Ｇタンパク質共役受容体ＲＣＣ３５６の天然リガンドおよびその使用
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＲＣＣ３５６の天然リガンドとしてのイソ吉草酸の同定に関する。ＲＣＣ３５６受容体の活性を調節する薬剤のスクリーニングアッセイの基礎として、本発明にはＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸との相互作用の利用が含まれる。本発明には、診断およびスクリーニングアッセイの実施用キットの他、ＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の相互作用に基づいて実施される診断および他のアッセイも含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＲＣＣ３５６の天然リガンドの同定およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内でのシグナル伝達に関与するタンパク質である。ＧＰＣＲは通常７つの膜貫通ドメインを有する。ＧＰＣＲの細胞外部分または断片へのリガンドの結合時、細胞の生物学的特性または生理学的特性もしくは挙動を変化させるシグナルを細胞内に伝達する。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によって調節される細胞内酵素およびチャンネル）と並んで、細胞内セカンドメッセンジャーの状態と細胞外入力とを結びつけるモジュラーシグナル伝達系の構成要素である。
【０００３】
ＧＰＣＲ遺伝子および遺伝子産物は、様々な生理的過程を調節可能であり、病原因子となりうる。ＧＰＣＲは、中枢神経系および末梢の生理的過程のいずれに対しても極めて重要と考えられる。
【０００４】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは５つのファミリーに代表される：ファミリーＩ ロドプシンおよびβ２‐アドレナリン受容体が典型例である受容体であり、現在２００以上の固有の一員によって代表される。ファミリーＩＩ 副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー。ファミリーＩＩＩ 代謝型グルタミン酸受容体ファミリー。ファミリーＩＶ 走化性およびＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの発生に重要なＣＡＭＰ受容体ファミリー。ファミリーＶ ＳＴＥ２などの真菌性接合フェロモン受容体。
【０００５】
Ｇタンパク質は、α、β、γサブユニットを含むヘテロ三量体タンパク質ファミリーであり、グアニンヌクレオチドと結合する。これらのタンパク質は通常、シグナル伝達のために細胞表面の受容体（７つの膜貫通ドメインを含む受容体）と結合している。実際に、リガンドがＧＰＣＲに結合後、構造変化がＧタンパク質に伝えられて、これはαサブユニットの結合ＧＤＰ分子とＧＴＰ分子を交換して、βγサブユニットから解離させる。
【０００６】
α、β、γサブユニットのＧＴＰ結合型は通常エフェクター調節成分として機能しており、ｃＡＭＰ（例、アデニルシクラーゼの活性化による）、ジアシルグリセロール、イノシトールリン酸などのセカンドメッセンジャーの産生をもたらす。
【０００７】
ヒトにおいて２０種類以上の様々なαサブユニットが知られている。これらのサブユニットは、β、γサブユニットの小プールに結合する。哺乳動物のＧタンパク質の例として、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇ−ｏｌｆ、Ｇｔが挙げられる。Ｇタンパク質については、Lodish ら, Molecular Cell Biology(Scientific American Books Inc., New York, N. Y., 1995; Downes and Gautam, 1999, The G-Protein Subunit Gene Families. Genomics 62:544-552)において広範に記述されており、すべての内容は参照により本明細書に援用したものとする。
【０００８】
既知の特徴づけされてないＧＰＣＲは、現在、薬物の作用および開発の主な標的となっている。一部のＧＰＣＲについては、考えられる生理学的役割が割り当てられてきたが、前記受容体を調節可能なリガンドは未同定である。潜在的な予防ならびに治療的特性を有する新規アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングに利用可能な新しいＧタンパク質共役受容体の同定の取り組みが続いている。
【０００９】
今日まで３００以上のＧＰＣＲがクローニングされている。機構的に、臨床的に関連する全ての薬剤の約５０−６０％が、様々なＧＰＣＲの機能を調節することで作用する(Cudemann ら, J. Mol. Med., 73:51-63)。
【００１０】
嗅覚は無脊椎動物から哺乳動物までの生命体と環境との化学的コミュニケーションを可能にしている。嗅覚を通じて数千のにおい物質が知覚、識別される。このような化学的シグナル伝達は、例えば、家族や仲間の識別、食物の位置決め、もしくは縄張りの認識をにおい化合物に依存する大半の動物種の社会的行動を調節しうる。嗅覚能力は、最初に嗅上皮のニューロン、嗅覚の感覚ニューロン（ＯＳＮ）によって決定される。そこで、におい分子は嗅覚受容体タンパク質（ＯＲ）（別名、におい受容体）に結合する。これらのＯＲは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの一員である。これらは最大の遺伝子ファミリーによってコード化される。げっ歯類において１３００もの様々なＯＲ遺伝子が同定されており、約８００のＯＲ遺伝子がヒトゲノム中において同定されている。各嗅覚ニューロンが１種類のみのＯＲを発現して、嗅覚ニューロンによるにおいの識別の細胞学的基礎を成すと考えられる。それらは小胞体内で合成されて、輸送され、最終的には樹状突起先端の繊毛の細胞表面膜に集結する。同様に、ＯＲはＯＳＮの軸索末端において認められる。それらはＯＲ特異的な嗅球部位を軸索が目指す際に役割を果たすと推測される。
【００１１】
大半の哺乳動物が第二の嗅覚システムである鋤鼻システムを有する。鋤鼻器官は鼻腔内に局在しており、部分的に鋤鼻感覚ニューロンからできている。このシステムは、フェロモン受容体の活性化を通じたフェロモンの検出に関与しうる。しかし、フェロモンが鋤鼻感覚ニューロンを通じてのみ検出され、鋤鼻感覚ニューロンがフェロモンのみを検出することを確認した証拠はない。フェロモン受容体は７ＴＭ タンパク質でもあるが、しかしそれらはＯＲスーパーファミリーとは全く異なる。フェロモン受容体はＧＰＣＲスーパーファミリーの一員であるが、これらの受容体と共役したＧタンパク質は依然として同定されていない。今日までにフェロモン受容体の２つのファミリー（Ｖ１Ｒ、Ｖ２Ｒファミリー）が記述されている。いずれのファミリーの受容体もマウスにおいては同定されているが（３００以上）、ヒトではＶ１Ｒファミリーのわずか５つの受容体のみである。
【００１２】
味覚は化学感覚の一部でもある。それはヒトの舌と口蓋上に局在する味覚受容体の活性化に依存する。それらは味蕾の味覚受容体細胞（ＴＣＲ）部分で発現する。これらの細胞はニューロンと接触する特別な上皮細胞であり、これらは次に脳に情報を伝える。従って、ＯＳＮとは異なり、ＴＣＲは神経細胞ではない。嗅覚受容体と同様に、味覚受容体はＧＰＣＲスーパーファミリーの一員である。今日、２つのファミリー（Ｔ１Ｒ、Ｔ２Ｒファミリー）が同定されている。ヒトのＴ１Ｒファミリーは３つの受容体（Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３）を含むが、Ｔ２Ｒファミリーはヒトにおいて２５の推定受容体を含む。Ｔ２Ｒ受容体は苦味の検出に関与しており、単量体で機能しうる。一方、Ｔ１Ｒ受容体は二量体で機能すると考えられている。二量体化によって受容体に特異性がもたらされうる。Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ のヘテロ二量体は「うまみ」味覚を検出し、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロ二量体は甘味化合物によって活性化される。これら２つのファミリーに加えて、他のタンパク質は、潜在的なチャンネルであるＴＲＭＰ５、うまみ受容体として機能しうるｍＧｌｕＲ４、酸味受容体であるＡＳＩＣ２、塩味受容体であるＥＮａＣ、辛味受容体であるＶＮ１、または冷たい味覚の受容体であるＴＭＰ８などの味覚受容体と考えられる。
【００１３】
嗅覚、味覚、フェロモンは、常に動物と人間の個別行動に影響を及ぼす。このため、前記認識のメカニズムを理解することは非常に重要である。特に、認識に影響を及ぼす方法の決定が重要となる。嗅覚、味覚、フェロモンシステムが、１リガンド／１受容体の法則に従わないことが既に知られている。数種のリガンドによって同じ受容体が活性化されることが文献において記述されている。したがって、前記感覚システムは、恐らく、異なる受容体が同じリガンドによって活性化される可能性があり、また１つの受容体が異なるリガンドによって調節される可能性のある、システムの一部である。
【００１４】
ＲＣＣ３５６（別名、ＰＨＯＲ−１）が過去に特性付けされており、前立腺癌においてアップレギュレートされている新しい前立腺特異的ＧＰＣＲと記載されている（米国特許第６，７９０，６３１号、米国特許第２００４／０２４８０８８号）。ＲＣＣ３５６のヒトのポリヌクレオチド配列が図１ａに、ＲＣＣ３５６のヒトのアミノ酸配列が図１ｂに示されている。前記アミノ酸配列は、１つ以上のＧＰＣＲ配列記号および嗅覚受容体記号を示している。したがって、ＲＣＣ３５６は嗅覚受容体（ＯＲ）と考えることができる。このＯＲが前立腺に特異的な機能を持ちうることは、例外的ではない。実際に、ＯＲ遺伝子は嗅上皮以外の組織でも発現していることが判明しており、このクラスの化学感覚受容体の別の潜在的な生物学的役割を示唆している。特に、ＲＣＣ３５６以外のＯＲが、生殖細胞、精巣、インスリン分泌ベータ細胞、脾臓、特定の脳部位、心臓でも発現していることが過去に示されている(Parmentierら. 1992, Nature, 355: 453-455; Thomasら. 1996, Gene, 178:1-5; Nef and Nef 1997, Pro., Nathl. Acad. Sci. USA, 94 : 4766-4771 ; Blacheら. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., 142 :669-672; Drutelら, 1995, Receptors Channels 3 :33-40; Ferrandら. 1999, J.Mol.Cell.Cardiol. 31:1137-1142; Ramingら, 1998, Receptors Channels 6 : 141 -151)。さらに、脳で発現しているラットの嗅覚受容体(別名、ＲＡ１ｃ)(Raming ら, 1998, Receptor Channels 6:141)が ＰＨＯＲ−０１と最も相同性の高い配列を有している。ＰＨＯＲ−１とＲＡ１ｃとの同一性は５９．９％であり、２９９個の残基が重複している。恐らくはＲＡ１ｃのヒトのホモログであるＨＰＲＡＡＪ７０もＰＨＯＲ−０１と同程度の相同性を示す。ＨＰＲＡＡＪ７０タンパク質は前立腺特異的ＧＰＣＲ （米国特許第５，７５６，３０９号、国際公開第９６／３９４３５号）であると報告されており、米国特許第６，７９０，６３１号記載の知見を確認している。米国特許第６，７９０，６３１号においても、ＰＨＯＲ−０１が、前立腺癌、腎臓癌、子宮癌、子宮頸癌、胃癌、直腸癌の他、正常な前立腺に限局していると記載されている。ＰＨＯＲ−０１は他の癌でも発現している可能性がある。細胞増殖および形質転換の調節におけるそれらの役割も示唆されている。例えば、米国特許第６，７９０，６３１号に示されるように、ＰＨＯＲ１が細胞増殖において極めて重要な役割を果たす可能性がある。この文脈において、米国特許第６，７９０，６３１号では、ＰＨＯＲ−０１を発現する様々な癌、特に前立腺癌の管理に有用な、診断、治療方法、組成物でのＰＨＯＲ−０１の使用が提案されている。潜在的な生理学的役割がＲＣＣ３５６に割り当てられているが［ＲＣＣ３５６を過剰発現している細胞での倍加時間の短縮（米国特許第６，７９０，６３１号）］、今日までリガンドによって該受容体が調節される可能性は示されていない。
【００１５】
イソ吉草酸は、ヒトおよび動物の分泌物、特に汗の悪臭形成の一部を形成する、不快なにおいのする有機酸である。ヒトの汗の別の成分は３−メチル−２−ヘキセン酸、酷い悪臭の成分はプロピオン酸、ペットの悪臭成分はヘキセン酸である。前記化合物は、嗅覚受容体の亜属によって識別されると過去に記載されている（米国特許第２００３／０２０７３３７号）。嗅覚受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として知られている７回膜貫通型の受容体スーパーファミリーに属する(Buckら, Cell 65:175-87, 1991)。ＧＰＣＲは、内分泌機能、外分泌機能、心拍数、脂肪分解、糖質代謝、神経伝達、視力、味覚受容などの多くの生理学的機能を制御する膜貫通シグナル伝達を媒介する。嗅覚受容体は、特定の嗅覚を引き起こす分子を特異的に認識する。これらの分子は「におい物質」とも呼ばれている。嗅覚受容体をコードする遺伝子は主に嗅覚ニューロン内で活性化している(Axel, Sci. Amer. 273:154-59, 1995)。個々の嗅覚受容体のサブタイプが、嗅上皮の別の部分に分布している細胞の一部で発現している(Breer, Semin. Cell Biol., 5:25-32, 1994)。しかし、上記のとおり、ＯＲの発現は嗅上皮に限定されていない。多くの研究所において、前立腺、脳、肺、肝臓、腎臓、子宮頸、乳房などの組織におけるＯＲの発現が証明されている。
【特許文献１】米国特許第６，７９０，６３１号明細書
【特許文献２】米国特許第２００４／０２４８０８８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７５６，３０９号明細書
【特許文献４】国際公開第９６／３９４３５号パンフレット
【特許文献５】米国特許第２００３／０２０７３３７号明細書
【特許文献６】国際公開第１０２５５１号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５，８８８，８１９号明細書
【特許文献８】米国特許第６，００４，７４４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０１３，４３１号明細書
【特許文献１０】米国特許第４，８７３，１９１号明細書
【特許文献１１】仏国特許出願公開第２，５９３，８２７号明細書
【非特許文献１】Lodish ら, Molecular Cell Biology(Scientific American Books Inc., New York, N. Y., 1995
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【非特許文献９】Ramingら, 1998, Receptors Channels 6 : 141 -151
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【非特許文献６５】Wagner ら, 1997, Nucleic Acids Res., 25:4323
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ＲＣＣ３５６ ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）の天然リガンドとしてのイソ吉草酸（ＩＶＡ）の同定に関する。ＲＣＣ３５６受容体の活性を調節する薬剤のスクリーニングアッセイの基礎として、本発明にはＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸との相互作用の利用が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明には、診断およびスクリーニング方法の実施用キットの他、ＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の相互作用に基づく診断などの方法も含まれる。特に、本発明では、癌の進行および／または発生にイソ吉草酸が関連していることが示されている。また、本発明では、ＲＣＣ３５６がにおい認識および神経活動において役割を果たしうることが示されている。
【００１８】
本発明にはＲＣＣ３５６に結合する薬剤の同定方法が含まれ、前記方法は、ａ）前記イソ吉草酸と前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件下での、候補調節因子の存在下または非存在下におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、およびｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸との結合を測定することからなる。ここで、前記候補調節因子の存在しない場合の結合と比較して、前記候補調節因子が存在する場合の結合の低下によって、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤としての前記候補調節因子が同定される。
【００１９】
本発明にはさらにサンプル中でＲＣＣ３５６に結合する薬剤のサンプル中での存在の検出方法が含まれ、前記方法が、ａ）イソ吉草酸とＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件下での、前記サンプルの存在下または非存在下における前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸とが接触すること、およびｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸との結合を測定することからなる。ここで、前記候補調節因子の非存在下における結合と比較して、前記サンプルの存在下における結合の低下は、前記サンプル中でＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を示している。
【００２０】
本発明にはさらにＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の同定方法を含まれ、前記方法が、ａ）イソ吉草酸によるＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性化を可能にする条件下での、候補調節因子の存在下または非存在下におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、およびｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定することからなる。ここで、前記候補調節因子の非存在下における活性と比較して、前記候補調節因子の存在下における活性の変化によって、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤として前記候補調節因子が同定される。
【００２１】
本発明はさらにＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の同定方法であり、前記方法が、ａ）ＲＣＣ３５６ポリペプチドと候補調節因子とが接触すること、ｂ）前記候補調節因子の存在下において、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、およびｃ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドをＥＣ５０のイソ吉草酸と接触させているサンプル中において測定された前記活性と、前記候補調節因子の存在下で測定された前記活性とを比較することからなる。ここで、該候補調節因子の存在下で測定された活性量は、ＥＣ５０の前記イソ吉草酸による誘導量の少なくとも１０％である場合、前記候補調節因子はＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤として同定される。本発明によると、候補調節因子の存在下で測定された活性は、ＥＣ５０のイソ吉草酸の誘導量の１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上でありうる。該当する場合、本発明ではさらに、好ましくはＥＣ５０のイソ吉草酸が本発明の方法において使用されることが示されている。しかし、本発明の方法において、ＲＣＣ３５６の活性化が検出されうる他の濃度でイソ吉草酸が使用されうる。
【００２２】
本発明ではさらにサンプル中においてＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を検出する方法を含み、前記方法が、ａ）前記サンプルの存在下、または非存在下においてＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、ｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、およびｃ）前記サンプルを含まず、ＲＣＣ３５６およびイソ吉草酸を含む反応で測定された前記活性と、ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸、前記サンプルを含む反応液中で測定された前記活性とを比較することからなる。ここで、前記サンプルの存在しない場合の活性と比較して、前記サンプルの存在する場合の前記活性変化は、前記サンプル中においてＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤が存在することを示唆している。
【００２３】
本発明はさらにサンプル中のＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を検出する方法を含み、前記方法が、ａ）ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記サンプルとが接触すること、ｂ）前記サンプルの存在下における、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、およびｃ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドをＥＣ５０のイソ吉草酸と接触させている反応液中において測定された前記活性と、前記サンプルの存在下で測定された前記活性とを比較することからなる。ここで、前記サンプルの存在下において測定された前記活性量が、ＥＣ５０の前記イソ吉草酸による誘導量の少なくとも１０％である場合、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤は検出される。
【００２４】
本発明によると、結合法を利用した場合、イソ吉草酸を検出可能なように標識できる。前記方法において、イソ吉草酸は、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、蛍光クエンチャーからなる群から選択される成分によって検出可能なように標識できる。または、イソ吉草酸をＮＭＲで検出可能な成分で検出可能なように標識できる。
【００２５】
前述の方法のいずれでも一実施態様では、前記接触は前記ＲＣＣ３５６ポリペプチを発現する細胞内、または細胞上で行われる。本発明によると、前記細胞は、ヒトの胚腎臓細胞（Ｈｅｋ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サルの細胞（ＣＯＳ）、初代嗅細胞、アフリカツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母、細菌でありうるが、これらに限定されない。
【００２６】
前述の方法のいずれでも別の実施態様では、合成リポソーム内、または前記リポソーム上(Tajib ら, 2000, Nature Biotechnology 18: 649-654、参照により本明細書に援用されている)、もしくはＲＣＣ３５６ポリペプチドを含むウイルス誘発性発芽膜内、または前記膜上で接触が行われる（国際公開第１０２５５１号、２００１年、参照により本明細書に援用されている）。
【００２７】
前述の方法のいずれでも別の実施態様では、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて前記方法が行われる。
【００２８】
前述の方法のいずれかの好ましい実施態様では、タンパク質チップ上で該方法が行われる。
【００２９】
前述の方法のいずれかの好ましい別の実施態様では、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光クエンチング、蛍光偏光から選択される方法を利用して該測定が行われる。
【００３０】
前述の方法のいずれかの好ましい別の実施態様では、前記薬剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、糖質、核酸、有機低分子（発臭成分およびフェロモンを含むが、これらに限定されない）からなる群から選択される。
【００３１】
本発明によると、機能アッセイを利用する場合、ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定する段階がセカンドメッセンジャーレベルにおける変化の検出を含む。
【００３２】
別の実施態様では、シグナル活性を測定する段階が、グアニンヌクレオチド結合／連結または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、プロテインキナーゼＡ活性、 ホスファチジルイノシトールの分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流束、 アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラニンアッセイ、受容体内在化アッセイまたはリポーター遺伝子発現の測定を含む。Ｇタンパク質結合／連結または交換を測定する場合、可能な全てのＧａサブユニットのうち、好ましくはＧＴＰ結合タンパク質Ｇタンパク質アルファ-ｏｌｆサブユニット（嗅覚）（別名、Ｇ−ｏｌｆ）の挙動を研究する。ヒトのＧ−ｏｌｆサブユニットの配列は、既に受託番号Ｌ１０６６５でジーンバンクに登録されている。しかし、他の種類のＧ−ｏｌｆサブユニットを使用して、研究可能である。
【００３３】
好ましい一実施態様では、シグナル活性の測定には、蛍光または発光アッセイの使用が含まれる。蛍光、発光アッセイは、ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４、Ｆｕｒａ（分子プローブ）、Ｃａ３−キットファミリー(Molecular Device)、エクオリンなどのＣａ２＋感受性フルオロフォアの使用を含みうる。さらに、該アッセイでは、ＦＤＳＳ (Hamamatsu)またはＦＬＩＰＲ(Molecular Device)などの蛍光または発光性リーダーを適用しうる。
【００３４】
本発明ではさらに細胞内におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性を調節する方法を含み、前記方法は、ＲＣＣ３５６の活性を調節できるように、ＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性を調節するイソ吉草酸を前記細胞内に輸送する段階を含む。
【００３５】
前述の方法のいずれでも別の実施態様では、方法はハイスループットスクリーニングである。
【００３６】
前述の方法のいずれでも別の実施態様では、薬剤が化学ライブラリーまたは動物器官の抽出物の一部である。動物器官の抽出物が、前立腺癌、血液、脳から調製された抽出物でありうるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明は前述の方法のいずれかによって同定または検出されたイソ吉草酸関連の薬剤を含んでいる。イソ吉草酸関連の前記薬剤が、ＲＣＣ３５６に対するアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストでありうる。
【００３８】
本発明は前述のいずれかによって同定または検出されたイソ吉草酸と関連する薬剤を含む組成も含んでいる。
【００３９】
本発明によると、前述の方法のいずれかによって同定または検出された薬剤、または前述の薬剤を含む組成は、医薬品の調製に使用できる。または、これらはにおい物質またはにおい物質のアンタゴニストの調製に使用されうる。例えば、ＲＣＣ３５６アゴニストは、防虫剤、つまりデオドラントとしてのＲＣＣ３５６アンタゴニストとして使用されうる。
【００４０】
好ましい一実施態様では、前述の薬剤または組成が、疾患または障害が好ましくは癌または腫瘍の転移からなる群から選択される、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用医薬品の調製に使用されうる。本発明によると、前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択されうる。
【００４１】
好ましい別の一実施態様では、前記薬剤または組成が、前記疾患または障害が好ましくはＣＮＳ障害または疾患である、ＲＣＣ３５６関連の疾患またはＲＣＣ３５６関連の障害の治療用医薬品の調製に使用されうる。本発明によると、前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんでありうる。
【００４２】
本発明は、分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチドおよびイソ吉草酸を含む組成も含む。
【００４３】
本発明は、分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチドおよび前記酸を含む組成の製造用のイソ吉草酸の使用にも関する。
【００４４】
本発明はさらに、ＲＣＣ３５６シグナル伝達を調整する薬剤のスクリーニング用キットの製造、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患の診断または予後診断用キットの製造、もしくはにおい物質またはにおい物質のアンタゴニストのスクリーニング用キットの製造におけるＲＣＣ３５６との併用における、イソ吉草酸の使用に関する。
【００４５】
また、本発明は、ＲＣＣ３５６のリガンドとしてのイソ吉草酸の使用を含む。
【００４６】
本発明はさらに医薬品調製のためのイソ吉草酸の使用を含む。本発明によると、前記疾患または障害が好ましくは癌または腫瘍の転移からなる群から選択される、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用に前記医薬品が使用される。特に、前記医薬品が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌の治療に使用できる。
【００４７】
または、前記医薬品は、疾患または障害が好ましくはＣＮＳ障害または疾患である、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用に使用される。 特に、該医薬品はてんかん治療に使用されうる。
【００４８】
本発明は、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体またはその断片を認識する抗体とも関連する。
【００４９】
本発明の別の一実施態様は、ＣＮＳ障害または疾患の治療用医薬品の調製のための、ＲＣＣ３５６断片またはＲＣＣ３５６を認識する抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用法と関連する。前記ＣＮＳ疾患または障害はてんかんでありうる。
【００５０】
本発明の別の一実施態様は、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の治療用医薬品の調製のための、ＲＣＣ３５６断片またはＲＣＣ３５６を認識する抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用に関する。
【００５１】
または、癌または腫瘍の転移の治療用医薬品の調製のための、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体が使用されうる。
【００５２】
本発明はさらに、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法を含み、前記方法が、ａ）組織サンプルとイソ吉草酸とが接触すること、ｂ）前記酸の前記組織サンプルへの結合を検出すること、およびｃ）段階（ｂ）で検出する結合と前記標準品とを比較することからなる。ここで、標準品と比較して結合の違いは、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に使用する。
【００５３】
本発明はさらに、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であり、前記方法が、ａ）組織サンプルとイソ吉草酸に対して特異的な抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対して特異的な抗体とが接触すること、ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出すること、およびｃ）段階（ｂ）で検出する結合と前記標準品を比較することからなる。ここで、標準品と比較した結合の違いは、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に使用する。
【００５４】
本発明はさらに ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法を含み、前記方法が、ａ）組織サンプルとＲＣＣ３５６ポリペプチドに対して特異的な抗体およびイソ吉草酸に対して特異的な抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対して特異的な抗体とが接触すること、ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出すること、およびｃ）段階（ｂ）で検出する結合と前記標準品を比較することからなる。ここで、標準品と比較したいずれか一方または両方の抗体の結合の違いは、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に使用する。
【００５５】
本発明は、さらにＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であり、前記方法が、ａ）組織サンプルのイソ吉草酸含量を定量すること、およびｂ）段階（ａ）で定量する前記酸の量と標準品を比較することからなる。ここで、前記標準品と比較したイソ吉草酸の量の違いは、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に使用する。
【００５６】
本発明の方法を利用して診断または予後診断されるＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害が、癌および腫瘍の転移（これらに限定されない）からなる群から選択されうる。特に、前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択される。
【００５７】
または、本発明の方法を利用して診断または予後診断されるＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害が、ＣＮＳ障害または疾患でありうる。例えば、前記ＣＮＳ疾患または障害はてんかんでありうる。
【００５８】
本発明ではさらに、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対して特異的な抗体を使用して、ＣＮＳ疾患または障害、もしくはイソ吉草酸関連の嗅覚異常を診断または予後診断しうることが示されている。上記の通り、前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんでありうる。
【００５９】
本発明は、イソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断の方法も含み、前記方法が、ａ）組織サンプルのＲＣＣ３５６含量を定量すること、およびｂ）段階（ａ）で定量する前記受容体の量を標準品と比較することからなる。ここで、標準品と比較したＲＣＣ３５６の量の違いは、嗅覚異常の診断または予後診断、もしくはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断に使用する。本発明によると、前記ＣＮＳ関連疾患または障害がてんかんでありうる。前記方法では、ＲＣＣ３５６抗体、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６抗体、またはイソ吉草酸を使用して定量が行われる。
【００６０】
本発明はさらにイソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断の方法を含み、前記方法が、ａ）ＲＣＣ３５６をコードするｍＲＮＡを定量すること、および／または組織サンプル中の野生型ＲＣＣ３５６の配列と比較して、該ＲＣＣ３５６配列の正確性を検証すること、およびｂ）段階（ａ）で定量または決定した前記核酸の量および／または正確性を標準品と比較することからなる。ここで、標準品と比較した前記量またはＲＣＣ３５６配列の違いは、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の診断または予後診断、もしくはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断に使用する。前記方法では、該ＣＮＳ関連疾患または障害はてんかんでありうる。
【００６１】
本発明は、癌または腫瘍の転移を診断または予後診断する方法も含み、前記方法が、ａ）ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６抗体を使用した組織サンプルのＲＣＣ３５６含量を定量すること、およびｂ）段階（ａ）での前記受容体の量と標準品とを比較することからなる。ここで、前記標準品と比較したＲＣＣ３５６の前記量の違いは、嗅覚異常の診断または予後診断、もしくは癌または腫瘍の転移の診断または予後診断に使用する。
【００６２】
本発明にはさらに、分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチド、イソ吉草酸、これらのためのパッケージング材料からなるキット、ＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチド、イソ吉草酸、これらのためのパッケージング材料からなるキット、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞またはその膜、イソ吉草酸、これらのためのパッケージング材料からなるキットを含む。前記細胞は、前記ＲＣＣ３５６をコードするポリヌクレオチドで形質転換されうる。
【００６３】
本発明によると、上記のキットはいくつかの目的で使用されうる。例えば、前記キットは、におい物質または抗におい物質剤のスクリーニング、または腫瘍化合物またはＣＮＳ障害または疾患の治療用化合物のスクリーニング向けの、ＲＣＣ３５６のシグナル伝達を調節する薬剤のスクリーニングに使用されうる。抗腫瘍化合物の探索時には、特に前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌が標的となり、ＣＮＳ障害の治療用化合物の探索時には、特にてんかん治療が標的となる。
【００６４】
また、本発明は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断用のイソ吉草酸を含むキットの用にも関する。
【００６５】
さらに、本発明は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断用のイソ吉草酸抗体を含むキットの使用に関する。本発明によると、前記疾患または障害は癌でありうる。
【００６６】
本発明は、ＣＮＳ関連疾患の診断または予後診断用のＲＣＣ３５６を含むキットの使用を含む。前記キットが、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の診断または予後診断にも使用されうる。
【００６７】
本発明は、癌の進行および／または治療に及ぼすイソ吉草酸の効果を研究するためのＲＣＣ３５６またはそのオルソログのトランスジェニック動物の使用法も含む。進行および／または治療が研究される癌は、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌でありうる。オルソログという用語は、進化上関連する種において、ＲＣＣ３５６と類似の機能を有する遺伝子を意味する。
【００６８】
本発明は、ＣＮＳ障害または疾患の進行および／またはイソ吉草酸関連の嗅覚異常の治療を研究するためのＲＣＣ３５６またはそのオルソログのトランスジェニック動物の使用も含む。進行および／または治療が研究されるＣＮＳ障害または疾患は、てんかんでありうる。
【００６９】
本発明によると、癌の進行および／または治療を研究するために、イソ吉草酸を過剰生産するトランスジェニック動物が使用されうる。動物での過剰生産は、例えばＩＶＡ分解の抑制を介して誘発されうる。
【００７０】
または、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の進行に及ぼすＲＣＣ３５６の効果を研究するためのＲＣＣ３５６ノックアウトトランスジェニック動物（ヒトは含まず）が使用されうる。また、ＣＮＳ障害または疾患の進行に及ぼすＲＣＣ３５６の効果を研究するためのＲＣＣ３５６ノックアウトトランスジェニック動物が使用されうる。本記載において、ＲＣＣ３５６は、選択された動物モデルに従ったＲＣＣ３５６のオルソログとして理解されうる。
【００７１】
本発明での上記の全ての方法、薬剤、使用法、組成、キットにおいて、図１ｂに示されているＲＣＣ３５６ポリペプチドに特異的に結合して、そのシグナル伝達活性を活性化させる、イソ吉草酸等価体または前記等価体に対する抗体が使用、参照、適用、もしくは組み込まれうる。イソ吉草酸の前記等価体がプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、 イソヘキサン酸、 ヘプタン酸、 イソヘプタン酸、オクタン酸、 イソオクタン酸、ノナン酸、 イソノナン酸、バルプロ酸、イソバレルアミド、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロ安息香酸、ペラルゴン酸、５−ヘキセン酸からなる群から選択されうる。特に、前記等価体が、酪酸、吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロ安息香酸、ペラルゴン酸、５−ヘキセン酸からなる群から選択される。
【００７２】
また、本発明での上記の全ての方法、薬剤、使用法、組成、キットにおいて、ＲＣＣ３５６ポリペプチドが、図１ｂに示されるポリペプチドと少なくとも２０％の同一性、または２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、さらに１００％といったより高い同一性を有するが、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと同等の活性を有しうる。当業者であれば、使用されたアッセイに左右される該活性の評価方法を知っている。
【００７３】
また、本発明での上記の全ての方法、薬剤、使用法、組成、キットにおいて、該ＲＣＣ３５６ポリペプチドがキメラまたはその活性フラグメントでありうる。
【００７４】
本明細書において用いられる用語「ＲＣＣ３５６ ポリペプチド」は２つの必須の特性を有する：１）ＲＣＣ３５６ポリペプチドが、図１ｂに示される配列と少なくとも２０％、好ましくは８０％、９０％、９５％以上（１００％を含む）のアミノ酸の同一性を有する、および２）ＲＣＣ３５６がＲＣＣ３５６活性を有する（つまり、該ポリペプチドがイソ吉草酸またはその等価体と結合する）。前記相同性は、ポリペプチド全体またはＣＤＲドメイン（受容体のリガンド結合ドメイン）などのポリペプチドの一部と関連しうる。PilpelおよびLancet (Protein Science 8:969-977、1999)によると、ＧＰＣＲのＣＤＲドメインは、公表されている表示（ＴＭ３−＃４、ＴＭ３−＃８、ＴＭ３−＃１１、ＴＭ３−＃１２、ＴＭ３−＃１５、ＴＭ４−＃１１、ＴＭ４−＃１５、ＴＭ４−＃１９、ＴＭ４−＃２２、ＴＭ４−＃２３、ＴＭ４−＃２６、ＴＭ５−＃３、ＴＭ５−＃６、ＴＭ５−＃７、ＴＭ５−＃１０、ＴＭ５−＃１１、ＴＭ５−＃１３）に従って定義され、ＴＭｘは前記受容体の膜貫通領域を示し、#は前記領域内のアミノ酸の位置を示す。好ましくは、「ＲＣＣ３５６ポリペプチド」は、本明細書で定義されるＲＣＣ３５６のシグナル伝達活性も有する。しかし、７ＴＭ受容体のＣＤＲの同定は全く運任せであり、ＴＭの定義に適用されるアルゴリズムに左右される。さらに、PilpelおよびLancet によれば、ＲＣＣ３５６は４つのＴＭしか有し得ない。上記のとおり、該ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、ＲＣＣ３５６のオルソログも含む。
【００７５】
本明細書において用いられる用語「ＲＣＣ３５６ポリヌクレオチド」は、本明細書で定義されるＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００７６】
本明細書において用いられる用語「ＲＣＣ３５６活性」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドによる、イソ吉草酸またはその等価体の特異的結合を意味する。
【００７７】
本明細書において用いられる用語「ＲＣＣ３５６シグナル伝達活性」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドによる、シグナル伝達の開始または伝搬を意味する。ＲＣＣ３５６シグナル伝達活性は、以下のうちの１つ以上の測定による、シグナル伝達カスケードにおいて検出可能な段階の測定によってモニターされる：Ｇタンパク質、特にＧ−ｏｌｆにおけるＧＤＰとＧＴＰの交換の促進、アデニル酸シクラーゼ活性の変化、プロテインキナーゼＣの調節、プロテインキナーゼＡの調節、ホスファチジルイノシトールの分解（セカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸の生成）、細胞内カルシウムの流出、ＭＡＰキナーゼの活性化、チロシンキナーゼの調節、内在化アッセイ、遺伝子またはリポーター遺伝子活性の調節、メラニンアッセイ。本明細書において後述されるＲＣＣ３５６活性アッセイのいずれか１つと比較した、イソ吉草酸の実質的な非存在下において確立されるベースラインより１０％以上、もしくは１０％以下の測定可能な活性の変化がある場合、シグナル伝達カスケードの検出可能な段階が開始または媒介されると考えられる。測定可能な活性は、例えば、ｃＡＭＰまたはジアシルグリセロール濃度の測定のように、直接的に測定可能である。または、測定可能な活性は、例えばリポーター遺伝子アッセイのように、間接的に測定可能である。これらのアッセイの大半について、市販のキットが利用できる。
【００７８】
本明細書において用いられる用語「検出可能な段階」は、直接的（例、セカンドメッセンジャーの測定または変性（例、リン酸化）タンパク質の検出）、または間接的に（例、該段階の下流への効果のモニタリング）測定可能な段階を意味する。例えば、アデニル酸シクラーゼの活性化は、ｃＡＭＰの生成をもたらす。アデニル酸シクラーゼの活性は、直接的（例、アッセイにおいてｃＡＭＰの産生をモニターするアッセイ）、または間接的に（例、ｃＡＭＰおよび／またはカルシウム流束の実際のレベルの測定）測定可能である。
【００７９】
本明細書において用いられる用語「分離された」は、分子の集団（例、異なる性質の分子の混在が、５０％未満（重量）、好ましくは４０％未満、最も好ましくは２％未満のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成）を意味する。「分離された」という用語がＲＣＣ３５６ポリペプチドに適用される場合、脂質膜に結合した、または脂質膜に埋め込まれたＲＣＣ３５６ポリペプチドを含むことを特に意味する。
【００８０】
本明細書において用いられる用語「イソ吉草酸」は、熟練した化学者には既知の化学分子を意味する。または、イソ吉草酸は、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、イソカプロン酸、イソエナンチル酸、イソカプリル酸、イソペラルゴン酸、ヘキサヒドロ安息香酸、５−ヘキセン酸、バルプロ酸、イソバレルアミド、またはこれらの派生物などの同等の分子も意味するが、これらに限定されない。全ての前記酸は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドに対して特異的に結合して、そのシグナル伝達活性を活性化させうる。「特異的に結合する」という用語は、イソ吉草酸のＥＣ５０、ＩＣ５０、Ｋｄが１ｍＭ未満であることを意味する。派生物は、それが派生する化合物と比較して、少なくとも１つの部位が異なる、類似の化合物でありうる。「イソ吉草酸等価体」のための一般的な化学式は（ＣＨ３）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−（ＣＨ）ｚ−ＣＯＯＨでありうる。また、アミン、ケトン、エステル、エーテル、アルコールを含めた（これらに限定されない）、様々な化学的機能を有する様々なラジカルが一般的な該化学式にグラフトされうる。
【００８１】
本明細書において用いられる用語「候補化合物」と「候補調節因子」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドへのリガンド結合の調節能、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性の調節能が評価される組成を意味する。候補調節因子は、例えば、動物、植物、細菌、カビの細胞からの「ならし培地」の他、該細胞の抽出物に含まれる低分子、化合物を含めた、天然または合成化合物でありうる。
【００８２】
本明細書において用いられる用語「低分子」は、分子量３０００ダルトン未満、好ましくは２０００または１５００ダルトン未満、より好ましくは１０００ダルトン未満、最も好ましくは６００ダルトン未満の化合物を意味する。「有機低分子」は、炭素を含む低分子である。
【００８３】
本明細書において用いられる用語「結合の変化」または「活性の変化」、および同義語で「結合の差」または「活性の差」は、特定のアッセイにおける結合またはシグナル伝達活性の少なくとも１０％が、上昇または低下することを意味する。
【００８４】
本明細書において用いられる用語「イソ吉草酸とＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件」は、例えば、イソ吉草酸がＲＣＣ３５６に結合する、温度、塩濃度、ｐＨ、タンパク質濃度の条件を意味する。厳密な結合条件は、アッセイの性質（例、アッセイにおいて生存細胞、もしくは細胞の膜画分のいずれが使用されるか）によって変動しうる。しかし、ＲＣＣ３５６は細胞表面タンパク質であり、イソ吉草酸は通常細胞表面上のＲＣＣ３５６と相互作用するため、好ましい条件には通常、生理学的塩濃度（９０ｍＭ）およびｐＨ（約７．０−８．０）が含まれる。結合の温度は４℃から３７℃まで変動しうるが、好ましくは室温および約３７℃の間である。結合反応においてイソ吉草酸およびＲＣＣ３５６ポリペプチドの濃度も変動するが、好ましくは約１０μＭ（例、放射性標識トレーサーイソ吉草酸との反応で、濃度は通常Ｋｄ未満）から１ｍＭ（例、競合因子としてのイソ吉草酸）である。実施例として、ＲＣＣ３５６発現細胞および精製済み標識イソ吉草酸を使用した結合アッセイにおいて、１０μＭ 標識イソ吉草酸、１ｍＭ 冷イソ吉草酸、および５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、脂肪酸不含０．５％ＢＳＡを含む２７℃の結合バッファー２５０μＬ中の細胞２５，０００個を使用して結合を行った。
【００８５】
本明細書において用いられる用語「サンプル」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドへの結合、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル伝達活性を調節する薬剤の存在について試験される分子の源を意味する。サンプルは、環境サンプル、動物、植物、酵母、または細菌の細胞または組織の天然抽出物、臨床サンプル、合成サンプル、組換え細胞の「ならし培地」、発酵工程でありうる。「組織」は、生物内において特定の機能を果たす細胞の集合体である。本明細書において用いられる用語「組織」は、特定の生理的領域からの細胞物質を意味する。特定組織の細胞は、いくつかの異なった細胞種類を含みうる。この一例は、限定はされないが、毛細血管内皮細胞および血球の他、さらにニューロンおよびグリア細胞から構成される脳組織があり、全てが特定の組織切片またはサンプル中に含まれる。固形組織に加えて、「組織」という用語は、血液などの非固形組織も含むこととなっている。
【００８６】
本明細書において用いられる用語「膜画分」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを含む細胞の脂質膜の調製物を意味する。該用語が本明細書において用いられるように、「膜画分」は、非膜結合細胞成分の少なくとも一部（少なくとも１０％、好ましくはそれ以上）が除去されている点で、細胞ホモジネートとは異なる。「膜結合」という用語は、脂質膜に取り込まれた、もしくは脂質膜に取り込まれた成分と物理的に結合した細胞成分を意味する。
【００８７】
本明細書において用いられるように、「結合の低下」は、本明細書に記載の結合アッセイ中において測定される、ＲＣＣ３５６ポリペプチドに対するイソ吉草酸または他のアゴニストの結合が、少なくとも１０％の低下することを意味する。
【００８８】
本明細書において用いられるように、「セカンドメッセンジャー」という用語は、ＧＰＣＲからのシグナル伝達に関与するＧタンパク質共役受容体の活性化によって生じる、もしくは濃度が変動する分子を意味する。セカンドメッセンジャーの例としては、これらに限定されないが、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウムが挙げられる。「セカンドメッセンジャーレベルの変化」は、候補調節因子の非存在下で実施されるアッセイにおける検出量と比較した、特定のセカンドメッセンジャーの検出レベルの少なくとも１０％の上昇または低下を意味する。
【００８９】
本明細書において用いられるように、「エクオリンアッセイ(aequorin-based assay)」という用語は、活性化ＧＰＣＲによって誘発される細胞内カルシウム流束を測定するＧＰＣＲ活性アッセイを意味しており、細胞内カルシウム流束が、細胞内で発現される発光またはエクオリンによって測定される。
【００９０】
本明細書において用いられるように、「結合」という用語は、リガンド（例、イソ吉草酸）と受容体（例、RCC356）との物理的結合を意味する。本明細書において該用語が用いられるように、１００ｎＭ未満、通常は１００μＭから１０００μＭのＥＣ５０またはＫｄで結合が生じる場合、結合は「特異的」である。におい物質機能アッセイを利用して、認められたＥＣ５０は通常１０、１００、さらには１ｍＭであり、前記シグナルは特異的と見なされうる（図３参照）。ＥＣ５０またはＫｄが、１０００μＭ、９５０μＭ、９００μＭ、８５０μＭ、８００μＭ、７５０μＭ、７００μＭ、６５０μＭ、６００μＭ、５５０μＭ、５００μＭ、４５０μＭ、４００μＭ、３５０μＭ、３００μＭ、２５０μＭ、２００μＭ、１５０μＭ、１００μＭ、７５μＭ、５０μＭ、２５μＭまたは１０μＭ、１μＭ、９５０ｎＭ、９００ｎＭ、８５０ｎＭ、８００ｎＭ、７５０ｎＭ、７００ｎＭ、６５０ｎＭ、６００ｎＭ、５５０ｎＭ、５００ｎＭ、４５０ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ、１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭまたは１０ｐＭ以下の場合、におい物質結合は特異的と見なされうる。
【００９１】
本明細書において用いられるように、「ＥＣ５０」という用語は、イソ吉草酸などのリガンドの結合などの任意の活性およびＲＣＣ３５６ポリペプチドの機能活性が、同じアッセイを利用して測定可能なＲＣＣ３５６活性の最高値の５０％となる薬剤の濃度を意味する。換言すると、「ＥＣ５０」は、１００％活性がより多量のアゴニストの添加によって上昇しない活性量と定められる場合に、５０％の活性化をもたらす薬剤の濃度である。「イソ吉草酸等価体のＥＣ５０」は、酸の同一性に伴って変動し、例えば、同等のイソ吉草酸分子のＥＣ５０値は、イソ吉草酸以上、未満、または同程度であることに注意する必要がある。したがって、イソ吉草酸等価体を使用する場合、当業者であれば従来の方法に従ってＥＣ５０を測定可能である。任意のイソ吉草酸等価体のＥＣ５０は、少なくともＲＣＣ３５６応答が飽和状態となる、もしくは最高に達するまで増量させたイソ吉草酸等価体の存在下で一定量のＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性測定を実施して、測定したＲＣＣ３５６活性と使用した酸の濃度をプロットすることで測定される。
本明細書において用いられるように、「Ｋｄ」は、解離定数、つまり受容体の半数が平衡状態でリガンドと結合するリガンドの濃度である。
【００９２】
本明細書において用いられるように、「ＩＣ５０」という用語は、ＲＣＣ３５６受容体の最高活性を５０％低下させるアンタゴニストまたはインバースアゴニストの濃度である。
【００９３】
本明細書において用いられるように、「検出可能なように標識」という用語は、分子の特性を意味する（例、構造的変化を受けたイソ吉草酸またはその等価体）。前記変化は、官能基の取り込み、または付加によって導入される。前記官能基（標識）は容易に検出可能である。検出可能な標識として、蛍光化合物、同位体化合物、発光化合物、量子ドットラベルが挙げられるが、これらに限定されない。イソ吉草酸または等価体の構造に付加可能な放射性同位体の例として１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈがありうる。イソ吉草酸または等価体の構造に取り込み可能な放射性同位体の例として３Ｈ、１４Ｃがありうる。多様な検出方法として、分光学的、光化学的、放射化学的、生化学的、免疫化学的、化学的方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書において用いられるように、「アフィニティタグ」という用語は、目的の分子（例、ＲＣＣ３５６ポリペプチド）に付ける標識を意味しており、これによって標識に結合する試薬が特異的に標識分子に結合できる。親和性タグとして、抗体に対するエピトープ（別名「エピトープタグ」）、ビオチン、６ＸＨｉｓ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴが挙げられるが、これらに限定されない。親和性タグは、標識種の精製の他、検出に使用可能である。
【００９５】
本明細書において用いられるように、「結合の低下」は、既知の、もしくは予測される調節因子のないアッセイ中で検出される結合量と比較して、既知の、もしくは予測されるＲＣＣ３５６の調節因子を有する任意のアッセイ中で検出される結合量が、少なくとも１０％の減少することを意味する。
【００９６】
本明細書において用いられるように、「送達」という用語は、薬物や薬剤に関して使用される場合、アッセイの混合液、もしくは細胞培養への薬物または薬剤の添加を意味する。該用語は動物への薬物または薬剤の投与も意味する。該投与は、例えば、注射（例えば生理食塩水や水まどの適当な溶媒中）、吸入、経口、経皮、直腸、膣内などの通常の薬物投与経路が可能である。
【００９７】
本明細書において用いられるように、「Ｇタンパク質共役受容体」または「ＧＰＣＲ」という用語は、７つのαヘリックス膜貫通ドメインを有する膜結合型ポリペプチドを意味する。 機能的なＧＰＣＲはリガンドまたはアゴニストと結合し、またＧタンパク質とも結合して、これを活性化させる。ＲＣＣ３５６はＧＰＣＲである。
【００９８】
本明細書において用いられるように、「嗅覚受容体」という用語は、Zozulya ら, Genome Biology 2001 2(6) research0018.1-0018.12.で定義される通り、ＯＲ記号を伴うＧＰＣＲである。 該参考文献は、参照により本明細書に援用されている。
【００９９】
本明細書において用いられるように、「ＲＣＣ３５６ポリペプチドの機能を調節する薬剤」という用語は、イソ吉草酸またはその等価体の結合を変化させる化合物、およびＲＣＣ３５６の下流のシグナル伝達活性を変化させる化合物を含む、ＲＣＣ３５６活性を上昇または低下させる分子または化合物である。
【０１００】
本明細書において用いられるように、「トランスジェニック動物」という用語は、該技術分野では周知のトランスジェニック技術などの人為的な方法によって、動物の１つ以上の細胞が、導入された外来の核酸を含んでいる、動物、好ましくはヒト以外の哺乳動物、鳥類、魚類、両生類を意味する。該核酸は、前駆細胞内への導入、マイクロインジェクションなどの計画的な遺伝子操作、組換えウイルスの感染によって、直接的または間接的に細胞内に導入される。遺伝子操作という用語には、古典的な異種交配や体外受精は含まれず、組換えＤＮＡの導入を目的としている。この分子は染色体中に組み込まれるか、もしくは染色体外で複製するＤＮＡとなりうる。本明細書に記載の典型的なトランスジェニック動物においては、導入遺伝子によって、細胞が目的のポリペプチドの組換え型（アゴニスト型またはアンタゴニスト型）を発現する。一方、例えば、後述のＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性コンストラクトなど、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も検討される。さらに、「トランスジェニック動物」には、遺伝子組換えおよびアンチセンス技術などの、人為的方法によって１つ以上の遺伝子が破壊された遺伝子組換え動物が含まれる。
【０１０１】
本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、目的のポリペプチドの１つとも特異的に反応する免疫グロブリン分子の断片の他、従来の免疫グロブリン分子である。抗体は従来技術を利用して断片化可能であり、該断片の可用性は、本明細書で後述されている完全な抗体のための同様の方法でスクリーニングされる。例えば、抗体をペプシン処理することでＦ（ａｂ）２断片を生成可能である。結果として得られるＦ（ａｂ）２断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元させ、Ｆａｂ断片を生成可能である。本発明の抗体はさらに、該抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって与えられる、ポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性、単鎖、キメラ、ヒト化分子を含むことを目的とする。好ましい実施態様では、抗体はさらに該抗体に付着した検出可能な標識を含む（例、標識は放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、補酵素でありうる）。
【０１０２】
本明細書において用いられるように、用語「抗腫瘍化合物」は、癌の発生または進行を停止または抑制させる任意の化合物を意味する。上記の通り、前記抗腫瘍化合物で治療されうる癌は、任意の癌または腫瘍の転移でありうる。さらに、前記化合物は、細胞増殖の抑制または停止、もしくは増殖中の細胞の生存に作用するが、他の細胞活動にも影響を及ぼしうる。
【０１０３】
本明細書において用いられるように、「抗におい物質剤」という用語は、動物によるにおい知覚を止める、または抑制する任意の薬剤を意味する。前記知覚は、インビボでにおい知覚を促進する、または示す動物試験、エクスビボ試験、またはインビトロ試験を利用してアッセイされうる。におい知覚の例には、アルデヒド、フルーティーライト、フルーティーダーク、甘い芳香植物、バルサム、芳香属スパイス、タバコ、 ツノマタゴケ、革、動物、琥珀、樹木、針葉樹、ハーブ系スパイス、薬草、緑黄色野菜、柑橘類でありうるが、これらに限定されない。
【０１０４】
「ＲＣＣ３５６活性の異常調節」という表現は、前記受容体が存在する正常な条件と比較して、ＲＣＣ３５６が活性化されないことを意味する。前記異常調節は、ＲＣＣ３５６受容体がＲＣＣ３５６に特異的リガンドによって正常に刺激されない条件、もしくは野生型ＲＣＣ３５６受容体と比較して、ＲＣＣ３５６刺激がシグナル伝達分子に異なる様式で伝達される条件に起因しうる。
【０１０５】
「診断方法」という表現は、疾患または障害が検出される方法を意味しており、前記状況下では、患者における前記疾患または障害の存在および（または）発生に関する測定可能な指標または徴候が既に存在する。
【０１０６】
「予後診断方法」という表現は、疾患または障害が発生する可能性を測定する方法を意味しており、前記状況下では、患者における前記疾患または障害の存在および／または発生に関する測定可能な指標または徴候は存在しないか、ほとんど見えない。
【０１０７】
「イソ吉草酸等価体」は、イソ吉草酸と同じ、または同等の効果を有する分子を意味する。該等価体の例が先に記載されているが、該化合物に限定されない。該記載は、一般的な周知の知見とともに、十分な情報を提供しているため、当業者であれば、任意の化合物がイソ吉草酸の等価体と見なされうるか否かを判断できる。このような「イソ吉草酸等価体」の一般的な化学式は（ＣＨ３）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−（ＣＨ）Ｚ−ＣＯＯＨでありうる。また、アミン、ケトン、エステル、エーテル、アルコールを含めた（これらに限定されない）、様々な化学的機能を有する様々なラジカルが一般的な該化学式にグラフトされうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
発明の詳細な説明
本発明は、イソ吉草酸が該ＲＣＣ３５６ ＧＰＣＲの天然リガンドであるとの発見と関連している。相互作用は、該相互作用、ひいてはＲＣＣ３６５の機能を調節する薬剤のスクリーニングアッセイに有用である。既知のリガンドおよびその受容体との相互作用は、無調節な前記受容体の活性などの状態の診断法も提供する。
【０１０９】
Ｉ. ＲＣＣ３５６の活性を調節する薬剤を同定するためのアッセイ
ＲＣＣ３５６の活性を調節する薬剤は、前記受容体とイソ吉草酸との相互作用を上手く利用した多数の方法で同定可能である。例えば、インビトロ、細胞培養、またはインビボにおいてＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の結合を再構成する能力によって、該結合を破壊する薬剤の同定における標的が与えられる。結合破壊に基づくアッセイによって、有機低分子のライブラリーまたは集合から有機低分子などの薬剤の同定が可能となる。または、該アッセイによって、植物、真菌、細菌の抽出物またはヒトの組織サンプルなどの天然材料からのサンプルまたは抽出物における薬剤の同定が可能となる。次に、該受容体を介した下流のシグナル伝達を測定する結合アッセイまたは機能アッセイを利用して、ＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の結合の調節因子をスクリーニング可能である。結合アッセイおよび機能アッセイのいずれもイソ吉草酸を使用して検証される。
【０１１０】
ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤をより直接的に同定するためのＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の相互作用を利用した別の方法では、候補薬剤または候補調節因子によって誘発されるＲＣＣ３５６の下流のシグナル伝達における変化が測定される。これらの機能アッセイは、分離した細胞膜画分または表面上に受容体を発現している細胞上で実施可能である。
【０１１１】
以下の説明では、ＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用に基づく結合アッセイおよび機能アッセイの方法を提供している。
【０１１２】
Ａ．ＲＣＣ３５６ポリペプチド
ＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用を利用したアッセイでは、ＲＣＣ３５６ポリペプチドの材料が必要となる。ヒトのＲＣＣ３５６のポリヌクレオチドとポリペプチドの配列を本明細書の図１に示している。ヒトのＲＣＣ３５６ポリヌクレオチドの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＲ５８１０８５．１でも入手可能であり、米国特許第６，７９０，６３１号で報告されており、参照により本明細書に援用されている。ＲＣＣ３５６ポリペプチド配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース受託番号ｓｐ／Ｑ８ＴＣＢ６／ｏｘｅ１ヒトにも記録されている。関連する配列としては、ＮＭ＿１５２４３０、ＮＰ＿６８９６４３、ＡＹ７７５７３１、ＡＡＶ５４１１０．１、ＡＢ０６５７８７、ＢＡＣ０６００６、ＢＫ００４３６９、ＤＡＡ０４７６７、ＡＣ０９０７１９、ＡＬ８３３１２７、ＡＹ６９８０５６、ＡＡＵ０７９９６が挙げられる。
【０１１３】
当業者であれば、既知の配列から設計されたプライマーまたはプローブを利用した基本的なＰＣＲおよび分子クローニング技術によって、該タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むサンプルからＲＣＣ３５６配列を容易に増幅できる。また、ＯＲ遺伝子はイントロンを含まない遺伝子であるため、当業者であればゲノムＤＮＡからＲＣＣ３５６配列を増幅できる。
【０１１４】
組換えポリペプチドの発現は、該技術分野においては周知である。当業者であれば、本発明に従って、真核細胞または原核細胞において有用なＲＣＣ３５６ポリペプチドの発現のためのベクターおよび発現制御配列を容易に選択できる。結合機能またはシグナル伝達機能を有するには、ＲＣＣ３５６は、細胞膜または合成リポソームのような界面活性剤と結合する必要がある。 細胞膜画分の調製方法は、該技術分野においては周知であり（例、Hubbard & Cohn, 1975, J. Cell Biol.64: 461-479において報告されている方法）、参照により本明細書に援用されている。ＲＣＣ３５６を含む膜を調製するためには、内因的に、もしくは組換え技術によってＲＣＣ３５６を発現している細胞に該技術を適用するだけでよい。または、膜を含まないＲＣＣ３５６は、ポリペプチドの界面活性剤液の希釈によって膜調製物中に組み込まれる(Salamon ら, 1996, Biophys.J.71 :283-294を参照。この文献は参照により本明細書に援用されている）。
【０１１５】
Ｂ．イソ吉草酸
イソ吉草酸の構造は当業者には周知である。また、当業者であれば、前記構造から容易に同等の酸を生じさせて、前記等価体がＲＣＣ３５６受容体に結合および／または調節可能あるか否かを容易に試験できる。イソ吉草酸およびその等価体は、天然試料または化学合成されたサンプルから分離できる。
【０１１６】
前記酸の定量に利用可能な方法として、a）抽出および精製には、溶媒抽出、油抽出、蒸気抽出、ＣＯ２超臨界抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留、ガスクロマトグラフィー、b）定量には、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、該方法の実施方法を知っている。
【０１１７】
イソ吉草酸またはその等価体は、精製して、もしくは組成物として使用されうる。本発明の任意の結合アッセイまたは機能アッセイに必要な酸の量はアッセイに応じて変わるが、通常、１回のアッセイ当たり標識済みの酸０．１μｍから１００μＭ、および未標識の酸１０μＭから１ｍＭを使用する。ＲＣＣ３５６に対する修飾イソ吉草酸分子の親和性およびＥＣ５０は元のイソ吉草酸とは変わるため、所与のアッセイにおいて必要な量は正常値に応じて調整できる。所与のアッセイにおいて必要な場合、上記の通りに、放射線標識ラベルの取り込みまたは添加によってイソ吉草酸を標識可能である。
【０１１８】
Ｃ．ＲＣＣ３５６活性の調節因子を同定するためのアッセイ
イソ吉草酸がＲＣＣ３５６受容体のリガンドであるとの発見によって、受容体活性のアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイが可能となる。スクリーニングアッセイには通常２つのアプローチが存在する。
【０１１９】
１）ＲＣＣ３５６発現細胞、該細胞の膜抽出物、ＲＣＣ３５６を含む固定化脂質膜を標識イソ吉草酸および候補化合物に暴露させるリガンド結合アッセイ。インキュベーション後、反応混合物における標識イソ吉草酸とＲＣＣ３５６受容体との特異的結合を測定する。標識イソ吉草酸を妨げる、もしくは置換する化合物は、ＲＣＣ３５６活性のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストでありうる。機能アッセイを実施して、陽性化合物がこれらのどれに分類されるかを判定可能である。
【０１２０】
化合物の結合は３つの主なカテゴリー（競合的結合、非競合的結合、不競合的結合）に分類できる。競合的結合化合物は二次（対照）化合物と似ており、標的分子（ここでは受容体）の同じ結合ポケットに結合する。添加時、競合的結合化合物は、前記標的から前記二次化合物を置換する。非競合的結合化合物は、二次（対照）化合物として標的分子の同じ結合ポケットに結合することはないが、前記標的分子上で前記二次化合物の作用と相互作用しうる。非競合的結合化合物の添加時、二次化合物は置換されない。二次化合物が既に結合している場合、不競合的結合化合物は標的分子に結合する。共同的結合は、任意の化合物が、対照化合物となりうる別の化合物の結合を促進することを意味する。このように、共同的効果は、前記他の化合物のＫｄアッセイにおいて認められる。
【０１２１】
２）ＲＣＣ３５６のシグナル伝達活性を測定する機能アッセイ
【０１２２】
ａ）アゴニストのスクリーニングにおいて、ＲＣＣ３５６発現細胞または該細胞から調製された膜を候補化合物とインキュベーションさせて、ＲＣＣ３５６シグナル伝達活性を測定する。イソ吉草酸をアゴニストとして使用してアッセイを検証し、受容体活性を調節する化合物によって誘発される活性をイソ吉草酸によって誘発される活性と比較する。アゴニストおよび部分的アゴニストは、該アゴニストおよび部分的アゴニストが１００（０）μＭ以下で存在する場合、イソ吉草酸の２、５、１０倍以上の活性を含め、イソ吉草酸の最高活性の少なくとも１０％、好ましくは、５０％、７５％、１００％に相当する最高生物活性を有する。
【０１２３】
ｂ）アンタゴニストまたはインバースアゴニストのスクリーニングでは、ＲＣＣ３５６発現細胞または該細胞から分離した膜について、候補化合物を伴う、もしくは伴わない、イソ吉草酸の存在下におけるシグナル伝達活性をアッセイした。アンタゴニストまたはインバースアゴニストは、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを欠く反応と比較して、イソ吉草酸によって刺激された受容体活性のレベルを少なくとも１０％低下させる。
【０１２４】
ｃ）インバースアゴニストのスクリーニングでは、候補化合物の存在下および非存在下において受容体活性を測定する機能アッセイにおいて、構成的ＲＣＣ３５６発現細胞または該細胞から分離した膜を使用する。インバースアゴニストは受容体の構成的活性を少なくとも１０％低下させる化合物である。ＲＣＣ３５６の過剰発現は、構成的活性化をもたらしうる。ＲＣＣ３５６は、強力な構成的プロモーター（例、ＣＭＶ初期プロモーター）の制御下に置かれることで過剰発現させることができる。または、保存されたＧＰＣＲのアミノ酸またはアミノ酸ドメインにおけるある種の突然変異が構成的活性化を招く傾向がある。 例えば、Kjelsberg ら, 1992, J. Biol. Chem. 267:1430; McWhinney ら, 2000. J. Biol. Chem. 275:2087; Ren ら, 1993, J. Biol. Chem. 268:16483; Samama ら, 1993, J. Biol. Chem 268:4625; Parma ら, 1993, Nature 365:649; Parma ら, 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 286:85; Parent ら, 1996, J. Biol. Chem. 271 :7949を参照されたい。
【０１２５】
リガンド結合および置換アッセイ：
イソ吉草酸とＲＣＣ３５６との結合を抑制する化合物をスクリーニングするために、イソ吉草酸とともに、細胞上で発現しているＲＣＣ３５６ポリペプチド、または受容体ポリペプチドを含む分離膜を利用可能である。結合またはイソ吉草酸の置換のみを測定するアッセイにおいて同定された場合、それらを機能試験にかけて化合物がアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストのいずれとして作用するかを判定する必要がある。
【０１２６】
置換実験において、ＲＣＣ３５６ポリペプチド発現細胞（通常、１回のアッセイまたは膜抽出物１〜１００μｇ当たり細胞２５，０００個）を、漸増濃度の候補調節因子の存在下または非存在下において、標識イソ吉草酸と一緒に、結合バッファー（例、50mM Hepes pH 7.4、1mM CaCl2、脂肪酸を含まない0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.5mM MgCl2)中で１．５時間（例えば２７℃で）インキュベートさせる。アッセイを検証して、較正するために、漸増濃度の未標識イソ吉草酸を使用した対照の競合反応を実施可能である。インキュベーション後、細胞を十分に洗浄して、結合した標識イソ吉草酸の特定の標識をそれぞれに見合った方法（例、シンチレーション計数、酵素アッセイ、蛍光など）で測定する。候補調節因子の存在下における標識イソ吉草酸の結合量の少なくとも１０％の低下は、候補調節因子による結合の置換を示している。仮に候補調節因子が１００μＭ以下の濃度（つまり、ＥＣ５０が１００μＭ以下）で標識イソ吉草酸（飽和量未満のイソ吉草酸）の５０％を置換する場合、該調節因子は該アッセイまたは本明細書に記載の他のアッセイにおいて特異的に結合すると考えられる。
【０１２７】
または、結合または結合の置換は、表面プラズモン共鳴(SPR)によってモニター可能である。表面プラズモン共鳴アッセイは、水層からセンサー上の膜内に固定されたＲＣＣ３５６ポリペプチドへのイソ吉草酸の結合または結合の喪失によって生じる固定化センサー付近での質量変化による、２つの分子間での結合の定量的測定法として使用可能である。この質量変化は、イソ吉草酸または候補調節因子の注入または除去後での時間に対する共鳴単位として測定され、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ(Biacore AB)を使用して測定される。ＲＣＣ３５６は、Salamonらの記述した方法に従って、薄膜脂質膜内のセンサーチップ（例、研究グレードのＣＭ５チップ；Biacore AB）上に固定可能である。(Salamon ら, 1996, Biophys J. 71 : 283-294; Salamon ら, 2001 , Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon ら, 1999, Trends Biochem. Sci.24: 213-219。これらの各文献は参照により本明細書に援用されている)。Sarrioらは、チップ上の脂質層内に固定化したＧＰＣＲ Ａ（１）アデノシン受容体へのリガンド結合を検出するために、ＳＰＲを使用可能であることを実証した(Sarrio ら, 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174。文献は参照により本明細書に援用されている)。ＳＰＲアッセイにおいてイソ吉草酸がＲＣＣ３５６に結合する条件は、開始点として、Sarrioらが報告した条件を利用して、当業者によって微調整可能である。
【０１２８】
ＳＰＲでは、少なくとも２つの方法で結合する調節因子をアッセイできる。第一に、イソ吉草酸を固定化ＲＣＣ３５６ポリペプチドに前もって結合させた後、流速約１０μＬ／分、濃度１ｎＭから１０００μＭ、好ましくは約１００μＭで候補調節因子を注入可能である。結合したイソ吉草酸の置換を定量して、調節因子の結合の検出を可能にする。または、膜結合ＲＣＣ３５６ポリペプチドを候補調節因子と事前にインキュベーションして、イソ吉草酸で攻撃できる。調節因子への暴露前のチップ上でのイソ吉草酸の結合と比較した、調節因子に暴露後のＲＣＣ３５６へのイソ吉草酸の結合における差によって、結合が実証される。いずれかのアッセイにおいても、候補調節因子の非存在下におけるイソ吉草酸の結合量と比較した、候補調節因子の存在下におけるイソ吉草酸の結合量の１０％以上の低下は、該候補調節因子はＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用を抑制していることを示唆している。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、質量分析またはガスクロマトグラフィーなど、候補調節因子を同定するシステムに接続可能である。
【０１２９】
ＲＣＣ３５６へのイソ吉草酸の結合の抑制を測定するもう１つの方法では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が利用される。ＦＲＥＴは、蛍光ドナー(Ｄ)の放出スペクトルと蛍光アクセプター（Ａ）の励起スペクトルが重なる場合、互いに隣接した（通常、間隔が１００Ａ未満）ＤとＡの間に生じる量子力学的現象である。被験分子（例、イソ吉草酸、ＲＣＣ３５６ポリペプチド）は、ドナーとアクセプターのフルオロフォアの相補的対合で標識される。ＲＣＣ３５６：イソ吉草酸の相互作用に起因して互いに隣接している間、ドナーのフルオロフォアの励起時に放出される蛍光は、分子が結合していない時にその励起波長に反応して放出される蛍光とは異なる波長を有しており、各波長での発光強度の測定によって結合ポリペプチド対未結合ポリペプチドが定量される。標的分子を標識するためのフルオロフォアのドナー：アクセプターは該技術分野において周知である。
【０１３０】
ＦＲＥＴにおける変化では、分子間相互作用をモニターするために蛍光クエンチングが利用される。相互作用対の一方の分子をフルオロフォアで標識可能であり、他方は、隣接して付加した場合にフルオロフォアの蛍光をクエンチングさせる分子で標識可能である。励起時の蛍光変化は、フルオロフォア：クエンチャー対のタグを付けた分子結合における変化を示唆する。通常、標識ＲＣＣ３５６ポリペプチドの蛍光の増大は、クエンチャーの付いたイソ吉草酸が置換されていることを示唆する。クエンチングアッセイにおいて、候補調節因子を含まないサンプルと比較した、候補調節因子を含むサンプル中での蛍光発光強度の１０％以上の増大は、候補調節因子が、ＲＣＣ３５６：イソ吉草酸との相互作用を阻害していることを示唆する。
【０１３１】
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)は、インビボでの分子内相互作用をモニターするシステムである。アッセイは、ウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)の含む融合タンパク質と、例えば黄色蛍光タンパク質(YPF)または緑色蛍光タンパク質(GFP)との間の非放射エネルギー移動に基づいている。ＢＲＥＴシグナルは、コエレンテラジン派生物基質の酸化によって生じる。該システムでは、アクセプターとして、細胞透過性、非毒性コエレンテラジン派生物基質であるDeepBleuC（商標）(DBC)および緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異体が適用されうる。ドナーとアクセプターが近傍にある場合、ＤＢＣの接触分解から生じるエネルギーが、ＲｌｕｃからＧＦＰに移され、固有の波長の蛍光を放つ。この方法によって、フルオロフォアの角度とは無関係に、２つの被験分子間の距離が増大される。
【０１３２】
表面プラズモン共鳴およびＦＲＥＴ／ＢＲＥＴ法に加えて、蛍光偏光測定はイソ吉草酸-受容体結合の定量に有用である。蛍光タグ付き分子の蛍光偏光度は、回転相関またはタンブリング速度に左右される。蛍光標識されたイソ吉草酸とＲＣＣ３５６との結合によって形成される複合体などのタンパク質複合体の偏光度は、複合体を形成しないイソ吉草酸の偏光度よりも高い。ＲＣＣ３５６：イソ吉草酸の相互作用の候補抑制剤を含むことで、候補阻害剤がＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用を破壊または抑制する場合、候補抑制剤を含まない混合物と比較して、蛍光偏光は低下する。蛍光偏光は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体の形成を破壊する低分子の同定に適切である。候補調節因子を含まないサンプル中での蛍光偏光と比較した、候補調節因子を含むサンプル中での蛍光偏光における１０％以上の低下は、候補調節因子がＲＣＣ３５６：イソ吉草酸の相互作用を抑制することを示唆している。
【０１３３】
ＲＣＣ３５６：イソ吉草酸の相互作用をモニタリングするためのもう１つの代替法では、バイオセンサーアッセイを利用する。ＩＣＳバイオセンサーについてはＡＭＢＲＩによって記載されている(Australian Membrane Biotechnology Research Institute; http//www.ambri.com.au/)。この技術において、ＲＣＣ３５６やイソ吉草酸などの分子の結合は、浮遊膜二重層のグラミシジン促進イオンチャンネルの閉鎖、ひいてはバイオセンサーのアドミタンス（インピーダンスと類似）における測定可能な変化と関連している。このアプローチは、６桁のアドミタンス変化量に及んで線形であり、低分子のコンビナトリアルライブラリーの大規模ハイスループットスクリーニングには理想的に適合する。候補調節因子を含まないサンプルのアドミタンスと比較した、候補調節因子を含むサンプルでのアドミタンスにおける１０％以上の変化（上昇または低下）は、候補調節因子がＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用を阻害することを示している。
【０１３４】
酸−タンパク質間での相互作用のアッセイでは、該相互作用の調節因子が、物理的に相互作用するタンパク質のドメインと必ずしも直接的に相互作用しなくても構わないことに注意することが重要である。調節因子は、酸‐タンパク質の相互作用部位とは離れた場所で相互作用して、例えば、ＲＣＣ３５６ポリペプチド内の構造変化を起こすことも可能である。それでも、この様式で作用する調節因子（阻害剤またはアゴニスト）は、ＲＣＣ３５６の活性を調節する薬剤として興味深い。
【０１３５】
サンプル（例、ＲＣＣ３５６受容体に結合する、もしくは該受容体へのイソ吉草酸の結合に影響を及ぼす組織サンプル）中での薬剤の存在を判定するために、記載されているいずれの結合アッセイも利用できる。この目的のために、該サンプルの存在下または非存在下において、ＲＣＣ３５６ポリペプチドをイソ吉草酸または別のリガンドと反応させて、利用した結合アッセイに応じた方法によってイソ吉草酸またはリガンドの結合を測定する。イソ吉草酸または他のリガンドの結合における１０％以上の低下は、該サンプルが受容体ポリペプチドへのイソ吉草酸またはリガンドの結合を調節する薬剤を含んでいることを示唆する。
【０１３６】
タンパク質チップ
本発明の方法はタンパク質チップに適用できる。前記タンパク質チップは、ガラススライドまたはニトロセルロース膜でありうるが、これらに限定されない。タンパク質チップ用のアレイ法は、該技術分野において周知である。
【０１３７】
受容体活性の機能アッセイ
ｉ．ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合アッセイ
ＲＣＣ３５６などのＧＰＣＲについて、受容体活性の測定は、受容体を含む細胞膜によるＧＴＰの結合である。参照により本明細書に援用されている、Traynor and Nahorski, 1995, MoI.Pharmacol.47: 848-854に記述の方法では、基本的に、標識ＧＴＰの結合を測定することでＧタンパク質の膜への結合を測定する。ＧＴＰ結合アッセイにおいては、受容体を発現する細胞の分離膜を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、８０ｐＭ ３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、３μＭ ＧＤＰを含むバッファー中でインキュベートさせる。アッセイ混合物を３０℃で６０分間インキュベートさせ、その後、未結合の標識ＧＴＰをＧＦ／Ｂフィルター上でのろ過によって除去する。結合標識ＧＴＰは液体シンチレーション計数で測定する。イソ吉草酸によって誘発された ＲＣＣ３５６活性の調節をアッセイするために、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞から調製された膜をイソ吉草酸と混合して、ＲＣＣ３５６活性の候補調節因子の存在下および非存在下においてＧＴＰ結合アッセイを実施する。候補調節因子を含まないアッセイと比較した、該候補調節因子を含むこの種のアッセイでのシンチレーション計数によって測定された標識ＧＴＰ結合における１０％以上の低下は、候補調節因子がＲＣＣ３５６活性を抑制することを示唆する。
【０１３８】
イソ吉草酸を含まない同様のＧＴＰ結合アッセイを実施して、アゴニストとして作用する化合物を同定できる。この場合、イソ吉草酸によって促進されたＧＴＰ結合が標準として使用される。化合物が１ｍＭ以下存在する際、該化合物がイソ吉草酸によって誘発されるＧＴＰ結合レベルの少なくとも５０％を誘発させる、また好ましくはイソ吉草酸によって誘発される以上のレベルを誘発する場合、化合物はアゴニストと見なされる。
【０１３９】
γ３２Ｐ−ＧＴＰ標識ＲＣＣ３５６ポリペプチドを含む膜をインキュベーションさせてＧＴＰａｓｅ活性を測定する。活性型ＧＴＰａｓｅは無機リン酸として標識を放出させ、これは２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４中の５％活性炭浮遊液における遊離の無機リン酸の分離によって検出され、シンチレーション計数にかけられる。候補化合物で起こり得る非特異的作用を除外するために、対照にはＲＣＣ３５６非発現細胞（ｍｏｃｋ導入）からの分離膜を使用したアッセイが含まれる。
【０１４０】
ＲＣＣ３５６によって制御されるＧＴＰａｓｅ活性に及ぼす候補調節因子の作用をアッセイするために、該調節因子を含む、もしくは含まないイソ吉草酸と一緒に膜サンプルをインキュベートさせた後、ＧＴＰａｓｅアッセイを実施する。調節因子を含まないサンプルと比較した、ＧＴＰ結合またはＧＴＰａｓｅ活性のレベルにおける１０％以上の変化（上昇または低下）は、候補調節因子によるＲＣＣ３５６調節を示唆する。
【０１４１】
ｉｉ 下流経路の活性化アッセイ：
ａ．カルシウム流束− エクオリンアッセイ
エクオリンアッセイでは、ＧＰＣＲの活性化によって誘発される細胞内でのカルシウム流束またはカルシウム流束（入口）に対するミトコンドリアまたは細胞質のアポエクオリンに対する反応性を上手く利用する（Stables ら, 1997, Anal.Biochem.252:115-126;Detheux ら, 2000, J. Exp.Med., 192 1501-1508; いずれの文献も参照により本明細書に援用されている）。簡単に説明すると、ミトコンドリアまたは細胞質のアポエクリオンおよびＧα１６またはＧ−ｏｌｆを同時発現するように、ＲＣＣ３５６を表現するクローンにトランスフェクションする。細胞を５μＭコエレンテラジンＨまたは派生物（Molecular Probes）と一緒に４時間室温でインキュベートさせて、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養液で洗い、濃度0.５×１０６細胞個／mLに再浮遊させる。次に細胞を試験アゴニストのペプチドと混合させて、エクオリンによる発光を発光計で３０秒間記録する。結果を相対的な光単位（ＲＬＵ）で表す。候補化合物で起こり得る非特異的作用を除外するために、対照にはＣ３５６非発現細胞（ｍｏｃｋ導入）からの分離膜を使用したアッセイが含まれる。
【０１４２】
Ｃ３５６ポリペプチドを発現しているが、候補調節因子では処理されていない細胞サンプル、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現していないが、候補調節因子で処理された細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しており、候補調節因子で処理された細胞サンプル中での光強度が１０％以上上昇または低下した場合、エクオリン活性または細胞内カルシウム濃度は「変化」している。
【０１４３】
イソ吉草酸の非存在下で実施される場合、アッセイを利用して、ＲＣＣ３５６活性のアゴニストまたはインバースアゴニストを同定可能である。イソ吉草酸の存在下でアッセイを実施する場合、該アッセイをアンタゴニストのアッセイに利用可能である。
【０１４４】
１）ａ Ｆｌｕｏ３、４、Ｆｕｒａ２、Ｃａｌｃｉｕｍ３（Molecular Device）アッセイ
蛍光アッセイでは、受容体の活性化によって引き起こされるカルシウム流束（例えば、ＣＮＧを介したカルシウム流束入または小胞体からのカルシウム放出）を上手く利用している。これらに限定されないが、Ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４、Ｆｕｒａ２（Molecular Probes）、Ｃａｌｃｕｍ３キットシリーズ（Molecular Device）などの一部のフルオロフォアがカルシウムと結合することが知られている。このようなフルオロフォア-カルシウム複合体は、それぞれに固有の周波数で蛍光を発する。これによって、Ｇタンパク質共役受容体の活性化の際、小胞体から放出された、もしくはＣＮＧを介して進入したカルシウムがフルオロフォアに結合して、固有の蛍光を発する。ＲＣＣ３５６を過剰発現している細胞を１−８μＭのフルオロフォア溶液と３７℃で３０−６０分間インキュベートさせる。生理食塩水での十分な洗浄後、細胞（６〜１５３６）を含む各ウェルに同バッファー５０μＬを分注する。次に、該添加細胞上に試験済みアゴニストを注入して、ＲＣＣ３５６の活性化後に蛍光を測定する。
【０１４５】
Ｃ３５６ポリペプチドを発現しているが、候補調節因子では処理されていない細胞サンプル、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現していないが、候補調節因子で処理された細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しており、候補調節因子で処理された細胞サンプル中での蛍光強度が１０％以上上昇または低下した場合、細胞内カルシウム濃度は「変化」している。
【０１４６】
２）脱分極／過分極膜アッセイ（例、DiBacフルオロフォア）
該アッセイの原理は、細胞膜の脱分極に従うはずである。陰イオン性プローブＤｉＢＡＣ４（３）は、膜電位依存的に細胞内、細胞外区画に分かれる。膜電位の上昇（脱分極）に伴い、プローブはさらに細胞内に分かれて、蛍光を増大させる。逆に、過分極は、染料の押し出しのために蛍光を減弱させる。
【０１４７】
ＤｉＢＡＣ４（３）プローブは波長４８８ｎｍで励起され、波長５４０ｎｍで発光する。
【０１４８】
実験当日、アッセイバッファー（生理食塩水バッファー）に最終濃度１０ｍＭのグルコースおよび最終濃度５μＭのＤｉＢＡＣ４（３）プローブを添加する。アッセイバッファーを３７℃に維持する。細胞培養液を除いて、ＲＣＣ３５６過剰発現細胞を含む各ウェルを予め加熱したアッセイバッファー２００μＬで２回洗い流す。ＤｉＢＡＣ４（３）を含むアッセイバッファー１８０μＬを加えて、適当な温度で細胞を３０分間インキュベートする。３０分後には細胞プレートはアッセイに使用できる。添加２分前にベースラインを収集する。適当なウェルに候補調節因子２０μＬを添加して、さらに２５分間のデータを収集する。
【０１４９】
Ｃ３５６ポリペプチドを発現しているが、候補調節因子では処理されていない細胞サンプル、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現していないが、候補調節因子で処理された細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しており、候補調節因子で処理された細胞サンプル中での蛍光強度が１０％以上上昇または低下した場合、膜分極は「変化」している。
【０１５０】
３）メラノフォアアッセイ メラノフォアアッセイは色によるアッセイである。基本的に、このアッセイに使用される細胞は、アフリカツメガエルの皮膚に由来している。これらの不死化細胞はメラニン小体を含んでおり、メラニン小体は黒色色素を含む細胞小器官である。アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣの活性化を引き起こす内因性または組換えＧＰＣＲの活性化は、メラニン小体を分散させて、細胞を黒くする。または、アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣを抑制するＧＰＣＲは細胞の色を薄くする。これによって、セカンドメッセンジャーの濃度測定の代わりに、細胞の色の変化を観察することでヒットを容易に特定できる。この色の変化は、６５０ｎＭでの吸光度を測定するマイクロリーダーで、もしくはビデオ画像システムでの検査によって容易に定量化できる。
【０１５１】
ｂ．アデニル酸シクラーゼ
アデニル酸シクラーゼ活性のアッセイについては、Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol.Pharmacol.20: 585-591に記述されており、この文献は参照により本明細書に援用されている。このアッセイは、Solomon ら、 1974、 Anal.Biochem.58: 541-548で説明されているアッセイの変法であり、この文献は参照により本明細書に援用されている。簡単に説明すると、１００μＬの反応液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH 7.5)、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ クレアチンリン酸（ジナトリウム塩）、クレアチン、ホスホキナーゼ１０ユニット（タンパク質７１μｇ）、１ｍＭ α−３２Ｐ−ＡＴＰ （四ナトリウム塩２μＣｉ）、０．５ｍＭ ｃＡＭＰ、Ｇ３Ｈ標識ｃＡＭＰ（約１０，０００ｃｐｍ）、０．５ｍＭ Ｒｏ２０−１７２４、０．２５％エタノール、被験タンパク質ホモジネート（ＲＣＣ３５６ポリペプチド発現／未発現、イソ吉草酸処理／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞のホモジネート）５０〜２００μｇを含んでいる。 通常、反応混合物を３７℃で６分間インキュベートする。インキュベーション後、反応混合物に６％冷三塩化酢酸０．９ｍＬを添加してタンパク質を除去する。チューブを１８００ｘｇで２０分間遠心分離にかけて、各上精をＤｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４カラムに加える。カラムからのｃＡＭＰ画分を４ｍＬの０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカウンターバイアル内に溶出させる。アッセイは３回行う。ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しない細胞のタンパク質ホモジネートを使用して対照反応も行う必要がある。
【０１５２】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子による非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１５３】
本発明によると、候補調節因子では処理されていない細胞サンプル、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現していないが、候補調節因子で処理された細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６活性の候補調節因子で処理された細胞サンプル中でアデニル酸シクラーゼ活性が１０％以上上昇または低下した場合、アデニル酸シクラーゼ活性は「変化」している。または、対照化合物で処理されたサンプル中におけるＲＣＣ３５６の候補調節因子による１０％以上の活性低下を試験できる。
【０１５４】
ｃ．ｃＡＭＰアッセイ：
ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ(RIA)を利用して細胞内ｃＡＭＰを、もしくは該技術分野において周知の方法に従ってｃＡＭＰ結合タンパク質を測定する。例えば、Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol.Biol.41:91-105においてｃＡＭＰに関するＲＩＡについて記述されており、この文献は参照により本明細書に援用されている。
【０１５５】
LJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsが販売しているHigh Efficiency Fluorescence Polarization-based homogeneous assayなどの多くのｃＡＭＰ測定用キットが市販されている。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１５６】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子による非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１５７】
候補調節因子で処理されていない同様の細胞におけるｃＡＭＰと比較して、上記のHorton & Baxendale(1995)のＲＩＡアッセイを利用して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しているＲＣＣ３５６活性の候補調節因子で処理された細胞（またはその抽出物）で検出されるｃＡＭＰ濃度が１０％以上上昇または低下した場合、ｃＡＭＰ濃度は「変化」している。
【０１５８】
ｄ．リン脂質の分解、ＤＡＧ産生、イノシトール三リン酸濃度：
リン脂質の分解、および結果としてもたらされるセカンドメッセンジャーであるＤＡＧおよび／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の産生をモニタリングすることで、既知の、もしくは予想されるＲＣＣ３５６調節因子の活性に起因する変化について、リン脂質の分解を活性化させる受容体をモニターできる。これらの各測定方法は、Ian M. Bird.Totowa(NJ1 Humana Press)が編集したPhospholipid Signaling Protocols(1998年)に記載されており、この文献は参照により本明細書に援用されている。本明細書において援用される、ホスファチジルイノシトールのアッセイについても記述しているRudolph ら, 1999, J. Biol.Chem.274: 11824-11831も参照されたい。ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１５９】
本発明によると、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しているが、候補調節因子で処理されていない細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しており、イソ吉草酸の存在下または非存在下において候補調節因子で処理された細胞サンプル中においてホスファチジルイノシトール分解、およびジアシルグリセロールおよび（または）イノシトール三リン酸濃度が少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、それらは「変化」している。
【０１６０】
ｅ．ＰＫＣ活性化アッセイ：
増殖因子の受容体であるチロシンキナーゼは、リン脂質、カルシウムで活性化されるプロテインキナーゼのファミリーであるプロテインキナーゼＣ(PKC)の活性化を含む経路を介してシグナル伝達を行う傾向がある。ＰＫＣ活性化は、最終的には、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎなどの一連のプロトオンコジーン転写因子、コラゲナーゼＩ型およびプラスミノゲンアクチベータインヒビターなどのプロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビター、そして細胞内接着分子Ｉ(ICAM I)などの接着分子をコードする遺伝子の転写をもたらす。ＰＫＣによって誘発される遺伝子産物の増加を検出するように設計されたアッセイを利用して、ＰＫＣ活性化、ひいては受容体活性をモニターできる。また、ＰＫＣを介してシグナル伝達を行う受容体の活性は、ＰＫＣ活性化によって活性化される遺伝子の制御配列によって促進されるレポーター遺伝子の利用によってモニター可能である。このタイプのリポーター遺伝子アッセイについては、以下で詳述されている。
【０１６１】
ＰＫＣ活性のより直接的な測定には、参照により本明細書に援用されている、Kikkawa ら、 1982、 J. Biol.Chem.257: 13341に記述されている方法を利用可能である。このアッセイによって、ＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化が測定され、これはその後ホスホセルロースペーパーへの結合によって分離される。このＰＫＣアッセイ系を利用して、精製キナーゼの活性、または細胞粗抽出物における活性を測定できる。プロテインキナーゼＣサンプルは、アッセイ直前に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ ＤＴＴで希釈可能である。
【０１６２】
アッセイ用基質は、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク質(MARCKS)由来のペプチドＡｃ−ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２（配列番号：２）である。このペプチドに対する酵素のＫｍは約５０μＭである。該技術分野において周知の他の塩基性のプロテインキナーゼＣ選択的ペプチドも、Ｋｍの少なくとも２〜３倍の濃度で使用可能である。アッセイに必要な補因子としてカルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロールが含まれる。使用者の目的に応じて、存在するＰＫＣ量（活性化条件）または存在する活性型ＰＫＣ量（非活性化条件）を測定するためにアッセイを実施可能である。本発明の大半の目的のために、活性化可能なＰＫＣの測定ではなく、分離時にサンプル中で活性であるＰＫＣを測定するために、非活性化条件を利用する。非活性化条件では、ＥＧＴＡを使用するために、アッセイにおいてカルシウムを除外する。
【０１６３】
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、１−２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ ＡＴＰ、〜１μＣｉγ−３２Ｐ−ＡＴＰ、１００μｇ／ｍＬペプチド基質（〜１００μＭ）、１４０μＭ／３．８μＭホスファチジルセリン／ジアシルグリセロール膜、１００μＭカルシウム（好ましくは５００μＭ ＥＧＴＡ）を含む混合物中でアッセイを実施する。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、２ｍＭ ＤＴＴで希釈した４８μＬサンプルを最終反応量８０μＬで使用した。３０℃で５〜１０分間、反応を行い、２５μＬの１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０を添加して反応を停止させた。
【０１６４】
反応停止後、各反応の一部（８５μＬ）をＷｈａｔｍａｎ Ｐ８１セルロースリン酸フィルター上にスポットして、０．４％リン酸５００ｍＬ中で４回（５〜１０分間／回）、そして最後に９５％ＥｔＯＨ５００ｍＬ中で２〜５分間洗う。結合している放射活性をシンチレーション計数によって測定する。標識ＡＴＰの比放射能（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）は、Ｐ８１ペーパー上に反応サンプルをスポットして、洗浄せずに計数することで測定される。１分間に転移したリン酸（ｎｍｏｌ）で定義される、ＰＫＣ活性の単位を以下のように計算する：
【０１６５】
活性単位（ｎｍｏｌ／分）＝（ペーパー上のｃｐｍ） ｘ （計１０５μＬ／スポット８５μＬ）（アッセイ時間、分）（ＡＴＰの比放射能ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）
【０１６６】
ＰａｎＶｅｒａ社が販売しているＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号P2747）を使用して、代わりのアッセイを実施可能である。
【０１６７】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１６８】
本発明によると、候補調節因子で処理されていない同様のサンプルで実施された反応と比較して、候補調節因子で処理されたＲＣＣ３５６発現細胞の抽出物において上記のいずれかのアッセイによって測定されるＰＫＣ単位が少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、ＰＫＣ活性は「変化」している。
【０１６９】
ｆ．ＰＫＡ活性化アッセイ
ＰＫＡ活性は、例えば、Molecular Device社のIMAP PKAアッセイキットまたはPromega社のProFluor PKAアッセイキットなど、市販のいくつかのキットを使用してアッセイ可能である。
【０１７０】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１７１】
候補調節因子で処理されていない同様のサンプルでのＰＫＡキナーゼ活性と比較して、候補調節因子で処理されたＲＣＣ３５６ポリペプチド発現細胞のサンプルにおいて活性レベルが少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、ＰＫＡ活性は「変化」している。
【０１７２】
ｇ．キナーゼアッセイ
例えば、New England Biolabs社が販売しているp38 MAP Kinaseアッセイキット(カタログ番号9820)またはPerkin-Elmer Life Sciences社が販売しているFlashPlate(商標) MAP Kinaseアッセイキットなど、市販のいくつかのキットを使用してＭＡＰキナーゼ活性のアッセイが可能である。
【０１７３】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１７４】
候補調節因子で処理されていない同様のサンプルでのＭＡＰキナーゼ活性と比較して、候補調節因子で処理されたＲＣＣ３５６ポリペプチド発現細胞のサンプルにおいて活性レベルが少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、ＭＡＰキナーゼ活性は「変化」している。
【０１７５】
既知の合成または天然のチロシンキナーゼ基質および標識リン酸を使用したチロシンキナーゼの直接アッセイは周知であり、他の種類のキナーゼ（例、Ser/Thrキナーゼ）に対する同様のアッセイも周知である。ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞の精製キナーゼおよび粗抽出物のいずれを使用してもキナーゼアッセイを実施可能である。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。基質は、完全長のタンパク質または基質を示す合成ペプチドのいずれでも可能である。Pinna & Ruzzene (1996, Biochem.Biophys.Acta 1314: 191-225、参照により本明細書に援用されている）には、キナーゼ活性の測定に有用な多数のリン酸化基質部位が掲載されている。多数のキナーゼ基質が市販されている。特に有用な基質は、「Ｓｒｃ関連ペプチド」（シグマから入手可能なＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（配列番号：１）＃Ａ７４３３）であり、これは多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である。後述のアッセイではペプチド基質のフィルターへの結合が必要であるため、ペプチド基質が正味の正電荷を有しており、結合を促進させる必要がある。通常、ペプチド基質は少なくとも２つの塩基性残基および遊離のアミノ末端を有する必要がある。反応では通常、ペプチド濃度０．７〜１．５ｍＭが利用される。
【０１７６】
通常、５μＬの５Ｘキナーゼバッファー（５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２；アッセイされる正確なキナーゼに応じて、ＭｇＣｌ２の代わりに、もしくは追加でＭｎＣｌ２を使用可能である）、５μＬの１．０ｍＭ ＡＴＰ（最終濃度０．２ｍＭ）、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（１００〜５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、３μＬの１０ｍＭペプチド基質（最終濃度１．２ｍＭ）、被験キナーゼを含む細胞抽出物（キナーゼアッセイに使用する細胞抽出物はホスファターゼ阻害剤（例、０．１〜１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）を含む必要がある）、Ｈ２Ｏ（２５μＬにする）を含む２５μＬ量でアッセイを実施する。反応は３０℃で実施して、細胞抽出物の添加によって開始させる。
【０１７７】
キナーゼ反応を３０秒間から約３０分間実施後、氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）４５μＬを添加する。サンプルを２分間微量遠心機にかけて、３５μＬの上精をＷｈａｔｍａｎ Ｐ８１セルロースリン酸フィルターサークル上にスポットする。フィルターを０．５％冷リン酸５００ｍＬで３回洗った後、室温のアセトン２００ｍＬで５分間１回洗う。フィルターを乾燥させて、取り込まれた３２Ｐをシンチレーション計数によって測定する。キナーゼ反応中のＡＴＰの比放射能（例、cpm/pmol）は、 少量の反応サンプル（２〜５μＬ）をＰ８１フィルターサークル上にスポットして、洗わずに直接計数して測定する。次に、キナーゼ反応（ブランクマイナス）において得られたｃｐｍを比放射能で割って、反応中に転移したリン酸のモル数を決定する。
【０１７８】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１７９】
候補調節因子で処理されていない同様のサンプルでのチロシンキナーゼ活性と比較して、候補調節因子で処理されたＲＣＣ３５６ポリペプチド発現細胞のサンプルにおいて活性レベルが少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、チロシンキナーゼ活性は「変化」している。
【０１８０】
ｈ．下流経路の活性化に関する転写リポーター：
受容体に対するアゴニスト（例、ＲＣＣ３５６）の結合によって開始される細胞内シグナルが細胞内事象のカスケードで機能しており、この最終的な結末は1つ以上の遺伝子における転写および／または翻訳の急速かつ検出可能な変化である。したがって、受容体の活性は、ＲＣＣ３５６活性化に応答する制御配列によって促進されるレポーター遺伝子の発現の測定によってモニター可能である。
【０１８１】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、基本プロモーターだけでなく、受容体によって制御される発現に必要な任意のエンハンサーまたは転写因子結合部位も含めた、受容体を介した遺伝子発現の制御に必要な転写調節エレメントに関する。アゴニストの結合に起因する細胞内シグナルに応答性のプロモーターの選択、および転写、翻訳、または最終的な活性が容易に検出かつ測定可能なレポーター遺伝子への選択されたプロモーターの機能的な連結によって、転写レポーターアッセイにおいて特定の受容体が活性化されたか否かが迅速に示される。
【０１８２】
ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子が該技術分野において周知であり、これらの産物の検出アッセイも周知である。
【０１８３】
受容体活性のモニタリングに特に適した遺伝子は「前初期」遺伝子であり、これらは通常、受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの接触後数分以内に迅速に誘導される。前初期遺伝子の転写誘導には、調節タンパク質の新たな合成は必要とされない。リガンド結合への迅速な反応性に加えて、レポーターコンストラクトの作成に有用な好ましい遺伝子の特性として、静止細胞内での低い、または検出不可能な発現、一過性であり、新たなタンパク質合成に依存しない誘導、その後の転写の停止における新たなタンパク質合成の必要性、これらの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの短い半減期が挙げられる。有用であるために、転写調節エレメントがこれらの特性の全てを有することが好ましいが、必要ではない。
【０１８４】
様々な刺激に応答性の遺伝子の一例は、ｃ−ｆｏｓ癌原遺伝子である。ｃ−ｆｏｓ遺伝子は、増殖因子、ホルモン、分化特異的な薬剤、ストレス、他の既知の細胞表面タンパク質の誘導因子により、タンパク質合成非依存的に活性化される。ｃ−ｆｏｓの発現誘導は極めて迅速であり、受容体刺激から数分以内に生じることが多い。この特性のため、受容体活性化のレポーターとしての使用においてｃ−ｆｏｓ調節領域は特に魅力的となっている。
【０１８５】
ｃ−ｆｏｓ調節エレメントとして以下が挙げられる(Verma ら, 1987, Cell 51: 513-514参照)：ＴＡＴＡボックスは転写開始に必要である；基本転写のための２つの上流エレメント、エンハンサーは、二分子対称のエレメントを含み、かつホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート(TPA)、血清、上皮細胞増殖因子(EGF)、ＰＭＡによる誘導に必要とされる。
【０１８６】
ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡキャップ部位の上流−３１７〜−２９８ ｂｐに位置する２０ bpのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサーエレメントは、血清飢餓ＮＩＨ３Ｔ３細胞における血清誘導に必須である。２つの上流エレメントの１つは−６３〜−５７に位置しており、ｃＡＭＰ調節のコンセンサス配列と類似している。
【０１８７】
転写調節因子ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合蛋白）は、名前が示すように、細胞内ｃＡＭＰ濃度に応答する。したがって、ｃＡＭＰ濃度の調節を介してシグナル伝達を行う受容体の活性化は、転写因子の結合、もしくはＣＲＥＢ結合エレメント（ＣＲＥまたはｃＡＭＰ応答エレメントと呼ぶ）と連結されたレポーター遺伝子の発現のいずれかの測定によってモニター可能である。ＣＲＥのＤＮＡ配列はＴＧＡＣＧＴＣＡである。ＣＲＥＢ結合活性に応答性のレポーターコンストラクトは、米国特許第５，９１９，６４９号に記載されている。
【０１８８】
ｃ−ｆｏｓエレメントおよびＣＲＥＢ応答コンストラクトに加えて、他のプロモーターおよび転写調節エレメントとして、血管活性腸管ペプチド(VIP)遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性; Fink ら, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci.85:6662-6666）、ソマトスタチン遺伝子プロモーター(cAMP応答性; Montminy ら, 1986, Proc.Natl.Acad.Sci.8.3:6682-6686)、プロエンケファリンプロモーター（ｃＡＭＰ、ニコチンアゴニスト、ホルボールエステル応答性； Comb ら, 1986, Nature 323:353-356）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性; Short ら, 1986, J. Biol.Chem.261: 9721-9726）が挙げられる。
【０１８９】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答する転写調節エレメントと別の例として、ＡＰ−１転写因子応答性エレメントおよびＮＦ−κＢ活性応答性エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。コンセンサスＡＰ−１結合部位は回文配列ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡである(Lee ら, 1987, Nature 325: 368-372; Lee ら, 1987, Cell 49: 741-752)。ＡＰ−１部位は、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート(TPA)などの腫瘍プロモーターによる誘導媒介にも関与しており、このためＴＲＥ（ＴＰＡ応答性エレメント）と呼ばれこともある。ＡＰ−１は、増殖刺激に対する細胞の初期応答に関与する多数の遺伝子を活性化させる。ＡＰ−１応答遺伝子の例として、ＦｏｓおよびＪｕｎ（これら自体がＡＰ−１活性を形成するタンパク質である）、Ｆｏｓ関連抗原(Fra)１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、アネキシンＩおよびＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
ＮＦ−κＢ結合エレメントはコンセンサス配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号：３）を有する。ＮＦ−κＢ応答性として多数の遺伝子が同定されており、これらの調節エレメントをレポーター遺伝子に連結させてＧＰＣＲ活性をモニター可能である。ＮＦ−κＢ応答性遺伝子の小サンプルとして、ＩＬ−１β(Hiscott ら, 1993, MoI.Cell.Biol.13: 6231-6240)、 ＴＮＦ−α(Shakhov ら, 1990, J. Exp.Med.171 : 35-47)、ＣＣＲ５(Liu ら, 1998, AIDS Res.Hum.Retroviruses 14: 1509-1519)、Ｐ−セレクチン(Pan & McEver, 1995, J. Biol.Chem.270: 23077-23083)、Ｆａｓリガンド(Matsui ら, 1998, J. Immunol.161 : 3469-3473)、ＧＭ−ＣＳＦ(Schreck & Baeuerle, 1990, Mol.Cell.Biol.10: 1281-1286)、ＩκＢα(Haskill ら, 1991, Cell 65: 1281-1289)をコードする遺伝子が挙げられる。これらの各文献は参照により本明細書に援用されている。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをコードするベクターは、該技術分野において周知であるか、もしくは、例えば合成ＮＦ−κＢエレメントおよび最小プロモーターを使用して、またはＮＦ−κＢによる調節を受けることが判明している遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を使用して、当業者が容易に作成できる。さらに、ＮＦ−κＢ応答性レポーターは、例えばCLONTECH社などから販売されている。
【０１９１】
任意のプロモーターコンストラクトについては、該コンストラクトを移入したＲＣＣ３５６発現細胞をイソ吉草酸に暴露させて試験する必要がある。イソ吉草酸に反応したレポーター発現の少なくとも２倍の増加は、該レポーターがＲＣＣ３５６活性の指標であることを示している。
【０１９２】
イソ吉草酸応答性転写レポーターコンストラクトを用いてＲＣＣ３５６活性をアッセイするために、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを安定発現する細胞にレポーターコンストラクトを安定的にトランスフェクションする。アゴニストをスクリーニングするために、未処理細胞を候補調節因子に暴露させるか、もしくはイソ吉草酸に暴露させて、レポーターの発現を測定する。イソ吉草酸で処理した培養物は、既知のアゴニストで誘導される転写レベルの標準として役立つ。調節因子の非存在下におけるレポーターの発現と比較した、候補調節因子の存在下におけるレポーターの発現の少なくとも１０％の増大は、候補がＲＣＣ３５６活性の調節因子であることを示唆する。アゴニストは、イソ吉草酸と少なくとも同量、好ましくは同量以上のレポーター発現を誘導する。部分的アゴニストは、イソ吉草酸と比較して、受容体の活性化は低い可能性がある。このアプローチは、イソ吉草酸または他のアゴニストの非存在下においてレポーターの基礎活性が上昇するようなレベルのＲＣＣ３５６ポリペプチドを細胞が発現する場合、インバースアゴニストのスクリーニングにも利用可能である。候補調節因子の非存在下と比較して、候補調節因子の存在下における１０％以上のレポーター活性の低下は、該化合物がインバースアゴニストであることを示唆している。
【０１９３】
アンタゴニストをスクリーニングするために、ＲＣＣ３５６を発現しており、レポーターコンストラクトを有する細胞を候補調節因子の存在下および非存在下においてイソ吉草酸（または他のアゴニスト）に暴露させる。候補調節因子の非存在下と比較した、候補調節因子の存在下におけるレポーター発現の１０％以上の低下は、該候補がＲＣＣ３５６活性のアンタゴニストであることを示唆している。
【０１９４】
転写アッセイにおける対照として、プロモーターを持たないレポーターコンストラクトの他、ＲＣＣ３５６を発現していないが、レポーターコンストラクトを有する細胞が挙げられる。ＲＣＣ３５６によって制御される転写の調節因子として同定される化合物についても、それらの活性の特異性およびスペクトルを決定するために分析して、それらが他の制御配列および他の受容体によって促進される転写に影響を及ぼすか否かを判断する必要がある。
【０１９５】
転写性リポーターアッセイおよび大半の細胞アッセイは、ＲＣＣ３５６活性を調節する化合物の化学ライブラリーのスクリーニングに適している。ライブラリーは、例えば、天然材料由来のライブラリー（例、植物、動物、細菌など）であるか、もしくは無作為または系統的にイソ吉草酸等価体を含むライブラリーでありうる。
【０１９６】
ｉ．受容体内在化
カルシウム流束、膜分極、メラノフォアアッセイ、ＧＴＰ結合、ＧＴＰａｓｅ、アデニル酸シクラーゼ、ｃＡＭＰ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、ＰＫＣ、ＰＫＡ、キナーゼ、受容体内在化、転写レポーターアッセイなど、受容体活性のアッセイを利用して、サンプル（例、ＲＣＣ３５６受容体分子の活性に影響を及ぼす組織サンプル）中の薬剤の存在を判定できる。この目的のために、サンプルまたはサンプルの抽出物の存在下および非存在下におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性をアッセイする。 サンプルの非存在下と比較した、サンプルの存在下におけるＲＣＣ３５６活性の上昇は、サンプルが受容体活性のアゴニストを含むことを示している。イソ吉草酸のみの存在下における受容体活性と比較して、イソ吉草酸または他のアゴニストとサンプルの存在下における受容体活性の低下は、サンプルがＲＣＣ３５６活性のアンタゴニストを含むことを示している。必要に応じて、次にサンプルを画分して、さらに試験してアゴニストまたはアンタゴニストを分離または精製できる。サンプルが調節因子を含んでいると言えるために必要な活性の測定値における上昇または低下は、利用したアッセイの種類に左右される。通常、サンプルの非存在下において実施したアッセイと比較した、１０％以上の変化（上昇または低下）は、サンプル中の調節因子の存在を示唆する。１つの例外は転写レポーターアッセイであり、このアッセイにおいてサンプルが調節因子を含んでいると言えるには少なくともシグナルの２倍の上昇または１０％の低下が必要である。アゴニストが少なくとも５０％、好ましくは７５％または１００％以上（イソ吉草酸の２倍、５倍、１０倍以上）に刺激することが好ましい。
【０１９７】
他の機能アッセイとして、例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）またはバイオセンサーアッセイが含まれる（Hafner,2000, Biosens.Bioelectron.15:149-158;参照により本明細書に援用されている）。
【０１９８】
ＩＩ．ＲＣＣ３５６とイソ吉草酸の相互作用に基づいた診断アッセイ：
イソ吉草酸は不快な臭いを有する有機酸であり、ヒトや動物の分泌物、特に汗の悪臭形成の一部である。前記酸および他のにおいは、ＲＣＣ３５６受容体を調節することが見出されており、本発明では、恐らくＲＣＣ３５６が嗅覚機能を有することを示唆している。本発明では、このように、特にイソ吉草酸およびその同等な酸を介したにおい認識が、ＲＣＣ３５６の調節を通じて調節されうることを示唆している。このように、イソ吉草酸などのＲＣＣ３５６を認識するリガンドの使用は、少なくともイソ吉草酸と関連するにおい知覚に影響を及ぼしうる。前記知見に基づいて、診断アッセイを設定して、におい認識の喪失を招く、異常機能しているＲＣＣ３５６受容体が被験者において存在するか否かを判定できる。
【０１９９】
ＧＰＣＲを通じたシグナル伝達は、多数の疾患および障害の病理に役立つ。ＲＣＣ３５６は前立腺などの多くの組織で発現しており、該組織における癌の進行の指標として作用することが示されている（米国特許第６，７９０，６３１号）。前記癌は、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌でありうる。したがって、嗅覚におけるその役割の他、 ＲＣＣ３５６は癌の進行において役割を果たす可能性が高い。前記癌の進行および／または治療は、本発明の方法を利用して研究されうる。例えば、本発明に記載のアッセイは、イソ吉草酸、イソ吉草酸等価体、イソ吉草酸‐抗体を使用して組み立てられる。
【０２００】
ＲＣＣ３５６が脳内で発現しているとの証拠がある(BBRC 2003, Vanti ら.305:67-71)。しかし、ＣＮＳ障害または疾患におけるその役割は依然として明らかになっていない。また、イソ吉草酸がてんかんに関与しうることが過去に示唆されている(Epilepsia,2004 45:1338-43)。実際に、バレリアン抽出物、特に粉末バレリアン根は抗けいれん薬として周知である。さらに、イソ吉草酸がそのような粉末の成分であることが示されている。このように、イソ吉草酸が抗けいれん作用を有することが推測される。イソ吉草酸がＲＣＣ３５６の天然リガンドであるとの本発明における知見に基づいて、本発明では、ＲＣＣ３５６がＣＮＳ障害、特にてんかんの治療の標的と見なされうることが示唆されている。一方で、前記受容体が、片頭痛、嘔吐、精神および神経障害（不安、統合失調症、躁うつ病、うつ病、せん妄、認知症、重度の知能低下症など）、神経変性疾患（アルツハイマー病またはパーキンソン病など）、運動異常症候群（ハンチントン病またはジルドラトゥレット症候群など）、他の関連疾患にも関与しうることを、本発明は除外していない。ＲＣＣ３５６のリガンドとしてのイソ吉草酸の提供は、該役割の解明に有用となりうる。また、本発明は、ＣＮＳ関連の疾患、特にてんかんを診断するために、ＲＣＣ３５６を定量する、またはＲＣＣ３５６を研究するための試薬を含むキットの使用法と関連している。
【０２０１】
ＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達が関与する疾患、障害、過程の診断またはモニタリングのアッセイの基礎として利用可能である。ＲＣＣ３５６関連の疾患または障害の診断アッセイにはいくつかの異なる型がありうる。
【０２０２】
第一に、診断アッセイによって組織サンプル中のイソ吉草酸の定量が可能となる。第二に、アッセイによって、組織サンプル中でのイソ吉草酸のＲＣＣ３５６への結合における差が評価可能となる。第三に、イソ吉草酸またはイソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体を認識する特異的抗体を使用して、サンプル中のイソ吉草酸の存在を測定（定量的または定性的）できる。この抗体の使用は、ＲＣＣ３５６を特異的に認識する抗体と併用されうる。該方法を利用して、ＣＮＳ障害または疾患および癌の進行を診断して、そしてそれらを治療できる。
【０２０３】
また、本発明では、ＲＣＣ３５６がにおい感知およびＣＮＳ障害において役割を果たしうることが初めて示唆されている。嗅覚異常またはＣＮＳ障害を診断またはモニターするためのアッセイにはいくつかの種類がありうる。
【０２０４】
第一に、ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸または関連する酸、イソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体に対する抗体を結合アッセイにおいて使用し、組織中でのＲＣＣ３５６ポリペプチド含量を測定する。第二に、ＲＣＣ３５６ ｍＲＮＡレベルが測定され、ＲＣＣ３５６遺伝子の発現レベルが示される。最後に、ｍＲＮＡまたはＲＣＣ３５６をコードするゲノムＤＮＡを増幅させて、野生型ＲＣＣ３５６メッセンジャーまたは遺伝子と比較した、配列の変化が確認されうる。 変化の存在は、嗅覚異常またはＣＮＳ障害の存在または素因を示唆しうる。
【０２０５】
本発明によると、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、図１ｂに示されるポリペプチドと少なくとも２０％の同一性、もしくは２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、１００％などより高い同一性を有するポリペプチドでありうる。または、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、前記配列の完全長ポリペプチドの断片であり、該断片が少なくとも５０％の結合活性、およびイソ吉草酸が誘発するシグナル伝達活性のレベルを保持しうる。本発明によると、イソ吉草酸に対する同様の結合特性を有する限り、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、野生型の配列と比較して、１つ以上の付加、挿入、欠失、置換を含みうる。該ＲＣＣ３５６ポリペプチドは切断ＲＣＣ３５６ポリペプチドでありうる。前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、ＲＣＣ３５６融合タンパク質を形成する追加配列を含み、前記追加配列は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ヒスチジンタグ（例、6XHis以上）、またはアフィニティタグ（例、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群から選択されうる。
【０２０６】
Ａ．有機低分子の定量アッセイ
前記酸の定量に使用可能な方法は、ａ）抽出および精製：溶媒抽出、油抽出、蒸気抽出、ＣＯ２超臨界抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留、ガスクロマトグラフィー、ｂ）定量：ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析でありうるが、これらに限定されない。当業者であれば、該方法の実施方法を知っている。
【０２０７】
Ｂ．ＲＣＣ３５６の量または変化の測定アッセイ
サンプル中での異常レベルの前記受容体の存在を判定するために、ＲＣＣ３５６レベルを測定して、標準と比較できる（標準組織以上または以下は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を示す）。例えば、ポリペプチド特異的な抗体を使用した免疫組織化学によって、ポリペプチドレベルを測定する。ＲＣＣ３５６活性を特徴とする疾患または障害の罹患が疑われる個人から分離されたサンプルをＲＣＣ３５６に対する抗体と接触させて、該技術分野において周知の通りに（例、二次抗体に結合させた酵素の活性測定）抗体の結合を測定する。
【０２０８】
ＲＣＣ３５６ポリペプチドレベル測定の別のアプローチでは、罹患組織からの細胞のフローサイトメトリー分析が利用される。フローサイトメトリーの方法として、該技術分野において周知のＲＣＣ３５６特異的な抗体の蛍光標識が挙げられる。他のアプローチとして、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡが挙げられる。これらのそれぞれのための方法は、該技術分野において周知である。
【０２０９】
検出された結合量と、健常人、もしくは罹患者の罹患していない部位からの同様の組織のサンプルにおける結合とを比較する。標準比較した１０％以上の増加は、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断となる。
【０２１０】
ＲＣＣ３５６発現は、組織サンプル中で該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量の測定によっても測定可能である。ｍＲＮＡは、定量的または半定量的ＰＣＲによって定量可能である。「定量的」増幅の方法は、該技術分野において周知であり、ＲＣＣ３５６増幅用プライマーの配列が本明細書において開示されている（米国特許第６，７９０，６３１号）。 定量的ＰＣＲに共通の方法としては、同じプライマーを使用して既知量の対照配列を同時に増幅させることが挙げられる。これによってＰＣＲ反応の較正に利用可能な内部標準が与えられる。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルが「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications', lnnis ら, Academic Press, Inc.N.Y.,(1990)」にあり、この文献は参照により本明細書に援用されている。健常人の組織サンプル、または罹患者の非罹患部位の組織サンプルにおける発現量と比較した、サンプル中におけるＲＣＣ３５６をコードするｍＲＮＡ量の１０％以上の増加は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断に用いられる。
【０２１１】
Ｃ．定量アッセイ
ＲＣＣ３５６ポリペプチドまたはそれをコードするｍＲＮＡが野生型であるか否か、もしくは診断に利用可能か否かを評価するアッセイ。ＲＣＣ３５６の調節異常を特徴とする嗅覚障害またはＣＮＳ障害または疾患をこの方法で診断するために、サンプルから分離されたＲＮＡをＲＣＣ３５６のＰＣＲ増幅用テンプレートとして使用する。次に標準方法を利用して増幅配列の配列を直接決定するか、もしくはまずベクターにクローニング後、配列を決定する。野生型ＲＣＣ３５６の配列と比較した、コード化されるアミノ酸を１つ以上変化させる配列上の変化は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断に利用可能である。サンプルにおいてコード配列の変化が同定される場合、その変異受容体またはリガンドを発現させて、その活性を野生型ＲＣＣ３５６の活性と比較することが有効となりうる。他の利点として、このアプローチによって、構成的に活性化しているヌル変異体などの新しい変異体がもたらされる。
【０２１２】
標準的な配列決定方法に加えて、例えば、野生型と変異型の配列を区別する分子指標のハイブリダイゼーションを利用して、特定の変異の存在について増幅配列をアッセイ可能である。わずか１個のヌクレオチドの変化に基づいて区別するハイブリダイゼーションアッセイは、該技術分野において周知である。または、例えば、米国特許第５，８８８，８１９号、第６，００４，７４４号、第６，０１３，４３１号（参照により本明細書に援用されている）に記載の多数の「ミニ配列」アッセイを実施可能である。これらのアッセイおよび該技術分野において周知の他のアッセイによって、任意のサンプル中における既知の多型を伴う核酸の有無を判定可能である。
【０２１３】
必要に応じて、アレイまたはマイクロアレイ法を利用して、ＲＣＣ３５６配列の発現または突然変異の有無を分析可能である。ミニ配列決定および核酸発現の定量のためのアレイ法は、該技術分野において周知である。
【０２１４】
Ｄ．機能アッセイ
イソ吉草酸と関連する嗅覚異常またはＣＮＳ疾患または障害の診断は、機能アッセイを利用して実施することも可能である。この目的のための、組織サンプルから調製した細胞膜または細胞抽出物が、本明細書に記載のＲＣＣ３５６活性アッセイ（例、リガンド結合アッセイ、カルシウム流束アッセイ、膜分極アッセイ、メラノフォアアッセイ、GTP結合アッセイ、ＧＴＰａｓｅアッセイ、アデニル酸シクラーゼアッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、リン脂質分解／ジアシルグリセロール／イノシトール三リン酸アッセイ、ＰＫＣまたはＰＫＡ活性化アッセイ、キナーゼアッセイ、受容体内在化アッセイ）に使用される。検出された活性を、健常人、または罹患者の非罹患部位から採取された標準サンプルの活性と比較する。代わりの方法として、サンプルまたはサンプル抽出物をＲＣＣ３５６発現細胞に適用後、標準サンプルとの比較でＲＣＣ３５６シグナル伝達活性を測定可能である。標準の活性と比較した、これらのアッセイで測定された活性における１０％以上の差は、イソ吉草酸と関連する嗅覚異常またはＣＮＳ疾患または障害の診断に用いられる。
【０２１５】
本発明の細胞内で発現されたＲＣＣ３５６活性の調節
ＲＣＣ３５６のリガンドとしてのイソ吉草酸の発見は、細胞内で発現しているＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性の調節方法をもたらす。ＲＣＣ３５６ポリペプチドの機能を調整する薬剤を細胞に送達することで、ＲＣＣ３５６活性は細胞内で調節される。該調節は、さらなる調節薬剤の同定のためのアッセイの一環として、培養細胞内、もしくは、例えば、ヒトを含む動物において実施可能である。薬剤としては、イソ吉草酸およびその等価体が挙げられる。
【０２１６】
薬剤を培養液に添加することで、細胞に送達可能である。送達量は、該薬剤の同一性および送達の目的に応じて変動する。例えば、ＲＣＣ３５６活性のアンタゴニストを同定するための培養アッセイにおいて、好ましくは受容体を最高の半分（例、ＥＣ５０程度）まで活性化させ、好ましくは受容体の飽和状態に必要な用量を超えない量のイソ吉草酸を添加する。イソ吉草酸量の滴定によって該用量を決定して、イソ吉草酸を追加してもＲＣＣ３５６活性に付加的効果を及ぼさない点を決定できる。
【０２１７】
疾患または障害の治療のために、医薬品としてＲＣＣ３５６活性の調節因子を動物に投与した場合、当業者であれば目的の転帰に応じて投与量を調節できる。治療前の測定可能な病気の測定値（例、腫瘍細胞の増殖、炎症細胞の蓄積、嗅覚、ＣＮＳ活性）と比較して、１つ以上の該値が１０％以上変化した場合、治療は成功となる。
【０２１８】
本発明の有用な候補調節因子
合成または天然化合物の大規模ライブラリーから候補調節因子をスクリーニング可能である。現在、様々な種類の化合物のランダム合成または指向性合成において多数の方法が利用されている。合成化合物ライブラリーは多数の企業から市販されている：例、Maybridge Chemical Co.（英国コーンウォール州Trevillet）、Comgenex(ニュージャージー州プリンストン)、Brandon Associates(ニューハンプシャー州メリマク)、Microsource(コネチカット州ニューミルフォード)。 希少化学ライブラリーがAldrich(ウィスコンシン州ミルウォーキー)から入手可能である。有機低分子のコンビナトリアルライブラリーを利用可能であり、また調製可能である。または、細菌、真菌、植物、動物の抽出物中の天然化合物ライブラリーが、例えばPan Laboratories(ワシントン州ボセル)やMycoSearch(ノースカロライナ州)から入手可能であるか、もしくは該技術分野において周知の方法によって容易に製造可能である。また、天然／合成のライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、生化学的方法によって容易に修飾される。
【０２１９】
本明細書において先に述べた通り、候補調節因子はイソ吉草酸の変異体または等価体でありうる。したがって、イソ吉草酸関連の化合物ライブラリーが使用されうる。本発明の結果（図３）に示されるように、イソ吉草酸（イソ構造）および吉草酸（線形構造）が同程度のＥＣ５０をもたらし、４〜９の炭素鎖が試験され、それらの全てがＲＣＣ３５６の活性化を引き起こした。したがって、本発明は、ＩＶＡの変異体（または等価体）が作成され、ＲＣＣ３５６に対するＩＶＡと同程度の活性を有する化合物が導かれることを示唆している。特に、本発明では、例えば炭素２−１２の脂肪族鎖長の操作、イソ対線形構造の操作、イソ型の各ラジカル連鎖の操作、分子のイソ／線形型の両方の官能基（カルボン酸基、アルデヒド基、アルコール基、エステル基、エーテル基…）の操作、イソおよび線形構造の両方の官能基の位置操作による変化の可能性が示唆される。
【０２２０】
本発明での有用な抗体
本発明は、ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸、イソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体に対する抗体の特定の使用法に関する。抗体は、該技術分野において既知の標準プロトコルを利用して作成可能である（Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press: 1988)参照）。マウス、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウサギなどの哺乳動物、または鶏などの鳥に免疫原性ＲＣＣ３５６ペプチド（例、RCC356ポリペプチドまたは抗体反応を引き起こすことの可能な抗原断片、本明細書における先述の融合タンパク質）、イソ吉草酸、イソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体を免疫可能である。抗体作成用の免疫原は、アジュバントと化合物（例、分離した組換えポリペプチドまたは合成ペプチド）を混合させて調製する。または、ＲＣＣ３５６ポリペプチドまたはペプチドから、融合タンパク質として、より大きな免疫原性タンパク質が作成される。ポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニンなどのより大きな他の免疫原性タンパク質と共有結合させることができる。前記ペプチドと前記酸との化学結合によってイソ吉草酸の免疫原性を高めることができる。または、ＲＣＣ３５６またはこれらのタンパク質の断片をコードするプラスミドまたはウィルスベクターを使用して、ポリペプチドを発現させて、動物において免疫反応を起こすことができる（Costagliola ら, 2000, J. Clin.Invest.105:803-811、本文献は参照により本明細書に援用されている）。抗体を作成するために、通常、免疫原をウサギ、ヒツジ、マウスなどの実験動物の皮内、皮下、筋肉内に投与する。上述の抗体に加えて、一本鎖抗体などの遺伝子組換え抗体の派生物を作成可能である。該組換え抗体はファージディスプレイライブラリーとして維持できる。ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸および／またはイソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体を認識する組換え抗体は、このようにしてＢｉａｃｏｒｅ技術などの結合アッセイを利用して該ライブラリーから分離可能である。
【０２２１】
予防接種の進行は、血漿または血清中の抗体価の検出によってモニター可能である。抗原として免疫原と一緒に、標準的ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、他のイムノアッセイを使用しても抗体レベルを評価可能である。抗体は簡単に免疫接種動物の血清から調製可能であり、もしくは必要に応じて、例えば固定免疫原を使用した親和性クロマトグラフィーによって血清からポリクローナル抗体を分離可能である。
【０２２２】
モノクローナル抗体を作成するために、抗体産生中の脾細胞を免疫接種動物から回収して、標準的な体細胞融合法によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を作成する。このような技術は該技術分野において周知であり、例えばヒトモノクローナル抗体を作成するための、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497において本来開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbar ら, (1983) Immunology Today, 4: 72）、ＥＢＶ‐ハイブリドーマ技術（Cole ら, (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp.77-96）が挙げられる。イソ吉草酸または同等の酸、ＲＣＣ３５６ペプチドまたはポリペプチド、またはイソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体と特異的に反応する抗体の産生のために、ハイブリドーマを免疫化学的にスクリーニング可能であり、該ハイブリドーマ細胞を含む培養液からモノクローナル抗体を分離する。
【０２２３】
ＲＣＣ３５６に特異的な抗体の産生については米国特許第６，７９０，６３１号に記載されている。イソ吉草酸に対する抗体は、上記の先行技術の方法の１つを利用して容易に作成可能である。
【０２２４】
本発明での有用なトランスジェニック動物
ＲＣＣ３５６またはその変異体を発現しているトランスジェニック動物は、ＲＣＣ３５６の活性を調節する薬物または薬剤の研究の他、ＲＣＣ３５６を介したシグナル伝達の研究にも有用である。トランスジェニック動物は、その遺伝物質の一部にトランス遺伝子と呼ばれる少なくとも１つの外来遺伝子を含むヒト以外の動物である。好ましくは、前記トランス遺伝子が動物の子孫に伝えられるように、それは動物の生殖細胞系列に含まれる。受精卵の前核へのトランス遺伝子のマイクロインジェクションおよびＥＳ細胞の操作など（これらに限定されない）、動物の遺伝物質へのトランス遺伝子の導入には多数の技術が利用されうる（WagnerおよびHoppeによる米国特許第４，８７３，１９１号；Palmiter and Brinster, 1986, Ann.Rev.Genet, 20:465-499; 1987年8月公開の仏国特許出願第２，５９３，８２７号、これら全ての文献は参照により本明細書に援用されている）。トランスジェニック動物は全ての細胞にトランス遺伝子を有するか、もしくは遺伝的にモザイクである。
【０２２５】
従来の遺伝子組換え方法によれば、正常遺伝子または改変遺伝子の追加コピーが受精卵の雄性前核に注入されて、受容マウスのゲノムＤＮＡ内に組み込まれる。トランス遺伝子は確立されたトランスジェニック系統においてメンデルの法則によって伝えられる。トランス遺伝子は、構成的、組織特異的、もしくはテトラサイクリンなどの外来性薬剤に応答性に発現可能である。１つのトランス遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、第二のトランス遺伝子を発現する第二のトランスジェニック動物と交配させて、子孫が両方のトランス遺伝子を持ち、また発現することができる。
【０２２６】
ノックアウト動物
ＲＣＣ３５６またはその変異体をコードする染色体配列中にホモ接合性欠失を有する動物を使用して、受容体の機能の研究が可能である。イソ吉草酸の産生および／または異化に関与する遺伝子（IVDHaseなど）のノックアウトが、特に癌またはＣＮＳ障害について異なる表現型を有するか否かが特に興味深く、これはイソ吉草酸がＲＣＣ３５６に結合する唯一のリガンドであるか否か、またはそれがファミリーの一員であるか否かを指摘しうる。特定の生理学的および／または病理学的な過程におけるＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の特定の役割を特定することはさらに興味深い。
【０２２７】
ｉ．標準的なノックアウト動物
ノックアウト動物はヒト以外の動物であり、相同的組換えによる遺伝子欠失の作成方法によって作出される。この技術は、胚由来で、培養で維持されており、宿主の胚盤胞内に導入された場合に動物の全ての組織の発生に関与する能力を有する胚性幹（ＥＳ）細胞の開発に基づいている。ノックアウト動物が、ＥＳ細胞内の特定の標的遺伝子に相同組換えを導き、該遺伝子のヌル対立遺伝子を作成することで作出される。ノックアウト動物の作成技術は詳細に説明されている（例、Huszar ら, 1997, Cell, 88:131;Ohki-Hamazaki ら, 1997, Nature, 390:165参照。これらのいずれの文献も参照により本明細書に援用されている）。当業者であれば、イソ吉草酸産生および（または）異化に関与する１つ以上の遺伝子のノックアウトを伴うホモ接合性ＲＣＣ３５６ノックアウト動物または動物遺伝子を作成可能である（例、マウス）。
【０２２８】
ｉｉ．組織特異的ノックアウト
標的相同組換え方法は、バクテリオファージＰ１部位特異的レコンビナーゼＣｒｅに基づく部位特異的組換え系の開発によって改良されている。バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼは、特定の組織または発生段階に限定した遺伝子ノックアウトを作成するために、トランスジェニックマウスアッセイにおいて使用される。全体的な遺伝子ノックアウトと対照的に、部位を限定した遺伝子欠失では、表現型が特定の細胞／組織に起因しうることを上手く利用する(Marth, 1996, Clin.Invest.97: 1999)。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムでは、ｌｏｘＰ部位が目的遺伝子の１つ以上のエキソンの両側を挟むように、１つのトランスジェニックマウス系統が改変される。このいわゆる「ｆｌｏｘｅｄ遺伝子」のホモ接合体は、細胞／組織タイプ転写プロモーターの制御下でＣｒｅ遺伝子を発現する第二のトランスジェニックマウスと交配させる。次に、Ｃｒｅタンパク質はｌｏｘＰ認識配列間のＤＮＡを切り出して、効果的に標的遺伝子の機能を取り除く(Sauer, 1998, Methods, 14:381)。例えば、乳房組織特異的遺伝子の誘導性不活性化など、現在、この方法には多くのｉｎ ｖｉｖｏでの実施例が存在する(Wagner ら, 1997, Nucleic Acids Res., 25:4323)。したがって、当業者であれば、選択された組織または細胞種において上記のＲＣＣ３５６またはイソ吉草酸と関連する遺伝子がホモ接合的に除去された組織特異的ノックアウト動物の作成が可能である。
【０２２９】
本発明での有用なキット
本発明は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断に有用なキットの他、ＲＣＣ３５６活性の調節因子のスクリーニングに有用なキットを提供する。本発明での有用なキットとして、分離ＲＣＣ３５６ポリペプチド（膜または細胞結合ＲＣＣ３５６ポリペプチド、例、ＲＣＣ３５６を発現する分離膜、細胞、またはＳＰＲチップ）および分離イソ吉草酸が挙げられる。細胞が含まれる場合、前記ＲＣＣ３５６をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に形質転換させうる。別の実施態様では、本発明のキットは、ＲＣＣ３５６ポリペプチドおよびイソ吉草酸をコードするポリヌクレオチドを含みうる。本発明の全てのキットは、定められた品目または品目の組み合わせ、およびそれらの包装材料を含む。キットは使用説明書も含みうる。
【０２３０】
本キットによると、前記イソ吉草酸は、イソ吉草酸と類似の、ＲＣＣ３５６受容体との結合能および（または）調節能を有するイソ吉草酸関連の薬剤でありうる。前記関連薬剤は、例えば、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、イソヘキサン酸、ヘプタン酸、イソヘプタン酸、オクタノン酸、イソオクタノン酸、ノナン酸、イソノナン酸、バルプロ酸、イソバレルアミド、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロベンゼン酸、ペラルゴン酸、５‐ヘキセン酸でありうる。
【０２３１】
本発明によると、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、図１ｂに示されるポリペプチドと、少なくとも２０％の同一性、または２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、１００％などより高い同一性を有するポリペプチドであり、これらはイソ吉草酸または同等の酸に特異的に結合する。または、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、図１ｂに示される完全長のポリペプチドの断片であり、前記断片が、イソ吉草酸を使用した場合の結合活性およびシグナル伝達活性の少なくとも５０％を保持する。本発明によると、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、図１ｂに示される配列と比較して、１つ以上の付加、挿入、欠失、置換を含みうる。前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは切断ＲＣＣ３５６ポリペプチドでありうる。前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドはＲＣＣ３５６融合タンパク質を形成する追加配列を含み、前記追加配列は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ヒスチジンタグ（例、6XHis以上）、または親和性タグ（例、Mycタグ、FLAGタグ）配列からなる群から選択されうる。
【実施例】
【０２３２】
実施例１：ＲＣＣ３５６における８０種のにおい物質のスクリーニング
補体不含ＦＢＳを添加したＭＥＭ中においてＨｅｋ２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％で増殖させた。スクリーニングの２日前、細胞を９６ウェルプレート上に播種した(PDLコーティング済みプレート、Becton-Dickinson)。翌日、蛍ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼをそれぞれコードする２つのプラスミドと一緒にＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションした。蛍ルシフェラーゼの転写はＣＲＥＢ応答性エレメント(CRE)を含む最小プロモーターによって促進させて、ウミシイタケルシフェラーゼは強力な構成的プロモーターであるＣＭＶプロモーターによって促進させた。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬を使用して実施した(Invitrogen)。トランスフェクションした細胞を標準的な培養条件下でさらに２４時間静置して、機能アッセイのために処理した。
【０２３３】
におい物質を１Ｍ ＤＭＳＯ溶液として溶解させた。次にそれらを２００μＭのＨＢＳＳ(Cambrex)溶液として９６ウェルプレートに播種した。したがって、ＤＭＳＯは１％（ｖ／ｖ）以下のにおい物質溶液を示す。ホルスコリンなどの陽性対照がにおい物質プレートに含まれた。ホルスコリンはｃＡＭＰ産生を活性化させて、次にＣＲＥＢ転写因子への結合を介して、システムのレポーター遺伝子である蛍ルシフェラーゼの産生を引き起こす。したがって、各ウェルで検出されたルシフェラーゼ活性は、ホルスコリン応答の百分率で表され、ルシフェラーゼ活性に関する標準化が可能となる。
【０２３４】
使用説明書(Promega)に従い、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを使用して機能アッセイを実施した。
【０２３５】
図２には、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを過剰発現するＨｅｋ２９３での８０種のにおい物質に関する２回の独立したスクリーニングで得られた結果を示している。イソ吉草酸、吉草酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、 カプリン酸、ペラルゴン酸など、多くのにおい物質がＲＣＣ３５６を活性化すると思われる。これらの潜在的なヒットのうち、イソ吉草酸と吉草酸のみがいずれのスクリーニングでも認められた。
【０２３６】
実施例２：ＲＣＣ３５６ポリペプチドを過剰発現するＨｅｋ２９３細胞に対する７種のにおい物質に関する濃度反応分析
ＲＣＣ３５６を過剰発現するＨｅｋ２９３細胞に対する８０種のにおい物質のスクリーニング中に見出されるヒットをさらに検証するために、濃度反応分析を実施している。補体不含ＦＢＳを添加したＭＥＭ中においてＨｅｋ２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％で増殖させた。スクリーニングの２日前、細胞を９６ウェルプレート上に播種した（PDLコーティング済みプレート、Becton-Dickinson）。翌日、蛍ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼをそれぞれコードする２つのプラスミドと一緒にＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションした。蛍ルシフェラーゼの転写はＣＲＥＢ応答性エレメント(CRE)を含む最小プロモーターによって促進させて、ウミシイタケルシフェラーゼは強力な構成的プロモーターであるCMVプロモーターによって促進させた。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬を使用して実施した(Invitrogen)。トランスフェクションした細胞を標準的な培養条件下でさらに２４時間静置して、機能アッセイのために処理した。
【０２３７】
まず、におい物質（イソ吉草酸、吉草酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、カプリン酸、ペラルゴン酸）を１Ｍ ＤＭＳＯ溶液として溶解した。次にそれらを０．１μＭ−１ｍＭの様々な濃度のＨＢＳＳ(Cambrex)溶液として９６ウェルプレートに播種した。したがって、ＤＭＳＯは１％（ｖ／ｖ）以下のにおい物質溶液を示す。ホルスコリンなどの陽性対照がにおい物質プレートに含まれた。ホルスコリンはｃＡＭＰ産生を活性化させて、次にＣＲＥＢ転写因子への結合を介して、システムのレポーター遺伝子である蛍ルシフェラーゼの産生を引き起こす。したがって、各ウェルで検出されたルシフェラーゼ活性は、ホルスコリン応答の百分率で表され、ルシフェラーゼ活性に関する標準化が可能となる。
【０２３８】
使用説明書(Promega)に従い、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを使用して機能アッセイを実施した。
【０２３９】
図３Ａは、ＲＣＣ３５６活性化に対する同定された様々なリガンドの効率を示している。図３Ｂ−Ｄは、ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３細胞に対する、クエン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリン酸、ペラルゴン酸、ヘキサヒドロ安息香酸、５−ヘキセン酸を用いて実施された濃度反応分析の結果を示している。試験された各ヒットが、ＲＣＣ３５６のリガンドであることを確認している。試験されたにおい物質において、イソ吉草酸が最も効率的なＲＣＣ３５６ポリペプチドのリガンドである。イソ吉草酸は、ＥＣ５０ ２５μＭでＲＣＣ３５６の活性化を引き起こす。吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリン酸、ペラルゴン酸、ヘキサヒドロ安息香酸、５−ヘキセン酸もそれぞれ９７μＭ、９１μＭ、２６０μＭ、３２９μＭ、６４３μＭ、１０４μＭ、ＥＣ５０ ４８５μＭでＲＣＣ３５６の活性化を導く。
【０２４０】
実施例３：ＲＣＣ３５６ポリペプチドを過剰発現するＨｅｋ２９３細胞について実施した単一細胞カルシウムイメージングアッセイ
単一細胞カルシウムイメージングアッセイでは、実験の４８時間前に９６ウェルプレートに細胞を播種して、カルシウムイメージングアッセイの２０時間前、使用説明書に従って、Lipofectamine(Invitrogen Inc.)を使用して嗅覚受容体のｃＤＮＡをトランスフェクションさせた。４μｇ／ｍＬ Ｆｌｕｏ４−ＡＭ (Molecular Probe)を含む生理食塩水バッファー中での３７℃、１時間の培養後、細胞をＦｌｕｏ４−ＡＭ不含生理食塩水バッファーで洗い流した。各ウェルに生理食塩水バッファー５０μＬを添加した。蛍光検出器を備えたZeiss Axiovert 200 Mot顕微鏡により、倍率２０倍でカルシウム動員を記録した。６０秒間１秒毎に同じ視野の画像を１枚撮影した。記録開始から１０秒後、生理食塩水バッファーに溶解した２倍濃度のリガンド５０μＬを注入した。試験されたリガンドは、イソ吉草酸（図４）、酪酸（図５）、ペラルゴン酸（図６）であった。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１：ＲＣＣ３５６の配列。ＲＣＣ３５６の全長のコード領域のｃＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。前記配列は、米国特許第６，７９０，６３１号において過去に開示されている。
【図２】図２：Ｈｅｋ２９３Ｔ内で過剰発現させたＲＣＣ３５６上で試験された８０のリガンドでのスクリーニング結果。結果はホルスコリンの活性化の百分率で表されている。
【図３−１】図３：ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３Ｔを受容体の様々なアゴニストで処理した後に得られた濃度反応曲線。
【図３−２】図３：ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３Ｔを受容体の様々なアゴニストで処理した後に得られた濃度反応曲線。
【図３−３】図３：ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３Ｔを受容体の様々なアゴニストで処理した後に得られた濃度反応曲線。
【図３−４】図３：ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３Ｔを受容体の様々なアゴニストで処理した後に得られた濃度反応曲線。
【図４】図４Ａ：ｆｌｕｏ４−ＡＭ、カルシウムトレーサーを添加したＲＣＣ３５６発現細胞に対して２５０μＭのイソ吉草酸を注入した際に誘発された蛍光変化の記録。細胞を倍率２０Ｘで観察した。時間スケールは秒で表している。記録開始後１０秒目にイソ吉草酸を注入した。Ｂ：蛍光測定 グラフ上の各トレースは、観察視野の１個の細胞において測定された蛍光強度を示している。１０秒目に引かれた縦棒は注入時間を示している。
【図５】図５Ａ：ｆｌｕｏ４−ＡＭ、カルシウムトレーサーを添加したＲＣＣ３５６発現細胞に対して２５０μＭの酪酸を注入した際に誘発された蛍光変化の記録。細胞を倍率２０Ｘで観察した。時間スケールは秒で表している。記録開始後１０秒目に酪酸を注入した。Ｂ：蛍光測定 グラフ上の各トレースは、観察視野の１個の細胞において測定された蛍光強度を示している。１０秒目に引かれた縦棒は注入時間を示している。
【図６】図６Ａ：ｆｌｕｏ４−ＡＭ、カルシウムトレーサーを添加したＲＣＣ３５６発現細胞に対して５００μＭのペラルゴン酸を注入した際に誘発された蛍光変化の記録。細胞を倍率２０Ｘで観察した。時間スケールは秒で表している。記録開始後１０秒目にペラルゴン酸を注入した。Ｂ：蛍光測定 グラフ上の各トレースは、観察視野の１個の細胞において測定された蛍光強度を示している。１０秒目に引かれた縦棒は注入時間を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＲＣＣ３５６の天然リガンドの同定およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内でのシグナル伝達に関与するタンパク質である。ＧＰＣＲは通常７つの膜貫通ドメインを有する。ＧＰＣＲの細胞外部分または断片へのリガンドの結合時、細胞の生物学的特性または生理学的特性もしくは挙動を変化させるシグナルを細胞内に伝達する。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によって調節される細胞内酵素およびチャンネル）と並んで、細胞内セカンドメッセンジャーの状態と細胞外入力とを結びつけるモジュラーシグナル伝達系の構成要素である。
【０００３】
ＧＰＣＲ遺伝子および遺伝子産物は、様々な生理的過程を調節可能であり、病原因子となりうる。ＧＰＣＲは、中枢神経系および末梢の生理的過程のいずれに対しても極めて重要と考えられる。
【０００４】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは５つのファミリーに代表される：ファミリーＩ ロドプシンおよびβ２‐アドレナリン受容体が典型例である受容体であり、現在２００以上の固有の一員によって代表される。ファミリーＩＩ 副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー。ファミリーＩＩＩ 代謝型グルタミン酸受容体ファミリー。ファミリーＩＶ 走化性およびＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの発生に重要なＣＡＭＰ受容体ファミリー。ファミリーＶ ＳＴＥ２などの真菌性接合フェロモン受容体。
【０００５】
Ｇタンパク質は、α、β、γサブユニットを含むヘテロ三量体タンパク質ファミリーであり、グアニンヌクレオチドと結合する。これらのタンパク質は通常、シグナル伝達のために細胞表面の受容体（７つの膜貫通ドメインを含む受容体）と結合している。実際に、リガンドがＧＰＣＲに結合後、構造変化がＧタンパク質に伝えられて、これはαサブユニットの結合ＧＤＰ分子とＧＴＰ分子を交換して、βγサブユニットから解離させる。
【０００６】
α、β、γサブユニットのＧＴＰ結合型は通常エフェクター調節成分として機能しており、ｃＡＭＰ（例、アデニルシクラーゼの活性化による）、ジアシルグリセロール、イノシトールリン酸などのセカンドメッセンジャーの産生をもたらす。
【０００７】
ヒトにおいて２０種類以上の様々なαサブユニットが知られている。これらのサブユニットは、β、γサブユニットの小プールに結合する。哺乳動物のＧタンパク質の例として、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇ−ｏｌｆ、Ｇｔが挙げられる。Ｇタンパク質については、Lodish ら, Molecular Cell Biology(Scientific American Books Inc., New York, N. Y., 1995; Downes and Gautam, 1999, The G-Protein Subunit Gene Families. Genomics 62:544-552)において広範に記述されており、すべての内容は参照により本明細書に援用したものとする。
【０００８】
既知の特徴づけされてないＧＰＣＲは、現在、薬物の作用および開発の主な標的となっている。一部のＧＰＣＲについては、考えられる生理学的役割が割り当てられてきたが、前記受容体を調節可能なリガンドは未同定である。潜在的な予防ならびに治療的特性を有する新規アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングに利用可能な新しいＧタンパク質共役受容体の同定の取り組みが続いている。
【０００９】
今日まで３００以上のＧＰＣＲがクローニングされている。機構的に、臨床的に関連する全ての薬剤の約５０−６０％が、様々なＧＰＣＲの機能を調節することで作用する(Cudemann ら, J. Mol. Med., 73:51-63)。
【００１０】
嗅覚は無脊椎動物から哺乳動物までの生命体と環境との化学的コミュニケーションを可能にしている。嗅覚を通じて数千のにおい物質が知覚、識別される。このような化学的シグナル伝達は、例えば、家族や仲間の識別、食物の位置決め、もしくは縄張りの認識をにおい化合物に依存する大半の動物種の社会的行動を調節しうる。嗅覚能力は、最初に嗅上皮のニューロン、嗅覚の感覚ニューロン（ＯＳＮ）によって決定される。そこで、におい分子は嗅覚受容体タンパク質（ＯＲ）（別名、におい受容体）に結合する。これらのＯＲは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの一員である。これらは最大の遺伝子ファミリーによってコード化される。げっ歯類において１３００もの様々なＯＲ遺伝子が同定されており、約８００のＯＲ遺伝子がヒトゲノム中において同定されている。各嗅覚ニューロンが１種類のみのＯＲを発現して、嗅覚ニューロンによるにおいの識別の細胞学的基礎を成すと考えられる。それらは小胞体内で合成されて、輸送され、最終的には樹状突起先端の繊毛の細胞表面膜に集結する。同様に、ＯＲはＯＳＮの軸索末端において認められる。それらはＯＲ特異的な嗅球部位を軸索が目指す際に役割を果たすと推測される。
【００１１】
大半の哺乳動物が第二の嗅覚システムである鋤鼻システムを有する。鋤鼻器官は鼻腔内に局在しており、部分的に鋤鼻感覚ニューロンからできている。このシステムは、フェロモン受容体の活性化を通じたフェロモンの検出に関与しうる。しかし、フェロモンが鋤鼻感覚ニューロンを通じてのみ検出され、鋤鼻感覚ニューロンがフェロモンのみを検出することを確認した証拠はない。フェロモン受容体は７ＴＭ タンパク質でもあるが、しかしそれらはＯＲスーパーファミリーとは全く異なる。フェロモン受容体はＧＰＣＲスーパーファミリーの一員であるが、これらの受容体と共役したＧタンパク質は依然として同定されていない。今日までにフェロモン受容体の２つのファミリー（Ｖ１Ｒ、Ｖ２Ｒファミリー）が記述されている。いずれのファミリーの受容体もマウスにおいては同定されているが（３００以上）、ヒトではＶ１Ｒファミリーのわずか５つの受容体のみである。
【００１２】
味覚は化学感覚の一部でもある。それはヒトの舌と口蓋上に局在する味覚受容体の活性化に依存する。それらは味蕾の味覚受容体細胞（ＴＣＲ）部分で発現する。これらの細胞はニューロンと接触する特別な上皮細胞であり、これらは次に脳に情報を伝える。従って、ＯＳＮとは異なり、ＴＣＲは神経細胞ではない。嗅覚受容体と同様に、味覚受容体はＧＰＣＲスーパーファミリーの一員である。今日、２つのファミリー（Ｔ１Ｒ、Ｔ２Ｒファミリー）が同定されている。ヒトのＴ１Ｒファミリーは３つの受容体（Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３）を含むが、Ｔ２Ｒファミリーはヒトにおいて２５の推定受容体を含む。Ｔ２Ｒ受容体は苦味の検出に関与しており、単量体で機能しうる。一方、Ｔ１Ｒ受容体は二量体で機能すると考えられている。二量体化によって受容体に特異性がもたらされうる。Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ のヘテロ二量体は「うまみ」味覚を検出し、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロ二量体は甘味化合物によって活性化される。これら２つのファミリーに加えて、他のタンパク質は、潜在的なチャンネルであるＴＲＭＰ５、うまみ受容体として機能しうるｍＧｌｕＲ４、酸味受容体であるＡＳＩＣ２、塩味受容体であるＥＮａＣ、辛味受容体であるＶＮ１、または冷たい味覚の受容体であるＴＭＰ８などの味覚受容体と考えられる。
【００１３】
嗅覚、味覚、フェロモンは、常に動物と人間の個別行動に影響を及ぼす。このため、前記認識のメカニズムを理解することは非常に重要である。特に、認識に影響を及ぼす方法の決定が重要となる。嗅覚、味覚、フェロモンシステムが、１リガンド／１受容体の法則に従わないことが既に知られている。数種のリガンドによって同じ受容体が活性化されることが文献において記述されている。したがって、前記感覚システムは、恐らく、異なる受容体が同じリガンドによって活性化される可能性があり、また１つの受容体が異なるリガンドによって調節される可能性のある、システムの一部である。
【００１４】
ＲＣＣ３５６（別名、ＰＨＯＲ−１）が過去に特性付けされており、前立腺癌においてアップレギュレートされている新しい前立腺特異的ＧＰＣＲと記載されている（米国特許第６，７９０，６３１号、米国特許第２００４／０２４８０８８号）。ＲＣＣ３５６のヒトのポリヌクレオチド配列が図１ａに、ＲＣＣ３５６のヒトのアミノ酸配列が図１ｂに示されている。前記アミノ酸配列は、１つ以上のＧＰＣＲ配列記号および嗅覚受容体記号を示している。したがって、ＲＣＣ３５６は嗅覚受容体（ＯＲ）と考えることができる。このＯＲが前立腺に特異的な機能を持ちうることは、例外的ではない。実際に、ＯＲ遺伝子は嗅上皮以外の組織でも発現していることが判明しており、このクラスの化学感覚受容体の別の潜在的な生物学的役割を示唆している。特に、ＲＣＣ３５６以外のＯＲが、生殖細胞、精巣、インスリン分泌ベータ細胞、脾臓、特定の脳部位、心臓でも発現していることが過去に示されている(Parmentierら. 1992, Nature, 355: 453-455; Thomasら. 1996, Gene, 178:1-5; Nef and Nef 1997, Pro., Nathl. Acad. Sci. USA, 94 : 4766-4771 ; Blacheら. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., 142 :669-672; Drutelら, 1995, Receptors Channels 3 :33-40; Ferrandら. 1999, J.Mol.Cell.Cardiol. 31:1137-1142; Ramingら, 1998, Receptors Channels 6 : 141 -151)。さらに、脳で発現しているラットの嗅覚受容体(別名、ＲＡ１ｃ)(Raming ら, 1998, Receptor Channels 6:141)が ＰＨＯＲ−０１と最も相同性の高い配列を有している。ＰＨＯＲ−１とＲＡ１ｃとの同一性は５９．９％であり、２９９個の残基が重複している。恐らくはＲＡ１ｃのヒトのホモログであるＨＰＲＡＡＪ７０もＰＨＯＲ−０１と同程度の相同性を示す。ＨＰＲＡＡＪ７０タンパク質は前立腺特異的ＧＰＣＲ （米国特許第５，７５６，３０９号、国際公開第９６／３９４３５号）であると報告されており、米国特許第６，７９０，６３１号記載の知見を確認している。米国特許第６，７９０，６３１号においても、ＰＨＯＲ−０１が、前立腺癌、腎臓癌、子宮癌、子宮頸癌、胃癌、直腸癌の他、正常な前立腺に限局していると記載されている。ＰＨＯＲ−０１は他の癌でも発現している可能性がある。細胞増殖および形質転換の調節におけるそれらの役割も示唆されている。例えば、米国特許第６，７９０，６３１号に示されるように、ＰＨＯＲ１が細胞増殖において極めて重要な役割を果たす可能性がある。この文脈において、米国特許第６，７９０，６３１号では、ＰＨＯＲ−０１を発現する様々な癌、特に前立腺癌の管理に有用な、診断、治療方法、組成物でのＰＨＯＲ−０１の使用が提案されている。潜在的な生理学的役割がＲＣＣ３５６に割り当てられているが［ＲＣＣ３５６を過剰発現している細胞での倍加時間の短縮（米国特許第６，７９０，６３１号）］、今日までリガンドによって該受容体が調節される可能性は示されていない。
【００１５】
イソ吉草酸は、ヒトおよび動物の分泌物、特に汗の悪臭形成の一部を形成する、不快なにおいのする有機酸である。ヒトの汗の別の成分は３−メチル−２−ヘキセン酸、酷い悪臭の成分はプロピオン酸、ペットの悪臭成分はヘキセン酸である。前記化合物は、嗅覚受容体の亜属によって識別されると過去に記載されている（米国特許第２００３／０２０７３３７号）。嗅覚受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として知られている７回膜貫通型の受容体スーパーファミリーに属する(Buckら, Cell 65:175-87, 1991)。ＧＰＣＲは、内分泌機能、外分泌機能、心拍数、脂肪分解、糖質代謝、神経伝達、視力、味覚受容などの多くの生理学的機能を制御する膜貫通シグナル伝達を媒介する。嗅覚受容体は、特定の嗅覚を引き起こす分子を特異的に認識する。これらの分子は「におい物質」とも呼ばれている。嗅覚受容体をコードする遺伝子は主に嗅覚ニューロン内で活性化している(Axel, Sci. Amer. 273:154-59, 1995)。個々の嗅覚受容体のサブタイプが、嗅上皮の別の部分に分布している細胞の一部で発現している(Breer, Semin. Cell Biol., 5:25-32, 1994)。しかし、上記のとおり、ＯＲの発現は嗅上皮に限定されていない。多くの研究所において、前立腺、脳、肺、肝臓、腎臓、子宮頸、乳房などの組織におけるＯＲの発現が証明されている。
【特許文献１】米国特許第６，７９０，６３１号明細書
【特許文献２】米国特許第２００４／０２４８０８８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７５６，３０９号明細書
【特許文献４】国際公開第９６／３９４３５号パンフレット
【特許文献５】米国特許第２００３／０２０７３３７号明細書
【特許文献６】国際公開第１０２５５１号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５，８８８，８１９号明細書
【特許文献８】米国特許第６，００４，７４４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０１３，４３１号明細書
【特許文献１０】米国特許第４，８７３，１９１号明細書
【特許文献１１】仏国特許出願公開第２，５９３，８２７号明細書
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【非特許文献６５】Wagner ら, 1997, Nucleic Acids Res., 25:4323
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ＲＣＣ３５６ ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）の天然リガンドとしてのイソ吉草酸（ＩＶＡ）の同定に関する。ＲＣＣ３５６受容体の活性を調節する薬剤のスクリーニングアッセイの基礎として、本発明にはＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸との相互作用の利用が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明には、診断およびスクリーニング方法の実施用キットの他、ＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の相互作用に基づく診断などの方法も含まれる。特に、本発明では、癌の進行および／または発生にイソ吉草酸が関連していることが示されている。また、本発明では、ＲＣＣ３５６がにおい認識および神経活動において役割を果たしうることが示されている。
【００１８】
本発明にはＲＣＣ３５６に結合する薬剤の同定方法が含まれ、前記方法は、ａ）前記イソ吉草酸と前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件下での、候補調節因子の存在下または非存在下におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、およびｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸との結合を測定することからなる。ここで、前記候補調節因子の存在しない場合の結合と比較して、前記候補調節因子が存在する場合の結合の低下によって、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤としての前記候補調節因子が同定される。
【００１９】
本発明にはさらにサンプル中でＲＣＣ３５６に結合する薬剤のサンプル中での存在の検出方法が含まれ、前記方法が、ａ）イソ吉草酸とＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件下での、前記サンプルの存在下または非存在下における前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸とが接触すること、およびｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸との結合を測定することからなる。ここで、前記候補調節因子の非存在下における結合と比較して、前記サンプルの存在下における結合の低下は、前記サンプル中でＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を示している。
【００２０】
本発明にはさらにＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の同定方法を含まれ、前記方法が、ａ）イソ吉草酸によるＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性化を可能にする条件下での、候補調節因子の存在下または非存在下におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、およびｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定することからなる。ここで、前記候補調節因子の非存在下における活性と比較して、前記候補調節因子の存在下における活性の変化によって、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤として前記候補調節因子が同定される。
【００２１】
本発明はさらにＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の同定方法であり、前記方法が、ａ）ＲＣＣ３５６ポリペプチドと候補調節因子とが接触すること、ｂ）前記候補調節因子の存在下において、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、およびｃ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドをＥＣ５０のイソ吉草酸と接触させているサンプル中において測定された前記活性と、前記候補調節因子の存在下で測定された前記活性とを比較することからなる。ここで、該候補調節因子の存在下で測定された活性量は、ＥＣ５０の前記イソ吉草酸による誘導量の少なくとも１０％である場合、前記候補調節因子はＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤として同定される。本発明によると、候補調節因子の存在下で測定された活性は、ＥＣ５０のイソ吉草酸の誘導量の１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上でありうる。該当する場合、本発明ではさらに、好ましくはＥＣ５０のイソ吉草酸が本発明の方法において使用されることが示されている。しかし、本発明の方法において、ＲＣＣ３５６の活性化が検出されうる他の濃度でイソ吉草酸が使用されうる。
【００２２】
本発明ではさらにサンプル中においてＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を検出する方法を含み、前記方法が、ａ）前記サンプルの存在下、または非存在下においてＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、ｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、およびｃ）前記サンプルを含まず、ＲＣＣ３５６およびイソ吉草酸を含む反応で測定された前記活性と、ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸、前記サンプルを含む反応液中で測定された前記活性とを比較することからなる。ここで、前記サンプルの存在しない場合の活性と比較して、前記サンプルの存在する場合の前記活性変化は、前記サンプル中においてＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤が存在することを示唆している。
【００２３】
本発明はさらにサンプル中のＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を検出する方法を含み、前記方法が、ａ）ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記サンプルとが接触すること、ｂ）前記サンプルの存在下における、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、およびｃ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドをＥＣ５０のイソ吉草酸と接触させている反応液中において測定された前記活性と、前記サンプルの存在下で測定された前記活性とを比較することからなる。ここで、前記サンプルの存在下において測定された前記活性量が、ＥＣ５０の前記イソ吉草酸による誘導量の少なくとも１０％である場合、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤は検出される。
【００２４】
本発明によると、結合法を利用した場合、イソ吉草酸を検出可能なように標識できる。前記方法において、イソ吉草酸は、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、蛍光クエンチャーからなる群から選択される成分によって検出可能なように標識できる。または、イソ吉草酸をＮＭＲで検出可能な成分で検出可能なように標識できる。
【００２５】
前述の方法のいずれでも一実施態様では、前記接触は前記ＲＣＣ３５６ポリペプチを発現する細胞内、または細胞上で行われる。本発明によると、前記細胞は、ヒトの胚腎臓細胞（Ｈｅｋ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サルの細胞（ＣＯＳ）、初代嗅細胞、アフリカツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母、細菌でありうるが、これらに限定されない。
【００２６】
前述の方法のいずれでも別の実施態様では、合成リポソーム内、または前記リポソーム上(Tajib ら, 2000, Nature Biotechnology 18: 649-654、参照により本明細書に援用されている)、もしくはＲＣＣ３５６ポリペプチドを含むウイルス誘発性発芽膜内、または前記膜上で接触が行われる（国際公開第１０２５５１号、２００１年、参照により本明細書に援用されている）。
【００２７】
前述の方法のいずれでも別の実施態様では、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて前記方法が行われる。
【００２８】
前述の方法のいずれかの好ましい実施態様では、タンパク質チップ上で該方法が行われる。
【００２９】
前述の方法のいずれかの好ましい別の実施態様では、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光クエンチング、蛍光偏光から選択される方法を利用して該測定が行われる。
【００３０】
前述の方法のいずれかの好ましい別の実施態様では、前記薬剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、糖質、核酸、有機低分子（発臭成分およびフェロモンを含むが、これらに限定されない）からなる群から選択される。
【００３１】
本発明によると、機能アッセイを利用する場合、ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定する段階がセカンドメッセンジャーレベルにおける変化の検出を含む。
【００３２】
別の実施態様では、シグナル活性を測定する段階が、グアニンヌクレオチド結合／連結または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、プロテインキナーゼＡ活性、 ホスファチジルイノシトールの分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流束、 アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラニンアッセイ、受容体内在化アッセイまたはリポーター遺伝子発現の測定を含む。Ｇタンパク質結合／連結または交換を測定する場合、可能な全てのＧａサブユニットのうち、好ましくはＧＴＰ結合タンパク質Ｇタンパク質アルファ-ｏｌｆサブユニット（嗅覚）（別名、Ｇ−ｏｌｆ）の挙動を研究する。ヒトのＧ−ｏｌｆサブユニットの配列は、既に受託番号Ｌ１０６６５でジーンバンクに登録されている。しかし、他の種類のＧ−ｏｌｆサブユニットを使用して、研究可能である。
【００３３】
好ましい一実施態様では、シグナル活性の測定には、蛍光または発光アッセイの使用が含まれる。蛍光、発光アッセイは、ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４、Ｆｕｒａ（分子プローブ）、Ｃａ３−キットファミリー(Molecular Device)、エクオリンなどのＣａ２＋感受性フルオロフォアの使用を含みうる。さらに、該アッセイでは、ＦＤＳＳ (Hamamatsu)またはＦＬＩＰＲ(Molecular Device)などの蛍光または発光性リーダーを適用しうる。
【００３４】
本発明ではさらに細胞内におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性を調節する方法を含み、前記方法は、ＲＣＣ３５６の活性を調節できるように、ＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性を調節するイソ吉草酸を前記細胞内に輸送する段階を含む。
【００３５】
前述の方法のいずれでも別の実施態様では、方法はハイスループットスクリーニングである。
【００３６】
前述の方法のいずれでも別の実施態様では、薬剤が化学ライブラリーまたは動物器官の抽出物の一部である。動物器官の抽出物が、前立腺癌、血液、脳から調製された抽出物でありうるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明は前述の方法のいずれかによって同定または検出されたイソ吉草酸関連の薬剤を含んでいる。イソ吉草酸関連の前記薬剤が、ＲＣＣ３５６に対するアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストでありうる。
【００３８】
本発明は前述のいずれかによって同定または検出されたイソ吉草酸と関連する薬剤を含む組成も含んでいる。
【００３９】
本発明によると、前述の方法のいずれかによって同定または検出された薬剤、または前述の薬剤を含む組成は、医薬品の調製に使用できる。または、これらはにおい物質またはにおい物質のアンタゴニストの調製に使用されうる。例えば、ＲＣＣ３５６アゴニストは、防虫剤、つまりデオドラントとしてのＲＣＣ３５６アンタゴニストとして使用されうる。
【００４０】
好ましい一実施態様では、前述の薬剤または組成が、疾患または障害が好ましくは癌または腫瘍の転移からなる群から選択される、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用医薬品の調製に使用されうる。本発明によると、前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択されうる。
【００４１】
好ましい別の一実施態様では、前記薬剤または組成が、前記疾患または障害が好ましくはＣＮＳ障害または疾患である、ＲＣＣ３５６関連の疾患またはＲＣＣ３５６関連の障害の治療用医薬品の調製に使用されうる。本発明によると、前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんでありうる。
【００４２】
本発明は、分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチドおよびイソ吉草酸を含む組成も含む。
【００４３】
本発明は、分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチドおよび前記酸を含む組成の製造用のイソ吉草酸の使用にも関する。
【００４４】
本発明はさらに、ＲＣＣ３５６シグナル伝達を調整する薬剤のスクリーニング用キットの製造、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患の診断または予後診断用キットの製造、もしくはにおい物質またはにおい物質のアンタゴニストのスクリーニング用キットの製造におけるＲＣＣ３５６との併用における、イソ吉草酸の使用に関する。
【００４５】
また、本発明は、ＲＣＣ３５６のリガンドとしてのイソ吉草酸の使用を含む。
【００４６】
本発明はさらに医薬品調製のためのイソ吉草酸の使用を含む。本発明によると、前記疾患または障害が好ましくは癌または腫瘍の転移からなる群から選択される、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用に前記医薬品が使用される。特に、前記医薬品が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌の治療に使用できる。
【００４７】
または、前記医薬品は、疾患または障害が好ましくはＣＮＳ障害または疾患である、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用に使用される。 特に、該医薬品はてんかん治療に使用されうる。
【００４８】
本発明は、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体またはその断片を認識する抗体とも関連する。
【００４９】
本発明の別の一実施態様は、ＣＮＳ障害または疾患の治療用医薬品の調製のための、ＲＣＣ３５６断片またはＲＣＣ３５６を認識する抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用法と関連する。前記ＣＮＳ疾患または障害はてんかんでありうる。
【００５０】
本発明の別の一実施態様は、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の治療用医薬品の調製のための、ＲＣＣ３５６断片またはＲＣＣ３５６を認識する抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用に関する。
【００５１】
または、癌または腫瘍の転移の治療用医薬品の調製のための、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体が使用されうる。
【００５２】
本発明はさらに、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法を含み、前記方法が、ａ）組織サンプルとイソ吉草酸とが接触すること、ｂ）前記酸の前記組織サンプルへの結合を検出すること、およびｃ）段階（ｂ）で検出する結合と前記標準品とを比較することからなる。ここで、標準品と比較して結合の違いは、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に使用する。
【００５３】
本発明はさらに、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であり、前記方法が、ａ）組織サンプルとイソ吉草酸に対して特異的な抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対して特異的な抗体とが接触すること、ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出すること、およびｃ）段階（ｂ）で検出する結合と前記標準品を比較することからなる。ここで、標準品と比較した結合の違いは、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に使用する。
【００５４】
本発明はさらに ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法を含み、前記方法が、ａ）組織サンプルとＲＣＣ３５６ポリペプチドに対して特異的な抗体およびイソ吉草酸に対して特異的な抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対して特異的な抗体とが接触すること、ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出すること、およびｃ）段階（ｂ）で検出する結合と前記標準品を比較することからなる。ここで、標準品と比較したいずれか一方または両方の抗体の結合の違いは、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に使用する。
【００５５】
本発明は、さらにＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であり、前記方法が、ａ）組織サンプルのイソ吉草酸含量を定量すること、およびｂ）段階（ａ）で定量する前記酸の量と標準品を比較することからなる。ここで、前記標準品と比較したイソ吉草酸の量の違いは、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に使用する。
【００５６】
本発明の方法を利用して診断または予後診断されるＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害が、癌および腫瘍の転移（これらに限定されない）からなる群から選択されうる。特に、前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択される。
【００５７】
または、本発明の方法を利用して診断または予後診断されるＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害が、ＣＮＳ障害または疾患でありうる。例えば、前記ＣＮＳ疾患または障害はてんかんでありうる。
【００５８】
本発明ではさらに、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対して特異的な抗体を使用して、ＣＮＳ疾患または障害、もしくはイソ吉草酸関連の嗅覚異常を診断または予後診断しうることが示されている。上記の通り、前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんでありうる。
【００５９】
本発明は、イソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断の方法も含み、前記方法が、ａ）組織サンプルのＲＣＣ３５６含量を定量すること、およびｂ）段階（ａ）で定量する前記受容体の量を標準品と比較することからなる。ここで、標準品と比較したＲＣＣ３５６の量の違いは、嗅覚異常の診断または予後診断、もしくはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断に使用する。本発明によると、前記ＣＮＳ関連疾患または障害がてんかんでありうる。前記方法では、ＲＣＣ３５６抗体、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６抗体、またはイソ吉草酸を使用して定量が行われる。
【００６０】
本発明はさらにイソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断の方法を含み、前記方法が、ａ）ＲＣＣ３５６をコードするｍＲＮＡを定量すること、および／または組織サンプル中の野生型ＲＣＣ３５６の配列と比較して、該ＲＣＣ３５６配列の正確性を検証すること、およびｂ）段階（ａ）で定量または決定した前記核酸の量および／または正確性を標準品と比較することからなる。ここで、標準品と比較した前記量またはＲＣＣ３５６配列の違いは、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の診断または予後診断、もしくはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断に使用する。前記方法では、該ＣＮＳ関連疾患または障害はてんかんでありうる。
【００６１】
本発明は、癌または腫瘍の転移を診断または予後診断する方法も含み、前記方法が、ａ）ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６抗体を使用した組織サンプルのＲＣＣ３５６含量を定量すること、およびｂ）段階（ａ）での前記受容体の量と標準品とを比較することからなる。ここで、前記標準品と比較したＲＣＣ３５６の前記量の違いは、嗅覚異常の診断または予後診断、もしくは癌または腫瘍の転移の診断または予後診断に使用する。
【００６２】
本発明にはさらに、分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチド、イソ吉草酸、これらのためのパッケージング材料からなるキット、ＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチド、イソ吉草酸、これらのためのパッケージング材料からなるキット、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞またはその膜、イソ吉草酸、これらのためのパッケージング材料からなるキットを含む。前記細胞は、前記ＲＣＣ３５６をコードするポリヌクレオチドで形質転換されうる。
【００６３】
本発明によると、上記のキットはいくつかの目的で使用されうる。例えば、前記キットは、におい物質または抗におい物質剤のスクリーニング、または腫瘍化合物またはＣＮＳ障害または疾患の治療用化合物のスクリーニング向けの、ＲＣＣ３５６のシグナル伝達を調節する薬剤のスクリーニングに使用されうる。抗腫瘍化合物の探索時には、特に前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌が標的となり、ＣＮＳ障害の治療用化合物の探索時には、特にてんかん治療が標的となる。
【００６４】
また、本発明は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断用のイソ吉草酸を含むキットの用にも関する。
【００６５】
さらに、本発明は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断用のイソ吉草酸抗体を含むキットの使用に関する。本発明によると、前記疾患または障害は癌でありうる。
【００６６】
本発明は、ＣＮＳ関連疾患の診断または予後診断用のＲＣＣ３５６を含むキットの使用を含む。前記キットが、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の診断または予後診断にも使用されうる。
【００６７】
本発明は、癌の進行および／または治療に及ぼすイソ吉草酸の効果を研究するためのＲＣＣ３５６またはそのオルソログのトランスジェニック動物の使用法も含む。進行および／または治療が研究される癌は、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌でありうる。オルソログという用語は、進化上関連する種において、ＲＣＣ３５６と類似の機能を有する遺伝子を意味する。
【００６８】
本発明は、ＣＮＳ障害または疾患の進行および／またはイソ吉草酸関連の嗅覚異常の治療を研究するためのＲＣＣ３５６またはそのオルソログのトランスジェニック動物の使用も含む。進行および／または治療が研究されるＣＮＳ障害または疾患は、てんかんでありうる。
【００６９】
本発明によると、癌の進行および／または治療を研究するために、イソ吉草酸を過剰生産するトランスジェニック動物が使用されうる。動物での過剰生産は、例えばＩＶＡ分解の抑制を介して誘発されうる。
【００７０】
または、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の進行に及ぼすＲＣＣ３５６の効果を研究するためのＲＣＣ３５６ノックアウトトランスジェニック動物（ヒトは含まず）が使用されうる。また、ＣＮＳ障害または疾患の進行に及ぼすＲＣＣ３５６の効果を研究するためのＲＣＣ３５６ノックアウトトランスジェニック動物が使用されうる。本記載において、ＲＣＣ３５６は、選択された動物モデルに従ったＲＣＣ３５６のオルソログとして理解されうる。
【００７１】
本発明での上記の全ての方法、薬剤、使用法、組成、キットにおいて、図１ｂに示されているＲＣＣ３５６ポリペプチドに特異的に結合して、そのシグナル伝達活性を活性化させる、イソ吉草酸等価体または前記等価体に対する抗体が使用、参照、適用、もしくは組み込まれうる。イソ吉草酸の前記等価体がプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、 イソヘキサン酸、 ヘプタン酸、 イソヘプタン酸、オクタン酸、 イソオクタン酸、ノナン酸、 イソノナン酸、バルプロ酸、イソバレルアミド、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロ安息香酸、ペラルゴン酸、５−ヘキセン酸からなる群から選択されうる。特に、前記等価体が、酪酸、吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロ安息香酸、ペラルゴン酸、５−ヘキセン酸からなる群から選択される。
【００７２】
また、本発明での上記の全ての方法、薬剤、使用法、組成、キットにおいて、ＲＣＣ３５６ポリペプチドが、図１ｂに示されるポリペプチドと少なくとも２０％の同一性、または２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、さらに１００％といったより高い同一性を有するが、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと同等の活性を有しうる。当業者であれば、使用されたアッセイに左右される該活性の評価方法を知っている。
【００７３】
また、本発明での上記の全ての方法、薬剤、使用法、組成、キットにおいて、該ＲＣＣ３５６ポリペプチドがキメラまたはその活性フラグメントでありうる。
【００７４】
本明細書において用いられる用語「ＲＣＣ３５６ ポリペプチド」は２つの必須の特性を有する：１）ＲＣＣ３５６ポリペプチドが、図１ｂに示される配列と少なくとも２０％、好ましくは８０％、９０％、９５％以上（１００％を含む）のアミノ酸の同一性を有する、および２）ＲＣＣ３５６がＲＣＣ３５６活性を有する（つまり、該ポリペプチドがイソ吉草酸またはその等価体と結合する）。前記相同性は、ポリペプチド全体またはＣＤＲドメイン（受容体のリガンド結合ドメイン）などのポリペプチドの一部と関連しうる。PilpelおよびLancet (Protein Science 8:969-977、1999)によると、ＧＰＣＲのＣＤＲドメインは、公表されている表示（ＴＭ３−＃４、ＴＭ３−＃８、ＴＭ３−＃１１、ＴＭ３−＃１２、ＴＭ３−＃１５、ＴＭ４−＃１１、ＴＭ４−＃１５、ＴＭ４−＃１９、ＴＭ４−＃２２、ＴＭ４−＃２３、ＴＭ４−＃２６、ＴＭ５−＃３、ＴＭ５−＃６、ＴＭ５−＃７、ＴＭ５−＃１０、ＴＭ５−＃１１、ＴＭ５−＃１３）に従って定義され、ＴＭｘは前記受容体の膜貫通領域を示し、#は前記領域内のアミノ酸の位置を示す。好ましくは、「ＲＣＣ３５６ポリペプチド」は、本明細書で定義されるＲＣＣ３５６のシグナル伝達活性も有する。しかし、７ＴＭ受容体のＣＤＲの同定は全く運任せであり、ＴＭの定義に適用されるアルゴリズムに左右される。さらに、PilpelおよびLancet によれば、ＲＣＣ３５６は４つのＴＭしか有し得ない。上記のとおり、該ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、ＲＣＣ３５６のオルソログも含む。
【００７５】
本明細書において用いられる用語「ＲＣＣ３５６ポリヌクレオチド」は、本明細書で定義されるＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００７６】
本明細書において用いられる用語「ＲＣＣ３５６活性」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドによる、イソ吉草酸またはその等価体の特異的結合を意味する。
【００７７】
本明細書において用いられる用語「ＲＣＣ３５６シグナル伝達活性」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドによる、シグナル伝達の開始または伝搬を意味する。ＲＣＣ３５６シグナル伝達活性は、以下のうちの１つ以上の測定による、シグナル伝達カスケードにおいて検出可能な段階の測定によってモニターされる：Ｇタンパク質、特にＧ−ｏｌｆにおけるＧＤＰとＧＴＰの交換の促進、アデニル酸シクラーゼ活性の変化、プロテインキナーゼＣの調節、プロテインキナーゼＡの調節、ホスファチジルイノシトールの分解（セカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸の生成）、細胞内カルシウムの流出、ＭＡＰキナーゼの活性化、チロシンキナーゼの調節、内在化アッセイ、遺伝子またはリポーター遺伝子活性の調節、メラニンアッセイ。本明細書において後述されるＲＣＣ３５６活性アッセイのいずれか１つと比較した、イソ吉草酸の実質的な非存在下において確立されるベースラインより１０％以上、もしくは１０％以下の測定可能な活性の変化がある場合、シグナル伝達カスケードの検出可能な段階が開始または媒介されると考えられる。測定可能な活性は、例えば、ｃＡＭＰまたはジアシルグリセロール濃度の測定のように、直接的に測定可能である。または、測定可能な活性は、例えばリポーター遺伝子アッセイのように、間接的に測定可能である。これらのアッセイの大半について、市販のキットが利用できる。
【００７８】
本明細書において用いられる用語「検出可能な段階」は、直接的（例、セカンドメッセンジャーの測定または変性（例、リン酸化）タンパク質の検出）、または間接的に（例、該段階の下流への効果のモニタリング）測定可能な段階を意味する。例えば、アデニル酸シクラーゼの活性化は、ｃＡＭＰの生成をもたらす。アデニル酸シクラーゼの活性は、直接的（例、アッセイにおいてｃＡＭＰの産生をモニターするアッセイ）、または間接的に（例、ｃＡＭＰおよび／またはカルシウム流束の実際のレベルの測定）測定可能である。
【００７９】
本明細書において用いられる用語「分離された」は、分子の集団（例、異なる性質の分子の混在が、５０％未満（重量）、好ましくは４０％未満、最も好ましくは２％未満のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成）を意味する。「分離された」という用語がＲＣＣ３５６ポリペプチドに適用される場合、脂質膜に結合した、または脂質膜に埋め込まれたＲＣＣ３５６ポリペプチドを含むことを特に意味する。
【００８０】
本明細書において用いられる用語「イソ吉草酸」は、熟練した化学者には既知の化学分子を意味する。または、イソ吉草酸は、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、イソカプロン酸、イソエナンチル酸、イソカプリル酸、イソペラルゴン酸、ヘキサヒドロ安息香酸、５−ヘキセン酸、バルプロ酸、イソバレルアミド、またはこれらの派生物などの同等の分子も意味するが、これらに限定されない。全ての前記酸は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドに対して特異的に結合して、そのシグナル伝達活性を活性化させうる。「特異的に結合する」という用語は、イソ吉草酸のＥＣ５０、ＩＣ５０、Ｋｄが１ｍＭ未満であることを意味する。派生物は、それが派生する化合物と比較して、少なくとも１つの部位が異なる、類似の化合物でありうる。「イソ吉草酸等価体」のための一般的な化学式は（ＣＨ３）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−（ＣＨ）ｚ−ＣＯＯＨでありうる。また、アミン、ケトン、エステル、エーテル、アルコールを含めた（これらに限定されない）、様々な化学的機能を有する様々なラジカルが一般的な該化学式にグラフトされうる。
【００８１】
本明細書において用いられる用語「候補化合物」と「候補調節因子」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドへのリガンド結合の調節能、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性の調節能が評価される組成を意味する。候補調節因子は、例えば、動物、植物、細菌、カビの細胞からの「ならし培地」の他、該細胞の抽出物に含まれる低分子、化合物を含めた、天然または合成化合物でありうる。
【００８２】
本明細書において用いられる用語「低分子」は、分子量３０００ダルトン未満、好ましくは２０００または１５００ダルトン未満、より好ましくは１０００ダルトン未満、最も好ましくは６００ダルトン未満の化合物を意味する。「有機低分子」は、炭素を含む低分子である。
【００８３】
本明細書において用いられる用語「結合の変化」または「活性の変化」、および同義語で「結合の差」または「活性の差」は、特定のアッセイにおける結合またはシグナル伝達活性の少なくとも１０％が、上昇または低下することを意味する。
【００８４】
本明細書において用いられる用語「イソ吉草酸とＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件」は、例えば、イソ吉草酸がＲＣＣ３５６に結合する、温度、塩濃度、ｐＨ、タンパク質濃度の条件を意味する。厳密な結合条件は、アッセイの性質（例、アッセイにおいて生存細胞、もしくは細胞の膜画分のいずれが使用されるか）によって変動しうる。しかし、ＲＣＣ３５６は細胞表面タンパク質であり、イソ吉草酸は通常細胞表面上のＲＣＣ３５６と相互作用するため、好ましい条件には通常、生理学的塩濃度（９０ｍＭ）およびｐＨ（約７．０−８．０）が含まれる。結合の温度は４℃から３７℃まで変動しうるが、好ましくは室温および約３７℃の間である。結合反応においてイソ吉草酸およびＲＣＣ３５６ポリペプチドの濃度も変動するが、好ましくは約１０μＭ（例、放射性標識トレーサーイソ吉草酸との反応で、濃度は通常Ｋｄ未満）から１ｍＭ（例、競合因子としてのイソ吉草酸）である。実施例として、ＲＣＣ３５６発現細胞および精製済み標識イソ吉草酸を使用した結合アッセイにおいて、１０μＭ 標識イソ吉草酸、１ｍＭ 冷イソ吉草酸、および５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、脂肪酸不含０．５％ＢＳＡを含む２７℃の結合バッファー２５０μＬ中の細胞２５，０００個を使用して結合を行った。
【００８５】
本明細書において用いられる用語「サンプル」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドへの結合、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル伝達活性を調節する薬剤の存在について試験される分子の源を意味する。サンプルは、環境サンプル、動物、植物、酵母、または細菌の細胞または組織の天然抽出物、臨床サンプル、合成サンプル、組換え細胞の「ならし培地」、発酵工程でありうる。「組織」は、生物内において特定の機能を果たす細胞の集合体である。本明細書において用いられる用語「組織」は、特定の生理的領域からの細胞物質を意味する。特定組織の細胞は、いくつかの異なった細胞種類を含みうる。この一例は、限定はされないが、毛細血管内皮細胞および血球の他、さらにニューロンおよびグリア細胞から構成される脳組織があり、全てが特定の組織切片またはサンプル中に含まれる。固形組織に加えて、「組織」という用語は、血液などの非固形組織も含むこととなっている。
【００８６】
本明細書において用いられる用語「膜画分」は、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを含む細胞の脂質膜の調製物を意味する。該用語が本明細書において用いられるように、「膜画分」は、非膜結合細胞成分の少なくとも一部（少なくとも１０％、好ましくはそれ以上）が除去されている点で、細胞ホモジネートとは異なる。「膜結合」という用語は、脂質膜に取り込まれた、もしくは脂質膜に取り込まれた成分と物理的に結合した細胞成分を意味する。
【００８７】
本明細書において用いられるように、「結合の低下」は、本明細書に記載の結合アッセイ中において測定される、ＲＣＣ３５６ポリペプチドに対するイソ吉草酸または他のアゴニストの結合が、少なくとも１０％の低下することを意味する。
【００８８】
本明細書において用いられるように、「セカンドメッセンジャー」という用語は、ＧＰＣＲからのシグナル伝達に関与するＧタンパク質共役受容体の活性化によって生じる、もしくは濃度が変動する分子を意味する。セカンドメッセンジャーの例としては、これらに限定されないが、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウムが挙げられる。「セカンドメッセンジャーレベルの変化」は、候補調節因子の非存在下で実施されるアッセイにおける検出量と比較した、特定のセカンドメッセンジャーの検出レベルの少なくとも１０％の上昇または低下を意味する。
【００８９】
本明細書において用いられるように、「エクオリンアッセイ(aequorin-based assay)」という用語は、活性化ＧＰＣＲによって誘発される細胞内カルシウム流束を測定するＧＰＣＲ活性アッセイを意味しており、細胞内カルシウム流束が、細胞内で発現される発光またはエクオリンによって測定される。
【００９０】
本明細書において用いられるように、「結合」という用語は、リガンド（例、イソ吉草酸）と受容体（例、RCC356）との物理的結合を意味する。本明細書において該用語が用いられるように、１００ｎＭ未満、通常は１００μＭから１０００μＭのＥＣ５０またはＫｄで結合が生じる場合、結合は「特異的」である。におい物質機能アッセイを利用して、認められたＥＣ５０は通常１０、１００、さらには１ｍＭであり、前記シグナルは特異的と見なされうる（図３参照）。ＥＣ５０またはＫｄが、１０００μＭ、９５０μＭ、９００μＭ、８５０μＭ、８００μＭ、７５０μＭ、７００μＭ、６５０μＭ、６００μＭ、５５０μＭ、５００μＭ、４５０μＭ、４００μＭ、３５０μＭ、３００μＭ、２５０μＭ、２００μＭ、１５０μＭ、１００μＭ、７５μＭ、５０μＭ、２５μＭまたは１０μＭ、１μＭ、９５０ｎＭ、９００ｎＭ、８５０ｎＭ、８００ｎＭ、７５０ｎＭ、７００ｎＭ、６５０ｎＭ、６００ｎＭ、５５０ｎＭ、５００ｎＭ、４５０ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ、１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭまたは１０ｐＭ以下の場合、におい物質結合は特異的と見なされうる。
【００９１】
本明細書において用いられるように、「ＥＣ５０」という用語は、イソ吉草酸などのリガンドの結合などの任意の活性およびＲＣＣ３５６ポリペプチドの機能活性が、同じアッセイを利用して測定可能なＲＣＣ３５６活性の最高値の５０％となる薬剤の濃度を意味する。換言すると、「ＥＣ５０」は、１００％活性がより多量のアゴニストの添加によって上昇しない活性量と定められる場合に、５０％の活性化をもたらす薬剤の濃度である。「イソ吉草酸等価体のＥＣ５０」は、酸の同一性に伴って変動し、例えば、同等のイソ吉草酸分子のＥＣ５０値は、イソ吉草酸以上、未満、または同程度であることに注意する必要がある。したがって、イソ吉草酸等価体を使用する場合、当業者であれば従来の方法に従ってＥＣ５０を測定可能である。任意のイソ吉草酸等価体のＥＣ５０は、少なくともＲＣＣ３５６応答が飽和状態となる、もしくは最高に達するまで増量させたイソ吉草酸等価体の存在下で一定量のＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性測定を実施して、測定したＲＣＣ３５６活性と使用した酸の濃度をプロットすることで測定される。
本明細書において用いられるように、「Ｋｄ」は、解離定数、つまり受容体の半数が平衡状態でリガンドと結合するリガンドの濃度である。
【００９２】
本明細書において用いられるように、「ＩＣ５０」という用語は、ＲＣＣ３５６受容体の最高活性を５０％低下させるアンタゴニストまたはインバースアゴニストの濃度である。
【００９３】
本明細書において用いられるように、「検出可能なように標識」という用語は、分子の特性を意味する（例、構造的変化を受けたイソ吉草酸またはその等価体）。前記変化は、官能基の取り込み、または付加によって導入される。前記官能基（標識）は容易に検出可能である。検出可能な標識として、蛍光化合物、同位体化合物、発光化合物、量子ドットラベルが挙げられるが、これらに限定されない。イソ吉草酸または等価体の構造に付加可能な放射性同位体の例として１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈがありうる。イソ吉草酸または等価体の構造に取り込み可能な放射性同位体の例として３Ｈ、１４Ｃがありうる。多様な検出方法として、分光学的、光化学的、放射化学的、生化学的、免疫化学的、化学的方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書において用いられるように、「アフィニティタグ」という用語は、目的の分子（例、ＲＣＣ３５６ポリペプチド）に付ける標識を意味しており、これによって標識に結合する試薬が特異的に標識分子に結合できる。親和性タグとして、抗体に対するエピトープ（別名「エピトープタグ」）、ビオチン、６ＸＨｉｓ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴが挙げられるが、これらに限定されない。親和性タグは、標識種の精製の他、検出に使用可能である。
【００９５】
本明細書において用いられるように、「結合の低下」は、既知の、もしくは予測される調節因子のないアッセイ中で検出される結合量と比較して、既知の、もしくは予測されるＲＣＣ３５６の調節因子を有する任意のアッセイ中で検出される結合量が、少なくとも１０％の減少することを意味する。
【００９６】
本明細書において用いられるように、「送達」という用語は、薬物や薬剤に関して使用される場合、アッセイの混合液、もしくは細胞培養への薬物または薬剤の添加を意味する。該用語は動物への薬物または薬剤の投与も意味する。該投与は、例えば、注射（例えば生理食塩水や水まどの適当な溶媒中）、吸入、経口、経皮、直腸、膣内などの通常の薬物投与経路が可能である。
【００９７】
本明細書において用いられるように、「Ｇタンパク質共役受容体」または「ＧＰＣＲ」という用語は、７つのαヘリックス膜貫通ドメインを有する膜結合型ポリペプチドを意味する。 機能的なＧＰＣＲはリガンドまたはアゴニストと結合し、またＧタンパク質とも結合して、これを活性化させる。ＲＣＣ３５６はＧＰＣＲである。
【００９８】
本明細書において用いられるように、「嗅覚受容体」という用語は、Zozulya ら, Genome Biology 2001 2(6) research0018.1-0018.12.で定義される通り、ＯＲ記号を伴うＧＰＣＲである。 該参考文献は、参照により本明細書に援用されている。
【００９９】
本明細書において用いられるように、「ＲＣＣ３５６ポリペプチドの機能を調節する薬剤」という用語は、イソ吉草酸またはその等価体の結合を変化させる化合物、およびＲＣＣ３５６の下流のシグナル伝達活性を変化させる化合物を含む、ＲＣＣ３５６活性を上昇または低下させる分子または化合物である。
【０１００】
本明細書において用いられるように、「トランスジェニック動物」という用語は、該技術分野では周知のトランスジェニック技術などの人為的な方法によって、動物の１つ以上の細胞が、導入された外来の核酸を含んでいる、動物、好ましくはヒト以外の哺乳動物、鳥類、魚類、両生類を意味する。該核酸は、前駆細胞内への導入、マイクロインジェクションなどの計画的な遺伝子操作、組換えウイルスの感染によって、直接的または間接的に細胞内に導入される。遺伝子操作という用語には、古典的な異種交配や体外受精は含まれず、組換えＤＮＡの導入を目的としている。この分子は染色体中に組み込まれるか、もしくは染色体外で複製するＤＮＡとなりうる。本明細書に記載の典型的なトランスジェニック動物においては、導入遺伝子によって、細胞が目的のポリペプチドの組換え型（アゴニスト型またはアンタゴニスト型）を発現する。一方、例えば、後述のＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性コンストラクトなど、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も検討される。さらに、「トランスジェニック動物」には、遺伝子組換えおよびアンチセンス技術などの、人為的方法によって１つ以上の遺伝子が破壊された遺伝子組換え動物が含まれる。
【０１０１】
本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、目的のポリペプチドの１つとも特異的に反応する免疫グロブリン分子の断片の他、従来の免疫グロブリン分子である。抗体は従来技術を利用して断片化可能であり、該断片の可用性は、本明細書で後述されている完全な抗体のための同様の方法でスクリーニングされる。例えば、抗体をペプシン処理することでＦ（ａｂ）２断片を生成可能である。結果として得られるＦ（ａｂ）２断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元させ、Ｆａｂ断片を生成可能である。本発明の抗体はさらに、該抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって与えられる、ポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性、単鎖、キメラ、ヒト化分子を含むことを目的とする。好ましい実施態様では、抗体はさらに該抗体に付着した検出可能な標識を含む（例、標識は放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、補酵素でありうる）。
【０１０２】
本明細書において用いられるように、用語「抗腫瘍化合物」は、癌の発生または進行を停止または抑制させる任意の化合物を意味する。上記の通り、前記抗腫瘍化合物で治療されうる癌は、任意の癌または腫瘍の転移でありうる。さらに、前記化合物は、細胞増殖の抑制または停止、もしくは増殖中の細胞の生存に作用するが、他の細胞活動にも影響を及ぼしうる。
【０１０３】
本明細書において用いられるように、「抗におい物質剤」という用語は、動物によるにおい知覚を止める、または抑制する任意の薬剤を意味する。前記知覚は、インビボでにおい知覚を促進する、または示す動物試験、エクスビボ試験、またはインビトロ試験を利用してアッセイされうる。におい知覚の例には、アルデヒド、フルーティーライト、フルーティーダーク、甘い芳香植物、バルサム、芳香属スパイス、タバコ、 ツノマタゴケ、革、動物、琥珀、樹木、針葉樹、ハーブ系スパイス、薬草、緑黄色野菜、柑橘類でありうるが、これらに限定されない。
【０１０４】
「ＲＣＣ３５６活性の異常調節」という表現は、前記受容体が存在する正常な条件と比較して、ＲＣＣ３５６が活性化されないことを意味する。前記異常調節は、ＲＣＣ３５６受容体がＲＣＣ３５６に特異的リガンドによって正常に刺激されない条件、もしくは野生型ＲＣＣ３５６受容体と比較して、ＲＣＣ３５６刺激がシグナル伝達分子に異なる様式で伝達される条件に起因しうる。
【０１０５】
「診断方法」という表現は、疾患または障害が検出される方法を意味しており、前記状況下では、患者における前記疾患または障害の存在および（または）発生に関する測定可能な指標または徴候が既に存在する。
【０１０６】
「予後診断方法」という表現は、疾患または障害が発生する可能性を測定する方法を意味しており、前記状況下では、患者における前記疾患または障害の存在および／または発生に関する測定可能な指標または徴候は存在しないか、ほとんど見えない。
【０１０７】
「イソ吉草酸等価体」は、イソ吉草酸と同じ、または同等の効果を有する分子を意味する。該等価体の例が先に記載されているが、該化合物に限定されない。該記載は、一般的な周知の知見とともに、十分な情報を提供しているため、当業者であれば、任意の化合物がイソ吉草酸の等価体と見なされうるか否かを判断できる。このような「イソ吉草酸等価体」の一般的な化学式は（ＣＨ３）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−（ＣＨ）Ｚ−ＣＯＯＨでありうる。また、アミン、ケトン、エステル、エーテル、アルコールを含めた（これらに限定されない）、様々な化学的機能を有する様々なラジカルが一般的な該化学式にグラフトされうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
発明の詳細な説明
本発明は、イソ吉草酸が該ＲＣＣ３５６ ＧＰＣＲの天然リガンドであるとの発見と関連している。相互作用は、該相互作用、ひいてはＲＣＣ３６５の機能を調節する薬剤のスクリーニングアッセイに有用である。既知のリガンドおよびその受容体との相互作用は、無調節な前記受容体の活性などの状態の診断法も提供する。
【０１０９】
Ｉ. ＲＣＣ３５６の活性を調節する薬剤を同定するためのアッセイ
ＲＣＣ３５６の活性を調節する薬剤は、前記受容体とイソ吉草酸との相互作用を上手く利用した多数の方法で同定可能である。例えば、インビトロ、細胞培養、またはインビボにおいてＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の結合を再構成する能力によって、該結合を破壊する薬剤の同定における標的が与えられる。結合破壊に基づくアッセイによって、有機低分子のライブラリーまたは集合から有機低分子などの薬剤の同定が可能となる。または、該アッセイによって、植物、真菌、細菌の抽出物またはヒトの組織サンプルなどの天然材料からのサンプルまたは抽出物における薬剤の同定が可能となる。次に、該受容体を介した下流のシグナル伝達を測定する結合アッセイまたは機能アッセイを利用して、ＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の結合の調節因子をスクリーニング可能である。結合アッセイおよび機能アッセイのいずれもイソ吉草酸を使用して検証される。
【０１１０】
ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤をより直接的に同定するためのＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の相互作用を利用した別の方法では、候補薬剤または候補調節因子によって誘発されるＲＣＣ３５６の下流のシグナル伝達における変化が測定される。これらの機能アッセイは、分離した細胞膜画分または表面上に受容体を発現している細胞上で実施可能である。
【０１１１】
以下の説明では、ＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用に基づく結合アッセイおよび機能アッセイの方法を提供している。
【０１１２】
Ａ．ＲＣＣ３５６ポリペプチド
ＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用を利用したアッセイでは、ＲＣＣ３５６ポリペプチドの材料が必要となる。ヒトのＲＣＣ３５６のポリヌクレオチドとポリペプチドの配列を本明細書の図１に示している。ヒトのＲＣＣ３５６ポリヌクレオチドの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＲ５８１０８５．１でも入手可能であり、米国特許第６，７９０，６３１号で報告されており、参照により本明細書に援用されている。ＲＣＣ３５６ポリペプチド配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース受託番号ｓｐ／Ｑ８ＴＣＢ６／ｏｘｅ１ヒトにも記録されている。関連する配列としては、ＮＭ＿１５２４３０、ＮＰ＿６８９６４３、ＡＹ７７５７３１、ＡＡＶ５４１１０．１、ＡＢ０６５７８７、ＢＡＣ０６００６、ＢＫ００４３６９、ＤＡＡ０４７６７、ＡＣ０９０７１９、ＡＬ８３３１２７、ＡＹ６９８０５６、ＡＡＵ０７９９６が挙げられる。
【０１１３】
当業者であれば、既知の配列から設計されたプライマーまたはプローブを利用した基本的なＰＣＲおよび分子クローニング技術によって、該タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むサンプルからＲＣＣ３５６配列を容易に増幅できる。また、ＯＲ遺伝子はイントロンを含まない遺伝子であるため、当業者であればゲノムＤＮＡからＲＣＣ３５６配列を増幅できる。
【０１１４】
組換えポリペプチドの発現は、該技術分野においては周知である。当業者であれば、本発明に従って、真核細胞または原核細胞において有用なＲＣＣ３５６ポリペプチドの発現のためのベクターおよび発現制御配列を容易に選択できる。結合機能またはシグナル伝達機能を有するには、ＲＣＣ３５６は、細胞膜または合成リポソームのような界面活性剤と結合する必要がある。 細胞膜画分の調製方法は、該技術分野においては周知であり（例、Hubbard & Cohn, 1975, J. Cell Biol.64: 461-479において報告されている方法）、参照により本明細書に援用されている。ＲＣＣ３５６を含む膜を調製するためには、内因的に、もしくは組換え技術によってＲＣＣ３５６を発現している細胞に該技術を適用するだけでよい。または、膜を含まないＲＣＣ３５６は、ポリペプチドの界面活性剤液の希釈によって膜調製物中に組み込まれる(Salamon ら, 1996, Biophys.J.71 :283-294を参照。この文献は参照により本明細書に援用されている）。
【０１１５】
Ｂ．イソ吉草酸
イソ吉草酸の構造は当業者には周知である。また、当業者であれば、前記構造から容易に同等の酸を生じさせて、前記等価体がＲＣＣ３５６受容体に結合および／または調節可能あるか否かを容易に試験できる。イソ吉草酸およびその等価体は、天然試料または化学合成されたサンプルから分離できる。
【０１１６】
前記酸の定量に利用可能な方法として、a）抽出および精製には、溶媒抽出、油抽出、蒸気抽出、ＣＯ２超臨界抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留、ガスクロマトグラフィー、b）定量には、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、該方法の実施方法を知っている。
【０１１７】
イソ吉草酸またはその等価体は、精製して、もしくは組成物として使用されうる。本発明の任意の結合アッセイまたは機能アッセイに必要な酸の量はアッセイに応じて変わるが、通常、１回のアッセイ当たり標識済みの酸０．１μｍから１００μＭ、および未標識の酸１０μＭから１ｍＭを使用する。ＲＣＣ３５６に対する修飾イソ吉草酸分子の親和性およびＥＣ５０は元のイソ吉草酸とは変わるため、所与のアッセイにおいて必要な量は正常値に応じて調整できる。所与のアッセイにおいて必要な場合、上記の通りに、放射線標識ラベルの取り込みまたは添加によってイソ吉草酸を標識可能である。
【０１１８】
Ｃ．ＲＣＣ３５６活性の調節因子を同定するためのアッセイ
イソ吉草酸がＲＣＣ３５６受容体のリガンドであるとの発見によって、受容体活性のアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイが可能となる。スクリーニングアッセイには通常２つのアプローチが存在する。
【０１１９】
１）ＲＣＣ３５６発現細胞、該細胞の膜抽出物、ＲＣＣ３５６を含む固定化脂質膜を標識イソ吉草酸および候補化合物に暴露させるリガンド結合アッセイ。インキュベーション後、反応混合物における標識イソ吉草酸とＲＣＣ３５６受容体との特異的結合を測定する。標識イソ吉草酸を妨げる、もしくは置換する化合物は、ＲＣＣ３５６活性のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストでありうる。機能アッセイを実施して、陽性化合物がこれらのどれに分類されるかを判定可能である。
【０１２０】
化合物の結合は３つの主なカテゴリー（競合的結合、非競合的結合、不競合的結合）に分類できる。競合的結合化合物は二次（対照）化合物と似ており、標的分子（ここでは受容体）の同じ結合ポケットに結合する。添加時、競合的結合化合物は、前記標的から前記二次化合物を置換する。非競合的結合化合物は、二次（対照）化合物として標的分子の同じ結合ポケットに結合することはないが、前記標的分子上で前記二次化合物の作用と相互作用しうる。非競合的結合化合物の添加時、二次化合物は置換されない。二次化合物が既に結合している場合、不競合的結合化合物は標的分子に結合する。共同的結合は、任意の化合物が、対照化合物となりうる別の化合物の結合を促進することを意味する。このように、共同的効果は、前記他の化合物のＫｄアッセイにおいて認められる。
【０１２１】
２）ＲＣＣ３５６のシグナル伝達活性を測定する機能アッセイ
【０１２２】
ａ）アゴニストのスクリーニングにおいて、ＲＣＣ３５６発現細胞または該細胞から調製された膜を候補化合物とインキュベーションさせて、ＲＣＣ３５６シグナル伝達活性を測定する。イソ吉草酸をアゴニストとして使用してアッセイを検証し、受容体活性を調節する化合物によって誘発される活性をイソ吉草酸によって誘発される活性と比較する。アゴニストおよび部分的アゴニストは、該アゴニストおよび部分的アゴニストが１００（０）μＭ以下で存在する場合、イソ吉草酸の２、５、１０倍以上の活性を含め、イソ吉草酸の最高活性の少なくとも１０％、好ましくは、５０％、７５％、１００％に相当する最高生物活性を有する。
【０１２３】
ｂ）アンタゴニストまたはインバースアゴニストのスクリーニングでは、ＲＣＣ３５６発現細胞または該細胞から分離した膜について、候補化合物を伴う、もしくは伴わない、イソ吉草酸の存在下におけるシグナル伝達活性をアッセイした。アンタゴニストまたはインバースアゴニストは、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを欠く反応と比較して、イソ吉草酸によって刺激された受容体活性のレベルを少なくとも１０％低下させる。
【０１２４】
ｃ）インバースアゴニストのスクリーニングでは、候補化合物の存在下および非存在下において受容体活性を測定する機能アッセイにおいて、構成的ＲＣＣ３５６発現細胞または該細胞から分離した膜を使用する。インバースアゴニストは受容体の構成的活性を少なくとも１０％低下させる化合物である。ＲＣＣ３５６の過剰発現は、構成的活性化をもたらしうる。ＲＣＣ３５６は、強力な構成的プロモーター（例、ＣＭＶ初期プロモーター）の制御下に置かれることで過剰発現させることができる。または、保存されたＧＰＣＲのアミノ酸またはアミノ酸ドメインにおけるある種の突然変異が構成的活性化を招く傾向がある。 例えば、Kjelsberg ら, 1992, J. Biol. Chem. 267:1430; McWhinney ら, 2000. J. Biol. Chem. 275:2087; Ren ら, 1993, J. Biol. Chem. 268:16483; Samama ら, 1993, J. Biol. Chem 268:4625; Parma ら, 1993, Nature 365:649; Parma ら, 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 286:85; Parent ら, 1996, J. Biol. Chem. 271 :7949を参照されたい。
【０１２５】
リガンド結合および置換アッセイ：
イソ吉草酸とＲＣＣ３５６との結合を抑制する化合物をスクリーニングするために、イソ吉草酸とともに、細胞上で発現しているＲＣＣ３５６ポリペプチド、または受容体ポリペプチドを含む分離膜を利用可能である。結合またはイソ吉草酸の置換のみを測定するアッセイにおいて同定された場合、それらを機能試験にかけて化合物がアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストのいずれとして作用するかを判定する必要がある。
【０１２６】
置換実験において、ＲＣＣ３５６ポリペプチド発現細胞（通常、１回のアッセイまたは膜抽出物１〜１００μｇ当たり細胞２５，０００個）を、漸増濃度の候補調節因子の存在下または非存在下において、標識イソ吉草酸と一緒に、結合バッファー（例、50mM Hepes pH 7.4、1mM CaCl2、脂肪酸を含まない0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.5mM MgCl2)中で１．５時間（例えば２７℃で）インキュベートさせる。アッセイを検証して、較正するために、漸増濃度の未標識イソ吉草酸を使用した対照の競合反応を実施可能である。インキュベーション後、細胞を十分に洗浄して、結合した標識イソ吉草酸の特定の標識をそれぞれに見合った方法（例、シンチレーション計数、酵素アッセイ、蛍光など）で測定する。候補調節因子の存在下における標識イソ吉草酸の結合量の少なくとも１０％の低下は、候補調節因子による結合の置換を示している。仮に候補調節因子が１００μＭ以下の濃度（つまり、ＥＣ５０が１００μＭ以下）で標識イソ吉草酸（飽和量未満のイソ吉草酸）の５０％を置換する場合、該調節因子は該アッセイまたは本明細書に記載の他のアッセイにおいて特異的に結合すると考えられる。
【０１２７】
または、結合または結合の置換は、表面プラズモン共鳴(SPR)によってモニター可能である。表面プラズモン共鳴アッセイは、水層からセンサー上の膜内に固定されたＲＣＣ３５６ポリペプチドへのイソ吉草酸の結合または結合の喪失によって生じる固定化センサー付近での質量変化による、２つの分子間での結合の定量的測定法として使用可能である。この質量変化は、イソ吉草酸または候補調節因子の注入または除去後での時間に対する共鳴単位として測定され、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ(Biacore AB)を使用して測定される。ＲＣＣ３５６は、Salamonらの記述した方法に従って、薄膜脂質膜内のセンサーチップ（例、研究グレードのＣＭ５チップ；Biacore AB）上に固定可能である。(Salamon ら, 1996, Biophys J. 71 : 283-294; Salamon ら, 2001 , Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon ら, 1999, Trends Biochem. Sci.24: 213-219。これらの各文献は参照により本明細書に援用されている)。Sarrioらは、チップ上の脂質層内に固定化したＧＰＣＲ Ａ（１）アデノシン受容体へのリガンド結合を検出するために、ＳＰＲを使用可能であることを実証した(Sarrio ら, 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174。文献は参照により本明細書に援用されている)。ＳＰＲアッセイにおいてイソ吉草酸がＲＣＣ３５６に結合する条件は、開始点として、Sarrioらが報告した条件を利用して、当業者によって微調整可能である。
【０１２８】
ＳＰＲでは、少なくとも２つの方法で結合する調節因子をアッセイできる。第一に、イソ吉草酸を固定化ＲＣＣ３５６ポリペプチドに前もって結合させた後、流速約１０μＬ／分、濃度１ｎＭから１０００μＭ、好ましくは約１００μＭで候補調節因子を注入可能である。結合したイソ吉草酸の置換を定量して、調節因子の結合の検出を可能にする。または、膜結合ＲＣＣ３５６ポリペプチドを候補調節因子と事前にインキュベーションして、イソ吉草酸で攻撃できる。調節因子への暴露前のチップ上でのイソ吉草酸の結合と比較した、調節因子に暴露後のＲＣＣ３５６へのイソ吉草酸の結合における差によって、結合が実証される。いずれかのアッセイにおいても、候補調節因子の非存在下におけるイソ吉草酸の結合量と比較した、候補調節因子の存在下におけるイソ吉草酸の結合量の１０％以上の低下は、該候補調節因子はＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用を抑制していることを示唆している。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、質量分析またはガスクロマトグラフィーなど、候補調節因子を同定するシステムに接続可能である。
【０１２９】
ＲＣＣ３５６へのイソ吉草酸の結合の抑制を測定するもう１つの方法では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が利用される。ＦＲＥＴは、蛍光ドナー(Ｄ)の放出スペクトルと蛍光アクセプター（Ａ）の励起スペクトルが重なる場合、互いに隣接した（通常、間隔が１００Ａ未満）ＤとＡの間に生じる量子力学的現象である。被験分子（例、イソ吉草酸、ＲＣＣ３５６ポリペプチド）は、ドナーとアクセプターのフルオロフォアの相補的対合で標識される。ＲＣＣ３５６：イソ吉草酸の相互作用に起因して互いに隣接している間、ドナーのフルオロフォアの励起時に放出される蛍光は、分子が結合していない時にその励起波長に反応して放出される蛍光とは異なる波長を有しており、各波長での発光強度の測定によって結合ポリペプチド対未結合ポリペプチドが定量される。標的分子を標識するためのフルオロフォアのドナー：アクセプターは該技術分野において周知である。
【０１３０】
ＦＲＥＴにおける変化では、分子間相互作用をモニターするために蛍光クエンチングが利用される。相互作用対の一方の分子をフルオロフォアで標識可能であり、他方は、隣接して付加した場合にフルオロフォアの蛍光をクエンチングさせる分子で標識可能である。励起時の蛍光変化は、フルオロフォア：クエンチャー対のタグを付けた分子結合における変化を示唆する。通常、標識ＲＣＣ３５６ポリペプチドの蛍光の増大は、クエンチャーの付いたイソ吉草酸が置換されていることを示唆する。クエンチングアッセイにおいて、候補調節因子を含まないサンプルと比較した、候補調節因子を含むサンプル中での蛍光発光強度の１０％以上の増大は、候補調節因子が、ＲＣＣ３５６：イソ吉草酸との相互作用を阻害していることを示唆する。
【０１３１】
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)は、インビボでの分子内相互作用をモニターするシステムである。アッセイは、ウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)の含む融合タンパク質と、例えば黄色蛍光タンパク質(YPF)または緑色蛍光タンパク質(GFP)との間の非放射エネルギー移動に基づいている。ＢＲＥＴシグナルは、コエレンテラジン派生物基質の酸化によって生じる。該システムでは、アクセプターとして、細胞透過性、非毒性コエレンテラジン派生物基質であるDeepBleuC（商標）(DBC)および緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異体が適用されうる。ドナーとアクセプターが近傍にある場合、ＤＢＣの接触分解から生じるエネルギーが、ＲｌｕｃからＧＦＰに移され、固有の波長の蛍光を放つ。この方法によって、フルオロフォアの角度とは無関係に、２つの被験分子間の距離が増大される。
【０１３２】
表面プラズモン共鳴およびＦＲＥＴ／ＢＲＥＴ法に加えて、蛍光偏光測定はイソ吉草酸-受容体結合の定量に有用である。蛍光タグ付き分子の蛍光偏光度は、回転相関またはタンブリング速度に左右される。蛍光標識されたイソ吉草酸とＲＣＣ３５６との結合によって形成される複合体などのタンパク質複合体の偏光度は、複合体を形成しないイソ吉草酸の偏光度よりも高い。ＲＣＣ３５６：イソ吉草酸の相互作用の候補抑制剤を含むことで、候補阻害剤がＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用を破壊または抑制する場合、候補抑制剤を含まない混合物と比較して、蛍光偏光は低下する。蛍光偏光は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体の形成を破壊する低分子の同定に適切である。候補調節因子を含まないサンプル中での蛍光偏光と比較した、候補調節因子を含むサンプル中での蛍光偏光における１０％以上の低下は、候補調節因子がＲＣＣ３５６：イソ吉草酸の相互作用を抑制することを示唆している。
【０１３３】
ＲＣＣ３５６：イソ吉草酸の相互作用をモニタリングするためのもう１つの代替法では、バイオセンサーアッセイを利用する。ＩＣＳバイオセンサーについてはＡＭＢＲＩによって記載されている(Australian Membrane Biotechnology Research Institute; http//www.ambri.com.au/)。この技術において、ＲＣＣ３５６やイソ吉草酸などの分子の結合は、浮遊膜二重層のグラミシジン促進イオンチャンネルの閉鎖、ひいてはバイオセンサーのアドミタンス（インピーダンスと類似）における測定可能な変化と関連している。このアプローチは、６桁のアドミタンス変化量に及んで線形であり、低分子のコンビナトリアルライブラリーの大規模ハイスループットスクリーニングには理想的に適合する。候補調節因子を含まないサンプルのアドミタンスと比較した、候補調節因子を含むサンプルでのアドミタンスにおける１０％以上の変化（上昇または低下）は、候補調節因子がＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用を阻害することを示している。
【０１３４】
酸−タンパク質間での相互作用のアッセイでは、該相互作用の調節因子が、物理的に相互作用するタンパク質のドメインと必ずしも直接的に相互作用しなくても構わないことに注意することが重要である。調節因子は、酸‐タンパク質の相互作用部位とは離れた場所で相互作用して、例えば、ＲＣＣ３５６ポリペプチド内の構造変化を起こすことも可能である。それでも、この様式で作用する調節因子（阻害剤またはアゴニスト）は、ＲＣＣ３５６の活性を調節する薬剤として興味深い。
【０１３５】
サンプル（例、ＲＣＣ３５６受容体に結合する、もしくは該受容体へのイソ吉草酸の結合に影響を及ぼす組織サンプル）中での薬剤の存在を判定するために、記載されているいずれの結合アッセイも利用できる。この目的のために、該サンプルの存在下または非存在下において、ＲＣＣ３５６ポリペプチドをイソ吉草酸または別のリガンドと反応させて、利用した結合アッセイに応じた方法によってイソ吉草酸またはリガンドの結合を測定する。イソ吉草酸または他のリガンドの結合における１０％以上の低下は、該サンプルが受容体ポリペプチドへのイソ吉草酸またはリガンドの結合を調節する薬剤を含んでいることを示唆する。
【０１３６】
タンパク質チップ
本発明の方法はタンパク質チップに適用できる。前記タンパク質チップは、ガラススライドまたはニトロセルロース膜でありうるが、これらに限定されない。タンパク質チップ用のアレイ法は、該技術分野において周知である。
【０１３７】
受容体活性の機能アッセイ
ｉ．ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合アッセイ
ＲＣＣ３５６などのＧＰＣＲについて、受容体活性の測定は、受容体を含む細胞膜によるＧＴＰの結合である。参照により本明細書に援用されている、Traynor and Nahorski, 1995, MoI.Pharmacol.47: 848-854に記述の方法では、基本的に、標識ＧＴＰの結合を測定することでＧタンパク質の膜への結合を測定する。ＧＴＰ結合アッセイにおいては、受容体を発現する細胞の分離膜を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、８０ｐＭ ３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、３μＭ ＧＤＰを含むバッファー中でインキュベートさせる。アッセイ混合物を３０℃で６０分間インキュベートさせ、その後、未結合の標識ＧＴＰをＧＦ／Ｂフィルター上でのろ過によって除去する。結合標識ＧＴＰは液体シンチレーション計数で測定する。イソ吉草酸によって誘発された ＲＣＣ３５６活性の調節をアッセイするために、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞から調製された膜をイソ吉草酸と混合して、ＲＣＣ３５６活性の候補調節因子の存在下および非存在下においてＧＴＰ結合アッセイを実施する。候補調節因子を含まないアッセイと比較した、該候補調節因子を含むこの種のアッセイでのシンチレーション計数によって測定された標識ＧＴＰ結合における１０％以上の低下は、候補調節因子がＲＣＣ３５６活性を抑制することを示唆する。
【０１３８】
イソ吉草酸を含まない同様のＧＴＰ結合アッセイを実施して、アゴニストとして作用する化合物を同定できる。この場合、イソ吉草酸によって促進されたＧＴＰ結合が標準として使用される。化合物が１ｍＭ以下存在する際、該化合物がイソ吉草酸によって誘発されるＧＴＰ結合レベルの少なくとも５０％を誘発させる、また好ましくはイソ吉草酸によって誘発される以上のレベルを誘発する場合、化合物はアゴニストと見なされる。
【０１３９】
γ３２Ｐ−ＧＴＰ標識ＲＣＣ３５６ポリペプチドを含む膜をインキュベーションさせてＧＴＰａｓｅ活性を測定する。活性型ＧＴＰａｓｅは無機リン酸として標識を放出させ、これは２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４中の５％活性炭浮遊液における遊離の無機リン酸の分離によって検出され、シンチレーション計数にかけられる。候補化合物で起こり得る非特異的作用を除外するために、対照にはＲＣＣ３５６非発現細胞（ｍｏｃｋ導入）からの分離膜を使用したアッセイが含まれる。
【０１４０】
ＲＣＣ３５６によって制御されるＧＴＰａｓｅ活性に及ぼす候補調節因子の作用をアッセイするために、該調節因子を含む、もしくは含まないイソ吉草酸と一緒に膜サンプルをインキュベートさせた後、ＧＴＰａｓｅアッセイを実施する。調節因子を含まないサンプルと比較した、ＧＴＰ結合またはＧＴＰａｓｅ活性のレベルにおける１０％以上の変化（上昇または低下）は、候補調節因子によるＲＣＣ３５６調節を示唆する。
【０１４１】
ｉｉ 下流経路の活性化アッセイ：
ａ．カルシウム流束− エクオリンアッセイ
エクオリンアッセイでは、ＧＰＣＲの活性化によって誘発される細胞内でのカルシウム流束またはカルシウム流束（入口）に対するミトコンドリアまたは細胞質のアポエクオリンに対する反応性を上手く利用する（Stables ら, 1997, Anal.Biochem.252:115-126;Detheux ら, 2000, J. Exp.Med., 192 1501-1508; いずれの文献も参照により本明細書に援用されている）。簡単に説明すると、ミトコンドリアまたは細胞質のアポエクリオンおよびＧα１６またはＧ−ｏｌｆを同時発現するように、ＲＣＣ３５６を表現するクローンにトランスフェクションする。細胞を５μＭコエレンテラジンＨまたは派生物（Molecular Probes）と一緒に４時間室温でインキュベートさせて、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養液で洗い、濃度0.５×１０６細胞個／mLに再浮遊させる。次に細胞を試験アゴニストのペプチドと混合させて、エクオリンによる発光を発光計で３０秒間記録する。結果を相対的な光単位（ＲＬＵ）で表す。候補化合物で起こり得る非特異的作用を除外するために、対照にはＣ３５６非発現細胞（ｍｏｃｋ導入）からの分離膜を使用したアッセイが含まれる。
【０１４２】
Ｃ３５６ポリペプチドを発現しているが、候補調節因子では処理されていない細胞サンプル、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現していないが、候補調節因子で処理された細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しており、候補調節因子で処理された細胞サンプル中での光強度が１０％以上上昇または低下した場合、エクオリン活性または細胞内カルシウム濃度は「変化」している。
【０１４３】
イソ吉草酸の非存在下で実施される場合、アッセイを利用して、ＲＣＣ３５６活性のアゴニストまたはインバースアゴニストを同定可能である。イソ吉草酸の存在下でアッセイを実施する場合、該アッセイをアンタゴニストのアッセイに利用可能である。
【０１４４】
１）ａ Ｆｌｕｏ３、４、Ｆｕｒａ２、Ｃａｌｃｉｕｍ３（Molecular Device）アッセイ
蛍光アッセイでは、受容体の活性化によって引き起こされるカルシウム流束（例えば、ＣＮＧを介したカルシウム流束入または小胞体からのカルシウム放出）を上手く利用している。これらに限定されないが、Ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４、Ｆｕｒａ２（Molecular Probes）、Ｃａｌｃｕｍ３キットシリーズ（Molecular Device）などの一部のフルオロフォアがカルシウムと結合することが知られている。このようなフルオロフォア-カルシウム複合体は、それぞれに固有の周波数で蛍光を発する。これによって、Ｇタンパク質共役受容体の活性化の際、小胞体から放出された、もしくはＣＮＧを介して進入したカルシウムがフルオロフォアに結合して、固有の蛍光を発する。ＲＣＣ３５６を過剰発現している細胞を１−８μＭのフルオロフォア溶液と３７℃で３０−６０分間インキュベートさせる。生理食塩水での十分な洗浄後、細胞（６〜１５３６）を含む各ウェルに同バッファー５０μＬを分注する。次に、該添加細胞上に試験済みアゴニストを注入して、ＲＣＣ３５６の活性化後に蛍光を測定する。
【０１４５】
Ｃ３５６ポリペプチドを発現しているが、候補調節因子では処理されていない細胞サンプル、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現していないが、候補調節因子で処理された細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しており、候補調節因子で処理された細胞サンプル中での蛍光強度が１０％以上上昇または低下した場合、細胞内カルシウム濃度は「変化」している。
【０１４６】
２）脱分極／過分極膜アッセイ（例、DiBacフルオロフォア）
該アッセイの原理は、細胞膜の脱分極に従うはずである。陰イオン性プローブＤｉＢＡＣ４（３）は、膜電位依存的に細胞内、細胞外区画に分かれる。膜電位の上昇（脱分極）に伴い、プローブはさらに細胞内に分かれて、蛍光を増大させる。逆に、過分極は、染料の押し出しのために蛍光を減弱させる。
【０１４７】
ＤｉＢＡＣ４（３）プローブは波長４８８ｎｍで励起され、波長５４０ｎｍで発光する。
【０１４８】
実験当日、アッセイバッファー（生理食塩水バッファー）に最終濃度１０ｍＭのグルコースおよび最終濃度５μＭのＤｉＢＡＣ４（３）プローブを添加する。アッセイバッファーを３７℃に維持する。細胞培養液を除いて、ＲＣＣ３５６過剰発現細胞を含む各ウェルを予め加熱したアッセイバッファー２００μＬで２回洗い流す。ＤｉＢＡＣ４（３）を含むアッセイバッファー１８０μＬを加えて、適当な温度で細胞を３０分間インキュベートする。３０分後には細胞プレートはアッセイに使用できる。添加２分前にベースラインを収集する。適当なウェルに候補調節因子２０μＬを添加して、さらに２５分間のデータを収集する。
【０１４９】
Ｃ３５６ポリペプチドを発現しているが、候補調節因子では処理されていない細胞サンプル、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現していないが、候補調節因子で処理された細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しており、候補調節因子で処理された細胞サンプル中での蛍光強度が１０％以上上昇または低下した場合、膜分極は「変化」している。
【０１５０】
３）メラノフォアアッセイ メラノフォアアッセイは色によるアッセイである。基本的に、このアッセイに使用される細胞は、アフリカツメガエルの皮膚に由来している。これらの不死化細胞はメラニン小体を含んでおり、メラニン小体は黒色色素を含む細胞小器官である。アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣの活性化を引き起こす内因性または組換えＧＰＣＲの活性化は、メラニン小体を分散させて、細胞を黒くする。または、アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣを抑制するＧＰＣＲは細胞の色を薄くする。これによって、セカンドメッセンジャーの濃度測定の代わりに、細胞の色の変化を観察することでヒットを容易に特定できる。この色の変化は、６５０ｎＭでの吸光度を測定するマイクロリーダーで、もしくはビデオ画像システムでの検査によって容易に定量化できる。
【０１５１】
ｂ．アデニル酸シクラーゼ
アデニル酸シクラーゼ活性のアッセイについては、Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol.Pharmacol.20: 585-591に記述されており、この文献は参照により本明細書に援用されている。このアッセイは、Solomon ら、 1974、 Anal.Biochem.58: 541-548で説明されているアッセイの変法であり、この文献は参照により本明細書に援用されている。簡単に説明すると、１００μＬの反応液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH 7.5)、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ クレアチンリン酸（ジナトリウム塩）、クレアチン、ホスホキナーゼ１０ユニット（タンパク質７１μｇ）、１ｍＭ α−３２Ｐ−ＡＴＰ （四ナトリウム塩２μＣｉ）、０．５ｍＭ ｃＡＭＰ、Ｇ３Ｈ標識ｃＡＭＰ（約１０，０００ｃｐｍ）、０．５ｍＭ Ｒｏ２０−１７２４、０．２５％エタノール、被験タンパク質ホモジネート（ＲＣＣ３５６ポリペプチド発現／未発現、イソ吉草酸処理／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞のホモジネート）５０〜２００μｇを含んでいる。 通常、反応混合物を３７℃で６分間インキュベートする。インキュベーション後、反応混合物に６％冷三塩化酢酸０．９ｍＬを添加してタンパク質を除去する。チューブを１８００ｘｇで２０分間遠心分離にかけて、各上精をＤｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４カラムに加える。カラムからのｃＡＭＰ画分を４ｍＬの０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカウンターバイアル内に溶出させる。アッセイは３回行う。ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しない細胞のタンパク質ホモジネートを使用して対照反応も行う必要がある。
【０１５２】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子による非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１５３】
本発明によると、候補調節因子では処理されていない細胞サンプル、またはＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現していないが、候補調節因子で処理された細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６活性の候補調節因子で処理された細胞サンプル中でアデニル酸シクラーゼ活性が１０％以上上昇または低下した場合、アデニル酸シクラーゼ活性は「変化」している。または、対照化合物で処理されたサンプル中におけるＲＣＣ３５６の候補調節因子による１０％以上の活性低下を試験できる。
【０１５４】
ｃ．ｃＡＭＰアッセイ：
ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ(RIA)を利用して細胞内ｃＡＭＰを、もしくは該技術分野において周知の方法に従ってｃＡＭＰ結合タンパク質を測定する。例えば、Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol.Biol.41:91-105においてｃＡＭＰに関するＲＩＡについて記述されており、この文献は参照により本明細書に援用されている。
【０１５５】
LJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsが販売しているHigh Efficiency Fluorescence Polarization-based homogeneous assayなどの多くのｃＡＭＰ測定用キットが市販されている。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１５６】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子による非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１５７】
候補調節因子で処理されていない同様の細胞におけるｃＡＭＰと比較して、上記のHorton & Baxendale(1995)のＲＩＡアッセイを利用して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しているＲＣＣ３５６活性の候補調節因子で処理された細胞（またはその抽出物）で検出されるｃＡＭＰ濃度が１０％以上上昇または低下した場合、ｃＡＭＰ濃度は「変化」している。
【０１５８】
ｄ．リン脂質の分解、ＤＡＧ産生、イノシトール三リン酸濃度：
リン脂質の分解、および結果としてもたらされるセカンドメッセンジャーであるＤＡＧおよび／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の産生をモニタリングすることで、既知の、もしくは予想されるＲＣＣ３５６調節因子の活性に起因する変化について、リン脂質の分解を活性化させる受容体をモニターできる。これらの各測定方法は、Ian M. Bird.Totowa(NJ1 Humana Press)が編集したPhospholipid Signaling Protocols(1998年)に記載されており、この文献は参照により本明細書に援用されている。本明細書において援用される、ホスファチジルイノシトールのアッセイについても記述しているRudolph ら, 1999, J. Biol.Chem.274: 11824-11831も参照されたい。ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１５９】
本発明によると、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しているが、候補調節因子で処理されていない細胞サンプル（ｍｏｃｋ導入細胞）と比較して、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現しており、イソ吉草酸の存在下または非存在下において候補調節因子で処理された細胞サンプル中においてホスファチジルイノシトール分解、およびジアシルグリセロールおよび（または）イノシトール三リン酸濃度が少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、それらは「変化」している。
【０１６０】
ｅ．ＰＫＣ活性化アッセイ：
増殖因子の受容体であるチロシンキナーゼは、リン脂質、カルシウムで活性化されるプロテインキナーゼのファミリーであるプロテインキナーゼＣ(PKC)の活性化を含む経路を介してシグナル伝達を行う傾向がある。ＰＫＣ活性化は、最終的には、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎなどの一連のプロトオンコジーン転写因子、コラゲナーゼＩ型およびプラスミノゲンアクチベータインヒビターなどのプロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビター、そして細胞内接着分子Ｉ(ICAM I)などの接着分子をコードする遺伝子の転写をもたらす。ＰＫＣによって誘発される遺伝子産物の増加を検出するように設計されたアッセイを利用して、ＰＫＣ活性化、ひいては受容体活性をモニターできる。また、ＰＫＣを介してシグナル伝達を行う受容体の活性は、ＰＫＣ活性化によって活性化される遺伝子の制御配列によって促進されるレポーター遺伝子の利用によってモニター可能である。このタイプのリポーター遺伝子アッセイについては、以下で詳述されている。
【０１６１】
ＰＫＣ活性のより直接的な測定には、参照により本明細書に援用されている、Kikkawa ら、 1982、 J. Biol.Chem.257: 13341に記述されている方法を利用可能である。このアッセイによって、ＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化が測定され、これはその後ホスホセルロースペーパーへの結合によって分離される。このＰＫＣアッセイ系を利用して、精製キナーゼの活性、または細胞粗抽出物における活性を測定できる。プロテインキナーゼＣサンプルは、アッセイ直前に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ ＤＴＴで希釈可能である。
【０１６２】
アッセイ用基質は、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク質(MARCKS)由来のペプチドＡｃ−ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２（配列番号：２）である。このペプチドに対する酵素のＫｍは約５０μＭである。該技術分野において周知の他の塩基性のプロテインキナーゼＣ選択的ペプチドも、Ｋｍの少なくとも２〜３倍の濃度で使用可能である。アッセイに必要な補因子としてカルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロールが含まれる。使用者の目的に応じて、存在するＰＫＣ量（活性化条件）または存在する活性型ＰＫＣ量（非活性化条件）を測定するためにアッセイを実施可能である。本発明の大半の目的のために、活性化可能なＰＫＣの測定ではなく、分離時にサンプル中で活性であるＰＫＣを測定するために、非活性化条件を利用する。非活性化条件では、ＥＧＴＡを使用するために、アッセイにおいてカルシウムを除外する。
【０１６３】
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、１−２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ ＡＴＰ、〜１μＣｉγ−３２Ｐ−ＡＴＰ、１００μｇ／ｍＬペプチド基質（〜１００μＭ）、１４０μＭ／３．８μＭホスファチジルセリン／ジアシルグリセロール膜、１００μＭカルシウム（好ましくは５００μＭ ＥＧＴＡ）を含む混合物中でアッセイを実施する。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、２ｍＭ ＤＴＴで希釈した４８μＬサンプルを最終反応量８０μＬで使用した。３０℃で５〜１０分間、反応を行い、２５μＬの１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０を添加して反応を停止させた。
【０１６４】
反応停止後、各反応の一部（８５μＬ）をＷｈａｔｍａｎ Ｐ８１セルロースリン酸フィルター上にスポットして、０．４％リン酸５００ｍＬ中で４回（５〜１０分間／回）、そして最後に９５％ＥｔＯＨ５００ｍＬ中で２〜５分間洗う。結合している放射活性をシンチレーション計数によって測定する。標識ＡＴＰの比放射能（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）は、Ｐ８１ペーパー上に反応サンプルをスポットして、洗浄せずに計数することで測定される。１分間に転移したリン酸（ｎｍｏｌ）で定義される、ＰＫＣ活性の単位を以下のように計算する：
【０１６５】
活性単位（ｎｍｏｌ／分）＝（ペーパー上のｃｐｍ） ｘ （計１０５μＬ／スポット８５μＬ）（アッセイ時間、分）（ＡＴＰの比放射能ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）
【０１６６】
ＰａｎＶｅｒａ社が販売しているＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号P2747）を使用して、代わりのアッセイを実施可能である。
【０１６７】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１６８】
本発明によると、候補調節因子で処理されていない同様のサンプルで実施された反応と比較して、候補調節因子で処理されたＲＣＣ３５６発現細胞の抽出物において上記のいずれかのアッセイによって測定されるＰＫＣ単位が少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、ＰＫＣ活性は「変化」している。
【０１６９】
ｆ．ＰＫＡ活性化アッセイ
ＰＫＡ活性は、例えば、Molecular Device社のIMAP PKAアッセイキットまたはPromega社のProFluor PKAアッセイキットなど、市販のいくつかのキットを使用してアッセイ可能である。
【０１７０】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１７１】
候補調節因子で処理されていない同様のサンプルでのＰＫＡキナーゼ活性と比較して、候補調節因子で処理されたＲＣＣ３５６ポリペプチド発現細胞のサンプルにおいて活性レベルが少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、ＰＫＡ活性は「変化」している。
【０１７２】
ｇ．キナーゼアッセイ
例えば、New England Biolabs社が販売しているp38 MAP Kinaseアッセイキット(カタログ番号9820)またはPerkin-Elmer Life Sciences社が販売しているFlashPlate(商標) MAP Kinaseアッセイキットなど、市販のいくつかのキットを使用してＭＡＰキナーゼ活性のアッセイが可能である。
【０１７３】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１７４】
候補調節因子で処理されていない同様のサンプルでのＭＡＰキナーゼ活性と比較して、候補調節因子で処理されたＲＣＣ３５６ポリペプチド発現細胞のサンプルにおいて活性レベルが少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、ＭＡＰキナーゼ活性は「変化」している。
【０１７５】
既知の合成または天然のチロシンキナーゼ基質および標識リン酸を使用したチロシンキナーゼの直接アッセイは周知であり、他の種類のキナーゼ（例、Ser/Thrキナーゼ）に対する同様のアッセイも周知である。ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞の精製キナーゼおよび粗抽出物のいずれを使用してもキナーゼアッセイを実施可能である。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。基質は、完全長のタンパク質または基質を示す合成ペプチドのいずれでも可能である。Pinna & Ruzzene (1996, Biochem.Biophys.Acta 1314: 191-225、参照により本明細書に援用されている）には、キナーゼ活性の測定に有用な多数のリン酸化基質部位が掲載されている。多数のキナーゼ基質が市販されている。特に有用な基質は、「Ｓｒｃ関連ペプチド」（シグマから入手可能なＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（配列番号：１）＃Ａ７４３３）であり、これは多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である。後述のアッセイではペプチド基質のフィルターへの結合が必要であるため、ペプチド基質が正味の正電荷を有しており、結合を促進させる必要がある。通常、ペプチド基質は少なくとも２つの塩基性残基および遊離のアミノ末端を有する必要がある。反応では通常、ペプチド濃度０．７〜１．５ｍＭが利用される。
【０１７６】
通常、５μＬの５Ｘキナーゼバッファー（５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２；アッセイされる正確なキナーゼに応じて、ＭｇＣｌ２の代わりに、もしくは追加でＭｎＣｌ２を使用可能である）、５μＬの１．０ｍＭ ＡＴＰ（最終濃度０．２ｍＭ）、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（１００〜５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、３μＬの１０ｍＭペプチド基質（最終濃度１．２ｍＭ）、被験キナーゼを含む細胞抽出物（キナーゼアッセイに使用する細胞抽出物はホスファターゼ阻害剤（例、０．１〜１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）を含む必要がある）、Ｈ２Ｏ（２５μＬにする）を含む２５μＬ量でアッセイを実施する。反応は３０℃で実施して、細胞抽出物の添加によって開始させる。
【０１７７】
キナーゼ反応を３０秒間から約３０分間実施後、氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）４５μＬを添加する。サンプルを２分間微量遠心機にかけて、３５μＬの上精をＷｈａｔｍａｎ Ｐ８１セルロースリン酸フィルターサークル上にスポットする。フィルターを０．５％冷リン酸５００ｍＬで３回洗った後、室温のアセトン２００ｍＬで５分間１回洗う。フィルターを乾燥させて、取り込まれた３２Ｐをシンチレーション計数によって測定する。キナーゼ反応中のＡＴＰの比放射能（例、cpm/pmol）は、 少量の反応サンプル（２〜５μＬ）をＰ８１フィルターサークル上にスポットして、洗わずに直接計数して測定する。次に、キナーゼ反応（ブランクマイナス）において得られたｃｐｍを比放射能で割って、反応中に転移したリン酸のモル数を決定する。
【０１７８】
ＲＣＣ３５６を発現する、イソ吉草酸処理済／未処理、候補調節因子含有／不含の細胞または細胞抽出物を使用してアッセイを行う必要がある。一部の候補調節因子によって起こり得る非特異的作用を除外するために、ｍｏｃｋ移入細胞またはその抽出物を使用して対照反応を行う必要がある。
【０１７９】
候補調節因子で処理されていない同様のサンプルでのチロシンキナーゼ活性と比較して、候補調節因子で処理されたＲＣＣ３５６ポリペプチド発現細胞のサンプルにおいて活性レベルが少なくとも１０％以上上昇または低下した場合、チロシンキナーゼ活性は「変化」している。
【０１８０】
ｈ．下流経路の活性化に関する転写リポーター：
受容体に対するアゴニスト（例、ＲＣＣ３５６）の結合によって開始される細胞内シグナルが細胞内事象のカスケードで機能しており、この最終的な結末は1つ以上の遺伝子における転写および／または翻訳の急速かつ検出可能な変化である。したがって、受容体の活性は、ＲＣＣ３５６活性化に応答する制御配列によって促進されるレポーター遺伝子の発現の測定によってモニター可能である。
【０１８１】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、基本プロモーターだけでなく、受容体によって制御される発現に必要な任意のエンハンサーまたは転写因子結合部位も含めた、受容体を介した遺伝子発現の制御に必要な転写調節エレメントに関する。アゴニストの結合に起因する細胞内シグナルに応答性のプロモーターの選択、および転写、翻訳、または最終的な活性が容易に検出かつ測定可能なレポーター遺伝子への選択されたプロモーターの機能的な連結によって、転写レポーターアッセイにおいて特定の受容体が活性化されたか否かが迅速に示される。
【０１８２】
ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子が該技術分野において周知であり、これらの産物の検出アッセイも周知である。
【０１８３】
受容体活性のモニタリングに特に適した遺伝子は「前初期」遺伝子であり、これらは通常、受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの接触後数分以内に迅速に誘導される。前初期遺伝子の転写誘導には、調節タンパク質の新たな合成は必要とされない。リガンド結合への迅速な反応性に加えて、レポーターコンストラクトの作成に有用な好ましい遺伝子の特性として、静止細胞内での低い、または検出不可能な発現、一過性であり、新たなタンパク質合成に依存しない誘導、その後の転写の停止における新たなタンパク質合成の必要性、これらの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの短い半減期が挙げられる。有用であるために、転写調節エレメントがこれらの特性の全てを有することが好ましいが、必要ではない。
【０１８４】
様々な刺激に応答性の遺伝子の一例は、ｃ−ｆｏｓ癌原遺伝子である。ｃ−ｆｏｓ遺伝子は、増殖因子、ホルモン、分化特異的な薬剤、ストレス、他の既知の細胞表面タンパク質の誘導因子により、タンパク質合成非依存的に活性化される。ｃ−ｆｏｓの発現誘導は極めて迅速であり、受容体刺激から数分以内に生じることが多い。この特性のため、受容体活性化のレポーターとしての使用においてｃ−ｆｏｓ調節領域は特に魅力的となっている。
【０１８５】
ｃ−ｆｏｓ調節エレメントとして以下が挙げられる(Verma ら, 1987, Cell 51: 513-514参照)：ＴＡＴＡボックスは転写開始に必要である；基本転写のための２つの上流エレメント、エンハンサーは、二分子対称のエレメントを含み、かつホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート(TPA)、血清、上皮細胞増殖因子(EGF)、ＰＭＡによる誘導に必要とされる。
【０１８６】
ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡキャップ部位の上流−３１７〜−２９８ ｂｐに位置する２０ bpのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサーエレメントは、血清飢餓ＮＩＨ３Ｔ３細胞における血清誘導に必須である。２つの上流エレメントの１つは−６３〜−５７に位置しており、ｃＡＭＰ調節のコンセンサス配列と類似している。
【０１８７】
転写調節因子ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合蛋白）は、名前が示すように、細胞内ｃＡＭＰ濃度に応答する。したがって、ｃＡＭＰ濃度の調節を介してシグナル伝達を行う受容体の活性化は、転写因子の結合、もしくはＣＲＥＢ結合エレメント（ＣＲＥまたはｃＡＭＰ応答エレメントと呼ぶ）と連結されたレポーター遺伝子の発現のいずれかの測定によってモニター可能である。ＣＲＥのＤＮＡ配列はＴＧＡＣＧＴＣＡである。ＣＲＥＢ結合活性に応答性のレポーターコンストラクトは、米国特許第５，９１９，６４９号に記載されている。
【０１８８】
ｃ−ｆｏｓエレメントおよびＣＲＥＢ応答コンストラクトに加えて、他のプロモーターおよび転写調節エレメントとして、血管活性腸管ペプチド(VIP)遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性; Fink ら, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci.85:6662-6666）、ソマトスタチン遺伝子プロモーター(cAMP応答性; Montminy ら, 1986, Proc.Natl.Acad.Sci.8.3:6682-6686)、プロエンケファリンプロモーター（ｃＡＭＰ、ニコチンアゴニスト、ホルボールエステル応答性； Comb ら, 1986, Nature 323:353-356）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性; Short ら, 1986, J. Biol.Chem.261: 9721-9726）が挙げられる。
【０１８９】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答する転写調節エレメントと別の例として、ＡＰ−１転写因子応答性エレメントおよびＮＦ−κＢ活性応答性エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。コンセンサスＡＰ−１結合部位は回文配列ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡである(Lee ら, 1987, Nature 325: 368-372; Lee ら, 1987, Cell 49: 741-752)。ＡＰ−１部位は、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート(TPA)などの腫瘍プロモーターによる誘導媒介にも関与しており、このためＴＲＥ（ＴＰＡ応答性エレメント）と呼ばれこともある。ＡＰ−１は、増殖刺激に対する細胞の初期応答に関与する多数の遺伝子を活性化させる。ＡＰ−１応答遺伝子の例として、ＦｏｓおよびＪｕｎ（これら自体がＡＰ−１活性を形成するタンパク質である）、Ｆｏｓ関連抗原(Fra)１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、アネキシンＩおよびＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
ＮＦ−κＢ結合エレメントはコンセンサス配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号：３）を有する。ＮＦ−κＢ応答性として多数の遺伝子が同定されており、これらの調節エレメントをレポーター遺伝子に連結させてＧＰＣＲ活性をモニター可能である。ＮＦ−κＢ応答性遺伝子の小サンプルとして、ＩＬ−１β(Hiscott ら, 1993, MoI.Cell.Biol.13: 6231-6240)、 ＴＮＦ−α(Shakhov ら, 1990, J. Exp.Med.171 : 35-47)、ＣＣＲ５(Liu ら, 1998, AIDS Res.Hum.Retroviruses 14: 1509-1519)、Ｐ−セレクチン(Pan & McEver, 1995, J. Biol.Chem.270: 23077-23083)、Ｆａｓリガンド(Matsui ら, 1998, J. Immunol.161 : 3469-3473)、ＧＭ−ＣＳＦ(Schreck & Baeuerle, 1990, Mol.Cell.Biol.10: 1281-1286)、ＩκＢα(Haskill ら, 1991, Cell 65: 1281-1289)をコードする遺伝子が挙げられる。これらの各文献は参照により本明細書に援用されている。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをコードするベクターは、該技術分野において周知であるか、もしくは、例えば合成ＮＦ−κＢエレメントおよび最小プロモーターを使用して、またはＮＦ−κＢによる調節を受けることが判明している遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を使用して、当業者が容易に作成できる。さらに、ＮＦ−κＢ応答性レポーターは、例えばCLONTECH社などから販売されている。
【０１９１】
任意のプロモーターコンストラクトについては、該コンストラクトを移入したＲＣＣ３５６発現細胞をイソ吉草酸に暴露させて試験する必要がある。イソ吉草酸に反応したレポーター発現の少なくとも２倍の増加は、該レポーターがＲＣＣ３５６活性の指標であることを示している。
【０１９２】
イソ吉草酸応答性転写レポーターコンストラクトを用いてＲＣＣ３５６活性をアッセイするために、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを安定発現する細胞にレポーターコンストラクトを安定的にトランスフェクションする。アゴニストをスクリーニングするために、未処理細胞を候補調節因子に暴露させるか、もしくはイソ吉草酸に暴露させて、レポーターの発現を測定する。イソ吉草酸で処理した培養物は、既知のアゴニストで誘導される転写レベルの標準として役立つ。調節因子の非存在下におけるレポーターの発現と比較した、候補調節因子の存在下におけるレポーターの発現の少なくとも１０％の増大は、候補がＲＣＣ３５６活性の調節因子であることを示唆する。アゴニストは、イソ吉草酸と少なくとも同量、好ましくは同量以上のレポーター発現を誘導する。部分的アゴニストは、イソ吉草酸と比較して、受容体の活性化は低い可能性がある。このアプローチは、イソ吉草酸または他のアゴニストの非存在下においてレポーターの基礎活性が上昇するようなレベルのＲＣＣ３５６ポリペプチドを細胞が発現する場合、インバースアゴニストのスクリーニングにも利用可能である。候補調節因子の非存在下と比較して、候補調節因子の存在下における１０％以上のレポーター活性の低下は、該化合物がインバースアゴニストであることを示唆している。
【０１９３】
アンタゴニストをスクリーニングするために、ＲＣＣ３５６を発現しており、レポーターコンストラクトを有する細胞を候補調節因子の存在下および非存在下においてイソ吉草酸（または他のアゴニスト）に暴露させる。候補調節因子の非存在下と比較した、候補調節因子の存在下におけるレポーター発現の１０％以上の低下は、該候補がＲＣＣ３５６活性のアンタゴニストであることを示唆している。
【０１９４】
転写アッセイにおける対照として、プロモーターを持たないレポーターコンストラクトの他、ＲＣＣ３５６を発現していないが、レポーターコンストラクトを有する細胞が挙げられる。ＲＣＣ３５６によって制御される転写の調節因子として同定される化合物についても、それらの活性の特異性およびスペクトルを決定するために分析して、それらが他の制御配列および他の受容体によって促進される転写に影響を及ぼすか否かを判断する必要がある。
【０１９５】
転写性リポーターアッセイおよび大半の細胞アッセイは、ＲＣＣ３５６活性を調節する化合物の化学ライブラリーのスクリーニングに適している。ライブラリーは、例えば、天然材料由来のライブラリー（例、植物、動物、細菌など）であるか、もしくは無作為または系統的にイソ吉草酸等価体を含むライブラリーでありうる。
【０１９６】
ｉ．受容体内在化
カルシウム流束、膜分極、メラノフォアアッセイ、ＧＴＰ結合、ＧＴＰａｓｅ、アデニル酸シクラーゼ、ｃＡＭＰ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、ＰＫＣ、ＰＫＡ、キナーゼ、受容体内在化、転写レポーターアッセイなど、受容体活性のアッセイを利用して、サンプル（例、ＲＣＣ３５６受容体分子の活性に影響を及ぼす組織サンプル）中の薬剤の存在を判定できる。この目的のために、サンプルまたはサンプルの抽出物の存在下および非存在下におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性をアッセイする。 サンプルの非存在下と比較した、サンプルの存在下におけるＲＣＣ３５６活性の上昇は、サンプルが受容体活性のアゴニストを含むことを示している。イソ吉草酸のみの存在下における受容体活性と比較して、イソ吉草酸または他のアゴニストとサンプルの存在下における受容体活性の低下は、サンプルがＲＣＣ３５６活性のアンタゴニストを含むことを示している。必要に応じて、次にサンプルを画分して、さらに試験してアゴニストまたはアンタゴニストを分離または精製できる。サンプルが調節因子を含んでいると言えるために必要な活性の測定値における上昇または低下は、利用したアッセイの種類に左右される。通常、サンプルの非存在下において実施したアッセイと比較した、１０％以上の変化（上昇または低下）は、サンプル中の調節因子の存在を示唆する。１つの例外は転写レポーターアッセイであり、このアッセイにおいてサンプルが調節因子を含んでいると言えるには少なくともシグナルの２倍の上昇または１０％の低下が必要である。アゴニストが少なくとも５０％、好ましくは７５％または１００％以上（イソ吉草酸の２倍、５倍、１０倍以上）に刺激することが好ましい。
【０１９７】
他の機能アッセイとして、例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）またはバイオセンサーアッセイが含まれる（Hafner,2000, Biosens.Bioelectron.15:149-158;参照により本明細書に援用されている）。
【０１９８】
ＩＩ．ＲＣＣ３５６とイソ吉草酸の相互作用に基づいた診断アッセイ：
イソ吉草酸は不快な臭いを有する有機酸であり、ヒトや動物の分泌物、特に汗の悪臭形成の一部である。前記酸および他のにおいは、ＲＣＣ３５６受容体を調節することが見出されており、本発明では、恐らくＲＣＣ３５６が嗅覚機能を有することを示唆している。本発明では、このように、特にイソ吉草酸およびその同等な酸を介したにおい認識が、ＲＣＣ３５６の調節を通じて調節されうることを示唆している。このように、イソ吉草酸などのＲＣＣ３５６を認識するリガンドの使用は、少なくともイソ吉草酸と関連するにおい知覚に影響を及ぼしうる。前記知見に基づいて、診断アッセイを設定して、におい認識の喪失を招く、異常機能しているＲＣＣ３５６受容体が被験者において存在するか否かを判定できる。
【０１９９】
ＧＰＣＲを通じたシグナル伝達は、多数の疾患および障害の病理に役立つ。ＲＣＣ３５６は前立腺などの多くの組織で発現しており、該組織における癌の進行の指標として作用することが示されている（米国特許第６，７９０，６３１号）。前記癌は、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌でありうる。したがって、嗅覚におけるその役割の他、 ＲＣＣ３５６は癌の進行において役割を果たす可能性が高い。前記癌の進行および／または治療は、本発明の方法を利用して研究されうる。例えば、本発明に記載のアッセイは、イソ吉草酸、イソ吉草酸等価体、イソ吉草酸‐抗体を使用して組み立てられる。
【０２００】
ＲＣＣ３５６が脳内で発現しているとの証拠がある(BBRC 2003, Vanti ら.305:67-71)。しかし、ＣＮＳ障害または疾患におけるその役割は依然として明らかになっていない。また、イソ吉草酸がてんかんに関与しうることが過去に示唆されている(Epilepsia,2004 45:1338-43)。実際に、バレリアン抽出物、特に粉末バレリアン根は抗けいれん薬として周知である。さらに、イソ吉草酸がそのような粉末の成分であることが示されている。このように、イソ吉草酸が抗けいれん作用を有することが推測される。イソ吉草酸がＲＣＣ３５６の天然リガンドであるとの本発明における知見に基づいて、本発明では、ＲＣＣ３５６がＣＮＳ障害、特にてんかんの治療の標的と見なされうることが示唆されている。一方で、前記受容体が、片頭痛、嘔吐、精神および神経障害（不安、統合失調症、躁うつ病、うつ病、せん妄、認知症、重度の知能低下症など）、神経変性疾患（アルツハイマー病またはパーキンソン病など）、運動異常症候群（ハンチントン病またはジルドラトゥレット症候群など）、他の関連疾患にも関与しうることを、本発明は除外していない。ＲＣＣ３５６のリガンドとしてのイソ吉草酸の提供は、該役割の解明に有用となりうる。また、本発明は、ＣＮＳ関連の疾患、特にてんかんを診断するために、ＲＣＣ３５６を定量する、またはＲＣＣ３５６を研究するための試薬を含むキットの使用法と関連している。
【０２０１】
ＲＣＣ３５６とイソ吉草酸との相互作用は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達が関与する疾患、障害、過程の診断またはモニタリングのアッセイの基礎として利用可能である。ＲＣＣ３５６関連の疾患または障害の診断アッセイにはいくつかの異なる型がありうる。
【０２０２】
第一に、診断アッセイによって組織サンプル中のイソ吉草酸の定量が可能となる。第二に、アッセイによって、組織サンプル中でのイソ吉草酸のＲＣＣ３５６への結合における差が評価可能となる。第三に、イソ吉草酸またはイソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体を認識する特異的抗体を使用して、サンプル中のイソ吉草酸の存在を測定（定量的または定性的）できる。この抗体の使用は、ＲＣＣ３５６を特異的に認識する抗体と併用されうる。該方法を利用して、ＣＮＳ障害または疾患および癌の進行を診断して、そしてそれらを治療できる。
【０２０３】
また、本発明では、ＲＣＣ３５６がにおい感知およびＣＮＳ障害において役割を果たしうることが初めて示唆されている。嗅覚異常またはＣＮＳ障害を診断またはモニターするためのアッセイにはいくつかの種類がありうる。
【０２０４】
第一に、ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸または関連する酸、イソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体に対する抗体を結合アッセイにおいて使用し、組織中でのＲＣＣ３５６ポリペプチド含量を測定する。第二に、ＲＣＣ３５６ ｍＲＮＡレベルが測定され、ＲＣＣ３５６遺伝子の発現レベルが示される。最後に、ｍＲＮＡまたはＲＣＣ３５６をコードするゲノムＤＮＡを増幅させて、野生型ＲＣＣ３５６メッセンジャーまたは遺伝子と比較した、配列の変化が確認されうる。 変化の存在は、嗅覚異常またはＣＮＳ障害の存在または素因を示唆しうる。
【０２０５】
本発明によると、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、図１ｂに示されるポリペプチドと少なくとも２０％の同一性、もしくは２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、１００％などより高い同一性を有するポリペプチドでありうる。または、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、前記配列の完全長ポリペプチドの断片であり、該断片が少なくとも５０％の結合活性、およびイソ吉草酸が誘発するシグナル伝達活性のレベルを保持しうる。本発明によると、イソ吉草酸に対する同様の結合特性を有する限り、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、野生型の配列と比較して、１つ以上の付加、挿入、欠失、置換を含みうる。該ＲＣＣ３５６ポリペプチドは切断ＲＣＣ３５６ポリペプチドでありうる。前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、ＲＣＣ３５６融合タンパク質を形成する追加配列を含み、前記追加配列は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ヒスチジンタグ（例、6XHis以上）、またはアフィニティタグ（例、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群から選択されうる。
【０２０６】
Ａ．有機低分子の定量アッセイ
前記酸の定量に使用可能な方法は、ａ）抽出および精製：溶媒抽出、油抽出、蒸気抽出、ＣＯ２超臨界抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留、ガスクロマトグラフィー、ｂ）定量：ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析でありうるが、これらに限定されない。当業者であれば、該方法の実施方法を知っている。
【０２０７】
Ｂ．ＲＣＣ３５６の量または変化の測定アッセイ
サンプル中での異常レベルの前記受容体の存在を判定するために、ＲＣＣ３５６レベルを測定して、標準と比較できる（標準組織以上または以下は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を示す）。例えば、ポリペプチド特異的な抗体を使用した免疫組織化学によって、ポリペプチドレベルを測定する。ＲＣＣ３５６活性を特徴とする疾患または障害の罹患が疑われる個人から分離されたサンプルをＲＣＣ３５６に対する抗体と接触させて、該技術分野において周知の通りに（例、二次抗体に結合させた酵素の活性測定）抗体の結合を測定する。
【０２０８】
ＲＣＣ３５６ポリペプチドレベル測定の別のアプローチでは、罹患組織からの細胞のフローサイトメトリー分析が利用される。フローサイトメトリーの方法として、該技術分野において周知のＲＣＣ３５６特異的な抗体の蛍光標識が挙げられる。他のアプローチとして、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡが挙げられる。これらのそれぞれのための方法は、該技術分野において周知である。
【０２０９】
検出された結合量と、健常人、もしくは罹患者の罹患していない部位からの同様の組織のサンプルにおける結合とを比較する。標準比較した１０％以上の増加は、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断となる。
【０２１０】
ＲＣＣ３５６発現は、組織サンプル中で該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量の測定によっても測定可能である。ｍＲＮＡは、定量的または半定量的ＰＣＲによって定量可能である。「定量的」増幅の方法は、該技術分野において周知であり、ＲＣＣ３５６増幅用プライマーの配列が本明細書において開示されている（米国特許第６，７９０，６３１号）。 定量的ＰＣＲに共通の方法としては、同じプライマーを使用して既知量の対照配列を同時に増幅させることが挙げられる。これによってＰＣＲ反応の較正に利用可能な内部標準が与えられる。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルが「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications', lnnis ら, Academic Press, Inc.N.Y.,(1990)」にあり、この文献は参照により本明細書に援用されている。健常人の組織サンプル、または罹患者の非罹患部位の組織サンプルにおける発現量と比較した、サンプル中におけるＲＣＣ３５６をコードするｍＲＮＡ量の１０％以上の増加は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断に用いられる。
【０２１１】
Ｃ．定量アッセイ
ＲＣＣ３５６ポリペプチドまたはそれをコードするｍＲＮＡが野生型であるか否か、もしくは診断に利用可能か否かを評価するアッセイ。ＲＣＣ３５６の調節異常を特徴とする嗅覚障害またはＣＮＳ障害または疾患をこの方法で診断するために、サンプルから分離されたＲＮＡをＲＣＣ３５６のＰＣＲ増幅用テンプレートとして使用する。次に標準方法を利用して増幅配列の配列を直接決定するか、もしくはまずベクターにクローニング後、配列を決定する。野生型ＲＣＣ３５６の配列と比較した、コード化されるアミノ酸を１つ以上変化させる配列上の変化は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断に利用可能である。サンプルにおいてコード配列の変化が同定される場合、その変異受容体またはリガンドを発現させて、その活性を野生型ＲＣＣ３５６の活性と比較することが有効となりうる。他の利点として、このアプローチによって、構成的に活性化しているヌル変異体などの新しい変異体がもたらされる。
【０２１２】
標準的な配列決定方法に加えて、例えば、野生型と変異型の配列を区別する分子指標のハイブリダイゼーションを利用して、特定の変異の存在について増幅配列をアッセイ可能である。わずか１個のヌクレオチドの変化に基づいて区別するハイブリダイゼーションアッセイは、該技術分野において周知である。または、例えば、米国特許第５，８８８，８１９号、第６，００４，７４４号、第６，０１３，４３１号（参照により本明細書に援用されている）に記載の多数の「ミニ配列」アッセイを実施可能である。これらのアッセイおよび該技術分野において周知の他のアッセイによって、任意のサンプル中における既知の多型を伴う核酸の有無を判定可能である。
【０２１３】
必要に応じて、アレイまたはマイクロアレイ法を利用して、ＲＣＣ３５６配列の発現または突然変異の有無を分析可能である。ミニ配列決定および核酸発現の定量のためのアレイ法は、該技術分野において周知である。
【０２１４】
Ｄ．機能アッセイ
イソ吉草酸と関連する嗅覚異常またはＣＮＳ疾患または障害の診断は、機能アッセイを利用して実施することも可能である。この目的のための、組織サンプルから調製した細胞膜または細胞抽出物が、本明細書に記載のＲＣＣ３５６活性アッセイ（例、リガンド結合アッセイ、カルシウム流束アッセイ、膜分極アッセイ、メラノフォアアッセイ、GTP結合アッセイ、ＧＴＰａｓｅアッセイ、アデニル酸シクラーゼアッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、リン脂質分解／ジアシルグリセロール／イノシトール三リン酸アッセイ、ＰＫＣまたはＰＫＡ活性化アッセイ、キナーゼアッセイ、受容体内在化アッセイ）に使用される。検出された活性を、健常人、または罹患者の非罹患部位から採取された標準サンプルの活性と比較する。代わりの方法として、サンプルまたはサンプル抽出物をＲＣＣ３５６発現細胞に適用後、標準サンプルとの比較でＲＣＣ３５６シグナル伝達活性を測定可能である。標準の活性と比較した、これらのアッセイで測定された活性における１０％以上の差は、イソ吉草酸と関連する嗅覚異常またはＣＮＳ疾患または障害の診断に用いられる。
【０２１５】
本発明の細胞内で発現されたＲＣＣ３５６活性の調節
ＲＣＣ３５６のリガンドとしてのイソ吉草酸の発見は、細胞内で発現しているＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性の調節方法をもたらす。ＲＣＣ３５６ポリペプチドの機能を調整する薬剤を細胞に送達することで、ＲＣＣ３５６活性は細胞内で調節される。該調節は、さらなる調節薬剤の同定のためのアッセイの一環として、培養細胞内、もしくは、例えば、ヒトを含む動物において実施可能である。薬剤としては、イソ吉草酸およびその等価体が挙げられる。
【０２１６】
薬剤を培養液に添加することで、細胞に送達可能である。送達量は、該薬剤の同一性および送達の目的に応じて変動する。例えば、ＲＣＣ３５６活性のアンタゴニストを同定するための培養アッセイにおいて、好ましくは受容体を最高の半分（例、ＥＣ５０程度）まで活性化させ、好ましくは受容体の飽和状態に必要な用量を超えない量のイソ吉草酸を添加する。イソ吉草酸量の滴定によって該用量を決定して、イソ吉草酸を追加してもＲＣＣ３５６活性に付加的効果を及ぼさない点を決定できる。
【０２１７】
疾患または障害の治療のために、医薬品としてＲＣＣ３５６活性の調節因子を動物に投与した場合、当業者であれば目的の転帰に応じて投与量を調節できる。治療前の測定可能な病気の測定値（例、腫瘍細胞の増殖、炎症細胞の蓄積、嗅覚、ＣＮＳ活性）と比較して、１つ以上の該値が１０％以上変化した場合、治療は成功となる。
【０２１８】
本発明の有用な候補調節因子
合成または天然化合物の大規模ライブラリーから候補調節因子をスクリーニング可能である。現在、様々な種類の化合物のランダム合成または指向性合成において多数の方法が利用されている。合成化合物ライブラリーは多数の企業から市販されている：例、Maybridge Chemical Co.（英国コーンウォール州Trevillet）、Comgenex(ニュージャージー州プリンストン)、Brandon Associates(ニューハンプシャー州メリマク)、Microsource(コネチカット州ニューミルフォード)。 希少化学ライブラリーがAldrich(ウィスコンシン州ミルウォーキー)から入手可能である。有機低分子のコンビナトリアルライブラリーを利用可能であり、また調製可能である。または、細菌、真菌、植物、動物の抽出物中の天然化合物ライブラリーが、例えばPan Laboratories(ワシントン州ボセル)やMycoSearch(ノースカロライナ州)から入手可能であるか、もしくは該技術分野において周知の方法によって容易に製造可能である。また、天然／合成のライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、生化学的方法によって容易に修飾される。
【０２１９】
本明細書において先に述べた通り、候補調節因子はイソ吉草酸の変異体または等価体でありうる。したがって、イソ吉草酸関連の化合物ライブラリーが使用されうる。本発明の結果（図３）に示されるように、イソ吉草酸（イソ構造）および吉草酸（線形構造）が同程度のＥＣ５０をもたらし、４〜９の炭素鎖が試験され、それらの全てがＲＣＣ３５６の活性化を引き起こした。したがって、本発明は、ＩＶＡの変異体（または等価体）が作成され、ＲＣＣ３５６に対するＩＶＡと同程度の活性を有する化合物が導かれることを示唆している。特に、本発明では、例えば炭素２−１２の脂肪族鎖長の操作、イソ対線形構造の操作、イソ型の各ラジカル連鎖の操作、分子のイソ／線形型の両方の官能基（カルボン酸基、アルデヒド基、アルコール基、エステル基、エーテル基…）の操作、イソおよび線形構造の両方の官能基の位置操作による変化の可能性が示唆される。
【０２２０】
本発明での有用な抗体
本発明は、ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸、イソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体に対する抗体の特定の使用法に関する。抗体は、該技術分野において既知の標準プロトコルを利用して作成可能である（Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press: 1988)参照）。マウス、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウサギなどの哺乳動物、または鶏などの鳥に免疫原性ＲＣＣ３５６ペプチド（例、RCC356ポリペプチドまたは抗体反応を引き起こすことの可能な抗原断片、本明細書における先述の融合タンパク質）、イソ吉草酸、イソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体を免疫可能である。抗体作成用の免疫原は、アジュバントと化合物（例、分離した組換えポリペプチドまたは合成ペプチド）を混合させて調製する。または、ＲＣＣ３５６ポリペプチドまたはペプチドから、融合タンパク質として、より大きな免疫原性タンパク質が作成される。ポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニンなどのより大きな他の免疫原性タンパク質と共有結合させることができる。前記ペプチドと前記酸との化学結合によってイソ吉草酸の免疫原性を高めることができる。または、ＲＣＣ３５６またはこれらのタンパク質の断片をコードするプラスミドまたはウィルスベクターを使用して、ポリペプチドを発現させて、動物において免疫反応を起こすことができる（Costagliola ら, 2000, J. Clin.Invest.105:803-811、本文献は参照により本明細書に援用されている）。抗体を作成するために、通常、免疫原をウサギ、ヒツジ、マウスなどの実験動物の皮内、皮下、筋肉内に投与する。上述の抗体に加えて、一本鎖抗体などの遺伝子組換え抗体の派生物を作成可能である。該組換え抗体はファージディスプレイライブラリーとして維持できる。ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸および／またはイソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体を認識する組換え抗体は、このようにしてＢｉａｃｏｒｅ技術などの結合アッセイを利用して該ライブラリーから分離可能である。
【０２２１】
予防接種の進行は、血漿または血清中の抗体価の検出によってモニター可能である。抗原として免疫原と一緒に、標準的ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、他のイムノアッセイを使用しても抗体レベルを評価可能である。抗体は簡単に免疫接種動物の血清から調製可能であり、もしくは必要に応じて、例えば固定免疫原を使用した親和性クロマトグラフィーによって血清からポリクローナル抗体を分離可能である。
【０２２２】
モノクローナル抗体を作成するために、抗体産生中の脾細胞を免疫接種動物から回収して、標準的な体細胞融合法によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を作成する。このような技術は該技術分野において周知であり、例えばヒトモノクローナル抗体を作成するための、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497において本来開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbar ら, (1983) Immunology Today, 4: 72）、ＥＢＶ‐ハイブリドーマ技術（Cole ら, (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp.77-96）が挙げられる。イソ吉草酸または同等の酸、ＲＣＣ３５６ペプチドまたはポリペプチド、またはイソ吉草酸／ＲＣＣ３５６複合体と特異的に反応する抗体の産生のために、ハイブリドーマを免疫化学的にスクリーニング可能であり、該ハイブリドーマ細胞を含む培養液からモノクローナル抗体を分離する。
【０２２３】
ＲＣＣ３５６に特異的な抗体の産生については米国特許第６，７９０，６３１号に記載されている。イソ吉草酸に対する抗体は、上記の先行技術の方法の１つを利用して容易に作成可能である。
【０２２４】
本発明での有用なトランスジェニック動物
ＲＣＣ３５６またはその変異体を発現しているトランスジェニック動物は、ＲＣＣ３５６の活性を調節する薬物または薬剤の研究の他、ＲＣＣ３５６を介したシグナル伝達の研究にも有用である。トランスジェニック動物は、その遺伝物質の一部にトランス遺伝子と呼ばれる少なくとも１つの外来遺伝子を含むヒト以外の動物である。好ましくは、前記トランス遺伝子が動物の子孫に伝えられるように、それは動物の生殖細胞系列に含まれる。受精卵の前核へのトランス遺伝子のマイクロインジェクションおよびＥＳ細胞の操作など（これらに限定されない）、動物の遺伝物質へのトランス遺伝子の導入には多数の技術が利用されうる（WagnerおよびHoppeによる米国特許第４，８７３，１９１号；Palmiter and Brinster, 1986, Ann.Rev.Genet, 20:465-499; 1987年8月公開の仏国特許出願第２，５９３，８２７号、これら全ての文献は参照により本明細書に援用されている）。トランスジェニック動物は全ての細胞にトランス遺伝子を有するか、もしくは遺伝的にモザイクである。
【０２２５】
従来の遺伝子組換え方法によれば、正常遺伝子または改変遺伝子の追加コピーが受精卵の雄性前核に注入されて、受容マウスのゲノムＤＮＡ内に組み込まれる。トランス遺伝子は確立されたトランスジェニック系統においてメンデルの法則によって伝えられる。トランス遺伝子は、構成的、組織特異的、もしくはテトラサイクリンなどの外来性薬剤に応答性に発現可能である。１つのトランス遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、第二のトランス遺伝子を発現する第二のトランスジェニック動物と交配させて、子孫が両方のトランス遺伝子を持ち、また発現することができる。
【０２２６】
ノックアウト動物
ＲＣＣ３５６またはその変異体をコードする染色体配列中にホモ接合性欠失を有する動物を使用して、受容体の機能の研究が可能である。イソ吉草酸の産生および／または異化に関与する遺伝子（IVDHaseなど）のノックアウトが、特に癌またはＣＮＳ障害について異なる表現型を有するか否かが特に興味深く、これはイソ吉草酸がＲＣＣ３５６に結合する唯一のリガンドであるか否か、またはそれがファミリーの一員であるか否かを指摘しうる。特定の生理学的および／または病理学的な過程におけるＲＣＣ３５６／イソ吉草酸の特定の役割を特定することはさらに興味深い。
【０２２７】
ｉ．標準的なノックアウト動物
ノックアウト動物はヒト以外の動物であり、相同的組換えによる遺伝子欠失の作成方法によって作出される。この技術は、胚由来で、培養で維持されており、宿主の胚盤胞内に導入された場合に動物の全ての組織の発生に関与する能力を有する胚性幹（ＥＳ）細胞の開発に基づいている。ノックアウト動物が、ＥＳ細胞内の特定の標的遺伝子に相同組換えを導き、該遺伝子のヌル対立遺伝子を作成することで作出される。ノックアウト動物の作成技術は詳細に説明されている（例、Huszar ら, 1997, Cell, 88:131;Ohki-Hamazaki ら, 1997, Nature, 390:165参照。これらのいずれの文献も参照により本明細書に援用されている）。当業者であれば、イソ吉草酸産生および（または）異化に関与する１つ以上の遺伝子のノックアウトを伴うホモ接合性ＲＣＣ３５６ノックアウト動物または動物遺伝子を作成可能である（例、マウス）。
【０２２８】
ｉｉ．組織特異的ノックアウト
標的相同組換え方法は、バクテリオファージＰ１部位特異的レコンビナーゼＣｒｅに基づく部位特異的組換え系の開発によって改良されている。バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼは、特定の組織または発生段階に限定した遺伝子ノックアウトを作成するために、トランスジェニックマウスアッセイにおいて使用される。全体的な遺伝子ノックアウトと対照的に、部位を限定した遺伝子欠失では、表現型が特定の細胞／組織に起因しうることを上手く利用する(Marth, 1996, Clin.Invest.97: 1999)。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムでは、ｌｏｘＰ部位が目的遺伝子の１つ以上のエキソンの両側を挟むように、１つのトランスジェニックマウス系統が改変される。このいわゆる「ｆｌｏｘｅｄ遺伝子」のホモ接合体は、細胞／組織タイプ転写プロモーターの制御下でＣｒｅ遺伝子を発現する第二のトランスジェニックマウスと交配させる。次に、Ｃｒｅタンパク質はｌｏｘＰ認識配列間のＤＮＡを切り出して、効果的に標的遺伝子の機能を取り除く(Sauer, 1998, Methods, 14:381)。例えば、乳房組織特異的遺伝子の誘導性不活性化など、現在、この方法には多くのｉｎ ｖｉｖｏでの実施例が存在する(Wagner ら, 1997, Nucleic Acids Res., 25:4323)。したがって、当業者であれば、選択された組織または細胞種において上記のＲＣＣ３５６またはイソ吉草酸と関連する遺伝子がホモ接合的に除去された組織特異的ノックアウト動物の作成が可能である。
【０２２９】
本発明での有用なキット
本発明は、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断に有用なキットの他、ＲＣＣ３５６活性の調節因子のスクリーニングに有用なキットを提供する。本発明での有用なキットとして、分離ＲＣＣ３５６ポリペプチド（膜または細胞結合ＲＣＣ３５６ポリペプチド、例、ＲＣＣ３５６を発現する分離膜、細胞、またはＳＰＲチップ）および分離イソ吉草酸が挙げられる。細胞が含まれる場合、前記ＲＣＣ３５６をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に形質転換させうる。別の実施態様では、本発明のキットは、ＲＣＣ３５６ポリペプチドおよびイソ吉草酸をコードするポリヌクレオチドを含みうる。本発明の全てのキットは、定められた品目または品目の組み合わせ、およびそれらの包装材料を含む。キットは使用説明書も含みうる。
【０２３０】
本キットによると、前記イソ吉草酸は、イソ吉草酸と類似の、ＲＣＣ３５６受容体との結合能および（または）調節能を有するイソ吉草酸関連の薬剤でありうる。前記関連薬剤は、例えば、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、イソヘキサン酸、ヘプタン酸、イソヘプタン酸、オクタノン酸、イソオクタノン酸、ノナン酸、イソノナン酸、バルプロ酸、イソバレルアミド、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロベンゼン酸、ペラルゴン酸、５‐ヘキセン酸でありうる。
【０２３１】
本発明によると、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、図１ｂに示されるポリペプチドと、少なくとも２０％の同一性、または２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、１００％などより高い同一性を有するポリペプチドであり、これらはイソ吉草酸または同等の酸に特異的に結合する。または、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、図１ｂに示される完全長のポリペプチドの断片であり、前記断片が、イソ吉草酸を使用した場合の結合活性およびシグナル伝達活性の少なくとも５０％を保持する。本発明によると、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは、図１ｂに示される配列と比較して、１つ以上の付加、挿入、欠失、置換を含みうる。前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドは切断ＲＣＣ３５６ポリペプチドでありうる。前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドはＲＣＣ３５６融合タンパク質を形成する追加配列を含み、前記追加配列は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ヒスチジンタグ（例、6XHis以上）、または親和性タグ（例、Mycタグ、FLAGタグ）配列からなる群から選択されうる。
【実施例】
【０２３２】
実施例１：ＲＣＣ３５６における８０種のにおい物質のスクリーニング
補体不含ＦＢＳを添加したＭＥＭ中においてＨｅｋ２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％で増殖させた。スクリーニングの２日前、細胞を９６ウェルプレート上に播種した(PDLコーティング済みプレート、Becton-Dickinson)。翌日、蛍ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼをそれぞれコードする２つのプラスミドと一緒にＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションした。蛍ルシフェラーゼの転写はＣＲＥＢ応答性エレメント(CRE)を含む最小プロモーターによって促進させて、ウミシイタケルシフェラーゼは強力な構成的プロモーターであるＣＭＶプロモーターによって促進させた。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬を使用して実施した(Invitrogen)。トランスフェクションした細胞を標準的な培養条件下でさらに２４時間静置して、機能アッセイのために処理した。
【０２３３】
におい物質を１Ｍ ＤＭＳＯ溶液として溶解させた。次にそれらを２００μＭのＨＢＳＳ(Cambrex)溶液として９６ウェルプレートに播種した。したがって、ＤＭＳＯは１％（ｖ／ｖ）以下のにおい物質溶液を示す。ホルスコリンなどの陽性対照がにおい物質プレートに含まれた。ホルスコリンはｃＡＭＰ産生を活性化させて、次にＣＲＥＢ転写因子への結合を介して、システムのレポーター遺伝子である蛍ルシフェラーゼの産生を引き起こす。したがって、各ウェルで検出されたルシフェラーゼ活性は、ホルスコリン応答の百分率で表され、ルシフェラーゼ活性に関する標準化が可能となる。
【０２３４】
使用説明書(Promega)に従い、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを使用して機能アッセイを実施した。
【０２３５】
図２には、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを過剰発現するＨｅｋ２９３での８０種のにおい物質に関する２回の独立したスクリーニングで得られた結果を示している。イソ吉草酸、吉草酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、 カプリン酸、ペラルゴン酸など、多くのにおい物質がＲＣＣ３５６を活性化すると思われる。これらの潜在的なヒットのうち、イソ吉草酸と吉草酸のみがいずれのスクリーニングでも認められた。
【０２３６】
実施例２：ＲＣＣ３５６ポリペプチドを過剰発現するＨｅｋ２９３細胞に対する７種のにおい物質に関する濃度反応分析
ＲＣＣ３５６を過剰発現するＨｅｋ２９３細胞に対する８０種のにおい物質のスクリーニング中に見出されるヒットをさらに検証するために、濃度反応分析を実施している。補体不含ＦＢＳを添加したＭＥＭ中においてＨｅｋ２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％で増殖させた。スクリーニングの２日前、細胞を９６ウェルプレート上に播種した（PDLコーティング済みプレート、Becton-Dickinson）。翌日、蛍ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼをそれぞれコードする２つのプラスミドと一緒にＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションした。蛍ルシフェラーゼの転写はＣＲＥＢ応答性エレメント(CRE)を含む最小プロモーターによって促進させて、ウミシイタケルシフェラーゼは強力な構成的プロモーターであるCMVプロモーターによって促進させた。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬を使用して実施した(Invitrogen)。トランスフェクションした細胞を標準的な培養条件下でさらに２４時間静置して、機能アッセイのために処理した。
【０２３７】
まず、におい物質（イソ吉草酸、吉草酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、カプリン酸、ペラルゴン酸）を１Ｍ ＤＭＳＯ溶液として溶解した。次にそれらを０．１μＭ−１ｍＭの様々な濃度のＨＢＳＳ(Cambrex)溶液として９６ウェルプレートに播種した。したがって、ＤＭＳＯは１％（ｖ／ｖ）以下のにおい物質溶液を示す。ホルスコリンなどの陽性対照がにおい物質プレートに含まれた。ホルスコリンはｃＡＭＰ産生を活性化させて、次にＣＲＥＢ転写因子への結合を介して、システムのレポーター遺伝子である蛍ルシフェラーゼの産生を引き起こす。したがって、各ウェルで検出されたルシフェラーゼ活性は、ホルスコリン応答の百分率で表され、ルシフェラーゼ活性に関する標準化が可能となる。
【０２３８】
使用説明書(Promega)に従い、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを使用して機能アッセイを実施した。
【０２３９】
図３Ａは、ＲＣＣ３５６活性化に対する同定された様々なリガンドの効率を示している。図３Ｂ−Ｄは、ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３細胞に対する、クエン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリン酸、ペラルゴン酸、ヘキサヒドロ安息香酸、５−ヘキセン酸を用いて実施された濃度反応分析の結果を示している。試験された各ヒットが、ＲＣＣ３５６のリガンドであることを確認している。試験されたにおい物質において、イソ吉草酸が最も効率的なＲＣＣ３５６ポリペプチドのリガンドである。イソ吉草酸は、ＥＣ５０ ２５μＭでＲＣＣ３５６の活性化を引き起こす。吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリン酸、ペラルゴン酸、ヘキサヒドロ安息香酸、５−ヘキセン酸もそれぞれ９７μＭ、９１μＭ、２６０μＭ、３２９μＭ、６４３μＭ、１０４μＭ、ＥＣ５０ ４８５μＭでＲＣＣ３５６の活性化を導く。
【０２４０】
実施例３：ＲＣＣ３５６ポリペプチドを過剰発現するＨｅｋ２９３細胞について実施した単一細胞カルシウムイメージングアッセイ
単一細胞カルシウムイメージングアッセイでは、実験の４８時間前に９６ウェルプレートに細胞を播種して、カルシウムイメージングアッセイの２０時間前、使用説明書に従って、Lipofectamine(Invitrogen Inc.)を使用して嗅覚受容体のｃＤＮＡをトランスフェクションさせた。４μｇ／ｍＬ Ｆｌｕｏ４−ＡＭ (Molecular Probe)を含む生理食塩水バッファー中での３７℃、１時間の培養後、細胞をＦｌｕｏ４−ＡＭ不含生理食塩水バッファーで洗い流した。各ウェルに生理食塩水バッファー５０μＬを添加した。蛍光検出器を備えたZeiss Axiovert 200 Mot顕微鏡により、倍率２０倍でカルシウム動員を記録した。６０秒間１秒毎に同じ視野の画像を１枚撮影した。記録開始から１０秒後、生理食塩水バッファーに溶解した２倍濃度のリガンド５０μＬを注入した。試験されたリガンドは、イソ吉草酸（図４）、酪酸（図５）、ペラルゴン酸（図６）であった。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１：ＲＣＣ３５６の配列。ＲＣＣ３５６の全長のコード領域のｃＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。前記配列は、米国特許第６，７９０，６３１号において過去に開示されている。
【図２】図２：Ｈｅｋ２９３Ｔ内で過剰発現させたＲＣＣ３５６上で試験された８０のリガンドでのスクリーニング結果。結果はホルスコリンの活性化の百分率で表されている。
【図３−１】図３：ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３Ｔを受容体の様々なアゴニストで処理した後に得られた濃度反応曲線。
【図３−２】図３：ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３Ｔを受容体の様々なアゴニストで処理した後に得られた濃度反応曲線。
【図３−３】図３：ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３Ｔを受容体の様々なアゴニストで処理した後に得られた濃度反応曲線。
【図３−４】図３：ＲＣＣ３５６を過剰発現しているＨｅｋ２９３Ｔを受容体の様々なアゴニストで処理した後に得られた濃度反応曲線。
【図４】図４Ａ：ｆｌｕｏ４−ＡＭ、カルシウムトレーサーを添加したＲＣＣ３５６発現細胞に対して２５０μＭのイソ吉草酸を注入した際に誘発された蛍光変化の記録。細胞を倍率２０Ｘで観察した。時間スケールは秒で表している。記録開始後１０秒目にイソ吉草酸を注入した。Ｂ：蛍光測定 グラフ上の各トレースは、観察視野の１個の細胞において測定された蛍光強度を示している。１０秒目に引かれた縦棒は注入時間を示している。
【図５】図５Ａ：ｆｌｕｏ４−ＡＭ、カルシウムトレーサーを添加したＲＣＣ３５６発現細胞に対して２５０μＭの酪酸を注入した際に誘発された蛍光変化の記録。細胞を倍率２０Ｘで観察した。時間スケールは秒で表している。記録開始後１０秒目に酪酸を注入した。Ｂ：蛍光測定 グラフ上の各トレースは、観察視野の１個の細胞において測定された蛍光強度を示している。１０秒目に引かれた縦棒は注入時間を示している。
【図６】図６Ａ：ｆｌｕｏ４−ＡＭ、カルシウムトレーサーを添加したＲＣＣ３５６発現細胞に対して５００μＭのペラルゴン酸を注入した際に誘発された蛍光変化の記録。細胞を倍率２０Ｘで観察した。時間スケールは秒で表している。記録開始後１０秒目にペラルゴン酸を注入した。Ｂ：蛍光測定 グラフ上の各トレースは、観察視野の１個の細胞において測定された蛍光強度を示している。１０秒目に引かれた縦棒は注入時間を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＣＣ３５６に結合する薬剤の同定方法であって、
ａ）イソ吉草酸とＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件下で、候補調節因子の存在下または非存在下において前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸とが接触すること、および
ｂ）前記候補調節因子の非存在下における結合と比較して、前記候補調節因子の存在下における結合の低下によって、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤としての前記候補調節因子が同定される、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸との結合を測定することを含む方法。
【請求項２】
サンプル中でＲＣＣ３５６に結合する薬剤のサンプル中での存在を検出する方法であって、ａ）前記イソ吉草酸と前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件下で、前記サンプルの存在下または非存在下においてＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、および
ｂ）前記候補調節因子の非存在下において結合と比較して、前記サンプルの存在下において結合の低下が、前記サンプル中でＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を示す、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸との結合を測定することを含む方法。
【請求項３】
ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の同定方法であって、
ａ）候補調節因子の存在下または非存在下において、すなわちイソ吉草酸により前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドを活性化させる条件下で、ＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、
および
ｂ）前記候補調節因子の非存在下における活性と比較して、前記候補調節因子の存在下における活性の変化によって、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤として前記候補調節因子が同定される、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定することを含む方法。
【請求項４】
ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の同定方法であって、
ａ）ＲＣＣ３５６ポリペプチドと候補調節因子とが接触すること、
ｂ）前記候補調節因子の存在下における、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、
および
ｃ）前記候補調節因子の存在下で測定された活性が、ＥＣ５０の前記イソ吉草酸による誘導量の少なくとも１０％である場合、前記候補調節因子がＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤として同定される、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドをＥＣ５０のイソ吉草酸と接触させているサンプル中において測定する前記活性と、前記候補調節因子の存在下で測定する前記活性とを比較することを含む方法。
【請求項５】
サンプル中においてＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルの存在下、または非存在下において、ＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、
ｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、
および
ｃ）前記サンプルの非存在下における活性と比較して、前記サンプルの存在下における前記活性の変化が、前記サンプル中においてＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を示唆する、前記サンプルを含まない、ＲＣＣ３５６およびイソ吉草酸を含む反応液中において測定された前記活性と、ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸、前記サンプルを含む反応液中において測定された前記活性を比較することを含む方法。
【請求項６】
ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を検出する方法であって、
ａ）ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記サンプルとが接触すること、
ｂ）前記サンプルの存在下において、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、
および
ｃ）前記サンプルの存在下において測定された前記活性が、ＥＣ５０の前記イソ吉草酸による誘導量の少なくとも１０％である場合、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤が検出される、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドをＥＣ５０のイソ吉草酸と接触させている反応液中において測定された前記活性と、前記サンプルの存在下で測定された前記活性とを比較することを含む方法。
【請求項７】
前記イソ吉草酸が、検出可能なように標識された、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記酸が、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、蛍光クエンチャー、ＮＭＲで検出可能な成分からなる群から選択される成分によって検出可能なように標識されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記接触が、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞内、または細胞上で行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
合成リポソーム内、または前記リポソーム上で前記接触が行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記接触が、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを含むウイルス誘発性発芽膜内、または前記膜上で行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、プロテインチップ上で行われる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記測定が、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光クエンチング、蛍光偏光から選択される方法を利用して行われる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、糖質、核酸、におい物質およびフェロモンを含有するが、これらに限定されることのない有機低分子からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定する前記段階が、セカンドメッセンジャーレベルにおける変化を検出することからなる、請求項３〜６および９〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
シグナル活性を測定する該段階が、グアニンヌクレオチド結合／共役または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、プロテインキナーゼＡ活性、 ホスファチジルイノシトールの分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流束、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラニンアッセイ、受容体内在化アッセイまたはリポーター遺伝子発現を測定することからなる、請求項３〜６および９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記シグナル活性を蛍光または発光アッセイによって測定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞内におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性の調節方法であって、ＲＣＣ３５６の活性を調節できるように、ＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性を調節するイソ吉草酸を前記細胞内に輸送する段階を含む方法。
【請求項２０】
前記方法がハイスループットスクリーニングである、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が化合物ライブラリーまたは動物器官の抽出物の一部である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法によって同定または検出されるイソ吉草酸関連薬剤。
【請求項２３】
請求項２２の薬剤を含む組成物。
【請求項２４】
医薬品の調製のための、請求項２２または２３に記載の薬剤または組成物の使用。
【請求項２５】
におい物質またはにおい物質のアンタゴニストの調製のための、請求項２２または２３に記載の薬剤または組成物の使用。
【請求項２６】
前記疾患または障害が好ましくは癌または腫瘍の転移からなる群から選択される、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用医薬品の調製のための、請求項２４に記載の薬剤または組成物の使用。
【請求項２７】
前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の薬剤または組成の使用。
【請求項２８】
前記疾患または障害が好ましくはＣＮＳ障害または疾患である、ＲＣＣ３５６関連の疾患またはＲＣＣ３５６関連の障害の治療用医薬品の調製のための、請求項２４に記載の薬剤または組成の使用。
【請求項２９】
前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんである、請求項２８に記載の薬剤または組成物の使用。
【請求項３０】
分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチドおよびイソ吉草酸を含む組成物。
【請求項３１】
分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチドおよび該酸を含む組成の製造用のイソ吉草酸の使用。
【請求項３２】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達を調整する薬剤のスクリーニング用キットの製造、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患の診断または予後診断用キットの製造、もしくはにおい物質またはにおい物質のアンタゴニストのスクリーニング用キットの製造におけるＲＣＣ３５６との併用における、イソ吉草酸の使用。
【請求項３３】
ＲＣＣ３５６のリガンドとしてのイソ吉草酸の使用。
【請求項３４】
医薬品調製のためのイソ吉草酸の使用。
【請求項３５】
前記疾患または障害が好ましくは癌または腫瘍の転移からなる群から選択される、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用に前記医薬品が使用される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体またはその断片を認識する抗体。
【請求項３８】
ＣＮＳ障害または疾患の治療用医薬品の調製のための、ＲＣＣ３５６断片、ＲＣＣ３５６を認識する抗体、またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用。
【請求項３９】
前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんである、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常の治療用医薬品の調製のための、ＲＣＣ３５６断片、ＲＣＣ３５６を認識する抗体、またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用。
【請求項４１】
癌または腫瘍の転移の治療用医薬品の調製のための、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用。
【請求項４２】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であって、
ａ）組織サンプルとイソ吉草酸とが接触すること、
ｂ）前記酸の前記組織サンプルへの結合を検出すること、
および、
ｃ）前記標準品と比較した結合の違いが、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に用いられる、段階（ｂ）で検出される結合と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項４３】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であって、
ａ）組織サンプルとイソ吉草酸に特異的な抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対する特異的な抗体とが接触すること、
ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出すること、
および、
ｃ）前記標準品と比較して結合の違いが、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に用いられる、段階（ｂ）で検出される結合と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項４４】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であって、
ａ）組織サンプルとＲＣＣ３５６ポリペプチドに対して特異的な抗体およびイソ吉草酸に対して特異的な抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対する特異的な抗体が接触すること、
ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出すること、
および、
ｃ）前記標準品と比較していずれか一方または両方の抗体の結合の違いが、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に用いられる、段階（ｂ）で検出される結合と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項４５】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であって、
ａ）組織サンプルのイソ吉草酸含量を定量すること、
および
ｂ）前記標準品と比較してイソ吉草酸の前記量の違いが、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に用いられる、段階（ａ）で定量される前記酸の量と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項４６】
前記疾患または障害が、癌または腫瘍の転移からなる群から選択されるＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害である、請求項４２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に特異的な抗体が使用され、疾患または障害が、イソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ障害または疾患である、請求項４２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ関連障害または疾患の診断方法または予後診断方法であって、
ａ）組織サンプルのＲＣＣ３５６含量を定量すること、
および
ｂ）標準品と比較してＲＣＣ３５６の量における違いが、嗅覚異常の診断または予後診断、もしくはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断に用いられる、段階（ａ）で定量される受容体の量と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項５１】
該ＣＮＳ関連疾患または障害がてんかんである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＲＣＣ３５６抗体、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６抗体、またはイソ吉草酸を使用して定量が行われる、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断の方法であって、
ａ）ＲＣＣ３５６をコードするｍＲＮＡの定量、および／または組織サンプルにおける野生型ＲＣＣ３５６の配列と比較した、前記ＲＣＣ３５６配列の正確性を検証すること、
および
ｂ）標準品と比較して量またはＲＣＣ３５６配列における違いが、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の診断または予後診断、もしくはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断に用いられる、段階（ａ）で定量または決定された前記核酸の量および／または正確性の標準品とを比較することを含む方法。
【請求項５４】
ＣＮＳ関連疾患または障害がてんかんである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
癌または腫瘍の転移を診断または予後診断する方法であって、
ａ）ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６抗体を使用した組織サンプルのＲＣＣ３５６含量を定量すること、
および
ｂ）標準品と比較したＲＣＣ３５６の量の違いが、嗅覚異常の診断または予後診断、あるいは癌もしくは腫瘍の転移の診断または予後診断に用いられる、段階（ａ）で定量された前記受容体の量と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項５６】
分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチド、イソ吉草酸、そしてこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項５７】
ＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチド、イソ吉草酸、そしてこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項５８】
ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞またはその膜、イソ吉草酸、そしてこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項５９】
前記ＲＣＣ３５６をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に形質転換させる、請求項５８に記載の該キット。
【請求項６０】
ＲＣＣ３５６のシグナル伝達活性を調節する薬剤のスクリーニング用の、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項６１】
におい物質または抗におい物質剤のスクリーニング用の、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項６２】
抗腫瘍化合物またはＣＮＳ障害または疾患の治療用化合物のスクリーニング用の、請求項請求項５６〜５９のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項６３】
前記癌が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択され、前記ＣＮＳ障害または疾患がてんかんである、請求項６２に記載のキットの使用。
【請求項６４】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断用のイソ吉草酸を含むキットの使用。
【請求項６５】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断用のイソ吉草酸抗体を含むキットの使用。
【請求項６６】
前記疾患または障害が癌である、請求項６４または６５記載の使用。
【請求項６７】
ＣＮＳ関連疾患の診断または予後診断用のＲＣＣ３５６を含むキットの使用。
【請求項６８】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常の診断または予後診断用のＲＣＣ３５６を含むキットの使用。
【請求項６９】
癌の進行および／または治療に及ぼすイソ吉草酸の効果を研究するためのＲＣＣ３５６またはそのオルソログのトランスジェニック動物の使用。
【請求項７０】
前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌の進行および／または治療が研究される、請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
ＣＮＳ障害または疾患の進行および／またはイソ吉草酸関連の嗅覚異常の治療を研究するためのＲＣＣ３５６またはそのオルソログのトランスジェニック動物の使用。
【請求項７２】
てんかんの進行および／または治療が研究される、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
癌の進行および／または治療を研究するための、イソ吉草酸を過剰生産するトランスジェニック動物の使用。
【請求項７４】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常の進行に及ぼすＲＣＣ３５６の効果を研究するためのＲＣＣ３５６ノックアウトの使用。
【請求項７５】
ＣＮＳ障害または疾患の進行に及ぼすＲＣＣ３５６の効果を研究するためのＲＣＣ３５６ノックアウトの使用。
【請求項７６】
請求項１〜２１、４２〜５５のいずれかに記載の方法、請求項２２に記載の薬剤、請求項２４〜２９、３１〜３６、３８〜４１、６０〜７５のいずれかに記載の使用法、請求項３７に記載の抗体、請求項２３または３０に記載の組成物、もしくは図１ｂに示されているＲＣＣ３５６ポリペプチドに特異的に結合して、そのシグナル伝達活性を活性化させる、イソ吉草酸等価体が使用され、参照され、適用され、もしくは組み込まれる、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキット。
【請求項７７】
前記等価体が、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、 イソヘキサン酸、 ヘプタン酸、 イソヘプタン酸、オクタン酸、 イソオクタン酸、ノナン酸、 イソノナン酸、バルプロ酸、イソバレルアミド、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロ安息香酸、ペラルゴン酸、５−ヘキセン酸からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法、薬剤、使用、組成物、またはキット。
【請求項７８】
前記等価体が、酪酸、吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロ安息香酸、ペラルゴン酸、５−ヘキセン酸からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法、薬剤、使用、組成物、またはキット。
【請求項７９】
請求項１〜２１、４２〜５５のいずれかに記載の方法、請求項２４〜２９、３１〜３６、３８〜４１、６０〜７５のいずれかに記載の使用法、請求項２３または３０記載の組成、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキット、もしくはＲＣＣ３５６ポリペプチドが、図１ｂに示されるポリペプチドと少なくとも２０％の同一性、または２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、さらに１００％といったより高い同一性を有するが、該ＲＣＣ３５６ポリペプチドと同等の活性を有する、請求項７６〜７８のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項８０】
前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドがキメラまたはその活性フラグメントである、請求項７９に記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項１】
ＲＣＣ３５６に結合する薬剤の同定方法であって、
ａ）イソ吉草酸とＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件下で、候補調節因子の存在下または非存在下において前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸とが接触すること、および
ｂ）前記候補調節因子の非存在下における結合と比較して、前記候補調節因子の存在下における結合の低下によって、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤としての前記候補調節因子が同定される、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸との結合を測定することを含む方法。
【請求項２】
サンプル中でＲＣＣ３５６に結合する薬剤のサンプル中での存在を検出する方法であって、ａ）前記イソ吉草酸と前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドとの結合を可能にする条件下で、前記サンプルの存在下または非存在下においてＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、および
ｂ）前記候補調節因子の非存在下において結合と比較して、前記サンプルの存在下において結合の低下が、前記サンプル中でＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を示す、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記イソ吉草酸との結合を測定することを含む方法。
【請求項３】
ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の同定方法であって、
ａ）候補調節因子の存在下または非存在下において、すなわちイソ吉草酸により前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドを活性化させる条件下で、ＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、
および
ｂ）前記候補調節因子の非存在下における活性と比較して、前記候補調節因子の存在下における活性の変化によって、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤として前記候補調節因子が同定される、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定することを含む方法。
【請求項４】
ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の同定方法であって、
ａ）ＲＣＣ３５６ポリペプチドと候補調節因子とが接触すること、
ｂ）前記候補調節因子の存在下における、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、
および
ｃ）前記候補調節因子の存在下で測定された活性が、ＥＣ５０の前記イソ吉草酸による誘導量の少なくとも１０％である場合、前記候補調節因子がＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤として同定される、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドをＥＣ５０のイソ吉草酸と接触させているサンプル中において測定する前記活性と、前記候補調節因子の存在下で測定する前記活性とを比較することを含む方法。
【請求項５】
サンプル中においてＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルの存在下、または非存在下において、ＲＣＣ３５６ポリペプチドとイソ吉草酸とが接触すること、
ｂ）前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、
および
ｃ）前記サンプルの非存在下における活性と比較して、前記サンプルの存在下における前記活性の変化が、前記サンプル中においてＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を示唆する、前記サンプルを含まない、ＲＣＣ３５６およびイソ吉草酸を含む反応液中において測定された前記活性と、ＲＣＣ３５６、イソ吉草酸、前記サンプルを含む反応液中において測定された前記活性を比較することを含む方法。
【請求項６】
ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤の存在を検出する方法であって、
ａ）ＲＣＣ３５６ポリペプチドと前記サンプルとが接触すること、
ｂ）前記サンプルの存在下において、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定すること、
および
ｃ）前記サンプルの存在下において測定された前記活性が、ＥＣ５０の前記イソ吉草酸による誘導量の少なくとも１０％である場合、ＲＣＣ３５６の機能を調節する薬剤が検出される、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドをＥＣ５０のイソ吉草酸と接触させている反応液中において測定された前記活性と、前記サンプルの存在下で測定された前記活性とを比較することを含む方法。
【請求項７】
前記イソ吉草酸が、検出可能なように標識された、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記酸が、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、蛍光クエンチャー、ＮＭＲで検出可能な成分からなる群から選択される成分によって検出可能なように標識されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記接触が、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞内、または細胞上で行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
合成リポソーム内、または前記リポソーム上で前記接触が行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記接触が、ＲＣＣ３５６ポリペプチドを含むウイルス誘発性発芽膜内、または前記膜上で行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、プロテインチップ上で行われる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記測定が、ラベル置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光クエンチング、蛍光偏光から選択される方法を利用して行われる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、糖質、核酸、におい物質およびフェロモンを含有するが、これらに限定されることのない有機低分子からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドのシグナル活性を測定する前記段階が、セカンドメッセンジャーレベルにおける変化を検出することからなる、請求項３〜６および９〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
シグナル活性を測定する該段階が、グアニンヌクレオチド結合／共役または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、プロテインキナーゼＡ活性、 ホスファチジルイノシトールの分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流束、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラニンアッセイ、受容体内在化アッセイまたはリポーター遺伝子発現を測定することからなる、請求項３〜６および９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記シグナル活性を蛍光または発光アッセイによって測定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞内におけるＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性の調節方法であって、ＲＣＣ３５６の活性を調節できるように、ＲＣＣ３５６ポリペプチドの活性を調節するイソ吉草酸を前記細胞内に輸送する段階を含む方法。
【請求項２０】
前記方法がハイスループットスクリーニングである、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が化合物ライブラリーまたは動物器官の抽出物の一部である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法によって同定または検出されるイソ吉草酸関連薬剤。
【請求項２３】
請求項２２の薬剤を含む組成物。
【請求項２４】
医薬品の調製のための、請求項２２または２３に記載の薬剤または組成物の使用。
【請求項２５】
におい物質またはにおい物質のアンタゴニストの調製のための、請求項２２または２３に記載の薬剤または組成物の使用。
【請求項２６】
前記疾患または障害が好ましくは癌または腫瘍の転移からなる群から選択される、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用医薬品の調製のための、請求項２４に記載の薬剤または組成物の使用。
【請求項２７】
前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の薬剤または組成の使用。
【請求項２８】
前記疾患または障害が好ましくはＣＮＳ障害または疾患である、ＲＣＣ３５６関連の疾患またはＲＣＣ３５６関連の障害の治療用医薬品の調製のための、請求項２４に記載の薬剤または組成の使用。
【請求項２９】
前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんである、請求項２８に記載の薬剤または組成物の使用。
【請求項３０】
分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチドおよびイソ吉草酸を含む組成物。
【請求項３１】
分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチドおよび該酸を含む組成の製造用のイソ吉草酸の使用。
【請求項３２】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達を調整する薬剤のスクリーニング用キットの製造、ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患の診断または予後診断用キットの製造、もしくはにおい物質またはにおい物質のアンタゴニストのスクリーニング用キットの製造におけるＲＣＣ３５６との併用における、イソ吉草酸の使用。
【請求項３３】
ＲＣＣ３５６のリガンドとしてのイソ吉草酸の使用。
【請求項３４】
医薬品調製のためのイソ吉草酸の使用。
【請求項３５】
前記疾患または障害が好ましくは癌または腫瘍の転移からなる群から選択される、ＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害の治療用に前記医薬品が使用される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体またはその断片を認識する抗体。
【請求項３８】
ＣＮＳ障害または疾患の治療用医薬品の調製のための、ＲＣＣ３５６断片、ＲＣＣ３５６を認識する抗体、またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用。
【請求項３９】
前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんである、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常の治療用医薬品の調製のための、ＲＣＣ３５６断片、ＲＣＣ３５６を認識する抗体、またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用。
【請求項４１】
癌または腫瘍の転移の治療用医薬品の調製のための、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体を認識する抗体の使用。
【請求項４２】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であって、
ａ）組織サンプルとイソ吉草酸とが接触すること、
ｂ）前記酸の前記組織サンプルへの結合を検出すること、
および、
ｃ）前記標準品と比較した結合の違いが、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に用いられる、段階（ｂ）で検出される結合と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項４３】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であって、
ａ）組織サンプルとイソ吉草酸に特異的な抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対する特異的な抗体とが接触すること、
ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出すること、
および、
ｃ）前記標準品と比較して結合の違いが、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に用いられる、段階（ｂ）で検出される結合と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項４４】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であって、
ａ）組織サンプルとＲＣＣ３５６ポリペプチドに対して特異的な抗体およびイソ吉草酸に対して特異的な抗体またはＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に対する特異的な抗体が接触すること、
ｂ）前記抗体の前記組織サンプルへの結合を検出すること、
および、
ｃ）前記標準品と比較していずれか一方または両方の抗体の結合の違いが、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に用いられる、段階（ｂ）で検出される結合と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項４５】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断の方法であって、
ａ）組織サンプルのイソ吉草酸含量を定量すること、
および
ｂ）前記標準品と比較してイソ吉草酸の前記量の違いが、ＲＣＣ３５６の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断に用いられる、段階（ａ）で定量される前記酸の量と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項４６】
前記疾患または障害が、癌または腫瘍の転移からなる群から選択されるＲＣＣ３５６関連疾患またはＲＣＣ３５６関連障害である、請求項４２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患または障害が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６複合体に特異的な抗体が使用され、疾患または障害が、イソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ障害または疾患である、請求項４２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記ＣＮＳ疾患または障害がてんかんである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ関連障害または疾患の診断方法または予後診断方法であって、
ａ）組織サンプルのＲＣＣ３５６含量を定量すること、
および
ｂ）標準品と比較してＲＣＣ３５６の量における違いが、嗅覚異常の診断または予後診断、もしくはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断に用いられる、段階（ａ）で定量される受容体の量と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項５１】
該ＣＮＳ関連疾患または障害がてんかんである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＲＣＣ３５６抗体、ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６抗体、またはイソ吉草酸を使用して定量が行われる、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常またはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断の方法であって、
ａ）ＲＣＣ３５６をコードするｍＲＮＡの定量、および／または組織サンプルにおける野生型ＲＣＣ３５６の配列と比較した、前記ＲＣＣ３５６配列の正確性を検証すること、
および
ｂ）標準品と比較して量またはＲＣＣ３５６配列における違いが、イソ吉草酸関連の嗅覚異常の診断または予後診断、もしくはＣＮＳ関連障害または疾患の診断または予後診断に用いられる、段階（ａ）で定量または決定された前記核酸の量および／または正確性の標準品とを比較することを含む方法。
【請求項５４】
ＣＮＳ関連疾患または障害がてんかんである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
癌または腫瘍の転移を診断または予後診断する方法であって、
ａ）ＩＶＡ／ＲＣＣ３５６抗体を使用した組織サンプルのＲＣＣ３５６含量を定量すること、
および
ｂ）標準品と比較したＲＣＣ３５６の量の違いが、嗅覚異常の診断または予後診断、あるいは癌もしくは腫瘍の転移の診断または予後診断に用いられる、段階（ａ）で定量された前記受容体の量と標準品とを比較することを含む方法。
【請求項５６】
分離されたＲＣＣ３５６ポリペプチド、イソ吉草酸、そしてこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項５７】
ＲＣＣ３５６ポリペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチド、イソ吉草酸、そしてこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項５８】
ＲＣＣ３５６ポリペプチドを発現する細胞またはその膜、イソ吉草酸、そしてこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項５９】
前記ＲＣＣ３５６をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に形質転換させる、請求項５８に記載の該キット。
【請求項６０】
ＲＣＣ３５６のシグナル伝達活性を調節する薬剤のスクリーニング用の、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項６１】
におい物質または抗におい物質剤のスクリーニング用の、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項６２】
抗腫瘍化合物またはＣＮＳ障害または疾患の治療用化合物のスクリーニング用の、請求項請求項５６〜５９のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項６３】
前記癌が、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌からなる群から選択され、前記ＣＮＳ障害または疾患がてんかんである、請求項６２に記載のキットの使用。
【請求項６４】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断用のイソ吉草酸を含むキットの使用。
【請求項６５】
ＲＣＣ３５６シグナル伝達の異常調節を特徴とする疾患または障害の診断または予後診断用のイソ吉草酸抗体を含むキットの使用。
【請求項６６】
前記疾患または障害が癌である、請求項６４または６５記載の使用。
【請求項６７】
ＣＮＳ関連疾患の診断または予後診断用のＲＣＣ３５６を含むキットの使用。
【請求項６８】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常の診断または予後診断用のＲＣＣ３５６を含むキットの使用。
【請求項６９】
癌の進行および／または治療に及ぼすイソ吉草酸の効果を研究するためのＲＣＣ３５６またはそのオルソログのトランスジェニック動物の使用。
【請求項７０】
前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌の進行および／または治療が研究される、請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
ＣＮＳ障害または疾患の進行および／またはイソ吉草酸関連の嗅覚異常の治療を研究するためのＲＣＣ３５６またはそのオルソログのトランスジェニック動物の使用。
【請求項７２】
てんかんの進行および／または治療が研究される、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
癌の進行および／または治療を研究するための、イソ吉草酸を過剰生産するトランスジェニック動物の使用。
【請求項７４】
イソ吉草酸関連の嗅覚異常の進行に及ぼすＲＣＣ３５６の効果を研究するためのＲＣＣ３５６ノックアウトの使用。
【請求項７５】
ＣＮＳ障害または疾患の進行に及ぼすＲＣＣ３５６の効果を研究するためのＲＣＣ３５６ノックアウトの使用。
【請求項７６】
請求項１〜２１、４２〜５５のいずれかに記載の方法、請求項２２に記載の薬剤、請求項２４〜２９、３１〜３６、３８〜４１、６０〜７５のいずれかに記載の使用法、請求項３７に記載の抗体、請求項２３または３０に記載の組成物、もしくは図１ｂに示されているＲＣＣ３５６ポリペプチドに特異的に結合して、そのシグナル伝達活性を活性化させる、イソ吉草酸等価体が使用され、参照され、適用され、もしくは組み込まれる、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキット。
【請求項７７】
前記等価体が、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、 イソヘキサン酸、 ヘプタン酸、 イソヘプタン酸、オクタン酸、 イソオクタン酸、ノナン酸、 イソノナン酸、バルプロ酸、イソバレルアミド、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロ安息香酸、ペラルゴン酸、５−ヘキセン酸からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法、薬剤、使用、組成物、またはキット。
【請求項７８】
前記等価体が、酪酸、吉草酸、カプロン酸、オエナンチル酸、カプリル酸、ヘキサヒドロ安息香酸、ペラルゴン酸、５−ヘキセン酸からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法、薬剤、使用、組成物、またはキット。
【請求項７９】
請求項１〜２１、４２〜５５のいずれかに記載の方法、請求項２４〜２９、３１〜３６、３８〜４１、６０〜７５のいずれかに記載の使用法、請求項２３または３０記載の組成、請求項５６〜５９のいずれかに記載のキット、もしくはＲＣＣ３５６ポリペプチドが、図１ｂに示されるポリペプチドと少なくとも２０％の同一性、または２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、さらに１００％といったより高い同一性を有するが、該ＲＣＣ３５６ポリペプチドと同等の活性を有する、請求項７６〜７８のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項８０】
前記ＲＣＣ３５６ポリペプチドがキメラまたはその活性フラグメントである、請求項７９に記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【図１】
【図３−１】
【図２】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４】
【図５】
【図６】
【図３−１】
【図２】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５３８２７８（Ｐ２００８−５３８２７８Ａ）
【公表日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５７４２３（Ｐ２００７−５５７４２３）
【出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００１９０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９４７０４
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０７２９６６１０）ケミコム エス．エー． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００１９０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９４７０４
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０７２９６６１０）ケミコム エス．エー． (1)
【Ｆターム（参考）】
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