ５０＝４〜１０ｐＭ）かつ効率的にＤａｕｄｉを阻害した（＞９０％）。しかし、２０‐２ｂ（ＥＣ５０＝Ｏ．２５ｐＭ）は、非標的化ＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物よりも約３０倍強力であった。２０‐２ｂの元の抗ＣＤ２０ＭＡｂは、Ｄａｕｄｉを含めた多くのリンパ腫細胞株に対して、かなりよリ高い濃度で（ＥＣ５０＞１０ｎＭ）インビトロでの抗増殖性活性を有する（Ｒｏｓｓｉら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６８：８３８４‐９２）。ＩＦＮαおよび抗ＣＤ２０双方に対してより低感受性のマントル細胞リンパ腫株であるＪｅｋｏ‐１を用いた、２０‐２ｂのインビトロ活性の評価も行った（図２Ｄ）。Ｊｅｋｏ‐１は、元の抗ＣＤ２０ＭＡｂに対してわずかに感受性であり、ＥＣ５０がほぼ１ｎＭで最大阻害率（Ｉｍａｘ）が１０％である。７３４‐２ｂで示されるように、Ｊｅｋｏ‐１（Ｉｍａｘ＝４３％；ＥＣ５０＝２３ｐＭ）は、Ｄａｕｄｉ（Ｉｍａｘ＝９０％；ＥＣ５０＝７．５ｐＭ）よりもＩＦＮα２ｂに対する反応性が低い。７３４‐２ｂに比べ、２０‐２ｂはＪｅｋｏ‐１をより高い程度（Ｉｍａｘ＝６５％）で阻害し、二相性の用量反応曲線を示した（図２Ｄ）。１０ｐＭ未満において、ＩＦＮα２ｂ活性に起因する低濃度の反応が見られ、７３４‐２ｂと同様にＩｍａｘ＝４３％でプラトーに達する。高濃度の反応は、１００ｐＭを超える部分で明らかであり、Ｉｍａｘは６５％に達した。２０‐２ｂの低濃度のＩＦＮα２ｂ反応（ＥＣ５０＝Ｏ．９７ｐＭ）は、７３４‐２ｂよりも２５倍強力であり、Ｄａｕｄｉでの結果と同様であった。
【０１２３】
２０‐２ｂの効力増大が、ＣＤ２０およびＩＦＮαシグナル伝達の相加／相乗作用によるものかを明らかにするために、元の抗ＣＤ２０抗体と７３４‐２ｂとの組合せ（ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂ）についてアッセイを行った。ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂの用量反応曲線は、１ｎＭを超える部分を除いては７３４‐２ｂ単独とほぼ同じであり、１ｎＭを超える部分では、前者では増加したが、後者では増加しなかった。これらの結果は、２０‐２ｂの低いＥＣ５０が、ＭＡｂ標的化に起因するものであるが、そのより大きいＩｍａｘはおそらくＩＦＮα２ｂおよびＣＤ‐２０シグナル伝達の相加活性によるものであることを示している。ＣＤ２０シグナル伝達の作用は、２０‐２ｂに対する高濃度の反応（ＥＣ５０＝Ｏ．８５ｎＭ）においてのみ明らかであり、これはｖ‐ｍａｂに対する反応（ＥＣ５０＝１．５ｎＭ）に匹敵する。ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂに関しては、２つの反応がオーバーラップするため、二相性の用量反応曲線が明白ではなかった。しかし、１ｎＭを超える濃度では相加作用が明らかであった。２０‐２ｂのＩｍａｘ（６５％）は、ＩＦＮα２ｂ の反応（Ｉｍａｘ＝４３％）とｖ‐ｍａｂ （Ｉｍａｘ＝１０％）の反応を加えたものよりも大きく、このことは、ＩＦＮα２ｂとｖ‐ｍａｂの作用間の相乗性の可能性を示唆している。
【０１２４】
ＡＤＣＣ活性
ＩＦＮαは、ＮＫ細胞およびマクロファージを活性化することにより、抗ＣＤ２０免疫療法の基本的な作用機序（ＭＯＡ）である、ＡＤＣＣ活性を増強し得る。本発明者らは、エフェクター細胞として末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、２つのＮＨＬ細胞株で２０‐２ｂとｖ‐ｍａｂのＡＤＣＣを比較した。複数のドナー由来のＰＢＭＣを用いた反復アッセイにより、ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ細胞双方について示すように、２０‐２ｂの方が、ｖ‐ｍａｂに比べＡＤＣＣをより増強することが実証された（図４Ａ）。この効果は、抗ＣＤ２２ＭＡｂであるエピラツズマブを含み、ＡＤＣＣをわずかに示すＭＡｂ‐ＩＦＮαである、２２‐２ｂでも示された（Ｃａｒｎａｈａｎら、２００７、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：１３３１‐４１）。
【０１２５】
ＣＤＣ活性
ＣＤＣは、I型抗ＣＤ２０ＭＡｂ（ｖ‐ｍａｂおよびリツキシマブを含む）の重要なＭＯＡであると考えられている。しかし、トシツモマブに代表されるII型ＭＡｂでは、この機能が欠如している（Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉら、２００２、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５１：１５‐２４）にもかかわらず、抗リンパ腫活性を有する。ｖ‐ｍａｂとは異なり、２０‐２ｂはインビトロでのＣＤＣ活性を示さない（図４Ｂ）。これらの結果は、補体結合がおそらく立体的干渉により阻害されていると思われるＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｖ‐ｍａｂモジュールベースの他のＤＮＬ構造物の結果（Ｒｏｓｓｉら、２００８）と一致する。
【０１２６】
実施例６．２０‐２ｂの薬物動態（ＰＫ）解析
雄のＳｗｉｓｓ‐Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける２０‐２ｂの薬物動態（ＰＫ）特性を評価し、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮおよびα２ｂ‐４１３（ＤＮＬにより作製されたペグ化ＩＦＮ、米国特許出願第１１／９２５，４０８を参照のこと）のものと比較した。様々な時間における血清試料中のＩＦＮ‐α濃度を、製造者による説明書に従ってＥＬＩＳＡ法により測定した。簡潔に述べれば、血清試料を、キットに備付けのヒトＩＦＮ‐αの基準に従って適切に希釈した。マイクロタイタープレートウェルに結合した抗体は、インターフェロンを捕捉する。次いで二次抗体を用いて、結合したインターフェロンを検出し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗二次抗体により定量化した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。図３はＰＫ解析の結果を表し、２０‐２ｂは他の薬剤と比べて、消失が有意に遅く、血中滞留時間が有意に長いことを示していた。２１０ｐｍｏｌの注入量において、時間単位で算出される薬物動態的な血中半減期は、８．０時間（２０‐２ｂ）、５．７時間（α２ｂ‐４１３）、４．７時間（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））および２．６時間（ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ）であった。消失速度（１／ｈ）は、０．０８７（２０‐２ｂ）、０．１２１（α２ｂ‐４１３）、０．１４９（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））および０．２６５（ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ）であった。算出されたＭＲＴ０．０８→∞（時間）は、２２．２（２０‐２ｂ）、１２．５（α２ｂ‐４１３）、１０．７（ＰＥＧＡＳＹＳ）および６．０（ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ）であった。薬物動態パラメーターは、個々の抗体またはサイトカインよりむしろ複合体の性質により決定されるため、サイトカイン‐ＤＮＬ複合体のＰＫ特性は、他のサイトカイン部分および抗体部分に一般化可能であり、上述の特定の２０‐２ｂ構築物に限定されないことが予想される。
【０１２７】
実施例７．２０‐２ｂのインビボ活性
血中安定性
２０‐２ｂは、３７℃で、ヒト血清中（≧１０日）または全血中（≧６日）において安定であった（不掲載）。２０‐２ｂ複合体の濃度を、二重特異性ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。アッセイ時間にわたり、検出可能な全血または血清中における血中２０‐２ｂレベルの変化は、実質的にはなかった。
【０１２８】
ヒト全血由来のリンパ腫細胞に対する２０‐２ｂのエキソビボでの効果
本発明者らは、２０‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂ、７３４‐２ｂまたはｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂが、エキソビボ環境でリンパ腫または正常なＢ細胞を全血から除去する能力を比較した（図５）。裸の抗ＣＤ２０ＭＡｂの治療効果は、３つの作用機序（ＭＯＡ）、すなわちシグナル伝達誘導性アポトーシスもしくは増殖停止、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを介して得られると考えられている（Ｇｌｅｎｎｉｅら、２００７、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：３８２３‐３７）。このアッセイにおいて、ｖ‐ｍａｂは、３つのＭＯＡすべてを利用し得るのに対し、インビトロの所見では、２０‐２ｂは、シグナル伝達および増強されたＡＤＣＣを利用できる可能性があるが、ＣＤＣはない。この短期モデルにおいて、２０‐２ｂおよび７３４‐２ｂのＩＦＮα２ｂグループは、腫瘍細胞に直接作用し、ｖ‐ｍａｂのＡＤＣＣ活性を増強しかつおそらくは免疫刺激作用をいくつか有し得る。しかし、インビボで生じ得る自然および適応免疫系の、ＩＦＮα仲介による活性化の全領域は、この２日のエキソビボアッセイでは実現されない。
【０１２９】
０．０１ｎＭでは、２０‐２ｂ（６０．５％）が、ｖ‐ｍａｂ（２２．８％）、７３４‐２ｂ（３８．６％）またはｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂ（４１．７％）よりも、有意にＤａｕｄｉ細胞を枯渇させた（図５）。０．１ｎＭでは、２０‐２ｂおよびｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂが同程度（８８．９％）にＤａｕｄｉ細胞を枯渇させ、これは、ｖ‐ｍａｂ（８２．４％）または７３４‐２ｂ（４０．７％）よりも多かった（図５）。１ｎＭでは、７３４‐２ｂ（５５．７％）以外、各薬剤ともＤａｕｄｉ枯渇が９５％を超えた（図５）。示される差はそれぞれ統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【０１３０】
Ｒａｍｏｓは、ＩＦＮα２ｂおよびｖ‐ｍａｂ双方に対してＤａｕｄｉよりも低感受性である。７３４‐２ｂの効果は中等度に過ぎず、各濃度におけるＲａｍｏｓ枯渇は２０％未満であった（図５）。０．０１および０．１ｎＭ双方において、２０‐２ｂの方が、ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂよりもＲａｍｏｓを枯渇させ、そしてｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂの方が、ｖ‐ｍａｂよりも多くの細胞を除去した（図５）。１ｎＭでは、７３４‐２ｂを除くすべての処置により同様のＲａｍｏｓ枯渇（７５％）が得られた（図５）。示される差はそれぞれ統計的に有意であった（ｐ＜０．０２）。
【０１３１】
７３４‐２ｂで実証されたように、このアッセイでは、ＩＦＮα２ｂ単独では、正常なＢ細胞を枯渇させない。これらの低濃度では、２０‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂおよびｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂは、それぞれ同様な用量反応的なＢ細胞枯渇を示し、これはＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓの枯渇よりも著しく低い。どの処置でもＴ細胞の有意な枯渇は得られなかった（データ不掲載）。
【０１３２】
ＳＣＩＤマウスにおける２０‐２ｂのインビボ効果
マウスモデルの限界は、マウス細胞がヒトＩＦＮα２ｂに対して非常に低感受性であるということである。ヒトにおいて得られ得る２０‐２ｂの全般的な治療上の利点として、先天および適応免疫双方の増強を挙げることができる。これらの限界を考慮して、本発明者らは、ＳＣＩＤマウスにおける播種性のバーキットリンパ腫モデルに対する、２０‐２ｂのインビボでの抗リンパ腫効果を調べた。始めに本発明者らは、高感受性の初期Ｄａｕｄｉモデルを試験した（図６Ａ）。接種の１日後に、各群に１低用量の２０‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂまたは７３４‐２ｂを投与した。ｖ‐ｍａｂまたは７３４‐２ｂの１用量０．７ｐｍｏｌ（１７０ｎｇ）では、生理食塩水と比較した場合の生存率において、ｖ‐ｍａｂに関しては有意な改善が得られた（ｐ＜Ｐ〈０．０００１）が、無関係対照ＭＡｂ‐ＩＦＮαである７３４‐２ｂでは得られなかった（図６Ａ）。この改善はわずかであり、生存期間中央値（ＭＳＴ）は生理食塩水での２７日からｖ‐ｍａｂでの３４日に増加した。しかし、２０‐２ｂの１用量０．７ｐｍｏｌ（１７０ｎｇ）では、ＭＳＴにおいて、生理食塩水およびｖ‐ｍａｂ群双方を１００日よりも多く上回る改善が得られた（ｐ＜Ｏ．０００１）（図６Ａ）。１９週間後にこの実験を終了し、その時点で、０．７ｐｍｏｌの２０‐２ｂ処置群中の７個体の長期生存例を剖検したところ、疾患の明白なエビデンスは見られなかった（治癒した）（図６Ａ）。注目すべきことに、最低用量０．０７ｐｍｏｌ（１７ｎｇ）の２０‐２ｂでさえもＭＳＴが２倍を超えた（図６Ａ）。
【０１３３】
次に発明者らは、マウスにおいて処置前に実質上より多くの腫瘍量が発現する、より困難な進行Ｄａｕｄｉモデルにおいて２０‐２ｂの効果を評価した（図６Ｂ）。腫瘍接種の７日後、各群に１回低用量（０．７、７．０または７０ｐｍｏｌ）の２０‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂ、７３４‐２ｂまたはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を投与した。生理食塩水の対照マウスのＭＳＴは２１日であった（図６Ｂ）。それぞれ（組換えＩＦＮαと比べて）ＰＫを増強するが、腫瘍を標的としない最高用量（７０ｐｍｏｌ）のＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）または７３４‐２ｂでは、ＭＳＴが２倍であった（４２日；ｐ＜Ｏ．０００１）（図６Ｂ）。１００倍低い用量（０．７ｐｍｏｌ）での２０‐２ｂ処置では、最高用量（７０ｐｍｏｌ）のＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）または７３４‐２ｂと同様の結果（３８．５日）が得られた（図６Ｂ）。１０倍低い用量（７ｐｍｏｌ）の２０‐２ｂ処置では、７０ｐｍｏｌのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）または７３４‐２ｂ処置よりも、有意な生存率の改善（８０．５日、２０％ＬＴＳ）が得られた（ｐ＜Ｏ．００１２）（図６Ｂ）。試験した最高用量（７０ｐｍｏｌ）では、２０‐２ｂにより１０５日を超えるＭＳＴに改善され、ＬＴＳは１００％であった（図６Ｂ）。本発明者らはこれまでに、ｖ‐ｍａｂが比較的低用量（３．５ｐｍｏｌ）で担Ｄａｕｄｉマウスの生存率を増加させ得るとともに、より高用量でＬＴＳが得られることを、初期腫瘍モデルを用いて実証した。しかし、今回の進行腫瘍モデルでは、１回量７０ｐｍｏｌのｖ‐ｍａｂの生存率に対する効果は、有意ではあるがほんのわずかであった（ＭＳＴ＝２４日、ｐ＝０．０００１）（図６Ｂ）。
【０１３４】
次いで本発明者らは、ＩＦＮαによる直接的阻害に対してＤａｕｄｉよりも低感受性でありかつｖ‐ｍａｂによる免疫療法に対して低反応性である、より困難な腫瘍モデルにおいて２０‐２ｂをアッセイした。Ｒａｊｉは、ＩＦＮα２ｂの直接作用に対してＤａｕｄｉに比べて〜１０００倍低感受性である。しかし、ＲａｊｉはＤａｕｄｉに匹敵するＣＤ２０抗原密度を有し（Ｓｔｅｉｎら、２００６、Ｂｌｏｏｄ、１０８：２７３６‐４４）、Ｄａｕｄｉにはかなり劣るものの、ｖ‐ｍａｂに対して反応性である（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、２００９、Ｂｌｏｏｄ、１１３；１０６２‐７０）。腫瘍接種５日後に治療を開始する進行Ｒａｊｉモデルにおいて、２０‐２ｂの効果を調べた（図７Ａ）。各群に、２週間にわたり計６回（各２５０ｐｍｏｌ）注射を施した。７３４‐２ｂでは、生理食塩水よりも生存率が改善されず（ＭＳＴ＝１６日）、ＲａｊｉのＩＦＮαに対する非感受性と一致した（図７Ａ）。ｖ‐ｍａｂでは、生理食塩水よりも生存率が有意に改善された（ＭＳＴ＝２６日、ｐ＜Ｏ．０００１）（図７Ａ）。２０‐２ｂは、他のすべての処置を上回っていた（ＭＳＴ＝３３日、ｐ＜ＰＯ．０００１）（図７Ａ）。
【０１３５】
最後に本発明者らは、ＮＡＭＡＬＷＡを用いて２０‐２ｂの効果を調べた（図７Ｂ）。ＮＡＭＡＬＷＡは、ＩＦＮαの直接作用に対して低感受性で、ＣＤ２０抗原密度がＤａｕｄｉまたはＲａｊｉに比べて〜２５倍低いヒトリンパ腫であり、抗ＣＤ２０免疫療法に対して耐性であると考えられている（Ｓｔｅｉｎら、２００６）。各群に、計６用量（各２５０ｐｍｏｌ）の２０‐２ｂまたは７３４‐２ｂを投与した。別の１群に、計７用量（各３．５ｎｍｏｌ）のｖ‐ｍａｂを投与した。生理食塩水で処置した群のＭＳＴは１７日であった（図７Ｂ）。７３４‐２ｂによる処置では、有意ではあるが、非常にわずかな生存率の改善が見られた（ＭＳＴ＝２０日、ｐ＝０．００１２）（図７Ｂ）。２０‐２ｂ（ＭＳＴ＝３４日）は、７３４‐２Ｂ（Ｐ＝０．０００４）および１４倍高い用量で投与したｖ‐ｍａｂ（ＭＳＴ＝２４日、Ｐ＝０．００２６）を上回っていた（図７Ｂ）。
【０１３６】
結論
以上の結果は、抗ＣＤ２０ＭＡｂを用いたＩＦＮαの標的化により、単独の薬剤または薬剤の組合せよりも、免疫サイトカインがより強力かつ効果的になることを明白に実証している。腫瘍に対するＭＡｂによるＩＦＮα標的化は、単一薬剤の投与計画の頻度を減らし、ＩＦＮ療法に付随する副作用を低減または除去し、非常に増大した効果をもたらし得る。さらに標的化ＩＦＮαは、腫瘍に対する急性免疫応答を誘導し、おそらくは、先天および適応免疫の多面的な刺激を介して免疫記憶を誘発することができる（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、２００２、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、１２：１１９‐３４）。別のグループは、化学的コンジュゲーションにより作製されるＭＡｂ‐ＩＦＮαを産生し、このような構築物の潜在的な臨床的有用性が明らかとなった（Ｐｅｌｈａｍら、１９８３、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１５：２１０‐１６；Ｏｚｚｅｌｌｏら、１９９８、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、４８：１３５‐４７）。マウスＩＦＮαおよび抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＭＡｂを含む組換えＭＡｂ‐ＩＦＮαは、免疫正常マウスにおいて、トランスジェニック（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）マウスＢ細胞リンパ腫の強力な阻害を示し、さらに免疫記憶による防御的な適応免疫応答の誘導も可能であった（Ｈｕａｎｇら、２００７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７９：６８８１‐８８）。
【０１３７】
本発明者らは、２０‐２ｂによる治療が、ＮＫ、Ｔ４、Ｔ８および樹状細胞を含めた多くの免疫細胞の局所的な動員および活性化を刺激して、細胞傷害性およびＡＤＣＣの増強をもたらし、さらに腫瘍に対する免疫記憶を潜在的に誘導し得るであろうと考える。しかし、ヒト細胞に比べ、マウス細胞はヒトＩＦＮα２ｂに対して極めて低感受性（〜４ｌｏｇ）である（Ｋｒａｍｅｒら、１９８３、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、３：４２５‐３５；Ｗｅｅｋら、１９８１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、５７：２３３‐３７）。したがって、上記マウスモデルのインビボ実験における２０‐２ｂの抗リンパ腫活性は、マウス免疫応答のＩＦＮα２ｂ活性化には起因し得ず、仮に起因し得ても極わずかである。むしろ殺傷性は、主としてリンパ腫細胞に対するＩＦＮα２ｂの直接作用によるものである。
【０１３８】
本発明者らは、２０‐２ｂが、抗ＣＤ２０免疫療法の最も重要なＭＯＡであり得るＡＤＣＣを増強することを示した。しかし、ヒトＩＦＮα２ｂは、マウス宿主の免疫エフェクター細胞を極わずかしか刺激しないため、ＩＦＮαに増強されたＡＤＣＣは、おそらくヒトにおけるほどは認められないであろう。これらの制限に関わらず、インビボでの結果により、２０‐２ｂが、ＩＦＮα感受性のＤａｕｄｉモデルにおいて、ｖ‐ｍａｂまたは非標的化ＭＡｂ‐ＩＦＮαの１００倍を超える効力を示し、非常に効果的な抗リンパ腫薬剤であり得ることが実証された。ＩＦＮαの直接作用に対して比較的非感受性であるリンパ腫モデル（Ｒａｊｉ／ＮＡＭＡＬＷＡ）または抗ＣＤ２０免疫療法に対して耐性であるリンパ腫モデル（ＮＡＭＡＬＷＡ）に対してさえも、２０‐２ｂは、ｖ‐ｍａｂまたは非標的化ＭＡｂ‐ＩＦＮαよりも優れた効果を示した。
【０１３９】
ＩＦＮα２ｂをｖ‐ｍａｂと融合させることで、循環時間が延長され、腫瘍標的化が可能となることにより、そのインビボでの効力が増大する。Ｄａｕｄｉモデルにおいて、Ｐｋの治療上の重要性が示され、ここでは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を緩やかに除去する方が、より高い比活性を有するＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）を急速に除去するよりも優れていた（データ不掲載）。２０‐２ｂは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）または７３４‐２ｂよりもかなり強力であったが、このことは、抗ＣＤ２０ＭＡｂを介したリンパ腫標的化が、２０‐２ｂの優れた効力および効果にとって重要であることを示唆している。驚くべきことに、標的化の効果は、インビトロアッセイにおいてさえも明らかであった。シグナル伝達を介したリンパ腫阻害のみ可能なインビトロ増殖実験において、２０‐２ｂは、単独のまたはｖ‐ｍａｂと組合せた場合の非標的化ＭＡｂ‐ＩＦＮαよりも２５倍低い濃度で活性を示した。エキソビボ環境においては、３つの抗ＣＤ２０ＭＯＡすべての関与が可能である。２０‐２ｂは、ＣＤＣ活性が無くても、血液由来リンパ腫の枯渇において、単独のＩＦＮαまたはｖ‐ｍａｂならびにその組合わせよりも効果的であったが、このことは標的化の重要性を示している。ＭＡｂ、エフェクターおよび標的細胞はすべて、実験を通して制限されていたため、インビボ／エキソビボ実験におけるＭＡｂ標的化の影響は、いささか驚くべきことである。本発明者らは、２０‐２ｂが、ヒト患者において実質上より大きなインビボ効果を有するであろうと考える。
【０１４０】
２０‐２ｂのＩＦＮα２ｂおよびｖ‐ｍａｂ成分はおそらく、相加的または相乗的に作用して２０‐２ｂの効力増強に寄与している可能性がある。インビトロ増殖アッセイでは、少なくとも１つの相加効果が示唆され、これはｖ‐ｍａｂおよび７３４‐２ｂの組合せが、どちらの薬剤単独よりも優れているというエキソビボ実験の結果により裏付けられた。この効果は、２０‐２ｂの一部としてのｖ‐ｍａｂのＡＤＣＣ活性増加を介して、または７３４‐２ｂと組合わされた場合に実現され得るが、ＡＤＣＣはインビトロ増殖アッセイにおいては機能せず、このことは、さらなる機序の存在を示唆する。ｖ‐ｍａｂ結合ＣＤ２０により伝達されるシグナルが、ＩＦＮαシグナルを増強することで、効力増大が生じる可能性がある。あるいは、徐々に内部移行するＭＡｂであるｖ‐ｍａｂの結合が、I型ＩＦＮ受容体の内部移行／下方制御を妨げることで、より持続的かつ効果的なＩＦＮα誘導性シグナルが生じる可能性がある。
【０１４１】
実施例８．エリスロポエチン（ＥＰＯ）ベースのＤＤＤモジュール生成
哺乳動物細胞内で発現するＥＰＯ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２の構築
ＥＰＯのｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅して、ＸｂａＩおよびＢａｍＨI が制限部位であり、シグナルペプチドがヒトＥＰＯ由来でありかつ６Ｈｉｓがヘキサヒスチジンタグである、以下の特徴配列を得た：Ｘｂａｌ―シグナルペプチド―ＥＰＯ―６Ｈｉｓ―ＢａｍＨI（６Ｈｉｓは、配列番号２８で開示される）。得られた分泌タンパク質は、そのＣ末端で、以下の配列：
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲ
ＬＲＥＡＲＡ（配列番号３）
からなるポリペプチドと融合しているＥＰＯで構成されていた。
【０１４２】
鋳型として完全長ヒトＥＰＯｃＤＮＡクローンをおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ増幅行った：
ＥＰＯ ＸｂａI 左側
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号６）
ＥＰＯ ＢａｍＨI 右側
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧ（配列番号７）。
【０１４３】
ＰＣＲアンプリマーを、ｐＧｅｍＴベクター内にクローニングした。ＥＰＯとのライゲーション用に、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを、ＸｂａIおよびＢａｍＨI制限酵素で消化して調製した。ＥＰＯアンプリマーを、ＸｂａIおよびＢａｍＨIでｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクター内にライゲートして、発現ベクターＥＰＯ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１４４】
哺乳動物細胞におけるＥＰ０‐ＤＤＤ２発現
ＥＰＯ‐ｐｄＨＬ２を、ＳａｌI酵素で消化して直線化し、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦ骨髄腫細胞内に安定にトランスフェクトした。クローンを、０．１５μＭのＭＴＸを含む培地で選択した。Ｈｉｓ‐タグ融合タンパク質を捕捉するためのＮｕｎｃ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ Ｎｉｃｋｅｌ‐Ｃｈｅｌａｔｅプレートおよび抗ＥＰＯ抗体による検出を用いたＥＬＩＳＡ法により、クローン番号４１、４９および３７がそれぞれ、〜０．５ｍｇ／ＬのＥＰＯを産生することが示された。９．６リットルの無血清ローラーボトル培養から、ＩＭＡＣにより約２．５ｍｇのＥＰＯ‐ＤＤＤ２が精製された。
【０１４５】
実施例９．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈ７３４と結合した４つのＥＰＯ‐ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬコンジュゲートである７３４‐ＥＰＯの生成
７３４‐ＥＰＯを、２０‐２ｂに関して上記した通り作製した。プロテインＡで精製した７３４‐ＥＰＯのＳＥ‐ＨＰＬＣ分析では、比較的大きい分子サイズの主要ピークおよびショルダーが見られた（不掲載）。主要ピークの保持時間は、１つのＩｇＧと４つのＥＰＯとのグループからなる共有結合複合体と一致した。ショルダーは、ＩｇＧ‐ＥＰＯコンジュゲートの非共有結合二量体によるものと思われた。クーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析および抗ＥＰＯイムノブロット分析では、非還元条件下において作製物は、推定されるＭＷ（〜３１０ｋＤａ）と一致する２６０ｋＤａを超えるＭｒを有することが示された（不掲載）。還元条件下において、７３４‐ＥＰＯの３つの成分ポリペプチド（ＥＰＯ‐ＤＤＤ２、重鎖‐ＡＤ２および軽鎖）を表すバンドが明瞭であり、量的に類似しているようであった（不掲載）。非作製物の夾雑物は検出されなかった。
【０１４６】
ＥＰＯ‐ＤＤＤ２および７３４‐ＥＰＯがＥＰＯ応答性ＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ）の増殖を刺激する能力について、組換えヒトＥＰＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を陽性対照としてアッセイを行った。ＴＦ１細胞を、１×１０４細胞／ウェルを含む９６ウェルプレートで、２０％ＦＢＳ添加かつＭ‐ＣＳＦ無添加であるＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ＥＰＯ構築物の濃度（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を、市販のキット（ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡキット、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６３０）を用いて測定した。細胞を、９００Ｕ／ｍｌ〜０．００１ Ｕ／ｍｌの範囲の濃度のｒｈＥＰＯ、ＥＰＯ‐ＤＤＤ２または７３４‐ＥＰＯ存在下で７２時間培養した。ＭＴＳ試薬２０μｌ／ウェルを用いたＭＴＳアッセイにより、生細胞密度を比較した。このアッセイでは、６時間のインキュベート後、９６ウェルプレートリーダーでＯＤ４９０を測定した。用量反応曲線およびＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて算出した（図８）。ＥＰＯ‐ＤＤＤ２および７３４‐ＥＰＯは共に、ｒｈＥＰＯの約１０％であるインビトロでの生物学的活性を示した。
【０１４７】
実施例１０．顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）ベースのＤＤＤモジュール生成
哺乳動物細胞内で発現するＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２の構築
Ｇ‐ＣＳＦのｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅して、シグナルペプチドがヒトＧ‐ＣＳＦ由来でありかつ６Ｈｉｓがヘキサヒスチジンタグである、以下の特徴を含む配列を得た：ＸｂａＩ―シグナルペプチド―Ｇ‐ＣＳＦ―６Ｈｉｓ―ＢａｍＨI（６Ｈｉｓは、配列番号２８で開示される）。得られた分泌タンパク質は、そのＣ末端で、配列番号３からなるポリペプチドと融合しているＧ‐ＣＳＦから構成されていた。
【０１４８】
鋳型として完全長ヒトＧ‐ＣＳＦｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＩＭＡＧＥヒト、カタログ番号９７００２ＲＧ、クローンＩＤ５７５９０２２）をおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ増幅を行った：
Ｇ‐ＣＳＦ ＸｂａIＬｅｆｔ
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧ（配列番号８）
Ｇ‐ＣＳＦ ＢａｍＨI‐Ｒｉｇｈｔ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ（配列番号９）。
【０１４９】
ＰＣＲアンプリマーをｐＧｅｍＴベクター内にクローニングした。Ｇ‐ＣＳＦとのライゲーション用に、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを、ＸｂａIおよびＢａｍＨI制限酵素で消化して調製した。Ｇ‐ＣＳＦアンプリマーを、ＸｂａIおよびＢａｍＨIでｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクター内にライゲートして、発現ベクターＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１５０】
哺乳動物細胞におけるＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２発現
Ｇ‐ＣＳＦ‐ｐｄＨＬ２を、ＳａｌI酵素で消化して直線化し、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦ骨髄腫細胞内に安定にトランスフェクトした。クローンを、０．１５μＭのＭＴＸを含む培地で選択した。サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、クローン番号４が０．１５ｍｇ／ＬのＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２を産生することが示された。
【０１５１】
ローラーボトル中で増殖したバッチ培養からのＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２精製
クローン番号４を、０．４μＭのＭＴＸを含有するハイブリドーマＳＦＭを計２０Ｌ含む３４個のローラーボトルに拡大し、最終培養まで培養した。上清液を遠心分離により清澄して、濾過し（０．２μＭ）、１Ｘ結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）中へダイアフィルター濾過して濃縮した。濃縮物をＩＭＡＣにより精製した。
【０１５２】
大腸菌におけるＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２の構築および発現
Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２は、大腸菌においても、微生物発酵により、可溶性タンパク質として発現された。コード配列を、Ｇ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、コード配列を増幅した。アンプリマーを、ＮｄｅIおよびＸｈｏI制限部位を用いて、ＩｐＥＴ２６ｂ大腸菌発現ベクター内にクローニングした。１８℃で１２時間、１００μＭのＩＰＴＧを含むＬＢ振盪フラスコでの誘導により、タンパク質をＢＬ２１ｐＬｙｓＳ宿主細胞において細胞内発現させた。可溶性Ｇ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２を、ＩＭＡＣにより細胞溶解物から精製した。
【０１５３】
大腸菌におけるＮ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の構築および発現
ＤＤＤ２配列とペプチドスペーサーを、Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）のＮ末端で融合することにより、別のＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２モジュールを作製した。Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は、１７位の不対システイン残基がセリンで置換されている点で、野生型とは異なる。Ｎ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）を大腸菌内で発現させ、ＩＭＡＣにより精製した。
【０１５４】
実施例１１．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１と結合した４つのＮ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）部分を含むＤＮＬコンジュゲートであるｈＲ１‐１７Ｓの生成
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１と過剰のＮ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）を酸化還元条件下で混合してｈＲ１‐１７Ｓを作製した。プロテインＡで精製したｈＲ１‐１７ＳのＳＥ‐ＨＰＬＣ分析では、比較的大きい分子サイズの主要ピークおよびショルダーが見られた（不掲載）。主要ピークの保持時間は、１つのＩｇＧと４つのＧ‐ＣＳＦとのグループからなる共有結合複合体と一致した。ショルダーは、ＩｇＧ‐Ｇ‐ＣＳＦコンジュゲートの非共有結合二量体によるものと思われた。クーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析および抗Ｇ‐ＣＳＦイムノブロット分析では、非還元条件下において、作製物は、推定されるＭＷ（〜２６０ｋＤａ）と一致するＭｒを有することが示された（不掲載）。還元条件下において、ｈＲ１‐１７Ｓの３つの成分ポリペプチド（Ｎ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）、重鎖‐ＡＤ２および軽鎖）を表すバンドが検出された（不掲載）。
【０１５５】
実施例１２．配列変異体
特定の好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ複合体に組み込まれるＡＤおよびＤＤＤ配列は、以下の示すようなＡＤ２およびＤＤＤ２のアミノ酸配列を含む：
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１０）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号１１）。
【０１５６】
しかし、別の実施形態において、配列変異体ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分をサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ複合体の構築に使用し得る。ＡＤおよびＤＤＤドメインの構造‐機能の関係が研究対象となってきた（例えば、Ｂｕｒｎｓ‐Ｈａｍｕｒｏら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、１４：２９８２‐９２；Ｃａｒｒら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：１７３３２‐３８；Ａｌｔｏら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：４４４５‐５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３９６：２９７‐３０６；Ｓｔｏｋｋａら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、４００：４９３‐９９；Ｇｏｌｄら、２００６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２４：３８３‐９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２４：３９７‐４０８（それぞれその全内容が参照により本明細書で援用される）を参照のこと）。
【０１５７】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）は、ＡＤ‐ＤＤＤ間の結合相互作用の結晶構造を調べ、ヒトＤＤＤ配列には、二量体形成またはＡＫＡＰ結合において重要な保存アミノ酸残基（配列番号１２の下線部）が数多く含まれると結論付けた（参照により本明細書で援用されるＫｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）の図１を参照のこと）。ＤＤＤ配列の配列変異体の設計において、下線部のいかなる残基も変化させないことが望ましいと同時に、保存的アミノ酸置換は、二量体形成およびＡＫＡＰ結合にあまり重要ではない残基に対して行われ得ることを、当業者は理解されよう。
タンパク質キナーゼＡ由来のヒトＤＤＤ配列
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１２）。
【０１５８】
Ａｌｔｏら（２００３）は、様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティック解析を行い、ＤＤＤに対して０．４ｎＭの結合定数を有する、ＡＫＡＰ‐ＩＳと呼ばれるＲII選択的ＡＤ配列（配列番号１７）を設計した。ＡＫＡＰ‐ＩＳを、ＡＫＡＰのＰＫＡへの結合に対するペプチドアンタゴニストとして設計した。配列番号１３において、ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列中の残基のうち、置換によりＤＤＤとの結合が低下する傾向にあるものに下線を付す。
ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１３）
【０１５９】
同様に、Ｇｏｌｄ（２００６）は、結晶構造解析およびペプチドスクリーニングを用いて、ＰＫＡのＲIIアイソフォームに対し、ＲIアイソフォームに比べて５桁高い選択性を示すＳｕｐｅｒＡＫＡＰ‐ＩＳ配列（配列番号１４）を開発した。下線を付した残基は、ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列に比べて、ＲIIαのＤＤＤ部分との結合を増大させるアミノ酸置換の位置を示す。この配列において、Ｎ末端のＱ残基には残基番号４を付し、Ｃ末端のＡ残基には残基番号２０を付す。置換によりＲIIαに対する親和性に影響を与え得た残基は、８、１１、１５、１６、１８、１９および２０であった（Ｇｏｌｄら、２００６）。特定の別の実施形態において、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ‐ＩＳ配列をＡＫＡＰ‐ＩＳのＡＤ部分の配列で置換して、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を調製し得ると考えられる。ＡＫＡＰ‐ＩＳのＡＤ配列で置換し得る他の代替配列を、配列番号１５〜１７で示す。ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列に対する置換には下線が付されている。配列番号１１で示されるＡＫＡＰ‐ＩＳ配列と同様に、ＡＤ部分にも、配列番号１１で示されるようなＮ末端残基システインおよびグリシンならびにＣ末端残基グリシンおよびシステインがさらに含まれ得ることが予想される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ‐ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号１４）
代替ＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１５）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１６）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１７）。
【０１６０】
Ｓｔｏｋｋａら（２００６）もまた、配列番号１８〜２０で示すような、ＡＫＡＰのＰＫＡへの結合に対する競合ペプチドを開発した。このペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１（配列番号１８）、ＲＩＡＤ（配列番号１９）およびＰＶ‐３８（配列番号２０）と称された。Ｈｔ３１ペプチドが、ＰＫＡのＲIIアイソフォームに対してより高い親和性を示したのに対し、ＲＩＡＤおよびＰＶ‐３８は、ＲIに対してより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号１８）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号１９）
ＰＶ‐３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号２０）。
【０１６１】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）は、ＡＫＡＰのＰＫＡへの結合に対するさらに別の競合ペプチドを開発し、このペプチドは、ＲII型のＰＫＡのＤＤＤに対して０．４ｎＭという低い結合定数を有していた。様々なＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列が、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（参照により本明細書で援用される）の表１に記載されている。異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間で高度に保存されていた残基を、ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列に関して下線を付すことにより、以下に示す（配列番号１３）。残基は、Ｃ末端アラニン残基を加えれば、Ａｌｔｏら（２００３）により確認されたものと同じである（参照により本明細書で援用されるＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４を参照のこと）。ＲIIのＤＤＤ配列に対して特に親和性の高いペプチドアンタゴニストの配列を、配列番号２１〜２３で示す。
ＡＫＡＰ‐ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１３）
ＡＫＡＰ７δ‐ｗｔ‐ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２１）
ＡＫＡＰ７δ‐Ｌ３０４Ｔ‐ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＴＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２２）
ＡＫＡＰ７δ‐Ｌ３０８Ｄ‐ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＤＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２３）。
【０１６２】
Ｃａｒｒら（２００１）は、ヒトおよび非ヒトタンパク質由来の異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調べ、異なるＤＤＤ部分間で最も高度に保存されていると思われる、ＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらを、配列番号１２のヒトＰＫＡＲIIαのＤＤＤ配列に関して下線を付すことにより、以下に示す。特に保存されていた残基は、さらにイタリック体で示す。これらの残基は、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）がＡＫＡＰタンパク質との結合に重要であると示唆したものと一部重複するが、同一ではない。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１２）。
【０１６３】
一般に、異なるタンパク質由来のＤＤＤおよびＡＤ配列中で高度に保存されているこれらのアミノ酸残基は、アミノ酸置換を行う際にも変わらないことが望まれ得る残基であり、一方、それほど高度に保存されていない残基は、容易に変化させて本明細書に記載のＡＤおよび／またはＤＤＤ配列の配列変異体を作製し得ることを、当業者は理解されよう。
【０１６４】
ＤＤＤおよび／またはＡＤ部分の配列変異体に加え、ある実施形態において、抗体とＡＤ配列とを繋ぐ抗体部分またはリンカーペプチド配列内に、配列変異を導入することが望まれ得る。一具体例では、上記２０‐２ｂ重鎖のＣ末端残基は、本来のリジン残基から変化したものである。野生型重鎖のＣ末端配列を、考え得る３つの融合タンパク質配列変異体と共に、配列番号２４〜２７で示す。
ＷＴ
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２４）
（Ｌ）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号２５）
（Ａ）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＡＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号２６）
（−）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号２７）。
【０１６５】
重鎖定常領域配列中の野生型Ｃ末端リジンをロイシンで置換することにより、ｈＡ２０（Ｌ）と称する配列変異体を作製した。２０‐２ｂ構築物形成のための上記例に記載のように、ｈＡ２０（Ｌ）‐２ｂ・ＤＮＬ構築物を作製して、ロイシン置換配列を組み込んだ。変異体の薬物動態特性を比較するために、様々なＤＮＬ構築物注射後の１、２、３および４日のマウス血清試料を採取した。各時点におけるマウス血清中のインターフェロン血清中濃度は、２０（Ｌ）‐２ｂ構築物の方が２０‐２ｂ構築物よりも約２倍高いと測定された。しかし、ｈＡ２０ＩｇＧの血清中濃度の比較では、２０（Ｌ）‐２ｂおよび２０‐２ｂ構築物間における実質的な差は見られなかった。野生型リジンのロイシンへの置換が、抗体ＩｇＧ部分由来のＡＤ部分のタンパク質分解切断の低下をもたらし、また、タンパク質分解により複合体からＩＦＮが失われ、次いで、非コンジュゲートＩＦＮの血清からのクリアランス速度が、ＤＮＬ構築物と結合したＩＦＮのクリアランス速度に比べて高くなった、と結論付けられる。ＤＮＬ構築物の抗体部分またはリンカー部分におけるこれらのおよびその他のアミノ酸置換は、得られるＤＮＬ構築物の治療的および／または薬物動態的特性を増強するために使用され得ることを、当業者は理解されよう。
【０１６６】
本明細書において開示および特許請求されるすべての組成物および方法は、本開示を踏まえれば、必要以上の実験を行うことなく作製および使用することができる。組成物および方法は、好適な実施形態という形で記載されているが、本明細書に記載の、組成物および方法に対して、ならびに方法の個々の段階においてまたは一連の段階において、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく変更を加え得ることは、当業者にとって明らかである。より具体的には、化学的かつ生理学的に類似した特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換え得るが、同一または同様の結果が得られるであろう。当業者に明らかなこのような類似の代替および修正はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念に含まれるものと見なされる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００８年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／０４３，９３２号、２００８年１０月１３日に出願された同第６１／１０４，９１６号および２００８年１２月３日に出願された同第６１／１１９，５４２号の利益を主張する。本出願は、２００６年３月２８日に出願された米国特許出願第１１／３９１，５８４の分割出願であった、２００９年３月３日に出願された同第１２／３９６，９６５号；２００６年３月２４日に出願された同第１１／３８９，３５８号；２００６年６月２９日に出願された同第１１／４７８，０２１号；２００６年１２月５日に出願された第１１／６３３，７２９の分割出願であった、２００９年３月３日に出願された同第１２／３９６，６０５号；２００７年５月８日に出願された同第１１／７４５，６９２号；および２００７年１０月２６日に出願された同第１１／９２５，４０８号の一部継続出願である。これらの出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００５年４月６日に出願された米国仮特許出願第６０／６６８，６０３号；２００５年１０月２０日に出願された同第６０／７２８，２９２号；２００５年１２月１６日に出願された同第６０／７５１，１９６号、２００６年３月１４日に出願された同第６０／７８２，３３２号；２００６年５月１５日に出願された同第６０／８００，３４２号；および２００６年１１月６日に出願された同第６０／８６４，５３０号の利益を主張する。各優先出願の内容全体が、参照により本明細書で援用される。
【０００２】
本発明は、インビトロでの活性を保持しかつ増強されたインビボでの有効性を示す多量体サイトカインの設計および生成に関する。サイトカインベースのＤＤＤ部分と組換えＩｇＧとの部位特異的コンジュゲーションによりヒト化モノクローナル抗体（ＭＡｂ）に固定される四量体サイトカインを産生するために、２つの抗体重鎖がそれぞれＡＤ部分と融合されかつＤＤＤ部分の二量体が各ＡＤ部分と結合する、ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ‐ａｎｄ‐ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）法を使用する。好適な実施形態において、ヒト化抗ＣＤ２０ＭＡｂ（ｈＡ２０）をインターフェロン‐α２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）とコンジュゲートさせて、４コピーのＩＦＮα２ｂを含む２０‐２ｂＤＮＬ構築物を形成する。サイトカイン‐ＭＡｂ構築物は、様々な病態を治療するのに有用であり、腫瘍のような標的細胞に対して、親ＭＡｂ単独、サイトカイン単独、コンジュゲートされていないＭＡｂとサイトカインとの併用または対照ＭＡｂとコンジュゲートされたサイトカインよりも大きな効力を示す。
【背景技術】
【０００３】
関連技術
インターフェロン‐α（ＩＦＮα）は、癌の動物モデル（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３：４６０４‐１５）およびヒト癌患者（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎら、１９８０、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、９３：３９９‐４０６）の双方において抗腫瘍活性を有することが報告されている。ＩＦＮαは、癌遺伝子の下方制御、腫瘍抑制因子の上方制御、腫瘍表面のＭＨＣクラスIタンパク質発現の増加を介した免疫認識の増強、アポトーシスの増強および化学療法剤に対する感作を含めた、種々の直接的な抗腫瘍作用を発揮し得る（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎら、１９９４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：１１９８‐２０５；Ｍａｔａｒｒｅｓｅら、２００２、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１６０：１５０７‐２０；Ｍｅｃｃｈｉａら、２０００、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：１６７‐７９；Ｓａｂａａｗｙら、１９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、１４：１１４３‐５１；Ｔａｋａｏｋａら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ、４２４：５１６‐２３）。一部の腫瘍に対しては、ＩＦＮαは、ＳＴＡＴ１の活性化により直接的かつ強力な抗増殖性作用を有し得る（Ｇｒｉｍｌｅｙら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ、９１：３０１７‐２７）。間接的には、ＩＦＮαは、血管新生を阻害し（ＳｉｄｋｙおよびＢｏｒｄｅｎ、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７：５１５５‐６１）、宿主免疫細胞を刺激し得るが、このことは、抗腫瘍応答全体にとって重要であり得るにもかかわらず、ほとんど過小評価されてきた（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１７：３６９‐７２）。ＩＦＮαは、骨髄細胞（Ｒａｅｆｓｋｙら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５：２５０７‐１２；Ｌｕｆｔら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１９４７‐５３）、Ｔ細胞（Ｃａｒｒｅｒｏら、２００６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０３：９３３‐４０；Ｐｉｌｌｉｎｇら、１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｏｌ．，、２９：１０４１‐５０）およびＢ細胞（Ｌｅら、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１４：４６１‐７０）への作用を介した、免疫応答に対する多面的な影響を有する。自然免疫系の重要なモジュレーターとして、ＩＦＮαは、樹状細胞の急速な分化および活性化を誘導し（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６４：６８２７‐３０；Ｐａｑｕｅｔｔｅら、１９９８、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．ｂｉｏｌ．、６４：３５８‐６７；Ｓａｎｔｉｎｉら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１：１７７７‐８８）、ＮＫ細胞の細胞傷害性、遊走、サイトカイン産生および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強する（Ｂｉｒｏｎら、１９９９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７：１８９‐２２０；Ｂｒｕｎｄａら、１９８４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４４：５９７‐６０１）。
【０００４】
癌治療法としてのＩＦＮαの有望性は、主にその短い循環血中半減期および全身毒性により妨げられてきた。ペグ化形態のＩＦＮα２では、循環時間の増加が見られ、それによりその生物学的有効性が増強される（ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ、２００３、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、２：２１４‐２１；Ｏｓｂｏｒｎら、２００２、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、３０３：５４０‐８）。ＩＦＮαとモノクローナル抗体（ＭＡｂ）との融合により、腎クリアランスの減少、溶解性および安定性の向上ならびに循環血中半減期の顕著な増加を含めた、ペグ化と同様の効果をもたらすことができる。これによる直接的な臨床上の利点は、低頻度および低用量のための要件であり、治療濃度の延長を可能にする。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するＭＡｂを使用した、ＩＦＮαの腫瘍への標的化により、ＩＦＮαの全身濃度を制限すると同時に、腫瘍への付着および保持を有意に増進させ、それにより治療指数を増加させることができる。ＩＦＮαの腫瘍への集積度増加により、ＩＦＮαの直接的な抗増殖性、アポトーシス性および抗血管新生の活性を増強し、さらに抗腫瘍免疫応答を刺激しかつそれに焦点を当てることができる。実際、同系のマウスＩＦＮα分泌トランスジェニック腫瘍を用いたマウスにおける研究では、ＩＦＮαの局所的集積により誘発された免疫応答の増強が実証された（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉら、２００７、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８９：８８４‐９３）。
【０００５】
ＣＤ２０は、ＭＡｂ‐ＩＦＮαを用いたＢ細胞リンパ腫治療のための興味ある候補ＴＡＡである。リツキシマブによる抗ＣＤ２０免疫療法は、比較的毒性が低く、最も成功を収めたリンパ腫に対する治療法の１つである（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１６：２８２５‐３３）。リツキシマブは、一部の患者群において免疫原性を示す可能性があり、初回投与の注入時間がかなり長いため（Ｃｈｅｓｏｎら、２００８、ＮＥＪＭ、３５９：６１３‐２６）、より優れたＣＤ２０標的化の候補は、ヒト化ＭＡｂのベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）である（Ｓｔｅｉｎら、２００４、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１０：２８６８‐７８）。
【０００６】
現在臨床評価中のリツキシマブとＩＦＮαとの併用療法においては、リツキシマブ単独の場合よりも効果の向上が見られた（Ｋｉｍｂｙら、２００８、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ、４９：１０２‐１２；Ｓａｌｌｅｓら、２００８、Ｂｌｏｏｄ、１１２：４８２４‐３１）。これらの研究では、この併用のいくつかの利点とともに、ＩＦＮαに関連した欠点も実証されている。週１回のリツキシマブ注入に加え、患者は通常、ＩＦＮαを３回／週で数ヶ月間投与され、ＩＦＮα療法に付随する一般的な副作用である、インフルエンザ様の症状に悩まされる。そしてこのことにより、耐容量が制限される。抗ＣＤ２０ＭＡｂ‐ＩＦＮαコンジュゲートであれば、単一の薬剤をより少ない頻度と用量で投与して、副作用を制限または除去することが可能であり、はるかに優れた効果をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
インビボでの効果の改善、毒性の低下および優れた薬物動態特性を示す、改善された抗体‐サイトカインコンジュゲートが、当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法（Ｃｈａｎｇら、２００７、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１３：５５８６ｓ‐９１ｓ）を用いて調製される、サイトカインと抗体とのコンジュゲートのための方法および組成物を開示する。ドック・アンド・ロック法により、インビボ適用に適した、安定で明確なコンジュゲートが生成される。好適な実施形態において、ＤＮＬ複合体は、ＩＦＮα２ｂのようなサイトカインを４コピー含み、各サイトカインは、二量体化／ドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分に付加されている。ＤＤＤ部分は自発的に二量体化し、各ＤＤＤ二量体は、アンカードメイン（ＡＤ部分）と結合する。より好適な実施形態において、ＡＤ部分は、ＩｇＧ抗体の各重鎖の定常領域Ｃ末端に付加され、四量体のサイトカイン‐ＩｇＧ・ＤＮＬ複合体を生じる。
【０００９】
しかし、２００９年３月３日に出願された米国特許第１２／３９６，９６５号；２００６年３月２４日に出願された同第１１／３８９，３５８号；２００６年３月２８日に出願された同第１１／３９１，５８４号；２００６年６月２９日に出願された同第１１／４７８，０２１号、２００９年３月３日に出願された同第１２／３９６，６０５号、２００６年１２月５日に出願された同第１１／６３３，７２９号；および２００７年１０月２６日に出願された同第１１／９２５，４０８号（各特許の実施例の節は、参照により本明細書で援用される）に開示されるような、異なる構造および異なるサイトカイン／抗体（もしくは抗体フラグメント）比を有する他のタイプのＤＮＬ複合体が構築され、かつ本明細書で特許請求される方法および組成物の範囲内で使用され得ることを、当業者は理解するであろう。本明細書においては、便宜上、対象とするＤＮＬ構築物を、一般にサイトカイン‐ＭＡｂ構築物と称する。しかし、「ＭＡｂ」という名称は、抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を示す一般名称として使用されることを、当業者は理解する。
【００１０】
任意の既知の抗体またはその抗原結合フラグメントを、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物に組み込み得ることを、当業者はさらに理解されよう。好適な実施形態において、当該複合体は癌治療に有用であり、抗体が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合する。様々な腫瘍関連抗原が当該分野において公知であり、炭酸脱水酵素IX、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ‐ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣ ＡＭ‐６、Ｂ７、フィブロネクチンＥＤ‐Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子‐１（ＩＬＧＦ‐１）、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２５、ＩＰ‐１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ‐９５、ＮＣＡ‐９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、ＨＬＡ‐ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン‐フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ‐α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。異なる病態の抗体ベースの治療には、その他のタイプの標的抗原が有用であり、そのような別の任意の抗原を標的とする抗体を組み込んだサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物が、本明細書で特許請求される方法および組成物において使用され得る。
【００１１】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物に使用され得る抗癌抗体の例としては、ｈＲ１（抗ＩＧＦ‐１Ｒ、２００９年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／１４５，８９６号）、ｈＰＡＭ４（ａｎｔｉ‐ＭＵＣ１、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ‐９ （抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ‐ＤＲ、米国仮特許出願第１１／３６８，２９６号）、ｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡ、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡ、米国仮特許出願第１０／６７２，２７８号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ‐１、米国特許第７，２３８，７８５号）およびｈＭＮ‐３（抗ＣＥＡ、米国特許出願第１０／６７２，２７８号）が挙げられるが、これらに限定されない。引用された各特許または各特許出願の実施例の節は、参照により本明細書で援用される。ここに列記したものは限定的なものではなく、他の任意の既知の抗ＴＡＡ抗体が、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物に組み込まれ得ることを、当業者は理解されよう。
【００１２】
キメラ抗体はマウス抗体ほど強いヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しないため、キメラ抗体の使用が好ましい。ＨＡＭＡ反応誘発の可能性をさらに減少させるために、ヒト化抗体の使用がさらにより好ましい。以下で論じるように、マウスのフレームワークおよび定常領域配列と、対応するヒト抗体のフレームワークおよび定常領域配列との置換によるマウス抗体のヒト化技術は、当該分野で公知であり、多くのマウス抗癌抗体に応用されてきた。抗体のヒト化は、ヒトフレームワークの１つまたは複数のアミノ酸残基を、元のマウスフレームワーク領域配列由来の対応する残基と置換することも含み得る。以下でも論じるように、ヒト抗体の作製技術もまた公知であり、このような抗体は、本発明のサイトカイン‐ＭＡｂ構築物に組み込まれ得る。
【００１３】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物に組み込まれ得るサイトカインの例として、ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）、ＨＭＧＢ‐１（高移動度タンパク質１）、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１６、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐１９、ＩＬ‐２３、ＩＬ‐２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ‐８、ＭＣＰ‐１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＥＮＡ‐７８、ＭＣＰ‐１、ＩＰ‐１０、Ｇｒｏ‐β、エオタキシン、インターフェロン‐α、‐β、‐λ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＭＳＦ、Ｆｌｔ‐３リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＩＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびＬＩＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
ある実施形態は、少なくとも１つの治療剤または少なくとも１つの診断剤と結合した、治療または診断用のサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物コンジュゲートに関し得る。同じまたは異なるタイプの治療剤を複数有する構築物も包含される。あるいは、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を、サイトカイン‐ＭＡｂ構築物の前、同時または後に投与される少なくとも１つの治療剤との併用で投与してもよい。以下でより詳細に論じるように、放射性核種、免疫調節物質、抗血管新生剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス促進剤、光活性治療剤、細胞傷害剤、化学療法剤、毒素、その他の抗体またはその抗原結合フラグメントを非限定的に含めた当該分野で既知の任意の治療剤を、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物と併用して、または当該構築物に付加して使用してもよい。
【００１５】
サイトカイン‐ＭＡｂ複合体は、癌、自己免疫疾患、過形成、敗血症、糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、喘息およびオスラー‐ウェーバー症候群を非限定的に含めた様々な疾患または病状の治療に有用である。
【００１６】
特定の実施形態において、本明細書に開示する方法および組成物は、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、若年性糖尿病、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維性肺胞炎のような自己免疫疾患を治療するのに有用であり得る。
【００１７】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物で治療され得る癌のタイプの例として、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、神経膠腫、黒色腫、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経細胞芽腫、黒色腫、皮膚癌、肝臓癌、甲状腺髄様癌腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
さらに他の実施形態は、サイトカイン‐ＤＤＤ融合タンパク質またはＦａｂ‐ＡＤ融合タンパク質のような融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含有するベクターおよび宿主細胞ならびにサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を作製する方法に関する。
【００１９】
特に好適な実施形態は、ヒト化抗ＣＤ２０抗体（ｈＡ２０）に付加された４つのＩＦＮα２ｂグループを含むＩＦＮα‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物である、２０‐２ｂに関する。２０‐２ｂ構築物は、インビトロ増殖、エキソビボでのリンパ腫細胞減少およびインビボ治療の研究により、元の抗体単独、ＩＦＮαサイトカイン単独または非標的化ＩＦＮα‐ＭＡｂよりも優れた抗リンパ腫剤であることが見出された。２０‐２ｂ構築物は、リンパ腫、白血病、骨髄腫および関連状態の治療に特に有用である。
【００２０】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ」という用語は、文脈上明らかに単数のみを意味するものでない限り、単数または複数を指し得る。
【００２１】
本明細書において、「約」という用語は、ある数値プラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味する。例えば「約１００」であれば、９０から１１０の間の任意の数値を指す。
【００２２】
抗体は、完全長の（すなわち、天然に発生する、または通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメントの組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部位を指す。
【００２３】
抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ´、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような、抗体の一部分のことである。構造を問わず、抗体フラグメントは、インタクトな抗体により認識されるものと同じ抗原と結合する。「抗体フラグメント」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントのような可変領域からなる単離フラグメントならびに軽および重可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子も包含する。本明細書において「抗体フラグメント」という用語は、Ｆｃフラグメントまたは単一アミノ酸残基のような、抗原結合活性をもたない抗体の部分は包含しない。
【００２４】
抗体融合タンパク質という用語は、同一のまたは異なる特異性を有する、同一のまたは異なる一本鎖抗体または抗体フラグメントのセグメントが１つまたは複数結合した、組換えにより産生される抗原結合分子を指し得る。融合タンパク質の結合価、すなわち一価、二価、三価または多価は、その融合タンパク質が単一の抗原またはエピトープに対する結合腕または結合部位をいくつ有するかを示す。抗体融合タンパク質の多価性とは、１つの抗原と結合する際に、複数の相互作用を利用することができ、したがって抗原との結合の親和力を増大し得ることを意味する。特異性、すなわち単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性とは、抗体融合タンパク質がいくつの抗原またはエピトープと結合することができるかを示す。これらの定義を用いれば、天然の抗体、例えばＩｇＧは、２つの結合アームを有するが、１種類のエプトープと結合するので、二価である。単一特異性で多価の融合タンパク質は、１種類のエプトープに対して１つ以上の結合部位を有するが、１種類のエプトープのみと結合する。融合タンパク質は、単一の抗体成分、異なる抗体成分の多価または多重特異性の組合せ、あるいは同一抗体成分の複数のコピーを含み得る。融合タンパク質は、抗体または抗体フラグメントならびに治療剤をさらに含み得る。このような融合タンパク質に適する治療剤の例として、免疫調節物質および毒素が挙げられる。１つの好適な毒素には、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、好ましくは組換えＲＮａｓｅが含まれる。しかし、当該用語は限定的なものでなく、様々なタンパク質エフェクターまたはペプチドエフェクターが、融合タンパク質に組み込まれ得る。別の非限定的な例において、融合タンパク質は、以下で論じるように、ＤＮＬ構築物を作製するためのＡＤまたはＤＤＤ配列を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】サイトカイン‐ＤＤＤ２（Ｃ）発現のための遺伝子構造（ＡおよびＢ）ならびにＩｇＧ‐ＡＤ２（Ｄ）ＤＮＬモジュールを表した模式図である。これらのモジュールが結合して、ＩｇＧ（Ｅ）と融合した４つのサイトカインからなるＤＮＬ構造が形成される。
【図２】ペグ化または天然のＩＦＮαと比較した、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物におけるインビトロでのＩＦＮα活性を示す図である。比活性（ＩＵ／ｐｍｏｌ）を実施例に記載通り測定した。既知濃度の各被検試料の活性は、ｒｈＩＦＮα２ｂの標準曲線から推定した。濃度を増加させた２０‐２ｂ（●）、７３４‐２ｂ（■）、ｖ‐ｍａｂ（○）、ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂ（□）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（▼）、ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（▲）または１Ｒ‐２ｂ（▽）の存在下で培養物を増殖させ、相対的生細胞密度をＭＴＳで測定した。未治療の細胞から得られたシグナルの％を、モル濃度の対数に対してプロットした。用量反応曲線およびＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて算出した。エラーバーはＳＤを表す。図２（Ａ）は細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイの図である。図２（Ｂ）はＥＭＣウイルスおよびＡ５４９細胞によるウイルス防御アッセイの図である。図２（Ｃ）はＤａｕｄｉ細胞を用いたインビトロでのリンパ腫増殖アッセイの図である。図２（Ｄ）はＪｅｋｏ‐１細胞を用いたインビトロでのリンパ腫増殖アッセイの図である。
【図３】Ｓｗｉｓｓ‐Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける薬物動態解析の結果を表した図である。マウスに２０‐２ｂ、α２ｂ‐４１３、ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮまたはＰＥＧＡＳＹＳを投与し、血清試料のＩＦＮα２ｂ濃度を、ＥＬＩＳＡ法により９６時間にわたり解析した。血中消失曲線を示す。血中半減期（Ｔ１／２）消失率および平均滞留時間（ＭＲＴ）を、挿入した表にまとめる。
【図４】図４（Ａ）は２０‐２ｂのＡＤＣＣエフェクター機能を表した図である。ＤａｕｄｉまたはＲａｊｉ細胞を、新たに単離したＰＢＭＣの存在下で、５μｇ／ｍｌの２０‐２ｂ、２２‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂ、エピラツズマブ（ｅ‐ｍａｂ）またはｈ７３４と共に４時間インキュベートした後、細胞溶解の定量化を行った。図４（Ｂ）は２０‐２ｂのＣＤＣエフェクター機能を表した図である。Ｄａｕｄｉ細胞を、ヒト補体の存在下で、２０‐２ｂ（●）、７３４‐２ｂ（■）またはｖ‐ｍａｂ（○）の段階希釈によりインキュベートした。ｎＭ濃度の対数に対する％補体対照（補体のみで処置した細胞と比較した、試験試料中の生細胞数）をプロットした。エラーバーはＳＤを表す。
【図５】２０‐２ｂによる、全血からのＮＨＬ細胞枯渇の増強を示す図である。新鮮なヘパリン化ヒト血液をＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓと混合し、０．０１、０．１または１ｎＭの２０‐２ｂ（●）、ｖ‐ｍａｂ（○）、７３４‐２ｂ（■）またはｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂ（□）と共に２日間インキュベートした。これらの処置のリンパ腫および末梢血リンパ球に対する効果を、フローサイトメトリーを用いて評価した。エラーバーはＳＤを表す。
【図６】図６（Ａ）は播種性バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）異種移植モデルにおける２０‐２ｂの治療効果を示す生存曲線を描いた図である。０日目に、ＣＢ．１７ＳＣＩＤ雌マウスにＤａｕｄｉ細胞を静注投与した。処置は、単回皮下用量で投与された２０‐２ｂ（●）、７３４‐２ｂ（■）、ｖ‐ｍａｂ（○）、ＰＥＧＡＳＹＳ（▼）または生理食塩水（×）で構成された。処置日を矢印で示す。生存曲線は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析した。初期Ｄａｕｄｉモデルにおいて、１日目に、０．７ｐｍｏｌ（実線）または０．０７ｐｍｏｌ（破線）の１回量を、１０匹のマウスからなる各グループに投与した。図６（Ｂ）は進行Ｄａｕｄｉモデルにおける図６（Ａ）と同様の実験を示す図である。７日目に、０．７ｐｍｏｌ（実線）、７ｐｍｏｌ（破線）または７０ｐｍｏｌ（灰色線）の１回量を、１０匹のマウスからなる各グループに投与した。
【図７】図７（Ａ）は播種性バーキットリンパ腫（ＲａｊｉおよびＮＡＭＡＬＷＡ）異種移植モデルにおける２０‐２ｂの治療効果を示す生存曲線を表した図である。０日目に、ＣＢ．１７ＳＣＩＤ雌マウスにＮＨＬ細胞を静注投与した。処置は、単回皮下用量で投与された２０‐２ｂ（●）、７３４‐２ｂ（■）、ｖ‐ｍａｂ（○）または生理食塩水（×）で構成された。処置日を矢印で示す。生存曲線はＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析した。進行Ｒａｊｉモデルにおいて、５、７、９、１２、１４および１６日目に、２５０ｐｍｏｌの用量を、１０匹のマウスからなる各グループに投与した。図７（Ｂ）は初期ＮＡＭＡＬＷＡモデルにおける図７（Ａ）と同様の実験を示す図である。１、３、５、８、１０および１２日目に、２５０ｐｍｏｌ用量の２０‐２ｂもしくは７３４‐２ｂを、または１、５、９、１３、１７、２１および２５日目に、３．５ｎｍｏｌ用量のｖ‐ｍａｂを、６匹のマウスからなる各グループに投与した。
【図８】ＥＰＯ標準品、７３４‐ＥＰＯまたはＥＰＯ‐ＤＤＤ２で７２時間処置したＴＦ１細胞を用いた、ＥＰＯ活性に関する細胞ベースのアッセイの結果を示す図である。用量反応曲線およびＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて算出した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法
ＤＮＬ法は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットとＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰs）のアンカードメイン（ＡＤ）との間に生じる特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００５、５７９：３２６４；ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００４、５：９５９）。ＰＫＡは、セカンドメッセンジャーｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合により誘発される、最も研究されているシグナル伝達経路の１つにおいて中心的役割を果たし、１９６８年にウサギ骨格筋から最初に単離された（Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６８、２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性型に保持されている２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムには、２つのタイプのＲサブユニット（ＲIおよびＲII）が見出されており、各タイプにはαおよびβアイソフォームが存在する（Ｓｃｏｔｔ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９９１、５０：１２３）。Ｒサブユニットは、安定な二量体としてのみ単離されており、その二量体化ドメインは、最初の４４のアミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、６：２２２）。ｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合により、広範囲なセリン／スレオニンキナーゼ活性に向けて活性触媒サブユニットの解離が生じ、これらはＰＫＡとＡＫＡＰとのドッキングを介したＰＫＡの区画化により選択された基質へと向かう（ｃｏｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、２６５；２１５６１）。
【００２７】
１９８４年に、微小管結合タンパク質２である最初のＡＫＡＰが特徴付けられて以来（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１９８４、８１：６７２３）、細胞膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリアおよび小胞体を含めた様々な細胞内部位に局在する５０以上のＡＫＡＰが、酵母からヒトに至る種において多様な構造で同定されている（ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００４、５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性へリックスである（Ｃａｒｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰ間で非常に変化に富み、ＲII二量体に関しては、２〜９０ｎＭにわたる結合親和性が報告されている（Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００３、１００：４４４５）。興味深いことに、ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットとのみ結合する。ヒトＲIIαでは、ＡＤは２３アミノ末端残基により形成される疎水性表面と結合する（ＣｏｌｌｅｄｇｅおよびＳｃｏｔｔ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９９、６：２１６）。したがって、ヒトＲIIαの二量体化ドメインおよびＡＫＡＰ結合ドメインは共に、同じＮ末端４４アミノ酸配列内に存在し（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２００１、２０：１６５１）、本明細書ではこれをＤＤＤと称する、。
【００２８】
リンカーモジュールとしてのヒトＲIIα のＤＤＤおよびＡＫＡＰのＡＤ
本発明者らは、ヒトＲIIαのＤＤＤおよび特定のアミノ酸配列のＡＤを、任意の２つの要素（以下ＡおよびＢと呼ぶ）をドッキングさせて非共有結合複合体を形成するための優れたリンカーモジュールのペアとして用いるためのプラットフォーム技術を開発した。さらに当該技術では、ＤＤＤおよびＡＤの双方の枢要な位置へシステイン残基を導入して、ジスルフィド結合の形成を促進することにより、形成された複合体が安定なテザー構造内へロックされ得る。「ドック・アンド・ロック」アプローチの概略的な方法論は以下の通りである。ＤＤＤ配列と要素Ａの前駆体とを結合させて要素Ａを構築し、第１の構成要素（以下ａと呼ぶ）を生成する。ＤＤＤ配列は、自発的な二量体形成に作用するため、Ａはａ２で構成されることになる。ＡＤ配列と要素Ｂの前駆体とを結合させて要素Ｂを構築し、第２の構成要素（以下ｂと呼ぶ）を生成する。ａ２中に含まれる二量体ＤＤＤモチーフに、ｂ中に含まれるＡＤ配列と結合するためのドッキング部位が生じることで、ａ２とｂとの即時の結合が促進され、これによりａ２ｂで構成される２成分の三量体複合体が形成される。この結合事象は、それに続く反応により、ジスルフィド架橋を介した共有結合により２つの要素が固定されて、不可逆性となる。この反応は、有効局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に起こり、これは、最初の結合相互作用により、ＤＤＤおよびＡＤの双方上に存在する反応性チオール基が近接して（Ｃｈｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００１、９８：８４８０）、部位特異的に結合するためであると考えられる。
【００２９】
好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物は、ＩｇＧ免疫グロブリン分子がそのＣ末端で２コピーのＡＤ部分に付加される、ａ２ｂ構造の変異に基づく。各ＡＤ部分は、二量体の形態で２つのＤＤＤ部分と結合することができる。サイトカインを各ＤＤＤ部分に付加させることにより、各ＩｇＧ分子に４コピーのサイトカインがコンジュゲートする。より好適な実施形態において、ＤＮＬ構築物中の４つの各サイトカインは同一のものである。
【００３０】
２つの前駆体の官能基から離れたＤＤＤとＡＤとを付加させることにより、このような部位特異的結合が、２つの前駆体の元の活性を保持することも期待される。このアプローチは本来モジュール的であり、広範な物質を部位特異的かつ共有結合的に結合させることに応用可能である。ＤＮＬ法は、２００５年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／７２８，２９２号；２００５年１２月１６日に出願された同第６０／７５１，１９６号；および２００６年３月１４日に出願された同第６０／７８２，３３２；ならびに２００６年３月２４日に出願された米国特許出願第１１／３８９，３５８号；２００６年３月２８日に出願された同第１１／３９１，５８４号、２００６年６月２９日に出願された同第１１／４７８，０２１号；２００６年１２月５日に出願された同第１１／６３３，７２９号および２００７年１０月２６日に出願された同第１１／９２５，４０８に開示された。
【００３１】
好適な実施形態において、以下の実施例で説明するように、エフェクター部分は、ＤＤＤユニットまたはＡＤユニットと結合して融合タンパク質または融合ペプチドを形成することができるタンパク質またはペプチドである。核酸の合成、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅により、対象とする融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を生成することを含めた、融合タンパク質作製のための様々な方法が知られている。このような二本鎖核酸を、標準的な分子生物学的手法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９を参照のこと）により、融合タンパク質作製用の発現ベクターに挿入してもよい。このような好適な実施形態において、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分を、エフェクタータンパク質またはエフェクターペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加してもよい。しかし、ＡＤまたはＤＤＤ部分のエフェクター部分への付加部位は、生理活性に関与するエフェクター部分の化学的性質およびエフェクター部分の部位（単数または複数）によって異なり得ることを、当業者は理解されよう。様々なエフェクター部分の部位特異的付加は、二価架橋試薬の使用および／またはその他の化学的コンジュゲーション技術のような、当該分野で公知の技術を用いて行われ得る。
【００３２】
サイトカインおよびその他の免疫調節物質
ある好適な実施形態において、エフェクター部分は免疫調節物質である。免疫調節物質は、それが存在する場合、体の免疫系を変化させるか、抑制するか、または刺激する作用物質である。有用な免疫調節物質として、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチンおよびこれらの組合せが挙げられ得る。特に有用なものは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）のような造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子、インターフェロン‐α、‐βまたは‐γのようなインターフェロンならびに「ＳＩ因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子である。
【００３３】
より好適な実施形態において、エフェクター部分は、サイトカイン、例えばリンホカイン、モノカイン、増殖因子および伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインとして、ヒト成長ホルモン、Ｎ‐メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子‐αおよび‐β；ミューラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ‐βのような神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ‐αおよびＴＧＦ‐βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子‐Iおよび‐II；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン‐α、‐βおよび‐γ；マクロファージ‐ＣＳＦ（Ｍ‐ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ‐I、ＩＬ‐１α、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐10、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２； ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１４、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１６、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２１、ＩＬ‐２５のようなインターロイキン、ＬＩＦ、ｋｉｔ‐リガンドまたはＦＬＴ‐３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ‐αのようなＴＮＦ）およびＬＴが挙げられる。
【００３４】
サイトカインのようなタンパク質免疫調節物質またはペプチド免疫調節物質のアミノ酸配列は、当該分野で公知であり、そのような任意の既知の配列が、本発明の実施において使用され得る。サイトカインの配列に関する多くの公開情報源が当業者に既知である。例えば、ＮＣＢＩデータベースには、エリスロポエチン（ＧｅｎＢａｎｋ、ＮＭ０００７９９）、ＩＬ‐１β（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＡＡＨ０８６７８）、ＧＭ‐ＣＳＦ（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＡＡＡ５２５７８）、ＴＮＦ‐α（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＣＡＡ２６６６９）、インターフェロン‐α（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＡＡＡ５２７１６．１）、インターフェロン‐α２ｂ（ＧｅｎＰｅｐｔ、ＡＡＰ２００９９．１）および実質上任意の上記ペプチド免疫調節物質またはタンパク質免疫調節物質のような、数多くのサイトカインおよび免疫調節物質に関するタンパク質およびコード核酸の配列が共に収められている。対象とする実質上任意のタンパク質エフェクターまたはペプチドエフェクター部分に対する適切なアミノ酸および／または核酸配列を同定することは、当業者にとって慣例となっていることである。
【００３５】
抗体および抗体フラグメント
様々な実施形態において、抗体または抗体の抗原結合フラグメントを、多量体サイトカインに付加し得る。抗原結合抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ´、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのように、当該分野で公知であり、任意のこのような既知のフラグメントを用い得る。本明細書において、抗原結合抗体フラグメントとは、インタクトまたは元の抗体により認識される抗原と同じ抗原と結合する、任意の抗体フラグメントを指す。対象とする実質上任意の抗体またはフラグメントのＡＤおよび／またはＤＤＤ複合体の調製技術は、公知である（例えば、米国特許出願第１１／６３３，７２９号）。
【００３６】
治療剤とコンジュゲートされていない抗体またはそのフラグメント（「裸の」抗体またはそのフラグメントと呼ぶ）を使用し得る。代替的実施形態において、抗体またはフラグメントを、１つまたは複数の治療剤および／または診断剤とコンジュゲートさせてもよい。種々のこのような治療剤および診断剤が当該分野で公知であり、以下でより詳細に論じるように、任意のこのような既知の治療剤および診断剤を用い得る。
【００３７】
実質上任意の標的抗原に対するモノクローナル抗体の調製技術は、当該分野で公知である。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、「Ｎａｔｕｒｅ」、２５６：４９５（１９７５）ならびにＣｏｌｉｇａｎら編、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」、第１巻、ｐ．２．５．１〜２．６．７ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ 、１９９１）を参照のこと。簡潔に述べれば、モノクローナル抗体は以下のようにして得ることができる。抗原を含む組成物をマウスに注射し、脾臓を取り出してＢリンパ球を採取する。このＢリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマをクローニングする。抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択して、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、このハイブリドーマ培養液から抗体を単離する。
【００３８】
ＭＡｂは、すでに確立された様々な技術によりハイブリドーマ培養液から単離および精製することができる。このような単離技術として、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ｐ．２．７．１〜２．７．１２およびｐ．２．９．１〜２．９．３を参照のこと。また、Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」、第１０巻、ｐ．７９‐１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９９２）も参照のこと。
【００３９】
免疫原に対する初回抗体産生の後、この抗体の配列を決定し、次いで組換え技術によりこれを調製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に公知である。ヒト化、キメラ化またはヒト抗体由来の抗体成分の使用により、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が未然に防がれる。
【００４０】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めたマウス抗体の可変領域と置換された、組換えタンパク質である。キメラ抗体は、被検体に投与された場合、免疫原性の減少および安定性の増加を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインの一般的なクローニング技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、８６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体の構築技術は当業者に公知である。一例として、Ｌｅｕｎｇらは、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体であるマウスＬＬ２のＶκおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれヒトκおよびＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることにより、ＬＬ２キメラを作製した（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９４、１３：４６９）。
【００４１】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂの作製技術は当該分野で公知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２：４３７（１９９２）およびＳｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１５０：２８４４（１９９３）を参照のこと）。マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖由来のマウスＣＤＲをヒト抗体の対応する可変ドメインへ移転することにより、キメラまたはマウスモノクローナル抗体をヒト化し得る。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もまた、ヒトＦＲ配列と置換される。単にマウスＣＤＲをヒトＦＲに移転するだけでは、抗体親和性の低下または喪失さえも生じる場合が多いため、マウス抗体本来の親和性を回復するために、さらなる改変が必要となり得る。このことは、ＦＲ領域中の１つまたは複数のヒト残基を、それらのマウスの対応部分と置換して、エピトープに対する十分な結合親和性を有する抗体を得ることにより達成され得る。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２３９：１５３４（１９８８）を参照のこと。一般に、マウスの対応部分とは異なりかつ１つまたは複数のＣＤＲアミノ酸残基と近接または接触しているヒトＦＲアミノ酸残基が置換の候補になるであろう。
【００４２】
ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座を移入したトランスジェニック動物を用いる完全ヒト抗体の作製方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉら、２００４、Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２７：３１５‐２８；ＣｏｎｒａｄおよびＳｃｈｅｌｌｅｒ、２００５、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．、８：１１７‐２６；ＢｒｅｋｋｅおよびＬｏｓｅｔ、２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．、３：５４４‐５０）。完全ヒト抗体は、遺伝子または染色体トランスフェクション法ならびにファージディスプレイ技術により構築することが可能であり、これらは全て当該分野で公知である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、「Ｎａｔｕｒｅ」、３４８：５５２‐５５３（１９９０）を参照のこと。このような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体に比べさらに少ない副作用を示ことおよびインビボにおいて実質的に内在性のヒト抗体として機能することが期待される。ある実施形態において、このような技術により作製されるヒト抗体が、本明細書で特許請求される方法および手順において使用され得る。
【００４３】
別の一方法において、ファージディスプレイ技術を用いてヒト抗体を生成し得る（例えば、Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａら、２００５、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．、４：１２６‐４０）。ヒト抗体は、正常なヒトまたは癌のような特定の病態を示すヒトから生成し得る（Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａら、２００５）。罹患個体からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが、疾患関連抗原に対する抗体へと偏り得ることである。
【００４４】
この方法論の非限定的な一例において、Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーを構築した。概略的には、循環血リンパ球から全ＲＮＡを得た（同上）。組換えＦａｂを、μ、γおよびκ鎖抗体レパートリーからクローニングして、ファージディスプレイライブラリーに挿入した（同上）。重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列に対して特異的なプライマーを用い、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＦａｂのｃＤＮＡライブラリー作製に使用した（Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１‐９７）。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ‐Ｗｉｄｈｏｐｆらに従い行った（２０００、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｂａｒｂａｓら編、第１版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ｐｐ．９．１‐９．２２に掲載）。最終的なＦａｂフラグメントを制限酵素で消化して、バクテリオファージゲノムへ挿入し、ファージディスプレイライブラリーを作製した。このようなライブラリーは、当該分野で公知の標準的なファージディスプレイ法によりスクリーニングし得る（例えば、ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：３６４‐３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９、Ｔｈｅ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、４３：１５９‐１６２を参照のこと）。
【００４５】
ファージディスプレイは様々な形式で行うことができ、総説としては、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３：５５６４‐５７１（１９９３）を参照のこと。ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞により生成してもよい。米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５（その内容全体が参照により本明細書で援用される）を参照のこと。これらの技術は、例示的なものであり、ヒト抗体および抗体フラグメントの作製およびスクリーニングの任意の既知の方法を用い得ることを、当業者は理解されよう。
【００４６】
別の方法において、標準的な免疫化プロトコールを用いて、実質上任意の免疫原性標的に対する抗体を生成するために、ヒト抗体を産生するよう遺伝子操作されたトランスジェニック動物を使用し得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら（１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、７：１３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６）およびＴａｙｌｏｒら（１９９４、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６：５７９）により開示されている。このような系の非限定的な一例は、Ａｂｇｅｎｉｘ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１１‐２３）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅおよび類似の動物では、マウス抗体遺伝子が不活性化されて、機能的なヒト抗体遺伝子と置換されているが、残りのマウス免疫系は元の状態に保たれている。
【００４７】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、可変領域の大部分を含むヒトＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座の一部をアクセサリー遺伝子および調節配列と共に含有する、生殖系列構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換されたものである。ヒト可変領域レパートリーを用いて抗体産生Ｂ細胞を作製してもよく、このＢ細胞を既知の技術で処理してハイブリドーマにしてもよい。標的抗原で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、通常の免疫応答によりヒト抗体を産生し、この抗体を上述の標準的な技術により収集および／または製造してもよい。様々な系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅが利用可能であり、それぞれの系統は異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子導入により産生されたヒト抗体は、通常のヒト抗体の薬物動態特性を保持しつつ治療能力を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。本明細書で特許請求される組成物および方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系の使用に限定されるものではなく、ヒト抗体を産生するよう遺伝子操作された任意のトランスジェニック動物を使用し得ることを、当業者は理解されよう。
【００４８】
抗体フラグメント
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを、既知の技術により生成することができる。抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどのような、抗体の抗原結合部分のことである。Ｆ（ａｂ´）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により作製することができ、Ｆａｂ´フラグメントは、Ｆ（ａｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成することができる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ´フラグメントの同定を迅速かつ簡便に行えるように、Ｆａｂ´発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７４‐１２８１）。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、抗体のパパイン消化により生成してもよく、Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィドの還元により得てもよい。
【００４９】
一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。このＶＬドメインとＶＨドメインが会合されて標的結合部位を形成する。これら２つのドメインはさらに、ペプチドリンカー（Ｌ）により共有結合する。ｓｃＦｖ分子の作製および適切なペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．ＲａａｇおよびＭ．Ｗｈｉｔｌｏｗ、「Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖｓ」ＦＡＳＥＢ、第９巻：７３‐８０（１９９５）ならびにＲ．Ｅ．ＢｉｒｄおよびＢ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ、「Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ」、ＴＩＢＴＥＣＨ、第９巻：１３２‐１３７（１９９１）に記載されている。
【００５０】
単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）の作製技術もまた当該分野で公知であり、例えば、Ｃｏｓｓｉｎｓら（２００６、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．、 ５１：２５３‐２５９）により開示されており、参照により本明細書で援用される。
【００５１】
抗体フラグメントを、完全長抗体のタンパク質分解性加水分解により、あるいはフラグメントをコードするＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または別の宿主内で発現させることにより調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法で完全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１ ，６４７号ならびにこれらに含まれる参考文献）により記載されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」、８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．」、７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎら、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」第１巻、ｐ．４２２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）ならびにＣｏｌｉｇａｎ、同書、ｐ．２．８．１‐２．８．１０および２．１０．‐２．１０．４．も参照のこと。
【００５２】
既知の抗体
使用する抗体は、広範な種々の既知の提供元から購入し得る。例えば、種々の抗体を分泌するハイブリドーマ系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能である。腫瘍関連抗原を非限定的に含む様々な疾患標的に対する数多くの抗体が、ＡＴＣＣに保管されおよび／または可変領域配列が公開されており、本明細書で特許請求される方法および組成物での使用のために入手可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；同第７，２８２，５６７号；同第７，１５１，１６４号；同第７，０７４，４０３号；同第７，０６０，８０２号；同第７，０５６，５０９号；同第７，０４９，０６０号；同第７，０４５，１３２号；同第７，０４１，８０３号；同第７，０４１，８０２号；同第７，０４１，２９３号；同第７，０３８，０１８号；同第７，０３７，４９８号；同第７，０１２，１３３号；同第７，００１，５９８号；同第６，９９８，４６８号；同第６，９９４，９７６号；同第６，９９４，８５２号；同第６，９８９，２４１号；同第６，９７４，８６３号；同第６，９６５，０１８号；同第６，９６４，８５４号；同第６，９６２，９８１号；同第６，９６２，８１３号；同第６，９５６，１０７号；同第６，９５１，９２４号；同第６，９４９，２４４号；同第６，９４６，１２９号；同第６，９４３，０２０号；同第６，９３９，５４７号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，５３３号；同第６，９１９，４３３号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９１６，４７５号；同第６，９０５，６８１号；同第６，８９９，８７９号；同第６，８９３，６２５号；同第６，８８７，４６８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，８８４，５９４号；同第６，８８１，４０５号；同第６，８７８，８１２号；同第６，８７５，５８０号；同第６，８７２，５６８号；同第６，８６７，００６号；同第６，８６４，０６２号；同第６，８６１，５１１号；同第６，８６１，２２７号；同第６，８６１，２２６号；同第６，８３８，２８２号；同第６，８３５，５４９号；同第６，８３５，３７０号；同第６，８２４，７８０号；同第６，８２４，７７８号；同第６，８１２，２０６号；同第６，７９３，９２４号；同第６，７８３，７５８号；同第６，７７０，４５０号；同第６，７６７，７１１号；同第６，７６４，６８８号；同第６，７６４，６８１号；同第６，７６４，６７９号；同第６，７４３，８９８号；同第６，７３３，９８１号；同第６，７３０，３０７号；同第６，７２０，１５号；同第６，７１６，９６６号；同第６，７０９，６５３号；同第６，６９３，１７６号；同第６，６９２，９０８号；同第６，６８９，６０７号；同第６，６８９，３６２号；同第６，６８９，３５５号；同第６，６８２，７３７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，６８２，７３４号；同第６，６７３，３４４号；同第６，６５３，１０４号；同第６，６５２，８５２号；同第６，６３５，４８２号；同第６，６３０，１４４号；同第６，６１０，８３３号；同第６，６１０，２９４号；同第６，６０５，４４１ 号；同第６，６０５，２７９号；同第６，５９６，８５２号；同第６，５９２，８６８号；同第６，５７６，７４５号；同第６，５７２；８５６号；同第６，５６６，０７６号；同第６，５６２，６１８号；同第６，５４５，１３０号；同第６，５４４，７４９号；同第６，５３４，０５８号；同第６，５２８，６２５号；同第６，５２８，２６９号；同第６，５２１，２２７号；同第６，５１８，４０４号；同第６，５１１，６６５号；同第６，４９１，９１５号；同第６，４８８，９３０号；同第６，４８２，５９８号；同第６，４８２，４０８号；同第６，４７９，２４７号；同第６，４６８，５３１号；同第６，４６８，５２９号；同第６，４６５，１７３号；同第６，４６１，８２３号；同第６，４５８，３５６号；同第６，４５５，０４４号；同第６，４５５，０４０， ６，４５１，３１０号；同第６，４４４，２０６' ６，４４１，１４３号；同第６，４３２，４０４号；同第６，４３２，４０２号；同第６，４１９，９２８号；同第６，４１３，７２６号；同第６，４０６，６９４号；同第６，４０３，７７０号；同第６，４０３，０９１号；同第６，３９５，２７６号；同第６，３９５，２７４号；同第６，３８７，３５０号；同第６，３８３，７５９号；同第６，３８３，４８４号；同第６，３７６，６５４号；同第６，３７２，２１５号；同第６，３５９，１２６号；同第６，３５５，４８１号；同第６，３５５，４４４号；同第６，３５５，２４５号；同第６，３５５，２４４号；同第６，３４６，２４６号；同第６，３４４，１９８号；同第６，３４０，５７１号；同第６，３４０，４５９号；同第６，３３１，１７５号；同第６，３０６，３９３号；同第６，２５４，８６８号；同第６，１８７，２８７号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１２９，９１４号；同第６，１２０，７６７号；同第６，０９６，２８９号；同第６，０７７，４９９号；同第５，９２２，３０２号；同第５，８７４，５４０号；同第５，８１４，４４０号；同第５，７９８，２２９号；同第５，７８９，５５４号；同第５，７７６，４５６号；同第５，７３６，１１９号；同第５，７１６，５９５号；同第５，６７７，１３６号；同第５，５８７，４５９号；同第５，４４３，９５３号；同第５，５２５，３３８を参照のこと。これらは例示的なもの過ぎず、広範な種々の他の抗体およびそのハイブリドーマが当該分野で公知である。ほぼどの疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマも、対象とする特定の疾患関連標的に対する抗体に関してＡＴＣＣ、ＮＣＢＩおよび／またはＵＳＰＴＯのデータベースを検索するだけで入手され得る。クローン抗体の抗原結合ドメインを、当該分野で公知の標準的な技術を用いて、増幅し、切り出し、発現ベクター内にライゲートし、適合した宿主細胞内にトランスフェクトして、タンパク質産生に使用し得る。
【００５３】
アミノ酸置換
ある実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物は、１つまたは複数の置換されたアミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの作製および使用を包含し得る。上述のように、実質上任意の標的抗原に対するモノクローナル抗体の作製方法は、当該分野で公知である。通常、これらの方法により、標的抗原に対するマウス抗体が作製される。当該分野で公知のように、マウスモノクローナル抗体の抗原結合特異性は、主として超可変性の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列により決定される。マウス抗体は一般に、抗体の軽鎖上に３つおよび重鎖上に３つ、つまり６つのＣＤＲ配列を含む。上で詳述したように、マウスＣＤＲ配列を、例えばヒト抗体のフレームワークおよび定常領域配列に挿入する、ＣＤＲ移植のような技術により、あるいはマウス可変領域配列全体をヒト抗体の定常領域配列に付加することにより、キメラ、ヒト化またはヒトバージョンのマウス抗体を構築し得る。別の実施形態において、抗体の可変領域配列を、例えば、抗体の軽および重鎖可変領域全体をコードするオリゴヌクレオチドの化学的合成およびアセンブリにより構築し得る。
【００５４】
様々な実施形態において、天然、キメラ、ヒト化またはヒト抗体の構造的、物理的および／または治療的特性を、１つまたは複数のアミノ酸残基を置換することにより最適化し得る。例えば、ヒト化抗体の機能的特性は、限定された数のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸を、元のマウス抗体の対応するＦＲアミノ酸と置換することにより改善され得る。このことは、フレームワーク領域のアミノ酸残基がＣＤＲ残基と非常に接近している場合に特に当てはまる。
【００５５】
別の場合には、標的抗原に対する結合親和性、標的抗原からの抗体解離速度またはオフ速度あるいは抗体によるＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）またはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の誘導効率さえのような抗体の治療的特性が、限定された数のアミノ酸置換により最適化され得る。
【００５６】
別の実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を作製するために使用されるＤＤＤおよび／またはＡＤ配列は、例えば、ＤＤＤ‐ＡＤ結合親和性を増加させるために最適化され得る。ＤＤＤまたはＡＤ配列において可能な配列バリエーションを以下の実施例で論じる。
【００５７】
一般に、アミノ酸置換は通常、あるアミノ酸を、特性が比較的類似した別のアミノ酸と置き換えること（すなわち、保存的アミノ酸置換）を包含することを、当業者は理解されよう。種々のアミノ酸の特性およびアミノ酸置換のタンパク質の構造および機能に及ぼす影響は、当該技術分野における広範な研究および知識の主題である。
【００５８】
例えば、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５‐１３２）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性が、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それによりタンパク質の他の分子との相互作用が決定される。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づきハイドロパシー指標が以下のように割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。保存的置換を行う場合、ハイドロパシー指標が±２以内のアミノ酸の使用が好ましく、より好ましくは±１以内のアミノ酸、さらにより好ましくは±０．５のアミノ酸の使用である。
【００５９】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性も考慮し得る（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。アミノ酸残基には以下のように親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン （０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５ ±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。親水性が類似した他のアミノ酸との置換が好ましい。
【００６０】
その他の考慮すべき事柄として、アミノ酸側鎖の大きさが挙げられる。例えば、グリシンまたはセリンのような小型の側鎖を有するアミノ酸を、例えば、トリプトファンまたはチロシンのような大型の側鎖を有するアミノ酸と置換するのは、一般に好ましくないであろう。タンパク質の二次構造に及ぼす様々なアミノ酸残基の影響も１つの考慮事項である。実証研究により、様々なアミノ酸残基が、α‐へリックス、β‐シートまたはリバースターンというタンパク質ドメインの二次構造の採用傾向に及ぼす影響が解明されており、当該分野で公知である（例えば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２‐２４５；１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１‐２７６；１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、２６：３６７‐３８４を参照のこと）。
【００６１】
このような考慮事項および広範な実証研究に基づいて、保存的アミノ酸置換表が作成されており、当該分野で公知である。例えば：アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシン。あるいは：Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｈｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ。
【００６２】
その他のアミノ酸置換に関する考慮事項として、残基がタンパク質の内側にあるか否か、あるいは溶媒に曝露されているか否かがある。内側の残基に関しては、保存的置換として：ＡｓｐとＡｓｎ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＳｅｒとＡｌａ；ＴｈｒとＡｌａ；ＡｌａとＧｌｙ；ＨｅとＶａｌ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＬｅｕとＭｅｔ；ＰｈｅとＴｙｒ；ＴｙｒとＴｒｐが挙げられるであろう（例えば、「ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ」にあるウェブサイト「ＰＲＯＷＬ」を参照のこと）。溶媒に曝露されている側鎖に関しては、保存的置換として： ＡｓｐとＡｓｎ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＧｌｕとＧｌｎ；ＧｌｕとＡｌａ；ＧｌｙとＡｓｎ；ＡｌａとＰｒｏ；ＡｌａとＧｌｙ；ＡｌａとＳｅｒ；ＡｌａとＬｙｓ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＬｙｓとＡｒｇ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＨｅとＶａｌ；ＰｈｅとＴｙｒが挙げられるであろう（同上）。アミノ酸置換の際に役立つように、ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、ＬｅｖｉｎマトリックスおよびＲｉｓｌｅｒマトリックスのような様々なマトリックスが作成されている（同上）。
【００６３】
アミノ酸置換を決定する際に、正荷電残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負荷電残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）との間のイオン結合（塩橋）または隣接するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成のような、分子間または分子内結合の存在も考慮され得る。
【００６４】
コードされたタンパク質配列において任意のアミノ酸を他の任意のアミノ酸と置換する方法は、公知でありかつ当業者にとってはルーティン化された実験方法であり、例えば、部位特異的突然変異誘発技術による方法、またはアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを合成およびアセンブリして、発現ベクター構築物内にスプライスすることによる方法がある。
【００６５】
治療剤
別の実施形態において、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素またはその他の薬剤を、本明細書に記載の多量体サイトカインに対する補完療法として使用し得る。有用な薬物は、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、抗代謝剤、抗生剤、アルカロイド、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤およびこれらの組合せからなる群より選択される薬剤特性を有し得る。
【００６６】
有用な薬物の例として、５‐フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオシタチン‐１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０‐ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ‐２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）、ＳＮ‐３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２‐ピロリノドキソルビシン（２Ｐ‐ＤＯＸ）、シアノ‐モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’‐Ｏ‐ジオレオイル‐ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ‐ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル‐タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ‐アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６‐メルカプトプリン、メソトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ‐３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンカアルカロイドを挙げ得る。
【００６７】
有用な毒素として、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（例えば、オンコナーゼ、ＤＮａｓｅI）、ブドウ球菌エンテロトキシン‐Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシンおよびシュードモナスエンドトキシンを挙げ得る。
【００６８】
有用なケモカインとして、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１‐α、ＭＩＰ１‐βおよびＩＰ‐１０を挙げ得る。
【００６９】
ある実施形態において、アンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＩＧＦペプチドおよび抗ＰＩＧＦ抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ‐１抗体、抗Ｆｉｔ‐１抗体および抗Ｆｉｔ‐１抗体ペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン‐１２、ＩＰ‐１０、 Ｇｒｏ‐β、トロンボスポンジン、２‐メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭｌＯｌ、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンジオポエチン‐２、インターフェロン‐α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ‐４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ‐１４７０、血小板因子４またはミノサイクリンのような抗血管新生剤が有用であり得る。
【００７０】
その他の有用な治療剤には、オリゴヌクレオチド、特に、好ましくは癌遺伝子および癌遺伝子産物に対する、ｂｃｌ‐２またはｐ５３のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ得る。好ましい形態の治療用オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００７１】
診断剤
診断剤は、好ましくは、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される。このような診断剤は公知であり、任意のこのような既知の診断剤を使用し得る。診断剤の非限定的な例として、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４‐１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒあるいはその他のガンマ、ベータまたは陽電子放射体を挙げ得る。有用な常磁性イオンとして、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）またはエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられ得る。金属造影剤として、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）またはビスマス（ＩＩＩ）を挙げ得る。超音波造影剤には、ガス封入リポソームのようなリポソームが包含され得る。放射線不透過性の診断剤は、バリウム化合物、ガリウム化合物およびタリウム化合物のような化合物から選択され得る。広範な種々の蛍光標識が当該分野で公知であり、フルオレセインイソチアシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ‐フタルデヒドおよびフルオレサミンが挙げられるが、これらに限定されない。有用な化学発光標識として、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩またはシュウ酸エステルを挙げ得るが、これらに限定されない。
【００７２】
イムノコンジュゲート
ある実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の抗体成分を、１つまたは複数の治療剤または診断剤とコンジュゲートし得る。複数の治療剤は同一である必要はなく、例えば、薬物と放射性同位元素のように、異なっていてもよい。例えば、１３１Ｉを抗体または融合タンパク質のチロシン中に組み込み、薬物をリジン残基のイプシロンアミノ基に付加してもよい。治療剤および診断剤を、例えば、還元ＳＨ基および／または炭化水素側鎖に付加してもよい。治療剤または診断剤と抗体または融合タンパク質との共有結合的または非共有結合的コンジュゲートを作製するための多くの方法が当該分野で公知であり、任意のこのような既知の方法を用いてもよい。
【００７３】
治療剤または診断剤を、ジスルフィド結合形成を介して、還元抗体成分のヒンジ領域に付加してもよい。あるいは、このような薬剤を、Ｎ‐スクシニル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて付加してもよい（Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５６：２４４（１９９４））。このようなコンジュゲーションのための一般的技術は、当該分野で公知である。例えば、Ｗｏｎｇ、「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ‐ＬＩＮＫＩＮＧ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、 １９９１）；「ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、Ｂｉｒｃｈら編、（Ｗｉｌｅｙ‐Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９５）に掲載の、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、ｐ．１８７‐２３０；「ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ， ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ」、Ｒｉｔｔｅｒら編、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）に掲載の、Ｐｒｉｃｅ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ‐Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 、ｐ．６０‐８４ を参照のこと。あるいは、治療剤または診断剤を、抗体のＦｃ領域中の炭水化物部分を介して、コンジュゲートしてもよい。チオール基と結合した同一薬剤の装薬量を増大させるために炭水化物基を用いてもよく、あるいは異なる治療剤または診断剤を結合させるために炭水化物部分を用いてもよい。
【００７４】
ペプチドを、抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にコンジュゲートするための方法は、当業者に公知である。例えば、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４６：１１０１（１９９０）；Ｓｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）を参照のこと。一般的な方法として、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、遊離アミン官能基を少なくとも１つ有する担体ポリマーと反応させることが挙げられる。この反応により、まずシッフ塩基（イミン）結合が形成され、これを第２級アミンに還元することで安定化させて、最終的なコンジュゲートを形成する。
【００７５】
イムノコンジュゲートの抗体成分として用いられる抗体が、抗体フラグメントである場合、Ｆｃ領域が欠如し得る。しかし、炭水化物部分を完全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することは可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎら、米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５）、Ｌｅｕｎｇら、米国特許第６，２５４，８６８号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）を参照のこと。改変された炭水化物部分を用いて、治療剤または診断剤を付加する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、キレート剤を抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質に付加して、放射性核種のような治療剤または診断剤をキレート化するために使用し得る。キレート剤の例として、ＤＴＰＡ（Ｍｘ‐ＤＴＰＡなど）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡまたはＮＯＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。コンジュゲーション法ならびにキレート剤を使用して金属またはその他のリガンドをタンパク質に付加する方法は、当該分野で公知である（例えば、その内容全体が参照により本明細書で援用される、米国特許出願第１２／１１２，２８９号を参照のこと）。
【００７７】
ある実施形態において、放射性金属または常磁性イオンを、イオンを結合させるための多様なキレート基を付加し得る長い尾部を有する試薬と反応させて、タンパク質またはペプチドに付加し得る。このような尾部は、ポリリジン、多糖または、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス‐チオセミカルバゾン、ポリオキシムおよびこの目的に有用であると知られている同様な基のようなキレート基が結合可能なペンダント基を有する他の誘導体化されたまたは誘導体化可能な鎖のような、ポリマーであってよい。
【００７８】
キレートを、例えば、米国特許第４，８２４，６５９号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）に開示されているように、抗体またはペプチドに直接結合させ得る。特に有用な金属‐キレートの組合せとして、１２５１、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４１、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５０、７６Ｂｒのような一般的エネルギー範囲が６０〜４０００ｋｅＶの診断用アイソトープとともに放射性イメージングに用いられる、２‐ベンジル‐ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレートが、マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体化した場合は、ＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡのような大環状キレートは、様々な金属および放射性金属とともに、最も具体的には、それぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種とともに用いられる。このような金属キレート錯体は、対象とする金属に環のサイズを合わせることにより、非常に安定させることができる。ＲＡＩＴに対する２２３Ｒａのような安定に結合する核種を対象とする、大環状ポリエーテルのような他の環型キレートが包含される。
【００７９】
ごく最近では、ＰＥＴスキャン技術で使用される１８Ｆ標識の方法、例えば、Ｆ‐１８とアルミニウムのような金属または他の原子との反応による方法が開示されている。１８Ｆ‐Ａｌコンジュゲートは、抗体に直接付加する、またはプレターゲティング法において標的となり得る構築物を標識するために使用される、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡまたはＮＥＴＡのようなキレート基と錯体化され得る。このようなＦ‐１８標識技術は、２００８年４月３０日に出願された米国特許出願第１２／１１２，２８９号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）に開示されている。
【００８０】
治療的処置の方法
様々な実施形態が、哺乳類、例えばヒトや、イヌおよびネコなどの飼い馴らされたまたは伴侶用のペットのような被検体における処置方法に関するものであり、治療有効量のサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を被検体に投与することを含む。好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物は、以下の実施例でさらに詳細に記載されるような、２０‐２ｂ構築物である。
【００８１】
標的細胞表面上の別の抗原と結合または反応する治療有効量の別の抗体を、同時にまたは逐次的に投与することにより、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の投与を補完することができる。好適な追加のＭＡｂは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＭ４抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、Ｉａ、ＭＩＦ、ＨＭｌ．２４、ＨＬＡ‐ＤＲ、テネイシン、Ｆｌｔ‐３、ＶＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐２５、テネイシン、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、補体因子Ｃ５、癌遺伝子産物またはこれらの組み合わせと反応するＭＡｂからなる群より選択される、ヒト化、キメラまたはヒトＭＡｂを少なくとも１つ含む。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ２２抗体のような種々の有用な抗体が当業者に既知である。例えば、Ｇｈｅｔｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：２６１０（１９８８）；Ｈｅｋｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３２：３６４（１９９１）；Ｌｏｎｇｏ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、５：３５３（１９９６）、米国特許第５，７９８，５５４号；同第６，１８７，２８７号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６７６，９２４号；同第７，１０９，３０４；同第７，１５１，１６４号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３０，０８５号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；ならびに米国特許出願公開第２００８／０１３１３６３号；同第２００８／００８９８３８号；同第２００７／０１７２９２０号；同第２００６／０１９３８６５号；同第２００６／０２１０４７５号；同第２００８／０１３８３３３号；および同第２００８／０１４６７８４号（それぞれが参照により本明細書で援用される）を参照のこと。
【００８２】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物療法は、少なくとも１つの治療剤の同時または逐次的投与によりさらに補完することができる。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ２シクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ２エトポシドおよび１５０〜２００ｍｇ／ｍ２カルムスチン）は、非ホジキンリンパ腫の治療に用いられるレジメンである（Ｐａｔｔｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、５７：１８（１９９３））。その他の適切な併用化学療法レジメンが当業者に公知である。例えば、「ＣＡＮＣＥＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ」、第２巻、第３版、Ｈｏｌｌａｎｄら編（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９３）に掲載のＦｒｅｅｄｍａｎら、「Ｎｏｎ‐Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」、ｐ．２０２８‐２０６８を参照のこと。例えば、中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）治療用の第一世代の化学療法レジメンとして、Ｃ‐ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）が挙げられる。有用な第二世代の化学療法レジメンは、ｍ‐ＢＡＣＯＤ（メソトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン）であり、一方、適切な第三世代のレジメンは、ＭＡＣＯＰ‐Ｂ（メソトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）である。有用な薬物として、さらにフェニルブチレート、ベンダムスチンおよびブリオシタチン‐１が挙げられる。
【００８３】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を既知の方法に従って製剤化して、薬学的に有用な組成物を調製することができ、これにより、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物が、薬学的に適切な添加剤との混合物に組み合わされる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水が薬学的に適切な添加剤の一例である。その他の適切な添加剤は当業者に公知である。例えば、Ａｎｓｅｌら、「ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ」、第５版（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９０）およびＧｅｎｎａｒｏ編、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）およびこれらの改訂版を参照のこと。
【００８４】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物は、例えば、ボーラス注入または持続注入による静脈内投与のために製剤化することができる。好ましくは、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を約４時間未満にわたり、より好ましくは、約３時間未満にわたり注入する。例えば、最初の２５‐５０ｍｇを３０分以内で、好ましくは１５分以内さえで注入し、残りは次の２〜３時間にわたり注入する。注入用の製剤は、単位剤形で、例えば、保存剤を添加したアンプルまたは多回用量容器に入れて、提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤用剤を含有することができる。あるいは使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌無パイロジェン水を用いて構成するために、有効成分は粉末形態であってもよい。
【００８５】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の作用持続時間を制御するために、さらなる薬学的方法を用い得る。ポリマーを使用してサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を複合体形成し、または吸着することにより、放出制御製剤を調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとして、ポリ（エチレン‐ｃｏ‐酢酸ビニル）のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ無水共重合体のマトリックスが挙げられる（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１４４６（１９９２））。このようなマトリックスからの放出速度は、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の分子量、マトリックス内のサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の量および分散粒子の大きさに依存する（Ｓａｌｔｚｍａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、同上）。その他の固形剤形は、Ａｎｓｅｌら、「ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ」、第５版、（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９０）およびＧｅｎｎａｒｏ編、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）およびこれらの改訂版に記載されている。
【００８６】
サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物は、哺乳動物に、皮下により、または他の非経口経路によってさえも投与し得る。さらに、投与は、持続注入によるあるいは単回のまたは複数回のボーラスによるものであってもよい。好ましくは、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を、約４時間未満にわたり、およびより好ましくは、約３時間未満にわたり注入する。
【００８７】
より一般的には、ヒトに対して投与されるサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的病状および既往歴のような因子により異なるであろう。受容者には、単回の静脈注射として約１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲のサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物用量を提供することが望まれ得るが、状況に応じてこれよりも低いまたは高い用量を投与してもよい。例えば、７０ｋｇの患者に対する１〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量は７０〜１，４００ｍｇであり、または１．７ｍの患者に対しては４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。この投与量は、必要に応じて、例えば、週１回で４〜１０週間、週１回で８週間または週１回で４週間繰り返してもよい。また、維持療法での必要に応じて、隔週で数ヶ月間あるいは毎月または３ヶ月毎に何ヶ月間もというように、より低頻度で投与してもよい。
【００８８】
あるいは、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を、１投与量を２週間または３週間毎に、少なくとも合計３投与量になるまで繰り返し投与してもよい。または、構築物を、週２回で４〜６週間投与してもよい。投与量を約２００〜３００ｍｇ／ｍ２まで（１．７ｍの患者に対して３４０ｍｇ／投与または７０ｋｇの患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）減らした場合、週に１回または２回でさえ４〜１０週間投与してもよい。あるいは、投与計画を減らす、すなわち２週間または３週間に１回で２〜３ヶ月間にしてもよい。しかし、２０ｍｇ／ｋｇを週１回または２〜３週間に１回のようなさらに高い用量でも、反復投与サイクルで緩徐な静注により投与できることが確認されている。用量および計画を適切に調節することにより、投与計画を他の間隔で任意に繰り返すことができかつ様々な非経口経路で投与してもよい。
【００８９】
好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂＤＮＬ構築物は、癌治療に有用である。癌の例として、癌腫、リンパ腫、膠芽腫、黒色腫、肉腫ならびに白血病、骨髄腫またはリンパ性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例が以下に記載され：扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌腫を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含めた胃癌、膵臓癌、多形膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、肝細胞癌腫、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化甲状腺癌腫、乳癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌腫、陰茎癌腫および頭頸部癌が挙げられる。「癌」という用語には、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、被検体の体において、元の悪性腫瘍部位または腫瘍部位以外に細胞がまだ移動していないもの）および続発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、つまり悪性細胞または腫瘍細胞が元の腫瘍部位と異なる第二の部位へ移動することから生じるもの）が包含される。本発明の治療法をもたらす癌には、ＩＧＦ‐１Ｒを発現するか、過剰発現するか、または異常に発現する細胞が包含される。
【００９０】
癌または悪性腫瘍のその他の例として、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂・尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原発性神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、胃腸管腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸癌、転移性原発性扁平上皮頸癌、転移性扁平上皮頸癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄球性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔・副鼻腔癌、上咽頭癌、神経細胞芽腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌、中咽頭癌、骨肉腫／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在性腫瘍、膵臓癌、異常タンパク血症、真性赤血球増加症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂・尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、テント上原発性神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂・尿管移行細胞癌、移行性腎盂・尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管・腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍および上記器官系に存在する新生物以外のその他の任意の高増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書において記載および特許請求される方法および組成物は、上記の疾患を非限定的に含む悪性または前悪性の状態を治療するためにならびに腫瘍性または悪性の状態への進行を阻止するために使用され得る。このような使用は、腫瘍または癌への進行前であることが分かる、または疑われる状態、特に、過形成、化生または最も特に異形成からなる非腫瘍性の細胞増殖が生じた状態において必要とされる（このような異常な増殖状態に関する総説として、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ、Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐｐ．６８‐７９（１９７６）を参照のこと）。
【００９２】
異形成は癌の前兆である場合が多く、主として上皮に見られる。異形成は、非腫瘍性細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造的配向の喪失を伴う。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する部位に生じるのが特徴である。治療可能な異形成疾患として、無汗性外胚様異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨線維性異形成、開花性骨性異形成、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少症性外胚葉異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖端セメント質異形成、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、眼中隔異形成、脊椎骨端異形成および心室橈骨異形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
さらに、治療可能な前腫瘍性疾患として、良性の異常増殖性疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープまたは腸腺腫および食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎および日光角化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
好適な実施形態において、本発明の方法は、癌、特に上記の癌の増殖、進行および／または転移を抑制するために使用される。
【００９５】
さらに、高増殖性の疾患、障害および／または症状として、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤血白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病ならびに線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎臓細胞癌腫、ヘパトーマ、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス癌腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経細胞芽腫および網膜芽細胞腫のような肉腫および癌腫を非限定的に含む固形腫瘍のような悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
キット
様々な実施形態が、患者における患部組織の治療または診断に適した成分を含むキットに関し得る。典型的なキットは、本明細書に記載のような少なくとも１つまたは複数のサイトカイン‐ＭＡｂ構築物を含み得る。投与のための成分を含有する組成物が、経口送達によるものなど、消化管を介した送達のために製剤化されていない場合、他の何らかの経路を通してキット成分を送達することが可能な装置が含まれ得る。非経口送達のような適用のための装置のタイプの１つは、組成物を被検体の体に注入するために使用される注射器である。吸入装置もまた使用され得る。ある実施形態において、治療剤を、滅菌された液剤または凍結乾燥調製物が充填された、注射器または自己注射ペンの形態で提供し得る。
【００９７】
キット成分を、一緒にあるいは２つまたはそれ以上の容器に分けて収容してもよい。いくつかの実施形態において、容器は、再構成に適する、滅菌された凍結乾燥剤形の組成物を収容できる、バイアルであり得る。キットは、再構成および／または他の試薬の希釈に適した１つまたは複数の緩衝剤も含有し得る。使用し得るその他の容器として、パウチ、トレイ、箱、チューブなどが挙げられるが、これらに限定されない。キット成分を、容器内に収容して滅菌状態を維持してもよい。含まれ得る他の構成要素は、キットを使用する者のための使用説明書である。
【００９８】
発現ベクター
さらに他の実施形態は、サイトカイン‐ＭＡｂ構築物またはその構成成分の融合タンパク質をコードする核酸を含むＤＮＡ配列に関し得る。融合タンパク質は、以下の実施例でより詳細に論じるように、ＤＮＬ構築物形成のために使用される、ＡＤおよびＤＤＤペプチドのような異なるペプチドまたはタンパク質に付加されている抗体またはサイトカインを含み得る。
【００９９】
様々な実施形態が、コードＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関し得る。ベクターは、キメラ、ヒト化またはヒト可変領域配列が付加され得るヒト免疫グロブリンの軽および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域をコードする配列を含み得る。ベクターは、コードされた１つまたは複数のタンパク質を、選択された宿主細胞内で発現するプロモーター、エンハンサーおよびシグナル配列もしくはリーダー配列をさらに含み得る。特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２またはＧＳである。より好ましくは、軽および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域は、ヒトＥＵ骨髄腫免疫グロブリンに由来してもよく、場合によっては、アロタイプの位置にある少なくとも１つのアミノ酸が、異なるＩｇＧ１アロタイプに見られるアミノ酸に変化し、そして場合によっては、ＥＵ番号システムに基づくＥＵ重鎖のアミノ酸２５３が、アラニンと置換され得る。Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、６３：７８‐８５（１９６９）を参照のこと。他の実施形態において、ＩｇＧ１配列は、ＩｇＧ４配列に変換し得る。
【０１００】
操作されたタンパク質を発現させるための、発現構築物の遺伝子操作および宿主細胞への挿入の方法は、当該分野で公知であり、ルーティン化された実験方法であることを、当業者は理解されよう。宿主細胞ならびにクローン抗体またはクローンフラグメントの発現方法は、例えば、２００５年７月２５日に出願された米国特許出願第１１／１８７，８６３号；２００５年１０月２０日に出願された同第１１／２５３，６６６号および２００６年７月１４日に出願された同第１１／４８７，２１５（それぞれその内容全体が参照により本明細書で援用される）に記載されている。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は説明ために提供されるものであり、本発明の特許請求の範囲を限定するためのものではない。
【０１０２】
一般的方法
細胞株
Ｓｐ２／０‐Ａｇ１４（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）の増強された変異株であるＳｐ／ＥＳＦ細胞を、２ｍＭのＬ‐グルタミンおよび１００単位／ｍＬのペニシリン‐ストレプトマイシンを添加したハイブリドーマ無血清培地（Ｈ‐ＳＦＭ）で維持した。Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、ＮＡＭＡＬＷＡおよびＪｅｋｏ‐１（ＡＴＣＣ）ヒトリンパ腫を、１０％ＦＢＳを含み、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＬ‐グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１００単位／ｍＬのペニシリン‐ストレプトマイシン添加したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。
【０１０３】
ＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物
それぞれＳｐ／ＥＳＦ内で発現させた２つのＤＮＬモジュールであるＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｖ‐ｍａｂとＩＦＮα２ｂ‐ＤＤＤ２との連結を介したＤＮＬにより、２０‐２ｂを作製した。ＤＮＬでさらに生成した、２０‐２ｂ（ヒト化ＩｇＧ１＋４つのＩＦＮα２ｂ）と類似した設計であるが、異なる標的化ＭＡｂを有するＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物を、対照としていくつかの実験で使用した：２２‐２ｂは、ＡＤ２モジュールとして、ＣＤ２２に対するものであり、リンパ腫と結合するＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｅ‐ｍａｂ（エピラツズマブ）を有し；７３４‐２ｂは、ＡＤ２モジュールとして、ハプテンであるＩｎ‐ＤＴＰＡに対するものであり、いかなる動物タンパク質または組織とも結合しないＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈ７３４を有し；およびＲｌ‐２ｂは、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ‐１Ｒ）と結合するＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１を使用する。
【０１０４】
分析方法
ＩＦＮα構築物のタンパク質濃度を、市販のヒトＩＦＮα２・ＥＬＩＳＡキットを用いて製造者の示すプロトコールに従い測定し（ＰＢＬ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｂｉｏ‐Ｓｉｌ ＳＥＣ ２５０カラム（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および移動相として０．０４ＭのＰＢＳ、ｐＨ６．８、１ｍＭのＥＤＴＡを用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ Ｍｏｄｅｌ １１６でサイズ排除ＨＰＬＣを行い確認した。還元および非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を、４〜２０％のトリス‐グリシン勾配ゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）を用いて行った。すべての比色（ＥＬＩＳＡおよびＭＴＳ）、発光（レポーター）および蛍光定量（ＣＤＣおよびＡＤＣＣ）アッセイを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１００マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により定量化した。
【０１０５】
ＩＦＮα活性の測定
ＩＦＮα２ｂの比活性を、ｉＬｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ Ｃｅｌｌ‐Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて製造者の示すプロトコールに従い測定した（ＰＢＬ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、２０‐２ｂおよびさらに７つのＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物を、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ中で１０、２．５および０．６２５ｎｇ／ｍＬに希釈した。ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）を、１、０．２５および０．０６２５ｎｇ／ｍＬに希釈した。各希釈液を、供給された細胞とともに一晩インキュベーションして、三重反復でアッセイした。付属の標準品で作成した標準曲線から、比活性を推定した。抗ウイルス活性を、Ａ５４９細胞に脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスを用いたインビトロでのウイルス曝露アッセイにより、独立分析機関（ＰＢＬ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）で測定した。
【０１０６】
インビトロ増殖
ＤａｕｄｉまたはＪｅｋｏ‐１を、９６ウェルプレートに５，０００細胞／ウェルで平板培養し、指示薬剤の濃度を増加させながら、４日（Ｄａｕｄｉ）または５日（Ｊｅｋｏ‐１）間、３７℃でインキュベートした。生細胞密度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて測定した。
【０１０７】
全血由来のＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓリンパ腫細胞のエキソビボ枯渇
健康な志願者由来のヒト全血中のＮＨＬ細胞および末梢血リンパ球に対する２０‐２ｂの効果を、フローサイトメトリーを用いてエキソビボで評価し、ｖ‐ｍａｂ、７３４‐２ｂまたはｖ‐ｍａｂと７３４‐２ｂとの組合せと比較した。ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ（５×１０４細胞）を、ヘパリン化した全血（１５０μｌ）と混合して、０．０１、０．１または１ｎＭの試験ＭＡｂとともに２日間３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９またはマウスＩｇＧ１アイソタイプの対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で細胞を染色した。赤血球溶解後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアで細胞を解析した。ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓ細胞は共にＣＤ１９＋であり、単球ゲート内にある。正常なＢ細胞およびＴ細胞はそれぞれＣＤ１９＋細胞およびＣＤ３＋細胞であり、リンパ球ゲートにある。スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性（ｐ＜０．０５）を評価した。マウスにおけるインビボでの効果。体重約２０ｇのＣ．Ｂ．１７ホモ接合型の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）雌マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）において実験を行った。０日目に、１．５×１０７個のＤａｕｄｉ細胞、２．５×１０６個のＲａｊｉ細胞または５×１０６個のＮＡＭＡＬＷＡ細胞を各マウスに静脈接種した。治療用量はすべて皮下注射により投与した。対照治療として生理食塩水を使用した。毎日監視した動物が、後肢麻痺を発症した時点でまたは瀕死の状態になった場合、人道的に動物を屠殺した。さらに、開始時の２０％を上回る体重を失った場合、マウスを屠殺した。Ｐｒｉｓｍ（ｖ４．０３）ソフトウェアパック（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して、Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロット（対数順位分析）により生存曲線を分析した。棄却ｚ検定により判定された異常値は、分析から切り捨てた。
【０１０８】
実施例１．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ発現ベクター
ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターが組換えＩｇＧ発現に用いられてきた（Ｑｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００５、３６：８４‐９５）。任意のＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２ベクターのＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２ベクターへの変換を促進するために、プラスミドシャトルベクターを作製した。Ｆｃ（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）の遺伝子を、ｐｄＨＬ２ベクターである鋳型および以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した：
Ｆｃ ＢｇｌＩＩ 左側
ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ （配列番号１）
Ｆｃ Ｂａｍ‐ＥｃｏＲＩ 右側
ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ （配列番号２）。
【０１０９】
アンプリマーを、ｐＧｅｍＴＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でクローニングした。Ｆｃ挿入フラグメントを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨIでｐＧｅｍＴから切り出し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨIによるｈ６７９‐Ｆａｂ‐ＡＤ２‐ｐｄＨＬ２ＡＤ２‐ｐｄＨＬ２の消化により調製したＡＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクター（Ｒｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００６、１０３：６８４１‐６）とライゲートして、シャトルベクターＦｃ‐ＡＤ２‐ｐｄＨＬ２を作製した。ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２発現ベクターをＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２発現ベクターに変換するために、８６１ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限酵素断片を前者から切り出し、Ｆｃ‐ＡＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクターから切り出した９５２ｂｐの ＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限酵素断片と置換した。以下は、組換えヒト化ＩｇＧ‐ＡＤ２モジュール作製のために生成され使用されたＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２発現ベクターの一部のリストである：
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＡ２０ （抗ＣＤ２０）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬＬ２ （抗ＣＤ２２）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬ２４３ （抗ＨＬＡ‐ＤＲ）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬＬ１ （抗ＣＤ７４）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１ （抗ＩＧＦ‐１Ｒ）
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈ７３４ （抗インジウム‐ＤＴＰＡ）。
【０１１０】
実施例２．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ産生
トランスフェクションおよび安定なＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ分泌細胞株の選択
すべての細胞株をハイブリドーマＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で増殖させた。ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｐｄＨＬ２ ベクター（３０μｇ）をＳａｌＩ制限酵素で消化して直線化し、エレクトロポレーション（４５０ボルト、２５μＦ）によりＳｐ２／０‐Ａｇ１４（２．８×１０６細胞）内にトランスフェクトした。ｐｄＨＬ２ベクターは、クローン選択およびメソトレキセート（ＭＴＸ）による遺伝子増幅を可能にする、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子を含む。
【０１１１】
トランスフェクションの後、細胞を９６ウェルプレートで平板培養し、０．２μＭのＭＴＸを含む培地中でトランスジェニッククローンを選択した。特異的抗イディオタイプＭＡｂでコートした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ産生能についてクローンをスクリーニングした。推定クローンからの条件培地をマイクロプレートウェルに移し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて融合タンパク質の検出を行った。最も高いシグナルを発するウェルを拡張して、最終的には産生に用いた。
【０１１２】
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧモジュールの産生および精製
融合タンパク質作製のために、ローラーボトル培養に２×１０５細胞／ｍｌで播種し、ローラーボトルインキュベーター中で５％ＣＯ２の下、３７℃で、細胞生存率が２５％を下回るまで（〜１０日）インキュベートした。培養ブロスを遠心分離により清澄して濾過し、限外濾過により５０倍にまで濃縮した。ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧモジュール精製のために、濃縮した上清液をプロテインＡ（ＭＡＢ Ｓｅｌｅｃｔ）アフィニティーカラムに負荷した。カラムをベースラインまでＰＢＳで洗浄し、ｐＨ２．５の０．１Ｍグリシンで融合タンパク質を溶出した。
【０１１３】
実施例３．インターフェロン（ＩＦＮ）‐α２ｂベースのＤＤＤモジュール生成
哺乳動物細胞内で発現するＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２の構築
ＩＦＮ‐α２ｂのｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅して、ＸｂａIおよびＢａｍＨIが制限部位であり、シグナルペプチドがＩＦＮ‐α２ｂ由来でありかつ６Ｈｉｓがヘキサヒスチジンタグであるという特徴を含む配列を得た：ＸｂａI―シグナルペプチド―ＩＦＮα２ｂ―６Ｈｉｓ―ＢａｍＨI（６Ｈｉｓは配列番号２８で開示される）。得られた分泌タンパク質は、そのＣ末端で、以下の配列：
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３）
のポリペプチドと融合しているＩＦＮ‐α２ｂで構成されていた。
【０１１４】
鋳型として完全長ヒトＩＦＮα２ｂのｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦ ヒトクローン、カタログ番号ＨＯＲＦ０１クローンＩＤ ＩＯＨ３５２２１）をおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ増幅を行った：
ＩＦＮＡ２ ＸｂａI 左側
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＣＴＧＧ （配列番号４）
ＩＦＮＡ２ ＢａｍＨI 右側
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣ （配列番号５）。
【０１１５】
ＰＣＲアンプリマーをｐＧｅｍＴベクター内にクローニングした。ＩＦＮ‐α２ｂとのライゲーション用に、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを以下のように調製した。ＣＨ１‐ＤＤＤ２‐Ｆａｂ‐ｈＭＮ‐１４‐ｐｄＨＬ２（Ｒｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００６、１０３：６８４１‐６）ベクターを、ＤＤＤ２コード配列を残しＦａｂ遺伝子配列をすべて除去するＸｂａＩおよびＢａｍＨIで消化した。ＩＦＮ‐α２ｂアンプリマーを、ｐＧｅｍＴからＸｂａＩおよびＢａｍＨIで切り出し、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクター内にライゲートして、発現ベクターＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１１６】
哺乳動物細胞によるＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２発現
ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２をＳａｌＩで消化して直線化し、エレクトロポレーションにより骨髄腫細胞内へ安定にトランスフェクトした（米国特許出願第１１／８７７，７２８号（実施例の節が参照により本明細書で援用される）を参照のこと）。ＥＬＩＳＡ法により、２つのクローンが、検出可能なレベルのＩＦＮ‐α２ｂを有することがわかった。２つのクローンのうち９５と称する一クローンが、実質的に産生能が低下することなく、無血清培地での増殖に適応した。次いで、このクローンを５週間にわたり、ＭＴＸ濃度を０．１から０．８μＭに増加させながら増幅した。この段階で、クローンを限界希釈によりサブクローニングし、最も産生能の高いサブクローン（９５‐５）を拡大した。振盪フラスコ中で増殖した９５‐５の産生能は、市販のｒＩＦＮ‐α２ｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＩＦ００７、ロット番号０６００８０３９０８４）を基準として用いて、２．５ｍｇ／Ｌであると推定された。
【０１１７】
ローラーボトル中で増殖したバッチ培養物からのＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２精製
クローン９５‐５を、０．８μＭのＭＴＸを含有する無血清ハイブリドーマＳＦＭ全２０Ｌを含む３４個のローラーボトルに拡大し、最終培養まで培養した。培養ブロスを処理して、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２を以下のように精製した。上清液を遠心分離により清澄し、０．２μＭで濾過し、１Ｘ結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．５）中へダイアフィルター濾過して、３１０ｍＬに濃縮し、最終濃度０．１％になるまでＴｗｅｅｎ２０を添加し、３０ｍＬＮｉ‐ＮＴＡカラムに負荷した。試料負荷の後、カラムを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０の１Ｘ結合緩衝液５００ｍＬ、次いで３０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．５の溶液２９０ｍＬで洗浄した。生成物を、２５０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５の溶液１１０ｍＬで溶出した。約６ｍｇのＩＦＮα２ｂ‐ＤＤＤ２が精製された。
【０１１８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２産生
ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２は、大腸菌においても、微生物発酵により、可溶性タンパク質として発現された。ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、コード配列を増幅した。アンプリマーを、Ｎｄｅ ＩおよびＸｈｏI制限部位を用いて、ＩｐＥＴ２６ｂ大腸菌発現ベクター内にクローニングした。１８℃で１２時間、１００μＭのＩＰＴＧを含むＬＢ振盪フラスコでの誘導により、タンパク質をＢＬ２１ｐＬｙｓＳ宿主細胞において細胞内発現させた。可溶性ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２を、上記ＩＭＡＣにより細胞溶解物から精製した。
【０１１９】
実施例４．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧと結合した４つのＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬコンジュゲートの生成
ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧと結合した４つのＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬ複合体（図１）を以下のように作製した。簡潔に述べれば、選定したＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧを約２モル当量のＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２と混合し、この混合物に１ｍＭのＥＤＴＡおよび２ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加した後、穏やかな条件下で一晩室温で還元した。酸化型グルタチオンを２ｍＭになるまで添加し、この混合物をさらに１２〜２４時間、室温で保持した。ＤＮＬコンジュゲートをプロテインＡアフィニティーカラムで精製した。２０‐２ｂ、２２‐２ｂ、ｈＲ１‐２ｂおよび２４３‐２ｂと称するこのような４つのＤＮＬコンジュゲートを調製した。各コンジュゲートは、それぞれＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＡ２０（ＣＤ２０に対する特異性を有する）、ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬＬ２（ＣＤ２２に対する特異性を有する）、ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１（ＩＧＦ‐１Ｒに対する特異性を有する）およびＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＬ２４３（ＨＬＡ‐ＤＲに対する特異性を有する）にアンカーされた、４コピーのＩＦＮ‐α２ｂを含んでいた。哺乳動物（ｍ）または大腸菌（ｅ）産生ＩＦＮ‐α２ｂ‐ＤＤＤ２から生成された２０‐２ｂのＳＥ‐ＨＰＬＣ分析では、それぞれが、１つのＩｇＧおよび４つのＩＦＮ‐α２ｂグループからなる共有結合複合体と一致した保持時間を有する主要ピークを示した（不掲載）。同様のＳＥ‐ＨＰＬＣプロファイルが、他の３つのＩＦＮ‐ＩｇＧコンジュゲートに関して見られた。
【０１２０】
実施例５．ＩＦＮ‐ＩｇＧコンジュゲートのインビトロ活性
２０‐２ｂのインビトロでのＩＦＮα生物学的活性を、細胞ベースのレポーター、ウイルス防御およびリンパ腫増殖の各アッセイを用いて、市販のペグ化ＩＦＮα２剤であるＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）およびＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）の生物学的活性と比較した。インターフェロン刺激応答エレメントと融合したレポーター遺伝子を含有するトランスジェニックヒト前単球細胞株を用いる細胞ベースのキットを使用して、比活性を測定した（図２Ａ〜２Ｄ）。２０‐２ｂの比活性（５３００ＩＵ／ｐｍｏｌ）は、ＰＥＧＡＳＹＳ（１７０ＩＵ／ｐｍｏｌ）およびＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（３４００ＩＵ／ｐｍｏｌ）双方よりも高かった（図２Ａ）。２０‐２ｂと同様に作製された７３４‐２ｂ、１Ｒ‐２ｂおよびさらに５つのＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物（データ不掲載）は、それぞれ同様の比活性（４０００〜８０００ＩＵ／ｐｍｏｌ）を示し、これにより、このような構造物を生成するためのＤＮＬ法に一貫性があることが実証された（図２Ａ）。４つのＩＦＮα２ｂグループを有することが、ＭＡｂ‐ＩＦＮαの効力増強に寄与した。ＩＦＮα当量に正規化すると、比活性／ＩＦＮαは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）よりも約１０倍高く、ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）よりも約２倍だけ低かった。
【０１２１】
インビトロでのウイルス防御アッセイにおけるＭＡｂ‐ＩＦＮα、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）およびＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）の比較により、ＭＡｂ‐ＩＦＮαが、比活性がＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）と同等のおよびＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）よりも１０倍高いＩＦＮα２ｂ抗ウイルス活性を保有することが実証された（図２Ｂ）。
【０１２２】
ＩＦＮα２ｂは、一部の腫瘍株に対して直接的な抗増殖性または細胞傷害性作用を有し得る。２０‐２ｂの活性を、ＩＦＮαに対して高感受性であるバーキットリンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ）を用いたインビトロ増殖アッセイで測定した（図２Ｃ）。各ＩＦＮα２剤は、インビトロにおいて強力（ＥＣ５０＝４〜１０ｐＭ）かつ効率的にＤａｕｄｉを阻害した（＞９０％）。しかし、２０‐２ｂ（ＥＣ５０＝Ｏ．２５ｐＭ）は、非標的化ＭＡｂ‐ＩＦＮα構築物よりも約３０倍強力であった。２０‐２ｂの元の抗ＣＤ２０ＭＡｂは、Ｄａｕｄｉを含めた多くのリンパ腫細胞株に対して、かなりよリ高い濃度で（ＥＣ５０＞１０ｎＭ）インビトロでの抗増殖性活性を有する（Ｒｏｓｓｉら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６８：８３８４‐９２）。ＩＦＮαおよび抗ＣＤ２０双方に対してより低感受性のマントル細胞リンパ腫株であるＪｅｋｏ‐１を用いた、２０‐２ｂのインビトロ活性の評価も行った（図２Ｄ）。Ｊｅｋｏ‐１は、元の抗ＣＤ２０ＭＡｂに対してわずかに感受性であり、ＥＣ５０がほぼ１ｎＭで最大阻害率（Ｉｍａｘ）が１０％である。７３４‐２ｂで示されるように、Ｊｅｋｏ‐１（Ｉｍａｘ＝４３％；ＥＣ５０＝２３ｐＭ）は、Ｄａｕｄｉ（Ｉｍａｘ＝９０％；ＥＣ５０＝７．５ｐＭ）よりもＩＦＮα２ｂに対する反応性が低い。７３４‐２ｂに比べ、２０‐２ｂはＪｅｋｏ‐１をより高い程度（Ｉｍａｘ＝６５％）で阻害し、二相性の用量反応曲線を示した（図２Ｄ）。１０ｐＭ未満において、ＩＦＮα２ｂ活性に起因する低濃度の反応が見られ、７３４‐２ｂと同様にＩｍａｘ＝４３％でプラトーに達する。高濃度の反応は、１００ｐＭを超える部分で明らかであり、Ｉｍａｘは６５％に達した。２０‐２ｂの低濃度のＩＦＮα２ｂ反応（ＥＣ５０＝Ｏ．９７ｐＭ）は、７３４‐２ｂよりも２５倍強力であり、Ｄａｕｄｉでの結果と同様であった。
【０１２３】
２０‐２ｂの効力増大が、ＣＤ２０およびＩＦＮαシグナル伝達の相加／相乗作用によるものかを明らかにするために、元の抗ＣＤ２０抗体と７３４‐２ｂとの組合せ（ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂ）についてアッセイを行った。ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂの用量反応曲線は、１ｎＭを超える部分を除いては７３４‐２ｂ単独とほぼ同じであり、１ｎＭを超える部分では、前者では増加したが、後者では増加しなかった。これらの結果は、２０‐２ｂの低いＥＣ５０が、ＭＡｂ標的化に起因するものであるが、そのより大きいＩｍａｘはおそらくＩＦＮα２ｂおよびＣＤ‐２０シグナル伝達の相加活性によるものであることを示している。ＣＤ２０シグナル伝達の作用は、２０‐２ｂに対する高濃度の反応（ＥＣ５０＝Ｏ．８５ｎＭ）においてのみ明らかであり、これはｖ‐ｍａｂに対する反応（ＥＣ５０＝１．５ｎＭ）に匹敵する。ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂに関しては、２つの反応がオーバーラップするため、二相性の用量反応曲線が明白ではなかった。しかし、１ｎＭを超える濃度では相加作用が明らかであった。２０‐２ｂのＩｍａｘ（６５％）は、ＩＦＮα２ｂ の反応（Ｉｍａｘ＝４３％）とｖ‐ｍａｂ （Ｉｍａｘ＝１０％）の反応を加えたものよりも大きく、このことは、ＩＦＮα２ｂとｖ‐ｍａｂの作用間の相乗性の可能性を示唆している。
【０１２４】
ＡＤＣＣ活性
ＩＦＮαは、ＮＫ細胞およびマクロファージを活性化することにより、抗ＣＤ２０免疫療法の基本的な作用機序（ＭＯＡ）である、ＡＤＣＣ活性を増強し得る。本発明者らは、エフェクター細胞として末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、２つのＮＨＬ細胞株で２０‐２ｂとｖ‐ｍａｂのＡＤＣＣを比較した。複数のドナー由来のＰＢＭＣを用いた反復アッセイにより、ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ細胞双方について示すように、２０‐２ｂの方が、ｖ‐ｍａｂに比べＡＤＣＣをより増強することが実証された（図４Ａ）。この効果は、抗ＣＤ２２ＭＡｂであるエピラツズマブを含み、ＡＤＣＣをわずかに示すＭＡｂ‐ＩＦＮαである、２２‐２ｂでも示された（Ｃａｒｎａｈａｎら、２００７、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：１３３１‐４１）。
【０１２５】
ＣＤＣ活性
ＣＤＣは、I型抗ＣＤ２０ＭＡｂ（ｖ‐ｍａｂおよびリツキシマブを含む）の重要なＭＯＡであると考えられている。しかし、トシツモマブに代表されるII型ＭＡｂでは、この機能が欠如している（Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉら、２００２、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５１：１５‐２４）にもかかわらず、抗リンパ腫活性を有する。ｖ‐ｍａｂとは異なり、２０‐２ｂはインビトロでのＣＤＣ活性を示さない（図４Ｂ）。これらの結果は、補体結合がおそらく立体的干渉により阻害されていると思われるＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｖ‐ｍａｂモジュールベースの他のＤＮＬ構造物の結果（Ｒｏｓｓｉら、２００８）と一致する。
【０１２６】
実施例６．２０‐２ｂの薬物動態（ＰＫ）解析
雄のＳｗｉｓｓ‐Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける２０‐２ｂの薬物動態（ＰＫ）特性を評価し、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮおよびα２ｂ‐４１３（ＤＮＬにより作製されたペグ化ＩＦＮ、米国特許出願第１１／９２５，４０８を参照のこと）のものと比較した。様々な時間における血清試料中のＩＦＮ‐α濃度を、製造者による説明書に従ってＥＬＩＳＡ法により測定した。簡潔に述べれば、血清試料を、キットに備付けのヒトＩＦＮ‐αの基準に従って適切に希釈した。マイクロタイタープレートウェルに結合した抗体は、インターフェロンを捕捉する。次いで二次抗体を用いて、結合したインターフェロンを検出し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗二次抗体により定量化した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。図３はＰＫ解析の結果を表し、２０‐２ｂは他の薬剤と比べて、消失が有意に遅く、血中滞留時間が有意に長いことを示していた。２１０ｐｍｏｌの注入量において、時間単位で算出される薬物動態的な血中半減期は、８．０時間（２０‐２ｂ）、５．７時間（α２ｂ‐４１３）、４．７時間（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））および２．６時間（ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ）であった。消失速度（１／ｈ）は、０．０８７（２０‐２ｂ）、０．１２１（α２ｂ‐４１３）、０．１４９（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））および０．２６５（ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ）であった。算出されたＭＲＴ０．０８→∞（時間）は、２２．２（２０‐２ｂ）、１２．５（α２ｂ‐４１３）、１０．７（ＰＥＧＡＳＹＳ）および６．０（ＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ）であった。薬物動態パラメーターは、個々の抗体またはサイトカインよりむしろ複合体の性質により決定されるため、サイトカイン‐ＤＮＬ複合体のＰＫ特性は、他のサイトカイン部分および抗体部分に一般化可能であり、上述の特定の２０‐２ｂ構築物に限定されないことが予想される。
【０１２７】
実施例７．２０‐２ｂのインビボ活性
血中安定性
２０‐２ｂは、３７℃で、ヒト血清中（≧１０日）または全血中（≧６日）において安定であった（不掲載）。２０‐２ｂ複合体の濃度を、二重特異性ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。アッセイ時間にわたり、検出可能な全血または血清中における血中２０‐２ｂレベルの変化は、実質的にはなかった。
【０１２８】
ヒト全血由来のリンパ腫細胞に対する２０‐２ｂのエキソビボでの効果
本発明者らは、２０‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂ、７３４‐２ｂまたはｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂが、エキソビボ環境でリンパ腫または正常なＢ細胞を全血から除去する能力を比較した（図５）。裸の抗ＣＤ２０ＭＡｂの治療効果は、３つの作用機序（ＭＯＡ）、すなわちシグナル伝達誘導性アポトーシスもしくは増殖停止、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを介して得られると考えられている（Ｇｌｅｎｎｉｅら、２００７、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：３８２３‐３７）。このアッセイにおいて、ｖ‐ｍａｂは、３つのＭＯＡすべてを利用し得るのに対し、インビトロの所見では、２０‐２ｂは、シグナル伝達および増強されたＡＤＣＣを利用できる可能性があるが、ＣＤＣはない。この短期モデルにおいて、２０‐２ｂおよび７３４‐２ｂのＩＦＮα２ｂグループは、腫瘍細胞に直接作用し、ｖ‐ｍａｂのＡＤＣＣ活性を増強しかつおそらくは免疫刺激作用をいくつか有し得る。しかし、インビボで生じ得る自然および適応免疫系の、ＩＦＮα仲介による活性化の全領域は、この２日のエキソビボアッセイでは実現されない。
【０１２９】
０．０１ｎＭでは、２０‐２ｂ（６０．５％）が、ｖ‐ｍａｂ（２２．８％）、７３４‐２ｂ（３８．６％）またはｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂ（４１．７％）よりも、有意にＤａｕｄｉ細胞を枯渇させた（図５）。０．１ｎＭでは、２０‐２ｂおよびｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂが同程度（８８．９％）にＤａｕｄｉ細胞を枯渇させ、これは、ｖ‐ｍａｂ（８２．４％）または７３４‐２ｂ（４０．７％）よりも多かった（図５）。１ｎＭでは、７３４‐２ｂ（５５．７％）以外、各薬剤ともＤａｕｄｉ枯渇が９５％を超えた（図５）。示される差はそれぞれ統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【０１３０】
Ｒａｍｏｓは、ＩＦＮα２ｂおよびｖ‐ｍａｂ双方に対してＤａｕｄｉよりも低感受性である。７３４‐２ｂの効果は中等度に過ぎず、各濃度におけるＲａｍｏｓ枯渇は２０％未満であった（図５）。０．０１および０．１ｎＭ双方において、２０‐２ｂの方が、ｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂよりもＲａｍｏｓを枯渇させ、そしてｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂの方が、ｖ‐ｍａｂよりも多くの細胞を除去した（図５）。１ｎＭでは、７３４‐２ｂを除くすべての処置により同様のＲａｍｏｓ枯渇（７５％）が得られた（図５）。示される差はそれぞれ統計的に有意であった（ｐ＜０．０２）。
【０１３１】
７３４‐２ｂで実証されたように、このアッセイでは、ＩＦＮα２ｂ単独では、正常なＢ細胞を枯渇させない。これらの低濃度では、２０‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂおよびｖ‐ｍａｂ＋７３４‐２ｂは、それぞれ同様な用量反応的なＢ細胞枯渇を示し、これはＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓの枯渇よりも著しく低い。どの処置でもＴ細胞の有意な枯渇は得られなかった（データ不掲載）。
【０１３２】
ＳＣＩＤマウスにおける２０‐２ｂのインビボ効果
マウスモデルの限界は、マウス細胞がヒトＩＦＮα２ｂに対して非常に低感受性であるということである。ヒトにおいて得られ得る２０‐２ｂの全般的な治療上の利点として、先天および適応免疫双方の増強を挙げることができる。これらの限界を考慮して、本発明者らは、ＳＣＩＤマウスにおける播種性のバーキットリンパ腫モデルに対する、２０‐２ｂのインビボでの抗リンパ腫効果を調べた。始めに本発明者らは、高感受性の初期Ｄａｕｄｉモデルを試験した（図６Ａ）。接種の１日後に、各群に１低用量の２０‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂまたは７３４‐２ｂを投与した。ｖ‐ｍａｂまたは７３４‐２ｂの１用量０．７ｐｍｏｌ（１７０ｎｇ）では、生理食塩水と比較した場合の生存率において、ｖ‐ｍａｂに関しては有意な改善が得られた（ｐ＜Ｐ〈０．０００１）が、無関係対照ＭＡｂ‐ＩＦＮαである７３４‐２ｂでは得られなかった（図６Ａ）。この改善はわずかであり、生存期間中央値（ＭＳＴ）は生理食塩水での２７日からｖ‐ｍａｂでの３４日に増加した。しかし、２０‐２ｂの１用量０．７ｐｍｏｌ（１７０ｎｇ）では、ＭＳＴにおいて、生理食塩水およびｖ‐ｍａｂ群双方を１００日よりも多く上回る改善が得られた（ｐ＜Ｏ．０００１）（図６Ａ）。１９週間後にこの実験を終了し、その時点で、０．７ｐｍｏｌの２０‐２ｂ処置群中の７個体の長期生存例を剖検したところ、疾患の明白なエビデンスは見られなかった（治癒した）（図６Ａ）。注目すべきことに、最低用量０．０７ｐｍｏｌ（１７ｎｇ）の２０‐２ｂでさえもＭＳＴが２倍を超えた（図６Ａ）。
【０１３３】
次に発明者らは、マウスにおいて処置前に実質上より多くの腫瘍量が発現する、より困難な進行Ｄａｕｄｉモデルにおいて２０‐２ｂの効果を評価した（図６Ｂ）。腫瘍接種の７日後、各群に１回低用量（０．７、７．０または７０ｐｍｏｌ）の２０‐２ｂ、ｖ‐ｍａｂ、７３４‐２ｂまたはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を投与した。生理食塩水の対照マウスのＭＳＴは２１日であった（図６Ｂ）。それぞれ（組換えＩＦＮαと比べて）ＰＫを増強するが、腫瘍を標的としない最高用量（７０ｐｍｏｌ）のＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）または７３４‐２ｂでは、ＭＳＴが２倍であった（４２日；ｐ＜Ｏ．０００１）（図６Ｂ）。１００倍低い用量（０．７ｐｍｏｌ）での２０‐２ｂ処置では、最高用量（７０ｐｍｏｌ）のＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）または７３４‐２ｂと同様の結果（３８．５日）が得られた（図６Ｂ）。１０倍低い用量（７ｐｍｏｌ）の２０‐２ｂ処置では、７０ｐｍｏｌのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）または７３４‐２ｂ処置よりも、有意な生存率の改善（８０．５日、２０％ＬＴＳ）が得られた（ｐ＜Ｏ．００１２）（図６Ｂ）。試験した最高用量（７０ｐｍｏｌ）では、２０‐２ｂにより１０５日を超えるＭＳＴに改善され、ＬＴＳは１００％であった（図６Ｂ）。本発明者らはこれまでに、ｖ‐ｍａｂが比較的低用量（３．５ｐｍｏｌ）で担Ｄａｕｄｉマウスの生存率を増加させ得るとともに、より高用量でＬＴＳが得られることを、初期腫瘍モデルを用いて実証した。しかし、今回の進行腫瘍モデルでは、１回量７０ｐｍｏｌのｖ‐ｍａｂの生存率に対する効果は、有意ではあるがほんのわずかであった（ＭＳＴ＝２４日、ｐ＝０．０００１）（図６Ｂ）。
【０１３４】
次いで本発明者らは、ＩＦＮαによる直接的阻害に対してＤａｕｄｉよりも低感受性でありかつｖ‐ｍａｂによる免疫療法に対して低反応性である、より困難な腫瘍モデルにおいて２０‐２ｂをアッセイした。Ｒａｊｉは、ＩＦＮα２ｂの直接作用に対してＤａｕｄｉに比べて〜１０００倍低感受性である。しかし、ＲａｊｉはＤａｕｄｉに匹敵するＣＤ２０抗原密度を有し（Ｓｔｅｉｎら、２００６、Ｂｌｏｏｄ、１０８：２７３６‐４４）、Ｄａｕｄｉにはかなり劣るものの、ｖ‐ｍａｂに対して反応性である（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、２００９、Ｂｌｏｏｄ、１１３；１０６２‐７０）。腫瘍接種５日後に治療を開始する進行Ｒａｊｉモデルにおいて、２０‐２ｂの効果を調べた（図７Ａ）。各群に、２週間にわたり計６回（各２５０ｐｍｏｌ）注射を施した。７３４‐２ｂでは、生理食塩水よりも生存率が改善されず（ＭＳＴ＝１６日）、ＲａｊｉのＩＦＮαに対する非感受性と一致した（図７Ａ）。ｖ‐ｍａｂでは、生理食塩水よりも生存率が有意に改善された（ＭＳＴ＝２６日、ｐ＜Ｏ．０００１）（図７Ａ）。２０‐２ｂは、他のすべての処置を上回っていた（ＭＳＴ＝３３日、ｐ＜ＰＯ．０００１）（図７Ａ）。
【０１３５】
最後に本発明者らは、ＮＡＭＡＬＷＡを用いて２０‐２ｂの効果を調べた（図７Ｂ）。ＮＡＭＡＬＷＡは、ＩＦＮαの直接作用に対して低感受性で、ＣＤ２０抗原密度がＤａｕｄｉまたはＲａｊｉに比べて〜２５倍低いヒトリンパ腫であり、抗ＣＤ２０免疫療法に対して耐性であると考えられている（Ｓｔｅｉｎら、２００６）。各群に、計６用量（各２５０ｐｍｏｌ）の２０‐２ｂまたは７３４‐２ｂを投与した。別の１群に、計７用量（各３．５ｎｍｏｌ）のｖ‐ｍａｂを投与した。生理食塩水で処置した群のＭＳＴは１７日であった（図７Ｂ）。７３４‐２ｂによる処置では、有意ではあるが、非常にわずかな生存率の改善が見られた（ＭＳＴ＝２０日、ｐ＝０．００１２）（図７Ｂ）。２０‐２ｂ（ＭＳＴ＝３４日）は、７３４‐２Ｂ（Ｐ＝０．０００４）および１４倍高い用量で投与したｖ‐ｍａｂ（ＭＳＴ＝２４日、Ｐ＝０．００２６）を上回っていた（図７Ｂ）。
【０１３６】
結論
以上の結果は、抗ＣＤ２０ＭＡｂを用いたＩＦＮαの標的化により、単独の薬剤または薬剤の組合せよりも、免疫サイトカインがより強力かつ効果的になることを明白に実証している。腫瘍に対するＭＡｂによるＩＦＮα標的化は、単一薬剤の投与計画の頻度を減らし、ＩＦＮ療法に付随する副作用を低減または除去し、非常に増大した効果をもたらし得る。さらに標的化ＩＦＮαは、腫瘍に対する急性免疫応答を誘導し、おそらくは、先天および適応免疫の多面的な刺激を介して免疫記憶を誘発することができる（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、２００２、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、１２：１１９‐３４）。別のグループは、化学的コンジュゲーションにより作製されるＭＡｂ‐ＩＦＮαを産生し、このような構築物の潜在的な臨床的有用性が明らかとなった（Ｐｅｌｈａｍら、１９８３、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１５：２１０‐１６；Ｏｚｚｅｌｌｏら、１９９８、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、４８：１３５‐４７）。マウスＩＦＮαおよび抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＭＡｂを含む組換えＭＡｂ‐ＩＦＮαは、免疫正常マウスにおいて、トランスジェニック（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）マウスＢ細胞リンパ腫の強力な阻害を示し、さらに免疫記憶による防御的な適応免疫応答の誘導も可能であった（Ｈｕａｎｇら、２００７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７９：６８８１‐８８）。
【０１３７】
本発明者らは、２０‐２ｂによる治療が、ＮＫ、Ｔ４、Ｔ８および樹状細胞を含めた多くの免疫細胞の局所的な動員および活性化を刺激して、細胞傷害性およびＡＤＣＣの増強をもたらし、さらに腫瘍に対する免疫記憶を潜在的に誘導し得るであろうと考える。しかし、ヒト細胞に比べ、マウス細胞はヒトＩＦＮα２ｂに対して極めて低感受性（〜４ｌｏｇ）である（Ｋｒａｍｅｒら、１９８３、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、３：４２５‐３５；Ｗｅｅｋら、１９８１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、５７：２３３‐３７）。したがって、上記マウスモデルのインビボ実験における２０‐２ｂの抗リンパ腫活性は、マウス免疫応答のＩＦＮα２ｂ活性化には起因し得ず、仮に起因し得ても極わずかである。むしろ殺傷性は、主としてリンパ腫細胞に対するＩＦＮα２ｂの直接作用によるものである。
【０１３８】
本発明者らは、２０‐２ｂが、抗ＣＤ２０免疫療法の最も重要なＭＯＡであり得るＡＤＣＣを増強することを示した。しかし、ヒトＩＦＮα２ｂは、マウス宿主の免疫エフェクター細胞を極わずかしか刺激しないため、ＩＦＮαに増強されたＡＤＣＣは、おそらくヒトにおけるほどは認められないであろう。これらの制限に関わらず、インビボでの結果により、２０‐２ｂが、ＩＦＮα感受性のＤａｕｄｉモデルにおいて、ｖ‐ｍａｂまたは非標的化ＭＡｂ‐ＩＦＮαの１００倍を超える効力を示し、非常に効果的な抗リンパ腫薬剤であり得ることが実証された。ＩＦＮαの直接作用に対して比較的非感受性であるリンパ腫モデル（Ｒａｊｉ／ＮＡＭＡＬＷＡ）または抗ＣＤ２０免疫療法に対して耐性であるリンパ腫モデル（ＮＡＭＡＬＷＡ）に対してさえも、２０‐２ｂは、ｖ‐ｍａｂまたは非標的化ＭＡｂ‐ＩＦＮαよりも優れた効果を示した。
【０１３９】
ＩＦＮα２ｂをｖ‐ｍａｂと融合させることで、循環時間が延長され、腫瘍標的化が可能となることにより、そのインビボでの効力が増大する。Ｄａｕｄｉモデルにおいて、Ｐｋの治療上の重要性が示され、ここでは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を緩やかに除去する方が、より高い比活性を有するＰＥＧ‐ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）を急速に除去するよりも優れていた（データ不掲載）。２０‐２ｂは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）または７３４‐２ｂよりもかなり強力であったが、このことは、抗ＣＤ２０ＭＡｂを介したリンパ腫標的化が、２０‐２ｂの優れた効力および効果にとって重要であることを示唆している。驚くべきことに、標的化の効果は、インビトロアッセイにおいてさえも明らかであった。シグナル伝達を介したリンパ腫阻害のみ可能なインビトロ増殖実験において、２０‐２ｂは、単独のまたはｖ‐ｍａｂと組合せた場合の非標的化ＭＡｂ‐ＩＦＮαよりも２５倍低い濃度で活性を示した。エキソビボ環境においては、３つの抗ＣＤ２０ＭＯＡすべての関与が可能である。２０‐２ｂは、ＣＤＣ活性が無くても、血液由来リンパ腫の枯渇において、単独のＩＦＮαまたはｖ‐ｍａｂならびにその組合わせよりも効果的であったが、このことは標的化の重要性を示している。ＭＡｂ、エフェクターおよび標的細胞はすべて、実験を通して制限されていたため、インビボ／エキソビボ実験におけるＭＡｂ標的化の影響は、いささか驚くべきことである。本発明者らは、２０‐２ｂが、ヒト患者において実質上より大きなインビボ効果を有するであろうと考える。
【０１４０】
２０‐２ｂのＩＦＮα２ｂおよびｖ‐ｍａｂ成分はおそらく、相加的または相乗的に作用して２０‐２ｂの効力増強に寄与している可能性がある。インビトロ増殖アッセイでは、少なくとも１つの相加効果が示唆され、これはｖ‐ｍａｂおよび７３４‐２ｂの組合せが、どちらの薬剤単独よりも優れているというエキソビボ実験の結果により裏付けられた。この効果は、２０‐２ｂの一部としてのｖ‐ｍａｂのＡＤＣＣ活性増加を介して、または７３４‐２ｂと組合わされた場合に実現され得るが、ＡＤＣＣはインビトロ増殖アッセイにおいては機能せず、このことは、さらなる機序の存在を示唆する。ｖ‐ｍａｂ結合ＣＤ２０により伝達されるシグナルが、ＩＦＮαシグナルを増強することで、効力増大が生じる可能性がある。あるいは、徐々に内部移行するＭＡｂであるｖ‐ｍａｂの結合が、I型ＩＦＮ受容体の内部移行／下方制御を妨げることで、より持続的かつ効果的なＩＦＮα誘導性シグナルが生じる可能性がある。
【０１４１】
実施例８．エリスロポエチン（ＥＰＯ）ベースのＤＤＤモジュール生成
哺乳動物細胞内で発現するＥＰＯ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２の構築
ＥＰＯのｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅して、ＸｂａＩおよびＢａｍＨI が制限部位であり、シグナルペプチドがヒトＥＰＯ由来でありかつ６Ｈｉｓがヘキサヒスチジンタグである、以下の特徴配列を得た：Ｘｂａｌ―シグナルペプチド―ＥＰＯ―６Ｈｉｓ―ＢａｍＨI（６Ｈｉｓは、配列番号２８で開示される）。得られた分泌タンパク質は、そのＣ末端で、以下の配列：
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲ
ＬＲＥＡＲＡ（配列番号３）
からなるポリペプチドと融合しているＥＰＯで構成されていた。
【０１４２】
鋳型として完全長ヒトＥＰＯｃＤＮＡクローンをおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ増幅行った：
ＥＰＯ ＸｂａI 左側
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号６）
ＥＰＯ ＢａｍＨI 右側
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧ（配列番号７）。
【０１４３】
ＰＣＲアンプリマーを、ｐＧｅｍＴベクター内にクローニングした。ＥＰＯとのライゲーション用に、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを、ＸｂａIおよびＢａｍＨI制限酵素で消化して調製した。ＥＰＯアンプリマーを、ＸｂａIおよびＢａｍＨIでｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクター内にライゲートして、発現ベクターＥＰＯ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１４４】
哺乳動物細胞におけるＥＰ０‐ＤＤＤ２発現
ＥＰＯ‐ｐｄＨＬ２を、ＳａｌI酵素で消化して直線化し、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦ骨髄腫細胞内に安定にトランスフェクトした。クローンを、０．１５μＭのＭＴＸを含む培地で選択した。Ｈｉｓ‐タグ融合タンパク質を捕捉するためのＮｕｎｃ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ Ｎｉｃｋｅｌ‐Ｃｈｅｌａｔｅプレートおよび抗ＥＰＯ抗体による検出を用いたＥＬＩＳＡ法により、クローン番号４１、４９および３７がそれぞれ、〜０．５ｍｇ／ＬのＥＰＯを産生することが示された。９．６リットルの無血清ローラーボトル培養から、ＩＭＡＣにより約２．５ｍｇのＥＰＯ‐ＤＤＤ２が精製された。
【０１４５】
実施例９．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈ７３４と結合した４つのＥＰＯ‐ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬコンジュゲートである７３４‐ＥＰＯの生成
７３４‐ＥＰＯを、２０‐２ｂに関して上記した通り作製した。プロテインＡで精製した７３４‐ＥＰＯのＳＥ‐ＨＰＬＣ分析では、比較的大きい分子サイズの主要ピークおよびショルダーが見られた（不掲載）。主要ピークの保持時間は、１つのＩｇＧと４つのＥＰＯとのグループからなる共有結合複合体と一致した。ショルダーは、ＩｇＧ‐ＥＰＯコンジュゲートの非共有結合二量体によるものと思われた。クーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析および抗ＥＰＯイムノブロット分析では、非還元条件下において作製物は、推定されるＭＷ（〜３１０ｋＤａ）と一致する２６０ｋＤａを超えるＭｒを有することが示された（不掲載）。還元条件下において、７３４‐ＥＰＯの３つの成分ポリペプチド（ＥＰＯ‐ＤＤＤ２、重鎖‐ＡＤ２および軽鎖）を表すバンドが明瞭であり、量的に類似しているようであった（不掲載）。非作製物の夾雑物は検出されなかった。
【０１４６】
ＥＰＯ‐ＤＤＤ２および７３４‐ＥＰＯがＥＰＯ応答性ＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ）の増殖を刺激する能力について、組換えヒトＥＰＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を陽性対照としてアッセイを行った。ＴＦ１細胞を、１×１０４細胞／ウェルを含む９６ウェルプレートで、２０％ＦＢＳ添加かつＭ‐ＣＳＦ無添加であるＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ＥＰＯ構築物の濃度（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を、市販のキット（ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡキット、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６３０）を用いて測定した。細胞を、９００Ｕ／ｍｌ〜０．００１ Ｕ／ｍｌの範囲の濃度のｒｈＥＰＯ、ＥＰＯ‐ＤＤＤ２または７３４‐ＥＰＯ存在下で７２時間培養した。ＭＴＳ試薬２０μｌ／ウェルを用いたＭＴＳアッセイにより、生細胞密度を比較した。このアッセイでは、６時間のインキュベート後、９６ウェルプレートリーダーでＯＤ４９０を測定した。用量反応曲線およびＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて算出した（図８）。ＥＰＯ‐ＤＤＤ２および７３４‐ＥＰＯは共に、ｒｈＥＰＯの約１０％であるインビトロでの生物学的活性を示した。
【０１４７】
実施例１０．顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）ベースのＤＤＤモジュール生成
哺乳動物細胞内で発現するＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２の構築
Ｇ‐ＣＳＦのｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅して、シグナルペプチドがヒトＧ‐ＣＳＦ由来でありかつ６Ｈｉｓがヘキサヒスチジンタグである、以下の特徴を含む配列を得た：ＸｂａＩ―シグナルペプチド―Ｇ‐ＣＳＦ―６Ｈｉｓ―ＢａｍＨI（６Ｈｉｓは、配列番号２８で開示される）。得られた分泌タンパク質は、そのＣ末端で、配列番号３からなるポリペプチドと融合しているＧ‐ＣＳＦから構成されていた。
【０１４８】
鋳型として完全長ヒトＧ‐ＣＳＦｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＩＭＡＧＥヒト、カタログ番号９７００２ＲＧ、クローンＩＤ５７５９０２２）をおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ増幅を行った：
Ｇ‐ＣＳＦ ＸｂａIＬｅｆｔ
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧ（配列番号８）
Ｇ‐ＣＳＦ ＢａｍＨI‐Ｒｉｇｈｔ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ（配列番号９）。
【０１４９】
ＰＣＲアンプリマーをｐＧｅｍＴベクター内にクローニングした。Ｇ‐ＣＳＦとのライゲーション用に、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを、ＸｂａIおよびＢａｍＨI制限酵素で消化して調製した。Ｇ‐ＣＳＦアンプリマーを、ＸｂａIおよびＢａｍＨIでｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ベクター内にライゲートして、発現ベクターＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１５０】
哺乳動物細胞におけるＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２発現
Ｇ‐ＣＳＦ‐ｐｄＨＬ２を、ＳａｌI酵素で消化して直線化し、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦ骨髄腫細胞内に安定にトランスフェクトした。クローンを、０．１５μＭのＭＴＸを含む培地で選択した。サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、クローン番号４が０．１５ｍｇ／ＬのＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２を産生することが示された。
【０１５１】
ローラーボトル中で増殖したバッチ培養からのＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２精製
クローン番号４を、０．４μＭのＭＴＸを含有するハイブリドーマＳＦＭを計２０Ｌ含む３４個のローラーボトルに拡大し、最終培養まで培養した。上清液を遠心分離により清澄して、濾過し（０．２μＭ）、１Ｘ結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）中へダイアフィルター濾過して濃縮した。濃縮物をＩＭＡＣにより精製した。
【０１５２】
大腸菌におけるＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２の構築および発現
Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２は、大腸菌においても、微生物発酵により、可溶性タンパク質として発現された。コード配列を、Ｇ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２‐ｐｄＨＬ２ ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、コード配列を増幅した。アンプリマーを、ＮｄｅIおよびＸｈｏI制限部位を用いて、ＩｐＥＴ２６ｂ大腸菌発現ベクター内にクローニングした。１８℃で１２時間、１００μＭのＩＰＴＧを含むＬＢ振盪フラスコでの誘導により、タンパク質をＢＬ２１ｐＬｙｓＳ宿主細胞において細胞内発現させた。可溶性Ｇ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２を、ＩＭＡＣにより細胞溶解物から精製した。
【０１５３】
大腸菌におけるＮ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の構築および発現
ＤＤＤ２配列とペプチドスペーサーを、Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）のＮ末端で融合することにより、別のＧ‐ＣＳＦ‐ＤＤＤ２モジュールを作製した。Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）は、１７位の不対システイン残基がセリンで置換されている点で、野生型とは異なる。Ｎ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）を大腸菌内で発現させ、ＩＭＡＣにより精製した。
【０１５４】
実施例１１．ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１と結合した４つのＮ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）部分を含むＤＮＬコンジュゲートであるｈＲ１‐１７Ｓの生成
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、ＣＨ３‐ＡＤ２‐ＩｇＧ‐ｈＲ１と過剰のＮ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）を酸化還元条件下で混合してｈＲ１‐１７Ｓを作製した。プロテインＡで精製したｈＲ１‐１７ＳのＳＥ‐ＨＰＬＣ分析では、比較的大きい分子サイズの主要ピークおよびショルダーが見られた（不掲載）。主要ピークの保持時間は、１つのＩｇＧと４つのＧ‐ＣＳＦとのグループからなる共有結合複合体と一致した。ショルダーは、ＩｇＧ‐Ｇ‐ＣＳＦコンジュゲートの非共有結合二量体によるものと思われた。クーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析および抗Ｇ‐ＣＳＦイムノブロット分析では、非還元条件下において、作製物は、推定されるＭＷ（〜２６０ｋＤａ）と一致するＭｒを有することが示された（不掲載）。還元条件下において、ｈＲ１‐１７Ｓの３つの成分ポリペプチド（Ｎ‐ＤＤＤ２‐Ｇ‐ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）、重鎖‐ＡＤ２および軽鎖）を表すバンドが検出された（不掲載）。
【０１５５】
実施例１２．配列変異体
特定の好適な実施形態において、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ複合体に組み込まれるＡＤおよびＤＤＤ配列は、以下の示すようなＡＤ２およびＤＤＤ２のアミノ酸配列を含む：
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１０）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号１１）。
【０１５６】
しかし、別の実施形態において、配列変異体ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分をサイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ複合体の構築に使用し得る。ＡＤおよびＤＤＤドメインの構造‐機能の関係が研究対象となってきた（例えば、Ｂｕｒｎｓ‐Ｈａｍｕｒｏら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、１４：２９８２‐９２；Ｃａｒｒら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：１７３３２‐３８；Ａｌｔｏら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：４４４５‐５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３９６：２９７‐３０６；Ｓｔｏｋｋａら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、４００：４９３‐９９；Ｇｏｌｄら、２００６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２４：３８３‐９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２４：３９７‐４０８（それぞれその全内容が参照により本明細書で援用される）を参照のこと）。
【０１５７】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）は、ＡＤ‐ＤＤＤ間の結合相互作用の結晶構造を調べ、ヒトＤＤＤ配列には、二量体形成またはＡＫＡＰ結合において重要な保存アミノ酸残基（配列番号１２の下線部）が数多く含まれると結論付けた（参照により本明細書で援用されるＫｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）の図１を参照のこと）。ＤＤＤ配列の配列変異体の設計において、下線部のいかなる残基も変化させないことが望ましいと同時に、保存的アミノ酸置換は、二量体形成およびＡＫＡＰ結合にあまり重要ではない残基に対して行われ得ることを、当業者は理解されよう。
タンパク質キナーゼＡ由来のヒトＤＤＤ配列
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１２）。
【０１５８】
Ａｌｔｏら（２００３）は、様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティック解析を行い、ＤＤＤに対して０．４ｎＭの結合定数を有する、ＡＫＡＰ‐ＩＳと呼ばれるＲII選択的ＡＤ配列（配列番号１７）を設計した。ＡＫＡＰ‐ＩＳを、ＡＫＡＰのＰＫＡへの結合に対するペプチドアンタゴニストとして設計した。配列番号１３において、ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列中の残基のうち、置換によりＤＤＤとの結合が低下する傾向にあるものに下線を付す。
ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１３）
【０１５９】
同様に、Ｇｏｌｄ（２００６）は、結晶構造解析およびペプチドスクリーニングを用いて、ＰＫＡのＲIIアイソフォームに対し、ＲIアイソフォームに比べて５桁高い選択性を示すＳｕｐｅｒＡＫＡＰ‐ＩＳ配列（配列番号１４）を開発した。下線を付した残基は、ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列に比べて、ＲIIαのＤＤＤ部分との結合を増大させるアミノ酸置換の位置を示す。この配列において、Ｎ末端のＱ残基には残基番号４を付し、Ｃ末端のＡ残基には残基番号２０を付す。置換によりＲIIαに対する親和性に影響を与え得た残基は、８、１１、１５、１６、１８、１９および２０であった（Ｇｏｌｄら、２００６）。特定の別の実施形態において、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ‐ＩＳ配列をＡＫＡＰ‐ＩＳのＡＤ部分の配列で置換して、サイトカイン‐ＭＡｂ・ＤＮＬ構築物を調製し得ると考えられる。ＡＫＡＰ‐ＩＳのＡＤ配列で置換し得る他の代替配列を、配列番号１５〜１７で示す。ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列に対する置換には下線が付されている。配列番号１１で示されるＡＫＡＰ‐ＩＳ配列と同様に、ＡＤ部分にも、配列番号１１で示されるようなＮ末端残基システインおよびグリシンならびにＣ末端残基グリシンおよびシステインがさらに含まれ得ることが予想される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ‐ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号１４）
代替ＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１５）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１６）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１７）。
【０１６０】
Ｓｔｏｋｋａら（２００６）もまた、配列番号１８〜２０で示すような、ＡＫＡＰのＰＫＡへの結合に対する競合ペプチドを開発した。このペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１（配列番号１８）、ＲＩＡＤ（配列番号１９）およびＰＶ‐３８（配列番号２０）と称された。Ｈｔ３１ペプチドが、ＰＫＡのＲIIアイソフォームに対してより高い親和性を示したのに対し、ＲＩＡＤおよびＰＶ‐３８は、ＲIに対してより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号１８）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号１９）
ＰＶ‐３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号２０）。
【０１６１】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）は、ＡＫＡＰのＰＫＡへの結合に対するさらに別の競合ペプチドを開発し、このペプチドは、ＲII型のＰＫＡのＤＤＤに対して０．４ｎＭという低い結合定数を有していた。様々なＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列が、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（参照により本明細書で援用される）の表１に記載されている。異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間で高度に保存されていた残基を、ＡＫＡＰ‐ＩＳ配列に関して下線を付すことにより、以下に示す（配列番号１３）。残基は、Ｃ末端アラニン残基を加えれば、Ａｌｔｏら（２００３）により確認されたものと同じである（参照により本明細書で援用されるＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４を参照のこと）。ＲIIのＤＤＤ配列に対して特に親和性の高いペプチドアンタゴニストの配列を、配列番号２１〜２３で示す。
ＡＫＡＰ‐ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１３）
ＡＫＡＰ７δ‐ｗｔ‐ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２１）
ＡＫＡＰ７δ‐Ｌ３０４Ｔ‐ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＴＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２２）
ＡＫＡＰ７δ‐Ｌ３０８Ｄ‐ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＤＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２３）。
【０１６２】
Ｃａｒｒら（２００１）は、ヒトおよび非ヒトタンパク質由来の異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調べ、異なるＤＤＤ部分間で最も高度に保存されていると思われる、ＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらを、配列番号１２のヒトＰＫＡＲIIαのＤＤＤ配列に関して下線を付すことにより、以下に示す。特に保存されていた残基は、さらにイタリック体で示す。これらの残基は、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）がＡＫＡＰタンパク質との結合に重要であると示唆したものと一部重複するが、同一ではない。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１２）。
【０１６３】
一般に、異なるタンパク質由来のＤＤＤおよびＡＤ配列中で高度に保存されているこれらのアミノ酸残基は、アミノ酸置換を行う際にも変わらないことが望まれ得る残基であり、一方、それほど高度に保存されていない残基は、容易に変化させて本明細書に記載のＡＤおよび／またはＤＤＤ配列の配列変異体を作製し得ることを、当業者は理解されよう。
【０１６４】
ＤＤＤおよび／またはＡＤ部分の配列変異体に加え、ある実施形態において、抗体とＡＤ配列とを繋ぐ抗体部分またはリンカーペプチド配列内に、配列変異を導入することが望まれ得る。一具体例では、上記２０‐２ｂ重鎖のＣ末端残基は、本来のリジン残基から変化したものである。野生型重鎖のＣ末端配列を、考え得る３つの融合タンパク質配列変異体と共に、配列番号２４〜２７で示す。
ＷＴ
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２４）
（Ｌ）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号２５）
（Ａ）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＡＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号２６）
（−）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号２７）。
【０１６５】
重鎖定常領域配列中の野生型Ｃ末端リジンをロイシンで置換することにより、ｈＡ２０（Ｌ）と称する配列変異体を作製した。２０‐２ｂ構築物形成のための上記例に記載のように、ｈＡ２０（Ｌ）‐２ｂ・ＤＮＬ構築物を作製して、ロイシン置換配列を組み込んだ。変異体の薬物動態特性を比較するために、様々なＤＮＬ構築物注射後の１、２、３および４日のマウス血清試料を採取した。各時点におけるマウス血清中のインターフェロン血清中濃度は、２０（Ｌ）‐２ｂ構築物の方が２０‐２ｂ構築物よりも約２倍高いと測定された。しかし、ｈＡ２０ＩｇＧの血清中濃度の比較では、２０（Ｌ）‐２ｂおよび２０‐２ｂ構築物間における実質的な差は見られなかった。野生型リジンのロイシンへの置換が、抗体ＩｇＧ部分由来のＡＤ部分のタンパク質分解切断の低下をもたらし、また、タンパク質分解により複合体からＩＦＮが失われ、次いで、非コンジュゲートＩＦＮの血清からのクリアランス速度が、ＤＮＬ構築物と結合したＩＦＮのクリアランス速度に比べて高くなった、と結論付けられる。ＤＮＬ構築物の抗体部分またはリンカー部分におけるこれらのおよびその他のアミノ酸置換は、得られるＤＮＬ構築物の治療的および／または薬物動態的特性を増強するために使用され得ることを、当業者は理解されよう。
【０１６６】
本明細書において開示および特許請求されるすべての組成物および方法は、本開示を踏まえれば、必要以上の実験を行うことなく作製および使用することができる。組成物および方法は、好適な実施形態という形で記載されているが、本明細書に記載の、組成物および方法に対して、ならびに方法の個々の段階においてまたは一連の段階において、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく変更を加え得ることは、当業者にとって明らかである。より具体的には、化学的かつ生理学的に類似した特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換え得るが、同一または同様の結果が得られるであろう。当業者に明らかなこのような類似の代替および修正はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念に含まれるものと見なされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ（ドック・アンド・ロック）複合体であって、
ａ）タンパク質キナーゼＡの二量体化／ドッキングドメイン由来のペプチド配列を有するＤＤＤ（二量体化／ドッキングドメイン）部分に付加されたサイトカイン部分と、
ｂ）ＡＫＡＰ（Ａ‐キナーゼアンカータンパク質）のアンカードメイン由来のペプチド配列を有するＡＤ（アンカードメイン）部分に付加された抗体部分と
を含み、前記ＤＤＤ部分が、前記ＡＤ部分と結合する二量体を形成して、前記複合体を形成する、サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体。
【請求項２】
前記ＤＤＤとＡＤとの間にジスルフィド結合をさらに含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ＤＤＤ部分が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記ＡＤ部分が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記抗体部分が、ＩｇＧ抗体および抗原結合抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記抗体部分がＩｇＧ抗体であり、かつ前記ＩｇＧ抗体の各重鎖のＣ末端がＡＤ部分に付加されている、請求項６に記載の複合体。
【請求項７】
各ＡＤ部分が２つのＤＤＤ部分と結合し、かつ前記複合体が４つのサイトカイン部分を含む、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記サイトカイン部分が、インターフェロン（ＩＦＮ）‐α２ｂ、Ｇ‐ＣＳＦおよびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記ＩｇＧ重鎖および前記ＡＤ部分が第一の融合タンパク質を形成し、かつ前記サイトカイン部分および前記ＤＤＤ部分が第二の融合タンパク質を形成する、請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
前記サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体が、前記サイトカイン単独およびペグ化形態の前記サイトカインよりも長い血中半減期を示す、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
前記サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体が、リンパ腫細胞に対して、前記サイトカイン部分単独、前記抗体部分単独、非コンジュゲートサイトカイン部分と非コンジュゲート抗体部分との組合せおよびペグ化形態の前記サイトカイン部分よりも大きなインビボ効果を示す、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
前記抗体部分がｈＡ２０ＩｇＧ抗体であり、かつ前記サイトカイン部分がヒトＩＦＮα２ｂである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
癌、自己免疫疾患および感染症からなる群より選択される疾患の治療方法であって、
ａ）請求項１によるサイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体を得る段階と、
ｂ）前記複合体を、前記疾患を有する被検体に投与する段階と
を含む方法。
【請求項１４】
前記疾患が癌であり、かつ前記抗体部分が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＡＡが、炭酸脱水酵素IX、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ‐ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ‐６、Ｂ７、フィブロネクチンＥＤ‐Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子‐１（ＩＬＧＦ‐１）、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２５、ＩＰ‐１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ‐９５、ＮＣＡ‐９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、ＨＬＡ‐ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン‐フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ‐α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体部分が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ‐１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ１）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ‐９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＣＤ７４）、ｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡ）、ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡ）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ‐１）および ｈＭＮ‐３（抗ＣＥＡ）からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＤＤ部分が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＡＤ部分が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体がＩｇＧ抗体を含み、かつ前記ＩｇＧ抗体の各重鎖のＣ末端がＡＤ部分に付加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
各ＡＤ部分が２つのＤＤＤ部分と結合し、かつ前記複合体が４つのサイトカイン部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
前記サイトカイン部分が、インターフェロン（ＩＦＮ）‐α２ｂ、Ｇ‐ＣＳＦおよびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
前記サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体が、リンパ腫細胞に対して、前記サイトカイン部分単独、前記抗体部分単独、非コンジュゲートサイトカイン部分と非コンジュゲート抗体部分との組合せおよびペグ化形態の前記サイトカイン部分よりも大きなインビボ効果を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体部分がｈＡ２０ＩｇＧ抗体であり、かつ前記サイトカイン部分がヒトＩＦＮα２ｂである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）請求項１によるサイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体を得る段階と、
ｂ）前記複合体を被検体に投与する段階と
を含む、サイトカイン送達方法。
【請求項２４】
前記疾患が癌であり、かつ前記抗体部分が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＡＡが、炭酸脱水酵素IX、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ‐ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ‐６、Ｂ７、フィブロネクチンＥＤ‐Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子‐１（ＩＬＧＦ‐１）、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２５、ＩＰ‐１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ‐９５、ＮＣＡ‐９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、ＨＬＡ‐ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ‐Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ‐α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体部分が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ‐１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ１）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ‐９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＣＤ７４）、ｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡ）、ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡ）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ‐１）およびｈＭＮ‐３（抗ＣＥＡ）からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＤＤ部分が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＡＤ部分が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記複合体がＩｇＧ抗体を含み、かつ前記ＩｇＧ抗体の各重鎖のＣ末端がＡＤ部分に付加される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
各ＡＤ部分が２つのＤＤＤ部分と結合し、かつ前記複合体が４つのサイトカイン部分を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
前記サイトカイン部分が、インターフェロン（ＩＦＮ）‐α２ｂ、Ｇ‐ＣＳＦおよびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体部分がｈＡ２０ＩｇＧ抗体であり、かつ前記サイトカイン部分がヒトＩＦＮα２ｂである、請求項２５に記載の方法。
【請求項１】
サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ（ドック・アンド・ロック）複合体であって、
ａ）タンパク質キナーゼＡの二量体化／ドッキングドメイン由来のペプチド配列を有するＤＤＤ（二量体化／ドッキングドメイン）部分に付加されたサイトカイン部分と、
ｂ）ＡＫＡＰ（Ａ‐キナーゼアンカータンパク質）のアンカードメイン由来のペプチド配列を有するＡＤ（アンカードメイン）部分に付加された抗体部分と
を含み、前記ＤＤＤ部分が、前記ＡＤ部分と結合する二量体を形成して、前記複合体を形成する、サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体。
【請求項２】
前記ＤＤＤとＡＤとの間にジスルフィド結合をさらに含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ＤＤＤ部分が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記ＡＤ部分が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記抗体部分が、ＩｇＧ抗体および抗原結合抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記抗体部分がＩｇＧ抗体であり、かつ前記ＩｇＧ抗体の各重鎖のＣ末端がＡＤ部分に付加されている、請求項６に記載の複合体。
【請求項７】
各ＡＤ部分が２つのＤＤＤ部分と結合し、かつ前記複合体が４つのサイトカイン部分を含む、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記サイトカイン部分が、インターフェロン（ＩＦＮ）‐α２ｂ、Ｇ‐ＣＳＦおよびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記ＩｇＧ重鎖および前記ＡＤ部分が第一の融合タンパク質を形成し、かつ前記サイトカイン部分および前記ＤＤＤ部分が第二の融合タンパク質を形成する、請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
前記サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体が、前記サイトカイン単独およびペグ化形態の前記サイトカインよりも長い血中半減期を示す、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
前記サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体が、リンパ腫細胞に対して、前記サイトカイン部分単独、前記抗体部分単独、非コンジュゲートサイトカイン部分と非コンジュゲート抗体部分との組合せおよびペグ化形態の前記サイトカイン部分よりも大きなインビボ効果を示す、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
前記抗体部分がｈＡ２０ＩｇＧ抗体であり、かつ前記サイトカイン部分がヒトＩＦＮα２ｂである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
癌、自己免疫疾患および感染症からなる群より選択される疾患の治療方法であって、
ａ）請求項１によるサイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体を得る段階と、
ｂ）前記複合体を、前記疾患を有する被検体に投与する段階と
を含む方法。
【請求項１４】
前記疾患が癌であり、かつ前記抗体部分が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＡＡが、炭酸脱水酵素IX、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ‐ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ‐６、Ｂ７、フィブロネクチンＥＤ‐Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子‐１（ＩＬＧＦ‐１）、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２５、ＩＰ‐１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ‐９５、ＮＣＡ‐９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、ＨＬＡ‐ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン‐フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ‐α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体部分が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ‐１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ１）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ‐９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＣＤ７４）、ｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡ）、ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡ）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ‐１）および ｈＭＮ‐３（抗ＣＥＡ）からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＤＤ部分が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＡＤ部分が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体がＩｇＧ抗体を含み、かつ前記ＩｇＧ抗体の各重鎖のＣ末端がＡＤ部分に付加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
各ＡＤ部分が２つのＤＤＤ部分と結合し、かつ前記複合体が４つのサイトカイン部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
前記サイトカイン部分が、インターフェロン（ＩＦＮ）‐α２ｂ、Ｇ‐ＣＳＦおよびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
前記サイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体が、リンパ腫細胞に対して、前記サイトカイン部分単独、前記抗体部分単独、非コンジュゲートサイトカイン部分と非コンジュゲート抗体部分との組合せおよびペグ化形態の前記サイトカイン部分よりも大きなインビボ効果を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体部分がｈＡ２０ＩｇＧ抗体であり、かつ前記サイトカイン部分がヒトＩＦＮα２ｂである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）請求項１によるサイトカイン‐抗体・ＤＮＬ複合体を得る段階と、
ｂ）前記複合体を被検体に投与する段階と
を含む、サイトカイン送達方法。
【請求項２４】
前記疾患が癌であり、かつ前記抗体部分が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＡＡが、炭酸脱水酵素IX、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ‐ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ‐６、Ｂ７、フィブロネクチンＥＤ‐Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ‐１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子‐１（ＩＬＧＦ‐１）、ＩＦＮ‐γ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１８Ｒ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２５、ＩＰ‐１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１Ａ、ＭＩＰ‐１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ‐９５、ＮＣＡ‐９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、ＨＬＡ‐ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ‐Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ‐α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体部分が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ‐１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ１）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ‐９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＣＤ７４）、ｈＭＮ‐１４（抗ＣＥＡ）、ｈＭＮ‐１５（抗ＣＥＡ）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ‐１）およびｈＭＮ‐３（抗ＣＥＡ）からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＤＤ部分が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＡＤ部分が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記複合体がＩｇＧ抗体を含み、かつ前記ＩｇＧ抗体の各重鎖のＣ末端がＡＤ部分に付加される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
各ＡＤ部分が２つのＤＤＤ部分と結合し、かつ前記複合体が４つのサイトカイン部分を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
前記サイトカイン部分が、インターフェロン（ＩＦＮ）‐α２ｂ、Ｇ‐ＣＳＦおよびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体部分がｈＡ２０ＩｇＧ抗体であり、かつ前記サイトカイン部分がヒトＩＦＮα２ｂである、請求項２５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５１７６８４（Ｐ２０１１−５１７６８４Ａ）
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０４１０１（Ｐ２０１１−５０４１０１）
【出願日】平成２１年４月６日（２００９．４．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９６１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２６５５８
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５１０１１６４９５）アイビーシー ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月６日（２００９．４．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９６１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２６５５８
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５１０１１６４９５）アイビーシー ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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