ＡＴＰ７Ａの使用による、神経変性疾患の治療
本発明は、神経生成（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患治療用の薬剤組成物を調製するためのＡＴＰ７Ａ相互作用分子の使用に関する。これによって、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子は、好ましくはＡＴＰ７Ａの阻害剤であり、そして特に、該分子は、ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの活性を調節する能力を有する。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤を同定する方法であって：ａ．既定の試験化合物がＡＴＰ７Ａ相互作用分子であるかどうか決定することによって、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子を同定し、ｂ．工程ａ）のＡＴＰ７Ａ相互作用分子がガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの活性を調節可能であるかどうか決定する工程を含む、前記方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ７Ａタンパク質を含む、ＡＰＰプロセシング経路のタンパク質複合体に関し、それとともに神経生成（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患の治療における、これらの複合体の阻害剤、並びにＡＴＰ７Ａの阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、世界中で何百万という個体に影響を及ぼす慢性状態である。
アルツハイマー病患者の脳は、顕著な神経病理学的損傷の特徴的な病変、例えば初期の細胞内の神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）（ＮＦＴ）、および細胞外のアミロイド・リッチ老人斑を示す。これらの損傷は、ＣＮＳニューロン集団の大量の損失と関連し、そしてその進行には、ＡＤと関連する臨床的認知症が伴う。アミロイド斑の主な構成要素は、多様な長さのアミロイド・ベータ（Ａ−ベータ、ＡベータまたはＡβ）ペプチドである。その変異体であるＡβ１−４２ペプチド（Ａベータ−４２）は、アミロイド形成の主な原因物質である。別の変異体はＡβ１−４０ペプチド（Ａベータ−４０）である。アミロイド・ベータは、前駆タンパク質、ベータ・アミロイド前駆タンパク質（ベータ−ＡＰＰまたはＡＰＰ）のタンパク質分解産物である。ＡＰＰは、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、該タンパク質は、いくつかの異なる膜会合プロテアーゼによって、順次、切断される。ＡＰＰの最初の切断は、２つのプロテアーゼ、アルファ−セクレターゼまたはベータ−セクレターゼの１つによって起こる。アルファ−セクレターゼは、メタロプロテアーゼであり、その活性は、タンパク質ＡＤＡＭ−１０およびＡＤＡＭ−１７の１つまたは組み合わせによって提供される可能性が最も高い。アルファ−セクレターゼによる切断は、アミロイド・ペプチド形成を妨げ、そしてしたがって、アミロイド非生成性と称される。対照的に、ベータ−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、アミロイド・ペプチド形成が続くための必要条件である。このセクレターゼは、ＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ切断酵素）とも称され、アスパルチル・プロテアーゼ活性を含有するＩ型膜貫通タンパク質である（以下に詳細に記載される）。
【０００３】
ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）活性は、細胞外ドメインでＡＰＰを切断し、分泌可溶性ＡＰＰｂの分断（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を生じ、そして９９残基のＣ末端膜貫通断片（ＡＰＰ−Ｃ９９）を生じる。Ｖａｓｓａｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ７３５−７４１）は、ＡＰＰのベータ−セクレターゼと推測される特性を有する膜貫通アスパラギン酸プロテアーゼをクローニングし、該プロテアーゼをＢＡＣＥ１と名づけた。ＢＡＣＥ１ノックアウトマウス由来の脳および初代皮質培養物は、検出可能なベータ−セクレターゼ活性を示さず、そしてＢＡＣＥノックアウトマウス由来の初代皮質培養物は、ＡＰＰからはるかに少ないアミロイド−ベータしか産生しなかった。これによって、ＢＡＣＥ１のパラログであるＢＡＣＥ２ではなく、ＢＡＣＥ１がＡＰＰの主なベータ−セクレターゼであることが示唆される。ＢＡＣＥ１は、５０１アミノ酸（ａａ）のタンパク質であり、２１ａａのシグナルペプチドに続いて、ａａ２２〜４５に渡る、プロ配列ドメインを含有する。選択的スプライシング型、ＢＡＣＥ−Ｉ−４５７およびＢＡＣＥ−Ｉ−４７６がある。成熟タンパク質の細胞外ドメインに続いて、予測される１つの膜貫通ドメインおよび２４ａａの短い細胞質ゾルＣ末端テールがある。ＢＡＣＥ１は、１型膜貫通タンパク質であり、活性部位が膜の細胞外側にあると予測され、ここでベータ−セクレターゼがＡＰＰ、およびありうる他の未同定の基質を切断する。ＢＡＣＥ１は、明らかに、ＡＰＰをＡ−ベータにプロセシングするのに必要とされる重要な酵素であるが、最近の証拠によって、ＢＡＣＥ１のさらなる潜在的基質および機能が示唆されている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９， １０５４２−１０５５０）。現在まで、制御機能または調節機能を持つＢＡＣＥ１相互作用タンパク質は、まったく記載されてきていない。
【０００４】
ＢＡＣＥ１切断によって生じるＡＰＰ断片であるＡＰＰ−Ｃ９９は、ガンマ−セクレターゼ活性の基質であり、該活性は、膜平面内でＡＰＰ−Ｃ９９を切断してＡ−ベータ・ペプチド（アミロイド生成性Ａβ１−４２ペプチドなど）、およびＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）と称されるＣ末端断片にする（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９， ２５−５１）。ガンマ−セクレターゼ活性は、少なくとも４つの別個のサブユニットを持つ多タンパク質複合体内にある。発見された第一のサブユニットは、プレセニリンであった（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４， ８２０８−１３）。ガンマ−セクレターゼ複合体の他の既知のタンパク質構成要素は、Ｐｅｎ−２、ニカストリンおよびＡｐｈ−１ａである。
【０００５】
アルツハイマー病の病因の根底にある分子事象の描写が近年、進歩しているにもかかわらず、これまでに疾患を緩和する療法は開発されてきていない。この目的に向け、業界は、ＢＡＣＥ１を阻害するための適切なリード化合物を同定しようと苦闘している。さらに、ガンマ−セクレターゼのより多くの別の基質、最も著名には、Ｎｏｔｃｈタンパク質が存在することが認められてきている。その結果、ガンマ−セクレターゼの阻害は、機構に基づく副作用を引き起こす可能性がある。現在、最も優れた薬剤（例えばアリセプト（登録商標）／ドネペジル）は、アセチルコリン・エステラーゼを阻害して、脳において、神経伝達物質アセチルコリンのレベル増加を生じることによって、認知機能の一時的な改善を達成することを試みる。これらの療法は、疾患のより後期の病期には適しておらず、根底にある疾患病変は治療せず、そして疾患進行を停止させることはない。
【０００６】
したがって、アルツハイマー病の治療のための新規分子戦略を可能にする、新規ターゲットの同定に関して、満たされていない必要性がある。さらに、前記新規ターゲットをターゲティングすることによって、前述の分子プロセスを修飾する新規療法化合物に関する、強い必要性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の側面において、本発明は、神経生成疾患治療用の薬剤組成物を調製するための、「ＡＴＰ７Ａ相互作用分子」の使用を提供する。
本発明の関連において、驚くべきことに、銅輸送ＡＴＰアーゼ（以下、ＡＴＰ７Ａと称する）が、アルツハイマー病において、ガンマ−セクレターゼによるＡＰＰの異常なプロセシングに関与する、異なる細胞内タンパク質複合体の一部を形成することが発見されている。特に、ＡＴＰ７ＡがＰｓｅｎ２複合体およびＢＡＣＥ１複合体の一部であることが発見されており、これらの複合体は、直接または間接的に、ガンマ−セクレターゼの活性を制御することが知られる。これらの複合体は、それぞれの重要なタンパク質化合物にちなんで命名されている。
【０００８】
ＡＴＰ７Ａがこれらの複合体において重要な分子と同定されたことによって、神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患の治療のため、ＡＴＰ７Ａと相互作用する分子の使用が可能になる。これは特に、ＡＴＰ７Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡが、Ａベータ−４２の生成および／または分泌の減弱を生じることを立証する実施例において示される。
【０００９】
本発明の関連において、「ＡＴＰ７Ａ相互作用分子」は、少なくとも一時的にＡＴＰ７Ａに結合し、そして好ましくは、ＡＴＰ７Ａ活性を調節し、そして特に阻害する、分子である。
【００１０】
ＡＴＰ７Ａは、肝臓を除いて、偏在性に発現されるＰ型銅輸送ＡＴＰアーゼであり、８つの膜貫通セグメントおよび６つのＮ末端金属結合性ドメインを含有する（Ｃｈｅｌｌｙら、１９９３；Ｍｅｒｃｅｒら、１９９３；Ｖｕｌｐｅら、１９９３）。銅ポンプは、細胞内小胞区画への銅の取り込みを仲介し、そして原形質膜では、細胞の銅の流出を仲介する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＡＴＰ７Ａは遠位ゴルジ装置に局在し、そして外因性銅イオンに反応して、原形質膜およびＲａｂ７陽性エンドソームに転位置する。この輸送事象は、クラスリンおよびカベオリン独立性であるが、Ｒａｃファミリー低分子量ＧＴＰアーゼによって制御される（Ｃｏｂｂｏｌｄら、２００２、２００３；Ｐａｓｃａｌｅら、２００３）。最近、コレステロール選別に関連付けられるＲａｂ７陽性小胞小器官が、ガンマ−セクレターゼ活性の重要な部位に相当しうることが示唆されてきている（Ｒｕｎｚら、２００２）。
【００１１】
銅輸送体は、リシル・オキシダーゼ、チロシナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼおよびＣｕ／Ｚｎスーパーオキシド・ジスムターゼなどの銅含有酵素の活性化に必要である（Ｐｅｔｒｉｓら、２０００）。ＡＴＰ７Ａにおける欠陥は、ヒトにおいて、メンケス病（ＭＤ）および後角症候群（ＯＨＳ）に関連し、そしてヒトＭＤのモデルである「ぶち（ｍｏｔｔｌｅｄ）」マウスで見出されている。メンケス病は、進行性の神経変性および結合組織障害：限局性大脳および小脳変性、成長の早期遅延、特異な毛髪、色素沈着減少、皮膚弛緩症、血管合併症および小児期初期の死亡によって特徴付けられるＸ連鎖劣性遺伝障害である。これは、銅の吸収および輸送に欠陥があるためである（Ｖｏｓｋｏｂｏｉｎｉｋら、２００３）。さらに、銅流出輸送体ＡＴＰ７Ａの発現増加は、卵巣癌細胞におけるシスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンに対する耐性を仲介し（Ｓａｍｉｍｉら、２００４）、そして卵巣癌患者の劣った生存と関連する（Ｓａｍｉｍｉら、２００３）。
【００１２】
ＡＰＰは、銅結合性タンパク質であり、銅恒常性の調節に機能しうる（Ｍｕｌｔｈａｕｐら、１９９６）。言い換えると、ＡＰＰ発現は、それ自体、細胞の銅に制御され：（ＡＴＰ７Ａの過剰発現によって）この金属が線維芽細胞で枯渇すると、ＡＰＰタンパク質レベルが有意に減少し、そしてＡＰＰ遺伝子発現が下方制御されることから、ＡＰＰ発現調節においてＡＴＰ７Ａが役割を果たしていることが示唆される（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍら、２００４）。しかし、ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングに対するＡＴＰ７Ａの効果は、いまだに立証されていない。
【００１３】
ＺｎおよびＣｕのキレート剤であるクリオキノールは、アルツハイマー病のパイロット第２相臨床試験において、有望な結果を示している（Ｒｉｔｓｃｈｉｅら、２００３）。クリオキノールは、ＺｎおよびＣｕがＡＰＰに結合するのを妨げ、そしてそれによってＡβ重合を妨げ、そしてまた、アミロイド斑をばらばらにすると仮定されている。しかし、最近の研究によって、クリオキノールは、銅取り込みを仲介し、そしてＡＰＰのＣｕ流出活性を相殺することが示唆される（Ｔｒｅｉｂｅｒら、２００４）。しかし、ＡＰＰプロセシングに対する銅キレート剤の直接効果は、現在まで、立証されてきていない。
【００１４】
本発明にしたがって、表現「ＡＴＰ７Ａ」は、図２に示すようなタンパク質だけでなく、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なその断片、またはその相同体、または低ストリンジェンシー条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味する。好ましくは、これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１〜５時間洗浄し、そして２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間洗浄することを含む。
【００１５】
本発明で挙げる他のタンパク質すべてにも同じことがあてはまる。したがって、既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なその断片、またはその相同体、または低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。
【００１６】
細胞または生物におけるＡＴＰ７Ａ活性を定量的に決定するため、多様な方法が利用可能である。
ａ）酵母における機能的補完アッセイによる：
Ｃｃｃ２ｐの機能が損なわれたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株では、フェロキシダーゼＦｅｔ３ｐが機能不全であり、鉄欠乏表現型を生じる。ＡＴＰ７Ｂ（Ｈｉｓら、２００４）またはＡＴＰ７Ａなどのヒト銅輸送ＡＴＰアーゼを発現させると、この表現型が補完される。その結果、鉄欠乏表現型の機能的補完の度合いを測定することによって、すなわち鉄制限培地中で酵母細胞が増殖する能力を定量化することによって、ＡＴＰ７Ａの活性を定量化することも可能である。
【００１７】
ｂ）ヒトＡＴＰ７Ａを発現するｃｃｃ２ｐ欠損酵母における、フェロキシダーゼ活性の測定による：
上に概略する表現型アプローチに加えて、ＡＴＰ７Ａ活性を定量化するための銅輸送機能のより高感度の指標として、ｃｃｐ２ｐ欠損酵母株において、フェロキシダーゼ活性を測定すること（Ｈｓｉら、２００４）もまた、可能である。
【００１８】
ｃ）ＡＴＰ７ＡのＡＴＰアーゼ活性の測定による：
ピルビン酸キナーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼとしてのＡＴＰ依存性酵素の反応効率を測定するアッセイによって、あるいは固定した時間間隔で、ホスフェート放出を測定する、比色アッセイによって、ＡＴＰ７Ａ（例えばＴＡＰ−ＡＴＰ７Ａの精製によって得られるようなもの）の金属イオン依存性ＡＴＰアーゼ活性を、３７℃で決定することも可能である（本明細書に援用される、Ｈｏｕら、２００１）。これらのアッセイの多くは、公知のものとして詳細に開示されており、そしてしたがって当業者に周知である。
【００１９】
ｄ）銅に誘導される毒性に対する感受性の測定：
細胞の銅の流出を測定することによって、または他の金属に対してではなく銅に対する細胞の感受性を定量化することによってもまた、ＡＴＰ７Ａの活性を測定することも可能である（Ｈｏｕら、２００１）。
【００２０】
ｅ）６４Ｃｕ集積の定常状態測定
細胞内銅（好ましくは６４Ｃｕ）集積を測定することによってもまた、ＡＴＰ７Ａの活性を測定することも可能である（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍら、２００４）。
【００２１】
ＡＴＰ７Ａ活性を測定するための上述の機能アッセイを、実施例３に、より詳細に論じる。
他のタンパク質の場合、用語「機能的に活性な」は、本明細書において、このポリペプチド、すなわち断片または誘導体が関連する態様にしたがって、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわち断片または誘導体を指す。
【００２２】
本発明にしたがって、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、一般的に、限定されるわけではないが、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、前記用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
【００２３】
本発明にしたがって、用語「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、本明細書において、好ましくは、限定されるわけではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、こうした分子は、多様な態様において、同一サイズのアミノ酸配列に渡って、または当該技術分野に知られるコンピュータ相同性プログラムによって並列を行って並列される配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこうした分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示す、タンパク質を意味する。例えば、本発明で提供するような、適切で利用可能なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、こうしたタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。
【００２４】
用語「断片」は、本明細書において、態様にしたがって、構成要素タンパク質の少なくとも１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸のポリペプチドを指す。特定の態様において、こうした断片は、３５、１００または２００アミノ酸より長くはない。
【００２５】
用語「遺伝子」は、本明細書において、別に言及しない限り、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指し、エクソンおよび場合によるイントロン配列両方を含む。
【００２６】
用語「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書において、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を実行する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうした相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称される。ヒトおよび哺乳動物または他の種からオルソログ遺伝子対を検出するためのアルゴリズムは、これらの生物の全ゲノムを用いる。まず、予測されるタンパク質の完全Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ並列を用いて、対合ベストヒットを回収する。信頼性をさらに改善するため、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質を含む対合ベストヒットを用いて、これらの対のクラスターを形成する。こうした分析は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ， ２００１， ４０９：８６０−９２１に提供される。他の種の遺伝子に対する、本明細書に提供するタンパク質をコードする遺伝子の配列相同性に基づいて、慣用的技術を適用してそれぞれの遺伝子をクローニングし、そしてこうした遺伝子からタンパク質を発現させることによって、あるいは本明細書に提供する方法にしたがって、または当該技術分野に一般的に知られる他の適切な方法にしたがって、類似の複合体を単離することにより、他の種のタンパク質を単離することによって、本発明記載のタンパク質の相同体を単離することも可能である。
【００２７】
本発明の好ましい態様において、「ＡＴＰ７Ａ相互作用分子」はＡＴＰ７Ａ阻害剤である。
本発明にしたがって、用語「阻害剤」は、ＡＴＰ７Ａの活性を好ましくは阻害するかまたは減少させる、生化学的化合物または化学的化合物を指す。これは、例えば、対応する遺伝子の発現の抑制を介して起こることも可能である。ＲＴ−ＰＣＲまたはウェスタンブロット分析によって、遺伝子の発現を測定することも可能である。さらに、これは、例えばＡＴＰ７Ａへの結合による、活性の阻害を介して起こることも可能である。
【００２８】
こうしたＡＴＰ７Ａ阻害剤の例は、ＡＴＰ７Ａに対して向けられる、特にＡＴＰ７Ａの活性部位に対して向けられる、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＡＴＰ７Ａ遺伝子に対して向けられる核酸である。
【００２９】
用語「ＡＴＰ７Ａに対する核酸」は、例えばＡＴＰ７Ａ遺伝子の発現またはＡＴＰ７Ａの活性を阻害する、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そして限定なしに、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）およびリボザイムを含む。
【００３０】
好ましくは、阻害剤は、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）からなる群より選択される。
【００３１】
いわゆる「低分子量分子」（以下、「ＬＭＷ」と称する）は、タンパク質、ペプチド、抗体または核酸ではなく、そして５０００Ｄａ未満、好ましくは２０００Ｄａ未満、より好ましくは１０００Ｄａ未満、最も好ましくは５００Ｄａ未満の分子量を示す、分子である。こうしたＬＭＷは、ライブラリーから出発するハイスループット法において同定可能である。こうした方法は当該技術分野で知られ、そして以下に詳細に論じられる。
【００３２】
これらの核酸を細胞に直接投与することも可能であるし、または外因性の導入された配列を転写させることによって、細胞内で産生することも可能である。
「アンチセンス」核酸は、本明細書において、何らかの配列相補性のため、構成要素タンパク質ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の配列特異的部分にハイブリダイズ可能な核酸を指す。アンチセンス核酸は、構成要素タンパク質ｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域に相補的であることも可能である。複合体形成または活性を阻害する、こうしたアンチセンス核酸は、療法剤として有用性を有し、そして本明細書に記載するような障害の治療または予防に使用可能である。
【００３３】
アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドのものであり、そして好ましくは、６〜約２００ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の側面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオチドである。
【００３４】
核酸、例えばアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを、例えばホスホトリエステル法にしたがって、化学的に合成することも可能である（例えばＵｈｌｍａｎｎ， Ｅ． ＆ Ｐｅｙｍａｎ， Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０， ５４３−５８４を参照されたい）。アプタマーは、ポリペプチド、本明細書ではＡＴＰ７Ａに、高い親和性で結合する核酸である。アプタマーは、異なる一本鎖ＲＮＡ分子の巨大プールから、ＳＥＬＥＸなどの選択法によって単離可能である（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９）Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， ４５， １６２８−５０；ＫｌｕｇおよびＦａｍｕｌｏｋ（１９９４）Ｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ．， ２０， ９７−１０７；ＵＳ ５，５８２，９８１を参照されたい）。アプタマーを、例えばＬ−リボヌクレオシドとして、鏡像型で合成し、そして選択することもまた可能である（Ｎｏｌｔｅら（１９９６）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４， １１１６−９；Ｋｌｕｓｓｍａｎｎら（１９９６）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４， １１１２−５）。この方式で単離された型は、天然存在リボヌクレアーゼによって分解されず、そしてしたがってより高い安定性を所持する利点を享受する。
【００３５】
核酸は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、特に細胞で見出されることも可能なＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅによって分解されうる。したがって、分解に対して安定化させ、それによって長期間に渡って、細胞中で、核酸が高濃度で維持されることを保証するため、核酸を修飾することは好都合である（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３９８９−９４；ＷＯ ９５／１１９１０；ＷＯ ９８／３７２４０；ＷＯ ９７／２９１１６）。典型的には、こうした安定化は、１以上のヌクレオチド間リン基を導入することによって、または１以上の非リン基をヌクレオチド間に導入することによって、得ることも可能である。
【００３６】
適切なヌクレオチド間修飾は、ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０）、上記に集められている（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３９８９−９４；ＷＯ ９５／１１９１０；ＷＯ ９８／３７２４０；ＷＯ ９７／２９１１６もまた参照されたい）。本発明にしたがった使用の１つで使用可能な、核酸における修飾ヌクレオチド間ホスフェート・ラジカルおよび／または非リン架橋は、例えば、メチル・ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエートおよび／またはホスフェート・エステルを含有し、一方、非リン・ヌクレオチド間類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）は、例えばシロキサン架橋、カーボネート架橋、カルボキシメチル・エステル、アセトアミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）架橋および／またはチオエーテル架橋を含有する。この修飾が、本発明記載の使用の１つで使用可能である薬剤組成物の耐久性を改善するはずであることもまた意図される。一般的に、オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、またはホスフェート主鎖で修飾することも可能である。
【００３７】
オリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を渡る輸送を促進する剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：６４８−６５２；国際特許公報第ＷＯ ８８／０９８１０号）または血液−脳関門を渡る輸送を促進する剤（例えば国際特許公報第ＷＯ ８９／１０１３４号）、ハイブリダイゼーションに誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照されたい）、またはインターカレート剤（例えばＺｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９を参照されたい）などの、他の付随する基を含むことも可能である。
【００３８】
詳細には、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、限定されるわけではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、Ｄ−マンノシルケオシン、５Ｎ−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群より選択される、少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことも可能である。
【００３９】
別の態様において、オリゴヌクレオチドは、限定されるわけではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群より選択される、少なくとも１つの修飾糖部分を含む。
【００４０】
適切なアンチセンス核酸の使用が、例えば、ＺｈｅｎｇおよびＫｅｍｅｎｙ（１９９５）Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １００， ３８０−２；ＮｅｌｌｅｎおよびＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， １８， ４１９−２３， Ｓｔｅｉｎ（１９９２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ６， ６９７−７４またはＹａｃｙｓｈｙｎ， Ｂ．Ｒ．ら（１９９８）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １１４， １１４２にさらに記載される。
【００４１】
さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドは、２−ａ−アノマー・オリゴヌクレオチドである。ａ−アノマー・オリゴヌクレオチド（２−ａ−アノマーまたはａ−アノマー）は、通常のβ−ユニットと対照的に、相補ＲＮＡと鎖が互いに平行に走る特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。
【００４２】
オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションが誘発する架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションが誘発する切断剤等にコンジュゲート化することも可能である。
【００４３】
本発明全体で、当該技術分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から商業的に入手可能なものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Ｓｔｅｉｎら（１９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：７４４８−７４５１）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
【００４４】
特定の態様において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、触媒性ＲＮＡまたはリボザイムを含む（例えば、国際特許公報第ＷＯ ９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５を参照されたい）。別の態様において、オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５：３２７−３３０）である。
【００４５】
別の態様において、本発明のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で産生される。例えば、細胞に取り込まれるように、ベクターをｉｎ ｖｉｖｏで導入することも可能であり、その細胞内でベクターまたはその一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が産生される。こうしたベクターは、構成要素タンパク質をコードする配列を含有するであろう。こうしたベクターは、望ましいアンチセンスＲＮＡを産生するように転写されることが可能である限り、エピソームにとどまることも可能であるし、または染色体に組み込まれることも可能である。当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって、こうしたベクターを構築することも可能である。ベクターは、プラスミド・ベクター、ウイルス・ベクター、または哺乳動物細胞における複製および発現が可能であることが当該技術分野に知られる他のものであることも可能である。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において、作用することが当該技術分野に知られるプロモーターいずれによることも可能である。こうしたプロモーターは誘導性または恒常性であることも可能である。こうしたプロモーターには、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペス・チミジンキナーゼ・プロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）等が含まれる。
【００４６】
本発明のアンチセンス核酸は、構成要素タンパク質遺伝子、好ましくはヒト遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対相補性は好ましいが必要ではない。「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列は、本明細書において、ＲＮＡとハイブリダイズ可能であるのに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味し；したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験することも可能であるし、または三重鎖形成をアッセイすることも可能である。ハイブリダイズする能力は、相補性の度合いおよびアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズする核酸がより長ければ、構成要素タンパク質ＲＮＡとの塩基ミスマッチをより多く含有して、そしてなお安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成することが可能になる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準法の使用によって、ミスマッチの容認しうる度合いを確認することも可能である。
【００４７】
遺伝子発現、本明細書ではＡＴＰ７Ａ遺伝子発現を下方制御するかまたはスイッチオフするプロセスにおける、ＲＮＡ干渉のためのツールとしてのｓｉＲＮＡの産生および使用は、例えばＥｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ．Ｍ．ら（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， １８８またはＥｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ．Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４に記載される。好ましくは、ｓｉＲＮＡは３０ヌクレオチド未満の長さを示し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の同一ストレッチは、好ましくは少なくとも１９ヌクレオチドである。
【００４８】
リボザイムもまた、核酸、本明細書ではＡＴＰ７Ａ遺伝子の翻訳を阻害するのに適したツールであり、これはリボザイムがｍＲＮＡに特異的に結合し、そして切断することが可能であるためである。これらは例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら（１９９８）Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ５４， １１７５−２０２；Ｖａｉｓｈら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２６， ５２３７−４２；Ｐｅｒｓｉｄｉｓ（１９９７）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５， ９２１−２またはＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １２， ５１０−５に記載される。
【００４９】
薬学的に許容しうるキャリアー中に有効量の核酸を含む、本発明の薬剤組成物を、本発明のタンパク質複合体を発現するかまたは過剰発現する種類の疾患または障害を有する患者に投与することも可能である。
【００５０】
特定の障害または状態の治療に有効であろう核酸の量は、障害または状態の性質に応じるであろうし、そして標準的臨床技術によって決定可能である。可能な場合、ヒトで試験しそして使用する前に、核酸細胞傷害性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定し、そして次いで有用な動物モデル系で測定することが望ましい。
【００５１】
特定の態様において、核酸を含む薬剤組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与する。本発明の多様な態様において、こうした組成物を用いて、核酸の持続放出を達成することが有用である可能性もある。特定の態様において、同定可能な中枢神経系細胞種に特異的な抗体を介してターゲティングされるリポソームを利用することが望ましい可能性もある（Ｌｅｏｎｅｔｔｉら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：２４４８−２４５１；Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１６３３７−１６３４２）。
【００５２】
用語「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」は、ＡＴＰ７Ａに結合し、そしてこれを阻害する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そして限定なしに、ＡＴＰ７Ａに対して向けられるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体断片およびタンパク質骨格を含む。
【００５３】
本発明にしたがって、用語、抗体または抗体断片はまた、組換え的に調製され、そして適切な場合、修飾された、抗体またはその抗原結合部分、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（ｏｌｉｇｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２断片（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０ ３６８ ６８４、ＵＳ ４，８１６，５６７、ＵＳ ４，８１６，３９７、ＷＯ ８８／０１６４９、ＷＯ ９３／０６２１３またはＷＯ ９８／２４８８４を参照されたい）を意味するとして理解され、好ましくはＦＡＢ発現ライブラリーの補助で産生される。
【００５４】
古典的な抗体の代替物として、例えば、ＡＴＰ７Ａに対するタンパク質骨格、例えばリポカリンに基づくアンチカリン（Ｂｅｓｔｅら（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６， １８９８−１９０３）を使用することもまた可能である。選択されるハプテン、本明細書ではＡＴＰ７Ａに結合する方式で、例えば「コンビナトリアル・タンパク質設計」アプローチによって、リポカリン、例えばレチノール結合性タンパク質またはビリン結合性タンパク質の天然リガンド結合部位を改変することも可能である（Ｓｋｅｒｒａ， ２０００， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４８２， ３３７−５０）。他の既知のタンパク質骨格が、分子認識のための抗体の代替物であることが知られる（Ｓｋｅｒｒａ（２０００）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．， １３， １６７−１８７）。
【００５５】
当業者に周知の方法にしたがって、例えば哺乳動物、例えばウサギを、適切な場合、例えばフロイントのアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で、ＡＴＰ７Ａで免疫することによって、抗体または抗体断片を調製する方法が達成される（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｂ．Ａ．ら（１９８１）Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１３４４−１３４９を参照されたい）。免疫学的反応の結果として、動物で形成されるポリクローナル抗体を、続いて、周知の方法を用いて血液から単離し、そして例えばカラム・クロマトグラフィーによって精製することも可能である。例えば、モノクローナル抗体をＷｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎの既知の方法（Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ， ３４９， ２９３−２９９）にしたがって、調製することも可能である。
【００５６】
詳細には、適切な被験者を、免疫原としてのポリペプチドで免疫することによって、上述のように、ポリクローナル抗体を調製することも可能である。好ましいポリクローナル抗体組成物は、本発明の単数または複数のポリペプチドに対して向けられる抗体に関して選択されているものである。特に好ましいポリクローナル抗体調製物は、既定の単数または複数のポリペプチドに対して向けられる抗体のみを含有するものである。特に好ましい免疫原組成物は、他のヒト・タンパク質を含有しないもの、例えば本発明のポリペプチドの組換え発現のため、非ヒト宿主細胞を用いて作製した免疫原組成物である。こうした方式では、この免疫原に対して作製して生じた抗体組成物に認識されるのは、本発明の単数または複数のポリペプチドの一部として存在する、単数または複数のヒト・エピトープのみであろう。
【００５７】
標準的技術、例えば固定ポリペプチドを用いた酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、一定時間に渡って、免疫した被験者における抗体力価を監視することも可能である。望ましい場合、哺乳動物から（例えば血液から）、抗体分子を単離し、そしてさらに、周知の技術、例えばプロテインＡクロマトグラフィーによって、さらに精製してＩｇＧ分画を得ることも可能である。あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチドに特異的な抗体を、例えばアフィニティー・クロマトグラフィーによって、選択する（例えば部分的に精製する）かまたは精製することも可能である。例えば、組換え的に発現され、そして精製された（または部分的に精製された）本発明のタンパク質を、本明細書に記載するように産生し、そして例えばクロマトグラフィー・カラムなどの固体支持体に、共有的にまたは非共有的にカップリングする。次いで、該カラムを用いて、多数の異なるエピトープに対して向けられる抗体を含有する試料から、本発明のタンパク質に特異的な抗体をアフィニティー精製し、それによって実質的に精製された抗体組成物、すなわち混入抗体を実質的に含まないものを生成することも可能である。この関連において、実質的に精製された抗体組成物によって、抗体試料が、本発明の望ましいタンパク質またはポリペプチドに対するもの以外のエピトープに対して向けられる混入抗体を（乾燥重量にして）最大わずか３０％しか含有せず、そして好ましくは（乾燥重量にして）試料の最大２０％、さらにより好ましくは最大１０％、そして最も好ましくは最大５％のみが混入抗体であることを意味する。精製抗体組成物は、組成物中の抗体の少なくとも９９％が、本発明の望ましいタンパク質またはポリペプチドに対して向けられることを意味する。
【００５８】
免疫後の適切な時点で、例えば特異的抗体力価が最も高いとき、抗体産生細胞を被験者から得て、そして該細胞を用いて、標準的技術、例えば元来、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６）またはトリオーマ技術によって、モノクローナル抗体を調製することも可能である。ハイブリドーマを産生するための技術は周知である（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９４， Ｃｏｌｉｇａｎら（監修）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨークを参照されたい）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、目的のポリペプチドに結合する抗体に関して、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって、検出される。
【００５９】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリン・ライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイ・ライブラリー）を、目的のポリペプチドでスクリーニングすることによって、本発明のポリペプチドに対して向けられるモノクローナル抗体を同定し、そして単離することも可能である。ファージディスプレイ・ライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットが商業的に入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰファージディスプレイ・キット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイ・ライブラリーを生成し、そしてスクリーニングする際に使用するのに特に受け入れられる方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／１８６１９号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９１／１７２７１号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／２０７９１号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／１５６７９号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９３／０１２８８号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／０１０４７号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／０９６９０号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら， １９９１， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら， １９９２， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら， １９９３， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４に見出すことも可能である。
【００６０】
さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作製可能である、ヒト部分および非ヒト部分両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体が、本発明の範囲内である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばネズミｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである（例えば、本明細書に完全に援用される、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、本明細書に完全に援用される、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野に知られる組換えＤＮＡ技術によって、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ ８７／０２６７１号；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；欧州特許出願１７３，４９４；ＰＣＴ公報第ＷＯ ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら， １９８７， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら， １９８８， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら， １９８６， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら， １９８８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０に記載される方法を用いて、産生可能である。
【００６１】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の療法的治療に特に望ましい。こうした抗体は、例えば、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現不能であるが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現可能である、トランスジェニックマウスを用いて、産生可能である。選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドすべてまたは一部を用いて、通常の様式で該トランスジェニックマウスを免疫する。慣用的ハイブリドーマ技術を用いて、該抗原に対して向けられるモノクローナル抗体を得ることも可能である。該トランスジェニックマウスに宿するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成し、そして続いてクラス・スイッチおよび体細胞突然変異を経る。したがって、こうした技術を用いて、療法的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説には、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ， １９９５， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３を参照されたい。ヒト抗体およびヒト・モノクローナル抗体を産生するためのこの技術の詳細な考察、およびこうした抗体を産生するためのプロトコルには、例えば米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号を参照されたい。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フリーモント）などの企業は、上述のものと類似の技術を用いて、選択した抗原に対して向けられるヒト抗体を提供するのに従事することも可能である。
【００６２】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体を、「ガイド選択」と称される技術を用いて、生成することも可能である。このアプローチでは、選択した非ヒト・モノクローナル抗体、例えばネズミ抗体を用いて、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓら， １９９４， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【００６３】
当該技術分野に知られる技術によって、複合体のイディオタイプを含有する抗体断片を生成することも可能である。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生可能なＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ’断片；パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することによって生成可能なＦａｂ断片；およびＦｖ断片が含まれる。
【００６４】
抗体産生において、望ましい抗体に関するスクリーニングは、当該技術分野に知られる技術、例えばＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）によって達成可能である。複合体の特定のドメイン、またはその誘導体に特異的な抗体を選択するため、こうしたドメインを含有する複合体の断片、またはその誘導体に結合する産物に関して、生成されたハイブリドーマをアッセイすることも可能である。本発明の複合体、あるいはその誘導体または相同体に特異的に結合するが、複合体、あるいはその誘導体または相同体の個々のタンパク質に特異的に結合しない、抗体を選択するため、複合体に対する陽性結合および個々のタンパク質構成要素に対する結合の欠如に基づいて、選択することも可能である。
【００６５】
既定の単数または複数のタンパク質の局在および／または定量に関連する、当該技術分野に知られる方法、例えばこれらのタンパク質を画像化するための方法、適切な生理学的試料中のそのレベルを測定する方法（イムノアッセイによる）、診断法などで、前述の抗体を使用することも可能である。これはまた、複合体の誘導体または相同体に関してもあてはまる。
【００６６】
好ましい態様において、ＡＴＰ７Ａ阻害剤は、配列：ＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＧＧＧ（Ａ）またはＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴ（Ｂ）いずれかを持つｓｉＲＮＡである。
【００６７】
上に論じるように、ＡＴＰ７Ａは、ガンマ・セクレターゼ活性および／またはベータ・セクレターゼ活性の制御に関与するタンパク質複合体の一部である。したがって、好ましい態様において、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子または阻害剤は、タンパク質複合体、好ましくはＰｓｅｎ２タンパク質複合体またはＢＡＣＥ１複合体の一部であるＡＴＰ７Ａ分子に作用する。
【００６８】
前記タンパク質複合体は、代替ガンマ−セクレターゼ・サブユニットＰｓｅｎ２およびベータ−セクレターゼ・タンパク質と相互作用するタンパク質の集合と同定されてきている。
【００６９】
上に説明するように、驚くべきことに、本発明の関連において、ＡＴＰ７Ａが、特にベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ−セクレターゼ活性によって、ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングを制御するタンパク質複合体の一部であることが発見された。したがって、好ましい態様において、阻害剤または相互作用分子は、ガンマ・セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの活性を調節する。
【００７０】
本発明全体で、用語「ガンマ・セクレターゼおよび／またはベータ・セクレターゼの活性を調節する」は、酵素活性が直接または間接的に調節されることを含む。これは、ＡＴＰ７Ａ調節剤がこれらの酵素のいずれかに直接結合可能であるか、あるいはより好ましくは、ＡＴＰ７Ａに影響を発揮して、次に例えばタンパク質−タンパク質相互作用によってまたはシグナル伝達によって、または小さい代謝産物を介して、これらの酵素のいずれかの活性を調節可能であることを意味する。
【００７１】
本発明全体で、ベータ・セクレターゼ調節剤が、完全にまたは部分的に、ベータ・セクレターゼの活性を阻害することが好ましい。本発明全体で、ＡＴＰ７Ａ調節剤の最も好ましい機能的結果は、Ａベータ−４２生成の減少である。
【００７２】
本発明の関連において、「ガンマ・セクレターゼおよび／またはベータ・セクレターゼの活性を調節する」は、活性が減少して、より少ない産物が形成されるかまたは産物がまったく形成されず、最も好ましくはより少ないＡベータ−４２が形成されるかまたはＡベータ−４２がまったく形成されない（部分的または完全阻害）か、あるいはそれぞれの酵素が異なる産物（ガンマ−セクレターゼの場合、Ａベータ−４２の代わりにより短いアミノ酸配列の、例えばＡベータ−３８または他のＡベータ・ペプチド）を産生するか、あるいは産物の相対量が異なる（ガンマ・セクレターゼの場合、例えばＡベータ４０対Ａベータ−４２の比が変化する、好ましくは増加する）ことを意味する。
【００７３】
さらに、調節剤が、ガンマ・セクレターゼまたはベータ・セクレターゼいずれか、あるいは両酵素の活性を調節することが含まれる。
ガンマ・セクレターゼ活性の調節剤に関しては、この調節剤が、ガンマ・セクレターゼ活性を阻害することが好ましい。しかし、Ａベータ・ペプチド種の総量が変化しないが、Ａベータ−４２の代わりに、より多くのＡベータ−３８が産生される方式で、ガンマ・セクレターゼの活性がシフトすることもまた、好ましい。
【００７４】
例えばＡＰＰプロセシングを測定することによって、例えば、産生されるＡベータ・ペプチド種のレベル、最も重要なことに、Ａベータ−４２のレベルを測定することによって、ガンマ・セクレターゼ活性を測定することも可能である（以下の実施例セクションを参照されたい）。
【００７５】
プレセニリン１および２（それぞれ、Ｐｓｅｎ１およびＰｓｅｎ２、ＰＳ１およびＰＳ２とも称される）は、小胞体、ゴルジ体、および細胞表面にもまた局在する、内在性膜タンパク質である（Ｋｏｖａｃｓ， Ｎａｔ Ｍｅｄ ２． ２２４）。これらは主に、ＮＴＦおよびＣＴＦ細胞内タンパク質分解断片のヘテロ二量体として見出される。プレセニリンを切断するプロテアーゼ（「プレセニリナーゼ」）は未知であり、プロセスが自己触媒性である可能性があり、またＰＳ（自己）タンパク質分解の機能的な重要性は不明である。プレセニリンは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３９１， ３８７）およびＮｏｔｃｈ受容体（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３９８， ５１８）のタンパク質分解プロセシングに関与する。さらに、プレセニリンは、細胞接着タンパク質、アルファおよびベータ−カテニン、Ｎ−カドヘリン、ならびにＥ−カドヘリン（Ｇｅｏｒｇａｋｏｐｏｕｌｏｓら， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４， ８９３）およびアルマジロ・ファミリーの他のメンバー（Ｙｕら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３， １６４７０）と会合する。プレセニリンによるＡＰＰプロセシングは、ＡＰＰを切断し、Ａ−ベータ・ペプチドのＣ末端を生成する、ガンマ−セクレターゼに対する影響を通じる。ＰＳ１は、ＡＰＰのＣ８３およびＣ９９プロセシングＣ末端断片（Ｘｉａら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９４， ８２０８）、ニカストリン（Ｙｕら， Ｎａｔｕｒｅ ４０７， ４８）およびＰｅｎ−２（Ｆｒａｎｃｉｓら， Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ３， ８５）と会合する。プレセニリン・プロセシングには、Ａｐｈ−１（Ｆｒａｎｃｉｓら， Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ３， ８５）が必要である。プレセニリンが、ガンマ−セクレターゼ活性を直接制御するかどうか、またはこれらがそれ自体、プロテアーゼ酵素であるのかどうかは明らかでない（ＫｏｐａｎおよびＧｏｕａｔｅ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４， ２７９９）。ガンマ・セクレターゼ活性は、これらのタンパク質の多量体複合体を含むことも可能である（Ｙｕら， Ｎａｔｕｒｅ ４０７， ４８）が、これらのタンパク質間の関係がどのようにセクレターゼ活性に影響を及ぼすかは知られていない。
【００７６】
ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）活性は、細胞外ドメインでＡＰＰを切断し、分泌可溶性ＡＰＰｂの分断を生じ、そして９９残基のＣ末端膜貫通断片（ＡＰＰ−Ｃ９９）を生じる。Ｖａｓｓａｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ７３５−７４１）は、ＡＰＰのベータ−セクレターゼと推測される特性を有する膜貫通アスパラギン酸プロテアーゼをクローニングし、該プロテアーゼをＢＡＣＥ１と名づけた。ＢＡＣＥ１ノックアウトマウス由来の脳および初代皮質培養物は、検出可能なベータ−セクレターゼ活性を示さず、そしてＢＡＣＥノックアウトマウス由来の初代皮質培養物は、ＡＰＰからはるかに少ないアミロイド−ベータしか産生しなかった。これによって、ＢＡＣＥ１のパラログであるＢＡＣＥ２ではなく、ＢＡＣＥ１がＡＰＰの主なベータ−セクレターゼであることが示唆される。ＢＡＣＥ１は、５０１アミノ酸のタンパク質であり、２１ａａのシグナルペプチドに続いて、ａａ２２〜４５に渡る、プロタンパク質ドメインを含有する。選択的スプライシング型、ＢＡＣＥ−Ｉ−４５７およびＢＡＣＥ−Ｉ−４７６がある。成熟タンパク質の管腔ドメインに続いて、予測される１つの膜貫通ドメインおよび２４ａａの短い細胞質ゾルＣ末端テールがある。ＢＡＣＥ１は、１型膜貫通タンパク質であり、活性部位が膜の管腔側にあると予測され、ここでベータ−セクレターゼがＡＰＰ、およびありうる他の未同定の基質を切断する。ＢＡＣＥ１は、明らかに、ＡＰＰをＡ−ベータにプロセシングするのに必要とされる重要な酵素であるが、最近の証拠は、ＢＡＣＥ１のさらなる潜在的基質および機能を示唆している（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９， １０５４２−１０５５０）。現在まで、制御機能または調節機能を持つＢＡＣＥ１相互作用タンパク質は、まったく記載されてきていない。
【００７７】
これらのタンパク質相互作用因子の解明は、療法のための新規介入点を提供する。
上に説明したように、驚くべきことに、本発明の関連において、ＡＴＰ７Ａは、ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ・セクレターゼ活性を制御するタンパク質複合体の一部であることが見出された。したがって、好ましい態様において、阻害剤または相互作用分子は、ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ・セクレターゼの活性を調節する。
【００７８】
本発明の関連において、「ガンマ・セクレターゼおよび／またはベータ・セクレターゼの活性を調節する」は、活性が減少して、より少ない産物が形成されるかまたは産物がまったく形成されない（部分的または完全阻害）か、あるいはそれぞれの酵素が異なる産物（ガンマ−セクレターゼの場合、例えばＡベータ−４２の代わりにＡベータ−４０）を産生するか、あるいは産物の相対量が異なる（ガンマ・セクレターゼの場合、例えばＡベータ−４２よりも多いＡベータ４０）ことを意味する。さらに、調節剤は、ガンマ・セクレターゼまたはベータ・セクレターゼのいずれか、あるいは両酵素の活性を調節することが含まれる。
【００７９】
本発明全体で、ベータ・セクレターゼ調節剤が、完全にまたは部分的に、ベータ・セクレターゼの活性を阻害することが好ましい。
ガンマ・セクレターゼ活性の調節剤に関して、この調節剤が、ガンマ・セクレターゼ活性を阻害することが好ましい。しかし、Ａベータ−４２の代わりに、より多くのＡベータ−４０が産生される方式で、ガンマ・セクレターゼの活性がシフトすることもまた、好ましい。
【００８０】
例えば、ＡＰＰプロセシングを決定することによって、例えばＡベータ４０またはＡベータ−４２が産生されるかどうかを決定することによって、ガンマ・セクレターゼ活性を測定することも可能である（以下の実施例セクションを参照されたい）。
【００８１】
ＢＡＣＥ１活性を測定するため、ウェスタンブロッティングによって、アルファ−およびベータ−Ｃ末端ＡＰＰ断片間の比の変化を分析することも可能であり（Ｂｌａｓｋｏら， Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ １１１， ５２３）；ＢＡＣＥ１活性アッセイのさらなる例には、限定されるわけではないが：ベータ−ガラクトシダーゼ・レポーター活性を再構成し、そして測定する、ＢＡＣＥ１切断部位を含有する環状化酵素ドナー・ペプチドの使用（Ｎａｑｖｉら， Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ． ９， ３９８）；消光蛍光ペプチド基質および蛍光測定の使用（Ａｎｄｒａｕら， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８， ２５８５９）；酵素（アルカリホスファターゼなど）を、ＢＡＣＥ１認識配列を含有するアミノ酸ストレッチを介して、ゴルジ体常在タンパク質に連結する、組換えキメラタンパク質を利用する、細胞に基づくアッセイの使用（Ｏｈら， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ３２３， ７）；蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイ（Ｋｅｎｎｅｄｙら， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｎ ３１９， ４９）；酵母における細胞増殖選択系（Ｌｕｔｈｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６２０， １６７）が含まれる。
【００８２】
好ましくは、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
本発明にしたがって、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子を用いて、薬剤組成物を調製する。
したがって、本発明は、有効量で被験者に投与可能な薬剤組成物を提供する。好ましい側面において、療法剤は、実質的に精製されている。被験者は、好ましくは、限定されるわけではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含む動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。特定の態様において、非ヒト哺乳動物が被験者である。
【００８３】
多様な搬送系が知られ、そしてこうした系を用いて、本発明の療法剤を投与することも可能であり、こうした系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：療法剤を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用（例えば、ＷｕおよびＷｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２）；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、化合物を投与することも可能であるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。さらに、脳室内注射およびクモ膜下注射を含む、適切な経路いずれかによって、本発明の薬剤組成物を中枢神経系に導入することが望ましい可能性もあり；脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａ容器などの容器に取り付けた、脳室内カテーテルによって容易にすることも可能である。例えば吸入器または噴霧器を使用し、そしてエアロゾル化剤と配合することによって、肺投与もまた使用可能である。
【００８４】
特定の態様において、治療の必要がある領域に、本発明の薬剤組成物を局所投与することが望ましい可能性もある。これは、例えば、そして限定なしに、手術中の局所注入によって、例えば手術後の創傷手当て（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）と組み合わせた局所適用によって、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、あるいはシアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜またはファイバーを含む、多孔、無孔、またはゼラチン性物質である移植物によって、達成可能である。１つの態様において、悪性腫瘍または新生物組織もしくは新生物発生前組織の部位（または以前の部位）に直接注射することによって、投与することも可能である。
【００８５】
別の態様において、療法剤を、小胞、特にリポソーム中で搬送することも可能である（Ｌａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら， １９８９， ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ中， Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ監修， Ｌｉｓｓ， ニューヨーク， ｐｐ．３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， 同書， ｐｐ．３１７−３２７；一般的には同書を参照されたい）。
【００８６】
さらに別の態様において、徐放系を介して、療法剤を搬送することも可能である。１つの態様において、ポンプを使用することも可能である（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ， １９８７， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら， １９８０， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋら， １９８９， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４−５７９）。別の態様において、ポリマー物質を用いることも可能である（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ監修， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， フロリダ州ボーカラートン， １９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ監修， Ｗｉｌｅｙ， ニューヨーク， １９８４；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ， １９８３， Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１；Ｌｅｖｙら， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇら， １９８９， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄら， １９８９， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：８５８−８６３）。さらに別の態様において、療法ターゲット、すなわち脳に近接して、徐放系を配置し、こうして全身用量のうち、ごく少量しか必要としないことも可能である（例えばＧｏｏｄｓｏｎ， １９８４， ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ中， 上記， Ｖｏｌ．２， ｐｐ．１１５−１３８）。他の徐放系が、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）による概説に論じられている。
【００８７】
療法剤が、好ましくはタンパク質療法剤をコードする核酸である、特定の態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、そして細胞内に存在するように投与することによって、核酸をｉｎ ｖｉｖｏで投与して、コードされるタンパク質の発現を促進することも可能であり、これは、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号）、または直接注射によって、または微小粒子銃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または核酸を脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られるホメオボックス様ペプチド（例えばＪｏｌｉｏｔら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８）に連結した核酸を投与することによって、実行可能である。あるいは、核酸療法剤を細胞内に導入し、そして発現のため、宿主細胞ＤＮＡ内に相同組換えによって取り込ませることも可能である。
【００８８】
一般的に、本発明の薬剤組成物は、療法的有効量の療法剤、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む。特定の態様において、用語「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、連邦政府または州政府の監督官庁に認可されたか、あるいは米国薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリアー」は、療法剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。こうした薬剤キャリアーは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。薬剤組成物を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアーである。薬剤組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアーである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアーとして使用される。適切な薬剤賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリアー、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアーを含むことも可能である。適切な薬剤キャリアーの例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載される。こうした組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアーと一緒に、療法的有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有するであろう。配合物は、投与様式に適していなければならない。
【００８９】
好ましい態様において、日常的な方法にしたがって、ヒトへの静脈内投与に適応させた薬剤組成物として、組成物を配合する。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給する。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
【００９０】
本発明の療法剤を中性型または塩型で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【００９１】
特定の障害または状態の治療に有効であろう、本発明の療法剤の量は、障害または状態の性質に応じるであろうし、そして標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性にも応じるであろうし、そして担当医の判断および各患者の状況にしたがって、決定すべきである。しかし、静脈内投与に適した投薬量範囲は、一般的に、キログラム体重あたり、活性化合物約２０〜５００マイクログラムである。鼻内投与に適した投薬量範囲は、一般的に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【００９２】
座薬は、一般的に、重量にして０．５％〜１０％の範囲の活性成分を含有し；経口配合物は、好ましくは、１０％〜９５％の活性成分を含有する。
本発明はまた、本発明の薬剤組成物の１以上の成分が充填された、１以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットも提供する。場合によって、こうした容器（単数または複数）に付随して、薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【００９３】
本発明のキットはまた、複合体機構の本質的な構成要素をコードする発現ベクターも含有することも可能であり、この構成要素は、発現された後、生物学的に活性な複合体を形成するため、再構成されることも可能である。こうしたキットは、好ましくはまた、必要な緩衝剤および試薬も含有する。場合によって、こうした容器（単数または複数）に付随して、キット使用のための説明書、並びに／あるいは薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【００９４】
本発明はさらに、有効量のＡＴＰ７Ａ相互作用分子または阻害剤あるいは本発明の薬剤組成物を、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を患う被験者に投与する、治療法に関する。
【００９５】
本発明のこの方法に関して、上記のすべての態様は、本発明の使用のため、あてはまる。
本発明はさらに、ガンマ−セクレターゼ調節剤および／またはベータ−セクレターゼ調節剤を同定する方法であって：
ａ．既定の試験化合物がＡＴＰ７Ａ相互作用分子であるかどうか決定することによって、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子を同定し、
ｂ．工程ａ）のＡＴＰ７Ａ相互作用分子がガンマ−セクレターゼ活性またはベータ−セクレターゼ活性を調節可能であるかどうか決定する
工程を含む、前記方法に関する。
【００９６】
本発明の好ましい態様において、工程ａ）において、試験化合物をＡＴＰ７Ａと接触させ、そして試験化合物とＡＴＰ７Ａの相互作用を決定する。好ましくは、候補分子がＡＴＰ７Ａに結合するかどうかを測定する。
【００９７】
本発明の好ましい態様において、ＡＴＰ７Ａ活性を調節する、好ましくは阻害するかどうかを見出すために、工程ａ）で同定されたＡＴＰ７Ａ相互作用分子をまず、上記のようなＡＴＰ７Ａ活性試験に供し（実施例３も参照されたい）、そして次いで、工程ｂ）に供する（Ａベータ低下効果に関する試験）。
【００９８】
本発明の方法を、好ましくは、ハイスループットアッセイの関連で行う。こうしたアッセイは、当業者に知られる。
スクリーニングしようとする試験分子または候補分子は、限定された数の明記される化合物の混合物として、または化合物ライブラリー、ペプチド・ライブラリー等として、提供されることも可能である。スクリーニングしようとする剤／分子はまた、複合体活性または形成を調節可能な、抗血清、アンチセンス核酸等のすべての形を含むことも可能である。スクリーニングのための典型的な候補分子およびライブラリーを以下に示す。
【００９９】
ライブラリーのスクリーニングは、一般的に知られる多様な方法のいずれによって、達成することも可能である。例えばペプチド・ライブラリーのスクリーニングを開示する、以下の参考文献を参照されたい：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら， １９９４， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２；すべてＬａｄｎｅｒらに対する米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；並びに国際特許公報第ＷＯ ９４／１８３１８号。
【０１００】
特定の態様において、固相上に固定したＡＴＰ７Ａとライブラリーメンバーを接触させ、そしてタンパク質（またはコード核酸もしくは誘導体）に結合するライブラリーメンバーを採取することによって、スクリーニングを行うことも可能である。こうしたスクリーニング法の例は、「パニング」技術と称され、例えば、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８８， Ｇｅｎｅ ７３：３０５ ３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；国際特許公報第ＷＯ ９４／１８３１８号；および上述の文献に引用される参考文献に記載される。
【０１０１】
特定の態様において、ＡＴＰ７Ａ断片および／または類似体、特にペプチド模倣体を、ＡＴＰ７Ａと他のタンパク質、例えばＰｓｅｎ２との複合体の形成（複合体の量または複合体の組成）または細胞中のＡＴＰ７Ａ活性の、細胞における複合体活性または形成を阻害する、競合的または非競合的阻害剤としての活性に関して、スクリーニングする。
【０１０２】
１つの態様において、試験しようとする剤の非存在下では複合体形成が起こる、水性または生理学的結合条件下で、複合体形成を調節する能力に関して剤をスクリーニングする、結合阻害アッセイを用いて、ＡＴＰ７Ａ活性またはＡＴＰ７Ａ−タンパク質複合体形成を調節する（すなわちアンタゴナイズするかまたはアゴナイズする）剤をスクリーニングすることも可能である。本発明の複合体形成に干渉する剤を、複合体形成のアンタゴニストとして同定する。複合体形成を促進する剤を、複合体形成のアゴニストとして同定する。複合体形成を完全に遮断する剤を、複合体形成の阻害剤として同定する。
【０１０３】
スクリーニング法は、放射性リガンド（例えば１２５Ｉまたは３Ｈ）、磁気リガンド（例えばフォトビオチン・アセテートに共有結合した常磁性ビーズ）、蛍光リガンド（例えばフルオレセインまたはローダミン）、または酵素リガンド（例えばルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）で、複合体の構成要素タンパク質を標識することを含むことも可能である。次いで、当該技術分野に知られる多くの技術の１つによって、溶液中で結合する反応剤を単離することも可能であり、こうした技術には、限定されるわけではないが、非標識結合パートナー（または第二の標識複合体部分上で用いるものと区別可能なマーカーで標識された結合パートナー）に対する抗血清を用いた、標識複合体部分の同時免疫沈降、免疫アフィニティー・クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および勾配密度遠心分離が含まれる。好ましい態様において、標識結合パートナーは、商業的に入手可能なフィルターに保持されない小さい断片またはペプチド模倣体である。結合したならば、次いで、標識種は、フィルターを通過不能となり、複合体形成の単純なアッセイが提供される。
【０１０４】
当該技術分野に一般的に知られる方法を用いて、複合体の構成要素メンバーの少なくとも１つを標識する。適切な標識法には、限定されるわけではないが、放射標識アミノ酸、例えば３Ｈ−ロイシンまたは３５Ｓ−メチオニンの取り込みによる放射標識、クロラミンＴ法、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬などを用いた、１２５Ｉまたは１３１Ｉでの翻訳後ヨウ素化による放射標識、あるいはホスホリラーゼおよび無機放射標識リンを用いた３２Ｐでの標識、フォトビオチン−アセテートでのビオチン標識、および太陽灯曝露などが含まれる。複合体メンバーの１つが、例えば以下に記載するように、固定されている場合、遊離種を標識する。相互作用種のいずれも固定されていない場合、各々を区別可能なマーカーで標識して、その後、両方の部分を単離して、より正確な定量化を提供し、そしてヘテロマー複合体からホモマー複合体の形成を区別可能であるようにすることも可能である。修飾相互作用因子の１つに結合する付属タンパク質を利用して、検出感度を改善し、複合体の安定性を増加させるなどの方法を提供する。
【０１０５】
典型的な結合条件は、限定ではないが、例えば、１０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５〜８、および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００または相互作用の特異性を改善する他の界面活性剤の水性塩溶液中である。金属キレート剤および／または二価陽イオンを添加して、結合を改善し、そして／またはタンパク質分解を減少させることも可能である。反応温度は、摂氏４、１０、１５、２２、２５、３５、または４２度を含むことも可能であり、そしてインキュベーション時間は、典型的には少なくとも１５秒間であるが、結合平衡が起こることを可能にするには、より長い時間が好ましい。日常的なタンパク質結合アッセイを用いて、特定の複合体をアッセイして、再現可能な結合に最適な結合条件を決定することも可能である。
【０１０６】
用いる標識に特異的なアッセイ法、例えば放射能検出のための液体シンチレーション計測、酵素標識部分のための酵素活性などを用いた、複合体形成の定量化によって、複合体形成の物理的パラメーターを分析することも可能である。次いで、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析、Ｈｉｌｌ分析、および当該技術分野に一般的に知られる他の方法（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ， ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， 第２版（１９９３）Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨークを参照されたい）を利用して、反応結果を分析する。
【０１０７】
結合アッセイに対する第二の一般的なアプローチにおいて、結合種の１つをフィルター上、マイクロタイタープレートウェル中、試験管中、クロマトグラフィーマトリックスなどに、共有的または非共有的に固定する。当該技術分野に周知の方法いずれか、例えば限定されるわけではないが、ＫａｄｏｎａｇａおよびＴｊｉａｎ， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：５８８９−５８９３の方法、すなわちＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの臭化シアン誘導体化支持体への連結を用いて、タンパク質を共有的に固定することも可能である。必要な場合、スペーサーを使用すると、支持体による立体障害を減少させることも可能である。支持体へのタンパク質の非共有結合には、限定されるわけではないが、荷電表面へのタンパク質の付着、特異的抗体との結合、関連しない第三の相互作用タンパク質への結合などが含まれる。
【０１０８】
いずれかの手段（例えば上述の手段）によって標識した複合体の別のメンバーと、複合体の１つのメンバー（またはその誘導体）の結合に関して競合する剤（細胞抽出物またはライブラリー・プールを含む）のアッセイを提供して、複合体形成の競合剤または増進剤に関してスクリーニングする。
【０１０９】
特定の態様において、他のタンパク質構成要素への試薬の非特異的結合、またはプラスチック、固定マトリックス等に試薬が吸収される損失を阻害する、ブロッキング剤をアッセイ混合物に含む。ブロッキング剤には、限定されるわけではないが、ウシ血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳、デンハルト試薬、Ｆｉｃｏｌｌ、ポリビニルピロリジン、非イオン性界面活性剤（ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０など）、イオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ、ＬＤＳなど）、ポリエチレングリコールなどが含まれる。適切なブロッキング剤濃度によって、複合体形成が可能である。
【０１１０】
結合を行った後、上清中の未結合標識タンパク質を取り除き、そして結合した標識タンパク質いずれかを保持する固定タンパク質を徹底的に洗浄する。次いで、上述のように標識を検出する当該技術分野の標準法を用いて、結合標識の量を定量化する。
【０１１１】
別の特定の態様において、本明細書に提供するようなタンパク質複合体／タンパク質および／または抗体を固体キャリアーに付着させることによって、本明細書に提供するようなタンパク質複合体／タンパク質の調節剤に関するスクリーニングを行うことも可能である。
【０１１２】
異なる種類のタンパク質（抗体を含む）を含有するアレイの調製が当該技術分野に周知であり、そして当業者に明らかである（例えば、Ｅｋｉｎｓら， １９８９， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ． ７：１５５−１６８；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：２２５−２２９；Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎら， ２００２， Ｌａｎｃｅｔ ３５９：５７２−５７７；Ｔｅｍｐｌｉｎら， ２００１， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１６０−１６６；ＷｉｌｓｏｎおよびＮｏｃｋ， ２００１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ６：８１−８５；Ｌｅｅら， ２００２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：１７０２−１７０５；ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ， ２０００， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６０；ＢｌａｗａｓおよびＲｅｉｃｈｅｒｔ， １９９８， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １９：５９５；Ｋａｎｅら， １９９９， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０：２３６３；Ｃｈｅｎら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１４２５；Ｖａｕｇｈａｍら， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３０９−３１４；Ｍａｈｌｅｒら， １９９７， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：３１−４３；Ｒｏｂｅｒｔｓら， １９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：２６８−２７３；Ｎｏｒｄら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：７７２−７７７；Ｎｏｒｄら， ２００１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６８：４２６９−４２７７；ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ， ２０００， Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３；ＫａｒｌｓｔｒｏｅｍおよびＮｙｇｒｅｎ， ２００１， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２９５：２２−３０；Ｎｅｌｓｏｎら， ２０００， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：１１５５−１１６３；Ｈｏｎｏｒｅら， ２００１， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ３：２６５−２７４；Ａｌｂａｌａ， ２００１， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ２：１４５−１５２， ＦｉｇｅｙｓおよびＰｉｎｔｏ， ２００１， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２：２０８−２１６、並びにここに列挙する刊行物中の参考文献を参照されたい）。
【０１１３】
タンパク質またはタンパク質複合体を、当業者に明らかであろうような異なる手段によって、アレイに付着させることも可能である。精製工程後、または当業者に明らかであろうような別の適切な精製スキームによって、例えばＴＡＰ−タグ（ＷＯ／０００９７１６およびＲｉｇａｕｔら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１０３０−１０３２に記載されるようなもの）を介して、複合体をアレイに付加させることも可能である。
【０１１４】
場合によって、複合体のタンパク質を架橋して、複合体の安定性を増進させることも可能である。タンパク質を架橋する、異なる方法が、当該技術分野で周知である。架橋剤の反応性末端基には、限定されるわけではないが、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２またはＮ−オキシ−スクシンアマートが含まれる。
【０１１５】
架橋剤のスペーサーは、架橋しようとする複合体のサイズに対して選択すべきである。いくつかのタンパク質しか含まない、小さいタンパク質複合体に関しては、反応混合物中、別個の複合体を架橋する可能性を減少させるため、比較的短いスペーサーが好ましい。より大きいタンパク質複合体に関しては、複合体内のタンパク質間の架橋を容易にするため、より大きいスペーサーのさらなる使用が好ましい。
【０１１６】
複合体をキャリアーに連結する前に、架橋の成功率をチェックすることが好ましい。
当業者に明らかであろうように、架橋の最適な率を、ケースバイケースで決定する必要がある。当該技術分野に周知の方法によって、これを達成することも可能であり、これらの方法のいくつかを以下に例示的に記載する。
【０１１７】
例えば、変性タンパク質ゲル上で、架橋されない複合体に対して、架橋された複合体を分析することによって、架橋が十分な率であることをチェックすることも可能である。
架橋が成功裡に行われたならば、複合体のタンパク質は、同一レーンに見られると予期され、一方、架橋されない複合体のタンパク質は、個々の特性にしたがって分離されると予期される。場合によって、質量分析および／またはエドマン分解などの当該技術分野に周知の方法を用いて、それぞれのバンド中のタンパク質をペプチド配列決定することによって、複合体のすべてのタンパク質の存在をさらにチェックすることも可能である。
【０１１８】
さらに、高すぎる架橋率もまた、回避しなければならない。架橋があまりにも大規模に起こった場合、個々のタンパク質複合体の架橋量が増加し、これが、アレイを用いた、潜在的な結合パートナーおよび／または調節剤等に関するスクリーニングと干渉する可能性があるであろう。
【０１１９】
当該技術分野に周知の方法によって、こうした構造の存在を決定することも可能であり、そしてこうした方法には、例えば、架橋されない複合体に対して、架橋された複合体を含有する溶液のゲルろ過プロフィールを比較する、ゲルろ過実験が含まれる。
【０１２０】
場合によって、いくつかが本明細書に例示的に提供される、当業者に明らかであろうような機能アッセイを行って、複合体の完全性をチェックすることも可能である。
あるいは、単数または複数のタンパク質を単一の融合タンパク質として発現させ、そして当業者に明らかであろうように、マトリックスにカップリングすることも可能である。
【０１２１】
場合によって、当業者に明らかな多様な方法によって、上に概略するような複合体またはタンパク質または抗体の付着をさらに監視することも可能である。これらには、限定されるわけではないが、表面プラズモン共鳴が含まれる（例えば、ＭｃＤｏｎｎｅｌ， ２００１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ５：５７２−５７７；Ｌｅｅ， ２００１， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：２１７−２２２；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら， ２０００， １：３９５−４１６；Ｐｅａｒｓｏｎら， ２０００， Ａｎｎ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３７：１１９−１４５；Ｖｅｌｙら， ２０００， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２１：３１３−３２１；Ｓｌｅｐａｋ， ２０００， Ｊ． Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ． １３：２０−２６を参照されたい）。
【０１２２】
Ａベータ−４０およびＡベータ−４２ペプチドの産生を、ＥＬＩＳＡによって測定するのに有用な典型的なアッセイには、限定されるわけではないが、Ｖａｓｓａｒ Ｒら， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６：７３５−４１に記載されるものが含まれる。
【０１２３】
細胞株またはトランスジェニック動物におけるＣ末端ＡＰＰ断片の産生を、ウェスタンブロットによって測定するのに有用な典型的なアッセイには、限定されるわけではないが、Ｙａｎ Ｒら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ， ４０２：５３３−７に記載されるものが含まれる。
【０１２４】
プレシニリン（Ｐｒｅｓｉｎｉｌｉｎ）２−複合体（Ｐｓｅｎ２）およびＢＡＣＥ１複合体の、細菌で発現されたＡＰＰ断片に対するベータ−セクレターゼまたはガンマ・セクレターゼのタンパク質分解活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えばＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ）および／または相互作用タンパク質（単数または複数）をコードするプラスミドにより細胞中の１つまたはいくつかの相互作用タンパク質の発現を修飾することによって）測定するのに有用な典型的なアッセイには、限定されるわけではないが、Ｔｉａｎ Ｇら， ２００２， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７７：３１４９９−５０５に記載されるものが含まれる。
【０１２５】
プレシニリン２−複合体（Ｐｓｅｎ２）およびＢＡＣＥ１複合体の、Ｇａｌ４駆動レポーター遺伝子のトランス活性化を（例えばＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ）および／または相互作用タンパク質（単数または複数）をコードするプラスミドにより細胞中の１つまたはいくつかの相互作用タンパク質の発現を修飾することによって）測定するのに有用な典型的なアッセイには、限定されるわけではないが、Ｃａｏ Ｘら， ２００１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９３：１１５−２０に記載されるものが含まれる。
【０１２６】
本発明記載の相互作用分子または阻害剤である能力に関して、当該技術分野に知られるいかなる分子を試験することも可能である。ＡＴＰ７Ａ複合体機構を発現する細胞に、候補分子を直接提供することも可能であるし、または候補タンパク質の場合、核酸が組換え的に発現されて候補タンパク質を産生する条件下で、コード核酸を提供することによって、候補タンパク質を提供することも可能である。
【０１２７】
本発明の方法は、複合体の量、活性、またはタンパク質構成要素組成を調節する分子、例えば阻害するか、アンタゴナイズするか、またはアゴナイズする分子に関して、化学的ライブラリーをスクリーニングするのによく適している。化学的ライブラリーは、ペプチド・ライブラリー、ペプチド模倣体ライブラリー、化学的合成ライブラリー、組換えライブラリー、例えばファージディスプレイ・ライブラリー、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に基づくライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどであることも可能である。
【０１２８】
典型的なライブラリーは、いくつかの供給源（ＡｒＱｕｌｅ、Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ、ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）から商業的に入手可能である。いくつかの場合、コンビナトリアル戦略を用いて、メンバー化合物が付着した支持体上にライブラリーの各メンバーの同一性をコードし、こうして有効な調節剤である分子を直接、そして直ちに同定することを可能にする、これらの化学的ライブラリーを生成する。したがって、多くのコンビナトリアル・アプローチにおいて、化合物プレート上の位置は、その化合物の組成を特定する。また、１つの例において、単一プレート位置に、１〜２０の化学薬品を有することも可能であり、この化学薬品を、目的の相互作用を含有するウェルに投与することによってスクリーニングすることも可能である。したがって調節が検出されたならば、調節活性に関して、相互作用対の徐々に小さいプールをアッセイすることも可能である。こうした方法によって、多くの候補分子をスクリーニングすることも可能である。
【０１２９】
使用に適した多くの多様性ライブラリーが当該技術分野に知られ、そしてこれを用いて、本発明にしたがって試験しようとする化合物を提供することも可能である。あるいは、標準法を用いて、ライブラリーを構築することも可能である。化学的（合成）ライブラリー、組換え発現ライブラリー、またはポリソームに基づくライブラリーが、使用可能なライブラリーの典型的な種類である。
【０１３０】
ライブラリーは、拘束性または半硬直性（ｓｅｍｉｒｉｇｉｄ）（ある程度の度合いの構造硬直性を有するもの）であることも可能であるし、あるいは直鎖または非拘束性であることも可能である。ライブラリーは、ｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリー、ランダムペプチド発現ライブラリーまたは化学的合成ランダムペプチド・ライブラリー、または非ペプチド・ライブラリーであることも可能である。発現ライブラリーを細胞に導入し、該細胞中でライブラリーの核酸を発現させて、コードされるタンパク質を産生し、アッセイを行う。
【０１３１】
１つの態様において、本発明で使用可能なペプチド・ライブラリーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に合成されるライブラリーであることも可能である。こうしたライブラリーの例が、各ペプチドの第一の残基および第二の残基が個々にそして具体的に定義される遊離ヘキサペプチドの混合物を記載する、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６；コレクション中の各ビーズが該ビーズ上にアミノ酸残基の単一ランダム配列を固定するペプチド・ライブラリーを、固相スプリット合成スキームによって産生する、「１ビーズ、１ペプチド」アプローチを記載する、Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；スプリット合成およびＴ−バッグ合成法を記載する、Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， １９９４， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０；およびＧａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３−１２５１に提供される。単に他の例として、Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８；またはＳａｌｍｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２の方法にしたがって、使用のためのコンビナトリアルライブラリーを調製することも可能である。ＰＣＴ公報第ＷＯ ９３／２０２４２号、並びにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３は、各化学ポリマーライブラリーメンバーに関してオリゴヌクレオチド識別子を含有する、「コードされるコンビナトリアル化学ライブラリー」を記載する。
【０１３２】
好ましい態様において、スクリーニングされるライブラリーは、ランダムペプチドが（例えばジスルフィド結合を有することによって）拘束されているランダムペプチド・ファージディスプレイ・ライブラリーである、生物学的発現ライブラリーである。
【０１３３】
さらに、より一般的には、構造的に拘束された有機多様性（例えば非ペプチド）ライブラリーもまた、使用可能である。例えば、ベンゾジアゼピン・ライブラリー（例えばＢｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照されたい）を使用することも可能である。
【０１３４】
使用可能な、コンホメーション的に拘束されたライブラリーには、限定されるわけではないが、酸化環境中でジスルフィド結合によって架橋されて、シスチンを形成する、不変システイン残基、修飾されたペプチド（例えばフッ素、金属、同位体標識を取り込む、リン酸化されているなど）、１以上の非天然存在アミノ酸を含有するペプチド、非ペプチド構造、およびかなりの割合の−カルボキシグルタミン酸を含有するペプチド、を含有するものが含まれる。
【０１３５】
非ペプチド、例えばペプチド誘導体（例えば１以上の非天然存在アミノ酸を含有するもの）のライブラリーを用いることもまた可能である。これらの一例は、ペプトイド・ライブラリーである（Ｓｉｍｏｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）。ペプトイドは、アルファ炭素に結合せず、主鎖アミノ窒素に結合する天然存在側鎖を有する、非天然アミノ酸のポリマーである。ペプトイドは、ヒト消化酵素によって容易には分解されないため、これらは好適に、薬剤使用に、より容易に適応可能である。ペプチド中のアミド官能性が過メチル化されて、化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーが生成される、使用可能なライブラリーの別の例が、Ｏｓｔｒｅｓｈら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２に記載されている。
【０１３６】
本発明にしたがってスクリーニング可能なペプチド・ライブラリーのメンバーは、２０の天然存在アミノ酸を含有するものに限定されない。特に、化学的に合成されたライブラリーおよびポリソームに基づくライブラリーは、２０の天然存在アミノ酸に加えたアミノ酸の使用を可能にする（ライブラリー産生に用いるアミノ酸の前駆体プールに含むことによる）。特定の態様において、ライブラリーメンバーは、１以上の非天然または非古典的アミノ酸または環状ペプチドを含有する。非古典的アミノ酸には、限定されるわけではないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸；−Ａｂｕ、−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸；Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸；３−アミノプロピオン酸；オルニチン；ノルロイシン；ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、シスチン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃ−メチルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、フルオロ−アミノ酸およびアミノ酸類似体一般が含まれる。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であることも可能である。
【０１３７】
特定の態様において、本発明の複合体の断片および／または類似体、またはそのタンパク質構成要素、特にペプチド模倣体を、複合体活性または形成の競合的または非競合的阻害剤としての活性に関して、スクリーニングする。
【０１３８】
本発明の別の態様において、コンビナトリアル化学を用いて、複合体の調節剤を同定することも可能である。コンビナトリアル化学は、その多くが構造的に類似でありうる、数十万の化合物を含有するライブラリーを生成することが可能である。ハイスループットスクリーニング・プログラムは、既知のターゲットに対する親和性に関して、これらの非常に大きいライブラリーをスクリーニングすることが可能である一方、より小規模であるが、最大化学的多様性を提供するライブラリーを得る、新規アプローチが開発されてきている（例えば、Ｍａｔｔｅｒ， １９９７， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４０：１２１９−１２２９を参照されたい）。
【０１３９】
明示される一団のタンパク質に対する結合親和性に関して、小分子の別個のライブラリーを試験するため、コンビナトリアル化学の１つの方法である、アフィニティー・フィンガープリンティングが、以前から用いられている。スクリーニングによって得られたフィンガープリントを用いて、目的の他のタンパク質または受容体（本発明において、本発明のタンパク質複合体およびそのタンパク質構成要素）に対する、個々のライブラリーメンバーの親和性を予測する。目的のタンパク質と反応することが知られる他の化合物から得たフィンガープリントと、フィンガープリントを比較して、ライブラリー化合物が同様に反応可能であるかどうかを予測する。例えば、複合体またはタンパク質構成要素との相互作用に関して、巨大ライブラリー中のすべてのリガンドを試験するのでなく、その活性を有することが知られる他の化合物と類似のフィンガープリントを有するリガンドのみを試験することも可能である（例えば、Ｋａｕｖａｒら， １９９５， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ， １９９５， Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ． ８：２５−２８；およびＫａｕｖａｒ， Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｋｕｒｔｚ， ＳｔａｎｋｅｒおよびＳｋｅｒｒｉｔｔ（監修）， １９９５， ＡＯＡＣ：ワシントンＤ．Ｃ．， ３０５−３１２を参照されたい）。
【０１４０】
Ｋａｙら（１９９３， Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５）は、先の慣用的ライブラリーいずれのものより長い、完全にランダムな配列のペプチドをコードする、ペプチド・ライブラリーを構築する方法を開示した。Ｋａｙらに開示されるライブラリーは、長さ約２０アミノ酸より長い、完全に合成のランダムペプチドをコードする。こうしたライブラリーを好適にスクリーニングして、複合体調節剤を同定することも可能である（米国特許第５，４９８，５３８号、１９９６年３月１２日；およびＰＣＴ公報第ＷＯ ９４／１８３１８号、１９９４年８月１８日もまた参照されたい）。
【０１４１】
ペプチド・ライブラリーの多様な種類の包括的な概説を、Ｇａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３−１２５１に見出すことも可能である。
【０１４２】
好ましい態様において、ＡＴＰ７Ａと試験化合物の相互作用は、ＡＴＰ７Ａ活性の阻害を生じる。
好ましい態様にしたがって、工程ｂ）において、ガンマ−セクレターゼがＡＰＰを切断する能力を測定する。これは上に示すように測定可能である。
【０１４３】
さらに、本発明はまた、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病治療用の薬剤組成物を調製するための方法であって：
ａ）本発明の方法にしたがって、ガンマ−セクレターゼ調節剤および／またはベータ−セクレターゼ調節剤、好ましくは阻害剤を同定し、そして
ｂ）ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤、好ましくは阻害剤を薬剤組成物に配合する
工程を含む、前記方法にも関する。
【０１４４】
ここでもまた、薬剤組成物に関して、上に示すようなすべての態様があてはまる。
好ましい態様において、本発明のこの方法は、同定された分子と、上に説明したような薬学的に許容しうるキャリアーを混合する工程をさらに含む。
【０１４５】
本発明はまた、上に定義するようなＡＴＰ７Ａ阻害剤を含む、薬剤組成物にも関する。
さらに、本発明はまた、薬剤組成物調製のための上記方法によって得られうる、薬剤組成物にも関する。
【０１４６】
本発明はまた、アルツハイマー病などの神経変性疾患および関連する神経変性障害の治療用の、本発明の薬剤組成物にも関する。
本発明はまた、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を治療するかまたは予防する方法であって、こうした治療または予防の必要がある被験者に、本発明の薬剤組成物の療法的有効量を投与することを含む、前記方法にも関する。
【０１４７】
本発明のこの方法に関して、上記のすべての態様は、本発明の使用のため、やはりあてはまる。
本発明はまた、ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ−セクレターゼ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで調節する、好ましくは阻害するための、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子の使用にも関する。例えば、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子によって、細胞培養において、ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ−セクレターゼの活性を調節する、好ましくは阻害することが、本発明内に含まれる。上述のような、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子に関するすべての態様もまた、本発明のこの使用にあてはまる。
【０１４８】
以下の実施例は、本発明の主題をより詳細に記載するであろう。
【実施例】
【０１４９】
（実施例１）
それぞれ、ＥＰ １ １０５ ５０８ Ｂ１およびＲｉｇａｕｔら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：１０３０−１０３２に、より十分に記載されるＴＡＰ技術を用いて、そしてタンパク質精製のため、以下にさらに記載するように、さらに適応させた。以下にさらに記載するように、質量分析を用いて、タンパク質を同定した。
【０１５０】
ＡＴＰ７Ａは、ＴＡＰ技術エントリーポイントＰｓｅｎ２で、タンパク質複合体のメンバーと同定された。
パート１：ＴＡＰタグ化ベイト（ｂａｉｔ）の構築
ＲＴ−ＰＣＲによって、完全ＯＲＦをコードするｃＤＮＡを得た。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、適切な細胞株から総ＲＮＡを調製した。遺伝子特異的プライマーを用い、長鎖テンプレート用ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ両方を行った。３５〜４０周期増幅した後、予期されるサイズのＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、そして必要な場合、さらなる増幅に用いた。低存在量のＲＮＡを、ゲル精製前に、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによって増幅した。ＮｏｔＩ制限部位をＰＣＲプライマーに付着させて、レトロウイルスベクターｐＩＥ９４−Ｎ／Ｃ−ＴＡＰに、増幅されたｃＤＮＡをサブクローニングすることを可能にし、それによって、ＴＡＰタグとのＮ末端融合体またはＣ末端融合体を生成した（Ｒｉｇａｕｔら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：１０３０−１０３２）。以下のベイト／エントリーポイントに関しては、Ｎ末端タグ化を選択した：プレセニリン１、プレセニリン２、Ａｐｈ−１ａ、Ａｐｈ−１ｂ、Ｐｅｎ−２、ＡＰＰ、タウ、Ｆｅ６５、カルセニリン。以下のベイト／エントリーポイントに関しては、Ｃ末端タグ化を選択した：ニカストリン、Ａｐｈ−１ａ、Ａｐｈ−１ｂ、ＢＡＣＥ１ Ｄ２１５Ｎ、ＡＰＰ、ＡＰＰ６９５ＳＷ、ＡＰＰ−Ｃ９９、Ｆｅ６５、Ｘ１１ベータ。
【０１５１】
制限消化、ＤＮＡ配列決定、およびＴＮＴ Ｔ７迅速カップリング転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ ｉｎｃ．）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によって、クローンを分析した。検出のため、ＴＡＰタグのプロテインＡ部分を用いたウェスタンブロッティングによって、タンパク質の存在を証明した。簡潔には、標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離した後、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈのＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩブロッティング装置を用いて、ニトロセルロース膜（ＰＲＯＴＲＡＮ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に半乾性トランスファーした。トランスファー緩衝液は、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭグリシン、１０％メタノールおよび０．０３７５％ドデシル硫酸ナトリウムからなった。１０％脱脂粉乳および０．１％ Ｔｗｅｅｅｎ２０を補ったリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でブロッキングした後、トランスファーしたタンパク質を、ブロッキング溶液中で希釈したペルオキシダーゼ−抗−ペルオキシダーゼ可溶性複合体（Ｓｉｇｍａ）で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。徹底的に洗浄した後、高感度化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、免疫反応性タンパク質を視覚化した。
【０１５２】
パート２：ウイルスの調製および感染
ベクターとして、ＭｏＭＬＶに基づく組換えウイルスを用いた。
調製は、以下のとおり行った：
２．１．ウイルスの調製
２９３ｇｐ細胞を１００％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に増殖させた。これらを、ポリ−Ｌ−リジンプレート（ＰＢＳ中、１：５希釈したポリーＬ−リジン［０．０１％ストック溶液、Ｓｉｇｍａ Ｐ−４８３２］を、プレート上に少なくとも１０分間放置した）上、１：５にスプリットした。第２日、６３マイクログラムのレトロウイルスベクターＤＮＡと一緒に、適切なエンベロープ・タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ １３マイクログラムを、２９３ｇｐ細胞にトランスフェクションした（Ｓｏｍｉａら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１２６６７−１２６７２；Ｓｏｍｉａら ２０００， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：４４２０−４４２４）。第３日、１５ｃｍディッシュあたり、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳと培地を交換した。第４日、ウイルスを含有する培地（上清）を採取した（トランスフェクション後の培地交換の２４時間後）。第二の収集を計画している場合、ＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳをプレートに添加し、そしてプレートをさらに２４時間インキュベーションした。すべての収集を以下のように行った：０．４５マイクロメートル・フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＧｍｂＨ、酢酸セルロース、４３１１５５）を通じて、上清をろ過した。フィルターをコニカル・ポリアロマー遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ、３５８１２６）に入れ、これをＳＷ２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）のバケットに入れた。ろ過した上清をＳＷ２８ローター中、１９４００ｒｐｍ、摂氏２１度で２時間、超遠心した。上清を廃棄した。ウイルスを含有するペレットを、エアロゾル安全チップを用い、上下に１００回ピペッティングすることによって、少量（例えば３００マイクロリットル）のハンクス平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、１４０２５−０９２）に再懸濁した。ウイルスを以下のようにトランスフェクションに用いた。
【０１５３】
２．２．感染
感染させる細胞を１日前に６ウェルプレートの１つのウェルに蒔いた。感染４時間前に、細胞上の古い培地を新鮮な培地と交換した。最小限の体積のみを添加して、細胞が完全に覆われるようにした（例えば７００マイクロリットル）。感染中、細胞は活発に分裂していた。
【０１５４】
細胞およびその増殖条件の説明を、以下にさらに提供する（「２．３．細胞株」）。
濃縮ウイルスに、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン；Ｓｉｇｍａ、Ｈ９２６８）を添加して、最終濃度８マイクログラム／ｍｌを達成した（これは、濃縮レトロウイルス３００マイクロリットルあたり、１ミリグラム／ｍｌポリブレンストックの２．４マイクロリットルと同等である）。ウイルスをポリブレン中、室温で１時間インキュベーションした。感染のため、ウイルス／ポリブレン混合物を細胞に添加して、そして摂氏３７度で数時間、適切なＣＯ２濃度でインキュベーションした（例えば１日または１晩）。感染後、感染細胞上の培地を新鮮な培地と交換した。集密になったら、通常どおりに細胞を継代した。細胞は染色体に組み込まれたレトロウイルスを含有し、そして目的の遺伝子を安定に発現する。
【０１５５】
２．３．細胞株
発現のため、ＳＫＮ−ＢＥ２細胞を用いた。ＳＫＮ−ＢＥ２細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション第ＣＲＬ−２２７１号）を９５％ ＯｐｔｉＭＥＭ＋５％鉄補充ウシ血清中で増殖させた。
【０１５６】
パート３：ＴＡＰタグ化タンパク質の発現パターンのチェック
イムノブロット分析によって、そして／または免疫蛍光によって、ＴＡＰタグ化タンパク質の発現パターンをチェックした。免疫蛍光分析を、ＴＡＰタグ化タンパク質の種類に応じて、Ｎｏ．１またはＮｏ．２にしたがって行った。イムノブロット分析を、Ｎｏ．３にしたがって行った。
【０１５７】
３．１．原形質膜およびＥＲ結合タンパク質に関する、固定哺乳動物細胞の間接的免疫蛍光染色のプロトコル
ポリリジンでコーティングした８ウェルチャンバー・スライド上、ＦＣＳ培地中で、細胞を５０％集密まで増殖させた。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（０．１４Ｍホスフェート、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）中で希釈した４％パラホルムアルデヒド中で、細胞の固定を行った。ウェルあたり３００マイクロリットル中、室温で３０分間、細胞をインキュベーションした。ＰＢＳ中の０．１Ｍグリシン中で、室温で２ｘ２０分間、反応停止を行った。０．３％サポニン＋ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温で少なくとも１時間、ブロッキングを行った。ブロッキング溶液中、＋４℃で１晩、一次抗体のインキュベーションを行った。ケースバイケースで、抗体の適切な希釈を決定した。０．３％サポニンを含有するＰＢＳ中、室温で２ｘ２０分間、細胞を洗浄した。ブロッキング溶液中で、二次抗体のインキュベーションを行う。Ａｌｅｘａ５９４にカップリングしたヤギ抗ウサギを１：１０００に希釈した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。Ａｌｅｘａ４８８にカップリングしたヤギ抗マウスを１：１０００に希釈した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを標識した。Ｆ−アクチンを標識するのにファロイジンを用いた場合、該薬剤を１：５００に希釈し、そして二次抗体とインキュベーションした。次いで、細胞を再び、ＰＢＳ中、室温で２ｘ２０分間洗浄した。過剰な緩衝液を取り除き、そしてアンチ・ブリーチング剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する培地中で細胞をマウントした。
【０１５８】
３．２．非原形質膜結合タンパク質に関する、固定哺乳動物細胞の間接的免疫蛍光染色のためのプロトコル：
ポリリジンでコーティングした８ウェルチャンバー・スライド上、ＦＣＳ培地中で、細胞を５０％集密まで増殖させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（０．１４Ｍホスフェート、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）中で希釈した４％パラホルムアルデヒド中、室温（ＲＴ）で３０分間、ウェルあたり３００マイクロリットルで、細胞の固定を行った。ＰＢＳ中の０．１Ｍグリシン中で、室温で２ｘ２０分間、反応停止を行った。ＰＢＳ中、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で、室温で１０分間、細胞の透過化を行った。次いで、０．３％サポニン＋ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、ＲＴで少なくとも１時間、ブロッキングを行った（ブロッキング溶液）。ブロッキング溶液中、＋４℃で１晩、一次抗体のインキュベーションを行った。ケースバイケースで、抗体の適切な希釈を決定しなければならない。０．３％サポニンを含有するＰＢＳ中、ＲＴで２ｘ２０分間、細胞を洗浄した。ブロッキング溶液中で、二次抗体のインキュベーションを行った。Ａｌｅｘａ５９４にカップリングしたヤギ抗ウサギを１：１０００に希釈し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ａｌｅｘａ４８８にカップリングしたヤギ抗マウスを１：１０００に希釈した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを標識した。Ｆ−アクチンを標識するのにファロイジンを用いた場合、該薬剤を１：５００に希釈し、そして二次抗体とインキュベーションした。細胞を、ＰＢＳ中、ＲＴで２ｘ２０分間洗浄した。過剰な緩衝液を取り除き、そしてアンチ・ブリーチング剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する培地中で細胞をマウントした。
【０１５９】
３．３．イムノブロット分析
ＴＡＰタグ化タンパク質の発現レベルを分析するため、細胞ペレット（６ウェルディッシュ由来）を６０μｌのＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（５％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．８％ ＮＰ−４０（ＩＧＥＰＡＬ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中、氷上で１５分間溶解した。各試料を２つのアリコットにスプリットした。最初の半分を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清中にＮＰ−４０抽出可能物質を得た；次の半分（全物質）を注意深くすりつぶした（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）。各５０μｇのＮＰ−４０抽出可能物質および全物質を、ＤＴＴ含有試料緩衝液と、シェーカー上、５０℃で３０分間混合し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、プレキャスト４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。次いで、不連続緩衝剤系で、半乾法を用いて、タンパク質をニトロセルロースにトランスファーした。簡潔には、ゲルおよびニトロセルロース膜を、陽極緩衝液（３層の緩衝液Ａ１（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）および３層の緩衝液Ａ２（０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ））または陰極緩衝液（３層の０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．４、０．１％ ＳＤＳ、４０ｍＭ □−アミノカプロン酸）のいずれかに浸したろ紙の間に積んだ。６００ｍＡで２５分間、同時に２つのゲルのエレクトロトランスファーを行った。トランスファー効率の対照とするため、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ溶液で、トランスファーしたタンパク質を１分間視覚化して、そして次いで、水中で脱染色した。ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ）中の５％脱脂粉乳で、室温で３０分間、膜をブロッキングした。
【０１６０】
続いて、ＨＲＰカップリングＰＡＰ抗体（５％ミルク／ＴＢＳＴ中、１：５０００に希釈）と室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳＴ中、１０分間、３回洗浄した。ブロット膜を最後に、化学発光基質（ＥＣＬ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に２分間浸し、そしてＸ線フィルムに曝露するか、またはイメージング・ステーション上で分析した。
【０１６１】
パート４ 精製またはタンパク質複合体
タンパク質複合体精製を、ＴＡＰタグ化タンパク質の細胞内局在に適応させ、そして以下に記載するように行った。
【０１６２】
４．１．細胞質タンパク質の溶解物調製
約１ｘ１０９の接着細胞（平均）を細胞スクレーパーで採取し、そして氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄した（３分間、５５０ｇ）。収集した細胞を液体窒素中で凍結するか、または直ちにさらにプロセシングした。細胞溶解のため、細胞ペレットを１０ｍｌのＣＺ溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；５％グリセロール；０．２％ ＩＧＥＰＡＬ；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；１００ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ；緩衝液２５ｍｌあたり１タブレットのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する）に再懸濁し、そして加圧型細胞破砕装置中、きつくはまったペッスルを１０回ストロークすることによって、ホモジナイズした。氷上で３０分間、溶解物をインキュベーションし、そして２０，０００ｇで１０分間回転させた。上清を、１００，０００ｇで１時間のさらなる超遠心工程に供した。上清を回収し、そして液体窒素中で迅速に凍結させるか、または直ちにさらにプロセシングした。
【０１６３】
４．２．膜タンパク質のための溶解物調製
約１ｘ１０９の接着細胞（平均）を細胞スクレーパーで採取し、そして氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄した（３分間、５５０ｇ）。収集した細胞を液体窒素中で凍結するか、または直ちにさらにプロセシングした。細胞溶解のため、細胞ペレットを１０ｍｌの膜溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；７．５％グリセロール；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ；緩衝液２５ｍｌあたり１タブレットのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する）に再懸濁し、そして加圧型細胞破砕装置中、きつくはまったペッスルを１０回ストロークすることによって、ホモジナイズした。溶解物を７５０ｇで１０分間回転させ、上清を回収し、そして１００，０００ｇで１時間の超遠心工程に供した。０．８％のｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含有する７．５ｍｌの膜溶解緩衝液に膜ペレットを再懸濁し、そして休まず攪拌しながら、４℃で１時間インキュベーションした。１００，０００ｇで１時間の別の超遠心工程に試料を供し、そして可溶化された物質を液体窒素中で迅速に凍結させるか、または直ちにさらにプロセシングした。
【０１６４】
４．３．核タンパク質のための溶解物調製
約１ｘ１０９の接着細胞（平均）を細胞スクレーパーで採取し、そして氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄した（３分間、５５０ｇ）。収集した細胞を液体窒素中で凍結するか、または直ちにさらにプロセシングした。細胞溶解のため、細胞ペレットを１０ｍｌの低張溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＫＣｌ；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ；緩衝液２５ｍｌあたり１タブレットのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する）に再懸濁し、そして加圧型細胞破砕装置中、きつくはまったペッスルを１０回ストロークすることによって、ホモジナイズした。溶解物を２，０００ｇで１０分間回転させ、そして生じた上清（Ｓ１）を氷上で保存した。核ペレット（Ｐ１）を５ｍｌの核溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；２０％グリセロール；４２０ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ；緩衝液２５ｍｌあたり１タブレットのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する）に再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベーションした。試料をＳ１と合わせ、７ｍｌの希釈緩衝液（１１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；０．７％ ＮＰ４０；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ）でさらに希釈し、氷上で１０分間インキュベーションし、そして１００，０００ｇで１時間遠心分離した。最終上清（Ｓ２）を液体窒素中で迅速に凍結させた。
【０１６５】
４．４．タンデムアフィニティー精製
凍結した溶解物を３７℃の水槽で迅速に融解し、そして１００，０００ｇで２０分間回転させた。上清を回収し、そして０．２ｍｌの定着した（ｓｅｔｔｌｅｄ）ウサギＩｇＧ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と、休みなく攪拌しながら４℃で２時間インキュベーションした。固定タンパク質複合体を１０ｍｌのＣＺ溶解緩衝液（５０ｍｌの緩衝液あたり１タブレットのＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）を含有する）で洗浄し、そしてさらに５ｍｌのＴＥＶ切断緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ ＩＧＥＰＡＬ；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。１５０μｌのＴＥＶ切断緩衝液中、５μｌのＴＥＶプロテアーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１０１２７−０１７）と、１６℃で１時間インキュベーションすることによって、タンパク質複合体を溶出させた。溶出液を回収し、そして０．２ｍｌ ＣＢＰ結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ ＩＧＥＰＡＬ；２ｍＭ ＭｇＡｃ；２ｍＭイミダゾール；１ｍＭ ＤＴＴ；４ｍＭ ＣａＣｌ２）中、０．２ｍｌの定着したカルモジュリン親和性ビーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と合わせ、その後、休みなく攪拌しながら４℃で１時間インキュベーションした。１０ｍｌのＣＢＰ洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ ＩＧＥＰＡＬ；１ｍＭ ＭｇＡｃ；１ｍＭイミダゾール；１ｍＭ ＤＴＴ；２ｍＭ ＣａＣｌ２）で固定タンパク質複合体を洗浄し、そして６００μｌ ＣＢＰ溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；５ｍＭ ＥＧＴＡ）の添加によって、３７℃で５分間溶出した。溶出物を、シリコン処理試験管に回収し、そして凍結乾燥した。残ったカルモジュリン樹脂を５０μｌ ４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で５分間煮沸した。試料緩衝液を単離し、凍結乾燥分画と合わせ、そしてＮｕＰＡＧＥ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４〜１２％、１．５ｍｍ、１０ウェル）上に装填した。
【０１６６】
パート５ 質量分析によるタンパク質同定
５．１．質量分析前のタンパク質消化
本質的に、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら， １９９６， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６８：８５０−８５８に記載される方法にしたがって、ゲル中で、ゲル分離したタンパク質を還元し、アルキル化し、そして消化した。簡潔には、ゲル分離したタンパク質を、清潔なメスを用いて、ゲルから切り出し、１０ｍＭ ＤＴＴ（５ｍＭ重炭酸アンモニウム中、５４℃、４５分間）を用いて還元し、そして続いて、５５ｍＭヨードアセトアミド（５ｍＭ重炭酸アンモニウム中）で、暗所中、室温でアルキル化した（３０分間）。還元し、そしてアルキル化したタンパク質を、５ｍＭ重炭酸アンモニウム中、１２．５ｎｇ／μｌのプロテアーゼ濃度のブタ・トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ゲル中で消化した。消化を３７℃で４時間進行させ、そして続いて、５μｌの５％ギ酸を用いて、反応を停止した。
【０１６７】
５．２．質量分析による分析前の試料調製
２０μｌの１％ ＴＦＡを用いて、ゲル・プラグを２回抽出し、そして酸性化した消化上清とともにプールした。真空遠心分離機中で試料を乾燥させ、そして１３μｌの１％ ＴＦＡ中に再懸濁した。
【０１６８】
５．３．質量分析データ収集
四極子ＴＯＦ（ＱＴＯＦ２、ＱＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ、ＱＴＯＦ Ｍｉｃｒｏ、ＭｉｃｒｏｍａｓｓまたはＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ、Ｓｃｉｅｘ）またはイオントラップ（ＬＣＱ Ｄｅｃａ ＸＰ）質量分析計いずれかに直接カップリングしたナノＬＣ系（ＣａｐＬＣ、ＷａｔｅｒｓまたはＵｌｔｉｍａｔｅ、Ｄｉｏｎｅｘ）に、ペプチド試料を注入した。水性溶媒および有機溶媒の勾配を用いて、ＬＣ系上でペプチドを分離した（以下を参照されたい）。溶媒Ａは０．５％ギ酸中の５％アセトニトリルであり、そして溶媒Ｂは、０．５％ギ酸中の７０％アセトニトリルであった。
【０１６９】
表１：ＬＣ系から溶出したペプチドを、質量分析計内で、部分的に配列決定した。
【０１７０】
【表１】
【０１７１】
５．４．タンパク質同定
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で得たペプチド質量および断片化データを用いて、ＮＣＢＩ（ＮＣＢＩｎｒ、ｄｂＥＳＴ、並びにヒトおよびマウスゲノムに関して）および欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエおよび線虫プロテオーム・データベースに関して）で、維持され、そして定期的に更新される、ｆａｓｔａ形式のタンパク質およびヌクレオチド配列データベースにクエリーを行った。測定したペプチド質量および断片化データを、ソフトウェア・ツール、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｐｅｒｋｉｎｓら， １９９９， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０：３５５１−３５６７）を用いてデータベース中のエントリーから計算した同じデータと相関させることによって、タンパク質を同定した。検索規準は、分析にどの質量分析計を用いたかに応じて、多様であった。
【０１７２】
（実施例２）
ｓｉＲＮＡが仲介するＡＴＰ７Ａのノックダウン
ＡＰＰプロセシングの既知のエフェクターであるＢＡＣＥ１およびニカストリンに対して向けられるｓｉＲＮＡ同様、ＡＴＰ７ＡをターゲットとするｓｉＲＮＡは、Ａβ１−４２分泌の有意な減弱を引き起こし、一方、Ｌｕｃ３ ｓｉＲＮＡは影響しないことが見出され（図１Ａ）、ＡＴＰ７Ａが、ＡＰＰのプロセシング／分泌を制御する際に機能的な役割を果たすことが立証された。
【０１７３】
さらに、ＡＴＰ７Ａ−ｓｉＲＮＡが、実際に、ＡＴＰ７Ａの発現に干渉することが確認された（図１Ｂ）。
２．１． ｓｉＲＮＡノックダウンおよび細胞性Ａβ１−４２アッセイ
ＡＰＰプロセシングのエフェクターとしてのＡＴＰ７Ａの機能的検証のため、ＲＮＡｉ遺伝子発現摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）戦略を使用した：ＡＴＰ７Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡ ＡおよびＢ、あるいはＡＰＰプロセシングの既知のエフェクターであるＢＡＣＥ１またはニカストリンに対して向けられるｓｉＲＮＡ、あるいは関連しないＬｕｃ３に対して向けられるｓｉＲＮＡを、ヒトＡＰＰ６９５を発現するＳＫ−Ｎ−ＢＥ２神経芽細胞にトランスフェクションした。ヒトＡＴＰ７Ａに対するｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって合成された。
【０１７４】
ＡＴＰ７Ａに対して用いるｓｉＲＮＡの配列は：ＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＧＧＧ（Ａ）およびＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴ（Ｂ）である。
製造者の指示にしたがって、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２細胞のトランスフェクションを行った。簡潔には、９６ウェルあたり最終体積８５μｌ中、１．０ｘ１０４細胞の密度で、トランスフェクション１２〜１６時間前に、細胞を植え付けた。２５ｎＭのｓｉＲＮＡを８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）および６０ｎｇのキャリアーＤＮＡと混合し、そして混合物を細胞に添加する前に、室温で２０分間インキュベーションした。トランスフェクション１６〜４８時間後、培地を、それぞれ血清を含むまたは含まない、１００μｌまたは２００μｌの増殖培地と交換した。トランスフェクション７２時間後、Ａβ１−４２ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）のため、１００μｌの上清を採取した。製造者の指示にしたがって、アッセイを行った。
【０１７５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、選択したｓｉＲＮＡのノックダウン効率を評価した。簡潔には、６ウェルあたり、５ｘ１０５ ＳＫＮＢＥ２細胞を蒔き、そして翌日、２５ｎＭ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション３６時間後、細胞を採取し、そして標準法を用いて、総ＲＮＡを調製し、そして逆転写した。製造者の指示にしたがって、ＡＴＰ７Ａの相対発現レベルを決定するため、等量のｃＤＮＡおよびＡＴＰ７Ａ特異的プライマーを利用した。すべての値を、ヒト参照ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対して標準化した。
【０１７６】
（実施例３）
ＡＴＰ７Ａ活性の決定
３．１ 酵母における機能的補完アッセイ
Ｃｃｃ２ｐの機能が損なわれたサッカロミセス・セレビシエ株では、フェロキシダーゼＦｅｔ３ｐが機能不全であり、鉄欠乏表現型を生じる。ＡＴＰ７Ｂ（Ｈｉｓら、２００４）またはＡＴＰ７Ａなどのヒト銅輸送ＡＴＰアーゼを発現させると、この表現型が補完される。その結果、鉄欠乏表現型の機能的補完の度合いを測定することによって、すなわち鉄制限培地中で酵母細胞が増殖する能力を定量化することによって、ＡＴＰ７Ａの活性を定量化することも可能である。
【０１７７】
したがって、前記の機能的補完と反対に作用する能力によって、すなわち鉄制限培地における増殖を停止させる能力によって、ＡＴＰ７Ａの阻害剤を同定することも可能である。
【０１７８】
３．２ ＡＴＰ７Ａを発現するｃｃｃ２ｐ欠損酵母における、フェロキシダーゼ活性の測定
上に概略する表現型アプローチに加えて、ＡＴＰ７Ａ活性を定量化するための銅輸送機能のより高感度の指標（Ｈｓｉら、２００４）として、ｃｃｐ２ｐ欠損酵母株において、フェロキシダーゼ活性を測定することもまた、可能である。
【０１７９】
３．３ ＡＴＰアーゼ活性の測定
いくつかのアッセイの多くは、公知のものとして当業者に周知である。例えば、ピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ共役アッセイによって、あるいは固定した時間間隔で、ホスフェート放出を測定する、比色アッセイによって、ＡＴＰ７Ａ（例えばＴＡＰ−ＡＴＰ７Ａの精製によって得られるようなもの）の金属イオン依存性ＡＴＰアーゼ活性を、３７℃でアッセイする（Ｈｏｕら、２００１および該文献の参考文献）。
【０１８０】
３．４ 銅に誘導される毒性に対する感受性の測定
細胞の銅の流出を測定することによって、または他の金属に対してではなく銅に対する細胞の感受性を定量化することによってもまた、ＡＴＰ７Ａの活性を測定することも可能である（Ｈｏｕら、２００１）。
【０１８１】
したがって、ＡＴＰ７Ａの阻害剤は、細胞の銅流出を減弱させ、他の金属に対してではなく銅に対する細胞の感受性を変化させる剤として、同定される（Ｈｏｕら、２００１）。
【０１８２】
３．５ ６４Ｃｕ集積の安定状態測定
細胞内銅（好ましくは６４Ｃｕ）集積を測定することによってもまた、ＡＴＰ７Ａの活性を測定することも可能である（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍら、２００４）。
【０１８３】
ＡＴＰ７Ａの阻害剤を、細胞内銅（好ましくは６４Ｃｕ）集積を引き起こす剤として、同定することも可能である（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍら、２００４）。
（実施例４）
ＡＴＰ７Ａ調節剤による、Ａβ１−４２生成／分泌の調節
ヒトＡＰＰ６９５を安定に過剰発現するＳＫＮＢＥ２細胞（ＳＫＮＢＥ２／ＡＰＰ６９５）（または別の適切な細胞株）またはベータ−／ガンマ−セクレターゼ切断反応速度が増進した適切な突然変異体を増殖培地中で蒔き、そして翌朝、４時間、血清枯渇させた。次いで、血清不含培地中で希釈した、ＡＴＰ７Ａ調節剤、好ましくは阻害剤を添加し、そして適切な期間、インキュベーションした。細胞上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡ（ＩＮＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ Ｎ．Ｖ．、Ｂｅｌｇｉｕｍ ＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓのＩｎｎｏｔｅｓｔ β−アミロイド（１−４２））によって、Ａβ１−４２のレベルを決定した。
【０１８４】
本発明は図面に、より詳細に記載される。
参考文献
【０１８５】
【表２】
【０１８６】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１：ＳｉＲＮＡが仲介するＡＴＰ７Ａ発現のノックダウンは、Ａβ１−４２の分泌を減弱する。 図１Ａ：ＢＡＣＥ１、ニカストリン、ＡＴＰ７Ａ（ｓｉＲＮＡ ＡまたはｓｉＲＮＡ Ｂ）またはＬｕｃ３に対して向けられるＳｉＲＮＡを、ＡＰＰ６９５を過剰発現するＳＫ−Ｎ−ＢＥ２神経芽腫細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、増殖培地を取り除き、そして細胞を血清不含培地中で１晩インキュベーションした。上清を収集し、そしてＡβ１−４２レベルをＥＬＩＳＡ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）によって決定した。少なくとも３回の独立実験を２つ組で行った。代表的な例を示す。
【０１８８】
図１Ｂ：ＡＴＰ７Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＡおよびｓｉＲＮＡ Ｂ）は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析で評価した際、ＡＴＰ７Ａ ｍＲＮＡを特異的に減少させたが、関連しないＬｕｃ３に対して向けられるｓｉＲＮＡは、該ｍＲＮＡを減少させなかった。各ｓｉＲＮＡを示す２つのバーは、２つの独立実験に相当する。
【図２】図２：１文字コードで示す、ヒトＡＴＰ７Ａ（銅輸送ＡＴＰアーゼ１）のアミノ酸配列。
【図３】図３：ヒトＡＴＰ７ＡおよびＡＴＰ７Ｂの複数配列並列。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ７Ａタンパク質を含む、ＡＰＰプロセシング経路のタンパク質複合体に関し、それとともに神経生成（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患の治療における、これらの複合体の阻害剤、並びにＡＴＰ７Ａの阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、世界中で何百万という個体に影響を及ぼす慢性状態である。
アルツハイマー病患者の脳は、顕著な神経病理学的損傷の特徴的な病変、例えば初期の細胞内の神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）（ＮＦＴ）、および細胞外のアミロイド・リッチ老人斑を示す。これらの損傷は、ＣＮＳニューロン集団の大量の損失と関連し、そしてその進行には、ＡＤと関連する臨床的認知症が伴う。アミロイド斑の主な構成要素は、多様な長さのアミロイド・ベータ（Ａ−ベータ、ＡベータまたはＡβ）ペプチドである。その変異体であるＡβ１−４２ペプチド（Ａベータ−４２）は、アミロイド形成の主な原因物質である。別の変異体はＡβ１−４０ペプチド（Ａベータ−４０）である。アミロイド・ベータは、前駆タンパク質、ベータ・アミロイド前駆タンパク質（ベータ−ＡＰＰまたはＡＰＰ）のタンパク質分解産物である。ＡＰＰは、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、該タンパク質は、いくつかの異なる膜会合プロテアーゼによって、順次、切断される。ＡＰＰの最初の切断は、２つのプロテアーゼ、アルファ−セクレターゼまたはベータ−セクレターゼの１つによって起こる。アルファ−セクレターゼは、メタロプロテアーゼであり、その活性は、タンパク質ＡＤＡＭ−１０およびＡＤＡＭ−１７の１つまたは組み合わせによって提供される可能性が最も高い。アルファ−セクレターゼによる切断は、アミロイド・ペプチド形成を妨げ、そしてしたがって、アミロイド非生成性と称される。対照的に、ベータ−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、アミロイド・ペプチド形成が続くための必要条件である。このセクレターゼは、ＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ切断酵素）とも称され、アスパルチル・プロテアーゼ活性を含有するＩ型膜貫通タンパク質である（以下に詳細に記載される）。
【０００３】
ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）活性は、細胞外ドメインでＡＰＰを切断し、分泌可溶性ＡＰＰｂの分断（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を生じ、そして９９残基のＣ末端膜貫通断片（ＡＰＰ−Ｃ９９）を生じる。Ｖａｓｓａｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ７３５−７４１）は、ＡＰＰのベータ−セクレターゼと推測される特性を有する膜貫通アスパラギン酸プロテアーゼをクローニングし、該プロテアーゼをＢＡＣＥ１と名づけた。ＢＡＣＥ１ノックアウトマウス由来の脳および初代皮質培養物は、検出可能なベータ−セクレターゼ活性を示さず、そしてＢＡＣＥノックアウトマウス由来の初代皮質培養物は、ＡＰＰからはるかに少ないアミロイド−ベータしか産生しなかった。これによって、ＢＡＣＥ１のパラログであるＢＡＣＥ２ではなく、ＢＡＣＥ１がＡＰＰの主なベータ−セクレターゼであることが示唆される。ＢＡＣＥ１は、５０１アミノ酸（ａａ）のタンパク質であり、２１ａａのシグナルペプチドに続いて、ａａ２２〜４５に渡る、プロ配列ドメインを含有する。選択的スプライシング型、ＢＡＣＥ−Ｉ−４５７およびＢＡＣＥ−Ｉ−４７６がある。成熟タンパク質の細胞外ドメインに続いて、予測される１つの膜貫通ドメインおよび２４ａａの短い細胞質ゾルＣ末端テールがある。ＢＡＣＥ１は、１型膜貫通タンパク質であり、活性部位が膜の細胞外側にあると予測され、ここでベータ−セクレターゼがＡＰＰ、およびありうる他の未同定の基質を切断する。ＢＡＣＥ１は、明らかに、ＡＰＰをＡ−ベータにプロセシングするのに必要とされる重要な酵素であるが、最近の証拠によって、ＢＡＣＥ１のさらなる潜在的基質および機能が示唆されている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９， １０５４２−１０５５０）。現在まで、制御機能または調節機能を持つＢＡＣＥ１相互作用タンパク質は、まったく記載されてきていない。
【０００４】
ＢＡＣＥ１切断によって生じるＡＰＰ断片であるＡＰＰ−Ｃ９９は、ガンマ−セクレターゼ活性の基質であり、該活性は、膜平面内でＡＰＰ−Ｃ９９を切断してＡ−ベータ・ペプチド（アミロイド生成性Ａβ１−４２ペプチドなど）、およびＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）と称されるＣ末端断片にする（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９， ２５−５１）。ガンマ−セクレターゼ活性は、少なくとも４つの別個のサブユニットを持つ多タンパク質複合体内にある。発見された第一のサブユニットは、プレセニリンであった（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４， ８２０８−１３）。ガンマ−セクレターゼ複合体の他の既知のタンパク質構成要素は、Ｐｅｎ−２、ニカストリンおよびＡｐｈ−１ａである。
【０００５】
アルツハイマー病の病因の根底にある分子事象の描写が近年、進歩しているにもかかわらず、これまでに疾患を緩和する療法は開発されてきていない。この目的に向け、業界は、ＢＡＣＥ１を阻害するための適切なリード化合物を同定しようと苦闘している。さらに、ガンマ−セクレターゼのより多くの別の基質、最も著名には、Ｎｏｔｃｈタンパク質が存在することが認められてきている。その結果、ガンマ−セクレターゼの阻害は、機構に基づく副作用を引き起こす可能性がある。現在、最も優れた薬剤（例えばアリセプト（登録商標）／ドネペジル）は、アセチルコリン・エステラーゼを阻害して、脳において、神経伝達物質アセチルコリンのレベル増加を生じることによって、認知機能の一時的な改善を達成することを試みる。これらの療法は、疾患のより後期の病期には適しておらず、根底にある疾患病変は治療せず、そして疾患進行を停止させることはない。
【０００６】
したがって、アルツハイマー病の治療のための新規分子戦略を可能にする、新規ターゲットの同定に関して、満たされていない必要性がある。さらに、前記新規ターゲットをターゲティングすることによって、前述の分子プロセスを修飾する新規療法化合物に関する、強い必要性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の側面において、本発明は、神経生成疾患治療用の薬剤組成物を調製するための、「ＡＴＰ７Ａ相互作用分子」の使用を提供する。
本発明の関連において、驚くべきことに、銅輸送ＡＴＰアーゼ（以下、ＡＴＰ７Ａと称する）が、アルツハイマー病において、ガンマ−セクレターゼによるＡＰＰの異常なプロセシングに関与する、異なる細胞内タンパク質複合体の一部を形成することが発見されている。特に、ＡＴＰ７ＡがＰｓｅｎ２複合体およびＢＡＣＥ１複合体の一部であることが発見されており、これらの複合体は、直接または間接的に、ガンマ−セクレターゼの活性を制御することが知られる。これらの複合体は、それぞれの重要なタンパク質化合物にちなんで命名されている。
【０００８】
ＡＴＰ７Ａがこれらの複合体において重要な分子と同定されたことによって、神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患の治療のため、ＡＴＰ７Ａと相互作用する分子の使用が可能になる。これは特に、ＡＴＰ７Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡが、Ａベータ−４２の生成および／または分泌の減弱を生じることを立証する実施例において示される。
【０００９】
本発明の関連において、「ＡＴＰ７Ａ相互作用分子」は、少なくとも一時的にＡＴＰ７Ａに結合し、そして好ましくは、ＡＴＰ７Ａ活性を調節し、そして特に阻害する、分子である。
【００１０】
ＡＴＰ７Ａは、肝臓を除いて、偏在性に発現されるＰ型銅輸送ＡＴＰアーゼであり、８つの膜貫通セグメントおよび６つのＮ末端金属結合性ドメインを含有する（Ｃｈｅｌｌｙら、１９９３；Ｍｅｒｃｅｒら、１９９３；Ｖｕｌｐｅら、１９９３）。銅ポンプは、細胞内小胞区画への銅の取り込みを仲介し、そして原形質膜では、細胞の銅の流出を仲介する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＡＴＰ７Ａは遠位ゴルジ装置に局在し、そして外因性銅イオンに反応して、原形質膜およびＲａｂ７陽性エンドソームに転位置する。この輸送事象は、クラスリンおよびカベオリン独立性であるが、Ｒａｃファミリー低分子量ＧＴＰアーゼによって制御される（Ｃｏｂｂｏｌｄら、２００２、２００３；Ｐａｓｃａｌｅら、２００３）。最近、コレステロール選別に関連付けられるＲａｂ７陽性小胞小器官が、ガンマ−セクレターゼ活性の重要な部位に相当しうることが示唆されてきている（Ｒｕｎｚら、２００２）。
【００１１】
銅輸送体は、リシル・オキシダーゼ、チロシナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼおよびＣｕ／Ｚｎスーパーオキシド・ジスムターゼなどの銅含有酵素の活性化に必要である（Ｐｅｔｒｉｓら、２０００）。ＡＴＰ７Ａにおける欠陥は、ヒトにおいて、メンケス病（ＭＤ）および後角症候群（ＯＨＳ）に関連し、そしてヒトＭＤのモデルである「ぶち（ｍｏｔｔｌｅｄ）」マウスで見出されている。メンケス病は、進行性の神経変性および結合組織障害：限局性大脳および小脳変性、成長の早期遅延、特異な毛髪、色素沈着減少、皮膚弛緩症、血管合併症および小児期初期の死亡によって特徴付けられるＸ連鎖劣性遺伝障害である。これは、銅の吸収および輸送に欠陥があるためである（Ｖｏｓｋｏｂｏｉｎｉｋら、２００３）。さらに、銅流出輸送体ＡＴＰ７Ａの発現増加は、卵巣癌細胞におけるシスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンに対する耐性を仲介し（Ｓａｍｉｍｉら、２００４）、そして卵巣癌患者の劣った生存と関連する（Ｓａｍｉｍｉら、２００３）。
【００１２】
ＡＰＰは、銅結合性タンパク質であり、銅恒常性の調節に機能しうる（Ｍｕｌｔｈａｕｐら、１９９６）。言い換えると、ＡＰＰ発現は、それ自体、細胞の銅に制御され：（ＡＴＰ７Ａの過剰発現によって）この金属が線維芽細胞で枯渇すると、ＡＰＰタンパク質レベルが有意に減少し、そしてＡＰＰ遺伝子発現が下方制御されることから、ＡＰＰ発現調節においてＡＴＰ７Ａが役割を果たしていることが示唆される（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍら、２００４）。しかし、ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングに対するＡＴＰ７Ａの効果は、いまだに立証されていない。
【００１３】
ＺｎおよびＣｕのキレート剤であるクリオキノールは、アルツハイマー病のパイロット第２相臨床試験において、有望な結果を示している（Ｒｉｔｓｃｈｉｅら、２００３）。クリオキノールは、ＺｎおよびＣｕがＡＰＰに結合するのを妨げ、そしてそれによってＡβ重合を妨げ、そしてまた、アミロイド斑をばらばらにすると仮定されている。しかし、最近の研究によって、クリオキノールは、銅取り込みを仲介し、そしてＡＰＰのＣｕ流出活性を相殺することが示唆される（Ｔｒｅｉｂｅｒら、２００４）。しかし、ＡＰＰプロセシングに対する銅キレート剤の直接効果は、現在まで、立証されてきていない。
【００１４】
本発明にしたがって、表現「ＡＴＰ７Ａ」は、図２に示すようなタンパク質だけでなく、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なその断片、またはその相同体、または低ストリンジェンシー条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味する。好ましくは、これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１〜５時間洗浄し、そして２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間洗浄することを含む。
【００１５】
本発明で挙げる他のタンパク質すべてにも同じことがあてはまる。したがって、既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なその断片、またはその相同体、または低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。
【００１６】
細胞または生物におけるＡＴＰ７Ａ活性を定量的に決定するため、多様な方法が利用可能である。
ａ）酵母における機能的補完アッセイによる：
Ｃｃｃ２ｐの機能が損なわれたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株では、フェロキシダーゼＦｅｔ３ｐが機能不全であり、鉄欠乏表現型を生じる。ＡＴＰ７Ｂ（Ｈｉｓら、２００４）またはＡＴＰ７Ａなどのヒト銅輸送ＡＴＰアーゼを発現させると、この表現型が補完される。その結果、鉄欠乏表現型の機能的補完の度合いを測定することによって、すなわち鉄制限培地中で酵母細胞が増殖する能力を定量化することによって、ＡＴＰ７Ａの活性を定量化することも可能である。
【００１７】
ｂ）ヒトＡＴＰ７Ａを発現するｃｃｃ２ｐ欠損酵母における、フェロキシダーゼ活性の測定による：
上に概略する表現型アプローチに加えて、ＡＴＰ７Ａ活性を定量化するための銅輸送機能のより高感度の指標として、ｃｃｐ２ｐ欠損酵母株において、フェロキシダーゼ活性を測定すること（Ｈｓｉら、２００４）もまた、可能である。
【００１８】
ｃ）ＡＴＰ７ＡのＡＴＰアーゼ活性の測定による：
ピルビン酸キナーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼとしてのＡＴＰ依存性酵素の反応効率を測定するアッセイによって、あるいは固定した時間間隔で、ホスフェート放出を測定する、比色アッセイによって、ＡＴＰ７Ａ（例えばＴＡＰ−ＡＴＰ７Ａの精製によって得られるようなもの）の金属イオン依存性ＡＴＰアーゼ活性を、３７℃で決定することも可能である（本明細書に援用される、Ｈｏｕら、２００１）。これらのアッセイの多くは、公知のものとして詳細に開示されており、そしてしたがって当業者に周知である。
【００１９】
ｄ）銅に誘導される毒性に対する感受性の測定：
細胞の銅の流出を測定することによって、または他の金属に対してではなく銅に対する細胞の感受性を定量化することによってもまた、ＡＴＰ７Ａの活性を測定することも可能である（Ｈｏｕら、２００１）。
【００２０】
ｅ）６４Ｃｕ集積の定常状態測定
細胞内銅（好ましくは６４Ｃｕ）集積を測定することによってもまた、ＡＴＰ７Ａの活性を測定することも可能である（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍら、２００４）。
【００２１】
ＡＴＰ７Ａ活性を測定するための上述の機能アッセイを、実施例３に、より詳細に論じる。
他のタンパク質の場合、用語「機能的に活性な」は、本明細書において、このポリペプチド、すなわち断片または誘導体が関連する態様にしたがって、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわち断片または誘導体を指す。
【００２２】
本発明にしたがって、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、一般的に、限定されるわけではないが、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、前記用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
【００２３】
本発明にしたがって、用語「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、本明細書において、好ましくは、限定されるわけではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、こうした分子は、多様な態様において、同一サイズのアミノ酸配列に渡って、または当該技術分野に知られるコンピュータ相同性プログラムによって並列を行って並列される配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこうした分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示す、タンパク質を意味する。例えば、本発明で提供するような、適切で利用可能なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、こうしたタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。
【００２４】
用語「断片」は、本明細書において、態様にしたがって、構成要素タンパク質の少なくとも１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸のポリペプチドを指す。特定の態様において、こうした断片は、３５、１００または２００アミノ酸より長くはない。
【００２５】
用語「遺伝子」は、本明細書において、別に言及しない限り、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指し、エクソンおよび場合によるイントロン配列両方を含む。
【００２６】
用語「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書において、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を実行する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうした相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称される。ヒトおよび哺乳動物または他の種からオルソログ遺伝子対を検出するためのアルゴリズムは、これらの生物の全ゲノムを用いる。まず、予測されるタンパク質の完全Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ並列を用いて、対合ベストヒットを回収する。信頼性をさらに改善するため、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質を含む対合ベストヒットを用いて、これらの対のクラスターを形成する。こうした分析は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ， ２００１， ４０９：８６０−９２１に提供される。他の種の遺伝子に対する、本明細書に提供するタンパク質をコードする遺伝子の配列相同性に基づいて、慣用的技術を適用してそれぞれの遺伝子をクローニングし、そしてこうした遺伝子からタンパク質を発現させることによって、あるいは本明細書に提供する方法にしたがって、または当該技術分野に一般的に知られる他の適切な方法にしたがって、類似の複合体を単離することにより、他の種のタンパク質を単離することによって、本発明記載のタンパク質の相同体を単離することも可能である。
【００２７】
本発明の好ましい態様において、「ＡＴＰ７Ａ相互作用分子」はＡＴＰ７Ａ阻害剤である。
本発明にしたがって、用語「阻害剤」は、ＡＴＰ７Ａの活性を好ましくは阻害するかまたは減少させる、生化学的化合物または化学的化合物を指す。これは、例えば、対応する遺伝子の発現の抑制を介して起こることも可能である。ＲＴ−ＰＣＲまたはウェスタンブロット分析によって、遺伝子の発現を測定することも可能である。さらに、これは、例えばＡＴＰ７Ａへの結合による、活性の阻害を介して起こることも可能である。
【００２８】
こうしたＡＴＰ７Ａ阻害剤の例は、ＡＴＰ７Ａに対して向けられる、特にＡＴＰ７Ａの活性部位に対して向けられる、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＡＴＰ７Ａ遺伝子に対して向けられる核酸である。
【００２９】
用語「ＡＴＰ７Ａに対する核酸」は、例えばＡＴＰ７Ａ遺伝子の発現またはＡＴＰ７Ａの活性を阻害する、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そして限定なしに、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）およびリボザイムを含む。
【００３０】
好ましくは、阻害剤は、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）からなる群より選択される。
【００３１】
いわゆる「低分子量分子」（以下、「ＬＭＷ」と称する）は、タンパク質、ペプチド、抗体または核酸ではなく、そして５０００Ｄａ未満、好ましくは２０００Ｄａ未満、より好ましくは１０００Ｄａ未満、最も好ましくは５００Ｄａ未満の分子量を示す、分子である。こうしたＬＭＷは、ライブラリーから出発するハイスループット法において同定可能である。こうした方法は当該技術分野で知られ、そして以下に詳細に論じられる。
【００３２】
これらの核酸を細胞に直接投与することも可能であるし、または外因性の導入された配列を転写させることによって、細胞内で産生することも可能である。
「アンチセンス」核酸は、本明細書において、何らかの配列相補性のため、構成要素タンパク質ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の配列特異的部分にハイブリダイズ可能な核酸を指す。アンチセンス核酸は、構成要素タンパク質ｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域に相補的であることも可能である。複合体形成または活性を阻害する、こうしたアンチセンス核酸は、療法剤として有用性を有し、そして本明細書に記載するような障害の治療または予防に使用可能である。
【００３３】
アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドのものであり、そして好ましくは、６〜約２００ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の側面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオチドである。
【００３４】
核酸、例えばアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを、例えばホスホトリエステル法にしたがって、化学的に合成することも可能である（例えばＵｈｌｍａｎｎ， Ｅ． ＆ Ｐｅｙｍａｎ， Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０， ５４３−５８４を参照されたい）。アプタマーは、ポリペプチド、本明細書ではＡＴＰ７Ａに、高い親和性で結合する核酸である。アプタマーは、異なる一本鎖ＲＮＡ分子の巨大プールから、ＳＥＬＥＸなどの選択法によって単離可能である（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９）Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， ４５， １６２８−５０；ＫｌｕｇおよびＦａｍｕｌｏｋ（１９９４）Ｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ．， ２０， ９７−１０７；ＵＳ ５，５８２，９８１を参照されたい）。アプタマーを、例えばＬ−リボヌクレオシドとして、鏡像型で合成し、そして選択することもまた可能である（Ｎｏｌｔｅら（１９９６）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４， １１１６−９；Ｋｌｕｓｓｍａｎｎら（１９９６）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４， １１１２−５）。この方式で単離された型は、天然存在リボヌクレアーゼによって分解されず、そしてしたがってより高い安定性を所持する利点を享受する。
【００３５】
核酸は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、特に細胞で見出されることも可能なＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅによって分解されうる。したがって、分解に対して安定化させ、それによって長期間に渡って、細胞中で、核酸が高濃度で維持されることを保証するため、核酸を修飾することは好都合である（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３９８９−９４；ＷＯ ９５／１１９１０；ＷＯ ９８／３７２４０；ＷＯ ９７／２９１１６）。典型的には、こうした安定化は、１以上のヌクレオチド間リン基を導入することによって、または１以上の非リン基をヌクレオチド間に導入することによって、得ることも可能である。
【００３６】
適切なヌクレオチド間修飾は、ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０）、上記に集められている（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３９８９−９４；ＷＯ ９５／１１９１０；ＷＯ ９８／３７２４０；ＷＯ ９７／２９１１６もまた参照されたい）。本発明にしたがった使用の１つで使用可能な、核酸における修飾ヌクレオチド間ホスフェート・ラジカルおよび／または非リン架橋は、例えば、メチル・ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエートおよび／またはホスフェート・エステルを含有し、一方、非リン・ヌクレオチド間類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）は、例えばシロキサン架橋、カーボネート架橋、カルボキシメチル・エステル、アセトアミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）架橋および／またはチオエーテル架橋を含有する。この修飾が、本発明記載の使用の１つで使用可能である薬剤組成物の耐久性を改善するはずであることもまた意図される。一般的に、オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、またはホスフェート主鎖で修飾することも可能である。
【００３７】
オリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を渡る輸送を促進する剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：６４８−６５２；国際特許公報第ＷＯ ８８／０９８１０号）または血液−脳関門を渡る輸送を促進する剤（例えば国際特許公報第ＷＯ ８９／１０１３４号）、ハイブリダイゼーションに誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照されたい）、またはインターカレート剤（例えばＺｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９を参照されたい）などの、他の付随する基を含むことも可能である。
【００３８】
詳細には、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、限定されるわけではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、Ｄ−マンノシルケオシン、５Ｎ−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群より選択される、少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことも可能である。
【００３９】
別の態様において、オリゴヌクレオチドは、限定されるわけではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群より選択される、少なくとも１つの修飾糖部分を含む。
【００４０】
適切なアンチセンス核酸の使用が、例えば、ＺｈｅｎｇおよびＫｅｍｅｎｙ（１９９５）Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １００， ３８０−２；ＮｅｌｌｅｎおよびＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， １８， ４１９−２３， Ｓｔｅｉｎ（１９９２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ６， ６９７−７４またはＹａｃｙｓｈｙｎ， Ｂ．Ｒ．ら（１９９８）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １１４， １１４２にさらに記載される。
【００４１】
さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドは、２−ａ−アノマー・オリゴヌクレオチドである。ａ−アノマー・オリゴヌクレオチド（２−ａ−アノマーまたはａ−アノマー）は、通常のβ−ユニットと対照的に、相補ＲＮＡと鎖が互いに平行に走る特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。
【００４２】
オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションが誘発する架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションが誘発する切断剤等にコンジュゲート化することも可能である。
【００４３】
本発明全体で、当該技術分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から商業的に入手可能なものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Ｓｔｅｉｎら（１９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：７４４８−７４５１）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
【００４４】
特定の態様において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、触媒性ＲＮＡまたはリボザイムを含む（例えば、国際特許公報第ＷＯ ９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５を参照されたい）。別の態様において、オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５：３２７−３３０）である。
【００４５】
別の態様において、本発明のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で産生される。例えば、細胞に取り込まれるように、ベクターをｉｎ ｖｉｖｏで導入することも可能であり、その細胞内でベクターまたはその一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が産生される。こうしたベクターは、構成要素タンパク質をコードする配列を含有するであろう。こうしたベクターは、望ましいアンチセンスＲＮＡを産生するように転写されることが可能である限り、エピソームにとどまることも可能であるし、または染色体に組み込まれることも可能である。当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって、こうしたベクターを構築することも可能である。ベクターは、プラスミド・ベクター、ウイルス・ベクター、または哺乳動物細胞における複製および発現が可能であることが当該技術分野に知られる他のものであることも可能である。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において、作用することが当該技術分野に知られるプロモーターいずれによることも可能である。こうしたプロモーターは誘導性または恒常性であることも可能である。こうしたプロモーターには、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペス・チミジンキナーゼ・プロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）等が含まれる。
【００４６】
本発明のアンチセンス核酸は、構成要素タンパク質遺伝子、好ましくはヒト遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対相補性は好ましいが必要ではない。「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列は、本明細書において、ＲＮＡとハイブリダイズ可能であるのに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味し；したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験することも可能であるし、または三重鎖形成をアッセイすることも可能である。ハイブリダイズする能力は、相補性の度合いおよびアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズする核酸がより長ければ、構成要素タンパク質ＲＮＡとの塩基ミスマッチをより多く含有して、そしてなお安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成することが可能になる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準法の使用によって、ミスマッチの容認しうる度合いを確認することも可能である。
【００４７】
遺伝子発現、本明細書ではＡＴＰ７Ａ遺伝子発現を下方制御するかまたはスイッチオフするプロセスにおける、ＲＮＡ干渉のためのツールとしてのｓｉＲＮＡの産生および使用は、例えばＥｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ．Ｍ．ら（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， １８８またはＥｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ．Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４に記載される。好ましくは、ｓｉＲＮＡは３０ヌクレオチド未満の長さを示し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の同一ストレッチは、好ましくは少なくとも１９ヌクレオチドである。
【００４８】
リボザイムもまた、核酸、本明細書ではＡＴＰ７Ａ遺伝子の翻訳を阻害するのに適したツールであり、これはリボザイムがｍＲＮＡに特異的に結合し、そして切断することが可能であるためである。これらは例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら（１９９８）Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ５４， １１７５−２０２；Ｖａｉｓｈら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２６， ５２３７−４２；Ｐｅｒｓｉｄｉｓ（１９９７）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５， ９２１−２またはＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １２， ５１０−５に記載される。
【００４９】
薬学的に許容しうるキャリアー中に有効量の核酸を含む、本発明の薬剤組成物を、本発明のタンパク質複合体を発現するかまたは過剰発現する種類の疾患または障害を有する患者に投与することも可能である。
【００５０】
特定の障害または状態の治療に有効であろう核酸の量は、障害または状態の性質に応じるであろうし、そして標準的臨床技術によって決定可能である。可能な場合、ヒトで試験しそして使用する前に、核酸細胞傷害性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定し、そして次いで有用な動物モデル系で測定することが望ましい。
【００５１】
特定の態様において、核酸を含む薬剤組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与する。本発明の多様な態様において、こうした組成物を用いて、核酸の持続放出を達成することが有用である可能性もある。特定の態様において、同定可能な中枢神経系細胞種に特異的な抗体を介してターゲティングされるリポソームを利用することが望ましい可能性もある（Ｌｅｏｎｅｔｔｉら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：２４４８−２４５１；Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１６３３７−１６３４２）。
【００５２】
用語「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」は、ＡＴＰ７Ａに結合し、そしてこれを阻害する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そして限定なしに、ＡＴＰ７Ａに対して向けられるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体断片およびタンパク質骨格を含む。
【００５３】
本発明にしたがって、用語、抗体または抗体断片はまた、組換え的に調製され、そして適切な場合、修飾された、抗体またはその抗原結合部分、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（ｏｌｉｇｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２断片（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０ ３６８ ６８４、ＵＳ ４，８１６，５６７、ＵＳ ４，８１６，３９７、ＷＯ ８８／０１６４９、ＷＯ ９３／０６２１３またはＷＯ ９８／２４８８４を参照されたい）を意味するとして理解され、好ましくはＦＡＢ発現ライブラリーの補助で産生される。
【００５４】
古典的な抗体の代替物として、例えば、ＡＴＰ７Ａに対するタンパク質骨格、例えばリポカリンに基づくアンチカリン（Ｂｅｓｔｅら（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６， １８９８−１９０３）を使用することもまた可能である。選択されるハプテン、本明細書ではＡＴＰ７Ａに結合する方式で、例えば「コンビナトリアル・タンパク質設計」アプローチによって、リポカリン、例えばレチノール結合性タンパク質またはビリン結合性タンパク質の天然リガンド結合部位を改変することも可能である（Ｓｋｅｒｒａ， ２０００， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４８２， ３３７−５０）。他の既知のタンパク質骨格が、分子認識のための抗体の代替物であることが知られる（Ｓｋｅｒｒａ（２０００）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．， １３， １６７−１８７）。
【００５５】
当業者に周知の方法にしたがって、例えば哺乳動物、例えばウサギを、適切な場合、例えばフロイントのアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で、ＡＴＰ７Ａで免疫することによって、抗体または抗体断片を調製する方法が達成される（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｂ．Ａ．ら（１９８１）Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１３４４−１３４９を参照されたい）。免疫学的反応の結果として、動物で形成されるポリクローナル抗体を、続いて、周知の方法を用いて血液から単離し、そして例えばカラム・クロマトグラフィーによって精製することも可能である。例えば、モノクローナル抗体をＷｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎの既知の方法（Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ， ３４９， ２９３−２９９）にしたがって、調製することも可能である。
【００５６】
詳細には、適切な被験者を、免疫原としてのポリペプチドで免疫することによって、上述のように、ポリクローナル抗体を調製することも可能である。好ましいポリクローナル抗体組成物は、本発明の単数または複数のポリペプチドに対して向けられる抗体に関して選択されているものである。特に好ましいポリクローナル抗体調製物は、既定の単数または複数のポリペプチドに対して向けられる抗体のみを含有するものである。特に好ましい免疫原組成物は、他のヒト・タンパク質を含有しないもの、例えば本発明のポリペプチドの組換え発現のため、非ヒト宿主細胞を用いて作製した免疫原組成物である。こうした方式では、この免疫原に対して作製して生じた抗体組成物に認識されるのは、本発明の単数または複数のポリペプチドの一部として存在する、単数または複数のヒト・エピトープのみであろう。
【００５７】
標準的技術、例えば固定ポリペプチドを用いた酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、一定時間に渡って、免疫した被験者における抗体力価を監視することも可能である。望ましい場合、哺乳動物から（例えば血液から）、抗体分子を単離し、そしてさらに、周知の技術、例えばプロテインＡクロマトグラフィーによって、さらに精製してＩｇＧ分画を得ることも可能である。あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチドに特異的な抗体を、例えばアフィニティー・クロマトグラフィーによって、選択する（例えば部分的に精製する）かまたは精製することも可能である。例えば、組換え的に発現され、そして精製された（または部分的に精製された）本発明のタンパク質を、本明細書に記載するように産生し、そして例えばクロマトグラフィー・カラムなどの固体支持体に、共有的にまたは非共有的にカップリングする。次いで、該カラムを用いて、多数の異なるエピトープに対して向けられる抗体を含有する試料から、本発明のタンパク質に特異的な抗体をアフィニティー精製し、それによって実質的に精製された抗体組成物、すなわち混入抗体を実質的に含まないものを生成することも可能である。この関連において、実質的に精製された抗体組成物によって、抗体試料が、本発明の望ましいタンパク質またはポリペプチドに対するもの以外のエピトープに対して向けられる混入抗体を（乾燥重量にして）最大わずか３０％しか含有せず、そして好ましくは（乾燥重量にして）試料の最大２０％、さらにより好ましくは最大１０％、そして最も好ましくは最大５％のみが混入抗体であることを意味する。精製抗体組成物は、組成物中の抗体の少なくとも９９％が、本発明の望ましいタンパク質またはポリペプチドに対して向けられることを意味する。
【００５８】
免疫後の適切な時点で、例えば特異的抗体力価が最も高いとき、抗体産生細胞を被験者から得て、そして該細胞を用いて、標準的技術、例えば元来、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６）またはトリオーマ技術によって、モノクローナル抗体を調製することも可能である。ハイブリドーマを産生するための技術は周知である（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９４， Ｃｏｌｉｇａｎら（監修）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨークを参照されたい）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、目的のポリペプチドに結合する抗体に関して、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって、検出される。
【００５９】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリン・ライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイ・ライブラリー）を、目的のポリペプチドでスクリーニングすることによって、本発明のポリペプチドに対して向けられるモノクローナル抗体を同定し、そして単離することも可能である。ファージディスプレイ・ライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットが商業的に入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰファージディスプレイ・キット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイ・ライブラリーを生成し、そしてスクリーニングする際に使用するのに特に受け入れられる方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／１８６１９号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９１／１７２７１号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／２０７９１号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／１５６７９号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９３／０１２８８号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／０１０４７号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／０９６９０号；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら， １９９１， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら， １９９２， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら， １９９３， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４に見出すことも可能である。
【００６０】
さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作製可能である、ヒト部分および非ヒト部分両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体が、本発明の範囲内である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばネズミｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである（例えば、本明細書に完全に援用される、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、本明細書に完全に援用される、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野に知られる組換えＤＮＡ技術によって、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ ８７／０２６７１号；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；欧州特許出願１７３，４９４；ＰＣＴ公報第ＷＯ ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら， １９８７， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら， １９８８， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら， １９８６， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら， １９８８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０に記載される方法を用いて、産生可能である。
【００６１】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の療法的治療に特に望ましい。こうした抗体は、例えば、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現不能であるが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現可能である、トランスジェニックマウスを用いて、産生可能である。選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドすべてまたは一部を用いて、通常の様式で該トランスジェニックマウスを免疫する。慣用的ハイブリドーマ技術を用いて、該抗原に対して向けられるモノクローナル抗体を得ることも可能である。該トランスジェニックマウスに宿するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成し、そして続いてクラス・スイッチおよび体細胞突然変異を経る。したがって、こうした技術を用いて、療法的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説には、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ， １９９５， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３を参照されたい。ヒト抗体およびヒト・モノクローナル抗体を産生するためのこの技術の詳細な考察、およびこうした抗体を産生するためのプロトコルには、例えば米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号を参照されたい。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フリーモント）などの企業は、上述のものと類似の技術を用いて、選択した抗原に対して向けられるヒト抗体を提供するのに従事することも可能である。
【００６２】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体を、「ガイド選択」と称される技術を用いて、生成することも可能である。このアプローチでは、選択した非ヒト・モノクローナル抗体、例えばネズミ抗体を用いて、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓら， １９９４， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【００６３】
当該技術分野に知られる技術によって、複合体のイディオタイプを含有する抗体断片を生成することも可能である。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生可能なＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ’断片；パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することによって生成可能なＦａｂ断片；およびＦｖ断片が含まれる。
【００６４】
抗体産生において、望ましい抗体に関するスクリーニングは、当該技術分野に知られる技術、例えばＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）によって達成可能である。複合体の特定のドメイン、またはその誘導体に特異的な抗体を選択するため、こうしたドメインを含有する複合体の断片、またはその誘導体に結合する産物に関して、生成されたハイブリドーマをアッセイすることも可能である。本発明の複合体、あるいはその誘導体または相同体に特異的に結合するが、複合体、あるいはその誘導体または相同体の個々のタンパク質に特異的に結合しない、抗体を選択するため、複合体に対する陽性結合および個々のタンパク質構成要素に対する結合の欠如に基づいて、選択することも可能である。
【００６５】
既定の単数または複数のタンパク質の局在および／または定量に関連する、当該技術分野に知られる方法、例えばこれらのタンパク質を画像化するための方法、適切な生理学的試料中のそのレベルを測定する方法（イムノアッセイによる）、診断法などで、前述の抗体を使用することも可能である。これはまた、複合体の誘導体または相同体に関してもあてはまる。
【００６６】
好ましい態様において、ＡＴＰ７Ａ阻害剤は、配列：ＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＧＧＧ（Ａ）またはＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴ（Ｂ）いずれかを持つｓｉＲＮＡである。
【００６７】
上に論じるように、ＡＴＰ７Ａは、ガンマ・セクレターゼ活性および／またはベータ・セクレターゼ活性の制御に関与するタンパク質複合体の一部である。したがって、好ましい態様において、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子または阻害剤は、タンパク質複合体、好ましくはＰｓｅｎ２タンパク質複合体またはＢＡＣＥ１複合体の一部であるＡＴＰ７Ａ分子に作用する。
【００６８】
前記タンパク質複合体は、代替ガンマ−セクレターゼ・サブユニットＰｓｅｎ２およびベータ−セクレターゼ・タンパク質と相互作用するタンパク質の集合と同定されてきている。
【００６９】
上に説明するように、驚くべきことに、本発明の関連において、ＡＴＰ７Ａが、特にベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ−セクレターゼ活性によって、ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングを制御するタンパク質複合体の一部であることが発見された。したがって、好ましい態様において、阻害剤または相互作用分子は、ガンマ・セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの活性を調節する。
【００７０】
本発明全体で、用語「ガンマ・セクレターゼおよび／またはベータ・セクレターゼの活性を調節する」は、酵素活性が直接または間接的に調節されることを含む。これは、ＡＴＰ７Ａ調節剤がこれらの酵素のいずれかに直接結合可能であるか、あるいはより好ましくは、ＡＴＰ７Ａに影響を発揮して、次に例えばタンパク質−タンパク質相互作用によってまたはシグナル伝達によって、または小さい代謝産物を介して、これらの酵素のいずれかの活性を調節可能であることを意味する。
【００７１】
本発明全体で、ベータ・セクレターゼ調節剤が、完全にまたは部分的に、ベータ・セクレターゼの活性を阻害することが好ましい。本発明全体で、ＡＴＰ７Ａ調節剤の最も好ましい機能的結果は、Ａベータ−４２生成の減少である。
【００７２】
本発明の関連において、「ガンマ・セクレターゼおよび／またはベータ・セクレターゼの活性を調節する」は、活性が減少して、より少ない産物が形成されるかまたは産物がまったく形成されず、最も好ましくはより少ないＡベータ−４２が形成されるかまたはＡベータ−４２がまったく形成されない（部分的または完全阻害）か、あるいはそれぞれの酵素が異なる産物（ガンマ−セクレターゼの場合、Ａベータ−４２の代わりにより短いアミノ酸配列の、例えばＡベータ−３８または他のＡベータ・ペプチド）を産生するか、あるいは産物の相対量が異なる（ガンマ・セクレターゼの場合、例えばＡベータ４０対Ａベータ−４２の比が変化する、好ましくは増加する）ことを意味する。
【００７３】
さらに、調節剤が、ガンマ・セクレターゼまたはベータ・セクレターゼいずれか、あるいは両酵素の活性を調節することが含まれる。
ガンマ・セクレターゼ活性の調節剤に関しては、この調節剤が、ガンマ・セクレターゼ活性を阻害することが好ましい。しかし、Ａベータ・ペプチド種の総量が変化しないが、Ａベータ−４２の代わりに、より多くのＡベータ−３８が産生される方式で、ガンマ・セクレターゼの活性がシフトすることもまた、好ましい。
【００７４】
例えばＡＰＰプロセシングを測定することによって、例えば、産生されるＡベータ・ペプチド種のレベル、最も重要なことに、Ａベータ−４２のレベルを測定することによって、ガンマ・セクレターゼ活性を測定することも可能である（以下の実施例セクションを参照されたい）。
【００７５】
プレセニリン１および２（それぞれ、Ｐｓｅｎ１およびＰｓｅｎ２、ＰＳ１およびＰＳ２とも称される）は、小胞体、ゴルジ体、および細胞表面にもまた局在する、内在性膜タンパク質である（Ｋｏｖａｃｓ， Ｎａｔ Ｍｅｄ ２． ２２４）。これらは主に、ＮＴＦおよびＣＴＦ細胞内タンパク質分解断片のヘテロ二量体として見出される。プレセニリンを切断するプロテアーゼ（「プレセニリナーゼ」）は未知であり、プロセスが自己触媒性である可能性があり、またＰＳ（自己）タンパク質分解の機能的な重要性は不明である。プレセニリンは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３９１， ３８７）およびＮｏｔｃｈ受容体（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３９８， ５１８）のタンパク質分解プロセシングに関与する。さらに、プレセニリンは、細胞接着タンパク質、アルファおよびベータ−カテニン、Ｎ−カドヘリン、ならびにＥ−カドヘリン（Ｇｅｏｒｇａｋｏｐｏｕｌｏｓら， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４， ８９３）およびアルマジロ・ファミリーの他のメンバー（Ｙｕら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３， １６４７０）と会合する。プレセニリンによるＡＰＰプロセシングは、ＡＰＰを切断し、Ａ−ベータ・ペプチドのＣ末端を生成する、ガンマ−セクレターゼに対する影響を通じる。ＰＳ１は、ＡＰＰのＣ８３およびＣ９９プロセシングＣ末端断片（Ｘｉａら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９４， ８２０８）、ニカストリン（Ｙｕら， Ｎａｔｕｒｅ ４０７， ４８）およびＰｅｎ−２（Ｆｒａｎｃｉｓら， Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ３， ８５）と会合する。プレセニリン・プロセシングには、Ａｐｈ−１（Ｆｒａｎｃｉｓら， Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ３， ８５）が必要である。プレセニリンが、ガンマ−セクレターゼ活性を直接制御するかどうか、またはこれらがそれ自体、プロテアーゼ酵素であるのかどうかは明らかでない（ＫｏｐａｎおよびＧｏｕａｔｅ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４， ２７９９）。ガンマ・セクレターゼ活性は、これらのタンパク質の多量体複合体を含むことも可能である（Ｙｕら， Ｎａｔｕｒｅ ４０７， ４８）が、これらのタンパク質間の関係がどのようにセクレターゼ活性に影響を及ぼすかは知られていない。
【００７６】
ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）活性は、細胞外ドメインでＡＰＰを切断し、分泌可溶性ＡＰＰｂの分断を生じ、そして９９残基のＣ末端膜貫通断片（ＡＰＰ−Ｃ９９）を生じる。Ｖａｓｓａｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ７３５−７４１）は、ＡＰＰのベータ−セクレターゼと推測される特性を有する膜貫通アスパラギン酸プロテアーゼをクローニングし、該プロテアーゼをＢＡＣＥ１と名づけた。ＢＡＣＥ１ノックアウトマウス由来の脳および初代皮質培養物は、検出可能なベータ−セクレターゼ活性を示さず、そしてＢＡＣＥノックアウトマウス由来の初代皮質培養物は、ＡＰＰからはるかに少ないアミロイド−ベータしか産生しなかった。これによって、ＢＡＣＥ１のパラログであるＢＡＣＥ２ではなく、ＢＡＣＥ１がＡＰＰの主なベータ−セクレターゼであることが示唆される。ＢＡＣＥ１は、５０１アミノ酸のタンパク質であり、２１ａａのシグナルペプチドに続いて、ａａ２２〜４５に渡る、プロタンパク質ドメインを含有する。選択的スプライシング型、ＢＡＣＥ−Ｉ−４５７およびＢＡＣＥ−Ｉ−４７６がある。成熟タンパク質の管腔ドメインに続いて、予測される１つの膜貫通ドメインおよび２４ａａの短い細胞質ゾルＣ末端テールがある。ＢＡＣＥ１は、１型膜貫通タンパク質であり、活性部位が膜の管腔側にあると予測され、ここでベータ−セクレターゼがＡＰＰ、およびありうる他の未同定の基質を切断する。ＢＡＣＥ１は、明らかに、ＡＰＰをＡ−ベータにプロセシングするのに必要とされる重要な酵素であるが、最近の証拠は、ＢＡＣＥ１のさらなる潜在的基質および機能を示唆している（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９， １０５４２−１０５５０）。現在まで、制御機能または調節機能を持つＢＡＣＥ１相互作用タンパク質は、まったく記載されてきていない。
【００７７】
これらのタンパク質相互作用因子の解明は、療法のための新規介入点を提供する。
上に説明したように、驚くべきことに、本発明の関連において、ＡＴＰ７Ａは、ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ・セクレターゼ活性を制御するタンパク質複合体の一部であることが見出された。したがって、好ましい態様において、阻害剤または相互作用分子は、ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ・セクレターゼの活性を調節する。
【００７８】
本発明の関連において、「ガンマ・セクレターゼおよび／またはベータ・セクレターゼの活性を調節する」は、活性が減少して、より少ない産物が形成されるかまたは産物がまったく形成されない（部分的または完全阻害）か、あるいはそれぞれの酵素が異なる産物（ガンマ−セクレターゼの場合、例えばＡベータ−４２の代わりにＡベータ−４０）を産生するか、あるいは産物の相対量が異なる（ガンマ・セクレターゼの場合、例えばＡベータ−４２よりも多いＡベータ４０）ことを意味する。さらに、調節剤は、ガンマ・セクレターゼまたはベータ・セクレターゼのいずれか、あるいは両酵素の活性を調節することが含まれる。
【００７９】
本発明全体で、ベータ・セクレターゼ調節剤が、完全にまたは部分的に、ベータ・セクレターゼの活性を阻害することが好ましい。
ガンマ・セクレターゼ活性の調節剤に関して、この調節剤が、ガンマ・セクレターゼ活性を阻害することが好ましい。しかし、Ａベータ−４２の代わりに、より多くのＡベータ−４０が産生される方式で、ガンマ・セクレターゼの活性がシフトすることもまた、好ましい。
【００８０】
例えば、ＡＰＰプロセシングを決定することによって、例えばＡベータ４０またはＡベータ−４２が産生されるかどうかを決定することによって、ガンマ・セクレターゼ活性を測定することも可能である（以下の実施例セクションを参照されたい）。
【００８１】
ＢＡＣＥ１活性を測定するため、ウェスタンブロッティングによって、アルファ−およびベータ−Ｃ末端ＡＰＰ断片間の比の変化を分析することも可能であり（Ｂｌａｓｋｏら， Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ １１１， ５２３）；ＢＡＣＥ１活性アッセイのさらなる例には、限定されるわけではないが：ベータ−ガラクトシダーゼ・レポーター活性を再構成し、そして測定する、ＢＡＣＥ１切断部位を含有する環状化酵素ドナー・ペプチドの使用（Ｎａｑｖｉら， Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ． ９， ３９８）；消光蛍光ペプチド基質および蛍光測定の使用（Ａｎｄｒａｕら， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８， ２５８５９）；酵素（アルカリホスファターゼなど）を、ＢＡＣＥ１認識配列を含有するアミノ酸ストレッチを介して、ゴルジ体常在タンパク質に連結する、組換えキメラタンパク質を利用する、細胞に基づくアッセイの使用（Ｏｈら， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ３２３， ７）；蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイ（Ｋｅｎｎｅｄｙら， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｎ ３１９， ４９）；酵母における細胞増殖選択系（Ｌｕｔｈｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６２０， １６７）が含まれる。
【００８２】
好ましくは、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
本発明にしたがって、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子を用いて、薬剤組成物を調製する。
したがって、本発明は、有効量で被験者に投与可能な薬剤組成物を提供する。好ましい側面において、療法剤は、実質的に精製されている。被験者は、好ましくは、限定されるわけではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含む動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。特定の態様において、非ヒト哺乳動物が被験者である。
【００８３】
多様な搬送系が知られ、そしてこうした系を用いて、本発明の療法剤を投与することも可能であり、こうした系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：療法剤を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用（例えば、ＷｕおよびＷｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２）；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、化合物を投与することも可能であるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。さらに、脳室内注射およびクモ膜下注射を含む、適切な経路いずれかによって、本発明の薬剤組成物を中枢神経系に導入することが望ましい可能性もあり；脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａ容器などの容器に取り付けた、脳室内カテーテルによって容易にすることも可能である。例えば吸入器または噴霧器を使用し、そしてエアロゾル化剤と配合することによって、肺投与もまた使用可能である。
【００８４】
特定の態様において、治療の必要がある領域に、本発明の薬剤組成物を局所投与することが望ましい可能性もある。これは、例えば、そして限定なしに、手術中の局所注入によって、例えば手術後の創傷手当て（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）と組み合わせた局所適用によって、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、あるいはシアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜またはファイバーを含む、多孔、無孔、またはゼラチン性物質である移植物によって、達成可能である。１つの態様において、悪性腫瘍または新生物組織もしくは新生物発生前組織の部位（または以前の部位）に直接注射することによって、投与することも可能である。
【００８５】
別の態様において、療法剤を、小胞、特にリポソーム中で搬送することも可能である（Ｌａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら， １９８９， ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ中， Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ監修， Ｌｉｓｓ， ニューヨーク， ｐｐ．３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， 同書， ｐｐ．３１７−３２７；一般的には同書を参照されたい）。
【００８６】
さらに別の態様において、徐放系を介して、療法剤を搬送することも可能である。１つの態様において、ポンプを使用することも可能である（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ， １９８７， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら， １９８０， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋら， １９８９， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４−５７９）。別の態様において、ポリマー物質を用いることも可能である（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ監修， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， フロリダ州ボーカラートン， １９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ監修， Ｗｉｌｅｙ， ニューヨーク， １９８４；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ， １９８３， Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１；Ｌｅｖｙら， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇら， １９８９， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄら， １９８９， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：８５８−８６３）。さらに別の態様において、療法ターゲット、すなわち脳に近接して、徐放系を配置し、こうして全身用量のうち、ごく少量しか必要としないことも可能である（例えばＧｏｏｄｓｏｎ， １９８４， ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ中， 上記， Ｖｏｌ．２， ｐｐ．１１５−１３８）。他の徐放系が、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）による概説に論じられている。
【００８７】
療法剤が、好ましくはタンパク質療法剤をコードする核酸である、特定の態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、そして細胞内に存在するように投与することによって、核酸をｉｎ ｖｉｖｏで投与して、コードされるタンパク質の発現を促進することも可能であり、これは、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号）、または直接注射によって、または微小粒子銃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または核酸を脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られるホメオボックス様ペプチド（例えばＪｏｌｉｏｔら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８）に連結した核酸を投与することによって、実行可能である。あるいは、核酸療法剤を細胞内に導入し、そして発現のため、宿主細胞ＤＮＡ内に相同組換えによって取り込ませることも可能である。
【００８８】
一般的に、本発明の薬剤組成物は、療法的有効量の療法剤、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む。特定の態様において、用語「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、連邦政府または州政府の監督官庁に認可されたか、あるいは米国薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリアー」は、療法剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。こうした薬剤キャリアーは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。薬剤組成物を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアーである。薬剤組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアーである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアーとして使用される。適切な薬剤賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリアー、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアーを含むことも可能である。適切な薬剤キャリアーの例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載される。こうした組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアーと一緒に、療法的有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有するであろう。配合物は、投与様式に適していなければならない。
【００８９】
好ましい態様において、日常的な方法にしたがって、ヒトへの静脈内投与に適応させた薬剤組成物として、組成物を配合する。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給する。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
【００９０】
本発明の療法剤を中性型または塩型で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【００９１】
特定の障害または状態の治療に有効であろう、本発明の療法剤の量は、障害または状態の性質に応じるであろうし、そして標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性にも応じるであろうし、そして担当医の判断および各患者の状況にしたがって、決定すべきである。しかし、静脈内投与に適した投薬量範囲は、一般的に、キログラム体重あたり、活性化合物約２０〜５００マイクログラムである。鼻内投与に適した投薬量範囲は、一般的に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【００９２】
座薬は、一般的に、重量にして０．５％〜１０％の範囲の活性成分を含有し；経口配合物は、好ましくは、１０％〜９５％の活性成分を含有する。
本発明はまた、本発明の薬剤組成物の１以上の成分が充填された、１以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットも提供する。場合によって、こうした容器（単数または複数）に付随して、薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【００９３】
本発明のキットはまた、複合体機構の本質的な構成要素をコードする発現ベクターも含有することも可能であり、この構成要素は、発現された後、生物学的に活性な複合体を形成するため、再構成されることも可能である。こうしたキットは、好ましくはまた、必要な緩衝剤および試薬も含有する。場合によって、こうした容器（単数または複数）に付随して、キット使用のための説明書、並びに／あるいは薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【００９４】
本発明はさらに、有効量のＡＴＰ７Ａ相互作用分子または阻害剤あるいは本発明の薬剤組成物を、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を患う被験者に投与する、治療法に関する。
【００９５】
本発明のこの方法に関して、上記のすべての態様は、本発明の使用のため、あてはまる。
本発明はさらに、ガンマ−セクレターゼ調節剤および／またはベータ−セクレターゼ調節剤を同定する方法であって：
ａ．既定の試験化合物がＡＴＰ７Ａ相互作用分子であるかどうか決定することによって、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子を同定し、
ｂ．工程ａ）のＡＴＰ７Ａ相互作用分子がガンマ−セクレターゼ活性またはベータ−セクレターゼ活性を調節可能であるかどうか決定する
工程を含む、前記方法に関する。
【００９６】
本発明の好ましい態様において、工程ａ）において、試験化合物をＡＴＰ７Ａと接触させ、そして試験化合物とＡＴＰ７Ａの相互作用を決定する。好ましくは、候補分子がＡＴＰ７Ａに結合するかどうかを測定する。
【００９７】
本発明の好ましい態様において、ＡＴＰ７Ａ活性を調節する、好ましくは阻害するかどうかを見出すために、工程ａ）で同定されたＡＴＰ７Ａ相互作用分子をまず、上記のようなＡＴＰ７Ａ活性試験に供し（実施例３も参照されたい）、そして次いで、工程ｂ）に供する（Ａベータ低下効果に関する試験）。
【００９８】
本発明の方法を、好ましくは、ハイスループットアッセイの関連で行う。こうしたアッセイは、当業者に知られる。
スクリーニングしようとする試験分子または候補分子は、限定された数の明記される化合物の混合物として、または化合物ライブラリー、ペプチド・ライブラリー等として、提供されることも可能である。スクリーニングしようとする剤／分子はまた、複合体活性または形成を調節可能な、抗血清、アンチセンス核酸等のすべての形を含むことも可能である。スクリーニングのための典型的な候補分子およびライブラリーを以下に示す。
【００９９】
ライブラリーのスクリーニングは、一般的に知られる多様な方法のいずれによって、達成することも可能である。例えばペプチド・ライブラリーのスクリーニングを開示する、以下の参考文献を参照されたい：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら， １９９４， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２；すべてＬａｄｎｅｒらに対する米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；並びに国際特許公報第ＷＯ ９４／１８３１８号。
【０１００】
特定の態様において、固相上に固定したＡＴＰ７Ａとライブラリーメンバーを接触させ、そしてタンパク質（またはコード核酸もしくは誘導体）に結合するライブラリーメンバーを採取することによって、スクリーニングを行うことも可能である。こうしたスクリーニング法の例は、「パニング」技術と称され、例えば、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８８， Ｇｅｎｅ ７３：３０５ ３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；国際特許公報第ＷＯ ９４／１８３１８号；および上述の文献に引用される参考文献に記載される。
【０１０１】
特定の態様において、ＡＴＰ７Ａ断片および／または類似体、特にペプチド模倣体を、ＡＴＰ７Ａと他のタンパク質、例えばＰｓｅｎ２との複合体の形成（複合体の量または複合体の組成）または細胞中のＡＴＰ７Ａ活性の、細胞における複合体活性または形成を阻害する、競合的または非競合的阻害剤としての活性に関して、スクリーニングする。
【０１０２】
１つの態様において、試験しようとする剤の非存在下では複合体形成が起こる、水性または生理学的結合条件下で、複合体形成を調節する能力に関して剤をスクリーニングする、結合阻害アッセイを用いて、ＡＴＰ７Ａ活性またはＡＴＰ７Ａ−タンパク質複合体形成を調節する（すなわちアンタゴナイズするかまたはアゴナイズする）剤をスクリーニングすることも可能である。本発明の複合体形成に干渉する剤を、複合体形成のアンタゴニストとして同定する。複合体形成を促進する剤を、複合体形成のアゴニストとして同定する。複合体形成を完全に遮断する剤を、複合体形成の阻害剤として同定する。
【０１０３】
スクリーニング法は、放射性リガンド（例えば１２５Ｉまたは３Ｈ）、磁気リガンド（例えばフォトビオチン・アセテートに共有結合した常磁性ビーズ）、蛍光リガンド（例えばフルオレセインまたはローダミン）、または酵素リガンド（例えばルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）で、複合体の構成要素タンパク質を標識することを含むことも可能である。次いで、当該技術分野に知られる多くの技術の１つによって、溶液中で結合する反応剤を単離することも可能であり、こうした技術には、限定されるわけではないが、非標識結合パートナー（または第二の標識複合体部分上で用いるものと区別可能なマーカーで標識された結合パートナー）に対する抗血清を用いた、標識複合体部分の同時免疫沈降、免疫アフィニティー・クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および勾配密度遠心分離が含まれる。好ましい態様において、標識結合パートナーは、商業的に入手可能なフィルターに保持されない小さい断片またはペプチド模倣体である。結合したならば、次いで、標識種は、フィルターを通過不能となり、複合体形成の単純なアッセイが提供される。
【０１０４】
当該技術分野に一般的に知られる方法を用いて、複合体の構成要素メンバーの少なくとも１つを標識する。適切な標識法には、限定されるわけではないが、放射標識アミノ酸、例えば３Ｈ−ロイシンまたは３５Ｓ−メチオニンの取り込みによる放射標識、クロラミンＴ法、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬などを用いた、１２５Ｉまたは１３１Ｉでの翻訳後ヨウ素化による放射標識、あるいはホスホリラーゼおよび無機放射標識リンを用いた３２Ｐでの標識、フォトビオチン−アセテートでのビオチン標識、および太陽灯曝露などが含まれる。複合体メンバーの１つが、例えば以下に記載するように、固定されている場合、遊離種を標識する。相互作用種のいずれも固定されていない場合、各々を区別可能なマーカーで標識して、その後、両方の部分を単離して、より正確な定量化を提供し、そしてヘテロマー複合体からホモマー複合体の形成を区別可能であるようにすることも可能である。修飾相互作用因子の１つに結合する付属タンパク質を利用して、検出感度を改善し、複合体の安定性を増加させるなどの方法を提供する。
【０１０５】
典型的な結合条件は、限定ではないが、例えば、１０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５〜８、および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００または相互作用の特異性を改善する他の界面活性剤の水性塩溶液中である。金属キレート剤および／または二価陽イオンを添加して、結合を改善し、そして／またはタンパク質分解を減少させることも可能である。反応温度は、摂氏４、１０、１５、２２、２５、３５、または４２度を含むことも可能であり、そしてインキュベーション時間は、典型的には少なくとも１５秒間であるが、結合平衡が起こることを可能にするには、より長い時間が好ましい。日常的なタンパク質結合アッセイを用いて、特定の複合体をアッセイして、再現可能な結合に最適な結合条件を決定することも可能である。
【０１０６】
用いる標識に特異的なアッセイ法、例えば放射能検出のための液体シンチレーション計測、酵素標識部分のための酵素活性などを用いた、複合体形成の定量化によって、複合体形成の物理的パラメーターを分析することも可能である。次いで、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析、Ｈｉｌｌ分析、および当該技術分野に一般的に知られる他の方法（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ， ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， 第２版（１９９３）Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨークを参照されたい）を利用して、反応結果を分析する。
【０１０７】
結合アッセイに対する第二の一般的なアプローチにおいて、結合種の１つをフィルター上、マイクロタイタープレートウェル中、試験管中、クロマトグラフィーマトリックスなどに、共有的または非共有的に固定する。当該技術分野に周知の方法いずれか、例えば限定されるわけではないが、ＫａｄｏｎａｇａおよびＴｊｉａｎ， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：５８８９−５８９３の方法、すなわちＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの臭化シアン誘導体化支持体への連結を用いて、タンパク質を共有的に固定することも可能である。必要な場合、スペーサーを使用すると、支持体による立体障害を減少させることも可能である。支持体へのタンパク質の非共有結合には、限定されるわけではないが、荷電表面へのタンパク質の付着、特異的抗体との結合、関連しない第三の相互作用タンパク質への結合などが含まれる。
【０１０８】
いずれかの手段（例えば上述の手段）によって標識した複合体の別のメンバーと、複合体の１つのメンバー（またはその誘導体）の結合に関して競合する剤（細胞抽出物またはライブラリー・プールを含む）のアッセイを提供して、複合体形成の競合剤または増進剤に関してスクリーニングする。
【０１０９】
特定の態様において、他のタンパク質構成要素への試薬の非特異的結合、またはプラスチック、固定マトリックス等に試薬が吸収される損失を阻害する、ブロッキング剤をアッセイ混合物に含む。ブロッキング剤には、限定されるわけではないが、ウシ血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳、デンハルト試薬、Ｆｉｃｏｌｌ、ポリビニルピロリジン、非イオン性界面活性剤（ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０など）、イオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ、ＬＤＳなど）、ポリエチレングリコールなどが含まれる。適切なブロッキング剤濃度によって、複合体形成が可能である。
【０１１０】
結合を行った後、上清中の未結合標識タンパク質を取り除き、そして結合した標識タンパク質いずれかを保持する固定タンパク質を徹底的に洗浄する。次いで、上述のように標識を検出する当該技術分野の標準法を用いて、結合標識の量を定量化する。
【０１１１】
別の特定の態様において、本明細書に提供するようなタンパク質複合体／タンパク質および／または抗体を固体キャリアーに付着させることによって、本明細書に提供するようなタンパク質複合体／タンパク質の調節剤に関するスクリーニングを行うことも可能である。
【０１１２】
異なる種類のタンパク質（抗体を含む）を含有するアレイの調製が当該技術分野に周知であり、そして当業者に明らかである（例えば、Ｅｋｉｎｓら， １９８９， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ． ７：１５５−１６８；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら ２００２， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：２２５−２２９；Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎら， ２００２， Ｌａｎｃｅｔ ３５９：５７２−５７７；Ｔｅｍｐｌｉｎら， ２００１， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１６０−１６６；ＷｉｌｓｏｎおよびＮｏｃｋ， ２００１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ６：８１−８５；Ｌｅｅら， ２００２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：１７０２−１７０５；ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ， ２０００， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６０；ＢｌａｗａｓおよびＲｅｉｃｈｅｒｔ， １９９８， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １９：５９５；Ｋａｎｅら， １９９９， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０：２３６３；Ｃｈｅｎら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１４２５；Ｖａｕｇｈａｍら， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３０９−３１４；Ｍａｈｌｅｒら， １９９７， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：３１−４３；Ｒｏｂｅｒｔｓら， １９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：２６８−２７３；Ｎｏｒｄら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：７７２−７７７；Ｎｏｒｄら， ２００１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６８：４２６９−４２７７；ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ， ２０００， Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３；ＫａｒｌｓｔｒｏｅｍおよびＮｙｇｒｅｎ， ２００１， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２９５：２２−３０；Ｎｅｌｓｏｎら， ２０００， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：１１５５−１１６３；Ｈｏｎｏｒｅら， ２００１， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ３：２６５−２７４；Ａｌｂａｌａ， ２００１， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． ２：１４５−１５２， ＦｉｇｅｙｓおよびＰｉｎｔｏ， ２００１， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２：２０８−２１６、並びにここに列挙する刊行物中の参考文献を参照されたい）。
【０１１３】
タンパク質またはタンパク質複合体を、当業者に明らかであろうような異なる手段によって、アレイに付着させることも可能である。精製工程後、または当業者に明らかであろうような別の適切な精製スキームによって、例えばＴＡＰ−タグ（ＷＯ／０００９７１６およびＲｉｇａｕｔら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１０３０−１０３２に記載されるようなもの）を介して、複合体をアレイに付加させることも可能である。
【０１１４】
場合によって、複合体のタンパク質を架橋して、複合体の安定性を増進させることも可能である。タンパク質を架橋する、異なる方法が、当該技術分野で周知である。架橋剤の反応性末端基には、限定されるわけではないが、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２またはＮ−オキシ−スクシンアマートが含まれる。
【０１１５】
架橋剤のスペーサーは、架橋しようとする複合体のサイズに対して選択すべきである。いくつかのタンパク質しか含まない、小さいタンパク質複合体に関しては、反応混合物中、別個の複合体を架橋する可能性を減少させるため、比較的短いスペーサーが好ましい。より大きいタンパク質複合体に関しては、複合体内のタンパク質間の架橋を容易にするため、より大きいスペーサーのさらなる使用が好ましい。
【０１１６】
複合体をキャリアーに連結する前に、架橋の成功率をチェックすることが好ましい。
当業者に明らかであろうように、架橋の最適な率を、ケースバイケースで決定する必要がある。当該技術分野に周知の方法によって、これを達成することも可能であり、これらの方法のいくつかを以下に例示的に記載する。
【０１１７】
例えば、変性タンパク質ゲル上で、架橋されない複合体に対して、架橋された複合体を分析することによって、架橋が十分な率であることをチェックすることも可能である。
架橋が成功裡に行われたならば、複合体のタンパク質は、同一レーンに見られると予期され、一方、架橋されない複合体のタンパク質は、個々の特性にしたがって分離されると予期される。場合によって、質量分析および／またはエドマン分解などの当該技術分野に周知の方法を用いて、それぞれのバンド中のタンパク質をペプチド配列決定することによって、複合体のすべてのタンパク質の存在をさらにチェックすることも可能である。
【０１１８】
さらに、高すぎる架橋率もまた、回避しなければならない。架橋があまりにも大規模に起こった場合、個々のタンパク質複合体の架橋量が増加し、これが、アレイを用いた、潜在的な結合パートナーおよび／または調節剤等に関するスクリーニングと干渉する可能性があるであろう。
【０１１９】
当該技術分野に周知の方法によって、こうした構造の存在を決定することも可能であり、そしてこうした方法には、例えば、架橋されない複合体に対して、架橋された複合体を含有する溶液のゲルろ過プロフィールを比較する、ゲルろ過実験が含まれる。
【０１２０】
場合によって、いくつかが本明細書に例示的に提供される、当業者に明らかであろうような機能アッセイを行って、複合体の完全性をチェックすることも可能である。
あるいは、単数または複数のタンパク質を単一の融合タンパク質として発現させ、そして当業者に明らかであろうように、マトリックスにカップリングすることも可能である。
【０１２１】
場合によって、当業者に明らかな多様な方法によって、上に概略するような複合体またはタンパク質または抗体の付着をさらに監視することも可能である。これらには、限定されるわけではないが、表面プラズモン共鳴が含まれる（例えば、ＭｃＤｏｎｎｅｌ， ２００１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ５：５７２−５７７；Ｌｅｅ， ２００１， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：２１７−２２２；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら， ２０００， １：３９５−４１６；Ｐｅａｒｓｏｎら， ２０００， Ａｎｎ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３７：１１９−１４５；Ｖｅｌｙら， ２０００， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２１：３１３−３２１；Ｓｌｅｐａｋ， ２０００， Ｊ． Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ． １３：２０−２６を参照されたい）。
【０１２２】
Ａベータ−４０およびＡベータ−４２ペプチドの産生を、ＥＬＩＳＡによって測定するのに有用な典型的なアッセイには、限定されるわけではないが、Ｖａｓｓａｒ Ｒら， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６：７３５−４１に記載されるものが含まれる。
【０１２３】
細胞株またはトランスジェニック動物におけるＣ末端ＡＰＰ断片の産生を、ウェスタンブロットによって測定するのに有用な典型的なアッセイには、限定されるわけではないが、Ｙａｎ Ｒら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ， ４０２：５３３−７に記載されるものが含まれる。
【０１２４】
プレシニリン（Ｐｒｅｓｉｎｉｌｉｎ）２−複合体（Ｐｓｅｎ２）およびＢＡＣＥ１複合体の、細菌で発現されたＡＰＰ断片に対するベータ−セクレターゼまたはガンマ・セクレターゼのタンパク質分解活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えばＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ）および／または相互作用タンパク質（単数または複数）をコードするプラスミドにより細胞中の１つまたはいくつかの相互作用タンパク質の発現を修飾することによって）測定するのに有用な典型的なアッセイには、限定されるわけではないが、Ｔｉａｎ Ｇら， ２００２， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７７：３１４９９−５０５に記載されるものが含まれる。
【０１２５】
プレシニリン２−複合体（Ｐｓｅｎ２）およびＢＡＣＥ１複合体の、Ｇａｌ４駆動レポーター遺伝子のトランス活性化を（例えばＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ）および／または相互作用タンパク質（単数または複数）をコードするプラスミドにより細胞中の１つまたはいくつかの相互作用タンパク質の発現を修飾することによって）測定するのに有用な典型的なアッセイには、限定されるわけではないが、Ｃａｏ Ｘら， ２００１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９３：１１５−２０に記載されるものが含まれる。
【０１２６】
本発明記載の相互作用分子または阻害剤である能力に関して、当該技術分野に知られるいかなる分子を試験することも可能である。ＡＴＰ７Ａ複合体機構を発現する細胞に、候補分子を直接提供することも可能であるし、または候補タンパク質の場合、核酸が組換え的に発現されて候補タンパク質を産生する条件下で、コード核酸を提供することによって、候補タンパク質を提供することも可能である。
【０１２７】
本発明の方法は、複合体の量、活性、またはタンパク質構成要素組成を調節する分子、例えば阻害するか、アンタゴナイズするか、またはアゴナイズする分子に関して、化学的ライブラリーをスクリーニングするのによく適している。化学的ライブラリーは、ペプチド・ライブラリー、ペプチド模倣体ライブラリー、化学的合成ライブラリー、組換えライブラリー、例えばファージディスプレイ・ライブラリー、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に基づくライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどであることも可能である。
【０１２８】
典型的なライブラリーは、いくつかの供給源（ＡｒＱｕｌｅ、Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ、ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）から商業的に入手可能である。いくつかの場合、コンビナトリアル戦略を用いて、メンバー化合物が付着した支持体上にライブラリーの各メンバーの同一性をコードし、こうして有効な調節剤である分子を直接、そして直ちに同定することを可能にする、これらの化学的ライブラリーを生成する。したがって、多くのコンビナトリアル・アプローチにおいて、化合物プレート上の位置は、その化合物の組成を特定する。また、１つの例において、単一プレート位置に、１〜２０の化学薬品を有することも可能であり、この化学薬品を、目的の相互作用を含有するウェルに投与することによってスクリーニングすることも可能である。したがって調節が検出されたならば、調節活性に関して、相互作用対の徐々に小さいプールをアッセイすることも可能である。こうした方法によって、多くの候補分子をスクリーニングすることも可能である。
【０１２９】
使用に適した多くの多様性ライブラリーが当該技術分野に知られ、そしてこれを用いて、本発明にしたがって試験しようとする化合物を提供することも可能である。あるいは、標準法を用いて、ライブラリーを構築することも可能である。化学的（合成）ライブラリー、組換え発現ライブラリー、またはポリソームに基づくライブラリーが、使用可能なライブラリーの典型的な種類である。
【０１３０】
ライブラリーは、拘束性または半硬直性（ｓｅｍｉｒｉｇｉｄ）（ある程度の度合いの構造硬直性を有するもの）であることも可能であるし、あるいは直鎖または非拘束性であることも可能である。ライブラリーは、ｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリー、ランダムペプチド発現ライブラリーまたは化学的合成ランダムペプチド・ライブラリー、または非ペプチド・ライブラリーであることも可能である。発現ライブラリーを細胞に導入し、該細胞中でライブラリーの核酸を発現させて、コードされるタンパク質を産生し、アッセイを行う。
【０１３１】
１つの態様において、本発明で使用可能なペプチド・ライブラリーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に合成されるライブラリーであることも可能である。こうしたライブラリーの例が、各ペプチドの第一の残基および第二の残基が個々にそして具体的に定義される遊離ヘキサペプチドの混合物を記載する、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６；コレクション中の各ビーズが該ビーズ上にアミノ酸残基の単一ランダム配列を固定するペプチド・ライブラリーを、固相スプリット合成スキームによって産生する、「１ビーズ、１ペプチド」アプローチを記載する、Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；スプリット合成およびＴ−バッグ合成法を記載する、Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， １９９４， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０；およびＧａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３−１２５１に提供される。単に他の例として、Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８；またはＳａｌｍｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２の方法にしたがって、使用のためのコンビナトリアルライブラリーを調製することも可能である。ＰＣＴ公報第ＷＯ ９３／２０２４２号、並びにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３は、各化学ポリマーライブラリーメンバーに関してオリゴヌクレオチド識別子を含有する、「コードされるコンビナトリアル化学ライブラリー」を記載する。
【０１３２】
好ましい態様において、スクリーニングされるライブラリーは、ランダムペプチドが（例えばジスルフィド結合を有することによって）拘束されているランダムペプチド・ファージディスプレイ・ライブラリーである、生物学的発現ライブラリーである。
【０１３３】
さらに、より一般的には、構造的に拘束された有機多様性（例えば非ペプチド）ライブラリーもまた、使用可能である。例えば、ベンゾジアゼピン・ライブラリー（例えばＢｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照されたい）を使用することも可能である。
【０１３４】
使用可能な、コンホメーション的に拘束されたライブラリーには、限定されるわけではないが、酸化環境中でジスルフィド結合によって架橋されて、シスチンを形成する、不変システイン残基、修飾されたペプチド（例えばフッ素、金属、同位体標識を取り込む、リン酸化されているなど）、１以上の非天然存在アミノ酸を含有するペプチド、非ペプチド構造、およびかなりの割合の−カルボキシグルタミン酸を含有するペプチド、を含有するものが含まれる。
【０１３５】
非ペプチド、例えばペプチド誘導体（例えば１以上の非天然存在アミノ酸を含有するもの）のライブラリーを用いることもまた可能である。これらの一例は、ペプトイド・ライブラリーである（Ｓｉｍｏｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）。ペプトイドは、アルファ炭素に結合せず、主鎖アミノ窒素に結合する天然存在側鎖を有する、非天然アミノ酸のポリマーである。ペプトイドは、ヒト消化酵素によって容易には分解されないため、これらは好適に、薬剤使用に、より容易に適応可能である。ペプチド中のアミド官能性が過メチル化されて、化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーが生成される、使用可能なライブラリーの別の例が、Ｏｓｔｒｅｓｈら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２に記載されている。
【０１３６】
本発明にしたがってスクリーニング可能なペプチド・ライブラリーのメンバーは、２０の天然存在アミノ酸を含有するものに限定されない。特に、化学的に合成されたライブラリーおよびポリソームに基づくライブラリーは、２０の天然存在アミノ酸に加えたアミノ酸の使用を可能にする（ライブラリー産生に用いるアミノ酸の前駆体プールに含むことによる）。特定の態様において、ライブラリーメンバーは、１以上の非天然または非古典的アミノ酸または環状ペプチドを含有する。非古典的アミノ酸には、限定されるわけではないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸；−Ａｂｕ、−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸；Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸；３−アミノプロピオン酸；オルニチン；ノルロイシン；ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、シスチン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃ−メチルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、フルオロ−アミノ酸およびアミノ酸類似体一般が含まれる。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であることも可能である。
【０１３７】
特定の態様において、本発明の複合体の断片および／または類似体、またはそのタンパク質構成要素、特にペプチド模倣体を、複合体活性または形成の競合的または非競合的阻害剤としての活性に関して、スクリーニングする。
【０１３８】
本発明の別の態様において、コンビナトリアル化学を用いて、複合体の調節剤を同定することも可能である。コンビナトリアル化学は、その多くが構造的に類似でありうる、数十万の化合物を含有するライブラリーを生成することが可能である。ハイスループットスクリーニング・プログラムは、既知のターゲットに対する親和性に関して、これらの非常に大きいライブラリーをスクリーニングすることが可能である一方、より小規模であるが、最大化学的多様性を提供するライブラリーを得る、新規アプローチが開発されてきている（例えば、Ｍａｔｔｅｒ， １９９７， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４０：１２１９−１２２９を参照されたい）。
【０１３９】
明示される一団のタンパク質に対する結合親和性に関して、小分子の別個のライブラリーを試験するため、コンビナトリアル化学の１つの方法である、アフィニティー・フィンガープリンティングが、以前から用いられている。スクリーニングによって得られたフィンガープリントを用いて、目的の他のタンパク質または受容体（本発明において、本発明のタンパク質複合体およびそのタンパク質構成要素）に対する、個々のライブラリーメンバーの親和性を予測する。目的のタンパク質と反応することが知られる他の化合物から得たフィンガープリントと、フィンガープリントを比較して、ライブラリー化合物が同様に反応可能であるかどうかを予測する。例えば、複合体またはタンパク質構成要素との相互作用に関して、巨大ライブラリー中のすべてのリガンドを試験するのでなく、その活性を有することが知られる他の化合物と類似のフィンガープリントを有するリガンドのみを試験することも可能である（例えば、Ｋａｕｖａｒら， １９９５， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ， １９９５， Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ． ８：２５−２８；およびＫａｕｖａｒ， Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｋｕｒｔｚ， ＳｔａｎｋｅｒおよびＳｋｅｒｒｉｔｔ（監修）， １９９５， ＡＯＡＣ：ワシントンＤ．Ｃ．， ３０５−３１２を参照されたい）。
【０１４０】
Ｋａｙら（１９９３， Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５）は、先の慣用的ライブラリーいずれのものより長い、完全にランダムな配列のペプチドをコードする、ペプチド・ライブラリーを構築する方法を開示した。Ｋａｙらに開示されるライブラリーは、長さ約２０アミノ酸より長い、完全に合成のランダムペプチドをコードする。こうしたライブラリーを好適にスクリーニングして、複合体調節剤を同定することも可能である（米国特許第５，４９８，５３８号、１９９６年３月１２日；およびＰＣＴ公報第ＷＯ ９４／１８３１８号、１９９４年８月１８日もまた参照されたい）。
【０１４１】
ペプチド・ライブラリーの多様な種類の包括的な概説を、Ｇａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３−１２５１に見出すことも可能である。
【０１４２】
好ましい態様において、ＡＴＰ７Ａと試験化合物の相互作用は、ＡＴＰ７Ａ活性の阻害を生じる。
好ましい態様にしたがって、工程ｂ）において、ガンマ−セクレターゼがＡＰＰを切断する能力を測定する。これは上に示すように測定可能である。
【０１４３】
さらに、本発明はまた、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病治療用の薬剤組成物を調製するための方法であって：
ａ）本発明の方法にしたがって、ガンマ−セクレターゼ調節剤および／またはベータ−セクレターゼ調節剤、好ましくは阻害剤を同定し、そして
ｂ）ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤、好ましくは阻害剤を薬剤組成物に配合する
工程を含む、前記方法にも関する。
【０１４４】
ここでもまた、薬剤組成物に関して、上に示すようなすべての態様があてはまる。
好ましい態様において、本発明のこの方法は、同定された分子と、上に説明したような薬学的に許容しうるキャリアーを混合する工程をさらに含む。
【０１４５】
本発明はまた、上に定義するようなＡＴＰ７Ａ阻害剤を含む、薬剤組成物にも関する。
さらに、本発明はまた、薬剤組成物調製のための上記方法によって得られうる、薬剤組成物にも関する。
【０１４６】
本発明はまた、アルツハイマー病などの神経変性疾患および関連する神経変性障害の治療用の、本発明の薬剤組成物にも関する。
本発明はまた、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を治療するかまたは予防する方法であって、こうした治療または予防の必要がある被験者に、本発明の薬剤組成物の療法的有効量を投与することを含む、前記方法にも関する。
【０１４７】
本発明のこの方法に関して、上記のすべての態様は、本発明の使用のため、やはりあてはまる。
本発明はまた、ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ−セクレターゼ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで調節する、好ましくは阻害するための、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子の使用にも関する。例えば、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子によって、細胞培養において、ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ−セクレターゼの活性を調節する、好ましくは阻害することが、本発明内に含まれる。上述のような、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子に関するすべての態様もまた、本発明のこの使用にあてはまる。
【０１４８】
以下の実施例は、本発明の主題をより詳細に記載するであろう。
【実施例】
【０１４９】
（実施例１）
それぞれ、ＥＰ １ １０５ ５０８ Ｂ１およびＲｉｇａｕｔら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：１０３０−１０３２に、より十分に記載されるＴＡＰ技術を用いて、そしてタンパク質精製のため、以下にさらに記載するように、さらに適応させた。以下にさらに記載するように、質量分析を用いて、タンパク質を同定した。
【０１５０】
ＡＴＰ７Ａは、ＴＡＰ技術エントリーポイントＰｓｅｎ２で、タンパク質複合体のメンバーと同定された。
パート１：ＴＡＰタグ化ベイト（ｂａｉｔ）の構築
ＲＴ−ＰＣＲによって、完全ＯＲＦをコードするｃＤＮＡを得た。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、適切な細胞株から総ＲＮＡを調製した。遺伝子特異的プライマーを用い、長鎖テンプレート用ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ両方を行った。３５〜４０周期増幅した後、予期されるサイズのＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、そして必要な場合、さらなる増幅に用いた。低存在量のＲＮＡを、ゲル精製前に、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによって増幅した。ＮｏｔＩ制限部位をＰＣＲプライマーに付着させて、レトロウイルスベクターｐＩＥ９４−Ｎ／Ｃ−ＴＡＰに、増幅されたｃＤＮＡをサブクローニングすることを可能にし、それによって、ＴＡＰタグとのＮ末端融合体またはＣ末端融合体を生成した（Ｒｉｇａｕｔら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：１０３０−１０３２）。以下のベイト／エントリーポイントに関しては、Ｎ末端タグ化を選択した：プレセニリン１、プレセニリン２、Ａｐｈ−１ａ、Ａｐｈ−１ｂ、Ｐｅｎ−２、ＡＰＰ、タウ、Ｆｅ６５、カルセニリン。以下のベイト／エントリーポイントに関しては、Ｃ末端タグ化を選択した：ニカストリン、Ａｐｈ−１ａ、Ａｐｈ−１ｂ、ＢＡＣＥ１ Ｄ２１５Ｎ、ＡＰＰ、ＡＰＰ６９５ＳＷ、ＡＰＰ−Ｃ９９、Ｆｅ６５、Ｘ１１ベータ。
【０１５１】
制限消化、ＤＮＡ配列決定、およびＴＮＴ Ｔ７迅速カップリング転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ ｉｎｃ．）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によって、クローンを分析した。検出のため、ＴＡＰタグのプロテインＡ部分を用いたウェスタンブロッティングによって、タンパク質の存在を証明した。簡潔には、標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離した後、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈのＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩブロッティング装置を用いて、ニトロセルロース膜（ＰＲＯＴＲＡＮ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に半乾性トランスファーした。トランスファー緩衝液は、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭグリシン、１０％メタノールおよび０．０３７５％ドデシル硫酸ナトリウムからなった。１０％脱脂粉乳および０．１％ Ｔｗｅｅｅｎ２０を補ったリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でブロッキングした後、トランスファーしたタンパク質を、ブロッキング溶液中で希釈したペルオキシダーゼ−抗−ペルオキシダーゼ可溶性複合体（Ｓｉｇｍａ）で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。徹底的に洗浄した後、高感度化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、免疫反応性タンパク質を視覚化した。
【０１５２】
パート２：ウイルスの調製および感染
ベクターとして、ＭｏＭＬＶに基づく組換えウイルスを用いた。
調製は、以下のとおり行った：
２．１．ウイルスの調製
２９３ｇｐ細胞を１００％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に増殖させた。これらを、ポリ−Ｌ−リジンプレート（ＰＢＳ中、１：５希釈したポリーＬ−リジン［０．０１％ストック溶液、Ｓｉｇｍａ Ｐ−４８３２］を、プレート上に少なくとも１０分間放置した）上、１：５にスプリットした。第２日、６３マイクログラムのレトロウイルスベクターＤＮＡと一緒に、適切なエンベロープ・タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ １３マイクログラムを、２９３ｇｐ細胞にトランスフェクションした（Ｓｏｍｉａら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１２６６７−１２６７２；Ｓｏｍｉａら ２０００， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：４４２０−４４２４）。第３日、１５ｃｍディッシュあたり、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳと培地を交換した。第４日、ウイルスを含有する培地（上清）を採取した（トランスフェクション後の培地交換の２４時間後）。第二の収集を計画している場合、ＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳをプレートに添加し、そしてプレートをさらに２４時間インキュベーションした。すべての収集を以下のように行った：０．４５マイクロメートル・フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＧｍｂＨ、酢酸セルロース、４３１１５５）を通じて、上清をろ過した。フィルターをコニカル・ポリアロマー遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ、３５８１２６）に入れ、これをＳＷ２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）のバケットに入れた。ろ過した上清をＳＷ２８ローター中、１９４００ｒｐｍ、摂氏２１度で２時間、超遠心した。上清を廃棄した。ウイルスを含有するペレットを、エアロゾル安全チップを用い、上下に１００回ピペッティングすることによって、少量（例えば３００マイクロリットル）のハンクス平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、１４０２５−０９２）に再懸濁した。ウイルスを以下のようにトランスフェクションに用いた。
【０１５３】
２．２．感染
感染させる細胞を１日前に６ウェルプレートの１つのウェルに蒔いた。感染４時間前に、細胞上の古い培地を新鮮な培地と交換した。最小限の体積のみを添加して、細胞が完全に覆われるようにした（例えば７００マイクロリットル）。感染中、細胞は活発に分裂していた。
【０１５４】
細胞およびその増殖条件の説明を、以下にさらに提供する（「２．３．細胞株」）。
濃縮ウイルスに、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン；Ｓｉｇｍａ、Ｈ９２６８）を添加して、最終濃度８マイクログラム／ｍｌを達成した（これは、濃縮レトロウイルス３００マイクロリットルあたり、１ミリグラム／ｍｌポリブレンストックの２．４マイクロリットルと同等である）。ウイルスをポリブレン中、室温で１時間インキュベーションした。感染のため、ウイルス／ポリブレン混合物を細胞に添加して、そして摂氏３７度で数時間、適切なＣＯ２濃度でインキュベーションした（例えば１日または１晩）。感染後、感染細胞上の培地を新鮮な培地と交換した。集密になったら、通常どおりに細胞を継代した。細胞は染色体に組み込まれたレトロウイルスを含有し、そして目的の遺伝子を安定に発現する。
【０１５５】
２．３．細胞株
発現のため、ＳＫＮ−ＢＥ２細胞を用いた。ＳＫＮ−ＢＥ２細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション第ＣＲＬ−２２７１号）を９５％ ＯｐｔｉＭＥＭ＋５％鉄補充ウシ血清中で増殖させた。
【０１５６】
パート３：ＴＡＰタグ化タンパク質の発現パターンのチェック
イムノブロット分析によって、そして／または免疫蛍光によって、ＴＡＰタグ化タンパク質の発現パターンをチェックした。免疫蛍光分析を、ＴＡＰタグ化タンパク質の種類に応じて、Ｎｏ．１またはＮｏ．２にしたがって行った。イムノブロット分析を、Ｎｏ．３にしたがって行った。
【０１５７】
３．１．原形質膜およびＥＲ結合タンパク質に関する、固定哺乳動物細胞の間接的免疫蛍光染色のプロトコル
ポリリジンでコーティングした８ウェルチャンバー・スライド上、ＦＣＳ培地中で、細胞を５０％集密まで増殖させた。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（０．１４Ｍホスフェート、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）中で希釈した４％パラホルムアルデヒド中で、細胞の固定を行った。ウェルあたり３００マイクロリットル中、室温で３０分間、細胞をインキュベーションした。ＰＢＳ中の０．１Ｍグリシン中で、室温で２ｘ２０分間、反応停止を行った。０．３％サポニン＋ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温で少なくとも１時間、ブロッキングを行った。ブロッキング溶液中、＋４℃で１晩、一次抗体のインキュベーションを行った。ケースバイケースで、抗体の適切な希釈を決定した。０．３％サポニンを含有するＰＢＳ中、室温で２ｘ２０分間、細胞を洗浄した。ブロッキング溶液中で、二次抗体のインキュベーションを行う。Ａｌｅｘａ５９４にカップリングしたヤギ抗ウサギを１：１０００に希釈した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。Ａｌｅｘａ４８８にカップリングしたヤギ抗マウスを１：１０００に希釈した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを標識した。Ｆ−アクチンを標識するのにファロイジンを用いた場合、該薬剤を１：５００に希釈し、そして二次抗体とインキュベーションした。次いで、細胞を再び、ＰＢＳ中、室温で２ｘ２０分間洗浄した。過剰な緩衝液を取り除き、そしてアンチ・ブリーチング剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する培地中で細胞をマウントした。
【０１５８】
３．２．非原形質膜結合タンパク質に関する、固定哺乳動物細胞の間接的免疫蛍光染色のためのプロトコル：
ポリリジンでコーティングした８ウェルチャンバー・スライド上、ＦＣＳ培地中で、細胞を５０％集密まで増殖させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（０．１４Ｍホスフェート、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）中で希釈した４％パラホルムアルデヒド中、室温（ＲＴ）で３０分間、ウェルあたり３００マイクロリットルで、細胞の固定を行った。ＰＢＳ中の０．１Ｍグリシン中で、室温で２ｘ２０分間、反応停止を行った。ＰＢＳ中、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で、室温で１０分間、細胞の透過化を行った。次いで、０．３％サポニン＋ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、ＲＴで少なくとも１時間、ブロッキングを行った（ブロッキング溶液）。ブロッキング溶液中、＋４℃で１晩、一次抗体のインキュベーションを行った。ケースバイケースで、抗体の適切な希釈を決定しなければならない。０．３％サポニンを含有するＰＢＳ中、ＲＴで２ｘ２０分間、細胞を洗浄した。ブロッキング溶液中で、二次抗体のインキュベーションを行った。Ａｌｅｘａ５９４にカップリングしたヤギ抗ウサギを１：１０００に希釈し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ａｌｅｘａ４８８にカップリングしたヤギ抗マウスを１：１０００に希釈した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを標識した。Ｆ−アクチンを標識するのにファロイジンを用いた場合、該薬剤を１：５００に希釈し、そして二次抗体とインキュベーションした。細胞を、ＰＢＳ中、ＲＴで２ｘ２０分間洗浄した。過剰な緩衝液を取り除き、そしてアンチ・ブリーチング剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する培地中で細胞をマウントした。
【０１５９】
３．３．イムノブロット分析
ＴＡＰタグ化タンパク質の発現レベルを分析するため、細胞ペレット（６ウェルディッシュ由来）を６０μｌのＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（５％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．８％ ＮＰ−４０（ＩＧＥＰＡＬ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中、氷上で１５分間溶解した。各試料を２つのアリコットにスプリットした。最初の半分を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清中にＮＰ−４０抽出可能物質を得た；次の半分（全物質）を注意深くすりつぶした（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）。各５０μｇのＮＰ−４０抽出可能物質および全物質を、ＤＴＴ含有試料緩衝液と、シェーカー上、５０℃で３０分間混合し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、プレキャスト４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。次いで、不連続緩衝剤系で、半乾法を用いて、タンパク質をニトロセルロースにトランスファーした。簡潔には、ゲルおよびニトロセルロース膜を、陽極緩衝液（３層の緩衝液Ａ１（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）および３層の緩衝液Ａ２（０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ））または陰極緩衝液（３層の０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．４、０．１％ ＳＤＳ、４０ｍＭ □−アミノカプロン酸）のいずれかに浸したろ紙の間に積んだ。６００ｍＡで２５分間、同時に２つのゲルのエレクトロトランスファーを行った。トランスファー効率の対照とするため、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ溶液で、トランスファーしたタンパク質を１分間視覚化して、そして次いで、水中で脱染色した。ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ）中の５％脱脂粉乳で、室温で３０分間、膜をブロッキングした。
【０１６０】
続いて、ＨＲＰカップリングＰＡＰ抗体（５％ミルク／ＴＢＳＴ中、１：５０００に希釈）と室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳＴ中、１０分間、３回洗浄した。ブロット膜を最後に、化学発光基質（ＥＣＬ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に２分間浸し、そしてＸ線フィルムに曝露するか、またはイメージング・ステーション上で分析した。
【０１６１】
パート４ 精製またはタンパク質複合体
タンパク質複合体精製を、ＴＡＰタグ化タンパク質の細胞内局在に適応させ、そして以下に記載するように行った。
【０１６２】
４．１．細胞質タンパク質の溶解物調製
約１ｘ１０９の接着細胞（平均）を細胞スクレーパーで採取し、そして氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄した（３分間、５５０ｇ）。収集した細胞を液体窒素中で凍結するか、または直ちにさらにプロセシングした。細胞溶解のため、細胞ペレットを１０ｍｌのＣＺ溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；５％グリセロール；０．２％ ＩＧＥＰＡＬ；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；１００ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ；緩衝液２５ｍｌあたり１タブレットのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する）に再懸濁し、そして加圧型細胞破砕装置中、きつくはまったペッスルを１０回ストロークすることによって、ホモジナイズした。氷上で３０分間、溶解物をインキュベーションし、そして２０，０００ｇで１０分間回転させた。上清を、１００，０００ｇで１時間のさらなる超遠心工程に供した。上清を回収し、そして液体窒素中で迅速に凍結させるか、または直ちにさらにプロセシングした。
【０１６３】
４．２．膜タンパク質のための溶解物調製
約１ｘ１０９の接着細胞（平均）を細胞スクレーパーで採取し、そして氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄した（３分間、５５０ｇ）。収集した細胞を液体窒素中で凍結するか、または直ちにさらにプロセシングした。細胞溶解のため、細胞ペレットを１０ｍｌの膜溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；７．５％グリセロール；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ；緩衝液２５ｍｌあたり１タブレットのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する）に再懸濁し、そして加圧型細胞破砕装置中、きつくはまったペッスルを１０回ストロークすることによって、ホモジナイズした。溶解物を７５０ｇで１０分間回転させ、上清を回収し、そして１００，０００ｇで１時間の超遠心工程に供した。０．８％のｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含有する７．５ｍｌの膜溶解緩衝液に膜ペレットを再懸濁し、そして休まず攪拌しながら、４℃で１時間インキュベーションした。１００，０００ｇで１時間の別の超遠心工程に試料を供し、そして可溶化された物質を液体窒素中で迅速に凍結させるか、または直ちにさらにプロセシングした。
【０１６４】
４．３．核タンパク質のための溶解物調製
約１ｘ１０９の接着細胞（平均）を細胞スクレーパーで採取し、そして氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄した（３分間、５５０ｇ）。収集した細胞を液体窒素中で凍結するか、または直ちにさらにプロセシングした。細胞溶解のため、細胞ペレットを１０ｍｌの低張溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＫＣｌ；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ；緩衝液２５ｍｌあたり１タブレットのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する）に再懸濁し、そして加圧型細胞破砕装置中、きつくはまったペッスルを１０回ストロークすることによって、ホモジナイズした。溶解物を２，０００ｇで１０分間回転させ、そして生じた上清（Ｓ１）を氷上で保存した。核ペレット（Ｐ１）を５ｍｌの核溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；２０％グリセロール；４２０ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ；緩衝液２５ｍｌあたり１タブレットのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する）に再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベーションした。試料をＳ１と合わせ、７ｍｌの希釈緩衝液（１１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；０．７％ ＮＰ４０；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；２５ｍＭ ＮａＦ；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＤＴＴ）でさらに希釈し、氷上で１０分間インキュベーションし、そして１００，０００ｇで１時間遠心分離した。最終上清（Ｓ２）を液体窒素中で迅速に凍結させた。
【０１６５】
４．４．タンデムアフィニティー精製
凍結した溶解物を３７℃の水槽で迅速に融解し、そして１００，０００ｇで２０分間回転させた。上清を回収し、そして０．２ｍｌの定着した（ｓｅｔｔｌｅｄ）ウサギＩｇＧ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と、休みなく攪拌しながら４℃で２時間インキュベーションした。固定タンパク質複合体を１０ｍｌのＣＺ溶解緩衝液（５０ｍｌの緩衝液あたり１タブレットのＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）を含有する）で洗浄し、そしてさらに５ｍｌのＴＥＶ切断緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ ＩＧＥＰＡＬ；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。１５０μｌのＴＥＶ切断緩衝液中、５μｌのＴＥＶプロテアーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１０１２７−０１７）と、１６℃で１時間インキュベーションすることによって、タンパク質複合体を溶出させた。溶出液を回収し、そして０．２ｍｌ ＣＢＰ結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ ＩＧＥＰＡＬ；２ｍＭ ＭｇＡｃ；２ｍＭイミダゾール；１ｍＭ ＤＴＴ；４ｍＭ ＣａＣｌ２）中、０．２ｍｌの定着したカルモジュリン親和性ビーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と合わせ、その後、休みなく攪拌しながら４℃で１時間インキュベーションした。１０ｍｌのＣＢＰ洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ ＩＧＥＰＡＬ；１ｍＭ ＭｇＡｃ；１ｍＭイミダゾール；１ｍＭ ＤＴＴ；２ｍＭ ＣａＣｌ２）で固定タンパク質複合体を洗浄し、そして６００μｌ ＣＢＰ溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；５ｍＭ ＥＧＴＡ）の添加によって、３７℃で５分間溶出した。溶出物を、シリコン処理試験管に回収し、そして凍結乾燥した。残ったカルモジュリン樹脂を５０μｌ ４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で５分間煮沸した。試料緩衝液を単離し、凍結乾燥分画と合わせ、そしてＮｕＰＡＧＥ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４〜１２％、１．５ｍｍ、１０ウェル）上に装填した。
【０１６６】
パート５ 質量分析によるタンパク質同定
５．１．質量分析前のタンパク質消化
本質的に、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら， １９９６， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６８：８５０−８５８に記載される方法にしたがって、ゲル中で、ゲル分離したタンパク質を還元し、アルキル化し、そして消化した。簡潔には、ゲル分離したタンパク質を、清潔なメスを用いて、ゲルから切り出し、１０ｍＭ ＤＴＴ（５ｍＭ重炭酸アンモニウム中、５４℃、４５分間）を用いて還元し、そして続いて、５５ｍＭヨードアセトアミド（５ｍＭ重炭酸アンモニウム中）で、暗所中、室温でアルキル化した（３０分間）。還元し、そしてアルキル化したタンパク質を、５ｍＭ重炭酸アンモニウム中、１２．５ｎｇ／μｌのプロテアーゼ濃度のブタ・トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ゲル中で消化した。消化を３７℃で４時間進行させ、そして続いて、５μｌの５％ギ酸を用いて、反応を停止した。
【０１６７】
５．２．質量分析による分析前の試料調製
２０μｌの１％ ＴＦＡを用いて、ゲル・プラグを２回抽出し、そして酸性化した消化上清とともにプールした。真空遠心分離機中で試料を乾燥させ、そして１３μｌの１％ ＴＦＡ中に再懸濁した。
【０１６８】
５．３．質量分析データ収集
四極子ＴＯＦ（ＱＴＯＦ２、ＱＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ、ＱＴＯＦ Ｍｉｃｒｏ、ＭｉｃｒｏｍａｓｓまたはＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ、Ｓｃｉｅｘ）またはイオントラップ（ＬＣＱ Ｄｅｃａ ＸＰ）質量分析計いずれかに直接カップリングしたナノＬＣ系（ＣａｐＬＣ、ＷａｔｅｒｓまたはＵｌｔｉｍａｔｅ、Ｄｉｏｎｅｘ）に、ペプチド試料を注入した。水性溶媒および有機溶媒の勾配を用いて、ＬＣ系上でペプチドを分離した（以下を参照されたい）。溶媒Ａは０．５％ギ酸中の５％アセトニトリルであり、そして溶媒Ｂは、０．５％ギ酸中の７０％アセトニトリルであった。
【０１６９】
表１：ＬＣ系から溶出したペプチドを、質量分析計内で、部分的に配列決定した。
【０１７０】
【表１】
【０１７１】
５．４．タンパク質同定
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で得たペプチド質量および断片化データを用いて、ＮＣＢＩ（ＮＣＢＩｎｒ、ｄｂＥＳＴ、並びにヒトおよびマウスゲノムに関して）および欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエおよび線虫プロテオーム・データベースに関して）で、維持され、そして定期的に更新される、ｆａｓｔａ形式のタンパク質およびヌクレオチド配列データベースにクエリーを行った。測定したペプチド質量および断片化データを、ソフトウェア・ツール、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｐｅｒｋｉｎｓら， １９９９， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０：３５５１−３５６７）を用いてデータベース中のエントリーから計算した同じデータと相関させることによって、タンパク質を同定した。検索規準は、分析にどの質量分析計を用いたかに応じて、多様であった。
【０１７２】
（実施例２）
ｓｉＲＮＡが仲介するＡＴＰ７Ａのノックダウン
ＡＰＰプロセシングの既知のエフェクターであるＢＡＣＥ１およびニカストリンに対して向けられるｓｉＲＮＡ同様、ＡＴＰ７ＡをターゲットとするｓｉＲＮＡは、Ａβ１−４２分泌の有意な減弱を引き起こし、一方、Ｌｕｃ３ ｓｉＲＮＡは影響しないことが見出され（図１Ａ）、ＡＴＰ７Ａが、ＡＰＰのプロセシング／分泌を制御する際に機能的な役割を果たすことが立証された。
【０１７３】
さらに、ＡＴＰ７Ａ−ｓｉＲＮＡが、実際に、ＡＴＰ７Ａの発現に干渉することが確認された（図１Ｂ）。
２．１． ｓｉＲＮＡノックダウンおよび細胞性Ａβ１−４２アッセイ
ＡＰＰプロセシングのエフェクターとしてのＡＴＰ７Ａの機能的検証のため、ＲＮＡｉ遺伝子発現摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）戦略を使用した：ＡＴＰ７Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡ ＡおよびＢ、あるいはＡＰＰプロセシングの既知のエフェクターであるＢＡＣＥ１またはニカストリンに対して向けられるｓｉＲＮＡ、あるいは関連しないＬｕｃ３に対して向けられるｓｉＲＮＡを、ヒトＡＰＰ６９５を発現するＳＫ−Ｎ−ＢＥ２神経芽細胞にトランスフェクションした。ヒトＡＴＰ７Ａに対するｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって合成された。
【０１７４】
ＡＴＰ７Ａに対して用いるｓｉＲＮＡの配列は：ＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＧＧＧ（Ａ）およびＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴ（Ｂ）である。
製造者の指示にしたがって、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２細胞のトランスフェクションを行った。簡潔には、９６ウェルあたり最終体積８５μｌ中、１．０ｘ１０４細胞の密度で、トランスフェクション１２〜１６時間前に、細胞を植え付けた。２５ｎＭのｓｉＲＮＡを８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）および６０ｎｇのキャリアーＤＮＡと混合し、そして混合物を細胞に添加する前に、室温で２０分間インキュベーションした。トランスフェクション１６〜４８時間後、培地を、それぞれ血清を含むまたは含まない、１００μｌまたは２００μｌの増殖培地と交換した。トランスフェクション７２時間後、Ａβ１−４２ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）のため、１００μｌの上清を採取した。製造者の指示にしたがって、アッセイを行った。
【０１７５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、選択したｓｉＲＮＡのノックダウン効率を評価した。簡潔には、６ウェルあたり、５ｘ１０５ ＳＫＮＢＥ２細胞を蒔き、そして翌日、２５ｎＭ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション３６時間後、細胞を採取し、そして標準法を用いて、総ＲＮＡを調製し、そして逆転写した。製造者の指示にしたがって、ＡＴＰ７Ａの相対発現レベルを決定するため、等量のｃＤＮＡおよびＡＴＰ７Ａ特異的プライマーを利用した。すべての値を、ヒト参照ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対して標準化した。
【０１７６】
（実施例３）
ＡＴＰ７Ａ活性の決定
３．１ 酵母における機能的補完アッセイ
Ｃｃｃ２ｐの機能が損なわれたサッカロミセス・セレビシエ株では、フェロキシダーゼＦｅｔ３ｐが機能不全であり、鉄欠乏表現型を生じる。ＡＴＰ７Ｂ（Ｈｉｓら、２００４）またはＡＴＰ７Ａなどのヒト銅輸送ＡＴＰアーゼを発現させると、この表現型が補完される。その結果、鉄欠乏表現型の機能的補完の度合いを測定することによって、すなわち鉄制限培地中で酵母細胞が増殖する能力を定量化することによって、ＡＴＰ７Ａの活性を定量化することも可能である。
【０１７７】
したがって、前記の機能的補完と反対に作用する能力によって、すなわち鉄制限培地における増殖を停止させる能力によって、ＡＴＰ７Ａの阻害剤を同定することも可能である。
【０１７８】
３．２ ＡＴＰ７Ａを発現するｃｃｃ２ｐ欠損酵母における、フェロキシダーゼ活性の測定
上に概略する表現型アプローチに加えて、ＡＴＰ７Ａ活性を定量化するための銅輸送機能のより高感度の指標（Ｈｓｉら、２００４）として、ｃｃｐ２ｐ欠損酵母株において、フェロキシダーゼ活性を測定することもまた、可能である。
【０１７９】
３．３ ＡＴＰアーゼ活性の測定
いくつかのアッセイの多くは、公知のものとして当業者に周知である。例えば、ピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ共役アッセイによって、あるいは固定した時間間隔で、ホスフェート放出を測定する、比色アッセイによって、ＡＴＰ７Ａ（例えばＴＡＰ−ＡＴＰ７Ａの精製によって得られるようなもの）の金属イオン依存性ＡＴＰアーゼ活性を、３７℃でアッセイする（Ｈｏｕら、２００１および該文献の参考文献）。
【０１８０】
３．４ 銅に誘導される毒性に対する感受性の測定
細胞の銅の流出を測定することによって、または他の金属に対してではなく銅に対する細胞の感受性を定量化することによってもまた、ＡＴＰ７Ａの活性を測定することも可能である（Ｈｏｕら、２００１）。
【０１８１】
したがって、ＡＴＰ７Ａの阻害剤は、細胞の銅流出を減弱させ、他の金属に対してではなく銅に対する細胞の感受性を変化させる剤として、同定される（Ｈｏｕら、２００１）。
【０１８２】
３．５ ６４Ｃｕ集積の安定状態測定
細胞内銅（好ましくは６４Ｃｕ）集積を測定することによってもまた、ＡＴＰ７Ａの活性を測定することも可能である（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍら、２００４）。
【０１８３】
ＡＴＰ７Ａの阻害剤を、細胞内銅（好ましくは６４Ｃｕ）集積を引き起こす剤として、同定することも可能である（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍら、２００４）。
（実施例４）
ＡＴＰ７Ａ調節剤による、Ａβ１−４２生成／分泌の調節
ヒトＡＰＰ６９５を安定に過剰発現するＳＫＮＢＥ２細胞（ＳＫＮＢＥ２／ＡＰＰ６９５）（または別の適切な細胞株）またはベータ−／ガンマ−セクレターゼ切断反応速度が増進した適切な突然変異体を増殖培地中で蒔き、そして翌朝、４時間、血清枯渇させた。次いで、血清不含培地中で希釈した、ＡＴＰ７Ａ調節剤、好ましくは阻害剤を添加し、そして適切な期間、インキュベーションした。細胞上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡ（ＩＮＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ Ｎ．Ｖ．、Ｂｅｌｇｉｕｍ ＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓのＩｎｎｏｔｅｓｔ β−アミロイド（１−４２））によって、Ａβ１−４２のレベルを決定した。
【０１８４】
本発明は図面に、より詳細に記載される。
参考文献
【０１８５】
【表２】
【０１８６】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１：ＳｉＲＮＡが仲介するＡＴＰ７Ａ発現のノックダウンは、Ａβ１−４２の分泌を減弱する。 図１Ａ：ＢＡＣＥ１、ニカストリン、ＡＴＰ７Ａ（ｓｉＲＮＡ ＡまたはｓｉＲＮＡ Ｂ）またはＬｕｃ３に対して向けられるＳｉＲＮＡを、ＡＰＰ６９５を過剰発現するＳＫ−Ｎ−ＢＥ２神経芽腫細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、増殖培地を取り除き、そして細胞を血清不含培地中で１晩インキュベーションした。上清を収集し、そしてＡβ１−４２レベルをＥＬＩＳＡ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）によって決定した。少なくとも３回の独立実験を２つ組で行った。代表的な例を示す。
【０１８８】
図１Ｂ：ＡＴＰ７Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＡおよびｓｉＲＮＡ Ｂ）は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析で評価した際、ＡＴＰ７Ａ ｍＲＮＡを特異的に減少させたが、関連しないＬｕｃ３に対して向けられるｓｉＲＮＡは、該ｍＲＮＡを減少させなかった。各ｓｉＲＮＡを示す２つのバーは、２つの独立実験に相当する。
【図２】図２：１文字コードで示す、ヒトＡＴＰ７Ａ（銅輸送ＡＴＰアーゼ１）のアミノ酸配列。
【図３】図３：ヒトＡＴＰ７ＡおよびＡＴＰ７Ｂの複数配列並列。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経生成（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患治療用の薬剤組成物を調製するための、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子の使用。
【請求項２】
ＡＴＰ７Ａ相互作用分子がＡＴＰ７Ａ阻害剤である、請求項１の使用。
【請求項３】
阻害剤が、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）からなる群より選択される、請求項２の使用。
【請求項４】
ＡＴＰ７Ａが細胞内タンパク質複合体の一部である、請求項１〜３のいずれかの使用。
【請求項５】
相互作用分子または阻害剤が、ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの活性を調節する、請求項１〜４のいずれかの使用。
【請求項６】
神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患がアルツハイマー病である、請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項７】
ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤を同定する方法であって：
ａ．既定の試験化合物がＡＴＰ７Ａ相互作用分子であるかどうか決定することによって、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子を同定し、
ｂ．工程ａ）のＡＴＰ７Ａ相互作用分子がガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの活性を調節可能であるかどうか決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項８】
工程ａ）において、試験化合物をＡＴＰ７Ａと接触させ、そして試験化合物とＡＴＰ７Ａの相互作用を決定する、請求項７の方法。
【請求項９】
ＡＴＰ７Ａと試験化合物の相互作用がＡＴＰ７Ａ活性の阻害を生じる、請求項８の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において、ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼがＡＰＰを切断する能力を測定する、好ましくはＡベータ４２を産生する能力を測定する、請求項７〜９のいずれかの方法。
【請求項１１】
神経変性疾患治療用の薬剤組成物を調製するための方法であって：
ａ．請求項７〜１０にしたがって、ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤を同定し、そして
ｂ．ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤を薬剤組成物に配合する
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
同定された分子と薬学的に許容しうるキャリアーを混合する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに定義されるようなＡＴＰ７Ａ阻害剤を含む、薬剤組成物。
【請求項１４】
請求項１１または１２のいずれかに記載の方法によって得られうる、薬剤組成物。
【請求項１５】
アルツハイマー病などの神経変性疾患および関連する神経変性障害の治療用の、請求項１３または１４のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を治療するかまたは予防する方法であって、こうした治療または予防の必要がある被験者に、請求項１３〜１５のいずれかの薬剤組成物の療法的有効量を投与する、前記方法。
【請求項１７】
ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ−セクレターゼの活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで調節するための、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子の使用。
【請求項１】
神経生成（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患治療用の薬剤組成物を調製するための、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子の使用。
【請求項２】
ＡＴＰ７Ａ相互作用分子がＡＴＰ７Ａ阻害剤である、請求項１の使用。
【請求項３】
阻害剤が、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）からなる群より選択される、請求項２の使用。
【請求項４】
ＡＴＰ７Ａが細胞内タンパク質複合体の一部である、請求項１〜３のいずれかの使用。
【請求項５】
相互作用分子または阻害剤が、ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの活性を調節する、請求項１〜４のいずれかの使用。
【請求項６】
神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患がアルツハイマー病である、請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項７】
ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤を同定する方法であって：
ａ．既定の試験化合物がＡＴＰ７Ａ相互作用分子であるかどうか決定することによって、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子を同定し、
ｂ．工程ａ）のＡＴＰ７Ａ相互作用分子がガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの活性を調節可能であるかどうか決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項８】
工程ａ）において、試験化合物をＡＴＰ７Ａと接触させ、そして試験化合物とＡＴＰ７Ａの相互作用を決定する、請求項７の方法。
【請求項９】
ＡＴＰ７Ａと試験化合物の相互作用がＡＴＰ７Ａ活性の阻害を生じる、請求項８の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において、ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼがＡＰＰを切断する能力を測定する、好ましくはＡベータ４２を産生する能力を測定する、請求項７〜９のいずれかの方法。
【請求項１１】
神経変性疾患治療用の薬剤組成物を調製するための方法であって：
ａ．請求項７〜１０にしたがって、ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤を同定し、そして
ｂ．ガンマ−セクレターゼおよび／またはベータ−セクレターゼの調節剤を薬剤組成物に配合する
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
同定された分子と薬学的に許容しうるキャリアーを混合する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに定義されるようなＡＴＰ７Ａ阻害剤を含む、薬剤組成物。
【請求項１４】
請求項１１または１２のいずれかに記載の方法によって得られうる、薬剤組成物。
【請求項１５】
アルツハイマー病などの神経変性疾患および関連する神経変性障害の治療用の、請求項１３または１４のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を治療するかまたは予防する方法であって、こうした治療または予防の必要がある被験者に、請求項１３〜１５のいずれかの薬剤組成物の療法的有効量を投与する、前記方法。
【請求項１７】
ベータ−セクレターゼおよび／またはガンマ−セクレターゼの活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで調節するための、ＡＴＰ７Ａ相互作用分子の使用。
【図２】
【図１】
【図３】
【図１】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２３８９３（Ｐ２００７−５２３８９３Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４９８９４（Ｐ２００６−５４９８９４）
【出願日】平成１６年１１月２９日（２００４．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１３５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６３２
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５０５０２２１０５）セルゾーム・アクチェンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＺＯＭＥ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２９日（２００４．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１３５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６３２
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５０５０２２１０５）セルゾーム・アクチェンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＺＯＭＥ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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