顕微鏡装置
【課題】一つのウェル領域を広い視野で一度に観察する際に、観察画像の輝度ムラを良好に補正した均一な輝度の標本画像を取得できる顕微鏡装置を提供すること。
【解決手段】ステージ３に載置された標本を照明する照明光学系４と、照明光で照明された前記標本の像を結像する結像光学系５と、前記結像の位置に配設された撮像装置１４と、前記撮像装置の撮像面の輝度分布が変化するように前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動する駆動手段３２と、前記撮像装置で撮像した前記標本の画像を処理する画像処理装置４０とを有し、前記画像処理装置は、前記駆動手段で前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動して前記撮像装置を介して取得した前記標本の画像の輝度を略均一にした前記標本の新たな画像を生成することを特徴とする顕微鏡装置。
【解決手段】ステージ３に載置された標本を照明する照明光学系４と、照明光で照明された前記標本の像を結像する結像光学系５と、前記結像の位置に配設された撮像装置１４と、前記撮像装置の撮像面の輝度分布が変化するように前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動する駆動手段３２と、前記撮像装置で撮像した前記標本の画像を処理する画像処理装置４０とを有し、前記画像処理装置は、前記駆動手段で前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動して前記撮像装置を介して取得した前記標本の画像の輝度を略均一にした前記標本の新たな画像を生成することを特徴とする顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本画像を取得する顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、複数のウェルが配置されたウェルプレートの各ウェルの細胞標本などを観察するための顕微鏡では、培養液の表面張力などに起因する表面形状の変化によるレンズ作用を低減し細胞標本の観察を可能にする顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３４３７２５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の顕微鏡で取得される細胞の標本画像は、一つのウェル領域を一度に観察するような広い視野において均一な明るさが得られるわけではなく、微妙な光軸ずれやフォーカス方向のずれなどにより取得した輝度ムラが発生する。この輝度ムラを補正するには、事前に画像の明るさを表す画像を採取して、取得した標本画像からの差分をとったり、輝度ムラを曲面近似したり、或いはハイパスフィルタをかけるなどの処理を行ってきたが、このような手法では、事前取得された画像と標本画像とが一致しなかったり、取得された標本画像の輝度階調を補正することによる量子化誤差が発生するなどの問題があった。
【０００５】
本発明は、上記に鑑みて行われたものであり、一つのウェル領域を広い視野で観察する際に、観察画像の輝度ムラを良好に補正した均一な輝度の標本画像を取得できる顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明は、ステージに載置され、液体中に存在する被観察物を有する標本を照明する照明光学系と、前記照明光学系の実効的な開口数よりも小さい開口数を有し、照明光で照明された前記標本の像を結像する結像光学系と、前記結像の位置に配設された撮像装置と、前記撮像装置の撮像面の輝度分布が変化するように前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動する駆動手段と、前記撮像装置で撮像した前記標本の画像を処理する画像処理装置とを有し、前記画像処理装置は、前記駆動手段で前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動して前記撮像装置を介して取得した前記標本の画像の輝度を略均一にした前記標本の新たな画像を生成することを特徴とする顕微鏡装置を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、一つのウェル領域を広い視野で観察する際に、観察画像の輝度ムラを良好に補正した均一な輝度の標本画像を取得できる顕微鏡装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図。
【図２】輝度ムラのある画像の一例
【図３】輝度ムラを補正した画像を取得手順のフローチャート
【図４】フロ−チャートにおける輝度ムラ補正説明図
【図５】第２、および第２の変形例の輝度ムラ低減方法を説明する図
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本願の実施形態にかかる顕微鏡装置について図面を参照しつつ説明する。なお、以下の実施形態は、発明の理解を容易にするためのものに過ぎず、本願発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・置換等を施すことを排除することは意図していない。
【００１０】
本実施形態にかかる顕微鏡装置は、シャーレやウェルプレート等の培養容器に配した試料を培養液で浸した状態で低倍率、広視野で観察することに適した明視野顕微鏡と画像を処理する画像処理装置などから構成されている。
【００１１】
図１に示すように、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、試料２を載置するためのステージ３、ステージ３の上方に配置された照明光学系４、およびステージ３の下方に配置された結像光学系５を有している。なお、ステージ３、照明光学系４、および結像光学系５は、下方に不図示のベース部を備えた顕微鏡支柱６に対して、支持部材７（７ａ〜７ｄ）を介して上下方向の位置を変更可能に支持されている。
【００１２】
本実施形態において、試料２には細胞等の位相物体が用いられている。斯かる試料２は、例えば９６ウェルプレート１０の各ウェル１０ａに培養液１１と共に注入されており、当該９６ウェルプレート１０がステージ３上に載置されている。
【００１３】
結像光学系５は、照明光学系４で照明された任意のウェル１０ａ内の試料２を観察するためのものであり、図１に示すように、ステージ３側から順に、高開口数の第１対物レンズ１２、第２対物レンズ１３、およびＣＣＤやＣＭＯＳなどで構成されるカメラ１４を有する。
【００１４】
第１対物レンズ１２は、ウェル１０ａの底面から射出された光を略漏れなく集光するための高い開口数（ＮＡ）を有する対物レンズであり、本実施形態においてはΦ６．４ｍｍ程度の実視野を実現するために、倍率が１．２５倍、開口数が０．２５以上のものが用いられている。
【００１５】
カメラ１４には、２／３インチＣＣＤカメラが用いられている。また、カメラ１４には、画像処理装置４０が接続されている。画像処理装置４０は、例えばパーソナルコンピュタ（以後、単にＰＣと記す）４１とモニタ４２とキーボードやマウスなどの入出力デバイス４３と、メモリ４４とから構成されている。
【００１６】
また、支持部材７ａには照明光学系４を、ＸＹＺθ駆動可能な駆動手段３２が配置されている。また駆動手段３２は、照明光学系４のＸＹＺθ方向の各移動量を検出する検出手段を内蔵している。
【００１７】
照明光学系４は、ウェル１０ａ内の試料２を透過照明するためのものであり、図１に示すように、ステージ３側から順に、コンデンサレンズ１８、開口絞り１９、可動絞り２０、コレクタレンズ２１、および光源２２を有する。
【００１８】
可動絞り２０は、ウェル１０ａの底面を略均一に照明するための低ＮＡの照明光を生成するための絞り部材である。本実施形態において可動絞り２０には、照明光学系４から射出される照明光のＮＡ（以下、「照明ＮＡ」という。）が０．１以下となるように、絞り径や光軸上の位置等が予め設計された絞り部材が用いられている。なお、可動絞り２０は、照明光がウェル１０ａの壁面で反射または透過することを防止するために、照明光の光束がウェル１０ａの内径よりも小さくなるように照明光の照射領域を絞る役割も果たしている。
【００１９】
また、可動絞り２０には、可動絞り２０を光軸方向および光軸に垂直な方向へ移動させるための不図示の移動機構と、絞り径を変更するための不図示の絞り径調整機構が備えられている。これにより、前記移動機構によって可動絞り２０を光軸方向へ移動させることで、試料２への照明光の主光線の角度を変更することができる。また、前記絞り径調整機構によって可動絞り２０の絞り径を変更し、照明光の実効的なＮＡを変更することができる。さらには、前記移動機構によって可動絞り２０を光軸に垂直な方向へ移動させることで、照明光学系４から射出される照明光の試料２に対する照射位置を光軸に垂直な方向へ変更することができる。
【００２０】
コンデンサレンズ１８には、コンデンサレンズ１８を光軸方向へ移動させるための不図示の移動機構が備えられている。これにより、当該移動機構によってコンデンサレンズ１８を光軸方向へ移動させることで、照明光の集光位置を光軸方向へ変更することができ、これによって視野内のシェーディングなどを除去することができる。
【００２１】
光源２２には、位相物体の観察に好適なコヒーレント性の高い赤色ＬＥＤ（発光ダイオード）が用いられている。これにより、照明の均一性と長寿命性を確保することができる。また、培養液１１内のフェノールレッド等の栄養素が培養液１１の劣化に伴って変色し、これが可視域の光を吸収してしまうため、培養状態によって観察像の明るさが変化してしまうという影響を解消することができる。
【００２２】
以上の構成の下、本実施形態にかかる顕微鏡装置１において、照明光学系４の光源２２から発せられた照明光は、コレクタレンズ２１を経た後、可動絞り２０を通過する。可動絞り２０は、光軸上の位置によって、主光線の方向を変えることができ、開口の大きさや開口部の位置を光軸から離れた位置に変化させることにより、照明光の実効的なＮＡを変えることができる。そして斯かる照明光は、開口絞り１９を通過し、コンデンサレンズ１８で集光されることにより、必要な照明光の実効的なＮＡや主光線の方向を形成することとなる。このようにして形成された照明光は、ステージ３上の９６ウェルプレート１０における任意のウェル１０ａ内の試料２に培養液１１を介して照射される。このように、照明光学系４は、試料２に対して一点に集光する光束の収束角とその主光線の方向が制御された照明を実現することができる。
【００２３】
ここで、当該ウェル１０ａ内の培養液１１の液面は、上述のように凹面となってレンズ効果が生じている。本顕微鏡装置１では、第１対物レンズ１２の開口数を十分に大きくし、結像光学系５を構成する第１対物レンズ１２の開口数よりも小さい実効的なＮＡを持つ照明光を斯かる培養液１１の凹面に照射することで、培養液１１の凹面によって照明光の方向が第１対物レンズ１２の外側に向かって屈折しても、培養液１１の液面によるレンズ効果の影響を受けにくくしている。また、このときに、照明光の主光線の方向を培養液１１の液面により屈折される方向を考慮して、屈折される方向とは逆方向に光軸に対して主光線の方向を向けることで、屈折した照明光がウェル１０ａの壁面で反射又は透過することを防止することができ、即ち照明光束がウェル１０ａ内のみを進行することととなり、これによってウェル１０ａの底面をムラなく略均一に照明することができる。
【００２４】
そして、以上のように結像光学系５を構成する第１対物レンズ１２の開口数よりも小さいＮＡの照明光で照明された試料２からの光は、結像光学系５の第１対物レンズ１２に入射する。ここで、第１対物レンズ１２は上述のように高開口数の対物レンズであるため、ウェル１０ａの底面から射出された光（前述の屈折した照明光で照明された試料２からの光を含む）を略漏れなく集光することができる。このようにして第１対物レンズ１２によって集光された光は、第２対物レンズ１３を介して、カメラ１４の撮像面上に試料２の観察像を形成する。なお、詳細には、上述のような主光線の方向と照明光の実効的なＮＡを持つ照明光によってウェル１０ａの壁面での反射光、即ちノイズ光の発生を抑えながらウェル１０ａの底面を略均一に照明することで、試料２の背景（バックグラウンド）からの光（直接光）のＮＡが小さくなるため、斯かる直接光と試料２で回折された回折光とが干渉してコントラストの良好な試料２の観察像が形成されることとなる。このようにして形成された試料２の観察像は、カメラ１４で撮影されて不図示のモニタに表示され、使用者に観察されることとなる。
【００２５】
ここで、上述のように再生医療の研究等において培養した細胞を観察する際には、低倍率で視野の全域を観察することが求められており、培養液のレンズ効果の影響を考慮しながら視野の全域で観察を行うためには、第１対物レンズに０．２５相当の開口数と１．２５倍程度の倍率が必要となる。
【００２６】
これに対して本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、上述のように照明光の実効的なＮＡが０．１以下、第１対物レンズ１２の倍率が１．２５倍で開口数が０．２５以上であり、これによって視野の全域（Φ６．４ｍｍ程度の実視野）で観察を行うことができる。また、上述のように９６ウェルプレート１０におけるウェル１０ａの内径はΦ６．４ｍｍ程度であるため、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、２／３インチＣＣＤカメラであるカメラ１４によって、９６ウェルプレート１０のウェル１０ａの底面全域を１枚の画像として撮影することができる。即ち、最大限のスループットでレンズ効果の影響を解消した試料２の観察像を取得することができる。
【００２７】
また、上述のように培養液１１のレンズ効果の大きさは、培養容器の種類、培養液１１の組成、培養容器の材質、及び培養液１１の量等によって様々に変化する。特に、培養容器の種類によって培養液１１の凹面の直径は異なり、これによって凹面の曲率半径は大きく変化し、レンズ効果も大きく変化することとなる。
【００２８】
そこで、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、培養液１１のレンズ効果の変化に応じて、上述のように可動絞り２０を光軸方向に移動させたり、可動絞り２０の絞り径を変更させたりすることで、照明光の実効的なＮＡや照明光の主光線の方向を変更することができる。これにより、培養液１１のレンズ効果が変化した場合でも、これに対応した低ＮＡの照明光によって培養容器の底面を略均一に照明することができ、レンズ効果の影響を解消した試料２の観察像を取得することができる。
【００２９】
しかし、上述のような照明光学系４、結像光学系５においても、照明光学系４や結像光学系５の配置ずれやカメラ１４の感度ムラなどにより、カメラ１４で撮影される画像に図２に示すような輝度ムラが発生することがある。
【００３０】
図２において、Ｓは視野であるウェル１０ａの底面全域の画像領域を示し、Ｓ１は輝度の高い領域を、Ｓ２は輝度の低い領域をそれぞれ示している。本顕微鏡装置１では、低い倍率でウェル１０ａの底面全域に亘る領域の試料２（細胞）を観察するため、図２に示すような輝度ムラが存在すると視野内で試料２のコントラストむらが発生し、試料２の細胞分布状態を正確に計測できないという問題が生じる。
【００３１】
本顕微鏡装置１は、このような視野Ｓ内に輝度ムラがある画像から視野Ｓ全体を均一な輝度に補正し、ウェル１０ａ底面全域に亘って良好な輝度状態の試料２（細胞観察）を可能にする画像処理装置４０を有している。以下、画像処理装置４０において、視野Ｓ内の輝度を均一にした画像を生成するフローチャートを図３に基づき説明する。
【００３２】
（第１の方法）
図３のフローチャート、および図４を参照しつつ第１の輝度ムラ補正画像取得手順について説明する。
【００３３】
本手順では、顕微鏡装置１において、カメラ１４でウェル１０ａの底面全域に亘る試料２の画像を取得する際、駆動手段３２で照明光学系４を光軸に直交する面内（ＸＹ面内）を所定の移動量（ΔＸ、ΔＹ）移動して試料２の複数の画像をそれぞれ取得し、画像処理装置４０の画像処理部を内蔵するＰＣ４１により輝度値補正処理して輝度ムラを補正した画像を生成しモニタ４２に表示すると共にメモリ４４に保存する。以下、ステップ毎に説明する。なお、ＰＣ４１が画像処理を開始する前に観察者がステージ３上にウェルプレート１０を載置し、画像を取得するウェル１０ａを照明光学系４及び結像光学系５の光路に配置しているとする。
【００３４】
（ステップＳ１）
ＰＣ４１は、この位置でのウェル１０ａ底面全域（視野Ｓ）にわたる細胞画像Ｉ０（ｉ＝０）をカメラ１４で取得し不図示のバッファーメモリに保存する。また、ＰＣ４１は、対象とする画像Ｓ領域を画像処理部で輝度信号などの信号変化を検出して自動的に行う。なお、画像Ｓ領域の抽出は、観察者がモニタ４２の画像を見ながら抽出することもできる。
【００３５】
(ステップＳ２)
ＰＣ４１は、画像Ｉ０の各画素の輝度信号値分布から、輝度平均値μ、ノイズ分布σを計算し、閾値Ｔ＝μ＋３σを決定する。
【００３６】
(ステップＳ３)
ＰＣ４１は、決定した閾値Ｔにより画像Ｓ内で光量が異常となる面積Ｒ（ｉ）を算出する。算出結果の一例を図４（ａ）に示す。図４（ａ）では、左側部分に三日月状に光量異常領域Ｒｉが存在する場合を示している。また、ＰＣ４１は、ΔＲ（ｉ）＝Ｒ（ｉ）―Ｒ（ｉ−１）を算出する。ΔＲ（ｉ）は、今回取得した画像の光量異常面積とひとつ前に取得した光量異常面責との差分である。ｉ＝１の時はΔＲ（１）＝Ｒ（１）となる。
【００３７】
(ステップＳ４)
ＰＣ４１は、前もって決定してある最小光量許容面積Ｒ（ｍｉｎ）とステップＳ３で求めた光量異常面積Ｒｉの大小比較を行い、Ｒ（ｉ）＞Ｒ（ｍｉｎ）ならば次のステップＳ５を実行し、Ｒ（ｉ）≦Ｒ（ｍｉｎ）ならばステップＳ１２を実行する。Ｒ（ｍｉｎ）は、計測対象物（本願では細胞）の面積にほぼ等しい値に設定されるが、これに限られず任意の面積に設定することができる。
【００３８】
（ステップＳ５）
ＰＣ４１は、光量異常面積Ｒ（ｉ）がＲ（ｍｉｎ）より大きいので、照明光学系４をＸＹ面内で前もって決めてある所定移動量ΔＬ（ΔＸ、ΔＹ）加えた位置に移動する。
【００３９】
(ステップＳ６)
ＰＣ４１は、照明光学系４を所定量移動した後、この位置でカメラ１４を介して画像Ｉ（ｉ＋１）を取得する。
【００４０】
（ステップＳ７）
ＰＣ４１は、閾値Ｔを用いて光量異常面積ΔＲ（ｉ＋１）を算出するとともに、ΔＲ（ｉ）＝ΔＲ（ｉ＋１）―ΔＲ（ｉ）を算出する。この状態を図４（ｂ）に示す。Ｒ（ｉ＋１）は、一つ前のＲ（ｉ）より小さな領域となる。
【００４１】
（ステップＳ８）
ＰＣ４１は、ΔＲ（ｉ）と予め求められている光量異常面積閾値Ｔｒとを比較する。Ｒ（ｉ）＞Ｔｒならば次のステップＳ９を実行し、Ｒ（ｉ）≦ＴｒならばステップＳ５にもどりステップＳ５からステップＳ７を実行する。なお、光量異常面積閾値Ｔｒは視野Ｓのほぼ２５％程度の値を用いるが、これに限られず任意に設定できる。
【００４２】
（ステップＳ９）
ＰＣ４１は、カウンタｉが前もって決められているｉｍａｘ値に達したか否かを判断する。カウンタｉがｉｍａｘに達していなければステップＳ１０に、ｉｍａｘに達していればステップＳ１３を実行する。
【００４３】
（ステップＳ１０）
ＰＣ４１は、カメラ１４を介して再度画像を取得し、メモリ４４に保存する（ステップＳ１１）。またカウンタｉに１をプラスして（ｉ＝ｉ＋１）、ステップＳ２に戻る。以降ステップＳ２からステップＳ９を実行する。
【００４４】
（ステップＳ１２）
ＰＣ４１は、光量異常面積Ｒｉが予め設定したＲｍｉｎ以下となったのでほぼ光量異常面積がなくなったと判断する。そして、ＰＣ４１は、メモリ４４に保存してある画像Ｉｉ（Ｉ０、Ｉ１，・・・、Ｉｉ）を用いて、各画像の画素毎に輝度値を平均化する処理を行い視野Ｓの全域にわたって輝度が均一になった画像を生成して、モニタ４２に表示するとともにメモリ４４に保存し、観察者に画像処理が終了した旨の表示をして知らせる。
【００４５】
（ステップＳ１３）
ＰＣ４１は、カウンタｉがｉｍａｘを超えたことを観察者にアラーム表示をして知らせる。照明光学系４の移動量ΔＬ値が不適切（小さすぎた）で所定の反復回数では輝度均一画像の取得ができなかったので、観察者に照明光学系４の移動量ΔＬ値の変更を指示する表示をする。観察者は、新たな移動量ΔＬ（ΔＸ、ΔＹ）を設定し、再度ステップＳ１から実行するようにＰＣ４１に指示する。
【００４６】
以上のフローをＰＣ４１が実行することで、視野Ｓ全域にわたって輝度を均一にした画像を生成することができる。
【００４７】
なお、上記説明では、照明光学系４を光軸に直行する面内（ＸＹ平面）に移動する場合について説明したが、光軸方向（Ｚ軸）に移動しながら同様の処理を行ってもよいし、光軸を中心として回転（θ方向）しながら同様の処理を行うことで、輝度の均一な画像を生成することができる。
【００４８】
また、上記説明では照明光学系４をＸＹＺθ方向に移動する場合について述べたが、ステージ３からカメラ１４までを一体的に移動することでも上記と同様の効果を奏することができる。
【００４９】
（第２の方法）
上記方法では、顕微鏡装置１において、カメラ１４でウェル１０ａの底面全域に亘る試料２の画像を取得する際、照明光学系４をＸＹ面内でΔＬずつ移動して輝度値補正処理した輝度ムラ補正画像を生成したが、以後の説明では、照明光学系４を光軸を中心として回転し、得られた複数の画像の各画素を平均化処理して輝度ムラ補正画像を生成する場合について説明する。なお、ステージ３からカメラ１４までを回転しても同様の処理で輝度ムラを補正した画像を生成することができる。
【００５０】
図５（ａ）に示すように、画像処理装置４０のＰＣ４１は、駆動手段３２を駆動して、照明光学系４を光軸を中心として９０度ずつ回転して（例えばθ＝０、９０、１８０、２７０°）、各回転角度の画像をそれぞれ取得する。例えば９０度毎の場合、画像は４枚取得する。ＰＣ４１は、この取得した４枚の画像の各画素それぞれの輝度値の単純平均化処理を行い、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な画像を生成する。なお、等分割角度であれば回転角度は９０度に限らず任意の角度で良いことは言うまでもない。
【００５１】
詳説すると、ＰＣ４１は駆動手段３２を駆動して、画像を取得する角度に照明光学系４の回転角度を設定し、内蔵する検出手段で角度を検出し回転角度が設定し終わった後、カメラ１４で画像（θ＝０°）を取得してＰＣ４１のメモリ４４に記憶する。
【００５２】
続いて、ＰＣ４１は駆動手段３２を駆動して照明光学系４を次の回転角度（θ＝９０°）位置に回転し、この角度での画像をカメラ１４で取得してＰＣ４１のメモリ４４記憶する。
【００５３】
以降、ＰＣ４１は同様にしてθ＝１８０°、θ＝２７０°の画像をカメラ１４を介して取得してＰＣ４１のメモリ４４に記憶する。
【００５４】
ＰＣ４１は、４枚の画像が取得できたので補正画像生成処理を開始する。ＰＣ４１は内蔵されている画像処理部において、記憶されている４枚の画像の各画素の輝度値を用いて輝度値の単純平均化処理を行い、処理結果に基いて輝度ムラを補正した画像を生成しモニタ４２に表示する(図５（ｂ）参照)と共にメモリ４４に記憶する。なお、ここで用いられる単純平均化処理は、公知の手段あるいはプログラムを使用することができる。
【００５５】
このように、本実施形態の第２の方法にかかる顕微鏡装置１では、ＰＣ４１は照明光学系４を回転しながら複数枚の画像を取得して、取得した全画像を用いた単純平均化処理を行うことで、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な１枚の画像を生成しモニタ４２に表示することができる。
【００５６】
（第２の方法の変形例）
この変形例は、第２の方法と同様に、顕微鏡装置１において、カメラ１４でウェル１０ａの底面全域に亘る試料２の画像を取得する際、照明光学系４とステージ３から結像光学系５のカメラ１４の少なくとも一方を光軸を中心として回転しながら試料２の複数の画像をそれぞれ取得し、画像処理装置４０のＰＣ４１により後述する方法で輝度値補正処理して輝度ムラを補正した画像を生成する。
【００５７】
図３（ａ）に示すように、ＰＣ４１は駆動手段３２を駆動して照明光学系４を光軸を中心として９０度ずつ回転して（例えばθ＝０、９０、１８０、２７０°）、各回転角度の画像をそれぞれ取得する。９０度毎の場合、画像は４枚取得する。ＰＣ４１は、予め取得しておいた基準画像の輝度値とこの取得した４枚の画像とのそれぞれの輝度値のずれ量に応じた加重平均化処理を行い、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な画像を生成する。なお、等分割角度であれば回転角度は９０度に限らず任意の角度で良いことは言うまでもない。
【００５８】
ＰＣ４１は、駆動手段３２を駆動して画像を取得する角度に照明光学系４の回転角度を設定し、回転角度が設定し終わった後、カメラ１４で画像（θ＝０°）を取得してＰＣ４１のメモリ４４に記憶する。
【００５９】
以降、ＰＣ４１は、駆動手段３２を駆動して、θ＝９０°、θ＝１８０°、θ＝２７０°の画像をカメラ１４を介して取得してＰＣ４１のメモリ４４に記憶する。
【００６０】
ＰＣ４１は、４枚の画像が取得できたのでＰＣ４１は内蔵されている画像処理部において記憶されている基準画像の輝度値と取得した４枚の画像の各画素の輝度値から加重平均化処理を行い、処理結果に基いて輝度ムラを補正した画像を生成しモニタ４２に表示する(図３（ｂ）参照)と共にメモリ４４に記憶する。なお、ここで用いられる加重平均化処理は、公知の手段あるいはプログラムを使用することができる。
【００６１】
このように、本実施形態にかかる顕微鏡装置１では、ＰＣ４１は照明光学系４を回転しながら複数枚の画像を取得して、取得した全画像と予め取得しておいた基準画像の輝度値とから加重平均化処理を行うことで、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な画像を生成しモニタ４２に表示することができる。この第２の方法の変形例は、複数枚の画像に基づく加重平均化処理を行う分、従来に比べて輝度ムラ補正精度を向上させた画像を生成することができる。
【００６２】
このように、本実施形態にかかる顕微鏡装置１では、ＰＣ４１は照明光学系４を駆動しながら取得した画像の輝度ムラ領域を検出し、この輝度ムラ領域が所定の面積以下になるように照明光学系４を移動して取得した画像の各画素の輝度値を平均化処理することで、輝度の均一な画像を生成しモニタ４２に表示することができる。
【００６３】
また、本実施形態にかかる顕微鏡装置１では、ＰＣ４１は照明光学系４を駆動しながら複数枚の画像を取得して、取得した画像の１枚から基準となる輝度値を選択し加重平均化処理を行うことで、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な画像を生成しモニタ４２に表示することができる。
【符号の説明】
【００６４】
１ 顕微鏡
２ 試料
４ 照明光学系
５ 結像光学系
１０ ９６ウェルプレート
１１ 培養液
１２ 第１対物レンズ
１３ 第２対物レンズ
１４ カメラ
１８ コンデンサレンズ
１９ 開口絞り
２０ 可動絞り
２１ コレクタレンズ
２２ 光源
３２ 駆動手段
４０ 画像処理装置
４１ ＰＣ
４２ モニタ
４３ 入出力デバイス
４４ メモリ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本画像を取得する顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、複数のウェルが配置されたウェルプレートの各ウェルの細胞標本などを観察するための顕微鏡では、培養液の表面張力などに起因する表面形状の変化によるレンズ作用を低減し細胞標本の観察を可能にする顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３４３７２５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の顕微鏡で取得される細胞の標本画像は、一つのウェル領域を一度に観察するような広い視野において均一な明るさが得られるわけではなく、微妙な光軸ずれやフォーカス方向のずれなどにより取得した輝度ムラが発生する。この輝度ムラを補正するには、事前に画像の明るさを表す画像を採取して、取得した標本画像からの差分をとったり、輝度ムラを曲面近似したり、或いはハイパスフィルタをかけるなどの処理を行ってきたが、このような手法では、事前取得された画像と標本画像とが一致しなかったり、取得された標本画像の輝度階調を補正することによる量子化誤差が発生するなどの問題があった。
【０００５】
本発明は、上記に鑑みて行われたものであり、一つのウェル領域を広い視野で観察する際に、観察画像の輝度ムラを良好に補正した均一な輝度の標本画像を取得できる顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明は、ステージに載置され、液体中に存在する被観察物を有する標本を照明する照明光学系と、前記照明光学系の実効的な開口数よりも小さい開口数を有し、照明光で照明された前記標本の像を結像する結像光学系と、前記結像の位置に配設された撮像装置と、前記撮像装置の撮像面の輝度分布が変化するように前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動する駆動手段と、前記撮像装置で撮像した前記標本の画像を処理する画像処理装置とを有し、前記画像処理装置は、前記駆動手段で前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動して前記撮像装置を介して取得した前記標本の画像の輝度を略均一にした前記標本の新たな画像を生成することを特徴とする顕微鏡装置を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、一つのウェル領域を広い視野で観察する際に、観察画像の輝度ムラを良好に補正した均一な輝度の標本画像を取得できる顕微鏡装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図。
【図２】輝度ムラのある画像の一例
【図３】輝度ムラを補正した画像を取得手順のフローチャート
【図４】フロ−チャートにおける輝度ムラ補正説明図
【図５】第２、および第２の変形例の輝度ムラ低減方法を説明する図
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本願の実施形態にかかる顕微鏡装置について図面を参照しつつ説明する。なお、以下の実施形態は、発明の理解を容易にするためのものに過ぎず、本願発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・置換等を施すことを排除することは意図していない。
【００１０】
本実施形態にかかる顕微鏡装置は、シャーレやウェルプレート等の培養容器に配した試料を培養液で浸した状態で低倍率、広視野で観察することに適した明視野顕微鏡と画像を処理する画像処理装置などから構成されている。
【００１１】
図１に示すように、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、試料２を載置するためのステージ３、ステージ３の上方に配置された照明光学系４、およびステージ３の下方に配置された結像光学系５を有している。なお、ステージ３、照明光学系４、および結像光学系５は、下方に不図示のベース部を備えた顕微鏡支柱６に対して、支持部材７（７ａ〜７ｄ）を介して上下方向の位置を変更可能に支持されている。
【００１２】
本実施形態において、試料２には細胞等の位相物体が用いられている。斯かる試料２は、例えば９６ウェルプレート１０の各ウェル１０ａに培養液１１と共に注入されており、当該９６ウェルプレート１０がステージ３上に載置されている。
【００１３】
結像光学系５は、照明光学系４で照明された任意のウェル１０ａ内の試料２を観察するためのものであり、図１に示すように、ステージ３側から順に、高開口数の第１対物レンズ１２、第２対物レンズ１３、およびＣＣＤやＣＭＯＳなどで構成されるカメラ１４を有する。
【００１４】
第１対物レンズ１２は、ウェル１０ａの底面から射出された光を略漏れなく集光するための高い開口数（ＮＡ）を有する対物レンズであり、本実施形態においてはΦ６．４ｍｍ程度の実視野を実現するために、倍率が１．２５倍、開口数が０．２５以上のものが用いられている。
【００１５】
カメラ１４には、２／３インチＣＣＤカメラが用いられている。また、カメラ１４には、画像処理装置４０が接続されている。画像処理装置４０は、例えばパーソナルコンピュタ（以後、単にＰＣと記す）４１とモニタ４２とキーボードやマウスなどの入出力デバイス４３と、メモリ４４とから構成されている。
【００１６】
また、支持部材７ａには照明光学系４を、ＸＹＺθ駆動可能な駆動手段３２が配置されている。また駆動手段３２は、照明光学系４のＸＹＺθ方向の各移動量を検出する検出手段を内蔵している。
【００１７】
照明光学系４は、ウェル１０ａ内の試料２を透過照明するためのものであり、図１に示すように、ステージ３側から順に、コンデンサレンズ１８、開口絞り１９、可動絞り２０、コレクタレンズ２１、および光源２２を有する。
【００１８】
可動絞り２０は、ウェル１０ａの底面を略均一に照明するための低ＮＡの照明光を生成するための絞り部材である。本実施形態において可動絞り２０には、照明光学系４から射出される照明光のＮＡ（以下、「照明ＮＡ」という。）が０．１以下となるように、絞り径や光軸上の位置等が予め設計された絞り部材が用いられている。なお、可動絞り２０は、照明光がウェル１０ａの壁面で反射または透過することを防止するために、照明光の光束がウェル１０ａの内径よりも小さくなるように照明光の照射領域を絞る役割も果たしている。
【００１９】
また、可動絞り２０には、可動絞り２０を光軸方向および光軸に垂直な方向へ移動させるための不図示の移動機構と、絞り径を変更するための不図示の絞り径調整機構が備えられている。これにより、前記移動機構によって可動絞り２０を光軸方向へ移動させることで、試料２への照明光の主光線の角度を変更することができる。また、前記絞り径調整機構によって可動絞り２０の絞り径を変更し、照明光の実効的なＮＡを変更することができる。さらには、前記移動機構によって可動絞り２０を光軸に垂直な方向へ移動させることで、照明光学系４から射出される照明光の試料２に対する照射位置を光軸に垂直な方向へ変更することができる。
【００２０】
コンデンサレンズ１８には、コンデンサレンズ１８を光軸方向へ移動させるための不図示の移動機構が備えられている。これにより、当該移動機構によってコンデンサレンズ１８を光軸方向へ移動させることで、照明光の集光位置を光軸方向へ変更することができ、これによって視野内のシェーディングなどを除去することができる。
【００２１】
光源２２には、位相物体の観察に好適なコヒーレント性の高い赤色ＬＥＤ（発光ダイオード）が用いられている。これにより、照明の均一性と長寿命性を確保することができる。また、培養液１１内のフェノールレッド等の栄養素が培養液１１の劣化に伴って変色し、これが可視域の光を吸収してしまうため、培養状態によって観察像の明るさが変化してしまうという影響を解消することができる。
【００２２】
以上の構成の下、本実施形態にかかる顕微鏡装置１において、照明光学系４の光源２２から発せられた照明光は、コレクタレンズ２１を経た後、可動絞り２０を通過する。可動絞り２０は、光軸上の位置によって、主光線の方向を変えることができ、開口の大きさや開口部の位置を光軸から離れた位置に変化させることにより、照明光の実効的なＮＡを変えることができる。そして斯かる照明光は、開口絞り１９を通過し、コンデンサレンズ１８で集光されることにより、必要な照明光の実効的なＮＡや主光線の方向を形成することとなる。このようにして形成された照明光は、ステージ３上の９６ウェルプレート１０における任意のウェル１０ａ内の試料２に培養液１１を介して照射される。このように、照明光学系４は、試料２に対して一点に集光する光束の収束角とその主光線の方向が制御された照明を実現することができる。
【００２３】
ここで、当該ウェル１０ａ内の培養液１１の液面は、上述のように凹面となってレンズ効果が生じている。本顕微鏡装置１では、第１対物レンズ１２の開口数を十分に大きくし、結像光学系５を構成する第１対物レンズ１２の開口数よりも小さい実効的なＮＡを持つ照明光を斯かる培養液１１の凹面に照射することで、培養液１１の凹面によって照明光の方向が第１対物レンズ１２の外側に向かって屈折しても、培養液１１の液面によるレンズ効果の影響を受けにくくしている。また、このときに、照明光の主光線の方向を培養液１１の液面により屈折される方向を考慮して、屈折される方向とは逆方向に光軸に対して主光線の方向を向けることで、屈折した照明光がウェル１０ａの壁面で反射又は透過することを防止することができ、即ち照明光束がウェル１０ａ内のみを進行することととなり、これによってウェル１０ａの底面をムラなく略均一に照明することができる。
【００２４】
そして、以上のように結像光学系５を構成する第１対物レンズ１２の開口数よりも小さいＮＡの照明光で照明された試料２からの光は、結像光学系５の第１対物レンズ１２に入射する。ここで、第１対物レンズ１２は上述のように高開口数の対物レンズであるため、ウェル１０ａの底面から射出された光（前述の屈折した照明光で照明された試料２からの光を含む）を略漏れなく集光することができる。このようにして第１対物レンズ１２によって集光された光は、第２対物レンズ１３を介して、カメラ１４の撮像面上に試料２の観察像を形成する。なお、詳細には、上述のような主光線の方向と照明光の実効的なＮＡを持つ照明光によってウェル１０ａの壁面での反射光、即ちノイズ光の発生を抑えながらウェル１０ａの底面を略均一に照明することで、試料２の背景（バックグラウンド）からの光（直接光）のＮＡが小さくなるため、斯かる直接光と試料２で回折された回折光とが干渉してコントラストの良好な試料２の観察像が形成されることとなる。このようにして形成された試料２の観察像は、カメラ１４で撮影されて不図示のモニタに表示され、使用者に観察されることとなる。
【００２５】
ここで、上述のように再生医療の研究等において培養した細胞を観察する際には、低倍率で視野の全域を観察することが求められており、培養液のレンズ効果の影響を考慮しながら視野の全域で観察を行うためには、第１対物レンズに０．２５相当の開口数と１．２５倍程度の倍率が必要となる。
【００２６】
これに対して本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、上述のように照明光の実効的なＮＡが０．１以下、第１対物レンズ１２の倍率が１．２５倍で開口数が０．２５以上であり、これによって視野の全域（Φ６．４ｍｍ程度の実視野）で観察を行うことができる。また、上述のように９６ウェルプレート１０におけるウェル１０ａの内径はΦ６．４ｍｍ程度であるため、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、２／３インチＣＣＤカメラであるカメラ１４によって、９６ウェルプレート１０のウェル１０ａの底面全域を１枚の画像として撮影することができる。即ち、最大限のスループットでレンズ効果の影響を解消した試料２の観察像を取得することができる。
【００２７】
また、上述のように培養液１１のレンズ効果の大きさは、培養容器の種類、培養液１１の組成、培養容器の材質、及び培養液１１の量等によって様々に変化する。特に、培養容器の種類によって培養液１１の凹面の直径は異なり、これによって凹面の曲率半径は大きく変化し、レンズ効果も大きく変化することとなる。
【００２８】
そこで、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、培養液１１のレンズ効果の変化に応じて、上述のように可動絞り２０を光軸方向に移動させたり、可動絞り２０の絞り径を変更させたりすることで、照明光の実効的なＮＡや照明光の主光線の方向を変更することができる。これにより、培養液１１のレンズ効果が変化した場合でも、これに対応した低ＮＡの照明光によって培養容器の底面を略均一に照明することができ、レンズ効果の影響を解消した試料２の観察像を取得することができる。
【００２９】
しかし、上述のような照明光学系４、結像光学系５においても、照明光学系４や結像光学系５の配置ずれやカメラ１４の感度ムラなどにより、カメラ１４で撮影される画像に図２に示すような輝度ムラが発生することがある。
【００３０】
図２において、Ｓは視野であるウェル１０ａの底面全域の画像領域を示し、Ｓ１は輝度の高い領域を、Ｓ２は輝度の低い領域をそれぞれ示している。本顕微鏡装置１では、低い倍率でウェル１０ａの底面全域に亘る領域の試料２（細胞）を観察するため、図２に示すような輝度ムラが存在すると視野内で試料２のコントラストむらが発生し、試料２の細胞分布状態を正確に計測できないという問題が生じる。
【００３１】
本顕微鏡装置１は、このような視野Ｓ内に輝度ムラがある画像から視野Ｓ全体を均一な輝度に補正し、ウェル１０ａ底面全域に亘って良好な輝度状態の試料２（細胞観察）を可能にする画像処理装置４０を有している。以下、画像処理装置４０において、視野Ｓ内の輝度を均一にした画像を生成するフローチャートを図３に基づき説明する。
【００３２】
（第１の方法）
図３のフローチャート、および図４を参照しつつ第１の輝度ムラ補正画像取得手順について説明する。
【００３３】
本手順では、顕微鏡装置１において、カメラ１４でウェル１０ａの底面全域に亘る試料２の画像を取得する際、駆動手段３２で照明光学系４を光軸に直交する面内（ＸＹ面内）を所定の移動量（ΔＸ、ΔＹ）移動して試料２の複数の画像をそれぞれ取得し、画像処理装置４０の画像処理部を内蔵するＰＣ４１により輝度値補正処理して輝度ムラを補正した画像を生成しモニタ４２に表示すると共にメモリ４４に保存する。以下、ステップ毎に説明する。なお、ＰＣ４１が画像処理を開始する前に観察者がステージ３上にウェルプレート１０を載置し、画像を取得するウェル１０ａを照明光学系４及び結像光学系５の光路に配置しているとする。
【００３４】
（ステップＳ１）
ＰＣ４１は、この位置でのウェル１０ａ底面全域（視野Ｓ）にわたる細胞画像Ｉ０（ｉ＝０）をカメラ１４で取得し不図示のバッファーメモリに保存する。また、ＰＣ４１は、対象とする画像Ｓ領域を画像処理部で輝度信号などの信号変化を検出して自動的に行う。なお、画像Ｓ領域の抽出は、観察者がモニタ４２の画像を見ながら抽出することもできる。
【００３５】
(ステップＳ２)
ＰＣ４１は、画像Ｉ０の各画素の輝度信号値分布から、輝度平均値μ、ノイズ分布σを計算し、閾値Ｔ＝μ＋３σを決定する。
【００３６】
(ステップＳ３)
ＰＣ４１は、決定した閾値Ｔにより画像Ｓ内で光量が異常となる面積Ｒ（ｉ）を算出する。算出結果の一例を図４（ａ）に示す。図４（ａ）では、左側部分に三日月状に光量異常領域Ｒｉが存在する場合を示している。また、ＰＣ４１は、ΔＲ（ｉ）＝Ｒ（ｉ）―Ｒ（ｉ−１）を算出する。ΔＲ（ｉ）は、今回取得した画像の光量異常面積とひとつ前に取得した光量異常面責との差分である。ｉ＝１の時はΔＲ（１）＝Ｒ（１）となる。
【００３７】
(ステップＳ４)
ＰＣ４１は、前もって決定してある最小光量許容面積Ｒ（ｍｉｎ）とステップＳ３で求めた光量異常面積Ｒｉの大小比較を行い、Ｒ（ｉ）＞Ｒ（ｍｉｎ）ならば次のステップＳ５を実行し、Ｒ（ｉ）≦Ｒ（ｍｉｎ）ならばステップＳ１２を実行する。Ｒ（ｍｉｎ）は、計測対象物（本願では細胞）の面積にほぼ等しい値に設定されるが、これに限られず任意の面積に設定することができる。
【００３８】
（ステップＳ５）
ＰＣ４１は、光量異常面積Ｒ（ｉ）がＲ（ｍｉｎ）より大きいので、照明光学系４をＸＹ面内で前もって決めてある所定移動量ΔＬ（ΔＸ、ΔＹ）加えた位置に移動する。
【００３９】
(ステップＳ６)
ＰＣ４１は、照明光学系４を所定量移動した後、この位置でカメラ１４を介して画像Ｉ（ｉ＋１）を取得する。
【００４０】
（ステップＳ７）
ＰＣ４１は、閾値Ｔを用いて光量異常面積ΔＲ（ｉ＋１）を算出するとともに、ΔＲ（ｉ）＝ΔＲ（ｉ＋１）―ΔＲ（ｉ）を算出する。この状態を図４（ｂ）に示す。Ｒ（ｉ＋１）は、一つ前のＲ（ｉ）より小さな領域となる。
【００４１】
（ステップＳ８）
ＰＣ４１は、ΔＲ（ｉ）と予め求められている光量異常面積閾値Ｔｒとを比較する。Ｒ（ｉ）＞Ｔｒならば次のステップＳ９を実行し、Ｒ（ｉ）≦ＴｒならばステップＳ５にもどりステップＳ５からステップＳ７を実行する。なお、光量異常面積閾値Ｔｒは視野Ｓのほぼ２５％程度の値を用いるが、これに限られず任意に設定できる。
【００４２】
（ステップＳ９）
ＰＣ４１は、カウンタｉが前もって決められているｉｍａｘ値に達したか否かを判断する。カウンタｉがｉｍａｘに達していなければステップＳ１０に、ｉｍａｘに達していればステップＳ１３を実行する。
【００４３】
（ステップＳ１０）
ＰＣ４１は、カメラ１４を介して再度画像を取得し、メモリ４４に保存する（ステップＳ１１）。またカウンタｉに１をプラスして（ｉ＝ｉ＋１）、ステップＳ２に戻る。以降ステップＳ２からステップＳ９を実行する。
【００４４】
（ステップＳ１２）
ＰＣ４１は、光量異常面積Ｒｉが予め設定したＲｍｉｎ以下となったのでほぼ光量異常面積がなくなったと判断する。そして、ＰＣ４１は、メモリ４４に保存してある画像Ｉｉ（Ｉ０、Ｉ１，・・・、Ｉｉ）を用いて、各画像の画素毎に輝度値を平均化する処理を行い視野Ｓの全域にわたって輝度が均一になった画像を生成して、モニタ４２に表示するとともにメモリ４４に保存し、観察者に画像処理が終了した旨の表示をして知らせる。
【００４５】
（ステップＳ１３）
ＰＣ４１は、カウンタｉがｉｍａｘを超えたことを観察者にアラーム表示をして知らせる。照明光学系４の移動量ΔＬ値が不適切（小さすぎた）で所定の反復回数では輝度均一画像の取得ができなかったので、観察者に照明光学系４の移動量ΔＬ値の変更を指示する表示をする。観察者は、新たな移動量ΔＬ（ΔＸ、ΔＹ）を設定し、再度ステップＳ１から実行するようにＰＣ４１に指示する。
【００４６】
以上のフローをＰＣ４１が実行することで、視野Ｓ全域にわたって輝度を均一にした画像を生成することができる。
【００４７】
なお、上記説明では、照明光学系４を光軸に直行する面内（ＸＹ平面）に移動する場合について説明したが、光軸方向（Ｚ軸）に移動しながら同様の処理を行ってもよいし、光軸を中心として回転（θ方向）しながら同様の処理を行うことで、輝度の均一な画像を生成することができる。
【００４８】
また、上記説明では照明光学系４をＸＹＺθ方向に移動する場合について述べたが、ステージ３からカメラ１４までを一体的に移動することでも上記と同様の効果を奏することができる。
【００４９】
（第２の方法）
上記方法では、顕微鏡装置１において、カメラ１４でウェル１０ａの底面全域に亘る試料２の画像を取得する際、照明光学系４をＸＹ面内でΔＬずつ移動して輝度値補正処理した輝度ムラ補正画像を生成したが、以後の説明では、照明光学系４を光軸を中心として回転し、得られた複数の画像の各画素を平均化処理して輝度ムラ補正画像を生成する場合について説明する。なお、ステージ３からカメラ１４までを回転しても同様の処理で輝度ムラを補正した画像を生成することができる。
【００５０】
図５（ａ）に示すように、画像処理装置４０のＰＣ４１は、駆動手段３２を駆動して、照明光学系４を光軸を中心として９０度ずつ回転して（例えばθ＝０、９０、１８０、２７０°）、各回転角度の画像をそれぞれ取得する。例えば９０度毎の場合、画像は４枚取得する。ＰＣ４１は、この取得した４枚の画像の各画素それぞれの輝度値の単純平均化処理を行い、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な画像を生成する。なお、等分割角度であれば回転角度は９０度に限らず任意の角度で良いことは言うまでもない。
【００５１】
詳説すると、ＰＣ４１は駆動手段３２を駆動して、画像を取得する角度に照明光学系４の回転角度を設定し、内蔵する検出手段で角度を検出し回転角度が設定し終わった後、カメラ１４で画像（θ＝０°）を取得してＰＣ４１のメモリ４４に記憶する。
【００５２】
続いて、ＰＣ４１は駆動手段３２を駆動して照明光学系４を次の回転角度（θ＝９０°）位置に回転し、この角度での画像をカメラ１４で取得してＰＣ４１のメモリ４４記憶する。
【００５３】
以降、ＰＣ４１は同様にしてθ＝１８０°、θ＝２７０°の画像をカメラ１４を介して取得してＰＣ４１のメモリ４４に記憶する。
【００５４】
ＰＣ４１は、４枚の画像が取得できたので補正画像生成処理を開始する。ＰＣ４１は内蔵されている画像処理部において、記憶されている４枚の画像の各画素の輝度値を用いて輝度値の単純平均化処理を行い、処理結果に基いて輝度ムラを補正した画像を生成しモニタ４２に表示する(図５（ｂ）参照)と共にメモリ４４に記憶する。なお、ここで用いられる単純平均化処理は、公知の手段あるいはプログラムを使用することができる。
【００５５】
このように、本実施形態の第２の方法にかかる顕微鏡装置１では、ＰＣ４１は照明光学系４を回転しながら複数枚の画像を取得して、取得した全画像を用いた単純平均化処理を行うことで、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な１枚の画像を生成しモニタ４２に表示することができる。
【００５６】
（第２の方法の変形例）
この変形例は、第２の方法と同様に、顕微鏡装置１において、カメラ１４でウェル１０ａの底面全域に亘る試料２の画像を取得する際、照明光学系４とステージ３から結像光学系５のカメラ１４の少なくとも一方を光軸を中心として回転しながら試料２の複数の画像をそれぞれ取得し、画像処理装置４０のＰＣ４１により後述する方法で輝度値補正処理して輝度ムラを補正した画像を生成する。
【００５７】
図３（ａ）に示すように、ＰＣ４１は駆動手段３２を駆動して照明光学系４を光軸を中心として９０度ずつ回転して（例えばθ＝０、９０、１８０、２７０°）、各回転角度の画像をそれぞれ取得する。９０度毎の場合、画像は４枚取得する。ＰＣ４１は、予め取得しておいた基準画像の輝度値とこの取得した４枚の画像とのそれぞれの輝度値のずれ量に応じた加重平均化処理を行い、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な画像を生成する。なお、等分割角度であれば回転角度は９０度に限らず任意の角度で良いことは言うまでもない。
【００５８】
ＰＣ４１は、駆動手段３２を駆動して画像を取得する角度に照明光学系４の回転角度を設定し、回転角度が設定し終わった後、カメラ１４で画像（θ＝０°）を取得してＰＣ４１のメモリ４４に記憶する。
【００５９】
以降、ＰＣ４１は、駆動手段３２を駆動して、θ＝９０°、θ＝１８０°、θ＝２７０°の画像をカメラ１４を介して取得してＰＣ４１のメモリ４４に記憶する。
【００６０】
ＰＣ４１は、４枚の画像が取得できたのでＰＣ４１は内蔵されている画像処理部において記憶されている基準画像の輝度値と取得した４枚の画像の各画素の輝度値から加重平均化処理を行い、処理結果に基いて輝度ムラを補正した画像を生成しモニタ４２に表示する(図３（ｂ）参照)と共にメモリ４４に記憶する。なお、ここで用いられる加重平均化処理は、公知の手段あるいはプログラムを使用することができる。
【００６１】
このように、本実施形態にかかる顕微鏡装置１では、ＰＣ４１は照明光学系４を回転しながら複数枚の画像を取得して、取得した全画像と予め取得しておいた基準画像の輝度値とから加重平均化処理を行うことで、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な画像を生成しモニタ４２に表示することができる。この第２の方法の変形例は、複数枚の画像に基づく加重平均化処理を行う分、従来に比べて輝度ムラ補正精度を向上させた画像を生成することができる。
【００６２】
このように、本実施形態にかかる顕微鏡装置１では、ＰＣ４１は照明光学系４を駆動しながら取得した画像の輝度ムラ領域を検出し、この輝度ムラ領域が所定の面積以下になるように照明光学系４を移動して取得した画像の各画素の輝度値を平均化処理することで、輝度の均一な画像を生成しモニタ４２に表示することができる。
【００６３】
また、本実施形態にかかる顕微鏡装置１では、ＰＣ４１は照明光学系４を駆動しながら複数枚の画像を取得して、取得した画像の１枚から基準となる輝度値を選択し加重平均化処理を行うことで、輝度ムラを良好に補正し輝度の均一な画像を生成しモニタ４２に表示することができる。
【符号の説明】
【００６４】
１ 顕微鏡
２ 試料
４ 照明光学系
５ 結像光学系
１０ ９６ウェルプレート
１１ 培養液
１２ 第１対物レンズ
１３ 第２対物レンズ
１４ カメラ
１８ コンデンサレンズ
１９ 開口絞り
２０ 可動絞り
２１ コレクタレンズ
２２ 光源
３２ 駆動手段
４０ 画像処理装置
４１ ＰＣ
４２ モニタ
４３ 入出力デバイス
４４ メモリ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステージに載置され、液体中に存在する被観察物を有する標本を照明する照明光学系と、
前記照明光学系の実効的な開口数よりも小さい開口数を有し、照明光で照明された前記標本の像を結像する結像光学系と、
前記結像の位置に配設された撮像装置と、
前記撮像装置の撮像面の輝度分布が変化するように前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動する駆動手段と、
前記撮像装置で撮像した前記標本の画像を処理する画像処理装置とを有し、
前記画像処理装置は、前記駆動手段で前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動して前記撮像装置を介して取得した前記標本の画像の輝度を略均一にした前記標本の新たな画像を生成することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記駆動手段は、前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を光軸を中心として回転することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記駆動手段は、前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を光軸に沿って移動することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記駆動手段は、前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を光軸に略垂直な方向に移動することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記標本の画像は、前記駆動に応じて複数取得され、
前記画像処理装置は、前記撮像装置の各画素に対する、複数の前記標本の画像それぞれの輝度値を平均化処理することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記画像処理装置は、前記撮像装置の各画素に対する、予め取得してある基準画像の輝度値と前記標本の画像の輝度値とのずれ量に基き加重平均処理することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１】
ステージに載置され、液体中に存在する被観察物を有する標本を照明する照明光学系と、
前記照明光学系の実効的な開口数よりも小さい開口数を有し、照明光で照明された前記標本の像を結像する結像光学系と、
前記結像の位置に配設された撮像装置と、
前記撮像装置の撮像面の輝度分布が変化するように前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動する駆動手段と、
前記撮像装置で撮像した前記標本の画像を処理する画像処理装置とを有し、
前記画像処理装置は、前記駆動手段で前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を駆動して前記撮像装置を介して取得した前記標本の画像の輝度を略均一にした前記標本の新たな画像を生成することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記駆動手段は、前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を光軸を中心として回転することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記駆動手段は、前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を光軸に沿って移動することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記駆動手段は、前記照明光学系または前記標本から前記撮像装置までのいずれか一方を光軸に略垂直な方向に移動することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記標本の画像は、前記駆動に応じて複数取得され、
前記画像処理装置は、前記撮像装置の各画素に対する、複数の前記標本の画像それぞれの輝度値を平均化処理することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記画像処理装置は、前記撮像装置の各画素に対する、予め取得してある基準画像の輝度値と前記標本の画像の輝度値とのずれ量に基き加重平均処理することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２２０５５８（Ｐ２０１２−２２０５５８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８３５９２（Ｐ２０１１−８３５９２）
【出願日】平成２３年４月５日（２０１１．４．５）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月５日（２０１１．４．５）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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