アルブミンクラスター、アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター、およびそれを含有する人工酸素運搬体
【課題】コロイド浸透圧を生理的条件に保ったまま高濃度の酸素輸送が可能で、しかも血中滞留時間の長い人工酸素運搬体を提供する。
【解決手段】中心となる１分子のアルブミン（コアアルブミン）に架橋剤を介し、１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）が結合されたことを特徴とするアルブミンクラスター、およびそれに金属ポルフィリン錯体を包接させたことを特徴とするアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【解決手段】中心となる１分子のアルブミン（コアアルブミン）に架橋剤を介し、１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）が結合されたことを特徴とするアルブミンクラスター、およびそれに金属ポルフィリン錯体を包接させたことを特徴とするアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清アルブミンを架橋剤を用いて共有結合により連結して得た構造明確なアルブミンクラスターと、それに金属ポルフィリン錯体を酸素吸脱着部位として包接させたアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター、およびそれを含有する人工酸素運搬体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンやミオグロビンの活性中心である鉄（II）ポルフィリン錯体は、酸素分子を可逆的に吸脱着して、生命活動に必要不可欠な酸素運搬・貯蔵の役割を演じている。このような酸素吸脱着機能を合成金属ポルフィリン錯体を構築して再現しようとする研究は、従来から数多く報告されている。初期の研究例としては、非特許文献１、非特許文献２等が代表的であり、また最近の開発動向については、非特許文献３、非特許文献４等に記載されている。とりわけ酸素親和性を上げる作用を有するイミダゾリル基を分子内に共有結合させた鉄（II）ポルフィリン錯体は、そのイミダゾールが中心鉄（II）の第５配位座に分子内配位で強固に固定されるため、安定な酸素錯体が生成できることが知られている。この場合、ポルフィリン／イミダゾールのモル比が１／１の最小必要量に抑えられるため、薬理作用や体内毒性の高いイミダゾール誘導体を過剰に共存させる必要もなく、生体内投与を目指した応用を考えた場合、きわめて有利となる。本発明者らの研究グループもポルフィリン環の２位にイミダゾリル基を共有結合で導入した鉄（II）ポルフィリン錯体を合成し、酸素の可逆的吸脱着を報告している（非特許文献５）。しかし、有機溶媒（例えば、トルエン、ベンゼン、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等）中で酸素錯体を形成できるこれら合成鉄（II）ポルフィリン錯体も、生理条件下（生理塩水溶液（ｐＨ７．４）中、室温ないし３７℃)では、中心鉄（II）が瞬時に酸化されてしまうため、充分な酸素結合能を発揮することはできない。可逆的な酸素配位活性を発現できるのは、ポルフィリンの中心鉄が２価の状態にある時のみで、中心鉄が酸化し、鉄（III）となると、酸素配位活性は完全に失われてしまうのである。つまり、これらの金属ポルフィリン錯体を医療用途、例えば人工血液、臓器保存液、人工肺等のための酸素供給液に利用する場合には、水中でもプロトンによる中心鉄の不可逆酸化を防止し、酸素配位錯体を安定に保全する技術が不可欠なのである。
【０００３】
水溶液中で微視的な疎水環境を提供する材料としては、リン脂質からなる二分子膜小胞体が知られている。本発明者らのグループは、金属ポルフィリン錯体をリン脂質二分子膜の疎水環境へ包埋させると、水相系においても酸素錯体が安定に存在し、生理条件下で有効に作用する人工酸素運搬体が提供できることを報告している（例えば、非特許文献６等）。しかしながら、これらの人工酸素運搬体では、多量のリン脂質を使用するため、工業的規模での製造、また代謝を含む生体適合性の点で、なお改善の余地が残されていた。そこで本発明者らは、より生体適合性に優れたキャリアーとして、血漿タンパク質の５０〜５５％を占め、生体内で種々の化合物（薬物、代謝産物等）の運搬をつかさどる血清アルブミンに着目し、これが金属ポルフィリン錯体に優れた疎水環境を提供するばかりでなく、所定の金属ポルフィリン錯体を取り込ませて調製したアルブミン−金属ポルフィリン錯体包接化合物（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）が水中で安定な酸素配位錯体を形成し、人工酸素運搬体として機能することを見出した（特許文献１）。
【０００４】
しかし、血液中における生体内アルブミン濃度は約４〜５ｗｔ％であることが知られており、生体内投与を想定して、アルブミン−金属ポルフィリン錯体水溶液のアルブミン濃度を４〜５ｗｔ％に調整すると、酸素結合席である金属ポルフィリン錯体の濃度は最大でも６ｍＭまでしか上げることはできない。この値はヒト血液のヘム濃度（９．２ｍＭ）の約６０％にすぎない。勿論、アルブミン−金属ポルフィリン錯体の濃度を増大させれば、酸素結合部位である金属ポルフィリン錯体の濃度が上昇するので、水溶液中の酸素溶解量を増やすことはできるが、生体内アルブミン濃度の増大は、膠質浸透圧の上昇を誘発するため好ましくない。
【０００５】
他方、より長時間、アルブミン−金属ポルフィリン錯体を血流中に滞留させることができれば、酸素輸送機能の持続的発現が可能となり、実用に耐える人工酸素運搬体が提供できる。出血ショック時などの病態では、血管の物質透過性が上昇しているため、アルブミン−金属ポルフィリン錯体の血中滞留時間は正常時に比べ、減少する可能性もある。このような病態では、金属ポルフィリン錯体を包接していない形態のもの、すなわち酸素輸送能はなくとも、血中滞留性の高いアルブミンは、循環血液量を回復させ保持する有効な血漿増量剤として作用するものと期待される。その点から、アルブミンの血中滞留時間を延長させる分子設計が望まれていた。
【０００６】
例えば、高分子化したアルブミン重合体には、１分子当り多くのポルフィリン金属錯体が包接されると期待される。その種の化合物としては、アルブミンをグルタルアルデヒドで重合したアルブミンマイクロスフェアーや、アルブミンを超音波処理して得たマイクロバブルスが知られ（非特許文献７、非特許文献８）、超音波イメージング、造影剤、ドラッグキャリアー、人工血小板などの用途として使用されている。しかし、これらのアルブミン重合体では、構成単位となるアルブミン分子（モノマー）の特異な高次構造は重合過程で既に失われており、その分子結合能はアルブミン単量体に比べ大きく変化していると考えてよい。また、重合度が高いために分子径は４μｍ以上と大きく、血中へ投与した場合、短時間内に細網内皮系などへ捕捉されることが推測される。
【０００７】
以上のような背景から、構成単位であるアルブミンの立体構造を保持したまま、ポルフィリン金属錯体などに対する分子包接能を変化させることなく、２〜７量体程度に連結された構造明確なアルブミン多量体の設計と合成が待たれていたのが現状であった。
【非特許文献１】J. P. Collman, Acc. Chem. Res., 10, 265 (1977)
【非特許文献２】F. Basolo, B. M. Hoffman, J. A. Ibers, Acc. Chem. Res., 8, 384 (1975)
【非特許文献３】Momentau et al., Chem. Rev., 110, 7690 (1994)
【非特許文献４】J. P. Collman, Chem. Rev., 104, 561 (2004)
【非特許文献５】E. Tsuchida et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1995, 747 (1995)
【非特許文献６】E. Tsuchida et al., J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1984, 1147 (1984)
【非特許文献７】T. Scotland, Biotechnol. Appl. Biochem. 18, 227 (1993)
【非特許文献８】K. S. Suslick, Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 7708 (1991)
【特許文献１】特開平０８−３０１８７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、１分子当りより多くの金属ポルフィリン錯体を酸素吸脱着部位として包接できる（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）多量体を合成し、コロイド浸透圧を生理的条件に保ちながら高濃度の酸素輸送が可能で、かつ血中滞留時間の長い人工酸素運搬体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、基本構成単位であるアルブミンの立体構造が保たれたアルブミン多量体（つまり個々のアルブミンの分子包接能は保持されるため、連結数に比例して分子包接数は増大する）の設計と機能発現に鋭意研究を重ねた結果、中心となる１分子のアルブミン（コアアルブミン）に二官能性架橋剤を介し、１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）を結合させることによりアルブミン多量体を調製すると、アルブミンが２〜７分子程度に結合されたアルブミン多量体が単離精製できることを見出した。アルブミンは、合計３５個のシステインを有するが、その３４個は計１７対のジスルフィド結合を形成し、高次構造を保持するために役立っている。つまり、残り一つの３４−システイン残基である活性チオール基をシェルアルブミンの結合位置として利用する方法により、１分子のコアアルブミンの周囲を複数のシェルアルブミンが取り囲む構造が確実に構築できるため、得られたアルブミン多量体はアルブミンクラスターともいえる。これらのアルブミンクラスターでは、１分子あたりの金属ポルフィリン錯体包接数がアルブミン単量体に比べ増大することを明らかにし、結果として高濃度酸素輸送に適した、さらに血中滞留性の高い新しい人工酸素運搬体が提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の側面によれば、中心となる１分子のアルブミン（コアアルブミン）に架橋剤を介し、１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）が結合されたことを特徴とするアルブミンクラスターが提供される。
【００１１】
第２の側面によれば、前記アルブミンクラスターに金属ポルフィリン錯体を包接させたことを特徴とするアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターが提供される。
【００１２】
さらに、第３の側面によれば、アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターを含む人工酸素運搬体が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のアルブミンクラスターは、基本構成単位であるアルブミンの高次構造が架橋により変化しないため、アルブミン自身の持つ分子包接能が保持されており、結果としてアルブミン分子数に比例した数の金属ポルフィリン錯体を包接できる特徴を持つ。つまり、本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターを含有する人工酸素運搬体は、コロイド浸透圧を生理的条件に保ちながら、血液よりも多くの酸素を輸送することのできる人工酸素運搬体として提供できる。また、本発明のアルブミンクラスターおよびアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターはアルブミン単量体に比べ分子径が大きいので、血中半減期の長い、血流中に長時間滞留できる新しい血漿増量剤または人工酸素運搬体として提供できる。さらに、本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターは、前記した人工酸素運搬体のほかにも、ガス吸着剤、酸素吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒等としても有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のアルブミンクラスターは、中心となる１分子のアルブミン（コアアルブミン）に二官能性架橋剤を介して１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）が結合されたアルブミン多量体であり、アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターは、前記したアルブミンクラスターに金属ポルフィリン錯体を包接させた複合体である。好ましくは、シェルアルブミンにおける架橋剤との結合部位がシステイン３４であり、コアアルブミンにおける架橋剤との結合部位がリジンで構成される。
【００１５】
架橋に利用される二官能性架橋剤は、上記式［Ｉ］または［II］で示されるものがよい。
【化７】
【００１６】
【化８】
【００１７】
式［Ｉ］において、Ｒ1は置換基を有してもよい炭化水素基である。そのような炭化水素基の例を挙げると、Ｃ1〜Ｃ12アルキレン基、アミド基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−基が介在したアルキレン基）、エステル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−ＯＣ（＝Ｏ）−基が介在したアルキレン基）、エーテル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−Ｏ−基が介在したアルキレン基）、シクロヘキシレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間にシクロヘキシレン基が介在したアルキレン基）、フェニレン基を含むＣ1〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間にフェニレン基が介在したアルキレン基）等である。
【００１８】
式［II］において、Ｒ2は置換基を有してもよい炭化水素基である。そのような炭化水素基の例を挙げると、Ｃ1〜Ｃ12アルキレン基、アミド基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−基が介在したアルキレン基）、エステル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−ＯＣ（＝Ｏ）−基が介在したアルキレン基）、エーテル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−Ｏ−基が介在したアルキレン基）、シクロヘキシレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間にシクロヘキシレン基が介在したアルキレン基）、フェニレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間にフェニレン基が介在したアルキレン基）等である。
【００１９】
包接されるポルフィリン金属錯体は、上記式［III］、［IV］、［Ｖ］または［VI］で示されるものがよい。
【化９】
【００２０】
【化１０】
【００２１】
【化１１】
【００２２】
【化１２】
【００２３】
式［III］で示されるポルフィリン金属錯体は、特開平６−２７１５７７号公報および特開２００３−４０８９３号公報に記載されている。式［III］において、Ｒ3は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ3が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’−ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’−ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基等である。ここでＲ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましい。
【００２４】
式［III］において、Ｒ4はアルキレン基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００２５】
式［III］において、Ｒ5はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基である。かかるＲ5の例を挙げると、水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００２６】
式［IV］で示されるポルフィリン金属錯体は、特開２００２−１２８７８１号公報に記載されている。式［IV］において、Ｒ6は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ6が1位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’−ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’−ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基等である。ここでＲ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましい。
【００２７】
式［IV］において、Ｒ4はアルキレン基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００２８】
式［IV］において、Ｒ5はアルキル基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキル基である。
【００２９】
式［IV］において、Ｍは中心遷移金属イオン（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００３０】
式［Ｖ］で示されるポルフィリン金属錯体は、特願２００４−１９０１８９号明細書に開示されている。式［Ｖ］において、Ｒ9は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ9が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’−ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’−ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基等である。ここでＲ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましい。
【００３１】
式［Ｖ］において、Ｒ10はアルキレン基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００３２】
式［Ｖ］において、Ｒ11はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第4〜5周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、好ましくは水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００３３】
式［Ｖ］で示される金属ポルフィリンは、例えば、次のようにして合成することができる。メソ−テトラキス（ｏ−アミノフェニル）ポルフィリンを適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム、テトラヒドロフランなど）に溶解し、そこにトリチルブロマイドおよびトリエチルアミンを加え、さらに１０分〜１時間撹拌後、溶媒を減圧除去する。得られたポルフィリンのトルエン溶液を活性アルミナおよびヘプタンの入った容器に加え、９０℃、遮光下にて１２〜２４時間撹拌する。ガラスフィルターでアルミナを濾別し、シリカゲルカラムによりメソ−トリ（α，α，α−ｏ−アミノフェニル）−β−ｏ−（Ｎ−トリフェニルメチル）アミノフェニルポルフィリンを分画精製する。得られたポルフィリンと適当な塩基（ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等）を適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム、テトラヒドロフラン等）に溶解した溶液を式Ｒ9ＣＯＣｌ（ここで、Ｒ9は、上記定義の通り）で示される酸クロライドに滴下し、窒素雰囲気下、室温で２〜１５時間撹拌する。溶媒を減圧除去後、クロロホルム、水を添加、水層をクロロホルムで洗浄後、有機層を回収し、溶媒を減圧除去する。得られた残渣をシリカゲルカラムで分画精製し、真空乾燥することで、メソ−トリ（α，α，α−ｏ−（置換アミド））−β−ｏ−（Ｎ−トリフェニルメチル）アミノフェニルポルフィリンを固体として得る。得られたポルフィリンと適当な塩基（ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等）を適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム、テトラヒドロフラン等）に溶解した溶液を下記一般式［VII］で示されるω−イミダゾリルカルボン酸（一般式［VII］において、Ｒ10〜Ｒ11は、上記定義の通り）の酸クロライドに滴下し、窒素雰囲気下、室温で２〜１５時間撹拌する。
【化１３】
【００３４】
ついで、溶媒を減圧除去後、クロロホルム層を水洗し、溶媒を減圧除去する。得られた残渣をシリカゲルカラムで分画精製し、真空乾燥することで、式［Ｖ］で示されるポルフィリン化合物を得ることができる。
【００３５】
こうして得られたポルフィリン化合物への中心金属導入は、例えばD. Dolphin編、The Porphyrin、1978年、アカデミック・プレス社などに記載の一般法により達成され、相当のポルフィリン金属錯体として得られる。
【００３６】
式［VI］で示されるポルフィリン金属錯体は、上記特許文献１（特開平０８−３０１８７３号公報）に記載されている。式［VI］において、Ｒ12は炭化水素基である。Ｒ12は水素原子、ビニル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基が好ましい。
【００３７】
式［VI］において、Ｒ13はアルキル基であり、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキル基である。
【００３８】
式［VI］において、Ｒ14はアルキレン基であり、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００３９】
式［VI］において、Ｒ15はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基である。かかるＲ15の例を挙げると、水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００４０】
本発明の金属ポルフィリン錯体を包接したアルブミンは、金属ポルフィリン錯体の結合をもたらすアミノ酸を遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入した組換えアルブミンに、金属ポルフィリン錯体を軸配位させて得た組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体であってもよい。このような組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、特表２００２−５００８６２号公報に記載されている。導入されるアミノ酸はヒスチジンが好ましく、導入位置はサブドメインＩＢが好ましい。この場合の金属ポルフィリン錯体は、軸塩基配位子を分子内に持っていない金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリン、金属オクタエチルポルフィリンが好ましい。
【００４１】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターにおいて、中心遷移金属イオンＭは好ましくは、ＦｅまたはＣｏである。Ｆｅの原子価は＋２価または＋３価であり得、Ｃｏの原子価は＋２価であり得る。
【００４２】
また、本発明のアルブミンクラスターおよびアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターにおいて、アルブミンはヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミンが好ましい。
【００４３】
上記したアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターは、酸素を可逆的に結合できるので、人工酸素運搬体としての機能を発現することはもちろん、一分子当りに多くの金属ポルフィリン錯体を包接できる特徴を持つ。つまり、体内に投与した場合、コロイド浸透圧を生理条件に保ちながら、血液よりも多くの酸素を輸送することが期待される。さらに、分子径が大きいので、より長い血中滞留時間も期待できる。
【００４４】
工酸素運搬体の適応は、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の血液代替物）のほか、術前血液希釈液、人工心肺等体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全等）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、癌治療用増感剤、再生組織細胞の培養液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用、が期待されている。
【００４５】
加えて、金属ポルフィリン錯体の中心金属が例えば第４〜５周期に属する金属イオンである場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のアルブミン−金属錯体クラスターは、人工酸素運搬体のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。
【００４６】
本発明のアルブミンクラスターおよびアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターの製造方法に制限はないが、例えば次の方法により合成される。
【００４７】
０．１〜２５ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％のアルブミン（１〜２５ｍＬ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４)に、α−スクシンイミジル−ω−ピリジルジチオ型架橋剤、例えばＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰＨ）のエタノール溶液を撹拌しながら添加し（ＳＰＤＰＨ／アルブミン＝１０（モル／モル））、室温で、１０〜６０分、好ましくは２０〜３０分間反応させた。限外濾過装置（ADVANTEC UHP-76K）と分画分子量５ｋＤａの膜（ADVANTEC Q0500 076E）を用いて未反応のＳＰＤＰＨを除去し、６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートアルブミン（ＰＤＰＨ−アルブミン）（コアアルブミンとなる）溶液を得る。アルブミン濃度の定量は、一般法であるブロモクレゾールグリーン法（和光純薬社製、アルブミンテストワコー）により行い、［ＰＤＰＨ−アルブミン］が１〜１０ｗｔ％であることが確認される。
【００４８】
ピリジルジチオ基の導入数は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いてジスルフィド結合を還元し、遊離した２−チオピリジノン（ε343＝８．１×１０3Ｍ-1ｃｍ-1）の定量から決定することができる。例えば、ＰＤＰＨ−アルブミンのＰＢＳ溶液（［アルブミン］＝３０μＭ）３ｍＬに、アルブミンに対して５〜５０倍モル、好ましくは１０〜２５倍モルのＤＴＴを添加、よく混合した後、１〜３０分静置してから、１９０〜７００ｎｍの範囲において紫外可視吸収スペクトル測定を行う。３４３ｎｍの吸光度から、溶液中のピリジルジチオ基の濃度を算出し、アルブミン１分子当たりのピリジルジチオ基数に換算する。
【００４９】
他方、０．１〜２５ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％のアルブミン（１〜２５ｍＬ）のリン酸緩衝水溶液（ＰＢ，１０ｍＭ、ｐＨ７．０）に１Ｍ ＤＴＴ水溶液（ＤＴＴ／アルブミン＝１〜１０、好ましくは２〜４）を添加し、よく振とうし、室温で１０〜６０分、好ましくは２０〜４０分静置する。その後、限外濾過装置を用いてアルブミンに添加したＤＴＴを除去する。アルブミン溶液をＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）で充分洗浄した後、濃縮し、還元型アルブミン溶液を得た。アルブミン濃度の定量は、ブロモクレゾールグリーン法により行い、［還元型アルブミン］が１〜１０ｗｔ％であることを確認する。
【００５０】
ＰＤＰＨ−アルブミン水溶液に、還元型アルブミン水溶液を添加し、室温で１０〜３０時間、好ましくは１５〜２５時間反応させる。反応溶液のNative-PAGE電気泳動には独立した複数のバンドが現れ、分子量マーカーとの比較から、アルブミン多量体の生成が確認できる。ＨＰＬＣ測定（昭和電工、Shodex Protein KW-803、流速１．０ｍＬ／分、移動相：ＰＢＳ)でも、アルブミン多量体成分に基づく幅広いピークが観測されるので、その生成が確認できる。また、この溶出曲線をピークフィッティングすると各成分に相当したピークに分離され、電気泳動の結果と一致する。
【００５１】
各成分をゲルカラムクロマトグラフィー（Pharmacia社製、Superdex 200pg、分画分子量：１０〜６００ｋＤａ、５ｃｍφ×４０ｃｍ）で精製し、単離した各成分を再度ＨＰＬＣ測定すると、不純物を含まない単一物質であることがわかる。
【００５２】
精製したアルブミン多量体の分子量をマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）(島津製作所、AXIMA-CFR Kompact MALDI)を用いて測定すると、実測分子量が計算分子量と同等であることがわかり、アルブミン多量体が単離されたことが明確となる。
【００５３】
アルブミンクラスターのＣＤスペクトルは、２０８、２２２ｎｍに極小値を持つ負のスペクトルパターンを示し、２０８、２２２ｎｍにおけるモル楕円率（［θ］208＝１．９×１０4、［θ］222＝１．８×１０4（ｄｅｇ ｃｍ2 ｄｍｏｌ-1））はアルブミン単量体の値と一致する。また、等電点（４．８）もアルブミン単量体の値と同等となる。これらの結果は、アルブミンクラスターを構成するアルブミンの二次構造や表面電荷が、クラスター形成後も変化していないことを示すことになる。
【００５４】
アルブミン多量体の透過型電子顕微鏡観察から、アルブミンクラスターの形態がわかる。
【００５５】
このようにして得られたアルブミンクラスターに特開２００３−４０８９３号公報に記載の方法により合成された、例えば２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接させる（アルブミン濃度：０．０５〜１０ｗｔ％、好ましくは０．１〜５．０ｗｔ％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：１〜１００（モル／モル）、好ましくは４〜６５）。
【００５６】
アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターの鉄イオン濃度は、誘導プラズマ発光分析（ＩＣＰ、セイコーインスツルメンツ製ＳＰＳ ７０００Ａ）を用いて測定する。得られた濃度は、鉄ポルフィリン錯体濃度の指標とできるので、一分子のアルブミンクラスターに何分子の鉄ポルフィリン錯体が包接されているかがわかる。
【００５７】
アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターは、いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素吸脱着剤、酸素運搬体として作用する。
【００５８】
酸素以外にも金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素等）。これらの理由から、本発明の金属ポルフィリン錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、有効な人工酸素運搬体として機能することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【００５９】
放射性原子で標識したアルブミンクラスター、例えばヨウ素１２５で標識したアルブミンクラスター水溶液を麻酔下のウイスターラットに尾静脈から投与し、その後の経時的採血から血漿中に含まれるアルブミンクラスターの濃度を定量すると、その血中滞留時間を測定できる。アルブミンクラスターの血中半減期は５〜８時間であり、これは同条件で測定したアルブミン単量体に比べて２〜４倍に延長していることになる。
【実施例】
【００６０】
以下、この発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明が実施例のものに限定されないことは、いうまでもないことである。
【００６１】
例１
ヒト血清アルブミンのＰＢＳ溶液（５ｗｔ％、２．０ｍＬ）にＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰＨ）のエタノール溶液（２０ｍＭ、０．７５ｍＬ）を撹拌しながら添加し（ＳＰＤＰＨ／アルブミン＝１０（モル／モル））、室温で２０分間、ゆっくりと攪拌する。限外濾過装置（ADVANTEC UHP-76K）と分画分子量５０ｋＤａの膜（ADVANTEC Q0500 076E）を用いて、濃縮とＰＢＳによる希釈を繰り返し、未反応のＳＰＤＰＨを除去、最終的には、６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートアルブミン（ＰＤＰＨ−アルブミン、５．１５ｗｔ％、２ｍＬ）（コアアルブミンとなる）溶液を得た。アルブミン濃度の定量は、一般法であるブロモクレゾールグリーン法（和光純薬社製、アルブミンテストワコー）により行った。
【００６２】
ピリジルジチオ基の導入数は、ＤＴＴを用いてジスルフィド結合を還元することにより遊離した２−チオピリジノン（ε343＝８．１×１０３Ｍ-1ｃｍ-1）の定量から決定した。ＰＤＰＨ-アルブミンのＰＢＳ溶液（［アルブミン］＝３０μＭ）３ｍＬに、アルブミンに対して１５倍モルのＤＴＴを添加し、よく混合した後、１０分静置してから、１９０〜７００ｎｍの範囲において紫外可視吸収スペクトル測定を行い、３４３ｎｍの吸光度から、溶液中のピリジルジチオ基の濃度を算出した。アルブミン１分子当たり８．６本のＰＤＰＨ鎖が導入されていることを明らかにした。
【００６３】
他方、ヒト血清アルブミンのリン酸緩衝水溶液（ＰＢ、１０ｍＭ、ｐＨ７．０）（５ｗｔ％、２０ｍＬ）に１ＭのＤＴＴ水溶液５６μＬ（ＤＴＴ/アルブミン＝３）を添加し、よく振とうさせ、室温で３０分静置した。その後、限外濾過装置を用いて上記と同様な方法で、アルブミンに添加したＤＴＴを除去した。最終的には１３ｍＬに定量し、還元型アルブミンを得た（［還元型アルブミン濃度］＝７．８ｗｔ％）。
【００６４】
このようにして得た、還元型アルブミン水溶液をＰＤＰＨ−アルブミンに添加し、室温で２０時間ゆっくりと攪拌した。反応溶液のNative-PAGE電気泳動には６つの独立した明確なバンドが現れ、分子量マーカーとの比較から、アルブミン二、三、四、五、六量体が形成されていることがわかった。ＨＰＬＣ測定（昭和電工、Shodex Protein KW-803、流速１．０ｍＬ／分、移動相：ＰＢＳ）でも、６．５〜８．５分にアルブミン多量体成分に基づく幅広いピークが観測され、この溶出曲線をピークフィッティングしたところ、６つの明確なピーク(１〜６)に分離でき、電気泳動の結果と一致した。
【００６５】
アルブミン多量体各成分をゲルカラムクロマトグラフィー（Pharmacia社製、Superdex 200pg、分画分子量：１０〜６００ｋＤａ、５ｃｍφ×４０ｃｍ）を用いて分離した。精製した各成分のＨＰＬＣ測定を再度行い、各成分が単ピークであることを確認した。
【００６６】
精製したアルブミンクラスターについて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）(島津製作所、AXIMA-CFR Kompact MALDI)により分子量の測定を行うと、実測分子量が計算分子量と同等で、アルブミン多量体が単離できたことが実証された。例えば、アルブミン三量体の分子量（実測値：２００，４６９、計算値：２０１，６１４）、アルブミン四量体の分子量（実測値：２６６，５３８、計算値：２６７，９５３）であった。
【００６７】
アルブミンクラスターのＣＤスペクトルは、２０８、２２２ｎｍに極小値を持つ負のスペクトルパターンを示し、２０８、２２２ｎｍにおけるモル楕円率（［θ］208＝１．９×１０4、［θ］222＝１．８×１０4（ｄｅｇ ｃｍ2 ｄｍｏｌ-1））はアルブミン単量体の値と一致した。また、等電点（４．８）もアルブミン単量体の値と同一となった。これらの結果から、アルブミンクラスターの構成単位であるアルブミンの二次構造や表面電荷は、クラスター形成後も変化していないことが明らかとなった。
【００６８】
透過型電子顕微鏡観察から、アルブミン四量体は均一な粒径約２０ｎｍの球状粒子構造であることがわかった。
【００６９】
例２
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、Ｎ−スクシンイミジル−１２−（２−ピリジルジチオ）オクタデカノエートを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から７量体が形成された。
【００７０】
例３
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエンを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から５量体が形成された。
【００７１】
例４
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステルを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から４量体が形成された。
【００７２】
例５
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から７量体が形成された。
【００７３】
例６
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−６−アミドカプロエートを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から６量体が形成された。
【００７４】
例７
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）オクチレートを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から６量体が形成された。
【００７５】
例８
例１で調製したアルブミン４量体のＰＢＳ溶液（５．６２５μＭ、６ｍＬ）に、特開２００３−４０８９３号公報に記載の方法により合成された、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体のエタノール溶液（６３８μＭ、１．８ｍＬ）を一酸化炭素雰囲気下で加え（鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：３４（モル／モル））、充分に混合した後、透析によりエタノールを除去し、（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）四量体溶液を得た。
【００７６】
アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターのアルブミン濃度の定量は、ブロモクレゾールグリーン法により行い、鉄ポルフィリン錯体濃度（鉄イオン濃度）の定量は、誘導プラズマ発光分析（ＩＣＰ、セイコーインスツルメンツ製ＳＰＳ ７０００A)を用いて実施した。得られた各濃度の比率から、アルブミン四量体には３１．６個の鉄ポルフィリン錯体が包接されていることがわかった。アルブミン単量体１分子当りの鉄ポルフィリン包接数は、最大約８であることから（特開２００３−４０８９３号公報）、アルブミンクラスターにおける構成アルブミン単位当りの鉄ポルフィリン錯体包接数は、クラスター形成後も変化ないことが明らかとなった。
【００７７】
また（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）四量体のＣＤスペクトル測定（日本分光社製、JASCO J-725)を行い、そのＣＤスペクトルパターンが鉄ポルフィリン錯体を包接していないアルブミン四量体のものと一致することを明らかにした。等電点も４．８で、アルブミン単量体の値と同等であった。これらの結果は、鉄ポルフィリン錯体を包接した後も、アルブミンクラスターを構成する個々のアルブミンの二次構造や表面電荷は変化していないことを示している。
【００７８】
例９
例８において、例１で調製したアルブミン四量体の代わりに例２で調製したアルブミン三量体（５．６２５μＭ、６ｍＬ）を、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体の代わりに、特開２００３−４０８９３号公報に記載の方法により合成された、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−アダマンタンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体のエタノール溶液（４８８μＭ、１．８ｍＬ）を鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：２６（モル／モル）の割合で混合した以外は、全く同様な方法に従って、（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）三量体を得た。アルブミン三量体１分子に包接されている、鉄ポルフィリン錯体の数は、２４．２であった。
【００７９】
また、ＣＤスペクトルパターンと等電点（４．８）は、鉄ポルフィリン錯体を包接した後も変化なく、アルブミンクラスターを構成する個々のアルブミンの二次構造や表面電荷に変化がないことがわかった。
【００８０】
例１０
例８において、例１で調製したアルブミン四量体の代わりに例３で調製したアルブミン４量体（５．６２５μＭ、６ｍＬ）を、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体の代わりに、特願２００４−１９０１８９号明細書に開示されている方法により合成された、５，１０，１５−トリス（α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）−２０−モノ（β−O−（６−（２−メチルイミダゾリル）ヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体のエタノール溶液（６３８μＭ、１．８ｍＬ）を鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：３４（モル／モル）の割合で混合した以外は、全く同様な方法に従って、（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）四量体を得た。アルブミン四量体１分子に包接されている、鉄ポルフィリン錯体の数は、３２．７であった。
【００８１】
また、ＣＤスペクトルパターンと等電点（４．８）は、鉄ポルフィリン錯体を包接した後も変化なく、アルブミンクラスターを構成する個々のアルブミンの二次構造や表面電荷に変化がないことがわかった。
【００８２】
例１１
例８において、例１で調製したアルブミン四量体の代わりに例１で調製したアルブミン３量体（５．６２５μＭ、６ｍＬ）を、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体の代わりに、特願２００４−１９０１８９号明細書に開示されている方法により合成された、５，１０，１５−トリス（α，α，α−O−（１−アダマンタンアミド）フェニル）−２０−モノ（β−O−（６−（２−メチルイミダゾリル）ヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体のエタノール溶液（４８８μＭ、１．８ｍＬ）を鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：２７（モル／モル）の割合で混合した以外は、全く同様な方法に従って、（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）三量体を得た。アルブミン三量体１分子に包接されている、鉄ポルフィリン錯体の数は、２４．４であった。
【００８３】
また、ＣＤスペクトルパターンと等電点（４．８）は、鉄ポルフィリン錯体を包接した後も変化なく、アルブミンクラスターを構成する個々のアルブミンの二次構造や表面電荷に変化がないことがわかった。
【００８４】
例１２
例１で調製したアルブミン四量体をヨウ素１２５（125Ｉ）で放射化ラベルし、得られた125Ｉ−アルブミン四量体（比放射能：１８．５ＭＢｑ／ｍＬ（２４．３ＭＢｑ／ｍｇ）、０．１３ｗｔ％、１８０μＬ）を非標識のアルブミン四量体（４００μＬ）で希釈して、投与液を調製（０．２４７ｗｔ％、５．７４ＭＢｑ／ｍＬ）した。ジエチルエーテル麻酔下のラット（体重：約３００ｇ、雄）に尾静脈から試料を１ｍｇ／ｋｇで注入した。投与後、３分〜７２時間に、ジエチルエーテル麻酔下、尾静脈より採血を行い、ヘパリンリチウムコーティング微量採血管に入れ、遠心分離後、血漿３０μＬをヘマトクリット管で採取した。放射能はガンマーカウンターを用いて測定した。125Ｉで標識したアルブミン四量体の血中消失半減期（τ1/2）は５．５時間であり、アルブミン単量体（２．３時間）に比べ、２．４倍に延長した。
【００８５】
例１３
例８で調製した（アルブミン−鉄ポルフィリン錯体）四量体（一酸化炭素錯体）水溶液（４ｍＬ）を１ｃｍ石英製分光用セルに入れ、氷水浴で冷やしながら、酸素を通気（フロー）しながら、ハロゲンランプ（５００Ｗ）を用いて光照射した（１０分間）。その後、得られた水溶液の紫外可視吸収スペクトル測定を行った。酸素錯体の形成を確認後、窒素を通気して、脱酸素を行いデオキシ体を調製した。（アルブミン−鉄（II）ポルフィリン錯体）四量体の窒素雰囲気下における吸収スペクトルは、λmaxが４４４、５３９、５６５ｎｍであり、包接されている鉄(II)ポルフィリン錯体は分子内軸塩基が１つ配位した鉄（II）高スピン５配位錯体を形成していることがわかった。この分散液に酸素を通気すると、その可視吸収スペクトルのλmaxは４２６、５４９ｎｍへ移行し、これは明らかに酸素化錯体になっていることを示す。この酸素化錯体溶液に窒素ガスを１分間吹き込むことにより、可視吸収スペクトルは酸素化型スペクトルからデオキシ型スペクトルへ可逆的に変化し、酸素の吸脱着が可逆的に生起することを確認した。なお、酸素を吹き込み、次に窒素を吹き込む操作を繰り返し、酸素吸脱着を連続して行うことができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清アルブミンを架橋剤を用いて共有結合により連結して得た構造明確なアルブミンクラスターと、それに金属ポルフィリン錯体を酸素吸脱着部位として包接させたアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター、およびそれを含有する人工酸素運搬体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンやミオグロビンの活性中心である鉄（II）ポルフィリン錯体は、酸素分子を可逆的に吸脱着して、生命活動に必要不可欠な酸素運搬・貯蔵の役割を演じている。このような酸素吸脱着機能を合成金属ポルフィリン錯体を構築して再現しようとする研究は、従来から数多く報告されている。初期の研究例としては、非特許文献１、非特許文献２等が代表的であり、また最近の開発動向については、非特許文献３、非特許文献４等に記載されている。とりわけ酸素親和性を上げる作用を有するイミダゾリル基を分子内に共有結合させた鉄（II）ポルフィリン錯体は、そのイミダゾールが中心鉄（II）の第５配位座に分子内配位で強固に固定されるため、安定な酸素錯体が生成できることが知られている。この場合、ポルフィリン／イミダゾールのモル比が１／１の最小必要量に抑えられるため、薬理作用や体内毒性の高いイミダゾール誘導体を過剰に共存させる必要もなく、生体内投与を目指した応用を考えた場合、きわめて有利となる。本発明者らの研究グループもポルフィリン環の２位にイミダゾリル基を共有結合で導入した鉄（II）ポルフィリン錯体を合成し、酸素の可逆的吸脱着を報告している（非特許文献５）。しかし、有機溶媒（例えば、トルエン、ベンゼン、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等）中で酸素錯体を形成できるこれら合成鉄（II）ポルフィリン錯体も、生理条件下（生理塩水溶液（ｐＨ７．４）中、室温ないし３７℃)では、中心鉄（II）が瞬時に酸化されてしまうため、充分な酸素結合能を発揮することはできない。可逆的な酸素配位活性を発現できるのは、ポルフィリンの中心鉄が２価の状態にある時のみで、中心鉄が酸化し、鉄（III）となると、酸素配位活性は完全に失われてしまうのである。つまり、これらの金属ポルフィリン錯体を医療用途、例えば人工血液、臓器保存液、人工肺等のための酸素供給液に利用する場合には、水中でもプロトンによる中心鉄の不可逆酸化を防止し、酸素配位錯体を安定に保全する技術が不可欠なのである。
【０００３】
水溶液中で微視的な疎水環境を提供する材料としては、リン脂質からなる二分子膜小胞体が知られている。本発明者らのグループは、金属ポルフィリン錯体をリン脂質二分子膜の疎水環境へ包埋させると、水相系においても酸素錯体が安定に存在し、生理条件下で有効に作用する人工酸素運搬体が提供できることを報告している（例えば、非特許文献６等）。しかしながら、これらの人工酸素運搬体では、多量のリン脂質を使用するため、工業的規模での製造、また代謝を含む生体適合性の点で、なお改善の余地が残されていた。そこで本発明者らは、より生体適合性に優れたキャリアーとして、血漿タンパク質の５０〜５５％を占め、生体内で種々の化合物（薬物、代謝産物等）の運搬をつかさどる血清アルブミンに着目し、これが金属ポルフィリン錯体に優れた疎水環境を提供するばかりでなく、所定の金属ポルフィリン錯体を取り込ませて調製したアルブミン−金属ポルフィリン錯体包接化合物（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）が水中で安定な酸素配位錯体を形成し、人工酸素運搬体として機能することを見出した（特許文献１）。
【０００４】
しかし、血液中における生体内アルブミン濃度は約４〜５ｗｔ％であることが知られており、生体内投与を想定して、アルブミン−金属ポルフィリン錯体水溶液のアルブミン濃度を４〜５ｗｔ％に調整すると、酸素結合席である金属ポルフィリン錯体の濃度は最大でも６ｍＭまでしか上げることはできない。この値はヒト血液のヘム濃度（９．２ｍＭ）の約６０％にすぎない。勿論、アルブミン−金属ポルフィリン錯体の濃度を増大させれば、酸素結合部位である金属ポルフィリン錯体の濃度が上昇するので、水溶液中の酸素溶解量を増やすことはできるが、生体内アルブミン濃度の増大は、膠質浸透圧の上昇を誘発するため好ましくない。
【０００５】
他方、より長時間、アルブミン−金属ポルフィリン錯体を血流中に滞留させることができれば、酸素輸送機能の持続的発現が可能となり、実用に耐える人工酸素運搬体が提供できる。出血ショック時などの病態では、血管の物質透過性が上昇しているため、アルブミン−金属ポルフィリン錯体の血中滞留時間は正常時に比べ、減少する可能性もある。このような病態では、金属ポルフィリン錯体を包接していない形態のもの、すなわち酸素輸送能はなくとも、血中滞留性の高いアルブミンは、循環血液量を回復させ保持する有効な血漿増量剤として作用するものと期待される。その点から、アルブミンの血中滞留時間を延長させる分子設計が望まれていた。
【０００６】
例えば、高分子化したアルブミン重合体には、１分子当り多くのポルフィリン金属錯体が包接されると期待される。その種の化合物としては、アルブミンをグルタルアルデヒドで重合したアルブミンマイクロスフェアーや、アルブミンを超音波処理して得たマイクロバブルスが知られ（非特許文献７、非特許文献８）、超音波イメージング、造影剤、ドラッグキャリアー、人工血小板などの用途として使用されている。しかし、これらのアルブミン重合体では、構成単位となるアルブミン分子（モノマー）の特異な高次構造は重合過程で既に失われており、その分子結合能はアルブミン単量体に比べ大きく変化していると考えてよい。また、重合度が高いために分子径は４μｍ以上と大きく、血中へ投与した場合、短時間内に細網内皮系などへ捕捉されることが推測される。
【０００７】
以上のような背景から、構成単位であるアルブミンの立体構造を保持したまま、ポルフィリン金属錯体などに対する分子包接能を変化させることなく、２〜７量体程度に連結された構造明確なアルブミン多量体の設計と合成が待たれていたのが現状であった。
【非特許文献１】J. P. Collman, Acc. Chem. Res., 10, 265 (1977)
【非特許文献２】F. Basolo, B. M. Hoffman, J. A. Ibers, Acc. Chem. Res., 8, 384 (1975)
【非特許文献３】Momentau et al., Chem. Rev., 110, 7690 (1994)
【非特許文献４】J. P. Collman, Chem. Rev., 104, 561 (2004)
【非特許文献５】E. Tsuchida et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1995, 747 (1995)
【非特許文献６】E. Tsuchida et al., J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1984, 1147 (1984)
【非特許文献７】T. Scotland, Biotechnol. Appl. Biochem. 18, 227 (1993)
【非特許文献８】K. S. Suslick, Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 7708 (1991)
【特許文献１】特開平０８−３０１８７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、１分子当りより多くの金属ポルフィリン錯体を酸素吸脱着部位として包接できる（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）多量体を合成し、コロイド浸透圧を生理的条件に保ちながら高濃度の酸素輸送が可能で、かつ血中滞留時間の長い人工酸素運搬体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、基本構成単位であるアルブミンの立体構造が保たれたアルブミン多量体（つまり個々のアルブミンの分子包接能は保持されるため、連結数に比例して分子包接数は増大する）の設計と機能発現に鋭意研究を重ねた結果、中心となる１分子のアルブミン（コアアルブミン）に二官能性架橋剤を介し、１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）を結合させることによりアルブミン多量体を調製すると、アルブミンが２〜７分子程度に結合されたアルブミン多量体が単離精製できることを見出した。アルブミンは、合計３５個のシステインを有するが、その３４個は計１７対のジスルフィド結合を形成し、高次構造を保持するために役立っている。つまり、残り一つの３４−システイン残基である活性チオール基をシェルアルブミンの結合位置として利用する方法により、１分子のコアアルブミンの周囲を複数のシェルアルブミンが取り囲む構造が確実に構築できるため、得られたアルブミン多量体はアルブミンクラスターともいえる。これらのアルブミンクラスターでは、１分子あたりの金属ポルフィリン錯体包接数がアルブミン単量体に比べ増大することを明らかにし、結果として高濃度酸素輸送に適した、さらに血中滞留性の高い新しい人工酸素運搬体が提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の側面によれば、中心となる１分子のアルブミン（コアアルブミン）に架橋剤を介し、１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）が結合されたことを特徴とするアルブミンクラスターが提供される。
【００１１】
第２の側面によれば、前記アルブミンクラスターに金属ポルフィリン錯体を包接させたことを特徴とするアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターが提供される。
【００１２】
さらに、第３の側面によれば、アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターを含む人工酸素運搬体が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のアルブミンクラスターは、基本構成単位であるアルブミンの高次構造が架橋により変化しないため、アルブミン自身の持つ分子包接能が保持されており、結果としてアルブミン分子数に比例した数の金属ポルフィリン錯体を包接できる特徴を持つ。つまり、本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターを含有する人工酸素運搬体は、コロイド浸透圧を生理的条件に保ちながら、血液よりも多くの酸素を輸送することのできる人工酸素運搬体として提供できる。また、本発明のアルブミンクラスターおよびアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターはアルブミン単量体に比べ分子径が大きいので、血中半減期の長い、血流中に長時間滞留できる新しい血漿増量剤または人工酸素運搬体として提供できる。さらに、本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターは、前記した人工酸素運搬体のほかにも、ガス吸着剤、酸素吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒等としても有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のアルブミンクラスターは、中心となる１分子のアルブミン（コアアルブミン）に二官能性架橋剤を介して１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）が結合されたアルブミン多量体であり、アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターは、前記したアルブミンクラスターに金属ポルフィリン錯体を包接させた複合体である。好ましくは、シェルアルブミンにおける架橋剤との結合部位がシステイン３４であり、コアアルブミンにおける架橋剤との結合部位がリジンで構成される。
【００１５】
架橋に利用される二官能性架橋剤は、上記式［Ｉ］または［II］で示されるものがよい。
【化７】
【００１６】
【化８】
【００１７】
式［Ｉ］において、Ｒ1は置換基を有してもよい炭化水素基である。そのような炭化水素基の例を挙げると、Ｃ1〜Ｃ12アルキレン基、アミド基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−基が介在したアルキレン基）、エステル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−ＯＣ（＝Ｏ）−基が介在したアルキレン基）、エーテル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−Ｏ−基が介在したアルキレン基）、シクロヘキシレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間にシクロヘキシレン基が介在したアルキレン基）、フェニレン基を含むＣ1〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間にフェニレン基が介在したアルキレン基）等である。
【００１８】
式［II］において、Ｒ2は置換基を有してもよい炭化水素基である。そのような炭化水素基の例を挙げると、Ｃ1〜Ｃ12アルキレン基、アミド基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−基が介在したアルキレン基）、エステル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−ＯＣ（＝Ｏ）−基が介在したアルキレン基）、エーテル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間に−Ｏ−基が介在したアルキレン基）、シクロヘキシレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間にシクロヘキシレン基が介在したアルキレン基）、フェニレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基（すなわち、隣接する２つの炭素原子の間にフェニレン基が介在したアルキレン基）等である。
【００１９】
包接されるポルフィリン金属錯体は、上記式［III］、［IV］、［Ｖ］または［VI］で示されるものがよい。
【化９】
【００２０】
【化１０】
【００２１】
【化１１】
【００２２】
【化１２】
【００２３】
式［III］で示されるポルフィリン金属錯体は、特開平６−２７１５７７号公報および特開２００３−４０８９３号公報に記載されている。式［III］において、Ｒ3は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ3が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’−ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’−ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基等である。ここでＲ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましい。
【００２４】
式［III］において、Ｒ4はアルキレン基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００２５】
式［III］において、Ｒ5はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基である。かかるＲ5の例を挙げると、水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００２６】
式［IV］で示されるポルフィリン金属錯体は、特開２００２−１２８７８１号公報に記載されている。式［IV］において、Ｒ6は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ6が1位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’−ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’−ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基等である。ここでＲ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましい。
【００２７】
式［IV］において、Ｒ4はアルキレン基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００２８】
式［IV］において、Ｒ5はアルキル基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキル基である。
【００２９】
式［IV］において、Ｍは中心遷移金属イオン（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００３０】
式［Ｖ］で示されるポルフィリン金属錯体は、特願２００４−１９０１８９号明細書に開示されている。式［Ｖ］において、Ｒ9は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ9が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’−ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’−ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基等である。ここでＲ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましい。
【００３１】
式［Ｖ］において、Ｒ10はアルキレン基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００３２】
式［Ｖ］において、Ｒ11はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第4〜5周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、好ましくは水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００３３】
式［Ｖ］で示される金属ポルフィリンは、例えば、次のようにして合成することができる。メソ−テトラキス（ｏ−アミノフェニル）ポルフィリンを適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム、テトラヒドロフランなど）に溶解し、そこにトリチルブロマイドおよびトリエチルアミンを加え、さらに１０分〜１時間撹拌後、溶媒を減圧除去する。得られたポルフィリンのトルエン溶液を活性アルミナおよびヘプタンの入った容器に加え、９０℃、遮光下にて１２〜２４時間撹拌する。ガラスフィルターでアルミナを濾別し、シリカゲルカラムによりメソ−トリ（α，α，α−ｏ−アミノフェニル）−β−ｏ−（Ｎ−トリフェニルメチル）アミノフェニルポルフィリンを分画精製する。得られたポルフィリンと適当な塩基（ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等）を適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム、テトラヒドロフラン等）に溶解した溶液を式Ｒ9ＣＯＣｌ（ここで、Ｒ9は、上記定義の通り）で示される酸クロライドに滴下し、窒素雰囲気下、室温で２〜１５時間撹拌する。溶媒を減圧除去後、クロロホルム、水を添加、水層をクロロホルムで洗浄後、有機層を回収し、溶媒を減圧除去する。得られた残渣をシリカゲルカラムで分画精製し、真空乾燥することで、メソ−トリ（α，α，α−ｏ−（置換アミド））−β−ｏ−（Ｎ−トリフェニルメチル）アミノフェニルポルフィリンを固体として得る。得られたポルフィリンと適当な塩基（ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等）を適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム、テトラヒドロフラン等）に溶解した溶液を下記一般式［VII］で示されるω−イミダゾリルカルボン酸（一般式［VII］において、Ｒ10〜Ｒ11は、上記定義の通り）の酸クロライドに滴下し、窒素雰囲気下、室温で２〜１５時間撹拌する。
【化１３】
【００３４】
ついで、溶媒を減圧除去後、クロロホルム層を水洗し、溶媒を減圧除去する。得られた残渣をシリカゲルカラムで分画精製し、真空乾燥することで、式［Ｖ］で示されるポルフィリン化合物を得ることができる。
【００３５】
こうして得られたポルフィリン化合物への中心金属導入は、例えばD. Dolphin編、The Porphyrin、1978年、アカデミック・プレス社などに記載の一般法により達成され、相当のポルフィリン金属錯体として得られる。
【００３６】
式［VI］で示されるポルフィリン金属錯体は、上記特許文献１（特開平０８−３０１８７３号公報）に記載されている。式［VI］において、Ｒ12は炭化水素基である。Ｒ12は水素原子、ビニル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基が好ましい。
【００３７】
式［VI］において、Ｒ13はアルキル基であり、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキル基である。
【００３８】
式［VI］において、Ｒ14はアルキレン基であり、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００３９】
式［VI］において、Ｒ15はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基である。かかるＲ15の例を挙げると、水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００４０】
本発明の金属ポルフィリン錯体を包接したアルブミンは、金属ポルフィリン錯体の結合をもたらすアミノ酸を遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入した組換えアルブミンに、金属ポルフィリン錯体を軸配位させて得た組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体であってもよい。このような組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、特表２００２−５００８６２号公報に記載されている。導入されるアミノ酸はヒスチジンが好ましく、導入位置はサブドメインＩＢが好ましい。この場合の金属ポルフィリン錯体は、軸塩基配位子を分子内に持っていない金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリン、金属オクタエチルポルフィリンが好ましい。
【００４１】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターにおいて、中心遷移金属イオンＭは好ましくは、ＦｅまたはＣｏである。Ｆｅの原子価は＋２価または＋３価であり得、Ｃｏの原子価は＋２価であり得る。
【００４２】
また、本発明のアルブミンクラスターおよびアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターにおいて、アルブミンはヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミンが好ましい。
【００４３】
上記したアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターは、酸素を可逆的に結合できるので、人工酸素運搬体としての機能を発現することはもちろん、一分子当りに多くの金属ポルフィリン錯体を包接できる特徴を持つ。つまり、体内に投与した場合、コロイド浸透圧を生理条件に保ちながら、血液よりも多くの酸素を輸送することが期待される。さらに、分子径が大きいので、より長い血中滞留時間も期待できる。
【００４４】
工酸素運搬体の適応は、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の血液代替物）のほか、術前血液希釈液、人工心肺等体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全等）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、癌治療用増感剤、再生組織細胞の培養液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用、が期待されている。
【００４５】
加えて、金属ポルフィリン錯体の中心金属が例えば第４〜５周期に属する金属イオンである場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のアルブミン−金属錯体クラスターは、人工酸素運搬体のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。
【００４６】
本発明のアルブミンクラスターおよびアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターの製造方法に制限はないが、例えば次の方法により合成される。
【００４７】
０．１〜２５ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％のアルブミン（１〜２５ｍＬ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４)に、α−スクシンイミジル−ω−ピリジルジチオ型架橋剤、例えばＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰＨ）のエタノール溶液を撹拌しながら添加し（ＳＰＤＰＨ／アルブミン＝１０（モル／モル））、室温で、１０〜６０分、好ましくは２０〜３０分間反応させた。限外濾過装置（ADVANTEC UHP-76K）と分画分子量５ｋＤａの膜（ADVANTEC Q0500 076E）を用いて未反応のＳＰＤＰＨを除去し、６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートアルブミン（ＰＤＰＨ−アルブミン）（コアアルブミンとなる）溶液を得る。アルブミン濃度の定量は、一般法であるブロモクレゾールグリーン法（和光純薬社製、アルブミンテストワコー）により行い、［ＰＤＰＨ−アルブミン］が１〜１０ｗｔ％であることが確認される。
【００４８】
ピリジルジチオ基の導入数は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いてジスルフィド結合を還元し、遊離した２−チオピリジノン（ε343＝８．１×１０3Ｍ-1ｃｍ-1）の定量から決定することができる。例えば、ＰＤＰＨ−アルブミンのＰＢＳ溶液（［アルブミン］＝３０μＭ）３ｍＬに、アルブミンに対して５〜５０倍モル、好ましくは１０〜２５倍モルのＤＴＴを添加、よく混合した後、１〜３０分静置してから、１９０〜７００ｎｍの範囲において紫外可視吸収スペクトル測定を行う。３４３ｎｍの吸光度から、溶液中のピリジルジチオ基の濃度を算出し、アルブミン１分子当たりのピリジルジチオ基数に換算する。
【００４９】
他方、０．１〜２５ｗｔ％、好ましくは１〜１０ｗｔ％のアルブミン（１〜２５ｍＬ）のリン酸緩衝水溶液（ＰＢ，１０ｍＭ、ｐＨ７．０）に１Ｍ ＤＴＴ水溶液（ＤＴＴ／アルブミン＝１〜１０、好ましくは２〜４）を添加し、よく振とうし、室温で１０〜６０分、好ましくは２０〜４０分静置する。その後、限外濾過装置を用いてアルブミンに添加したＤＴＴを除去する。アルブミン溶液をＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）で充分洗浄した後、濃縮し、還元型アルブミン溶液を得た。アルブミン濃度の定量は、ブロモクレゾールグリーン法により行い、［還元型アルブミン］が１〜１０ｗｔ％であることを確認する。
【００５０】
ＰＤＰＨ−アルブミン水溶液に、還元型アルブミン水溶液を添加し、室温で１０〜３０時間、好ましくは１５〜２５時間反応させる。反応溶液のNative-PAGE電気泳動には独立した複数のバンドが現れ、分子量マーカーとの比較から、アルブミン多量体の生成が確認できる。ＨＰＬＣ測定（昭和電工、Shodex Protein KW-803、流速１．０ｍＬ／分、移動相：ＰＢＳ)でも、アルブミン多量体成分に基づく幅広いピークが観測されるので、その生成が確認できる。また、この溶出曲線をピークフィッティングすると各成分に相当したピークに分離され、電気泳動の結果と一致する。
【００５１】
各成分をゲルカラムクロマトグラフィー（Pharmacia社製、Superdex 200pg、分画分子量：１０〜６００ｋＤａ、５ｃｍφ×４０ｃｍ）で精製し、単離した各成分を再度ＨＰＬＣ測定すると、不純物を含まない単一物質であることがわかる。
【００５２】
精製したアルブミン多量体の分子量をマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）(島津製作所、AXIMA-CFR Kompact MALDI)を用いて測定すると、実測分子量が計算分子量と同等であることがわかり、アルブミン多量体が単離されたことが明確となる。
【００５３】
アルブミンクラスターのＣＤスペクトルは、２０８、２２２ｎｍに極小値を持つ負のスペクトルパターンを示し、２０８、２２２ｎｍにおけるモル楕円率（［θ］208＝１．９×１０4、［θ］222＝１．８×１０4（ｄｅｇ ｃｍ2 ｄｍｏｌ-1））はアルブミン単量体の値と一致する。また、等電点（４．８）もアルブミン単量体の値と同等となる。これらの結果は、アルブミンクラスターを構成するアルブミンの二次構造や表面電荷が、クラスター形成後も変化していないことを示すことになる。
【００５４】
アルブミン多量体の透過型電子顕微鏡観察から、アルブミンクラスターの形態がわかる。
【００５５】
このようにして得られたアルブミンクラスターに特開２００３−４０８９３号公報に記載の方法により合成された、例えば２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接させる（アルブミン濃度：０．０５〜１０ｗｔ％、好ましくは０．１〜５．０ｗｔ％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：１〜１００（モル／モル）、好ましくは４〜６５）。
【００５６】
アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターの鉄イオン濃度は、誘導プラズマ発光分析（ＩＣＰ、セイコーインスツルメンツ製ＳＰＳ ７０００Ａ）を用いて測定する。得られた濃度は、鉄ポルフィリン錯体濃度の指標とできるので、一分子のアルブミンクラスターに何分子の鉄ポルフィリン錯体が包接されているかがわかる。
【００５７】
アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターは、いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素吸脱着剤、酸素運搬体として作用する。
【００５８】
酸素以外にも金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素等）。これらの理由から、本発明の金属ポルフィリン錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、有効な人工酸素運搬体として機能することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【００５９】
放射性原子で標識したアルブミンクラスター、例えばヨウ素１２５で標識したアルブミンクラスター水溶液を麻酔下のウイスターラットに尾静脈から投与し、その後の経時的採血から血漿中に含まれるアルブミンクラスターの濃度を定量すると、その血中滞留時間を測定できる。アルブミンクラスターの血中半減期は５〜８時間であり、これは同条件で測定したアルブミン単量体に比べて２〜４倍に延長していることになる。
【実施例】
【００６０】
以下、この発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明が実施例のものに限定されないことは、いうまでもないことである。
【００６１】
例１
ヒト血清アルブミンのＰＢＳ溶液（５ｗｔ％、２．０ｍＬ）にＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰＨ）のエタノール溶液（２０ｍＭ、０．７５ｍＬ）を撹拌しながら添加し（ＳＰＤＰＨ／アルブミン＝１０（モル／モル））、室温で２０分間、ゆっくりと攪拌する。限外濾過装置（ADVANTEC UHP-76K）と分画分子量５０ｋＤａの膜（ADVANTEC Q0500 076E）を用いて、濃縮とＰＢＳによる希釈を繰り返し、未反応のＳＰＤＰＨを除去、最終的には、６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートアルブミン（ＰＤＰＨ−アルブミン、５．１５ｗｔ％、２ｍＬ）（コアアルブミンとなる）溶液を得た。アルブミン濃度の定量は、一般法であるブロモクレゾールグリーン法（和光純薬社製、アルブミンテストワコー）により行った。
【００６２】
ピリジルジチオ基の導入数は、ＤＴＴを用いてジスルフィド結合を還元することにより遊離した２−チオピリジノン（ε343＝８．１×１０３Ｍ-1ｃｍ-1）の定量から決定した。ＰＤＰＨ-アルブミンのＰＢＳ溶液（［アルブミン］＝３０μＭ）３ｍＬに、アルブミンに対して１５倍モルのＤＴＴを添加し、よく混合した後、１０分静置してから、１９０〜７００ｎｍの範囲において紫外可視吸収スペクトル測定を行い、３４３ｎｍの吸光度から、溶液中のピリジルジチオ基の濃度を算出した。アルブミン１分子当たり８．６本のＰＤＰＨ鎖が導入されていることを明らかにした。
【００６３】
他方、ヒト血清アルブミンのリン酸緩衝水溶液（ＰＢ、１０ｍＭ、ｐＨ７．０）（５ｗｔ％、２０ｍＬ）に１ＭのＤＴＴ水溶液５６μＬ（ＤＴＴ/アルブミン＝３）を添加し、よく振とうさせ、室温で３０分静置した。その後、限外濾過装置を用いて上記と同様な方法で、アルブミンに添加したＤＴＴを除去した。最終的には１３ｍＬに定量し、還元型アルブミンを得た（［還元型アルブミン濃度］＝７．８ｗｔ％）。
【００６４】
このようにして得た、還元型アルブミン水溶液をＰＤＰＨ−アルブミンに添加し、室温で２０時間ゆっくりと攪拌した。反応溶液のNative-PAGE電気泳動には６つの独立した明確なバンドが現れ、分子量マーカーとの比較から、アルブミン二、三、四、五、六量体が形成されていることがわかった。ＨＰＬＣ測定（昭和電工、Shodex Protein KW-803、流速１．０ｍＬ／分、移動相：ＰＢＳ）でも、６．５〜８．５分にアルブミン多量体成分に基づく幅広いピークが観測され、この溶出曲線をピークフィッティングしたところ、６つの明確なピーク(１〜６)に分離でき、電気泳動の結果と一致した。
【００６５】
アルブミン多量体各成分をゲルカラムクロマトグラフィー（Pharmacia社製、Superdex 200pg、分画分子量：１０〜６００ｋＤａ、５ｃｍφ×４０ｃｍ）を用いて分離した。精製した各成分のＨＰＬＣ測定を再度行い、各成分が単ピークであることを確認した。
【００６６】
精製したアルブミンクラスターについて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）(島津製作所、AXIMA-CFR Kompact MALDI)により分子量の測定を行うと、実測分子量が計算分子量と同等で、アルブミン多量体が単離できたことが実証された。例えば、アルブミン三量体の分子量（実測値：２００，４６９、計算値：２０１，６１４）、アルブミン四量体の分子量（実測値：２６６，５３８、計算値：２６７，９５３）であった。
【００６７】
アルブミンクラスターのＣＤスペクトルは、２０８、２２２ｎｍに極小値を持つ負のスペクトルパターンを示し、２０８、２２２ｎｍにおけるモル楕円率（［θ］208＝１．９×１０4、［θ］222＝１．８×１０4（ｄｅｇ ｃｍ2 ｄｍｏｌ-1））はアルブミン単量体の値と一致した。また、等電点（４．８）もアルブミン単量体の値と同一となった。これらの結果から、アルブミンクラスターの構成単位であるアルブミンの二次構造や表面電荷は、クラスター形成後も変化していないことが明らかとなった。
【００６８】
透過型電子顕微鏡観察から、アルブミン四量体は均一な粒径約２０ｎｍの球状粒子構造であることがわかった。
【００６９】
例２
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、Ｎ−スクシンイミジル−１２−（２−ピリジルジチオ）オクタデカノエートを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から７量体が形成された。
【００７０】
例３
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエンを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から５量体が形成された。
【００７１】
例４
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステルを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から４量体が形成された。
【００７２】
例５
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から７量体が形成された。
【００７３】
例６
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−６−アミドカプロエートを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から６量体が形成された。
【００７４】
例７
例１で使用したＮ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートの代わりに、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）オクチレートを用いた以外は全く同様な方法に従って、アルブミンクラスターを得た。アルブミン２量体から６量体が形成された。
【００７５】
例８
例１で調製したアルブミン４量体のＰＢＳ溶液（５．６２５μＭ、６ｍＬ）に、特開２００３−４０８９３号公報に記載の方法により合成された、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体のエタノール溶液（６３８μＭ、１．８ｍＬ）を一酸化炭素雰囲気下で加え（鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：３４（モル／モル））、充分に混合した後、透析によりエタノールを除去し、（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）四量体溶液を得た。
【００７６】
アルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターのアルブミン濃度の定量は、ブロモクレゾールグリーン法により行い、鉄ポルフィリン錯体濃度（鉄イオン濃度）の定量は、誘導プラズマ発光分析（ＩＣＰ、セイコーインスツルメンツ製ＳＰＳ ７０００A)を用いて実施した。得られた各濃度の比率から、アルブミン四量体には３１．６個の鉄ポルフィリン錯体が包接されていることがわかった。アルブミン単量体１分子当りの鉄ポルフィリン包接数は、最大約８であることから（特開２００３−４０８９３号公報）、アルブミンクラスターにおける構成アルブミン単位当りの鉄ポルフィリン錯体包接数は、クラスター形成後も変化ないことが明らかとなった。
【００７７】
また（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）四量体のＣＤスペクトル測定（日本分光社製、JASCO J-725)を行い、そのＣＤスペクトルパターンが鉄ポルフィリン錯体を包接していないアルブミン四量体のものと一致することを明らかにした。等電点も４．８で、アルブミン単量体の値と同等であった。これらの結果は、鉄ポルフィリン錯体を包接した後も、アルブミンクラスターを構成する個々のアルブミンの二次構造や表面電荷は変化していないことを示している。
【００７８】
例９
例８において、例１で調製したアルブミン四量体の代わりに例２で調製したアルブミン三量体（５．６２５μＭ、６ｍＬ）を、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体の代わりに、特開２００３−４０８９３号公報に記載の方法により合成された、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−アダマンタンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体のエタノール溶液（４８８μＭ、１．８ｍＬ）を鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：２６（モル／モル）の割合で混合した以外は、全く同様な方法に従って、（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）三量体を得た。アルブミン三量体１分子に包接されている、鉄ポルフィリン錯体の数は、２４．２であった。
【００７９】
また、ＣＤスペクトルパターンと等電点（４．８）は、鉄ポルフィリン錯体を包接した後も変化なく、アルブミンクラスターを構成する個々のアルブミンの二次構造や表面電荷に変化がないことがわかった。
【００８０】
例１０
例８において、例１で調製したアルブミン四量体の代わりに例３で調製したアルブミン４量体（５．６２５μＭ、６ｍＬ）を、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体の代わりに、特願２００４−１９０１８９号明細書に開示されている方法により合成された、５，１０，１５−トリス（α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）−２０−モノ（β−O−（６−（２−メチルイミダゾリル）ヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体のエタノール溶液（６３８μＭ、１．８ｍＬ）を鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：３４（モル／モル）の割合で混合した以外は、全く同様な方法に従って、（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）四量体を得た。アルブミン四量体１分子に包接されている、鉄ポルフィリン錯体の数は、３２．７であった。
【００８１】
また、ＣＤスペクトルパターンと等電点（４．８）は、鉄ポルフィリン錯体を包接した後も変化なく、アルブミンクラスターを構成する個々のアルブミンの二次構造や表面電荷に変化がないことがわかった。
【００８２】
例１１
例８において、例１で調製したアルブミン四量体の代わりに例１で調製したアルブミン３量体（５．６２５μＭ、６ｍＬ）を、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−O−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体の代わりに、特願２００４−１９０１８９号明細書に開示されている方法により合成された、５，１０，１５−トリス（α，α，α−O−（１−アダマンタンアミド）フェニル）−２０−モノ（β−O−（６−（２−メチルイミダゾリル）ヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体のエタノール溶液（４８８μＭ、１．８ｍＬ）を鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：２７（モル／モル）の割合で混合した以外は、全く同様な方法に従って、（アルブミン−金属ポルフィリン錯体）三量体を得た。アルブミン三量体１分子に包接されている、鉄ポルフィリン錯体の数は、２４．４であった。
【００８３】
また、ＣＤスペクトルパターンと等電点（４．８）は、鉄ポルフィリン錯体を包接した後も変化なく、アルブミンクラスターを構成する個々のアルブミンの二次構造や表面電荷に変化がないことがわかった。
【００８４】
例１２
例１で調製したアルブミン四量体をヨウ素１２５（125Ｉ）で放射化ラベルし、得られた125Ｉ−アルブミン四量体（比放射能：１８．５ＭＢｑ／ｍＬ（２４．３ＭＢｑ／ｍｇ）、０．１３ｗｔ％、１８０μＬ）を非標識のアルブミン四量体（４００μＬ）で希釈して、投与液を調製（０．２４７ｗｔ％、５．７４ＭＢｑ／ｍＬ）した。ジエチルエーテル麻酔下のラット（体重：約３００ｇ、雄）に尾静脈から試料を１ｍｇ／ｋｇで注入した。投与後、３分〜７２時間に、ジエチルエーテル麻酔下、尾静脈より採血を行い、ヘパリンリチウムコーティング微量採血管に入れ、遠心分離後、血漿３０μＬをヘマトクリット管で採取した。放射能はガンマーカウンターを用いて測定した。125Ｉで標識したアルブミン四量体の血中消失半減期（τ1/2）は５．５時間であり、アルブミン単量体（２．３時間）に比べ、２．４倍に延長した。
【００８５】
例１３
例８で調製した（アルブミン−鉄ポルフィリン錯体）四量体（一酸化炭素錯体）水溶液（４ｍＬ）を１ｃｍ石英製分光用セルに入れ、氷水浴で冷やしながら、酸素を通気（フロー）しながら、ハロゲンランプ（５００Ｗ）を用いて光照射した（１０分間）。その後、得られた水溶液の紫外可視吸収スペクトル測定を行った。酸素錯体の形成を確認後、窒素を通気して、脱酸素を行いデオキシ体を調製した。（アルブミン−鉄（II）ポルフィリン錯体）四量体の窒素雰囲気下における吸収スペクトルは、λmaxが４４４、５３９、５６５ｎｍであり、包接されている鉄(II)ポルフィリン錯体は分子内軸塩基が１つ配位した鉄（II）高スピン５配位錯体を形成していることがわかった。この分散液に酸素を通気すると、その可視吸収スペクトルのλmaxは４２６、５４９ｎｍへ移行し、これは明らかに酸素化錯体になっていることを示す。この酸素化錯体溶液に窒素ガスを１分間吹き込むことにより、可視吸収スペクトルは酸素化型スペクトルからデオキシ型スペクトルへ可逆的に変化し、酸素の吸脱着が可逆的に生起することを確認した。なお、酸素を吹き込み、次に窒素を吹き込む操作を繰り返し、酸素吸脱着を連続して行うことができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心となるアルブミン（コアアルブミン）に架橋剤を介し、１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）が共有結合されたアルブミン多量体、すなわちアルブミンクラスター。
【請求項２】
コアアルブミンにおける架橋剤の結合部位がリジンである請求項１記載のアルブミンクラスター。
【請求項３】
シェルアルブミンにおける架橋剤の結合位置がシステイン３４である請求項１または請求項２記載のアルブミンクラスター。
【請求項４】
架橋剤とコアアルブミンとの結合様式がアミド結合、架橋剤とシェルアルブミンとの結合様式がジスルフィド結合またはスルフィド結合である請求項３記載のアルブミンクラスター。
【請求項５】
シェルアルブミンの数が１〜６である請求項４記載のアルブミンクラスター。
【請求項６】
アルブミンがヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミンである請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルブミンクラスター。
【請求項７】
コアアルブミンとシェルアルブミンを連結する二官能性架橋剤が、一般式［Ｉ］
【化１】
（ここで、Ｒ1は置換基を有してもよい炭化水素基）で示されることを特徴とする請求項６に記載のアルブミンクラスター。
【請求項８】
前記二官能性架橋剤のＲ1がＣ1〜Ｃ12アルキレン基、アミド基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、エステル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、エーテル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、シクロヘキシレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、またはフェニレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基であることを特徴とする請求項７に記載のアルブミンクラスター。
【請求項９】
コアアルブミンとシェルアルブミンを連結する二官能性架橋剤が、一般式［II］
【化２】
（ここで、Ｒ1は置換基を有してもよい炭化水素基）で示されることを特徴とする請求項６に記載のアルブミンクラスター。
【請求項１０】
前記二官能性架橋剤のＲ2がＣ1〜Ｃ12アルキレン基、アミド基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、エステル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、エーテル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、シクロヘキシレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、またはフェニレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基であることを特徴とする請求項９に記載のアルブミンクラスター。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載のアルブミンクラスターを有効成分とする人工血漿増量剤。
【請求項１２】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載のアルブミンクラスターに、金属ポルフィリン錯体を包接させて得たアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１３】
前記金属ポルフィリン錯体が、一般式［III］
【化３】
（ここで、Ｒ3は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ4はアルキレン基、Ｒ5はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基）で示されることを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１４】
前記金属ポルフィリン錯体のＲ3が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ4がＣ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ5が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基で示されることを特徴とする請求項１３に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１５】
前記金属ポルフィリン錯体のＲ3が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基であることを特徴とする請求項１４に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１６】
前記金属ポルフィリン錯体が、一般式［IV］
【化４】
（ここで、Ｒ6は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ7はアルキレン基、Ｒ8はアルキル基、Ｍは中心遷移金属イオン（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン））で示される金属ポルフィリン錯体で示されることを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１７】
Ｒ6が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ7がＣ1〜Ｃ6アルキレン基であり、Ｒ8がＣ1〜Ｃ6アルキル基であることを特徴とする請求項１６に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１８】
前記金属ポルフィリン錯体のＲ6が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基であることを特徴とする請求項１７に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１９】
前記金属ポルフィリン錯体が、一般式［Ｖ］
【化５】
（ここで、Ｒ9は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ10はアルキレン基、Ｒ11はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基）で示されることを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２０】
Ｒ9が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ10がＣ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ11が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基で示される請求項１９に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２１】
Ｒ9が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基であることを特徴とする請求項２０に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２２】
前記金属ポルフィリン錯体が、一般式［VI］
【化６】
（ここで、Ｒ12は炭化水素基、Ｒ13はアルキル基、Ｒ14はアルキレン基、Ｒ15はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基）で示されることを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２３】
前記金属ポルフィリン錯体のＲ12が水素原子、ビニル基、エチル基、ホルミル基、もしくはアセチル基であり、Ｒ13がＣ1〜Ｃ10アルキル基であり、Ｒ14がＣ1〜Ｃ10アルキレン基でありＲ15が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基であることを特徴とする請求項２２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２４】
血清アルブミンが、金属ポルフィリンの結合をもたらすアミノ酸を遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入された組換えヒト血清アルブミンであり、金属ポルフィリン錯体を軸配位結合させることにより固定させたことを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２５】
金属ポルフィリン錯体のＭがＦｅまたはＣｏであることを特徴とする請求項１２、１５、１８、２１、２３、２４いずれか１項に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２６】
Ｆｅの価数が＋２価または＋３価である請求項２５記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２７】
Ｃｏの価数が＋２価である請求項２５に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２８】
請求項２６〜２７いずれか１項に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターを有効成分とする人工酸素運搬体。
【請求項１】
中心となるアルブミン（コアアルブミン）に架橋剤を介し、１個または複数個のアルブミン（シェルアルブミン）が共有結合されたアルブミン多量体、すなわちアルブミンクラスター。
【請求項２】
コアアルブミンにおける架橋剤の結合部位がリジンである請求項１記載のアルブミンクラスター。
【請求項３】
シェルアルブミンにおける架橋剤の結合位置がシステイン３４である請求項１または請求項２記載のアルブミンクラスター。
【請求項４】
架橋剤とコアアルブミンとの結合様式がアミド結合、架橋剤とシェルアルブミンとの結合様式がジスルフィド結合またはスルフィド結合である請求項３記載のアルブミンクラスター。
【請求項５】
シェルアルブミンの数が１〜６である請求項４記載のアルブミンクラスター。
【請求項６】
アルブミンがヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミンである請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルブミンクラスター。
【請求項７】
コアアルブミンとシェルアルブミンを連結する二官能性架橋剤が、一般式［Ｉ］
【化１】
（ここで、Ｒ1は置換基を有してもよい炭化水素基）で示されることを特徴とする請求項６に記載のアルブミンクラスター。
【請求項８】
前記二官能性架橋剤のＲ1がＣ1〜Ｃ12アルキレン基、アミド基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、エステル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、エーテル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、シクロヘキシレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、またはフェニレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基であることを特徴とする請求項７に記載のアルブミンクラスター。
【請求項９】
コアアルブミンとシェルアルブミンを連結する二官能性架橋剤が、一般式［II］
【化２】
（ここで、Ｒ1は置換基を有してもよい炭化水素基）で示されることを特徴とする請求項６に記載のアルブミンクラスター。
【請求項１０】
前記二官能性架橋剤のＲ2がＣ1〜Ｃ12アルキレン基、アミド基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、エステル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、エーテル基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、シクロヘキシレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基、またはフェニレン基を含むＣ2〜Ｃ12アルキレン基であることを特徴とする請求項９に記載のアルブミンクラスター。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載のアルブミンクラスターを有効成分とする人工血漿増量剤。
【請求項１２】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載のアルブミンクラスターに、金属ポルフィリン錯体を包接させて得たアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１３】
前記金属ポルフィリン錯体が、一般式［III］
【化３】
（ここで、Ｒ3は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ4はアルキレン基、Ｒ5はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基）で示されることを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１４】
前記金属ポルフィリン錯体のＲ3が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ4がＣ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ5が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基で示されることを特徴とする請求項１３に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１５】
前記金属ポルフィリン錯体のＲ3が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基であることを特徴とする請求項１４に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１６】
前記金属ポルフィリン錯体が、一般式［IV］
【化４】
（ここで、Ｒ6は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ7はアルキレン基、Ｒ8はアルキル基、Ｍは中心遷移金属イオン（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン））で示される金属ポルフィリン錯体で示されることを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１７】
Ｒ6が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ7がＣ1〜Ｃ6アルキレン基であり、Ｒ8がＣ1〜Ｃ6アルキル基であることを特徴とする請求項１６に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１８】
前記金属ポルフィリン錯体のＲ6が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基であることを特徴とする請求項１７に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項１９】
前記金属ポルフィリン錯体が、一般式［Ｖ］
【化５】
（ここで、Ｒ9は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ10はアルキレン基、Ｒ11はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基）で示されることを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２０】
Ｒ9が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ10がＣ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ11が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基で示される請求項１９に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２１】
Ｒ9が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基であることを特徴とする請求項２０に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２２】
前記金属ポルフィリン錯体が、一般式［VI］
【化６】
（ここで、Ｒ12は炭化水素基、Ｒ13はアルキル基、Ｒ14はアルキレン基、Ｒ15はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基）で示されることを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２３】
前記金属ポルフィリン錯体のＲ12が水素原子、ビニル基、エチル基、ホルミル基、もしくはアセチル基であり、Ｒ13がＣ1〜Ｃ10アルキル基であり、Ｒ14がＣ1〜Ｃ10アルキレン基でありＲ15が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基であることを特徴とする請求項２２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２４】
血清アルブミンが、金属ポルフィリンの結合をもたらすアミノ酸を遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入された組換えヒト血清アルブミンであり、金属ポルフィリン錯体を軸配位結合させることにより固定させたことを特徴とする請求項１２に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２５】
金属ポルフィリン錯体のＭがＦｅまたはＣｏであることを特徴とする請求項１２、１５、１８、２１、２３、２４いずれか１項に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２６】
Ｆｅの価数が＋２価または＋３価である請求項２５記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２７】
Ｃｏの価数が＋２価である請求項２５に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスター。
【請求項２８】
請求項２６〜２７いずれか１項に記載のアルブミン−金属ポルフィリン錯体クラスターを有効成分とする人工酸素運搬体。
【公開番号】特開２００７−９９９００（Ｐ２００７−９９９００Ａ）
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９１４５３（Ｐ２００５−２９１４５３）
【出願日】平成１７年１０月４日（２００５．１０．４）
【出願人】（０００２１８７１９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月４日（２００５．１０．４）
【出願人】（０００２１８７１９）
【Ｆターム（参考）】
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