ＣＤ９９アンタゴニストを用いる慢性関節リウマチの処置
本発明は、慢性関節リウマチおよびその症状を処置する新規な方法ならびに慢性関節リウマチおよびその臨床症状の処置において有用な薬物を同定およびスクリーニングする新規な方法を含む。ヒトリウマチ関節のコンピュータモデルの標的化操作は、一部の癌に対する効果を有することが既知である接着分子、ＣＤ９９の活性が慢性関節リウマチの病態生理学に著しい影響を有するという驚くべき結果を提供した。ＣＤ９９の活性の阻害は、慢性関節リウマチの症状を軽減することが予想される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．緒言）
（Ａ．関連出願）
本出願は、２００３年９月１１日に提出され、本明細書中に参考として援用される米国特許仮出願番号６０／５０２，３４５の利益を請求する。
【０００２】
（Ｂ．発明の分野）
本発明は、慢性関節リウマチを処置する新規な方法および慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（Ｃ．発明の背景）
１００を超える種類の関節炎があり、そのうち慢性関節リウマチは最も痛く壊滅的な種類である。関節の一般的な疾患である慢性関節リウマチは、２００万人を超えるアメリカ人に影響を及ぼしている自己免疫疾患であり、男性よりも女性の間で発生率が著しく高い。慢性関節リウマチでは、関節を裏打ちする膜または組織（滑膜）が炎症（滑膜炎）を起こすようになる。時間と共に炎症は関節組織を破壊して、身体障害を引き起こす。慢性関節リウマチは体の複数の臓器に影響を及ぼしうるため、慢性関節リウマチは全身病と呼ばれ、時にはリウマチ様疾患と呼ばれる。リウマチ様疾患の発症は通常は中年においてであるが、その２０代または３０代に頻繁に発生する。
【０００４】
リウマチ様疾患に関連する疼痛および全身（全身性）症状は、身体に障害を引き起こすことがある。時間と共に慢性関節リウマチは関節破壊を生じて、変形および日常活動の困難につながる。慢性関節リウマチを患った人々が、疼痛および進行性身体障害によって引き起こされるある程度の鬱病に苦しむことは珍しいことではない。ある研究は、慢性関節リウマチを患った人々の４分の１がその診断の６〜７年後に働くことができず、半分が２０年後に働くことができないということを報告している（Ｏ’Ｄｅｌｌ ＪＲ（２００１）．Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｉｃｔｕｒｅ．Ｉｎ ＷＪ Ｋｏｏｐｍａｎ，ｅｄ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１４ｔｈ ｅｄ．，ｖｏｌ．１，ｃｈａｐ．５８，ｐｐ．１１５３−１１８６．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。慢性関節リウマチなどの筋骨格状態は、逸失賃金および生産などの間接出費として、米国経済に毎年６５０億円近くを費やさせている。
【０００５】
滑膜炎症、軟骨の急速な破壊および罹患関節における骨の侵食が慢性関節リウマチ（ＲＡ）の特徴である。近年の証明により、骨格組織の破壊および炎症がリウマチ関節における重複しているが同一でない生物プロセスによって調節されることと、これらの２つの局面に対する治療効果が相関する必要がないこととが示されている。関節における生物プロセスの複雑さのために、数学およびコンピュータモデルの使用は、種々の組織対応物、細胞タイプ、メディエータ、関節疾患および健全なホメオスタシスに関与する他の因子間の相互作用をよりよく理解するのに役立つ。複数の研究者が、慢性関節リウマチの生物プロセスではなくむしろ、関節の機械的環境の簡単なモデルを構築して、結果を軟骨および骨の疾患および発育のパターンと比較した（Ｗｙｎａｒｓｋｙ ＆ Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．，１６：２４１−２５１，１９８３；Ｐｏｌｌａｔｓｃｈｅｋ ＆ Ｎａｈｉｒ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１４３：４９７−５０５，１９９０；Ｂｅａｕｐｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，３７：１４５−１５１，２０００；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ，１７：６４６−６５３，１９９９）。コンピュータで扱うことができる関節疾患の数学モデルは、滑膜を含む複数のコンパートメントを含み、これらのコンパートメントの相互作用は、２００２年１２月５日に公開された国際公開番号ＷＯ０２／０９７７０６および２００３年４月２４日に２００３−００７８７５９として公開された米国特許出願番号１０／１５４，１２３に述べられている。どちらの公報も参考としてその全体が援用される。
【０００６】
慢性関節リウマチは、現在、制御できるが治癒できない慢性疾患である。処置の目標は、症状の軽減および疾患を悪化させないことである。慢性関節リウマチの大半の処置の目標は、疼痛を軽減し、炎症を減少させ、関節損傷の進行を遅延または停止させて、人が機能する能力を改善することである。処置への現在の手法は、ライフスタイルの変化、薬剤、外科手術、ならびに日常的監視およびケアを含む。慢性関節リウマチの処置に使用される薬剤は、疾患の進行に影響を与える方法に基づいて２つの群：（１）症状緩和薬および（２）疾患改変薬に分類できる。
【０００７】
症状、例えば、疼痛、硬直、および腫脹を軽減するための薬剤が使用される。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン、イブプロフェン、およびナプロキセン）は、疼痛を制御するために使用され、炎症を減少させるのに役立つ。これらの抗炎症薬は、疾患を制御せず、または疾患が悪化するのを停止しない。コルチコステロイド、例えば、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン（メドロール）は、疼痛を制御して、炎症を減少させるために使用する。それらは疾患を制御して、疾患が悪化するのを停止させる；しかしながら、コルチコステロイドを長期に亘る唯一の療法として使用することは、最良の処置とは見なされない。コルチコステロイドは、最大６ヶ月かかりうる抗リウマチ薬がその全有効性に達するときまで、関節炎症の拡大を制御するために使用されることが多い。非処方薬剤（例えば、アセトアミノフェン）および局所用薬剤（例えば、カプサイシン）は疼痛を制御するために使用されるが、通常、関節腫脹または疾患の悪化に影響を及ぼさない。
【０００８】
疾患改変抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）は、慢性関節リウマチの進行を制御し、関節破壊および身体障害の防止を試みるために使用される。これらの抗リウマチ薬は、他の抗リウマチ薬と、または他の薬剤、例えば、非ステロイド性抗炎症薬と組合せて投与されることが多い。慢性関節リウマチに一般に処方される疾患改変抗リウマチ薬としては、抗マラリア薬剤、例えば、ヒドロキシクロロキン（プラケニル）またはクロロキン（アラレン）、メトトレキサート、例えば、リウマトレックス、スルファサラジン（アザルフィジン）、レフルノミド（アラバ）、エタネルセプト（エンブレル）、インフリキシマブ（レミケード）、およびアナキンラ（キネレット）が挙げられる。慢性関節リウマチにはあまり一般的に処方されないＤＭＡＲＤは、アザチオプリン（イムラン）、ペニシラミン（例えば、キュプリミンまたはデペン）、金塩（例えば、リドーラまたはＡｕｒｏｌａｔｅ）、ミノサイクリン（例えば、ダイナシンまたはミノシン）、シクロスポリン（例えば、ネオーラルまたはサンディミュン）、およびシクロホスファミド（例えば、シトキサンまたはネオサル）を含む。これらの抗リウマチ薬は、作用するまで最大６ヶ月かかることがある。多くは重篤な副作用を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ慢性関節リウマチの処置のための新しい、治療的に有効な薬物への要求はもちろんのこと、そのような薬物を同定する新しい方法への要求も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（Ｄ．発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、慢性関節リウマチを有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。ＣＤ９９活性のアンタゴニストは、タンパク質、核酸または小分子インヒビターでありうる。「小分子」は本明細書では、１０００ダルトン未満の分子量を有する分子として定義される。好ましいタンパク質アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。好ましい核酸アンタゴニストは、ＣＤ９９をコード化する遺伝子、ｍｉｃ２のアンチセンスインヒビターを含む。好ましい実施形態において、患者は、メトトレキサート耐性患者、ＴＮＦ−α遮断軟骨不応答者（ＣＮＲ）、ＴＮＦ−α遮断過形成不応答者（ＨＮＲ）、またはＴＮＦ−α遮断二重不応答者（ＤＮＲ）である。
【００１１】
本発明の別の局面は、異常に上昇した滑膜細胞密度に関連する状態を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、関節内の滑膜細胞の密度を低下させる方法を提供する。
【００１２】
本発明は、異常に高い割合の軟骨破壊に関連する状態を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、関節内の軟骨破壊を減少させる方法も提供する。
【００１３】
本発明の局面は、滑膜組織中のＩＬ−６の異常に高い濃度に関連する状態を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、滑膜組織中のＩＬ−６濃度を低下させる方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の局面は、異常に高い割合の骨びらんに関連する状態を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与することを含む、関節内の骨びらんを低減する方法を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、炎症性疾患を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、炎症性疾患の少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。好ましい実施形態において、炎症性疾患は、糖尿病、動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、炎症性大動脈瘤、再狭窄、虚血／再潅流傷害、糸球体腎炎、再狭窄、再潅流傷害、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ライター症候群、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、股関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、骨盤腹膜炎、多発性硬化症、糖尿病、骨髄炎、癒着性関節包炎、少数関節炎、変形性関節炎、関節周囲炎、多発性関節炎、乾癬、スティル病、滑膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、および炎症性皮膚疾患からなる群より選択される。さらに好ましくは、炎症性疾患は、関節炎、例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、股関節炎、骨関節炎、または多発性関節炎である。最も好ましくは、炎症性疾患は慢性関節リウマチである。
【００１６】
本発明のなお別の局面は、化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が、該化合物の非存在下で移動する白血球の量より少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程と；を含む方法を提供する。好ましい実施形態において、内皮細胞は、場合によりインターロイキン−１の腫瘍壊死因子によって刺激された、培養ヒト臍静脈内皮細胞である。別の好ましい実施形態において、内皮細胞の少なくとも１つの層は内皮細胞の単層である。本発明の別の局面は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストを同定する工程と、同定されたアンタゴニストをヒトが消費するために配合する工程とを含む、慢性関節リウマチの処置で使用する薬物を製造する方法を含む。好ましい実施形態において、白血球は単球またはＴ細胞のどちらかである。
【００１７】
本発明の局面は、炎症性疾患の処置に有用な化合物を同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量を該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量が、該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量より少ないときに、該化合物を炎症性疾患の処置に有用であるとして同定する工程と；を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下でのＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量より少ないときに、慢性関節リウマチの処置に有用であるとして同定する工程と；を含む方法を提供する。本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞サイトカインはＴｈ１サイトカインである。好ましくは、測定されたＴｈ１サイトカインはＴＮＦ−αまたはＩＦＮγである。本発明の別の実施形態は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストを同定する工程と、同定されたアンタゴニストをヒトが消費するために調剤する工程とを含む、慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法を含む。
【００１９】
本発明の別の局面は、慢性関節リウマチの処置に有用な薬物を同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から増殖したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から増殖したＴ細胞の数と比較する工程であって、非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および化合物への曝露前には第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、工程と；（ｂ）該化合物の存在下で発現したＴ細胞の数が、該化合物の非存在下で増殖したＴ細胞の数よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程と；を含む方法を提供する。本発明の別の実施形態は、ＣＤ活性のアンタゴニストを同定する工程と、同定されたアンタゴニストをヒトが消費するために配合する工程とを含む、慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法を含む。
【００２０】
本発明のなお別の局面は、慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって：（ａ）該集合の化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が、該化合物の非存在下で移動する白血球の量よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして選択する工程と；を含む方法を提供する。好ましくは、これらの工程は集合の各化合物について反復され、集合の少なくとも１つの化合物がＣＤ９９活性のアンタゴニストとして選択される。
【００２１】
本発明のなお別の局面は、慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって、（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴｈ１サイトカインの量を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴｈ１サイトカインの量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴｈ１サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴｈ１サイトカインの量よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程と；を含む方法を提供する。好ましくは測定されたＴｈ１サイトカインは、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγである。
【００２２】
本発明の局面は、炎症性疾患の処置に有用な化合物を同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量を該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量を比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量が、該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量よりも少ないときに、該化合物を炎症性疾患の処置に有用であるとして同定する工程と；を含む方法を提供する。
【００２３】
（ＩＩ．図面の簡単な説明）
本発明のある実施形態の性質および目的をさらに理解するために、添付図面と併せて以下の詳細な説明を参照すべきである。
【００２４】
（ＩＩＩ．詳細な説明）
（Ａ．概要）
一般に本発明は、炎症性疾患、例えば、慢性関節リウマチを処置する新規な方法、および炎症性疾患およびその臨床症状の処置に有用な薬物を同定およびスクリーニングする新規な方法を含むとして見ることができる。ヒトリウマチ関節のコンピュータモデルの使用を通して、本発明者らは、一部の癌に対して効果を有することが既知である接着分子、ＣＤ９９の活性が慢性関節リウマチの病態生理学に著しい影響を有することを発見した。ＣＤ９９の活性の阻害は、炎症性疾患、例えば、慢性関節リウマチの症状を軽減することが予測される。
【００２５】
（Ｂ．定義）
「滑膜組織におけるＩＬ−６の異常に高い濃度」という用語は、本明細書で使用するように、正常な非罹患関節で見られるレベルより、標準偏差の少なくとも３倍高い罹患関節の滑膜組織におけるＩＬ−６のレベルを指す。
【００２６】
「異常に高い割合の骨びらん」という用語は、本明細書で使用するように、標準Ｘ線撮影方法によって決定される骨の少なくとも１つの寸法の検出可能な減少を指す。
【００２７】
「異常に高い割合の軟骨破壊」という用語は、本明細書で使用するように、標準Ｘ線撮影方法によって決定される、検出可能な関節空間の狭窄を指す。非罹患関節では、狭窄は検知できない。
【００２８】
「異常に上昇した滑膜細胞密度」という用語は、本明細書で使用するように、関節の滑膜組織が、正常な、すなわち非罹患関節の滑膜組織に見られる滑膜細胞の数の少なくとも１０倍である多数の滑膜細胞を含有する状態を指す。
【００２９】
「投与する工程」は、当業者に既知の医薬組成物を投与する標準方法のいずれかを意味する。例としては、静脈内、筋肉内または腹腔内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「ＣＤ９９活性のアンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用するように、慢性関節リウマチに関連することが示されたＣＤ９９の４つ生物活性：（１）単球補充、（２）Ｔ細胞増殖、（３）Ｔ細胞活性化および（４）Ｔ細胞補充のいずれか１つを阻害する特性を指す。阻害は、拮抗性であるために、阻害は１００％有効である必要はない。
【００３１】
「薬物」という用語は、既知または未知の生物機構によって生体系に影響を及ぼしうる、治療的に使用されるまたは使用されない、いずれかの程度の複雑さの化合物を指す。薬物の例は、研究または治療上の興味がある代表的な小分子；天然に存在する因子（例えば、エンドクリン、パラクリン、またはオートクライン因子）、抗体、あるいはいずれかの種類の細胞レセプターと相互作用する因子；細胞内因子（例えば、細胞内シグナル伝達経路の要素；他の天然源から単離された因子）；農薬；除草剤；および殺虫剤を含む。薬物は、遺伝子療法で使用される薬剤、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡも含む。また抗体、ウィルス、細菌、ならびに細菌およびウィルスによって産生された生物活性剤（例えば、毒素）も薬物と見なすことができる。薬物に対する応答は、例えば、ＲＮＡの１つ以上の種の転写または分解における薬物媒介変化、１つ以上のポリペプチドの翻訳または翻訳後処理の割合または程度における薬物媒介変化、１つ以上のタンパク質の分解の割合または程度における薬物媒介変化、１つ以上のタンパク質の作用または活性の薬物媒介阻害または刺激などの結果でありうる。ある例において、薬物は、タンパク質と相互作用することによってその効果を働かせることができる。ある用途では、薬物は例えば、１つ以上の薬物を含む組成物または１つ以上の薬物および１つ以上の賦形剤を含む組成物を含むこともできる。
【００３２】
「炎症性疾患」は、以下のいずれか１つ：炎症性応答のトリガ；炎症性カスケードのいずれかのメンバーのアップレギュレーション；炎症性カスケードのいずれかのメンバーのダウンレギュレーションを特徴とする、さまざまな疾患および障害のクラスを指す。炎症性疾患は、糖尿病、動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、炎症性大動脈瘤、再狭窄、虚血／再潅流傷害、糸球体腎炎、再狭窄、再潅流傷害、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ライター症候群、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、強直性脊椎炎、股関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、骨盤腹膜炎、多発性硬化症、糖尿病、骨髄炎、癒着性関節包炎、少数関節炎、変形性関節炎、関節周囲炎、多発性関節炎、乾癬、スティル病、滑膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、および炎症性皮膚疾患を含む。単数形の用語「炎症性疾患」は、炎症性疾患のクラスから選択されるいずれかの１つ以上の疾患を含み、疾患状態の成分が炎症性疾患のクラスから選択される疾患を含み、そしていずれかの複合および複雑な疾患状態を含む。
【００３３】
「関節」という用語は、本明細書で使用するように、滑膜組織、滑膜液、関節軟骨、骨組織、ならびにその細胞および細胞外構成物、そしてそれらが含有する溶解性メディエータを含む。
【００３４】
「メトトレキサート不応答者」という用語は、メトトレキサート処置に効果的に応答しない、またはメトトレキサートに最初は応答するが、時間が経つにつれて不応となる慢性関節リウマチ患者を指す。
【００３５】
「ＴＮＦ−α遮断軟骨不応答者」という用語は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、低下した滑膜過形成を示すが、軟骨破壊の最小限の低下を示す、低い初期ＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者を指す。
【００３６】
「ＴＮＦ−α遮断過形成不応答者」という用語は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、軟骨破壊の改善を生じるが、滑膜過形成のわずかな低下を生じる、異常に高いまたは耐性レベルのＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者を指す。
【００３７】
「ＴＮＦ−α遮断二重不応答者」という用語は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、滑膜過形成および軟骨破壊の両方で低い応答を示す、無視できる初期ＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者を指す。
【００３８】
「患者」という用語は、いずれかの温血動物、好ましくはヒトを指す。慢性関節リウマチを有する患者は、慢性関節リウマチと診断された患者、慢性関節リウマチに関連する症状の１つ以上を示す患者、あるいは慢性関節リウマチを発症するリスクに向かって進行している、またはリスクに瀕している患者を含むことができる。
【００３９】
本発明の薬物の「治療有効量」は本明細書で使用するように、リウマチ関節における滑膜細胞の増加またはリウマチ関節での軟骨破壊率の低下または滑膜組織でのＩＬ−６濃度の低下または骨びらん率の低下を示し、それにより慢性関節リウマチに関連する疼痛および炎症の後退および緩和を引き起こす、化合物の量を意味するものである。
【００４０】
（Ｃ．慢性関節リウマチ関節のインシリコモデル化）
本発明は、関節炎関節のインシリコモデルから得た結果を利用する。モデルは、慢性関節リウマチに罹患したヒト関節の生物学的状態に関連する動的過程の数学的表現を提供する。コンピュータモデルに含まれる主なコンパートメントは、この原型的な慢性関節リウマチ関節の軟骨−パンヌス接合部における滑膜組織および軟骨を表現する。現在のモデルは、以下を含む、軟骨代謝、組織炎症および組織過形成に関与する過程に関連する種々の生物学的変数を考慮する：
・補充、活性化、増殖、アポトーシスおよびその調節を含むマクロファージ個体群動態
・補充、抗原依存性および抗原独立性活性化、増殖、アポトーシスおよびその調節を含むＴ細胞個体群動態
・組織での流入、増殖およびアポトーシスならびにその調節を含む線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）個体群動態
・増殖およびアポトーシスを含む軟骨細胞個体群動態
・表現された異なるＴ細胞型による（マクロファージ、ＦＬＳ、Ｔ細胞、軟骨細胞）成長因子、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質分解酵素およびマトリクスタンパク質を含む、種々のタンパク質の合成および調節
・滑膜組織と軟骨との間でのメディエーターの内皮細胞拡散による接着分子の発現
・サイトカインまたはプロテアーゼおよびその天然インヒビターとの間の相互作用、抗原提示
・細胞メディエーター（抗ＴＮＦ−α剤（例えば、エタネルセプトおよびインフリキシマブ）およびＩＬ−１ ＲＡアンタゴニスト（例えば、アナキンラ））への治療薬剤の結合。
このモデルは、滑膜組織密度および血管体積もモニターする。さらに、数学モデルは治療薬剤（例えば、メトトレキサート、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、溶解性ＴＮＦ−αレセプター、ＴＮＦ−α抗体およびインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト）の効果を考慮できる。
【００４１】
インシリコモデル化は、システムの制御原理を再現するために関連する生物学的−ゲノム、プロテオミクスおよび生理学的−データをコンピュータベースのプラットフォームに統合する手法である。定義された疾患状態の初期条件のセットを考えると、これらのコンピュータモデルは、システムの将来の生物学的挙動、バイオシミュレーションと呼ばれる過程をシミュレートできる。
【００４２】
（１．慢性関節リウマチモデル化のトップダウン手法）
本発明のコンピュータモデルは、慢性関節リウマチを示す挙動の一般的なセットを定義することによって開始した「トップダウン」手法を使用して構築した。これらの挙動は、次にシステムへの制約として使用され、内在する詳細の次のレベルを定義するために、ネスト化されたサブシステムのセットが開発される。例えば、慢性関節リウマチにおける軟骨破壊の挙動を考えると、その挙動を含む特定の機構が次にそれぞれモデル化され、サブシステムのセットを生じ、それ自体は分解され、細部にわたってモデル化される。したがってこれらのサブシステムの制御および状況は、システムの動態を全体として特徴付ける挙動によってすでに定義されている。分解過程は、慢性関節リウマチの既知の生物学的挙動を反復するのに十分な詳細が存在するまで、トップダウンからより多くの生物学的モデル化を継続する。
【００４３】
トップダウン手法を使用するときに、（１）基本生物学を説明する、（２）システム全体の生理的機能または挙動を説明する、という２つの具体的な目的を支持するために、公開データおよび独占データが識別および収集される。システム全体の生理的機能または挙動を説明するデータは、モデル開発の早期に選択される。これらのデータは、モデルシステムの広範囲に亘る挙動、例えば、慢性関節リウマチ患者の測定値（挙動）としての軟骨破壊を表す。これらのデータは、十分に確立された臨床試験に基づくヒトインビボデータである。基本生物学を説明するデータは、選択した挙動をシミュレートするのに必要なサブシステムを十分にモデル化するために選択される。これらのデータは、内在する生物学の知識を提供する、ヒトまたは動物（ヒトが好ましいが、必ずしも利用可能ではない場合）のインビボデータ、インビトロデータまたはエクスビボデータでありうる。
【００４４】
このモデル化手法は、サブシステムレベルで生物学を操作して、シミュレートされた挙動をシステムレベルで観察することによって、研究者に「仮定．．．」シナリオを提示および迅速に開発させる。この手法を通じて、研究者は、一般に受入れられているが、なお証明されていない仮説との不一致を発見し、科学者が利用可能なおびただしい量のインビトロデータおよびインビボデータからの重要な知識ギャップを識別することができる。不一致および知識ギャップが識別されるときに、モデルを使用すると、より焦点の合った、よりよく設計された具体的なデータ収集作業に注力することができ、それらはさらに予測的で効率的に利用されるデータを生じる。
【００４５】
トップダウン手法は、ヒト関節における慢性関節リウマチのモデルを開発するのに使用された。同様のモデルは、２００３年４月２４日に２００３−００７８７５９として公開された、同時係属Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １０／１５４，１２３で述べられている。現在のモデルでは、４つの重要な臨床結果：滑膜細胞密度、軟骨破壊率、滑膜組織中のＩＬ−６のレベルおよび骨びらん率に特に興味がある。慢性関節リウマチは、末梢血中の炎症誘発性サイトカイン、特にＩＬ−６のレベル上昇を伴う全身性炎症性疾患である：Ｃ応答性タンパク質（ＣＲＰ）は、血漿中で日常的に測定される炎症の一般的なマーカーであり、複数の研究が慢性関節リウマチ患者でのＩＬ−６濃度とＣＲＰ濃度の相関を示している。したがって関節中または血漿中のどちらかのＩＬ−６濃度は、炎症の良好なマーカーとなる。
【００４６】
（２．感受性解析）
疾患の内在する生物学の明示的な表現は、特定の臨床結果、例えば、軟骨破壊または滑膜細胞密度に対して最も影響のあるサブシステムを識別するために、単独でのまたは組合された各サブシステムの調節を可能にする。表現型開始および進行または慢性関節リウマチに最大の影響を持つこれらのサブシステムのモデル化およびデータ収集作業に集中することによって、この手法は、システムの複雑さをさらに明確に表現して、慢性関節リウマチの病態生理学に内在する原因因子を識別するのに役立つ。インシリコで各システムを調節する（例えば、１つの細胞種または細胞間メディエーターをノックアウトする、あるいは１つの特定の生物プロセスを遮断する）ことによって、慢性関節リウマチを促進する生物学的現象をよりよく理解し、それゆえ最良の、最も関連する標的を識別するために、疾患病態生理学全体へのその寄与を評価することができる。
【００４７】
慢性関節リウマチの場合、疾患状態は、例えば、疾患状態を引き起こす、疾患状態に影響を及ぼす、または疾患状態によって改変される１つ以上の生物プロセスを示すことのできる酵素活性、生成物形成動態および細胞機能に関連するアウトプットとして表現できる。通例、コンピュータモデルのアウトプットは、生物学的構成要素のレベルまたは活性あるいは疾患状態の他のいずれかの挙動を示す値のセットを含む。これらのアウトプットに基づいて、１つ以上の生物プロセスを重要な生物プロセスと呼ぶことができる。
【００４８】
コンピュータモデルは、１つ以上の生物プロセスへの改変を表すために実行できる。特に生物プロセスへの改変は、生物プロセスと慢性関節リウマチとの間の関連度（例えば、相関度）を識別するためにコンピュータモデルにて表現できる。例えば、生物プロセスへの改変は、生物プロセスが慢性関節リウマチを発症させる、慢性関節リウマチに影響を及ぼす、または慢性関節リウマチによって改変される程度を識別するために、コンピュータモデルにて表現できる。生物プロセスは、慢性関節リウマチに関連する症状、例えば、滑膜組織での滑膜細胞密度、軟骨破壊およびＩＬ−６レベルの上昇を生じさせるこの生物プロセスへの改変が観察された場合に、慢性関節リウマチを引き起こすとして識別できる。ある例において、生物プロセスへの改変は、他の生物プロセスと慢性関節リウマチとの間の関連度を識別するために、コンピュータモデルにて表現できる。
【００４９】
いくつかの例において、生物プロセスのセットを識別することは、感受性解析を含むことができる。感受性解析は、疾患状態に関連する生物プロセスの優先順位決定を含むことができる。感受性解析は、この優先順位決定の頑強さを判定するために、コンピュータモデルの種々の構成を用いて実施できる。いくつかの例において、感受性解析は、疾患状態との関連度に基づいた生物プロセスの順位序列を含むことができる。感受性解析によって、ユーザは疾患状態の状況における生物プロセスの重要性を決定できる。非常に重要な生物プロセスの例は、疾患状態の重篤度を上昇させる生物プロセスである。それゆえこの生物プロセスの阻害は、疾患状態の重篤度を低下させることができる。生物プロセスの重要性は、その生物プロセスと疾患状態との間の関連の存在だけでなく、疾患状態の重篤度において変更を達成するために生物プロセスを改変しなければならない程度にも依存しうる。順位序列において、疾患状態においてより重要な役割を果たす生物プロセスは通例、より高い順位を得る。順位序列は、疾患状態においてより重要な役割を果たす生物プロセスがより低い順位を得るような逆の方法でも実施できる。通例、生物プロセスのセットは、疾患状態においてより重要な役割を果たすとして識別される生物プロセスを含む。
【００５０】
慢性関節リウマチの感受性解析の処理の間に、これらに限定されるわけではないが、単球補充、Ｔ細胞補充、細胞アポトーシス、およびサイトカイン産生などの生物プロセスの活性は、コンピュータモデルで一度に１つずつ調節される（増加または減少する）。次にバイオシミュレーションが実施され、刺激または阻害の異なるレベルでの１つの生物プロセスの調節の結果が、これらに限定されるわけではないが、軟骨破壊、滑膜細胞密度およびＩＬ−６レベルなどの臨床結果を測定することによって評価される。この解析の結果は、臨床結果に著しい影響を有する生物プロセスを識別した。
【００５１】
本発明において、感受性解析は、疾患病態生理学に著しい影響を有する慢性関節リウマチの生物学の４つの分野：（１）マクロファージアポトーシス、（２）インターフェロン−ガンマ産生、（３）Ｔｈ１細胞活性化ならびに（４）Ｔ細胞および単球補充を識別した。
【００５２】
（３．標的の同定）
上述のモデルによって予測されたＣＤ９９活性阻害の効果に基づいて、ＣＤ９９遮断は慢性関節リウマチの効果的な療法であることが予測される。
【００５３】
単球補充、およびＴ細胞増殖、活性化および補充に対するＣＤ９９の効果は定量され、慢性関節リウマチのコンピュータモデルにおいて明示的に表現された。これらの各生物プロセスに対するＣＤ９９活性の寄与が明確に特徴付けされていないため、ＣＤ９９活性の寄与を特徴付けるために一連の効果を定義した（表１）。「より低い最大効果」の値は、他のタンパク質との考えられる重複を考慮して記録された最も低い効果を表し、「より高い最大効果」は各生物プロセスに対するＣＤ９９活性の最大の考えられる効果であり、「最も有望な最大効果」は、生体内環境および重複を考慮した、各生物プロセスにおけるＣＤ９９活性の現実的な寄与の概算である。
【００５４】
（表１．関節モデルに対するＣＤ９９活性の効果）
【００５５】
【表１】
次に、慢性関節リウマチに対するＣＤ９９活性の効果のシミュレーションを、関連する生物プロセスすべてにおいて、いっせいに、または一度に１つの生物プロセスで、または複数の生物プロセスを組合せてＣＤ９９を遮断することによって実施した。シミュレーションの結果は、６ヶ月間のＣＤ９９活性の遮断が軟骨破壊を１５〜６０％、滑膜細胞過形成を４０〜７０％、滑膜組織中のＩＬ−６レベルを１６〜６０％低下させることによって、慢性関節リウマチの臨床結果を改善することを示した。図３は、滑膜細胞密度に対するＣＤ９９活性の効果を示す。図４は、軟骨破壊に対するＣＤ９９活性の効果を示す。図５は、滑膜組織中のＩＬ−６レベルに対するＣＤ９９活性の効果を示す。
【００５６】
メトトレキサートは、慢性関節リウマチには一般的な処置である。メトトレキサート処置は、滑膜細胞密度をおおよそ３０％低下させ、軟骨破壊率をおおよそ１５％低下させ、滑膜組織におけるＩＬ−６の濃度を９３％低下させることが既知である。１００％有効性では、コンピュータモデルはＣＤ９９拮抗作用がメトトレキサートよりも大きな改善を誘発することを予測する。モデルは、ＣＤ９９活性の阻害の７０％のみを引き起こす化合物が、滑膜細胞密度の低下においてメトトレキサートよりも優れており、軟骨破壊率に対してはおおよそ同じかまたは優れた効果を有することを予測している。
【００５７】
一度の１つの生物プロセスにおけるＣＤ９９遮断のシミュレーションは、臨床結果に対するＣＤ９９遮断の影響を引き起こす主な生物プロセスが単球補充に対する効果であることを示した。コンピュータモデルは、単球補充に対するＣＤ９９遮断の効果が観察された臨床改善の９０％超の原因であることを明らかにしている。図６は、ＩＦＮγの単球血管外遊走（単球補充）、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を与える。
【００５８】
ある慢性関節リウマチ患者は、メトトレキサート処置（初期不応答者）に効果的に応答しないが、メトトレキサートに最初は応答した他の患者は、時間が経つにつれて不応となる（漸進的不応答者）。メトトレキサート耐性患者でのＣＤ９９活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者とは異なる応答パターンを明らかにする。図７は、メトトレキサート耐性患者におけるＩＦＮγの単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を示している。メトトレキサート耐性患者では、Ｔ細胞補充でのＣＤ９９活性は、非耐性慢性関節リウマチ患者と比較して、慢性関節リウマチの症状を引き起こすのに実質的により大きな役割を果たしている（図６を参照）。シミュレーションの結果は、メトトレキサート耐性患者における６ヶ月間のＣＤ９９活性の遮断は、軟骨破壊を１２〜４５％減少させ、滑膜細胞過形成を２５〜５０％減少させることによって、慢性関節リウマチ臨床結果を改善できることを示した。図８は、メトトレキサート耐性患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。図９は、メトトレキサート耐性患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【００５９】
ＴＮＦ−α中和療法は、慢性関節リウマチ患者の処置においてますます重要になっている。しかしながらすべての慢性関節リウマチ患者のほぼ３分の１が、ＴＮＦ−α中和療法に対する臨床的に著しい応答を達成できない。ＴＮＦ−α遮断不応答者の３つの潜在的なクラスが上述のモデルで定義された。滑膜過形成および軟骨破壊は、ＴＮＦ−αが異なる範囲内で変化するときに異なって影響を受け、現在のモデル内での３つの不応答者クラスの識別をもたらす。特に低い初期ＴＮＦ−α活性の患者は、ＴＮＦ−α遮断に応答して滑膜過形成が低下、しかし軟骨破壊の最低限の減少を示すが（軟骨不応答者、すなわちＣＮＲ）、無視できる初期ＴＮＦ−α活性患者は、滑膜過形成および軟骨破壊の療法で不十分な応答を示す（二重不応答者、すなわちＤＮＲ）。あるいはＴＮＦ−α活性の異常に高いかまたは耐性レベルの患者におけるＴＮＦ−αの不十分な中和は、軟骨破壊の改善を生じるが、過形成においては不十分な応答を生じる（過形成不応答者、すなわちＨＮＲ）。機械的に、低レベルのＴＮＦ−αの患者では、疾患は、代わりのマクロファージ活性化経路（例えば、ＣＤ４０結合）の活性上昇、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の活性低下、および破壊促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−ｌｂ）の活性上昇によって永続される。無応答患者も、ＩＬ−１Ｒａなどの他の療法に変化した応答を示した（データは示さず）。
【００６０】
ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者におけるＣＤ９９活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者においてと同様の応答パターンを明らかにする。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者におけるＩＦＮγの単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。シミュレーションの結果は、ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者での６ヶ月間のＣＤ９９活性の完全な遮断が軟骨破壊を１１〜３５％減少させ、滑膜細胞過形成を３５〜６１％減少させることによって、慢性関節リウマチ臨床結果を改善することを示した。図１１は、ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。図１２は、ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【００６１】
ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者におけるＣＤ９９活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者においてと同様の応答パターンを明らかにする。図１３Ａおよび１３Ｂは、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者におけるＩＦＮγの単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。シミュレーションの結果は、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者での６ヶ月間のＣＤ９９活性の完全な遮断が軟骨破壊を１１〜２７％減少させ、滑膜細胞過形成を２９〜５１％減少させることによって、慢性関節リウマチ臨床結果を改善することを示した。図１４は、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。図１５は、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【００６２】
ＴＮＦ−α遮断ＤＮＲ患者におけるＣＤ９９活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者においてと同様の応答パターンを明らかにする。図１６Ａおよび１６Ｂは、ＴＮＦ−α−遮断ＤＮＲ患者におけるＩＦＮγの単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。シミュレーションの結果は、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者での６ヶ月間のＣＤ９９活性の完全な遮断が軟骨破壊を６〜３８％減少させ、滑膜細胞過形成を９〜４７％減少させることによって、慢性関節リウマチ臨床結果を改善することを示した。図１７は、ＴＮＦ−α遮断ＤＮＲ患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。図１８は、ＴＮＦ−α遮断ＤＮＲ患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【００６３】
慢性関節リウマチのインシリコモデルの利用は、ＣＤ９９活性の拮抗作用が慢性関節リウマチに罹患している患者にとって有望な治療方法であるという、驚くべき結果を与えた。
【００６４】
（Ｄ．ＣＤ９９）
ＣＤ９９（ＭＩＣ２またはＥ２抗原とも呼ばれる）は、ｍｉｃ２遺伝子によってコード化された３２ｋＤ細胞表面（膜貫通）糖タンパク質である。ｍｉｃ２遺伝子は、一度の細胞膜に及ぶ１６．７ｋＤのＩ型膜貫通タンパク質を予測する。コンセンサスＮ結合グリコシル化部位はないが、Ｏ結合グリコシル化の複数の部位があり、３２ｋＤのＣＤ９９の見かけの分子量の１４ｋＤを説明している。ＣＤ９９は、既知のタンパク質ファミリのメンバーではない。ＣＤ９９は、たいていは単球、末梢Ｔ細胞（ＲＯ＋のみ）、Ｂ細胞、および胸腺細胞で発現される接着分子である。
【００６５】
ＣＤ９９は、種々の癌、例えば、ユーイング肉腫（Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ，２０００）、ホジキンおよびリード・シュテルンベルグＢ細胞（Ｋｉｍ，Ｂｌｏｏｄ ２０００）ならびに乳癌（Ｌｅｅ，２００２）において効果を有することが証明されている。ＣＤ９９の機能は、Ｔ細胞で最も良好に特徴付けられており、そこではヒツジ血液細胞ロゼット形成の現象のためのＣＤ２への別のリガンドであることが見出された。さらに胸腺細胞およびＴ細胞へのＣＤ９９の結合は、あるインビトロシステムにおいて同時刺激機能を果たすことが示されている。ＣＤ９９の活性は、慢性関節リウマチに関連しているとして文献に述べられていない。
【００６６】
その機能はなお研究中であるが、ホモタイプ結合によって媒介されるＣＤ９９の一部の重要な効果は、慢性関節リウマチの状況に関連しうる。ＣＤ９９は、ＣＤ９９が接着分子として作用する内皮細胞を通じて細胞補充を引き起こすイベントのカスケードにおける工程である、漏出、すなわち経内皮移動で重要な役割を果たすことが示されている。単球漏出は、ＣＤ９９活性に強く依存する。一般に漏出は、内皮細胞が例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１または他の炎症誘発性メディエータによって活性化されたときに起こる。経内皮移動はまた、内皮細胞の直接活性化の非存在下でも、白血球接着の結果として、内皮細胞に亘って通常は低いレベルで内因的に発生する。それゆえ移動は、炎症性病巣にて生体内で起こる。ＣＤ９９は、単球の補充にも関与する（Ｓｃｈｅｎｋｅｌ，２００２）。
【００６７】
ＣＤ９９は、ＶＣＡＭ−１のアップレギュレーションを介したＴ細胞血管接着で間接的な役割も果たす。ＣＤ９９はＴ細胞シグナル伝達（Ｗａｃｌａｖｉｃｅｋ １９９８，Ｗｉｎｇｏｔｔ １９９９，Ｂｅｒｎａｒｄ ２０００）、Ｔ細胞の補充（Ｂｅｒｎａｒｄ，２０００）、Ｔ細胞のサイトカイン産生および活性化（Ｗａｃｌａｖｉｃｅｋ １９９８，Ｗｉｎｇｏｔｔ ２０００）および胸腺細胞のアポトーシス（Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ）にも関係してきた。
【００６８】
多数のマウスおよびラットモノクローナル抗体がＣＤ９９の種々のエピトープに対して開発されてきたが、ＣＤ９９の遮断では３つのみが試験されている。これらはＨｅｃ２（Ｓｃｈｅｎｋｅｌ ２００３）、Ｏ６６２（Ｂｅｒｎａｒｄ １９９５，１９９７）、およびＤ４４（Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｂｏｕｍｓｅｌｌ）である。これらの抗体はそれぞれ、経内皮移動をある程度まで阻害する。本発明に使用できる他の抗ＣＤ９９抗体としては：Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０が挙げられるが、これらに限定されない。アンチセンスＲＮＡインヒビターも、ＣＤ９９の活性に拮抗することが証明されている（Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９２：４２８７−４２９５（１９９８））。ＥＢウィルス潜在タンパク質１（ＬＭＰ−１）は、表面ＣＤ９９発現のダウンレギュレーション、それゆえ活性を直接引き起こすことも示されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９５：２９４−３００（２０００））。
【００６９】
（Ｅ．ＣＤ９９アンタゴニストおよび抗リウマチ薬を同定する方法）
（１．単球補充）
ＣＤ９９活性のアンタゴニストを同定する１つの好ましいアッセイは、代表的な血管外移動アッセイの改変である。単球は、内因性（内皮によって作成された）または外因性化学誘引物質の下部ウェル上の多孔性支持体で増殖する内皮層上に浮遊している。アッセイ終了時に下部チャンバに達した単球は、移動したとしてカウントされる。ＣＤ９９の活性を阻害する化合物は、内皮層で移動する細胞の数は減少するであろう。
【００７０】
１つの好ましいアッセイにおいて、内皮細胞は、フィブロネクチンを重ねた水和Ｉ型コラーゲンゲル上で培養される。培地の成分は多孔性ゲル中に浸透する。あるいは内皮細胞は、下部チャンバ上に吊るされた多孔性フィルタの上面で培養される。培地は、上部および下部チャンバに配置されて、単層の先端面および基底面に達する。単球は上部チャンバに添加される。「移動した」とカウントするためには、単球は（１）内皮細胞の上端面に付着し、（２）細胞内接合点まで移動して、（３）内皮細胞間で漏出し、（４）内皮細胞から分離して、基底薄層に浸透し、（５）フィルタまたはゲルを通過して、（６）フィルタまたはゲルから分離して、下部チャンバに入る必要がある。
【００７１】
健常またはリウマチドナーの末梢血から新たに単離された単球または好中球は、試験化合物の存在下または非存在下でコンフルエント内皮単層上に３７℃にて静置する。アッセイは、これに限定されるわけではないが、場合によりヒト血清アルブミンを添加した完全培地、培地１９９、またはＲＰＭＩ１６４０を含む種々の培地で実施される。十分な経内皮移動時間、一般に１時間後、単層をＥＧＴＡなどのキレート化剤で洗浄して、上端面になお結合している単球または好中球を除去する。コラーゲンゲルを基材として使用する場合、次に単層を、２価カチオンを含むリン酸緩衝生理食塩水ですすいで、グルタルアルデヒド中で一晩固定する。固定はコラーゲンゲルを強化するので、ゲルが操作しやすくなる。単層は好ましくはＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａを用いて染色し、好ましくはノマルスキー顕微鏡下で直接観察するためにスライドに載せる。ノマルスキー顕微鏡を使用すると、焦点面によって、単層の上端面に付着した単球または好中球を移動したものから識別することができる。血管外移動の定量化できる基準は、単層の下で移動した、単層に関連するこれらの単球または好中球のパーセンテージである。したがって血管外移動の測定は、単層への接着度とは独立している。
【００７２】
単球または好中球の移動は、内皮のサイトカイン刺激の存在下または非存在下で決定できる。内皮細胞の活性化は、刺激メディエータとの接触から生じうる。本発明の目的では、内皮細胞の活性化は好ましくは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）などのサイトカインとの接触から生じる。
【００７３】
「内皮細胞」という用語は、当該分野での普通の意味を有する。内皮細胞は、体全体で特に血管組織（静脈、動脈、および毛細血管）の管腔に見られる内皮を構成する。関節炎では、白血球が循環血から関節に移動して、そこで炎症に関与する。
（２．Ｔ細胞補充）
同様の血管外移動アッセイを、健常およびリウマチドナーの末梢血から新たに単離したＴリンパ球に利用できる。単離後、精製Ｔリンパ球は、試験化合物の存在下または非存在下でコンフルエント内皮単層上に３７℃にて静置する。アッセイは、これに限定されるわけではないが、場合によりヒト血清アルブミンを添加した完全培地、培地１９９、またはＲＰＭＩ１６４０を含む種々の培地で実施される。十分な経内皮移動時間、一般に１時間の後、単層をＥＧＴＡなどのキレート化剤で洗浄して、上端面になお結合しているＴ細胞を除去する。コラーゲンゲルを基材として使用する場合、次に単層を、２価カチオンを含むリン酸緩衝生理食塩水ですすいで、グルタルアルデヒド中で一晩固定する。固定はコラーゲンゲルを強化するので、ゲルが操作しやすくなる。単層は好ましくはＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａを用いて染色し、好ましくはノマルスキー顕微鏡下で直接観察するためにスライドに載せる。ノマルスキー顕微鏡を使用すると、焦点面によって、単層の上端面に付着したＴ細胞を移動したものから識別することができる。血管外移動の定量化できる基準は、単層の下で移動した、単層に関連するこれらのＴ細胞のパーセンテージである。
【００７４】
Ｔ細胞の移動は、内皮のサイトカイン刺激の存在下または非存在下で決定できる。内皮細胞の活性化は、刺激メディエータとの接触から生じうる。本発明の目的では、内皮細胞の活性化は好ましくは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）などのサイトカインとの接触から生じる。
【００７５】
（３．インビトロＴ細胞増殖）
ＣＤ９９活性のアンタゴニストを評価する好ましい方法は、活性化がＴ細胞の増殖によって定義されるＴ細胞活性化アッセイの使用による。Ｔ細胞は、健常な対象または慢性関節リウマチ患者に由来する。好ましくはＴｈ１細胞が得られるが、しかしながらいずれのＴ細胞個体群が使用される。
【００７６】
Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ９９の正常な結合および他の生理活動を遮断することなく、Ｔ細胞上のＣＤ９９を活性化する抗ＣＤ９９抗体によってＴ細胞を刺激することにより誘発される。１２Ｅ７および３Ｂ２／ＴＡ８は、ＣＤ９９を遮断せずに活性化することが既知である。場合により、Ｔ細胞の刺激を増強するために、抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ３に抗ＣＤ９９抗体を添加することができる。さらに、ＰＭＡまたはイノマイシンなどの化学刺激薬も場合により使用できる。Ｔ細胞が刺激された後、細胞にトリチウム化チミジン［メチル−３Ｈ］ＴｄＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などのＤＮＡ標識を適用する。あるいは細胞の数を直接カウントすることができる。細胞を１２〜２４時間インキュベートして、回収し、放射能カウントする。放射能の量は、生Ｔ細胞の数に相関している。
【００７７】
次にＴ細胞増殖の阻害は、Ｔ細胞を１２〜２４時間に亘って刺激抗体（例えば、１２Ｅ７および３Ｂ２／ＴＡ８）およびＣＤ９９活性のアンタゴニスト（抗体または他の分子）の両方でインキュベートすることによって評価できる。精製Ｔ細胞の残存増殖は、上述したアッセイを使用して評価できる。
【００７８】
（４．Ｔ細胞活性化）
ＣＤ９９活性のアンタゴニストを評価する別の方法は、Ｔ細胞活性化アッセイの使用による。Ｔ細胞活性化は、ＣＤ９９の正常な結合および他の生理活動を遮断することなく、Ｔ細胞上のＣＤ９９を活性化する抗ＣＤ９９抗体によるＴ細胞の刺激後に、サイトカインの産生を測定することによって評価できる。ＣＤ９９を遮断せずに活性化することが既知である。場合により、Ｔ細胞の刺激を増強するために、抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ３に抗ＣＤ９９抗体を添加することができる。さらに、ＰＭＡまたはイノマイシンなどの化学刺激薬も場合により使用できる。次に培養物上澄みを回収して、これに限定されるわけではないが、サンドイッチＥＬＩＳＡなどの方法を使用してサイトカイン濃度を測定した。
【００７９】
Ｔ細胞活性化の阻害（サイトカイン放出によって測定できるように）は、Ｔ細胞を刺激抗体（例えば、１２Ｅ７および３Ｂ２／ＴＡ８）およびＣＤ９９活性のアンタゴニスト（抗体または他の分子）の両方でインキュベートすることによって評価できる。精製Ｔ細胞の残存サイトカイン産生は、上述したアッセイを使用して評価できる。
【００８０】
「Ｔ細胞」という用語は、当該分野での普通の意味を有する。Ｔ細胞は、胸腺から由来して、胸腺処理を受けているため、いわゆるリンパ球のクラスである。これらの細胞は主に、細胞媒介免疫応答の制御およびＢ細胞発生の制御に関与する。Ｔ細胞は、リンフォカインホルモンを分泌することによって免疫系を調整する。
【００８１】
（Ｆ．処置の方法）
別の局面において、本発明は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を、炎症性疾患を有する患者に投与する工程を含む、慢性関節リウマチなどの炎症性疾患の少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。本発明は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を、慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程を含む、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を軽減する方法も提供する。ＣＤ９９活性のアンタゴニストは、タンパク質、核酸または小分子インヒビターでありうる。好ましいタンパク質アンタゴニストは、抗体、さらに好ましくはモノクローナル抗体である。好ましい核酸アンタゴニストは、ＣＤ９９をコード化する遺伝子である、ｍｉｃ２のアンチセンスインヒビターを含む。本発明は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与することによって、滑膜細胞密度を低下させる方法、軟骨破壊を低下させる方法および滑膜組織中のＩＬ−６濃度を低下させる方法も含む。
【００８２】
本発明で有用な化合物は、医学的に許容される投与経路によって、例えば、経口的に、非経口的に（例えば、筋肉内に、静脈内に、皮下に、腹腔内に）、経皮的に、直腸に、吸入などによって、患者に治療的有効用量で投与される。採用される投薬量範囲は、投与経路および処置される患者の年齢、体重および状態によって変わるであろう。
【００８３】
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、化合物の発現が可能な組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照）、レトロウィルスまたは他のベクターの一部として核酸の作成などの、種々の送達系が既知であり、本発明の組成物を投与するために使用できる。導入の方法は、これに限定されるわけではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外、および経口経路を含む。組成物は、いずれかの好都合な経路によって、例えば、輸液またはボーラス注入によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与されるか、生物活性剤と共に投与される。投与は全身的でも局所的でもよい。さらに、本発明の組成物を脳室内および髄腔内注入を含む、いずれかの適切な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい；脳室内注入は例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取付けられた脳室内カテーテルによって促進される。吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を用いた製剤の使用により、肺投与も利用できる。
【００８４】
（Ｇ．医薬組成物）
（１．抗体）
本発明の抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、ｓＦｖｓ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびにＣＤ９９およびＣＤ９９を発現する細胞に免疫特異的に結合する上のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。「抗体」という用語は本明細書で使用するように、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわちＣＤ９９および／またはＣＤ９９を発現する細胞に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれの種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）、クラス、またはサブクラスでもよい。
【００８５】
本発明の方法で使用されるポリクローナル抗体は、免疫された動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。当該分野で周知の種々の手順がＣＤ９９に対するポリクローナル抗体の産生に使用される。例えば、ポリクローナル抗体の産生では、これに限定されるわけではないがウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物は、ＣＤ９９またはその誘導体を用いた注射によって免疫できる。種々のアジュバントは、宿主種によって免疫応答を上昇させるために使用され、これらとしては、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルヴムが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアジュバントも当該分野で周知である。
【００８６】
本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体は、特定の抗原（例えば、ＣＤ９９）への抗体の均一な集団である。本発明の目的では「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ細胞によって産生された抗体である。例えば、Ｂリンパ球を産生する抗体と不死化Ｂリンパ球細胞系との融合による、モノクローナル抗体−合成ハイブリドーマ細胞を作成する方法は、当業者に周知である。好ましくは、モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、または最も好ましくはヒトモノクローナル抗体である。
【００８７】
ＣＤ９９に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培養物中の連続細胞系による抗体分子の産生を規定する、当該分野で既知のいずれかの技法によって作成できる。これらとしては、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に述べられたハイブリドーマ技法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７）、さらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤ、ならびにそのサブクラスを含むいずれかの免疫グロブリンの抗体でもよい。本発明で有用なｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養される。
【００８８】
本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体としては、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野で既知の多くの技法のいずれかによって産生される（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０，７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２−７９；およびＯｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２，３−１６）。
【００８９】
本発明は、ＣＤ９９および／またはＣＤ９９を発現する細胞に免疫特異的に結合する抗体の機能的に活性な断片、誘導体または類似物質の使用を提供する。「機能的に活性な」は、断片、誘導体または類似物質の由来する抗体が認識されるように、断片、誘導体または類似物質が同じ抗原を認識する抗−抗−イディオタイプ抗体を誘発できることを意味する。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、枠組みおよび特異的に抗原を認識するＣＤＲ配列に対してＣ末端であるＣＤＲ配列の欠失によって向上される。抗原に結合するＣＤＲ配列を判定するためには、当該分野で既知のいずれかの結合アッセイ方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）によって、ＣＤＲ配列を含有する合成ペプチドを抗原との結合アッセイに使用できる。
【００９０】
本発明の他の実施形態は、本発明の抗体の断片としては、例えば、抗体分子のペプシン消化によって産生できる可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有するＦ（ａｂ’）２断片、ならびにＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィドブリッジを還元することによって産生できるＦａｂ断片が挙げられるがこれらに限定されない。本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖ダイマー、またはその最小断片、例えば、Ｆｖｓまたは単鎖抗体（ＳＣＡ）（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４に述べられている）あるいは本発明の抗体と同じ特異性を持つ他のいずれかの分子も提供する。
【００９１】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して作製できる、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組換え抗体、例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種から由来する分子、例えば、マウスモノクローナルに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である（例えば、参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号を参照）。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からの枠組み領域を有する、非ヒト種からの抗体分子である（例えば、参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第，５８５，０８９号）。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で既知の組換えＤＮＡ技法によって、例えば、それぞれ参考としてその全体が本明細書に援用される、国際公開番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；Ｅ欧州特許出願１７３，４９４；国際公開番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｅ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に述べられている方法を使用して産生できる。
【００９２】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処置に特に好ましい。そのような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して産生できる。トランスジェニックマウスは、選択した抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部を用いて通常の方法で免疫される。抗原に向けられたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスに宿されたヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に転位して、次にクラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。それゆえそのような技法を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することができる。ヒト抗体を産生するこの技法の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するこの技法およびそのような抗体を産生するプロトコルの詳細な議論については、例えば、それぞれ参考としてその全体が本明細書に援用される、米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号を参照。さらにＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（フレモント、カリフォルニア州）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（サンノゼ、カリフォルニア）などの企業は、上述した技術と同様の技術を使用して、選択した抗原に対するヒト抗原の提供に従事することができる。
【００９３】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導された選択」と呼ばれる技法を使用して産生できる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【００９４】
（２．製剤）
本発明の局面は、温血動物の慢性関節リウマチを処置するのに有用な薬物を製造する方法を提供する。薬物は、経口、局所、経皮、経直腸、吸入、非経口（静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与などに適した組成物を提供するために、既知の処方技法に従って調製される。本発明の組成物を調製するための詳細な指針は、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４０のＭａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．によって出版されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓの１８ｔｈまたは１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎを参照することによって見出される。適切な部分は、参考として本明細書に援用される。
【００９５】
単位用量または複数回用量様式が考慮され、それぞれある臨床状況において利点を提供する。単位用量は、慢性関節リウマチを処置する状況において所望の効果を生じるように計算されたＣＤ９９活性のアンタゴニストの規定量を含有する。複数回用量様式は、所望の結果を達成するために複数の１回用量、または分別用量が必要なときに、特に有用である。これらの投薬様式のどちらも、特定の化合物の独自の特徴、達成される特定の治療効果および癌の処置のための特定の化合物を調製する当該分野に固有の制限によって規定される、またはそれらに直接依存する仕様を有する。
【００９６】
単位用量は、対象において慢性関節リウマチを処置するのに十分な治療有効量を含有し、化合物を約１．０〜１０００ｍｇ、例えば、約５０〜５００ｍｇ含有する。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明の薬物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として、日常的な手順に従って処方される。通例、静脈内投与用の医薬組成物は、滅菌等張水性緩衝液による溶液である。必要な場合に医薬組成物は、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含む。一般に成分は、活性剤の量を表示したアンプルまたはサシェなどの密封容器内の例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、個別に、または共に混合されて単位投薬様式で供給される。組成物が輸液によって投与される場合、滅菌製薬グレードの水または生理食塩水を含有する輸液ボトルを用いて分配できる。組成物を注射によって投与する場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合されるように提供することができる。
【００９８】
本発明の薬物は、中性または塩の形状として製剤できる。製薬的に許容される塩は、アニオンを用いて形成された塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩、およびカチオンを用いて形成された塩、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩を含む。
【００９９】
化合物は好ましくは、摂取錠剤、口腔錠、カプセル剤、カプレット剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、トローチ剤、ウェファ剤、菱形錠などどの適切な製剤で経口投与される。一般に最も容易な製剤は、錠剤またはカプセル剤である（個別にまたは集合的に「経口投薬単位」と呼ばれる）。適切な製剤は、化合物の特徴を適切な組成物を配合するために利用可能な賦形剤に適合させることができる標準配合技法に従って調製される。
【０１００】
その形式は、化合物を迅速に送達するか、または持続放出性調製物である。化合物は、硬カプセルまたは軟カプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または飲料、食品またはそうでなければ食餌に包含される。最終組成物および調製物のパーセンテージはもちろん変化して、好都合には最終形、例えば、錠剤の重量の１〜９０％の範囲である。そのように治療的に有用な組成物の量は、適切な投薬量が得られるようになっている。本発明による好ましい組成物は、経口投薬単位形が５〜１０００ｍｇの重さの投薬単位中で約５．０〜約５０重量％（％ｗ）を含有するように調製される。
【０１０１】
経口投薬単位の適切な製剤は：バインダー、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン；甘味剤、例えば、ラクトースまたはスクロース；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、アルギン酸など；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；または着香料、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油なども含有する。種々の他の物質がコーティングとして、またはそうでなければ経口投薬単位の物理形を改良するために存在する。経口投薬単位は、シェラック、糖またはその両方でコーティングされる。シロップ剤またはエリキシル剤は、化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料および着香料を含有する。利用できるいずれの物質も、製薬的に許容され、実質的に非毒性でなければならない。有用な賦形剤の種類の詳細は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”の第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出される。特に。より完全な議論については９１−９３章を参照。
【０１０２】
本発明の薬物は、非経口的に、例えば、静脈内に、筋肉内に、静脈内に、皮下的に、または腹腔内に投与できる。担体または賦形剤または賦形剤混合物は、溶媒、あるいは例えば、種々の極性または非極性溶媒、その適切な混合物、または油を含有する分散媒体でありうる。本明細書で使用するように、「担体」または「賦形剤」は製薬的に許容される担体または賦形剤を意味し、ありとあらゆる溶媒、分散剤または媒体、コーティング、抗菌剤、等張／低張／高張剤、吸収改良剤などを含む。そのような物質および薬剤の製薬活性物質への使用は、当該分野で周知である。従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物での使用が考慮される。さらに他のまたは補助活性成分も最終組成物に含むことができる。
【０１０３】
化合物の液剤は、希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、種々の油および／またはその混合物、および当業者に既知のその他で調製できる。
【０１０４】
注射用途に適切な製薬形は、滅菌液剤、分散剤、乳剤、および滅菌粉剤を含む。最終形は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならない。その上、最終製薬形は、汚染に対して防御されなければならず、したがって細菌または真菌などの微生物の増殖を阻害できなければならない。単回静脈内または腹腔内用量を投与できる。あるいは、通例１〜８日間続く、低速の長期輸液または複数回の短期１日輸液を利用できる。別の日数または複数日ごとの投薬も利用できる。
【０１０５】
滅菌注射用液剤は、必要な量の化合物を１つ以上の適切な溶媒に含有させて、必要ならば上に挙げた、または当業者に既知である他の成分をそれに添加することによって調製される。滅菌注射用液剤は、必要な量の化合物を必要に応じた種々の他の成分と共に適切な溶媒に含有させることによって調製される。濾過などの滅菌手順が次に続く。通例、分散剤は、分散媒体および上で示した必要な他の成分も含む滅菌ビヒクルに化合物を含有させることによって作成される。滅菌粉剤の場合、好ましい方法は真空乾燥または凍結乾燥を含み、それに必要な成分が添加される。
【０１０６】
いずれの場合でも、上記の最終形は滅菌する必要があり、中空針などの注射器をただちに通過できる必要もある。適正な粘度は、溶媒または賦形剤の適正な選択によって実現および維持される。その上、レクチンなどの分子または粒子コーティングの使用、分散剤中の粒径の適正な選択、または界面活性剤特性を備えた物質の使用が利用される。
【０１０７】
微生物の増殖の防止または阻害は、１つ以上の抗菌剤、例えば、クロロブタノール、アスコルビン酸、パラベン、テルメロサール（ｔｈｅｒｍｅｒｏｓａｌ）などの添加によって実現される。張性を変化させる薬剤、例えば、糖または塩を含むことも好ましい。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明の組成物を処置の必要な部分に局所的に投与することが望ましい；これは例えば、これに限定されるわけではないが、外科処置中の局所輸液、外科処置後の例えば、創傷被覆材と併せた局所塗布によって、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、またはシラスティック膜などの膜、または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料のインプラントによって、実施できる。
【０１０９】
別の実施形態において、組成物は、小胞、特にリポソーム中で送達できる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７−３２７を参照；一般に同書を参照）。
【０１１０】
なお別の実施形態において、組成物は制御放出、または持続放出系で送達できる。１つの実施形態において、ポンプが使用される（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ， １９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照）。別の実施形態において、ポリマー材料を制御放出系に使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照）。なお別の実施形態において、制御放出系を治療標的（例えば、脳、腎臓、胃、膵臓、および肺）に近接して配置し、それゆえ全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４））。
【０１１１】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説に述べられている（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）。
【０１１２】
本発明の薬物がタンパク質をコードする核酸である特定の実施形態において、そのコードされたタンパク質の発現を促進するために、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを作製して、それが細胞内となるように投与することによって、例えば、レトロウィルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または直接注入によって、または微粒子銃（例えば、遺伝子ガン；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、あるいは脂質または細胞表面レセプターあるいは形質移入剤を用いたコーティングによって、あるいは核に入ることが既知であるホメオボックス様ペプチドへの結合へそれを投与することなどによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８を参照）核酸を生体内に投与できる。あるいは核酸は相同組換えによって、細胞内に導入され、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に含むことができる。
【実施例】
【０１１３】
（ＩＶ．実施例）
以下の実施例は、当業者への指針として提供される。実施例は単に本発明の実施形態を理解および実施するのに有用な具体的方法を提供するので、実施例は、本発明を制限するものと見なすべきではない。
【０１１４】
（Ａ．実施例１単球／Ｔ細胞補充）
（細胞）
ヒトＰＢＬは、健常ドナーまたは慢性関節リウマチ患者のクエン酸塩抗凝固処理全血から、デキストラン沈降およびＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上での密度分離によって単離する。この単核細胞を洗浄して、上述したようにナイロンウール上およびプラスチック付着によってさらに精製する（Ｃａｒｒ １９９６）。得られたＰＢＬ（＞９０％ＣＤ３＋Ｔリンパ球）は、使用前にＬＰＳ−無ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で１５〜１８時間培養する。メモリーおよび未変性ＣＤ３＋Ｔリンパ球サブセット（それぞれＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋）は、製造者の説明書に従って磁気細胞分離（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して、ネガティブセレクションによって単離する。ＨＵＶＥＣは、臍帯静脈（ｊａｆｆｅ １９７３）から単離して、１０％ＦＣＳ、８％プールヒト血清、５０μｇ／ｍｌ内皮細胞成長因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０Ｕ／ｍｌブタ腸ヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および抗生物質を含有するＭ１９９中で一次培養物として確立する。実験は、９６ウェル培養プレート内で水和Ｉ型コラーゲンゲル上に培養された継代２の細胞に対して実施する（Ｍｕｌｌｅｒ １９８９）。ある実験では、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌおよび１０Ｕ／ｍｌ最終濃度）あるいは健常ドナーまたは慢性関節リウマチ患者からの希釈滑膜液を最後の４〜２４時間に亘って培地に添加する。
【０１１５】
（抗体）
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州、ロックビル）からのＣＤ１８（ＩＢ４）、ＣＤ１４（３Ｃ１０）およびＭＨＣクラスＩＩ（９．３Ｃ９）に対する抗体をネガティブコントロールとして使用する。抗ＣＤ３１は経内皮移動遮断からのポジティブコントロールとして使用する。抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）および抗ＣＤ２８（ｌｅｕ２８）ｍＡｂはＴ細胞活性化アッセイで使用する。
【０１１６】
内皮細胞の層を通じた単球またはＴ細胞の移動を測定する。このアッセイの詳細は、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７６：８１９−８２８（１９９２）およびＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：４４９−４６０（１９９３）に記載されている。経内皮移動は、Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：１３３７−１３４３（１９９５）およびＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：４４９−４６０（１９９３）で記載されているようにノマルスキー顕微鏡によって定量する。白血球は、健常ボランティアまたは慢性関節リウマチ患者の末梢血から単離して、抗ＣＤ９９ｍＡｂ、１２Ｅ７を用いて以前にインキュベートした水和コラーゲンゲル上で培養したＨＵＶＥＣのコンフルエント単層に添加する。インキュベーション（別途報告しない場合は１時間）の後、非接着性細胞を洗浄することによって除去し、残りの接着性血管外移動細胞は、ｐＨ７．４の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒド中での一晩のインキュベーションによって、内皮単層上の所定の位置に固定する。複数の高倍率視野を顕微鏡下で観察して評価する。血管外移動データは、内皮の下にある単層に残った全細胞のパーセンテージとして表される。ある実験において、抗ＣＤ９９または対照ｍＡｂを白血球、内皮細胞または両方でアッセイの前に３０分間インキュベートして、次に血管外移動開始前に広範囲に亘る洗浄で除去する。ある実験において、標準血管外移動時間の完了時に、ブロッキングｍＡｂを洗い流し、その培養物を同じまたは別のｍＡｂのブロッキング濃度を含有する、または含有しない完全培地内に入れて、インキュベータに戻す。
【０１１７】
経内皮移動もパラフィン包埋した単層の断面上で定量する。これらの試験片は、サンプル単層を折り曲げて慎重に除去して、コラーゲンゲル側を外に向けて内皮表面を互いに合せて配置することによって作成する。このことは包埋プロセス中の細胞の機械的移動を回避する。ワックスでの置換の後、試験片を二等分して、試験片の切断が４つの単層サンプルの断片を生成するようにする（２つの単層それぞれの２つの異なる部分）。定量を３つのレベルのそのような試験片に対して、試験片の異なる部分がサンプリングされて同じ細胞が２回カウントされないように、少なくとも５０μｍ離して実施する。
【０１１８】
（Ｂ．実施例２：Ｔ細胞増殖および活性化Ｔ細胞増殖アッセイ）
健常ボランティアまたは慢性関節リウマチ患者に由来する高度に精製されたＰＢ Ｔ細胞の増殖アッセイ（５ｘ１０４細胞／ウェル）は、９６ウェルＵ底組織培養プレートで最終体積２００μｌとして３通り実施する。増殖は、ＧＡＭ−ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）によって架橋された抗ＣＤ３ｍＡｂ＋抗ＣＤ９９または対照ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）によって、およびＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ；最終濃度、１０−７Ｍ）またはイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ；最終濃度、１μＭ）によって誘発される。固定化ＣＤ３ ｍＡｂを用いた増殖実験では、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）は、ＰＢＳで希釈した０．１２５〜１．０μｇ／ｍｌ精製ＯＫＴ３ ｍＡｂ １００μｌを用いて４℃にて一晩コーティングする。プレートをＰＢＳで２回洗浄して、次にアッセイに使用する。ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）、イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）、そしてｍＡｂを１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０で希釈する。ＧＡＭ−ＩｇＧおよび細胞は、１０％プールヒト血清を添加したＲＰＭＩ １６４０で再懸濁させる。
【０１１９】
５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿大気中での７２時間のインキュベーション後、細胞に［メチル−３Ｈ］ＴｄＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１μＣｉ／ウェルを適用する。１８時間後、この細胞溶解液をガラス繊維フィルター上に回収して、マイクロプレートシンチレーションカウンターで放射能を決定する。
【０１２０】
（細胞内サイトカインの決定）
ＰＨＡ／ＩＬ−２依存性芽球を産生するために、ＰＢＭＣ（１ｘ１０５／ウェル）は９６ウェルＵ底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において、ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ；最終濃度、１μｇ／ｍｌ）の存在下で抗生物質を添加した、１０％ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えたＲＰＭＩ １６４０中で７日間培養する。次に５〜７日ごとに、ＩＬ−２ １０Ｕ／ｍｌおよび自己照射（３０００ｒａｄ、１３７Ｃｓ源）ＰＢＭＣをフィーダー細胞（芽細胞／フィーダー細胞の比＝１：１）として添加する。細胞は第１の実験を実施する前に少なくとも１ヶ月間培養する。
【０１２１】
９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＧＡＭ−ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；１０μｇ／ｍｌ）およびＣＤ３ ｍＡｂ ＯＫＴ３（２０ｎｇ／ｍｌ）の最適下限濃度で４℃にて一晩コーティングする。ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔ細胞系またはクローン（１−２ｘ１０５／ウェル）を最適濃度（５μｇ／ｍｌ）のＣＤ９９ｍＡｂ、ＣＤ２８ ｍＡｂ Ｌｅｕ２８またはアイソタイプ対照ｍＡｂを用いて予備コーティングしたプレート内でインキュベートする。アッセイは、抗生物質および２μｇ／ｍｌ（最終濃度）ブレフェルディンＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加した、５％プールヒト血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で、総体積２００μｌ／ウェルにて準備する。５％ＣＯ２大気中で３７℃での１８時間のインキュベーションの後、細胞を回収して、細胞内サイトカインの存在について解析した。染色では、細胞懸濁物５０μｌ（１−２ｘ１０５細胞に相当）を１％パラホルムアルデヒド１００μｌの添加により、室温にて３０分間固定する。次に細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡ ４ｍｌで１回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ ５０μｌ中に再懸濁させ、ＰＥＲＭ溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１００μｌの添加によって透過処理し、指示された直接結合抗サイトカインｍＡｂとともに３０分間、室温にてインキュベートした。最後に、細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁させて、フローサイトメトリーによって解析した。
【０１２２】
分泌サイトカインの定量的測定では、１ｘ１０６個のＴ細胞を抗ＣＤ９９または対照ｍＡｂｓによる抗ＣＤ３コーティングプレート上で３７℃／５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートする。次に培養上澄みを回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを、製造者のプロトコル（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ミネアポリス、ミネソタ州）を使用して、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生を測定するために実施する。対照実験：Ｔ細胞の刺激およびインターフェロンガンマ産生の測定。
【０１２３】
上の明細書で触れたすべての刊行物および特許は、参考として本明細書に援用される。本発明の上述の方法およびシステムの種々の改良および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかになるであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、本発明は、特許請求したように、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解する必要がある。実際に、当業者に明らかである本発明を実施するための上述した様式の種々の改良は、以下の特許請求の範囲内に含まれると企図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、特にＴ細胞レセプター刺激、Ｔ細胞アポトーシス率、単球補充率、インターフェロンガンマ産生および単球／マクロファージ活性化インデックスを含む多数の生物プロセスの撹乱に対する滑膜細胞密度の感受性を示す。
【図２】図２は、特にＴ細胞レセプター刺激、Ｔ細胞アポトーシス率、単球補充率、インターフェロンガンマ産生および単球／マクロファージ活性化インデックスを含む多数の生物プロセスの撹乱に対する軟骨破壊率の感受性を示す。
【図３】図３は、滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図４】図４は、軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図５】図５は、滑膜組織中のＩＬ−６に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図６】図６は、個々の重要な生物プロセスに対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図７】図７は、単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対するメトトレキサート耐性患者におけるＣＤ９９遮断の相対効果を示す。
【図８】図８は、メトトレキサート耐性患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図９】図９は、メトトレキサート耐性患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、各過程それぞれについて調査した単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α軟骨不応答者において最も起こりそうなＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１回に１つの過程を遮断することによって調査した、単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α軟骨不応答者におけるＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。
【図１１】図１１は、ＴＮＦ−α軟骨不応答者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１２】図１２は、ＴＮＦ−α軟骨不応答者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、各過程それぞれについて調査した単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α過形成不応答者において最も可能性のあるＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、１回に１つの過程を遮断することによって調査した、単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α過形成不応答者におけるＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。
【図１４】図１４は、ＴＮＦ−α過形成不応答者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１５】図１５は、ＴＮＦ−α過形成不応答者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、各過程それぞれについて調査した単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α二重不応答者において最も可能性のあるＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１６Ｂ】１回に１つの過程を遮断することによって調査した、単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α二重不応答者におけるＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。
【図１７】図１７は、ＴＮＦ−α二重不応答者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１８】図１８は、ＴＮＦ−α二重不応答者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．緒言）
（Ａ．関連出願）
本出願は、２００３年９月１１日に提出され、本明細書中に参考として援用される米国特許仮出願番号６０／５０２，３４５の利益を請求する。
【０００２】
（Ｂ．発明の分野）
本発明は、慢性関節リウマチを処置する新規な方法および慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（Ｃ．発明の背景）
１００を超える種類の関節炎があり、そのうち慢性関節リウマチは最も痛く壊滅的な種類である。関節の一般的な疾患である慢性関節リウマチは、２００万人を超えるアメリカ人に影響を及ぼしている自己免疫疾患であり、男性よりも女性の間で発生率が著しく高い。慢性関節リウマチでは、関節を裏打ちする膜または組織（滑膜）が炎症（滑膜炎）を起こすようになる。時間と共に炎症は関節組織を破壊して、身体障害を引き起こす。慢性関節リウマチは体の複数の臓器に影響を及ぼしうるため、慢性関節リウマチは全身病と呼ばれ、時にはリウマチ様疾患と呼ばれる。リウマチ様疾患の発症は通常は中年においてであるが、その２０代または３０代に頻繁に発生する。
【０００４】
リウマチ様疾患に関連する疼痛および全身（全身性）症状は、身体に障害を引き起こすことがある。時間と共に慢性関節リウマチは関節破壊を生じて、変形および日常活動の困難につながる。慢性関節リウマチを患った人々が、疼痛および進行性身体障害によって引き起こされるある程度の鬱病に苦しむことは珍しいことではない。ある研究は、慢性関節リウマチを患った人々の４分の１がその診断の６〜７年後に働くことができず、半分が２０年後に働くことができないということを報告している（Ｏ’Ｄｅｌｌ ＪＲ（２００１）．Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｉｃｔｕｒｅ．Ｉｎ ＷＪ Ｋｏｏｐｍａｎ，ｅｄ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１４ｔｈ ｅｄ．，ｖｏｌ．１，ｃｈａｐ．５８，ｐｐ．１１５３−１１８６．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。慢性関節リウマチなどの筋骨格状態は、逸失賃金および生産などの間接出費として、米国経済に毎年６５０億円近くを費やさせている。
【０００５】
滑膜炎症、軟骨の急速な破壊および罹患関節における骨の侵食が慢性関節リウマチ（ＲＡ）の特徴である。近年の証明により、骨格組織の破壊および炎症がリウマチ関節における重複しているが同一でない生物プロセスによって調節されることと、これらの２つの局面に対する治療効果が相関する必要がないこととが示されている。関節における生物プロセスの複雑さのために、数学およびコンピュータモデルの使用は、種々の組織対応物、細胞タイプ、メディエータ、関節疾患および健全なホメオスタシスに関与する他の因子間の相互作用をよりよく理解するのに役立つ。複数の研究者が、慢性関節リウマチの生物プロセスではなくむしろ、関節の機械的環境の簡単なモデルを構築して、結果を軟骨および骨の疾患および発育のパターンと比較した（Ｗｙｎａｒｓｋｙ ＆ Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．，１６：２４１−２５１，１９８３；Ｐｏｌｌａｔｓｃｈｅｋ ＆ Ｎａｈｉｒ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１４３：４９７−５０５，１９９０；Ｂｅａｕｐｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，３７：１４５−１５１，２０００；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ，１７：６４６−６５３，１９９９）。コンピュータで扱うことができる関節疾患の数学モデルは、滑膜を含む複数のコンパートメントを含み、これらのコンパートメントの相互作用は、２００２年１２月５日に公開された国際公開番号ＷＯ０２／０９７７０６および２００３年４月２４日に２００３−００７８７５９として公開された米国特許出願番号１０／１５４，１２３に述べられている。どちらの公報も参考としてその全体が援用される。
【０００６】
慢性関節リウマチは、現在、制御できるが治癒できない慢性疾患である。処置の目標は、症状の軽減および疾患を悪化させないことである。慢性関節リウマチの大半の処置の目標は、疼痛を軽減し、炎症を減少させ、関節損傷の進行を遅延または停止させて、人が機能する能力を改善することである。処置への現在の手法は、ライフスタイルの変化、薬剤、外科手術、ならびに日常的監視およびケアを含む。慢性関節リウマチの処置に使用される薬剤は、疾患の進行に影響を与える方法に基づいて２つの群：（１）症状緩和薬および（２）疾患改変薬に分類できる。
【０００７】
症状、例えば、疼痛、硬直、および腫脹を軽減するための薬剤が使用される。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン、イブプロフェン、およびナプロキセン）は、疼痛を制御するために使用され、炎症を減少させるのに役立つ。これらの抗炎症薬は、疾患を制御せず、または疾患が悪化するのを停止しない。コルチコステロイド、例えば、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン（メドロール）は、疼痛を制御して、炎症を減少させるために使用する。それらは疾患を制御して、疾患が悪化するのを停止させる；しかしながら、コルチコステロイドを長期に亘る唯一の療法として使用することは、最良の処置とは見なされない。コルチコステロイドは、最大６ヶ月かかりうる抗リウマチ薬がその全有効性に達するときまで、関節炎症の拡大を制御するために使用されることが多い。非処方薬剤（例えば、アセトアミノフェン）および局所用薬剤（例えば、カプサイシン）は疼痛を制御するために使用されるが、通常、関節腫脹または疾患の悪化に影響を及ぼさない。
【０００８】
疾患改変抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）は、慢性関節リウマチの進行を制御し、関節破壊および身体障害の防止を試みるために使用される。これらの抗リウマチ薬は、他の抗リウマチ薬と、または他の薬剤、例えば、非ステロイド性抗炎症薬と組合せて投与されることが多い。慢性関節リウマチに一般に処方される疾患改変抗リウマチ薬としては、抗マラリア薬剤、例えば、ヒドロキシクロロキン（プラケニル）またはクロロキン（アラレン）、メトトレキサート、例えば、リウマトレックス、スルファサラジン（アザルフィジン）、レフルノミド（アラバ）、エタネルセプト（エンブレル）、インフリキシマブ（レミケード）、およびアナキンラ（キネレット）が挙げられる。慢性関節リウマチにはあまり一般的に処方されないＤＭＡＲＤは、アザチオプリン（イムラン）、ペニシラミン（例えば、キュプリミンまたはデペン）、金塩（例えば、リドーラまたはＡｕｒｏｌａｔｅ）、ミノサイクリン（例えば、ダイナシンまたはミノシン）、シクロスポリン（例えば、ネオーラルまたはサンディミュン）、およびシクロホスファミド（例えば、シトキサンまたはネオサル）を含む。これらの抗リウマチ薬は、作用するまで最大６ヶ月かかることがある。多くは重篤な副作用を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ慢性関節リウマチの処置のための新しい、治療的に有効な薬物への要求はもちろんのこと、そのような薬物を同定する新しい方法への要求も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（Ｄ．発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、慢性関節リウマチを有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。ＣＤ９９活性のアンタゴニストは、タンパク質、核酸または小分子インヒビターでありうる。「小分子」は本明細書では、１０００ダルトン未満の分子量を有する分子として定義される。好ましいタンパク質アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。好ましい核酸アンタゴニストは、ＣＤ９９をコード化する遺伝子、ｍｉｃ２のアンチセンスインヒビターを含む。好ましい実施形態において、患者は、メトトレキサート耐性患者、ＴＮＦ−α遮断軟骨不応答者（ＣＮＲ）、ＴＮＦ−α遮断過形成不応答者（ＨＮＲ）、またはＴＮＦ−α遮断二重不応答者（ＤＮＲ）である。
【００１１】
本発明の別の局面は、異常に上昇した滑膜細胞密度に関連する状態を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、関節内の滑膜細胞の密度を低下させる方法を提供する。
【００１２】
本発明は、異常に高い割合の軟骨破壊に関連する状態を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、関節内の軟骨破壊を減少させる方法も提供する。
【００１３】
本発明の局面は、滑膜組織中のＩＬ−６の異常に高い濃度に関連する状態を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、滑膜組織中のＩＬ−６濃度を低下させる方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の局面は、異常に高い割合の骨びらんに関連する状態を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与することを含む、関節内の骨びらんを低減する方法を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、炎症性疾患を有する患者にＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、炎症性疾患の少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。好ましい実施形態において、炎症性疾患は、糖尿病、動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、炎症性大動脈瘤、再狭窄、虚血／再潅流傷害、糸球体腎炎、再狭窄、再潅流傷害、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ライター症候群、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、股関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、骨盤腹膜炎、多発性硬化症、糖尿病、骨髄炎、癒着性関節包炎、少数関節炎、変形性関節炎、関節周囲炎、多発性関節炎、乾癬、スティル病、滑膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、および炎症性皮膚疾患からなる群より選択される。さらに好ましくは、炎症性疾患は、関節炎、例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、股関節炎、骨関節炎、または多発性関節炎である。最も好ましくは、炎症性疾患は慢性関節リウマチである。
【００１６】
本発明のなお別の局面は、化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が、該化合物の非存在下で移動する白血球の量より少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程と；を含む方法を提供する。好ましい実施形態において、内皮細胞は、場合によりインターロイキン−１の腫瘍壊死因子によって刺激された、培養ヒト臍静脈内皮細胞である。別の好ましい実施形態において、内皮細胞の少なくとも１つの層は内皮細胞の単層である。本発明の別の局面は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストを同定する工程と、同定されたアンタゴニストをヒトが消費するために配合する工程とを含む、慢性関節リウマチの処置で使用する薬物を製造する方法を含む。好ましい実施形態において、白血球は単球またはＴ細胞のどちらかである。
【００１７】
本発明の局面は、炎症性疾患の処置に有用な化合物を同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量を該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量が、該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量より少ないときに、該化合物を炎症性疾患の処置に有用であるとして同定する工程と；を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下でのＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量より少ないときに、慢性関節リウマチの処置に有用であるとして同定する工程と；を含む方法を提供する。本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞サイトカインはＴｈ１サイトカインである。好ましくは、測定されたＴｈ１サイトカインはＴＮＦ−αまたはＩＦＮγである。本発明の別の実施形態は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストを同定する工程と、同定されたアンタゴニストをヒトが消費するために調剤する工程とを含む、慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法を含む。
【００１９】
本発明の別の局面は、慢性関節リウマチの処置に有用な薬物を同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から増殖したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から増殖したＴ細胞の数と比較する工程であって、非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および化合物への曝露前には第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、工程と；（ｂ）該化合物の存在下で発現したＴ細胞の数が、該化合物の非存在下で増殖したＴ細胞の数よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程と；を含む方法を提供する。本発明の別の実施形態は、ＣＤ活性のアンタゴニストを同定する工程と、同定されたアンタゴニストをヒトが消費するために配合する工程とを含む、慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法を含む。
【００２０】
本発明のなお別の局面は、慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって：（ａ）該集合の化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が、該化合物の非存在下で移動する白血球の量よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして選択する工程と；を含む方法を提供する。好ましくは、これらの工程は集合の各化合物について反復され、集合の少なくとも１つの化合物がＣＤ９９活性のアンタゴニストとして選択される。
【００２１】
本発明のなお別の局面は、慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって、（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴｈ１サイトカインの量を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴｈ１サイトカインの量と比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴｈ１サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴｈ１サイトカインの量よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程と；を含む方法を提供する。好ましくは測定されたＴｈ１サイトカインは、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγである。
【００２２】
本発明の局面は、炎症性疾患の処置に有用な化合物を同定する方法であって：（ａ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量を該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量を比較する工程と；（ｂ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量が、該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量よりも少ないときに、該化合物を炎症性疾患の処置に有用であるとして同定する工程と；を含む方法を提供する。
【００２３】
（ＩＩ．図面の簡単な説明）
本発明のある実施形態の性質および目的をさらに理解するために、添付図面と併せて以下の詳細な説明を参照すべきである。
【００２４】
（ＩＩＩ．詳細な説明）
（Ａ．概要）
一般に本発明は、炎症性疾患、例えば、慢性関節リウマチを処置する新規な方法、および炎症性疾患およびその臨床症状の処置に有用な薬物を同定およびスクリーニングする新規な方法を含むとして見ることができる。ヒトリウマチ関節のコンピュータモデルの使用を通して、本発明者らは、一部の癌に対して効果を有することが既知である接着分子、ＣＤ９９の活性が慢性関節リウマチの病態生理学に著しい影響を有することを発見した。ＣＤ９９の活性の阻害は、炎症性疾患、例えば、慢性関節リウマチの症状を軽減することが予測される。
【００２５】
（Ｂ．定義）
「滑膜組織におけるＩＬ−６の異常に高い濃度」という用語は、本明細書で使用するように、正常な非罹患関節で見られるレベルより、標準偏差の少なくとも３倍高い罹患関節の滑膜組織におけるＩＬ−６のレベルを指す。
【００２６】
「異常に高い割合の骨びらん」という用語は、本明細書で使用するように、標準Ｘ線撮影方法によって決定される骨の少なくとも１つの寸法の検出可能な減少を指す。
【００２７】
「異常に高い割合の軟骨破壊」という用語は、本明細書で使用するように、標準Ｘ線撮影方法によって決定される、検出可能な関節空間の狭窄を指す。非罹患関節では、狭窄は検知できない。
【００２８】
「異常に上昇した滑膜細胞密度」という用語は、本明細書で使用するように、関節の滑膜組織が、正常な、すなわち非罹患関節の滑膜組織に見られる滑膜細胞の数の少なくとも１０倍である多数の滑膜細胞を含有する状態を指す。
【００２９】
「投与する工程」は、当業者に既知の医薬組成物を投与する標準方法のいずれかを意味する。例としては、静脈内、筋肉内または腹腔内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「ＣＤ９９活性のアンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用するように、慢性関節リウマチに関連することが示されたＣＤ９９の４つ生物活性：（１）単球補充、（２）Ｔ細胞増殖、（３）Ｔ細胞活性化および（４）Ｔ細胞補充のいずれか１つを阻害する特性を指す。阻害は、拮抗性であるために、阻害は１００％有効である必要はない。
【００３１】
「薬物」という用語は、既知または未知の生物機構によって生体系に影響を及ぼしうる、治療的に使用されるまたは使用されない、いずれかの程度の複雑さの化合物を指す。薬物の例は、研究または治療上の興味がある代表的な小分子；天然に存在する因子（例えば、エンドクリン、パラクリン、またはオートクライン因子）、抗体、あるいはいずれかの種類の細胞レセプターと相互作用する因子；細胞内因子（例えば、細胞内シグナル伝達経路の要素；他の天然源から単離された因子）；農薬；除草剤；および殺虫剤を含む。薬物は、遺伝子療法で使用される薬剤、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡも含む。また抗体、ウィルス、細菌、ならびに細菌およびウィルスによって産生された生物活性剤（例えば、毒素）も薬物と見なすことができる。薬物に対する応答は、例えば、ＲＮＡの１つ以上の種の転写または分解における薬物媒介変化、１つ以上のポリペプチドの翻訳または翻訳後処理の割合または程度における薬物媒介変化、１つ以上のタンパク質の分解の割合または程度における薬物媒介変化、１つ以上のタンパク質の作用または活性の薬物媒介阻害または刺激などの結果でありうる。ある例において、薬物は、タンパク質と相互作用することによってその効果を働かせることができる。ある用途では、薬物は例えば、１つ以上の薬物を含む組成物または１つ以上の薬物および１つ以上の賦形剤を含む組成物を含むこともできる。
【００３２】
「炎症性疾患」は、以下のいずれか１つ：炎症性応答のトリガ；炎症性カスケードのいずれかのメンバーのアップレギュレーション；炎症性カスケードのいずれかのメンバーのダウンレギュレーションを特徴とする、さまざまな疾患および障害のクラスを指す。炎症性疾患は、糖尿病、動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、炎症性大動脈瘤、再狭窄、虚血／再潅流傷害、糸球体腎炎、再狭窄、再潅流傷害、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ライター症候群、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、強直性脊椎炎、股関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、骨盤腹膜炎、多発性硬化症、糖尿病、骨髄炎、癒着性関節包炎、少数関節炎、変形性関節炎、関節周囲炎、多発性関節炎、乾癬、スティル病、滑膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、および炎症性皮膚疾患を含む。単数形の用語「炎症性疾患」は、炎症性疾患のクラスから選択されるいずれかの１つ以上の疾患を含み、疾患状態の成分が炎症性疾患のクラスから選択される疾患を含み、そしていずれかの複合および複雑な疾患状態を含む。
【００３３】
「関節」という用語は、本明細書で使用するように、滑膜組織、滑膜液、関節軟骨、骨組織、ならびにその細胞および細胞外構成物、そしてそれらが含有する溶解性メディエータを含む。
【００３４】
「メトトレキサート不応答者」という用語は、メトトレキサート処置に効果的に応答しない、またはメトトレキサートに最初は応答するが、時間が経つにつれて不応となる慢性関節リウマチ患者を指す。
【００３５】
「ＴＮＦ−α遮断軟骨不応答者」という用語は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、低下した滑膜過形成を示すが、軟骨破壊の最小限の低下を示す、低い初期ＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者を指す。
【００３６】
「ＴＮＦ−α遮断過形成不応答者」という用語は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、軟骨破壊の改善を生じるが、滑膜過形成のわずかな低下を生じる、異常に高いまたは耐性レベルのＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者を指す。
【００３７】
「ＴＮＦ−α遮断二重不応答者」という用語は、ＴＮＦ−α遮断に応答して、滑膜過形成および軟骨破壊の両方で低い応答を示す、無視できる初期ＴＮＦ−α活性を有する慢性関節リウマチ患者を指す。
【００３８】
「患者」という用語は、いずれかの温血動物、好ましくはヒトを指す。慢性関節リウマチを有する患者は、慢性関節リウマチと診断された患者、慢性関節リウマチに関連する症状の１つ以上を示す患者、あるいは慢性関節リウマチを発症するリスクに向かって進行している、またはリスクに瀕している患者を含むことができる。
【００３９】
本発明の薬物の「治療有効量」は本明細書で使用するように、リウマチ関節における滑膜細胞の増加またはリウマチ関節での軟骨破壊率の低下または滑膜組織でのＩＬ−６濃度の低下または骨びらん率の低下を示し、それにより慢性関節リウマチに関連する疼痛および炎症の後退および緩和を引き起こす、化合物の量を意味するものである。
【００４０】
（Ｃ．慢性関節リウマチ関節のインシリコモデル化）
本発明は、関節炎関節のインシリコモデルから得た結果を利用する。モデルは、慢性関節リウマチに罹患したヒト関節の生物学的状態に関連する動的過程の数学的表現を提供する。コンピュータモデルに含まれる主なコンパートメントは、この原型的な慢性関節リウマチ関節の軟骨−パンヌス接合部における滑膜組織および軟骨を表現する。現在のモデルは、以下を含む、軟骨代謝、組織炎症および組織過形成に関与する過程に関連する種々の生物学的変数を考慮する：
・補充、活性化、増殖、アポトーシスおよびその調節を含むマクロファージ個体群動態
・補充、抗原依存性および抗原独立性活性化、増殖、アポトーシスおよびその調節を含むＴ細胞個体群動態
・組織での流入、増殖およびアポトーシスならびにその調節を含む線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）個体群動態
・増殖およびアポトーシスを含む軟骨細胞個体群動態
・表現された異なるＴ細胞型による（マクロファージ、ＦＬＳ、Ｔ細胞、軟骨細胞）成長因子、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質分解酵素およびマトリクスタンパク質を含む、種々のタンパク質の合成および調節
・滑膜組織と軟骨との間でのメディエーターの内皮細胞拡散による接着分子の発現
・サイトカインまたはプロテアーゼおよびその天然インヒビターとの間の相互作用、抗原提示
・細胞メディエーター（抗ＴＮＦ−α剤（例えば、エタネルセプトおよびインフリキシマブ）およびＩＬ−１ ＲＡアンタゴニスト（例えば、アナキンラ））への治療薬剤の結合。
このモデルは、滑膜組織密度および血管体積もモニターする。さらに、数学モデルは治療薬剤（例えば、メトトレキサート、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、溶解性ＴＮＦ−αレセプター、ＴＮＦ−α抗体およびインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト）の効果を考慮できる。
【００４１】
インシリコモデル化は、システムの制御原理を再現するために関連する生物学的−ゲノム、プロテオミクスおよび生理学的−データをコンピュータベースのプラットフォームに統合する手法である。定義された疾患状態の初期条件のセットを考えると、これらのコンピュータモデルは、システムの将来の生物学的挙動、バイオシミュレーションと呼ばれる過程をシミュレートできる。
【００４２】
（１．慢性関節リウマチモデル化のトップダウン手法）
本発明のコンピュータモデルは、慢性関節リウマチを示す挙動の一般的なセットを定義することによって開始した「トップダウン」手法を使用して構築した。これらの挙動は、次にシステムへの制約として使用され、内在する詳細の次のレベルを定義するために、ネスト化されたサブシステムのセットが開発される。例えば、慢性関節リウマチにおける軟骨破壊の挙動を考えると、その挙動を含む特定の機構が次にそれぞれモデル化され、サブシステムのセットを生じ、それ自体は分解され、細部にわたってモデル化される。したがってこれらのサブシステムの制御および状況は、システムの動態を全体として特徴付ける挙動によってすでに定義されている。分解過程は、慢性関節リウマチの既知の生物学的挙動を反復するのに十分な詳細が存在するまで、トップダウンからより多くの生物学的モデル化を継続する。
【００４３】
トップダウン手法を使用するときに、（１）基本生物学を説明する、（２）システム全体の生理的機能または挙動を説明する、という２つの具体的な目的を支持するために、公開データおよび独占データが識別および収集される。システム全体の生理的機能または挙動を説明するデータは、モデル開発の早期に選択される。これらのデータは、モデルシステムの広範囲に亘る挙動、例えば、慢性関節リウマチ患者の測定値（挙動）としての軟骨破壊を表す。これらのデータは、十分に確立された臨床試験に基づくヒトインビボデータである。基本生物学を説明するデータは、選択した挙動をシミュレートするのに必要なサブシステムを十分にモデル化するために選択される。これらのデータは、内在する生物学の知識を提供する、ヒトまたは動物（ヒトが好ましいが、必ずしも利用可能ではない場合）のインビボデータ、インビトロデータまたはエクスビボデータでありうる。
【００４４】
このモデル化手法は、サブシステムレベルで生物学を操作して、シミュレートされた挙動をシステムレベルで観察することによって、研究者に「仮定．．．」シナリオを提示および迅速に開発させる。この手法を通じて、研究者は、一般に受入れられているが、なお証明されていない仮説との不一致を発見し、科学者が利用可能なおびただしい量のインビトロデータおよびインビボデータからの重要な知識ギャップを識別することができる。不一致および知識ギャップが識別されるときに、モデルを使用すると、より焦点の合った、よりよく設計された具体的なデータ収集作業に注力することができ、それらはさらに予測的で効率的に利用されるデータを生じる。
【００４５】
トップダウン手法は、ヒト関節における慢性関節リウマチのモデルを開発するのに使用された。同様のモデルは、２００３年４月２４日に２００３−００７８７５９として公開された、同時係属Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １０／１５４，１２３で述べられている。現在のモデルでは、４つの重要な臨床結果：滑膜細胞密度、軟骨破壊率、滑膜組織中のＩＬ−６のレベルおよび骨びらん率に特に興味がある。慢性関節リウマチは、末梢血中の炎症誘発性サイトカイン、特にＩＬ−６のレベル上昇を伴う全身性炎症性疾患である：Ｃ応答性タンパク質（ＣＲＰ）は、血漿中で日常的に測定される炎症の一般的なマーカーであり、複数の研究が慢性関節リウマチ患者でのＩＬ−６濃度とＣＲＰ濃度の相関を示している。したがって関節中または血漿中のどちらかのＩＬ−６濃度は、炎症の良好なマーカーとなる。
【００４６】
（２．感受性解析）
疾患の内在する生物学の明示的な表現は、特定の臨床結果、例えば、軟骨破壊または滑膜細胞密度に対して最も影響のあるサブシステムを識別するために、単独でのまたは組合された各サブシステムの調節を可能にする。表現型開始および進行または慢性関節リウマチに最大の影響を持つこれらのサブシステムのモデル化およびデータ収集作業に集中することによって、この手法は、システムの複雑さをさらに明確に表現して、慢性関節リウマチの病態生理学に内在する原因因子を識別するのに役立つ。インシリコで各システムを調節する（例えば、１つの細胞種または細胞間メディエーターをノックアウトする、あるいは１つの特定の生物プロセスを遮断する）ことによって、慢性関節リウマチを促進する生物学的現象をよりよく理解し、それゆえ最良の、最も関連する標的を識別するために、疾患病態生理学全体へのその寄与を評価することができる。
【００４７】
慢性関節リウマチの場合、疾患状態は、例えば、疾患状態を引き起こす、疾患状態に影響を及ぼす、または疾患状態によって改変される１つ以上の生物プロセスを示すことのできる酵素活性、生成物形成動態および細胞機能に関連するアウトプットとして表現できる。通例、コンピュータモデルのアウトプットは、生物学的構成要素のレベルまたは活性あるいは疾患状態の他のいずれかの挙動を示す値のセットを含む。これらのアウトプットに基づいて、１つ以上の生物プロセスを重要な生物プロセスと呼ぶことができる。
【００４８】
コンピュータモデルは、１つ以上の生物プロセスへの改変を表すために実行できる。特に生物プロセスへの改変は、生物プロセスと慢性関節リウマチとの間の関連度（例えば、相関度）を識別するためにコンピュータモデルにて表現できる。例えば、生物プロセスへの改変は、生物プロセスが慢性関節リウマチを発症させる、慢性関節リウマチに影響を及ぼす、または慢性関節リウマチによって改変される程度を識別するために、コンピュータモデルにて表現できる。生物プロセスは、慢性関節リウマチに関連する症状、例えば、滑膜組織での滑膜細胞密度、軟骨破壊およびＩＬ−６レベルの上昇を生じさせるこの生物プロセスへの改変が観察された場合に、慢性関節リウマチを引き起こすとして識別できる。ある例において、生物プロセスへの改変は、他の生物プロセスと慢性関節リウマチとの間の関連度を識別するために、コンピュータモデルにて表現できる。
【００４９】
いくつかの例において、生物プロセスのセットを識別することは、感受性解析を含むことができる。感受性解析は、疾患状態に関連する生物プロセスの優先順位決定を含むことができる。感受性解析は、この優先順位決定の頑強さを判定するために、コンピュータモデルの種々の構成を用いて実施できる。いくつかの例において、感受性解析は、疾患状態との関連度に基づいた生物プロセスの順位序列を含むことができる。感受性解析によって、ユーザは疾患状態の状況における生物プロセスの重要性を決定できる。非常に重要な生物プロセスの例は、疾患状態の重篤度を上昇させる生物プロセスである。それゆえこの生物プロセスの阻害は、疾患状態の重篤度を低下させることができる。生物プロセスの重要性は、その生物プロセスと疾患状態との間の関連の存在だけでなく、疾患状態の重篤度において変更を達成するために生物プロセスを改変しなければならない程度にも依存しうる。順位序列において、疾患状態においてより重要な役割を果たす生物プロセスは通例、より高い順位を得る。順位序列は、疾患状態においてより重要な役割を果たす生物プロセスがより低い順位を得るような逆の方法でも実施できる。通例、生物プロセスのセットは、疾患状態においてより重要な役割を果たすとして識別される生物プロセスを含む。
【００５０】
慢性関節リウマチの感受性解析の処理の間に、これらに限定されるわけではないが、単球補充、Ｔ細胞補充、細胞アポトーシス、およびサイトカイン産生などの生物プロセスの活性は、コンピュータモデルで一度に１つずつ調節される（増加または減少する）。次にバイオシミュレーションが実施され、刺激または阻害の異なるレベルでの１つの生物プロセスの調節の結果が、これらに限定されるわけではないが、軟骨破壊、滑膜細胞密度およびＩＬ−６レベルなどの臨床結果を測定することによって評価される。この解析の結果は、臨床結果に著しい影響を有する生物プロセスを識別した。
【００５１】
本発明において、感受性解析は、疾患病態生理学に著しい影響を有する慢性関節リウマチの生物学の４つの分野：（１）マクロファージアポトーシス、（２）インターフェロン−ガンマ産生、（３）Ｔｈ１細胞活性化ならびに（４）Ｔ細胞および単球補充を識別した。
【００５２】
（３．標的の同定）
上述のモデルによって予測されたＣＤ９９活性阻害の効果に基づいて、ＣＤ９９遮断は慢性関節リウマチの効果的な療法であることが予測される。
【００５３】
単球補充、およびＴ細胞増殖、活性化および補充に対するＣＤ９９の効果は定量され、慢性関節リウマチのコンピュータモデルにおいて明示的に表現された。これらの各生物プロセスに対するＣＤ９９活性の寄与が明確に特徴付けされていないため、ＣＤ９９活性の寄与を特徴付けるために一連の効果を定義した（表１）。「より低い最大効果」の値は、他のタンパク質との考えられる重複を考慮して記録された最も低い効果を表し、「より高い最大効果」は各生物プロセスに対するＣＤ９９活性の最大の考えられる効果であり、「最も有望な最大効果」は、生体内環境および重複を考慮した、各生物プロセスにおけるＣＤ９９活性の現実的な寄与の概算である。
【００５４】
（表１．関節モデルに対するＣＤ９９活性の効果）
【００５５】
【表１】
次に、慢性関節リウマチに対するＣＤ９９活性の効果のシミュレーションを、関連する生物プロセスすべてにおいて、いっせいに、または一度に１つの生物プロセスで、または複数の生物プロセスを組合せてＣＤ９９を遮断することによって実施した。シミュレーションの結果は、６ヶ月間のＣＤ９９活性の遮断が軟骨破壊を１５〜６０％、滑膜細胞過形成を４０〜７０％、滑膜組織中のＩＬ−６レベルを１６〜６０％低下させることによって、慢性関節リウマチの臨床結果を改善することを示した。図３は、滑膜細胞密度に対するＣＤ９９活性の効果を示す。図４は、軟骨破壊に対するＣＤ９９活性の効果を示す。図５は、滑膜組織中のＩＬ−６レベルに対するＣＤ９９活性の効果を示す。
【００５６】
メトトレキサートは、慢性関節リウマチには一般的な処置である。メトトレキサート処置は、滑膜細胞密度をおおよそ３０％低下させ、軟骨破壊率をおおよそ１５％低下させ、滑膜組織におけるＩＬ−６の濃度を９３％低下させることが既知である。１００％有効性では、コンピュータモデルはＣＤ９９拮抗作用がメトトレキサートよりも大きな改善を誘発することを予測する。モデルは、ＣＤ９９活性の阻害の７０％のみを引き起こす化合物が、滑膜細胞密度の低下においてメトトレキサートよりも優れており、軟骨破壊率に対してはおおよそ同じかまたは優れた効果を有することを予測している。
【００５７】
一度の１つの生物プロセスにおけるＣＤ９９遮断のシミュレーションは、臨床結果に対するＣＤ９９遮断の影響を引き起こす主な生物プロセスが単球補充に対する効果であることを示した。コンピュータモデルは、単球補充に対するＣＤ９９遮断の効果が観察された臨床改善の９０％超の原因であることを明らかにしている。図６は、ＩＦＮγの単球血管外遊走（単球補充）、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を与える。
【００５８】
ある慢性関節リウマチ患者は、メトトレキサート処置（初期不応答者）に効果的に応答しないが、メトトレキサートに最初は応答した他の患者は、時間が経つにつれて不応となる（漸進的不応答者）。メトトレキサート耐性患者でのＣＤ９９活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者とは異なる応答パターンを明らかにする。図７は、メトトレキサート耐性患者におけるＩＦＮγの単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を示している。メトトレキサート耐性患者では、Ｔ細胞補充でのＣＤ９９活性は、非耐性慢性関節リウマチ患者と比較して、慢性関節リウマチの症状を引き起こすのに実質的により大きな役割を果たしている（図６を参照）。シミュレーションの結果は、メトトレキサート耐性患者における６ヶ月間のＣＤ９９活性の遮断は、軟骨破壊を１２〜４５％減少させ、滑膜細胞過形成を２５〜５０％減少させることによって、慢性関節リウマチ臨床結果を改善できることを示した。図８は、メトトレキサート耐性患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。図９は、メトトレキサート耐性患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【００５９】
ＴＮＦ−α中和療法は、慢性関節リウマチ患者の処置においてますます重要になっている。しかしながらすべての慢性関節リウマチ患者のほぼ３分の１が、ＴＮＦ−α中和療法に対する臨床的に著しい応答を達成できない。ＴＮＦ−α遮断不応答者の３つの潜在的なクラスが上述のモデルで定義された。滑膜過形成および軟骨破壊は、ＴＮＦ−αが異なる範囲内で変化するときに異なって影響を受け、現在のモデル内での３つの不応答者クラスの識別をもたらす。特に低い初期ＴＮＦ−α活性の患者は、ＴＮＦ−α遮断に応答して滑膜過形成が低下、しかし軟骨破壊の最低限の減少を示すが（軟骨不応答者、すなわちＣＮＲ）、無視できる初期ＴＮＦ−α活性患者は、滑膜過形成および軟骨破壊の療法で不十分な応答を示す（二重不応答者、すなわちＤＮＲ）。あるいはＴＮＦ−α活性の異常に高いかまたは耐性レベルの患者におけるＴＮＦ−αの不十分な中和は、軟骨破壊の改善を生じるが、過形成においては不十分な応答を生じる（過形成不応答者、すなわちＨＮＲ）。機械的に、低レベルのＴＮＦ−αの患者では、疾患は、代わりのマクロファージ活性化経路（例えば、ＣＤ４０結合）の活性上昇、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の活性低下、および破壊促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−ｌｂ）の活性上昇によって永続される。無応答患者も、ＩＬ−１Ｒａなどの他の療法に変化した応答を示した（データは示さず）。
【００６０】
ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者におけるＣＤ９９活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者においてと同様の応答パターンを明らかにする。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者におけるＩＦＮγの単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。シミュレーションの結果は、ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者での６ヶ月間のＣＤ９９活性の完全な遮断が軟骨破壊を１１〜３５％減少させ、滑膜細胞過形成を３５〜６１％減少させることによって、慢性関節リウマチ臨床結果を改善することを示した。図１１は、ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。図１２は、ＴＮＦ−α遮断ＣＮＲ患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【００６１】
ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者におけるＣＤ９９活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者においてと同様の応答パターンを明らかにする。図１３Ａおよび１３Ｂは、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者におけるＩＦＮγの単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。シミュレーションの結果は、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者での６ヶ月間のＣＤ９９活性の完全な遮断が軟骨破壊を１１〜２７％減少させ、滑膜細胞過形成を２９〜５１％減少させることによって、慢性関節リウマチ臨床結果を改善することを示した。図１４は、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。図１５は、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【００６２】
ＴＮＦ−α遮断ＤＮＲ患者におけるＣＤ９９活性遮断のシミュレーションは、非耐性患者においてと同様の応答パターンを明らかにする。図１６Ａおよび１６Ｂは、ＴＮＦ−α−遮断ＤＮＲ患者におけるＩＦＮγの単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生に対するＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。シミュレーションの結果は、ＴＮＦ−α遮断ＨＮＲ患者での６ヶ月間のＣＤ９９活性の完全な遮断が軟骨破壊を６〜３８％減少させ、滑膜細胞過形成を９〜４７％減少させることによって、慢性関節リウマチ臨床結果を改善することを示した。図１７は、ＴＮＦ−α遮断ＤＮＲ患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。図１８は、ＴＮＦ−α遮断ＤＮＲ患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【００６３】
慢性関節リウマチのインシリコモデルの利用は、ＣＤ９９活性の拮抗作用が慢性関節リウマチに罹患している患者にとって有望な治療方法であるという、驚くべき結果を与えた。
【００６４】
（Ｄ．ＣＤ９９）
ＣＤ９９（ＭＩＣ２またはＥ２抗原とも呼ばれる）は、ｍｉｃ２遺伝子によってコード化された３２ｋＤ細胞表面（膜貫通）糖タンパク質である。ｍｉｃ２遺伝子は、一度の細胞膜に及ぶ１６．７ｋＤのＩ型膜貫通タンパク質を予測する。コンセンサスＮ結合グリコシル化部位はないが、Ｏ結合グリコシル化の複数の部位があり、３２ｋＤのＣＤ９９の見かけの分子量の１４ｋＤを説明している。ＣＤ９９は、既知のタンパク質ファミリのメンバーではない。ＣＤ９９は、たいていは単球、末梢Ｔ細胞（ＲＯ＋のみ）、Ｂ細胞、および胸腺細胞で発現される接着分子である。
【００６５】
ＣＤ９９は、種々の癌、例えば、ユーイング肉腫（Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ，２０００）、ホジキンおよびリード・シュテルンベルグＢ細胞（Ｋｉｍ，Ｂｌｏｏｄ ２０００）ならびに乳癌（Ｌｅｅ，２００２）において効果を有することが証明されている。ＣＤ９９の機能は、Ｔ細胞で最も良好に特徴付けられており、そこではヒツジ血液細胞ロゼット形成の現象のためのＣＤ２への別のリガンドであることが見出された。さらに胸腺細胞およびＴ細胞へのＣＤ９９の結合は、あるインビトロシステムにおいて同時刺激機能を果たすことが示されている。ＣＤ９９の活性は、慢性関節リウマチに関連しているとして文献に述べられていない。
【００６６】
その機能はなお研究中であるが、ホモタイプ結合によって媒介されるＣＤ９９の一部の重要な効果は、慢性関節リウマチの状況に関連しうる。ＣＤ９９は、ＣＤ９９が接着分子として作用する内皮細胞を通じて細胞補充を引き起こすイベントのカスケードにおける工程である、漏出、すなわち経内皮移動で重要な役割を果たすことが示されている。単球漏出は、ＣＤ９９活性に強く依存する。一般に漏出は、内皮細胞が例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１または他の炎症誘発性メディエータによって活性化されたときに起こる。経内皮移動はまた、内皮細胞の直接活性化の非存在下でも、白血球接着の結果として、内皮細胞に亘って通常は低いレベルで内因的に発生する。それゆえ移動は、炎症性病巣にて生体内で起こる。ＣＤ９９は、単球の補充にも関与する（Ｓｃｈｅｎｋｅｌ，２００２）。
【００６７】
ＣＤ９９は、ＶＣＡＭ−１のアップレギュレーションを介したＴ細胞血管接着で間接的な役割も果たす。ＣＤ９９はＴ細胞シグナル伝達（Ｗａｃｌａｖｉｃｅｋ １９９８，Ｗｉｎｇｏｔｔ １９９９，Ｂｅｒｎａｒｄ ２０００）、Ｔ細胞の補充（Ｂｅｒｎａｒｄ，２０００）、Ｔ細胞のサイトカイン産生および活性化（Ｗａｃｌａｖｉｃｅｋ １９９８，Ｗｉｎｇｏｔｔ ２０００）および胸腺細胞のアポトーシス（Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ）にも関係してきた。
【００６８】
多数のマウスおよびラットモノクローナル抗体がＣＤ９９の種々のエピトープに対して開発されてきたが、ＣＤ９９の遮断では３つのみが試験されている。これらはＨｅｃ２（Ｓｃｈｅｎｋｅｌ ２００３）、Ｏ６６２（Ｂｅｒｎａｒｄ １９９５，１９９７）、およびＤ４４（Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｂｏｕｍｓｅｌｌ）である。これらの抗体はそれぞれ、経内皮移動をある程度まで阻害する。本発明に使用できる他の抗ＣＤ９９抗体としては：Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０が挙げられるが、これらに限定されない。アンチセンスＲＮＡインヒビターも、ＣＤ９９の活性に拮抗することが証明されている（Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９２：４２８７−４２９５（１９９８））。ＥＢウィルス潜在タンパク質１（ＬＭＰ−１）は、表面ＣＤ９９発現のダウンレギュレーション、それゆえ活性を直接引き起こすことも示されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９５：２９４−３００（２０００））。
【００６９】
（Ｅ．ＣＤ９９アンタゴニストおよび抗リウマチ薬を同定する方法）
（１．単球補充）
ＣＤ９９活性のアンタゴニストを同定する１つの好ましいアッセイは、代表的な血管外移動アッセイの改変である。単球は、内因性（内皮によって作成された）または外因性化学誘引物質の下部ウェル上の多孔性支持体で増殖する内皮層上に浮遊している。アッセイ終了時に下部チャンバに達した単球は、移動したとしてカウントされる。ＣＤ９９の活性を阻害する化合物は、内皮層で移動する細胞の数は減少するであろう。
【００７０】
１つの好ましいアッセイにおいて、内皮細胞は、フィブロネクチンを重ねた水和Ｉ型コラーゲンゲル上で培養される。培地の成分は多孔性ゲル中に浸透する。あるいは内皮細胞は、下部チャンバ上に吊るされた多孔性フィルタの上面で培養される。培地は、上部および下部チャンバに配置されて、単層の先端面および基底面に達する。単球は上部チャンバに添加される。「移動した」とカウントするためには、単球は（１）内皮細胞の上端面に付着し、（２）細胞内接合点まで移動して、（３）内皮細胞間で漏出し、（４）内皮細胞から分離して、基底薄層に浸透し、（５）フィルタまたはゲルを通過して、（６）フィルタまたはゲルから分離して、下部チャンバに入る必要がある。
【００７１】
健常またはリウマチドナーの末梢血から新たに単離された単球または好中球は、試験化合物の存在下または非存在下でコンフルエント内皮単層上に３７℃にて静置する。アッセイは、これに限定されるわけではないが、場合によりヒト血清アルブミンを添加した完全培地、培地１９９、またはＲＰＭＩ１６４０を含む種々の培地で実施される。十分な経内皮移動時間、一般に１時間後、単層をＥＧＴＡなどのキレート化剤で洗浄して、上端面になお結合している単球または好中球を除去する。コラーゲンゲルを基材として使用する場合、次に単層を、２価カチオンを含むリン酸緩衝生理食塩水ですすいで、グルタルアルデヒド中で一晩固定する。固定はコラーゲンゲルを強化するので、ゲルが操作しやすくなる。単層は好ましくはＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａを用いて染色し、好ましくはノマルスキー顕微鏡下で直接観察するためにスライドに載せる。ノマルスキー顕微鏡を使用すると、焦点面によって、単層の上端面に付着した単球または好中球を移動したものから識別することができる。血管外移動の定量化できる基準は、単層の下で移動した、単層に関連するこれらの単球または好中球のパーセンテージである。したがって血管外移動の測定は、単層への接着度とは独立している。
【００７２】
単球または好中球の移動は、内皮のサイトカイン刺激の存在下または非存在下で決定できる。内皮細胞の活性化は、刺激メディエータとの接触から生じうる。本発明の目的では、内皮細胞の活性化は好ましくは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）などのサイトカインとの接触から生じる。
【００７３】
「内皮細胞」という用語は、当該分野での普通の意味を有する。内皮細胞は、体全体で特に血管組織（静脈、動脈、および毛細血管）の管腔に見られる内皮を構成する。関節炎では、白血球が循環血から関節に移動して、そこで炎症に関与する。
（２．Ｔ細胞補充）
同様の血管外移動アッセイを、健常およびリウマチドナーの末梢血から新たに単離したＴリンパ球に利用できる。単離後、精製Ｔリンパ球は、試験化合物の存在下または非存在下でコンフルエント内皮単層上に３７℃にて静置する。アッセイは、これに限定されるわけではないが、場合によりヒト血清アルブミンを添加した完全培地、培地１９９、またはＲＰＭＩ１６４０を含む種々の培地で実施される。十分な経内皮移動時間、一般に１時間の後、単層をＥＧＴＡなどのキレート化剤で洗浄して、上端面になお結合しているＴ細胞を除去する。コラーゲンゲルを基材として使用する場合、次に単層を、２価カチオンを含むリン酸緩衝生理食塩水ですすいで、グルタルアルデヒド中で一晩固定する。固定はコラーゲンゲルを強化するので、ゲルが操作しやすくなる。単層は好ましくはＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａを用いて染色し、好ましくはノマルスキー顕微鏡下で直接観察するためにスライドに載せる。ノマルスキー顕微鏡を使用すると、焦点面によって、単層の上端面に付着したＴ細胞を移動したものから識別することができる。血管外移動の定量化できる基準は、単層の下で移動した、単層に関連するこれらのＴ細胞のパーセンテージである。
【００７４】
Ｔ細胞の移動は、内皮のサイトカイン刺激の存在下または非存在下で決定できる。内皮細胞の活性化は、刺激メディエータとの接触から生じうる。本発明の目的では、内皮細胞の活性化は好ましくは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）などのサイトカインとの接触から生じる。
【００７５】
（３．インビトロＴ細胞増殖）
ＣＤ９９活性のアンタゴニストを評価する好ましい方法は、活性化がＴ細胞の増殖によって定義されるＴ細胞活性化アッセイの使用による。Ｔ細胞は、健常な対象または慢性関節リウマチ患者に由来する。好ましくはＴｈ１細胞が得られるが、しかしながらいずれのＴ細胞個体群が使用される。
【００７６】
Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ９９の正常な結合および他の生理活動を遮断することなく、Ｔ細胞上のＣＤ９９を活性化する抗ＣＤ９９抗体によってＴ細胞を刺激することにより誘発される。１２Ｅ７および３Ｂ２／ＴＡ８は、ＣＤ９９を遮断せずに活性化することが既知である。場合により、Ｔ細胞の刺激を増強するために、抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ３に抗ＣＤ９９抗体を添加することができる。さらに、ＰＭＡまたはイノマイシンなどの化学刺激薬も場合により使用できる。Ｔ細胞が刺激された後、細胞にトリチウム化チミジン［メチル−３Ｈ］ＴｄＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などのＤＮＡ標識を適用する。あるいは細胞の数を直接カウントすることができる。細胞を１２〜２４時間インキュベートして、回収し、放射能カウントする。放射能の量は、生Ｔ細胞の数に相関している。
【００７７】
次にＴ細胞増殖の阻害は、Ｔ細胞を１２〜２４時間に亘って刺激抗体（例えば、１２Ｅ７および３Ｂ２／ＴＡ８）およびＣＤ９９活性のアンタゴニスト（抗体または他の分子）の両方でインキュベートすることによって評価できる。精製Ｔ細胞の残存増殖は、上述したアッセイを使用して評価できる。
【００７８】
（４．Ｔ細胞活性化）
ＣＤ９９活性のアンタゴニストを評価する別の方法は、Ｔ細胞活性化アッセイの使用による。Ｔ細胞活性化は、ＣＤ９９の正常な結合および他の生理活動を遮断することなく、Ｔ細胞上のＣＤ９９を活性化する抗ＣＤ９９抗体によるＴ細胞の刺激後に、サイトカインの産生を測定することによって評価できる。ＣＤ９９を遮断せずに活性化することが既知である。場合により、Ｔ細胞の刺激を増強するために、抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ３に抗ＣＤ９９抗体を添加することができる。さらに、ＰＭＡまたはイノマイシンなどの化学刺激薬も場合により使用できる。次に培養物上澄みを回収して、これに限定されるわけではないが、サンドイッチＥＬＩＳＡなどの方法を使用してサイトカイン濃度を測定した。
【００７９】
Ｔ細胞活性化の阻害（サイトカイン放出によって測定できるように）は、Ｔ細胞を刺激抗体（例えば、１２Ｅ７および３Ｂ２／ＴＡ８）およびＣＤ９９活性のアンタゴニスト（抗体または他の分子）の両方でインキュベートすることによって評価できる。精製Ｔ細胞の残存サイトカイン産生は、上述したアッセイを使用して評価できる。
【００８０】
「Ｔ細胞」という用語は、当該分野での普通の意味を有する。Ｔ細胞は、胸腺から由来して、胸腺処理を受けているため、いわゆるリンパ球のクラスである。これらの細胞は主に、細胞媒介免疫応答の制御およびＢ細胞発生の制御に関与する。Ｔ細胞は、リンフォカインホルモンを分泌することによって免疫系を調整する。
【００８１】
（Ｆ．処置の方法）
別の局面において、本発明は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を、炎症性疾患を有する患者に投与する工程を含む、慢性関節リウマチなどの炎症性疾患の少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。本発明は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を、慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程を含む、慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を軽減する方法も提供する。ＣＤ９９活性のアンタゴニストは、タンパク質、核酸または小分子インヒビターでありうる。好ましいタンパク質アンタゴニストは、抗体、さらに好ましくはモノクローナル抗体である。好ましい核酸アンタゴニストは、ＣＤ９９をコード化する遺伝子である、ｍｉｃ２のアンチセンスインヒビターを含む。本発明は、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を投与することによって、滑膜細胞密度を低下させる方法、軟骨破壊を低下させる方法および滑膜組織中のＩＬ−６濃度を低下させる方法も含む。
【００８２】
本発明で有用な化合物は、医学的に許容される投与経路によって、例えば、経口的に、非経口的に（例えば、筋肉内に、静脈内に、皮下に、腹腔内に）、経皮的に、直腸に、吸入などによって、患者に治療的有効用量で投与される。採用される投薬量範囲は、投与経路および処置される患者の年齢、体重および状態によって変わるであろう。
【００８３】
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、化合物の発現が可能な組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照）、レトロウィルスまたは他のベクターの一部として核酸の作成などの、種々の送達系が既知であり、本発明の組成物を投与するために使用できる。導入の方法は、これに限定されるわけではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外、および経口経路を含む。組成物は、いずれかの好都合な経路によって、例えば、輸液またはボーラス注入によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与されるか、生物活性剤と共に投与される。投与は全身的でも局所的でもよい。さらに、本発明の組成物を脳室内および髄腔内注入を含む、いずれかの適切な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい；脳室内注入は例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取付けられた脳室内カテーテルによって促進される。吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を用いた製剤の使用により、肺投与も利用できる。
【００８４】
（Ｇ．医薬組成物）
（１．抗体）
本発明の抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、ｓＦｖｓ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびにＣＤ９９およびＣＤ９９を発現する細胞に免疫特異的に結合する上のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。「抗体」という用語は本明細書で使用するように、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわちＣＤ９９および／またはＣＤ９９を発現する細胞に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれの種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）、クラス、またはサブクラスでもよい。
【００８５】
本発明の方法で使用されるポリクローナル抗体は、免疫された動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。当該分野で周知の種々の手順がＣＤ９９に対するポリクローナル抗体の産生に使用される。例えば、ポリクローナル抗体の産生では、これに限定されるわけではないがウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物は、ＣＤ９９またはその誘導体を用いた注射によって免疫できる。種々のアジュバントは、宿主種によって免疫応答を上昇させるために使用され、これらとしては、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルヴムが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアジュバントも当該分野で周知である。
【００８６】
本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体は、特定の抗原（例えば、ＣＤ９９）への抗体の均一な集団である。本発明の目的では「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ細胞によって産生された抗体である。例えば、Ｂリンパ球を産生する抗体と不死化Ｂリンパ球細胞系との融合による、モノクローナル抗体−合成ハイブリドーマ細胞を作成する方法は、当業者に周知である。好ましくは、モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、または最も好ましくはヒトモノクローナル抗体である。
【００８７】
ＣＤ９９に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培養物中の連続細胞系による抗体分子の産生を規定する、当該分野で既知のいずれかの技法によって作成できる。これらとしては、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に述べられたハイブリドーマ技法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７）、さらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤ、ならびにそのサブクラスを含むいずれかの免疫グロブリンの抗体でもよい。本発明で有用なｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養される。
【００８８】
本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体としては、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野で既知の多くの技法のいずれかによって産生される（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０，７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２−７９；およびＯｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２，３−１６）。
【００８９】
本発明は、ＣＤ９９および／またはＣＤ９９を発現する細胞に免疫特異的に結合する抗体の機能的に活性な断片、誘導体または類似物質の使用を提供する。「機能的に活性な」は、断片、誘導体または類似物質の由来する抗体が認識されるように、断片、誘導体または類似物質が同じ抗原を認識する抗−抗−イディオタイプ抗体を誘発できることを意味する。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、枠組みおよび特異的に抗原を認識するＣＤＲ配列に対してＣ末端であるＣＤＲ配列の欠失によって向上される。抗原に結合するＣＤＲ配列を判定するためには、当該分野で既知のいずれかの結合アッセイ方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）によって、ＣＤＲ配列を含有する合成ペプチドを抗原との結合アッセイに使用できる。
【００９０】
本発明の他の実施形態は、本発明の抗体の断片としては、例えば、抗体分子のペプシン消化によって産生できる可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有するＦ（ａｂ’）２断片、ならびにＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィドブリッジを還元することによって産生できるＦａｂ断片が挙げられるがこれらに限定されない。本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖ダイマー、またはその最小断片、例えば、Ｆｖｓまたは単鎖抗体（ＳＣＡ）（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４に述べられている）あるいは本発明の抗体と同じ特異性を持つ他のいずれかの分子も提供する。
【００９１】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して作製できる、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組換え抗体、例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種から由来する分子、例えば、マウスモノクローナルに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である（例えば、参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号を参照）。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からの枠組み領域を有する、非ヒト種からの抗体分子である（例えば、参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第，５８５，０８９号）。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で既知の組換えＤＮＡ技法によって、例えば、それぞれ参考としてその全体が本明細書に援用される、国際公開番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；Ｅ欧州特許出願１７３，４９４；国際公開番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｅ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に述べられている方法を使用して産生できる。
【００９２】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処置に特に好ましい。そのような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して産生できる。トランスジェニックマウスは、選択した抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部を用いて通常の方法で免疫される。抗原に向けられたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスに宿されたヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に転位して、次にクラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。それゆえそのような技法を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することができる。ヒト抗体を産生するこの技法の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するこの技法およびそのような抗体を産生するプロトコルの詳細な議論については、例えば、それぞれ参考としてその全体が本明細書に援用される、米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号を参照。さらにＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（フレモント、カリフォルニア州）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（サンノゼ、カリフォルニア）などの企業は、上述した技術と同様の技術を使用して、選択した抗原に対するヒト抗原の提供に従事することができる。
【００９３】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導された選択」と呼ばれる技法を使用して産生できる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【００９４】
（２．製剤）
本発明の局面は、温血動物の慢性関節リウマチを処置するのに有用な薬物を製造する方法を提供する。薬物は、経口、局所、経皮、経直腸、吸入、非経口（静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与などに適した組成物を提供するために、既知の処方技法に従って調製される。本発明の組成物を調製するための詳細な指針は、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４０のＭａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．によって出版されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓの１８ｔｈまたは１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎを参照することによって見出される。適切な部分は、参考として本明細書に援用される。
【００９５】
単位用量または複数回用量様式が考慮され、それぞれある臨床状況において利点を提供する。単位用量は、慢性関節リウマチを処置する状況において所望の効果を生じるように計算されたＣＤ９９活性のアンタゴニストの規定量を含有する。複数回用量様式は、所望の結果を達成するために複数の１回用量、または分別用量が必要なときに、特に有用である。これらの投薬様式のどちらも、特定の化合物の独自の特徴、達成される特定の治療効果および癌の処置のための特定の化合物を調製する当該分野に固有の制限によって規定される、またはそれらに直接依存する仕様を有する。
【００９６】
単位用量は、対象において慢性関節リウマチを処置するのに十分な治療有効量を含有し、化合物を約１．０〜１０００ｍｇ、例えば、約５０〜５００ｍｇ含有する。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明の薬物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として、日常的な手順に従って処方される。通例、静脈内投与用の医薬組成物は、滅菌等張水性緩衝液による溶液である。必要な場合に医薬組成物は、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含む。一般に成分は、活性剤の量を表示したアンプルまたはサシェなどの密封容器内の例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、個別に、または共に混合されて単位投薬様式で供給される。組成物が輸液によって投与される場合、滅菌製薬グレードの水または生理食塩水を含有する輸液ボトルを用いて分配できる。組成物を注射によって投与する場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合されるように提供することができる。
【００９８】
本発明の薬物は、中性または塩の形状として製剤できる。製薬的に許容される塩は、アニオンを用いて形成された塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩、およびカチオンを用いて形成された塩、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩を含む。
【００９９】
化合物は好ましくは、摂取錠剤、口腔錠、カプセル剤、カプレット剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、トローチ剤、ウェファ剤、菱形錠などどの適切な製剤で経口投与される。一般に最も容易な製剤は、錠剤またはカプセル剤である（個別にまたは集合的に「経口投薬単位」と呼ばれる）。適切な製剤は、化合物の特徴を適切な組成物を配合するために利用可能な賦形剤に適合させることができる標準配合技法に従って調製される。
【０１００】
その形式は、化合物を迅速に送達するか、または持続放出性調製物である。化合物は、硬カプセルまたは軟カプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または飲料、食品またはそうでなければ食餌に包含される。最終組成物および調製物のパーセンテージはもちろん変化して、好都合には最終形、例えば、錠剤の重量の１〜９０％の範囲である。そのように治療的に有用な組成物の量は、適切な投薬量が得られるようになっている。本発明による好ましい組成物は、経口投薬単位形が５〜１０００ｍｇの重さの投薬単位中で約５．０〜約５０重量％（％ｗ）を含有するように調製される。
【０１０１】
経口投薬単位の適切な製剤は：バインダー、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン；甘味剤、例えば、ラクトースまたはスクロース；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、アルギン酸など；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；または着香料、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油なども含有する。種々の他の物質がコーティングとして、またはそうでなければ経口投薬単位の物理形を改良するために存在する。経口投薬単位は、シェラック、糖またはその両方でコーティングされる。シロップ剤またはエリキシル剤は、化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料および着香料を含有する。利用できるいずれの物質も、製薬的に許容され、実質的に非毒性でなければならない。有用な賦形剤の種類の詳細は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”の第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出される。特に。より完全な議論については９１−９３章を参照。
【０１０２】
本発明の薬物は、非経口的に、例えば、静脈内に、筋肉内に、静脈内に、皮下的に、または腹腔内に投与できる。担体または賦形剤または賦形剤混合物は、溶媒、あるいは例えば、種々の極性または非極性溶媒、その適切な混合物、または油を含有する分散媒体でありうる。本明細書で使用するように、「担体」または「賦形剤」は製薬的に許容される担体または賦形剤を意味し、ありとあらゆる溶媒、分散剤または媒体、コーティング、抗菌剤、等張／低張／高張剤、吸収改良剤などを含む。そのような物質および薬剤の製薬活性物質への使用は、当該分野で周知である。従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物での使用が考慮される。さらに他のまたは補助活性成分も最終組成物に含むことができる。
【０１０３】
化合物の液剤は、希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、種々の油および／またはその混合物、および当業者に既知のその他で調製できる。
【０１０４】
注射用途に適切な製薬形は、滅菌液剤、分散剤、乳剤、および滅菌粉剤を含む。最終形は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならない。その上、最終製薬形は、汚染に対して防御されなければならず、したがって細菌または真菌などの微生物の増殖を阻害できなければならない。単回静脈内または腹腔内用量を投与できる。あるいは、通例１〜８日間続く、低速の長期輸液または複数回の短期１日輸液を利用できる。別の日数または複数日ごとの投薬も利用できる。
【０１０５】
滅菌注射用液剤は、必要な量の化合物を１つ以上の適切な溶媒に含有させて、必要ならば上に挙げた、または当業者に既知である他の成分をそれに添加することによって調製される。滅菌注射用液剤は、必要な量の化合物を必要に応じた種々の他の成分と共に適切な溶媒に含有させることによって調製される。濾過などの滅菌手順が次に続く。通例、分散剤は、分散媒体および上で示した必要な他の成分も含む滅菌ビヒクルに化合物を含有させることによって作成される。滅菌粉剤の場合、好ましい方法は真空乾燥または凍結乾燥を含み、それに必要な成分が添加される。
【０１０６】
いずれの場合でも、上記の最終形は滅菌する必要があり、中空針などの注射器をただちに通過できる必要もある。適正な粘度は、溶媒または賦形剤の適正な選択によって実現および維持される。その上、レクチンなどの分子または粒子コーティングの使用、分散剤中の粒径の適正な選択、または界面活性剤特性を備えた物質の使用が利用される。
【０１０７】
微生物の増殖の防止または阻害は、１つ以上の抗菌剤、例えば、クロロブタノール、アスコルビン酸、パラベン、テルメロサール（ｔｈｅｒｍｅｒｏｓａｌ）などの添加によって実現される。張性を変化させる薬剤、例えば、糖または塩を含むことも好ましい。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明の組成物を処置の必要な部分に局所的に投与することが望ましい；これは例えば、これに限定されるわけではないが、外科処置中の局所輸液、外科処置後の例えば、創傷被覆材と併せた局所塗布によって、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、またはシラスティック膜などの膜、または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料のインプラントによって、実施できる。
【０１０９】
別の実施形態において、組成物は、小胞、特にリポソーム中で送達できる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７−３２７を参照；一般に同書を参照）。
【０１１０】
なお別の実施形態において、組成物は制御放出、または持続放出系で送達できる。１つの実施形態において、ポンプが使用される（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ， １９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照）。別の実施形態において、ポリマー材料を制御放出系に使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照）。なお別の実施形態において、制御放出系を治療標的（例えば、脳、腎臓、胃、膵臓、および肺）に近接して配置し、それゆえ全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４））。
【０１１１】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説に述べられている（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）。
【０１１２】
本発明の薬物がタンパク質をコードする核酸である特定の実施形態において、そのコードされたタンパク質の発現を促進するために、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを作製して、それが細胞内となるように投与することによって、例えば、レトロウィルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または直接注入によって、または微粒子銃（例えば、遺伝子ガン；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、あるいは脂質または細胞表面レセプターあるいは形質移入剤を用いたコーティングによって、あるいは核に入ることが既知であるホメオボックス様ペプチドへの結合へそれを投与することなどによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８を参照）核酸を生体内に投与できる。あるいは核酸は相同組換えによって、細胞内に導入され、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に含むことができる。
【実施例】
【０１１３】
（ＩＶ．実施例）
以下の実施例は、当業者への指針として提供される。実施例は単に本発明の実施形態を理解および実施するのに有用な具体的方法を提供するので、実施例は、本発明を制限するものと見なすべきではない。
【０１１４】
（Ａ．実施例１単球／Ｔ細胞補充）
（細胞）
ヒトＰＢＬは、健常ドナーまたは慢性関節リウマチ患者のクエン酸塩抗凝固処理全血から、デキストラン沈降およびＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上での密度分離によって単離する。この単核細胞を洗浄して、上述したようにナイロンウール上およびプラスチック付着によってさらに精製する（Ｃａｒｒ １９９６）。得られたＰＢＬ（＞９０％ＣＤ３＋Ｔリンパ球）は、使用前にＬＰＳ−無ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で１５〜１８時間培養する。メモリーおよび未変性ＣＤ３＋Ｔリンパ球サブセット（それぞれＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋）は、製造者の説明書に従って磁気細胞分離（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して、ネガティブセレクションによって単離する。ＨＵＶＥＣは、臍帯静脈（ｊａｆｆｅ １９７３）から単離して、１０％ＦＣＳ、８％プールヒト血清、５０μｇ／ｍｌ内皮細胞成長因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０Ｕ／ｍｌブタ腸ヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および抗生物質を含有するＭ１９９中で一次培養物として確立する。実験は、９６ウェル培養プレート内で水和Ｉ型コラーゲンゲル上に培養された継代２の細胞に対して実施する（Ｍｕｌｌｅｒ １９８９）。ある実験では、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌおよび１０Ｕ／ｍｌ最終濃度）あるいは健常ドナーまたは慢性関節リウマチ患者からの希釈滑膜液を最後の４〜２４時間に亘って培地に添加する。
【０１１５】
（抗体）
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州、ロックビル）からのＣＤ１８（ＩＢ４）、ＣＤ１４（３Ｃ１０）およびＭＨＣクラスＩＩ（９．３Ｃ９）に対する抗体をネガティブコントロールとして使用する。抗ＣＤ３１は経内皮移動遮断からのポジティブコントロールとして使用する。抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）および抗ＣＤ２８（ｌｅｕ２８）ｍＡｂはＴ細胞活性化アッセイで使用する。
【０１１６】
内皮細胞の層を通じた単球またはＴ細胞の移動を測定する。このアッセイの詳細は、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７６：８１９−８２８（１９９２）およびＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：４４９−４６０（１９９３）に記載されている。経内皮移動は、Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：１３３７−１３４３（１９９５）およびＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：４４９−４６０（１９９３）で記載されているようにノマルスキー顕微鏡によって定量する。白血球は、健常ボランティアまたは慢性関節リウマチ患者の末梢血から単離して、抗ＣＤ９９ｍＡｂ、１２Ｅ７を用いて以前にインキュベートした水和コラーゲンゲル上で培養したＨＵＶＥＣのコンフルエント単層に添加する。インキュベーション（別途報告しない場合は１時間）の後、非接着性細胞を洗浄することによって除去し、残りの接着性血管外移動細胞は、ｐＨ７．４の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒド中での一晩のインキュベーションによって、内皮単層上の所定の位置に固定する。複数の高倍率視野を顕微鏡下で観察して評価する。血管外移動データは、内皮の下にある単層に残った全細胞のパーセンテージとして表される。ある実験において、抗ＣＤ９９または対照ｍＡｂを白血球、内皮細胞または両方でアッセイの前に３０分間インキュベートして、次に血管外移動開始前に広範囲に亘る洗浄で除去する。ある実験において、標準血管外移動時間の完了時に、ブロッキングｍＡｂを洗い流し、その培養物を同じまたは別のｍＡｂのブロッキング濃度を含有する、または含有しない完全培地内に入れて、インキュベータに戻す。
【０１１７】
経内皮移動もパラフィン包埋した単層の断面上で定量する。これらの試験片は、サンプル単層を折り曲げて慎重に除去して、コラーゲンゲル側を外に向けて内皮表面を互いに合せて配置することによって作成する。このことは包埋プロセス中の細胞の機械的移動を回避する。ワックスでの置換の後、試験片を二等分して、試験片の切断が４つの単層サンプルの断片を生成するようにする（２つの単層それぞれの２つの異なる部分）。定量を３つのレベルのそのような試験片に対して、試験片の異なる部分がサンプリングされて同じ細胞が２回カウントされないように、少なくとも５０μｍ離して実施する。
【０１１８】
（Ｂ．実施例２：Ｔ細胞増殖および活性化Ｔ細胞増殖アッセイ）
健常ボランティアまたは慢性関節リウマチ患者に由来する高度に精製されたＰＢ Ｔ細胞の増殖アッセイ（５ｘ１０４細胞／ウェル）は、９６ウェルＵ底組織培養プレートで最終体積２００μｌとして３通り実施する。増殖は、ＧＡＭ−ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）によって架橋された抗ＣＤ３ｍＡｂ＋抗ＣＤ９９または対照ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）によって、およびＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ；最終濃度、１０−７Ｍ）またはイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ；最終濃度、１μＭ）によって誘発される。固定化ＣＤ３ ｍＡｂを用いた増殖実験では、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）は、ＰＢＳで希釈した０．１２５〜１．０μｇ／ｍｌ精製ＯＫＴ３ ｍＡｂ １００μｌを用いて４℃にて一晩コーティングする。プレートをＰＢＳで２回洗浄して、次にアッセイに使用する。ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）、イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）、そしてｍＡｂを１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０で希釈する。ＧＡＭ−ＩｇＧおよび細胞は、１０％プールヒト血清を添加したＲＰＭＩ １６４０で再懸濁させる。
【０１１９】
５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿大気中での７２時間のインキュベーション後、細胞に［メチル−３Ｈ］ＴｄＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１μＣｉ／ウェルを適用する。１８時間後、この細胞溶解液をガラス繊維フィルター上に回収して、マイクロプレートシンチレーションカウンターで放射能を決定する。
【０１２０】
（細胞内サイトカインの決定）
ＰＨＡ／ＩＬ−２依存性芽球を産生するために、ＰＢＭＣ（１ｘ１０５／ウェル）は９６ウェルＵ底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において、ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ；最終濃度、１μｇ／ｍｌ）の存在下で抗生物質を添加した、１０％ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えたＲＰＭＩ １６４０中で７日間培養する。次に５〜７日ごとに、ＩＬ−２ １０Ｕ／ｍｌおよび自己照射（３０００ｒａｄ、１３７Ｃｓ源）ＰＢＭＣをフィーダー細胞（芽細胞／フィーダー細胞の比＝１：１）として添加する。細胞は第１の実験を実施する前に少なくとも１ヶ月間培養する。
【０１２１】
９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＧＡＭ−ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；１０μｇ／ｍｌ）およびＣＤ３ ｍＡｂ ＯＫＴ３（２０ｎｇ／ｍｌ）の最適下限濃度で４℃にて一晩コーティングする。ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔ細胞系またはクローン（１−２ｘ１０５／ウェル）を最適濃度（５μｇ／ｍｌ）のＣＤ９９ｍＡｂ、ＣＤ２８ ｍＡｂ Ｌｅｕ２８またはアイソタイプ対照ｍＡｂを用いて予備コーティングしたプレート内でインキュベートする。アッセイは、抗生物質および２μｇ／ｍｌ（最終濃度）ブレフェルディンＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加した、５％プールヒト血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で、総体積２００μｌ／ウェルにて準備する。５％ＣＯ２大気中で３７℃での１８時間のインキュベーションの後、細胞を回収して、細胞内サイトカインの存在について解析した。染色では、細胞懸濁物５０μｌ（１−２ｘ１０５細胞に相当）を１％パラホルムアルデヒド１００μｌの添加により、室温にて３０分間固定する。次に細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡ ４ｍｌで１回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ ５０μｌ中に再懸濁させ、ＰＥＲＭ溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１００μｌの添加によって透過処理し、指示された直接結合抗サイトカインｍＡｂとともに３０分間、室温にてインキュベートした。最後に、細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁させて、フローサイトメトリーによって解析した。
【０１２２】
分泌サイトカインの定量的測定では、１ｘ１０６個のＴ細胞を抗ＣＤ９９または対照ｍＡｂｓによる抗ＣＤ３コーティングプレート上で３７℃／５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートする。次に培養上澄みを回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを、製造者のプロトコル（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ミネアポリス、ミネソタ州）を使用して、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生を測定するために実施する。対照実験：Ｔ細胞の刺激およびインターフェロンガンマ産生の測定。
【０１２３】
上の明細書で触れたすべての刊行物および特許は、参考として本明細書に援用される。本発明の上述の方法およびシステムの種々の改良および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかになるであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、本発明は、特許請求したように、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解する必要がある。実際に、当業者に明らかである本発明を実施するための上述した様式の種々の改良は、以下の特許請求の範囲内に含まれると企図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、特にＴ細胞レセプター刺激、Ｔ細胞アポトーシス率、単球補充率、インターフェロンガンマ産生および単球／マクロファージ活性化インデックスを含む多数の生物プロセスの撹乱に対する滑膜細胞密度の感受性を示す。
【図２】図２は、特にＴ細胞レセプター刺激、Ｔ細胞アポトーシス率、単球補充率、インターフェロンガンマ産生および単球／マクロファージ活性化インデックスを含む多数の生物プロセスの撹乱に対する軟骨破壊率の感受性を示す。
【図３】図３は、滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図４】図４は、軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図５】図５は、滑膜組織中のＩＬ−６に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図６】図６は、個々の重要な生物プロセスに対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図７】図７は、単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対するメトトレキサート耐性患者におけるＣＤ９９遮断の相対効果を示す。
【図８】図８は、メトトレキサート耐性患者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図９】図９は、メトトレキサート耐性患者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、各過程それぞれについて調査した単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α軟骨不応答者において最も起こりそうなＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１回に１つの過程を遮断することによって調査した、単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α軟骨不応答者におけるＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。
【図１１】図１１は、ＴＮＦ−α軟骨不応答者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１２】図１２は、ＴＮＦ−α軟骨不応答者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、各過程それぞれについて調査した単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α過形成不応答者において最も可能性のあるＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、１回に１つの過程を遮断することによって調査した、単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α過形成不応答者におけるＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。
【図１４】図１４は、ＴＮＦ−α過形成不応答者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１５】図１５は、ＴＮＦ−α過形成不応答者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、各過程それぞれについて調査した単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α二重不応答者において最も可能性のあるＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１６Ｂ】１回に１つの過程を遮断することによって調査した、単球血管外遊走、Ｔ細胞補充、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞ＩＦＮγ産生に対する、ＴＮＦ−α二重不応答者におけるＣＤ９９遮断の相対的効果を示す。
【図１７】図１７は、ＴＮＦ−α二重不応答者における滑膜細胞密度に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【図１８】図１８は、ＴＮＦ−α二重不応答者における軟骨破壊に対するＣＤ９９遮断の効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を軽減させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を、慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断軟骨不応答者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断過形成不応答者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断二重不応答者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
関節内の滑膜細胞の密度を低下させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を異常に上昇した滑膜細胞密度に関連する状態を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
関節における該軟骨破壊を減少させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を異常に高い割合の軟骨破壊に関連する状態を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
滑膜組織中のＩＬ−６濃度を低下させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を滑膜組織中のＩＬ−６の異常に高い濃度に関連する状態を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
関節内の骨びらんを減少させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を異常に高い割合の骨びらんに関連する状態を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４６】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９、およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体がＨｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
炎症性疾患の少なくとも１つの症状を軽減させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を、炎症性疾患を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５６】
前記炎症性疾患が、糖尿病、動脈硬化症、炎症性大動脈瘤、再狭窄、虚血／再潅流傷害、糸球体腎炎、再狭窄、再潅流傷害、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ライター症候群、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、股関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、骨盤腹膜炎、多発性硬化症、糖尿病、骨髄炎、癒着性関節包炎、少数関節炎、変形性関節炎、関節周囲炎、多発性関節炎、乾癬、スティル病、滑膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症および炎症性皮膚疾患からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、股関節炎、骨関節炎、および多発性関節炎からなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が、該化合物の非存在下で移動する白血球の量より少ないときに、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用であるとして同定する工程
を包含する、方法。
【請求項６５】
前記内皮細胞が培養されたヒト臍静脈内皮細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記内皮細胞が腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１によって刺激される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
内皮細胞の少なくとも１つの層が内皮細胞の単層である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記白血球が単球である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記白血球がＴ細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法であって：
（ａ）化合物を：
（ｉ）該化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程；および
（ｉｉ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が該化合物の非存在下で移動する白血球の量より少ないときに、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用であるとして同定する工程；
によって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；および
（ｂ）該化合物をヒトが消費するために配合する工程
を包含する、方法。
【請求項７１】
慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定するための方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量よりも少ないときに、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７２】
前記非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体が、１２Ｅ７または３Ｂ２／ＴＡ８である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｔ細胞サイトカインがＴｈ１サイトカインである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｔｈ１サイトカインがＴＮＦ−αまたはＩＦＮγである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｔ細胞がＴｈ１ Ｔ細胞である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法であって：
（ａ）化合物を：
（ｉ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を比較する工程；および
（ｉｉ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；
によって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；および
（ｂ）該化合物をヒトが消費するために配合する工程
を包含する、方法。
【請求項７７】
慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から発現したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から発現したＴ細胞の数と比較する工程であって、該非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および該化合物への曝露前は該第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、工程；ならびに
（ｂ）該化合物の存在下で発現したＴ細胞の数が、該化合物の非存在下で発現したＴ細胞の数よりも少ないときに、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用であるとして同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７８】
前記Ｔ細胞がＴｈ１ Ｔ細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法であって：
（ａ）化合物を：
（ｉ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から増殖したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から増殖したＴ細胞の数と比較する工程であって、非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および該化合物への曝露前は該第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、工程；および
（ｉｉ）該化合物の存在下で増殖したＴ細胞の数が、該化合物の非存在下で増殖したＴ細胞の数よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；
によって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；ならびに
（ｂ）該化合物をヒトが消費するために配合する工程
を包含する、方法。
【請求項８０】
慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって：
（ａ）該集合の化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が、該化合物の非存在下で移動する白血球の量よりも少ないときに、慢性関節リウマチの処置に有用として化合物を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項８１】
前記集合の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程をさらに包含し、該集合の少なくとも１つの化合物が、慢性関節リウマチの処置に有用であるとして選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記内皮細胞がヒト臍静脈内皮細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記内皮細胞が、腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１によって刺激される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
内皮細胞の少なくとも１つの層が内皮細胞の単層である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記白血球がＴ細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
前記白血球が単球である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
ＣＤ９９拮抗特性に関して化合物の集合をスクリーニングする方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量よりも少ないときに、化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして選択する工程
を包含する、方法。
【請求項８８】
前記集合の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程をさらに包含し、該集合の少なくとも１つの化合物が、ＣＤ９９活性のアンタゴニストとして選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記Ｔ細胞がＴｈ１細胞である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体が、１２Ｅ７または３Ｂ２／ＴＡ８である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｔ細胞サイトカインがＴｈ１サイトカインである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｔｈ１サイトカインが、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮγである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量よりも少ないときに、慢性関節リウマチの処置で有用であるとして選択する工程
を包含する、方法。
【請求項９４】
前記集合の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程をさらに包含し、該集合の少なくとも１つの化合物が、慢性関節リウマチの処置に有用であるとして選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｔ細胞がＴｈ１細胞である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体が、１２Ｅ７または３Ｂ２／ＴＡ８である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｔ細胞サイトカインがＴｈ１サイトカインである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｔｈ１サイトカインが、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮγである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から増殖したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から増殖したＴ細胞の数と比較する工程であって、該非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および該化合物への曝露前は該第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、工程；ならびに
（ｂ）該化合物の存在下で増殖したＴ細胞の数が、該化合物の非存在下で増殖したＴ細胞の数よりも少ないときに、慢性関節リウマチの処置に使用するための化合物を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１００】
前記集合の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程をさらに包含し、該集合の少なくとも１つの化合物が、慢性関節リウマチの処置に有用であるとして選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｔ細胞がＴｈ１細胞である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
炎症性疾患の処置に有用な化合物を同定する方法であって：
（ａ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量を、該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量が該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量より少ないときに、該化合物を炎症性疾患の処置に有用であるとして同定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０３】
前記ＣＤ９９活性の量が、前記集合の化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較することによって測定される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＣＤ９９活性の量が、前記化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較することによって測定される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＣＤ９９活性の量が、前記化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から増殖したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から増殖したＴ細胞の数と比較することによって測定され、該非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および化合物への曝露前は該第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１】
慢性関節リウマチの少なくとも１つの症状を軽減させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を、慢性関節リウマチを有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者が、メトトレキサート耐性患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断軟骨不応答者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断過形成不応答者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が、ＴＮＦ−α遮断二重不応答者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
関節内の滑膜細胞の密度を低下させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を異常に上昇した滑膜細胞密度に関連する状態を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
関節における該軟骨破壊を減少させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を異常に高い割合の軟骨破壊に関連する状態を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
滑膜組織中のＩＬ−６濃度を低下させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を滑膜組織中のＩＬ−６の異常に高い濃度に関連する状態を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
関節内の骨びらんを減少させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を異常に高い割合の骨びらんに関連する状態を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４６】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体が、Ｈｅｃ２、Ｄ４４、Ｏ６６２、ＭＥＭ−１３１、ＴＵ１２、ＨＯ３６−１．１、ＨＩＴ４、Ｏ１３、Ｎ−１６、Ｃ−２０、Ｂ−Ｎ２４、１２Ｅ７、３Ｂ２／ＴＡ８、ＨＩ１４２、ＨＩ１７５、ＦＭＣ２９、ＨＩ１４７、ＨＩ１７０、Ｌ１２９、およびＡｄ２０からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗ＣＤ９９モノクローナル抗体がＨｅｃ２、Ｄ４４およびＯ６６２からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アンチセンスインヒビターが逆方向に転写されたｍｉｃ２遺伝子の一部分を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
炎症性疾患の少なくとも１つの症状を軽減させる方法であって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストの治療有効量を、炎症性疾患を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５６】
前記炎症性疾患が、糖尿病、動脈硬化症、炎症性大動脈瘤、再狭窄、虚血／再潅流傷害、糸球体腎炎、再狭窄、再潅流傷害、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ライター症候群、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、股関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、骨盤腹膜炎、多発性硬化症、糖尿病、骨髄炎、癒着性関節包炎、少数関節炎、変形性関節炎、関節周囲炎、多発性関節炎、乾癬、スティル病、滑膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症および炎症性皮膚疾患からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、股関節炎、骨関節炎、および多発性関節炎からなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストがタンパク質である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記タンパク質が抗ＣＤ９９抗体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが核酸である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸がアンチセンスインヒビターである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＣＤ９９活性のアンタゴニストが小分子である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が、該化合物の非存在下で移動する白血球の量より少ないときに、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用であるとして同定する工程
を包含する、方法。
【請求項６５】
前記内皮細胞が培養されたヒト臍静脈内皮細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記内皮細胞が腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１によって刺激される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
内皮細胞の少なくとも１つの層が内皮細胞の単層である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記白血球が単球である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記白血球がＴ細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法であって：
（ａ）化合物を：
（ｉ）該化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程；および
（ｉｉ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が該化合物の非存在下で移動する白血球の量より少ないときに、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用であるとして同定する工程；
によって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；および
（ｂ）該化合物をヒトが消費するために配合する工程
を包含する、方法。
【請求項７１】
慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定するための方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量よりも少ないときに、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７２】
前記非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体が、１２Ｅ７または３Ｂ２／ＴＡ８である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｔ細胞サイトカインがＴｈ１サイトカインである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｔｈ１サイトカインがＴＮＦ−αまたはＩＦＮγである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｔ細胞がＴｈ１ Ｔ細胞である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法であって：
（ａ）化合物を：
（ｉ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を比較する工程；および
（ｉｉ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；
によって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；および
（ｂ）該化合物をヒトが消費するために配合する工程
を包含する、方法。
【請求項７７】
慢性関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から発現したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から発現したＴ細胞の数と比較する工程であって、該非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および該化合物への曝露前は該第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、工程；ならびに
（ｂ）該化合物の存在下で発現したＴ細胞の数が、該化合物の非存在下で発現したＴ細胞の数よりも少ないときに、該化合物を慢性関節リウマチの処置に有用であるとして同定する工程
を包含する、方法。
【請求項７８】
前記Ｔ細胞がＴｈ１ Ｔ細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
慢性関節リウマチの処置に使用する薬物を製造する方法であって：
（ａ）化合物を：
（ｉ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から増殖したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から増殖したＴ細胞の数と比較する工程であって、非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および該化合物への曝露前は該第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、工程；および
（ｉｉ）該化合物の存在下で増殖したＴ細胞の数が、該化合物の非存在下で増殖したＴ細胞の数よりも少ないときに、該化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；
によって、ＣＤ９９活性のアンタゴニストとして同定する工程；ならびに
（ｂ）該化合物をヒトが消費するために配合する工程
を包含する、方法。
【請求項８０】
慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって：
（ａ）該集合の化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で移動する白血球の量が、該化合物の非存在下で移動する白血球の量よりも少ないときに、慢性関節リウマチの処置に有用として化合物を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項８１】
前記集合の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程をさらに包含し、該集合の少なくとも１つの化合物が、慢性関節リウマチの処置に有用であるとして選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記内皮細胞がヒト臍静脈内皮細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記内皮細胞が、腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１によって刺激される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
内皮細胞の少なくとも１つの層が内皮細胞の単層である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記白血球がＴ細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
前記白血球が単球である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
ＣＤ９９拮抗特性に関して化合物の集合をスクリーニングする方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量よりも少ないときに、化合物をＣＤ９９活性のアンタゴニストとして選択する工程
を包含する、方法。
【請求項８８】
前記集合の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程をさらに包含し、該集合の少なくとも１つの化合物が、ＣＤ９９活性のアンタゴニストとして選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記Ｔ細胞がＴｈ１細胞である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体が、１２Ｅ７または３Ｂ２／ＴＡ８である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｔ細胞サイトカインがＴｈ１サイトカインである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｔｈ１サイトカインが、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮγである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量が、該化合物の非存在下で産生されたＴ細胞サイトカインの量よりも少ないときに、慢性関節リウマチの処置で有用であるとして選択する工程
を包含する、方法。
【請求項９４】
前記集合の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程をさらに包含し、該集合の少なくとも１つの化合物が、慢性関節リウマチの処置に有用であるとして選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｔ細胞がＴｈ１細胞である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体が、１２Ｅ７または３Ｂ２／ＴＡ８である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｔ細胞サイトカインがＴｈ１サイトカインである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｔｈ１サイトカインが、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮγである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
慢性関節リウマチの処置に使用する化合物の集合をスクリーニングする方法であって：
（ａ）該化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から増殖したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から増殖したＴ細胞の数と比較する工程であって、該非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および該化合物への曝露前は該第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、工程；ならびに
（ｂ）該化合物の存在下で増殖したＴ細胞の数が、該化合物の非存在下で増殖したＴ細胞の数よりも少ないときに、慢性関節リウマチの処置に使用するための化合物を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１００】
前記集合の各化合物について工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程をさらに包含し、該集合の少なくとも１つの化合物が、慢性関節リウマチの処置に有用であるとして選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｔ細胞がＴｈ１細胞である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
炎症性疾患の処置に有用な化合物を同定する方法であって：
（ａ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量を、該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量と比較する工程；および
（ｂ）該化合物の存在下でのＣＤ９９活性の量が該化合物の非存在下でのＣＤ９９活性の量より少ないときに、該化合物を炎症性疾患の処置に有用であるとして同定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０３】
前記ＣＤ９９活性の量が、前記集合の化合物の存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量を、該化合物の非存在下で内皮細胞の少なくとも１つの層を通じて移動する白血球の量と比較することによって測定される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＣＤ９９活性の量が、前記化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第１の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量を、該化合物の非存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって活性化されたＴ細胞の第２の集団によって産生されたＴ細胞サイトカインの量と比較することによって測定される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＣＤ９９活性の量が、前記化合物の存在下で非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体によって刺激されたＴ細胞の第１の集団から増殖したＴ細胞の数を、該化合物の非存在下でＴ細胞の第２の集団から増殖したＴ細胞の数と比較することによって測定され、該非ブロッキング抗ＣＤ９９抗体による刺激および化合物への曝露前は該第１の集団および第２の集団におけるＴ細胞の数が同じである、請求項１０２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００７−５０５１４１（Ｐ２００７−５０５１４１Ａ）
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６３５８（Ｐ２００６−５２６３５８）
【出願日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９７６９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５６１８
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５００２００５３５）エンテロス・インコーポレーテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９７６９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５６１８
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５００２００５３５）エンテロス・インコーポレーテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
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