アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤と組み合わせて、フォロデシンのようなＰＮＰ阻害剤を使用する、血液学的な癌を処置する方法
この出願は、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤の投与を含むことができる血液学的な癌の処置に関し、さらには関連組成物およびキットに関する。具体的には、本発明の方法は、（ａ）上記被験体に有効量のＰＮＰ）害剤を投与する工程と、（ｂ）上記被験体に有効量のアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤を投与する工程を含む。特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。他の実施形態では、上記アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、およびイミダゾールカルボキサミド化合物から選択される。いくつかの実施形態では、上記アルキル化剤はベンダムスチンである。特定の実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤の投与を含む方法による、血液学的な癌（例えば、血液の癌）の処置に関する。特に、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を処置する方法が記載される。
【０００２】
関連出願
この出願は、２００７年１２月１０日に出願された、米国出願第６１／０１２，７６２号（この出願は、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
現在、癌は、米国では２番目の死因であり、米国では８百万人超が癌と診断されている。１９９５年には、米国内の死者の２３．３％が癌を死因としていた（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｈｅａｌｔｈ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ １９９６−９７ ａｎｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｃｈａｒｔｂｏｏｋ １１７（１９９７）参照）。
【０００４】
現在、癌は、主として、外科手術、放射線療法、および化学療法の３種類の療法の１つまたはそれらの組み合わせにより処置される。外科手術には、病変組織の大量除去が含まれる。外科手術は、例えば、胸部、結腸、および皮膚等、特定の部位に位置する腫瘍の除去に効果的な場合があるが、骨格等の他の領域に位置する腫瘍の処置や、白血病等の播種性の腫瘍性病態の処置には使用できない。放射線療法には、生体組織を電離放射線に曝露して曝露細胞の死または損傷を生じることが含まれる。放射線療法の副作用は急性かつ一過性のものであり得るが、他のものに関しては不可逆性であり得る。化学療法には、細胞複製または細胞代謝の崩壊が含まれる。これは、胸部、肺、および精巣癌の処置において最もよく用いられる。この癌処置における失敗の主因の１つは、癌細胞が薬物耐性を生じることであり、これは、病気の再発または死にも繋がり得る重大な問題である。よって、より効果的な癌処置が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、被験体の血液学的な癌（例えば、ＣＬＬおよびＡＬＬ）を処置する方法を提供する。この方法は、（ａ）上記被験体に有効量のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤を投与する工程と、（ｂ）上記被験体に有効量のアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤を投与する工程を含む。特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。他の実施形態では、上記アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、およびイミダゾールカルボキサミド化合物から選択される。いくつかの実施形態では、上記アルキル化剤はベンダムスチンである。特定の実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【０００６】
いくつかの実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は同時投与されるが、他の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は連続投与される。後者の実施形態では、上記アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤は、上記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与することができる。
【０００７】
他の実施形態では、１つ以上の化学療法剤（例えば、ベンダムスチン等のアルキル化剤およびフルラダビン（Ｆｌｕｒａｄａｂｉｎｅ）等のプリンヌクレオシド類似体）に耐性を持つ被験体の血液学的な癌を処置する方法は、（ａ）１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体を同定する工程と、（ｂ）上記被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程とを含むことができる。具体的な実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。
【０００８】
他の実施形態では、血液学的な癌を有する被験体を処置する方法は、（ａ）上記被験体由来の試料中の１つ以上の癌細胞においてｐ５３欠失を検出する工程と、（ｂ）上記被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程とを含むことができる。特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。いくつかの実施形態では、上記方法は、１７ｐ欠失の存在を検出する工程および／または上記試料中の１つ以上の癌細胞が１つ以上の化学療法剤（例えば、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体）に耐性を持つか否かを判定する工程をさらに含むことができる。
【０００９】
本明細書では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００１０】
本明細書では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含むキットも提供する。いくつかの実施形態では、上記キットは、上記ＰＮＰ阻害剤、上記アルキル化剤、上記抗ＣＤ２０剤、またはそれらの任意の組み合わせの送達システムをさらに含むことができる。他の実施形態では、上記キットはまた、被験体を処置するための使用説明書含むことができる。
【００１１】
他の実施形態では、キットはＰＮＰ阻害剤を含む。１つの実施形態では、上記キットは、その内容物がアルキル化剤に耐性を持つ被験体に投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記キットはまた、その内容物がｐ５３欠失を有する被験体に投与されるべきものであることを示すラベルを含む。最後の実施形態では、上記キットは、その内容物がアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤とともに投与されるべきものであることを示すラベルを含むことができる。
【００１２】
特定の実施形態では、動物の血液学的な癌の処置に有用な薬剤を調製するためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤およびアルキル化剤の使用を提供する。
【００１３】
特定の実施形態では、動物の血液学的な癌の処置に有用な薬剤を調製するためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤および抗ＣＤ２０剤の使用を提供する。
【００１４】
特定の実施形態では、血液学的な癌の処置のためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤およびアルキル化剤の使用を提供する。
【００１５】
特定の実施形態では、血液学的な癌の処置のためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤および抗ＣＤ２０剤の使用を提供する。
【００１６】
本発明の１つ以上の実施形態を添付の図面および下記の説明において詳細に示す。他の特徴、目的、および利点は、それらの説明および図面、ならびに請求の範囲により明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】高いＺＡＰ−７０レベルおよび低いＺＡＰ−７０レベルの両方を示すＣＬＬ細胞におけるフォロデシンの細胞毒性効果を詳細に示す。
【図１Ｂ】高いＺＡＰ−７０レベルおよび低いＺＡＰ−７０レベルの両方を示すＣＬＬ細胞におけるフォロデシンの細胞毒性効果を詳細に示す。
【図２】フォロデシン処置後の細胞内のｄＧＴＰレベルの上昇と誘導された細胞死の量の相関性を示す。
【図３】フォロデシンに対する反応が大きいｐ５３欠失ＣＬＬ症例を詳細に示す値を示す。
【図４】ベンダムスチンまたはフルダラビン処置に対する感受性が低いかまたは感受性を有さないＣＬＬ症例のフォロデシンを用いた処置のデータを示す。
【図５Ａ】フォロデシン／ベンダムスチンおよびフォロデシン／フルダラビンの結合指数データを示す。
【図５Ｂ】フォロデシン／ベンダムスチンおよびフォロデシン／フルダラビンの結合指数データを示す。
【図６】フォロデシン／リツキシマブの結合指数データの詳細を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本明細書に記載するように、フォロデシンを用いた処置は、一次ＣＬＬ細胞の時間および用量依存性細胞死を誘導した。２μＭのフォロデシンおよび２０μＭのｄＧｕｏを用いた６０％を超える細胞毒性反応が４８％の症例において観察され、細胞毒性が４０％未満であったのは９％の症例のみであった。１７ｐ１３（ＴＰ５３）および１１ｑ２２−ｑ２３（ＡＴＭ）の欠失等の遺伝学的異常、進行疾患による後天性かつ薬物耐性に関する遺伝学的異常、ならびにＣＬＬ患者の短期間生存率に関しては、反応に差異は観察されなかった。それらのｐ５３または１１ｑ変異を有するＣＬＬ症例は、フォロデシンに対して高い感受性（平均細胞毒性６０．１％、４８時間）を示し、化学療法に耐性を有するＣＬＬ患者において良好な細胞毒性反応が得られた。フォロデシンと臨床的抗白血病レジメンの組み合わせにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性反応が促進され、フォロデシンと、低用量のベンダムスチン、モノクローナル抗体の抗ＣＤ２０リツキシマブ、またはシクロホスファミドとの組み合わせにより強力な相乗効果が観察された。対照的に、フルダラビンには拮抗作用が見られた。それゆえ、フォロデシンは、ＡＴＭ／ｐ５３経路を回避するＣＬＬ細胞のアポトーシスを誘導可能な新規な化学療法的アプローチの典型を示す。
【００１９】
従って、特定の実施形態では、被験体の血液学的な癌を処置する方法であって、上記被験体に有効量のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤を投与する工程と、上記被験体に有効量のアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤を投与する工程とを含む、方法を提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。
【００２１】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、およびイミダゾールカルボキサミド化合物から選択される。
【００２２】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤はマスタード誘導体である。
【００２３】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤はベンダムスチンである。
【００２４】
特定の実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【００２５】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は同時投与される。
【００２６】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は連続投与される。
【００２７】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤は、上記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与される。
【００２８】
特定の実施形態では、上記血液学的な癌は、慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される。
【００２９】
特定の実施形態では、上記血液学的な癌は慢性リンパ性白血病である。
【００３０】
特定の実施形態では、上記血液学的な癌は急性リンパ芽球性白血病である。
【００３１】
特定の実施形態では、有効量のアルキル化剤が上記被験体に投与される。
【００３２】
特定の実施形態では、有効量の抗ＣＤ２０剤が上記被験体に投与される。
【００３３】
上記方法の特定の実施形態では、上記方法は、上記被験体に有効量のＰＮＰ阻害剤、有効量のアルキル化剤、および有効量の抗ＣＤ２０剤を投与する工程を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は同時投与される。
【００３５】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は連続投与される。
【００３６】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は、上記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与される。
【００３７】
特定の実施形態では、１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体の血液学的な癌を処置する方法であって、１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体を同定する工程と、上記被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００３８】
特定の実施形態では、上記被験体は、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体からなる群より選択される１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ。
【００３９】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤はベンダムスチンである。
【００４０】
特定の実施形態では、上記プリンヌクレオシド類似体はフルラダジン（Ｆｌｕｒａｄａｄｉｎｅ）である。
【００４１】
特定の実施形態では、血液学的な癌を有する被験体を処置する方法であって、上記被験体由来の試料において１つ以上の癌細胞中のｐ５３欠失を検出する工程と、上記被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程と、を含む、方法を提供する。
【００４２】
特定の実施形態では、上記方法は、１７ｐ欠失の存在を検出する工程をさらに含むことができる。
【００４３】
特定の実施形態では、上記方法は、上記試料中の１つ以上の癌細胞が１つ以上の化学療法剤に耐性を持つか否かを判定する工程をさらに含むことができる。
【００４４】
特定の実施形態では、１つまたは複数の上記癌細胞は、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体からなる群より選択される１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ。
【００４５】
特定の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
特定の実施形態では、上記組成物はフォロデシンおよびベンダムスチンを含む。
【００４７】
特定の実施形態では、上記組成物はフォロデシンおよびリツキシマブを含む。
【００４８】
特定の実施形態では、上記組成物はＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および抗ＣＤ２０剤を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、上記組成物はフォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブを含む。
【００５０】
特定の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含むキットを提供する。
【００５１】
特定の実施形態では、上記キットは、上記ＰＮＰ阻害剤、上記アルキル化剤、上記抗ＣＤ２０剤、またはそれらの任意の組み合わせの送達システムをさらに含むことができる。
【００５２】
特定の実施形態では、上記キットは、被験体を処置するための使用説明書をさらに含むことができる。
【００５３】
特定の実施形態では、上記キットはＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤を含む。
【００５４】
特定の実施形態では、上記キットはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含む。
【００５５】
特定の実施形態では、上記キットはフォロデシンおよびベンダムスチンを含む。
【００５６】
特定の実施形態では、上記キットはフォロデシンおよびリツキシマブを含む。
【００５７】
特定の実施形態では、上記キットはＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および抗ＣＤ２０剤を含む。
【００５８】
特定の実施形態では、上記キットはフォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブを含む。
【００５９】
特定の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤を含むキットを提供する。
【００６０】
特定の実施形態では、上記キットは、その内容物がアルキル化剤に耐性を持つ被験体に投与されるべきものであることを示すラベルを含む。
【００６１】
特定の実施形態では、上記キットは、その内容物がｐ５３欠失を有する被験体に投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む。
【００６２】
特定の実施形態では、上記キットは、その内容物がアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤とともに投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む。
【００６３】
他のヌクレオシド類似体とは異なり、フォロデシンはＤＮＡに取り込まれない。フォロデシン処置により、ＣＬＬ細胞中のｄＧＴＰが増加し、この細胞毒性と相関性を有する増加は、フォロデシン処置後にｄＧＴＰレベルが達したことを示し、細胞毒性反応を示す代理マーカーとなる。フォロデシンに対するＣＬＬの感受性は、この細胞で観察される高いｄＣＫ活性によるものである可能性があり、この活性は、ｄＣＫのＳｅｒ−７４に対するリン酸化反応により正に調節される。リン酸−ｄＣＫ／ｄＣＫ比（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｄＣＫ／ｄＣＫ ｒａｔｉｏ）とフォロデシン誘導アポトーシスの間には有意な正の相関性が観察された。ｄＣＫはまた、フルダラビン、ゲムシタビン、またはクラドリビン等のいくつかの抗白血病ヌクレオシド類似体の活性化に必要なリン酸化反応を触媒する。フォロデシンとフルダラビン間で観察された拮抗作用は、フルダラビンとフォロデシンを組み合わせた後に観察されたｄＧＴＰレベルの低減により説明することができる。これらの結果は、ｄＣＫリン酸化反応およびその後のｄＧＴＰの増加がＣＬＬ細胞中のフォロデシンによるアポトーシスの誘導の第一段階として重要な役割を果たすことを示す。
【００６４】
ｄＧＴＰ媒介細胞死のいくつかの機序が提案されている。例えば、蓄積されたデオキシヌクレオシドは、デオキシグアノシンキナーゼおよびチミジンキナーゼによりミトコンドリア中でリン酸化され、ミトコンドリアＤＮＡ合成および修復と干渉し得るｄＮＴＰが異常に蓄積され、ミトコンドリア損傷、ｐ５３活性化およびアポトーシスに対する感受性を増感させ得る。ミトコンドリアｄＧＴＰの不均衡はまた、ミトコンドリアＡＴＰ合成および／またはミトコンドリア電子伝達鎖の抗酸化酵素の不活性化に影響を及ぼし、ＲＯＳ産生を生じ得る。ミトコンドリアゲノムは、アポトーシスを迅速に開始し得る酸化ストレス損傷に対する感受性が高い。本明細書に記載するように、フォロデシンは、ＲＯＳの産生およびΔΨｍ損失によりミトコンドリアアポトーシス経路を活性化させ、カスパーゼ依存性および非依存性アポトーシスを生じた。ＲＯＳは、ミトコンドリア電子伝達により生成され、強い酸化ストレスの下で、Ｏ２−、ＯＨ−またはＨ２Ｏ２レベルの上昇によりΔΨｍの損失および細胞死が引き起こされる。フォロデシンにより誘導されるこれらの事象は、ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化に先行する酸化ストレスの役割を担うＯ２−の特定の捕捉剤であるＴｉｒｏｎおよびＮＡＣを用いたＣＬＬ細胞のプレインキュベーションにより回復した。ｐ５３のリン酸化反応および活性化は、ＤＮＡ損傷反応により誘導されるが、いくつかのストレス信号によっても誘導される。超酸化物過剰産生およびその後のＤＮＡ損傷の誘導により、ＲＯＳ媒介ミトコンドリア経路の活性化およびｐ５３活性化によりアポトーシスが誘導され得る。この意味で、フォロデシンにより誘導されるＲＯＳ生成は、ｐ５３活性化の上流調節因子として作用し得る。野生型ｐ５３ＣＬＬ症例におけるｐ５３安定化を示すとともに、フォロデシンがｐ５３変異の症例においてミトコンドリアアポトーシス経路を活性化させたことを示す結果を本明細書に記載するが、これらの結果は、フォロデシンがｐ５３に依存しない異なる機序および／またはさらなる機序により作用することを示す。酸化ストレスおよびＲＯＳ産生はまた、異なる経路によりｐ５３依存性および非依存性アポトーシスの両方を調節する転写因子Ｅ２Ｆ−１の活性化を引き起こす。Ｅ２Ｆ−１は、ＤＮＡ損傷に応じてリン酸化される残基においてｐ５３リン酸化反応を増加させるが、ｐ５３非依存性アポトーシス経路を介したｐ５３同属体ｐ７３の活性化により細胞死を誘導することもできる。ＲＯＳ生成がどのようにＥ２Ｆ−１、ｐ５３および／またはｐ７３活性化および細胞死を調節することができるかについては、依然として十分に解明されていない。
【００６５】
ミトコンドリアアポトーシス経路の初期事象は、アポトソームの形成およびカスパーゼ−９の活性化であり、これにより、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−８が切断および活性化される。フォロデシンは、カスパーゼ−９および−３の時間に関連した活性化を誘導するとともに、カスパーゼ−９の活性化と同時にプロカスパーゼ−８の活性化も誘導した。同様に、カスパーゼ−８は、ＢＩＤタンパク質の切断を誘導し、ミトコンドリアアポトーシス経路を活性化するプロアポトーシス切断型にした。カスパーゼ−８の選択的阻害により、フォロデシンにより誘導されるΔΨｍ損失が低減するが、その後における細胞死に対する効果は抑えられており、これは、カスパーゼ−８／ＢＩＤがミトコンドリアアポトーシス経路の増幅ループを引き起こしたことを示唆する。カスパーゼ−９の活性化はそれ自体ではアポトーシスの誘導に十分ではない可能性があり、カスパーゼ−８／ＢＩＤを活性化させるとともに、アポトーシス抑制因子ＸＩＡＰおよびスルビビンを減少させることにより、カスパーゼ−９および−３活性が増大するため、フォロデシンにより誘導されるアポトーシスが促進される。
【００６６】
ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質は、アポトーシス細胞死への関与を制御する。ＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１等の生存促進メンバーとアポトーシス促進ＢＣＬ−２メンバー（ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＢＨ３オンリータンパク質ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＢＭＦ、ＢＩＫおよびＨＲＫ）間の均衡により、多数の死シグナル伝達経路の結果が制御される。ＣＬＬ患者では、高レベルのＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１は、疾患進行、低生存率およびアルキル化剤、ヌクレオシド類似体、およびリツキシマブを用いた療法に対する完全な反応の失敗と相関性を有する。フォロデシンは、ＢＣＬ−２レベルを変化させることなく、ＢＩＭタンパク質の蓄積およびＭＣＬ−１レベルの低下を誘導した。ＣＬＬ細胞では、ＢＩＭはＭＣＬ−１と関連するため、ＭＣＬ−１レベルの低下により、このＢＨ３オンリータンパク質に対するＣＬＬ細胞の反応を容易にする。ＢＩＭおよび切断Ｂｉｄは、抗アポトーシスＢＣＬ−２メンバーの阻害剤ならびにアポトーシス促進ＢＡＸおよびＢＡＫの直接活性剤の両方として二重に機能する。この意味では、ＢＩＭレベルの上昇は、Ｂｉｄの活性化とともに、ＢＡＸおよびＢＡＫを活性化させるとともに、ＭＣＬ−１を減少させ、ＢＣＬ−２の残りの抗アポトーシス能力が押さえ込まれる。本明細書で提供する結果は、アポトーシス誘導と有意な相関性を有するフォロデシンによるＢＩＭの増加とともにＭＣＬ−１の度合いが減少すること、およびフォロデシンに対するＣＬＬ細胞の感受性がＭＣＬ−１およびＢＩＭ基礎レベルにより決定され得ることを示す。
【００６７】
ｐ５３の状態に依存しないミトコンドリアアポトーシス経路の活性化が示されている。ｐ５３の転写標的であるｐ７３誘導は機能的なｐ５３を有さないＣＬＬ細胞のアポトーシス耐性を克服可能なことが報告されている。いくつかの化学療法薬に応じて、ｐ７３のアポトーシス促進型であるＴＡｐ７３は、ある意味ではｐ５３の状態に依存するが、非依存的でもある細胞周期停止およびアポトーシスを制御するいくつかのｐ５３標的遺伝子を転写活性化する。フォロデシンが機能的なｐ５３を有するＣＬＬ細胞中のｐ５３を誘導し、さらにＴＡｐ７３も誘導するが、興味深いことに、ｐ５３が欠失したＣＬＬ細胞中のｐ７３ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルも上昇することが分かった。酸化ストレスおよびＲＯＳ産生によりＴＡｐ７３およびＥ２Ｆ１が活性化するが、これらはともにｐ５３依存性および非依存性機序を介したミトコンドリアアポトーシス経路の活性化に関係するタンパク質である。それゆえ、ＲＯＳにより誘導されるフォロデシンの上昇により、Ｅ２Ｆ−１を活性化するおよび／またはＴＡｐ７３を上方調節するシグナルを提供することができる。ＦＯＸＯファミリーの転写因子は、アポトーシスに関与する多数の遺伝子の発現を調節し、酸化ストレスの増大により活性化することが可能である。ＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａは、Ｅ２Ｆ−１の転写標的であり、ＲＯＳ誘導アポトーシスに不可欠であることが示されているとともに、造血細胞におけるＢＩＭ発現の転写因子でもある。さらに、個々のアポトーシス刺激時に、ＲＯＳ捕捉剤は、ＦＯＸＯ３ａおよびＢＩＭの誘導を阻止する。ＦＯＸＯ１ａとＢＩＭ両方の発現ならびにその後のアポトーシスはｐ５３が欠損した腫瘍性細胞中のｐ７３により調節されると言われている。フォロデシンによる処置の後、タンパク質およびｍＲＮＡは、ｐ５３状態に依存しないｐ７３およびＢＩＭの上方調節を示すとともに、ＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａレベルの上昇が初期において検出された。ＦＯＸＯ調節された標的遺伝子の発現は、いずれかのＦＯＸＯメンバーにより制御可能であるが、これは、ＦＯＸＯ１ＡおよびＦＯＸＯ３Ａにより行われるＢＩＭの転写調節により示されるように、作用機序が重複していることを示唆している。
【００６８】
よって、本明細書に記載の結果は、ｐ５３状態に依存しないＣＬＬ細胞においてフォロデシンにより誘導される細胞死に関与する機序を証明し、異なるプログラム細胞死経路が同じ細胞内で共存し、様々な刺激により選択的に誘導され得ることを明らかにする。
【００６９】
これらの結果は、フォロデシンが単剤でまたはベンダムスチンもしくはリツキシマブと組み合わせることによりＣＬＬの処置において非常に効果的となることを示す。それゆえ、例えば、低毒性プロフィールの経口および静注製剤で利用可能なフォロデシンは、不良予後（ｐｏｏｐ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）（例えば、１７ｐ−）の患者、難病患者の処置選択肢および／または高齢患者の処置選択肢である。再発性ＣＬＬ患者におけるフォロデシンの多施設非盲検第１相臨床試験が開始されている。
【００７０】
Ａ．血液学的な癌を処置する方法
本明細書では、被験体の血液学的な癌、例えば、血液癌を処置する方法を提供する。この種の癌の例としては、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記血液学的な癌はＣＬＬである。他の実施形態では、上記血液学的な癌はＡＬＬである。
【００７１】
被験体としては、哺乳動物および非哺乳動物の両方を挙げることができる。哺乳動物には、例えば、ヒト；非ヒト霊長類、例えば、類人猿およびサル；ウシ；ウマ；ヒツジ；ラット；マウス；ブタ；およびヤギが含まれる。非哺乳動物には、例えば、魚類および鳥類が含まれる。
【００７２】
１つの実施形態では、上記方法は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を上記被験体に投与する工程を含む。特定の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤を投与する。他の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を投与する。さらに他の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤は、１つ以上の化学療法剤（例えば、ベンダムスチンまたはフルアラビン（Ｆｌｕａｒａｂｉｎｅ））に耐性を持つ被験体を同定した後に投与する。さらなる実施形態では、ＰＮＰ阻害剤は、被験体のｐ５３欠失を検出した後に投与する。
【００７３】
理論に束縛されるものではないが、ＰＮＰ阻害剤は、血漿２’−デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）の上昇および細胞内デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）の蓄積を誘導し、細胞死を誘導することができる。ＰＮＰ阻害剤の非限定的な例としては、ＢｉｏＣｒｙｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第４，９８５，４３３号；同第４，９８５，４３４号、同第５，００８，２６５号；同第５，００８，２７０号；同第５，５６５，４６３号および同第５，７２１，２４０号に開示されるものが挙げられるが、こけらの開示内容を本明細書において参考として援用する。特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤は、フォロデシンまたはその塩であり、下記のＨＣｌ塩を含む。
【００７４】
【化１】
理論に束縛されるものではないが、アルキル化剤は、ＤＮＡを化学修飾するとともに、その機能を妨げる化学療法化合物を指す。アルキル化剤には、二本鎖ＤＮＡ分子の同じ鎖または相補鎖上のヌクレオチド間に架橋形成をさせるものがある一方で、他には、ＤＮＡ鎖間に塩基対ミスマッチを生じさせるものもある。アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、またはイミダゾールカルボキサミド化合物とすることができる。アルキル化剤の例としては、ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパ、およびトリエチレンメラミンが挙げられる。場合によっては、上記アルキル化剤は、ベンダムスチンまたはその塩とすることができ、下記のＨＣｌ塩を含む。
【００７５】
【化２】
抗ＣＤ２０剤は、Ｂリンパ球細胞表面タンパク質ＣＤ２０を標的とする（例えば、選択的に結合する）任意の薬剤とすることができる。いくつかの実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はＣＤ２０に特異的な抗体である。理論に束縛されるものではないが、これらの薬剤は、以下の３つの機序のうちの１つにより作用することができると考えられる：（１）補体媒介細胞毒性；（２）抗体依存性細胞媒介細胞毒性；および（３）アポトーシスの誘導。抗ＣＤ２０剤の例としては、リツキシマブ、イブリツモマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、およびアレムツズマブが挙げられる。いくつかの実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【００７６】
上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、任意の経路（例えば、術中、くも膜下、椎間板内、椎間板周囲（ｐｅｒｉｄｉｓｋａｌ）、硬膜外（歯周（ｐｅｒｉｒａｄｉｃｕｌａｒ）および大後頭孔（ｔｒａｎｓｆｏｒａｍｉｎａｌ）を含む）、椎間板内、硬膜外、および硬膜周の任意の組み合わせ、脊髄周（ｐｅｒｉｓｐｉｎａｌ）、ＩＶ、筋内、ＳＣ、経口、鼻腔内、吸入、経皮、および非経口）より投与することができる。
【００７７】
上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、選択投与経路および標準的な薬務に基づいて選択される薬剤として許容される担体を用いて調合することができる。上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、医薬品分野の標準的技法に応じた投与剤型に調合してもよい。Ａｌｐｈｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい。適切な投与剤型には、例えば、錠剤、カプセル、液剤、非経口液剤、トローチ、座薬、または懸濁剤が含まれ得る。
【００７８】
非経口投与については、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、水、油（特に、植物油）、エタノール、生理食塩溶液、水性デキストロース（グルコース）および関連糖溶液、グリセロール、またはプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコール等の適切な担体または希釈剤と混合してもよい。非経口投与液剤は、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤の水溶性塩を含有することが好ましい。また、安定剤、抗酸化剤および防腐剤を添加してもよい。適切な抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、クエン酸およびその塩、ならびにＥＤＴＡナトリウムが挙げられる。適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルもしくはプロピルパラベン、およびクロルブタノール（ｃｈｌｏｒｂｕｔａｎｏｌ）が挙げられる。上記非経口投与組成物は、水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液、または乳剤の形態であってもよい。
【００７９】
経口投与については、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、または他の適切な経口与剤型（ｏｒａｌ ａｇｅ ｆｏｒｍｓ）の調製のための１つ以上の固体非活性成分と組み合わせてもよい。例えば、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、充填剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤吸収剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ａｂｓｏｒｂｅｎｔｓ）または潤滑剤等、少なくとも１つの賦形剤と組み合わせてもよい。
【００８０】
ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤の具体的な用量は、当然ながら、個々の患者の体格、体重、年齢および性別を含む当該患者の特定の状況、処置する疾患の性質および段階、疾患障害の悪性度、ならびに上記化合物の投与経路により決定される。化合物、例えば、フォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブの用量および投与期間については、例えば、ＦＤＡに認可されたラベルに示される用量および投与期間に従って、単独投与または併用投与を行うようにしてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は同時投与されるが、他の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は連続投与される。１つの実施形態では、上記アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤は、ＰＮＰ阻害剤の投与前（例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、または２０時間）に１回以上投与することができる。さらなる実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤は、アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤の投与前（例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、または２０時間）に１回以上投与してもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、被験体の血液学的な癌の処置は、１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体を同定する工程を含む。癌処置における失敗の主因の１つは、癌細胞による薬物耐性の発現である。これは疾患の再発、さらには死に繋がり得る非常に深刻な問題である。１つの実施形態では、上記１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体は、当該分野で公知の手段により同定することができる。上記被験体は、任意の公知の化学療法剤に耐性を持つものであってもよい。特定の実施形態では、上記被験体は、アルキル化剤（例えば、ベンダムスチン）および／またはプリンヌクレオシド類似体（例えば、フルラダジン（Ｆｌｕｒａｄａｄｉｎｅ））に耐性を持つものとすることができる。
【００８３】
化学療法に耐性を持つ被験体の同定に続いて、上記被験体にＰＮＰ阻害剤の投与を行うようにすることができる。いくつかの実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンＨＣｌである。
【００８４】
他の実施形態では、被験体の血液学的な癌の処置は、当該被験体由来の試料中の１つ以上の癌細胞におけるｐ５３欠失、例えば、１７ｐ欠失の存在の検出を含むことができる。１７ｐ欠失は、異なる生物学的および臨床的挙動を示し得る血液学的な癌被験体を同定可能なマーカーである。例えば、ｐ５３変異は、薬物耐性および短い生存期間を伝えることができる。
【００８５】
１つの実施形態では、ｐ５３欠失を示す被験体は、ＰＮＰ阻害剤の投与が行われるようにすることができる。選択される実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンＨＣｌである。
【００８６】
上述した処置法は、単剤療法および併用療法の両方を伴う。併用療法の文脈では、上記開示は、２つ以上の化学療法剤、特に、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤の投与を想定している。これらの化合物のいくつかは、１つ以上の癌兆候の処置における使用についてすでに認可されている。他のものは前臨床および臨床開発の様々な段階にある。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤の投与により相乗効果を生み出すことができる。この効果は、併用指数（ＣＩ）の展開により示すことができる。特定の実施形態では、当該指数は、Ｃｈｏｕら、Ａｄｖａｎｃｅ Ｅｎｚ．Ｒｅｇｕｌ．，２２、２７−５５（１９８５）の手順に従って、病的細胞部分の関数として算出することができる。これは、様々な細胞死の割合に対する係数相互作用を評価する周知の検定である。例えば、薬物Ａを用いた処置の結果、細胞死が３０％であり、薬物Ｂを用いた処置の結果、細胞死が５０％であった場合、それら２つの薬物を併用した結果、細胞死は６５％となることが予想される。従って、予想細胞死と薬物併用時に実際に測定したものとの比率が１未満であれば、相乗効果が観察される。しかしながら、その比率が１を超える場合には、拮抗作用が観察される。１つの実施形態では、フォロデシンおよびベンダムスチンの併用は相乗効果を示すが、フォロデシンおよびフルダラビンの併用は拮抗作用を示す（実施例５参照）。
【００８８】
Ｂ．医薬組成物
本明細書では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＮＰ阻害剤は、フォロデシン（ＢＣＸ−１７７７）を含むことができる。特定の実施形態では、アルキル化剤は、ベンダムスチンを含むことができる。他の実施形態では、抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【００８９】
本明細書で提供する医薬組成物は、血液学的な癌の処置に有効な量のＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤ならびに薬剤として許容される担体を含有する。本明細書で提供する化合物の投与に適した医薬担体は、特定の投与方式に適した、当業者に公知の任意の担体を含む。
【００９０】
それらの組成物は、１つの実施形態では、経口投与用の液剤、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤もしくはエリキシル剤または非経口投与用の滅菌液もしくは懸濁剤等の医薬品、ならびに経皮貼布製剤および乾燥粉末吸入剤に調合することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８５，１２６参照）。
【００９１】
上記医薬組成物中のＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤の濃度は、上記化合物の吸収、不活性化および排泄速度、上記化合物の物理化学的特性、投与計画、および投与量、ならびに当業者に公知の他の要因に依存する。例えば、送達量は、本明細書に記載するように、慢性リンパ性白血病を処置するのに十分な量である。
【００９２】
上記医薬組成物は一度に投与してもよく、あるいは、より少量の用量にわけて時間をあけて投与してもよい。正確な投与量および処置期間は処置する疾患に応じ、公知の試験プロトコルを用いるかまたはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ試験データからの外挿により経験的に決定してもよいことは言うまでもない。濃度および投与量の値はまた、緩和すべき病状の重篤度によって変更してもよいことに留意されたい。さらに、いずれの特定の被験体についても、具体的な投与量レジメンは、個々の必要性および上記組成物を投与するかまたは投与を監督する人の専門的判断に従って時間の経過とともに調整する必要があり、本明細書で示す濃度範囲は例示のみであり、請求の範囲に記載の組成物の範囲または実施を制限するものではないことは言うまでもない。
【００９３】
上記医薬組成物は、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、滅菌非経口液剤もしくは懸濁剤、および経口液剤もしくは懸濁剤、ならびに上記化合物もしくはその薬剤として許容される誘導体を適量含有する油−水乳剤等の単回投与剤型でヒトおよび動物に投与するために提供される。薬学的に治療効果がある化合物およびその誘導体は、１つの実施形態では、単回投与剤型または複数回投与剤型で調合および投与される。本明細書で用いる単位用量形態とは、ヒトおよび動物被験体に適した物理的に個別の単位であり、当該分野で公知のように個別に包装されるものを指す。各単位用量は、上記治療効果がある化合物を、必要な医薬担体、ビヒクル、または希釈剤とともに所望の治療効果を生じるのに十分な所定量含有する。単位用量形態の例としては。アンプルおよび注射器ならびに個別に包装した錠剤もしくはカプセルが挙げられる。単位用量形態は、分割するかまたはその何倍かの量で投与してもよい。複数回投与剤型は、分離した単位用量形態で投与するための単一の容器に、同一の単回投与剤型複数回分を包装したものである。複数回投与剤型の例としては、バイアル、数ボトルの錠剤もしくはカプセル、または数パイントもしくはガロンのボトルが挙げられる。よって、複数回投与剤型は、分離することなく包装された複数回の単位用量である。
【００９４】
液剤として投与可能な組成物は、例えば、上記で定義したような活性化合物および任意の医薬アジュバントを、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノール等の担体中で溶解、分散、または他の方法で混合することにより、溶液または懸濁液を生成して調製することができる。所望であれば、上記の投与すべき医薬組成物はまた、例えば、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような薬剤等、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤等の非毒性補助物質を少量含有してもよい。
【００９５】
そのような投与剤型を実際に調製する方法は当業者には公知であるか明白である；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５を参照されたい。
【００９６】
０．００５％〜１００％の範囲のＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含有し、残部が非毒性担体からなる投与剤型または組成物を調製してもよい。これらの組成物の調製方法は、当業者には公知である。企図される組成物は、０．００１％〜１００％の活性成分を含有し、１つの実施形態では、０．１〜９５％、他の実施形態では、７５〜８５％であってもよい。
【００９７】
Ｃ．キット
本明細書ではまた、キットも提供する。典型的には、キットは、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含む。特定の実施形態では、キットは、例えば、ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、抗ＣＤ２０、またはそれらの任意の組み合わせに対する１つ以上の送達システム、および当該キットの使用説明書（例えば、被験体を処置するための使用説明書）を含むことができる。特定の実施形態では、キットは、上記ＰＮＰ阻害剤および／または上記アルキル化剤を含むことができる。他の実施形態では、キットは、上記ＰＮＰ阻害剤および／または上記抗ＣＤ２０剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、上記キットは、ＰＮＰ阻害剤と、内容物がベンダムスチン等のアルキル化剤に耐性を持つ被験体に投与されるべきものであることを示すラベルとを含むことができる。他の実施形態では、上記キットは、ＰＮＰ阻害剤と、内容物がｐ５３欠失（例えば、１７ｐ欠失）を有する被験体に投与されるべきものであることを示すラベルとを含むことができる。さらなる実施形態では、キットは、ＰＮＰ阻害剤と、内容物がアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤とともに投与されるべきものであることを示すラベルとを含むことができる。
【００９８】
Ｄ．定義
本明細書で用いる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明示されない限り、複数のものも対象とする。
【００９９】
「有効量」という表現は、方法において化合物の量を説明するために用いた場合、所望の薬理効果または他の効果を達成する化合物の量、例えば、癌細胞の異常成長もしくは増殖を阻害するかまたは癌細胞のアポトーシスを誘導し、有用な効果をもたらす量を指す。
【０１００】
「処置する」および「処置」という用語は、症状の改善、さらなる症状の予防、症状の根本的な代謝に関する原因の改善もしくは予防、障害のさらなる発現の遅延もしくは予防ならびに／または進行するかもしくは進行が予想される症状の重篤度の低減等、治療に有益な効果を生じることを意味する。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：ＣＬＬ中のフォロデシン細胞毒性 − ＺＡＰ−７０高対ＺＡＰ−７０低
ＺＡＰ−７０が高レベル（＞２０％）の１６人のＣＬＬ患者由来の細胞およびＺＡＰ−７０が低レベル（＜２０％）の１３人のＣＬＬ患者由来の細胞を、２μＭのフォロデシンと２０μＭのｄＧｕｏを用いて４８時間かけて処理した。細胞毒性をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ染色により分析した（コントロールである未処理細胞のパーセンテージで表現）。その結果、平均細胞毒性が、高レベルおよび低レベルのＺＡＰ−７０の両方について５０％を超えることが示された（図１Ａおよび図１Ｂ参照）。
【０１０２】
実施例２：細胞内におけるｄＧＴＰレベルの上昇
２６人のＣＬＬ患者由来の細胞をフォロデシンを用いて２０時間かけて処理した。全ヌクレオチドを抽出し（６０％メタノール）、ｄＧＴＰレベルをＤＮＡポリメラーゼアッセイにより定量化した。コントロール（未処理細胞）と比較した細胞の生存をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ染色により４８時間かけて分析した。フォロデシン処置後の細胞内におけるｄＧＴＰレベルの上昇は、誘導された細胞死と良好な相関性を有する（図２参照）。
【０１０３】
実施例３：フォロデシンに対するｐ５３欠失ＣＬＬ症例の反応
１７ｐ欠失を有する１１人のＣＬＬ患者由来の細胞（ｇ≧細胞の８５％、ＦＩＳＨ分析）を２μＭのフォロデシンおよび２０μＭのｄＧｕｏと、２５μＭのベンダムスチンまたは１μｇ／ｍＬのフルダラビンを用いて４８時間かけて処理した。その結果、ｐ５３欠失ＣＬＬ症例がフォロデシンに対して高い反応を示すことが分かった（図３参照）。
【０１０４】
実施例４：化学療法耐性を有するＣＬＬ症例に対するフォロデシンの効果
ベンダムスチンまたはフルダラビンに対する感受性が低いか全くないことが分かっているＣＬＬ患者由来の細胞を２μＭのフォロデシンと２０μＭのｄＧｕｏ１０を用いて処理した。その結果、これらの細胞はフォロデシン処置に対して良好な反応を示すことが分かった（図４参照）。
【０１０５】
実施例５：フォロデシン／ベンダムスチンおよびフォロデシン／フルダラビンの併用効果
ＣＬＬ患者由来の細胞を、２μＭのフォロデシンおよび１０〜２０μＭのｄＧｕｏと、１０〜２５μＭのベンダムスチンまたは３．７５〜７．５μＭのフルダラビンとを用いて４８時間かけて処理した。併用指数（ＣＩ）を４８時間後に分析した。１未満のＣＩ値は相乗効果を示し（ＣｈｏｕｒとＴａｌａｌａｙのアルゴリズム）、１を超えるＣＩ値は拮抗作用を示す。その結果、フォロデシン／ベンダムスチンは相乗効果を有し、フォロデシン／フルダラビンは拮抗作用を有することが分かった（図５Ａおよび図５Ｂ参照）。
【０１０６】
実施例６：フォロデシン／リツキシマブの併用効果
７人のＣＬＬ患者（ＺＡＰ−７０レベル高（＞３５％）３人およびｐ５３欠失４人）由来の細胞を、２μＭのフォロデシンＨＣｌおよび１０〜２０μＭのｄＧｕｏと、２５〜５０μＭのリツキシマブとを用いて２４〜４８時間かけて処理した。併用指数（ＣＩ）を４８時間後に分析した。それらの細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ染色およびＰＩ透過性アッセイを用いてフローサイトメトリーにより分析した。１未満のＣＩ値は相乗効果を示し（ＣｈｏｕｒとＴａｌａｌａｙのアルゴリズム）、１を超えるＣＩ値は拮抗作用を示す。その結果、フォロデシン／リツキシマブの併用は相乗効果を有することが分かった（図６参照）。
【０１０７】
実施例７：フォロデシンはｐ５３非依存性ミトコンドリアアポトーシスを誘導する
本明細書に記載するように、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤であるフォロデシンは、慢性リンパ性白血病細胞において、Ｍｃｌ−１の下方調節ならびにｐ７３およびＢｉｍの誘導により、ｐ５３非依存性ミトコンドリアアポトーシスを誘導する。
【０１０８】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、アポトーシスが異常調節され、増殖速度が低い長寿命ＣＤ５＋Ｂリンパ球のモノクローナル増殖由来の臨床不均質体（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｅｎｔｉｔｙ）である。近年において進歩は見られるが、この新規なＣＬＬ処置法では、患者の全生存率は依然として改善されておらず、多数の患者は最終的には薬物耐性を生じる。免疫グロブリン遺伝子の突然変異がないプロフィール、ＺＡＰ−７０タンパク質の高度発現、高度ＣＤ３８発現、および特定の細胞遺伝学的異常の存在（特に、１７ｐ１３（ＴＰ５３）および１１ｑ２２−ｑ２３（ＡＴＭ）の欠失）は、ＣＬＬ患者の全生存率の低さおよび疾患進行までの時間の短さと関係がある。化学療法抗癌剤は、通常、ＤＮＡ損傷反応とｐ５３活性化を介して、および／またはミトコンドリア機能の摂動を直接介してアポトーシスを誘導する。ＤＮＡ損傷反応経路は、ＣＬＬ薬物誘導アポトーシスにおいて重要な役割を果たしていると考えられるが、これは、ＴＰ５３異常を有するＣＬＬ患者由来の細胞は、従来の化学療法に耐性を示すとともに生存期間が短いためである。ｐ５３の欠失および残りの対立遺伝子の突然変異によるｐ５３機能の喪失は、化学療法が効果がないＣＬＬ患者を増加させ、ｐ５３の転写およびミトコンドリアアポトーシス活性を無効にする薬物耐性獲得中に「二重の打撃」を与えている。それゆえ、新規な効果的アプローチにより、ＤＮＡ損傷非依存性経路および／またはｐ５３に依存しないアポトーシス経路の直接的活性化によりアポトーシスを誘導する必要がある。
【０１０９】
ＣＬＬ細胞の特徴は、それらのアポトーシス誘導に対する耐性であり、ＣＬＬ細胞におけるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の重要なアポトーシスおよび生存調節因子である。高レベルの抗アポトーシスＢｃｌ−２およびＭｃｌ−１タンパク質は、ＣＬＬにおける侵攻性疾患および化学療法に対する耐性と関係がある。ＭＣＬ−１はまた、ＣＬＬ細胞の生存期間の延長において重要な役割を有するが、これは、ＭＣＬ−１レベルがいくつかの薬物に対するｉｎ ｖｉｔｒｏおよび臨床反応と逆相関するためである。
【０１１０】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）は、プリン類似体をそれぞれ塩基およびデオキシリボースリン酸にリン酸化するプリンサルベージ経路中の酵素である。フォロデシン、すなわち、イムシリンＨ（ＢＣＸ−１７７７）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞増殖の阻害を示した強力な遷移状態類似体ＰＮＰ阻害剤である（Ｂａｎｔｉａら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，１（６），１１９９−２１０（２００１）；Ｋｉｃｓｋａら、ＰＮＡＳ，９８（８），４５９３−４５９８（２００１）；Ｂａｎｔｉａら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，３（６），８７９−８８７（２００３）；およびＧａｎｄｈｉら、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３４（６ Ｓｕｐｐｌ ５），Ｓ８−１２（２００７））。フォロデシンは、低い毒性プロフィールを示しており（Ｇａｎｄｈｉら、Ｂｌｏｏｄ，１０６（１３），４２５３−４２６０（２００５）；およびＫｏｒｙｃｋａら、Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，７（９），９７６−９８３（２００７））、Ｔ細胞前リンパ性白血病、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫およびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病患者の臨床試験において研究されている（Ｇａｌｍａｒｉｎｉら、ＩＤｒｕｇｓ，９（１０），７１２−７２２（２００６））。また、フォロデシンは、ＣＬＬ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を発揮すると考えられる（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｂｌｏｏｄ，１０８（７），２３９２−２３９８（２００６））。ＰＮＰ阻害の結果、血漿２’デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）レベルが上昇した後、デオキシヌクレオシドキナーゼ活性が高レベルの細胞においてデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）が細胞内蓄積し、Ｔリンパ球においてアポトーシスが誘導される。ＣＬＬ細胞は、ｄＧｕｏをｄＧＭＰに転換する主要酵素である高い（ｄＣＫ）活性を有し、ＰＮＰ阻害を受け易いＣＬＬ細胞であるｄＧＭＰはその後ｄＧＴＰに転換される。フルダラビンまたはベンダムスチン等の他のプリンヌクレオシド類似体と異なり、フォロデシンはＤＮＡ内に取り込まれることはなく、新規で、十分には解明されていない作用機序を有する典型的な新種の選択的抗腫瘍剤である。
【０１１１】
本明細書に記載するように、４３人のＣＬＬ患者由来の一次白血病細胞におけるフォロデシンの細胞毒性効果を、フォロデシンと、臨床診療で用いるフルダラビン、ベンダムスチン、およびリツキシマブ等の薬物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの併用とともに評価した。これらの結果に基づいて、フォロデシンは、ＺＡＰ−７０、ＣＤ３８、ｐ５３の状態または細胞遺伝学的異常に依存しないＣＬＬ患者の処置において非常に効果的な療法であると考えられる。さらに、フォロデシンは、Ｍｃｌ−１タンパク質のレベルならびにｐ７３およびアポトーシス促進Ｂｉｍタンパク質の誘導を低下させることによりミトコンドリアアポトーシス経路の活性化を誘導すると考えられる。興味深いことに、これらのアポトーシスマーカーにはｐ５３の状態に基づく有意な差は観察されなかったが、これは、アポトーシス経路が共通してｐ５３媒介細胞死に依存しないことを示唆している。
【０１１２】
ＺＡＰ−７０、ＣＤ３８および細胞遺伝学的状態に依存しないＣＬＬ患者由来の一次細胞におけるフォロデシン誘導アポトーシス
用量漸増研究を行ってＣＬＬ患者由来の一次白血病リンパ球におけるｉｎ ｖｉｔｒｏフォロデシン細胞毒性を評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を得るために、外部ｄＧｕｏ源をフォロデシンとともに加えた。ｄＧｕｏの用量を増加させながら（１０〜２０または３０μＭ）、薬理学的に達成可能なレベルのフォロデシン（２−５−１０μＭ）を用いて４８時間かけてＣＬＬ細胞のインキュベーションを行うことにより細胞死を誘導したが（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ＋染色により分析）、フォロデシンまたはｄＧｕｏ単独では細胞毒性効果は誘導されなかった。より高い用量のフォロデシン（最大で１５μＭまで）を用いても細胞死に関しては差は観察されなかった。逆に、ｄＧｕｏの用量を増加することにより細胞死がより多く誘導されたため、その後の研究は単一用量のフォロデシン（２μＭ）を１０または２０μＭのｄＧｕｏとともに用いて行った。
【０１１３】
次に、フォロデシンおよびｄＧｕｏの細胞毒性効果を４３人のＣＬＬ患者由来の一次白血病細胞において分析した。４４．２％±１１．４および５７．４％±１３．１のコントロールに対する平均細胞毒性をそれぞれ２４時間、および４８時間観察した。細胞毒性効果は、２１の症例（全体の４８．８％）において６０％よりも高く、１８の症例（全体の４１．８％）において４０〜６０％の間であり、４０％よりも低かったのは僅か４つの症例（全体の９．４％）のみであった。細胞死に関しては、凍結保存一次ＣＬＬ試料（ｎ＝３２、５８．３％±１１、４８時間）とＣＬＬ生試料（ｎ＝１０、５６．６％±６．４、４８時間）の使用での差は観察されなかった。健康なドナー由来のＰＢＭＣ中における２μＭのフォロデシンとｄＧｕｏ（１０〜２０μＭ）の細胞毒性は、ＣＬＬ細胞と比較して、Ｔリンパ球（ＣＤ３＋細胞）とＢリンパ球（ＣＤ１９＋細胞）の両方において相対的に低かった。
【０１１４】
ＣＬＬ患者では、ＺＡＰ−７０および／またはＣＤ３８タンパク質の発現レベルは、全生存率の低さおよび疾患進行までの時間の短縮と関係がある（Ｈｕｓら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ，１７（４），６８３−６９０（２００６））。ＺＡＰ−７０レベルが低いＣＬＬ細胞においてフォロデシンにより誘導される細胞死（１７人のＣＬＬ患者；コントロールに対する平均細胞毒性５８．１％±１１）と高レベルのＺＡＰ−７０を発現するＣＬＬ細胞（２２人のＣＬＬ患者；平均細胞毒性５７．９％±１２）との間には有意な差は観察されず、また、ＣＤ３８発現レベルに関しても同様であった（平均細胞毒性：ＣＤ３８（低）、５２．３％±１２対ＣＤ３８（高）、６２．１％±１２）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ薬物耐性およびＣＬＬ患者の短期間生存と関係がある１３ｑ欠失、１１ｑ欠失および１７ｐ欠失等のＣＬＬ細胞における最も一般的な細胞遺伝学的変異は、フォロデシン誘導細胞毒性とは相関性を有さなかったが、これらの症例では良好な反応が見られた。
【０１１５】
ＣＬＬで用いられる２つの主要な化学療法剤であるフォロデシンとフルダラビンまたはベンダムスチンの細胞毒性を用いて処置したＣＬＬ細胞の細胞毒性反応についても比較した（Ａｉｖａｄｏら、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２９，（４ Ｓｕｐｐｌ １３），１９−２２（２００２）；およびＭｏｎｔｓｅｒｒａｔ，Ｈｅｍａｔｏｌ Ｊ，５，Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ２−Ｓ９（２００４））。３２人のＣＬＬ患者（そのうち１１人がｐ５３欠失を有する）由来の一次ＣＬＬ細胞を、２μＭのフォロデシン、２０μＭのｄＧｕｏ、１０〜２５μＭのベンダムスチンおよび１μｇ／ｍｌのフルダラビンを単独でまたは組み合わせて用いて４８時間かけてインキュベートした。単剤としては、１７ｐ欠失を有さないＣＬＬにおける平均細胞毒性は、フォロデシン、フルダラビンおよびベンダムスチンについてそれぞれ５５．３±８、５０．６±１１および４９．２±１８であった。ｐ５３変異を生じる１７ｐ欠失の獲得は、ＣＬＬ患者のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏフルダラビン耐性と関係がある（Ｄｏｈｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，８５（６），１５８０−１５８９（１９９５）；およびＴｕｒｇｕｔら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，４８（２），３１１−３２０（２００７））。注目すべきは、１７ｐ欠失を有する大半のＣＬＬ患者は、フォロデシンに対して高い反応を示したことであり、４８時間における平均細胞毒性は６０．１％±２１であった（２μＭのフォロデシンおよび２０μＭのｄＧｕｏ）。対照的に、これらの症例は、フルダラビン（平均細胞毒性２５．１±１３）およびベンダムスチン（平均細胞毒性３６．２％±１７）に対して低い反応を示した。さらに、分析した３２人のＣＬＬ患者試料のうち１２人については、２５μＭのベンダムスチンおよび／または１μｇ／ｍｌのフルダラビンに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ反応が観察されなかったかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ反応が低かったが（コントロールに対して３５％未満の細胞毒性）、フォロデシンに対しては高い反応を示した。ベンダムスチンまたはフルダラビンに対する反応が低いまたは非常に低い１７ｐ欠失を有する３つの症例は、フォロデシンに対して高い反応を示し（平均細胞毒性６７％±２０）、フォロデシンに対して低い反応を示したのはわずかに２人のＣＬＬ患者のみであった。
【０１１６】
フォロデシンとフルダラビン、ベンダムスチン、およびリツキシマブの併用
処置のためのフルダラビンとフォロデシンの併用を評価した。フォロデシンとベンダムスチン、アルキル化剤およびプリン様類似体の併用についても評価した。２μＭのフォロデシンおよびｄＧｕｏ（１０〜２０μＭ）とフルダラビン（０．５〜１μｇ／ｍｌ）の併用は、いずれの単剤薬物の細胞毒性効果も増大することなく、細胞死誘導に悪影響が観察された。両方の薬物の併用効果を評価するために、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙのアルゴリズム（Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ，２２，２７−５５（１９８４））を２つの異なる薬物の併用についての拮抗作用または相乗効果の指示マーカーとして用いて、併用指数、すなわち、ＣＩ値を算出した。簡潔に言えば、１を超えるＣＩ値は拮抗作用を示し、１未満のＣＩ値は相乗効果を示す。フルダラビンおよびフォロデシンを用いた併用に関する研究は、分析（４８時間）した全てのＣＬＬ症例において１を超えるＣＩ値を示したが、これは、両方の薬物間の拮抗作用を示す。フォロデシンおよびフルダラビンを併用して得られた平均細胞毒性は、両方の薬物によるものよりも低かった。フォロデシンはまた、ベンダムスチンに対する反応が低いＣＬＬ症例においても効果的であったが、対照的に、フルダラビンに対しては、ベンダムスチンとフォロデシンの併用において細胞死の著しい増加が観察され、強力な相乗効果（ＣＩ＜１）が観察された。フロデシン（Ｆｒｏｄｅｓｉｎｅ）は、低用量のベンダムスチン（１０μＭ、平均細胞毒性３２．９５％）の細胞毒性反応を明確に向上させ、両方の薬物の併用について７０．５％の平均細胞毒性効果を達成する。
【０１１７】
フォロデシンとリツキシマブ（ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体）の併用についても評価した。２４時間では、リツキシマブ単剤（２５〜５０μｇ／ｍｌ）で観察された細胞死は少なく、フォロデシンとの併用では、両方の薬物の細胞毒性効果は明確に改善された。リツキシマブとフォロデシンの強力な相乗効果も示され、ＣＩ値は０．５付近であった。
【０１１８】
細胞内ｄＧＴＰレベルの上昇およびＳｅｒ−７４におけるｄＣＫリン酸化反応とフォロデシン誘導細胞死との相関性
２μＭのフォロデシンおよび１０μＭのｄＧｕｏで処置した２６人のＣＬＬ患者由来の一次細胞におけるｄＧＴＰの細胞内レベルを分析した。１８時間で分析したｄＧＴＰレベルの倍増と４８時間におけるフォロデシン細胞毒性の有意な直接的相関性（ｐ＜０．０５）を観察した。フォロデシンは、細胞内ｄＧＴＰレベルの高い上昇を誘導した（コントロールの基準レベルに対して最大で９６倍まで上昇し、細胞１兆個につきｄＧＴＰが６〜１２９ｐｍｏｌｅの間の値に達した）。４つのＣＬＬ症例では、ｄＧＴＰレベルの上昇がないかまたは低く、これらの症例で観察されたフォロデシンに対する細胞毒性反応は低かった。フォロデシン処置後のｄＧＴＰレベルの上昇がｄＣＫによるｄＧｕｏのリン酸化反応により媒介されることを確認するために、デオキシシチジンの存在下における細胞死誘導を分析した。デオキシシチジンはｄＣＫの一次基質であるため、ｄＣＫによるｄＧｕｏのリン酸化反応を阻害し、細胞内におけるｄＧＴＰの上昇およびフォロデシンにより誘導されるその後のアポトーシスに影響を与える。デオキシシチジン（５〜１０μＭ）を用いた細胞のプレインキュベーションによりフォロデシン誘導細胞死が阻害された。抗癌化学療法に用いたヌクレオシド類似体、特に、プリン類似体のフルダラビンおよびデオキシシチジン類似体のゲムシタビンは、活性化のためにｄＣＫによりリン酸化されるものがある。デオキシシチジンまたは、フルダラビンにより誘導される細胞生存の損失は回復するが、ベンダムスチン（ｄＣＫに依存せずに作用し得る薬物）により誘導される細胞死については不可逆的であった。
【０１１９】
ｄＣＫのリン酸化反応状態をフォロデシン処置時にウエスタンブロット法により分析したが、最近では、ＣＬＬ細胞においては、ｄＣＫ活性がＳｅｒ−７４においてリン酸化反応により正に調節されると言われている（Ｓｍａｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８１（８），４８８７−４８９３（２００６）；Ｓｍａｌら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２５（９−１１），１１４１−１１４６（２００６）；Ｓｍａｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２５３（１），６８−７３（２００７））。ＣＬＬ細胞中のｄＣＫの（Ｓｅｒ−７４における）リン酸化体の増加を観察したところ、増加はベンダムスチンによるものではなかった。フォロデシン処置後にホスホ−ｄＣＫ／ｄＣＫ比の濃度分析を行い、細胞毒性との相関性を２４時間（ｐ＝０．０５、補足データ）および４８時間（ｐ＝０．０５）の両方において観察した。
【０１２０】
フルダラビンとフォロデシン間で観察された拮抗作用を調べるために、ＣＬＬ細胞をフルダラビン（１μｇ／ｍｌ）およびフォロデシン（２μＭおよびｄＧｕｏ、１０μＭ）でインキュベートした後の細胞内ｄＧＴＰの上昇を観察した。フルダラビン単独ではｄＧＴＰレベルの上昇を誘導しなかったが、フルダラビンとフォロデシンとを併用した場合（灰色の棒）、フォロデシン単独（黒色の棒）でもたらされたｄＧＴＰの倍増が低減した。それゆえ、フルダラビンとフォロデシンの併用について観察されたｄＧＴＰ上昇の低下は、両方の薬物間で観察された拮抗作用を説明する。フルダラビンは、活性化のためにｄＣＫによるリン酸化を必要とし、ｄＧｕｏもこの酵素によりリン酸化されるため、両方の薬物は同じ酵素を奪い合うことがあり、そのため、ｄＧＴＰの生成またはフルダラビンの活性型が低減する。
【０１２１】
ｐ５３に依存しないミトコンドリアアポトーシス経路のフォロデシン誘導による活性化
ＣＬＬ細胞においてフォロデシンがアポトーシスを誘導する作用機序を解明するために、ミトコンドリアアポトーシス経路のいくつかの特徴を分析した。フォロデシンは、早期において、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の損失を誘導した。活性酸素種（ＲＯＳ）は、ミトコンドリア損傷の後に産生することができるとともに、引き続いてアポトーシスを媒介し得る（Ｖｉｌｌａｍｏｒら、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ，１０（８），８４１−８５３（２００４））。フォロデシンはまた、ＣＬＬ一次細胞におけるＲＯＳの産生を誘導する。ミトコンドリア脱分極およびＲＯＳ産生が初期事象として観察されたが、それらはフォロデシンを用いた処置の１０時間後に顕著であった。酸化ストレスは、プログラム細胞死を調節する役割を果たすため、いくつかのＲＯＳ捕捉剤の効果を分析した。グルタチオン還元エチルエステル（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはタイロンを用いたＣＬＬ細胞のプレインキュベーションにより、フォロデシンにより誘導されるΔΨｍ損失およびＲＯＳ産生が低減した。ＮＡＣおよびタイロン（Ｏ２に特異的な捕捉剤）は、ＲＯＳ産生を事実上元に戻し、Ｈ２Ｏ２に選択的な捕捉剤であるＧＳＨの効果を抑えた。
【０１２２】
ＣＬＬ細胞に関する過去のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、フォロデシンがｐ５３の安定化およびアポトーシス誘導を生じることが報告されており（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｂｌｏｏｄ，１０８（７），２３９２−２３９８（２００６））、結果は、ＤＮＡ損傷およびｐ５３媒介アポトーシスを誘導する他の抗癌剤と一致している。しかし、他のプリンヌクレオシド類似体と異なり、フォロデシンはＤＮＡ内に取り込まれない。興味深いことに、分析したミトコンドリアアポトーシス経路の初期の特徴は、１７ｐ（ｐ５３）欠失または１１ｑ（ＡＴＭ）欠失を有するＣＬＬ患者でも観察されており、アポトーシス開始機序がＤＮＡ損傷ｐ５３媒介反応に依存しないことが示される。
【０１２３】
カスパーゼ−８により媒介されるミトコンドリアアポトーシス経路の増幅ループの役割を示唆するフォロデシンにより誘発される連続的なカスパーゼ−９および−８活性化ならびにＢＩＤの処理
ミトコンドリアアポトーシスを導く下流側シグナル伝達経路を調べるために、フォロデシン曝露後のカスパーゼ活性化パターンを調べた。カスパーゼ−９、−８および−３の用量および時間依存的な活性化を、それらの不活性型の処理により観察および分析した。プロカスパーゼ−９および−８の分解産物は、フォロデシン処置後１０時間程度の早期にほぼ同時に存在し、最初は、プロカスパーゼ−９のｐ３７切断型となり、その後に、カスパーゼ−８のｐ４３／４１切断型が増加した。プロカスパーゼ−３の分解およびその活性型の存在はその後に検出された。カスパーゼ−８の活性化との相関性において、フォロデシンはまた、カスパーゼ−８の主要基質であるＢＨ３オンリータンパク質ＢＩＤの減少を誘導し、分解アポトーシス促進型にして、ミトコンドリアアポトーシス経路を活性化する。アポトーシス誘導との相関性において、アポトーシス阻害剤ＸＩＡＰおよびスルビビンならびにカスパーゼ−３基質であるＰＡＲＰのタンパク質分解切断の減少も観察された。次に、ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化がカスパーゼ依存性だけでなく非依存性細胞死にも繋がるため、フォロデシン誘導アポトーシスのカスパーゼ活性化の役割を調べた。効能範囲が広いカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋを用いた細胞の処置では、フォロデシン処置後のホスパチジルセリン曝露（ｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）が２４時間かけて部分的に低減されたが、これは、カスパーゼ依存性および非依存性作用機序の両方の関連を示唆する。
【０１２４】
カスパーゼ−８／ＢＩＤの活性化は、フォロデシンが引き起こすアポトーシス誘導中に重要な役割を果たすか、またはカスパーゼ−９活性化による、すなわち、ミトコンドリアの下流側での二次的な事象となる場合がある。興味深いことに、ＡｎｎｅｘｉｎＶ染色で分析したアポトーシス誘導は、特定のカスパーゼ−８阻害剤ｚ−ＩＥＴＤ．ｆｍｋにより部分的に阻止されたが、観察されたΔΨｍ損失の復帰はより顕著であった。これらの結果をまとめると、カスパーゼ−８活性化およびＢＩＤはフォロデシンにより誘導されるミトコンドリアアポトーシス経路において初期増幅の役割を果たすことが示唆される。
【０１２５】
ミトコンドリア媒介細胞死のアポトーシス促進および抗アポトーシス調節因子の分析
ミトコンドリアアポトーシス経路は、特に、抗アポトーシスＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１タンパク質ならびにアポトーシス促進ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＤおよびＢＩＭタンパク質等のＢＣＬ−２ファミリータンパク質に属するアポトーシス促進メンバーおよび抗アポトーシスメンバー間の厳格な均衡により調節される。ＣＬＬ細胞は、化学療法に対するｉｎ ｖｉｔｒｏおよび臨床反応と逆相関する高レベルの抗アポトーシスタンパク質ＭＣＬ−１およびＢＣＬ−２を発現する。これらの抗アポトーシスタンパク質のレベルでのフォロデシンインキュベーションの効果を調べた。フォロデシン処置時に、抗アポトーシスＭＣＬ−１タンパク質のレベルは大幅に減少したが、ＢＣＬ−２タンパク質レベルには影響はなかった。ＢＨ３オンリータンパク質ＢＩＭは、ＢＣＬ−２および他の抗アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーと相互に作用し、アポトーシスを誘発する。フォロデシンは、アポトーシス促進ＢＩＭタンパク質レベルでのタンパク質レベルの上昇を誘導する。フォロデシンで処置した７つのＣＬＬ症例において、濃度分析によりＢＩＭおよびＭＣＬ−１タンパク質レベルの変化が確認された。アポトーシス促進ＢＩＭ ＥＬタンパク質レベルの上昇またはＭＣＬ−１レベルの低下と、ＭＣＬ−１の減少にとって有意（ｐ＝０．０４）なフォロデシンに対する細胞毒性反応の直接的相関性が観察された。さらに、フォロデシン処置後に観察された細胞毒性に対するＭＣＬ−１およびＢＩＭ ＥＬ誘導の減少の比を（コントロールに対して）プロットすると、有意な相関性（ｐ＝０．０４）が見られた。
【０１２６】
ＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１は、ミトコンドリア膜を保護し、ＢＡＸおよびＢＡＫ等のエフェクターアポトーシス促進タンパク質の作用からその完全性を保持する作用をする。ＢＩＭおよび分解ＢＩＤは、ＢＡＸおよびＢＡＫの直接活性剤として作用する能力を有する唯一のＢＨ３オンリータンパク質であり、ＢＡＸおよびＢＡＫの活性化を、フォロデシンを用いたＣＬＬ細胞のインキュベーション後にフローサイトメトリーにより分析した。フォロデシンは、これらのタンパク質をミトコンドリア外膜内に挿入することを可能にするＢＡＸおよびＢＡＫの構造変化、そのオリゴマー化、その後のミトコンドリア膜透過化の誘導、および細胞死機構の活性化を誘導した。
【０１２７】
フォロデシン処置により誘発されるｍＲＮＡのｐ７３およびタンパク質レベルの上昇ならびにＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３Ａの誘導
フォロデシンはｐ５３の状態に関係なく全てのＣＬＬ症例において細胞毒性効果を発揮したが、フォロデシンは、１７ｐ欠失がないＣＬＬ症例においてｐ５３タンパク質の安定化を誘導することができた。ｐ５３媒介アポトーシスに必要なｐ５３関連タンパク質であるＴＡｐ７３タンパク質の誘導により、機能的なｐ５３を有さないＣＬＬ細胞のアポトーシス耐性を克服できた（Ｄｉｃｋｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，１０８（１０），３４５０−３４５７（２００６））。フォロデシン処置は、分析した全てのＣＬＬ症例においてｐ７３ｍＲＮＡおよびＴＡｐ７３タンパク質レベルの明確な上方調節を誘導する。ｐ７３は、ある意味においてｐ５３依存性であるが腫瘍性細胞においてはｐ５３非依存性である転写因子ＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａの上方調節を介して、アポトーシス促進タンパク質ＢＩＭの誘導を調節するが（Ａｍｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６７（１２），５６１７−５６２１（２００７））、ＦＯＸＯ誘導の機序は不明である。フォロデシンで処置したＣＬＬ細胞におけるＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａのレベルを調べた。フォロデシンは、観察したｐ７３およびＢＩＭタンパク質レベルの上昇と相関して、ＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａの両方の上昇を誘導した。
【０１２８】
材料および方法
薬物および化学物質
実験用フォロデシン（ＢＣＸ−１７７７／イムシリンＨ）はＢｉｏＣｒｙｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＳＡ）により提供されたものであり、デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）はＳｉｇｍａから購入した。デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）の定量化のために、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからｄＮＴＰおよび［３Ｈ］ｄＡＴＰを入手した。フルダラビン（Ｓｈｅｒｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ベンダムスチン塩酸塩（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）、Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｚｅｒ，ＰＡにより提供された）、リツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および２’−デオキシシチジン（Ｓｉｇｍａ）を細胞毒性アッセイに用いた。
【０１２９】
健康なドナー由来のＣＬＬ一次細胞および末梢血単核細胞の分離および培養
本ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、世界保健機関の分類に従ってＣＬＬと診断された４３人の患者由来の一次白血病リンパ球において実施した。インフォームドコンセントは各患者から得た。
【０１３０】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）細胞をフィコール／ハイパーク沈降（Ｓｅｒｏｍｅｄ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により分離した。細胞は直接使用するかまたは１０％ジメチルスルホキシドおよび９０％加熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）の存在下で液体窒素中において凍結保存した。解凍後、ＣＬＬ患者由来の単核細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を、５％二酸化炭素を含有する３７℃の加湿雰囲気下で、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび５０μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培養培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。腫瘍性細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ５＋）のパーセンテージ、ＺＡＰ−７０およびＣＤ３８発現レベルをフローサイトメトリーにより分析し、上述したように定量化した（Ｃｒｅｓｐｏら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４８（１８），１７６４−１７７５（２００３））。ＺＡＰ−７０の高発現レベルのカットオフポイントは≧２０％とし、ＣＤ３８については≧３０％とした（Ｈｕｓら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ，１７（４），６８３−６９０（２００６））。この研究に用いた全てのＣＬＬ試料には、９５％を超える腫瘍性細胞があった。Ｖｙｓｉｓ（Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）から販売される１７ｐ１３．１（ｐ５３）、１１ｑ２２．３（ＡＴＭ）および１３ｑ１４．３（Ｄ１３Ｓ３１９）の欠失を判定する遺伝子座特異的プローブおよび１２トリソミーを検出する動原体プローブを含む市販の多検出キットを用いて蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により細胞遺伝学的変異を評価した。ｐ５３遺伝子の突然変異は、通常、ミスセンス突然変異であり、変異タンパク質は半減期が延長され、ウエスタンブロットによる検出が可能となる。さらに、ｐ５３突然変異がＩＡＲＣ ＴＰ５３コンソーシアムに従った直接配列決定により確認された。
【０１３１】
アポトーシス誘導
１０−２０−３０μＭのデオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）の存在する場合と存在しない場合において異なる時点でフォロデシンを１〜１２μＭの用量範囲で用いて細胞をインキュベートした。必要な場合には、８０μＭの汎カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋ（ベンジルオキシ−カルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロ−メチルケトン；Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、５０μＭのカスパーゼ−８阻害剤ｚ−ＩＥＴＤ．ｆｉｎｋ（Ｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）Ｔｈｒ−ＤＬ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン、Ｂａｃｈｅｍ）、２’−デオキシシチジン（５−１０−２０μＭ、Ｓｉｇｍａ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ、２５ｍＭ）、タイロン（５ｍＭ、４，５−ジヒドロキシ−１，３−ベンゼン−ジスルホン酸、Ｓｉｇｍａ）またはＧＳＨ（２ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）を用いて１時間かけて細胞をプレインキュベートした。薬物併用研究については、フルダラビンまたはベンダムスチンを用いて４時間、１２時間、もしくは２４時間かけて、またはフォロデシン（２μＭ）とｄＧｕｏ（１０〜２０μＭ）を加える前にモノクローナル抗体抗ＣＤ２０リツキシマブを用いて１時間かけて細胞を前処理した。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に接合させた二重染色によるホスファチジルセリン（ＰＳ）曝露の定量化であるＦＳＣ／ＳＳＣ（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、細胞生存およびアポトーシス誘導を細胞の複雑さの変化により分析した。ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋母集団におけるアポトーシスの分析については、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、抗ＣＤ１９−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＡＰＣと同時にＰＢＭＣを標識した。細胞生存および細胞毒性をコントロール細胞に対するパーセンテージでプロットした。２０ｎＭのＤｉＯＣ６（３，３−ジエキシルオキサカルボシアニンヨージド（３，３−ｄｉｅｘｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で細胞を染色してミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の損失を評価し、２μＭジヒドロエチジン（ＤＨＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で細胞を染色してフローサイトメトリー分析により活性酸素種（ＲＯＳ）産生を判定した。上述のとおりＢＡＸまたはＢＡＫタンパク質のＮＨ２末端に向けられた抗体で細胞をイムノサイトメトリー標識（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）して、構造変化によるアポトーシス促進ＢＡＸおよびＢＡＫタンパク質の活性化を分析した（Ｂｅｌｌｏｓｉｌｌｏら、Ｂｌｏｏｄ，１００（５），１８１０−１８１６（２００２））。この領域は基本的に閉塞され、ＮＨ２末端エピトープ特異的抗体による結合には利用できない。アポトーシス刺激の後、これらのタンパク質の構造変化により、ＮＨ２末端と、ミトコンドリアを標的とし、ミトコンドリアにより媒介される細胞死機構の誘導において重要な役割を果たす疎水性ＣＯＯＨ末端とが露出される。端的には、細胞をＰＢＳ中で一旦洗浄し、パラホルムアルデヒド４％中に固定し、０．１％サポニンおよび０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で透過処理した。立体構造活性ＢＡＫ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に対する１μｇ／ｍｌの一次抗体またはＢＡＸ（クローン６Ａ７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体を用いて室温で細胞を染色した。透過化緩衝液中で数回洗浄した後、細胞を、二次ヤギ抗マウスＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ）またはヤギ抗ウサギＦＩＴＣ（Ｓｕｐｅｒｔｅｃｈｓ）抗体でインキュベートし、透過化緩衝液で再度洗浄した。次いで、１つの試料につき１万個の染色細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【０１３２】
細胞内ｄＧＴＰレベルの測定
フォロデシン（２μＭ）およびｄＧｕｏ（１０μＭ）もしくはフルダラビン（１μｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに、１５×１０６個のＣＬＬ一次細胞を１８時間かけてインキュベートし、６０％メタノールを用いてヌクレオチドを抽出し、ＳｈｅｒｍａｎおよびＦｙｆｅにより改変されたＤＮＡポリメラーゼアッセイによって細胞内ｄＧＴＰレベルを定量化した（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１８０（２），２２２−２２６（１９８９））。データは、コントロール細胞に対する細胞内ｄＧＴＰレベルの誘導倍率で示した。並行して、２４時間および４８時間における細胞生存も評価した。
【０１３３】
免疫ブロット法
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ロイペプチン１０μｇ／ｍｌ、アポプロチニン１０μｇ／ｍｌ、１μＭ ＰＭＳＦ、１μＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１μＭ ＮａＦ、２μＭピロリン酸ナトリウム十水和物（Ｓｉｇｍａ）を加えたＲＩＰＡ緩衝液において細胞を１５分間かけて溶解した。細胞内全タンパク質を還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜に移した。タンパク質検出のために、以下の一次抗体を用いて膜を調べた：抗ＢＩＭ、抗ＢＡＫ（Ａｂ１）抗カスパーゼ−８（Ａｂ−３）、抗ｐ５３（Ａｂ−２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；抗ＢＩＤ、抗カスパーゼ−９、抗ＦｏｘＯ１および抗ＸＩＡＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；抗Ｂｃｌ−２、抗ｄＣＫ、抗Ｍｃｌ−１（Ｓ−１９）および抗ｐ７３（クローン５Ｂ４２９）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；抗ＰＡＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）；抗カスパーゼ−３および抗ＢＡＸ（クローン６Ａ７）（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗スルビビン（Ａｂｅａｍ）；抗β−アクチンおよび抗α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）および抗ＦｏｘＯ３Ａ（Ｕｐｓｔａｔｅ）。ウサギ抗ホスホｄＣＫ（Ｓｅｒ７９）およびウサギ抗ｄＣＫは、Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｓｍａｌ氏およびＦｒａｎｃｏｉｓｅ Ｂｏｎｔｅｍｐｓ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ ｄｅ Ｌｏｕｖａｉｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の厚意により提供された。適切な一次抗体でインキュベーションを行った後、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス（Ｓｉｇｍａ）、抗ウサギ（Ｓｉｇｍａ）もしくは抗ヤギ（Ｄａｋｏ）抗体でブロットを現像した。均等なタンパク質負荷がβ−アクチンもしくはα−チューブリン発現で確認され、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ Ｆｕｊｉｆｉｌｍソフトウェア（Ｆｕｊｉ）を用いて相対的タンパク質定量を行った。
【０１３４】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ定量化
製造者の使用説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて１０７個の細胞から全ＲＮＡを抽出した。次いで、ランダムプライマーおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１マイクログラムの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。デザイン済のＡｓｓａｙ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でｐ７３およびＭｃｌ−１の発現レベルを判定した。ＧＵＳを内在性コントロールとして用いて、比較サイクル閾値（Ｃｔ）法（ΔΔＣｔ）により各遺伝子の相対的発現を定量化した。ｍＲＮＡ発現レベルを任意の定量ＰＣＲ単位とし、各症例のコントロール試料（未処理）を較正物質ととした。
【０１３５】
統計分析
データは３つの独立した実験の平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。全ての統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。２つの試料群間の比較をノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により評価し、スピアマン検定を用いて相関係数を評価した。ｐ値≦０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）である場合、結果を統計的に有意であると見なした。２つの異なる薬物の併用効果を評価するために、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙに記載のアルゴリズム（Ｃａｌｃｕｓｙｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．０，Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて併用指数またはＣＩ値を分析した（Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ，２２，２７−５５（１９８４））。このＣＩ値は、２つの異なる薬物の併用効果に関する拮抗作用または相乗効果の指示マーカーである。２つの薬物間の相互作用については、ＣＩ値が１未満である場合に相乗的と見なし、１である場合に付加的と見なし、ＣＩが１を超える場合に拮抗的と見なした。
【０１３６】
本発明を多数の実施形態について説明した。しかしながら、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、各種の改変を行うことが可能であることは言うまでもない。従って、他の実施形態も添付する請求の範囲内とする。本明細書中で引用した全ての文献、特許および特許出願を本明細書中において参考として援用する。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤の投与を含む方法による、血液学的な癌（例えば、血液の癌）の処置に関する。特に、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を処置する方法が記載される。
【０００２】
関連出願
この出願は、２００７年１２月１０日に出願された、米国出願第６１／０１２，７６２号（この出願は、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
現在、癌は、米国では２番目の死因であり、米国では８百万人超が癌と診断されている。１９９５年には、米国内の死者の２３．３％が癌を死因としていた（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｈｅａｌｔｈ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ １９９６−９７ ａｎｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｃｈａｒｔｂｏｏｋ １１７（１９９７）参照）。
【０００４】
現在、癌は、主として、外科手術、放射線療法、および化学療法の３種類の療法の１つまたはそれらの組み合わせにより処置される。外科手術には、病変組織の大量除去が含まれる。外科手術は、例えば、胸部、結腸、および皮膚等、特定の部位に位置する腫瘍の除去に効果的な場合があるが、骨格等の他の領域に位置する腫瘍の処置や、白血病等の播種性の腫瘍性病態の処置には使用できない。放射線療法には、生体組織を電離放射線に曝露して曝露細胞の死または損傷を生じることが含まれる。放射線療法の副作用は急性かつ一過性のものであり得るが、他のものに関しては不可逆性であり得る。化学療法には、細胞複製または細胞代謝の崩壊が含まれる。これは、胸部、肺、および精巣癌の処置において最もよく用いられる。この癌処置における失敗の主因の１つは、癌細胞が薬物耐性を生じることであり、これは、病気の再発または死にも繋がり得る重大な問題である。よって、より効果的な癌処置が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、被験体の血液学的な癌（例えば、ＣＬＬおよびＡＬＬ）を処置する方法を提供する。この方法は、（ａ）上記被験体に有効量のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤を投与する工程と、（ｂ）上記被験体に有効量のアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤を投与する工程を含む。特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。他の実施形態では、上記アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、およびイミダゾールカルボキサミド化合物から選択される。いくつかの実施形態では、上記アルキル化剤はベンダムスチンである。特定の実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【０００６】
いくつかの実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は同時投与されるが、他の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は連続投与される。後者の実施形態では、上記アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤は、上記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与することができる。
【０００７】
他の実施形態では、１つ以上の化学療法剤（例えば、ベンダムスチン等のアルキル化剤およびフルラダビン（Ｆｌｕｒａｄａｂｉｎｅ）等のプリンヌクレオシド類似体）に耐性を持つ被験体の血液学的な癌を処置する方法は、（ａ）１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体を同定する工程と、（ｂ）上記被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程とを含むことができる。具体的な実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。
【０００８】
他の実施形態では、血液学的な癌を有する被験体を処置する方法は、（ａ）上記被験体由来の試料中の１つ以上の癌細胞においてｐ５３欠失を検出する工程と、（ｂ）上記被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程とを含むことができる。特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。いくつかの実施形態では、上記方法は、１７ｐ欠失の存在を検出する工程および／または上記試料中の１つ以上の癌細胞が１つ以上の化学療法剤（例えば、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体）に耐性を持つか否かを判定する工程をさらに含むことができる。
【０００９】
本明細書では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００１０】
本明細書では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含むキットも提供する。いくつかの実施形態では、上記キットは、上記ＰＮＰ阻害剤、上記アルキル化剤、上記抗ＣＤ２０剤、またはそれらの任意の組み合わせの送達システムをさらに含むことができる。他の実施形態では、上記キットはまた、被験体を処置するための使用説明書含むことができる。
【００１１】
他の実施形態では、キットはＰＮＰ阻害剤を含む。１つの実施形態では、上記キットは、その内容物がアルキル化剤に耐性を持つ被験体に投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記キットはまた、その内容物がｐ５３欠失を有する被験体に投与されるべきものであることを示すラベルを含む。最後の実施形態では、上記キットは、その内容物がアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤とともに投与されるべきものであることを示すラベルを含むことができる。
【００１２】
特定の実施形態では、動物の血液学的な癌の処置に有用な薬剤を調製するためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤およびアルキル化剤の使用を提供する。
【００１３】
特定の実施形態では、動物の血液学的な癌の処置に有用な薬剤を調製するためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤および抗ＣＤ２０剤の使用を提供する。
【００１４】
特定の実施形態では、血液学的な癌の処置のためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤およびアルキル化剤の使用を提供する。
【００１５】
特定の実施形態では、血液学的な癌の処置のためのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤および抗ＣＤ２０剤の使用を提供する。
【００１６】
本発明の１つ以上の実施形態を添付の図面および下記の説明において詳細に示す。他の特徴、目的、および利点は、それらの説明および図面、ならびに請求の範囲により明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】高いＺＡＰ−７０レベルおよび低いＺＡＰ−７０レベルの両方を示すＣＬＬ細胞におけるフォロデシンの細胞毒性効果を詳細に示す。
【図１Ｂ】高いＺＡＰ−７０レベルおよび低いＺＡＰ−７０レベルの両方を示すＣＬＬ細胞におけるフォロデシンの細胞毒性効果を詳細に示す。
【図２】フォロデシン処置後の細胞内のｄＧＴＰレベルの上昇と誘導された細胞死の量の相関性を示す。
【図３】フォロデシンに対する反応が大きいｐ５３欠失ＣＬＬ症例を詳細に示す値を示す。
【図４】ベンダムスチンまたはフルダラビン処置に対する感受性が低いかまたは感受性を有さないＣＬＬ症例のフォロデシンを用いた処置のデータを示す。
【図５Ａ】フォロデシン／ベンダムスチンおよびフォロデシン／フルダラビンの結合指数データを示す。
【図５Ｂ】フォロデシン／ベンダムスチンおよびフォロデシン／フルダラビンの結合指数データを示す。
【図６】フォロデシン／リツキシマブの結合指数データの詳細を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本明細書に記載するように、フォロデシンを用いた処置は、一次ＣＬＬ細胞の時間および用量依存性細胞死を誘導した。２μＭのフォロデシンおよび２０μＭのｄＧｕｏを用いた６０％を超える細胞毒性反応が４８％の症例において観察され、細胞毒性が４０％未満であったのは９％の症例のみであった。１７ｐ１３（ＴＰ５３）および１１ｑ２２−ｑ２３（ＡＴＭ）の欠失等の遺伝学的異常、進行疾患による後天性かつ薬物耐性に関する遺伝学的異常、ならびにＣＬＬ患者の短期間生存率に関しては、反応に差異は観察されなかった。それらのｐ５３または１１ｑ変異を有するＣＬＬ症例は、フォロデシンに対して高い感受性（平均細胞毒性６０．１％、４８時間）を示し、化学療法に耐性を有するＣＬＬ患者において良好な細胞毒性反応が得られた。フォロデシンと臨床的抗白血病レジメンの組み合わせにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性反応が促進され、フォロデシンと、低用量のベンダムスチン、モノクローナル抗体の抗ＣＤ２０リツキシマブ、またはシクロホスファミドとの組み合わせにより強力な相乗効果が観察された。対照的に、フルダラビンには拮抗作用が見られた。それゆえ、フォロデシンは、ＡＴＭ／ｐ５３経路を回避するＣＬＬ細胞のアポトーシスを誘導可能な新規な化学療法的アプローチの典型を示す。
【００１９】
従って、特定の実施形態では、被験体の血液学的な癌を処置する方法であって、上記被験体に有効量のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤を投与する工程と、上記被験体に有効量のアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤を投与する工程とを含む、方法を提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである。
【００２１】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、およびイミダゾールカルボキサミド化合物から選択される。
【００２２】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤はマスタード誘導体である。
【００２３】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤はベンダムスチンである。
【００２４】
特定の実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【００２５】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は同時投与される。
【００２６】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は連続投与される。
【００２７】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤は、上記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与される。
【００２８】
特定の実施形態では、上記血液学的な癌は、慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される。
【００２９】
特定の実施形態では、上記血液学的な癌は慢性リンパ性白血病である。
【００３０】
特定の実施形態では、上記血液学的な癌は急性リンパ芽球性白血病である。
【００３１】
特定の実施形態では、有効量のアルキル化剤が上記被験体に投与される。
【００３２】
特定の実施形態では、有効量の抗ＣＤ２０剤が上記被験体に投与される。
【００３３】
上記方法の特定の実施形態では、上記方法は、上記被験体に有効量のＰＮＰ阻害剤、有効量のアルキル化剤、および有効量の抗ＣＤ２０剤を投与する工程を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は同時投与される。
【００３５】
特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は連続投与される。
【００３６】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は、上記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与される。
【００３７】
特定の実施形態では、１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体の血液学的な癌を処置する方法であって、１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体を同定する工程と、上記被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００３８】
特定の実施形態では、上記被験体は、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体からなる群より選択される１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ。
【００３９】
特定の実施形態では、上記アルキル化剤はベンダムスチンである。
【００４０】
特定の実施形態では、上記プリンヌクレオシド類似体はフルラダジン（Ｆｌｕｒａｄａｄｉｎｅ）である。
【００４１】
特定の実施形態では、血液学的な癌を有する被験体を処置する方法であって、上記被験体由来の試料において１つ以上の癌細胞中のｐ５３欠失を検出する工程と、上記被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程と、を含む、方法を提供する。
【００４２】
特定の実施形態では、上記方法は、１７ｐ欠失の存在を検出する工程をさらに含むことができる。
【００４３】
特定の実施形態では、上記方法は、上記試料中の１つ以上の癌細胞が１つ以上の化学療法剤に耐性を持つか否かを判定する工程をさらに含むことができる。
【００４４】
特定の実施形態では、１つまたは複数の上記癌細胞は、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体からなる群より選択される１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ。
【００４５】
特定の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
特定の実施形態では、上記組成物はフォロデシンおよびベンダムスチンを含む。
【００４７】
特定の実施形態では、上記組成物はフォロデシンおよびリツキシマブを含む。
【００４８】
特定の実施形態では、上記組成物はＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および抗ＣＤ２０剤を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、上記組成物はフォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブを含む。
【００５０】
特定の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含むキットを提供する。
【００５１】
特定の実施形態では、上記キットは、上記ＰＮＰ阻害剤、上記アルキル化剤、上記抗ＣＤ２０剤、またはそれらの任意の組み合わせの送達システムをさらに含むことができる。
【００５２】
特定の実施形態では、上記キットは、被験体を処置するための使用説明書をさらに含むことができる。
【００５３】
特定の実施形態では、上記キットはＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤を含む。
【００５４】
特定の実施形態では、上記キットはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含む。
【００５５】
特定の実施形態では、上記キットはフォロデシンおよびベンダムスチンを含む。
【００５６】
特定の実施形態では、上記キットはフォロデシンおよびリツキシマブを含む。
【００５７】
特定の実施形態では、上記キットはＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および抗ＣＤ２０剤を含む。
【００５８】
特定の実施形態では、上記キットはフォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブを含む。
【００５９】
特定の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤を含むキットを提供する。
【００６０】
特定の実施形態では、上記キットは、その内容物がアルキル化剤に耐性を持つ被験体に投与されるべきものであることを示すラベルを含む。
【００６１】
特定の実施形態では、上記キットは、その内容物がｐ５３欠失を有する被験体に投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む。
【００６２】
特定の実施形態では、上記キットは、その内容物がアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤とともに投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む。
【００６３】
他のヌクレオシド類似体とは異なり、フォロデシンはＤＮＡに取り込まれない。フォロデシン処置により、ＣＬＬ細胞中のｄＧＴＰが増加し、この細胞毒性と相関性を有する増加は、フォロデシン処置後にｄＧＴＰレベルが達したことを示し、細胞毒性反応を示す代理マーカーとなる。フォロデシンに対するＣＬＬの感受性は、この細胞で観察される高いｄＣＫ活性によるものである可能性があり、この活性は、ｄＣＫのＳｅｒ−７４に対するリン酸化反応により正に調節される。リン酸−ｄＣＫ／ｄＣＫ比（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｄＣＫ／ｄＣＫ ｒａｔｉｏ）とフォロデシン誘導アポトーシスの間には有意な正の相関性が観察された。ｄＣＫはまた、フルダラビン、ゲムシタビン、またはクラドリビン等のいくつかの抗白血病ヌクレオシド類似体の活性化に必要なリン酸化反応を触媒する。フォロデシンとフルダラビン間で観察された拮抗作用は、フルダラビンとフォロデシンを組み合わせた後に観察されたｄＧＴＰレベルの低減により説明することができる。これらの結果は、ｄＣＫリン酸化反応およびその後のｄＧＴＰの増加がＣＬＬ細胞中のフォロデシンによるアポトーシスの誘導の第一段階として重要な役割を果たすことを示す。
【００６４】
ｄＧＴＰ媒介細胞死のいくつかの機序が提案されている。例えば、蓄積されたデオキシヌクレオシドは、デオキシグアノシンキナーゼおよびチミジンキナーゼによりミトコンドリア中でリン酸化され、ミトコンドリアＤＮＡ合成および修復と干渉し得るｄＮＴＰが異常に蓄積され、ミトコンドリア損傷、ｐ５３活性化およびアポトーシスに対する感受性を増感させ得る。ミトコンドリアｄＧＴＰの不均衡はまた、ミトコンドリアＡＴＰ合成および／またはミトコンドリア電子伝達鎖の抗酸化酵素の不活性化に影響を及ぼし、ＲＯＳ産生を生じ得る。ミトコンドリアゲノムは、アポトーシスを迅速に開始し得る酸化ストレス損傷に対する感受性が高い。本明細書に記載するように、フォロデシンは、ＲＯＳの産生およびΔΨｍ損失によりミトコンドリアアポトーシス経路を活性化させ、カスパーゼ依存性および非依存性アポトーシスを生じた。ＲＯＳは、ミトコンドリア電子伝達により生成され、強い酸化ストレスの下で、Ｏ２−、ＯＨ−またはＨ２Ｏ２レベルの上昇によりΔΨｍの損失および細胞死が引き起こされる。フォロデシンにより誘導されるこれらの事象は、ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化に先行する酸化ストレスの役割を担うＯ２−の特定の捕捉剤であるＴｉｒｏｎおよびＮＡＣを用いたＣＬＬ細胞のプレインキュベーションにより回復した。ｐ５３のリン酸化反応および活性化は、ＤＮＡ損傷反応により誘導されるが、いくつかのストレス信号によっても誘導される。超酸化物過剰産生およびその後のＤＮＡ損傷の誘導により、ＲＯＳ媒介ミトコンドリア経路の活性化およびｐ５３活性化によりアポトーシスが誘導され得る。この意味で、フォロデシンにより誘導されるＲＯＳ生成は、ｐ５３活性化の上流調節因子として作用し得る。野生型ｐ５３ＣＬＬ症例におけるｐ５３安定化を示すとともに、フォロデシンがｐ５３変異の症例においてミトコンドリアアポトーシス経路を活性化させたことを示す結果を本明細書に記載するが、これらの結果は、フォロデシンがｐ５３に依存しない異なる機序および／またはさらなる機序により作用することを示す。酸化ストレスおよびＲＯＳ産生はまた、異なる経路によりｐ５３依存性および非依存性アポトーシスの両方を調節する転写因子Ｅ２Ｆ−１の活性化を引き起こす。Ｅ２Ｆ−１は、ＤＮＡ損傷に応じてリン酸化される残基においてｐ５３リン酸化反応を増加させるが、ｐ５３非依存性アポトーシス経路を介したｐ５３同属体ｐ７３の活性化により細胞死を誘導することもできる。ＲＯＳ生成がどのようにＥ２Ｆ−１、ｐ５３および／またはｐ７３活性化および細胞死を調節することができるかについては、依然として十分に解明されていない。
【００６５】
ミトコンドリアアポトーシス経路の初期事象は、アポトソームの形成およびカスパーゼ−９の活性化であり、これにより、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−８が切断および活性化される。フォロデシンは、カスパーゼ−９および−３の時間に関連した活性化を誘導するとともに、カスパーゼ−９の活性化と同時にプロカスパーゼ−８の活性化も誘導した。同様に、カスパーゼ−８は、ＢＩＤタンパク質の切断を誘導し、ミトコンドリアアポトーシス経路を活性化するプロアポトーシス切断型にした。カスパーゼ−８の選択的阻害により、フォロデシンにより誘導されるΔΨｍ損失が低減するが、その後における細胞死に対する効果は抑えられており、これは、カスパーゼ−８／ＢＩＤがミトコンドリアアポトーシス経路の増幅ループを引き起こしたことを示唆する。カスパーゼ−９の活性化はそれ自体ではアポトーシスの誘導に十分ではない可能性があり、カスパーゼ−８／ＢＩＤを活性化させるとともに、アポトーシス抑制因子ＸＩＡＰおよびスルビビンを減少させることにより、カスパーゼ−９および−３活性が増大するため、フォロデシンにより誘導されるアポトーシスが促進される。
【００６６】
ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質は、アポトーシス細胞死への関与を制御する。ＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１等の生存促進メンバーとアポトーシス促進ＢＣＬ−２メンバー（ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＢＨ３オンリータンパク質ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＢＭＦ、ＢＩＫおよびＨＲＫ）間の均衡により、多数の死シグナル伝達経路の結果が制御される。ＣＬＬ患者では、高レベルのＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１は、疾患進行、低生存率およびアルキル化剤、ヌクレオシド類似体、およびリツキシマブを用いた療法に対する完全な反応の失敗と相関性を有する。フォロデシンは、ＢＣＬ−２レベルを変化させることなく、ＢＩＭタンパク質の蓄積およびＭＣＬ−１レベルの低下を誘導した。ＣＬＬ細胞では、ＢＩＭはＭＣＬ−１と関連するため、ＭＣＬ−１レベルの低下により、このＢＨ３オンリータンパク質に対するＣＬＬ細胞の反応を容易にする。ＢＩＭおよび切断Ｂｉｄは、抗アポトーシスＢＣＬ−２メンバーの阻害剤ならびにアポトーシス促進ＢＡＸおよびＢＡＫの直接活性剤の両方として二重に機能する。この意味では、ＢＩＭレベルの上昇は、Ｂｉｄの活性化とともに、ＢＡＸおよびＢＡＫを活性化させるとともに、ＭＣＬ−１を減少させ、ＢＣＬ−２の残りの抗アポトーシス能力が押さえ込まれる。本明細書で提供する結果は、アポトーシス誘導と有意な相関性を有するフォロデシンによるＢＩＭの増加とともにＭＣＬ−１の度合いが減少すること、およびフォロデシンに対するＣＬＬ細胞の感受性がＭＣＬ−１およびＢＩＭ基礎レベルにより決定され得ることを示す。
【００６７】
ｐ５３の状態に依存しないミトコンドリアアポトーシス経路の活性化が示されている。ｐ５３の転写標的であるｐ７３誘導は機能的なｐ５３を有さないＣＬＬ細胞のアポトーシス耐性を克服可能なことが報告されている。いくつかの化学療法薬に応じて、ｐ７３のアポトーシス促進型であるＴＡｐ７３は、ある意味ではｐ５３の状態に依存するが、非依存的でもある細胞周期停止およびアポトーシスを制御するいくつかのｐ５３標的遺伝子を転写活性化する。フォロデシンが機能的なｐ５３を有するＣＬＬ細胞中のｐ５３を誘導し、さらにＴＡｐ７３も誘導するが、興味深いことに、ｐ５３が欠失したＣＬＬ細胞中のｐ７３ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルも上昇することが分かった。酸化ストレスおよびＲＯＳ産生によりＴＡｐ７３およびＥ２Ｆ１が活性化するが、これらはともにｐ５３依存性および非依存性機序を介したミトコンドリアアポトーシス経路の活性化に関係するタンパク質である。それゆえ、ＲＯＳにより誘導されるフォロデシンの上昇により、Ｅ２Ｆ−１を活性化するおよび／またはＴＡｐ７３を上方調節するシグナルを提供することができる。ＦＯＸＯファミリーの転写因子は、アポトーシスに関与する多数の遺伝子の発現を調節し、酸化ストレスの増大により活性化することが可能である。ＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａは、Ｅ２Ｆ−１の転写標的であり、ＲＯＳ誘導アポトーシスに不可欠であることが示されているとともに、造血細胞におけるＢＩＭ発現の転写因子でもある。さらに、個々のアポトーシス刺激時に、ＲＯＳ捕捉剤は、ＦＯＸＯ３ａおよびＢＩＭの誘導を阻止する。ＦＯＸＯ１ａとＢＩＭ両方の発現ならびにその後のアポトーシスはｐ５３が欠損した腫瘍性細胞中のｐ７３により調節されると言われている。フォロデシンによる処置の後、タンパク質およびｍＲＮＡは、ｐ５３状態に依存しないｐ７３およびＢＩＭの上方調節を示すとともに、ＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａレベルの上昇が初期において検出された。ＦＯＸＯ調節された標的遺伝子の発現は、いずれかのＦＯＸＯメンバーにより制御可能であるが、これは、ＦＯＸＯ１ＡおよびＦＯＸＯ３Ａにより行われるＢＩＭの転写調節により示されるように、作用機序が重複していることを示唆している。
【００６８】
よって、本明細書に記載の結果は、ｐ５３状態に依存しないＣＬＬ細胞においてフォロデシンにより誘導される細胞死に関与する機序を証明し、異なるプログラム細胞死経路が同じ細胞内で共存し、様々な刺激により選択的に誘導され得ることを明らかにする。
【００６９】
これらの結果は、フォロデシンが単剤でまたはベンダムスチンもしくはリツキシマブと組み合わせることによりＣＬＬの処置において非常に効果的となることを示す。それゆえ、例えば、低毒性プロフィールの経口および静注製剤で利用可能なフォロデシンは、不良予後（ｐｏｏｐ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）（例えば、１７ｐ−）の患者、難病患者の処置選択肢および／または高齢患者の処置選択肢である。再発性ＣＬＬ患者におけるフォロデシンの多施設非盲検第１相臨床試験が開始されている。
【００７０】
Ａ．血液学的な癌を処置する方法
本明細書では、被験体の血液学的な癌、例えば、血液癌を処置する方法を提供する。この種の癌の例としては、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記血液学的な癌はＣＬＬである。他の実施形態では、上記血液学的な癌はＡＬＬである。
【００７１】
被験体としては、哺乳動物および非哺乳動物の両方を挙げることができる。哺乳動物には、例えば、ヒト；非ヒト霊長類、例えば、類人猿およびサル；ウシ；ウマ；ヒツジ；ラット；マウス；ブタ；およびヤギが含まれる。非哺乳動物には、例えば、魚類および鳥類が含まれる。
【００７２】
１つの実施形態では、上記方法は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を上記被験体に投与する工程を含む。特定の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤を投与する。他の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を投与する。さらに他の実施形態では、ＰＮＰ阻害剤は、１つ以上の化学療法剤（例えば、ベンダムスチンまたはフルアラビン（Ｆｌｕａｒａｂｉｎｅ））に耐性を持つ被験体を同定した後に投与する。さらなる実施形態では、ＰＮＰ阻害剤は、被験体のｐ５３欠失を検出した後に投与する。
【００７３】
理論に束縛されるものではないが、ＰＮＰ阻害剤は、血漿２’−デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）の上昇および細胞内デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）の蓄積を誘導し、細胞死を誘導することができる。ＰＮＰ阻害剤の非限定的な例としては、ＢｉｏＣｒｙｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第４，９８５，４３３号；同第４，９８５，４３４号、同第５，００８，２６５号；同第５，００８，２７０号；同第５，５６５，４６３号および同第５，７２１，２４０号に開示されるものが挙げられるが、こけらの開示内容を本明細書において参考として援用する。特定の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤は、フォロデシンまたはその塩であり、下記のＨＣｌ塩を含む。
【００７４】
【化１】
理論に束縛されるものではないが、アルキル化剤は、ＤＮＡを化学修飾するとともに、その機能を妨げる化学療法化合物を指す。アルキル化剤には、二本鎖ＤＮＡ分子の同じ鎖または相補鎖上のヌクレオチド間に架橋形成をさせるものがある一方で、他には、ＤＮＡ鎖間に塩基対ミスマッチを生じさせるものもある。アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、またはイミダゾールカルボキサミド化合物とすることができる。アルキル化剤の例としては、ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパ、およびトリエチレンメラミンが挙げられる。場合によっては、上記アルキル化剤は、ベンダムスチンまたはその塩とすることができ、下記のＨＣｌ塩を含む。
【００７５】
【化２】
抗ＣＤ２０剤は、Ｂリンパ球細胞表面タンパク質ＣＤ２０を標的とする（例えば、選択的に結合する）任意の薬剤とすることができる。いくつかの実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はＣＤ２０に特異的な抗体である。理論に束縛されるものではないが、これらの薬剤は、以下の３つの機序のうちの１つにより作用することができると考えられる：（１）補体媒介細胞毒性；（２）抗体依存性細胞媒介細胞毒性；および（３）アポトーシスの誘導。抗ＣＤ２０剤の例としては、リツキシマブ、イブリツモマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、およびアレムツズマブが挙げられる。いくつかの実施形態では、上記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【００７６】
上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、任意の経路（例えば、術中、くも膜下、椎間板内、椎間板周囲（ｐｅｒｉｄｉｓｋａｌ）、硬膜外（歯周（ｐｅｒｉｒａｄｉｃｕｌａｒ）および大後頭孔（ｔｒａｎｓｆｏｒａｍｉｎａｌ）を含む）、椎間板内、硬膜外、および硬膜周の任意の組み合わせ、脊髄周（ｐｅｒｉｓｐｉｎａｌ）、ＩＶ、筋内、ＳＣ、経口、鼻腔内、吸入、経皮、および非経口）より投与することができる。
【００７７】
上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、選択投与経路および標準的な薬務に基づいて選択される薬剤として許容される担体を用いて調合することができる。上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、医薬品分野の標準的技法に応じた投与剤型に調合してもよい。Ａｌｐｈｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい。適切な投与剤型には、例えば、錠剤、カプセル、液剤、非経口液剤、トローチ、座薬、または懸濁剤が含まれ得る。
【００７８】
非経口投与については、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、水、油（特に、植物油）、エタノール、生理食塩溶液、水性デキストロース（グルコース）および関連糖溶液、グリセロール、またはプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコール等の適切な担体または希釈剤と混合してもよい。非経口投与液剤は、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤の水溶性塩を含有することが好ましい。また、安定剤、抗酸化剤および防腐剤を添加してもよい。適切な抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、クエン酸およびその塩、ならびにＥＤＴＡナトリウムが挙げられる。適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルもしくはプロピルパラベン、およびクロルブタノール（ｃｈｌｏｒｂｕｔａｎｏｌ）が挙げられる。上記非経口投与組成物は、水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液、または乳剤の形態であってもよい。
【００７９】
経口投与については、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、または他の適切な経口与剤型（ｏｒａｌ ａｇｅ ｆｏｒｍｓ）の調製のための１つ以上の固体非活性成分と組み合わせてもよい。例えば、上記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤は、充填剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤吸収剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ａｂｓｏｒｂｅｎｔｓ）または潤滑剤等、少なくとも１つの賦形剤と組み合わせてもよい。
【００８０】
ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および／または抗ＣＤ２０剤の具体的な用量は、当然ながら、個々の患者の体格、体重、年齢および性別を含む当該患者の特定の状況、処置する疾患の性質および段階、疾患障害の悪性度、ならびに上記化合物の投与経路により決定される。化合物、例えば、フォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブの用量および投与期間については、例えば、ＦＤＡに認可されたラベルに示される用量および投与期間に従って、単独投与または併用投与を行うようにしてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は同時投与されるが、他の実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は連続投与される。１つの実施形態では、上記アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤は、ＰＮＰ阻害剤の投与前（例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、または２０時間）に１回以上投与することができる。さらなる実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤は、アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤の投与前（例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、または２０時間）に１回以上投与してもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、被験体の血液学的な癌の処置は、１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体を同定する工程を含む。癌処置における失敗の主因の１つは、癌細胞による薬物耐性の発現である。これは疾患の再発、さらには死に繋がり得る非常に深刻な問題である。１つの実施形態では、上記１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体は、当該分野で公知の手段により同定することができる。上記被験体は、任意の公知の化学療法剤に耐性を持つものであってもよい。特定の実施形態では、上記被験体は、アルキル化剤（例えば、ベンダムスチン）および／またはプリンヌクレオシド類似体（例えば、フルラダジン（Ｆｌｕｒａｄａｄｉｎｅ））に耐性を持つものとすることができる。
【００８３】
化学療法に耐性を持つ被験体の同定に続いて、上記被験体にＰＮＰ阻害剤の投与を行うようにすることができる。いくつかの実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンＨＣｌである。
【００８４】
他の実施形態では、被験体の血液学的な癌の処置は、当該被験体由来の試料中の１つ以上の癌細胞におけるｐ５３欠失、例えば、１７ｐ欠失の存在の検出を含むことができる。１７ｐ欠失は、異なる生物学的および臨床的挙動を示し得る血液学的な癌被験体を同定可能なマーカーである。例えば、ｐ５３変異は、薬物耐性および短い生存期間を伝えることができる。
【００８５】
１つの実施形態では、ｐ５３欠失を示す被験体は、ＰＮＰ阻害剤の投与が行われるようにすることができる。選択される実施形態では、上記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンＨＣｌである。
【００８６】
上述した処置法は、単剤療法および併用療法の両方を伴う。併用療法の文脈では、上記開示は、２つ以上の化学療法剤、特に、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤の投与を想定している。これらの化合物のいくつかは、１つ以上の癌兆候の処置における使用についてすでに認可されている。他のものは前臨床および臨床開発の様々な段階にある。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤の投与により相乗効果を生み出すことができる。この効果は、併用指数（ＣＩ）の展開により示すことができる。特定の実施形態では、当該指数は、Ｃｈｏｕら、Ａｄｖａｎｃｅ Ｅｎｚ．Ｒｅｇｕｌ．，２２、２７−５５（１９８５）の手順に従って、病的細胞部分の関数として算出することができる。これは、様々な細胞死の割合に対する係数相互作用を評価する周知の検定である。例えば、薬物Ａを用いた処置の結果、細胞死が３０％であり、薬物Ｂを用いた処置の結果、細胞死が５０％であった場合、それら２つの薬物を併用した結果、細胞死は６５％となることが予想される。従って、予想細胞死と薬物併用時に実際に測定したものとの比率が１未満であれば、相乗効果が観察される。しかしながら、その比率が１を超える場合には、拮抗作用が観察される。１つの実施形態では、フォロデシンおよびベンダムスチンの併用は相乗効果を示すが、フォロデシンおよびフルダラビンの併用は拮抗作用を示す（実施例５参照）。
【００８８】
Ｂ．医薬組成物
本明細書では、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＮＰ阻害剤は、フォロデシン（ＢＣＸ−１７７７）を含むことができる。特定の実施形態では、アルキル化剤は、ベンダムスチンを含むことができる。他の実施形態では、抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである。
【００８９】
本明細書で提供する医薬組成物は、血液学的な癌の処置に有効な量のＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤ならびに薬剤として許容される担体を含有する。本明細書で提供する化合物の投与に適した医薬担体は、特定の投与方式に適した、当業者に公知の任意の担体を含む。
【００９０】
それらの組成物は、１つの実施形態では、経口投与用の液剤、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤もしくはエリキシル剤または非経口投与用の滅菌液もしくは懸濁剤等の医薬品、ならびに経皮貼布製剤および乾燥粉末吸入剤に調合することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８５，１２６参照）。
【００９１】
上記医薬組成物中のＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤の濃度は、上記化合物の吸収、不活性化および排泄速度、上記化合物の物理化学的特性、投与計画、および投与量、ならびに当業者に公知の他の要因に依存する。例えば、送達量は、本明細書に記載するように、慢性リンパ性白血病を処置するのに十分な量である。
【００９２】
上記医薬組成物は一度に投与してもよく、あるいは、より少量の用量にわけて時間をあけて投与してもよい。正確な投与量および処置期間は処置する疾患に応じ、公知の試験プロトコルを用いるかまたはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ試験データからの外挿により経験的に決定してもよいことは言うまでもない。濃度および投与量の値はまた、緩和すべき病状の重篤度によって変更してもよいことに留意されたい。さらに、いずれの特定の被験体についても、具体的な投与量レジメンは、個々の必要性および上記組成物を投与するかまたは投与を監督する人の専門的判断に従って時間の経過とともに調整する必要があり、本明細書で示す濃度範囲は例示のみであり、請求の範囲に記載の組成物の範囲または実施を制限するものではないことは言うまでもない。
【００９３】
上記医薬組成物は、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、滅菌非経口液剤もしくは懸濁剤、および経口液剤もしくは懸濁剤、ならびに上記化合物もしくはその薬剤として許容される誘導体を適量含有する油−水乳剤等の単回投与剤型でヒトおよび動物に投与するために提供される。薬学的に治療効果がある化合物およびその誘導体は、１つの実施形態では、単回投与剤型または複数回投与剤型で調合および投与される。本明細書で用いる単位用量形態とは、ヒトおよび動物被験体に適した物理的に個別の単位であり、当該分野で公知のように個別に包装されるものを指す。各単位用量は、上記治療効果がある化合物を、必要な医薬担体、ビヒクル、または希釈剤とともに所望の治療効果を生じるのに十分な所定量含有する。単位用量形態の例としては。アンプルおよび注射器ならびに個別に包装した錠剤もしくはカプセルが挙げられる。単位用量形態は、分割するかまたはその何倍かの量で投与してもよい。複数回投与剤型は、分離した単位用量形態で投与するための単一の容器に、同一の単回投与剤型複数回分を包装したものである。複数回投与剤型の例としては、バイアル、数ボトルの錠剤もしくはカプセル、または数パイントもしくはガロンのボトルが挙げられる。よって、複数回投与剤型は、分離することなく包装された複数回の単位用量である。
【００９４】
液剤として投与可能な組成物は、例えば、上記で定義したような活性化合物および任意の医薬アジュバントを、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノール等の担体中で溶解、分散、または他の方法で混合することにより、溶液または懸濁液を生成して調製することができる。所望であれば、上記の投与すべき医薬組成物はまた、例えば、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような薬剤等、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤等の非毒性補助物質を少量含有してもよい。
【００９５】
そのような投与剤型を実際に調製する方法は当業者には公知であるか明白である；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５を参照されたい。
【００９６】
０．００５％〜１００％の範囲のＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含有し、残部が非毒性担体からなる投与剤型または組成物を調製してもよい。これらの組成物の調製方法は、当業者には公知である。企図される組成物は、０．００１％〜１００％の活性成分を含有し、１つの実施形態では、０．１〜９５％、他の実施形態では、７５〜８５％であってもよい。
【００９７】
Ｃ．キット
本明細書ではまた、キットも提供する。典型的には、キットは、ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤またはＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含む。特定の実施形態では、キットは、例えば、ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、抗ＣＤ２０、またはそれらの任意の組み合わせに対する１つ以上の送達システム、および当該キットの使用説明書（例えば、被験体を処置するための使用説明書）を含むことができる。特定の実施形態では、キットは、上記ＰＮＰ阻害剤および／または上記アルキル化剤を含むことができる。他の実施形態では、キットは、上記ＰＮＰ阻害剤および／または上記抗ＣＤ２０剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、上記キットは、ＰＮＰ阻害剤と、内容物がベンダムスチン等のアルキル化剤に耐性を持つ被験体に投与されるべきものであることを示すラベルとを含むことができる。他の実施形態では、上記キットは、ＰＮＰ阻害剤と、内容物がｐ５３欠失（例えば、１７ｐ欠失）を有する被験体に投与されるべきものであることを示すラベルとを含むことができる。さらなる実施形態では、キットは、ＰＮＰ阻害剤と、内容物がアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤とともに投与されるべきものであることを示すラベルとを含むことができる。
【００９８】
Ｄ．定義
本明細書で用いる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明示されない限り、複数のものも対象とする。
【００９９】
「有効量」という表現は、方法において化合物の量を説明するために用いた場合、所望の薬理効果または他の効果を達成する化合物の量、例えば、癌細胞の異常成長もしくは増殖を阻害するかまたは癌細胞のアポトーシスを誘導し、有用な効果をもたらす量を指す。
【０１００】
「処置する」および「処置」という用語は、症状の改善、さらなる症状の予防、症状の根本的な代謝に関する原因の改善もしくは予防、障害のさらなる発現の遅延もしくは予防ならびに／または進行するかもしくは進行が予想される症状の重篤度の低減等、治療に有益な効果を生じることを意味する。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：ＣＬＬ中のフォロデシン細胞毒性 − ＺＡＰ−７０高対ＺＡＰ−７０低
ＺＡＰ−７０が高レベル（＞２０％）の１６人のＣＬＬ患者由来の細胞およびＺＡＰ−７０が低レベル（＜２０％）の１３人のＣＬＬ患者由来の細胞を、２μＭのフォロデシンと２０μＭのｄＧｕｏを用いて４８時間かけて処理した。細胞毒性をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ染色により分析した（コントロールである未処理細胞のパーセンテージで表現）。その結果、平均細胞毒性が、高レベルおよび低レベルのＺＡＰ−７０の両方について５０％を超えることが示された（図１Ａおよび図１Ｂ参照）。
【０１０２】
実施例２：細胞内におけるｄＧＴＰレベルの上昇
２６人のＣＬＬ患者由来の細胞をフォロデシンを用いて２０時間かけて処理した。全ヌクレオチドを抽出し（６０％メタノール）、ｄＧＴＰレベルをＤＮＡポリメラーゼアッセイにより定量化した。コントロール（未処理細胞）と比較した細胞の生存をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ染色により４８時間かけて分析した。フォロデシン処置後の細胞内におけるｄＧＴＰレベルの上昇は、誘導された細胞死と良好な相関性を有する（図２参照）。
【０１０３】
実施例３：フォロデシンに対するｐ５３欠失ＣＬＬ症例の反応
１７ｐ欠失を有する１１人のＣＬＬ患者由来の細胞（ｇ≧細胞の８５％、ＦＩＳＨ分析）を２μＭのフォロデシンおよび２０μＭのｄＧｕｏと、２５μＭのベンダムスチンまたは１μｇ／ｍＬのフルダラビンを用いて４８時間かけて処理した。その結果、ｐ５３欠失ＣＬＬ症例がフォロデシンに対して高い反応を示すことが分かった（図３参照）。
【０１０４】
実施例４：化学療法耐性を有するＣＬＬ症例に対するフォロデシンの効果
ベンダムスチンまたはフルダラビンに対する感受性が低いか全くないことが分かっているＣＬＬ患者由来の細胞を２μＭのフォロデシンと２０μＭのｄＧｕｏ１０を用いて処理した。その結果、これらの細胞はフォロデシン処置に対して良好な反応を示すことが分かった（図４参照）。
【０１０５】
実施例５：フォロデシン／ベンダムスチンおよびフォロデシン／フルダラビンの併用効果
ＣＬＬ患者由来の細胞を、２μＭのフォロデシンおよび１０〜２０μＭのｄＧｕｏと、１０〜２５μＭのベンダムスチンまたは３．７５〜７．５μＭのフルダラビンとを用いて４８時間かけて処理した。併用指数（ＣＩ）を４８時間後に分析した。１未満のＣＩ値は相乗効果を示し（ＣｈｏｕｒとＴａｌａｌａｙのアルゴリズム）、１を超えるＣＩ値は拮抗作用を示す。その結果、フォロデシン／ベンダムスチンは相乗効果を有し、フォロデシン／フルダラビンは拮抗作用を有することが分かった（図５Ａおよび図５Ｂ参照）。
【０１０６】
実施例６：フォロデシン／リツキシマブの併用効果
７人のＣＬＬ患者（ＺＡＰ−７０レベル高（＞３５％）３人およびｐ５３欠失４人）由来の細胞を、２μＭのフォロデシンＨＣｌおよび１０〜２０μＭのｄＧｕｏと、２５〜５０μＭのリツキシマブとを用いて２４〜４８時間かけて処理した。併用指数（ＣＩ）を４８時間後に分析した。それらの細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ染色およびＰＩ透過性アッセイを用いてフローサイトメトリーにより分析した。１未満のＣＩ値は相乗効果を示し（ＣｈｏｕｒとＴａｌａｌａｙのアルゴリズム）、１を超えるＣＩ値は拮抗作用を示す。その結果、フォロデシン／リツキシマブの併用は相乗効果を有することが分かった（図６参照）。
【０１０７】
実施例７：フォロデシンはｐ５３非依存性ミトコンドリアアポトーシスを誘導する
本明細書に記載するように、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤であるフォロデシンは、慢性リンパ性白血病細胞において、Ｍｃｌ−１の下方調節ならびにｐ７３およびＢｉｍの誘導により、ｐ５３非依存性ミトコンドリアアポトーシスを誘導する。
【０１０８】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、アポトーシスが異常調節され、増殖速度が低い長寿命ＣＤ５＋Ｂリンパ球のモノクローナル増殖由来の臨床不均質体（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｅｎｔｉｔｙ）である。近年において進歩は見られるが、この新規なＣＬＬ処置法では、患者の全生存率は依然として改善されておらず、多数の患者は最終的には薬物耐性を生じる。免疫グロブリン遺伝子の突然変異がないプロフィール、ＺＡＰ−７０タンパク質の高度発現、高度ＣＤ３８発現、および特定の細胞遺伝学的異常の存在（特に、１７ｐ１３（ＴＰ５３）および１１ｑ２２−ｑ２３（ＡＴＭ）の欠失）は、ＣＬＬ患者の全生存率の低さおよび疾患進行までの時間の短さと関係がある。化学療法抗癌剤は、通常、ＤＮＡ損傷反応とｐ５３活性化を介して、および／またはミトコンドリア機能の摂動を直接介してアポトーシスを誘導する。ＤＮＡ損傷反応経路は、ＣＬＬ薬物誘導アポトーシスにおいて重要な役割を果たしていると考えられるが、これは、ＴＰ５３異常を有するＣＬＬ患者由来の細胞は、従来の化学療法に耐性を示すとともに生存期間が短いためである。ｐ５３の欠失および残りの対立遺伝子の突然変異によるｐ５３機能の喪失は、化学療法が効果がないＣＬＬ患者を増加させ、ｐ５３の転写およびミトコンドリアアポトーシス活性を無効にする薬物耐性獲得中に「二重の打撃」を与えている。それゆえ、新規な効果的アプローチにより、ＤＮＡ損傷非依存性経路および／またはｐ５３に依存しないアポトーシス経路の直接的活性化によりアポトーシスを誘導する必要がある。
【０１０９】
ＣＬＬ細胞の特徴は、それらのアポトーシス誘導に対する耐性であり、ＣＬＬ細胞におけるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の重要なアポトーシスおよび生存調節因子である。高レベルの抗アポトーシスＢｃｌ−２およびＭｃｌ−１タンパク質は、ＣＬＬにおける侵攻性疾患および化学療法に対する耐性と関係がある。ＭＣＬ−１はまた、ＣＬＬ細胞の生存期間の延長において重要な役割を有するが、これは、ＭＣＬ−１レベルがいくつかの薬物に対するｉｎ ｖｉｔｒｏおよび臨床反応と逆相関するためである。
【０１１０】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）は、プリン類似体をそれぞれ塩基およびデオキシリボースリン酸にリン酸化するプリンサルベージ経路中の酵素である。フォロデシン、すなわち、イムシリンＨ（ＢＣＸ−１７７７）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞増殖の阻害を示した強力な遷移状態類似体ＰＮＰ阻害剤である（Ｂａｎｔｉａら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，１（６），１１９９−２１０（２００１）；Ｋｉｃｓｋａら、ＰＮＡＳ，９８（８），４５９３−４５９８（２００１）；Ｂａｎｔｉａら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，３（６），８７９−８８７（２００３）；およびＧａｎｄｈｉら、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３４（６ Ｓｕｐｐｌ ５），Ｓ８−１２（２００７））。フォロデシンは、低い毒性プロフィールを示しており（Ｇａｎｄｈｉら、Ｂｌｏｏｄ，１０６（１３），４２５３−４２６０（２００５）；およびＫｏｒｙｃｋａら、Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，７（９），９７６−９８３（２００７））、Ｔ細胞前リンパ性白血病、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫およびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病患者の臨床試験において研究されている（Ｇａｌｍａｒｉｎｉら、ＩＤｒｕｇｓ，９（１０），７１２−７２２（２００６））。また、フォロデシンは、ＣＬＬ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を発揮すると考えられる（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｂｌｏｏｄ，１０８（７），２３９２−２３９８（２００６））。ＰＮＰ阻害の結果、血漿２’デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）レベルが上昇した後、デオキシヌクレオシドキナーゼ活性が高レベルの細胞においてデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）が細胞内蓄積し、Ｔリンパ球においてアポトーシスが誘導される。ＣＬＬ細胞は、ｄＧｕｏをｄＧＭＰに転換する主要酵素である高い（ｄＣＫ）活性を有し、ＰＮＰ阻害を受け易いＣＬＬ細胞であるｄＧＭＰはその後ｄＧＴＰに転換される。フルダラビンまたはベンダムスチン等の他のプリンヌクレオシド類似体と異なり、フォロデシンはＤＮＡ内に取り込まれることはなく、新規で、十分には解明されていない作用機序を有する典型的な新種の選択的抗腫瘍剤である。
【０１１１】
本明細書に記載するように、４３人のＣＬＬ患者由来の一次白血病細胞におけるフォロデシンの細胞毒性効果を、フォロデシンと、臨床診療で用いるフルダラビン、ベンダムスチン、およびリツキシマブ等の薬物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの併用とともに評価した。これらの結果に基づいて、フォロデシンは、ＺＡＰ−７０、ＣＤ３８、ｐ５３の状態または細胞遺伝学的異常に依存しないＣＬＬ患者の処置において非常に効果的な療法であると考えられる。さらに、フォロデシンは、Ｍｃｌ−１タンパク質のレベルならびにｐ７３およびアポトーシス促進Ｂｉｍタンパク質の誘導を低下させることによりミトコンドリアアポトーシス経路の活性化を誘導すると考えられる。興味深いことに、これらのアポトーシスマーカーにはｐ５３の状態に基づく有意な差は観察されなかったが、これは、アポトーシス経路が共通してｐ５３媒介細胞死に依存しないことを示唆している。
【０１１２】
ＺＡＰ−７０、ＣＤ３８および細胞遺伝学的状態に依存しないＣＬＬ患者由来の一次細胞におけるフォロデシン誘導アポトーシス
用量漸増研究を行ってＣＬＬ患者由来の一次白血病リンパ球におけるｉｎ ｖｉｔｒｏフォロデシン細胞毒性を評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性効果を得るために、外部ｄＧｕｏ源をフォロデシンとともに加えた。ｄＧｕｏの用量を増加させながら（１０〜２０または３０μＭ）、薬理学的に達成可能なレベルのフォロデシン（２−５−１０μＭ）を用いて４８時間かけてＣＬＬ細胞のインキュベーションを行うことにより細胞死を誘導したが（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ＋染色により分析）、フォロデシンまたはｄＧｕｏ単独では細胞毒性効果は誘導されなかった。より高い用量のフォロデシン（最大で１５μＭまで）を用いても細胞死に関しては差は観察されなかった。逆に、ｄＧｕｏの用量を増加することにより細胞死がより多く誘導されたため、その後の研究は単一用量のフォロデシン（２μＭ）を１０または２０μＭのｄＧｕｏとともに用いて行った。
【０１１３】
次に、フォロデシンおよびｄＧｕｏの細胞毒性効果を４３人のＣＬＬ患者由来の一次白血病細胞において分析した。４４．２％±１１．４および５７．４％±１３．１のコントロールに対する平均細胞毒性をそれぞれ２４時間、および４８時間観察した。細胞毒性効果は、２１の症例（全体の４８．８％）において６０％よりも高く、１８の症例（全体の４１．８％）において４０〜６０％の間であり、４０％よりも低かったのは僅か４つの症例（全体の９．４％）のみであった。細胞死に関しては、凍結保存一次ＣＬＬ試料（ｎ＝３２、５８．３％±１１、４８時間）とＣＬＬ生試料（ｎ＝１０、５６．６％±６．４、４８時間）の使用での差は観察されなかった。健康なドナー由来のＰＢＭＣ中における２μＭのフォロデシンとｄＧｕｏ（１０〜２０μＭ）の細胞毒性は、ＣＬＬ細胞と比較して、Ｔリンパ球（ＣＤ３＋細胞）とＢリンパ球（ＣＤ１９＋細胞）の両方において相対的に低かった。
【０１１４】
ＣＬＬ患者では、ＺＡＰ−７０および／またはＣＤ３８タンパク質の発現レベルは、全生存率の低さおよび疾患進行までの時間の短縮と関係がある（Ｈｕｓら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ，１７（４），６８３−６９０（２００６））。ＺＡＰ−７０レベルが低いＣＬＬ細胞においてフォロデシンにより誘導される細胞死（１７人のＣＬＬ患者；コントロールに対する平均細胞毒性５８．１％±１１）と高レベルのＺＡＰ−７０を発現するＣＬＬ細胞（２２人のＣＬＬ患者；平均細胞毒性５７．９％±１２）との間には有意な差は観察されず、また、ＣＤ３８発現レベルに関しても同様であった（平均細胞毒性：ＣＤ３８（低）、５２．３％±１２対ＣＤ３８（高）、６２．１％±１２）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ薬物耐性およびＣＬＬ患者の短期間生存と関係がある１３ｑ欠失、１１ｑ欠失および１７ｐ欠失等のＣＬＬ細胞における最も一般的な細胞遺伝学的変異は、フォロデシン誘導細胞毒性とは相関性を有さなかったが、これらの症例では良好な反応が見られた。
【０１１５】
ＣＬＬで用いられる２つの主要な化学療法剤であるフォロデシンとフルダラビンまたはベンダムスチンの細胞毒性を用いて処置したＣＬＬ細胞の細胞毒性反応についても比較した（Ａｉｖａｄｏら、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２９，（４ Ｓｕｐｐｌ １３），１９−２２（２００２）；およびＭｏｎｔｓｅｒｒａｔ，Ｈｅｍａｔｏｌ Ｊ，５，Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ２−Ｓ９（２００４））。３２人のＣＬＬ患者（そのうち１１人がｐ５３欠失を有する）由来の一次ＣＬＬ細胞を、２μＭのフォロデシン、２０μＭのｄＧｕｏ、１０〜２５μＭのベンダムスチンおよび１μｇ／ｍｌのフルダラビンを単独でまたは組み合わせて用いて４８時間かけてインキュベートした。単剤としては、１７ｐ欠失を有さないＣＬＬにおける平均細胞毒性は、フォロデシン、フルダラビンおよびベンダムスチンについてそれぞれ５５．３±８、５０．６±１１および４９．２±１８であった。ｐ５３変異を生じる１７ｐ欠失の獲得は、ＣＬＬ患者のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏフルダラビン耐性と関係がある（Ｄｏｈｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，８５（６），１５８０−１５８９（１９９５）；およびＴｕｒｇｕｔら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，４８（２），３１１−３２０（２００７））。注目すべきは、１７ｐ欠失を有する大半のＣＬＬ患者は、フォロデシンに対して高い反応を示したことであり、４８時間における平均細胞毒性は６０．１％±２１であった（２μＭのフォロデシンおよび２０μＭのｄＧｕｏ）。対照的に、これらの症例は、フルダラビン（平均細胞毒性２５．１±１３）およびベンダムスチン（平均細胞毒性３６．２％±１７）に対して低い反応を示した。さらに、分析した３２人のＣＬＬ患者試料のうち１２人については、２５μＭのベンダムスチンおよび／または１μｇ／ｍｌのフルダラビンに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ反応が観察されなかったかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ反応が低かったが（コントロールに対して３５％未満の細胞毒性）、フォロデシンに対しては高い反応を示した。ベンダムスチンまたはフルダラビンに対する反応が低いまたは非常に低い１７ｐ欠失を有する３つの症例は、フォロデシンに対して高い反応を示し（平均細胞毒性６７％±２０）、フォロデシンに対して低い反応を示したのはわずかに２人のＣＬＬ患者のみであった。
【０１１６】
フォロデシンとフルダラビン、ベンダムスチン、およびリツキシマブの併用
処置のためのフルダラビンとフォロデシンの併用を評価した。フォロデシンとベンダムスチン、アルキル化剤およびプリン様類似体の併用についても評価した。２μＭのフォロデシンおよびｄＧｕｏ（１０〜２０μＭ）とフルダラビン（０．５〜１μｇ／ｍｌ）の併用は、いずれの単剤薬物の細胞毒性効果も増大することなく、細胞死誘導に悪影響が観察された。両方の薬物の併用効果を評価するために、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙのアルゴリズム（Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ，２２，２７−５５（１９８４））を２つの異なる薬物の併用についての拮抗作用または相乗効果の指示マーカーとして用いて、併用指数、すなわち、ＣＩ値を算出した。簡潔に言えば、１を超えるＣＩ値は拮抗作用を示し、１未満のＣＩ値は相乗効果を示す。フルダラビンおよびフォロデシンを用いた併用に関する研究は、分析（４８時間）した全てのＣＬＬ症例において１を超えるＣＩ値を示したが、これは、両方の薬物間の拮抗作用を示す。フォロデシンおよびフルダラビンを併用して得られた平均細胞毒性は、両方の薬物によるものよりも低かった。フォロデシンはまた、ベンダムスチンに対する反応が低いＣＬＬ症例においても効果的であったが、対照的に、フルダラビンに対しては、ベンダムスチンとフォロデシンの併用において細胞死の著しい増加が観察され、強力な相乗効果（ＣＩ＜１）が観察された。フロデシン（Ｆｒｏｄｅｓｉｎｅ）は、低用量のベンダムスチン（１０μＭ、平均細胞毒性３２．９５％）の細胞毒性反応を明確に向上させ、両方の薬物の併用について７０．５％の平均細胞毒性効果を達成する。
【０１１７】
フォロデシンとリツキシマブ（ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体）の併用についても評価した。２４時間では、リツキシマブ単剤（２５〜５０μｇ／ｍｌ）で観察された細胞死は少なく、フォロデシンとの併用では、両方の薬物の細胞毒性効果は明確に改善された。リツキシマブとフォロデシンの強力な相乗効果も示され、ＣＩ値は０．５付近であった。
【０１１８】
細胞内ｄＧＴＰレベルの上昇およびＳｅｒ−７４におけるｄＣＫリン酸化反応とフォロデシン誘導細胞死との相関性
２μＭのフォロデシンおよび１０μＭのｄＧｕｏで処置した２６人のＣＬＬ患者由来の一次細胞におけるｄＧＴＰの細胞内レベルを分析した。１８時間で分析したｄＧＴＰレベルの倍増と４８時間におけるフォロデシン細胞毒性の有意な直接的相関性（ｐ＜０．０５）を観察した。フォロデシンは、細胞内ｄＧＴＰレベルの高い上昇を誘導した（コントロールの基準レベルに対して最大で９６倍まで上昇し、細胞１兆個につきｄＧＴＰが６〜１２９ｐｍｏｌｅの間の値に達した）。４つのＣＬＬ症例では、ｄＧＴＰレベルの上昇がないかまたは低く、これらの症例で観察されたフォロデシンに対する細胞毒性反応は低かった。フォロデシン処置後のｄＧＴＰレベルの上昇がｄＣＫによるｄＧｕｏのリン酸化反応により媒介されることを確認するために、デオキシシチジンの存在下における細胞死誘導を分析した。デオキシシチジンはｄＣＫの一次基質であるため、ｄＣＫによるｄＧｕｏのリン酸化反応を阻害し、細胞内におけるｄＧＴＰの上昇およびフォロデシンにより誘導されるその後のアポトーシスに影響を与える。デオキシシチジン（５〜１０μＭ）を用いた細胞のプレインキュベーションによりフォロデシン誘導細胞死が阻害された。抗癌化学療法に用いたヌクレオシド類似体、特に、プリン類似体のフルダラビンおよびデオキシシチジン類似体のゲムシタビンは、活性化のためにｄＣＫによりリン酸化されるものがある。デオキシシチジンまたは、フルダラビンにより誘導される細胞生存の損失は回復するが、ベンダムスチン（ｄＣＫに依存せずに作用し得る薬物）により誘導される細胞死については不可逆的であった。
【０１１９】
ｄＣＫのリン酸化反応状態をフォロデシン処置時にウエスタンブロット法により分析したが、最近では、ＣＬＬ細胞においては、ｄＣＫ活性がＳｅｒ−７４においてリン酸化反応により正に調節されると言われている（Ｓｍａｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８１（８），４８８７−４８９３（２００６）；Ｓｍａｌら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２５（９−１１），１１４１−１１４６（２００６）；Ｓｍａｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２５３（１），６８−７３（２００７））。ＣＬＬ細胞中のｄＣＫの（Ｓｅｒ−７４における）リン酸化体の増加を観察したところ、増加はベンダムスチンによるものではなかった。フォロデシン処置後にホスホ−ｄＣＫ／ｄＣＫ比の濃度分析を行い、細胞毒性との相関性を２４時間（ｐ＝０．０５、補足データ）および４８時間（ｐ＝０．０５）の両方において観察した。
【０１２０】
フルダラビンとフォロデシン間で観察された拮抗作用を調べるために、ＣＬＬ細胞をフルダラビン（１μｇ／ｍｌ）およびフォロデシン（２μＭおよびｄＧｕｏ、１０μＭ）でインキュベートした後の細胞内ｄＧＴＰの上昇を観察した。フルダラビン単独ではｄＧＴＰレベルの上昇を誘導しなかったが、フルダラビンとフォロデシンとを併用した場合（灰色の棒）、フォロデシン単独（黒色の棒）でもたらされたｄＧＴＰの倍増が低減した。それゆえ、フルダラビンとフォロデシンの併用について観察されたｄＧＴＰ上昇の低下は、両方の薬物間で観察された拮抗作用を説明する。フルダラビンは、活性化のためにｄＣＫによるリン酸化を必要とし、ｄＧｕｏもこの酵素によりリン酸化されるため、両方の薬物は同じ酵素を奪い合うことがあり、そのため、ｄＧＴＰの生成またはフルダラビンの活性型が低減する。
【０１２１】
ｐ５３に依存しないミトコンドリアアポトーシス経路のフォロデシン誘導による活性化
ＣＬＬ細胞においてフォロデシンがアポトーシスを誘導する作用機序を解明するために、ミトコンドリアアポトーシス経路のいくつかの特徴を分析した。フォロデシンは、早期において、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の損失を誘導した。活性酸素種（ＲＯＳ）は、ミトコンドリア損傷の後に産生することができるとともに、引き続いてアポトーシスを媒介し得る（Ｖｉｌｌａｍｏｒら、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ，１０（８），８４１−８５３（２００４））。フォロデシンはまた、ＣＬＬ一次細胞におけるＲＯＳの産生を誘導する。ミトコンドリア脱分極およびＲＯＳ産生が初期事象として観察されたが、それらはフォロデシンを用いた処置の１０時間後に顕著であった。酸化ストレスは、プログラム細胞死を調節する役割を果たすため、いくつかのＲＯＳ捕捉剤の効果を分析した。グルタチオン還元エチルエステル（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはタイロンを用いたＣＬＬ細胞のプレインキュベーションにより、フォロデシンにより誘導されるΔΨｍ損失およびＲＯＳ産生が低減した。ＮＡＣおよびタイロン（Ｏ２に特異的な捕捉剤）は、ＲＯＳ産生を事実上元に戻し、Ｈ２Ｏ２に選択的な捕捉剤であるＧＳＨの効果を抑えた。
【０１２２】
ＣＬＬ細胞に関する過去のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、フォロデシンがｐ５３の安定化およびアポトーシス誘導を生じることが報告されており（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｂｌｏｏｄ，１０８（７），２３９２−２３９８（２００６））、結果は、ＤＮＡ損傷およびｐ５３媒介アポトーシスを誘導する他の抗癌剤と一致している。しかし、他のプリンヌクレオシド類似体と異なり、フォロデシンはＤＮＡ内に取り込まれない。興味深いことに、分析したミトコンドリアアポトーシス経路の初期の特徴は、１７ｐ（ｐ５３）欠失または１１ｑ（ＡＴＭ）欠失を有するＣＬＬ患者でも観察されており、アポトーシス開始機序がＤＮＡ損傷ｐ５３媒介反応に依存しないことが示される。
【０１２３】
カスパーゼ−８により媒介されるミトコンドリアアポトーシス経路の増幅ループの役割を示唆するフォロデシンにより誘発される連続的なカスパーゼ−９および−８活性化ならびにＢＩＤの処理
ミトコンドリアアポトーシスを導く下流側シグナル伝達経路を調べるために、フォロデシン曝露後のカスパーゼ活性化パターンを調べた。カスパーゼ−９、−８および−３の用量および時間依存的な活性化を、それらの不活性型の処理により観察および分析した。プロカスパーゼ−９および−８の分解産物は、フォロデシン処置後１０時間程度の早期にほぼ同時に存在し、最初は、プロカスパーゼ−９のｐ３７切断型となり、その後に、カスパーゼ−８のｐ４３／４１切断型が増加した。プロカスパーゼ−３の分解およびその活性型の存在はその後に検出された。カスパーゼ−８の活性化との相関性において、フォロデシンはまた、カスパーゼ−８の主要基質であるＢＨ３オンリータンパク質ＢＩＤの減少を誘導し、分解アポトーシス促進型にして、ミトコンドリアアポトーシス経路を活性化する。アポトーシス誘導との相関性において、アポトーシス阻害剤ＸＩＡＰおよびスルビビンならびにカスパーゼ−３基質であるＰＡＲＰのタンパク質分解切断の減少も観察された。次に、ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化がカスパーゼ依存性だけでなく非依存性細胞死にも繋がるため、フォロデシン誘導アポトーシスのカスパーゼ活性化の役割を調べた。効能範囲が広いカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋを用いた細胞の処置では、フォロデシン処置後のホスパチジルセリン曝露（ｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）が２４時間かけて部分的に低減されたが、これは、カスパーゼ依存性および非依存性作用機序の両方の関連を示唆する。
【０１２４】
カスパーゼ−８／ＢＩＤの活性化は、フォロデシンが引き起こすアポトーシス誘導中に重要な役割を果たすか、またはカスパーゼ−９活性化による、すなわち、ミトコンドリアの下流側での二次的な事象となる場合がある。興味深いことに、ＡｎｎｅｘｉｎＶ染色で分析したアポトーシス誘導は、特定のカスパーゼ−８阻害剤ｚ−ＩＥＴＤ．ｆｍｋにより部分的に阻止されたが、観察されたΔΨｍ損失の復帰はより顕著であった。これらの結果をまとめると、カスパーゼ−８活性化およびＢＩＤはフォロデシンにより誘導されるミトコンドリアアポトーシス経路において初期増幅の役割を果たすことが示唆される。
【０１２５】
ミトコンドリア媒介細胞死のアポトーシス促進および抗アポトーシス調節因子の分析
ミトコンドリアアポトーシス経路は、特に、抗アポトーシスＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１タンパク質ならびにアポトーシス促進ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＤおよびＢＩＭタンパク質等のＢＣＬ−２ファミリータンパク質に属するアポトーシス促進メンバーおよび抗アポトーシスメンバー間の厳格な均衡により調節される。ＣＬＬ細胞は、化学療法に対するｉｎ ｖｉｔｒｏおよび臨床反応と逆相関する高レベルの抗アポトーシスタンパク質ＭＣＬ−１およびＢＣＬ−２を発現する。これらの抗アポトーシスタンパク質のレベルでのフォロデシンインキュベーションの効果を調べた。フォロデシン処置時に、抗アポトーシスＭＣＬ−１タンパク質のレベルは大幅に減少したが、ＢＣＬ−２タンパク質レベルには影響はなかった。ＢＨ３オンリータンパク質ＢＩＭは、ＢＣＬ−２および他の抗アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーと相互に作用し、アポトーシスを誘発する。フォロデシンは、アポトーシス促進ＢＩＭタンパク質レベルでのタンパク質レベルの上昇を誘導する。フォロデシンで処置した７つのＣＬＬ症例において、濃度分析によりＢＩＭおよびＭＣＬ−１タンパク質レベルの変化が確認された。アポトーシス促進ＢＩＭ ＥＬタンパク質レベルの上昇またはＭＣＬ−１レベルの低下と、ＭＣＬ−１の減少にとって有意（ｐ＝０．０４）なフォロデシンに対する細胞毒性反応の直接的相関性が観察された。さらに、フォロデシン処置後に観察された細胞毒性に対するＭＣＬ−１およびＢＩＭ ＥＬ誘導の減少の比を（コントロールに対して）プロットすると、有意な相関性（ｐ＝０．０４）が見られた。
【０１２６】
ＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１は、ミトコンドリア膜を保護し、ＢＡＸおよびＢＡＫ等のエフェクターアポトーシス促進タンパク質の作用からその完全性を保持する作用をする。ＢＩＭおよび分解ＢＩＤは、ＢＡＸおよびＢＡＫの直接活性剤として作用する能力を有する唯一のＢＨ３オンリータンパク質であり、ＢＡＸおよびＢＡＫの活性化を、フォロデシンを用いたＣＬＬ細胞のインキュベーション後にフローサイトメトリーにより分析した。フォロデシンは、これらのタンパク質をミトコンドリア外膜内に挿入することを可能にするＢＡＸおよびＢＡＫの構造変化、そのオリゴマー化、その後のミトコンドリア膜透過化の誘導、および細胞死機構の活性化を誘導した。
【０１２７】
フォロデシン処置により誘発されるｍＲＮＡのｐ７３およびタンパク質レベルの上昇ならびにＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３Ａの誘導
フォロデシンはｐ５３の状態に関係なく全てのＣＬＬ症例において細胞毒性効果を発揮したが、フォロデシンは、１７ｐ欠失がないＣＬＬ症例においてｐ５３タンパク質の安定化を誘導することができた。ｐ５３媒介アポトーシスに必要なｐ５３関連タンパク質であるＴＡｐ７３タンパク質の誘導により、機能的なｐ５３を有さないＣＬＬ細胞のアポトーシス耐性を克服できた（Ｄｉｃｋｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，１０８（１０），３４５０−３４５７（２００６））。フォロデシン処置は、分析した全てのＣＬＬ症例においてｐ７３ｍＲＮＡおよびＴＡｐ７３タンパク質レベルの明確な上方調節を誘導する。ｐ７３は、ある意味においてｐ５３依存性であるが腫瘍性細胞においてはｐ５３非依存性である転写因子ＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａの上方調節を介して、アポトーシス促進タンパク質ＢＩＭの誘導を調節するが（Ａｍｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６７（１２），５６１７−５６２１（２００７））、ＦＯＸＯ誘導の機序は不明である。フォロデシンで処置したＣＬＬ細胞におけるＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａのレベルを調べた。フォロデシンは、観察したｐ７３およびＢＩＭタンパク質レベルの上昇と相関して、ＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３ａの両方の上昇を誘導した。
【０１２８】
材料および方法
薬物および化学物質
実験用フォロデシン（ＢＣＸ−１７７７／イムシリンＨ）はＢｉｏＣｒｙｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＳＡ）により提供されたものであり、デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）はＳｉｇｍａから購入した。デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）の定量化のために、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからｄＮＴＰおよび［３Ｈ］ｄＡＴＰを入手した。フルダラビン（Ｓｈｅｒｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ベンダムスチン塩酸塩（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）、Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｚｅｒ，ＰＡにより提供された）、リツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および２’−デオキシシチジン（Ｓｉｇｍａ）を細胞毒性アッセイに用いた。
【０１２９】
健康なドナー由来のＣＬＬ一次細胞および末梢血単核細胞の分離および培養
本ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、世界保健機関の分類に従ってＣＬＬと診断された４３人の患者由来の一次白血病リンパ球において実施した。インフォームドコンセントは各患者から得た。
【０１３０】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）細胞をフィコール／ハイパーク沈降（Ｓｅｒｏｍｅｄ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により分離した。細胞は直接使用するかまたは１０％ジメチルスルホキシドおよび９０％加熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）の存在下で液体窒素中において凍結保存した。解凍後、ＣＬＬ患者由来の単核細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を、５％二酸化炭素を含有する３７℃の加湿雰囲気下で、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび５０μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培養培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。腫瘍性細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ５＋）のパーセンテージ、ＺＡＰ−７０およびＣＤ３８発現レベルをフローサイトメトリーにより分析し、上述したように定量化した（Ｃｒｅｓｐｏら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４８（１８），１７６４−１７７５（２００３））。ＺＡＰ−７０の高発現レベルのカットオフポイントは≧２０％とし、ＣＤ３８については≧３０％とした（Ｈｕｓら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ，１７（４），６８３−６９０（２００６））。この研究に用いた全てのＣＬＬ試料には、９５％を超える腫瘍性細胞があった。Ｖｙｓｉｓ（Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）から販売される１７ｐ１３．１（ｐ５３）、１１ｑ２２．３（ＡＴＭ）および１３ｑ１４．３（Ｄ１３Ｓ３１９）の欠失を判定する遺伝子座特異的プローブおよび１２トリソミーを検出する動原体プローブを含む市販の多検出キットを用いて蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により細胞遺伝学的変異を評価した。ｐ５３遺伝子の突然変異は、通常、ミスセンス突然変異であり、変異タンパク質は半減期が延長され、ウエスタンブロットによる検出が可能となる。さらに、ｐ５３突然変異がＩＡＲＣ ＴＰ５３コンソーシアムに従った直接配列決定により確認された。
【０１３１】
アポトーシス誘導
１０−２０−３０μＭのデオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）の存在する場合と存在しない場合において異なる時点でフォロデシンを１〜１２μＭの用量範囲で用いて細胞をインキュベートした。必要な場合には、８０μＭの汎カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋ（ベンジルオキシ−カルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロ−メチルケトン；Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、５０μＭのカスパーゼ−８阻害剤ｚ−ＩＥＴＤ．ｆｉｎｋ（Ｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）Ｔｈｒ−ＤＬ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン、Ｂａｃｈｅｍ）、２’−デオキシシチジン（５−１０−２０μＭ、Ｓｉｇｍａ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ、２５ｍＭ）、タイロン（５ｍＭ、４，５−ジヒドロキシ−１，３−ベンゼン−ジスルホン酸、Ｓｉｇｍａ）またはＧＳＨ（２ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）を用いて１時間かけて細胞をプレインキュベートした。薬物併用研究については、フルダラビンまたはベンダムスチンを用いて４時間、１２時間、もしくは２４時間かけて、またはフォロデシン（２μＭ）とｄＧｕｏ（１０〜２０μＭ）を加える前にモノクローナル抗体抗ＣＤ２０リツキシマブを用いて１時間かけて細胞を前処理した。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に接合させた二重染色によるホスファチジルセリン（ＰＳ）曝露の定量化であるＦＳＣ／ＳＳＣ（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、細胞生存およびアポトーシス誘導を細胞の複雑さの変化により分析した。ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋母集団におけるアポトーシスの分析については、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、抗ＣＤ１９−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＡＰＣと同時にＰＢＭＣを標識した。細胞生存および細胞毒性をコントロール細胞に対するパーセンテージでプロットした。２０ｎＭのＤｉＯＣ６（３，３−ジエキシルオキサカルボシアニンヨージド（３，３−ｄｉｅｘｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で細胞を染色してミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の損失を評価し、２μＭジヒドロエチジン（ＤＨＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で細胞を染色してフローサイトメトリー分析により活性酸素種（ＲＯＳ）産生を判定した。上述のとおりＢＡＸまたはＢＡＫタンパク質のＮＨ２末端に向けられた抗体で細胞をイムノサイトメトリー標識（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）して、構造変化によるアポトーシス促進ＢＡＸおよびＢＡＫタンパク質の活性化を分析した（Ｂｅｌｌｏｓｉｌｌｏら、Ｂｌｏｏｄ，１００（５），１８１０−１８１６（２００２））。この領域は基本的に閉塞され、ＮＨ２末端エピトープ特異的抗体による結合には利用できない。アポトーシス刺激の後、これらのタンパク質の構造変化により、ＮＨ２末端と、ミトコンドリアを標的とし、ミトコンドリアにより媒介される細胞死機構の誘導において重要な役割を果たす疎水性ＣＯＯＨ末端とが露出される。端的には、細胞をＰＢＳ中で一旦洗浄し、パラホルムアルデヒド４％中に固定し、０．１％サポニンおよび０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で透過処理した。立体構造活性ＢＡＫ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に対する１μｇ／ｍｌの一次抗体またはＢＡＸ（クローン６Ａ７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体を用いて室温で細胞を染色した。透過化緩衝液中で数回洗浄した後、細胞を、二次ヤギ抗マウスＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ）またはヤギ抗ウサギＦＩＴＣ（Ｓｕｐｅｒｔｅｃｈｓ）抗体でインキュベートし、透過化緩衝液で再度洗浄した。次いで、１つの試料につき１万個の染色細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【０１３２】
細胞内ｄＧＴＰレベルの測定
フォロデシン（２μＭ）およびｄＧｕｏ（１０μＭ）もしくはフルダラビン（１μｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに、１５×１０６個のＣＬＬ一次細胞を１８時間かけてインキュベートし、６０％メタノールを用いてヌクレオチドを抽出し、ＳｈｅｒｍａｎおよびＦｙｆｅにより改変されたＤＮＡポリメラーゼアッセイによって細胞内ｄＧＴＰレベルを定量化した（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１８０（２），２２２−２２６（１９８９））。データは、コントロール細胞に対する細胞内ｄＧＴＰレベルの誘導倍率で示した。並行して、２４時間および４８時間における細胞生存も評価した。
【０１３３】
免疫ブロット法
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ロイペプチン１０μｇ／ｍｌ、アポプロチニン１０μｇ／ｍｌ、１μＭ ＰＭＳＦ、１μＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１μＭ ＮａＦ、２μＭピロリン酸ナトリウム十水和物（Ｓｉｇｍａ）を加えたＲＩＰＡ緩衝液において細胞を１５分間かけて溶解した。細胞内全タンパク質を還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜に移した。タンパク質検出のために、以下の一次抗体を用いて膜を調べた：抗ＢＩＭ、抗ＢＡＫ（Ａｂ１）抗カスパーゼ−８（Ａｂ−３）、抗ｐ５３（Ａｂ−２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；抗ＢＩＤ、抗カスパーゼ−９、抗ＦｏｘＯ１および抗ＸＩＡＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；抗Ｂｃｌ−２、抗ｄＣＫ、抗Ｍｃｌ−１（Ｓ−１９）および抗ｐ７３（クローン５Ｂ４２９）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；抗ＰＡＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）；抗カスパーゼ−３および抗ＢＡＸ（クローン６Ａ７）（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗スルビビン（Ａｂｅａｍ）；抗β−アクチンおよび抗α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）および抗ＦｏｘＯ３Ａ（Ｕｐｓｔａｔｅ）。ウサギ抗ホスホｄＣＫ（Ｓｅｒ７９）およびウサギ抗ｄＣＫは、Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｓｍａｌ氏およびＦｒａｎｃｏｉｓｅ Ｂｏｎｔｅｍｐｓ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ ｄｅ Ｌｏｕｖａｉｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の厚意により提供された。適切な一次抗体でインキュベーションを行った後、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス（Ｓｉｇｍａ）、抗ウサギ（Ｓｉｇｍａ）もしくは抗ヤギ（Ｄａｋｏ）抗体でブロットを現像した。均等なタンパク質負荷がβ−アクチンもしくはα−チューブリン発現で確認され、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ Ｆｕｊｉｆｉｌｍソフトウェア（Ｆｕｊｉ）を用いて相対的タンパク質定量を行った。
【０１３４】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ定量化
製造者の使用説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて１０７個の細胞から全ＲＮＡを抽出した。次いで、ランダムプライマーおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１マイクログラムの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。デザイン済のＡｓｓａｙ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でｐ７３およびＭｃｌ−１の発現レベルを判定した。ＧＵＳを内在性コントロールとして用いて、比較サイクル閾値（Ｃｔ）法（ΔΔＣｔ）により各遺伝子の相対的発現を定量化した。ｍＲＮＡ発現レベルを任意の定量ＰＣＲ単位とし、各症例のコントロール試料（未処理）を較正物質ととした。
【０１３５】
統計分析
データは３つの独立した実験の平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。全ての統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。２つの試料群間の比較をノンパラメトリックマン−ホイットニー検定により評価し、スピアマン検定を用いて相関係数を評価した。ｐ値≦０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）である場合、結果を統計的に有意であると見なした。２つの異なる薬物の併用効果を評価するために、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙに記載のアルゴリズム（Ｃａｌｃｕｓｙｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．０，Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて併用指数またはＣＩ値を分析した（Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ，２２，２７−５５（１９８４））。このＣＩ値は、２つの異なる薬物の併用効果に関する拮抗作用または相乗効果の指示マーカーである。２つの薬物間の相互作用については、ＣＩ値が１未満である場合に相乗的と見なし、１である場合に付加的と見なし、ＣＩが１を超える場合に拮抗的と見なした。
【０１３６】
本発明を多数の実施形態について説明した。しかしながら、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、各種の改変を行うことが可能であることは言うまでもない。従って、他の実施形態も添付する請求の範囲内とする。本明細書中で引用した全ての文献、特許および特許出願を本明細書中において参考として援用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の血液学的な癌を処置する方法であって、
（ａ）該被験体に有効量のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤を投与する工程と、
（ｂ）該被験体に有効量のアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤を投与する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、およびイミダゾールカルボキサミド化合物から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルキル化剤はマスタード誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アルキル化剤はベンダムスチンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は同時投与される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は連続投与される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤は、前記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液学的な癌は、慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記血液学的な癌は慢性リンパ性白血病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液学的な癌は急性リンパ芽球性白血病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
有効量のアルキル化剤が前記被験体に投与される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
有効量の抗ＣＤ２０剤が前記被験体に投与される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、前記被験体に有効量のＰＮＰ阻害剤、有効量のアルキル化剤、および有効量の抗ＣＤ２０剤を投与する工程を包含する、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は同時投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は連続投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は、前記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体の血液学的な癌を処置する方法であって、
（ａ）１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体を同定する工程と、
（ｂ）該被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
【請求項２０】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体は、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体からなる群より選択される１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルキル化剤はベンダムスチンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プリンヌクレオシド類似体はフルラダジン（Ｆｌｕｒａｄａｄｉｎｅ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記血液学的な癌は、慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項２１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記血液学的な癌は慢性リンパ性白血病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液学的な癌は急性リンパ芽球性白血病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
血液学的な癌を有する被験体を処置する方法であって、
（ａ）該被験体由来の試料において１つ以上の癌細胞中のｐ５３欠失を検出する工程と、
（ｂ）該被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
【請求項２８】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１７ｐ欠失の存在を検出する工程をさらに包含する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料中の１つ以上の癌細胞が１つ以上の化学療法剤に耐性を持つか否かを判定する工程をさらに包含する、請求項２７〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
１つまたは複数の前記癌細胞は、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体からなる群より選択される１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血液学的な癌は、慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項２７〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
前記血液学的な癌は慢性リンパ性白血病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記血液学的な癌は急性リンパ芽球性白血病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含む医薬組成物。
【請求項３６】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
フォロデシンおよびベンダムスチンを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
フォロデシンおよびリツキシマブを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および抗ＣＤ２０剤を含む、請求項３５〜３８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４０】
フォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含むキット。
【請求項４２】
前記ＰＮＰ阻害剤、前記アルキル化剤、前記抗ＣＤ２０剤、またはそれらの任意の組み合わせの送達システムをさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
被験体を処置するための使用説明書をさらに含む、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４４】
ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤を含む、請求項４１〜４３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４５】
ＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含む、請求項４１〜４３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４６】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項４１〜４５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４７】
フォロデシンおよびベンダムスチンを含む、請求項４１〜４６のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４８】
フォロデシンおよびリツキシマブを含む、請求項４１〜４７のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４９】
ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および抗ＣＤ２０剤を含む、請求項４１〜４８のいずれか１つに記載のキット。
【請求項５０】
フォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブを含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
ＰＮＰ阻害剤を含むキット。
【請求項５２】
その内容物がアルキル化剤に耐性を持つ被験体に投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
その内容物がｐ５３欠失を有する被験体に投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む、請求項５１または５２に記載のキット。
【請求項５４】
その内容物がアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤とともに投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む、請求項５１〜５３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１】
被験体の血液学的な癌を処置する方法であって、
（ａ）該被験体に有効量のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤を投与する工程と、
（ｂ）該被験体に有効量のアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤を投与する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルキル化剤は、マスタード誘導体、ニトロソ尿素誘導体、白金化合物、およびイミダゾールカルボキサミド化合物から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルキル化剤はマスタード誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アルキル化剤はベンダムスチンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＣＤ２０剤はリツキシマブである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は同時投与される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤は連続投与される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記アルキル化剤または抗ＣＤ２０剤は、前記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液学的な癌は、慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記血液学的な癌は慢性リンパ性白血病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液学的な癌は急性リンパ芽球性白血病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
有効量のアルキル化剤が前記被験体に投与される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
有効量の抗ＣＤ２０剤が前記被験体に投与される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、前記被験体に有効量のＰＮＰ阻害剤、有効量のアルキル化剤、および有効量の抗ＣＤ２０剤を投与する工程を包含する、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は同時投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は連続投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルキル化剤および抗ＣＤ２０剤は、前記ＰＮＰ阻害剤の投与前に１回以上投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体の血液学的な癌を処置する方法であって、
（ａ）１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ被験体を同定する工程と、
（ｂ）該被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
【請求項２０】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体は、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体からなる群より選択される１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルキル化剤はベンダムスチンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プリンヌクレオシド類似体はフルラダジン（Ｆｌｕｒａｄａｄｉｎｅ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記血液学的な癌は、慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項２１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記血液学的な癌は慢性リンパ性白血病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液学的な癌は急性リンパ芽球性白血病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
血液学的な癌を有する被験体を処置する方法であって、
（ａ）該被験体由来の試料において１つ以上の癌細胞中のｐ５３欠失を検出する工程と、
（ｂ）該被験体にＰＮＰ阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
【請求項２８】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１７ｐ欠失の存在を検出する工程をさらに包含する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料中の１つ以上の癌細胞が１つ以上の化学療法剤に耐性を持つか否かを判定する工程をさらに包含する、請求項２７〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
１つまたは複数の前記癌細胞は、アルキル化剤およびプリンヌクレオシド類似体からなる群より選択される１つ以上の化学療法剤に耐性を持つ、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血液学的な癌は、慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項２７〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
前記血液学的な癌は慢性リンパ性白血病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記血液学的な癌は急性リンパ芽球性白血病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含む医薬組成物。
【請求項３６】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
フォロデシンおよびベンダムスチンを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
フォロデシンおよびリツキシマブを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および抗ＣＤ２０剤を含む、請求項３５〜３８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４０】
フォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤もしくは抗ＣＤ２０剤を含むキット。
【請求項４２】
前記ＰＮＰ阻害剤、前記アルキル化剤、前記抗ＣＤ２０剤、またはそれらの任意の組み合わせの送達システムをさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
被験体を処置するための使用説明書をさらに含む、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４４】
ＰＮＰ阻害剤およびアルキル化剤を含む、請求項４１〜４３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４５】
ＰＮＰ阻害剤および抗ＣＤ２０剤を含む、請求項４１〜４３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４６】
前記ＰＮＰ阻害剤はフォロデシンである、請求項４１〜４５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４７】
フォロデシンおよびベンダムスチンを含む、請求項４１〜４６のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４８】
フォロデシンおよびリツキシマブを含む、請求項４１〜４７のいずれか１つに記載のキット。
【請求項４９】
ＰＮＰ阻害剤、アルキル化剤、および抗ＣＤ２０剤を含む、請求項４１〜４８のいずれか１つに記載のキット。
【請求項５０】
フォロデシン、ベンダムスチン、およびリツキシマブを含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
ＰＮＰ阻害剤を含むキット。
【請求項５２】
その内容物がアルキル化剤に耐性を持つ被験体に投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
その内容物がｐ５３欠失を有する被験体に投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む、請求項５１または５２に記載のキット。
【請求項５４】
その内容物がアルキル化剤または抗ＣＤ２０剤とともに投与されるべきものであることを示すラベルをさらに含む、請求項５１〜５３のいずれか１つに記載のキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５０６３４５（Ｐ２０１１−５０６３４５Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３７１５９（Ｐ２０１０−５３７１５９）
【出願日】平成２０年１２月１０日（２００８．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６２５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６４５５
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０７１４１２７３）バイオクライスト ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１０日（２００８．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６２５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６４５５
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０７１４１２７３）バイオクライスト ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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