Ｎ−末端が修飾された走化性因子の生成法
本発明は、組換えにより生成されたGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1を調製する方法に関する。本発明の方法に従い、Gln-MCP-1は、温度30℃〜80℃の範囲で、10mM〜160mMの範囲の濃度の塩を含みpH値2〜7.5の範囲の緩衝液中で、MCP-1の少なくとも90％がピロGlu-MCP-1の形で提供されるまで、インキュベーションされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えにより生成されたGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1を調製する方法及びピロGlu-MCP-1調製物を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
MCP-1(単球走化性タンパク質-1；同じく、単球走化性及び活性化因子「MCAF」、マクロファージ走化性因子「MCF」、腫瘍壊死因子刺激した遺伝子-8「TSG-8」、「HC-11」、平滑筋細胞走化性因子「SMC-CF」、リンパ球由来走化性因子「LDCF」、更にはグリオーマ由来走化性因子「GDCF」の名称でも知られている)は、CC-ケモカインファミリーのメンバーである。ヒトMCP-1タンパク質は、当初、米国特許第5,714,578号に開示された。これは、天然の条件下で、99アミノ酸長の前駆体タンパク質として体内で(自然に)合成され、これはその後プロセッシングされ、76個のアミノ酸群を伴うペプチドを形成する。成熟ヒトMCP-1(hMCP-1)は、分子量14kDaの糖タンパク質であり、例えば血管平滑筋細胞及び内皮細胞のような、多くの種類の細胞により分泌される(Leonard and Yoshimura、Immunology Today、11:97-101(1990))。これはふたつの分子内ジスルフィド橋を含み、かつ自然に発現された場合は、O-グリコシル化及びシアル酸化される(J. Yan Ling et al.、Journal of Biological Chemistry、265:18318-18321(1990))。
【０００３】
このタンパク質は、染色体座位17q11.2-q21.1のJE遺伝子産物である。この遺伝子座は、SCY A2(小型誘導性サイトカインA2)としても公知である。このヒト遺伝子は、最初に、米国特許第5,212,073号に開示された。この遺伝子の発現は、例えば、腫瘍壊死因子αのような多くのサイトカインにより誘導されるが、例えば免疫グロブリンGによっても誘導され得る。この遺伝子配列並びに更には遺伝子及び遺伝子産物の情報は、NCBIデータバンクから寄託番号M37719で入手可能である(表1参照)。
【０００４】
表1：
ヒト単球走化性タンパク質遺伝子、完全なCDS
LOCUS HUMMCHEMP 2776bp DNA 線状 PRI 1994年5月13日
定義 ヒト単球走化性タンパク質遺伝子、完全CDS
寄託番号 M37719
バージョン M37719.1 GI:187447
キーワード 単球走化性タンパク質
給源 ホモ・サピエンス(ヒト)
生物 ホモ・サピエンス
真核生物界；後生動物；脊索動物門；有頭動物(Craniata)；
脊椎動物亜門(Vertebrate;Euteleostomi)；哺乳綱；
真獣亜綱；霊長目；類人猿上科；ヒト化；ヒト属
文献データ 1(塩基1〜2776)
著者 Shyy, Y.J.、Li, Y.S.及びKolattukudy, P.E.
タイトル Structure of human monocyte chemotactic protein gene
and its regulation by TPA
雑誌 Biochem. Biophys. Res. Commun.、169(2):346-351(1990)
メドライン 90290466
コメント Original source text: Human DNA.
特徴 Location/Qualifiers
給源 1..2776
/organism="homo sapiens"
/db_xref="taxon:9606"
遺伝子 598..2080
/gene="SCYA2"
CDS join(598..673,1472..1589,1975..2080)
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein"
/codon_start=1
/protein_id="AAA18102.1"
/db_xref="GI:487124"
翻訳= "MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLA
SYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT"
エキソン <598..673
/gene="SCYA2"
/note=" monocyte chemotactic protein"
/number=1
エキソン 598..673
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein"
/number=1
イントロン 674..1471
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein intron A"
エキソン 1472..1589
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein"
/number=2
イントロン 1590..1974
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein intron B"
エキソン 1975..2080
/gene="SCYA2"
/note=" monocyte chemotactic protein"
/number=3
エキソン 1975..>2080
/gene="SCYA2"
/note=" monocyte chemotactic protein"
/number=3
塩基カウント 700 a 727 c 565 g 781 t 3 others
起源
【０００５】
配列
1 cagttcaatg tttacacaat cctacagttc tgctaggctt ctatgatgct actattctgc
61 atttgaatga gcaaatggat ttaatgcatt gtcagggagc cggccaaagc ttgagagctc
121 cttcctggct gggaggcccc ttggaatgtg gcctgaaggt aagctggcag cgagcctgac
181 atgctttcat ctagtttcct cgcttccttc cttttcctgc agttttcgct tcagagaaag
241 cagaatcctt aaaaataacc ctcttagttc acatctgtgg tcagtctggg cttaatggca
301 ccccatcctc cccatttgcg tcatttggtc tcagcagtga atggaaaaaa gtgctcgtcc
361 tcacccccct gcttcccttt cctacttcct ggaaatccac aggatgctgc atttgctcag
421 cagatttaac agcccactta tcactcatgg aagatccctc ctcctgcttg actccgccct
481 ctctccctct gcccgctttc aataagaggc agagacagca gccagaggaa ccgagaggct
541 gagactaacc cagaaacatc caattctcaa actgaagctc gcactctcgc ctccagcatg
601 aaagtctctg ccgcccttct gtgcctgctg ctcatagcag ccaccttcat tccccaaggg
661 ctcgctcagc caggtaaggc cccctcttct tctccttgaa ccacattgtc ttctctctga
721 gttatcatgg accatccaag cagacgtggt acccacagtc ttgctttaac gctacttttc
781 caagataagg tgactcagaa aaggacaagg ggtgagcccc aaccacacag ctgctgctcg
841 gcagagcctg aactagaatt ccagctgtga acccaaatcc agctccttcc aggattcagg
901 atccagctct gggaacacac tcagcagtta ctcccccagc tgcttccagc agagtttggg
961 gatcagggta atcaaagaga agggtgggtg tgtaggctgt ttccagacac gctggagacc
1021 cagaatctgg tctgtgcttc attcacctta gcttccagag accggtgact ctgcaggtaa
1081 tgagtatcag ggaaactcat gaccaggcat agctattcag agtctaaaag gaggctcata
1141 gtggggctcc cagctgatct tccctggtgc tgatcatctg gattattggt ccgtcttaat
1201 gacacttgta ggcattatct agctttaaca gctcctcctt ctctctgtcc attatcaatg
1261 ttatataccc cattttacag cataggaaac tgagtcattg ggtcaaagat cacattctag
1321 ctctgaggta taggcagaag cactgggatt taatgagctc tttctcttct cctgcctgcc
1381 ttttgttttt tcctcatgac tcttttctgc tcttaagatc agaataatcc agttcatcct
1441 aaaatgcttt tctttgtggt ttattttcca gatgcaatca atgccccagt cacctgctgc
1501 tataacttca ccaataggaa gatctcagtg cagaggctcg cgagctatag aagaatcacc
1561 agcagcaagt gtcccaaaga agctgtgatg tgagttcagc acaccaacct tccctggcct
1621 gaagttcttc cttgtggagc aagggacaag cctcataaac ctagagtcag agagtgcact
1681 atttaactta atgtacaaag gttcccaatg ggaaaactga ggcaccaagg gaaaaagtga
1741 accccaacat cactctccac ctgggtgcct attcagaaca ccccaatttc tttagcttga
1801 agtcaggatg gctccacctg gacacctata ggagcagttt gccctgggtt ccctccttcc
1861 acctgcgtcc tcctagtctc catggcagct cgcttttggt gcagaatggg ctgcacttct
1921 agaccaaaac tgcaaaggaa cttcatctaa ctctgtctcc tcccttcccc acagcttcaa
1981 gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag aagtgggttc aggattccat
2041 ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga acactcactc cacaacccaa
2101 gaatctgcag ctaacttatt ttcccctagc tttccccaga caccctgttt tattttatta
2161 taatgaattt tgtttgttga tgtgaaacat tatgccttaa gtaatgttaa ttcttattta
2221 agttattgat gttttaagtt tatctttcat ggtactagtg ttttttagat acagagactt
2281 ggggaaattg cttttcctct tgaaccacag ttctacccct gggatgtttt gagggtcttt
2341 gcaagaatca ttaatacaaa gaattttttt taacattcca atgcattgct aaaatattat
2401 tgtggaaatg aatattttgt aactattaca ccaaataaat atatttttgt acaaaacctg
2461 acttccagtg ttttcttgaa ggaaattaca aagctgagag tatgagcttg gtggtgacaa
2521 aggaacatga tttcagaggg tggggcttac attttgaagg aatgggaaag tggattggcc
2581 cnntntcttc ctccactggg tggtctcctc tgagtctccg gtagaagaat ctttatggca
2641 ggccagttag gcattaaagc accacccttc cagtcttcaa cataagcagc ccagagtcca
2701 atgaccctgg tcacccattt gcaagagccc acccccattt cttttgctct cacgaccctg
2761 accctgcatg caattt
//
【０００６】
前記米国特許第5,714,578号において、天然の給源からMCP-1タンパク質が単離された場合に、そのN末端はブロックされていることが既に説明されている。後になってようやく、これは成熟タンパク質のN末端のリーダー配列の切断後に露出されたグルタミンが、環化されNH3分子を喪失し、ピログルタミン酸基を形成するという翻訳後修飾に起因することが発見された。
米国特許第5,212,073号において、MCP-1をコードしているオープンリーディングフレームの同定は、このタンパク質の組換え発現を可能にした。例えばE. coliなどにおける組換え法により作出されたMCP-1は、未変性のMCP-1の典型的N-又はO-グリコシル化パターンを有さない。この方法で調製されたMCP-1調製物は同じく、未変性の材料から得た調製物と同じ様式でEdman分解を妨害せず、すなわちこれはブロックされないN末端(グルタミン)を含む。マクロファージに対する走化作用を基にした細胞アッセイにおいて、未変性のMCP-1調製物と組換え法により得られたものの生物活性の間には、当初差異は認められない。
【０００７】
生理的条件下において、MCP-1は、両者とも主に単球において発現されかつ好塩基球上並びにT-及びB-リンパ球上の両方でも認められるβ-ケモカイン受容体CCR2及びCCR4に、アゴニストとして作用する。MCP-1は、ナノモル以下の濃度であっても、単球走化性を誘導する。受容体CCR2及びCCR4は、単球の活性化及びインテグリンの増加した接着につながる、G-タンパク質-共役型7回膜貫通ドメイン受容体である。この方法は、最終的には、単球の内皮細胞への接着(docking)及び引き続きの血管系からの単球の離脱(departure)を生じる。
【０００８】
国際公開公報第98/44953号は、MCP-1の動脈形成、すなわち存在する小動脈結合部からの側副動脈及び／又は他の動脈への成長に対する影響を開示している。この知見を基に、前記国際特許出願において、治療目的で、すなわち新規血管の形成を刺激することにより緩和され得る血管閉塞性疾患の治療のために、MCP-1を使用することが提唱された。このような血管閉塞性疾患は、特に冠動脈疾患(CAD)、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、脳動脈及び腸間膜動脈閉塞性疾患などである。この出願は、特に十分な血液供給及びその結果の適切な腫瘍組織の血管形成に頼っている腫瘍増殖を撃退することを目的として、新規血管形成を予防するための、例えば抗-MCP-1-抗体のような、MCP-1-中和剤の使用も提唱している。
【０００９】
組織の血管形成を促進する治療的方法において先に説明したようにMCP-1タンパク質を使用することができることを目的として、医薬目的に十分な純度で利用可能な十分に大量のタンパク質が作出されなければならない。ヒトMCP-1は、当初ヒトグリオーマ細胞株U105MG又は末梢血のヒト単核白血球の培養物から未変性の形で得られた。治療目的が意図されたタンパク質の十分に大量の生成は、労働及び／又は材料に関して許容できない程高コストである場合のみ可能であり；必要量のヒト白血球を得ることは不可能であるので、このタンパク質はこれらの給源からは単離することができない。これらのグリオーマ細胞は、実際に事実上制限されない量で複製することができるが、バイテクノロジー的発酵槽における培養には適しておらず、かつ更にそれらの培養にはウシ胎仔血清を必要とし、例えばあらゆるそれに付帯する問題点を伴う。
【００１０】
従ってMCP-1の未変性の発現の代わりに、組換え法によりMCP-1を調製することは、魅力的な展望がある。実際、組換えヒトMCP-1は既に市販されており、特にMessrs R&D Systems社(カタログ番号279-MC)及びPeprotech社(カタログ番号300-04；表2参照；引用されたカタログ番号は、2003年1月に入手可能なものである。)から販売されている。市販の組換えMCP-1調製物の製品規格によると、その中に存在するMCP-1タンパク質は、アミノ酸グルタミン(Q)をN末端に含んでいる。この製品説明は、このタンパク質調製物は、特に再構成された液体型において(推奨された最大貯蔵：4℃で1週間)、高い感受性があることも指摘している。実際本発明者らによる実験(社内(internal)の先行技術)は、通常のMCP-1タンパク質調製物が溶解された形で貯蔵される場合に、この-生物活性のある-タンパク質調製物は、特に温度4℃以上での、非常に迅速な製品の崩壊により、夾雑の徴候を示すように見えることを示した(分析的HPLCクロマトグラフィーにおいて二次的バンドの出現)。
【００１１】
表2(Messrs Peprotech社のインターネットウェブサイトからの抜粋
http://www.peprotech.com/content/details.htm?results=1&prod=1392):
組換えヒトMCAF(ヒトMCP-1)
説明：マクロファージ/単球走化性及び活性化因子(MCAF)としても知られているヒト単球走化性タンパク質-1(MCP-1)は、76個のアミノ酸残基を含む、8.6kDaタンパク質である。これは、血液単球及び組織マクロファージの炎症反応において重要な役割を果たす。
カタログ番号：300-04
給源：E.coli
製剤：滅菌濾過した溶液を、添加剤を加えずに凍結乾燥。
安定性：凍結乾燥したタンパク質は、室温で数週間安定しているが、最良の貯蔵は-20℃である。再構成されたヒトMCAFは、-20℃で作業アリコートにおいて貯蔵すること。
純度：SDS-PAGE及びHPLC分析により99％以上。エンドトキシンレベルは、0.1ng/μg(1EU/μg)未満である。
再構成：当社は、迅速な回転(quick spin)後、水中に濃度0.1〜1.0mg/mlで再構成することを推奨する。その後この溶液は、他の水生緩衝液に希釈され、4℃で1週間、又は-20℃で将来の使用のために貯蔵することができる。
生物活性：濃度範囲5.0〜20.0ng/mlを用い、ヒト単球を化学誘引する能力により決定。
アミノ酸配列：QPDAINAPVT CCYNFTNRKI SVQRLASYRR ITSSKCPKEA VIFKTIVAKE ICADPKQKWV QDSMDHLDKQ TQTPKT
原産国：米国
【００１２】
ヒトMCP-1タンパク質を組換えにより作出する通常の方法は、融合タンパク質としてのタンパク質の温度-誘導した発現、引き続き形成された封入体の精製、タンパク質の溶解及びリフォールディング、並びにその後の融合タンパク質からのhMCP-1タンパク質の酵素的放出による。
ヒトMCP-1タンパク質の組換え調製物に関する通常の方法において、N-末端が1個又は複数のアミノ酸だけ切断されたタンパク質が副産物として得られることが多いという問題が生じている。これらの副産物は、生物学的システムにおいて、MCP-1受容体のアンタゴニストとして挙動することがある。
【００１３】
Van Coillieらの論文(Biochemistry、37:12672,12673 a.E. (1998))において、MCP-2の生物活性に対するN-末端修飾の影響に関する実験と組合せた方法が説明されており、ここで組換え法により得られたMCP-2調製物は、0.01M Na2HPO4、pH8.0中で、24時間、37℃でインキュベーションされる。MCP-2は、MCP-1と、アミノ酸配列レベルで62％の相同性を有し、かつN-末端が修飾されないMCP-1は、MCP-2とは異なり、生物活性がある範囲が、それとは異なる(表2の「生物活性」の行参照)。この論文の執筆者らは、前述の条件下で生じるN-末端グルタミン基がピログルタミン酸基に変換する程度は決定しなかった。本発明者らは、どのような場合であってもMCP-1と同様の条件の適用は、N-末端アミノ酸の部分的環化につながるのみであることを発見した(社内の先行技術)(表3、比較試験2参照)。
【発明の開示】
【００１４】
従って本発明のひとつの目的は、前述の考察を考慮し、(a)その生物活性の観点から治療的目的に適しており、かつ(b)バイオ医薬品の場合、例えば、医薬組成物の純度及び製造の再現性に関し準拠することが極めて困難である必要要件を含む薬物のライセンス供与手続きに関して利点を有し、並びに特に、(c)優れた貯蔵寿命を有する、MCP-1-調製物(MCP-1組成物)が調製される方法を提供することである。他の関連した目的は、組換え法により生成されたMCP-1を含み、かつ前述の目的に適するか又は前述の利点を有するような組成物又は調製物を提供することである。
これらの目的は、「特許請求の範囲」に引用されたMCP-1を含有する方法及び組成物により実現される。
【００１５】
従って本発明に従い、組換えにより生成されたGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1を調製する方法は、Gln-MCP-1が、温度30℃〜80℃の範囲、好ましくは30℃〜70℃の範囲、より好ましくは35℃〜60℃の範囲で、塩濃度10mM〜160mMの範囲、好ましくは10mM〜100mMの範囲を有し、並びにpH2〜7.5、好ましくは3.5〜7.5、より好ましくは3.5〜6.5、より好ましくは5〜6.5、より好ましくは5.5〜6.5の範囲を有し、かつ更に好ましくはpH約6を有する緩衝液中で、インキュベーションされることで提供された。このインキュベーションは、インキュベーション緩衝液中に含まれたMCP-1の少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％が、ピロGlu-MCP-1の形で存在するまで実行される。
【００１６】
"MCP-1"は、本開示の範囲において、状況に応じて、N-末端グルタミン基を伴う("Gln-MCP-1"；表1及び表2に示されたアミノ酸配列と比較)又はピログルタミン酸基に既に変換/環化されたN-末端を伴う("ピロGlu-MCP-1")、MCP-1タンパク質(プレプロ配列を伴わない)を意味する。しかし、その生物学的機能(特に、単球-誘引活性又はCCR受容体に対する作用)に影響を及ぼさず、かつ先に説明された反応パラメータが最早望ましい結果を生じない(すなわちこのタンパク質は本発明の方法によりピロGlu-変種に最早変換され得ない)ようにその構造を変更しないような、MCP-1-タンパク質の修飾は、保護の範囲から逸脱しないことは明らかである。従って本発明の方法は、これが、得られるタンパク質の生物学的機能又は生物活性にも、前述の方法によるN-末端グルタミンのピログルタミン酸への変換可能性のいずれにも影響を及ぼさない限りは、例えばセリンのトレオニンへ又はロイシンのイソロイシンへのような保存的アミノ酸置換が生じたMCP-1にも当然適用可能である。従って本発明の方法は、例えばラット、マウス、モルモット、ウサギ及びフェレット(及びいくつか他の種)などの他の哺乳類のMCP-1タンパク質に適用することもできる。
【００１７】
その中で先に説明された方法が実行される緩衝液は、好ましくは低い又は生理的モル濃度、すなわち10〜160mM、10〜80mM、10〜50mM、20〜40mMの範囲、又は約20もしくは40mMである、リン酸-緩衝した(リン酸ナトリウム及び／又はリン酸カリウム-緩衝した)水溶液である。比較的長いインキュベーション時間が許容できる場合は、本発明のひとつの特定の態様に従い、この作業は生理的モル濃度、例えば約150mMの生理食塩水濃度で行うことができ、このモル濃度は好ましくはリン酸-緩衝した生理食塩水溶液又は"PBS"の使用により実現される。比較的長いインキュベーション期間の欠点-及び崩壊生成物、二次的生成物又は酸化生成物の量の増加という付帯するリスク-は、この特定の態様において、生理的塩濃度の溶液の形ですぐにタンパク質調製物を得ることができるという利点により埋め合わされる。
【００１８】
その中で修飾工程が実行される緩衝液は、例えば、(穏やかな)界面活性剤、酸化防止剤、保存剤、錯化剤、安定剤、抗菌剤なども含むことができる。
インキュベーション温度は、30℃〜80℃の範囲、すなわち周囲温度よりも高い温度から選択される。比較的低い温度で、この変換工程は、非常に遅く進行する。事実上全ての変換を実現するためには、インキュベーション期間は、実質的に1週間よりも長く延長されるであろう。これは、バイオテクノロジー的方法において許容できない時間がかかることにつながり、更にタンパク質溶液の夾雑(崩壊生成物又は酸化生成物、細菌、ウイルス又は病原体による)の別の形のリスクを実質的に増大する。他方で、80℃を超えるインキュベーション温度の上昇は実際変換反応を大きく加速するにもかかわらず、これは望ましくない副産物及び崩壊生成物の形成の増加も生じる(実施例1及び2参照)。最大6日間の放置時間が許容できるならば、35〜40℃のインキュベーション温度が特に好ましい。インキュベーションが可能な限り著しく短い場合、インキュベーションは、例えば、50〜60、70又は80℃の範囲で実行されてもよい。40〜50℃の範囲の温度は、天然には、望ましい結果も生じるであろう。
【００１９】
インキュベーション緩衝液のpHは、2〜7.5、すなわち中性から酸性の範囲でなければならない。このpHは好ましくは3.5〜7.5の範囲、より好ましくは3.5〜6.5の範囲、より好ましくは5〜6.5の範囲、更に好ましくは5.5〜6.5の範囲であり、より好ましくはpH約6が選択される。
例えば本実施例に説明されるような、前記パラメータの適当な選択により、ピロGlu-MCP-1変種は、いずれの場合にも純度90％で、可能ならばより高く、例えば95％、96％又は98％で得ることができ、この割合は、溶液中に存在する総MCP-1の量(すなわち、Gln-MCP-1及び可能な酸化生成物及び他の副産物又は崩壊生成物の残存量を含む)を基にしたピロGlu-MCP-1の量(例えば、HPLC溶出プロファイルの曲線下面積により決定される)を示す。
【００２０】
本発明の別の態様に従い、少なくとも下記の工程を含むピロGlu-MCP-1調製物を調製する方法が提供される：
−宿主細胞においてMCP-1をコードしている遺伝子構築体の発現による組換え法によるGln-MCP-1調製物の調製、
−任意のGln-MCP-1調製物中に含まれたGln-MCP-1の濃縮及び／又は精製、並びに最後に
−Gln-MCP-1調製物中に含まれる又は濃縮及び／もしくは精製の前にその中に含まれるようなGln-MCP-1の、タンパク質分子種ピロGlu-MCP-1を含むピロGlu-MCP-1調製物への変換、この工程は、前述の"Process for preparing pyroGlu-MCP-1 from recombinantly produced Gln-MCP-1"に従い実行される。
この方法は、任意に、例えば、ピロGlu-MCP-1調製物の緩衝、又は例えばカラムクロマトグラフィー、透析、限外濾過などの引き続きの工程による更なる精製を含んでもよい。
【００２１】
バイオテクノロジーにより組換えタンパク質を作出する方法は公知である。これらは特に、発酵、精製、濃縮、及び他の工程を含む。前述の変換工程は、"多工程法"において様々な時点で含まれることができ、すなわち出発溶液として、依然大部分精製されないか又は全体が精製されたMCP-1タンパク質溶液を使うことができる。特により多く、より少なく又は実質的に全体が精製された形の依然(全体的に)変換されていないGln-MCP-1は、依然未変性の形でその貯蔵寿命を改善するために凍結乾燥され、並びに適当な時期に溶液に戻され、その後前述の方法に従いピロGlu-MCP-1に変換される方法を有することも考えられる。当然に、ピロGlu-MCP-1への変換後に得られたタンパク質溶液も凍結乾燥することができる。
【００２２】
この方法の産物、すなわちN-末端修飾(変換)が施されたピロGlu-MCP-1調製物は、本発明に従い、ピロGlu-MCP-1を、MCP-1総含量(例えば、変換タンパク質＋未変換タンパク質＋酸化により形成された副産物)を基に少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、及びより好ましくは少なくとも96％の量を含む。
用語(Gln-又はピロGlu-MCP-1-)調製物は、この方法の様々な段階において、MCP-1タンパク質は(緩衝)溶液中に溶解型で存在し、その結果すなわち、MCP-1に加え、いずれの場合においても使用される緩衝塩のイオン、及び同じく可能性のある他の塩、酸化防止剤、安定剤、抗菌剤、界面活性剤、保存剤、錯化剤など、他の成分が存在することを意味する。
【００２３】
本発明の更なる局面に従い、前述の方法による、ピロGlu-MCP-1又はピロGlu-MCP-1調製物を含む組成物が提供され、ここで組成物(変換タンパク質＋未変換タンパク質＋副産物；すなわち、例えばHPLC溶出クロマトグラフィーにおける"曲線下面積")中に含まれたMCP-1の少なくとも90％は、ピロGlu-MCP-1の形で存在する。
従って本発明は、特に原核生物、及び特に好ましくは大腸菌における組換え法により生成されたMCPO-1調製物に関連し、ここでMCP-1タンパク質の少なくとも90％は、ピロGlu-MCP-1として存在する。一般的発現細胞において調製される場合、このタンパク質は頻繁には、自然の生成とは異なり、天然のグリコシル化パターンを示さないであろう。例えば大腸菌などの原核生物において調製される場合、特にヒトの体において自然の発現において生じる形とは異なり、得られたピロGlu-MCP-1又は得られたピロGlu-MCP-1調製物は、グリコシル化及び／又はシアル酸化されず、従ってこの種の未変性のタンパク質又は未変性の給源から得られたタンパク質調製物とは異なるであろう。
【００２４】
本発明のこの種の組成物は、特に、総MCP-1含量(変換タンパク質＋未変換タンパク質＋副産物)の少なくとも90％、95％又は96％を生じるピロGlu-MCP-1の量に加え、常用の賦形剤及び担体、塩、酸化防止剤、安定剤、抗菌剤、界面活性剤、保存剤、錯化剤などを含有する、医薬品又は医薬組成物であってよい。本発明の組成物は、特にPAOD又はCADのような、動脈閉塞性疾患に罹患した患者を治療するために使用することができる。この治療は、例えば動脈内注入によるか、又はそこからMCP-1タンパク質がかなり長い期間にわたり放出される末梢動脈に配置されたゲル形のような、適当な経路により、治療的有効量のそのような組成物を投与することを含む。
驚くべきことに、予想に反して、組換えにより調製されたMCP-1タンパク質調製物の水溶液中及び上昇した温度でのインキュベーションは、その分解及び生物学的失活につながらないこともわかっている；対照的に、多くのパラメータの適当な選択により、バイオテクノロジーの観点からは余り一般的でなくかつ通常本質的には望ましくないこの工程は、驚くべきことに均質で、生物学的に十分に活性のあるピロGlu-MCP-1調製物を生じ、これは例え長期に渡る貯蔵期間であっても、その均質性を維持する、すなわちGln-MCP-1(出発)調製物よりもより安定している。
【００２５】
米国の食品医薬品局(FDA)又はヨーロッパのEMEAのような機関は、患者の保護という究極の目的により製薬業者に課される多くの条件に合致することに応じて、薬物の販売承認を許可する。従って当該の製造業者は、例えば医薬製品の純度、その貯蔵寿命及びその製造の再現性などを明らかにする証明を提供しなければならない。これらの3種の局面は、小さい選択でしかないが、バイオ医薬品、すなわち天然の材料又はそれらから誘導されたもの(タンパク質、核酸、プロテオグリカン、多糖など)からなる巨大分子の活性物質を含む薬物のライセンス供与において中心的役割を正確に果たす。時折、本承認の枠内で(バイオ)医薬品に強いられた必要要件は、合致することが非常に困難であることがある。例えばタンパク質を基にした活性物質は、より複雑な又は余り複雑でない細胞生物体におけるそれらの生成後に集中的かつ複雑な多-段階精製が施され、かつ例えば酸化又は他の自発的化学反応により、構造が制御できないように変更されることがあってはならない。更に最終生成物は、妥当な貯蔵寿命を有さなければならず、その結果製造業者と処方する医師又はその製品を使用する患者もしくは診療所の間に複雑かつ経費のかかる供給網は不要であり−これは、概して特に正確な二次構造(折畳み)を維持することが重要であるタンパク質の場合、唯一の大きな困難に遭う必要要件である。
【００２６】
MCP-1タンパク質の場合、市販の調製物の品質は、例えばin vitro試験に多くの観点で適していることが多い。しかし本発明者らは、この調製物は承認されるにふさわしい薬物の製造に決して適していないことを、自分達の作業過程において認めた。例えば医師の診療所又は病院において無視することができないような、患者へ投与する前に例え短時間であっても周囲温度で溶液中に放置することは、本発明者らの経験では、当初夾雑物として認められたMCP-1調製物中の"崩壊"生成物の出現につながった。当初活性物質として提供されたGln-MCP-1のより徹底した精製は、高レベルの純度を短期間回復するが、この調製物であっても、溶液中及び周囲温度で短期間貯蔵される場合には、同じく不安定であった。そのような不安定な活性物質調製物を基にした薬物承認方法の手続きは、全く見込みがないわけでない場合にも、多大な問題により悩まされる。
【００２７】
驚くべきことに、これらの問題点は、本発明の内容により克服することができ、ここで通常でないかつ一見して非常に対立する製造工程、すなわち上昇した温度でのインキュベーション(これは今までは不均一性を正に促進するように思われた)が、実際の調製及び精製方法に含まれた。実際本発明者らにより詳細に分析されかつ完成された条件下で実行される場合、このようなインキュベーションは、最初の活性物質Gln-MCP-1の、当初は夾雑物と見なされたピロGlu-MCP-1形へのほぼ事実上定量的な変換をもたらすことができる。その後後者の形は、上昇した温度でのインキュベーションなどのようなタンパク質を変性する作用に対し信じ難いほど安定している。従ってその高い純度及び均質性、例外なく再現可能な製造及び貯蔵時の安定性に関して、より早期に付託されるライセンス供与手続きに対応する厳密な必要要件に従う良好な見込みを有する医薬活性物質としての使用に適しているMCP-1調製物が得られ、従ってMCP-1の活性を基にした新規治療的方法を実行することを可能にする。
【００２８】
本発明の部分的局面に従い、先に説明された方法及び「特許請求の範囲」の方法により調製されたピロGlu-MCP-1調製物が、
−血管閉塞性疾患、特に、冠動脈疾患(CAD)、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、脳動脈及び腸間膜動脈閉塞性疾患などの治療のために、
−血管閉塞性疾患、特に、冠動脈疾患(CAD)、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、脳動脈及び腸間膜動脈閉塞性疾患などの治療用の医薬組成物の調製のために
使用される。
従って本発明は、前述の血管閉塞性疾患に罹患した患者を治療する方法を実行することも可能にし、ここで変換により調製されたピロGlu-MCP-1調製物又はこの種のピロGlu-MCP-1調製物を用いて調製された医薬組成物が、例えば注射又は注入により投与される。
【００２９】
個々の最適化された方法パラメータに関して、バイオテクノロジー技術者は、極めて長い期間、場合によっては数日間、例えば60℃の上昇した温度で、タンパク質調製物をインキュベーションすべきであることを容易に納得することができないことも注目される。先に最適であるとして明らかにされたインキュベーション溶液の中性から酸性のpHに関して、これは化学的論理に対立している：グルタミンの環式ピログルタミン酸への変換は、遊離電子対が、C-γ-アミド基のC原子において、グルタミン酸のC-α-アミノ基の窒素原子の攻撃に対し作用する求核置換反応である。酸性pHは、本質的にC-α-アミノ基の増加したプロトン化につながり、その結果この反応速度に負の作用を有するであろう。しかしこれは正確には、本発明者らの知見に準ずるケースではない。ひとつの可能性のある説明は−これは厳密に解釈されるものではない−、フールディングされたMCP-1タンパク質は、N末端に微小環境を形成し、そこで周囲の水溶液の酸性pHの代わりに、アミノ基は脱プロトン化された形で存在し、すなわち遊離電子対が求核攻撃に利用可能であるというものである。
【００３０】
実施例
実施例1：本発明の方法によるピロGlu-MCP-1調製物の生成
発酵：
発酵は、大腸菌(Escherichia coli)株K12(W3110)により実行した。この株は、下記エレメントを含むColE1プラスミド(pBR322誘導体)で形質転換した：汎用(all-purpose)プロモーター(ホスファターゼ、pPhoA)の制御下のhMCP-1のゲノム配列、ColE1-複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子。発酵のために、この産生株は、テトラサイクリンを含有するLB培地中、振盪フラスコにおいて、予備培養した。インキュベーションは、37℃で、ODが1に達するまで実行した。予備培養物を、発酵槽に移し、更に攪拌及び37℃で空気を供給しながら培養した。この培地は、ブドウ糖、様々な塩、微量元素、酵母抽出物、アミノ酸及びテトラサイクリンを含有した。このpHは、アンモニアにより6.8に維持した。投入されたブドウ糖が消費された直後、溶存酸素(pO2)は、ブドウ糖供給により40％の意図されたレベルで一定に維持した。ホスファターゼプロモーターの誘導は、培地中のリン酸が消費された直後に自動的に生じた。39時間後、バイオマスは、チューブ遠心(CEPA)により収集し、かつ-70℃で貯蔵した。
【００３１】
細胞溶解及びタンパク質精製工程：
凍結細胞ペレットは、Ultraturraxを用い、4倍量の溶解緩衝液(200mM Tris、55mM NaCl、5mM EDTA、pH7.5)中に再懸濁した。この細胞溶解は、460barでホモジナイザーにより2回通過(passage)させ行った。細胞断片は、CEPA遠心により除去した。上清は、任意にPolysep II (1.2μm)フィルター(Millipore)で濾過し、その後QセファロースFF及びSPセファロースFFからなる組合せカラム上に負荷した。これらのカラムは、溶解緩衝液で平衡化した。
【００３２】
負荷が完了後、このカラム組合せを、溶解緩衝液で洗浄し、かつQセファロースカラムの留め具を外した。SPセファロースは、溶解緩衝液で、その後5M尿素(溶解緩衝液中)で、及び再度溶解緩衝液で洗浄した。この生成物を、直線NaCl勾配で溶出した。
溶離液は、最終濃度1.3mol/Lの硫酸アンモニウムで塩析し、3200gで15分間遠心した。上清を、1.3M硫酸アンモニウム(溶解緩衝液中)で平衡としたフェニルセファロースカラム上に負荷した。
フェニルセファロースの流れを、溶解緩衝液で平衡としたSource 30RPCカラムに流した。その後洗浄を、溶解緩衝液、水及び緩衝液A(5％EtOH、0,1％TFA)で行った。この生成物を、10倍カラム容量の 20％緩衝液B(95％EtOH、0.1％TFA)から70％緩衝液Bまでの直線勾配で溶離した。
【００３３】
変換工程：
この溶離液を、例えば、リン酸緩衝液、10-40mM、pH6.0-7.4の異なる緩衝液中で1:10に希釈した。好ましい態様に従い、この変換溶液の最終pHが6.0〜6.5の値となるようにした。タンパク質濃度は、0.2〜1.0mg/mLの間であった。この溶液を滅菌濾過し、穏やかに攪拌しながら(60rpm)、温度35〜80℃でインキュベーションした(異なるバッチで)。この反応の進行は、HPLC分析によりモニタリングした。
【００３４】
最終精製工程：
この反応が終点に達した直後、緩衝液A(40mMリン酸、pH6.0)中で平衡化した変換溶液をSPセファロースHPカラムに負荷した。溶離は、直線NaCl勾配で行った。溶離液中のNaCl濃度は、約350mmol/Lであり、タンパク質濃度は約3mg/mLであった。溶離液は、250mM NaClに相当する電導度になるよう、緩衝液Aで希釈した。その後これを更に、40mMリン酸、pH6.0、250mM NaClで、タンパク質濃度が1mg/mLになるまで希釈した。その後形成されたバルク溶液を、滅菌濾過し、4℃又は-70℃で、製剤の準備ができるまで貯蔵した。
【００３５】
解析：
先に考察した変換工程の進行は、RP-HPLCによりモニタリングした。溶離液プロファイルのクロマトグラフィーを、変換反応の開始前(t0)、並びにt=24h、t=48h及びt=120hで行った。図1に示した4種のクロマトグラフィーからわかるように、48時間後、このタンパク質の約90％が、インキュベーション温度35℃でピロGlu-MCP-1に変換された。HPLC解析は、ふたつのジスルフィド橋が適切に形成されたことを示した。
図2は、説明された条件下でのGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1への反応速度論を示している。これは反応時間が延長するにつれて、図2において"変種2"と称される不純物が出現したことを示し、更には特徴付けられなかった。
同様の反応パターンが、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5.5、又は0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH3.5中で、変換工程が実行された場合に観察された(データは示さず)。
24℃、60℃及び80℃の温度が、35℃の反応温度の代わりに使用されること以外は、先に説明された反応を反復した。表3にまとめたデータから明らかであるように、ピロGlu-MCP-1の満足できる収量が、妥当な時間内に24℃では得られなかった。他方60℃及び80℃では、有意に高い反応速度が観察された。80℃の反応速度は、周囲温度での速度のおよそ50倍であった。
【００３６】
表3：
n.d.＝決定されず、特定された時間以降に反応の終点には到達しなかった。
【００３７】
明らかにより高い反応温度が、副産物又は崩壊生成物の形成には好ましく、特に試験が80℃で実行される場合に、純度レベルが低下した(表3)。
図3は、表3にまとめた条件下(20mMリン酸緩衝液、35℃、60℃又は80℃)で得られた、高解像度の、ピロGlu-MCP-1調製物の溶離プロファイルのクロマトグラフィーを示している。これからわかるように、例え短いインキュベーション期間であっても高温では(例えば、80℃で3時間)、35℃で5日間のインキュベーションよりも、有意に多い不純物が、MCP-1副産物又は崩壊生成物と共に生じる。
この生成法から生じる方法のある種の態様におけるエタノール(EtOH)の含量(例えば5％)は、そのほかの点では一定の試験条件(20mMリン酸緩衝液、pH6.0)下で、この生成物の反応速度又は純度に負の作用を有さない。
【００３８】
実施例2：本発明の代替法によるピロGlu-MCP-1調製物の生成
発酵、細胞溶解及びタンパク質精製の工程は、実施例1に説明したように実行した。
変換工程：
Source 30 RPCの溶離液は、PBS、0.02％Tween20で、1:10に希釈した。その後タンパク質濃度は、約0.2〜0.5mg/mL、pHは約7.4であった。この溶液は、緩衝液成分に加え、約3.5％EtOH及び0.01％TFAを含有し、これは先のSource 30 RPC工程の溶離液に起源を有した。この溶液を、Millipak 20 (0.2μm、Millipore)によりポリプロピレン製フラスコに滅菌濾過し、穏やかに攪拌しながら35℃でインキュベーションした。反応の進行は、HPLC解析によりモニタリングした。反応の終点に到達すると直ぐに、変換溶液を、Pellikon 2 UDFメンブレン(3k、Millipore)で、PBS、0.02％Tween 20に対してウルトラダイアフィルトレーションし、及びタンパク質濃度を0.1mg/mLに調節した。この調製物を、滅菌条件下で、Millipore GVフィルター(0.22μm)を通し、ガラス容器の1mLバッチにデカントした。
【００３９】
解析：
変換工程の進行は、RP-HPLCによりモニタリングした。図4に認められるように、5日後に、90％を超えるタンパク質が、ピロGlu-MCP-1に変換される一方、驚くべきことに長いインキュベーション期間にもかかわらず、95％と非常に高い純度が得られた(表3)。20mMリン酸緩衝液を含有する混合液と、20mMリン酸緩衝液及び150mM塩を含有する混合液との比較から明らかであるように(実施例1、表3、3行から6行)、インキュベーション溶液としてPBSを含有する混合液中の比較的低い速度定数は、より高い塩濃度、イオン強度又は浸透圧よりも高いことができる。
【００４０】
実施例3：実施例1又は実施例2に従い生成されたMCP-1調製物を基にした医薬組成物の調製
実施例1又は実施例2において得られたピロGlu-MCP-1調製物を、0.02％Tween 20も含有するPBS(塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム；pH7.0)中濃度0.1mg/mLに希釈し、1mLの容積のガラス容器に移した。最後の医薬溶液は、透明で、無色かつ無臭であり、注射又は注入により投与することができる。
【００４１】
実施例4：ピロGlu-MCP-1及びGln-MCP-1の生物活性の比較
測定原理：
MCP-1は、MCP-1受容体CCR2bに結合しかつ活性化する。この受容体の活性化は、細胞質ゾルへのカルシウム流入につながる。これは、蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR；Molecular Devices)を用いて測定することができる。これを行うために、不活性蛍光色素エステルFluo-4 AMは、その表面にhCCR2bを発現している細胞にどっと流れ込み、その後このエステルは細胞内エステラーゼにより切断される。この形において、蛍光色素は、Ca2+イオンに結合する。波長488nmでの励起時に、528nmにピークのある発光が生じる。発光強度は、細胞質ゾルのカルシウム濃度によって決まる。従って放出された光の強度の変化は、細胞質ゾル内のカルシウム濃度と相関し、これは次に受容体の活性化の状態によって左右される。
MCP-1の添加後の特徴的な時間が引き金となる測定シグナルを、図5に示した。このことから、MCP-1の添加後、蛍光の急激な上昇に結びつけられた迅速なカルシウム放出が存在することは明らかである。このピーク(b)は、添加(a)後わずかにほんの数秒で到達する。添加(a)と最大刺激(b)の間の間隔は、おおまかに20〜30秒である。
下記の試験において、例えば最大値は、カルシウムが誘導したカルシウム流入のような二次的作用に余り影響されず、その結果より正確な測定が可能であるので、最大値を用い評価を行った。
【００４２】
安定して発現するCHO/hCCR2B-K1細胞の調製：
ヒトCCR2b受容体(Gene bank寄託番号：D29984)のコード領域を、PCRにより増幅した。その後1.08kb BamHI-XbaI断片を、発現ベクターにクローニングした。CHO-K1細胞は、発現ベクターとして作用するこのプラスミドによりトランスフェクションした。
これらの細胞は、Ham's F12培地を基にした培養培地において培養し、通常のように継代した。測定前日、5000個の細胞を、384-ウェルアッセイプレート(Corning Costar)に、培養培地40μlと共に播種し、一晩(およそ24時間)、37℃で、5％CO2、95％相対湿度で接着させた。全てのアッセイにおいて、測定は4回行った。
【００４３】
別の試験日、全ての物質のプレートの最初のものを調製した。0.1％BSA(プロテアーゼ非含有)を含むHanks緩衝液を、様々なMCP-1調製物のための希釈緩衝液として使用した。0.1％BSAを含むHanks緩衝液を、ブランク対照として使用した。次にFluo-4色素培地40μl/ウェルを、これらの細胞に添加し、これらの調製物を37℃、5％CO2、95％相対湿度で45分間インキュベーションした。その後染色された細胞を、60μl洗浄緩衝液で4回洗浄し、各ウェル中の洗浄緩衝液25μlの残渣を除去した。次にこれらの細胞を、洗浄緩衝液と共に更に5分間周囲温度でインキュベーションした。
蛍光を測定するために、FLIPR測定装置を、染色ウェルと非染色ウェルが少なくとも1:5倍異なり、かつ染色ウェルは約11,000蛍光カウントを有するように調節した。他のFLIPR設定は以下であった：
励起：488nm
発光：510〜570nm(バンドパス)
負の補正：Hanks/BSA(＝ブランク対照との比較)
バイアス減算：6(＝物質添加前の全てのウェルの0への平準化)
チップのプレ含浸：物質プレートからの関連物質溶液25μl(＝接着アーチファクトの最小化)
【００４４】
測定方法は、下記工程を含む：
5秒サイクルで6インターバル
15μl物質の添加
1秒サイクルで60インターバル
5秒サイクルで18インターバル
評価のために、物質添加後の78インターバルの最大シグナルを使用した。使用した対照混合物は以下であった：
ブランク対照：負の補正のため
陽性対照(ATP)：染色のチェックのため
参照対照(標準)：−細胞上の受容体発現のモニタリング
−未知試料の活性決定のための計算の基礎
試験される試料は、同一の希釈工程において参照対照と平行してピペッティングした。これらの試験において使用した濃度は、参照対照のEC50領域内であるように選択した。
【００４５】
本発明のMCP-1調製物と本発明でないMCP-1調製物の比較
本発明の方法により調製した2種のピロGlu-MCP-1調製物("バッチ071100kh"及び"バッチ0141921")並びにそのN-末端のグルタミン基は先に説明した本発明の方法工程においてピログルタミン酸基に変換されていない組換え法により調製したMCP-1調製物(Peprotechより入手可能なMCP-1調製物)を、先に説明した試験システムを用いて試験及び比較した。EC50は、前述のように記録した測定曲線から決定した(図6参照)。
事実上同じEC50値を、これら2種のピロGlu-MCP-1調製物から得たのに対し、本発明のものではないMCP-1調製物及びN-末端が修飾されないMCP-1調製物の値は、有意に異なった(図6)。後者の調製物のEC50値は、2〜3倍悪化されることが証明された(ピロGlu-MCP-1：EC50＝7.82nM；PeprotechのMCP-1調製物：EC50＝20.76nM)。
【００４６】
2種の調製物の生物活性は下記のように計算した：
第一に、陽性補正は、ピロGlu MCP-1について濃度1e-8Mで行い、すなわち10nMピロGlu-MCP-1の濃度で得られた値を100％と設定した。これは、上昇曲線のほぼ直線部分にある。このシグナル百分率を用い、例えばPeprotech MCP-1のような、他の調製物の活性を、下記式により算出した：
％活性(試料)＝RFU(1e-8Mの試料) x 100％ / RFU(1e-8Mの標準)
前記実施例において、表4に示したように、これは、ピロGlu-MCP-1調製物を基にN-末端が未修飾のMCP-1調製物について48％活性の値を生じた。
【００４７】
表4：
測定値(負の補正：Hanks/BSA；バイアス減算：6)
【００４８】
％活性(MCP-1(Peprotech))＝6151 x 100％ / 12898.3＝48％活性
【００４９】
実施例5：ピロGlu-MCP1の温度感受性
ピロGlu-MCP-1は、56℃又は95℃で1又は2時間インキュベーションした。その後依然存在する生物活性を、実施例4の試験システムを用い測定した。
ピロGlu-MCP-1調製物は、56℃で1時間又は2時間インキュベーションされた場合には、変性が起こらないことが分かった。しかし図7に示されたように、95℃でのインキュベーションは、非常に顕著な変性作用を示した。
【００５０】
実施例6：動脈閉塞性疾患に罹患した患者の治療：
PAOD患者を治療するために、先に調製したピロGlu-MCP-1調製物を、濃度1.2〜120μg/mlに調節した。使用直前に、この溶液を、最終濃度0.1〜10μg/mlに調節し、血管閉塞により冒された病巣近傍に動脈内経路で、1〜6時間かけて2〜12ml/分の流量で患者へ注入した。この注入は、1〜7日後に再度行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】Gln-MCP-1からピロGlu-MCP-1への変換を示すクロマトグラムである。
【図２】Gln-MCP-1からピロGlu-MCP-1への変換の経時的変化を示すグラフである。
【図３】ピロGlu-MCP-1調製物の溶離プロファイルを示すクロマトグラムである。
【図４】ピロGlu-MCP-1調製物の溶離プロファイルを示すクロマトグラムである。
【図５】MCP-1の添加後の蛍光カウントを示すグラフである。
【図６】本発明のMCP-1調製物と比較例のMCP-1調製物のRFU(負の補正：Hanks/BSA；バイアス減算：6)を示すグラフである。
【図７】ピロGlu MCP-1と変性したピロGlu MCP-1のRFU(負の補正：Hanks/BSA；バイアス減算：6) を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えにより生成されたGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1を調製する方法及びピロGlu-MCP-1調製物を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
MCP-1(単球走化性タンパク質-1；同じく、単球走化性及び活性化因子「MCAF」、マクロファージ走化性因子「MCF」、腫瘍壊死因子刺激した遺伝子-8「TSG-8」、「HC-11」、平滑筋細胞走化性因子「SMC-CF」、リンパ球由来走化性因子「LDCF」、更にはグリオーマ由来走化性因子「GDCF」の名称でも知られている)は、CC-ケモカインファミリーのメンバーである。ヒトMCP-1タンパク質は、当初、米国特許第5,714,578号に開示された。これは、天然の条件下で、99アミノ酸長の前駆体タンパク質として体内で(自然に)合成され、これはその後プロセッシングされ、76個のアミノ酸群を伴うペプチドを形成する。成熟ヒトMCP-1(hMCP-1)は、分子量14kDaの糖タンパク質であり、例えば血管平滑筋細胞及び内皮細胞のような、多くの種類の細胞により分泌される(Leonard and Yoshimura、Immunology Today、11:97-101(1990))。これはふたつの分子内ジスルフィド橋を含み、かつ自然に発現された場合は、O-グリコシル化及びシアル酸化される(J. Yan Ling et al.、Journal of Biological Chemistry、265:18318-18321(1990))。
【０００３】
このタンパク質は、染色体座位17q11.2-q21.1のJE遺伝子産物である。この遺伝子座は、SCY A2(小型誘導性サイトカインA2)としても公知である。このヒト遺伝子は、最初に、米国特許第5,212,073号に開示された。この遺伝子の発現は、例えば、腫瘍壊死因子αのような多くのサイトカインにより誘導されるが、例えば免疫グロブリンGによっても誘導され得る。この遺伝子配列並びに更には遺伝子及び遺伝子産物の情報は、NCBIデータバンクから寄託番号M37719で入手可能である(表1参照)。
【０００４】
表1：
ヒト単球走化性タンパク質遺伝子、完全なCDS
LOCUS HUMMCHEMP 2776bp DNA 線状 PRI 1994年5月13日
定義 ヒト単球走化性タンパク質遺伝子、完全CDS
寄託番号 M37719
バージョン M37719.1 GI:187447
キーワード 単球走化性タンパク質
給源 ホモ・サピエンス(ヒト)
生物 ホモ・サピエンス
真核生物界；後生動物；脊索動物門；有頭動物(Craniata)；
脊椎動物亜門(Vertebrate;Euteleostomi)；哺乳綱；
真獣亜綱；霊長目；類人猿上科；ヒト化；ヒト属
文献データ 1(塩基1〜2776)
著者 Shyy, Y.J.、Li, Y.S.及びKolattukudy, P.E.
タイトル Structure of human monocyte chemotactic protein gene
and its regulation by TPA
雑誌 Biochem. Biophys. Res. Commun.、169(2):346-351(1990)
メドライン 90290466
コメント Original source text: Human DNA.
特徴 Location/Qualifiers
給源 1..2776
/organism="homo sapiens"
/db_xref="taxon:9606"
遺伝子 598..2080
/gene="SCYA2"
CDS join(598..673,1472..1589,1975..2080)
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein"
/codon_start=1
/protein_id="AAA18102.1"
/db_xref="GI:487124"
翻訳= "MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLA
SYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT"
エキソン <598..673
/gene="SCYA2"
/note=" monocyte chemotactic protein"
/number=1
エキソン 598..673
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein"
/number=1
イントロン 674..1471
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein intron A"
エキソン 1472..1589
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein"
/number=2
イントロン 1590..1974
/gene="SCYA2"
/note="monocyte chemotactic protein intron B"
エキソン 1975..2080
/gene="SCYA2"
/note=" monocyte chemotactic protein"
/number=3
エキソン 1975..>2080
/gene="SCYA2"
/note=" monocyte chemotactic protein"
/number=3
塩基カウント 700 a 727 c 565 g 781 t 3 others
起源
【０００５】
配列
1 cagttcaatg tttacacaat cctacagttc tgctaggctt ctatgatgct actattctgc
61 atttgaatga gcaaatggat ttaatgcatt gtcagggagc cggccaaagc ttgagagctc
121 cttcctggct gggaggcccc ttggaatgtg gcctgaaggt aagctggcag cgagcctgac
181 atgctttcat ctagtttcct cgcttccttc cttttcctgc agttttcgct tcagagaaag
241 cagaatcctt aaaaataacc ctcttagttc acatctgtgg tcagtctggg cttaatggca
301 ccccatcctc cccatttgcg tcatttggtc tcagcagtga atggaaaaaa gtgctcgtcc
361 tcacccccct gcttcccttt cctacttcct ggaaatccac aggatgctgc atttgctcag
421 cagatttaac agcccactta tcactcatgg aagatccctc ctcctgcttg actccgccct
481 ctctccctct gcccgctttc aataagaggc agagacagca gccagaggaa ccgagaggct
541 gagactaacc cagaaacatc caattctcaa actgaagctc gcactctcgc ctccagcatg
601 aaagtctctg ccgcccttct gtgcctgctg ctcatagcag ccaccttcat tccccaaggg
661 ctcgctcagc caggtaaggc cccctcttct tctccttgaa ccacattgtc ttctctctga
721 gttatcatgg accatccaag cagacgtggt acccacagtc ttgctttaac gctacttttc
781 caagataagg tgactcagaa aaggacaagg ggtgagcccc aaccacacag ctgctgctcg
841 gcagagcctg aactagaatt ccagctgtga acccaaatcc agctccttcc aggattcagg
901 atccagctct gggaacacac tcagcagtta ctcccccagc tgcttccagc agagtttggg
961 gatcagggta atcaaagaga agggtgggtg tgtaggctgt ttccagacac gctggagacc
1021 cagaatctgg tctgtgcttc attcacctta gcttccagag accggtgact ctgcaggtaa
1081 tgagtatcag ggaaactcat gaccaggcat agctattcag agtctaaaag gaggctcata
1141 gtggggctcc cagctgatct tccctggtgc tgatcatctg gattattggt ccgtcttaat
1201 gacacttgta ggcattatct agctttaaca gctcctcctt ctctctgtcc attatcaatg
1261 ttatataccc cattttacag cataggaaac tgagtcattg ggtcaaagat cacattctag
1321 ctctgaggta taggcagaag cactgggatt taatgagctc tttctcttct cctgcctgcc
1381 ttttgttttt tcctcatgac tcttttctgc tcttaagatc agaataatcc agttcatcct
1441 aaaatgcttt tctttgtggt ttattttcca gatgcaatca atgccccagt cacctgctgc
1501 tataacttca ccaataggaa gatctcagtg cagaggctcg cgagctatag aagaatcacc
1561 agcagcaagt gtcccaaaga agctgtgatg tgagttcagc acaccaacct tccctggcct
1621 gaagttcttc cttgtggagc aagggacaag cctcataaac ctagagtcag agagtgcact
1681 atttaactta atgtacaaag gttcccaatg ggaaaactga ggcaccaagg gaaaaagtga
1741 accccaacat cactctccac ctgggtgcct attcagaaca ccccaatttc tttagcttga
1801 agtcaggatg gctccacctg gacacctata ggagcagttt gccctgggtt ccctccttcc
1861 acctgcgtcc tcctagtctc catggcagct cgcttttggt gcagaatggg ctgcacttct
1921 agaccaaaac tgcaaaggaa cttcatctaa ctctgtctcc tcccttcccc acagcttcaa
1981 gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag aagtgggttc aggattccat
2041 ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga acactcactc cacaacccaa
2101 gaatctgcag ctaacttatt ttcccctagc tttccccaga caccctgttt tattttatta
2161 taatgaattt tgtttgttga tgtgaaacat tatgccttaa gtaatgttaa ttcttattta
2221 agttattgat gttttaagtt tatctttcat ggtactagtg ttttttagat acagagactt
2281 ggggaaattg cttttcctct tgaaccacag ttctacccct gggatgtttt gagggtcttt
2341 gcaagaatca ttaatacaaa gaattttttt taacattcca atgcattgct aaaatattat
2401 tgtggaaatg aatattttgt aactattaca ccaaataaat atatttttgt acaaaacctg
2461 acttccagtg ttttcttgaa ggaaattaca aagctgagag tatgagcttg gtggtgacaa
2521 aggaacatga tttcagaggg tggggcttac attttgaagg aatgggaaag tggattggcc
2581 cnntntcttc ctccactggg tggtctcctc tgagtctccg gtagaagaat ctttatggca
2641 ggccagttag gcattaaagc accacccttc cagtcttcaa cataagcagc ccagagtcca
2701 atgaccctgg tcacccattt gcaagagccc acccccattt cttttgctct cacgaccctg
2761 accctgcatg caattt
//
【０００６】
前記米国特許第5,714,578号において、天然の給源からMCP-1タンパク質が単離された場合に、そのN末端はブロックされていることが既に説明されている。後になってようやく、これは成熟タンパク質のN末端のリーダー配列の切断後に露出されたグルタミンが、環化されNH3分子を喪失し、ピログルタミン酸基を形成するという翻訳後修飾に起因することが発見された。
米国特許第5,212,073号において、MCP-1をコードしているオープンリーディングフレームの同定は、このタンパク質の組換え発現を可能にした。例えばE. coliなどにおける組換え法により作出されたMCP-1は、未変性のMCP-1の典型的N-又はO-グリコシル化パターンを有さない。この方法で調製されたMCP-1調製物は同じく、未変性の材料から得た調製物と同じ様式でEdman分解を妨害せず、すなわちこれはブロックされないN末端(グルタミン)を含む。マクロファージに対する走化作用を基にした細胞アッセイにおいて、未変性のMCP-1調製物と組換え法により得られたものの生物活性の間には、当初差異は認められない。
【０００７】
生理的条件下において、MCP-1は、両者とも主に単球において発現されかつ好塩基球上並びにT-及びB-リンパ球上の両方でも認められるβ-ケモカイン受容体CCR2及びCCR4に、アゴニストとして作用する。MCP-1は、ナノモル以下の濃度であっても、単球走化性を誘導する。受容体CCR2及びCCR4は、単球の活性化及びインテグリンの増加した接着につながる、G-タンパク質-共役型7回膜貫通ドメイン受容体である。この方法は、最終的には、単球の内皮細胞への接着(docking)及び引き続きの血管系からの単球の離脱(departure)を生じる。
【０００８】
国際公開公報第98/44953号は、MCP-1の動脈形成、すなわち存在する小動脈結合部からの側副動脈及び／又は他の動脈への成長に対する影響を開示している。この知見を基に、前記国際特許出願において、治療目的で、すなわち新規血管の形成を刺激することにより緩和され得る血管閉塞性疾患の治療のために、MCP-1を使用することが提唱された。このような血管閉塞性疾患は、特に冠動脈疾患(CAD)、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、脳動脈及び腸間膜動脈閉塞性疾患などである。この出願は、特に十分な血液供給及びその結果の適切な腫瘍組織の血管形成に頼っている腫瘍増殖を撃退することを目的として、新規血管形成を予防するための、例えば抗-MCP-1-抗体のような、MCP-1-中和剤の使用も提唱している。
【０００９】
組織の血管形成を促進する治療的方法において先に説明したようにMCP-1タンパク質を使用することができることを目的として、医薬目的に十分な純度で利用可能な十分に大量のタンパク質が作出されなければならない。ヒトMCP-1は、当初ヒトグリオーマ細胞株U105MG又は末梢血のヒト単核白血球の培養物から未変性の形で得られた。治療目的が意図されたタンパク質の十分に大量の生成は、労働及び／又は材料に関して許容できない程高コストである場合のみ可能であり；必要量のヒト白血球を得ることは不可能であるので、このタンパク質はこれらの給源からは単離することができない。これらのグリオーマ細胞は、実際に事実上制限されない量で複製することができるが、バイテクノロジー的発酵槽における培養には適しておらず、かつ更にそれらの培養にはウシ胎仔血清を必要とし、例えばあらゆるそれに付帯する問題点を伴う。
【００１０】
従ってMCP-1の未変性の発現の代わりに、組換え法によりMCP-1を調製することは、魅力的な展望がある。実際、組換えヒトMCP-1は既に市販されており、特にMessrs R&D Systems社(カタログ番号279-MC)及びPeprotech社(カタログ番号300-04；表2参照；引用されたカタログ番号は、2003年1月に入手可能なものである。)から販売されている。市販の組換えMCP-1調製物の製品規格によると、その中に存在するMCP-1タンパク質は、アミノ酸グルタミン(Q)をN末端に含んでいる。この製品説明は、このタンパク質調製物は、特に再構成された液体型において(推奨された最大貯蔵：4℃で1週間)、高い感受性があることも指摘している。実際本発明者らによる実験(社内(internal)の先行技術)は、通常のMCP-1タンパク質調製物が溶解された形で貯蔵される場合に、この-生物活性のある-タンパク質調製物は、特に温度4℃以上での、非常に迅速な製品の崩壊により、夾雑の徴候を示すように見えることを示した(分析的HPLCクロマトグラフィーにおいて二次的バンドの出現)。
【００１１】
表2(Messrs Peprotech社のインターネットウェブサイトからの抜粋
http://www.peprotech.com/content/details.htm?results=1&prod=1392):
組換えヒトMCAF(ヒトMCP-1)
説明：マクロファージ/単球走化性及び活性化因子(MCAF)としても知られているヒト単球走化性タンパク質-1(MCP-1)は、76個のアミノ酸残基を含む、8.6kDaタンパク質である。これは、血液単球及び組織マクロファージの炎症反応において重要な役割を果たす。
カタログ番号：300-04
給源：E.coli
製剤：滅菌濾過した溶液を、添加剤を加えずに凍結乾燥。
安定性：凍結乾燥したタンパク質は、室温で数週間安定しているが、最良の貯蔵は-20℃である。再構成されたヒトMCAFは、-20℃で作業アリコートにおいて貯蔵すること。
純度：SDS-PAGE及びHPLC分析により99％以上。エンドトキシンレベルは、0.1ng/μg(1EU/μg)未満である。
再構成：当社は、迅速な回転(quick spin)後、水中に濃度0.1〜1.0mg/mlで再構成することを推奨する。その後この溶液は、他の水生緩衝液に希釈され、4℃で1週間、又は-20℃で将来の使用のために貯蔵することができる。
生物活性：濃度範囲5.0〜20.0ng/mlを用い、ヒト単球を化学誘引する能力により決定。
アミノ酸配列：QPDAINAPVT CCYNFTNRKI SVQRLASYRR ITSSKCPKEA VIFKTIVAKE ICADPKQKWV QDSMDHLDKQ TQTPKT
原産国：米国
【００１２】
ヒトMCP-1タンパク質を組換えにより作出する通常の方法は、融合タンパク質としてのタンパク質の温度-誘導した発現、引き続き形成された封入体の精製、タンパク質の溶解及びリフォールディング、並びにその後の融合タンパク質からのhMCP-1タンパク質の酵素的放出による。
ヒトMCP-1タンパク質の組換え調製物に関する通常の方法において、N-末端が1個又は複数のアミノ酸だけ切断されたタンパク質が副産物として得られることが多いという問題が生じている。これらの副産物は、生物学的システムにおいて、MCP-1受容体のアンタゴニストとして挙動することがある。
【００１３】
Van Coillieらの論文(Biochemistry、37:12672,12673 a.E. (1998))において、MCP-2の生物活性に対するN-末端修飾の影響に関する実験と組合せた方法が説明されており、ここで組換え法により得られたMCP-2調製物は、0.01M Na2HPO4、pH8.0中で、24時間、37℃でインキュベーションされる。MCP-2は、MCP-1と、アミノ酸配列レベルで62％の相同性を有し、かつN-末端が修飾されないMCP-1は、MCP-2とは異なり、生物活性がある範囲が、それとは異なる(表2の「生物活性」の行参照)。この論文の執筆者らは、前述の条件下で生じるN-末端グルタミン基がピログルタミン酸基に変換する程度は決定しなかった。本発明者らは、どのような場合であってもMCP-1と同様の条件の適用は、N-末端アミノ酸の部分的環化につながるのみであることを発見した(社内の先行技術)(表3、比較試験2参照)。
【発明の開示】
【００１４】
従って本発明のひとつの目的は、前述の考察を考慮し、(a)その生物活性の観点から治療的目的に適しており、かつ(b)バイオ医薬品の場合、例えば、医薬組成物の純度及び製造の再現性に関し準拠することが極めて困難である必要要件を含む薬物のライセンス供与手続きに関して利点を有し、並びに特に、(c)優れた貯蔵寿命を有する、MCP-1-調製物(MCP-1組成物)が調製される方法を提供することである。他の関連した目的は、組換え法により生成されたMCP-1を含み、かつ前述の目的に適するか又は前述の利点を有するような組成物又は調製物を提供することである。
これらの目的は、「特許請求の範囲」に引用されたMCP-1を含有する方法及び組成物により実現される。
【００１５】
従って本発明に従い、組換えにより生成されたGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1を調製する方法は、Gln-MCP-1が、温度30℃〜80℃の範囲、好ましくは30℃〜70℃の範囲、より好ましくは35℃〜60℃の範囲で、塩濃度10mM〜160mMの範囲、好ましくは10mM〜100mMの範囲を有し、並びにpH2〜7.5、好ましくは3.5〜7.5、より好ましくは3.5〜6.5、より好ましくは5〜6.5、より好ましくは5.5〜6.5の範囲を有し、かつ更に好ましくはpH約6を有する緩衝液中で、インキュベーションされることで提供された。このインキュベーションは、インキュベーション緩衝液中に含まれたMCP-1の少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％が、ピロGlu-MCP-1の形で存在するまで実行される。
【００１６】
"MCP-1"は、本開示の範囲において、状況に応じて、N-末端グルタミン基を伴う("Gln-MCP-1"；表1及び表2に示されたアミノ酸配列と比較)又はピログルタミン酸基に既に変換/環化されたN-末端を伴う("ピロGlu-MCP-1")、MCP-1タンパク質(プレプロ配列を伴わない)を意味する。しかし、その生物学的機能(特に、単球-誘引活性又はCCR受容体に対する作用)に影響を及ぼさず、かつ先に説明された反応パラメータが最早望ましい結果を生じない(すなわちこのタンパク質は本発明の方法によりピロGlu-変種に最早変換され得ない)ようにその構造を変更しないような、MCP-1-タンパク質の修飾は、保護の範囲から逸脱しないことは明らかである。従って本発明の方法は、これが、得られるタンパク質の生物学的機能又は生物活性にも、前述の方法によるN-末端グルタミンのピログルタミン酸への変換可能性のいずれにも影響を及ぼさない限りは、例えばセリンのトレオニンへ又はロイシンのイソロイシンへのような保存的アミノ酸置換が生じたMCP-1にも当然適用可能である。従って本発明の方法は、例えばラット、マウス、モルモット、ウサギ及びフェレット(及びいくつか他の種)などの他の哺乳類のMCP-1タンパク質に適用することもできる。
【００１７】
その中で先に説明された方法が実行される緩衝液は、好ましくは低い又は生理的モル濃度、すなわち10〜160mM、10〜80mM、10〜50mM、20〜40mMの範囲、又は約20もしくは40mMである、リン酸-緩衝した(リン酸ナトリウム及び／又はリン酸カリウム-緩衝した)水溶液である。比較的長いインキュベーション時間が許容できる場合は、本発明のひとつの特定の態様に従い、この作業は生理的モル濃度、例えば約150mMの生理食塩水濃度で行うことができ、このモル濃度は好ましくはリン酸-緩衝した生理食塩水溶液又は"PBS"の使用により実現される。比較的長いインキュベーション期間の欠点-及び崩壊生成物、二次的生成物又は酸化生成物の量の増加という付帯するリスク-は、この特定の態様において、生理的塩濃度の溶液の形ですぐにタンパク質調製物を得ることができるという利点により埋め合わされる。
【００１８】
その中で修飾工程が実行される緩衝液は、例えば、(穏やかな)界面活性剤、酸化防止剤、保存剤、錯化剤、安定剤、抗菌剤なども含むことができる。
インキュベーション温度は、30℃〜80℃の範囲、すなわち周囲温度よりも高い温度から選択される。比較的低い温度で、この変換工程は、非常に遅く進行する。事実上全ての変換を実現するためには、インキュベーション期間は、実質的に1週間よりも長く延長されるであろう。これは、バイオテクノロジー的方法において許容できない時間がかかることにつながり、更にタンパク質溶液の夾雑(崩壊生成物又は酸化生成物、細菌、ウイルス又は病原体による)の別の形のリスクを実質的に増大する。他方で、80℃を超えるインキュベーション温度の上昇は実際変換反応を大きく加速するにもかかわらず、これは望ましくない副産物及び崩壊生成物の形成の増加も生じる(実施例1及び2参照)。最大6日間の放置時間が許容できるならば、35〜40℃のインキュベーション温度が特に好ましい。インキュベーションが可能な限り著しく短い場合、インキュベーションは、例えば、50〜60、70又は80℃の範囲で実行されてもよい。40〜50℃の範囲の温度は、天然には、望ましい結果も生じるであろう。
【００１９】
インキュベーション緩衝液のpHは、2〜7.5、すなわち中性から酸性の範囲でなければならない。このpHは好ましくは3.5〜7.5の範囲、より好ましくは3.5〜6.5の範囲、より好ましくは5〜6.5の範囲、更に好ましくは5.5〜6.5の範囲であり、より好ましくはpH約6が選択される。
例えば本実施例に説明されるような、前記パラメータの適当な選択により、ピロGlu-MCP-1変種は、いずれの場合にも純度90％で、可能ならばより高く、例えば95％、96％又は98％で得ることができ、この割合は、溶液中に存在する総MCP-1の量(すなわち、Gln-MCP-1及び可能な酸化生成物及び他の副産物又は崩壊生成物の残存量を含む)を基にしたピロGlu-MCP-1の量(例えば、HPLC溶出プロファイルの曲線下面積により決定される)を示す。
【００２０】
本発明の別の態様に従い、少なくとも下記の工程を含むピロGlu-MCP-1調製物を調製する方法が提供される：
−宿主細胞においてMCP-1をコードしている遺伝子構築体の発現による組換え法によるGln-MCP-1調製物の調製、
−任意のGln-MCP-1調製物中に含まれたGln-MCP-1の濃縮及び／又は精製、並びに最後に
−Gln-MCP-1調製物中に含まれる又は濃縮及び／もしくは精製の前にその中に含まれるようなGln-MCP-1の、タンパク質分子種ピロGlu-MCP-1を含むピロGlu-MCP-1調製物への変換、この工程は、前述の"Process for preparing pyroGlu-MCP-1 from recombinantly produced Gln-MCP-1"に従い実行される。
この方法は、任意に、例えば、ピロGlu-MCP-1調製物の緩衝、又は例えばカラムクロマトグラフィー、透析、限外濾過などの引き続きの工程による更なる精製を含んでもよい。
【００２１】
バイオテクノロジーにより組換えタンパク質を作出する方法は公知である。これらは特に、発酵、精製、濃縮、及び他の工程を含む。前述の変換工程は、"多工程法"において様々な時点で含まれることができ、すなわち出発溶液として、依然大部分精製されないか又は全体が精製されたMCP-1タンパク質溶液を使うことができる。特により多く、より少なく又は実質的に全体が精製された形の依然(全体的に)変換されていないGln-MCP-1は、依然未変性の形でその貯蔵寿命を改善するために凍結乾燥され、並びに適当な時期に溶液に戻され、その後前述の方法に従いピロGlu-MCP-1に変換される方法を有することも考えられる。当然に、ピロGlu-MCP-1への変換後に得られたタンパク質溶液も凍結乾燥することができる。
【００２２】
この方法の産物、すなわちN-末端修飾(変換)が施されたピロGlu-MCP-1調製物は、本発明に従い、ピロGlu-MCP-1を、MCP-1総含量(例えば、変換タンパク質＋未変換タンパク質＋酸化により形成された副産物)を基に少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、及びより好ましくは少なくとも96％の量を含む。
用語(Gln-又はピロGlu-MCP-1-)調製物は、この方法の様々な段階において、MCP-1タンパク質は(緩衝)溶液中に溶解型で存在し、その結果すなわち、MCP-1に加え、いずれの場合においても使用される緩衝塩のイオン、及び同じく可能性のある他の塩、酸化防止剤、安定剤、抗菌剤、界面活性剤、保存剤、錯化剤など、他の成分が存在することを意味する。
【００２３】
本発明の更なる局面に従い、前述の方法による、ピロGlu-MCP-1又はピロGlu-MCP-1調製物を含む組成物が提供され、ここで組成物(変換タンパク質＋未変換タンパク質＋副産物；すなわち、例えばHPLC溶出クロマトグラフィーにおける"曲線下面積")中に含まれたMCP-1の少なくとも90％は、ピロGlu-MCP-1の形で存在する。
従って本発明は、特に原核生物、及び特に好ましくは大腸菌における組換え法により生成されたMCPO-1調製物に関連し、ここでMCP-1タンパク質の少なくとも90％は、ピロGlu-MCP-1として存在する。一般的発現細胞において調製される場合、このタンパク質は頻繁には、自然の生成とは異なり、天然のグリコシル化パターンを示さないであろう。例えば大腸菌などの原核生物において調製される場合、特にヒトの体において自然の発現において生じる形とは異なり、得られたピロGlu-MCP-1又は得られたピロGlu-MCP-1調製物は、グリコシル化及び／又はシアル酸化されず、従ってこの種の未変性のタンパク質又は未変性の給源から得られたタンパク質調製物とは異なるであろう。
【００２４】
本発明のこの種の組成物は、特に、総MCP-1含量(変換タンパク質＋未変換タンパク質＋副産物)の少なくとも90％、95％又は96％を生じるピロGlu-MCP-1の量に加え、常用の賦形剤及び担体、塩、酸化防止剤、安定剤、抗菌剤、界面活性剤、保存剤、錯化剤などを含有する、医薬品又は医薬組成物であってよい。本発明の組成物は、特にPAOD又はCADのような、動脈閉塞性疾患に罹患した患者を治療するために使用することができる。この治療は、例えば動脈内注入によるか、又はそこからMCP-1タンパク質がかなり長い期間にわたり放出される末梢動脈に配置されたゲル形のような、適当な経路により、治療的有効量のそのような組成物を投与することを含む。
驚くべきことに、予想に反して、組換えにより調製されたMCP-1タンパク質調製物の水溶液中及び上昇した温度でのインキュベーションは、その分解及び生物学的失活につながらないこともわかっている；対照的に、多くのパラメータの適当な選択により、バイオテクノロジーの観点からは余り一般的でなくかつ通常本質的には望ましくないこの工程は、驚くべきことに均質で、生物学的に十分に活性のあるピロGlu-MCP-1調製物を生じ、これは例え長期に渡る貯蔵期間であっても、その均質性を維持する、すなわちGln-MCP-1(出発)調製物よりもより安定している。
【００２５】
米国の食品医薬品局(FDA)又はヨーロッパのEMEAのような機関は、患者の保護という究極の目的により製薬業者に課される多くの条件に合致することに応じて、薬物の販売承認を許可する。従って当該の製造業者は、例えば医薬製品の純度、その貯蔵寿命及びその製造の再現性などを明らかにする証明を提供しなければならない。これらの3種の局面は、小さい選択でしかないが、バイオ医薬品、すなわち天然の材料又はそれらから誘導されたもの(タンパク質、核酸、プロテオグリカン、多糖など)からなる巨大分子の活性物質を含む薬物のライセンス供与において中心的役割を正確に果たす。時折、本承認の枠内で(バイオ)医薬品に強いられた必要要件は、合致することが非常に困難であることがある。例えばタンパク質を基にした活性物質は、より複雑な又は余り複雑でない細胞生物体におけるそれらの生成後に集中的かつ複雑な多-段階精製が施され、かつ例えば酸化又は他の自発的化学反応により、構造が制御できないように変更されることがあってはならない。更に最終生成物は、妥当な貯蔵寿命を有さなければならず、その結果製造業者と処方する医師又はその製品を使用する患者もしくは診療所の間に複雑かつ経費のかかる供給網は不要であり−これは、概して特に正確な二次構造(折畳み)を維持することが重要であるタンパク質の場合、唯一の大きな困難に遭う必要要件である。
【００２６】
MCP-1タンパク質の場合、市販の調製物の品質は、例えばin vitro試験に多くの観点で適していることが多い。しかし本発明者らは、この調製物は承認されるにふさわしい薬物の製造に決して適していないことを、自分達の作業過程において認めた。例えば医師の診療所又は病院において無視することができないような、患者へ投与する前に例え短時間であっても周囲温度で溶液中に放置することは、本発明者らの経験では、当初夾雑物として認められたMCP-1調製物中の"崩壊"生成物の出現につながった。当初活性物質として提供されたGln-MCP-1のより徹底した精製は、高レベルの純度を短期間回復するが、この調製物であっても、溶液中及び周囲温度で短期間貯蔵される場合には、同じく不安定であった。そのような不安定な活性物質調製物を基にした薬物承認方法の手続きは、全く見込みがないわけでない場合にも、多大な問題により悩まされる。
【００２７】
驚くべきことに、これらの問題点は、本発明の内容により克服することができ、ここで通常でないかつ一見して非常に対立する製造工程、すなわち上昇した温度でのインキュベーション(これは今までは不均一性を正に促進するように思われた)が、実際の調製及び精製方法に含まれた。実際本発明者らにより詳細に分析されかつ完成された条件下で実行される場合、このようなインキュベーションは、最初の活性物質Gln-MCP-1の、当初は夾雑物と見なされたピロGlu-MCP-1形へのほぼ事実上定量的な変換をもたらすことができる。その後後者の形は、上昇した温度でのインキュベーションなどのようなタンパク質を変性する作用に対し信じ難いほど安定している。従ってその高い純度及び均質性、例外なく再現可能な製造及び貯蔵時の安定性に関して、より早期に付託されるライセンス供与手続きに対応する厳密な必要要件に従う良好な見込みを有する医薬活性物質としての使用に適しているMCP-1調製物が得られ、従ってMCP-1の活性を基にした新規治療的方法を実行することを可能にする。
【００２８】
本発明の部分的局面に従い、先に説明された方法及び「特許請求の範囲」の方法により調製されたピロGlu-MCP-1調製物が、
−血管閉塞性疾患、特に、冠動脈疾患(CAD)、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、脳動脈及び腸間膜動脈閉塞性疾患などの治療のために、
−血管閉塞性疾患、特に、冠動脈疾患(CAD)、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、脳動脈及び腸間膜動脈閉塞性疾患などの治療用の医薬組成物の調製のために
使用される。
従って本発明は、前述の血管閉塞性疾患に罹患した患者を治療する方法を実行することも可能にし、ここで変換により調製されたピロGlu-MCP-1調製物又はこの種のピロGlu-MCP-1調製物を用いて調製された医薬組成物が、例えば注射又は注入により投与される。
【００２９】
個々の最適化された方法パラメータに関して、バイオテクノロジー技術者は、極めて長い期間、場合によっては数日間、例えば60℃の上昇した温度で、タンパク質調製物をインキュベーションすべきであることを容易に納得することができないことも注目される。先に最適であるとして明らかにされたインキュベーション溶液の中性から酸性のpHに関して、これは化学的論理に対立している：グルタミンの環式ピログルタミン酸への変換は、遊離電子対が、C-γ-アミド基のC原子において、グルタミン酸のC-α-アミノ基の窒素原子の攻撃に対し作用する求核置換反応である。酸性pHは、本質的にC-α-アミノ基の増加したプロトン化につながり、その結果この反応速度に負の作用を有するであろう。しかしこれは正確には、本発明者らの知見に準ずるケースではない。ひとつの可能性のある説明は−これは厳密に解釈されるものではない−、フールディングされたMCP-1タンパク質は、N末端に微小環境を形成し、そこで周囲の水溶液の酸性pHの代わりに、アミノ基は脱プロトン化された形で存在し、すなわち遊離電子対が求核攻撃に利用可能であるというものである。
【００３０】
実施例
実施例1：本発明の方法によるピロGlu-MCP-1調製物の生成
発酵：
発酵は、大腸菌(Escherichia coli)株K12(W3110)により実行した。この株は、下記エレメントを含むColE1プラスミド(pBR322誘導体)で形質転換した：汎用(all-purpose)プロモーター(ホスファターゼ、pPhoA)の制御下のhMCP-1のゲノム配列、ColE1-複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子。発酵のために、この産生株は、テトラサイクリンを含有するLB培地中、振盪フラスコにおいて、予備培養した。インキュベーションは、37℃で、ODが1に達するまで実行した。予備培養物を、発酵槽に移し、更に攪拌及び37℃で空気を供給しながら培養した。この培地は、ブドウ糖、様々な塩、微量元素、酵母抽出物、アミノ酸及びテトラサイクリンを含有した。このpHは、アンモニアにより6.8に維持した。投入されたブドウ糖が消費された直後、溶存酸素(pO2)は、ブドウ糖供給により40％の意図されたレベルで一定に維持した。ホスファターゼプロモーターの誘導は、培地中のリン酸が消費された直後に自動的に生じた。39時間後、バイオマスは、チューブ遠心(CEPA)により収集し、かつ-70℃で貯蔵した。
【００３１】
細胞溶解及びタンパク質精製工程：
凍結細胞ペレットは、Ultraturraxを用い、4倍量の溶解緩衝液(200mM Tris、55mM NaCl、5mM EDTA、pH7.5)中に再懸濁した。この細胞溶解は、460barでホモジナイザーにより2回通過(passage)させ行った。細胞断片は、CEPA遠心により除去した。上清は、任意にPolysep II (1.2μm)フィルター(Millipore)で濾過し、その後QセファロースFF及びSPセファロースFFからなる組合せカラム上に負荷した。これらのカラムは、溶解緩衝液で平衡化した。
【００３２】
負荷が完了後、このカラム組合せを、溶解緩衝液で洗浄し、かつQセファロースカラムの留め具を外した。SPセファロースは、溶解緩衝液で、その後5M尿素(溶解緩衝液中)で、及び再度溶解緩衝液で洗浄した。この生成物を、直線NaCl勾配で溶出した。
溶離液は、最終濃度1.3mol/Lの硫酸アンモニウムで塩析し、3200gで15分間遠心した。上清を、1.3M硫酸アンモニウム(溶解緩衝液中)で平衡としたフェニルセファロースカラム上に負荷した。
フェニルセファロースの流れを、溶解緩衝液で平衡としたSource 30RPCカラムに流した。その後洗浄を、溶解緩衝液、水及び緩衝液A(5％EtOH、0,1％TFA)で行った。この生成物を、10倍カラム容量の 20％緩衝液B(95％EtOH、0.1％TFA)から70％緩衝液Bまでの直線勾配で溶離した。
【００３３】
変換工程：
この溶離液を、例えば、リン酸緩衝液、10-40mM、pH6.0-7.4の異なる緩衝液中で1:10に希釈した。好ましい態様に従い、この変換溶液の最終pHが6.0〜6.5の値となるようにした。タンパク質濃度は、0.2〜1.0mg/mLの間であった。この溶液を滅菌濾過し、穏やかに攪拌しながら(60rpm)、温度35〜80℃でインキュベーションした(異なるバッチで)。この反応の進行は、HPLC分析によりモニタリングした。
【００３４】
最終精製工程：
この反応が終点に達した直後、緩衝液A(40mMリン酸、pH6.0)中で平衡化した変換溶液をSPセファロースHPカラムに負荷した。溶離は、直線NaCl勾配で行った。溶離液中のNaCl濃度は、約350mmol/Lであり、タンパク質濃度は約3mg/mLであった。溶離液は、250mM NaClに相当する電導度になるよう、緩衝液Aで希釈した。その後これを更に、40mMリン酸、pH6.0、250mM NaClで、タンパク質濃度が1mg/mLになるまで希釈した。その後形成されたバルク溶液を、滅菌濾過し、4℃又は-70℃で、製剤の準備ができるまで貯蔵した。
【００３５】
解析：
先に考察した変換工程の進行は、RP-HPLCによりモニタリングした。溶離液プロファイルのクロマトグラフィーを、変換反応の開始前(t0)、並びにt=24h、t=48h及びt=120hで行った。図1に示した4種のクロマトグラフィーからわかるように、48時間後、このタンパク質の約90％が、インキュベーション温度35℃でピロGlu-MCP-1に変換された。HPLC解析は、ふたつのジスルフィド橋が適切に形成されたことを示した。
図2は、説明された条件下でのGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1への反応速度論を示している。これは反応時間が延長するにつれて、図2において"変種2"と称される不純物が出現したことを示し、更には特徴付けられなかった。
同様の反応パターンが、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5.5、又は0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH3.5中で、変換工程が実行された場合に観察された(データは示さず)。
24℃、60℃及び80℃の温度が、35℃の反応温度の代わりに使用されること以外は、先に説明された反応を反復した。表3にまとめたデータから明らかであるように、ピロGlu-MCP-1の満足できる収量が、妥当な時間内に24℃では得られなかった。他方60℃及び80℃では、有意に高い反応速度が観察された。80℃の反応速度は、周囲温度での速度のおよそ50倍であった。
【００３６】
表3：
n.d.＝決定されず、特定された時間以降に反応の終点には到達しなかった。
【００３７】
明らかにより高い反応温度が、副産物又は崩壊生成物の形成には好ましく、特に試験が80℃で実行される場合に、純度レベルが低下した(表3)。
図3は、表3にまとめた条件下(20mMリン酸緩衝液、35℃、60℃又は80℃)で得られた、高解像度の、ピロGlu-MCP-1調製物の溶離プロファイルのクロマトグラフィーを示している。これからわかるように、例え短いインキュベーション期間であっても高温では(例えば、80℃で3時間)、35℃で5日間のインキュベーションよりも、有意に多い不純物が、MCP-1副産物又は崩壊生成物と共に生じる。
この生成法から生じる方法のある種の態様におけるエタノール(EtOH)の含量(例えば5％)は、そのほかの点では一定の試験条件(20mMリン酸緩衝液、pH6.0)下で、この生成物の反応速度又は純度に負の作用を有さない。
【００３８】
実施例2：本発明の代替法によるピロGlu-MCP-1調製物の生成
発酵、細胞溶解及びタンパク質精製の工程は、実施例1に説明したように実行した。
変換工程：
Source 30 RPCの溶離液は、PBS、0.02％Tween20で、1:10に希釈した。その後タンパク質濃度は、約0.2〜0.5mg/mL、pHは約7.4であった。この溶液は、緩衝液成分に加え、約3.5％EtOH及び0.01％TFAを含有し、これは先のSource 30 RPC工程の溶離液に起源を有した。この溶液を、Millipak 20 (0.2μm、Millipore)によりポリプロピレン製フラスコに滅菌濾過し、穏やかに攪拌しながら35℃でインキュベーションした。反応の進行は、HPLC解析によりモニタリングした。反応の終点に到達すると直ぐに、変換溶液を、Pellikon 2 UDFメンブレン(3k、Millipore)で、PBS、0.02％Tween 20に対してウルトラダイアフィルトレーションし、及びタンパク質濃度を0.1mg/mLに調節した。この調製物を、滅菌条件下で、Millipore GVフィルター(0.22μm)を通し、ガラス容器の1mLバッチにデカントした。
【００３９】
解析：
変換工程の進行は、RP-HPLCによりモニタリングした。図4に認められるように、5日後に、90％を超えるタンパク質が、ピロGlu-MCP-1に変換される一方、驚くべきことに長いインキュベーション期間にもかかわらず、95％と非常に高い純度が得られた(表3)。20mMリン酸緩衝液を含有する混合液と、20mMリン酸緩衝液及び150mM塩を含有する混合液との比較から明らかであるように(実施例1、表3、3行から6行)、インキュベーション溶液としてPBSを含有する混合液中の比較的低い速度定数は、より高い塩濃度、イオン強度又は浸透圧よりも高いことができる。
【００４０】
実施例3：実施例1又は実施例2に従い生成されたMCP-1調製物を基にした医薬組成物の調製
実施例1又は実施例2において得られたピロGlu-MCP-1調製物を、0.02％Tween 20も含有するPBS(塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム；pH7.0)中濃度0.1mg/mLに希釈し、1mLの容積のガラス容器に移した。最後の医薬溶液は、透明で、無色かつ無臭であり、注射又は注入により投与することができる。
【００４１】
実施例4：ピロGlu-MCP-1及びGln-MCP-1の生物活性の比較
測定原理：
MCP-1は、MCP-1受容体CCR2bに結合しかつ活性化する。この受容体の活性化は、細胞質ゾルへのカルシウム流入につながる。これは、蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR；Molecular Devices)を用いて測定することができる。これを行うために、不活性蛍光色素エステルFluo-4 AMは、その表面にhCCR2bを発現している細胞にどっと流れ込み、その後このエステルは細胞内エステラーゼにより切断される。この形において、蛍光色素は、Ca2+イオンに結合する。波長488nmでの励起時に、528nmにピークのある発光が生じる。発光強度は、細胞質ゾルのカルシウム濃度によって決まる。従って放出された光の強度の変化は、細胞質ゾル内のカルシウム濃度と相関し、これは次に受容体の活性化の状態によって左右される。
MCP-1の添加後の特徴的な時間が引き金となる測定シグナルを、図5に示した。このことから、MCP-1の添加後、蛍光の急激な上昇に結びつけられた迅速なカルシウム放出が存在することは明らかである。このピーク(b)は、添加(a)後わずかにほんの数秒で到達する。添加(a)と最大刺激(b)の間の間隔は、おおまかに20〜30秒である。
下記の試験において、例えば最大値は、カルシウムが誘導したカルシウム流入のような二次的作用に余り影響されず、その結果より正確な測定が可能であるので、最大値を用い評価を行った。
【００４２】
安定して発現するCHO/hCCR2B-K1細胞の調製：
ヒトCCR2b受容体(Gene bank寄託番号：D29984)のコード領域を、PCRにより増幅した。その後1.08kb BamHI-XbaI断片を、発現ベクターにクローニングした。CHO-K1細胞は、発現ベクターとして作用するこのプラスミドによりトランスフェクションした。
これらの細胞は、Ham's F12培地を基にした培養培地において培養し、通常のように継代した。測定前日、5000個の細胞を、384-ウェルアッセイプレート(Corning Costar)に、培養培地40μlと共に播種し、一晩(およそ24時間)、37℃で、5％CO2、95％相対湿度で接着させた。全てのアッセイにおいて、測定は4回行った。
【００４３】
別の試験日、全ての物質のプレートの最初のものを調製した。0.1％BSA(プロテアーゼ非含有)を含むHanks緩衝液を、様々なMCP-1調製物のための希釈緩衝液として使用した。0.1％BSAを含むHanks緩衝液を、ブランク対照として使用した。次にFluo-4色素培地40μl/ウェルを、これらの細胞に添加し、これらの調製物を37℃、5％CO2、95％相対湿度で45分間インキュベーションした。その後染色された細胞を、60μl洗浄緩衝液で4回洗浄し、各ウェル中の洗浄緩衝液25μlの残渣を除去した。次にこれらの細胞を、洗浄緩衝液と共に更に5分間周囲温度でインキュベーションした。
蛍光を測定するために、FLIPR測定装置を、染色ウェルと非染色ウェルが少なくとも1:5倍異なり、かつ染色ウェルは約11,000蛍光カウントを有するように調節した。他のFLIPR設定は以下であった：
励起：488nm
発光：510〜570nm(バンドパス)
負の補正：Hanks/BSA(＝ブランク対照との比較)
バイアス減算：6(＝物質添加前の全てのウェルの0への平準化)
チップのプレ含浸：物質プレートからの関連物質溶液25μl(＝接着アーチファクトの最小化)
【００４４】
測定方法は、下記工程を含む：
5秒サイクルで6インターバル
15μl物質の添加
1秒サイクルで60インターバル
5秒サイクルで18インターバル
評価のために、物質添加後の78インターバルの最大シグナルを使用した。使用した対照混合物は以下であった：
ブランク対照：負の補正のため
陽性対照(ATP)：染色のチェックのため
参照対照(標準)：−細胞上の受容体発現のモニタリング
−未知試料の活性決定のための計算の基礎
試験される試料は、同一の希釈工程において参照対照と平行してピペッティングした。これらの試験において使用した濃度は、参照対照のEC50領域内であるように選択した。
【００４５】
本発明のMCP-1調製物と本発明でないMCP-1調製物の比較
本発明の方法により調製した2種のピロGlu-MCP-1調製物("バッチ071100kh"及び"バッチ0141921")並びにそのN-末端のグルタミン基は先に説明した本発明の方法工程においてピログルタミン酸基に変換されていない組換え法により調製したMCP-1調製物(Peprotechより入手可能なMCP-1調製物)を、先に説明した試験システムを用いて試験及び比較した。EC50は、前述のように記録した測定曲線から決定した(図6参照)。
事実上同じEC50値を、これら2種のピロGlu-MCP-1調製物から得たのに対し、本発明のものではないMCP-1調製物及びN-末端が修飾されないMCP-1調製物の値は、有意に異なった(図6)。後者の調製物のEC50値は、2〜3倍悪化されることが証明された(ピロGlu-MCP-1：EC50＝7.82nM；PeprotechのMCP-1調製物：EC50＝20.76nM)。
【００４６】
2種の調製物の生物活性は下記のように計算した：
第一に、陽性補正は、ピロGlu MCP-1について濃度1e-8Mで行い、すなわち10nMピロGlu-MCP-1の濃度で得られた値を100％と設定した。これは、上昇曲線のほぼ直線部分にある。このシグナル百分率を用い、例えばPeprotech MCP-1のような、他の調製物の活性を、下記式により算出した：
％活性(試料)＝RFU(1e-8Mの試料) x 100％ / RFU(1e-8Mの標準)
前記実施例において、表4に示したように、これは、ピロGlu-MCP-1調製物を基にN-末端が未修飾のMCP-1調製物について48％活性の値を生じた。
【００４７】
表4：
測定値(負の補正：Hanks/BSA；バイアス減算：6)
【００４８】
％活性(MCP-1(Peprotech))＝6151 x 100％ / 12898.3＝48％活性
【００４９】
実施例5：ピロGlu-MCP1の温度感受性
ピロGlu-MCP-1は、56℃又は95℃で1又は2時間インキュベーションした。その後依然存在する生物活性を、実施例4の試験システムを用い測定した。
ピロGlu-MCP-1調製物は、56℃で1時間又は2時間インキュベーションされた場合には、変性が起こらないことが分かった。しかし図7に示されたように、95℃でのインキュベーションは、非常に顕著な変性作用を示した。
【００５０】
実施例6：動脈閉塞性疾患に罹患した患者の治療：
PAOD患者を治療するために、先に調製したピロGlu-MCP-1調製物を、濃度1.2〜120μg/mlに調節した。使用直前に、この溶液を、最終濃度0.1〜10μg/mlに調節し、血管閉塞により冒された病巣近傍に動脈内経路で、1〜6時間かけて2〜12ml/分の流量で患者へ注入した。この注入は、1〜7日後に再度行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】Gln-MCP-1からピロGlu-MCP-1への変換を示すクロマトグラムである。
【図２】Gln-MCP-1からピロGlu-MCP-1への変換の経時的変化を示すグラフである。
【図３】ピロGlu-MCP-1調製物の溶離プロファイルを示すクロマトグラムである。
【図４】ピロGlu-MCP-1調製物の溶離プロファイルを示すクロマトグラムである。
【図５】MCP-1の添加後の蛍光カウントを示すグラフである。
【図６】本発明のMCP-1調製物と比較例のMCP-1調製物のRFU(負の補正：Hanks/BSA；バイアス減算：6)を示すグラフである。
【図７】ピロGlu MCP-1と変性したピロGlu MCP-1のRFU(負の補正：Hanks/BSA；バイアス減算：6) を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えにより作出されたGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1を調製する方法であり、ここでGln-MCP-1は：
30℃〜80℃の範囲の温度で、
10mM〜160mMの範囲の塩濃度、及び、2〜7.5の範囲のpHを有する緩衝液中で、
MCP-1の少なくとも90％がピロGlu-MCP-1の形で存在するまで、インキュベーションされる、方法。
【請求項２】
緩衝液が、20mM〜50mMの範囲の濃度及び3.5〜6.5の範囲のpHを有するリン酸緩衝液である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
緩衝液が、更に界面活性剤、酸化防止剤、保存剤、安定剤、抗菌剤及び／又は錯化剤を含有する、請求項1又は2のいずれか1項記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞においてMCP-1をコードしている遺伝子構築体の発現により、Gln-MCP-1調製物を調製する工程、
任意にGln-MCP-1調製物に含まれたGln-MCP-1を濃縮及び／又は精製する工程、
方法1〜3のいずれかひとつに従い、Gln-MCP-1調製物のGln-MCP-1を、ピロGlu-MCP-1を含有するピロGlu-MCP-1調製物へ変換する工程、並びに
任意に、ピロGlu-MCP-1調製物を緩衝及び／又は更に精製する工程
の少なくともひとつを含む、ピロGlu-MCP-1調製物を調製する方法であり、
この得られたピロGlu-MCP-1調製物においてMCP-1の総含量を基にしたピロGlu-MCP-1の割合が少なくとも90％である、方法。
【請求項５】
ピロGlu-MCP-1調製物中に含まれたMCP-1の少なくとも90％が、ピロGlu-MCP-1の形で存在する、請求項4に従い調製されたピロGlu-MCP-1調製物を含有する組成物。
【請求項６】
請求項4に従い調製されたピロGlu-MCP-1調製物が使用される、ピロGlu-MCP-1を含有する医薬組成物を調製する方法。
【請求項７】
請求項4に従い調製されたピロGlu-MCP-1調製物を含有する医薬品又は医薬組成物であり、そこに含まれるMCP-1の少なくとも90％はピロGlu-MCP-1の形である、医薬品又は医薬組成物。
【請求項８】
塩化ナトリウム及び任意に添加剤として界面活性剤を含むリン酸緩衝液中にピロGlu-MCP-1を含有する、請求項7記載の医薬品又は医薬組成物。
【請求項９】
血管閉塞性疾患、特に冠動脈疾患(CAD)、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、大脳動脈及び腸間膜動脈閉塞性疾患の治療のための医薬組成物を調製するための、請求項4に従い調製されたピロGlu-MCP-1又はピロGlu-MCP-1調製物の使用。
【請求項１０】
その生物活性が、請求項１記載の方法が施されない組換えにより生成されたMCP-1調製物(N-末端が未修飾のMCP-1調製物)と比べ、100：48又はそれよりも大きい比である、請求項4の方法により生成された組換えMCP-1調製物。
【請求項１１】
MCP-1タンパク質の少なくとも90％は、ピロGlu-MCP-1として存在する、組換えにより生成されたMCP-1調製物。
【請求項１２】
ピロGlu-MCP-1が、グリコシル化されない形で存在する、請求項11記載のMCP-1調製物。
【請求項１３】
内因性の未変性のMCP-1-タンパク質の生物活性又は生理活性を代替又は増強する、生物学的又は生理的反応を誘導する方法であり、請求項5記載の組成物又は請求項7記載の医薬組成物又は請求項10〜12の少なくともいずれか1項記載の調製物が、生物活性又は生理活性の誘導に適している量で、細胞又は組織又は器官に添加されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
細胞又は組織又は器官が、CCR-2受容体及び／又はCCR-4受容体を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
細胞は、MCP-1受容体サブタイプCCR2、特にCCR2bを、天然に又は組換え的に発現する哺乳類細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１】
組換えにより作出されたGln-MCP-1からピロGlu-MCP-1を調製する方法であり、ここでGln-MCP-1は：
30℃〜80℃の範囲の温度で、
10mM〜160mMの範囲の塩濃度、及び、2〜7.5の範囲のpHを有する緩衝液中で、
MCP-1の少なくとも90％がピロGlu-MCP-1の形で存在するまで、インキュベーションされる、方法。
【請求項２】
緩衝液が、20mM〜50mMの範囲の濃度及び3.5〜6.5の範囲のpHを有するリン酸緩衝液である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
緩衝液が、更に界面活性剤、酸化防止剤、保存剤、安定剤、抗菌剤及び／又は錯化剤を含有する、請求項1又は2のいずれか1項記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞においてMCP-1をコードしている遺伝子構築体の発現により、Gln-MCP-1調製物を調製する工程、
任意にGln-MCP-1調製物に含まれたGln-MCP-1を濃縮及び／又は精製する工程、
方法1〜3のいずれかひとつに従い、Gln-MCP-1調製物のGln-MCP-1を、ピロGlu-MCP-1を含有するピロGlu-MCP-1調製物へ変換する工程、並びに
任意に、ピロGlu-MCP-1調製物を緩衝及び／又は更に精製する工程
の少なくともひとつを含む、ピロGlu-MCP-1調製物を調製する方法であり、
この得られたピロGlu-MCP-1調製物においてMCP-1の総含量を基にしたピロGlu-MCP-1の割合が少なくとも90％である、方法。
【請求項５】
ピロGlu-MCP-1調製物中に含まれたMCP-1の少なくとも90％が、ピロGlu-MCP-1の形で存在する、請求項4に従い調製されたピロGlu-MCP-1調製物を含有する組成物。
【請求項６】
請求項4に従い調製されたピロGlu-MCP-1調製物が使用される、ピロGlu-MCP-1を含有する医薬組成物を調製する方法。
【請求項７】
請求項4に従い調製されたピロGlu-MCP-1調製物を含有する医薬品又は医薬組成物であり、そこに含まれるMCP-1の少なくとも90％はピロGlu-MCP-1の形である、医薬品又は医薬組成物。
【請求項８】
塩化ナトリウム及び任意に添加剤として界面活性剤を含むリン酸緩衝液中にピロGlu-MCP-1を含有する、請求項7記載の医薬品又は医薬組成物。
【請求項９】
血管閉塞性疾患、特に冠動脈疾患(CAD)、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、大脳動脈及び腸間膜動脈閉塞性疾患の治療のための医薬組成物を調製するための、請求項4に従い調製されたピロGlu-MCP-1又はピロGlu-MCP-1調製物の使用。
【請求項１０】
その生物活性が、請求項１記載の方法が施されない組換えにより生成されたMCP-1調製物(N-末端が未修飾のMCP-1調製物)と比べ、100：48又はそれよりも大きい比である、請求項4の方法により生成された組換えMCP-1調製物。
【請求項１１】
MCP-1タンパク質の少なくとも90％は、ピロGlu-MCP-1として存在する、組換えにより生成されたMCP-1調製物。
【請求項１２】
ピロGlu-MCP-1が、グリコシル化されない形で存在する、請求項11記載のMCP-1調製物。
【請求項１３】
内因性の未変性のMCP-1-タンパク質の生物活性又は生理活性を代替又は増強する、生物学的又は生理的反応を誘導する方法であり、請求項5記載の組成物又は請求項7記載の医薬組成物又は請求項10〜12の少なくともいずれか1項記載の調製物が、生物活性又は生理活性の誘導に適している量で、細胞又は組織又は器官に添加されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
細胞又は組織又は器官が、CCR-2受容体及び／又はCCR-4受容体を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
細胞は、MCP-1受容体サブタイプCCR2、特にCCR2bを、天然に又は組換え的に発現する哺乳類細胞である、請求項14記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５３５８９１（Ｐ２００７−５３５８９１Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０００８９（Ｐ２００６−５０００８９）
【出願日】平成１６年４月１３日（２００４．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３８５６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６８５０
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５０３３８５９２３）ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (976)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１３日（２００４．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３８５６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６８５０
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５０３３８５９２３）ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (976)
【Ｆターム（参考）】
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