骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法及び弁別装置
【課題】フローサイトメトリーによる血液試料の測定において、血小板凝集の影響を受けることなく、骨髄芽球をより正確に弁別することができる弁別方法及び弁別装置を提供する。
【解決手段】血液学的試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させ、上記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と側方散乱光情報とに基づいて骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する。
【解決手段】血液学的試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させ、上記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と側方散乱光情報とに基づいて骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法及び弁別装置に関し、幼若白血球、特に骨髄芽球を血小板凝集と高精度に弁別することができる骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法及び弁別装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液の細胞成分は、血小板、白血球、及び赤血球に大別され、さらに白血球は、顆粒球（好酸球、好中球、及び好塩基球）、単球、及びリンパ球に分類される。
これらの細胞は、骨髄で作られ、未熟な細胞から分化・成熟し、末梢血に移動する。健常人の場合、顆粒球、単球、リンパ球といった正常な血液に含まれる白血球（以下、これらを「成熟白血球」ということがある）にまで成熟していない幼若な白血球（幼若白血球）が末梢血に出現することはないが、白血病、癌の骨髄転移、重症感染症などの患者の末梢血には、骨髄芽球などの幼若白血球が出現することがある。特に骨髄芽球を検出することは、上述の疾患を診断する上で重要である。
【０００３】
臨床検査、健康診断などにおいて採血した血液を自動的に測定する方法として、フローサイトメトリーを利用した測定方法が利用されている。フローサイトメトリーは、細胞膜や核などを蛍光染色した試料をフローセルに導入し、フローセルを通過する細胞に色素の励起光を照射して、フローセルを通過する個々の細胞から発される散乱光や蛍光に関する情報を取得し、これらの情報から細胞の種類や個数を測定する方法である。
【０００４】
フローサイトメトリーを用いた血液学的試料の測定方法において、血液に含まれる血球、さらには血球系疾患の場合に現れる幼若白血球や形態変化した血球などを、他の血球細胞と区別して、検出するための種々の方法が提案されている。
【０００５】
例えば、ＷＯ２００４／００１４０８（特許文献１）の技術によると、以下の（１）〜（３）のようにして血液中の血球が分類される。
（１）先ず前方散乱光ピークと前方散乱光幅を二軸とする二次元スキャッタグラムにおいて血小板凝集と、白血球及び赤血球ゴーストとを弁別する。
（２）次に、（１）において弁別された白血球及び赤血球ゴーストについて前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする二次元スキャッタグラムに展開し、白血球と、赤血球ゴーストとを弁別する。
（３）さらに、（２）において弁別された白血球について蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とする二次元スキャッタグラムに展開し、白血球を、リンパ球、単球、顆粒球、骨髄芽球、及び顆粒球系幼若球に細分類する。
【０００６】
特許文献１によると、上記（３）において、骨髄芽球を分類することができるが、血小板凝集を少量含む試料を測定した場合、（１）において血小板凝集が白血球及び赤血球ゴーストの領域に出現する可能性があり、（３）において骨髄芽球の領域に出現する可能性がある。このため、より精度良く骨髄芽球を測定する技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／００１４０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、フローサイトメトリーによる血液試料の測定において、血小板凝集の影響を受けず、骨髄芽球をより正確に弁別できる弁別方法及び弁別装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、成熟白血球の細胞膜に損傷を与えた血液学的試料をフローサイトメトリーに適用して得られる角度が異なる２種類の散乱光情報に基づいて骨髄芽球を含む細胞群を特定することにより血小板凝集の影響を排除することで、血小板凝集と区別して骨髄芽球を測定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法は、血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する方法であって、前記試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させる工程；前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する工程；及び前記前方散乱光情報と、前記側方散乱光情報とに基づいて前記骨髄芽球と前記血小板凝集とを弁別する工程；を含む。
好ましくは、前記収縮させる工程は、試料と、界面活性剤と、可溶化剤とを混合させる工程である。
より好ましくは、界面活性剤は、ポリオキシエチレンノニオン系界面活性剤である。
さらに好ましくは、可溶化剤は、サルコシン誘導体又はその塩である。
さらに好ましくは、前方散乱光情報は前方散乱光強度であり、側方散乱光情報は側方散乱光強度である。
また、本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別装置は、血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する装置であって、前記試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させる試料処理手段、前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する取得手段、及び、前記前方散乱光情報と、前記側方散乱光情報とに基づいて前記骨髄芽球と前記血小板凝集とを弁別する処理を実行する制御手段、を含む。
【００１１】
本発明にいう「幼若白血球」とは、通常骨髄に存在し、末梢血液に存在しない未成熟な細胞をいう。例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球をいう。前骨髄球、骨髄球、後骨髄球については、まとめて幼若顆粒球とすることもある。さらには、芽球以前の分化段階である、骨髄系幹細胞、好中球・マクロファージコロニー形成細胞、好酸球コロニー形成細胞等の白血球系の造血前駆細胞も本発明の幼若白血球の範囲に含む。
本発明にいう「成熟白血球」とは、成熟リンパ球、単球、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）のことをいう。
本発明にいう「血小板凝集」とは、血小板が２個以上凝集したものをいう。
本発明にいう「細胞膜の損傷」とは、細胞膜に特定の物質が通過できるような細孔があくことをいう。
本発明にいう「血液学的試料」とは、主に末梢血液をさすが、この他にも、骨髄液、アフェレーシス等によって回収された血液成分を含む試料、又は腹腔液、尿試料等の白血球成分を含む生体試料も好適な試料である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法は、フローサイトメトリーによる血液試料の測定により得られる２種類の散乱光情報を用いて細胞群を弁別するにあたり、血小板凝集の影響を排除して骨髄芽球を含む細胞群を特定することができるので、骨髄芽球を正確に弁別することができる。
本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別装置は、本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法を適用しているので、骨髄芽球を高精度に弁別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１細胞群を説明するためのスキャッタグラムである。
【図２】第２細胞群を説明するためのスキャッタグラムである。
【図３】第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を説明するためのスキャッタグラムである。
【図４】第３細胞群を説明するためのスキャッタグラムである。
【図５】第４細胞群を説明するためのスキャッタグラムである。
【図６】本発明の測定装置の外観の一例を示す図である。
【図７】本発明の測定装置に用いられるフローサイトメータの一例を示す図である。
【図８】本発明の測定装置に用いられる制御部の構成の一例を示すブロック図である。
【図９】本発明の測定装置で採用される情報処理の一例を示すフローチャートである。
【図１０】本発明の測定装置で採用される情報処理の他の例を示すフローチャートである。
【図１１】本発明の測定装置で採用される情報処理の他の例を示すフローチャートである。
【図１２】本発明の測定装置で採用される情報処理の他の例を示すフローチャートである。
【図１３】（ａ）は実施例１で調製した測定用試料を測定して得られた第１スキャッタグラムであり、（ｂ）は同測定用試料を測定して得られた第２スキャッタグラムである。
【図１４】実施例１について、第１細胞群と第２細胞群の双方に含まれる細胞について作成した第３スキャッタグラムである。
【図１５】（ａ）は実施例２で調製した測定用試料を測定して得られた第１スキャッタグラムであり、（ｂ）は同測定用試料を測定して得られた第２スキャッタグラムである。
【図１６】実施例２の測定用試料について、第１細胞群と第２細胞群の双方に含まれる細胞について作成した第３スキャッタグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の血液学的試料の測定方法は、血液学的試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させ、核酸を染色できる蛍光色素で染色処理する試料処理工程；前記処理がなされた試料に前記蛍光色素の励起光を照射することによって生じる第１散乱光情報と、第１散乱光とは角度の異なる散乱光に基づく第２散乱光情報と、蛍光情報とを取得する取得工程；取得した蛍光情報及び２種類の散乱光情報を用いて血小板凝集の影響が排除され、他の血球細胞と区別して骨髄芽球を含む細胞集団を特定する工程；特定できた骨髄芽球の細胞集団を骨髄芽球として計数する計数工程を含む。
【００１５】
以下、具体的に説明する。
〔血液学的試料の処理〕
本発明の測定方法における試料処理工程は、血液学的試料と以下に述べる処理試薬とを混合することにより行なわれることが好ましい。
前記処理試薬は、血液学的試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させ、核酸を染色できる試薬である。具体的には、試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤及び核酸を蛍光染色する蛍光色素を含む。
【００１６】
本発明で用いられる界面活性剤は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える。作用機序は明確ではないが、特定の細胞膜脂質構成成分の一部を抽出する（引き抜く）ことにより、細胞膜に特定の物質が通過できるだけの細孔をあける（これを損傷とよぶ）と考えられる。そして、蛍光色素は、界面活性剤により損傷を受けた細胞の内部にまで入り込んで核酸を染色することができる。
【００１７】
界面活性剤は、幼若白血球にも損傷を与えるが、赤血球や成熟白血球に比べて細胞の損傷に時間を要する。このため、血液学的試料と処理試薬との混合後の所定時間内では、未損傷の骨髄芽球や幼若顆粒球などよりも、損傷を与えられた成熟白血球の方が染色されやすい状態となっている。このような結果、骨髄芽球、幼若顆粒球は、損傷を受けて核が染色された成熟白血球と比べて、核を染める蛍光色素ではほとんど染色されないので、成熟白血球よりも蛍光強度が低くなる。
【００１８】
本発明で用いられる界面活性剤としては、ポリオキシエチレンノニオン系界面活性剤が挙げられる。具体的には、Ｒ１Ｒ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨで表されるノニオン界面活性剤である。式中、Ｒ１は炭素数９〜２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、Ｒ２は−Ｏ−又は−ＣＯＯ−又は
【００１９】
【化１】
であり、ｎは１０〜４０の整数である。
【００２０】
炭素数９〜２５のアルキル基としては、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシルテトラデシル等が挙げられる。炭素数９〜２５のアルケニル基としてはドデセニル、テトラデセニル等が挙げられる。炭素数９〜２５のアルキニル基としては、ドデシニル、ウンデシニル、ドデシニル等が挙げられる。
【００２１】
具体的には、ポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルなどが挙げられる。
【００２２】
界面活性剤は、水溶液の形態で用いることができる。例えば、ポリオキシエチレンノニオン系界面活性剤の水中濃度については、使用する界面活性剤の種類によって異なるが、前述のポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルでは、５〜５０ｇ／ｌ（好ましくは１５〜３５ｇ／ｌ）の範囲で使用できる。ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤は、疎水性基の炭素数が同じであれば、ｎの値が小さくなるほど細胞を損傷する力が強く、ｎの値が大きくなるほど弱くなる。また、ｎの値が同じであれば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて細胞を損傷する力が強くなる。その点を考慮し、上記の値を目安にして、必要な界面活性剤の濃度は実験により適宜求めればよい。
【００２３】
本発明で用いられる蛍光色素は、核酸を蛍光染色する色素である。細胞膜に損傷を与えられた成熟白血球に対しては、蛍光色素が細胞膜を通過して核を染めることができる。
【００２４】
具体的には、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、さらにモレキュラープローブ社から販売されているエチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３等が挙げられる。さらに光源として、Ｈｅ−Ｎｅ、赤色半導体レーザなどを使用する場合に好適な色素として、下記（１）式で示される色素を使用できる。
【００２５】
【化２】
式中、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基、Ｒ４は水素原子、アシル基、又は低級アルキル基、Ｒ５は水素原子又は置換されていてもよい低級アルキル基、Ｒ６は水素原子又は低級アルキル基、Ｒ７は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基、及びＺは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換された炭素原子、ｍは１又は２、Ｘはアニオンである。
【００２６】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７における低級アルキルとは、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基が挙げられ、中でも、メチル基、エチル基が好ましい。
Ｒ３及びＲ７における低級アルコキシ基としては、炭素数１〜６のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ基、エトキシ基が好ましい。なお、Ｒ３及びＲ７は、水素原子であることが好ましい。
Ｒ４におけるアシル基とは、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもアセチル基が好ましい。
Ｒ５における置換されていてもよい低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）等で置換されていてもよい低級アルキル基を意味し、中でも１個の水酸基で置換されたメチル基、エチル基が好ましい。
【００２７】
Ｚにおける低級アルキル基とは、Ｚとしては硫黄原子であることが好ましい。
Ｘ−におけるアニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ４−、ＢＣｌ４−、ＢＢｒ４−等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。中でも臭素イオン又はＢＦ４−が好ましい。
【００２８】
上記式（１）の色素の具体的例としては、以下の色素Ａ、色素Ｂ、色素Ｃが好適である。
【００２９】
【化３】
【００３０】
色素濃度は、使用する色素に応じて適宜決定できる。好ましくは、試薬中の濃度が０．０１〜５００ｐｐｍであり、より好ましくは０．１〜２００ｐｐｍである。
【００３１】
上述の界面活性剤により細胞膜は損傷して、細胞内の一部が細胞外に排出されることで細胞収縮が起る、あるいは細胞膜の表面状態の変化により細胞収縮が起るが、白血球以外の血球、特に赤血球を、有用な散乱光情報及び蛍光情報を提供しないゴースト集団とするために、損傷した細胞を十分に収縮させるための可溶化剤を含むことが好ましい。
【００３２】
可溶化剤としては、具体的には、下記（２）式で表されるサルコシン誘導体あるいはその塩；
【００３３】
【化４】
（式中、Ｒ１０は炭素数１０〜２２のアルキル基、ｐは１〜５の整数である。）
下記（３）式で表されるコール酸誘導体；
【００３４】
【化５】
（式中、Ｒ１１は水素原子又は水酸基）
及び下記（４）式
【００３５】
【化６】
（式中、ｑは５〜７）
で表されるメチルグルカンアミドから選択される１又はそれ以上を用いることができる。
【００３６】
炭素数１０〜２２のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイル等が挙げられる。
【００３７】
具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシン、ＣＨＡＰＳ（３−〔３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−〔３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）等が挙げられる。
【００３８】
可溶化剤の濃度は、サルコシン酸誘導体あるいはその塩では、０．２〜２．０ｇ／ｌ、コール酸誘導体では０．１〜０．５ｇ／ｌ、メチルグルカンアミドでは１．０〜８．０ｇ／ｌが好ましい。
【００３９】
可溶化剤として、上記以外に、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレートやＮ−ホルミルメチルロイシルアラニン等を用いてもよく、０．０１〜５０．０ｇ／ｌの濃度で用いることが好ましい。
【００４０】
さらに、試薬のｐＨを調節するためのｐＨ調節剤および緩衝液を含有することが好ましく、更に必要に応じて浸透圧調整剤を含有することが好ましい。
【００４１】
緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液やリン酸緩衝液等が用いられる。ｐＨ調節剤としては、水酸化ナトリウムなどが用いられる。浸透圧調節剤としては、糖、アミノ酸、有機溶媒、塩化ナトリウムなどが用いられる。糖としては、グルコース、キシリトールマンニトール、アラビノース、リビトールなどを用いることができる。アミノ酸としては、アラニン、プロリン、グリシン、バリンなどを用いることができる。有機溶媒としては、エチレングリコール、グリセリンなどを用いることができる。試薬中の浸透圧調節剤の濃度は、分子量により適宜調節されるが、例えばキシリトールを用いる場合は１０〜７５ｇ／ｌが好ましく、グリセリンを用いる場合は５〜４５ｇ／ｌが好ましく、グリシンを用いる場合は５〜４５ｇ／ｌが好ましい。
【００４２】
以上のような組成を有する処理試薬は、ｐＨ５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇとするのが好ましい。
【００４３】
尚、処理試薬は、界面活性剤、色素、その他の成分を含有する一液型の試薬であってもよいし、蛍光色素を含む染色液と、上述の界面活性剤を含む溶液（溶血剤）とを別々の容器に収容し、これらを備えた試薬キットとすることもできる。この場合、色素の保存安定性を高めるために、蛍光色素の溶媒としてエチレングリコール等の水溶性有機溶媒を用いることが好ましい。
【００４４】
〔測定用試料の調製〕
上記処理試薬を含む溶液と血液学的試料を混合することにより、測定用試料を調製することができる。上述の試薬キットを使用する場合には、まず、界面活性剤を含む溶液（溶血剤）と血液学的試料とを混合し、次いで染色液を混合して、測定用試料としてもよい。
【００４５】
血液学的試料と処理試薬との混合は、試料：処理試薬の比が１：１０〜１：１０００、反応温度が２０〜４０℃であることが好ましく、反応時間は、３秒〜５分間、より好ましくは４秒〜１分である。
【００４６】
このようにして調製される測定用試料において、赤血球及び成熟白血球は、細胞収縮してサイズが小さくなっている。特に、赤血球は核がないため、細胞膜損傷による溶血、細胞収縮が進み、蛍光色素による染色もされないことから、前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光のいずれも小さくなり、ゴースト集団として扱うことができる。
【００４７】
一方、成熟白血球は、試料と試薬とを所定の時間反応させると細胞膜が損傷することによって細胞収縮するが、核は実質的に収縮しないため、赤血球ほど小さくならない。さらに、損傷した膜を蛍光色素が透過することができるので、核が染色される。
【００４８】
幼若白血球は、成熟白血球や赤血球に比べて溶血剤に対して耐性を有するので、細胞膜の損傷に時間がかかる。従って、所定の反応時間内では細胞収縮が実質的におこらず、また蛍光色素が透過できないので、核もほとんど染色されない。
【００４９】
個々の血小板細胞については、処理試薬によって幼若白血球と同様に膜損傷に時間を要し、また色素が血小板内に進入して血小板自体を染色することもないが、血小板凝集体の場合、凝集体の周囲に色素が物理的吸着して、染色される。
【００５０】
〔散乱光情報及び蛍光情報の取得〕
調製した測定用試料をフローサイトメータで測定して、試料中に含まれる細胞、血小板などの散乱光情報及び蛍光情報を取得する。
【００５１】
情報の取得は、測定用試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、前記フローセル内を流れる試料に前記蛍光色素を励起できる励起光を照射することにより行なうことが好ましい。これにより、フローセルを通過する細胞から発される散乱光情報及び蛍光情報を取得することができる。
【００５２】
照射光は、使用する蛍光色素を励起することができる波長の光を含む。使用するフローサイトメータに備え付けられている光源の光の波長に応じて、その光で励起できる蛍光色素を選択してもよい。
散乱光情報は、角度の異なる２種類の散乱光を取得する。具体的には前方散乱光と側方散乱光の組合わせが好ましく用いられる。
【００５３】
ここで、前方散乱光とは、細胞のサイズが反映された情報と考えられる。つまり、細胞が大きいと前方散乱光も大きい。側方散乱光とは、前方散乱光に対して、角度が８０〜１００度、好ましくは８５〜９５度異なる散乱光である。側方散乱光からは、細胞の内部情報、特に核の情報を得ることができる。顆粒を含んでいたり、核の形がいびつな場合には側方散乱光は大きくなる傾向にある。
【００５４】
所定の反応時間内では、蛍光色素は血小板の内部には殆ど進入できないため、血小板自体が殆ど染色されることはない。しかしながら、蛍光色素は血小板凝集体の周囲や血小板同士が接着している部分に結合するため、測定用試料において、凝集体が大きくなると蛍光強度が大きくなる。一方、血小板凝集が少なく凝集体が小さいときには、側方散乱光強度は小さくなり、付着する蛍光色素は少なくなるので、結果として蛍光強度も小さくなる。
【００５５】
〔細胞群の特定及び骨髄芽球の計数〕
取得した散乱光情報及び蛍光情報を用いて、目的の細胞群を特定し、骨髄芽球を計数する。本発明の測定方法は、特定工程の見地から、以下の第１の測定方法〜第４の測定方法に分類できる。以下、順に説明する。
【００５６】
（１）第１の測定方法
第１の測定方法では、取得した第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第１細胞群を特定し（第１特定工程）、取得した第１散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第２細胞群を特定し（第２特定工程）、第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数する。第１特定工程と第２特定工程の順序はいずれが先であってもよい。
【００５７】
（１−１）第１細胞群
第１細胞群は、取得された２種類の散乱光情報、好ましくは前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づいて特定される。第１細胞群は、この２種類の散乱光情報を二軸とするスキャッタグラム（第１スキャッタグラム）中で、骨髄芽球が出現すると考えられる領域を設定することにより特定されることが好ましい。また、検体によって骨髄芽球の染色の程度や大きさが異なるため、第１細胞群が出現する領域の設定は検体毎に行なわれることが好ましい。
【００５８】
第１細胞群が出現する領域の具体的設定方法として、まず、２種類の散乱光情報を二軸とするスキャッタグラム中に骨髄芽球が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、この集団の中心を特定する。骨髄芽球の細胞集団の中心から、他の細胞集団の出現領域までの間で、骨髄芽球細胞集団の細胞が出現している部分までを、第１細胞群の出現領域の境界として決定することができる。同様にして、他の細胞集団（幼若顆粒球、顆粒球、リンパ球、単球）が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、各集団の中心を特定するとともにその出現領域を特定する。これらの領域は、使用する色素、
濃度に応じて、種々のサイズの骨髄芽球について蓄積されたデータから、予め領域を設定しておいてもよい。
【００５９】
本発明で用いられる測定用試料を、縦軸に前方散乱光強度（第１散乱光情報）、横軸に側方散乱光強度（第２散乱光情報）を二軸とするスキャッタグラム中で、各細胞が出現すると考えられる領域を設定すると、一般に図１のようになる。図１中、「Ｂｌａｓｔ」は骨髄芽球出現領域であり、「ＩＧ」は幼若顆粒球出現領域、「Ｇｒａｎ」は顆粒球出現領域、「Ｌｙ」はリンパ球出現領域、「Ｍｏ」は単球の出現領域である。
【００６０】
骨髄芽球は、側方散乱光強度が弱いため、スキャッタグラム中、比較的左側の領域に現れる。一方、顆粒球、幼若顆粒球は、その核の形態のいびつさなどから、比較的側方散乱光が大きい右側に出現するので、これらの集団は骨髄芽球出現領域とは離れた領域に出現することになる。従って、第１細胞群の出現領域としては、Ｂｌａｓｔ部分を囲むような一点鎖線で示す領域を設定すればよい。
【００６１】
血小板凝集は、凝集の仕方が多岐にわたることから、側方散乱光強度も小さいものから大きいものまであり、また、凝集体の大きさも数個〜数１０個と様々であることから、前方散乱光強度も小さいものから大きいものまで存在する。但し、凝集体のサイズといびつさには相関性があることから、図１に示すスキャッタグラムにおいて、左下から右上に向けた領域（点線で囲まれた領域）に現れることになり、Ｂｌａｓｔの領域（第１細胞群の出現領域）と重なることはない。
【００６２】
図１によれば、第１細胞群は、血小板凝集や他の血球成分と区別されているので、第１細胞群を骨髄芽球として計数することが可能とも考えられる。しかしながら、試料によってはサイズが大きいリンパ球が含まれることがあり、稀であるが、リンパ球の出現領域の一部が第１細胞群の出現領域に重なることがある。
【００６３】
（１−２）第２細胞群
第２細胞群は、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報、好ましくは、前方散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定される。第２細胞群は、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラム（第２スキャッタグラム）中で骨髄芽球が出現すると考えられる領域に含まれる細胞集団である。
【００６４】
骨髄芽球や幼若顆粒球は、所定の反応時間内では処理試薬による膜損傷が実質的にないので、核染色されず、蛍光強度が低い左側領域に出現する。従って、骨髄芽球が出現すると考えられる領域には、幼若白血球も出現することがある。一方、顆粒球、リンパ球、単球は、所定の反応時間で処理試薬による膜損傷を受けて核染色されるので、蛍光強度が高い右側領域に出現することになり、所定の反応時間内では実質的に核染色されない幼若白血球の集団とは明確に区別できる。すなわち、骨髄芽球を含む幼若白血球の出現領域には、成熟白血球は実質的には出現しない。
【００６５】
従って、第２細胞群の出現領域の具体的特定方法としては、まずスキャッタグラム中で骨髄芽球が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、この集団の中心を特定する。骨髄芽球の細胞集団の中心から、成熟白血球の細胞集団の細胞集団の出現領域までの間で、骨髄芽球細胞集団の細胞が出現している部分までを、第２細胞群の出現領域の境界として決定することができる。同様にして、他の細胞集団（幼若顆粒球、顆粒球、リンパ球、単球）が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、各集団の中心を特定するとともにその出現領域を特定する。これらの領域は、使用する色素、濃度に応
じて、種々のサイズの骨髄芽球について蓄積されたデータから、予め領域を設定しておいてもよい。
【００６６】
具体的には、図２に示すように、蛍光強度を横軸、前方散乱光強度を縦軸とするスキャッタグラムにおいて、第２細胞群は、蛍光強度が低い左側領域の一点鎖線で囲まれた領域に含まれる集団となる。図２中、「Ｂｌａｓｔ」は骨髄芽球出現領域であり、「ＩＧ」は幼若顆粒球出現領域、「Ｇｒａｎ」は顆粒球出現領域、「Ｌｙ」はリンパ球出現領域、「Ｍｏ」は単球出現領域である。
【００６７】
尚、血小板凝集の染色は、物理的に吸着する程度なので、左側領域に出現する。また、凝集の程度により、骨髄芽球よりも小さなサイズから大きいサイズがのものが存在し得るので、図２のように、前方散乱光強度が小さいところから、大きいところまで、縦長に伸びた領域に出現する。
【００６８】
（１−３）骨髄芽球の計数
以上のようにして特定した第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数する。
【００６９】
第１細胞群に含まれる可能性があるリンパ球は、第２細胞群には含まれていない。一方、第２細胞群に含まれる可能性がある血小板凝集、幼若白血球は、第１細胞群には含まれていない。従って、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞は、リンパ球、血小板凝集、幼若白血球を含まず、実質的に骨髄芽球だけであるといえる。よって、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数することで、正確に骨髄芽球を計数することができる。
【００７０】
尚、前記第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれる細胞を、蛍光情報及び第２散乱光情報を二軸とするスキャッタグラム（第３スキャッタグラム）中に展開してもよい。この第３スキャッタグラムに出現する細胞は、実質的に骨髄芽球のみの集団である。
【００７１】
第１散乱光情報は、好ましくは前方散乱光強度であり、第２散乱光情報は好ましくは側方散乱光強度である。第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞について、蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラム（第３スキャッタグラム）に展開すると、例えば図３に示すようなスキャッタグラムが得られる。このスキャッタグラムには、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞、すなわち実質的に骨髄芽球だけが出現していることになるから、ここに出現した細胞を骨髄芽球として計数することもできる。
【００７２】
（２）第２の測定方法
第１の測定方法及び第２の測定方法では、第１特定工程及び第２特定工程を個別に行なって、第１細胞群及び第２細胞群をそれぞれ特定したが、第１細胞群（又は第２細胞群）を先に特定し、次いで第２細胞群（又は第１細胞群）を、先に特定した第１細胞群（又は第２細胞群）の中から特定するようにしてもよい。
すなわち、第２の測定方法は、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第２細胞群を特定し（第２特定工程）、次いで、特定した第２細胞群の第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、前記第２細胞群の中から第１細胞群を特定して(第２の測定方法に特化して言及する場合には、この特定工程を「第１’特定工程」、第１’特定工程で特定される第１細胞群を「第１’細胞群」という）、この第１’細胞群を骨髄芽球として計数する。あるいは取得した第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第１細胞群を特定し（第１特定工程）、次いで特定した第１細胞群の第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、前記第１細胞群の中から第２細胞群を特定し(第２の測定方法に特化して言及する場合には、この特定工程を「第２’特定工程」、第２’特定工程で特定される第２細胞群を「第２’細胞群」という）、この第２’細胞群を骨髄芽球として計数する。
【００７３】
第１特定工程及びそこで特定される第１細胞群、第２特定工程及びそこで特定される第２細胞群は、それぞれ取得工程で取得した散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定され、その具体的手法は、上記第１の測定方法と同様であるから、説明を省略する。
【００７４】
（２−１）第２’細胞群の特定と骨髄芽球の計数
第２’特定工程は、先に特定した第１細胞群の第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び蛍光情報（好ましくは蛍光強度）に基づいて、前記第１細胞群の中から、骨髄芽球を含む集団を特定する（第２’細胞集団の特定）。このようにして特定される第２’細胞群は、第１測定方法及び第２測定方法における第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞に該当する。
【００７５】
第２’細胞集団の特定は、具体的には次のようにして行なわれる。
先ず第１散乱光情報及び第２散乱光情報を軸とするスキャッタグラム（第１スキャッタグラム）を作成し、このスキャッタグラムに全ての有形成分（細胞、血小板等）を展開する。この第１のスキャッタグラム中で骨髄芽球の候補領域を設定し、この領域内に出現する第１細胞群を特定する。次に、第１散乱光情報及び蛍光情報を二軸とするスキャッタグラム（第２’スキャッタグラム）を作成し、このスキャッタグラムに第１細胞群のみ展開する。第２’スキャッタグラム中で、骨髄芽球が出現すると考えられる領域に含まれる細胞集団が、第２’細胞群である。第１散乱光情報及び蛍光情報を二軸とする第２’スキャッタグラムでは、成熟白血球と幼若白血球とが明確に区別されるので、たとえ第１細胞群にリンパ球が含まれていたとしても、第２’スキャッタグラムに展開された第２’細胞群には、リンパ球が含まれない。即ち、第２’細胞群は、実質的に血小板凝集、リンパ球などの他の成分を含まない骨髄芽球の集団である。従って、第２’細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数すればよい。
【００７６】
（２−２）第１’細胞群の特定及び骨髄芽球の計数
第１’特定工程は、先に第２特定工程により第２細胞群を特定し、特定した第２細胞群の第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び第２散乱光情報（好ましくは側方散乱光強度）に基づいて、前記第２細胞群の中から、骨髄芽球を含む集団を特定する（第１’細胞集団の特定）。このようにして特定される第１’細胞群は、第１測定方法及び第２測定方法における第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞に該当する。
【００７７】
第１’細胞集団の特定は、具体的には次のようにして行なわれる。
先ず、取得した第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び蛍光情報（好ましくは蛍光強度）を、第１散乱光情報及び蛍光情報を二軸とするスキャッタグラム（第２スキャッタグラム）を作成し、このスキャッタグラムに全ての有形成分（細胞、血小板等）を展開する。この第２スキャッタグラム中で骨髄芽球を含む第２細胞群の候補領域を特定する。次に、第１散乱光情報及び第２散乱光情報を二軸とするスキャッタグラム（第１’スキャッタグラム）を作成し、このスキャッタグラムに上記で特定した第２細胞群のみを展開する。第１’スキャッタグラム中で、骨髄芽球が出現すると考えられる領域に含まれる細胞集団が、第１’細胞群である。第１散乱光情報及び第２散乱光情報を二軸とする第１’スキャッタグラムでは、幼若白血球及び血小板凝集が、骨髄芽球が出現する領域とは明確に区別できる領域に出現するので、第１’細胞群には、実質的に血小板凝集、リンパ球、幼若白血球などの他の成分は含まなれない。従って、第１’細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数すればよい。
【００７８】
（３）第３の測定方法
第１及び第２の測定方法では、第１細胞集団（又は第１’細胞集団）及び第２細胞集団（又は第２’細胞集団）の特定にあたり、いずれの特定工程においても、２種類の情報に基づいて、それぞれの細胞集団を個別に特定した後、第１細胞集団に含まれ且つ第２細胞集団に含まれる細胞集団を特定し、これを骨髄芽球として計数したが、本発明の血液学的試料の測定方法は、取得した第１散乱光情報、第２散乱光情報、及び蛍光情報を用いて、第１細胞集団と第２細胞集団を単一の工程で特定し、第１細胞集団及び第２細胞集団の双方に含まれる細胞を決定し、それを骨髄芽球として計数してもよい。
【００７９】
すなわち、第３の測定方法では、取得した第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて骨髄芽球を含む第１細胞群を特定するとともに、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて骨髄芽球を含む第２細胞群を特定し、第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数する。
【００８０】
具体的には、第１の散乱光情報、第２の散乱光情報、及び蛍光情報を三軸とする三次元のスキャッタグラムに展開し、第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び第２散乱光情報（好ましくは側方散乱光強度）に基づいて骨髄芽球を含む第１細胞群を特定するとともに、第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び蛍光情報（好ましくは蛍光強度）に基づいて骨髄芽球を含む第２細胞群を特定する。このときの第１細胞群の特定方法、第２細胞群の特定方法は、第１の測定方法の場合と同様にして行なうことができる。要するに、三次元のスキャッタグラムにおいて、第１細胞群の特定と第２細胞群の特定を同時に行なうことができ、さらに第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を特定することができる。第１の測定方法で述べたように、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞は、実質的に血小板凝集、リンパ球等の他の細胞成分を含んでいない。従って、三次元スキャッタグラムで、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を、骨髄芽球として計数すれば、高精度に骨髄芽球を計数できる。
【００８１】
（４）第４の測定方法
第４の測定方法は、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定する細胞群として、骨髄芽球を含む第２細胞群に代えて、ゴースト集団以外の細胞（本発明で用いられる測定用試料においては、赤血球は細胞収縮によりゴースト集団となっているので、実質的に全白血球）を含む第３細胞群を特定した場合に適用される方法である。
【００８２】
すなわち、第４の測定方法では、取得した第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第１細胞群を特定し（第１特定工程）、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、全白血球を含む第３細胞群を特定し（第３特定工程）、前記第３細胞群の第２散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、前記第３細胞群の中から、少なくとも成熟白血球を実質的に含まない第４細胞群を特定し（第４特定工程）、前記第１細胞群に含まれ且つ前記第４細胞群に含まれる細胞を計数する。
【００８３】
第１特定工程及び第１細胞群は、第１の測定方法と同様であるから、説明を省略する。
（４−１）第３特定工程及び第３細胞群
第３細胞群は、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムにおいて、赤血球ゴースト集団が出現する領域を除いた領域に出現する細胞集団、すなわち実質的に全白血球の集団である。具体的には、蛍光強度を横軸、前方散乱光強度を縦軸とするスキャッタグラムを描いた場合に、図４に示すように、一点鎖線で囲まれる領域に出現する細胞集団が、第３細胞群となる。尚、第３細胞群の出現領域には、図２で示したように、血小板凝集も含まれていることになる。
【００８４】
（４−２）第４特定工程及び第４細胞群
第４細胞群は、第３細胞群の第２散乱光情報及び蛍光情報、好ましくは側方散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定される。蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラム中に第３細胞群を展開した場合、成熟白血球が出現する領域と幼若白血球が出現する領域とが明確に区別されるので、蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラム中で骨髄芽球が含まれると考えられる領域を特定すれば、幼若白血球を含む細胞集団、さらには骨髄芽球を含む集団の出現領域を特定することができる。ここでの骨髄芽球の候補領域の特定は、第１細胞群や第２細胞群の特定と同様に、検体毎に行なわれることが好ましい。また、使用する色素、濃度に応じて、種々のサイズの骨髄芽球、成熟白血球について蓄積されたデータから、予め設定しておいてもよい。
【００８５】
側方散乱光強度を横軸、蛍光強度を縦軸とするスキャッタグラムにおいて、第３細胞群を展開すると、図５に示すように、成熟白血球（リンパ球、単球、及び顆粒球）は、核が染色されているので上方に出現し、実質的に核染色されない幼若白血球と明確に区別できる。成熟白血球は、核の形態等に応じて、左側から順にリンパ球集団（Ｌｙ）、単球集団（Ｍｏ）、顆粒球集団（Ｇｒａｎ）となって出現する。血小板凝集は、下方に、左側から右側にかけて出現する。従って、側方散乱光強度が低い左側領域で、蛍光強度の比較的低い位置から中程度に位置する、骨髄芽球を含む一点鎖線で囲まれた領域内の細胞集団を第４細胞群として特定すればよい。骨髄芽球と幼若顆粒球とは、核の形態、複雑性が異なるので、側方散乱光強度の大きさで両者を区別することが可能であるが、両者を明確に区別するためのゲーティングが困難なときは、骨髄芽球と幼若顆粒球の双方が含まれる幼若顆粒球の出現領域に含まれる細胞集団を第４細胞群としてもよい。
【００８６】
（４−３）骨髄芽球の特定及び計数
以上のようにして特定された第１細胞群に含まれ且つ第４細胞群に含まれる細胞を計数する。第１細胞群は血小板凝集が含まれておらず、第４細胞群には成熟白血球が含まれていないので、第１細胞群に含まれ且つ第４細胞群に含まれる細胞は、実質的に血小板凝集、成熟白血球が含まれない骨髄芽球あるいは幼若白血球の集団である。すなわち、たとえ第１細胞群にリンパ球が含まれていたとしても、第１細胞群に含まれ且つ第４細胞群に含まれる細胞には、リンパ球が除かれているので、実質的に骨髄芽球あるいは幼若白血球を、高精度に計数することができる。
【００８７】
〔弁別方法〕
本発明の血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する方法は、本発明の測定方法における試料処理工程；前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する工程；及び前記前方散乱光情報と前記側方散乱光情報とに基づいて、骨髄芽球を含む第１細胞群を特定することで、骨髄芽球を含む細胞集団と血小板凝集とを弁別する方法である。
【００８８】
上述のように、前方散乱光情報と側方散乱光情報とを二軸とするスキャッタグラムにおいて、骨髄芽球が出現すると考えられる領域を特定した場合、血小板凝集が出現すると考えられる領域とは明確に区別されているので、血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別することができる。
【００８９】
〔血液学的試料の測定装置〕
本発明の測定装置は、血液学的試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させ、核酸を染色できる蛍光色素で染色処理する試料処理手段；前記処理がなされた試料に前記蛍光色素の励起光を照射することによって生じる第１散乱光情報と、第１散乱光とは角度の異なる散乱光に基づく第２散乱光情報と、蛍光情報とを取得する取得手段；前記第１散乱光情報及び前記第２散乱光情報に基づいて骨髄芽球を含む第１細胞群を特定する第１特定手段；前記第１散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて骨髄芽球を含む第２細胞群を特定する第２特定手段；及び前記第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数する計数手段を含む。
【００９０】
本発明の測定装置は、その外観として、例えば図６に示すような外観を有している。
図６に示す装置は、測定部１と、解析部２と、解析部２と測定部１とを接続する信号ケーブル３とを有する。測定部１に本発明の装置の試料処理手段及び取得手段が含まれ、解析部２に本発明の第１特定手段、第２特定手段及び計数手段が含まれる。
測定部１は、操作者が各種設定入力を行うための液晶タッチパネル１０、測定動作を開始するためのスタートスイッチ１１、及び検体を吸引するためのプローブ１２を備えている。また、測定部１の内部には、図７に示されるようなフローサイトメータが搭載されている。解析部２は、測定部１から送信された情報の処理や、測定部１の動作を制御する制御部６と、各種測定結果などを表示する表示部たる出力部７と、操作者が検体情報等を入力するためのキーボード８とを備えている。
【００９１】
次に、図７に示されるフローサイトメータについて説明する。
光源（例えば赤半導体レーザ：波長６３３ｎｍ）２１から出射されたビームは、コリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。ノズル２０から吐出されたオリフィス部を通過する血球から発せられる前方散乱光は集光レンズ２４とピンホール板２５を介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。一方、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８を介して側方散乱光検出器（フォトマルチプライアチューブ）２９に入射する。また、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２８’とピンホール板３０を介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２，３３，３４により増幅され、制御部６に入力される。
【００９２】
なお、前記光源２１は、試料の処理に用いた色素を励起できる光を、調製した測定用試料を導入したフローセルのオリフィス部に光を照射するもので、試料中の血球を染色する蛍光色素に応じたものが選ばれる。従って、使用する蛍光色素の種類により、赤色半導体レーザの他、例えば、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、青色半導体レーザなどが用いられてもよい。
【００９３】
図８は、制御部６の構成を示すブロック図である。この制御部６は、CPU６aと、ROM６ｂと、RAM６ｃと、ハードディスク６ｄと、入出力インタフェース６eと、画像出力インタフェース６ｆと、通信インタフェース６ｇとから主として構成されており、ＣＰＵ６a、ＲＯＭ６ｂ、ＲＡＭ６ｃ、ハードディスク６ｄ、入出力インタフェース６e、出力インタフェース６ｆ、および通信インタフェース６ｇは、バス６ｈによってデータ通信可能に接続されている。
【００９４】
ＣＰＵ６aは、ＲＯＭ６ｂ及びハードディスク６ｄに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ６ｃに読み出されたコンピュータプログラムを実行することが可能である。従って、測定部１、具体的にはフローサイトメータから入力された前方散乱光信号、側方散乱光信号、及び蛍光信号に基づいて、設定されたプログラムの演算処理を行ない、第１細胞群、第２細胞群といった細胞群を特定し、さらに骨髄芽球を計数する。
【００９５】
ＲＯＭ６ｂは、ＣＰＵ６aに実行させるためのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータ等を記憶している。ＲＡＭ６ｃは、ＲＯＭ６ｂ及びハードディスク６ｄに記憶されているコンピュータプログラムの読み出し、及びコンピュータプログラムを実行するときのＣＰＵ６aの作業領域に用いられる。ハードディスク６ｄは、ＣＰＵ６aに実行させるためのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータを記憶している。このコンピュータプログラムは、光学的情報を分析し、分析結果を出力するための機能を果たす。
【００９６】
入出力インタフェース６eには、キーボード８が接続されている。入力部たるキーボード８は、出力画面上における操作等のために設けられている。出力インタフェース６ｆは、液晶ディスプレイからなる出力部７に接続されている。出力部７は、制御部６で得られた分析結果を出力表示する等のために設けられている。通信インタフェース６ｇは、測定部１に接続されており、光学的情報を受信するための機能を果たす。
【００９７】
次に、制御部６における情報処理の実施態様について説明する。
図９は、本発明の第１の測定方法に対応する情報処理を示すフローチャートである。制御部６が第２の測定方法を採用している場合、まず、測定部１で検出された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を、信号ケーブル３を介して受信する（ステップＳ１）。制御部６はこれらの信号を解析し、それぞれの信号強度を算出する（ステップＳ２）。次に、試料中の有形成分（細胞や血小板など）の前方散乱光強度及び側方散乱光強度を用い、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を二軸とする第１スキャッタグラムを作成する（ステップＳ３）。第１スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候
補領域を設定し、この領域内に含まれる第１細胞群を特定する（ステップＳ４）。また、試料中の有形成分の前方散乱光強度及び蛍光強度を用い、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第２スキャッタグラムを作成する（ステップＳ５）。第２スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この領域内に含まれる第２細胞群を特定する（ステップＳ６）。次いで、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞の蛍光強度及び側方散乱光強度を用いて、蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とする第３スキャッタグラムを作成する（ステップＳ７）。この第３スキャッタグラムに出現する細胞（第１細胞群に含まれ、且つ第２細胞群にも含まれる細胞）を骨髄芽球として計数し（ステップＳ８）、この計数結果と第３スキャッタグラムとを出力部７に出力する（ステップＳ９）。
【００９８】
図１０は、本発明の第２の測定方法のうち、第１細胞群を先に特定する方法に対応する情報処理を示すフローチャートである。制御部６がこのような第２の測定方法を採用している場合、先ず、測定部１で検出された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を、信号ケーブル３を介して受信する（ステップＳ１）。制御部６はこれらの信号を解析し、それぞれの信号強度を算出する（ステップＳ２）。次に、試料中の有形成分（細胞や血小板など）の前方散乱光強度及び側方散乱光強度を用い、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を二軸とする第１スキャッタグラムを作成する（ステップＳ３）。第１スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この領域内に含まれる第１細胞群を特定する（ステップＳ４）。また、第１細胞群の前方散乱光強度及び蛍光強度を用い、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラム（第２’スキャッタグラム）を作成する（ステップＳ５）。第２’スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この候補領域に含まれる第２’細胞群を特定する（ステップＳ６）。この第２’細胞群を骨髄芽球として計数し（ステップＳ７）、この計数結果と第２’スキャッタグラムを出力部７に出力する（ステップＳ８）。
【００９９】
図１１は、本発明の第２の測定方法のうち、第２細胞群を先に特定する方法に対応する情報処理を示すフローチャートである。制御部６がこのような第２の測定方法を採用している場合、先ず、測定部１で検出された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を、信号ケーブル３を介して受信する（ステップＳ１）。制御部６はこれらの信号を解析し、それぞれの信号強度を算出する（ステップＳ２）。次に、試料中の有形成分（細胞や血小板など）の前方散乱光強度及び蛍光強度を用い、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第２スキャッタグラムを作成する（ステップＳ３）。第２スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この領域内に含まれる第２細胞群を特定する（ステップＳ４）。次に、第２細胞群の前方散乱光強度及び側方散乱光強度を用い、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラム（第１’スキャッタグラム）を作成する（ステップＳ５）。第１’スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この候補領域内に含まれる第１’細胞群を特定する（ステップＳ６）。この第１’細胞群を骨髄芽球として計数し（ステップＳ７）、この計数結果と第１’スキャッタグラムを出力部７に出力する（ステップＳ８）。
【０１００】
図１２は、本発明の第３の測定方法に対応する情報処理を示すフローチャートである。制御部６がこのような第３の測定方法を採用している場合、先ず、測定部１で検出された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を、信号ケーブル３を介して受信する（ステップＳ１）。制御部６はこれらの信号を解析し、それぞれの信号強度を算出する（ステップＳ２）。次に、試料中の有形成分（細胞や血小板など）の前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度を三軸とする三次元スキャッタグラムを作成する（ステップＳ３）。この三次元スキャッタグラムにおいて、前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づく第１細胞群と、前方散乱光強度及び蛍光強度に基づく第２細胞群とを特定する（ステップＳ４）。この三次元スキャッタグラム中で第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群にも含まれる細胞が出現する骨髄芽球領域を設定し、この領域に出現する細胞を骨髄芽球として計数する（ステップＳ５）。骨髄芽球の計数結果と三次元スキャッタグラムとを出力部７に出力する（ステップＳ８）。
【０１０１】
上記実施態様の装置では、制御部６は、骨髄芽球の計数結果と計数に用いたスキャッタグラムを出力部７の表示ディスプレイに出力表示するが、これらのうち何れかのみを出力するものであってもよい。また、スキャッタグラムを出力する場合、最終的に骨髄芽球の計数に使用するスキャッタグラムだけでなく、作成したスキャッタグラムの全てを出力するようにしてもよい。
【０１０２】
以上の実施形態の測定装置は、上記本発明の第１〜第３の測定方法を採用したものであったが、第４の測定方法を採用する場合には、取得した蛍光情報及び第２散乱光情報に基づいて、少なくとも成熟白血球を含まない第４細胞群を特定する第３特定手段を更に含み、前記計数手段は、前記第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれ且つ第３特定手段で特定した細胞群に含まれる細胞を、骨髄芽球として計数する手段であることが好ましい。
【０１０３】
第４の測定方法を採用する装置については、具体的には、上記実施形態の制御部６における情報処理を変更するだけでよい。但し、第２特定手段において、第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定される第２細胞群として、骨髄芽球を含む全白血球の集団（第３細胞群に該当）を特定し、第３特定手段では、第４細胞群を特定するために、第２散乱光情報（側方散乱光強度）と蛍光情報(蛍光強度）を二軸とするスキャッタグラムを作成する。そして、第１細胞群に含まれ、第２細胞群（ここでは実質的に第３細胞群に該当）に含まれ、且つ第４細胞群に含まれる細胞を計数し、計数結果を出力部７に出力する。
【０１０４】
尚、以上の実施形態においていう「骨髄芽球の計数結果」には、試料中の骨髄芽球数、単位体積あたりの骨髄芽球数（濃度）、全白血球に対する骨髄芽球の割合などが含まれ、制御部６はこれらのうち少なくともひとつを出力することができる。
【実施例】
【０１０５】
〔血液学的試料〕
血液学的試料として、骨髄芽球を多量に含むサンプル（試料ａ）、骨髄芽球と幼若白血球を含むサンプル（試料ｂ）を用いた。試料ａ，ｂには、血小板凝集が含まれている。
【０１０６】
〔測定用試料の調製〕
（１）処理試薬Ａを用いた測定用試料
（Ａ−１）溶血剤
以下の成分を含む下記組成の溶血剤を調製した。
グリシン １９．５ｇ／ｌ
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２５．０ｇ／ｌ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム ０．７５ｇ／ｌ
ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ
精製水 １ｌ
水酸化ナトリウム ｐＨが７．０となる量
【０１０７】
（Ａ−２）染色液
下記式で表される蛍光色素Ａをエチレングリコールで溶解したものである。
【０１０８】
【化７】
上記溶血剤と血液学的試料を混合し、これに上記染色液を、蛍光色素の最終濃度が２０ｐｐｍとなるように、混合して測定用試料を調製した。
【０１０９】
（２）処理試薬Ｂを用いた測定用試料
下記組成を有する溶血剤を用いた以外は、処理試薬Ａの場合と同様にして、測定用試料を調製した。
キシリトール ３７．０ｇ／ｌ
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２５．０ｇ／ｌ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム ０．７５ｇ／ｌ
ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ
精製水 １ｌ
水酸化ナトリウム ｐＨが７．０となる量
【０１１０】
〔測定〕
実施例１
血液学的試料ａ及び処理試薬Ｂを混合し、３３℃で５秒間反応させて調製した測定用試料をフローセルに導入し、フローサイトメータ（光源：赤色半導体：波長：６３３ｎｍ）で前方散乱光、側方散乱光、蛍光を測定した。測定結果を、前方散乱光強度と側方散乱光強度を二軸とする第１スキャッタグラム（図１３（ａ））、及び蛍光強度と前方散乱光強度を二軸とする第２スキャッタグラム（図１３（ｂ））に示す。
【０１１１】
図１３（ａ）において、第１細胞群の出現領域は、実線で囲まれた領域である。図１３（ｂ）において、第２細胞群の出現領域は、実線で囲まれた領域である。図１３（ａ）において、リンパ球を含む細胞集団が広がっていて、その一部が第１細胞群に重なっていた。
第１細胞群及び第２細胞群の双方に含まれる細胞の集団を、図１４に示す。図１４は、側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第３スキャッタグラムで、第１細胞群及び第２細胞群の双方に含まれる細胞集団は、実線で囲まれた部分に集中して出現していた。
【０１１２】
図１４の実線で囲まれた領域内の細胞数を計数し、全白血球数に対する割合を算出したところ、５８．５％であった。一方、血液学的試料ａを顕微鏡で観察し、骨髄芽球を計数した。視野における全白血球数に対する骨髄芽球の割合を求めたところ、４２．０％であった。
従って、本発明の測定方法によれば、顕微鏡観察と同程度の精度で、骨髄芽球を検出できることを確認できた。
【０１１３】
実施例２
血液学的試料ｂを処理試薬Ａで、３３℃で５秒間処理して調製した測定用試料を、フローセルに導入し、フローサイトメータ（光源：赤色半導体、波長：６３３ｎｍ）で前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光を測定した。測定結果を、前方散乱光強度と側方散乱光強度を二軸とする第１スキャッタグラム（図１５（ａ））、及び蛍光強度と前方散乱光強度を二軸とする第２スキャッタグラム（図１５（ｂ））に示す。
【０１１４】
図１５（ａ）において、第１細胞群の出現領域は、実線で囲まれた領域である。図１５（ｂ）において、第２細胞群の出現領域は、実線で囲まれた領域である。
第１細胞群及び第２細胞群の双方に含まれる細胞の集団を、図１６に示す。図１６は、側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第３スキャッタグラムで、第１細胞群及び第２細胞群の双方に含まれる細胞集団は、実線で囲まれた部分に集中して出現していた。
【０１１５】
図１６の実線で囲まれた領域内の細胞数を計数し、全白血球数に対する割合を算出したところ、２．４％であった。一方、血液学的試料ａを顕微鏡で観察し、骨髄芽球を計数した。全白血球に対する骨髄芽球の割合は２．５％であった。
従って、本発明の測定方法によれば、顕微鏡観察と同程度の精度で、骨髄芽球を検出できること、特に幼若顆粒球とも区別して、骨髄芽球を高精度に検出できることを確認できた。
【符号の説明】
【０１１６】
６ 制御部
７ 表示部（出力部）
２１ 光源
２６ 前方散乱光検出器
２９ 側方散乱光検出器
３１ 蛍光検出器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法及び弁別装置に関し、幼若白血球、特に骨髄芽球を血小板凝集と高精度に弁別することができる骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法及び弁別装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液の細胞成分は、血小板、白血球、及び赤血球に大別され、さらに白血球は、顆粒球（好酸球、好中球、及び好塩基球）、単球、及びリンパ球に分類される。
これらの細胞は、骨髄で作られ、未熟な細胞から分化・成熟し、末梢血に移動する。健常人の場合、顆粒球、単球、リンパ球といった正常な血液に含まれる白血球（以下、これらを「成熟白血球」ということがある）にまで成熟していない幼若な白血球（幼若白血球）が末梢血に出現することはないが、白血病、癌の骨髄転移、重症感染症などの患者の末梢血には、骨髄芽球などの幼若白血球が出現することがある。特に骨髄芽球を検出することは、上述の疾患を診断する上で重要である。
【０００３】
臨床検査、健康診断などにおいて採血した血液を自動的に測定する方法として、フローサイトメトリーを利用した測定方法が利用されている。フローサイトメトリーは、細胞膜や核などを蛍光染色した試料をフローセルに導入し、フローセルを通過する細胞に色素の励起光を照射して、フローセルを通過する個々の細胞から発される散乱光や蛍光に関する情報を取得し、これらの情報から細胞の種類や個数を測定する方法である。
【０００４】
フローサイトメトリーを用いた血液学的試料の測定方法において、血液に含まれる血球、さらには血球系疾患の場合に現れる幼若白血球や形態変化した血球などを、他の血球細胞と区別して、検出するための種々の方法が提案されている。
【０００５】
例えば、ＷＯ２００４／００１４０８（特許文献１）の技術によると、以下の（１）〜（３）のようにして血液中の血球が分類される。
（１）先ず前方散乱光ピークと前方散乱光幅を二軸とする二次元スキャッタグラムにおいて血小板凝集と、白血球及び赤血球ゴーストとを弁別する。
（２）次に、（１）において弁別された白血球及び赤血球ゴーストについて前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする二次元スキャッタグラムに展開し、白血球と、赤血球ゴーストとを弁別する。
（３）さらに、（２）において弁別された白血球について蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とする二次元スキャッタグラムに展開し、白血球を、リンパ球、単球、顆粒球、骨髄芽球、及び顆粒球系幼若球に細分類する。
【０００６】
特許文献１によると、上記（３）において、骨髄芽球を分類することができるが、血小板凝集を少量含む試料を測定した場合、（１）において血小板凝集が白血球及び赤血球ゴーストの領域に出現する可能性があり、（３）において骨髄芽球の領域に出現する可能性がある。このため、より精度良く骨髄芽球を測定する技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／００１４０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、フローサイトメトリーによる血液試料の測定において、血小板凝集の影響を受けず、骨髄芽球をより正確に弁別できる弁別方法及び弁別装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、成熟白血球の細胞膜に損傷を与えた血液学的試料をフローサイトメトリーに適用して得られる角度が異なる２種類の散乱光情報に基づいて骨髄芽球を含む細胞群を特定することにより血小板凝集の影響を排除することで、血小板凝集と区別して骨髄芽球を測定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法は、血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する方法であって、前記試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させる工程；前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する工程；及び前記前方散乱光情報と、前記側方散乱光情報とに基づいて前記骨髄芽球と前記血小板凝集とを弁別する工程；を含む。
好ましくは、前記収縮させる工程は、試料と、界面活性剤と、可溶化剤とを混合させる工程である。
より好ましくは、界面活性剤は、ポリオキシエチレンノニオン系界面活性剤である。
さらに好ましくは、可溶化剤は、サルコシン誘導体又はその塩である。
さらに好ましくは、前方散乱光情報は前方散乱光強度であり、側方散乱光情報は側方散乱光強度である。
また、本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別装置は、血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する装置であって、前記試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させる試料処理手段、前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する取得手段、及び、前記前方散乱光情報と、前記側方散乱光情報とに基づいて前記骨髄芽球と前記血小板凝集とを弁別する処理を実行する制御手段、を含む。
【００１１】
本発明にいう「幼若白血球」とは、通常骨髄に存在し、末梢血液に存在しない未成熟な細胞をいう。例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球をいう。前骨髄球、骨髄球、後骨髄球については、まとめて幼若顆粒球とすることもある。さらには、芽球以前の分化段階である、骨髄系幹細胞、好中球・マクロファージコロニー形成細胞、好酸球コロニー形成細胞等の白血球系の造血前駆細胞も本発明の幼若白血球の範囲に含む。
本発明にいう「成熟白血球」とは、成熟リンパ球、単球、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）のことをいう。
本発明にいう「血小板凝集」とは、血小板が２個以上凝集したものをいう。
本発明にいう「細胞膜の損傷」とは、細胞膜に特定の物質が通過できるような細孔があくことをいう。
本発明にいう「血液学的試料」とは、主に末梢血液をさすが、この他にも、骨髄液、アフェレーシス等によって回収された血液成分を含む試料、又は腹腔液、尿試料等の白血球成分を含む生体試料も好適な試料である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法は、フローサイトメトリーによる血液試料の測定により得られる２種類の散乱光情報を用いて細胞群を弁別するにあたり、血小板凝集の影響を排除して骨髄芽球を含む細胞群を特定することができるので、骨髄芽球を正確に弁別することができる。
本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別装置は、本発明の骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法を適用しているので、骨髄芽球を高精度に弁別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１細胞群を説明するためのスキャッタグラムである。
【図２】第２細胞群を説明するためのスキャッタグラムである。
【図３】第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を説明するためのスキャッタグラムである。
【図４】第３細胞群を説明するためのスキャッタグラムである。
【図５】第４細胞群を説明するためのスキャッタグラムである。
【図６】本発明の測定装置の外観の一例を示す図である。
【図７】本発明の測定装置に用いられるフローサイトメータの一例を示す図である。
【図８】本発明の測定装置に用いられる制御部の構成の一例を示すブロック図である。
【図９】本発明の測定装置で採用される情報処理の一例を示すフローチャートである。
【図１０】本発明の測定装置で採用される情報処理の他の例を示すフローチャートである。
【図１１】本発明の測定装置で採用される情報処理の他の例を示すフローチャートである。
【図１２】本発明の測定装置で採用される情報処理の他の例を示すフローチャートである。
【図１３】（ａ）は実施例１で調製した測定用試料を測定して得られた第１スキャッタグラムであり、（ｂ）は同測定用試料を測定して得られた第２スキャッタグラムである。
【図１４】実施例１について、第１細胞群と第２細胞群の双方に含まれる細胞について作成した第３スキャッタグラムである。
【図１５】（ａ）は実施例２で調製した測定用試料を測定して得られた第１スキャッタグラムであり、（ｂ）は同測定用試料を測定して得られた第２スキャッタグラムである。
【図１６】実施例２の測定用試料について、第１細胞群と第２細胞群の双方に含まれる細胞について作成した第３スキャッタグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の血液学的試料の測定方法は、血液学的試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させ、核酸を染色できる蛍光色素で染色処理する試料処理工程；前記処理がなされた試料に前記蛍光色素の励起光を照射することによって生じる第１散乱光情報と、第１散乱光とは角度の異なる散乱光に基づく第２散乱光情報と、蛍光情報とを取得する取得工程；取得した蛍光情報及び２種類の散乱光情報を用いて血小板凝集の影響が排除され、他の血球細胞と区別して骨髄芽球を含む細胞集団を特定する工程；特定できた骨髄芽球の細胞集団を骨髄芽球として計数する計数工程を含む。
【００１５】
以下、具体的に説明する。
〔血液学的試料の処理〕
本発明の測定方法における試料処理工程は、血液学的試料と以下に述べる処理試薬とを混合することにより行なわれることが好ましい。
前記処理試薬は、血液学的試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させ、核酸を染色できる試薬である。具体的には、試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤及び核酸を蛍光染色する蛍光色素を含む。
【００１６】
本発明で用いられる界面活性剤は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える。作用機序は明確ではないが、特定の細胞膜脂質構成成分の一部を抽出する（引き抜く）ことにより、細胞膜に特定の物質が通過できるだけの細孔をあける（これを損傷とよぶ）と考えられる。そして、蛍光色素は、界面活性剤により損傷を受けた細胞の内部にまで入り込んで核酸を染色することができる。
【００１７】
界面活性剤は、幼若白血球にも損傷を与えるが、赤血球や成熟白血球に比べて細胞の損傷に時間を要する。このため、血液学的試料と処理試薬との混合後の所定時間内では、未損傷の骨髄芽球や幼若顆粒球などよりも、損傷を与えられた成熟白血球の方が染色されやすい状態となっている。このような結果、骨髄芽球、幼若顆粒球は、損傷を受けて核が染色された成熟白血球と比べて、核を染める蛍光色素ではほとんど染色されないので、成熟白血球よりも蛍光強度が低くなる。
【００１８】
本発明で用いられる界面活性剤としては、ポリオキシエチレンノニオン系界面活性剤が挙げられる。具体的には、Ｒ１Ｒ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨで表されるノニオン界面活性剤である。式中、Ｒ１は炭素数９〜２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、Ｒ２は−Ｏ−又は−ＣＯＯ−又は
【００１９】
【化１】
であり、ｎは１０〜４０の整数である。
【００２０】
炭素数９〜２５のアルキル基としては、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシルテトラデシル等が挙げられる。炭素数９〜２５のアルケニル基としてはドデセニル、テトラデセニル等が挙げられる。炭素数９〜２５のアルキニル基としては、ドデシニル、ウンデシニル、ドデシニル等が挙げられる。
【００２１】
具体的には、ポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルなどが挙げられる。
【００２２】
界面活性剤は、水溶液の形態で用いることができる。例えば、ポリオキシエチレンノニオン系界面活性剤の水中濃度については、使用する界面活性剤の種類によって異なるが、前述のポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルでは、５〜５０ｇ／ｌ（好ましくは１５〜３５ｇ／ｌ）の範囲で使用できる。ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤は、疎水性基の炭素数が同じであれば、ｎの値が小さくなるほど細胞を損傷する力が強く、ｎの値が大きくなるほど弱くなる。また、ｎの値が同じであれば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて細胞を損傷する力が強くなる。その点を考慮し、上記の値を目安にして、必要な界面活性剤の濃度は実験により適宜求めればよい。
【００２３】
本発明で用いられる蛍光色素は、核酸を蛍光染色する色素である。細胞膜に損傷を与えられた成熟白血球に対しては、蛍光色素が細胞膜を通過して核を染めることができる。
【００２４】
具体的には、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、さらにモレキュラープローブ社から販売されているエチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３等が挙げられる。さらに光源として、Ｈｅ−Ｎｅ、赤色半導体レーザなどを使用する場合に好適な色素として、下記（１）式で示される色素を使用できる。
【００２５】
【化２】
式中、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基、Ｒ４は水素原子、アシル基、又は低級アルキル基、Ｒ５は水素原子又は置換されていてもよい低級アルキル基、Ｒ６は水素原子又は低級アルキル基、Ｒ７は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基、及びＺは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換された炭素原子、ｍは１又は２、Ｘはアニオンである。
【００２６】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７における低級アルキルとは、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基が挙げられ、中でも、メチル基、エチル基が好ましい。
Ｒ３及びＲ７における低級アルコキシ基としては、炭素数１〜６のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ基、エトキシ基が好ましい。なお、Ｒ３及びＲ７は、水素原子であることが好ましい。
Ｒ４におけるアシル基とは、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもアセチル基が好ましい。
Ｒ５における置換されていてもよい低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）等で置換されていてもよい低級アルキル基を意味し、中でも１個の水酸基で置換されたメチル基、エチル基が好ましい。
【００２７】
Ｚにおける低級アルキル基とは、Ｚとしては硫黄原子であることが好ましい。
Ｘ−におけるアニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ４−、ＢＣｌ４−、ＢＢｒ４−等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。中でも臭素イオン又はＢＦ４−が好ましい。
【００２８】
上記式（１）の色素の具体的例としては、以下の色素Ａ、色素Ｂ、色素Ｃが好適である。
【００２９】
【化３】
【００３０】
色素濃度は、使用する色素に応じて適宜決定できる。好ましくは、試薬中の濃度が０．０１〜５００ｐｐｍであり、より好ましくは０．１〜２００ｐｐｍである。
【００３１】
上述の界面活性剤により細胞膜は損傷して、細胞内の一部が細胞外に排出されることで細胞収縮が起る、あるいは細胞膜の表面状態の変化により細胞収縮が起るが、白血球以外の血球、特に赤血球を、有用な散乱光情報及び蛍光情報を提供しないゴースト集団とするために、損傷した細胞を十分に収縮させるための可溶化剤を含むことが好ましい。
【００３２】
可溶化剤としては、具体的には、下記（２）式で表されるサルコシン誘導体あるいはその塩；
【００３３】
【化４】
（式中、Ｒ１０は炭素数１０〜２２のアルキル基、ｐは１〜５の整数である。）
下記（３）式で表されるコール酸誘導体；
【００３４】
【化５】
（式中、Ｒ１１は水素原子又は水酸基）
及び下記（４）式
【００３５】
【化６】
（式中、ｑは５〜７）
で表されるメチルグルカンアミドから選択される１又はそれ以上を用いることができる。
【００３６】
炭素数１０〜２２のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイル等が挙げられる。
【００３７】
具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシン、ＣＨＡＰＳ（３−〔３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−〔３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）等が挙げられる。
【００３８】
可溶化剤の濃度は、サルコシン酸誘導体あるいはその塩では、０．２〜２．０ｇ／ｌ、コール酸誘導体では０．１〜０．５ｇ／ｌ、メチルグルカンアミドでは１．０〜８．０ｇ／ｌが好ましい。
【００３９】
可溶化剤として、上記以外に、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレートやＮ−ホルミルメチルロイシルアラニン等を用いてもよく、０．０１〜５０．０ｇ／ｌの濃度で用いることが好ましい。
【００４０】
さらに、試薬のｐＨを調節するためのｐＨ調節剤および緩衝液を含有することが好ましく、更に必要に応じて浸透圧調整剤を含有することが好ましい。
【００４１】
緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液やリン酸緩衝液等が用いられる。ｐＨ調節剤としては、水酸化ナトリウムなどが用いられる。浸透圧調節剤としては、糖、アミノ酸、有機溶媒、塩化ナトリウムなどが用いられる。糖としては、グルコース、キシリトールマンニトール、アラビノース、リビトールなどを用いることができる。アミノ酸としては、アラニン、プロリン、グリシン、バリンなどを用いることができる。有機溶媒としては、エチレングリコール、グリセリンなどを用いることができる。試薬中の浸透圧調節剤の濃度は、分子量により適宜調節されるが、例えばキシリトールを用いる場合は１０〜７５ｇ／ｌが好ましく、グリセリンを用いる場合は５〜４５ｇ／ｌが好ましく、グリシンを用いる場合は５〜４５ｇ／ｌが好ましい。
【００４２】
以上のような組成を有する処理試薬は、ｐＨ５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇとするのが好ましい。
【００４３】
尚、処理試薬は、界面活性剤、色素、その他の成分を含有する一液型の試薬であってもよいし、蛍光色素を含む染色液と、上述の界面活性剤を含む溶液（溶血剤）とを別々の容器に収容し、これらを備えた試薬キットとすることもできる。この場合、色素の保存安定性を高めるために、蛍光色素の溶媒としてエチレングリコール等の水溶性有機溶媒を用いることが好ましい。
【００４４】
〔測定用試料の調製〕
上記処理試薬を含む溶液と血液学的試料を混合することにより、測定用試料を調製することができる。上述の試薬キットを使用する場合には、まず、界面活性剤を含む溶液（溶血剤）と血液学的試料とを混合し、次いで染色液を混合して、測定用試料としてもよい。
【００４５】
血液学的試料と処理試薬との混合は、試料：処理試薬の比が１：１０〜１：１０００、反応温度が２０〜４０℃であることが好ましく、反応時間は、３秒〜５分間、より好ましくは４秒〜１分である。
【００４６】
このようにして調製される測定用試料において、赤血球及び成熟白血球は、細胞収縮してサイズが小さくなっている。特に、赤血球は核がないため、細胞膜損傷による溶血、細胞収縮が進み、蛍光色素による染色もされないことから、前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光のいずれも小さくなり、ゴースト集団として扱うことができる。
【００４７】
一方、成熟白血球は、試料と試薬とを所定の時間反応させると細胞膜が損傷することによって細胞収縮するが、核は実質的に収縮しないため、赤血球ほど小さくならない。さらに、損傷した膜を蛍光色素が透過することができるので、核が染色される。
【００４８】
幼若白血球は、成熟白血球や赤血球に比べて溶血剤に対して耐性を有するので、細胞膜の損傷に時間がかかる。従って、所定の反応時間内では細胞収縮が実質的におこらず、また蛍光色素が透過できないので、核もほとんど染色されない。
【００４９】
個々の血小板細胞については、処理試薬によって幼若白血球と同様に膜損傷に時間を要し、また色素が血小板内に進入して血小板自体を染色することもないが、血小板凝集体の場合、凝集体の周囲に色素が物理的吸着して、染色される。
【００５０】
〔散乱光情報及び蛍光情報の取得〕
調製した測定用試料をフローサイトメータで測定して、試料中に含まれる細胞、血小板などの散乱光情報及び蛍光情報を取得する。
【００５１】
情報の取得は、測定用試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、前記フローセル内を流れる試料に前記蛍光色素を励起できる励起光を照射することにより行なうことが好ましい。これにより、フローセルを通過する細胞から発される散乱光情報及び蛍光情報を取得することができる。
【００５２】
照射光は、使用する蛍光色素を励起することができる波長の光を含む。使用するフローサイトメータに備え付けられている光源の光の波長に応じて、その光で励起できる蛍光色素を選択してもよい。
散乱光情報は、角度の異なる２種類の散乱光を取得する。具体的には前方散乱光と側方散乱光の組合わせが好ましく用いられる。
【００５３】
ここで、前方散乱光とは、細胞のサイズが反映された情報と考えられる。つまり、細胞が大きいと前方散乱光も大きい。側方散乱光とは、前方散乱光に対して、角度が８０〜１００度、好ましくは８５〜９５度異なる散乱光である。側方散乱光からは、細胞の内部情報、特に核の情報を得ることができる。顆粒を含んでいたり、核の形がいびつな場合には側方散乱光は大きくなる傾向にある。
【００５４】
所定の反応時間内では、蛍光色素は血小板の内部には殆ど進入できないため、血小板自体が殆ど染色されることはない。しかしながら、蛍光色素は血小板凝集体の周囲や血小板同士が接着している部分に結合するため、測定用試料において、凝集体が大きくなると蛍光強度が大きくなる。一方、血小板凝集が少なく凝集体が小さいときには、側方散乱光強度は小さくなり、付着する蛍光色素は少なくなるので、結果として蛍光強度も小さくなる。
【００５５】
〔細胞群の特定及び骨髄芽球の計数〕
取得した散乱光情報及び蛍光情報を用いて、目的の細胞群を特定し、骨髄芽球を計数する。本発明の測定方法は、特定工程の見地から、以下の第１の測定方法〜第４の測定方法に分類できる。以下、順に説明する。
【００５６】
（１）第１の測定方法
第１の測定方法では、取得した第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第１細胞群を特定し（第１特定工程）、取得した第１散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第２細胞群を特定し（第２特定工程）、第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数する。第１特定工程と第２特定工程の順序はいずれが先であってもよい。
【００５７】
（１−１）第１細胞群
第１細胞群は、取得された２種類の散乱光情報、好ましくは前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づいて特定される。第１細胞群は、この２種類の散乱光情報を二軸とするスキャッタグラム（第１スキャッタグラム）中で、骨髄芽球が出現すると考えられる領域を設定することにより特定されることが好ましい。また、検体によって骨髄芽球の染色の程度や大きさが異なるため、第１細胞群が出現する領域の設定は検体毎に行なわれることが好ましい。
【００５８】
第１細胞群が出現する領域の具体的設定方法として、まず、２種類の散乱光情報を二軸とするスキャッタグラム中に骨髄芽球が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、この集団の中心を特定する。骨髄芽球の細胞集団の中心から、他の細胞集団の出現領域までの間で、骨髄芽球細胞集団の細胞が出現している部分までを、第１細胞群の出現領域の境界として決定することができる。同様にして、他の細胞集団（幼若顆粒球、顆粒球、リンパ球、単球）が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、各集団の中心を特定するとともにその出現領域を特定する。これらの領域は、使用する色素、
濃度に応じて、種々のサイズの骨髄芽球について蓄積されたデータから、予め領域を設定しておいてもよい。
【００５９】
本発明で用いられる測定用試料を、縦軸に前方散乱光強度（第１散乱光情報）、横軸に側方散乱光強度（第２散乱光情報）を二軸とするスキャッタグラム中で、各細胞が出現すると考えられる領域を設定すると、一般に図１のようになる。図１中、「Ｂｌａｓｔ」は骨髄芽球出現領域であり、「ＩＧ」は幼若顆粒球出現領域、「Ｇｒａｎ」は顆粒球出現領域、「Ｌｙ」はリンパ球出現領域、「Ｍｏ」は単球の出現領域である。
【００６０】
骨髄芽球は、側方散乱光強度が弱いため、スキャッタグラム中、比較的左側の領域に現れる。一方、顆粒球、幼若顆粒球は、その核の形態のいびつさなどから、比較的側方散乱光が大きい右側に出現するので、これらの集団は骨髄芽球出現領域とは離れた領域に出現することになる。従って、第１細胞群の出現領域としては、Ｂｌａｓｔ部分を囲むような一点鎖線で示す領域を設定すればよい。
【００６１】
血小板凝集は、凝集の仕方が多岐にわたることから、側方散乱光強度も小さいものから大きいものまであり、また、凝集体の大きさも数個〜数１０個と様々であることから、前方散乱光強度も小さいものから大きいものまで存在する。但し、凝集体のサイズといびつさには相関性があることから、図１に示すスキャッタグラムにおいて、左下から右上に向けた領域（点線で囲まれた領域）に現れることになり、Ｂｌａｓｔの領域（第１細胞群の出現領域）と重なることはない。
【００６２】
図１によれば、第１細胞群は、血小板凝集や他の血球成分と区別されているので、第１細胞群を骨髄芽球として計数することが可能とも考えられる。しかしながら、試料によってはサイズが大きいリンパ球が含まれることがあり、稀であるが、リンパ球の出現領域の一部が第１細胞群の出現領域に重なることがある。
【００６３】
（１−２）第２細胞群
第２細胞群は、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報、好ましくは、前方散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定される。第２細胞群は、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラム（第２スキャッタグラム）中で骨髄芽球が出現すると考えられる領域に含まれる細胞集団である。
【００６４】
骨髄芽球や幼若顆粒球は、所定の反応時間内では処理試薬による膜損傷が実質的にないので、核染色されず、蛍光強度が低い左側領域に出現する。従って、骨髄芽球が出現すると考えられる領域には、幼若白血球も出現することがある。一方、顆粒球、リンパ球、単球は、所定の反応時間で処理試薬による膜損傷を受けて核染色されるので、蛍光強度が高い右側領域に出現することになり、所定の反応時間内では実質的に核染色されない幼若白血球の集団とは明確に区別できる。すなわち、骨髄芽球を含む幼若白血球の出現領域には、成熟白血球は実質的には出現しない。
【００６５】
従って、第２細胞群の出現領域の具体的特定方法としては、まずスキャッタグラム中で骨髄芽球が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、この集団の中心を特定する。骨髄芽球の細胞集団の中心から、成熟白血球の細胞集団の細胞集団の出現領域までの間で、骨髄芽球細胞集団の細胞が出現している部分までを、第２細胞群の出現領域の境界として決定することができる。同様にして、他の細胞集団（幼若顆粒球、顆粒球、リンパ球、単球）が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、各集団の中心を特定するとともにその出現領域を特定する。これらの領域は、使用する色素、濃度に応
じて、種々のサイズの骨髄芽球について蓄積されたデータから、予め領域を設定しておいてもよい。
【００６６】
具体的には、図２に示すように、蛍光強度を横軸、前方散乱光強度を縦軸とするスキャッタグラムにおいて、第２細胞群は、蛍光強度が低い左側領域の一点鎖線で囲まれた領域に含まれる集団となる。図２中、「Ｂｌａｓｔ」は骨髄芽球出現領域であり、「ＩＧ」は幼若顆粒球出現領域、「Ｇｒａｎ」は顆粒球出現領域、「Ｌｙ」はリンパ球出現領域、「Ｍｏ」は単球出現領域である。
【００６７】
尚、血小板凝集の染色は、物理的に吸着する程度なので、左側領域に出現する。また、凝集の程度により、骨髄芽球よりも小さなサイズから大きいサイズがのものが存在し得るので、図２のように、前方散乱光強度が小さいところから、大きいところまで、縦長に伸びた領域に出現する。
【００６８】
（１−３）骨髄芽球の計数
以上のようにして特定した第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数する。
【００６９】
第１細胞群に含まれる可能性があるリンパ球は、第２細胞群には含まれていない。一方、第２細胞群に含まれる可能性がある血小板凝集、幼若白血球は、第１細胞群には含まれていない。従って、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞は、リンパ球、血小板凝集、幼若白血球を含まず、実質的に骨髄芽球だけであるといえる。よって、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数することで、正確に骨髄芽球を計数することができる。
【００７０】
尚、前記第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれる細胞を、蛍光情報及び第２散乱光情報を二軸とするスキャッタグラム（第３スキャッタグラム）中に展開してもよい。この第３スキャッタグラムに出現する細胞は、実質的に骨髄芽球のみの集団である。
【００７１】
第１散乱光情報は、好ましくは前方散乱光強度であり、第２散乱光情報は好ましくは側方散乱光強度である。第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞について、蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラム（第３スキャッタグラム）に展開すると、例えば図３に示すようなスキャッタグラムが得られる。このスキャッタグラムには、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞、すなわち実質的に骨髄芽球だけが出現していることになるから、ここに出現した細胞を骨髄芽球として計数することもできる。
【００７２】
（２）第２の測定方法
第１の測定方法及び第２の測定方法では、第１特定工程及び第２特定工程を個別に行なって、第１細胞群及び第２細胞群をそれぞれ特定したが、第１細胞群（又は第２細胞群）を先に特定し、次いで第２細胞群（又は第１細胞群）を、先に特定した第１細胞群（又は第２細胞群）の中から特定するようにしてもよい。
すなわち、第２の測定方法は、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第２細胞群を特定し（第２特定工程）、次いで、特定した第２細胞群の第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、前記第２細胞群の中から第１細胞群を特定して(第２の測定方法に特化して言及する場合には、この特定工程を「第１’特定工程」、第１’特定工程で特定される第１細胞群を「第１’細胞群」という）、この第１’細胞群を骨髄芽球として計数する。あるいは取得した第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第１細胞群を特定し（第１特定工程）、次いで特定した第１細胞群の第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、前記第１細胞群の中から第２細胞群を特定し(第２の測定方法に特化して言及する場合には、この特定工程を「第２’特定工程」、第２’特定工程で特定される第２細胞群を「第２’細胞群」という）、この第２’細胞群を骨髄芽球として計数する。
【００７３】
第１特定工程及びそこで特定される第１細胞群、第２特定工程及びそこで特定される第２細胞群は、それぞれ取得工程で取得した散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定され、その具体的手法は、上記第１の測定方法と同様であるから、説明を省略する。
【００７４】
（２−１）第２’細胞群の特定と骨髄芽球の計数
第２’特定工程は、先に特定した第１細胞群の第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び蛍光情報（好ましくは蛍光強度）に基づいて、前記第１細胞群の中から、骨髄芽球を含む集団を特定する（第２’細胞集団の特定）。このようにして特定される第２’細胞群は、第１測定方法及び第２測定方法における第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞に該当する。
【００７５】
第２’細胞集団の特定は、具体的には次のようにして行なわれる。
先ず第１散乱光情報及び第２散乱光情報を軸とするスキャッタグラム（第１スキャッタグラム）を作成し、このスキャッタグラムに全ての有形成分（細胞、血小板等）を展開する。この第１のスキャッタグラム中で骨髄芽球の候補領域を設定し、この領域内に出現する第１細胞群を特定する。次に、第１散乱光情報及び蛍光情報を二軸とするスキャッタグラム（第２’スキャッタグラム）を作成し、このスキャッタグラムに第１細胞群のみ展開する。第２’スキャッタグラム中で、骨髄芽球が出現すると考えられる領域に含まれる細胞集団が、第２’細胞群である。第１散乱光情報及び蛍光情報を二軸とする第２’スキャッタグラムでは、成熟白血球と幼若白血球とが明確に区別されるので、たとえ第１細胞群にリンパ球が含まれていたとしても、第２’スキャッタグラムに展開された第２’細胞群には、リンパ球が含まれない。即ち、第２’細胞群は、実質的に血小板凝集、リンパ球などの他の成分を含まない骨髄芽球の集団である。従って、第２’細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数すればよい。
【００７６】
（２−２）第１’細胞群の特定及び骨髄芽球の計数
第１’特定工程は、先に第２特定工程により第２細胞群を特定し、特定した第２細胞群の第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び第２散乱光情報（好ましくは側方散乱光強度）に基づいて、前記第２細胞群の中から、骨髄芽球を含む集団を特定する（第１’細胞集団の特定）。このようにして特定される第１’細胞群は、第１測定方法及び第２測定方法における第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞に該当する。
【００７７】
第１’細胞集団の特定は、具体的には次のようにして行なわれる。
先ず、取得した第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び蛍光情報（好ましくは蛍光強度）を、第１散乱光情報及び蛍光情報を二軸とするスキャッタグラム（第２スキャッタグラム）を作成し、このスキャッタグラムに全ての有形成分（細胞、血小板等）を展開する。この第２スキャッタグラム中で骨髄芽球を含む第２細胞群の候補領域を特定する。次に、第１散乱光情報及び第２散乱光情報を二軸とするスキャッタグラム（第１’スキャッタグラム）を作成し、このスキャッタグラムに上記で特定した第２細胞群のみを展開する。第１’スキャッタグラム中で、骨髄芽球が出現すると考えられる領域に含まれる細胞集団が、第１’細胞群である。第１散乱光情報及び第２散乱光情報を二軸とする第１’スキャッタグラムでは、幼若白血球及び血小板凝集が、骨髄芽球が出現する領域とは明確に区別できる領域に出現するので、第１’細胞群には、実質的に血小板凝集、リンパ球、幼若白血球などの他の成分は含まなれない。従って、第１’細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数すればよい。
【００７８】
（３）第３の測定方法
第１及び第２の測定方法では、第１細胞集団（又は第１’細胞集団）及び第２細胞集団（又は第２’細胞集団）の特定にあたり、いずれの特定工程においても、２種類の情報に基づいて、それぞれの細胞集団を個別に特定した後、第１細胞集団に含まれ且つ第２細胞集団に含まれる細胞集団を特定し、これを骨髄芽球として計数したが、本発明の血液学的試料の測定方法は、取得した第１散乱光情報、第２散乱光情報、及び蛍光情報を用いて、第１細胞集団と第２細胞集団を単一の工程で特定し、第１細胞集団及び第２細胞集団の双方に含まれる細胞を決定し、それを骨髄芽球として計数してもよい。
【００７９】
すなわち、第３の測定方法では、取得した第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて骨髄芽球を含む第１細胞群を特定するとともに、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて骨髄芽球を含む第２細胞群を特定し、第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数する。
【００８０】
具体的には、第１の散乱光情報、第２の散乱光情報、及び蛍光情報を三軸とする三次元のスキャッタグラムに展開し、第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び第２散乱光情報（好ましくは側方散乱光強度）に基づいて骨髄芽球を含む第１細胞群を特定するとともに、第１散乱光情報（好ましくは前方散乱光強度）及び蛍光情報（好ましくは蛍光強度）に基づいて骨髄芽球を含む第２細胞群を特定する。このときの第１細胞群の特定方法、第２細胞群の特定方法は、第１の測定方法の場合と同様にして行なうことができる。要するに、三次元のスキャッタグラムにおいて、第１細胞群の特定と第２細胞群の特定を同時に行なうことができ、さらに第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を特定することができる。第１の測定方法で述べたように、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞は、実質的に血小板凝集、リンパ球等の他の細胞成分を含んでいない。従って、三次元スキャッタグラムで、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞を、骨髄芽球として計数すれば、高精度に骨髄芽球を計数できる。
【００８１】
（４）第４の測定方法
第４の測定方法は、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定する細胞群として、骨髄芽球を含む第２細胞群に代えて、ゴースト集団以外の細胞（本発明で用いられる測定用試料においては、赤血球は細胞収縮によりゴースト集団となっているので、実質的に全白血球）を含む第３細胞群を特定した場合に適用される方法である。
【００８２】
すなわち、第４の測定方法では、取得した第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、骨髄芽球を含む第１細胞群を特定し（第１特定工程）、取得した第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、全白血球を含む第３細胞群を特定し（第３特定工程）、前記第３細胞群の第２散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、前記第３細胞群の中から、少なくとも成熟白血球を実質的に含まない第４細胞群を特定し（第４特定工程）、前記第１細胞群に含まれ且つ前記第４細胞群に含まれる細胞を計数する。
【００８３】
第１特定工程及び第１細胞群は、第１の測定方法と同様であるから、説明を省略する。
（４−１）第３特定工程及び第３細胞群
第３細胞群は、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムにおいて、赤血球ゴースト集団が出現する領域を除いた領域に出現する細胞集団、すなわち実質的に全白血球の集団である。具体的には、蛍光強度を横軸、前方散乱光強度を縦軸とするスキャッタグラムを描いた場合に、図４に示すように、一点鎖線で囲まれる領域に出現する細胞集団が、第３細胞群となる。尚、第３細胞群の出現領域には、図２で示したように、血小板凝集も含まれていることになる。
【００８４】
（４−２）第４特定工程及び第４細胞群
第４細胞群は、第３細胞群の第２散乱光情報及び蛍光情報、好ましくは側方散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定される。蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラム中に第３細胞群を展開した場合、成熟白血球が出現する領域と幼若白血球が出現する領域とが明確に区別されるので、蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラム中で骨髄芽球が含まれると考えられる領域を特定すれば、幼若白血球を含む細胞集団、さらには骨髄芽球を含む集団の出現領域を特定することができる。ここでの骨髄芽球の候補領域の特定は、第１細胞群や第２細胞群の特定と同様に、検体毎に行なわれることが好ましい。また、使用する色素、濃度に応じて、種々のサイズの骨髄芽球、成熟白血球について蓄積されたデータから、予め設定しておいてもよい。
【００８５】
側方散乱光強度を横軸、蛍光強度を縦軸とするスキャッタグラムにおいて、第３細胞群を展開すると、図５に示すように、成熟白血球（リンパ球、単球、及び顆粒球）は、核が染色されているので上方に出現し、実質的に核染色されない幼若白血球と明確に区別できる。成熟白血球は、核の形態等に応じて、左側から順にリンパ球集団（Ｌｙ）、単球集団（Ｍｏ）、顆粒球集団（Ｇｒａｎ）となって出現する。血小板凝集は、下方に、左側から右側にかけて出現する。従って、側方散乱光強度が低い左側領域で、蛍光強度の比較的低い位置から中程度に位置する、骨髄芽球を含む一点鎖線で囲まれた領域内の細胞集団を第４細胞群として特定すればよい。骨髄芽球と幼若顆粒球とは、核の形態、複雑性が異なるので、側方散乱光強度の大きさで両者を区別することが可能であるが、両者を明確に区別するためのゲーティングが困難なときは、骨髄芽球と幼若顆粒球の双方が含まれる幼若顆粒球の出現領域に含まれる細胞集団を第４細胞群としてもよい。
【００８６】
（４−３）骨髄芽球の特定及び計数
以上のようにして特定された第１細胞群に含まれ且つ第４細胞群に含まれる細胞を計数する。第１細胞群は血小板凝集が含まれておらず、第４細胞群には成熟白血球が含まれていないので、第１細胞群に含まれ且つ第４細胞群に含まれる細胞は、実質的に血小板凝集、成熟白血球が含まれない骨髄芽球あるいは幼若白血球の集団である。すなわち、たとえ第１細胞群にリンパ球が含まれていたとしても、第１細胞群に含まれ且つ第４細胞群に含まれる細胞には、リンパ球が除かれているので、実質的に骨髄芽球あるいは幼若白血球を、高精度に計数することができる。
【００８７】
〔弁別方法〕
本発明の血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する方法は、本発明の測定方法における試料処理工程；前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する工程；及び前記前方散乱光情報と前記側方散乱光情報とに基づいて、骨髄芽球を含む第１細胞群を特定することで、骨髄芽球を含む細胞集団と血小板凝集とを弁別する方法である。
【００８８】
上述のように、前方散乱光情報と側方散乱光情報とを二軸とするスキャッタグラムにおいて、骨髄芽球が出現すると考えられる領域を特定した場合、血小板凝集が出現すると考えられる領域とは明確に区別されているので、血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別することができる。
【００８９】
〔血液学的試料の測定装置〕
本発明の測定装置は、血液学的試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させ、核酸を染色できる蛍光色素で染色処理する試料処理手段；前記処理がなされた試料に前記蛍光色素の励起光を照射することによって生じる第１散乱光情報と、第１散乱光とは角度の異なる散乱光に基づく第２散乱光情報と、蛍光情報とを取得する取得手段；前記第１散乱光情報及び前記第２散乱光情報に基づいて骨髄芽球を含む第１細胞群を特定する第１特定手段；前記第１散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて骨髄芽球を含む第２細胞群を特定する第２特定手段；及び前記第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれる細胞を骨髄芽球として計数する計数手段を含む。
【００９０】
本発明の測定装置は、その外観として、例えば図６に示すような外観を有している。
図６に示す装置は、測定部１と、解析部２と、解析部２と測定部１とを接続する信号ケーブル３とを有する。測定部１に本発明の装置の試料処理手段及び取得手段が含まれ、解析部２に本発明の第１特定手段、第２特定手段及び計数手段が含まれる。
測定部１は、操作者が各種設定入力を行うための液晶タッチパネル１０、測定動作を開始するためのスタートスイッチ１１、及び検体を吸引するためのプローブ１２を備えている。また、測定部１の内部には、図７に示されるようなフローサイトメータが搭載されている。解析部２は、測定部１から送信された情報の処理や、測定部１の動作を制御する制御部６と、各種測定結果などを表示する表示部たる出力部７と、操作者が検体情報等を入力するためのキーボード８とを備えている。
【００９１】
次に、図７に示されるフローサイトメータについて説明する。
光源（例えば赤半導体レーザ：波長６３３ｎｍ）２１から出射されたビームは、コリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。ノズル２０から吐出されたオリフィス部を通過する血球から発せられる前方散乱光は集光レンズ２４とピンホール板２５を介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。一方、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８を介して側方散乱光検出器（フォトマルチプライアチューブ）２９に入射する。また、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２８’とピンホール板３０を介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２，３３，３４により増幅され、制御部６に入力される。
【００９２】
なお、前記光源２１は、試料の処理に用いた色素を励起できる光を、調製した測定用試料を導入したフローセルのオリフィス部に光を照射するもので、試料中の血球を染色する蛍光色素に応じたものが選ばれる。従って、使用する蛍光色素の種類により、赤色半導体レーザの他、例えば、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、青色半導体レーザなどが用いられてもよい。
【００９３】
図８は、制御部６の構成を示すブロック図である。この制御部６は、CPU６aと、ROM６ｂと、RAM６ｃと、ハードディスク６ｄと、入出力インタフェース６eと、画像出力インタフェース６ｆと、通信インタフェース６ｇとから主として構成されており、ＣＰＵ６a、ＲＯＭ６ｂ、ＲＡＭ６ｃ、ハードディスク６ｄ、入出力インタフェース６e、出力インタフェース６ｆ、および通信インタフェース６ｇは、バス６ｈによってデータ通信可能に接続されている。
【００９４】
ＣＰＵ６aは、ＲＯＭ６ｂ及びハードディスク６ｄに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ６ｃに読み出されたコンピュータプログラムを実行することが可能である。従って、測定部１、具体的にはフローサイトメータから入力された前方散乱光信号、側方散乱光信号、及び蛍光信号に基づいて、設定されたプログラムの演算処理を行ない、第１細胞群、第２細胞群といった細胞群を特定し、さらに骨髄芽球を計数する。
【００９５】
ＲＯＭ６ｂは、ＣＰＵ６aに実行させるためのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータ等を記憶している。ＲＡＭ６ｃは、ＲＯＭ６ｂ及びハードディスク６ｄに記憶されているコンピュータプログラムの読み出し、及びコンピュータプログラムを実行するときのＣＰＵ６aの作業領域に用いられる。ハードディスク６ｄは、ＣＰＵ６aに実行させるためのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータを記憶している。このコンピュータプログラムは、光学的情報を分析し、分析結果を出力するための機能を果たす。
【００９６】
入出力インタフェース６eには、キーボード８が接続されている。入力部たるキーボード８は、出力画面上における操作等のために設けられている。出力インタフェース６ｆは、液晶ディスプレイからなる出力部７に接続されている。出力部７は、制御部６で得られた分析結果を出力表示する等のために設けられている。通信インタフェース６ｇは、測定部１に接続されており、光学的情報を受信するための機能を果たす。
【００９７】
次に、制御部６における情報処理の実施態様について説明する。
図９は、本発明の第１の測定方法に対応する情報処理を示すフローチャートである。制御部６が第２の測定方法を採用している場合、まず、測定部１で検出された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を、信号ケーブル３を介して受信する（ステップＳ１）。制御部６はこれらの信号を解析し、それぞれの信号強度を算出する（ステップＳ２）。次に、試料中の有形成分（細胞や血小板など）の前方散乱光強度及び側方散乱光強度を用い、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を二軸とする第１スキャッタグラムを作成する（ステップＳ３）。第１スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候
補領域を設定し、この領域内に含まれる第１細胞群を特定する（ステップＳ４）。また、試料中の有形成分の前方散乱光強度及び蛍光強度を用い、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第２スキャッタグラムを作成する（ステップＳ５）。第２スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この領域内に含まれる第２細胞群を特定する（ステップＳ６）。次いで、第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群に含まれる細胞の蛍光強度及び側方散乱光強度を用いて、蛍光強度及び側方散乱光強度を二軸とする第３スキャッタグラムを作成する（ステップＳ７）。この第３スキャッタグラムに出現する細胞（第１細胞群に含まれ、且つ第２細胞群にも含まれる細胞）を骨髄芽球として計数し（ステップＳ８）、この計数結果と第３スキャッタグラムとを出力部７に出力する（ステップＳ９）。
【００９８】
図１０は、本発明の第２の測定方法のうち、第１細胞群を先に特定する方法に対応する情報処理を示すフローチャートである。制御部６がこのような第２の測定方法を採用している場合、先ず、測定部１で検出された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を、信号ケーブル３を介して受信する（ステップＳ１）。制御部６はこれらの信号を解析し、それぞれの信号強度を算出する（ステップＳ２）。次に、試料中の有形成分（細胞や血小板など）の前方散乱光強度及び側方散乱光強度を用い、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を二軸とする第１スキャッタグラムを作成する（ステップＳ３）。第１スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この領域内に含まれる第１細胞群を特定する（ステップＳ４）。また、第１細胞群の前方散乱光強度及び蛍光強度を用い、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラム（第２’スキャッタグラム）を作成する（ステップＳ５）。第２’スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この候補領域に含まれる第２’細胞群を特定する（ステップＳ６）。この第２’細胞群を骨髄芽球として計数し（ステップＳ７）、この計数結果と第２’スキャッタグラムを出力部７に出力する（ステップＳ８）。
【００９９】
図１１は、本発明の第２の測定方法のうち、第２細胞群を先に特定する方法に対応する情報処理を示すフローチャートである。制御部６がこのような第２の測定方法を採用している場合、先ず、測定部１で検出された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を、信号ケーブル３を介して受信する（ステップＳ１）。制御部６はこれらの信号を解析し、それぞれの信号強度を算出する（ステップＳ２）。次に、試料中の有形成分（細胞や血小板など）の前方散乱光強度及び蛍光強度を用い、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第２スキャッタグラムを作成する（ステップＳ３）。第２スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この領域内に含まれる第２細胞群を特定する（ステップＳ４）。次に、第２細胞群の前方散乱光強度及び側方散乱光強度を用い、前方散乱光強度及び側方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラム（第１’スキャッタグラム）を作成する（ステップＳ５）。第１’スキャッタグラム中、骨髄芽球が出現すると考えられる骨髄芽球候補領域を設定し、この候補領域内に含まれる第１’細胞群を特定する（ステップＳ６）。この第１’細胞群を骨髄芽球として計数し（ステップＳ７）、この計数結果と第１’スキャッタグラムを出力部７に出力する（ステップＳ８）。
【０１００】
図１２は、本発明の第３の測定方法に対応する情報処理を示すフローチャートである。制御部６がこのような第３の測定方法を採用している場合、先ず、測定部１で検出された前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を、信号ケーブル３を介して受信する（ステップＳ１）。制御部６はこれらの信号を解析し、それぞれの信号強度を算出する（ステップＳ２）。次に、試料中の有形成分（細胞や血小板など）の前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度を三軸とする三次元スキャッタグラムを作成する（ステップＳ３）。この三次元スキャッタグラムにおいて、前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づく第１細胞群と、前方散乱光強度及び蛍光強度に基づく第２細胞群とを特定する（ステップＳ４）。この三次元スキャッタグラム中で第１細胞群に含まれ且つ第２細胞群にも含まれる細胞が出現する骨髄芽球領域を設定し、この領域に出現する細胞を骨髄芽球として計数する（ステップＳ５）。骨髄芽球の計数結果と三次元スキャッタグラムとを出力部７に出力する（ステップＳ８）。
【０１０１】
上記実施態様の装置では、制御部６は、骨髄芽球の計数結果と計数に用いたスキャッタグラムを出力部７の表示ディスプレイに出力表示するが、これらのうち何れかのみを出力するものであってもよい。また、スキャッタグラムを出力する場合、最終的に骨髄芽球の計数に使用するスキャッタグラムだけでなく、作成したスキャッタグラムの全てを出力するようにしてもよい。
【０１０２】
以上の実施形態の測定装置は、上記本発明の第１〜第３の測定方法を採用したものであったが、第４の測定方法を採用する場合には、取得した蛍光情報及び第２散乱光情報に基づいて、少なくとも成熟白血球を含まない第４細胞群を特定する第３特定手段を更に含み、前記計数手段は、前記第１細胞群に含まれ且つ前記第２細胞群に含まれ且つ第３特定手段で特定した細胞群に含まれる細胞を、骨髄芽球として計数する手段であることが好ましい。
【０１０３】
第４の測定方法を採用する装置については、具体的には、上記実施形態の制御部６における情報処理を変更するだけでよい。但し、第２特定手段において、第１散乱光情報及び蛍光情報に基づいて特定される第２細胞群として、骨髄芽球を含む全白血球の集団（第３細胞群に該当）を特定し、第３特定手段では、第４細胞群を特定するために、第２散乱光情報（側方散乱光強度）と蛍光情報(蛍光強度）を二軸とするスキャッタグラムを作成する。そして、第１細胞群に含まれ、第２細胞群（ここでは実質的に第３細胞群に該当）に含まれ、且つ第４細胞群に含まれる細胞を計数し、計数結果を出力部７に出力する。
【０１０４】
尚、以上の実施形態においていう「骨髄芽球の計数結果」には、試料中の骨髄芽球数、単位体積あたりの骨髄芽球数（濃度）、全白血球に対する骨髄芽球の割合などが含まれ、制御部６はこれらのうち少なくともひとつを出力することができる。
【実施例】
【０１０５】
〔血液学的試料〕
血液学的試料として、骨髄芽球を多量に含むサンプル（試料ａ）、骨髄芽球と幼若白血球を含むサンプル（試料ｂ）を用いた。試料ａ，ｂには、血小板凝集が含まれている。
【０１０６】
〔測定用試料の調製〕
（１）処理試薬Ａを用いた測定用試料
（Ａ−１）溶血剤
以下の成分を含む下記組成の溶血剤を調製した。
グリシン １９．５ｇ／ｌ
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２５．０ｇ／ｌ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム ０．７５ｇ／ｌ
ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ
精製水 １ｌ
水酸化ナトリウム ｐＨが７．０となる量
【０１０７】
（Ａ−２）染色液
下記式で表される蛍光色素Ａをエチレングリコールで溶解したものである。
【０１０８】
【化７】
上記溶血剤と血液学的試料を混合し、これに上記染色液を、蛍光色素の最終濃度が２０ｐｐｍとなるように、混合して測定用試料を調製した。
【０１０９】
（２）処理試薬Ｂを用いた測定用試料
下記組成を有する溶血剤を用いた以外は、処理試薬Ａの場合と同様にして、測定用試料を調製した。
キシリトール ３７．０ｇ／ｌ
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２５．０ｇ／ｌ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム ０．７５ｇ／ｌ
ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ
精製水 １ｌ
水酸化ナトリウム ｐＨが７．０となる量
【０１１０】
〔測定〕
実施例１
血液学的試料ａ及び処理試薬Ｂを混合し、３３℃で５秒間反応させて調製した測定用試料をフローセルに導入し、フローサイトメータ（光源：赤色半導体：波長：６３３ｎｍ）で前方散乱光、側方散乱光、蛍光を測定した。測定結果を、前方散乱光強度と側方散乱光強度を二軸とする第１スキャッタグラム（図１３（ａ））、及び蛍光強度と前方散乱光強度を二軸とする第２スキャッタグラム（図１３（ｂ））に示す。
【０１１１】
図１３（ａ）において、第１細胞群の出現領域は、実線で囲まれた領域である。図１３（ｂ）において、第２細胞群の出現領域は、実線で囲まれた領域である。図１３（ａ）において、リンパ球を含む細胞集団が広がっていて、その一部が第１細胞群に重なっていた。
第１細胞群及び第２細胞群の双方に含まれる細胞の集団を、図１４に示す。図１４は、側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第３スキャッタグラムで、第１細胞群及び第２細胞群の双方に含まれる細胞集団は、実線で囲まれた部分に集中して出現していた。
【０１１２】
図１４の実線で囲まれた領域内の細胞数を計数し、全白血球数に対する割合を算出したところ、５８．５％であった。一方、血液学的試料ａを顕微鏡で観察し、骨髄芽球を計数した。視野における全白血球数に対する骨髄芽球の割合を求めたところ、４２．０％であった。
従って、本発明の測定方法によれば、顕微鏡観察と同程度の精度で、骨髄芽球を検出できることを確認できた。
【０１１３】
実施例２
血液学的試料ｂを処理試薬Ａで、３３℃で５秒間処理して調製した測定用試料を、フローセルに導入し、フローサイトメータ（光源：赤色半導体、波長：６３３ｎｍ）で前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光を測定した。測定結果を、前方散乱光強度と側方散乱光強度を二軸とする第１スキャッタグラム（図１５（ａ））、及び蛍光強度と前方散乱光強度を二軸とする第２スキャッタグラム（図１５（ｂ））に示す。
【０１１４】
図１５（ａ）において、第１細胞群の出現領域は、実線で囲まれた領域である。図１５（ｂ）において、第２細胞群の出現領域は、実線で囲まれた領域である。
第１細胞群及び第２細胞群の双方に含まれる細胞の集団を、図１６に示す。図１６は、側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第３スキャッタグラムで、第１細胞群及び第２細胞群の双方に含まれる細胞集団は、実線で囲まれた部分に集中して出現していた。
【０１１５】
図１６の実線で囲まれた領域内の細胞数を計数し、全白血球数に対する割合を算出したところ、２．４％であった。一方、血液学的試料ａを顕微鏡で観察し、骨髄芽球を計数した。全白血球に対する骨髄芽球の割合は２．５％であった。
従って、本発明の測定方法によれば、顕微鏡観察と同程度の精度で、骨髄芽球を検出できること、特に幼若顆粒球とも区別して、骨髄芽球を高精度に検出できることを確認できた。
【符号の説明】
【０１１６】
６ 制御部
７ 表示部（出力部）
２１ 光源
２６ 前方散乱光検出器
２９ 側方散乱光検出器
３１ 蛍光検出器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する方法であって、
前記試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させる工程、
前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する工程、及び
前記前方散乱光情報と、前記側方散乱光情報とに基づいて前記骨髄芽球と前記血小板凝集とを弁別する工程
を含む骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法。
【請求項２】
前記収縮させる工程は、前記試料と、界面活性剤と、可溶化剤とを混合させる工程である、請求項１に記載の弁別方法。
【請求項３】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンノニオン系界面活性剤である、請求項２に記載の弁別方法。
【請求項４】
前記可溶化剤は、サルコシン誘導体又はその塩である、請求項２又は３に記載の弁別方法。
【請求項５】
前記前方散乱光情報は前方散乱光強度であり、前記側方散乱光情報は側方散乱光強度である、請求項１−４のいずれか１つに記載の弁別方法。
【請求項６】
血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する装置であって、
前記試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させる試料処理手段、
前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する取得手段、及び
前記前方散乱光情報と、前記側方散乱光情報とに基づいて前記骨髄芽球と前記血小板凝集とを弁別する処理を実行する制御手段
を含む、骨髄芽球と血小板凝集との弁別装置。
【請求項１】
血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する方法であって、
前記試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させる工程、
前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する工程、及び
前記前方散乱光情報と、前記側方散乱光情報とに基づいて前記骨髄芽球と前記血小板凝集とを弁別する工程
を含む骨髄芽球と血小板凝集との弁別方法。
【請求項２】
前記収縮させる工程は、前記試料と、界面活性剤と、可溶化剤とを混合させる工程である、請求項１に記載の弁別方法。
【請求項３】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンノニオン系界面活性剤である、請求項２に記載の弁別方法。
【請求項４】
前記可溶化剤は、サルコシン誘導体又はその塩である、請求項２又は３に記載の弁別方法。
【請求項５】
前記前方散乱光情報は前方散乱光強度であり、前記側方散乱光情報は側方散乱光強度である、請求項１−４のいずれか１つに記載の弁別方法。
【請求項６】
血液学的試料に含まれる骨髄芽球と血小板凝集とを弁別する装置であって、
前記試料に含まれる赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与え、細胞膜が損傷した血球を収縮させる試料処理手段、
前記処理がなされた試料に光を照射することによって生じる前方散乱光情報と、側方散乱光情報とを取得する取得手段、及び
前記前方散乱光情報と、前記側方散乱光情報とに基づいて前記骨髄芽球と前記血小板凝集とを弁別する処理を実行する制御手段
を含む、骨髄芽球と血小板凝集との弁別装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１２−８８３３６（Ｐ２０１２−８８３３６Ａ）
【公開日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１１４８５（Ｐ２０１２−１１４８５）
【出願日】平成２４年１月２３日（２０１２．１．２３）
【分割の表示】特願２００６−９２４８０（Ｐ２００６−９２４８０）の分割
【原出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１月２３日（２０１２．１．２３）
【分割の表示】特願２００６−９２４８０（Ｐ２００６−９２４８０）の分割
【原出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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