α−アミラーゼ阻害剤
【課題】天然物由来の，安全で温和な効力を有するα−アミラーゼ阻害剤，及び，該α−アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は治療薬，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いはペットフードを提供すること。
【解決手段】ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分として含むキウイフルーツの葉をアルコール又は熱水で抽出して得た抽出液を，９０％メタノールで抽出される精製画分を採取することにより調製することができる。また，更に，シリカカラム及び／又はＯＤＳカラムによるカラムクロマトグラフィーにより精製・分離し，精製画分を採取することにより，更に精製することができる。
【解決手段】ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分として含むキウイフルーツの葉をアルコール又は熱水で抽出して得た抽出液を，９０％メタノールで抽出される精製画分を採取することにより調製することができる。また，更に，シリカカラム及び／又はＯＤＳカラムによるカラムクロマトグラフィーにより精製・分離し，精製画分を採取することにより，更に精製することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，α−アミラーゼ阻害剤，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤，及び該α−アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は治療薬，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いはペットフードに関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満や糖尿病等は，食生活のような生活習慣，環境因子によりその発症が大きく影響されることから，生活習慣病とも呼ばれている。近年，日本では食べ過ぎ等の食生活が原因となるＩＩ型糖尿病が増加の一途をたどっている。糖尿病には，インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）とインスリン非依存型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）の２タイプがあるが，その９０％は後者のタイプである。インスリン非依存型糖尿病における高血糖の原因として，食後の急峻な血糖上昇に対応し，瞬時に分泌されるべきインスリン早期相の欠如と食後高血糖の持続により誘導される内因性基礎インスリン分泌低下が挙げられる。
【０００３】
食後高血糖の是正には消化系における糖質の急速な吸収を防ぐ方法がある。消化系における糖質の吸収としては，唾液中や膵液中のα−アミラーゼや小腸中のα−グルコシダーゼが関与しており，これらの酵素を阻害することにより，食後の血糖値上昇が抑制され，更にそれに続くインスリン値の上昇も抑制されることが明らかにされている。一般的な経口糖尿病薬にはアカルボース，ボグリボース，ミグリトールといったα−グルコシダーゼを競合的かつ拮抗的に阻害するα−グルコシダーゼ阻害剤がある。
【０００４】
これまで植物或いは植物抽出物からなる各種の血糖値上昇抑制剤が開示されているが，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄのような成分からなるα−アミラーゼ阻害剤は開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は，天然物由来の安全で，温和な効力を有するα−アミラーゼ阻害剤，及び，該α−アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は，治療薬，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いは，ペットフードを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは，先に，キウイフルーツの葉のメタノール抽出物が顕著な血糖値上昇抑制作用を有することを見い出し，該抽出物を有効成分とする血糖値上昇抑制剤等について，特許出願を行なった（特願２００７−３５４８３号）
【特許文献１】。そして更に，キウイフルーツの葉の血糖値上昇を抑制する物質について，鋭意検討する中で，キウイフルーツの葉の血糖値上昇を抑制する物質として数種類の五環性のヒドロキシトリテルペン類が含まれることを見い出し，その中から特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄおよび（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを精製・単離することに成功し，該物質がα−アミラーゼ阻害を有することを確認し，本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち，本発明は，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤からなる。本発明の，（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，下記一般式で表される。
【０００８】
【化１】
【化２】
【０００９】
本発明のα−アミラーゼ阻害剤の有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，アルコール又は熱水抽出物を抽出して得られるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン精製画分，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを採取することにより調製できる。また，アルコール又は熱水抽出物を抽出し，９０％メタノールで抽出して得られるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン精製画分，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを採取することにより調製できる。更に，シリカカラム及び／又はＯＤＳカラムによるカラムクロマトグラフィーにより精製・分離し，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類画分を採取することにより，更に精製された（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを調製することができる。
【００１０】
本発明のヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを１種または２種含むことを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤は，消化管における糖質の分解を阻害することでグルコースの血中への吸収を抑制し，該α−アミラーゼ阻害剤を添加，含有させることにより，血糖値上昇予防または治療薬を，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いはペットフードを提供することができる。
【００１１】
すなわち具体的には本発明は，（１）ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。（２）（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを１種または２種含むことを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤からなる。
【００１２】
また本発明は，（３）上記（１または２）に記載のα−アミラーゼ阻害剤を含有することと特徴とする血糖値上昇予防または治療薬や，（４）上記（１または２）に記載のα−アミラーゼ阻害剤を添加したことを特徴とする血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品や，（５）上記（１または２）に記載のα−アミラーゼ阻害剤を添加したことを特徴とする血糖値上昇抑制機能を付与したペットフードからなる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のα−アミラーゼ阻害剤の有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，植物のような天然由来の有効成分として，穏やかなかつ顕著なα−アミラーゼ阻害作用を奏する。したがって，本発明は，天然物由来の安全で，温和な効力を有するα−アミラーゼ阻害剤を提供するとともに，該α−アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は治療薬，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いは，ペットフードを提供し，人間又は動物の糖尿病のような生活習慣病の予防，改善のための有力な対処法を提供することができる。
【００１４】
本発明は，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを１種または２種含むことを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤，及び，該α‐アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は治療薬，或いは，α−アミラーゼ阻害剤を添加した血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いは，ペットフードからなる。
【００１５】
本発明のα−アミラーゼ阻害剤の有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを調製するには，トリテルペン類からの合成法により製造することもできるが，α−アミラーゼ阻害剤の有効成分としての用途の目的からは，植物エキスからの抽出・精製することによる調製方法が特に好ましい。ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを調製するには，まず，植物抽出液を調製する。植物抽出液は，葉部および花部，或いは植物全体をそのまま用いてもよく，これらを乾燥した乾燥体，若しくは乾燥後粉砕した粉末を用いることもできる。また，これらを水抽出，熱水抽出，酸性下での抽出，アルカリ性下での抽出，メタノール，エタノール，アセトン，酢酸エチル，ヘキサン等各種の有機溶媒を用いて，抽出した抽出物を用いることもできる。
【００１６】
植物抽出液から，本発明の有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄの精製画分を精製・分離して採取するには，例えば，植物の葉のメタノール抽出液または熱水抽出液を，９０％メタノールで抽出したヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分精製画分を採取する。該画分は，更に，シリカカラム及び／又はＯＤＳ（Ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌａｎｅ）カラムによるカラムクロマトグラフィーにより精製・分離し，（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ精製画分を採取することができる。
【００１７】
ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類画分，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ精製画分を用いて，血糖値上昇抑制剤，或いは，血糖値上昇予防又は治療薬を製造するには，上記の方法で製造した精製画分を情報に従って公知の医薬用無毒性担体と組み合わせて製剤化すればよい。本発明に関わる血糖値上昇抑制剤は，種々の剤型での投与が可能であるが，経口投与剤として製剤化される。例えば，経口投与剤としては錠剤，顆粒剤，散剤，カプセル剤，ソフトカプセル剤などの固形剤，溶液剤，懸濁剤，乳化剤等の液剤，凍結乾燥剤等が挙げられ，これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。
【００１８】
上記医薬用無毒性担体としては，例えば，グルコース，乳糖，ショ糖，でんぷん，マンニトール，デキストリン，脂肪酸グリセリド，ポリエチレングリコール，ヒドロキシエチルでんぷん，エチレングリコール，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル，アミノ酸，アルブミン，水，生理食塩水などが挙げられる。また，必要に応じて安定化剤，滑沢剤，湿潤剤，乳化剤，結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。本発明に関わる血糖値上昇抑制剤において，有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分および該画分に含有される（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄの投与量は，患者の年齢，体重，症状，疾患の程度，投与スケジュール，製剤形態等により，適宜選択，決定されるが，例えば，一日当たり生薬当価量として０．１から１００ｇ／ｋｇ体重程度とされ，一日数回に分けて投与してもよい。
【００１９】
また，本発明に関わるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分および該画分に含有される（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，毒性を有することは報告されていないことから，血糖値上昇抑制を目的とした飲食品として摂取することもできる。本発明の有効成分を添加した血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品は，特定保健用食品，栄養機能食品，又は健康食品等として位置付けることができる。機能性食品としては，例えば，本発明の有効成分に適当な所剤を添加した後，慣用の手段を用いて，食用に適した状態，例えば，顆粒状，粒状，錠剤，カプセル剤，ソフトカプセル剤，ペースト状等に形成したものを用いることができる。この飲食品はそのまま食用に供してもよく，また種々の食品（例えばハム，ソーセージ，かまぼこ，ちくわ，パン，バター，粉乳，菓子など）に添加して使用したり，水，酒類，果汁，牛乳，清涼飲料水等の飲物に添加して使用してもよい。かかる食品の形態における本発明の有効成分の摂取量は，年齢，体重，症状，疾患の程度，食品の形態等により適宜選択・決定されるが，例えば，一日当たり生葉等価量として０．１から１００ｇ／ｋｇ体重程度とされ，一日数回に分けて投与してもよい。
【００２０】
また，本発明に関わるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分および該画分に含有される（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，動物用にペットフードとして用いることもでき，摂取量はペットの種類，年齢，体重，症状，疾患の程度，食品の形態等により適宜選択されるが，食品に準拠して投与すればよい。
【００２１】
以下，実施例により本発明を具体的に説明するが，本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
［キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の抽出分離］
キウイフルーツの葉エキスに有意な血糖値上昇抑制作用があることから，該血糖値上昇抑制作用を有する活性成分の抽出分離を，図１のフローに従って行なった。すなわち，キウイフルーツの葉のメタノール（ＭｅＯＨ）抽出エキス（８．０ｇ）を１．５Ｌの蒸留水（Ｗａｔｅｒ）に溶解させ，等量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を加え，Ｗａｔｅｒ［１］画分とＥｔＯＡｃ画分に分配した。この操作を３回繰り返した。Ｗａｔｅｒ［１］画分をエバポレーターで減圧濃縮後，同様の操作により，更にＷａｔｅｒ［２］画分とｎ‐ＢｕＯＨ画分（ｎ‐ブタノール）画分に分配した。また，酢酸エチル画分をエバポレーターで減圧濃縮後，同様の操作により，更に９０％メタノール画分とｎ‐Ｈｅｘ画分（ｎ‐ヘキサン）画分に分配した。全ての画分をエバポレーターで減圧濃縮後，凍結乾燥し，重量を測定した。これらの分配操作により，Ｗａｔｅｒ［２］画分１．０ｇ，ｎ‐ＢｕＯＨ画分２．８ｇ，９０％ＭｅＯＨ画分１．３ｇ，ｎ‐Ｈｅｘ画分２．６ｇの４つの画分を得た。Ｗａｔｅｒ［２］画分，ｎ‐ＢｕＯＨ画分，９０％ＭｅＯＨ画分のうち，９０％ＭｅＯＨ画分とｎ‐ＢｕＯＨ画分が，スターチを負荷したマウスにおいて血糖値上昇抑制作用を示した。
【００２３】
上記で得られたキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分を含有する９０％ＭｅＯＨ画分を精製・分離して，該α−アミラーゼ阻害活性成分の構造について分析した。９０％ＭｅＯＨ画分の精製・分離のフローを上記に続いて図１に示す。すなわち，上記で得られたキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分を含有する９０％ＭｅＯＨ画分を，Ｓｉｌｉｃａカラム（ゲル２０ｇ，ｎ‐Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ＝１／０（１ｖｏｌ．）→ＭｅＯＨ（１０ｖｏｌ．））クロマトグラフィーにより，６個の画分に分画したところ，Ｆｒ.Ｂ−３がグルコースを負荷したマウスにおいて血糖値上昇抑制作用を示した。更に，この画分を高速液体クロマトグラフィーシステムを用いたＯＤＳカラム（ＨＧ‐５，直径２０ｍｍ，５０％ＭｅＯＨ → ＭｅＯＨ，２１５ｎｍ）クロマトグラフィーにより，単一の成分である６個の画分に分画したところ，Ｆｒ.Ｄ−１からＦｒ.Ｄ−３がグルコースを負荷したマウスにおいて血糖値上昇抑制作用を示した。
【００２４】
［キウイフルーツ葉エキスの分離画分の血糖値上昇抑制作用の確認］
上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の抽出分離によって，分離途中で得られたＷａｔｅｒ［２］画分，ｎ‐ＢｕＯＨ画分，９０％ＭｅＯＨ画分の３つの画分について，スターチ負荷（１，０００ｍｇ／ｋｇ）による血糖値上昇の抑制作用（ｉｎ ｖｉｖｏ試験）とα−アミラーゼ阻害活性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）を確認するために試験した。
【００２５】
（キウイフルーツ葉エキスの分離画分のスターチ負荷試験の結果）
上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の分離において得られたＷａｔｅｒ［２］画分，ｎ‐ＢｕＯＨ画分，９０％ＭｅＯＨ画分の３つの画分について，スターチ負荷試験を行なった結果を，図２に示す。図２に示されるように，ｎ‐ＢｕＯＨ画分と９０％ＭｅＯＨ画分において，糖負荷後３０分時に対照群に対して有意な血糖値上昇抑制作用を示した。このことから，この画分にスターチ負荷による血糖値上昇を抑制する活性成分が含有されていることが示された。
（キウイフルーツ葉エキスの分離画分のα−アミラーゼ阻害活性試験）
α−アミラーゼ阻害活性試験はＸｉａｏらの方法を改良して行った。２ｍＭ ＣａＣｌ２と０．２％ウシ血清アルブミン含有０．１ Mリン酸バッファー（ｐＨ６．９），基質として２．５ ｍｇ／ｍｌの可溶性デンプン溶液（Ｗａｋｏ），酵素として０．２ ｕｎｉｔｓの豚膵臓由来α−アミラーゼ (Ｅ.Ｃ. ３．２．１．１)，呈色液にヨウ素溶液を用い，一定時間の反応ののち分解されずに残存したデンプンをヨウ素デンプン反応で評価した。９６ウェルプレートにバッファーとサンプルの希釈段階を作製し，総量５０ μｌとした。ここに基質を１００℃で加熱してα化させたものを５０ μｌ加えて，３７℃で５分間プレインキュベーションした。反応は酵素を１００ μｌ加えることによって開始し，３７℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後，反応停止液と呈色液の混合液１００ μｌを反応液に加え，反応停止直後に６００ ｎｍで吸光度を測定した。α−アミラーゼ阻害活性はＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ）で表した。上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の分離において得られたｎ‐ＢｕＯＨ画分，９０％ＭｅＯＨ画分の２つの画分について，α−アミラーゼ阻害活性試験を行なった結果を，図３に示す。図３に示されるように，９０％ＭｅＯＨ画分において，ＩＣ５０値は４２．９（μｇ／ｍｌ）であり，一般的な経口糖尿病薬であるｖｏｇｌｉｂｏｓｅと同等の値を示したことから，この画分にα−アミラーゼを阻害する活性成分が含有されていることが示された。
【００２６】
［キウイフルーツ葉エキスの分離画分の血糖値上昇抑制作用の確認］
上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の分離において得られたＦｒ．Ｂ−３と高速液体クロマトグラフィーシステムを用いたＯＤＳカラム（ＨＧ−５，直径２０ｍｍ，５０％ＭｅＯＨ→ＭｅＯＨ，２１５ｎｍ）クロマトグラフィーにより得られたと単一の成分である化合物Ｄ−１からＤ−６の６つの画分について，スターチ負荷（１，０００ｍｇ／ｋｇ）による血糖値上昇の抑制作用を確認するために試験した。
【００２７】
（キウイフルーツ葉エキスの分離画分のスターチ負荷試験の結果）
上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の分離において得られたＦｒ．Ｂ−３と高速液体クロマトグラフィーシステムを用いたＯＤＳカラム（ＨＧ−５，直径２０ｍｍ，５０％ＭｅＯＨ →ＭｅＯＨ，２１５ｎｍ）クロマトグラフィーにより得られた単一の成分である化合物Ｄ−１から化合物Ｄ−６の６つの画分について，スターチ負荷試験を行なった結果を，図２に示す。対照群の糖負荷後30分時の値から０分時の値を引いたものを１００％として示した。図２に示されるように，Ｆｒ．Ｂ−３画分において，糖負荷後３０分時に対照群に対して有意な血糖値上昇抑制作用を示した。また，化合物Ｄ−１からＤ−３が糖負荷後３０分時に対照群に対して血糖値上昇抑制傾向を示した。このことから，この化合物Ｄ−１，化合物Ｄ−２，化合物Ｄ−３がスターチ負荷による血糖値上昇を抑制する活性成分であることが示された。
【００２８】
［キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の同定］
上記の分離操作により９０％ＭｅＯＨ画分から分離されたα−アミラーゼ阻害活性成分は，ＴＬＣ上で，各々単一スポットとして確認されたため，ＮＭＲによる分析（１Ｈ ＮＭＲ；１３Ｃ ＮＭＲ；ＤＥＰＴ；ＣＯＳＹ；ＨＭＱＣ；ＨＭＢＣ；ＮＯＥＳＹ）を行なった。化合物Ｄ−２と化合物Ｄ−３の１Ｈ ＮＭＲによる分析の結果を，図３に示す１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）。化合物Ｄ２の１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて，特徴的なシグナルとして，δＨ１．３から０．８ｐｐｍ付近にみられる６個のメチル基と考えられるシグナル，δＨ４．６から３．２ｐｐｍ付近に酸素と隣り合った炭素に結合する水素と考えられるシグナル（４Ｈ分），δＨ５．２ｐｐｍ付近にオレフィンプロトンと考えられる１Ｈ分のシグナルが観測された。一方，化合物Ｄ３の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは，化合物Ｄ−２のスペクトルでδＨ２．８ｐｐｍ付近に見られた１Ｈ分のシグナルが，Ｄ−３ではδＨ２．２ｐｐｍ付近にシフトしているほかは、よく似たシグナルを示した。
【００２９】
また，化合物Ｄ−２と化合物Ｄ−３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルによる分析の結果を，図４に示す１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）。はじめに化合物Ｄ−２の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル，ＤＥＰＴスペクトル及びＨＭＱＣスペクトルより，１個のカルボニル炭素（δＣ１７８．７），２個のオレフィン炭素（δＣ１４４．３，１２２．５），２個のオキシメチン炭素（δＣ７３．８，６６．６），１個のオキシメチレン炭素（δＣ６６．０）の存在が示唆された。この他に，６個の四級炭素（δＣ４７．０，４４．２，４２．０，３９．８，３８．４，３０．９），３個のメチン炭素（δＣ４９．０，４７．８，４１．６），９個のメチレン炭素（δＣ４６．２，４２．０，３４．１，３２．６５，３２．６０，２７．９，２３．３，２２．２，１８．６），６個のメチル炭素（δＣ３３．２，２６．２，２３．７５，２３．７０，１６．９，１６．８）の存在が示唆された。つぎに化合物Ｄ３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル，ＤＥＰＴスペクトル及びＨＭＱＣスペクトルより，１個のカルボニル炭素（δＣ１８２．３），２個のオレフィン炭素（δＣ１４０．３，１２７．２），２個のオキシメチン炭素（δＣ７５．１，６７．５），１個のオキシメチレン炭素（δＣ６６．４）の存在が示唆された。この他に，５個の四級炭素（δＣ４７．０，４５．９，４３．９，４１．５，３９．７），５個のメチン炭素（δＣ５４．９，５０．４，４９．４，４０．９５，４０．９３），８個のメチレン炭素（δＣ４３．２，３８．６，３５．１，３２．３，２９．７，２５．８，２５．１，１９．９），６個のメチル炭素（δＣ２４．６，２３．６，２２．１，１８．１，１８．２，１７．９）の存在が示唆された。
【００３０】
また，ＣＯＳＹスペクトル，ＨＭＢＣスペクトルの解析により，化合物Ｄ−２については五環性トリテルペンの一種であるｏｌｅａｎｅｎ骨格が明らかとなった。更にＮＯＥＳＹによる立体配置の解析により一般式（１）の化合物であることが示された。この化合物は白色針状結晶として得られ，メタノールに可溶である。高分解能質量分析（ＥＳＩＭＳ）より，［ｍ／ｚ５１１．３４１５（Ｍ＋Nａ）＋］に分子イオンピークが確認されたことから，分子式はＣ３０Ｈ４８Ｏ５であると決定された。以上の分析結果から，化合物Ｄ−２は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄであると同定された。
【００３１】
同様に，化合物Ｄ−３については五環性トリテルペンの一種であるｕｒｓｅｎ骨格が明らかとなった。更にＮＯＥＳＹによる立体配置の解析により一般式（２）の化合物であることが示された。この化合物は白色針状結晶として得られ，メタノールに可溶である。高分解能質量分析（ＥＳＩＭＳ）より，［ｍ／ｚ５１１．３３８９（Ｍ＋Ｎａ）＋］に分子イオンピークが確認されたことから，分子式はＣ３０Ｈ４８Ｏ５であると決定された。以上の分析結果から，化合物Ｄ−３は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄであると同定された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の実施例におけるキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の抽出分離において，活性成分の抽出分離のフローおよびを示す図である。
【図２】本発明の実施例における，化合物Ｄ−２と化合物Ｄ−３のスターチ負荷試験の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例におけるキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の同定において，分離されたα−アミラーゼ阻害活性成分の１Ｈ ＮＭＲによる分析の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例におけるキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の同定において，分離されたα−アミラーゼ阻害活性成分の１３Ｃ ＮＭＲによる分析の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，α−アミラーゼ阻害剤，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤，及び該α−アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は治療薬，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いはペットフードに関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満や糖尿病等は，食生活のような生活習慣，環境因子によりその発症が大きく影響されることから，生活習慣病とも呼ばれている。近年，日本では食べ過ぎ等の食生活が原因となるＩＩ型糖尿病が増加の一途をたどっている。糖尿病には，インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）とインスリン非依存型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）の２タイプがあるが，その９０％は後者のタイプである。インスリン非依存型糖尿病における高血糖の原因として，食後の急峻な血糖上昇に対応し，瞬時に分泌されるべきインスリン早期相の欠如と食後高血糖の持続により誘導される内因性基礎インスリン分泌低下が挙げられる。
【０００３】
食後高血糖の是正には消化系における糖質の急速な吸収を防ぐ方法がある。消化系における糖質の吸収としては，唾液中や膵液中のα−アミラーゼや小腸中のα−グルコシダーゼが関与しており，これらの酵素を阻害することにより，食後の血糖値上昇が抑制され，更にそれに続くインスリン値の上昇も抑制されることが明らかにされている。一般的な経口糖尿病薬にはアカルボース，ボグリボース，ミグリトールといったα−グルコシダーゼを競合的かつ拮抗的に阻害するα−グルコシダーゼ阻害剤がある。
【０００４】
これまで植物或いは植物抽出物からなる各種の血糖値上昇抑制剤が開示されているが，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄのような成分からなるα−アミラーゼ阻害剤は開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は，天然物由来の安全で，温和な効力を有するα−アミラーゼ阻害剤，及び，該α−アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は，治療薬，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いは，ペットフードを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは，先に，キウイフルーツの葉のメタノール抽出物が顕著な血糖値上昇抑制作用を有することを見い出し，該抽出物を有効成分とする血糖値上昇抑制剤等について，特許出願を行なった（特願２００７−３５４８３号）
【特許文献１】。そして更に，キウイフルーツの葉の血糖値上昇を抑制する物質について，鋭意検討する中で，キウイフルーツの葉の血糖値上昇を抑制する物質として数種類の五環性のヒドロキシトリテルペン類が含まれることを見い出し，その中から特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄおよび（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを精製・単離することに成功し，該物質がα−アミラーゼ阻害を有することを確認し，本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち，本発明は，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤からなる。本発明の，（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，下記一般式で表される。
【０００８】
【化１】
【化２】
【０００９】
本発明のα−アミラーゼ阻害剤の有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，アルコール又は熱水抽出物を抽出して得られるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン精製画分，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを採取することにより調製できる。また，アルコール又は熱水抽出物を抽出し，９０％メタノールで抽出して得られるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン精製画分，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを採取することにより調製できる。更に，シリカカラム及び／又はＯＤＳカラムによるカラムクロマトグラフィーにより精製・分離し，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類画分を採取することにより，更に精製された（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを調製することができる。
【００１０】
本発明のヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを１種または２種含むことを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤は，消化管における糖質の分解を阻害することでグルコースの血中への吸収を抑制し，該α−アミラーゼ阻害剤を添加，含有させることにより，血糖値上昇予防または治療薬を，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いはペットフードを提供することができる。
【００１１】
すなわち具体的には本発明は，（１）ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。（２）（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを１種または２種含むことを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤からなる。
【００１２】
また本発明は，（３）上記（１または２）に記載のα−アミラーゼ阻害剤を含有することと特徴とする血糖値上昇予防または治療薬や，（４）上記（１または２）に記載のα−アミラーゼ阻害剤を添加したことを特徴とする血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品や，（５）上記（１または２）に記載のα−アミラーゼ阻害剤を添加したことを特徴とする血糖値上昇抑制機能を付与したペットフードからなる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のα−アミラーゼ阻害剤の有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，植物のような天然由来の有効成分として，穏やかなかつ顕著なα−アミラーゼ阻害作用を奏する。したがって，本発明は，天然物由来の安全で，温和な効力を有するα−アミラーゼ阻害剤を提供するとともに，該α−アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は治療薬，或いは，血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いは，ペットフードを提供し，人間又は動物の糖尿病のような生活習慣病の予防，改善のための有力な対処法を提供することができる。
【００１４】
本発明は，ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを１種または２種含むことを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤，及び，該α‐アミラーゼ阻害剤を含有する血糖値上昇予防又は治療薬，或いは，α−アミラーゼ阻害剤を添加した血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品，或いは，ペットフードからなる。
【００１５】
本発明のα−アミラーゼ阻害剤の有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを調製するには，トリテルペン類からの合成法により製造することもできるが，α−アミラーゼ阻害剤の有効成分としての用途の目的からは，植物エキスからの抽出・精製することによる調製方法が特に好ましい。ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄを調製するには，まず，植物抽出液を調製する。植物抽出液は，葉部および花部，或いは植物全体をそのまま用いてもよく，これらを乾燥した乾燥体，若しくは乾燥後粉砕した粉末を用いることもできる。また，これらを水抽出，熱水抽出，酸性下での抽出，アルカリ性下での抽出，メタノール，エタノール，アセトン，酢酸エチル，ヘキサン等各種の有機溶媒を用いて，抽出した抽出物を用いることもできる。
【００１６】
植物抽出液から，本発明の有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄの精製画分を精製・分離して採取するには，例えば，植物の葉のメタノール抽出液または熱水抽出液を，９０％メタノールで抽出したヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分精製画分を採取する。該画分は，更に，シリカカラム及び／又はＯＤＳ（Ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌａｎｅ）カラムによるカラムクロマトグラフィーにより精製・分離し，（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ精製画分を採取することができる。
【００１７】
ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類画分，特に（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ精製画分を用いて，血糖値上昇抑制剤，或いは，血糖値上昇予防又は治療薬を製造するには，上記の方法で製造した精製画分を情報に従って公知の医薬用無毒性担体と組み合わせて製剤化すればよい。本発明に関わる血糖値上昇抑制剤は，種々の剤型での投与が可能であるが，経口投与剤として製剤化される。例えば，経口投与剤としては錠剤，顆粒剤，散剤，カプセル剤，ソフトカプセル剤などの固形剤，溶液剤，懸濁剤，乳化剤等の液剤，凍結乾燥剤等が挙げられ，これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。
【００１８】
上記医薬用無毒性担体としては，例えば，グルコース，乳糖，ショ糖，でんぷん，マンニトール，デキストリン，脂肪酸グリセリド，ポリエチレングリコール，ヒドロキシエチルでんぷん，エチレングリコール，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル，アミノ酸，アルブミン，水，生理食塩水などが挙げられる。また，必要に応じて安定化剤，滑沢剤，湿潤剤，乳化剤，結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。本発明に関わる血糖値上昇抑制剤において，有効成分であるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分および該画分に含有される（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄの投与量は，患者の年齢，体重，症状，疾患の程度，投与スケジュール，製剤形態等により，適宜選択，決定されるが，例えば，一日当たり生薬当価量として０．１から１００ｇ／ｋｇ体重程度とされ，一日数回に分けて投与してもよい。
【００１９】
また，本発明に関わるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分および該画分に含有される（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，毒性を有することは報告されていないことから，血糖値上昇抑制を目的とした飲食品として摂取することもできる。本発明の有効成分を添加した血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品は，特定保健用食品，栄養機能食品，又は健康食品等として位置付けることができる。機能性食品としては，例えば，本発明の有効成分に適当な所剤を添加した後，慣用の手段を用いて，食用に適した状態，例えば，顆粒状，粒状，錠剤，カプセル剤，ソフトカプセル剤，ペースト状等に形成したものを用いることができる。この飲食品はそのまま食用に供してもよく，また種々の食品（例えばハム，ソーセージ，かまぼこ，ちくわ，パン，バター，粉乳，菓子など）に添加して使用したり，水，酒類，果汁，牛乳，清涼飲料水等の飲物に添加して使用してもよい。かかる食品の形態における本発明の有効成分の摂取量は，年齢，体重，症状，疾患の程度，食品の形態等により適宜選択・決定されるが，例えば，一日当たり生葉等価量として０．１から１００ｇ／ｋｇ体重程度とされ，一日数回に分けて投与してもよい。
【００２０】
また，本発明に関わるヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペン類精製画分および該画分に含有される（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄは，動物用にペットフードとして用いることもでき，摂取量はペットの種類，年齢，体重，症状，疾患の程度，食品の形態等により適宜選択されるが，食品に準拠して投与すればよい。
【００２１】
以下，実施例により本発明を具体的に説明するが，本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
［キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の抽出分離］
キウイフルーツの葉エキスに有意な血糖値上昇抑制作用があることから，該血糖値上昇抑制作用を有する活性成分の抽出分離を，図１のフローに従って行なった。すなわち，キウイフルーツの葉のメタノール（ＭｅＯＨ）抽出エキス（８．０ｇ）を１．５Ｌの蒸留水（Ｗａｔｅｒ）に溶解させ，等量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を加え，Ｗａｔｅｒ［１］画分とＥｔＯＡｃ画分に分配した。この操作を３回繰り返した。Ｗａｔｅｒ［１］画分をエバポレーターで減圧濃縮後，同様の操作により，更にＷａｔｅｒ［２］画分とｎ‐ＢｕＯＨ画分（ｎ‐ブタノール）画分に分配した。また，酢酸エチル画分をエバポレーターで減圧濃縮後，同様の操作により，更に９０％メタノール画分とｎ‐Ｈｅｘ画分（ｎ‐ヘキサン）画分に分配した。全ての画分をエバポレーターで減圧濃縮後，凍結乾燥し，重量を測定した。これらの分配操作により，Ｗａｔｅｒ［２］画分１．０ｇ，ｎ‐ＢｕＯＨ画分２．８ｇ，９０％ＭｅＯＨ画分１．３ｇ，ｎ‐Ｈｅｘ画分２．６ｇの４つの画分を得た。Ｗａｔｅｒ［２］画分，ｎ‐ＢｕＯＨ画分，９０％ＭｅＯＨ画分のうち，９０％ＭｅＯＨ画分とｎ‐ＢｕＯＨ画分が，スターチを負荷したマウスにおいて血糖値上昇抑制作用を示した。
【００２３】
上記で得られたキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分を含有する９０％ＭｅＯＨ画分を精製・分離して，該α−アミラーゼ阻害活性成分の構造について分析した。９０％ＭｅＯＨ画分の精製・分離のフローを上記に続いて図１に示す。すなわち，上記で得られたキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分を含有する９０％ＭｅＯＨ画分を，Ｓｉｌｉｃａカラム（ゲル２０ｇ，ｎ‐Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ＝１／０（１ｖｏｌ．）→ＭｅＯＨ（１０ｖｏｌ．））クロマトグラフィーにより，６個の画分に分画したところ，Ｆｒ.Ｂ−３がグルコースを負荷したマウスにおいて血糖値上昇抑制作用を示した。更に，この画分を高速液体クロマトグラフィーシステムを用いたＯＤＳカラム（ＨＧ‐５，直径２０ｍｍ，５０％ＭｅＯＨ → ＭｅＯＨ，２１５ｎｍ）クロマトグラフィーにより，単一の成分である６個の画分に分画したところ，Ｆｒ.Ｄ−１からＦｒ.Ｄ−３がグルコースを負荷したマウスにおいて血糖値上昇抑制作用を示した。
【００２４】
［キウイフルーツ葉エキスの分離画分の血糖値上昇抑制作用の確認］
上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の抽出分離によって，分離途中で得られたＷａｔｅｒ［２］画分，ｎ‐ＢｕＯＨ画分，９０％ＭｅＯＨ画分の３つの画分について，スターチ負荷（１，０００ｍｇ／ｋｇ）による血糖値上昇の抑制作用（ｉｎ ｖｉｖｏ試験）とα−アミラーゼ阻害活性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）を確認するために試験した。
【００２５】
（キウイフルーツ葉エキスの分離画分のスターチ負荷試験の結果）
上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の分離において得られたＷａｔｅｒ［２］画分，ｎ‐ＢｕＯＨ画分，９０％ＭｅＯＨ画分の３つの画分について，スターチ負荷試験を行なった結果を，図２に示す。図２に示されるように，ｎ‐ＢｕＯＨ画分と９０％ＭｅＯＨ画分において，糖負荷後３０分時に対照群に対して有意な血糖値上昇抑制作用を示した。このことから，この画分にスターチ負荷による血糖値上昇を抑制する活性成分が含有されていることが示された。
（キウイフルーツ葉エキスの分離画分のα−アミラーゼ阻害活性試験）
α−アミラーゼ阻害活性試験はＸｉａｏらの方法を改良して行った。２ｍＭ ＣａＣｌ２と０．２％ウシ血清アルブミン含有０．１ Mリン酸バッファー（ｐＨ６．９），基質として２．５ ｍｇ／ｍｌの可溶性デンプン溶液（Ｗａｋｏ），酵素として０．２ ｕｎｉｔｓの豚膵臓由来α−アミラーゼ (Ｅ.Ｃ. ３．２．１．１)，呈色液にヨウ素溶液を用い，一定時間の反応ののち分解されずに残存したデンプンをヨウ素デンプン反応で評価した。９６ウェルプレートにバッファーとサンプルの希釈段階を作製し，総量５０ μｌとした。ここに基質を１００℃で加熱してα化させたものを５０ μｌ加えて，３７℃で５分間プレインキュベーションした。反応は酵素を１００ μｌ加えることによって開始し，３７℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後，反応停止液と呈色液の混合液１００ μｌを反応液に加え，反応停止直後に６００ ｎｍで吸光度を測定した。α−アミラーゼ阻害活性はＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ）で表した。上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の分離において得られたｎ‐ＢｕＯＨ画分，９０％ＭｅＯＨ画分の２つの画分について，α−アミラーゼ阻害活性試験を行なった結果を，図３に示す。図３に示されるように，９０％ＭｅＯＨ画分において，ＩＣ５０値は４２．９（μｇ／ｍｌ）であり，一般的な経口糖尿病薬であるｖｏｇｌｉｂｏｓｅと同等の値を示したことから，この画分にα−アミラーゼを阻害する活性成分が含有されていることが示された。
【００２６】
［キウイフルーツ葉エキスの分離画分の血糖値上昇抑制作用の確認］
上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の分離において得られたＦｒ．Ｂ−３と高速液体クロマトグラフィーシステムを用いたＯＤＳカラム（ＨＧ−５，直径２０ｍｍ，５０％ＭｅＯＨ→ＭｅＯＨ，２１５ｎｍ）クロマトグラフィーにより得られたと単一の成分である化合物Ｄ−１からＤ−６の６つの画分について，スターチ負荷（１，０００ｍｇ／ｋｇ）による血糖値上昇の抑制作用を確認するために試験した。
【００２７】
（キウイフルーツ葉エキスの分離画分のスターチ負荷試験の結果）
上記キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の分離において得られたＦｒ．Ｂ−３と高速液体クロマトグラフィーシステムを用いたＯＤＳカラム（ＨＧ−５，直径２０ｍｍ，５０％ＭｅＯＨ →ＭｅＯＨ，２１５ｎｍ）クロマトグラフィーにより得られた単一の成分である化合物Ｄ−１から化合物Ｄ−６の６つの画分について，スターチ負荷試験を行なった結果を，図２に示す。対照群の糖負荷後30分時の値から０分時の値を引いたものを１００％として示した。図２に示されるように，Ｆｒ．Ｂ−３画分において，糖負荷後３０分時に対照群に対して有意な血糖値上昇抑制作用を示した。また，化合物Ｄ−１からＤ−３が糖負荷後３０分時に対照群に対して血糖値上昇抑制傾向を示した。このことから，この化合物Ｄ−１，化合物Ｄ−２，化合物Ｄ−３がスターチ負荷による血糖値上昇を抑制する活性成分であることが示された。
【００２８】
［キウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の同定］
上記の分離操作により９０％ＭｅＯＨ画分から分離されたα−アミラーゼ阻害活性成分は，ＴＬＣ上で，各々単一スポットとして確認されたため，ＮＭＲによる分析（１Ｈ ＮＭＲ；１３Ｃ ＮＭＲ；ＤＥＰＴ；ＣＯＳＹ；ＨＭＱＣ；ＨＭＢＣ；ＮＯＥＳＹ）を行なった。化合物Ｄ−２と化合物Ｄ−３の１Ｈ ＮＭＲによる分析の結果を，図３に示す１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）。化合物Ｄ２の１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて，特徴的なシグナルとして，δＨ１．３から０．８ｐｐｍ付近にみられる６個のメチル基と考えられるシグナル，δＨ４．６から３．２ｐｐｍ付近に酸素と隣り合った炭素に結合する水素と考えられるシグナル（４Ｈ分），δＨ５．２ｐｐｍ付近にオレフィンプロトンと考えられる１Ｈ分のシグナルが観測された。一方，化合物Ｄ３の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは，化合物Ｄ−２のスペクトルでδＨ２．８ｐｐｍ付近に見られた１Ｈ分のシグナルが，Ｄ−３ではδＨ２．２ｐｐｍ付近にシフトしているほかは、よく似たシグナルを示した。
【００２９】
また，化合物Ｄ−２と化合物Ｄ−３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルによる分析の結果を，図４に示す１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）。はじめに化合物Ｄ−２の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル，ＤＥＰＴスペクトル及びＨＭＱＣスペクトルより，１個のカルボニル炭素（δＣ１７８．７），２個のオレフィン炭素（δＣ１４４．３，１２２．５），２個のオキシメチン炭素（δＣ７３．８，６６．６），１個のオキシメチレン炭素（δＣ６６．０）の存在が示唆された。この他に，６個の四級炭素（δＣ４７．０，４４．２，４２．０，３９．８，３８．４，３０．９），３個のメチン炭素（δＣ４９．０，４７．８，４１．６），９個のメチレン炭素（δＣ４６．２，４２．０，３４．１，３２．６５，３２．６０，２７．９，２３．３，２２．２，１８．６），６個のメチル炭素（δＣ３３．２，２６．２，２３．７５，２３．７０，１６．９，１６．８）の存在が示唆された。つぎに化合物Ｄ３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル，ＤＥＰＴスペクトル及びＨＭＱＣスペクトルより，１個のカルボニル炭素（δＣ１８２．３），２個のオレフィン炭素（δＣ１４０．３，１２７．２），２個のオキシメチン炭素（δＣ７５．１，６７．５），１個のオキシメチレン炭素（δＣ６６．４）の存在が示唆された。この他に，５個の四級炭素（δＣ４７．０，４５．９，４３．９，４１．５，３９．７），５個のメチン炭素（δＣ５４．９，５０．４，４９．４，４０．９５，４０．９３），８個のメチレン炭素（δＣ４３．２，３８．６，３５．１，３２．３，２９．７，２５．８，２５．１，１９．９），６個のメチル炭素（δＣ２４．６，２３．６，２２．１，１８．１，１８．２，１７．９）の存在が示唆された。
【００３０】
また，ＣＯＳＹスペクトル，ＨＭＢＣスペクトルの解析により，化合物Ｄ−２については五環性トリテルペンの一種であるｏｌｅａｎｅｎ骨格が明らかとなった。更にＮＯＥＳＹによる立体配置の解析により一般式（１）の化合物であることが示された。この化合物は白色針状結晶として得られ，メタノールに可溶である。高分解能質量分析（ＥＳＩＭＳ）より，［ｍ／ｚ５１１．３４１５（Ｍ＋Nａ）＋］に分子イオンピークが確認されたことから，分子式はＣ３０Ｈ４８Ｏ５であると決定された。以上の分析結果から，化合物Ｄ−２は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄであると同定された。
【００３１】
同様に，化合物Ｄ−３については五環性トリテルペンの一種であるｕｒｓｅｎ骨格が明らかとなった。更にＮＯＥＳＹによる立体配置の解析により一般式（２）の化合物であることが示された。この化合物は白色針状結晶として得られ，メタノールに可溶である。高分解能質量分析（ＥＳＩＭＳ）より，［ｍ／ｚ５１１．３３８９（Ｍ＋Ｎａ）＋］に分子イオンピークが確認されたことから，分子式はＣ３０Ｈ４８Ｏ５であると決定された。以上の分析結果から，化合物Ｄ−３は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄであると同定された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の実施例におけるキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の抽出分離において，活性成分の抽出分離のフローおよびを示す図である。
【図２】本発明の実施例における，化合物Ｄ−２と化合物Ｄ−３のスターチ負荷試験の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例におけるキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の同定において，分離されたα−アミラーゼ阻害活性成分の１Ｈ ＮＭＲによる分析の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例におけるキウイフルーツ葉エキスのα−アミラーゼ阻害活性成分の同定において，分離されたα−アミラーゼ阻害活性成分の１３Ｃ ＮＭＲによる分析の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。
【請求項２】
（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄから１種または２種を含むことを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のα−アミラーゼ阻害剤を含有することを特徴とする血糖値上昇予防又は治療薬。
【請求項４】
請求項１または２に記載のα−アミラーゼ阻害剤を添加したことを特徴とする血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品。
【請求項５】
請求項１または２に記載のα−アミラーゼ阻害剤を添加したことを特徴とする血糖値上昇抑制機能を付与したペットフード。
【請求項１】
ヒドロキシオレアンネンタイプまたはヒドロキシウルセンタイプの五環性トリテルペンを有効成分とするα−アミラーゼ阻害剤。
【請求項２】
（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ又は（２α，３α）２，３，２４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄから１種または２種を含むことを特徴とするα−アミラーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のα−アミラーゼ阻害剤を含有することを特徴とする血糖値上昇予防又は治療薬。
【請求項４】
請求項１または２に記載のα−アミラーゼ阻害剤を添加したことを特徴とする血糖値上昇抑制機能を付与した飲食品。
【請求項５】
請求項１または２に記載のα−アミラーゼ阻害剤を添加したことを特徴とする血糖値上昇抑制機能を付与したペットフード。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１１６７１４（Ｐ２０１１−１１６７１４Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７６７９７（Ｐ２００９−２７６７９７）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年６月５日 新規素材探索研究会主催の「新規素材探索研究会 第８回セミナー」において文書をもって発表
【出願人】（５０９１６０９４８）
【出願人】（５０７３９１４６５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年６月５日 新規素材探索研究会主催の「新規素材探索研究会 第８回セミナー」において文書をもって発表
【出願人】（５０９１６０９４８）
【出願人】（５０７３９１４６５）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]