４級ケリドニン及びアルカロイド誘導体類、それらの製造法、及び医薬の製造でのそれらの使用
本発明は、アルカロイド類をアルキル化剤、好ましくはチオテパと反応させ、水または適当な水性溶媒で洗浄することにより未反応のアルキル化剤及び他の水溶性化合物を反応混合物から除去し、反応混合物を強酸、好ましくは塩酸（ＨＣｌ）で処理し反応生成物の水溶性塩を沈殿させる方法で得られるアルカロイド反応生成物に関する。沈殿した該反応生成物は、少なくとも１種の４級アルカロイド誘導体を含み、予防及び治療、特に免疫または代謝障害及び癌の治療のための薬物として適している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の開発及び健康管理の分野に属し、ケリドニン（ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｎｅ）分子中の窒素が４級窒素であるアルカロイドケリドニン及びそれらの誘導体類に関する。本発明はまた、それらの化合物類の製造法、それらの化合物類を含有する組成物、様々な疾病及び身体上の状態の治療のためのそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカロイドケリドニン及びケリドニンを含有する組成物に関しては、代謝障害及び腫瘍を含む、様々な身体上の状態及び疾病においてケリドニンまたは一部のケリドニン誘導体類の治療剤としての使用が当業界に知られている。
【０００３】
ＤＥ２０２８３３０及びＵＳ３８６５８３０は、有機溶媒中でケシ科クサノオウ(Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ ｍａｊｕｓ Ｌ．、“白屈菜”として知られている)とトリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物とを反応させることにより、チオホスホルアミド−イソキノリン付加物を製造する方法を開示している。
【０００４】
ＡＴ３５４６４４及びＡＴ３７７９８８は、抗癌性の燐化合物類との反応によりアルカロイドの燐誘導体類（これらは塩への転換により水溶性を持つ）を製造する方法を開示している。開示された製造方法の不利な点は、反応生成物の水溶性塩への転換が不完全で、反応生成物の殆どが水に不溶になるということである。
【０００５】
ＵＳ５９８１５１２は、放射線障害の治療において、ＡＴ３７７９８８及びＡＴ３５４６４４に開示されている物質を使用することについて開示している。
【０００６】
前述した特許に記載されている化合物類は、異なる細胞増殖抑制作用及び抗癌作用を有する。アルカロイド類の混合物、特にクサノオウの全アルカロイドの混合物は治療上特に有望で、それらの薬理学的活性は癌治療に関する幾つかの研究で証明されてきた。未反応試薬は、反応の完了後に合成混合物から除去される。トリス(１−アジリジニル)ホルフィン硫化物(今後、“チオテパ”と称する)は、ベンゼン、エーテルまたはクロロフォルムのような有機溶媒に可溶であるため、従来技術によれば、エーテルで反応生成物を洗浄することにより合成混合物から未反応のトリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物を除去した。
【０００７】
薬理的に活性のケリドニン誘導体類を製造するための上記の従来技術は、例外なく、可燃性のまたは爆発性の有機溶媒を用いて最終生成物を精製する段階を必要とするが、本発明者によれば、水性溶媒を用いて精製が可能であるばかりでなく、より良い結果を得ることができる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第１の態様は、アルカロイド類、特にケリドニン、オキシケリドニンまたはメトキシケリドニンと、適当なアルキル化剤との反応生成物の斬新な製造法である。その製造法はアルキル化反応の完了後に、水性溶媒、好ましくは水で１回以上洗浄する段階を含む。
【０００９】
この方法はまた、広範囲な治療活性と共に低い毒性を有する注射可能な薬学製剤を製造するために、該アルカロイド誘導体類を水溶性塩へ転換させる段階を含む。
【００１０】
本発明の第２の態様として、水溶性の反応生成物類、例えばケリドニン誘導体類がある。ここで、最初のアルカロイド分子中の３級窒素は４級窒素へ転換され、４級窒素に対する第４のリガンドは低級アルキル残基、好ましくはメチルまたはエチル残基または置換されたメチルまたはエチル残基、例えばチオテパ残基である。好ましい実施態様によれば、４級ケリドニン誘導体類は標的組織、特に癌組織に選択的に蓄積するなどの特徴を持つ。
【００１１】
本発明の更なる態様は、少なくとも１種の４級アルカロイド誘導体類、特に本発明による製造法で得られる４級ケリドニン誘導体類を含む薬学組成物である。
【００１２】
本発明はさらに、治療的用途で使用するための薬物としての、４級アルカロイド誘導体類を含む反応生成物類の使用、及び様々な疾病または身体上の状態の治療のための薬学組成物の製造のための上記誘導体類の使用にも関する。
【００１３】
本発明の更なる実施態様は特許請求の範囲に記載されている。
【００１４】
本発明の製造法は、有機溶媒中のアルカロイドまたはアルカロイド類の混合物を、アルキル化剤、好ましくはそれ自体が治療活性を持つアルキル化剤、例えば少なくとも１つのアジリジン基を含む細胞毒性ホスホルアミド類または燐酸誘導体類と反応させ、次いでその反応生成物を水で洗浄することを含む。水またはそれに相当する水性溶媒、例えばマイルド（ｍｉｌｄ）塩溶液で洗浄する段階は特に、その後の、水難溶解性または水不溶性の反応生成物類、即ち４級アルカロイド誘導体類を水溶性化合物類、例えば塩類へ転換させる段階を促す。アルキル化剤が細胞毒性物質である場合、それが水溶性であるか、または少なくとも水と接触した後に水溶性成分に分解し、水洗により反応混合物から未反応のアルキル化剤またはその一部を実質的に取り除くことを可能にするのが好ましい。
【００１５】
水洗段階は、純粋な有機溶媒、例えばジメチルエーテルの爆発の危険に起因する複雑な安全対策をもはや取る必要がないので、実質的に製造プロセスを単純化することができる。従って、産業規模の製造も問題なく行うことができる。さらに、反応混合物中に存在する不必要な水溶性成分は反応生成物類から分離され、除去される。驚いたことに、水洗段階は、その後の、生成物の水溶性形態への転換段階の効率が、純粋な有機溶媒で洗浄を行った場合に比べ１０倍から１５倍までに増加するように、反応生成物の構造及び組成に対し有利な効果を与え、従って望ましい最終生成物の収率を著しく改善させる。
【００１６】
本発明の製造法は、例えばＡＴ３７７９８８の請求項１記載の化合物類を含む抗癌性の燐、特に本発明の図３に示されている燐化合物類、最も好ましくはアジリジン基を有する燐化合物でアルカロイド類をアルキル化させる反応で用いられ得る。
【００１７】
本明細書に使われている“ケリドニン（ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｎｅ）”とは、他に記載がない限りまたは発明の詳細な説明から明確に逸脱しない限り、ケリドニン，オキシケリドニン及びメトキシケリドニンからなる群から選ばれるものまたはその同等物を意味する。
【００１８】
本発明による適当な有機溶媒とは、反応に用いられるアルカロイド類が可溶となるいかなる試薬である。これらのアルカロイド類は、例えばモノクロロメタン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、モノクロロエタン、ジクロロエタン及びトリクロロエタンからなる群から選ばれる溶媒のような、アルキル化反応を促すか或いはそれに寄与する有機溶媒中に溶解され得る。
【００１９】
アルカロイド類のアルキル化反応は、高温で、好ましくは溶媒の沸点で起こる。
【００２０】
得られた反応生成物は、水で洗浄され、その後水溶性形態へ転換される。これは、ＨＣｌ気体のような液体または液体状の強酸中に通過させるか、または洗浄した反応生成物の有機溶液にＨＣｌ溶液を加えることによる(その間またはその後、塩酸塩が沈殿する)、水溶性塩（特に、塩酸塩）への転換により、ＡＴ３７７９８８及びＡＴ３５４６４４に記載されている製造法に従って行われ得る。このような酸処理により、殆どのアルキル化剤は、アルカロイド類とアルキル化剤から形成された中間反応生成物から分離され、そして修飾アルカロイド誘導体類が残る。この誘導体で、最初の３級窒素原子は４級窒素へ転換され、アルキル化剤に由来する残基または水素残基は第４のリガンドとして上記４級窒素に結合する。上記アルキル化剤に由来する残基は、メチル、エチル、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物残基、またはトリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物の一部からなる群から選ばれるのが好ましい。理解を助けるために、下記の化１は本発明の典型的な４級アルカロイド反応生成物(ケリドニンとして例示される)を示す。
【００２１】
【化１】
Ｒ１＝メチル、エチル、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物、メチル−Ｒ２、エチル−Ｒ２（Ｒ２はトリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物の一部である）
【００２２】
本発明による、沈殿された反応生成物中１つの元素分析の結果から(実施例３参照)、特定の理論に拘るわけではないが、アルキル化反応後反応混合物の酸処理、例えば４級化反応により得られた、アルキル化剤の少なくとも一部またはアルキル化剤の分解化合物類は、沈殿の結晶中である程度咬合するか、或いはある程度結晶に強く付着するので、ジクロロメタン及びエーテルのような有機溶媒で洗浄することによる沈殿の精製が行われ得る。それにもかかわらず、反応生成物は、そのような付加物質の存在下でも完全に作用性を持つことが判明した。
【００２３】
反応生成物の水溶性塩は注射溶液として使用するに適している。
【００２４】
本発明の１つの実施態様として、その反応は薬局方でチオテパとして知られている、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物(ＣＡＳ ５２−２４−４番)を用いて行われる。それに類似したものとしては、レデルテパ、オンコ（Ｏｎｃｏ） チオテパ、ＴＥＳＰＡ、テスパミン、チオホスファミド、チオ−ＴＥＰＡ、チオトリエチレンホスホルアミド、チィホシル（ｔｉｆｏｓｙｌ）、トリアジリジニルホスフィン硫化物、Ｎ，Ｎ’、Ｎ”−トリ−１，２−エタンジイルホスホロチオイン トリアミド；Ｎ，Ｎ’、Ｎ”−トリ−１，２−エタンジイルチオホスホルアミド、トリ−(エチレンイミノ)チオホスホルアミド；Ｎ，Ｎ’、Ｎ”−トリエチレンチオホスホルアミド、トリエチレンチオホスホロトリアミド、ｍ−トリエチレンチオホスホルアミド、ｍ−トリス（１−アジリジン−１−イル）ホスフィン硫化物、トリエチレンチオホスホルアミド、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン サルファ、トリス(エチレンイミノ)チオ燐酸、ＴＳＰＡ及びＷＲ４５３１２がある。
【００２５】
本発明の更なる実施態様によれば、有機溶媒中のアルカロイド類、任意にはクサノオウの全アルカロイド類の抽出物をトリス(１‐アジリジニル)−ホスフィン硫化物(チオテパ)と反応させ、次いで、得られた反応生成物、任意には化合物類の混合物中に存在する反応生成物を水で少なくとも１回洗浄する。チオテパは水中で分解するため、反応後の過剰なチオテパの転換されない残留物は、この手段により、有機相から除去され得る。好ましくは、中間反応生成物、即ちアルキル化剤及びアルカロイド類の間に形成された化合物を含む有機溶液を数回水洗し、毎回水で飽和させる。特に好ましくは、過剰な猛毒性のチオテパが反応生成物から完全に除去されるまで洗浄を繰り返す。
【００２６】
また、医薬的使用において不作用に係り、肝臓で肝硬変症を引き起こし得る一部の水溶性毒性アルカロイド類は、水相で合成混合物からそれらを除去するか、或いはそれらの濃度を減少させる。エイムス（Ａｍｅｓ）テストにより、本発明により製造された、この実施態様の反応生成物が突然変異誘発性を持たないことが判った。
【００２７】
出発原料としてクサノオウからの全アルカロイドの抽出物を用いる場合に、最終反応生成物はアルカロイド類と、チオテパ及びチオテパの分解生成物との高分子量反応生成物を含むアルカロイド類の混合物である。合成プロセスの結果として、アルカロイド類の溶解度は変わる。反応生成物は、未反応のクサノオウのアルカロイド類約６０−７０％と、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物の反応生成物約３０−４０％の混合物からなる。
【００２８】
３級アルカロイド類は、クサノオウから得られたアルカロイド抽出物の出発成分の主な部分を代表する。例えば、下記の３級アルカロイド類は合成混合物中に出発成分として含まれても良い：ケリドニン、プロトピン、スチロピン、アロクリプトピン、α−ホモケリドニン、ケラミジン、ケラミン、Ｌ−スパルテイン、ケリジメリン、ジヒドロサンギナリン、オキシサンギナリン及びメトキシケリドニン。
【００２９】
アルキル化反応後、未反応の４級アルカロイド類（例えば、ベルベリン）は水洗により反応混合物から実質的に除去される。一方、未反応の水不溶性アルカロイド類及びアルキル化アルカロイド反応生成物は有機溶媒中に残存する。アルキル化反応に用いられたアルキル化剤及び／または有機溶媒の性質に基づき、得られる中間反応生成物はチオテパに結合している化合物類を含んでも良く、ここで１つのチオテパ分子は１つ、２つまたは３つのケリドニン、オキシ−ケリドニンまたはメトキシ−ケリドニン分子類に結合している。さらに、それはアルキル化アルカロイド誘導体類を含んでも良く、ここでアルカロイド分子、例えばケリドニン、オキシ−ケリドニンまたはメトキシ−ケリドニン分子は、その４級窒素の位置で短鎖の直鎖状のアルキル残基、特にメチルまたはエチル基に結合している。さらにアルキル化された反応化合物が、アルキル化反応後に反応混合物中に存在しても良い。
【００３０】
本発明に従い、クサノオウの全アルカロイド類とチオテパとの反応から得られた反応生成物は、類似した製造法(洗浄段階が有機溶媒，例えばジエチルエーテルにより行われる)から得られた反応生成物より良い治療活性を示す。本発明の反応生成物中に存在する少なくとも一部の化合物、特に４級ケリドニン誘導体類は、癌組織に選択的に蓄積し、アポプトシスにより癌細胞を破壊する。（知られている殆どの細胞増殖抑制剤とは対照的に、健康な細胞を攻撃しない）これはそのような製剤を用いる治療に対する良好な許容性、そして遺伝子の配列などに起因する癌の発病の危険度が高い個体で治療的、及び予防的使用に対する全体的な適合性をもたらす。それは取り扱いが簡単で、治療用量で有意な副作用を起こさない。
【００３１】
クサノオウの全アルカロイド類とチオテパとを反応させて得られた反応生成物は、代謝の調節で生物学的活性を示し、そして代謝疾病（例えば、骨粗しょう症）ばかりでなく、リューマチ性疾病、アレルギー、ウイルス感染、てんかん、多発性硬化症、はん痕、皮膚腫瘍、手術後の傷害及び放射線障害の治療及び予防にも適している。
【００３２】
クサノオウの乾いた根の抽出物は合成のための出発物質として用いられても良い。根は葉または茎より多量のアルカロイド類を含む。
【００３３】
驚いたことに、つい最近、唯一のアルカロイド源（ｓｏｕｒｃｅ）として、商業的に利用可能なケリドニン、オキシケリドニンまたはメトキシケリドニンで合成を開始する場合に、本発明の製造法(実施例３参照)に従って得られた反応生成物は、実施例１に従ってクサノオウの全アルカロイド類のアルキル化反応から得られる反応生成物に少なくとも類似した治療効果及び活性を示すことが判明した。
【００３４】
通常の薬剤学的賦形剤類、特に溶液類、例えば注射溶液類または注入溶液類、または軟膏剤のための賦形剤、圧迫ガーゼ（ｃｏｍｐｒｅｓｓ）または懸垂帯の基剤は、本発明により製造された反応生成物を含む薬物類に適している。
【００３５】
以下の実施例は本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００３６】
Ａ）アルカロイド類の抽出：
ａ．２５ｇのアルカロイド塩混合物を水中に懸濁し、分液漏斗へ移す。ジクロロメタン１００ｍｌを追加した後に、分離漏斗を振とうする。そして有機相を分離し、濾過してガラス瓶に入れる。
【００３７】
ｂ．混濁が生じるまで、１ＮのＮａＯＨ（ｐＨ８−９）を水相に加える。ジクロロメタン１００ｍｌを追加した後に、混合物を振とうする。その後、有機相を分離し、ステップaからのジクロロメタン相と合わせる。このプロセスを例えば3回繰り返す。有機相をろ過し合わせる。
【００３８】
ｃ．水相はＮａＯＨを加えｐＨを１０に調整する。ジクロロメタンを追加した後に、混合物を振とうする。その後、有機相を分離、ろ過そして他の有機相と合わせる。水相を今度はＮａＯＨでｐＨを１３に調整し、そして抽出をジクロロメタンで繰り返す。
【００３９】
ｄ．合わせた有機相を蒸発させて油性の茶色の物質を得る。
【００４０】
Ｂ）トリス（１−アジリジニル）ホスフィン硫化物との反応:
アルカロイド残留物をジクロロメタン中に溶解させ、そしてトリス（１−アジリジニル）ホスフィン硫化物を加える。その混合物を８０℃で２時間還流させる。室温に冷却後、反応混合物は透明になる。そしてろ過を行い、ろ過物を分離漏斗の中で、２５０ｍｌの水で数回、例えば３回以上洗浄する。
【００４１】
Ｃ）塩化水素との反応
洗浄した溶液をガラスビーカーに移し、かき混ぜ、ＨＣｌガスで飽和させると塩酸塩錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）が沈殿する。沈殿生成物をろ過しジエチルエーテルで洗浄、乾燥後、水に溶解する。
【００４２】
ラットでは、４８５ｍ／ｋｇのＬＤ50値が、実施例lによる反応生成物から確定された。マウス及びラットの研究で、本発明の生成物が胸腺のホルモン調節を調整し、胸腺を除去した動物でチモシンに類似した活性を有する物質の合成を引き起こすことを見出した。この結果は用量に依存する。その製剤は動物実験において、末梢血のＴ−リンパ球の数を、５０％まで（処理前４．０４±０．４３ｘ１０９／ｌ、 処理後６．２４±０．７３ｘ１０９/ｌ）増加させ、進入抗原への体液性免疫反応及び脾臓細胞のナチュラルキラー細胞活性（対照群での７１．５０±９．１０％に対して１９８．２０±１７．６９％）を調整し、白血球のインターフェロン遊離性を強める。動物実験の結果は臨床での観察によって確認された。したがって、免疫パラメーターでの改善は癌患者の中でも観察された。
【００４３】
予防と免疫の用途のためには、実施例１の製剤を体重７０ｋｇ当たり約５ｍｇの用量で使用することができる。癌治療の場合、体重２０ｋｇ当たり製剤５ｍｇを投与することが好ましい。
【実施例２】
【００４４】
ＨＬＰＣフィンガープリント
測定は傾斜（ｇｒａｄｉｅｎｔ）モードにおけるイオン対逆相クロマトグラフィーと、２８５ｎｍのＤＡＤ検出器を使用したスペクトル測定により実行された。同時に、クロマトグラムは基準アルカロイドを使用した。さらに、ＨＰＬＣ−ＭＳＤの分析が行われたが、該アルカロイドのピークから逸脱したピークは見られなかった。
1126836197859_0
及び２のＨＰＬＣダイアグラムは次の実験データに基づいて得られた:
【００４５】
クロマトグラフィーのパラメーター
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂ，５μｍ， １２５ｘ２４ｍｍ ＩＤ
溶離液：Ａ）アセトニトリル２００ｍｌ＋水８００ｍｌ＋ヘキサンスルホン酸 １．５ｇ＋８５％リン酸０．３ｍｌ
Ｂ）アセトニトリル９００ｍｌ＋水１００ｍｌ＋ヘキサンスルホン酸１．５ｇ＋８５％リン酸０．３ｍｌ
傾斜（勾配）５ 分 ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ １００％ Ａ；
２４分で４０％Ｂまで
１分で１００％Ｂまで
５分１００％Ｂ；
５分１００％Ａと平衡
検出：２８５ｎｍの紫外光線
溶離液流量：１ｍｌ／分、３５分後に止まる
注入量：１０μｌ
試料作成：反応前の抽出（図１）：２５ｍｇのアルカロイド類を４０ｍｌのメタノールで超音波溶解し５０ｍｌまでにして精密ろ過膜でろ過する。
反応生成物（図２）:反応生成物を塩酸塩に変換し、水に溶かして１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、ｐＨ２．５〜６．５に調整する。
【実施例３】
【００４６】
実施例１に記載されている条件に従って、商業的に利用可能な、精製ケリドニン（Ｓｉｇｍａ）をトリス（１−アジリジニル）ホルフィン硫化物（チオテパ）と反応させた。アルキル化反応段階、洗浄段階、及びＨＣｌガスを用いる転換段階の完了後に、最終生成物を以下のようにさらに処理した：
【００４７】
ＨＣｌで処理して水溶性の反応生成物３４０ｇを水中に溶解し、飽和に近く濃縮させ、８℃の冷蔵庫の中に放置した。数時間後、自発的に沈殿が起こり、２６４ｍｇの沈殿物(今後、Ｕ−ＫＲＳと称する)を収集した。その沈殿物は、２０５−２０７℃のより狭い範囲の沸点を持ち（かなり良く結晶化されている生成物であることを示す）、３６６ｎｍの紫外光線で照射する際に淡青色の蛍光を示す、淡黄色の吸湿性の結晶を含んだ。黄色、オレンジ色、及び赤色の蛍光帯の痕跡も見られた。その生成物は、薄層クロマトグラフィーで、少なくともＲｆ＞０．１になるように移動した痕跡を除けば、どんな動きも見せずに出発点（Ｒｆ＝０）に留まっていた。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（図４）から、Ｕ−ＫＲＳがケリドニン分子に含まれているものに類似した芳香環を含んでいることが明らかになった。ＵＶスペクトル（図５）は、ケリドニンのＵＶスペクトル（図６）にかなり類似した、１４８、１５５、１６０、２０５、２３０及び２８２ｎｍで最大吸光を示すが、ただＵ−ＫＲＳの場合２３０ｎｍで、ケリドニンの場合２４０ｎｍでそれぞれピークを示すというところだけが異なっていた。これは、Ｕ−ＫＲＳの窒素が４級である一方、ケリドニンの窒素は３級であることを示す。
【００４８】
より詳細な分析情報は、図７及び８（Ｕ−ＫＲＳ）及び図９（ケリドニン）に示されている質量分光写真、及び以下の組成（表１）を示すＵ−ＫＲＳの元素分析結果から得られる。
【００４９】
全質量に対する白分率（％）で示したＵ−ＫＲＳの元素組成
【表１】
【００５０】
以下の実施例は、実施例３に記載されている方法から得られる化合物Ｕ−ＫＲＳの様々な用途を示す。
【実施例４】
【００５１】
抗腫瘍剤Ｕ−ＫＲＳによるインビトロ細胞成長の選択的阻害
材料及び方法
細胞培養は、８％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で、３７−３７．５℃の、茶色瓶内で行われた。融合した培養物は、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中０．０１％トリプシン及び０．２％ＥＤＴＡの溶液により分離され、１：５から１：２５の割合で分配された。
コラゲナーゼ処理を行って臍静脈からヒト内皮細胞を分離した。内皮細胞の培地は、１５％熱不活性化ウシ胎児血清、２００μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子及び９０μｇ／ｍｌのへパリンを補充したＭ１９９であった。
【００５２】
蛍光顕微鏡検査法
細胞を３５ｍｍディッシュで成長させ、１００μｇ／ｍｌのＵ−ＫＲＳで３０−６０分間インキュベートした。その培地を吸入し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞上にカバーガラスを設け、
アルゴンレーザー源を備えた共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用い蛍光を励起させた。その放出光は増倍型光電管チャネル中で検出された。ＭＲＣ６００映像処理ソフトウェアを用い、信号をビデオモニター上に映した。
【００５３】
結果
１．２０−４０μｇ／ｍｌのＵ−ＫＲＳで、内皮細胞の成長は約５５％阻害された。このような濃度はヒト骨肉腫細胞株を死滅させた。２つの細胞タイプのハイブリッドは正常細胞とほぼ同じ感度を示した。
２．自己蛍光のため、Ｕ−ＫＲＳは細胞内で検出され得る。レーザースキャニング顕微鏡は悪性細胞で高い程度のＵ−ＫＲＳの取り込み率（ｕｐｔａｋｅ）を示した。
【実施例５】
【００５４】
抗癌剤としてのＵ−ＫＲＳ−酸素消費
材料及び方法
マウスでのインビボ実験。５匹の対照動物のうち２匹にそれぞれ５０μｇのエーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）マウス腹水腫瘍サスペンション（それは８日齢の、成体のドナー動物から新たに分離したものである）を腹腔内へ注射した。対照群にはそれ以上処理しなかった。試験群には、腫瘍の移植の直後に、１０ｍｇのＵ−ＫＲＳ／ｋｇ（動物の体重）を腹部に注射した。
【００５５】
結果
腹水腫瘍を移植したマウスは、Ｕ−ＫＲＳの服腔内投与後或いは皮下投与後共に、そのような処置が施されなかった移植動物に比べ、より長い生存期間を示した。
インビトロで電極により腹水腫瘍サスペンションの酸素消費を測定した結果、Ｕ−ＫＲＳの添加後しばらくは酸素消費が増加したが、その後、Ｕ−ＫＲＳを含んでいない対照サスペンションと違って酸素消費が迅速に減少した。
【実施例６】
【００５６】
げっ歯類でＵ−ＫＲＳによるモルヒネの抗侵害受容作用の改質
材料及び方法
動物：実験は雄アルビノスイス（Ａｌｂｉｎｏ Ｓｗｉｓｓ）マウス及び雄ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットに対し行われた。
処置：マウスに対し２０ｍｇ／ｋｇ、ラットに対し２５ｍｇ／ｋｇのＵ−ＫＲＳを初期用量として服腔内へ注射した。
実験方法：各々の実験で、４群の動物に１）偽薬、２）モルヒネ、３）Ｕ−ＫＲＳ、４）Ｕ−ＫＲＳ+モルヒネを注射した。
【００５７】
結果：
Ｕ−ＫＲＳとモルヒネを同時に投与すると、麻薬性鎮痛剤の作用が改質された。これらは、潜伏期間の増加から明らかなように、ラットのテール−フリック（ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ）テストで抗侵害受容作用を引き起こした。
このような結果は、モルヒネと同時に投与されたＵ−ＫＲＳが、前述したテストで侵害受容反応に対する実験動物の感受性を変化させることを示す。この結果はＵ−ＫＲＳが、癌に用いられる鎮痛剤と互いに作用し得ることを示唆する。
【実施例７】
【００５８】
誘導体Ｕ−ＫＲＳによる、悪性細胞で複蜂性の（ｂｉｍｏｄａｌ）プログラム細胞死の誘導
材料及び方法
Ｋ５６２赤白血病細胞株を用い、純粋な結晶形態で生成されたＵ−ＫＲＳを水中に１．２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。
様々な濃度のＵ−ＫＲＳに露出されたＫ５６２細胞中ＤＮＡの含量は、ヨウ化プロピジウム及びフローサイトメトリーを用い分析した。
【００５９】
結果
この研究の結果は、Ｕ−ＫＲＳが複蜂性のプログラム細胞死を誘導することを示す。そのうち第１の蜂であるアポプトシスはキニジン感受性Ｃａ２+−依存性Ｋ+チャネルにより媒介され；第２の蜂である水疱（ｂｌｉｓｔｅｒ）細胞死は微小管の形成を防止し、したがって多倍数性の誘導を防止することにより媒介される。
【実施例８】
【００６０】
悪性細胞でＤＮＡ、ＲＮＡ及びたんぱく質合成に対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
３Ｈで標識されたチミジン、２０μｌ培地中０．５μＣｉ；ウリジン、２０μｌ培地中０．５μＣｉ；及びロイシン、２０μｌ培地中１．０μＣｉを、異なるＵ−ＫＲＳ濃度を持つ４つのウェル内に２−４時間放置した。その前に、細胞株、モルモットの肝細胞、Ｃ１Ｌ肝細胞，ヒト扁桃腺細胞、マウスのリンパ種、マウスの骨髄種、ヨシダ細胞、２つのＨｅＬａ菌株、ＥｓＢ−、ＥＢ、リンパ種、ＺＡＣ／１、Ｐ８１５を、９６マイクロタイターウェル中に３７℃で２４時間成長させた。
ＷｉＤｒ細胞は、１、４、８及び１４μｇ／ｍｌのＵ−ＫＲＳ濃度で６時間及び２４時間の多少異なる計画でインキュベートした。
【００６１】
結果
蛍光分析で、Ｕ−ＫＲＳは、他の癌細胞域に比べて、癌細胞の核の構成要素により強い親和性を示す。蛍光現象は腫瘍及び転移域でＵ−ＫＲＳの強い、かつ迅速な親和性を明確に示す。テストされた癌細胞株の成長を１００％阻害する供与量で処置した正常細胞において毒性効果は一切見られない。
【実施例９】
【００６２】
ヒト異種移植片に対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
ヒト腫瘍異種移植片から腫瘍細胞を取り、それを連続的にヌードマウスへ移植した。これらの細胞はインビトロコロニー形成分析に用いられた。腫瘍細胞を様々な濃度の薬物Ｕ−ＫＲＳと共に少なくとも一週間連続的にインキュベートした。それは６種の異なるタイプに対して行われ、各々の腫瘍に対しコロニー形成が評価された。薬物の効果は百分率Ｔ／Ｃ（試験群／対照群）として報告された。
【００６３】
結果
多くの異なる種類の腫瘍は、Ｕ−ＫＲＳによりテストされた様々な場合に関連して、Ｕ−ＫＲＳに感受性を持つ。殺腫瘍性の効果は免疫器具の再生能力に依存するものと見られ、その免疫器具の刺激及び調整はＵ−ＫＲＳにより行われ得る。
【実施例１０】
【００６４】
ヒト悪性細胞株に対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
４種の悪性細胞株を用いた：１）マウス肉腫；２）乳癌；３）ヒト結腸癌；４）ヒト黒色種。
Ｕ−ＫＲＳ及びＰＰ９ＡＡ０２誘導体を培地に加えた。
照射後、１つのスライド当たり２００個の細胞をプレートし、１週間インキュベートし、その後に染色し、その数を数えた。
【００６５】
結果
ここに示されている結果は、Ｕ−ＫＲＳ及びＰＰ９ＡＡ０２誘導体がヒト悪性細胞株に対し細胞毒性物質として相乗的に作用することを意味する。
【実施例１１】
【００６６】
ヒト類表皮癌細胞株でＵ−ＫＲＳにより誘導されたＧ２／Ｍの阻止（ａｒｒｅｓｔ）及びアポプトシス
材料及び方法
一次性のヒトケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を新生児の皮膚試料から分離した。表皮シートをトリプシンで分解し、遠心分離により単一細胞サスペンションを収集した。
【００６７】
結果
Ｕ−ＫＲＳは用量依存的に細胞サイクルの進行を妨げる。
Ｕ−ＫＲＳ処理はＡ４３１及びＭＥ１８０細胞で細胞サイクル分布に影響を与え、アポプトシスを誘導する。
サイクリン類、ＣＤＫ類及びＣＤＫ阻害薬ｐ２７の発現は、Ｕ−ＫＲＳでの処理後に、変化する。
【実施例１２】
【００６８】
Ｕ−ＫＲＳの抗転移的効果、及び黒色種Ｂ−１６を持つマウスの酸素及びエネルギー代謝に対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
実験は１３３ Ｃ５７Ｂ／６雄マウスで行われた。転移性の黒色種Ｂ−１６を各々のマウスの右脛筋肉へ移植した。腫瘍移植後１０日目に、該動物を２つの群に分けた。１つの群には、目の静脈洞に０．０５ｍｌ容積で１ｍｇ／ｋｇ用量のＵ−ＫＲＳを与えた。１日おきに一回、全５回注射した。もう１つの群には、目の静脈洞に滅菌した生理食塩水を同様に与えた。
【００６９】
結果
Ｕ−ＫＲＳを最初に静脈注射した後１日目に、筋肉組織で酸素レジームの指数は著しく向上した。ｐＯ２レベルのレートは酸素吸入の際に最大まで増加し、ｐＯ２のレートは吸入の停止後最大レベルから初期レベルまで下がった。試験群の動物で、肝臓ミトコンドリアの酸化的リン酸化の特定の指数はまた、製剤の投与後１日で増加した。悪性過程の進行中に、酸素及び代謝は阻害されるのが判った。Ｕ−ＫＲＳを５回注射したマウスでは、そのような阻害がそれほど著しくはなかった。対照群の動物の場合、筋肉組織で酸素圧力のレベル及びそこへのＯ２運搬速度は統計的に高かった。得られたデータを一般化すると、Ｂ／１６黒色種を持つマウスでＵ−ＫＲＳが組織への酸素の運搬を増加させるばかりでなく、生体エネルギー論に基づき悪性過程の破壊的な効果を阻害するという結論に到達することができる。
【００７０】
以下の実施例はＵ−ＫＲＳの免疫−調整特性及び代謝−調節特性を説明する。これらの特性は、Ｕ−ＫＲＳが、特にアレルギー反応、ウイルス疾病（ＨＩＶ、肝炎Ａ、Ｂ及びＣ、大腸菌、インフルエンザ）、骨粗しょう症、多発関節炎、乾癬及び他の疾病または身体の状態の治療に適するようにする。
【実施例１３】
【００７１】
Ｕ−ＫＲＳによる大食細胞の殺腫瘍活性の向上
材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスは，実験室で近親交配（ｂｒｏｔｈｅｒ／ｓｉｓｔｅｒ ｍａｔｉｎｇ）により維持された。皮下注射により腫瘍Ｄ１ ＤＭＢＡ／３を通常的にＢＡＬＢ／ｃに移植させた。腫瘍は移植後５日に明らかになった。
【００７２】
皮下腫瘍移植後５日目に、Ｕ−ＫＲＳを用いるインビボ処置を開始した。３つの投与経路、即ち静脈、服腔、及び皮下を用いた。それぞれ少なくとも１０匹のマウスからなる３つの全試験群には、ＰＢＳ０．１５ｍｌ中５．０μのＵ−ＫＲＳを投与した。その投与量は予備実験に基づき選ばれた。
【００７３】
結果
処置したマウスで、腫瘍の成長速度は著しく減少した。Ｕ−ＫＲＳを投与したマウスでは該薬物に関するいかなる副作用も見られなかった。
【実施例１４】
【００７４】
正常のヒトリンパ球の表現型に対するＵ−ＫＲＳのインビトロ効果
材料及び方法
この研究は１０名の健康な志願者の抹消血から分離したリンパ球に対して行われた。その細胞は、フィコル−パーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）濃度勾配遠心分離で分離された。細胞の生存度は、０．１％トリパンブルー染色により、９５％であることが判った。
全Ｔ−細胞、Ｔ−ヘルパー細胞及びＴ−サプレッサー細胞に対するモノクローナル抗体を用い、免疫蛍光法によりリンパ球の分集団を定量した。次いで、その細胞を、ＦＩＴＣ／接合ウサギＦ／ａｂ／２断片抗−マウスＩｇＧで処理し、ＰＢＳで洗浄し、ポリビニル−アルコール及びグリセロールを用いスライド上に置いた。対照製剤では、モノクローナル抗体の代わりにＰＢＳまたは正常マウス血清を用いた。
【００７５】
結果
Ｔ−細胞の分集団に対するＵ−ＫＲＳの直接的な影響の可能性を示す本研究により、Ｕ−ＫＲＳが癌患者で細胞性免疫に対する優れた免疫刺激物質になり得るということを確認した。
【実施例１５】
【００７６】
ヒト抹消血の単球（単核細胞）に対するＵ−ＫＲＳの細胞分裂誘起特性
材料及び方法
抹消血単核細胞。血液を同容積のＰＢＳ（ｐＨ７．５で、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）で希釈し、ヒストパーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）１０７７上に層状にした。そのチューブを２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。リンパ球を含む界面層を収集し、ＲＰＭＩ組織培地で３回洗浄した。
【００７７】
結果
細胞をＵ−ＫＲＳで短時間前処理しても、それはＰＨＡ細胞分裂誘起特性に対し強力な上昇効果をもたらし、その結果ＰＨＡを単独で使用した場合に比べ著しく高い細胞刺激指数を示すことが判明した。さらに、細胞をＰＨＡで短時間処理することが、その細胞分裂誘起効果を奏するのにいつも肝要であることも判った。
その研究は、Ｕ−ＫＲＳで処理した悪性の発展段階で、患者の循環性リンパ球が著しく増加することを示す。
【実施例１６】
【００７８】
Ｕ−ＫＲＳによる、インビボで免疫効果器細胞の細胞溶解活性及び腫瘍成長阻害の調整
材料及び方法
腫瘍細胞：肥胖細胞腫Ｐ８１５及びＡＫＲ白血病ＡＫＩＬ細胞株を、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む９．０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中に維持させた。
【００７９】
結果
本インビトロ研究は、Ｕ−ＫＲＳが、同種異系免疫化されたマウスから得られた脾性のリンパ球の溶解活性を４８倍まで増加させる、効果的な生物学的反応調整剤であることを示す。ＩＬ−２で処理した脾細胞及び服腔の滲出液リンパ球の溶解活性はまた、細胞により媒介される溶解分析媒質にＵ−ＫＲＳを加えることにより著しく増加した。
Ｕ−ＫＲＳがまた脾のリンパ球の細胞溶解活性を強めるという結果は、インビボで観察されたＵ−ＫＲＳの治療効果が免疫効果器細胞の細胞溶解活性を刺激することにより媒介されることを示す。
【実施例１７】
【００８０】
インビトロ及びインビボで免疫学的血液パラメーターに対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
この研究では９６匹のウィスターラットを用いた。初期年齢は雄及び雌ラット共に１６週であった。
用量０．０１から２０μｇ／ｍｌでの刺激指数を評価するために、Ｕ−ＫＲＳ及びＰＨＡをＴリンパ球上で＃Ｈチミジンテストにより試験した。
【００８１】
結果
Ｕ−ＫＲＳは、造血及び免疫系の異なるサブセットを刺激する。この実験では、特定の幹細胞を刺激した場合、或いは赤血球形成系の一般的な活性化の場合に起こり得る徴候として、網状赤血球増加症が誘導される。絶対的な白血球数での変化がないことが判れば、Ｕ−ＫＲＳの作用により、強力な調整特性（例えば、異なるサブセットの転位）がこの実験で起こると仮定しても良いだろう。
これらの実験で得られたものに類似した刺激が、癌細胞でのアポプトシスを含めて、インビトロで見られた。
【実施例１８】
【００８２】
マウスでオバルブミン抗原性及び抗オバルブミンＩｇＥ抗体反応に対するＵ−ＫＲＳの阻害効果
材料及び方法
オバルブミンにより誘導された感作を阻害するＵ−ＫＲＳの能力を、ＢＡＬＢ／ｃ及びＦ1(ＢＡＬＢ／ｃ ｘ Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ)マウスでテストした。Ｕ−ＫＲＳは抗原（オバルブミン）及びアジュバント（明礬）との混合物の形態でマウスへ導入され、マウスの感作を妨げ、より低い抗−ＯＡ ＩｇＥ抗体反応で応答し、並びに感作されたマウスの腹膜腔から分離した肥満細胞からの、抗原により誘導された、ヒスタミンの放出を減少させた。アナフィラキシーで抗原性ｏｄオバルブミン（ＯＡ）に対するＵ−ＫＲＳの効果は、ラットに対し異種性の手動的皮膚のアナフィラキシー反応でテストした。
【００８３】
結果
その結果は、Ｕ−ＫＲＳとの混合物で製造されたＯＡが、異種のＰＣＡ反応でラットの肥満細胞の表面に付着されかつマウスで自生のＯＡに対し生成された、抗−ＯＡＩｇＥ抗体と反応する能力が減少したことを示す。その結果は、ＯＡのＵ−ＫＲＳ前処理が、その抗原性、及び自生のＩｇＥ分子に対し生成された抗−ＯＡＩｇＥ抗体類と反応する能力に影響を及ぼし得ることを示唆する。
【実施例１９】
【００８４】
初期骨粗しょう症に対するＵ−ＫＲＳ治療の効果
材料及び方法
卵巣摘出術による初期骨粗しょう症を持つ雌ラットにＵ−ＫＲＳを３０ｍｇ／ｋｇの用量で１日おきに6ヶ月間腹腔内投与した。Ｕ−ＫＲＳの投与は外科手術後２日目に開始した。Ｕ−ＫＲＳを用いる長期治療の末期に、すべてのラットに対し、両方の上腕骨の力をテストし、そしてラット大たい骨の幾つかのパラメーターを測定した。
【００８５】
結果
その結果は、上腕骨の機械的強度の減少及び卵巣摘出術により誘発された大たい骨での幾つかの変化が、６ヶ月間のＵ−ＫＲＳ治療により予防されたことを示す。
【実施例２０】
【００８６】
細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、及びインフルエンザウイルスに対するＵ−ＫＲＳ製剤の影響
材料及び方法
インフルエンザウイルス菌株ＡＰＲ８／ＨＯＮ１／３４を雌鶏のエンブリオ上で培養した。
現在臨床的に用いられている大腸菌及び黄色ブドウ球菌株２０９Ｐを用いた。Ｕ−ＫＲＳ製剤シリーズ２９０６１４
【００８７】
結果
この研究では、感染されたマクロ生物体でＵ−ＫＲＳ製剤の抗−感染作用の存在を確認した。そのような作用は、これらのマイクロ生物体で感染された細胞またはマイクロ生物体の２次的分解に起因する、宿主免疫系の幾つかのエレメントの刺激を通じて働く。
【実施例２１】
【００８８】
インフルエンザウイルスに対するＵ−ＫＲＳの生物学的活性
材料及び方法
Ａタイプのウイルス、ポート−チャルメルス（Ｐｏｒｔ−Ｃｈａｌｍｅｒｓ）１／７３培養物、抗原性Ｈ３Ｎ２変種。
このウイルスに、エンブリオ当たり１、１０及び１００ＥＩＤ５０を注射した。Ｕ−ＫＲＳをハンクス溶液中に溶解させた。
【００８９】
結果
Ｕ−ＫＲＳが、感染プロセスの発展を妨げる作用を持つことを確認した。
【実施例２２】
【００９０】
照射の効果に対するＵ−ＫＲＳの作用
材料及び方法
１６／２０ｇ体重のＣＢＡ／Ｊ雄マウス
マウスに対し、６．０Ｇｙから７．５Ｇｙまでの用量で短期間全身カンマ−照射を行った。ＣＥＧＯ装置を用いて蓄積線量８．７５Ｇｙで長期照射を行った。
Ｕ−ＫＲＳは０．１、１．４及び１２ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で服腔内投与した。
【００９１】
結果
照射の効果を改質させるＵ−ＫＲＳの能力は、０．１から１２ｍｇ／ｋｇの薬物投与量を用い、ＣＢＡ／Ｊマウスで研究された。Ｕ−ＫＲＳは、照射用量５．００から７Ｇｙでマウスの生存率を５０―６０％まで増加させたが、７．５Ｇｙの用量ではいかなる効果も見られなかった。薬物用量の変更は、照射の結果に影響を及ぼさなかった。
本研究の主な成果は、Ｕ−ＫＲＳが予防及び治療に適用された場合に、照射の効果を改質することができるということにある。
【実施例２３】
【００９２】
イオン化放射線に対するＵ−ＫＲＳの効果
材料及び方法
乳癌、結腸直腸の腺癌、神経膠芽細胞腫及び膵臓腺癌の細胞株。Ｕ−ＫＲＳ製剤。
細胞生存に対するＵ−ＫＲＳの効果を、０．２μＧ ＭＬの濃度でテストした。その露出時間は１、３及び２４時間で、その後細胞をリン酸塩／緩衝塩水で洗浄し、新しい培地を加えた。
【００９３】
結果
Ｕ−ＫＲＳで処理した場合、クローン原性の細胞生存において、特異の時間及び用量に依存する減少が見られた。テストを行った、すべての４つのヒト腫瘍の細胞株は、２４時間インキュベートしたヒト線維芽細胞に比べて、クローン原性の生存が１００倍までより高く割合で減少した場合を含めて、Ｕ−ＫＲＳに対し異なる感受性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、クサノオウの根の特徴的な全アルカロイド組成物のＨＰＬＣダイアグラムを示す。
【図２】図２は、実施例１による製剤のＨＰＬＣフィンガープリントを示す。
【図３】図３は、適切な試薬として選択されたリン誘導体を示す。
【図４】図４は、反応生成物であるＵ−ＫＲＳの核磁気共鳴スペクトルを示す。
【図５】図５は、反応生成物であるＵ−ＫＲＳのＵＶスペクトルを示す。
【図６】図６は、ケリドニン塩酸塩のＵＶスペクトルを示す。
【図７】図７は、反応生成物であるＵ−ＫＲＳの質量スペクトルの第１のセクションを示す。
【図８】図８は、より高い解像度での、反応生成物Ｕ−ＫＲＳの質量スペクトルの第２のセクションを示す。
【図９】図９は、ケリドニン塩酸塩の質量スペクトルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の開発及び健康管理の分野に属し、ケリドニン（ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｎｅ）分子中の窒素が４級窒素であるアルカロイドケリドニン及びそれらの誘導体類に関する。本発明はまた、それらの化合物類の製造法、それらの化合物類を含有する組成物、様々な疾病及び身体上の状態の治療のためのそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカロイドケリドニン及びケリドニンを含有する組成物に関しては、代謝障害及び腫瘍を含む、様々な身体上の状態及び疾病においてケリドニンまたは一部のケリドニン誘導体類の治療剤としての使用が当業界に知られている。
【０００３】
ＤＥ２０２８３３０及びＵＳ３８６５８３０は、有機溶媒中でケシ科クサノオウ(Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ ｍａｊｕｓ Ｌ．、“白屈菜”として知られている)とトリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物とを反応させることにより、チオホスホルアミド−イソキノリン付加物を製造する方法を開示している。
【０００４】
ＡＴ３５４６４４及びＡＴ３７７９８８は、抗癌性の燐化合物類との反応によりアルカロイドの燐誘導体類（これらは塩への転換により水溶性を持つ）を製造する方法を開示している。開示された製造方法の不利な点は、反応生成物の水溶性塩への転換が不完全で、反応生成物の殆どが水に不溶になるということである。
【０００５】
ＵＳ５９８１５１２は、放射線障害の治療において、ＡＴ３７７９８８及びＡＴ３５４６４４に開示されている物質を使用することについて開示している。
【０００６】
前述した特許に記載されている化合物類は、異なる細胞増殖抑制作用及び抗癌作用を有する。アルカロイド類の混合物、特にクサノオウの全アルカロイドの混合物は治療上特に有望で、それらの薬理学的活性は癌治療に関する幾つかの研究で証明されてきた。未反応試薬は、反応の完了後に合成混合物から除去される。トリス(１−アジリジニル)ホルフィン硫化物(今後、“チオテパ”と称する)は、ベンゼン、エーテルまたはクロロフォルムのような有機溶媒に可溶であるため、従来技術によれば、エーテルで反応生成物を洗浄することにより合成混合物から未反応のトリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物を除去した。
【０００７】
薬理的に活性のケリドニン誘導体類を製造するための上記の従来技術は、例外なく、可燃性のまたは爆発性の有機溶媒を用いて最終生成物を精製する段階を必要とするが、本発明者によれば、水性溶媒を用いて精製が可能であるばかりでなく、より良い結果を得ることができる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第１の態様は、アルカロイド類、特にケリドニン、オキシケリドニンまたはメトキシケリドニンと、適当なアルキル化剤との反応生成物の斬新な製造法である。その製造法はアルキル化反応の完了後に、水性溶媒、好ましくは水で１回以上洗浄する段階を含む。
【０００９】
この方法はまた、広範囲な治療活性と共に低い毒性を有する注射可能な薬学製剤を製造するために、該アルカロイド誘導体類を水溶性塩へ転換させる段階を含む。
【００１０】
本発明の第２の態様として、水溶性の反応生成物類、例えばケリドニン誘導体類がある。ここで、最初のアルカロイド分子中の３級窒素は４級窒素へ転換され、４級窒素に対する第４のリガンドは低級アルキル残基、好ましくはメチルまたはエチル残基または置換されたメチルまたはエチル残基、例えばチオテパ残基である。好ましい実施態様によれば、４級ケリドニン誘導体類は標的組織、特に癌組織に選択的に蓄積するなどの特徴を持つ。
【００１１】
本発明の更なる態様は、少なくとも１種の４級アルカロイド誘導体類、特に本発明による製造法で得られる４級ケリドニン誘導体類を含む薬学組成物である。
【００１２】
本発明はさらに、治療的用途で使用するための薬物としての、４級アルカロイド誘導体類を含む反応生成物類の使用、及び様々な疾病または身体上の状態の治療のための薬学組成物の製造のための上記誘導体類の使用にも関する。
【００１３】
本発明の更なる実施態様は特許請求の範囲に記載されている。
【００１４】
本発明の製造法は、有機溶媒中のアルカロイドまたはアルカロイド類の混合物を、アルキル化剤、好ましくはそれ自体が治療活性を持つアルキル化剤、例えば少なくとも１つのアジリジン基を含む細胞毒性ホスホルアミド類または燐酸誘導体類と反応させ、次いでその反応生成物を水で洗浄することを含む。水またはそれに相当する水性溶媒、例えばマイルド（ｍｉｌｄ）塩溶液で洗浄する段階は特に、その後の、水難溶解性または水不溶性の反応生成物類、即ち４級アルカロイド誘導体類を水溶性化合物類、例えば塩類へ転換させる段階を促す。アルキル化剤が細胞毒性物質である場合、それが水溶性であるか、または少なくとも水と接触した後に水溶性成分に分解し、水洗により反応混合物から未反応のアルキル化剤またはその一部を実質的に取り除くことを可能にするのが好ましい。
【００１５】
水洗段階は、純粋な有機溶媒、例えばジメチルエーテルの爆発の危険に起因する複雑な安全対策をもはや取る必要がないので、実質的に製造プロセスを単純化することができる。従って、産業規模の製造も問題なく行うことができる。さらに、反応混合物中に存在する不必要な水溶性成分は反応生成物類から分離され、除去される。驚いたことに、水洗段階は、その後の、生成物の水溶性形態への転換段階の効率が、純粋な有機溶媒で洗浄を行った場合に比べ１０倍から１５倍までに増加するように、反応生成物の構造及び組成に対し有利な効果を与え、従って望ましい最終生成物の収率を著しく改善させる。
【００１６】
本発明の製造法は、例えばＡＴ３７７９８８の請求項１記載の化合物類を含む抗癌性の燐、特に本発明の図３に示されている燐化合物類、最も好ましくはアジリジン基を有する燐化合物でアルカロイド類をアルキル化させる反応で用いられ得る。
【００１７】
本明細書に使われている“ケリドニン（ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｎｅ）”とは、他に記載がない限りまたは発明の詳細な説明から明確に逸脱しない限り、ケリドニン，オキシケリドニン及びメトキシケリドニンからなる群から選ばれるものまたはその同等物を意味する。
【００１８】
本発明による適当な有機溶媒とは、反応に用いられるアルカロイド類が可溶となるいかなる試薬である。これらのアルカロイド類は、例えばモノクロロメタン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、モノクロロエタン、ジクロロエタン及びトリクロロエタンからなる群から選ばれる溶媒のような、アルキル化反応を促すか或いはそれに寄与する有機溶媒中に溶解され得る。
【００１９】
アルカロイド類のアルキル化反応は、高温で、好ましくは溶媒の沸点で起こる。
【００２０】
得られた反応生成物は、水で洗浄され、その後水溶性形態へ転換される。これは、ＨＣｌ気体のような液体または液体状の強酸中に通過させるか、または洗浄した反応生成物の有機溶液にＨＣｌ溶液を加えることによる(その間またはその後、塩酸塩が沈殿する)、水溶性塩（特に、塩酸塩）への転換により、ＡＴ３７７９８８及びＡＴ３５４６４４に記載されている製造法に従って行われ得る。このような酸処理により、殆どのアルキル化剤は、アルカロイド類とアルキル化剤から形成された中間反応生成物から分離され、そして修飾アルカロイド誘導体類が残る。この誘導体で、最初の３級窒素原子は４級窒素へ転換され、アルキル化剤に由来する残基または水素残基は第４のリガンドとして上記４級窒素に結合する。上記アルキル化剤に由来する残基は、メチル、エチル、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物残基、またはトリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物の一部からなる群から選ばれるのが好ましい。理解を助けるために、下記の化１は本発明の典型的な４級アルカロイド反応生成物(ケリドニンとして例示される)を示す。
【００２１】
【化１】
Ｒ１＝メチル、エチル、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物、メチル−Ｒ２、エチル−Ｒ２（Ｒ２はトリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物の一部である）
【００２２】
本発明による、沈殿された反応生成物中１つの元素分析の結果から(実施例３参照)、特定の理論に拘るわけではないが、アルキル化反応後反応混合物の酸処理、例えば４級化反応により得られた、アルキル化剤の少なくとも一部またはアルキル化剤の分解化合物類は、沈殿の結晶中である程度咬合するか、或いはある程度結晶に強く付着するので、ジクロロメタン及びエーテルのような有機溶媒で洗浄することによる沈殿の精製が行われ得る。それにもかかわらず、反応生成物は、そのような付加物質の存在下でも完全に作用性を持つことが判明した。
【００２３】
反応生成物の水溶性塩は注射溶液として使用するに適している。
【００２４】
本発明の１つの実施態様として、その反応は薬局方でチオテパとして知られている、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物(ＣＡＳ ５２−２４−４番)を用いて行われる。それに類似したものとしては、レデルテパ、オンコ（Ｏｎｃｏ） チオテパ、ＴＥＳＰＡ、テスパミン、チオホスファミド、チオ−ＴＥＰＡ、チオトリエチレンホスホルアミド、チィホシル（ｔｉｆｏｓｙｌ）、トリアジリジニルホスフィン硫化物、Ｎ，Ｎ’、Ｎ”−トリ−１，２−エタンジイルホスホロチオイン トリアミド；Ｎ，Ｎ’、Ｎ”−トリ−１，２−エタンジイルチオホスホルアミド、トリ−(エチレンイミノ)チオホスホルアミド；Ｎ，Ｎ’、Ｎ”−トリエチレンチオホスホルアミド、トリエチレンチオホスホロトリアミド、ｍ−トリエチレンチオホスホルアミド、ｍ−トリス（１−アジリジン−１−イル）ホスフィン硫化物、トリエチレンチオホスホルアミド、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン サルファ、トリス(エチレンイミノ)チオ燐酸、ＴＳＰＡ及びＷＲ４５３１２がある。
【００２５】
本発明の更なる実施態様によれば、有機溶媒中のアルカロイド類、任意にはクサノオウの全アルカロイド類の抽出物をトリス(１‐アジリジニル)−ホスフィン硫化物(チオテパ)と反応させ、次いで、得られた反応生成物、任意には化合物類の混合物中に存在する反応生成物を水で少なくとも１回洗浄する。チオテパは水中で分解するため、反応後の過剰なチオテパの転換されない残留物は、この手段により、有機相から除去され得る。好ましくは、中間反応生成物、即ちアルキル化剤及びアルカロイド類の間に形成された化合物を含む有機溶液を数回水洗し、毎回水で飽和させる。特に好ましくは、過剰な猛毒性のチオテパが反応生成物から完全に除去されるまで洗浄を繰り返す。
【００２６】
また、医薬的使用において不作用に係り、肝臓で肝硬変症を引き起こし得る一部の水溶性毒性アルカロイド類は、水相で合成混合物からそれらを除去するか、或いはそれらの濃度を減少させる。エイムス（Ａｍｅｓ）テストにより、本発明により製造された、この実施態様の反応生成物が突然変異誘発性を持たないことが判った。
【００２７】
出発原料としてクサノオウからの全アルカロイドの抽出物を用いる場合に、最終反応生成物はアルカロイド類と、チオテパ及びチオテパの分解生成物との高分子量反応生成物を含むアルカロイド類の混合物である。合成プロセスの結果として、アルカロイド類の溶解度は変わる。反応生成物は、未反応のクサノオウのアルカロイド類約６０−７０％と、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物の反応生成物約３０−４０％の混合物からなる。
【００２８】
３級アルカロイド類は、クサノオウから得られたアルカロイド抽出物の出発成分の主な部分を代表する。例えば、下記の３級アルカロイド類は合成混合物中に出発成分として含まれても良い：ケリドニン、プロトピン、スチロピン、アロクリプトピン、α−ホモケリドニン、ケラミジン、ケラミン、Ｌ−スパルテイン、ケリジメリン、ジヒドロサンギナリン、オキシサンギナリン及びメトキシケリドニン。
【００２９】
アルキル化反応後、未反応の４級アルカロイド類（例えば、ベルベリン）は水洗により反応混合物から実質的に除去される。一方、未反応の水不溶性アルカロイド類及びアルキル化アルカロイド反応生成物は有機溶媒中に残存する。アルキル化反応に用いられたアルキル化剤及び／または有機溶媒の性質に基づき、得られる中間反応生成物はチオテパに結合している化合物類を含んでも良く、ここで１つのチオテパ分子は１つ、２つまたは３つのケリドニン、オキシ−ケリドニンまたはメトキシ−ケリドニン分子類に結合している。さらに、それはアルキル化アルカロイド誘導体類を含んでも良く、ここでアルカロイド分子、例えばケリドニン、オキシ−ケリドニンまたはメトキシ−ケリドニン分子は、その４級窒素の位置で短鎖の直鎖状のアルキル残基、特にメチルまたはエチル基に結合している。さらにアルキル化された反応化合物が、アルキル化反応後に反応混合物中に存在しても良い。
【００３０】
本発明に従い、クサノオウの全アルカロイド類とチオテパとの反応から得られた反応生成物は、類似した製造法(洗浄段階が有機溶媒，例えばジエチルエーテルにより行われる)から得られた反応生成物より良い治療活性を示す。本発明の反応生成物中に存在する少なくとも一部の化合物、特に４級ケリドニン誘導体類は、癌組織に選択的に蓄積し、アポプトシスにより癌細胞を破壊する。（知られている殆どの細胞増殖抑制剤とは対照的に、健康な細胞を攻撃しない）これはそのような製剤を用いる治療に対する良好な許容性、そして遺伝子の配列などに起因する癌の発病の危険度が高い個体で治療的、及び予防的使用に対する全体的な適合性をもたらす。それは取り扱いが簡単で、治療用量で有意な副作用を起こさない。
【００３１】
クサノオウの全アルカロイド類とチオテパとを反応させて得られた反応生成物は、代謝の調節で生物学的活性を示し、そして代謝疾病（例えば、骨粗しょう症）ばかりでなく、リューマチ性疾病、アレルギー、ウイルス感染、てんかん、多発性硬化症、はん痕、皮膚腫瘍、手術後の傷害及び放射線障害の治療及び予防にも適している。
【００３２】
クサノオウの乾いた根の抽出物は合成のための出発物質として用いられても良い。根は葉または茎より多量のアルカロイド類を含む。
【００３３】
驚いたことに、つい最近、唯一のアルカロイド源（ｓｏｕｒｃｅ）として、商業的に利用可能なケリドニン、オキシケリドニンまたはメトキシケリドニンで合成を開始する場合に、本発明の製造法(実施例３参照)に従って得られた反応生成物は、実施例１に従ってクサノオウの全アルカロイド類のアルキル化反応から得られる反応生成物に少なくとも類似した治療効果及び活性を示すことが判明した。
【００３４】
通常の薬剤学的賦形剤類、特に溶液類、例えば注射溶液類または注入溶液類、または軟膏剤のための賦形剤、圧迫ガーゼ（ｃｏｍｐｒｅｓｓ）または懸垂帯の基剤は、本発明により製造された反応生成物を含む薬物類に適している。
【００３５】
以下の実施例は本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００３６】
Ａ）アルカロイド類の抽出：
ａ．２５ｇのアルカロイド塩混合物を水中に懸濁し、分液漏斗へ移す。ジクロロメタン１００ｍｌを追加した後に、分離漏斗を振とうする。そして有機相を分離し、濾過してガラス瓶に入れる。
【００３７】
ｂ．混濁が生じるまで、１ＮのＮａＯＨ（ｐＨ８−９）を水相に加える。ジクロロメタン１００ｍｌを追加した後に、混合物を振とうする。その後、有機相を分離し、ステップaからのジクロロメタン相と合わせる。このプロセスを例えば3回繰り返す。有機相をろ過し合わせる。
【００３８】
ｃ．水相はＮａＯＨを加えｐＨを１０に調整する。ジクロロメタンを追加した後に、混合物を振とうする。その後、有機相を分離、ろ過そして他の有機相と合わせる。水相を今度はＮａＯＨでｐＨを１３に調整し、そして抽出をジクロロメタンで繰り返す。
【００３９】
ｄ．合わせた有機相を蒸発させて油性の茶色の物質を得る。
【００４０】
Ｂ）トリス（１−アジリジニル）ホスフィン硫化物との反応:
アルカロイド残留物をジクロロメタン中に溶解させ、そしてトリス（１−アジリジニル）ホスフィン硫化物を加える。その混合物を８０℃で２時間還流させる。室温に冷却後、反応混合物は透明になる。そしてろ過を行い、ろ過物を分離漏斗の中で、２５０ｍｌの水で数回、例えば３回以上洗浄する。
【００４１】
Ｃ）塩化水素との反応
洗浄した溶液をガラスビーカーに移し、かき混ぜ、ＨＣｌガスで飽和させると塩酸塩錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）が沈殿する。沈殿生成物をろ過しジエチルエーテルで洗浄、乾燥後、水に溶解する。
【００４２】
ラットでは、４８５ｍ／ｋｇのＬＤ50値が、実施例lによる反応生成物から確定された。マウス及びラットの研究で、本発明の生成物が胸腺のホルモン調節を調整し、胸腺を除去した動物でチモシンに類似した活性を有する物質の合成を引き起こすことを見出した。この結果は用量に依存する。その製剤は動物実験において、末梢血のＴ−リンパ球の数を、５０％まで（処理前４．０４±０．４３ｘ１０９／ｌ、 処理後６．２４±０．７３ｘ１０９/ｌ）増加させ、進入抗原への体液性免疫反応及び脾臓細胞のナチュラルキラー細胞活性（対照群での７１．５０±９．１０％に対して１９８．２０±１７．６９％）を調整し、白血球のインターフェロン遊離性を強める。動物実験の結果は臨床での観察によって確認された。したがって、免疫パラメーターでの改善は癌患者の中でも観察された。
【００４３】
予防と免疫の用途のためには、実施例１の製剤を体重７０ｋｇ当たり約５ｍｇの用量で使用することができる。癌治療の場合、体重２０ｋｇ当たり製剤５ｍｇを投与することが好ましい。
【実施例２】
【００４４】
ＨＬＰＣフィンガープリント
測定は傾斜（ｇｒａｄｉｅｎｔ）モードにおけるイオン対逆相クロマトグラフィーと、２８５ｎｍのＤＡＤ検出器を使用したスペクトル測定により実行された。同時に、クロマトグラムは基準アルカロイドを使用した。さらに、ＨＰＬＣ−ＭＳＤの分析が行われたが、該アルカロイドのピークから逸脱したピークは見られなかった。
1126836197859_0
及び２のＨＰＬＣダイアグラムは次の実験データに基づいて得られた:
【００４５】
クロマトグラフィーのパラメーター
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂ，５μｍ， １２５ｘ２４ｍｍ ＩＤ
溶離液：Ａ）アセトニトリル２００ｍｌ＋水８００ｍｌ＋ヘキサンスルホン酸 １．５ｇ＋８５％リン酸０．３ｍｌ
Ｂ）アセトニトリル９００ｍｌ＋水１００ｍｌ＋ヘキサンスルホン酸１．５ｇ＋８５％リン酸０．３ｍｌ
傾斜（勾配）５ 分 ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ １００％ Ａ；
２４分で４０％Ｂまで
１分で１００％Ｂまで
５分１００％Ｂ；
５分１００％Ａと平衡
検出：２８５ｎｍの紫外光線
溶離液流量：１ｍｌ／分、３５分後に止まる
注入量：１０μｌ
試料作成：反応前の抽出（図１）：２５ｍｇのアルカロイド類を４０ｍｌのメタノールで超音波溶解し５０ｍｌまでにして精密ろ過膜でろ過する。
反応生成物（図２）:反応生成物を塩酸塩に変換し、水に溶かして１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、ｐＨ２．５〜６．５に調整する。
【実施例３】
【００４６】
実施例１に記載されている条件に従って、商業的に利用可能な、精製ケリドニン（Ｓｉｇｍａ）をトリス（１−アジリジニル）ホルフィン硫化物（チオテパ）と反応させた。アルキル化反応段階、洗浄段階、及びＨＣｌガスを用いる転換段階の完了後に、最終生成物を以下のようにさらに処理した：
【００４７】
ＨＣｌで処理して水溶性の反応生成物３４０ｇを水中に溶解し、飽和に近く濃縮させ、８℃の冷蔵庫の中に放置した。数時間後、自発的に沈殿が起こり、２６４ｍｇの沈殿物(今後、Ｕ−ＫＲＳと称する)を収集した。その沈殿物は、２０５−２０７℃のより狭い範囲の沸点を持ち（かなり良く結晶化されている生成物であることを示す）、３６６ｎｍの紫外光線で照射する際に淡青色の蛍光を示す、淡黄色の吸湿性の結晶を含んだ。黄色、オレンジ色、及び赤色の蛍光帯の痕跡も見られた。その生成物は、薄層クロマトグラフィーで、少なくともＲｆ＞０．１になるように移動した痕跡を除けば、どんな動きも見せずに出発点（Ｒｆ＝０）に留まっていた。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（図４）から、Ｕ−ＫＲＳがケリドニン分子に含まれているものに類似した芳香環を含んでいることが明らかになった。ＵＶスペクトル（図５）は、ケリドニンのＵＶスペクトル（図６）にかなり類似した、１４８、１５５、１６０、２０５、２３０及び２８２ｎｍで最大吸光を示すが、ただＵ−ＫＲＳの場合２３０ｎｍで、ケリドニンの場合２４０ｎｍでそれぞれピークを示すというところだけが異なっていた。これは、Ｕ−ＫＲＳの窒素が４級である一方、ケリドニンの窒素は３級であることを示す。
【００４８】
より詳細な分析情報は、図７及び８（Ｕ−ＫＲＳ）及び図９（ケリドニン）に示されている質量分光写真、及び以下の組成（表１）を示すＵ−ＫＲＳの元素分析結果から得られる。
【００４９】
全質量に対する白分率（％）で示したＵ−ＫＲＳの元素組成
【表１】
【００５０】
以下の実施例は、実施例３に記載されている方法から得られる化合物Ｕ−ＫＲＳの様々な用途を示す。
【実施例４】
【００５１】
抗腫瘍剤Ｕ−ＫＲＳによるインビトロ細胞成長の選択的阻害
材料及び方法
細胞培養は、８％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で、３７−３７．５℃の、茶色瓶内で行われた。融合した培養物は、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中０．０１％トリプシン及び０．２％ＥＤＴＡの溶液により分離され、１：５から１：２５の割合で分配された。
コラゲナーゼ処理を行って臍静脈からヒト内皮細胞を分離した。内皮細胞の培地は、１５％熱不活性化ウシ胎児血清、２００μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子及び９０μｇ／ｍｌのへパリンを補充したＭ１９９であった。
【００５２】
蛍光顕微鏡検査法
細胞を３５ｍｍディッシュで成長させ、１００μｇ／ｍｌのＵ−ＫＲＳで３０−６０分間インキュベートした。その培地を吸入し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞上にカバーガラスを設け、
アルゴンレーザー源を備えた共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用い蛍光を励起させた。その放出光は増倍型光電管チャネル中で検出された。ＭＲＣ６００映像処理ソフトウェアを用い、信号をビデオモニター上に映した。
【００５３】
結果
１．２０−４０μｇ／ｍｌのＵ−ＫＲＳで、内皮細胞の成長は約５５％阻害された。このような濃度はヒト骨肉腫細胞株を死滅させた。２つの細胞タイプのハイブリッドは正常細胞とほぼ同じ感度を示した。
２．自己蛍光のため、Ｕ−ＫＲＳは細胞内で検出され得る。レーザースキャニング顕微鏡は悪性細胞で高い程度のＵ−ＫＲＳの取り込み率（ｕｐｔａｋｅ）を示した。
【実施例５】
【００５４】
抗癌剤としてのＵ−ＫＲＳ−酸素消費
材料及び方法
マウスでのインビボ実験。５匹の対照動物のうち２匹にそれぞれ５０μｇのエーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）マウス腹水腫瘍サスペンション（それは８日齢の、成体のドナー動物から新たに分離したものである）を腹腔内へ注射した。対照群にはそれ以上処理しなかった。試験群には、腫瘍の移植の直後に、１０ｍｇのＵ−ＫＲＳ／ｋｇ（動物の体重）を腹部に注射した。
【００５５】
結果
腹水腫瘍を移植したマウスは、Ｕ−ＫＲＳの服腔内投与後或いは皮下投与後共に、そのような処置が施されなかった移植動物に比べ、より長い生存期間を示した。
インビトロで電極により腹水腫瘍サスペンションの酸素消費を測定した結果、Ｕ−ＫＲＳの添加後しばらくは酸素消費が増加したが、その後、Ｕ−ＫＲＳを含んでいない対照サスペンションと違って酸素消費が迅速に減少した。
【実施例６】
【００５６】
げっ歯類でＵ−ＫＲＳによるモルヒネの抗侵害受容作用の改質
材料及び方法
動物：実験は雄アルビノスイス（Ａｌｂｉｎｏ Ｓｗｉｓｓ）マウス及び雄ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットに対し行われた。
処置：マウスに対し２０ｍｇ／ｋｇ、ラットに対し２５ｍｇ／ｋｇのＵ−ＫＲＳを初期用量として服腔内へ注射した。
実験方法：各々の実験で、４群の動物に１）偽薬、２）モルヒネ、３）Ｕ−ＫＲＳ、４）Ｕ−ＫＲＳ+モルヒネを注射した。
【００５７】
結果：
Ｕ−ＫＲＳとモルヒネを同時に投与すると、麻薬性鎮痛剤の作用が改質された。これらは、潜伏期間の増加から明らかなように、ラットのテール−フリック（ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ）テストで抗侵害受容作用を引き起こした。
このような結果は、モルヒネと同時に投与されたＵ−ＫＲＳが、前述したテストで侵害受容反応に対する実験動物の感受性を変化させることを示す。この結果はＵ−ＫＲＳが、癌に用いられる鎮痛剤と互いに作用し得ることを示唆する。
【実施例７】
【００５８】
誘導体Ｕ−ＫＲＳによる、悪性細胞で複蜂性の（ｂｉｍｏｄａｌ）プログラム細胞死の誘導
材料及び方法
Ｋ５６２赤白血病細胞株を用い、純粋な結晶形態で生成されたＵ−ＫＲＳを水中に１．２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。
様々な濃度のＵ−ＫＲＳに露出されたＫ５６２細胞中ＤＮＡの含量は、ヨウ化プロピジウム及びフローサイトメトリーを用い分析した。
【００５９】
結果
この研究の結果は、Ｕ−ＫＲＳが複蜂性のプログラム細胞死を誘導することを示す。そのうち第１の蜂であるアポプトシスはキニジン感受性Ｃａ２+−依存性Ｋ+チャネルにより媒介され；第２の蜂である水疱（ｂｌｉｓｔｅｒ）細胞死は微小管の形成を防止し、したがって多倍数性の誘導を防止することにより媒介される。
【実施例８】
【００６０】
悪性細胞でＤＮＡ、ＲＮＡ及びたんぱく質合成に対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
３Ｈで標識されたチミジン、２０μｌ培地中０．５μＣｉ；ウリジン、２０μｌ培地中０．５μＣｉ；及びロイシン、２０μｌ培地中１．０μＣｉを、異なるＵ−ＫＲＳ濃度を持つ４つのウェル内に２−４時間放置した。その前に、細胞株、モルモットの肝細胞、Ｃ１Ｌ肝細胞，ヒト扁桃腺細胞、マウスのリンパ種、マウスの骨髄種、ヨシダ細胞、２つのＨｅＬａ菌株、ＥｓＢ−、ＥＢ、リンパ種、ＺＡＣ／１、Ｐ８１５を、９６マイクロタイターウェル中に３７℃で２４時間成長させた。
ＷｉＤｒ細胞は、１、４、８及び１４μｇ／ｍｌのＵ−ＫＲＳ濃度で６時間及び２４時間の多少異なる計画でインキュベートした。
【００６１】
結果
蛍光分析で、Ｕ−ＫＲＳは、他の癌細胞域に比べて、癌細胞の核の構成要素により強い親和性を示す。蛍光現象は腫瘍及び転移域でＵ−ＫＲＳの強い、かつ迅速な親和性を明確に示す。テストされた癌細胞株の成長を１００％阻害する供与量で処置した正常細胞において毒性効果は一切見られない。
【実施例９】
【００６２】
ヒト異種移植片に対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
ヒト腫瘍異種移植片から腫瘍細胞を取り、それを連続的にヌードマウスへ移植した。これらの細胞はインビトロコロニー形成分析に用いられた。腫瘍細胞を様々な濃度の薬物Ｕ−ＫＲＳと共に少なくとも一週間連続的にインキュベートした。それは６種の異なるタイプに対して行われ、各々の腫瘍に対しコロニー形成が評価された。薬物の効果は百分率Ｔ／Ｃ（試験群／対照群）として報告された。
【００６３】
結果
多くの異なる種類の腫瘍は、Ｕ−ＫＲＳによりテストされた様々な場合に関連して、Ｕ−ＫＲＳに感受性を持つ。殺腫瘍性の効果は免疫器具の再生能力に依存するものと見られ、その免疫器具の刺激及び調整はＵ−ＫＲＳにより行われ得る。
【実施例１０】
【００６４】
ヒト悪性細胞株に対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
４種の悪性細胞株を用いた：１）マウス肉腫；２）乳癌；３）ヒト結腸癌；４）ヒト黒色種。
Ｕ−ＫＲＳ及びＰＰ９ＡＡ０２誘導体を培地に加えた。
照射後、１つのスライド当たり２００個の細胞をプレートし、１週間インキュベートし、その後に染色し、その数を数えた。
【００６５】
結果
ここに示されている結果は、Ｕ−ＫＲＳ及びＰＰ９ＡＡ０２誘導体がヒト悪性細胞株に対し細胞毒性物質として相乗的に作用することを意味する。
【実施例１１】
【００６６】
ヒト類表皮癌細胞株でＵ−ＫＲＳにより誘導されたＧ２／Ｍの阻止（ａｒｒｅｓｔ）及びアポプトシス
材料及び方法
一次性のヒトケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を新生児の皮膚試料から分離した。表皮シートをトリプシンで分解し、遠心分離により単一細胞サスペンションを収集した。
【００６７】
結果
Ｕ−ＫＲＳは用量依存的に細胞サイクルの進行を妨げる。
Ｕ−ＫＲＳ処理はＡ４３１及びＭＥ１８０細胞で細胞サイクル分布に影響を与え、アポプトシスを誘導する。
サイクリン類、ＣＤＫ類及びＣＤＫ阻害薬ｐ２７の発現は、Ｕ−ＫＲＳでの処理後に、変化する。
【実施例１２】
【００６８】
Ｕ−ＫＲＳの抗転移的効果、及び黒色種Ｂ−１６を持つマウスの酸素及びエネルギー代謝に対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
実験は１３３ Ｃ５７Ｂ／６雄マウスで行われた。転移性の黒色種Ｂ−１６を各々のマウスの右脛筋肉へ移植した。腫瘍移植後１０日目に、該動物を２つの群に分けた。１つの群には、目の静脈洞に０．０５ｍｌ容積で１ｍｇ／ｋｇ用量のＵ−ＫＲＳを与えた。１日おきに一回、全５回注射した。もう１つの群には、目の静脈洞に滅菌した生理食塩水を同様に与えた。
【００６９】
結果
Ｕ−ＫＲＳを最初に静脈注射した後１日目に、筋肉組織で酸素レジームの指数は著しく向上した。ｐＯ２レベルのレートは酸素吸入の際に最大まで増加し、ｐＯ２のレートは吸入の停止後最大レベルから初期レベルまで下がった。試験群の動物で、肝臓ミトコンドリアの酸化的リン酸化の特定の指数はまた、製剤の投与後１日で増加した。悪性過程の進行中に、酸素及び代謝は阻害されるのが判った。Ｕ−ＫＲＳを５回注射したマウスでは、そのような阻害がそれほど著しくはなかった。対照群の動物の場合、筋肉組織で酸素圧力のレベル及びそこへのＯ２運搬速度は統計的に高かった。得られたデータを一般化すると、Ｂ／１６黒色種を持つマウスでＵ−ＫＲＳが組織への酸素の運搬を増加させるばかりでなく、生体エネルギー論に基づき悪性過程の破壊的な効果を阻害するという結論に到達することができる。
【００７０】
以下の実施例はＵ−ＫＲＳの免疫−調整特性及び代謝−調節特性を説明する。これらの特性は、Ｕ−ＫＲＳが、特にアレルギー反応、ウイルス疾病（ＨＩＶ、肝炎Ａ、Ｂ及びＣ、大腸菌、インフルエンザ）、骨粗しょう症、多発関節炎、乾癬及び他の疾病または身体の状態の治療に適するようにする。
【実施例１３】
【００７１】
Ｕ−ＫＲＳによる大食細胞の殺腫瘍活性の向上
材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスは，実験室で近親交配（ｂｒｏｔｈｅｒ／ｓｉｓｔｅｒ ｍａｔｉｎｇ）により維持された。皮下注射により腫瘍Ｄ１ ＤＭＢＡ／３を通常的にＢＡＬＢ／ｃに移植させた。腫瘍は移植後５日に明らかになった。
【００７２】
皮下腫瘍移植後５日目に、Ｕ−ＫＲＳを用いるインビボ処置を開始した。３つの投与経路、即ち静脈、服腔、及び皮下を用いた。それぞれ少なくとも１０匹のマウスからなる３つの全試験群には、ＰＢＳ０．１５ｍｌ中５．０μのＵ−ＫＲＳを投与した。その投与量は予備実験に基づき選ばれた。
【００７３】
結果
処置したマウスで、腫瘍の成長速度は著しく減少した。Ｕ−ＫＲＳを投与したマウスでは該薬物に関するいかなる副作用も見られなかった。
【実施例１４】
【００７４】
正常のヒトリンパ球の表現型に対するＵ−ＫＲＳのインビトロ効果
材料及び方法
この研究は１０名の健康な志願者の抹消血から分離したリンパ球に対して行われた。その細胞は、フィコル−パーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）濃度勾配遠心分離で分離された。細胞の生存度は、０．１％トリパンブルー染色により、９５％であることが判った。
全Ｔ−細胞、Ｔ−ヘルパー細胞及びＴ−サプレッサー細胞に対するモノクローナル抗体を用い、免疫蛍光法によりリンパ球の分集団を定量した。次いで、その細胞を、ＦＩＴＣ／接合ウサギＦ／ａｂ／２断片抗−マウスＩｇＧで処理し、ＰＢＳで洗浄し、ポリビニル−アルコール及びグリセロールを用いスライド上に置いた。対照製剤では、モノクローナル抗体の代わりにＰＢＳまたは正常マウス血清を用いた。
【００７５】
結果
Ｔ−細胞の分集団に対するＵ−ＫＲＳの直接的な影響の可能性を示す本研究により、Ｕ−ＫＲＳが癌患者で細胞性免疫に対する優れた免疫刺激物質になり得るということを確認した。
【実施例１５】
【００７６】
ヒト抹消血の単球（単核細胞）に対するＵ−ＫＲＳの細胞分裂誘起特性
材料及び方法
抹消血単核細胞。血液を同容積のＰＢＳ（ｐＨ７．５で、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）で希釈し、ヒストパーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）１０７７上に層状にした。そのチューブを２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。リンパ球を含む界面層を収集し、ＲＰＭＩ組織培地で３回洗浄した。
【００７７】
結果
細胞をＵ−ＫＲＳで短時間前処理しても、それはＰＨＡ細胞分裂誘起特性に対し強力な上昇効果をもたらし、その結果ＰＨＡを単独で使用した場合に比べ著しく高い細胞刺激指数を示すことが判明した。さらに、細胞をＰＨＡで短時間処理することが、その細胞分裂誘起効果を奏するのにいつも肝要であることも判った。
その研究は、Ｕ−ＫＲＳで処理した悪性の発展段階で、患者の循環性リンパ球が著しく増加することを示す。
【実施例１６】
【００７８】
Ｕ−ＫＲＳによる、インビボで免疫効果器細胞の細胞溶解活性及び腫瘍成長阻害の調整
材料及び方法
腫瘍細胞：肥胖細胞腫Ｐ８１５及びＡＫＲ白血病ＡＫＩＬ細胞株を、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む９．０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中に維持させた。
【００７９】
結果
本インビトロ研究は、Ｕ−ＫＲＳが、同種異系免疫化されたマウスから得られた脾性のリンパ球の溶解活性を４８倍まで増加させる、効果的な生物学的反応調整剤であることを示す。ＩＬ−２で処理した脾細胞及び服腔の滲出液リンパ球の溶解活性はまた、細胞により媒介される溶解分析媒質にＵ−ＫＲＳを加えることにより著しく増加した。
Ｕ−ＫＲＳがまた脾のリンパ球の細胞溶解活性を強めるという結果は、インビボで観察されたＵ−ＫＲＳの治療効果が免疫効果器細胞の細胞溶解活性を刺激することにより媒介されることを示す。
【実施例１７】
【００８０】
インビトロ及びインビボで免疫学的血液パラメーターに対するＵ−ＫＲＳの影響
材料及び方法
この研究では９６匹のウィスターラットを用いた。初期年齢は雄及び雌ラット共に１６週であった。
用量０．０１から２０μｇ／ｍｌでの刺激指数を評価するために、Ｕ−ＫＲＳ及びＰＨＡをＴリンパ球上で＃Ｈチミジンテストにより試験した。
【００８１】
結果
Ｕ−ＫＲＳは、造血及び免疫系の異なるサブセットを刺激する。この実験では、特定の幹細胞を刺激した場合、或いは赤血球形成系の一般的な活性化の場合に起こり得る徴候として、網状赤血球増加症が誘導される。絶対的な白血球数での変化がないことが判れば、Ｕ−ＫＲＳの作用により、強力な調整特性（例えば、異なるサブセットの転位）がこの実験で起こると仮定しても良いだろう。
これらの実験で得られたものに類似した刺激が、癌細胞でのアポプトシスを含めて、インビトロで見られた。
【実施例１８】
【００８２】
マウスでオバルブミン抗原性及び抗オバルブミンＩｇＥ抗体反応に対するＵ−ＫＲＳの阻害効果
材料及び方法
オバルブミンにより誘導された感作を阻害するＵ−ＫＲＳの能力を、ＢＡＬＢ／ｃ及びＦ1(ＢＡＬＢ／ｃ ｘ Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ)マウスでテストした。Ｕ−ＫＲＳは抗原（オバルブミン）及びアジュバント（明礬）との混合物の形態でマウスへ導入され、マウスの感作を妨げ、より低い抗−ＯＡ ＩｇＥ抗体反応で応答し、並びに感作されたマウスの腹膜腔から分離した肥満細胞からの、抗原により誘導された、ヒスタミンの放出を減少させた。アナフィラキシーで抗原性ｏｄオバルブミン（ＯＡ）に対するＵ−ＫＲＳの効果は、ラットに対し異種性の手動的皮膚のアナフィラキシー反応でテストした。
【００８３】
結果
その結果は、Ｕ−ＫＲＳとの混合物で製造されたＯＡが、異種のＰＣＡ反応でラットの肥満細胞の表面に付着されかつマウスで自生のＯＡに対し生成された、抗−ＯＡＩｇＥ抗体と反応する能力が減少したことを示す。その結果は、ＯＡのＵ−ＫＲＳ前処理が、その抗原性、及び自生のＩｇＥ分子に対し生成された抗−ＯＡＩｇＥ抗体類と反応する能力に影響を及ぼし得ることを示唆する。
【実施例１９】
【００８４】
初期骨粗しょう症に対するＵ−ＫＲＳ治療の効果
材料及び方法
卵巣摘出術による初期骨粗しょう症を持つ雌ラットにＵ−ＫＲＳを３０ｍｇ／ｋｇの用量で１日おきに6ヶ月間腹腔内投与した。Ｕ−ＫＲＳの投与は外科手術後２日目に開始した。Ｕ−ＫＲＳを用いる長期治療の末期に、すべてのラットに対し、両方の上腕骨の力をテストし、そしてラット大たい骨の幾つかのパラメーターを測定した。
【００８５】
結果
その結果は、上腕骨の機械的強度の減少及び卵巣摘出術により誘発された大たい骨での幾つかの変化が、６ヶ月間のＵ−ＫＲＳ治療により予防されたことを示す。
【実施例２０】
【００８６】
細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、及びインフルエンザウイルスに対するＵ−ＫＲＳ製剤の影響
材料及び方法
インフルエンザウイルス菌株ＡＰＲ８／ＨＯＮ１／３４を雌鶏のエンブリオ上で培養した。
現在臨床的に用いられている大腸菌及び黄色ブドウ球菌株２０９Ｐを用いた。Ｕ−ＫＲＳ製剤シリーズ２９０６１４
【００８７】
結果
この研究では、感染されたマクロ生物体でＵ−ＫＲＳ製剤の抗−感染作用の存在を確認した。そのような作用は、これらのマイクロ生物体で感染された細胞またはマイクロ生物体の２次的分解に起因する、宿主免疫系の幾つかのエレメントの刺激を通じて働く。
【実施例２１】
【００８８】
インフルエンザウイルスに対するＵ−ＫＲＳの生物学的活性
材料及び方法
Ａタイプのウイルス、ポート−チャルメルス（Ｐｏｒｔ−Ｃｈａｌｍｅｒｓ）１／７３培養物、抗原性Ｈ３Ｎ２変種。
このウイルスに、エンブリオ当たり１、１０及び１００ＥＩＤ５０を注射した。Ｕ−ＫＲＳをハンクス溶液中に溶解させた。
【００８９】
結果
Ｕ−ＫＲＳが、感染プロセスの発展を妨げる作用を持つことを確認した。
【実施例２２】
【００９０】
照射の効果に対するＵ−ＫＲＳの作用
材料及び方法
１６／２０ｇ体重のＣＢＡ／Ｊ雄マウス
マウスに対し、６．０Ｇｙから７．５Ｇｙまでの用量で短期間全身カンマ−照射を行った。ＣＥＧＯ装置を用いて蓄積線量８．７５Ｇｙで長期照射を行った。
Ｕ−ＫＲＳは０．１、１．４及び１２ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で服腔内投与した。
【００９１】
結果
照射の効果を改質させるＵ−ＫＲＳの能力は、０．１から１２ｍｇ／ｋｇの薬物投与量を用い、ＣＢＡ／Ｊマウスで研究された。Ｕ−ＫＲＳは、照射用量５．００から７Ｇｙでマウスの生存率を５０―６０％まで増加させたが、７．５Ｇｙの用量ではいかなる効果も見られなかった。薬物用量の変更は、照射の結果に影響を及ぼさなかった。
本研究の主な成果は、Ｕ−ＫＲＳが予防及び治療に適用された場合に、照射の効果を改質することができるということにある。
【実施例２３】
【００９２】
イオン化放射線に対するＵ−ＫＲＳの効果
材料及び方法
乳癌、結腸直腸の腺癌、神経膠芽細胞腫及び膵臓腺癌の細胞株。Ｕ−ＫＲＳ製剤。
細胞生存に対するＵ−ＫＲＳの効果を、０．２μＧ ＭＬの濃度でテストした。その露出時間は１、３及び２４時間で、その後細胞をリン酸塩／緩衝塩水で洗浄し、新しい培地を加えた。
【００９３】
結果
Ｕ−ＫＲＳで処理した場合、クローン原性の細胞生存において、特異の時間及び用量に依存する減少が見られた。テストを行った、すべての４つのヒト腫瘍の細胞株は、２４時間インキュベートしたヒト線維芽細胞に比べて、クローン原性の生存が１００倍までより高く割合で減少した場合を含めて、Ｕ−ＫＲＳに対し異なる感受性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、クサノオウの根の特徴的な全アルカロイド組成物のＨＰＬＣダイアグラムを示す。
【図２】図２は、実施例１による製剤のＨＰＬＣフィンガープリントを示す。
【図３】図３は、適切な試薬として選択されたリン誘導体を示す。
【図４】図４は、反応生成物であるＵ−ＫＲＳの核磁気共鳴スペクトルを示す。
【図５】図５は、反応生成物であるＵ−ＫＲＳのＵＶスペクトルを示す。
【図６】図６は、ケリドニン塩酸塩のＵＶスペクトルを示す。
【図７】図７は、反応生成物であるＵ−ＫＲＳの質量スペクトルの第１のセクションを示す。
【図８】図８は、より高い解像度での、反応生成物Ｕ−ＫＲＳの質量スペクトルの第２のセクションを示す。
【図９】図９は、ケリドニン塩酸塩の質量スペクトルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種以上のアルカロイドとアルキル化剤との反応を通じて得られた一種以上のアルカロイド誘導体を含むアルカロイド反応生成物であって、最初の上記誘導体中の３級窒素は４級の形態で存在し、第４のリガンドとして、該アルキル化剤に由来する残基または水素残基がその４級窒素に結合しており、好ましくは、その残基がメチル、エチル及びトリス（１−アジリジニル）ホルフィン硫化物残基からなる群、またはトリス（１−アジリジニル）ホルフィン硫化物の一部から選ばれるアルカロイド反応生成物。
【請求項２】
前記一種以上のアルカロイド誘導体が、水溶性塩、好ましくは塩酸塩の形態で存在することを特徴とする請求項１記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項３】
前記一種以上のアルカロイドが、草本、クサノオウ中に存在する一種以上のアルカロイド、好ましくはクサノオウの幾つかのアルカロイド類または全アルカロイド類の混合物であることを特徴とする請求項１または２記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項４】
前記アルカロイドが、ケリドニン、プロトピン、スチロピン、アロクリプトピン、ホモケリドニン、サンギナリン、ケラミジン、ケラミン、Ｌ−スパルテイン及びオキシケリドニンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１から３のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項５】
ケリドニン、オキシケリドニンまたはメトキシケリドニンが、唯一のアルカロイド源として存在することを特徴とする請求項１から４のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項６】
未反応の３級アルカロイド類、未反応のアルキル化剤、及びアルキル化剤の分解生成物からなる群から選ばれる一種以上の化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項７】
図４のＮＭＲスペクトル、図５のＵＶスペクトル、図７及び８の質量スペクトル及び表１の元素分析からなる群から選ばれる、少なくとも１つの分析結果により特徴付けられることを特徴とする請求項１から６のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項８】
請求項１１から２２のいずれか記載の方法で得られる、請求項１から７のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項９】
天然のケリドニンが、下記の化１に示される４級の形態で存在するケリドニン誘導体。
【化１】
（ここで、４級窒素に対する第４のリガンドＲ１として、水素、またはメチルまたはエチル残基が存在する。）
【請求項１０】
水溶性形態、好ましくは強酸との塩、もっとも好ましくは塩酸塩の形態で存在することを特徴とする請求項９記載のケリドニン誘導体。
【請求項１１】
請求項１のアルカロイド反応生成物の製造方法であって、
ａ）化学構造中に３級窒素を有する一種以上のアルカロイド及び有機溶媒を含む反応混合物、及びアルキル化剤を提供し、有機溶媒の存在下で上記一種以上のアルカロイドとアルキル化剤との反応を通じてアルキル化反応を実行し、該３級アルカロイド窒素でアルキル化が起こるため、その３級窒素が４級窒素へ転換された、１種以上の反応生成物を形成する段階；
ｂ）上記反応の完了後に、得られる反応混合物を、水性溶媒または水で１回以上洗浄し、反応混合物中に存在する水溶性化合物を除去する段階；及び
ｃ）洗浄した該反応混合物を、気体または液体状の強酸、好ましくは気体状の塩化水素または塩酸溶液で処理し、残存する１種以上の反応生成物を水溶性形態、特に水溶性塩へ転換させる段階
を含む製造方法。
【請求項１２】
前記段階ｃ）で、酸処理中またはその後に反応生成物が沈殿し、その後、該沈殿物を有機溶媒から分離し、任意には、好ましくは有機溶媒を用いてその沈殿物をさらに精製することを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記アルキル化反応が、高温、特に溶媒の沸点で行われることを特徴とする請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
草本、クサノオウ中に存在する一種以上のアルカロイド、好ましくはクサノオウの幾つかのアルカロイド類または全アルカロイド類の混合物が、アルカロイド源としても用いられることを特徴とする請求項１１から１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
前記アルカロイドが、ケリドニン、プロトピン、スチロピン、アロクリプトピン、ホモケリドニン、サンギナリン、ケラミジン、ケラミン、Ｌ−スパルテイン及びオキシケリドニンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１から１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
ケリドニン、オキシケリドニンまたはメトキシケリドニンを、唯一のアルカロイド源として使用することを特徴とする請求項１１から１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
前記アルキル化剤が、生理活性剤、好ましくは細胞毒性剤であることを特徴とする請求項１１から１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
前記アルキル化剤が、水溶性であるか、または水と接触すると水溶性成分に分解することを特徴とする請求項１１から１７のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
前記有機溶媒が、アルキル化反応を促すかまたはそれに寄与し、好ましくは、モノクロロメタン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、モノクロロエタン、ジクロロエタン及びトリクロロエタンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１から１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
前記アルキル化剤が、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物(ＣＡＳ ５２−２４−４番)であることを特徴とする請求項１１から１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
前記反応生成物が、ケリドニン、オキシケリドニン及びメトキシケリドニンからなる群から選ばれる一種以上の化合物を含み、該化合物が、４級窒素原子を持ち、第４のリガンドとして、アルキル化剤に由来する残基または水素残基が上記４級窒素原子に結合しており、その残基が、好ましくは、メチル、エチル及びトリス（１−アジリジニル）−ホスフィン硫化物残基からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１から２０記載の方法。
【請求項２２】
前記トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物が、アルキル化剤として用いられ、前記残基が、該アルキル化剤の一部であり、任意には酸処理に起因して形成された分解生成物であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
薬物または医薬としての、請求項１から１０のいずれか記載の反応生成物の使用。
【請求項２４】
ウイルス感染、癌、免疫障害、代謝障害及び放射線障害からなる群から選ばれる疾病または身体上の状態の治療または予防用薬学組成物の製造のための、請求項１から１０のいずれか記載の反応生成物の使用。
【請求項２５】
前記疾病が、アレルギー、骨粗しょう症、皮膚腫瘍、インフルエンザウイルス感染、リューマチ性疾病、はん痕、手術後の傷害、てんかん及び多発性硬化症からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２４記載の使用。
【請求項１】
一種以上のアルカロイドとアルキル化剤との反応を通じて得られた一種以上のアルカロイド誘導体を含むアルカロイド反応生成物であって、最初の上記誘導体中の３級窒素は４級の形態で存在し、第４のリガンドとして、該アルキル化剤に由来する残基または水素残基がその４級窒素に結合しており、好ましくは、その残基がメチル、エチル及びトリス（１−アジリジニル）ホルフィン硫化物残基からなる群、またはトリス（１−アジリジニル）ホルフィン硫化物の一部から選ばれるアルカロイド反応生成物。
【請求項２】
前記一種以上のアルカロイド誘導体が、水溶性塩、好ましくは塩酸塩の形態で存在することを特徴とする請求項１記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項３】
前記一種以上のアルカロイドが、草本、クサノオウ中に存在する一種以上のアルカロイド、好ましくはクサノオウの幾つかのアルカロイド類または全アルカロイド類の混合物であることを特徴とする請求項１または２記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項４】
前記アルカロイドが、ケリドニン、プロトピン、スチロピン、アロクリプトピン、ホモケリドニン、サンギナリン、ケラミジン、ケラミン、Ｌ−スパルテイン及びオキシケリドニンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１から３のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項５】
ケリドニン、オキシケリドニンまたはメトキシケリドニンが、唯一のアルカロイド源として存在することを特徴とする請求項１から４のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項６】
未反応の３級アルカロイド類、未反応のアルキル化剤、及びアルキル化剤の分解生成物からなる群から選ばれる一種以上の化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項７】
図４のＮＭＲスペクトル、図５のＵＶスペクトル、図７及び８の質量スペクトル及び表１の元素分析からなる群から選ばれる、少なくとも１つの分析結果により特徴付けられることを特徴とする請求項１から６のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項８】
請求項１１から２２のいずれか記載の方法で得られる、請求項１から７のいずれか記載のアルカロイド反応生成物。
【請求項９】
天然のケリドニンが、下記の化１に示される４級の形態で存在するケリドニン誘導体。
【化１】
（ここで、４級窒素に対する第４のリガンドＲ１として、水素、またはメチルまたはエチル残基が存在する。）
【請求項１０】
水溶性形態、好ましくは強酸との塩、もっとも好ましくは塩酸塩の形態で存在することを特徴とする請求項９記載のケリドニン誘導体。
【請求項１１】
請求項１のアルカロイド反応生成物の製造方法であって、
ａ）化学構造中に３級窒素を有する一種以上のアルカロイド及び有機溶媒を含む反応混合物、及びアルキル化剤を提供し、有機溶媒の存在下で上記一種以上のアルカロイドとアルキル化剤との反応を通じてアルキル化反応を実行し、該３級アルカロイド窒素でアルキル化が起こるため、その３級窒素が４級窒素へ転換された、１種以上の反応生成物を形成する段階；
ｂ）上記反応の完了後に、得られる反応混合物を、水性溶媒または水で１回以上洗浄し、反応混合物中に存在する水溶性化合物を除去する段階；及び
ｃ）洗浄した該反応混合物を、気体または液体状の強酸、好ましくは気体状の塩化水素または塩酸溶液で処理し、残存する１種以上の反応生成物を水溶性形態、特に水溶性塩へ転換させる段階
を含む製造方法。
【請求項１２】
前記段階ｃ）で、酸処理中またはその後に反応生成物が沈殿し、その後、該沈殿物を有機溶媒から分離し、任意には、好ましくは有機溶媒を用いてその沈殿物をさらに精製することを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記アルキル化反応が、高温、特に溶媒の沸点で行われることを特徴とする請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
草本、クサノオウ中に存在する一種以上のアルカロイド、好ましくはクサノオウの幾つかのアルカロイド類または全アルカロイド類の混合物が、アルカロイド源としても用いられることを特徴とする請求項１１から１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
前記アルカロイドが、ケリドニン、プロトピン、スチロピン、アロクリプトピン、ホモケリドニン、サンギナリン、ケラミジン、ケラミン、Ｌ−スパルテイン及びオキシケリドニンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１から１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
ケリドニン、オキシケリドニンまたはメトキシケリドニンを、唯一のアルカロイド源として使用することを特徴とする請求項１１から１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
前記アルキル化剤が、生理活性剤、好ましくは細胞毒性剤であることを特徴とする請求項１１から１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
前記アルキル化剤が、水溶性であるか、または水と接触すると水溶性成分に分解することを特徴とする請求項１１から１７のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
前記有機溶媒が、アルキル化反応を促すかまたはそれに寄与し、好ましくは、モノクロロメタン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、モノクロロエタン、ジクロロエタン及びトリクロロエタンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１から１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
前記アルキル化剤が、トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物(ＣＡＳ ５２−２４−４番)であることを特徴とする請求項１１から１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
前記反応生成物が、ケリドニン、オキシケリドニン及びメトキシケリドニンからなる群から選ばれる一種以上の化合物を含み、該化合物が、４級窒素原子を持ち、第４のリガンドとして、アルキル化剤に由来する残基または水素残基が上記４級窒素原子に結合しており、その残基が、好ましくは、メチル、エチル及びトリス（１−アジリジニル）−ホスフィン硫化物残基からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１１から２０記載の方法。
【請求項２２】
前記トリス(１−アジリジニル)ホスフィン硫化物が、アルキル化剤として用いられ、前記残基が、該アルキル化剤の一部であり、任意には酸処理に起因して形成された分解生成物であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
薬物または医薬としての、請求項１から１０のいずれか記載の反応生成物の使用。
【請求項２４】
ウイルス感染、癌、免疫障害、代謝障害及び放射線障害からなる群から選ばれる疾病または身体上の状態の治療または予防用薬学組成物の製造のための、請求項１から１０のいずれか記載の反応生成物の使用。
【請求項２５】
前記疾病が、アレルギー、骨粗しょう症、皮膚腫瘍、インフルエンザウイルス感染、リューマチ性疾病、はん痕、手術後の傷害、てんかん及び多発性硬化症からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２４記載の使用。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５２０７６３（Ｐ２００６−５２０７６３Ａ）
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０４６８３（Ｐ２００６−５０４６８３）
【出願日】平成１６年３月１２日（２００４．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２６３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８２６９８
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０２１５９１２５）
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＷＩＣＫＹ， Ｗａｓｓｙｌ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１２日（２００４．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２６３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８２６９８
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０２１５９１２５）
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＷＩＣＫＹ， Ｗａｓｓｙｌ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]