インターフェロン−タウを用いるＣ型肝炎ウイルスの処置のための組成物およびモニタリングの方法
【課題】Ｃ型肝炎の処置において、強力な抗ウイルス活性を有し、そして重篤な副作用がより少ない新しい治療候補物を同定することが望まれる。
【解決手段】インターフェロン−タウを用いるＣ型肝炎ウイルスの処置のための組成物およびモニタリングの方法が提供される。
【解決手段】インターフェロン−タウを用いるＣ型肝炎ウイルスの処置のための組成物およびモニタリングの方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロンタウ（ＩＦＮ−τ）を用いる、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染により引き起こされる肝炎に関連した状態を処置するための組成物に関する。本発明はまた、２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血中レベルを測定することによるＨＣＶの処置のモニタリングの方法に関連する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎は（ＨＣＶ）は、世界中で１億７千万、そしていくつかの国では、人口の１０％より多いと見積もられる人々が罹患しているという主要な公衆衛生問題である（Ｌｅｃｈｎｅｒら、２０００）。ＨＣＶは、感染血液および血液製剤の輸血により主に伝播される（Ｃｕｔｈｂｅｒｔら、１９９４；Ｍａｎｓｅｌｌら、１９９５）。Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎは、ＨＣＶが毎年、合衆国における急性肝炎の新しい１６０，０００症例の原因であると見積もっている。従って、効果的な抗ＨＣＶ薬剤の緊急の医学的必要性が存在する。
【０００３】
ＨＣＶは、正鎖であり、フラビウイルスファミリーの脂質エンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、およそ１万ヌクレオチド長である（Ｃｈｏｏら、１９８９）。ＨＣＶ（Ｂ型肝炎ウイルスと異なり）は、ＤＮＡ中間体を有さず、従って、宿主ゲノムに組み込まれ得ない（Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒら、１９９６）。ＨＣＶはクローン化されているが、このウイルスは、インビトロで培養することが困難であった（Ｔｒｅｐｏ、２０００）。ＨＣＶは、非常に永続的であり、感染した個体の８５％で慢性感染を生ずるが、この永続性の機構は未知である（Ｔｒｅｐｏ、２０００）。
【０００４】
ＨＣＶの処置は、炎症および肝臓細胞の損傷を軽減することで補助され、これにより、硬変および肝細胞癌を防ぐ（Ｈｏｒｉｉｋｅら、１９９８；Ｂｅｎｖｅｇｎｕら、１９９８）。ＨＣＶに現在利用可能な治療は、感染した患者のわずかな小集団に有効であるのみである（Ｍａｇｒｉｎら、１９９４；Ｃｈｏｏら、１９９１；Ｃｈｏｏら、１９８９）。ＩＦＮ−αは、１９９１年に合衆国で、そして１９９２年に日本で慢性Ｃ型肝炎の治療に導入された（Ｓａｉｔｏら、２０００）。しかし、臨床的効力を得るために十分な投薬量（すなわち、約１×１０6単位／１処置、およびそれより多く）のＩＦＮ−αの使用には、通常、発熱、頭痛、嗜眠、関節痛および筋肉痛によって特徴付けられる「インフルエンザ様」の症候群を伴う（Ｔｙｒｉｎｇら、１９９２）。５〜１０×１０6単位／１処置、およびそれより多い用量では、他の毒性、例えば、悪心、嘔吐、下痢および食欲不振がより高頻度となる。神経精神医学的な症状もまた、ＩＦＮ−α処置と関連して報告されている（Ｄｉｅｐｅｒｉｎｋら、２０００）。さらに、いくつかの研究は、ＩＦＮ−α処置の効力が用量依存性でないこと（Ｓａｉｔｏら、２０００）、およびＩＦＮ−αでの処置は、新生物またはウイルス性肝炎を有する患者における自己免疫障害の発症または増悪に関連していること（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｓａｅｎｚら、２０００）を示唆する。
【０００５】
リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、ウイルスｍＲＮＡ合成を妨害することならびに広範なＲＮＡおよびＤＮＡウイルスのインビボおよびインビトロでの複製を阻害することが見出されているプリンヌクレオシドアナログである（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、１９８６；Ｂａｌｚａｒｉｎｉら、１９９１）。リバビリンは、アミノトランスフェラーゼレベルの正常化において有効であることが示されたが、慢性Ｃ型肝炎患者における血清のＨＣＶのＲＮＡ価に対する活性はわずかである（Ｄｉ Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅら、１９９２）。しかし、リバビリンの有益な効果でさえ、一過性であり（Ｃｌａｒｋｅ、２０００；Ｋｏｓｋｉｎａｓら、１９９５）、そして重篤な副作用のために、ＩＦＮαとの組み合わせにおけるリバビリンは、許容困難で有り得る（Ｃｏｔｌｅｒら、２０００）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在のＨＣＶ処置方法に関連する欠点のために、本発明者らは、より強力な抗ウイルス活性を有し、そして重篤な副作用がより少ない新しい治療候補物を同定することを計画した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＨＣＶ感染患者におけるＨＣＶの処置に用いるための経口送達組成物であって、（ｉ）２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血流中レベルを刺激するために有効な投薬量のヒツジＩＦＮ−τ、および（ｉｉ）ＩＦＮ−τを含有する経口送達ビヒクルであって消化管において活性な形態の該ＩＦＮ−τを放出するために有効なビヒクルを含む、経口送達組成物に関する。
【０００８】
本発明の組成物は、ヒツジＩＦＮ−τの投薬量が被検体あたり１０8〜１０10単位の間である組成物である。
【０００９】
本発明の組成物は、ヒツジＩＦＮ−τの投薬量が口腔粘膜を回避する組成物である。
【００１０】
本発明の組成物は、ビヒクルが胃または腸内においてヒツジＩＦＮ−τを放出するのに有効な組成物である。
【００１１】
本発明の組成物は、リバビリンと組み合わせられる。
【００１２】
また、本発明は、ＨＣＶの処置のための薬学的組成物であって、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、口腔粘膜を通してのヒツジＩＦＮ−τの吸収を回避する、薬学的組成物に関する。
【００１３】
本発明の組成物は、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、ＨＣＶによって引き起こされる肝炎の処置のために有効である。
【００１４】
また、本発明は、ヒツジＩＦＮ−τを含み、ヒツジ以外の動物における２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの活性誘導物質に関する。
【００１５】
また、本発明は、ヒツジＩＦＮ−τの経口投与によるＨＣＶ処置のモニタリングの方法であって、（ｉ）２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの経口投与の前および後の該２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血中レベルを測定する工程、および、必要に応じて、（ｉｉ）投与前に観察した血中２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼのレベルと比較して、測定可能な該レベルの上昇が観察されるまで、ＩＦＮ−τの用量を調節する工程を含む、方法に関する。
【００１６】
本発明の方法は、この調節する工程が用量を１０8単位より上に増加する工程を含む方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
１つの局面では、本発明は、ＨＣＶ感染患者でのＨＣＶ処置における使用のための経口送達組成物を含む。この組成物は、組成物の投与２４時間後の血流中において観察される２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼ（ＯＡＳ）のレベルを刺激するのに有効な投薬量のヒツジインターフェロン−タウ（ＯｖＩＦＮ−τ）、ならびにＩＦＮ−τを含み、かつ胃において活性形態でＩＦＮ−τを放出するのに有効である経口送達ビヒクルを含む。この組成物は、被検体あたり１０8〜１０10単位の間のヒツジＩＦＮ−τの好ましい用量を提供する。
【００１８】
別の局面では、ＨＣＶに感染した個体におけるＨＣＶの処置のための組成物は、胃に達するが口腔粘膜には達しない形態で、そしてその組成物の経口投与後２４時間の血中において測定される２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼレベルを誘導するのに有効な用量でヒツジＩＦＮ−τを含む。好ましい用量は、約１０8〜１０10単位の間である。
【００１９】
さらに別の局面では、本発明の組成物は、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、この組成物は、経口粘膜を通してのヒツジＩＦＮ−τの吸収を回避する。
【００２０】
関連の局面において、本発明の組成物は、ＨＣＶによって引き起こされる肝炎の処置に関しており、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、そしてヒツジＩＦＮ−τを含むヒツジ以外の動物における２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼ活性の誘導物質を含む。
【００２１】
さらに別の局面では、本発明は、ヒツジＩＦＮ−τの経口投与によるＨＣＶの処置のモニタリングの方法を含む。本方法は、このような経口投与の前および後に２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血液レベルを測定する工程を含み、そして必要に応じて、投与前に観察した血中２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼのレベルと比較して、測定可能なレベルの上昇が観察されるまで、ＩＦＮ−τの用量を調節する工程を含む。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、以下の詳細な説明を添付の図と組み合わせて読む場合、より完全に明白になる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
Ｃ型肝炎ウイルスまたはＨＣＶとは、病原性型が非Ａ、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）および弱毒型またはそこから誘導される不完全干渉粒子を生じるウイルス種のことをいう。このＨＣＶゲノムは、ＲＮＡから構成される。ＲＮＡ含有ウイルスは、伝えられるところによれば、組み込まれたヌクレオチド当たり１０-3〜１０-4オーダーの比較的高率の偶発変異を有する。遺伝子型の異質性および流動性は、ＲＮＡウイルスに固有であるので、病原性または非病原性であり得るＨＣＶ種内で複数の型／サブタイプが存在する。種々のＨＣＶ型または単離物の増殖、同定、検出および単離は、文献において考証される。
【００２４】
状態を処置するとは、病徴の症状を減少させ、そして／または状態の重篤度を減じるのに有効な治療的物質を投与することをいう。
【００２５】
経口とは、胃の投与を含む、胃または腸中への口または直接投与による投与を含む任意の経路のことをいう。
【００２６】
ＯＡＳレベルとは、血液の２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）タンパク質の濃度または活性のことをいう。
【００２７】
組換え宿主細胞、宿主細胞、細胞、細胞株、細胞培養物、および単細胞実体として培養される微生物または高等真核生物細胞株を示す他のこのような用語は、交換可能に使用され、そして組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡのレシピエントとして使用され得るか、または使用されている細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされた最初の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的または意図的な変異のため、形態学的にあるいはゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡ相補体において最初の親と必ずしも完全に同じでないかもしれないことが理解される。関連の特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴付けられる、親に十分類似する、親細胞の子孫はこの定義によって意図される子孫に含まれ、そして上記用語によって包含される。
【００２８】
作動可能に連結されるとは、このように記載された構成要素がそれらの意図された様式で機能することを可能とする関係にある並列（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）のことをいう。コード配列に作動可能に連結された調節配列は、このコード配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるような方法で連結される。
【００２９】
オープンリーディングフレームは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域である。
【００３０】
ヒツジＩＦＮ-τ（ｏｖＩＦＮ-τ）とは、図４に示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質のことをいい、そしてアミノ酸の置換および変更（例えば、タンパク質の活性に有意な影響を与えない中性アミノ酸置換）を有するタンパク質のことをいう。好ましくは、この配列は、図４のヒツジＩＦＮ-τ配列、および図４に示される配列と９０％の配列相同性を有するタンパク質を含む。アミノ酸相同性は、例えば、デフォルトパラメーターを有するＡＬＩＧＮプログラムを使用して決定され得る。このプログラムは、配列比較プログラムのＦＡＳＴＡバージョン１．７スート（ｓｕｉｔｅ）（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｏｘ ４４０、Ｊｏｒｄａｎ Ｈａｌｌ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡから利用可能なプログラム）において見出される。
【００３１】
（ＩＩ．インターフェロン−τ）
同定された最初のＩＦＮ-τは、１８〜１９ｋＤａタンパク質としてのヒツジＩＦＮ-τ（ＯｖＩＦＮ-τ）であった。いくつかのアイソフォームが受胎産物（胚および周囲の膜）ホモジネート中で同定された（Ｍａｒｔａｌら、１９７９）。引き続いて、受胎産物培養培地中に放出された低分子量タンパク質が精製され、そして熱に不安定およびプロテアーゼに対して感受性の両方であることが示された（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）。ＯｖＩＦＮ-τは最初、ヒツジ栄養膜タンパク質−１（ｏＴＰ−１）と呼ばれていた。なぜならば、それは、ヒツジにおける母体認識の重要な期間中にこのヒツジ受胎産物の栄養外胚葉によって最初に産生される主な分泌タンパク質であったからである。後の実験は、ＯｖＩＦＮ-τが反芻動物（例えば、ヒツジおよびウシ）における妊娠に対する生理学的な応答の確立に必須の妊娠認識ホルモンであることを決定した（ＢａｚｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９９１）。
【００３２】
Ｎ末端アミノ酸配列を提示している合成オリゴヌクレオチドでヒツジ胚盤胞ライブラリーをプローブすることによって得られたＩＦＮ-τ ｃＤＮＡ（Ｉｍａｋａｗａら、１９８７）は、ヒト、マウス、ラットおよびブタ由来のＩＦＮ−αｓと４５〜５５％の相同性であり、そして現在ＩＦＮ−Ωと言われるウシＩＦＮ−αＩＩと７０％の相同性である推定アミノ酸配列を有する。異なったアイソフォームを示し得る、いくつかのｃＤＮＡ配列が報告されている（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９８９；Ｋｌｅｍａｎｎら、１９９０；およびＣｈａｒｌｉｅｒ、Ｍ．ら、１９９１）。いずれも２３個のアミノ酸のリーダー配列および１７２個のアミノ酸の成熟タンパク質をコードする５８５塩基のオープンリーディングフレームを有し、約１ｋｂである。並置してアミノ末端およびカルボキシル末端を有する４個のらせん束としてのＩＦＮ-τの推定構造はさらに、Ｉ型ＩＦＮとしてのその分類を支持する（Ｊａｒｐｅら、１９９４）。
【００３３】
【表１】
【００３４】
ＩＦＮ−τは、Ｉ型ＩＦＮに古典的に関連する活性の多くを示すが（上記表１を参照のこと）、ＩＦＮ−τと他のＩ型ＩＦＮとの間にかなりの差異が存在する。最も顕著な差異は、上記に詳述した、妊娠におけるその役割である。ウイルス性の誘導もまた異なる。ＩＦＮ−τを除く、全てのＩ型ＩＦＮは、ウイルスおよびｄｓＲＮＡにより容易に誘導される（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９２）。誘導されたＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの発現は、一過性であり、約２、３時間継続する。これに対して、ＩＦＮ−τの合成は、一旦誘導されると、何日もの期間に渡り持続される（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）。１細胞ベースで、他のＩ型ＩＦＮより３００倍多いＩＦＮ−τが産生される（ＣｒｏｓｓおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９１）。
【００３５】
他の差異は、ＩＦＮ−τ遺伝子の調節領域に存在し得る。例えば、ウシＩＦＮ−τに対する遺伝子でのヒトトロホブラスト細胞株ＪＡＲのトランスフェクションは、抗ウイルス活性を生じたが、ウシＩＦＮ−Ω遺伝子でのトランスフェクションはこれを生じなかった。このことは、ＩＮＦ−τ遺伝子発現に関与する独特のトランス作用性因子を暗示する。このことは、ＩＦＮ−τのその近接するプロモーター領域（−１２６〜転写開始部位）は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βのそれに高い相同性を示すが；−１２６〜−４５０の領域は相同性を示さず、そしてＩＮＦ−τ発現のみを増強する（ＣｒｏｓｓおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９１）という観察と一致する。従って、他のＩ型ＩＦＮと比較して、異なる調節因子が、ＩＦＮ−τの発現に関与するようである。
【００３６】
ＩＦＮ−τの発現はまた、種の間で異なり得る。例えば、ＩＦＮ−τの発現は、反芻動物において、受胎産物の発生の特定の段階（主に１３〜２１日目）に制限されるが（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）、予備的な研究は、ヒト型のＩＦＮ−τは、妊娠時を通して構成的に発現されることを示唆する（Ｗｈａｌｅｙら、１９９４）。
【００３７】
（Ａ．ＩＦＮ−τの単離）
ＯｖＩＦＮ−τタンパク質は、妊娠中のヒツジから収集された受胎産物から単離され得、そしてＧｏｄｋｉｎら、（１９８２）およびＶａｌｌｅｔら、（１９８７）に記載されるような改変最小必須培地（ＭＥＭ）中でインビトロで培養され得る。ＩＦＮ−τは、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過により受胎産物培養物から精製され得る。単離されたＩＦＮ−τの均一性は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８）により評価し得、精製ＩＦＮ−τサンプル中のタンパク質濃度の決定は、バイシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；Ｓｍｉｔｈら、１９８５）を使用して行われ得る。
【００３８】
（Ｂ．ＩＦＮ−τの組換え産生）
組換えＩＦＮ−τタンパクは、適切な発現系（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を使用して、任意の選択されたＩＦＮ−τポリヌクレオチドフラグメントから産生され得る。ＩＦＮ−τヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド配列の単離は、Ｂａｚｅｒら（１９９４）に記載される。例えば、Ｂａｚｅｒらは、ヒトＩＦＮ−τ遺伝子の同定および単離を記載する。
【００３９】
ＩＦＮ−τ発現ベクターを作製するために、ＩＦＮ−τコード配列（例えば、図３）は、発現ベクター（例えば細菌の発現ベクター）内に配置し、そして標準的な方法に従って発現される。適切なベクターの例としては、λｇｔ１１（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）；ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、１９８５）；ｐＧＥＭＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；およびｐＢＳ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＬＡＪｏｌｌａ ＣＡ）ベクターが挙げられる。適切なプロモーター（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはｔａｃプロモーター）を含む、他の細菌の発現ベクターもまた使用し得る。ＯｖＩＦＮ−τ合成ポリヌクレオチドの、改変ｐＩＮ ＩＩＩ ｏｍｐ−Ａ発現ベクターへのクローニングは、「材料および方法」に記載される。
【００４０】
本明細書に記載される実験について、図３に存在するＯｖＩＦＮ−τコード配列を、メタノール調節アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターおよびＰｈｏ１シグナル配列を含む、酵母細胞の形質転換に適切なベクター内にクローン化した。製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って、そのベクターを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を形質転換し、そして形質転換細胞を使用して、タンパク質を発現させた。
【００４１】
本発明の方法を用いる使用のための、ＩＦＮ−τを発現するために適切な他の酵母ベクターとしては、２ミクロンプラスミドベクター（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９３）、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ；例えば、Ｓｈａｗら、１９８８）、ＹＥＰベクター（Ｓｈｅｎら、１９８６）、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ；例えば）、および調節可能な発現を伴う他のベクター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８８；Ｒｕｔｔｅｒら、１９８８；Ｏｅｄａら、１９８８）が挙げられる。好ましくは、ベクターは、ＭＦα１プロモーター（Ｂａｙｎｅら、１９８８）、ＧＡＤＰＨプロモーター（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；Ｗｕら、１９９１）またはガラクトース誘導性ＧＡＬ１０プロモーター（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９３；Ｆｅｈｅｒら、１９８９；Ｓｈｅｎら、１９８６）のような、効果的な酵母プロモーターを含む発現カセットを含む。酵母の形質転換宿主は、代表的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであるが、しかし、上記に例示されるように、形質転換に適切な他の酵母も同様に、使用され得る（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなど）。
【００４２】
さらに、ＩＦＮ−τポリペプチドをコードするＤＮＡが、適切な宿主系においてポリペプチドの発現を生成するために任意の多くの市販のベクター内にクローン化され得る。これらの系としては、上記の細菌および酵母の発現系、ならびに以下のバキュロウイルス発現（Ｒｅｉｌｌｙら、１９９２；Ｂｅａｍｅｓら、１９９１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）；植物細胞発現、トランスジェニック植物発現、および哺乳動物細胞における発現（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ）が挙げられる。組換えポリペプチドは、融合タンパク質として、またはネイティブなタンパク質として発現され得る。培養培地中への発現された配列の分泌を促進するリーダー配列のような、多くの特徴が発現ベクター内に操作され得る。組換え産生されたポリペプチドは、代表的には、細胞溶解物または培養培地から単離される。精製は、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーを含む当該分野で公知の方法により行われ得る。免疫親和性クロマトグラフィーは、上記のように、ＩＦＮ−τポリペプチドに基づいて産生された抗体を用いて使用され得る。
【００４３】
組換え方法に加えて、ＩＦＮ−τタンパク質またはポリペプチドは、親和性に基づく方法により（例えば、適切な抗体を使用することにより）選択された細胞から単離され得る。さらに、ＩＦＮ−τペプチドは、当業者に公知の方法を使用して化学合成され得る。
【００４４】
（ＩＩＩ．ＨＣＶについての処置剤としてのＩＦＮτ）
本発明の組成物および方法は、ＨＣＶにより引き起こされる肝炎を治療的に処置し、それによりこの肝炎を軽減するために使用され得る。慢性Ｃ型肝炎感染に罹患している患者は、１つ以上の以下の徴候または症状を示し得る：（ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の増加、（ｂ）抗ＨＣＶ抗体についての試験陽性、（ｃ）ＨＣＶ−ＲＮＡについての試験陽性により示されるＨＣＶの存在、（ｄ）慢性的肝臓疾患の臨床的徴候、（ｅ）肝細胞の損傷、および／または（ｆ）２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼの血液レベルの変化。このような基準は、Ｃ型肝炎を診断するために使用され得るだけではなく、薬物処置に対する患者の応答を評価するためにも使用され得る。
【００４５】
インターフェロンは、酵素２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ（ＯＡＳ）の合成を引き起こし、このことは、次に、ウイルス性ｍＲＮＡの分解を生じる（Ｈｏｕｇｌｕｍ、１９８３）。ＯＡＳは、細胞性ＲＮＡおよびウイルスＲＮＡを切断するＲＮａｓｅを活性化し、それにより、ウイルスの複製を不活化する（Ｋｕｍａｒら、１９８８）。ＯＡＳは、細胞において確立される抗ウイルス状態の、少なくとも一部の原因であると考えられ、そしてＨＣＶの除去において役割を果たす（Ｐａｗｌｏｔｓｋｙら、１９９５）。
【００４６】
（Ａ．経口投与および腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｏｎｅａｌｌｙ）投与されたＩＦＮは、ＯＡＳを誘導する）
本発明の支持により実行され、そして実施例１に詳述される実験において、経口投与されたＩＦＮ−τがＯＡＳを誘導するその能力について試験した。ＯｖＩＮＦ−τを、経口か腹腔内かのいずれかで、マウスに投与した。ＩＦＮ−τ投与の２４時間後、全血中のＯＡＳ活性を決定した。図１に示す。
【００４７】
ＯｖＩＦＮ−τを経口投与かまたは腹腔内投与した場合、全血中のＯＡＳ活性の増加が観察された。経口投与したＯｖＩＦＮ−τの効果および腹腔内投与したＯｖＩＦＮ−τの効果を比較した場合、両方の投与が、本質的に同じ全血のＯＡＳ誘導活性を提供した。
【００４８】
（Ｂ．経口投与されたＩＦＮ−τは、用量に依存する様式でＯＡＳを誘導する）
本発明の支持により実行され、そして実施例２に詳述される実験において、経口投与されたＩＦＮ−τが用量に依存する様式でＯＡＳを誘導するその能力について試験した。０ユニット、１×１０3ユニット、１×１０4ユニット、１×１０5ユニットのＯｖＩＦＮ−τを、マウスの胃の上部に経口投与した。経口投与の１２時間後、全血をマウスの心臓から採取し、全血のＯＡＳ活性を決定した。図２に示すように、全血のＯＡＳ活性は、用量に依存する様式で増加した。
【００４９】
ＩＦＮ−τが口を通って活性であることはすでに立証されている（ＷＯ ９６／２８１８３）が、ＩＦＮ−τがどのように投与されたか、またはＩＦＮ−τがどのように吸収されるかに関する正確な決定は、以前になされていない。本発明において、ＩＦＮ−τを、全く口腔粘膜への曝露を伴わずにマウスの胃に直接投与し、その結果として、胃の粘膜を通じての吸収がＯＡＳ活性を効果的に誘導することを立証した。胃からのＩＦＮ−τの直接吸収は、口腔粘膜を通じて吸収されるＩＦＮ−τと比較して、特にＩＦＮ−τを慢性的に投与した場合に、ＩＦＮ−τに対する抗体の形成を減少する。
【００５０】
さらに、本発明は、ヒツジＩＦＮ−τが、マウスにおいて２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ活性を増加させる能力を記載する。この研究の前に、マウスＩＦＮ−τのみが、マウスにおいて有効であることが公知であった。
【００５１】
（ＩＶ．ＩＦＮ−τの投与）
（Ａ．薬学的組成物）
ＩＦＮ−τを含む治療用調製物または医薬、あるいは関連ポリペプチドまたは関連タンパク質を、薬学的に有用な組成物（医薬）を調製するための公知の方法に従って、処方および製造し得る。インターフェロンを含む処方物、またはインターフェロン様化合物を含む処方物が、以前に記載されている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ、１９７６）。一般に、ＩＦＮ−τを含有する医薬は、有効量のＩＦＮ−τを適切なキャリアおよび／または賦形剤と組み合わせて、その組成物の有効な投与を容易にするように処方される。ＩＦＮ−τまたは関連ポリペプチドを、任意の薬学的に受容可能な投薬形態（静脈内注射、筋肉内注射、病巣内注射、または皮下注射を含む）で患者に投与し得る。詳細には、他のインターフェロン化合物のために使用される組成物および方法を、これらの化合物の送達のために使用し得る。
【００５２】
経口投与に適切な組成物の場合、ＩＦＮ−τおよび、必要に応じて、例えば、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、ラクトース、トウモロコシデンプン、軽質無水ケイ酸（ｌｉｇｈｔ ｓｉｌｉｃｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、微結晶性セルロース、ショ糖）、結合剤（例えば、α型デンプン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、低置換型（ｌｏｗ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）ヒドロキシ−プロピルセルロース）、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー）、抗酸化剤（例えば、Ｌ−システイン、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク）などの添加剤を含む錠剤およびカプセルを、ＩＦＮ−τ（例えば、凍結乾燥されたＩＦＮ−τタンパク質）から製造し得る。
【００５３】
さらに、ＩＦＮ−τポリペプチドは固形、粉状、または他のキャリア（例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン（例えば、ポテトデンプン、トウモロコシデンプン）、ミロペクチン（ｍｉｌｌｏｐｅｃｔｉｎｅ）、セルロース誘導体、またはゼラチン）と混合し得、そしてまた、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム）、あるいは錠剤の形状に圧縮されたポリエチレングリコールワックスを含み得る。いくつかの層のキャリアまたは希釈剤を使用して、徐放性で作動する錠剤を調製し得る。
【００５４】
経口投与のための液体調製物を、エリキシル剤、シロップまたは懸濁液の形態（例えば、重量で約０．１％〜約３０％のＩＦＮ−τ、糖ならびにエタノール、水、グリセロール、プロピレン、グリコールおよび従来の性質の可能な他の添加剤の混合物を含む溶液）で作製し得る。
【００５５】
（Ｂ．投薬量）
経口的に活性なＩＦＮ−τ薬学的組成物を、処置の必要のある個体に治療的に有効な量で投与する。その用量は、顕著に変動し得、そして患者の障害の重篤さ、年齢、および体重、患者が取り得る他の投薬などのような因子に依存する。この投薬の量は、代表的には担当医によって決定される。投薬量は、代表的には約１×１０5単位／日と１×１０10単位／日との間であり、好ましくは約１×１０8単位／日と１．５×１０9単位／日との間である。そのより低い毒性ゆえに、ＩＦＮ−τは、例えばＩＦＮ−αよりも高用量で投与され得ることが理解される。
【００５６】
血漿中のＩＦＮ−τの定常的に上昇したレベルを必要とする障害は、約２〜４時間毎の頻度の経口投与、または約１２〜２４時間毎の注射を経由した投与から恩恵を受けるが、一方他の障害は、より少ない頻度の間隔で（例えば、４８時間毎）、治療的に有効な用量を投与することによって効果的に処置され得る。個々の用量の投与の速度は、代表的には担当医によって調整され、処置される疾患の重篤度を軽減しながら、最も低い全体用量の投与を可能にする。
【００５７】
一旦患者の状態の改善が起これば、必要な場合、維持用量が投与される。その後、用量または投与の頻度、あるいはその両方が、症状の関数として、改善された状態が保持されるレベルまで減少され得る。
【００５８】
（Ｃ．組み合わせ治療）
本発明の組成物および方法が、他の治療と組み合わせて使用され得ることが当然理解され得る。例えば、ＨＣＶ−感染患者におけるＨＣＶの処置のためのｏｖＩＦＮ−τの組成物は、リバビリンのような抗ウイルス剤と組み合わせられ得る。
【００５９】
（Ｄ．モニタリング）
ｏｖＩＦＮ−τの経口投与によるＨＣＶの処置は、投与の前および投与の後に、血中の２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）レベルを測定することによってモニタリングされる。ＯＡＳレベルは、例えば、投与の１２時間後、２４時間後、および４８時間後にモニタリングされ得る。必要な場合、ＩＦＮ−τの用量は、投与前に観察されるレベルと比較して血中ＯＡＳレベルの測定可能な増加が観察されるまで調整される。
【００６０】
本明細書中で引用されるすべての特許文献および学術文献は、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【００６１】
以下の実施例は、本発明を例証するが、いかなる場合においても本発明を制限することを意図しない。
【００６２】
【実施例】
（材料および方法）
（Ａ．ｏｖＩＦＮ−τの産生）
合成ｏｖＩＦＮ−τ遺伝子を、標準的な分子的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８）を使用して、ＯｖＩＦＮ−τアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（Ｉｍａｋａｗａら、１９８７）の連続部分を含むオリゴヌクレオチドを連結することによって生成した。生じたＩＦＮ−τポリヌクレオチドコード配列は、１６位〜５３１位（１７２アミノ酸のコード配列）にわたる。
【００６３】
全長合成遺伝子ＳｔｕＩ／ＳＳｔＩフラグメント（５４０ｂｐ）を、改変したｐＩＮ ＩＩＩ ｏｍｐ−Ａ発現ベクター中にクローニングし、そしてコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株ＳＢ２２１中に形質転換した。ＩＦＮ−τタンパク質の発現のために、この発現ベクターを有する細胞を、アンピシリンを含むＬ−ブロス中で０．１〜１ＯＤ（５５０ｎｍ）まで増殖させ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）で３時間誘導し、そして遠心分離によって収集した。可溶性の組換えＩＦＮ−τを、超音波処理または浸透圧分画によって細胞から遊離させた。
【００６４】
酵母における発現のために、ＩＦＮ−τ遺伝子を、５’および３’末端にそれぞれＳｔｕＩおよびＳａｃＩ制限部位を含むＰＣＲプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７；Ｍｕｌｌｉｓら、１９８７）を使用して増幅した。増幅したフラグメントを、ＳｔｕＩおよびＳａｃＩＩを用いて消化し、そしてｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ＋（ＫＳ）のＳａｃＩＩおよびＳｍａＩ部位に連結して、ｐＢＳＹ−ＩＦＮτを生成した。プラスミドｐＢＳＹ−ＩＦＮτを、ＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化し、そして合成ＩＦＮ−τ遺伝子を含むフラグメントを単離した。酵母発現ベクターｐＢＳ２４Ｕｂ（Ｅｃｋｅｒら、１９８９）を、ＳａｌＩで消化した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、平滑末端を生成した。ベクターＤＮＡをフェノールで抽出し、そしてエタノール沈澱させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。回収したプラスミドをＳａｃＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、そしてｐＢＳＹ−ＩＦＮ−τから単離したＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントに連結した。生じた組換えプラスミドを、ｐＢＳ２４Ｕｂ−ＩＦＮτと命名した。
【００６５】
組換えプラスミドｐＢＳ２４Ｕｂ−ＩＦＮτを、Ｅ，ｃｏｌｉに形質転換した。ＩＦＮ−τ挿入物を含む組換えクローンを単離し、そして制限酵素分析によって同定した。ＩＦＮ−τコード配列を、ｐＢＳ２４Ｕｂ−ＩＦＮτから単離し、そしてアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングした。次いでこのベクターを、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５ Ｈｉｓ-宿主細胞を形質転換するために使用し、そしてタンパク質を製造者の指示に従って発現させた。このタンパク質を培地中に分泌させ、そして連続的なＤＥＡＥ−セルロースおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって決定されるように、電気泳動的に均一なまでに精製した。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞での抗ウイルス活性によって測定される場合、精製したタンパク質は、約０．２９〜約０．４４×１０8Ｕ／ｍｇの比活性を有した。
【００６６】
（実施例１：ｏｖＩＦＮτの経口および腹腔内投与によるＯＡＳの誘導）
ヒツジインターフェロンタウ（ｏｖＩＦＮτ）（４．９９×１０8単位／ｍｇタンパク質；Ｐｅｐｇｅｎ社、カリフォルニア）を、１０％マルトース溶液に溶かして、ｏｖＩＦＮτ溶液を調製した。
【００６７】
２０ゲージのディスポーザブル経口ゾンデ（フチガミ、京都）を用いてＩＣＲマウス（平均約３０ｇ、６週齢、メス）に１０％マルトース溶液に溶かした２００μｌのｏｖＩＦＮτ溶液を経口投与し、胃上部に直接注入した（ＧＡ）。腹腔内投与では、１００μｌのｏｖＩＦＮτ溶液を用いた（ｉ．ｐ．）。胃上部にサンプルが注入されたことを、色素の投与によって確認した。投与の２４時間後にネンブタール麻酔し、心臓より採血し、全血中のＯＡＳ活性を２−５Ａ ＲＩＡキット（栄研化学、東京）（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｍ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、９、７１５〜７１９、１９８９を参照のこと）を用いて測定した。
【００６８】
１０5単位のｏｖＩＦＮτの、経口投与（τＧＡ）と腹腔投与（τｉ．ｐ．）の効果を比較した場合、両者ともほぼ同じ血中ＯＡＳ誘導活性を示した。結果を図１に示す。
【００６９】
（実施例２：ｏｖＩＦＮτ経口投与によるＯＡＳの用量依存性誘導）
実施例１と同様の手順で、０、１０3、１０4、１０5単位のｏｖＩＦＮτを、ＩＣＲマウスにそれぞれ経口投与した。投与の１２時間後に心臓から血液を採取し、全血中のＯＡＳ活性を測定した。図２に示すように、全血中のＯＡＳ活性は、用量依存的に上昇した。
【００７０】
本発明を特定の方法および実施態様に関して記載したが、種々の改変および変更が本発明から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【００７１】
（参考文献）
【００７２】
【表２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【発明の効果】
インターフェロンタウ（ＩＦＮ−τ）を用いる、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染により引き起こされる肝炎に関連した状態を処置するための組成物を提供する。本発明はまた、２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血中レベルを測定することによるＨＣＶの処置のモニタリングの方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｏｖＩＦＮ-τの腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与または胃投与（Ｇ．Ａ．）後のマウス全血中のＯＡＳレベルを示す。
【図２】図２は、ｏｖＩＦＮ-τの胃投与（Ｇ．Ａ．）による血液ＯＡＳの用量依存誘導を示す。
【図３】図３は、ヒツジＩＦＮ-τのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ヒツジ成熟ＩＦＮ-τのアミノ酸配列を示す。
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロンタウ（ＩＦＮ−τ）を用いる、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染により引き起こされる肝炎に関連した状態を処置するための組成物に関する。本発明はまた、２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血中レベルを測定することによるＨＣＶの処置のモニタリングの方法に関連する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎は（ＨＣＶ）は、世界中で１億７千万、そしていくつかの国では、人口の１０％より多いと見積もられる人々が罹患しているという主要な公衆衛生問題である（Ｌｅｃｈｎｅｒら、２０００）。ＨＣＶは、感染血液および血液製剤の輸血により主に伝播される（Ｃｕｔｈｂｅｒｔら、１９９４；Ｍａｎｓｅｌｌら、１９９５）。Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎは、ＨＣＶが毎年、合衆国における急性肝炎の新しい１６０，０００症例の原因であると見積もっている。従って、効果的な抗ＨＣＶ薬剤の緊急の医学的必要性が存在する。
【０００３】
ＨＣＶは、正鎖であり、フラビウイルスファミリーの脂質エンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、およそ１万ヌクレオチド長である（Ｃｈｏｏら、１９８９）。ＨＣＶ（Ｂ型肝炎ウイルスと異なり）は、ＤＮＡ中間体を有さず、従って、宿主ゲノムに組み込まれ得ない（Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒら、１９９６）。ＨＣＶはクローン化されているが、このウイルスは、インビトロで培養することが困難であった（Ｔｒｅｐｏ、２０００）。ＨＣＶは、非常に永続的であり、感染した個体の８５％で慢性感染を生ずるが、この永続性の機構は未知である（Ｔｒｅｐｏ、２０００）。
【０００４】
ＨＣＶの処置は、炎症および肝臓細胞の損傷を軽減することで補助され、これにより、硬変および肝細胞癌を防ぐ（Ｈｏｒｉｉｋｅら、１９９８；Ｂｅｎｖｅｇｎｕら、１９９８）。ＨＣＶに現在利用可能な治療は、感染した患者のわずかな小集団に有効であるのみである（Ｍａｇｒｉｎら、１９９４；Ｃｈｏｏら、１９９１；Ｃｈｏｏら、１９８９）。ＩＦＮ−αは、１９９１年に合衆国で、そして１９９２年に日本で慢性Ｃ型肝炎の治療に導入された（Ｓａｉｔｏら、２０００）。しかし、臨床的効力を得るために十分な投薬量（すなわち、約１×１０6単位／１処置、およびそれより多く）のＩＦＮ−αの使用には、通常、発熱、頭痛、嗜眠、関節痛および筋肉痛によって特徴付けられる「インフルエンザ様」の症候群を伴う（Ｔｙｒｉｎｇら、１９９２）。５〜１０×１０6単位／１処置、およびそれより多い用量では、他の毒性、例えば、悪心、嘔吐、下痢および食欲不振がより高頻度となる。神経精神医学的な症状もまた、ＩＦＮ−α処置と関連して報告されている（Ｄｉｅｐｅｒｉｎｋら、２０００）。さらに、いくつかの研究は、ＩＦＮ−α処置の効力が用量依存性でないこと（Ｓａｉｔｏら、２０００）、およびＩＦＮ−αでの処置は、新生物またはウイルス性肝炎を有する患者における自己免疫障害の発症または増悪に関連していること（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｓａｅｎｚら、２０００）を示唆する。
【０００５】
リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、ウイルスｍＲＮＡ合成を妨害することならびに広範なＲＮＡおよびＤＮＡウイルスのインビボおよびインビトロでの複製を阻害することが見出されているプリンヌクレオシドアナログである（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、１９８６；Ｂａｌｚａｒｉｎｉら、１９９１）。リバビリンは、アミノトランスフェラーゼレベルの正常化において有効であることが示されたが、慢性Ｃ型肝炎患者における血清のＨＣＶのＲＮＡ価に対する活性はわずかである（Ｄｉ Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅら、１９９２）。しかし、リバビリンの有益な効果でさえ、一過性であり（Ｃｌａｒｋｅ、２０００；Ｋｏｓｋｉｎａｓら、１９９５）、そして重篤な副作用のために、ＩＦＮαとの組み合わせにおけるリバビリンは、許容困難で有り得る（Ｃｏｔｌｅｒら、２０００）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在のＨＣＶ処置方法に関連する欠点のために、本発明者らは、より強力な抗ウイルス活性を有し、そして重篤な副作用がより少ない新しい治療候補物を同定することを計画した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＨＣＶ感染患者におけるＨＣＶの処置に用いるための経口送達組成物であって、（ｉ）２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血流中レベルを刺激するために有効な投薬量のヒツジＩＦＮ−τ、および（ｉｉ）ＩＦＮ−τを含有する経口送達ビヒクルであって消化管において活性な形態の該ＩＦＮ−τを放出するために有効なビヒクルを含む、経口送達組成物に関する。
【０００８】
本発明の組成物は、ヒツジＩＦＮ−τの投薬量が被検体あたり１０8〜１０10単位の間である組成物である。
【０００９】
本発明の組成物は、ヒツジＩＦＮ−τの投薬量が口腔粘膜を回避する組成物である。
【００１０】
本発明の組成物は、ビヒクルが胃または腸内においてヒツジＩＦＮ−τを放出するのに有効な組成物である。
【００１１】
本発明の組成物は、リバビリンと組み合わせられる。
【００１２】
また、本発明は、ＨＣＶの処置のための薬学的組成物であって、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、口腔粘膜を通してのヒツジＩＦＮ−τの吸収を回避する、薬学的組成物に関する。
【００１３】
本発明の組成物は、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、ＨＣＶによって引き起こされる肝炎の処置のために有効である。
【００１４】
また、本発明は、ヒツジＩＦＮ−τを含み、ヒツジ以外の動物における２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの活性誘導物質に関する。
【００１５】
また、本発明は、ヒツジＩＦＮ−τの経口投与によるＨＣＶ処置のモニタリングの方法であって、（ｉ）２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの経口投与の前および後の該２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血中レベルを測定する工程、および、必要に応じて、（ｉｉ）投与前に観察した血中２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼのレベルと比較して、測定可能な該レベルの上昇が観察されるまで、ＩＦＮ−τの用量を調節する工程を含む、方法に関する。
【００１６】
本発明の方法は、この調節する工程が用量を１０8単位より上に増加する工程を含む方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
１つの局面では、本発明は、ＨＣＶ感染患者でのＨＣＶ処置における使用のための経口送達組成物を含む。この組成物は、組成物の投与２４時間後の血流中において観察される２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼ（ＯＡＳ）のレベルを刺激するのに有効な投薬量のヒツジインターフェロン−タウ（ＯｖＩＦＮ−τ）、ならびにＩＦＮ−τを含み、かつ胃において活性形態でＩＦＮ−τを放出するのに有効である経口送達ビヒクルを含む。この組成物は、被検体あたり１０8〜１０10単位の間のヒツジＩＦＮ−τの好ましい用量を提供する。
【００１８】
別の局面では、ＨＣＶに感染した個体におけるＨＣＶの処置のための組成物は、胃に達するが口腔粘膜には達しない形態で、そしてその組成物の経口投与後２４時間の血中において測定される２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼレベルを誘導するのに有効な用量でヒツジＩＦＮ−τを含む。好ましい用量は、約１０8〜１０10単位の間である。
【００１９】
さらに別の局面では、本発明の組成物は、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、この組成物は、経口粘膜を通してのヒツジＩＦＮ−τの吸収を回避する。
【００２０】
関連の局面において、本発明の組成物は、ＨＣＶによって引き起こされる肝炎の処置に関しており、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、そしてヒツジＩＦＮ−τを含むヒツジ以外の動物における２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼ活性の誘導物質を含む。
【００２１】
さらに別の局面では、本発明は、ヒツジＩＦＮ−τの経口投与によるＨＣＶの処置のモニタリングの方法を含む。本方法は、このような経口投与の前および後に２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血液レベルを測定する工程を含み、そして必要に応じて、投与前に観察した血中２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼのレベルと比較して、測定可能なレベルの上昇が観察されるまで、ＩＦＮ−τの用量を調節する工程を含む。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、以下の詳細な説明を添付の図と組み合わせて読む場合、より完全に明白になる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
Ｃ型肝炎ウイルスまたはＨＣＶとは、病原性型が非Ａ、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）および弱毒型またはそこから誘導される不完全干渉粒子を生じるウイルス種のことをいう。このＨＣＶゲノムは、ＲＮＡから構成される。ＲＮＡ含有ウイルスは、伝えられるところによれば、組み込まれたヌクレオチド当たり１０-3〜１０-4オーダーの比較的高率の偶発変異を有する。遺伝子型の異質性および流動性は、ＲＮＡウイルスに固有であるので、病原性または非病原性であり得るＨＣＶ種内で複数の型／サブタイプが存在する。種々のＨＣＶ型または単離物の増殖、同定、検出および単離は、文献において考証される。
【００２４】
状態を処置するとは、病徴の症状を減少させ、そして／または状態の重篤度を減じるのに有効な治療的物質を投与することをいう。
【００２５】
経口とは、胃の投与を含む、胃または腸中への口または直接投与による投与を含む任意の経路のことをいう。
【００２６】
ＯＡＳレベルとは、血液の２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）タンパク質の濃度または活性のことをいう。
【００２７】
組換え宿主細胞、宿主細胞、細胞、細胞株、細胞培養物、および単細胞実体として培養される微生物または高等真核生物細胞株を示す他のこのような用語は、交換可能に使用され、そして組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡのレシピエントとして使用され得るか、または使用されている細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされた最初の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的または意図的な変異のため、形態学的にあるいはゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡ相補体において最初の親と必ずしも完全に同じでないかもしれないことが理解される。関連の特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴付けられる、親に十分類似する、親細胞の子孫はこの定義によって意図される子孫に含まれ、そして上記用語によって包含される。
【００２８】
作動可能に連結されるとは、このように記載された構成要素がそれらの意図された様式で機能することを可能とする関係にある並列（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）のことをいう。コード配列に作動可能に連結された調節配列は、このコード配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるような方法で連結される。
【００２９】
オープンリーディングフレームは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域である。
【００３０】
ヒツジＩＦＮ-τ（ｏｖＩＦＮ-τ）とは、図４に示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質のことをいい、そしてアミノ酸の置換および変更（例えば、タンパク質の活性に有意な影響を与えない中性アミノ酸置換）を有するタンパク質のことをいう。好ましくは、この配列は、図４のヒツジＩＦＮ-τ配列、および図４に示される配列と９０％の配列相同性を有するタンパク質を含む。アミノ酸相同性は、例えば、デフォルトパラメーターを有するＡＬＩＧＮプログラムを使用して決定され得る。このプログラムは、配列比較プログラムのＦＡＳＴＡバージョン１．７スート（ｓｕｉｔｅ）（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｏｘ ４４０、Ｊｏｒｄａｎ Ｈａｌｌ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡから利用可能なプログラム）において見出される。
【００３１】
（ＩＩ．インターフェロン−τ）
同定された最初のＩＦＮ-τは、１８〜１９ｋＤａタンパク質としてのヒツジＩＦＮ-τ（ＯｖＩＦＮ-τ）であった。いくつかのアイソフォームが受胎産物（胚および周囲の膜）ホモジネート中で同定された（Ｍａｒｔａｌら、１９７９）。引き続いて、受胎産物培養培地中に放出された低分子量タンパク質が精製され、そして熱に不安定およびプロテアーゼに対して感受性の両方であることが示された（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）。ＯｖＩＦＮ-τは最初、ヒツジ栄養膜タンパク質−１（ｏＴＰ−１）と呼ばれていた。なぜならば、それは、ヒツジにおける母体認識の重要な期間中にこのヒツジ受胎産物の栄養外胚葉によって最初に産生される主な分泌タンパク質であったからである。後の実験は、ＯｖＩＦＮ-τが反芻動物（例えば、ヒツジおよびウシ）における妊娠に対する生理学的な応答の確立に必須の妊娠認識ホルモンであることを決定した（ＢａｚｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９９１）。
【００３２】
Ｎ末端アミノ酸配列を提示している合成オリゴヌクレオチドでヒツジ胚盤胞ライブラリーをプローブすることによって得られたＩＦＮ-τ ｃＤＮＡ（Ｉｍａｋａｗａら、１９８７）は、ヒト、マウス、ラットおよびブタ由来のＩＦＮ−αｓと４５〜５５％の相同性であり、そして現在ＩＦＮ−Ωと言われるウシＩＦＮ−αＩＩと７０％の相同性である推定アミノ酸配列を有する。異なったアイソフォームを示し得る、いくつかのｃＤＮＡ配列が報告されている（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９８９；Ｋｌｅｍａｎｎら、１９９０；およびＣｈａｒｌｉｅｒ、Ｍ．ら、１９９１）。いずれも２３個のアミノ酸のリーダー配列および１７２個のアミノ酸の成熟タンパク質をコードする５８５塩基のオープンリーディングフレームを有し、約１ｋｂである。並置してアミノ末端およびカルボキシル末端を有する４個のらせん束としてのＩＦＮ-τの推定構造はさらに、Ｉ型ＩＦＮとしてのその分類を支持する（Ｊａｒｐｅら、１９９４）。
【００３３】
【表１】
【００３４】
ＩＦＮ−τは、Ｉ型ＩＦＮに古典的に関連する活性の多くを示すが（上記表１を参照のこと）、ＩＦＮ−τと他のＩ型ＩＦＮとの間にかなりの差異が存在する。最も顕著な差異は、上記に詳述した、妊娠におけるその役割である。ウイルス性の誘導もまた異なる。ＩＦＮ−τを除く、全てのＩ型ＩＦＮは、ウイルスおよびｄｓＲＮＡにより容易に誘導される（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９２）。誘導されたＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの発現は、一過性であり、約２、３時間継続する。これに対して、ＩＦＮ−τの合成は、一旦誘導されると、何日もの期間に渡り持続される（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）。１細胞ベースで、他のＩ型ＩＦＮより３００倍多いＩＦＮ−τが産生される（ＣｒｏｓｓおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９１）。
【００３５】
他の差異は、ＩＦＮ−τ遺伝子の調節領域に存在し得る。例えば、ウシＩＦＮ−τに対する遺伝子でのヒトトロホブラスト細胞株ＪＡＲのトランスフェクションは、抗ウイルス活性を生じたが、ウシＩＦＮ−Ω遺伝子でのトランスフェクションはこれを生じなかった。このことは、ＩＮＦ−τ遺伝子発現に関与する独特のトランス作用性因子を暗示する。このことは、ＩＦＮ−τのその近接するプロモーター領域（−１２６〜転写開始部位）は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βのそれに高い相同性を示すが；−１２６〜−４５０の領域は相同性を示さず、そしてＩＮＦ−τ発現のみを増強する（ＣｒｏｓｓおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９１）という観察と一致する。従って、他のＩ型ＩＦＮと比較して、異なる調節因子が、ＩＦＮ−τの発現に関与するようである。
【００３６】
ＩＦＮ−τの発現はまた、種の間で異なり得る。例えば、ＩＦＮ−τの発現は、反芻動物において、受胎産物の発生の特定の段階（主に１３〜２１日目）に制限されるが（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）、予備的な研究は、ヒト型のＩＦＮ−τは、妊娠時を通して構成的に発現されることを示唆する（Ｗｈａｌｅｙら、１９９４）。
【００３７】
（Ａ．ＩＦＮ−τの単離）
ＯｖＩＦＮ−τタンパク質は、妊娠中のヒツジから収集された受胎産物から単離され得、そしてＧｏｄｋｉｎら、（１９８２）およびＶａｌｌｅｔら、（１９８７）に記載されるような改変最小必須培地（ＭＥＭ）中でインビトロで培養され得る。ＩＦＮ−τは、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過により受胎産物培養物から精製され得る。単離されたＩＦＮ−τの均一性は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８）により評価し得、精製ＩＦＮ−τサンプル中のタンパク質濃度の決定は、バイシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；Ｓｍｉｔｈら、１９８５）を使用して行われ得る。
【００３８】
（Ｂ．ＩＦＮ−τの組換え産生）
組換えＩＦＮ−τタンパクは、適切な発現系（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を使用して、任意の選択されたＩＦＮ−τポリヌクレオチドフラグメントから産生され得る。ＩＦＮ−τヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド配列の単離は、Ｂａｚｅｒら（１９９４）に記載される。例えば、Ｂａｚｅｒらは、ヒトＩＦＮ−τ遺伝子の同定および単離を記載する。
【００３９】
ＩＦＮ−τ発現ベクターを作製するために、ＩＦＮ−τコード配列（例えば、図３）は、発現ベクター（例えば細菌の発現ベクター）内に配置し、そして標準的な方法に従って発現される。適切なベクターの例としては、λｇｔ１１（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）；ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、１９８５）；ｐＧＥＭＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；およびｐＢＳ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＬＡＪｏｌｌａ ＣＡ）ベクターが挙げられる。適切なプロモーター（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはｔａｃプロモーター）を含む、他の細菌の発現ベクターもまた使用し得る。ＯｖＩＦＮ−τ合成ポリヌクレオチドの、改変ｐＩＮ ＩＩＩ ｏｍｐ−Ａ発現ベクターへのクローニングは、「材料および方法」に記載される。
【００４０】
本明細書に記載される実験について、図３に存在するＯｖＩＦＮ−τコード配列を、メタノール調節アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターおよびＰｈｏ１シグナル配列を含む、酵母細胞の形質転換に適切なベクター内にクローン化した。製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って、そのベクターを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を形質転換し、そして形質転換細胞を使用して、タンパク質を発現させた。
【００４１】
本発明の方法を用いる使用のための、ＩＦＮ−τを発現するために適切な他の酵母ベクターとしては、２ミクロンプラスミドベクター（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９３）、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ；例えば、Ｓｈａｗら、１９８８）、ＹＥＰベクター（Ｓｈｅｎら、１９８６）、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ；例えば）、および調節可能な発現を伴う他のベクター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８８；Ｒｕｔｔｅｒら、１９８８；Ｏｅｄａら、１９８８）が挙げられる。好ましくは、ベクターは、ＭＦα１プロモーター（Ｂａｙｎｅら、１９８８）、ＧＡＤＰＨプロモーター（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；Ｗｕら、１９９１）またはガラクトース誘導性ＧＡＬ１０プロモーター（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９３；Ｆｅｈｅｒら、１９８９；Ｓｈｅｎら、１９８６）のような、効果的な酵母プロモーターを含む発現カセットを含む。酵母の形質転換宿主は、代表的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであるが、しかし、上記に例示されるように、形質転換に適切な他の酵母も同様に、使用され得る（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなど）。
【００４２】
さらに、ＩＦＮ−τポリペプチドをコードするＤＮＡが、適切な宿主系においてポリペプチドの発現を生成するために任意の多くの市販のベクター内にクローン化され得る。これらの系としては、上記の細菌および酵母の発現系、ならびに以下のバキュロウイルス発現（Ｒｅｉｌｌｙら、１９９２；Ｂｅａｍｅｓら、１９９１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）；植物細胞発現、トランスジェニック植物発現、および哺乳動物細胞における発現（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ）が挙げられる。組換えポリペプチドは、融合タンパク質として、またはネイティブなタンパク質として発現され得る。培養培地中への発現された配列の分泌を促進するリーダー配列のような、多くの特徴が発現ベクター内に操作され得る。組換え産生されたポリペプチドは、代表的には、細胞溶解物または培養培地から単離される。精製は、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーを含む当該分野で公知の方法により行われ得る。免疫親和性クロマトグラフィーは、上記のように、ＩＦＮ−τポリペプチドに基づいて産生された抗体を用いて使用され得る。
【００４３】
組換え方法に加えて、ＩＦＮ−τタンパク質またはポリペプチドは、親和性に基づく方法により（例えば、適切な抗体を使用することにより）選択された細胞から単離され得る。さらに、ＩＦＮ−τペプチドは、当業者に公知の方法を使用して化学合成され得る。
【００４４】
（ＩＩＩ．ＨＣＶについての処置剤としてのＩＦＮτ）
本発明の組成物および方法は、ＨＣＶにより引き起こされる肝炎を治療的に処置し、それによりこの肝炎を軽減するために使用され得る。慢性Ｃ型肝炎感染に罹患している患者は、１つ以上の以下の徴候または症状を示し得る：（ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の増加、（ｂ）抗ＨＣＶ抗体についての試験陽性、（ｃ）ＨＣＶ−ＲＮＡについての試験陽性により示されるＨＣＶの存在、（ｄ）慢性的肝臓疾患の臨床的徴候、（ｅ）肝細胞の損傷、および／または（ｆ）２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼの血液レベルの変化。このような基準は、Ｃ型肝炎を診断するために使用され得るだけではなく、薬物処置に対する患者の応答を評価するためにも使用され得る。
【００４５】
インターフェロンは、酵素２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ（ＯＡＳ）の合成を引き起こし、このことは、次に、ウイルス性ｍＲＮＡの分解を生じる（Ｈｏｕｇｌｕｍ、１９８３）。ＯＡＳは、細胞性ＲＮＡおよびウイルスＲＮＡを切断するＲＮａｓｅを活性化し、それにより、ウイルスの複製を不活化する（Ｋｕｍａｒら、１９８８）。ＯＡＳは、細胞において確立される抗ウイルス状態の、少なくとも一部の原因であると考えられ、そしてＨＣＶの除去において役割を果たす（Ｐａｗｌｏｔｓｋｙら、１９９５）。
【００４６】
（Ａ．経口投与および腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｏｎｅａｌｌｙ）投与されたＩＦＮは、ＯＡＳを誘導する）
本発明の支持により実行され、そして実施例１に詳述される実験において、経口投与されたＩＦＮ−τがＯＡＳを誘導するその能力について試験した。ＯｖＩＮＦ−τを、経口か腹腔内かのいずれかで、マウスに投与した。ＩＦＮ−τ投与の２４時間後、全血中のＯＡＳ活性を決定した。図１に示す。
【００４７】
ＯｖＩＦＮ−τを経口投与かまたは腹腔内投与した場合、全血中のＯＡＳ活性の増加が観察された。経口投与したＯｖＩＦＮ−τの効果および腹腔内投与したＯｖＩＦＮ−τの効果を比較した場合、両方の投与が、本質的に同じ全血のＯＡＳ誘導活性を提供した。
【００４８】
（Ｂ．経口投与されたＩＦＮ−τは、用量に依存する様式でＯＡＳを誘導する）
本発明の支持により実行され、そして実施例２に詳述される実験において、経口投与されたＩＦＮ−τが用量に依存する様式でＯＡＳを誘導するその能力について試験した。０ユニット、１×１０3ユニット、１×１０4ユニット、１×１０5ユニットのＯｖＩＦＮ−τを、マウスの胃の上部に経口投与した。経口投与の１２時間後、全血をマウスの心臓から採取し、全血のＯＡＳ活性を決定した。図２に示すように、全血のＯＡＳ活性は、用量に依存する様式で増加した。
【００４９】
ＩＦＮ−τが口を通って活性であることはすでに立証されている（ＷＯ ９６／２８１８３）が、ＩＦＮ−τがどのように投与されたか、またはＩＦＮ−τがどのように吸収されるかに関する正確な決定は、以前になされていない。本発明において、ＩＦＮ−τを、全く口腔粘膜への曝露を伴わずにマウスの胃に直接投与し、その結果として、胃の粘膜を通じての吸収がＯＡＳ活性を効果的に誘導することを立証した。胃からのＩＦＮ−τの直接吸収は、口腔粘膜を通じて吸収されるＩＦＮ−τと比較して、特にＩＦＮ−τを慢性的に投与した場合に、ＩＦＮ−τに対する抗体の形成を減少する。
【００５０】
さらに、本発明は、ヒツジＩＦＮ−τが、マウスにおいて２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ活性を増加させる能力を記載する。この研究の前に、マウスＩＦＮ−τのみが、マウスにおいて有効であることが公知であった。
【００５１】
（ＩＶ．ＩＦＮ−τの投与）
（Ａ．薬学的組成物）
ＩＦＮ−τを含む治療用調製物または医薬、あるいは関連ポリペプチドまたは関連タンパク質を、薬学的に有用な組成物（医薬）を調製するための公知の方法に従って、処方および製造し得る。インターフェロンを含む処方物、またはインターフェロン様化合物を含む処方物が、以前に記載されている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ、１９７６）。一般に、ＩＦＮ−τを含有する医薬は、有効量のＩＦＮ−τを適切なキャリアおよび／または賦形剤と組み合わせて、その組成物の有効な投与を容易にするように処方される。ＩＦＮ−τまたは関連ポリペプチドを、任意の薬学的に受容可能な投薬形態（静脈内注射、筋肉内注射、病巣内注射、または皮下注射を含む）で患者に投与し得る。詳細には、他のインターフェロン化合物のために使用される組成物および方法を、これらの化合物の送達のために使用し得る。
【００５２】
経口投与に適切な組成物の場合、ＩＦＮ−τおよび、必要に応じて、例えば、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、ラクトース、トウモロコシデンプン、軽質無水ケイ酸（ｌｉｇｈｔ ｓｉｌｉｃｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、微結晶性セルロース、ショ糖）、結合剤（例えば、α型デンプン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、低置換型（ｌｏｗ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）ヒドロキシ−プロピルセルロース）、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー）、抗酸化剤（例えば、Ｌ−システイン、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク）などの添加剤を含む錠剤およびカプセルを、ＩＦＮ−τ（例えば、凍結乾燥されたＩＦＮ−τタンパク質）から製造し得る。
【００５３】
さらに、ＩＦＮ−τポリペプチドは固形、粉状、または他のキャリア（例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン（例えば、ポテトデンプン、トウモロコシデンプン）、ミロペクチン（ｍｉｌｌｏｐｅｃｔｉｎｅ）、セルロース誘導体、またはゼラチン）と混合し得、そしてまた、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム）、あるいは錠剤の形状に圧縮されたポリエチレングリコールワックスを含み得る。いくつかの層のキャリアまたは希釈剤を使用して、徐放性で作動する錠剤を調製し得る。
【００５４】
経口投与のための液体調製物を、エリキシル剤、シロップまたは懸濁液の形態（例えば、重量で約０．１％〜約３０％のＩＦＮ−τ、糖ならびにエタノール、水、グリセロール、プロピレン、グリコールおよび従来の性質の可能な他の添加剤の混合物を含む溶液）で作製し得る。
【００５５】
（Ｂ．投薬量）
経口的に活性なＩＦＮ−τ薬学的組成物を、処置の必要のある個体に治療的に有効な量で投与する。その用量は、顕著に変動し得、そして患者の障害の重篤さ、年齢、および体重、患者が取り得る他の投薬などのような因子に依存する。この投薬の量は、代表的には担当医によって決定される。投薬量は、代表的には約１×１０5単位／日と１×１０10単位／日との間であり、好ましくは約１×１０8単位／日と１．５×１０9単位／日との間である。そのより低い毒性ゆえに、ＩＦＮ−τは、例えばＩＦＮ−αよりも高用量で投与され得ることが理解される。
【００５６】
血漿中のＩＦＮ−τの定常的に上昇したレベルを必要とする障害は、約２〜４時間毎の頻度の経口投与、または約１２〜２４時間毎の注射を経由した投与から恩恵を受けるが、一方他の障害は、より少ない頻度の間隔で（例えば、４８時間毎）、治療的に有効な用量を投与することによって効果的に処置され得る。個々の用量の投与の速度は、代表的には担当医によって調整され、処置される疾患の重篤度を軽減しながら、最も低い全体用量の投与を可能にする。
【００５７】
一旦患者の状態の改善が起これば、必要な場合、維持用量が投与される。その後、用量または投与の頻度、あるいはその両方が、症状の関数として、改善された状態が保持されるレベルまで減少され得る。
【００５８】
（Ｃ．組み合わせ治療）
本発明の組成物および方法が、他の治療と組み合わせて使用され得ることが当然理解され得る。例えば、ＨＣＶ−感染患者におけるＨＣＶの処置のためのｏｖＩＦＮ−τの組成物は、リバビリンのような抗ウイルス剤と組み合わせられ得る。
【００５９】
（Ｄ．モニタリング）
ｏｖＩＦＮ−τの経口投与によるＨＣＶの処置は、投与の前および投与の後に、血中の２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）レベルを測定することによってモニタリングされる。ＯＡＳレベルは、例えば、投与の１２時間後、２４時間後、および４８時間後にモニタリングされ得る。必要な場合、ＩＦＮ−τの用量は、投与前に観察されるレベルと比較して血中ＯＡＳレベルの測定可能な増加が観察されるまで調整される。
【００６０】
本明細書中で引用されるすべての特許文献および学術文献は、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【００６１】
以下の実施例は、本発明を例証するが、いかなる場合においても本発明を制限することを意図しない。
【００６２】
【実施例】
（材料および方法）
（Ａ．ｏｖＩＦＮ−τの産生）
合成ｏｖＩＦＮ−τ遺伝子を、標準的な分子的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８）を使用して、ＯｖＩＦＮ−τアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（Ｉｍａｋａｗａら、１９８７）の連続部分を含むオリゴヌクレオチドを連結することによって生成した。生じたＩＦＮ−τポリヌクレオチドコード配列は、１６位〜５３１位（１７２アミノ酸のコード配列）にわたる。
【００６３】
全長合成遺伝子ＳｔｕＩ／ＳＳｔＩフラグメント（５４０ｂｐ）を、改変したｐＩＮ ＩＩＩ ｏｍｐ−Ａ発現ベクター中にクローニングし、そしてコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株ＳＢ２２１中に形質転換した。ＩＦＮ−τタンパク質の発現のために、この発現ベクターを有する細胞を、アンピシリンを含むＬ−ブロス中で０．１〜１ＯＤ（５５０ｎｍ）まで増殖させ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）で３時間誘導し、そして遠心分離によって収集した。可溶性の組換えＩＦＮ−τを、超音波処理または浸透圧分画によって細胞から遊離させた。
【００６４】
酵母における発現のために、ＩＦＮ−τ遺伝子を、５’および３’末端にそれぞれＳｔｕＩおよびＳａｃＩ制限部位を含むＰＣＲプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７；Ｍｕｌｌｉｓら、１９８７）を使用して増幅した。増幅したフラグメントを、ＳｔｕＩおよびＳａｃＩＩを用いて消化し、そしてｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ＋（ＫＳ）のＳａｃＩＩおよびＳｍａＩ部位に連結して、ｐＢＳＹ−ＩＦＮτを生成した。プラスミドｐＢＳＹ−ＩＦＮτを、ＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化し、そして合成ＩＦＮ−τ遺伝子を含むフラグメントを単離した。酵母発現ベクターｐＢＳ２４Ｕｂ（Ｅｃｋｅｒら、１９８９）を、ＳａｌＩで消化した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、平滑末端を生成した。ベクターＤＮＡをフェノールで抽出し、そしてエタノール沈澱させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。回収したプラスミドをＳａｃＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、そしてｐＢＳＹ−ＩＦＮ−τから単離したＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントに連結した。生じた組換えプラスミドを、ｐＢＳ２４Ｕｂ−ＩＦＮτと命名した。
【００６５】
組換えプラスミドｐＢＳ２４Ｕｂ−ＩＦＮτを、Ｅ，ｃｏｌｉに形質転換した。ＩＦＮ−τ挿入物を含む組換えクローンを単離し、そして制限酵素分析によって同定した。ＩＦＮ−τコード配列を、ｐＢＳ２４Ｕｂ−ＩＦＮτから単離し、そしてアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングした。次いでこのベクターを、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５ Ｈｉｓ-宿主細胞を形質転換するために使用し、そしてタンパク質を製造者の指示に従って発現させた。このタンパク質を培地中に分泌させ、そして連続的なＤＥＡＥ−セルロースおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって決定されるように、電気泳動的に均一なまでに精製した。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞での抗ウイルス活性によって測定される場合、精製したタンパク質は、約０．２９〜約０．４４×１０8Ｕ／ｍｇの比活性を有した。
【００６６】
（実施例１：ｏｖＩＦＮτの経口および腹腔内投与によるＯＡＳの誘導）
ヒツジインターフェロンタウ（ｏｖＩＦＮτ）（４．９９×１０8単位／ｍｇタンパク質；Ｐｅｐｇｅｎ社、カリフォルニア）を、１０％マルトース溶液に溶かして、ｏｖＩＦＮτ溶液を調製した。
【００６７】
２０ゲージのディスポーザブル経口ゾンデ（フチガミ、京都）を用いてＩＣＲマウス（平均約３０ｇ、６週齢、メス）に１０％マルトース溶液に溶かした２００μｌのｏｖＩＦＮτ溶液を経口投与し、胃上部に直接注入した（ＧＡ）。腹腔内投与では、１００μｌのｏｖＩＦＮτ溶液を用いた（ｉ．ｐ．）。胃上部にサンプルが注入されたことを、色素の投与によって確認した。投与の２４時間後にネンブタール麻酔し、心臓より採血し、全血中のＯＡＳ活性を２−５Ａ ＲＩＡキット（栄研化学、東京）（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｍ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、９、７１５〜７１９、１９８９を参照のこと）を用いて測定した。
【００６８】
１０5単位のｏｖＩＦＮτの、経口投与（τＧＡ）と腹腔投与（τｉ．ｐ．）の効果を比較した場合、両者ともほぼ同じ血中ＯＡＳ誘導活性を示した。結果を図１に示す。
【００６９】
（実施例２：ｏｖＩＦＮτ経口投与によるＯＡＳの用量依存性誘導）
実施例１と同様の手順で、０、１０3、１０4、１０5単位のｏｖＩＦＮτを、ＩＣＲマウスにそれぞれ経口投与した。投与の１２時間後に心臓から血液を採取し、全血中のＯＡＳ活性を測定した。図２に示すように、全血中のＯＡＳ活性は、用量依存的に上昇した。
【００７０】
本発明を特定の方法および実施態様に関して記載したが、種々の改変および変更が本発明から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【００７１】
（参考文献）
【００７２】
【表２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【発明の効果】
インターフェロンタウ（ＩＦＮ−τ）を用いる、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染により引き起こされる肝炎に関連した状態を処置するための組成物を提供する。本発明はまた、２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血中レベルを測定することによるＨＣＶの処置のモニタリングの方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｏｖＩＦＮ-τの腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与または胃投与（Ｇ．Ａ．）後のマウス全血中のＯＡＳレベルを示す。
【図２】図２は、ｏｖＩＦＮ-τの胃投与（Ｇ．Ａ．）による血液ＯＡＳの用量依存誘導を示す。
【図３】図３は、ヒツジＩＦＮ-τのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ヒツジ成熟ＩＦＮ-τのアミノ酸配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ感染患者におけるＨＣＶの処置に用いるための経口送達組成物であって、以下：
ｉ）２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血流中レベルを刺激するために有効な投薬量のヒツジＩＦＮ−τ、および
ｉｉ）ＩＦＮ−τを含有する経口送達ビヒクルであって消化管において活性な形態の該ＩＦＮ−τを放出するために有効なビヒクル
を含む、経口送達組成物。
【請求項２】
ヒツジＩＦＮ−τの前記投薬量が１０8〜１０10単位の間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒツジＩＦＮ−τの前記投薬量が口腔粘膜を回避する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ビヒクルが胃または腸内においてヒツジＩＦＮ−τを放出するのに有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
リバビリンと組み合わせた、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＨＣＶの処置のための薬学的組成物であって、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、ここで、該組成物は、口腔粘膜を通してのヒツジＩＦＮ−τの吸収を回避する、薬学的組成物。
【請求項７】
有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含む、ＨＣＶによって引き起こされる肝炎の処置のための、薬学的組成物。
【請求項８】
ヒツジＩＦＮ−τを含む、ヒツジ以外の動物における２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの活性誘導物質。
【請求項９】
ヒツジＩＦＮ−τの経口投与によるＨＣＶ処置のモニタリングの方法であって、以下：
ｉ）２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの経口投与の前および後の該２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血中レベルを測定する工程、および、必要に応じて、
ｉｉ）投与前に観察した血中２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼのレベルと比較して、測定可能な該レベルの上昇が観察されるまで、ＩＦＮ−τの用量を調節する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
前記調節する工程が用量を１０8単位より上に増加する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
ＨＣＶ感染患者におけるＨＣＶの処置に用いるための経口送達組成物であって、以下：
ｉ）２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血流中レベルを刺激するために有効な投薬量のヒツジＩＦＮ−τ、および
ｉｉ）ＩＦＮ−τを含有する経口送達ビヒクルであって消化管において活性な形態の該ＩＦＮ−τを放出するために有効なビヒクル
を含む、経口送達組成物。
【請求項２】
ヒツジＩＦＮ−τの前記投薬量が１０8〜１０10単位の間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒツジＩＦＮ−τの前記投薬量が口腔粘膜を回避する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ビヒクルが胃または腸内においてヒツジＩＦＮ−τを放出するのに有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
リバビリンと組み合わせた、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＨＣＶの処置のための薬学的組成物であって、有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含み、ここで、該組成物は、口腔粘膜を通してのヒツジＩＦＮ−τの吸収を回避する、薬学的組成物。
【請求項７】
有効成分としてヒツジＩＦＮ−τを含む、ＨＣＶによって引き起こされる肝炎の処置のための、薬学的組成物。
【請求項８】
ヒツジＩＦＮ−τを含む、ヒツジ以外の動物における２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの活性誘導物質。
【請求項９】
ヒツジＩＦＮ−τの経口投与によるＨＣＶ処置のモニタリングの方法であって、以下：
ｉ）２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの経口投与の前および後の該２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼの血中レベルを測定する工程、および、必要に応じて、
ｉｉ）投与前に観察した血中２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼのレベルと比較して、測定可能な該レベルの上昇が観察されるまで、ＩＦＮ−τの用量を調節する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
前記調節する工程が用量を１０8単位より上に増加する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−２１３５９７（Ｐ２００６−２１３５９７Ａ）
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０００−３１７１６０（Ｐ２０００−３１７１６０）
【出願日】平成１２年１０月１７日（２０００．１０．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１２年７月２１日〜２２日開催の「２０００年度 第６５回日本インターフェロン・サイトカイン学会」において文書をもって発表
【出願人】（５００１８３６３０）ペプジェン コーポレイション (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１２年１０月１７日（２０００．１０．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１２年７月２１日〜２２日開催の「２０００年度 第６５回日本インターフェロン・サイトカイン学会」において文書をもって発表
【出願人】（５００１８３６３０）ペプジェン コーポレイション (2)
【Ｆターム（参考）】
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