観察装置および観察方法
【課題】被観察物に応じた好適な検出が可能な観察を実現する。
【解決手段】入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐する第１の分岐手段３と、被観察物に対して第１の測定光を斜入射照明する第１の照明光学系と、斜入射照明された被観察物からの透過光と第１の参照光とを合成する第１の合成手段４と、第１の参照光と被観察物からの透過光との第１の干渉光を検出する第１の検出手段１６とを備えた透過型観察装置と、入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐する第２の分岐手段４と、被観察物に第２の測定光を照明する第２の照明光学系と、第２の参照光と被観察物からの反射光とを合成する第２の合成手段４と、第２の参照光と被観察物からの反射光との第２の干渉光を検出する第２の検出手段１６とを備えた反射型観察装置とを備える。
【解決手段】入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐する第１の分岐手段３と、被観察物に対して第１の測定光を斜入射照明する第１の照明光学系と、斜入射照明された被観察物からの透過光と第１の参照光とを合成する第１の合成手段４と、第１の参照光と被観察物からの透過光との第１の干渉光を検出する第１の検出手段１６とを備えた透過型観察装置と、入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐する第２の分岐手段４と、被観察物に第２の測定光を照明する第２の照明光学系と、第２の参照光と被観察物からの反射光とを合成する第２の合成手段４と、第２の参照光と被観察物からの反射光との第２の干渉光を検出する第２の検出手段１６とを備えた反射型観察装置とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置および観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非破壊断層計測技術の１つに光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）がある（非特許文献１等を参照）。ＯＣＴは、波長幅の広い光をプローブとして用いることにより、被観察物の屈折率分布、分光情報、偏光情報等を計測することができる。そして、被観察物の３次元構造を、非染色・非侵襲で観察することができることが挙げられる。よって、ＯＣＴは、生体内細胞などに好適である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】E.A. Swanson, J.A. Izatt, M.R. Michael, D. Huang, C.P. Lin, J.S. Shuman, C.A. Puliafito, J.G. Fujimoto, 18 (21) 1864-1866, Optics Letters (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、培養細胞や細胞内器官などにおいて、ＯＣＴを用い、非染色・非侵襲で被観察物の３次元構造を観察したいという要求もある。しかし、上述した培養細胞や細胞内器官などの被観察物は、サイズや形状が様々であり、また、ＯＣＴ装置の分解能や特徴によっては、３次元構造をむらなく検出することができない場合が多い。
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、被観察物に応じた好適な検出が可能な観察装置および観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の観察装置の一態様は、入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐する第１の分岐手段と、被観察物に対して前記第１の測定光を斜入射照明する第１の照明光学系と、斜入射照明された前記被観察物からの透過光を観察する第１の観察光学系と、前記第１の測定光を基準とする前記第１の参照光を形成する第１の参照光学系と、前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光とを合成する第１の合成手段と、前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光との第１の干渉光を検出する第１の検出手段と、前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する第１の位置情報取得手段とを備えた透過型観察装置と、入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐する第２の分岐手段と、前記被観察物に前記第２の測定光を照明する第２の照明光学系と、照明された前記被観察物からの反射光を観察する第２の観察光学系と、前記第２の測定光を基準とする前記第２の参照光を形成する第２の参照光学系と、前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光とを合成する第２の合成手段と、前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光との第２の干渉光を検出する第２の検出手段と、前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する第２の位置情報取得手段とを備えた反射型観察装置とを備えるものである。
【０００７】
なお、透過型観察装置と反射型観察装置とを切り替える切替手段とを備えても良い。
【０００８】
また、前記第１の検出手段と前記第２の検出手段とが同一であっても良い。
【０００９】
また、前記第１の照明光学系は、前記被観察物に対して斜入射する斜入射手段を備えても良い。
【００１０】
また、前記第１の照明光学系、前記第２の照明光学系、前記第１の観察光学系、前記第２の観察光学系の少なくとも一つの光軸に直交した方向に前記第１の測定光または前記第２の測定光を走査する走査手段を備えても良い。
【００１１】
また、前記第１の検出手段または前記第２の検出手段の少なくとも一つは、前記第１の干渉光または前記第２の干渉光を分光して検出するスペクトル検出器であっても良い。
【００１２】
また、前記第１の参照光中または前記第１の測定光中に配置された１／２波長板または１／４波長板と、前記第１の分岐手段に所定の偏光の光を入射するための第１の偏光素子と、前記所定の偏光に基づいて決定する偏光方向を含む前記第１の干渉光の一部を透過する第２の偏光素子と、前記第１の偏光素子が透過させる偏光方向と前記第２の偏光素子が透過させる偏光方向とを同時に変化させる第１の制御手段とを備えても良い。
【００１３】
また、前記第２の参照光中または前記第２の測定光中に配置された１／２波長板または１／４波長板と、前記第２の分岐手段に所定の偏光の光を入射するための第３の偏光素子と、前記所定の偏光に基づいて決定する偏光方向を含む前記第２の干渉光の一部を透過する第４の偏光素子と、前記第３の偏光素子が透過させる偏光方向と前記第４の偏光素子が透過させる偏光方向とを同時に変化させる第２の制御手段とを備えても良い。
【００１４】
また、前記第２の偏光素子と前記第４の偏光素子とが同位置であっても良い。
【００１５】
本発明の観察方法の一態様は、入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐し、被観察物に対して前記第１の測定光を斜入射照明し、斜入射照明された前記被観察物からの透過光を観察し、前記第１の測定光を基準とする前記第１の参照光を形成し、前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光とを合成した干渉光を検出し、前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する透過型観察方法と、入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐し、記被観察物に前記第２の測定光を照明し、照明された前記被観察物からの反射光を観察し、前記第２の測定光を基準とする前期第２の参照光を形成し、前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光とを合成した干渉光を検出し、前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する反射型観察方法とを有し、前記透過型観察方法と前記反射型観察方法とを切り替えて観察することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、被観察物に応じた好適な検出が可能な観察装置および観察方法を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】第１実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。
【図２】第１実施形態のＯＣＴ装置における輪帯マスク２２について説明する図である。
【図３】第１実施形態のＯＣＴ装置における光路を説明する図である。
【図４】第１実施形態のＯＣＴ装置におけるアパーチャー１３について説明する図である。
【図５】第２実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。
【図６】第２実施形態のＯＣＴ装置を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の第１実施形態のＯＣＴ装置を説明する。
【００１９】
図１は、第１実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。図１に示すとおりＯＣＴ装置には、光源１、コリメートレンズ２、ビームスプリッタ３および４、ビームエキスパンダ２１、全反射ミラー７および８、輪帯マスク２２、対物レンズ９および１０、サンプル１１、サンプルステージ１２、アパーチャー１３、分散補正用光学部材１４、シリンドリカルレンズ１５、スペクトル検出器１６、制御装置１７、演算装置１８等が配置される。制御装置１７は、光源１、対物レンズ９、サンプルステージ１２、スペクトル検出器１６、輪帯マスク２２の各部を制御するとともに、スペクトル検出器１６により取得したスペクトル信号を演算装置１８に送出する。
【００２０】
サンプル１１には、例えば、不図示の容器等に被観察物である培養細胞などが培養されている。なお、上述した容器としては、シャーレ、フラスコ、ウェルプレート、マイクロプレートなど、様々なものが使用できる。また、容器の代わりにスライドガラスを使用することもできる。
【００２１】
また、サンプル１１は、サンプルステージ１２上に設置される。サンプルステージ１２は、対物レンズ９および１０の光軸方向に垂直な面（ｘｙ面）内に移動可能であり、ＯＣＴ装置による検出時にｘｙ方向への走査を行う（詳細は後述する）。
【００２２】
光源１は、時間コヒーレントの短い光を同時に出射する白色光源であり、例えば、スーパールミネッセンスダイオード（ＳＬＤ）、チタンサファイアレーザ、白色ＬＥＤなどが適用される。
【００２３】
光源１から射出した照明光Ｌ０は、コリメートレンズ２により所定のビーム径にコリメートされ、ビームスプリッタ３へ入射する。ビームスプリッタ３へ入射した照明光Ｌ０は、分散補正用光学部材１４の側へ向かう参照光Ｌｒと、サンプル１１の側へ向かう測定光Ｌｍとに分岐される。
【００２４】
参照光Ｌｒは、分散補正用光学部材１４、全反射ミラー８を介してビームスプリッタ４へ入射する。
【００２５】
ここで、分散補正用光学部材１４は、主にＯＣＴ装置における干渉計のバランスを保つための素子である。ここでいう干渉計のバランスとは、干渉計の、試料アームおよび参照アームの波長分散のバランスを指す。このバランスは、対物レンズなどの光学材料、および、サンプルに含まれる媒質（培養液など）に起因して崩れることがある。
【００２６】
そこで、分散補正用光学部材１４は、対物レンズなどの光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材と、サンプルに含まれる媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材とを備える。上述した光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材は、試料アームに配置される各光学部材に応じた補正量を有する。また、上述した媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材は、媒質の種類や量などに応じて補正量が可変な部材であることが好ましい。一例としては、光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材としては、ガラスブロックなどが用いられる。また、媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材としては、ＡＯＰＤＦ（Acousto-Optic programmable dispersive filter）や挿入変化可能なプリズム対などが用いられる。また、補正量や補正内容を計算処理によって補正可能な場合は、分散補正用光学部材１４を演算処理で代用しても良い。
【００２７】
参照光Ｌｒは、このような分散補正用光学部材１４によって、試料アームとバランスの取れた分散を持つように調整される。なお、分散補正用光学部材１４を経た参照光Ｌｒを、以下では参照光Ｌｒ’と称する。
【００２８】
一方、測定光Ｌｍは、ビームエキスパンダ２１へ入射して、所定のビーム径にコリメートされる。なお、光源１から射出された光のビーム径が十分に広い場合には、ビームエキスパンダ２１を用いなくても良い。そして、全反射ミラー７を経た測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２に導光される。測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２によって環状に形成され、環状に形成された測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９によってサンプル１１に照射される。なお、この環状の照明は、サンプル１１に対して測定光を斜入射する（詳細は後述する）。
【００２９】
ここで、輪帯マスク２２とは、対物レンズ９の瞳位置（サンプル１１と反対側の瞳位置）に配置され、ビームスプリッタ３から導光され、ビームエキスパンダ２１によりビーム径が変換された測定光Ｌｍの一部を遮光する。なお、サンプル１１に対して幅を持つ光束を斜入射可能に形成する素子であれば、他の部材を用いて良い。例えば、凸型のアキシコンレンズと凹型のアキシコンレンズとを組み合わせたズームレンズなどを用いても良い。輪帯マスク２２は、図２に示すように、環状の開口を有するマスクであり、その輪帯直径はｄである。開口の帯幅と、輪帯マスク２２から対物レンズ９の瞳位置までの距離との兼ね合いにより、対物レンズ９の瞳位置に帯幅ρの輪帯パターンが形成される。このとき、焦点深度について次式の関係が成り立つ。
【００３０】
焦点深度＝２ρｆ／Ｄ〜ρ／ＮＡ ・・・（式１）
式１において、ｆは対物レンズ９の焦点距離を示し、ＮＡは対物レンズの有効ＮＡを示す。さらに、輪帯マスク２２は、制御装置１７による制御に応じて、輪帯直径Ｄ、および、開口の帯の幅ρを変更可能である（詳細は後述する）。
【００３１】
輪帯マスク２２により環状に形成された測定光（以下、測定光Ｌｍ’と称する）は、対物レンズ９に導光される。
【００３２】
測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９により集光され、サンプル１１の深部の１点（集光点）に向かって照射される。なお、サンプル１１と対物レンズ９とのｚ方向の相対位置は、対物レンズ１１の焦点面がサンプル１１中の被観察物（培養細胞など）の存在領域に掛かるよう予め調整されている。
【００３３】
サンプル１１のうち測定光Ｌｍ’の照射領域（以下、「照射スポット」と称す。）では、様々な角度の回折光が発生する可能性がある。それらの回折光のうち、集光点へ向かった測定光Ｌｍ’と同じ方向へ進行する光は、アパーチャー１３を介して対物レンズ１０によって捉えられる。
【００３４】
なお、対物レンズ１０の仕様は、上述した対物レンズ９の仕様と同じであり、対物レンズ１０の配置先は、サンプル１１を挟み対物レンズ９に対向する位置である。また、対物レンズ１０の焦点面は対物レンズ９の焦点面に一致し、かつ対物レンズ１０の焦点は対物レンズ９の焦点に一致している。
【００３５】
さらに、対物レンズ９は、制御装置１７による制御または対物レンズ９が設置されたレボルバ等を配置することで開口数ＮＡが可変となる。
【００３６】
以下、照射スポットから対物レンズ１０の側へ向かった透過光のうち、対物レンズ１０によって捉えられた光を「測定光Ｌｍ”」と称す。この測定光Ｌｍ”は、対物レンズ１０を通過した後、ビームスプリッタ４へ入射する。
【００３７】
ここで、光源１から射出した照明光Ｌ０から、ビームスプリッタ４へ入射する測定光Ｌｍ”までの詳細を、図３を用いて説明する。
【００３８】
図３は、光源１から射出した照明光Ｌ０から、ビームスプリッタ４へ入射する測定光Ｌｍ”までの光路図である。図３に示すように、光源１から射出した照明光Ｌ０は、コリメートレンズ２により所定のビーム径にコリメートされる。そして、測定光Ｌｍは、ビームエキスパンダ２１によって所定のビーム径に変換される。さらに、全反射ミラー７を経た測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２に導光される。測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２によって環状に形成され、環状に形成された測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９によってサンプル１１に照射される。このとき、測定光Ｌｍ’は、サンプル１１に対して斜入射される。サンプル１１においては、サンプル１１の被観察物の内容に応じて、回折光が生じる。この回折光のうち、サンプル１１を透過する成分を、対物レンズ１０によりとらえる。ただし、この際に、アパーチャー１３は、透過光の一部（０次の回折光成分）を遮断する。アパーチャー１３は、図３に示すように、サンプル１２と対物レンズ１０との間に配置され、サンプル１２を透過した測定光のうち、サンプル１２による散乱成分を主に取り出すための絞りである。
【００３９】
図４に、アパーチャー１３近傍の拡大図を示す。図４に示すように、アパーチャー１３は、所定の口径を有し、サンプル１１を透過した回折光のうち、中央近傍の回折光（図３中斜線部分）のみを透過し、それ以外の光を遮断する。
【００４０】
そして、ビームスプリッタ４に入射した測定光Ｌｍ”は、参照アーム側からビームスプリッタ４へ入射した参照光Ｌｒ’と光路を合成され、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かう。なお、合成された参照光Ｌｒ’と測定光Ｌｍ”とを纏めて「合成光」または「干渉光」と称す。シリンドリカルレンズ１５の側へ向かった干渉光は、シリンドリカルレンズ１５によってスペクトル検出器１６の入射スリットに導光される。
【００４１】
スペクトル検出器１６には、図１に示すように、干渉光の集光点にスリット開口を配したスリット板１６ａと、スリット板１６ａを通過した干渉光を平行光に変換するコリメートミラー１６ｂと、平行光となった干渉光を複数の波長成分に分離する反射型回折格子１６ｃと、それらの波長成分を互いにずれた位置へ集光させる集光ミラー１６ｄと、互いにずれた位置に集光する各波長成分の強度を個別に検出するラインセンサ１６ｅとが備えられる。この構成により、スペクトル検出器１６は、干渉光の波長成分毎の強度信号（すなわちスペクトル信号）を生成する。このスペクトル信号は、制御装置１７へ送出される。
【００４２】
ここで、前述したサンプルステージ１２は、制御装置１７の制御により、サンプル１１をｘｙ方向へ変位させることができる。よって、サンプルステージ１２が駆動されると、サンプル１１上の照射スポットがｘｙ方向に移動する。
【００４３】
よって、制御装置１７は、サンプルステージ１２を駆動することにより照射スポットでサンプル１１上をｘｙ方向にかけて二次元走査し、照射スポットが各ｘｙ位置にあるときにラインセンサ１６ｅを駆動してスペクトル信号を取り込むことにより、各ｘｙ位置のスペクトル信号を取得する。これらのスペクトル信号は、演算装置１８へ送出される。
【００４４】
演算装置１８は、各ｘｙ位置のスペクトル信号を個別にフーリエ変換することにより、各ｘｙ位置のｚ方向の構造情報を取得する。これによって、ｘｙｚ方向の三次元画像情報が既知となる（詳細は後述する）。演算装置１８は、既知となったサンプル１１における構造情報を不図示のモニタに表示する。
【００４５】
制御装置１７は、上述したＯＣＴ装置の対物レンズ９を保持するレボルバおよび輪帯マスク２２を、サンプル１１に応じて、連動して制御することにより、ＯＣＴにおけるｚ分解能を制御する。このような制御は、サンプル１１に含まれる被観察物のサイズや形状に応じて、最適な分解能で検出を行うためである。
【００４６】
本実施形態でのｚ分解能は、コヒーレンス長だけでなく、対物レンズ９の開口数ＮＡににも依存する。深さ方向（ｚ方向）に距離Ｌ１だけ離れて位置する２つの構造が、干渉計測を行うと（１−ｃｏｓθ）倍に縮まって計測されることが知られている。
【００４７】
他方、通常の反射型の構成のＯＣＴにおいて、ｚ方向の距離がＬ１だけ離れて存在する構造の光路長差は、２＊Ｌ１となることが知られている。そのため、上述した透過型、かつ、斜入射による照明場合のｚ分解能は、通常の反射型の構成のＯＣＴにおけるｚ分解能の２／（１−ｃｏｓθ）倍となる。
【００４８】
また、対物レンズ９の開口数ＮＡは次式で表すことができる。
【００４９】
ＮＡ＝ｓｉｎθ＝ｄ／２ｆ ・・・（式２）
式２において、ｄは、対物レンズ９の有効瞳系を示し、ｆは、対物レンズ９の焦点距離を示す。
【００５０】
上記式２により、対物レンズ９の開口数ＮＡは対物レンズの有効瞳系ｄおよび焦点距離ｆに依存することがわかる。また、式１より、対物レンズ９の開口数ＮＡを制御することができれば、焦点深度も制御することがわかる。焦点深度とｚ分解能はトレードオフの関係のため、焦点深度を浅くすれば、ｚ分解能を高くすることができる。
ここで、開口数ＮＡは対物レンズ９に固有の値である。そのため、対物レンズ９自体の有効瞳径ｄおよび焦点距離ｆも固有の値である。有効瞳径を変えるには、上限をｄとして有効瞳径を絞りなどで小さく絞ることが考えられる。有効瞳径を大きくするほどｚ分解能を高くすることができる。焦点深度を深くとり、対物レンズ９の有効瞳径ｄをフルに生かすためには、同程度の直径を持つ絞りを用いればよい。
【００５１】
また、式１より輪帯マスク２２によって形成される輪体の帯幅もｚ分解能に寄与することがわかる。帯幅ρが狭いほど焦点深度が浅くｚ分解能が高くなる。そのため、輪帯マスク２２が瞳上に形成する輪帯の外直径の上限をｄとして輪帯の大きさを可変にすることでｚ分解能を制御することができる。
【００５２】
さらに、被観察物のサイズや形状に応じて、最適な分解能で検出を行うためには、被観察物に応じて、対物レンズ９の有効瞳系ｄと輪帯マスク２２の輪帯直径Ｄとを最適化すれば良い。なお、この制御によって、対物レンズ９の焦点深度も最適化することが可能である。
【００５３】
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態のＯＣＴ装置を説明する。
【００５４】
図５は、第２実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。図５において図１に示した要素と同じものには同一の符号を付した。図５に示すとおり本実施形態のＯＣＴ装置は、第１実施形態で説明した透過型のＯＣＴ装置と反射型のＯＣＴ装置との両方の構成を併せ持つＯＣＴ装置である。
【００５５】
図５に示すとおり本実施形態のＯＣＴ装置には、図１に示した各構成に加えて、フリッパーミラー５１、全反射ミラー５２および５３、分散補正用光学部材５４、平面ミラー（参照ミラー）５５が配置される。
【００５６】
フリッパーミラー５１は、コリメートレンズ２とビームスプリッタ３との間に配置され、コリメートレンズ２を透過した照明光Ｌ０を、ビームスプリッタ３と、全反射ミラー５２とのいずれかに導光する。全反射ミラー５２および５３は、フリッパーミラー５１により導光された照明光Ｌ０を、ビームスプリッタ４に導光する。
【００５７】
分散補正用光学部材５４は、反射型のＯＣＴ用の分散補正用光学部材であり、その構成は、第１実施形態で説明した分散補正用光学部材１４と同様である。また、平面ミラー（参照ミラー）５５は、反射型のＯＣＴ時に用いられるミラーであり、第２実施形態で説明した参照ミラー４１と同様のミラーである。なお、分散補正用光学部材５４および参照ミラー５５は、光路に対して挿脱可能である（詳細は後述する）。
【００５８】
なお、図５においては、制御装置１７および演算装置１８の図示、および、制御系の矢印の図示を省略した。制御装置１７は、光源１、対物レンズ９、サンプルステージ１２、スペクトル検出器１６、輪帯マスク２２の各部を制御するとともに、フリッパーミラー５１、分散補正用光学部材５４、参照ミラー５５の各部を連動して制御する。また、制御装置１７は、第１実施形態と同様に、スペクトル検出器１６により取得したスペクトル信号を演算装置１８に送出する。
【００５９】
ここで、透過型のＯＣＴ装置と反射型のＯＣＴ装置との特徴の違いについて説明する。図６Ａは、透過型のＯＣＴ装置により、被観察物（細胞Ｃ）を観察する際の例であり、図６Ｂは、反射型のＯＣＴ装置により、被観察物（細胞Ｃ）を観察する際の例である。図６Ａに示すように、透過型のＯＣＴ装置は、側壁（図６Ａ中の点線で囲った部分）の観察に適している。一方、反射型のＯＣＴ装置は、水平面方向（図６Ｂ中の点線で囲った部分）の観察に適している。
【００６０】
そこで、本実施形態のＯＣＴ装置は、透過型のＯＣＴ装置と反射型のＯＣＴ装置との両方の構成を併せ持つことにより、より被観察物に好適な検出を行う。
【００６１】
まず、透過型のＯＣＴについて説明する。制御装置１７は、図６中のＡ１の枠内の各部を用いて透過型のＯＣＴを実行する。制御装置１７は、フリッパーミラー５１をＯＦＦにすることにより、コリメートレンズ２を透過した照明光Ｌ０を、ビームスプリッタ３に導光する。このとき、制御装置１７は、分散補正用光学部材５４および参照ミラー５５を、光路から離脱した状態にする。ビームスプリッタ３に導光された照明光Ｌ０は、第１実施形態で説明したように、各部を経過し、スペクトル検出器１６に到達する。各部における処理は、第１実施形態と同様であるため説明を省略する。
【００６２】
次に、反射型のＯＣＴについて説明する。制御装置１７は、図６中のＡ２の枠内の各部を用いて反射型のＯＣＴを実行する。制御装置１７は、フリッパーミラー５１をＯＮにすることにより、コリメートレンズ２を透過した照明光Ｌ０を、全反射ミラー５２に導光する。このとき、制御装置１７は、分散補正用光学部材５４および参照ミラー５５を、光路に挿入した状態にする。
【００６３】
全反射ミラー５２に導光された照明光Ｌ０は、全反射ミラー５３を介してビームスプリッタ４に導光される。そして、光路に挿入された参照ミラー５５の側へ向かう参照光Ｌｒと、サンプル１１の側へ向かう測定光Ｌｍとに分岐される。
【００６４】
参照光Ｌｒは、分散補正用光学部材５４を介して参照ミラー５５へ正面から入射すると、参照ミラー５５を反射して光路を折り返し、分散補正用光学部材５４を介して再びビームスプリッタ４へ戻る。
【００６５】
一方、測定光Ｌｍは、（透過型のＯＣＴの場合と反対側から）対物レンズ１０へ入射すると、対物レンズ１０の集光作用を受け、サンプル１１の深部の１点（集光点）に向かって集光する。なお、サンプル１１と対物レンズ１０とのｚ方向の相対位置は、対物レンズ１０の焦点面がサンプル１１中の被観察物（培養細胞など）の存在領域に掛かるよう予め調整されている。また、このとき、制御装置１７は、アパーチャー１３を開放状態にする。
【００６６】
サンプル１１の照射スポットにおける反射光のうち、集光点へ向かった測定光Ｌｍの光路を逆向きに辿る光は、対物レンズ１０によって捉えられる。そして、対物レンズ１０によって捉えられた測定光Ｌｍ’は、測定光Ｌｍの光路を逆向きに辿り、ビームスプリッタ４へ入射する。
【００６７】
ビームスプリッタ４へ入射した測定光Ｌｍ’は、ビームスプリッタ４へ戻った参照光Ｌｒ’と光路を合成させ、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かう。なお、ここで、参照光の単独光路の光路長（参照アームの光路長）と、測定光の単独光路の光路長（測定アームの光路長）とは、分散補正用光学部材５４の作用により一致している。
【００６８】
そして、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かった干渉光は、シリンドリカルレンズ１５によってスペクトル検出器１６の入射スリットに導光される。スペクトル検出器１６の構成および作用は、第１実施形態と同様である。
【００６９】
制御装置１７は、第１実施形態で説明した原理に従って、上述したＯＣＴ装置の対物レンズ９、輪帯マスク２２、フリッパーミラー５１、分散補正用光学部材５４、参照ミラー５５等の各部を、サンプル１１に応じて、連動して制御することにより、ＯＣＴにおけるｚ分解能を制御する。このような制御により、サンプル１１に含まれる被観察物に対して、様々な方向からの測定光を照射することが可能になり、三次元構造をむらなく捉えることが可能になる。
【００７０】
以上説明したように、本実施形態によれば、透過型と反射型の両方で干渉光の強度を検出可能なＯＣＴ装置において、検出手段による検出の内容に応じて、対物レンズの開口数の制御と、透過型と反射型の切り換え制御とを行う。したがって、より細やかに被観察物に応じた検出を可能とすることができる。特に、本実施形態によれば、透過型と反射型とを適宜切り換えてＯＣＴを行うことにより、被観察物の全方位的な情報を得ることが期待できる。
【００７１】
［第２実施形態の補足］
なお、第２実施形態のＯＣＴ装置において、反射型ＯＣＴ次に対物レンズとして機能する対物レンズ１０を、対物レンズ９と同様に、開口数ＮＡが可変な対物レンズとすることにより、反射型ＯＣＴにおいてもｚ分解能を可変な構成としても良い。また、ｚ分解能が可変な反射型ＯＣＴ装置の構成と、分解能が不変の、通常の透過型ＯＣＴ装置の構成との両方を併せ持つＯＣＴ装置も、本発明の具体的態様として有効である。
【００７２】
［実施形態の変形例］
上述した第１実施形態および第２実施形態のＯＣＴ装置は、サンプルステージ１２を移動することにより、サンプル１１の側を変位させる方法（ステージスキャン型）を採用したが、照射スポットの側を変位させる方法（ビームスキャン型）を採用してもよい。また、２つの方法を選択的に利用しても良いし、組み合わせて利用しても良い。
【００７３】
また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置は、光源（白色光源）を使用して白色の干渉光を分光検出する方法（フーリエドメイン型）を採用したが、光源波長を走査して各波長の干渉光を時分割で検出する方法（波長スキャン型）を採用してもよい。
【００７４】
因みに、フーリエドメイン型を採用した場合は、分光検出を行う必要が無いので、スペクトル検出器１８の代わりに撮像素子を使用することで、サンプル１１上のｘｙ方向各位置の干渉光強度を一括に検出してもよい。
【００７５】
また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置は、光源（白色光源）を使用して干渉光を分光検出する方法（フーリエドメイン型）を採用したが、光源（白色光源）を使用し、かつ、測定光と参照光との光路長差を走査して白色の干渉光を走査位置毎に検出する方法（タイムドメイン型）を採用してもよい。
【００７６】
因みに、タイムドメイン型を採用した場合は、分光検出を行う必要が無いので、スペクトル検出器１８の代わりに撮像素子を使用することで、サンプル１１上のｘｙ方向各位置の干渉光強度を一括に検出してもよい。
【００７７】
また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置において、偏光成分を利用しても良い。例えば、検出手段へ向かう参照光の偏光方向と、被観察物へ向かう測定光の偏光方向との間に差異を設け、検出手段へ向かう測定光から、検出手段へ向かう参照光とは偏光方向の異なる成分を除去することにより、偏光成分を利用した検出を行うことができる。
【符号の説明】
【００７８】
１…光源、３，４ビームスプリッタ、９，１０…対物レンズ、１１…サンプル、１３…アパーチャー、１４，５４…分散補正用光学部材、１６…スペクトル検出器、１７…制御装置、１８…演算装置、２２…輪帯マスク、４２…光スキャナ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置および観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非破壊断層計測技術の１つに光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）がある（非特許文献１等を参照）。ＯＣＴは、波長幅の広い光をプローブとして用いることにより、被観察物の屈折率分布、分光情報、偏光情報等を計測することができる。そして、被観察物の３次元構造を、非染色・非侵襲で観察することができることが挙げられる。よって、ＯＣＴは、生体内細胞などに好適である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】E.A. Swanson, J.A. Izatt, M.R. Michael, D. Huang, C.P. Lin, J.S. Shuman, C.A. Puliafito, J.G. Fujimoto, 18 (21) 1864-1866, Optics Letters (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、培養細胞や細胞内器官などにおいて、ＯＣＴを用い、非染色・非侵襲で被観察物の３次元構造を観察したいという要求もある。しかし、上述した培養細胞や細胞内器官などの被観察物は、サイズや形状が様々であり、また、ＯＣＴ装置の分解能や特徴によっては、３次元構造をむらなく検出することができない場合が多い。
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、被観察物に応じた好適な検出が可能な観察装置および観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の観察装置の一態様は、入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐する第１の分岐手段と、被観察物に対して前記第１の測定光を斜入射照明する第１の照明光学系と、斜入射照明された前記被観察物からの透過光を観察する第１の観察光学系と、前記第１の測定光を基準とする前記第１の参照光を形成する第１の参照光学系と、前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光とを合成する第１の合成手段と、前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光との第１の干渉光を検出する第１の検出手段と、前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する第１の位置情報取得手段とを備えた透過型観察装置と、入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐する第２の分岐手段と、前記被観察物に前記第２の測定光を照明する第２の照明光学系と、照明された前記被観察物からの反射光を観察する第２の観察光学系と、前記第２の測定光を基準とする前記第２の参照光を形成する第２の参照光学系と、前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光とを合成する第２の合成手段と、前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光との第２の干渉光を検出する第２の検出手段と、前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する第２の位置情報取得手段とを備えた反射型観察装置とを備えるものである。
【０００７】
なお、透過型観察装置と反射型観察装置とを切り替える切替手段とを備えても良い。
【０００８】
また、前記第１の検出手段と前記第２の検出手段とが同一であっても良い。
【０００９】
また、前記第１の照明光学系は、前記被観察物に対して斜入射する斜入射手段を備えても良い。
【００１０】
また、前記第１の照明光学系、前記第２の照明光学系、前記第１の観察光学系、前記第２の観察光学系の少なくとも一つの光軸に直交した方向に前記第１の測定光または前記第２の測定光を走査する走査手段を備えても良い。
【００１１】
また、前記第１の検出手段または前記第２の検出手段の少なくとも一つは、前記第１の干渉光または前記第２の干渉光を分光して検出するスペクトル検出器であっても良い。
【００１２】
また、前記第１の参照光中または前記第１の測定光中に配置された１／２波長板または１／４波長板と、前記第１の分岐手段に所定の偏光の光を入射するための第１の偏光素子と、前記所定の偏光に基づいて決定する偏光方向を含む前記第１の干渉光の一部を透過する第２の偏光素子と、前記第１の偏光素子が透過させる偏光方向と前記第２の偏光素子が透過させる偏光方向とを同時に変化させる第１の制御手段とを備えても良い。
【００１３】
また、前記第２の参照光中または前記第２の測定光中に配置された１／２波長板または１／４波長板と、前記第２の分岐手段に所定の偏光の光を入射するための第３の偏光素子と、前記所定の偏光に基づいて決定する偏光方向を含む前記第２の干渉光の一部を透過する第４の偏光素子と、前記第３の偏光素子が透過させる偏光方向と前記第４の偏光素子が透過させる偏光方向とを同時に変化させる第２の制御手段とを備えても良い。
【００１４】
また、前記第２の偏光素子と前記第４の偏光素子とが同位置であっても良い。
【００１５】
本発明の観察方法の一態様は、入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐し、被観察物に対して前記第１の測定光を斜入射照明し、斜入射照明された前記被観察物からの透過光を観察し、前記第１の測定光を基準とする前記第１の参照光を形成し、前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光とを合成した干渉光を検出し、前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する透過型観察方法と、入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐し、記被観察物に前記第２の測定光を照明し、照明された前記被観察物からの反射光を観察し、前記第２の測定光を基準とする前期第２の参照光を形成し、前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光とを合成した干渉光を検出し、前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する反射型観察方法とを有し、前記透過型観察方法と前記反射型観察方法とを切り替えて観察することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、被観察物に応じた好適な検出が可能な観察装置および観察方法を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】第１実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。
【図２】第１実施形態のＯＣＴ装置における輪帯マスク２２について説明する図である。
【図３】第１実施形態のＯＣＴ装置における光路を説明する図である。
【図４】第１実施形態のＯＣＴ装置におけるアパーチャー１３について説明する図である。
【図５】第２実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。
【図６】第２実施形態のＯＣＴ装置を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の第１実施形態のＯＣＴ装置を説明する。
【００１９】
図１は、第１実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。図１に示すとおりＯＣＴ装置には、光源１、コリメートレンズ２、ビームスプリッタ３および４、ビームエキスパンダ２１、全反射ミラー７および８、輪帯マスク２２、対物レンズ９および１０、サンプル１１、サンプルステージ１２、アパーチャー１３、分散補正用光学部材１４、シリンドリカルレンズ１５、スペクトル検出器１６、制御装置１７、演算装置１８等が配置される。制御装置１７は、光源１、対物レンズ９、サンプルステージ１２、スペクトル検出器１６、輪帯マスク２２の各部を制御するとともに、スペクトル検出器１６により取得したスペクトル信号を演算装置１８に送出する。
【００２０】
サンプル１１には、例えば、不図示の容器等に被観察物である培養細胞などが培養されている。なお、上述した容器としては、シャーレ、フラスコ、ウェルプレート、マイクロプレートなど、様々なものが使用できる。また、容器の代わりにスライドガラスを使用することもできる。
【００２１】
また、サンプル１１は、サンプルステージ１２上に設置される。サンプルステージ１２は、対物レンズ９および１０の光軸方向に垂直な面（ｘｙ面）内に移動可能であり、ＯＣＴ装置による検出時にｘｙ方向への走査を行う（詳細は後述する）。
【００２２】
光源１は、時間コヒーレントの短い光を同時に出射する白色光源であり、例えば、スーパールミネッセンスダイオード（ＳＬＤ）、チタンサファイアレーザ、白色ＬＥＤなどが適用される。
【００２３】
光源１から射出した照明光Ｌ０は、コリメートレンズ２により所定のビーム径にコリメートされ、ビームスプリッタ３へ入射する。ビームスプリッタ３へ入射した照明光Ｌ０は、分散補正用光学部材１４の側へ向かう参照光Ｌｒと、サンプル１１の側へ向かう測定光Ｌｍとに分岐される。
【００２４】
参照光Ｌｒは、分散補正用光学部材１４、全反射ミラー８を介してビームスプリッタ４へ入射する。
【００２５】
ここで、分散補正用光学部材１４は、主にＯＣＴ装置における干渉計のバランスを保つための素子である。ここでいう干渉計のバランスとは、干渉計の、試料アームおよび参照アームの波長分散のバランスを指す。このバランスは、対物レンズなどの光学材料、および、サンプルに含まれる媒質（培養液など）に起因して崩れることがある。
【００２６】
そこで、分散補正用光学部材１４は、対物レンズなどの光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材と、サンプルに含まれる媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材とを備える。上述した光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材は、試料アームに配置される各光学部材に応じた補正量を有する。また、上述した媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材は、媒質の種類や量などに応じて補正量が可変な部材であることが好ましい。一例としては、光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材としては、ガラスブロックなどが用いられる。また、媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材としては、ＡＯＰＤＦ（Acousto-Optic programmable dispersive filter）や挿入変化可能なプリズム対などが用いられる。また、補正量や補正内容を計算処理によって補正可能な場合は、分散補正用光学部材１４を演算処理で代用しても良い。
【００２７】
参照光Ｌｒは、このような分散補正用光学部材１４によって、試料アームとバランスの取れた分散を持つように調整される。なお、分散補正用光学部材１４を経た参照光Ｌｒを、以下では参照光Ｌｒ’と称する。
【００２８】
一方、測定光Ｌｍは、ビームエキスパンダ２１へ入射して、所定のビーム径にコリメートされる。なお、光源１から射出された光のビーム径が十分に広い場合には、ビームエキスパンダ２１を用いなくても良い。そして、全反射ミラー７を経た測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２に導光される。測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２によって環状に形成され、環状に形成された測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９によってサンプル１１に照射される。なお、この環状の照明は、サンプル１１に対して測定光を斜入射する（詳細は後述する）。
【００２９】
ここで、輪帯マスク２２とは、対物レンズ９の瞳位置（サンプル１１と反対側の瞳位置）に配置され、ビームスプリッタ３から導光され、ビームエキスパンダ２１によりビーム径が変換された測定光Ｌｍの一部を遮光する。なお、サンプル１１に対して幅を持つ光束を斜入射可能に形成する素子であれば、他の部材を用いて良い。例えば、凸型のアキシコンレンズと凹型のアキシコンレンズとを組み合わせたズームレンズなどを用いても良い。輪帯マスク２２は、図２に示すように、環状の開口を有するマスクであり、その輪帯直径はｄである。開口の帯幅と、輪帯マスク２２から対物レンズ９の瞳位置までの距離との兼ね合いにより、対物レンズ９の瞳位置に帯幅ρの輪帯パターンが形成される。このとき、焦点深度について次式の関係が成り立つ。
【００３０】
焦点深度＝２ρｆ／Ｄ〜ρ／ＮＡ ・・・（式１）
式１において、ｆは対物レンズ９の焦点距離を示し、ＮＡは対物レンズの有効ＮＡを示す。さらに、輪帯マスク２２は、制御装置１７による制御に応じて、輪帯直径Ｄ、および、開口の帯の幅ρを変更可能である（詳細は後述する）。
【００３１】
輪帯マスク２２により環状に形成された測定光（以下、測定光Ｌｍ’と称する）は、対物レンズ９に導光される。
【００３２】
測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９により集光され、サンプル１１の深部の１点（集光点）に向かって照射される。なお、サンプル１１と対物レンズ９とのｚ方向の相対位置は、対物レンズ１１の焦点面がサンプル１１中の被観察物（培養細胞など）の存在領域に掛かるよう予め調整されている。
【００３３】
サンプル１１のうち測定光Ｌｍ’の照射領域（以下、「照射スポット」と称す。）では、様々な角度の回折光が発生する可能性がある。それらの回折光のうち、集光点へ向かった測定光Ｌｍ’と同じ方向へ進行する光は、アパーチャー１３を介して対物レンズ１０によって捉えられる。
【００３４】
なお、対物レンズ１０の仕様は、上述した対物レンズ９の仕様と同じであり、対物レンズ１０の配置先は、サンプル１１を挟み対物レンズ９に対向する位置である。また、対物レンズ１０の焦点面は対物レンズ９の焦点面に一致し、かつ対物レンズ１０の焦点は対物レンズ９の焦点に一致している。
【００３５】
さらに、対物レンズ９は、制御装置１７による制御または対物レンズ９が設置されたレボルバ等を配置することで開口数ＮＡが可変となる。
【００３６】
以下、照射スポットから対物レンズ１０の側へ向かった透過光のうち、対物レンズ１０によって捉えられた光を「測定光Ｌｍ”」と称す。この測定光Ｌｍ”は、対物レンズ１０を通過した後、ビームスプリッタ４へ入射する。
【００３７】
ここで、光源１から射出した照明光Ｌ０から、ビームスプリッタ４へ入射する測定光Ｌｍ”までの詳細を、図３を用いて説明する。
【００３８】
図３は、光源１から射出した照明光Ｌ０から、ビームスプリッタ４へ入射する測定光Ｌｍ”までの光路図である。図３に示すように、光源１から射出した照明光Ｌ０は、コリメートレンズ２により所定のビーム径にコリメートされる。そして、測定光Ｌｍは、ビームエキスパンダ２１によって所定のビーム径に変換される。さらに、全反射ミラー７を経た測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２に導光される。測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２によって環状に形成され、環状に形成された測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９によってサンプル１１に照射される。このとき、測定光Ｌｍ’は、サンプル１１に対して斜入射される。サンプル１１においては、サンプル１１の被観察物の内容に応じて、回折光が生じる。この回折光のうち、サンプル１１を透過する成分を、対物レンズ１０によりとらえる。ただし、この際に、アパーチャー１３は、透過光の一部（０次の回折光成分）を遮断する。アパーチャー１３は、図３に示すように、サンプル１２と対物レンズ１０との間に配置され、サンプル１２を透過した測定光のうち、サンプル１２による散乱成分を主に取り出すための絞りである。
【００３９】
図４に、アパーチャー１３近傍の拡大図を示す。図４に示すように、アパーチャー１３は、所定の口径を有し、サンプル１１を透過した回折光のうち、中央近傍の回折光（図３中斜線部分）のみを透過し、それ以外の光を遮断する。
【００４０】
そして、ビームスプリッタ４に入射した測定光Ｌｍ”は、参照アーム側からビームスプリッタ４へ入射した参照光Ｌｒ’と光路を合成され、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かう。なお、合成された参照光Ｌｒ’と測定光Ｌｍ”とを纏めて「合成光」または「干渉光」と称す。シリンドリカルレンズ１５の側へ向かった干渉光は、シリンドリカルレンズ１５によってスペクトル検出器１６の入射スリットに導光される。
【００４１】
スペクトル検出器１６には、図１に示すように、干渉光の集光点にスリット開口を配したスリット板１６ａと、スリット板１６ａを通過した干渉光を平行光に変換するコリメートミラー１６ｂと、平行光となった干渉光を複数の波長成分に分離する反射型回折格子１６ｃと、それらの波長成分を互いにずれた位置へ集光させる集光ミラー１６ｄと、互いにずれた位置に集光する各波長成分の強度を個別に検出するラインセンサ１６ｅとが備えられる。この構成により、スペクトル検出器１６は、干渉光の波長成分毎の強度信号（すなわちスペクトル信号）を生成する。このスペクトル信号は、制御装置１７へ送出される。
【００４２】
ここで、前述したサンプルステージ１２は、制御装置１７の制御により、サンプル１１をｘｙ方向へ変位させることができる。よって、サンプルステージ１２が駆動されると、サンプル１１上の照射スポットがｘｙ方向に移動する。
【００４３】
よって、制御装置１７は、サンプルステージ１２を駆動することにより照射スポットでサンプル１１上をｘｙ方向にかけて二次元走査し、照射スポットが各ｘｙ位置にあるときにラインセンサ１６ｅを駆動してスペクトル信号を取り込むことにより、各ｘｙ位置のスペクトル信号を取得する。これらのスペクトル信号は、演算装置１８へ送出される。
【００４４】
演算装置１８は、各ｘｙ位置のスペクトル信号を個別にフーリエ変換することにより、各ｘｙ位置のｚ方向の構造情報を取得する。これによって、ｘｙｚ方向の三次元画像情報が既知となる（詳細は後述する）。演算装置１８は、既知となったサンプル１１における構造情報を不図示のモニタに表示する。
【００４５】
制御装置１７は、上述したＯＣＴ装置の対物レンズ９を保持するレボルバおよび輪帯マスク２２を、サンプル１１に応じて、連動して制御することにより、ＯＣＴにおけるｚ分解能を制御する。このような制御は、サンプル１１に含まれる被観察物のサイズや形状に応じて、最適な分解能で検出を行うためである。
【００４６】
本実施形態でのｚ分解能は、コヒーレンス長だけでなく、対物レンズ９の開口数ＮＡににも依存する。深さ方向（ｚ方向）に距離Ｌ１だけ離れて位置する２つの構造が、干渉計測を行うと（１−ｃｏｓθ）倍に縮まって計測されることが知られている。
【００４７】
他方、通常の反射型の構成のＯＣＴにおいて、ｚ方向の距離がＬ１だけ離れて存在する構造の光路長差は、２＊Ｌ１となることが知られている。そのため、上述した透過型、かつ、斜入射による照明場合のｚ分解能は、通常の反射型の構成のＯＣＴにおけるｚ分解能の２／（１−ｃｏｓθ）倍となる。
【００４８】
また、対物レンズ９の開口数ＮＡは次式で表すことができる。
【００４９】
ＮＡ＝ｓｉｎθ＝ｄ／２ｆ ・・・（式２）
式２において、ｄは、対物レンズ９の有効瞳系を示し、ｆは、対物レンズ９の焦点距離を示す。
【００５０】
上記式２により、対物レンズ９の開口数ＮＡは対物レンズの有効瞳系ｄおよび焦点距離ｆに依存することがわかる。また、式１より、対物レンズ９の開口数ＮＡを制御することができれば、焦点深度も制御することがわかる。焦点深度とｚ分解能はトレードオフの関係のため、焦点深度を浅くすれば、ｚ分解能を高くすることができる。
ここで、開口数ＮＡは対物レンズ９に固有の値である。そのため、対物レンズ９自体の有効瞳径ｄおよび焦点距離ｆも固有の値である。有効瞳径を変えるには、上限をｄとして有効瞳径を絞りなどで小さく絞ることが考えられる。有効瞳径を大きくするほどｚ分解能を高くすることができる。焦点深度を深くとり、対物レンズ９の有効瞳径ｄをフルに生かすためには、同程度の直径を持つ絞りを用いればよい。
【００５１】
また、式１より輪帯マスク２２によって形成される輪体の帯幅もｚ分解能に寄与することがわかる。帯幅ρが狭いほど焦点深度が浅くｚ分解能が高くなる。そのため、輪帯マスク２２が瞳上に形成する輪帯の外直径の上限をｄとして輪帯の大きさを可変にすることでｚ分解能を制御することができる。
【００５２】
さらに、被観察物のサイズや形状に応じて、最適な分解能で検出を行うためには、被観察物に応じて、対物レンズ９の有効瞳系ｄと輪帯マスク２２の輪帯直径Ｄとを最適化すれば良い。なお、この制御によって、対物レンズ９の焦点深度も最適化することが可能である。
【００５３】
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態のＯＣＴ装置を説明する。
【００５４】
図５は、第２実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。図５において図１に示した要素と同じものには同一の符号を付した。図５に示すとおり本実施形態のＯＣＴ装置は、第１実施形態で説明した透過型のＯＣＴ装置と反射型のＯＣＴ装置との両方の構成を併せ持つＯＣＴ装置である。
【００５５】
図５に示すとおり本実施形態のＯＣＴ装置には、図１に示した各構成に加えて、フリッパーミラー５１、全反射ミラー５２および５３、分散補正用光学部材５４、平面ミラー（参照ミラー）５５が配置される。
【００５６】
フリッパーミラー５１は、コリメートレンズ２とビームスプリッタ３との間に配置され、コリメートレンズ２を透過した照明光Ｌ０を、ビームスプリッタ３と、全反射ミラー５２とのいずれかに導光する。全反射ミラー５２および５３は、フリッパーミラー５１により導光された照明光Ｌ０を、ビームスプリッタ４に導光する。
【００５７】
分散補正用光学部材５４は、反射型のＯＣＴ用の分散補正用光学部材であり、その構成は、第１実施形態で説明した分散補正用光学部材１４と同様である。また、平面ミラー（参照ミラー）５５は、反射型のＯＣＴ時に用いられるミラーであり、第２実施形態で説明した参照ミラー４１と同様のミラーである。なお、分散補正用光学部材５４および参照ミラー５５は、光路に対して挿脱可能である（詳細は後述する）。
【００５８】
なお、図５においては、制御装置１７および演算装置１８の図示、および、制御系の矢印の図示を省略した。制御装置１７は、光源１、対物レンズ９、サンプルステージ１２、スペクトル検出器１６、輪帯マスク２２の各部を制御するとともに、フリッパーミラー５１、分散補正用光学部材５４、参照ミラー５５の各部を連動して制御する。また、制御装置１７は、第１実施形態と同様に、スペクトル検出器１６により取得したスペクトル信号を演算装置１８に送出する。
【００５９】
ここで、透過型のＯＣＴ装置と反射型のＯＣＴ装置との特徴の違いについて説明する。図６Ａは、透過型のＯＣＴ装置により、被観察物（細胞Ｃ）を観察する際の例であり、図６Ｂは、反射型のＯＣＴ装置により、被観察物（細胞Ｃ）を観察する際の例である。図６Ａに示すように、透過型のＯＣＴ装置は、側壁（図６Ａ中の点線で囲った部分）の観察に適している。一方、反射型のＯＣＴ装置は、水平面方向（図６Ｂ中の点線で囲った部分）の観察に適している。
【００６０】
そこで、本実施形態のＯＣＴ装置は、透過型のＯＣＴ装置と反射型のＯＣＴ装置との両方の構成を併せ持つことにより、より被観察物に好適な検出を行う。
【００６１】
まず、透過型のＯＣＴについて説明する。制御装置１７は、図６中のＡ１の枠内の各部を用いて透過型のＯＣＴを実行する。制御装置１７は、フリッパーミラー５１をＯＦＦにすることにより、コリメートレンズ２を透過した照明光Ｌ０を、ビームスプリッタ３に導光する。このとき、制御装置１７は、分散補正用光学部材５４および参照ミラー５５を、光路から離脱した状態にする。ビームスプリッタ３に導光された照明光Ｌ０は、第１実施形態で説明したように、各部を経過し、スペクトル検出器１６に到達する。各部における処理は、第１実施形態と同様であるため説明を省略する。
【００６２】
次に、反射型のＯＣＴについて説明する。制御装置１７は、図６中のＡ２の枠内の各部を用いて反射型のＯＣＴを実行する。制御装置１７は、フリッパーミラー５１をＯＮにすることにより、コリメートレンズ２を透過した照明光Ｌ０を、全反射ミラー５２に導光する。このとき、制御装置１７は、分散補正用光学部材５４および参照ミラー５５を、光路に挿入した状態にする。
【００６３】
全反射ミラー５２に導光された照明光Ｌ０は、全反射ミラー５３を介してビームスプリッタ４に導光される。そして、光路に挿入された参照ミラー５５の側へ向かう参照光Ｌｒと、サンプル１１の側へ向かう測定光Ｌｍとに分岐される。
【００６４】
参照光Ｌｒは、分散補正用光学部材５４を介して参照ミラー５５へ正面から入射すると、参照ミラー５５を反射して光路を折り返し、分散補正用光学部材５４を介して再びビームスプリッタ４へ戻る。
【００６５】
一方、測定光Ｌｍは、（透過型のＯＣＴの場合と反対側から）対物レンズ１０へ入射すると、対物レンズ１０の集光作用を受け、サンプル１１の深部の１点（集光点）に向かって集光する。なお、サンプル１１と対物レンズ１０とのｚ方向の相対位置は、対物レンズ１０の焦点面がサンプル１１中の被観察物（培養細胞など）の存在領域に掛かるよう予め調整されている。また、このとき、制御装置１７は、アパーチャー１３を開放状態にする。
【００６６】
サンプル１１の照射スポットにおける反射光のうち、集光点へ向かった測定光Ｌｍの光路を逆向きに辿る光は、対物レンズ１０によって捉えられる。そして、対物レンズ１０によって捉えられた測定光Ｌｍ’は、測定光Ｌｍの光路を逆向きに辿り、ビームスプリッタ４へ入射する。
【００６７】
ビームスプリッタ４へ入射した測定光Ｌｍ’は、ビームスプリッタ４へ戻った参照光Ｌｒ’と光路を合成させ、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かう。なお、ここで、参照光の単独光路の光路長（参照アームの光路長）と、測定光の単独光路の光路長（測定アームの光路長）とは、分散補正用光学部材５４の作用により一致している。
【００６８】
そして、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かった干渉光は、シリンドリカルレンズ１５によってスペクトル検出器１６の入射スリットに導光される。スペクトル検出器１６の構成および作用は、第１実施形態と同様である。
【００６９】
制御装置１７は、第１実施形態で説明した原理に従って、上述したＯＣＴ装置の対物レンズ９、輪帯マスク２２、フリッパーミラー５１、分散補正用光学部材５４、参照ミラー５５等の各部を、サンプル１１に応じて、連動して制御することにより、ＯＣＴにおけるｚ分解能を制御する。このような制御により、サンプル１１に含まれる被観察物に対して、様々な方向からの測定光を照射することが可能になり、三次元構造をむらなく捉えることが可能になる。
【００７０】
以上説明したように、本実施形態によれば、透過型と反射型の両方で干渉光の強度を検出可能なＯＣＴ装置において、検出手段による検出の内容に応じて、対物レンズの開口数の制御と、透過型と反射型の切り換え制御とを行う。したがって、より細やかに被観察物に応じた検出を可能とすることができる。特に、本実施形態によれば、透過型と反射型とを適宜切り換えてＯＣＴを行うことにより、被観察物の全方位的な情報を得ることが期待できる。
【００７１】
［第２実施形態の補足］
なお、第２実施形態のＯＣＴ装置において、反射型ＯＣＴ次に対物レンズとして機能する対物レンズ１０を、対物レンズ９と同様に、開口数ＮＡが可変な対物レンズとすることにより、反射型ＯＣＴにおいてもｚ分解能を可変な構成としても良い。また、ｚ分解能が可変な反射型ＯＣＴ装置の構成と、分解能が不変の、通常の透過型ＯＣＴ装置の構成との両方を併せ持つＯＣＴ装置も、本発明の具体的態様として有効である。
【００７２】
［実施形態の変形例］
上述した第１実施形態および第２実施形態のＯＣＴ装置は、サンプルステージ１２を移動することにより、サンプル１１の側を変位させる方法（ステージスキャン型）を採用したが、照射スポットの側を変位させる方法（ビームスキャン型）を採用してもよい。また、２つの方法を選択的に利用しても良いし、組み合わせて利用しても良い。
【００７３】
また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置は、光源（白色光源）を使用して白色の干渉光を分光検出する方法（フーリエドメイン型）を採用したが、光源波長を走査して各波長の干渉光を時分割で検出する方法（波長スキャン型）を採用してもよい。
【００７４】
因みに、フーリエドメイン型を採用した場合は、分光検出を行う必要が無いので、スペクトル検出器１８の代わりに撮像素子を使用することで、サンプル１１上のｘｙ方向各位置の干渉光強度を一括に検出してもよい。
【００７５】
また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置は、光源（白色光源）を使用して干渉光を分光検出する方法（フーリエドメイン型）を採用したが、光源（白色光源）を使用し、かつ、測定光と参照光との光路長差を走査して白色の干渉光を走査位置毎に検出する方法（タイムドメイン型）を採用してもよい。
【００７６】
因みに、タイムドメイン型を採用した場合は、分光検出を行う必要が無いので、スペクトル検出器１８の代わりに撮像素子を使用することで、サンプル１１上のｘｙ方向各位置の干渉光強度を一括に検出してもよい。
【００７７】
また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置において、偏光成分を利用しても良い。例えば、検出手段へ向かう参照光の偏光方向と、被観察物へ向かう測定光の偏光方向との間に差異を設け、検出手段へ向かう測定光から、検出手段へ向かう参照光とは偏光方向の異なる成分を除去することにより、偏光成分を利用した検出を行うことができる。
【符号の説明】
【００７８】
１…光源、３，４ビームスプリッタ、９，１０…対物レンズ、１１…サンプル、１３…アパーチャー、１４，５４…分散補正用光学部材、１６…スペクトル検出器、１７…制御装置、１８…演算装置、２２…輪帯マスク、４２…光スキャナ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐する第１の分岐手段と、
被観察物に対して前記第１の測定光を斜入射照明する第１の照明光学系と、
斜入射照明された前記被観察物からの透過光を観察する第１の観察光学系と、
前記第１の測定光を基準とする前記第１の参照光を形成する第１の参照光学系と、
前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光とを合成する第１の合成手段と、
前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光との第１の干渉光を検出する第１の検出手段と、
前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する第１の位置情報取得手段とを備えた透過型観察装置と、
入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐する第２の分岐手段と、
前記被観察物に前記第２の測定光を照明する第２の照明光学系と、
照明された前記被観察物からの反射光を観察する第２の観察光学系と、
前記第２の測定光を基準とする前記第２の参照光を形成する第２の参照光学系と、
前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光とを合成する第２の合成手段と、
前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光との第２の干渉光を検出する第２の検出手段と、
前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する第２の位置情報取得手段とを備えた反射型観察装置とを備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の観察装置において、
透過型観察装置と反射型観察装置とを切り替える切替手段とを備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の観察装置において、
前記第１の検出手段と前記第２の検出手段とが同一である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項４】
請求項１〜請求項３に記載の観察装置において、
前記第１の照明光学系は、前記被観察物に対して斜入射する斜入射手段を備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項５】
請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の観察装置において、
前記第１の照明光学系、前記第２の照明光学系、前記第１の観察光学系、前記第２の観察光学系の少なくとも一つの光軸に直交した方向に前記第１の測定光または前記第２の測定光を走査する走査手段を備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項６】
請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の観察装置において、
前記第１の検出手段または前記第２の検出手段の少なくとも一つは、
前記第１の干渉光または前記第２の干渉光を分光して検出するスペクトル検出器である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項７】
請求項１〜請求項６の何れか１項に記載の観察装置において、
前記第１の参照光中または前記第１の測定光中に配置された１／２波長板または１／４波長板と、
前記第１の分岐手段に所定の偏光の光を入射するための第１の偏光素子と、
前記所定の偏光に基づいて決定する偏光方向を含む前記第１の干渉光の一部を透過する第２の偏光素子と、
前記第１の偏光素子が透過させる偏光方向と前記第２の偏光素子が透過させる偏光方向とを同時に変化させる第１の制御手段とを備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項８】
請求項１〜請求項７の何れか１項に記載の観察装置において、
前記第２の参照光中または前記第２の測定光中に配置された１／２波長板または１／４波長板と、
前記第２の分岐手段に所定の偏光の光を入射するための第３の偏光素子と、
前記所定の偏光に基づいて決定する偏光方向を含む前記第２の干渉光の一部を透過する第４の偏光素子と、
前記第３の偏光素子が透過させる偏光方向と前記第４の偏光素子が透過させる偏光方向とを同時に変化させる第２の制御手段とを備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項９】
請求項８に記載の観察装置において、
前記第２の偏光素子と前記第４の偏光素子とが同位置である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項１０】
入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐し、
被観察物に対して前記第１の測定光を斜入射照明し、
斜入射照明された前記被観察物からの透過光を観察し、
前記第１の測定光を基準とする前記第１の参照光を形成し、
前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光とを合成した干渉光を検出し、
前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する透過型観察方法と、
入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐し、
記被観察物に前記第２の測定光を照明し、
照明された前記被観察物からの反射光を観察し、
前記第２の測定光を基準とする前期第２の参照光を形成し、
前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光とを合成した干渉光を検出し、
前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する反射型観察方法とを有し、
前記透過型観察方法と前記反射型観察方法とを切り替えて観察することを特徴とする観察方法。
【請求項１】
入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐する第１の分岐手段と、
被観察物に対して前記第１の測定光を斜入射照明する第１の照明光学系と、
斜入射照明された前記被観察物からの透過光を観察する第１の観察光学系と、
前記第１の測定光を基準とする前記第１の参照光を形成する第１の参照光学系と、
前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光とを合成する第１の合成手段と、
前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光との第１の干渉光を検出する第１の検出手段と、
前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する第１の位置情報取得手段とを備えた透過型観察装置と、
入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐する第２の分岐手段と、
前記被観察物に前記第２の測定光を照明する第２の照明光学系と、
照明された前記被観察物からの反射光を観察する第２の観察光学系と、
前記第２の測定光を基準とする前記第２の参照光を形成する第２の参照光学系と、
前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光とを合成する第２の合成手段と、
前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光との第２の干渉光を検出する第２の検出手段と、
前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する第２の位置情報取得手段とを備えた反射型観察装置とを備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の観察装置において、
透過型観察装置と反射型観察装置とを切り替える切替手段とを備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の観察装置において、
前記第１の検出手段と前記第２の検出手段とが同一である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項４】
請求項１〜請求項３に記載の観察装置において、
前記第１の照明光学系は、前記被観察物に対して斜入射する斜入射手段を備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項５】
請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の観察装置において、
前記第１の照明光学系、前記第２の照明光学系、前記第１の観察光学系、前記第２の観察光学系の少なくとも一つの光軸に直交した方向に前記第１の測定光または前記第２の測定光を走査する走査手段を備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項６】
請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の観察装置において、
前記第１の検出手段または前記第２の検出手段の少なくとも一つは、
前記第１の干渉光または前記第２の干渉光を分光して検出するスペクトル検出器である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項７】
請求項１〜請求項６の何れか１項に記載の観察装置において、
前記第１の参照光中または前記第１の測定光中に配置された１／２波長板または１／４波長板と、
前記第１の分岐手段に所定の偏光の光を入射するための第１の偏光素子と、
前記所定の偏光に基づいて決定する偏光方向を含む前記第１の干渉光の一部を透過する第２の偏光素子と、
前記第１の偏光素子が透過させる偏光方向と前記第２の偏光素子が透過させる偏光方向とを同時に変化させる第１の制御手段とを備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項８】
請求項１〜請求項７の何れか１項に記載の観察装置において、
前記第２の参照光中または前記第２の測定光中に配置された１／２波長板または１／４波長板と、
前記第２の分岐手段に所定の偏光の光を入射するための第３の偏光素子と、
前記所定の偏光に基づいて決定する偏光方向を含む前記第２の干渉光の一部を透過する第４の偏光素子と、
前記第３の偏光素子が透過させる偏光方向と前記第４の偏光素子が透過させる偏光方向とを同時に変化させる第２の制御手段とを備える
ことを特徴とする観察装置。
【請求項９】
請求項８に記載の観察装置において、
前記第２の偏光素子と前記第４の偏光素子とが同位置である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項１０】
入射した光を第１の参照光と第１の測定光とに分岐し、
被観察物に対して前記第１の測定光を斜入射照明し、
斜入射照明された前記被観察物からの透過光を観察し、
前記第１の測定光を基準とする前記第１の参照光を形成し、
前記第１の参照光と前記被観察物からの透過光とを合成した干渉光を検出し、
前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する透過型観察方法と、
入射した光を第２の参照光と第２の測定光とに分岐し、
記被観察物に前記第２の測定光を照明し、
照明された前記被観察物からの反射光を観察し、
前記第２の測定光を基準とする前期第２の参照光を形成し、
前記第２の参照光と前記被観察物からの反射光とを合成した干渉光を検出し、
前記観察光学系の光軸方向に沿った前記被観察物の位置情報を取得する反射型観察方法とを有し、
前記透過型観察方法と前記反射型観察方法とを切り替えて観察することを特徴とする観察方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−２０２７７７（Ｐ２０１２−２０２７７７Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６６７００（Ｐ２０１１−６６７００）
【出願日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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