カチオン性オリゴヌクレオチド、同ヌクレオチドの自動調製法およびそれらの使用
本発明は、自動ホスホロアミダイト化学を介して合成され得る、オリゴヌクレオチド部分Ａｉおよびオリゴカチオン部分Ｂｊを有するオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子ＡｉＢｊＨであって、Ａｉは、ｉ−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド残基であり、ｉ＝５〜５０であり、ヌクレオチドＡは、天然または非天然に発生する核酸塩基および／またはペンタフラノシル基および／または生来のホルホジエステル結合を有するオリゴマー、例えば、デオキシリボ、リボ、ロック（ＬＮＡ）ヌクレオチドから選択され、並びにそれらの化学改変体または置換体、例えばホスホロチオアート、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルまたはマーカー基、例えば、蛍光剤であり、Ｂｊは、ｊ−ｍｅｒの有機オリゴカチオン部分であり、ｊ＝１〜５０であり、Ｂは、・-HPO3-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、低級アルキレンであり、ＸはＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎは１〜５であり、ｎ１＝２〜２０である）、・-HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-（ここで、Ｒ４は低級アルキレンであり、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、低級アルキレンであり、Ｘ１はプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミン残基である）、・-HPO3-R7-(aa)n2-R8-O-（ここで、Ｒ７は低級アルキレンであり、Ｒ８は低級アルキレン、セリン、天然アミノアルコールであり、(aa)n2は、カチオン性側鎖を有する天然アミノ酸、例えば、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）を含む群から選択されるものに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン性オリゴヌクレオチド、すなわち、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子（本明細書において（それらの全体的な電荷に関係なく）カチオン性オリゴヌクレオチドとも呼ばれる）であって、オリゴヌクレオチド合成機で段階的に合成され得るものに関する。本発明はまた、分子生物学、診断および治療適用におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、分子生物学および医療において極めて大多数の適用を見出し、膨大な種類の疾患の治療のための非常に選択的な部類の薬物になり得る。
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、別のポリアニオン核酸によって生み出された相補配列にハイブリッド形成した後にそれらの特異的な活性を発揮するポリアニオンである。
【０００４】
候補薬として、それらはまた、アニオン性の細胞膜を通過することが可能でなければならない。
【０００５】
簡単な静電気的な考察により、ハイブリッド形成エネルギーおよび細胞バインディングは、カチオン基のオリゴヌクレオチド構造への付加から恩恵を受け得ることが暗示される。
【０００６】
この目的に向けて、アンモニウムまたはグアニジニウム残基をオリゴヌクレオチドに導入するための多くの合成的なアプローチが研究された：リン酸骨格の置き換え、リボースまたは核酸塩基の改変、およびポリアニオンの末端接合（end conjugation）。しかしながら、ハイブリッド形成の特異性、核酸プロセシング酵素活性並びに代謝物の毒性が、阻害アプローチへの全ての点に影響し、そこで、最良の解決策としてポリカチオンが他の状態の天然のオリゴヌクレオチドに加えられる。残念なことに、オリゴヌクレオチド−カチオンペプチド接合体の段階的な自動合成は、まだ日常的ではない。一方、予め形成された大きなブロック間の接合化学は、簡単ではなく、特に、水においては、「超」双性イオンが、解決困難な溶解性、精製および特徴的な問題を引き起こす。さらに、分子生物学および診断適用は、任意の有機カチオン長さにつながる任意の所与の塩基配列の迅速で簡単な合成を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らによって、オンライン（コンピュータ駆動）のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の合成は、適切に活性化されかつ保護されたオリゴカチオン誘導体を含むバイアルを、４種の天然塩基のものに加えてオリゴヌクレオチド合成機に詰めることによって可能であることが見出された。
【０００８】
本発明の目的は、それ故に、新規なカチオン性オリゴヌクレオチドを提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記カチオン性オリゴヌクレオチドの高収率の自動合成を提供することにある。
【００１０】
さらなる目的において、本発明は、前記カチオン性オリゴヌクレオチドの適用、特には、分子生物学、診断および治療での適用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
それ故に、本発明は、混合オリゴヌクレオチドオリゴカチオン分子であって、自動ホスホロアミダイト化学、すなわち、ポリホスホジエステルを介して合成され得るものに関する。
【００１２】
より詳細には、本発明のカチオン性オリゴヌクレオチドＡｉＢｊＨは、オリゴヌクレオチド部分Ａｉおよびオリゴカチオン部分Ｂｊを有し、ここで、
Ａｉは、ｉ ｍｅｒ（ｉ個）のオリゴヌクレオチド残基であり、ｉ＝５〜５０であり、ヌクレオチドＡは、天然または非天然に生じた核酸塩基および／またはペンタフラノシル基および／または生来のホスホジエステル結合を有するオリゴマーであり、
Ｂｊは、ｊ ｍｅｒの有機オリゴカチオン部分であり、ｊ＝１〜５０であり、Ｂは、
・ -HPO3-R1-(X-R2n)n1-X-R3-O-（ここで、Ｒ１、Ｒ２ｎおよびＲ３は、同一または異なって、低級アルキレンであり、Ｘは、ＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎは１〜５であり、ｎ１は２〜２０である）、
・ -HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-（ここで、Ｒ４は低級アルキレンであり、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、低級アルキレンであり、Ｘ１は、プトレッシン、スペルミジンまたはスペルミン残基である）、
・ -HPO3-R7-(aa)n2-R8-O-（ここで、Ｒ７は低級アルキレンであり、Ｒ８は低級アルキレン、セリン、天然アミノアルコールであり、(aa)n2は、カチオン性側鎖を有する天然アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸）を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）
を含む基から選択される。
【００１３】
明細書および特許請求の範囲において用いられる場合の「低級アルキル」および「低級アルキレン」は、好ましくは、置換されてもよいＣ１−Ｃ５直鎖（linear）または分枝鎖アルキルまたはアルキレン基をそれぞれ表す。
【００１４】
Ａは、例えば、デオキシリボ、リボ、ロック（ＬＮＡ）ヌクレオチド並びにそれらの化学改変体または置換体、例えば、ホスホロチオアート（チオホスファートとも表される）、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルまたはマーカー基、例えば、蛍光剤を含む群から選択される。
【００１５】
本発明の混合オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子は、３’Ａ５’−Ｂ配列を有する。
【００１６】
本発明の他の分子は、Ｂ−３’Ａ５’配列を有する。
【００１７】
本発明のさらに他の分子は、Ｂ−３’Ａ５’−Ｂまたは３’Ａ５’−Ｂ−３’Ａ５’配列を有する。
【００１８】
このような配列は、実施例において、下記構造を有するオリゴヌクレオチド−スペルミン分子によって例示される：
（３’Ａ５）ｉ−［ＰＯ３−−（ＣＨ２）４−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）３−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）４−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）３−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）４−Ｏ］ｊＨ
式中、Ａ、ｉおよびｊは、上記定義の通りである。
【００１９】
Ａがホスホロチオアートヌクレオチドである分子は、それらの生物学的適用の点で特に有利である。ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、生体液中で加水分解されないからである。
【００２０】
上記規定のカチオン性オリゴヌクレオチドは、実施例によって例示されるように、鎖置換の状況下、さらにはプラスミド鎖の侵入の状況下にそれらの相補配列と迅速で安定な複合体を形成する。
【００２１】
末端接合に起因して、配列の選択性は、天然のヌクレオチドと同程度に高いままである。
【００２２】
したがって、本発明のカチオン性オリゴヌクレオチドは、分子生物学、研究試薬および診断適用、例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ジェノタイピング、in situ ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡチップのために非常に興味深いものである。
【００２３】
このような適用もまた本発明によってカバーされ、上記に定義されたようなオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の使用を含む。
【００２４】
アニオン性オリゴヌクレオチドとは対照的に、本発明のカチオン性オリゴヌクレオチドは、実施例において、生細胞の細胞質および核に自発的に入ることが示される。
【００２５】
それらの強化されたハイブリダイゼーションおよび細胞浸透特性の点で、それらはまた、治療適用、例えば、メッセンジャーＲＮＡのアンチセンスおよびｓｉＲＮＡ分解、メッセンジャーＲＮＡの成熟の間のエキソンスキッピング、クロマチンによる三重らせんの形成、クロマチン鎖の侵入（遺伝子修正）等によって媒介されるものに有用である。
【００２６】
本発明は、それ故に、上記規定のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の有効量を、製薬的に許容される担体と関連して含む医薬組成物にも関する。
【００２７】
本発明はまた、上記に規定されたようなオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の有効量を製薬的に許容される担体と関連して用いる工程を包含する治療方法に関する。
【００２８】
上記規定の混合オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子は、有利には、オリゴヌクレオチド合成機により、ホスホロアミダイトルートを介して、
− 活性化されかつ保護されたオリゴカチオンＢを含むバイアルを、上記規定のようなオリゴヌクレオチドＡのバイアルに加えて、またはその逆のようにしてオリゴヌクレオチド合成機に詰める工程と、
− 所望の長さが得られた時に合成を停止させる工程と、
− 固体担体からオリゴマーを開裂させる工程と、
− 保護基を除去する工程と
を包含する方法に従って段階的に合成される。
【００２９】
本発明は、オリゴカチオン反復ブロックＢの構造の自動合成において用いられるホスホロアミダイト試薬と密接に関連する。以下のホスホロアミダイト試薬が、この目的のために用いられ得る：
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2ｎ)n1-X-R3-O-Prot（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎおよびｎ１は、上記定義の通りであり、Ｘは、適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは低級アルキルであり、Ｒ１０が低級アルキルであるかまたは−Ｎ（Ｒ１０）２がピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ基であり、Protは、オリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基、例えば、ＤＭＴ、ＭＭＴである）；
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot（ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は低級アルキレンであり、Ｘ１は適切に保護されたプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミンであり、Ｒ９およびＲ１０は上記の定義通りである）；
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2 -R8-O-Prot（ここで、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２およびProtは、上記定義の通りであり、(aa)n2は、適切に保護されたカチオン性側鎖を有する天然アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸）を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）。
【００３０】
適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２は、試薬が露出させられた化学反応条件に対してアミノ基またはグアニジン残基の機能を不活性にするために保護基がそれら上にそれぞれ存在することを意味する。
【００３１】
そのような保護基は、例えば、フタルイミド（ＰＨＴＨ）、トリフルオロアセタート、アリルオキシカルボニル（Alloc）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、クロロベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびイソニコチニルオキシ（ｉ−Ｎｏｃ）基である。
【００３２】
本発明の実施形態によると、オリゴヌクレオチド配列の段階的合成の後に、オリゴカチオン部分の段階的合成が行われて、配列（３’Ａ５’−Ｂ）を有する化合物が得られる。
【００３３】
別の実施形態によると、逆順の工程が行われ、オリゴカチオン部分の段階的合成の後に、オリゴヌクレオチド配列の段階的合成が行われて、（Ｂ−３’Ａ５’）配列の化合物が得られる。
【００３４】
さらに別の実施形態によると、混合配列が合成される。
【００３５】
特に、両端でキャッピングされたオリゴヌクレオチド配列（Ｂ−３’Ａ５’−Ｂ）は、生体液中でエキソヌクレアーゼに抵抗することができ、カチオンを割り込ませた配列（３’Ａ５’−Ｂ−３’Ａ５’）は、隣接する核酸配列のターゲッティングを可能にする。
【００３６】
天然に生ずるアミン（例えばスペルミン）またはペプチド（例えばオリゴアルギニン）を用いることによって、代謝物の潜在的な毒性は回避される。スペルミンは、リモラー濃度で細胞中に実際に存在し、その末端のアルキル化物は無害である。さらに、塩基性ペプチド配列は、多くの核タンパク質に存在する。
【００３７】
活性化されかつ保護されたオリゴカチオンＢは、有利には、ポリアミンのアミノ基を保護した後に、オリゴヌクレオチド合成に化学反応を起こさないジオールにつながるα，ω−ビスヒドロキシアルキル化を行うことによって得られる。
【００３８】
従来のＤＭＴおよびホスホロアミダイトの延長（elongation）化学は、有利には、塩基不安定ＴＦＡ保護基と一緒に実行される。
【００３９】
化学的に保護されたジオール体は、新規物であり、本発明の範囲に入る。
【００４０】
本発明は、特に、以下を含む群から選択される中間体に関する：
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2ｎ)n1-XR3-O-Prot（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎおよびｎ１は上記に定義された通りであり、Ｘは適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは低級アルキルであり、Ｒ１０は低級アルキルであるかまたは−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ基であり、Protは、オリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基、例えばＤＭＴ、ＭＭＴである）；
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot（ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は低級アルキレンであり、Ｘ１は適切に保護されたプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミンであり、Ｒ９およびＲ１０は上記に定義された通りである）；
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2 -R8-O-Prot（ここで、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２およびProtは上記に定義された通りであり、(aa)n2は、適切に保護されたカチオン性側鎖を有する天然アミノ酸、例えば、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）。
【００４１】
本発明の他の特徴および利点は以降に与えられる。特に、スペルミン（Ｓ）を有するデカマーオリゴヌクレオチド配列（Ａ１０）（以下においてＡ１０Ｓｎ）によって表される）の合成が、実例として、本発明の範囲を制限することなく与えられることになる。実施例において、図１〜１４が参照されることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（実施例１：ホスホロアミダイトスペルミン合成素子の合成）
スペルミン連結ホスホロアミダイト１は、以下のスキーム１に示されるようにスペルミンから合成された。
【化１】
【００４３】
（Mes＝２，４，６−トリメチルフェニル；ＴＢＤＭＳ＝ｔ−ブチルジメチルシリル；ＴＦＡ＝ＣＦ３ＣＯ−；ＤＭＴ＝４，４’−ジメトキシトリチル）
テトラキス（メシチルスルホニル）スペルミン２は、スペルミンから調製されるものであり、このものはビスアルキル化されて３を得た。酢酸条件中での３の完全な脱保護の後、粗ビス（Ｃ４−ＯＨ）スペルミン・テトラヒドロブロミド４は、ピリジン中の無水トリフルオロ酢酸によって完全に保護され、次いで、５の２つの末端エステル基は、中性条件下に加水分解されてジオール体６を得た。１モル当量のＤＭＴＣｌ試薬を用いる統計的方法で５のモノトリチル化が行われ、４３％の収率で７を得た。未反応のジオール体６およびビス・トリチル化合物８が回収され、中程度の酸条件（ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸）下、再平衡に達しさせられ、７を得た。７のホスファイト化により、所望のホスホロアミダイト１を得た。
【００４４】
Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（メシチルスルホニル）スペルミン（２）：この化合物は、文献：Bergeron et al. J. Med. Chem. 2001, 44, 232-244.に従って調製された。
【００４５】
Ｎ１，Ｎ１２−ビス［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ブチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（メシチルスルホニル）−スペルミン（３）：水素化ナトリウム（６０％，１．０ｇ，２５ｍｍｏｌ）が、２（９．３１ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）にＮ２下に０℃で攪拌しながら分けて加えられた。室温で３０分間にわたって攪拌した後、ｔ−ブチル（４−ヨードブトキシ）ジメチルシラン（７．８６ｇ，２５ｍｍｏｌ）が、一度に加えられた。混合物は、室温で終夜攪拌され、次いで、Ｈ２Ｏ−ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ／１００ｍＬ）で分液された。有機相が分けられ、水相はＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）により３回抽出された。有機相が合わせられ、このものは、ＮａＨＣＯ３溶液（１Ｍ）により洗浄され、次いで、ＭｇＳＯ４により乾燥させられた。溶媒留去の後、糊状の残渣は、フラッシュ・クロマトグラフィーによって、溶離液として１：４ ＡｃＯＥｔ：シクロヘキサンを用いて精製された。３を含むフラクションは、糊状の油状物にまで溶媒留去され、このものは、冷ペンタンによりさらに洗浄され、迅速な可動不純物（fast moving impurity）が除去され、次いで、ポンプで真空吸引され、９．９７ｇ（７６％）の３を油状物として得た：ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン １：４）：Rf=0.28 IR (KRS-5): 2937, 1604, 1471, 1320, 1151, 1101, 838, 777, 657, 578 cm-1. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ= -0.01 (s, 12 H), 0.85 (s, 18 H), 1.20-1.45 (m, 12 H), 1.62 (m, 4 H), 2.28 (s, 6 H), 2.29 (s, 6 H), 2.53 (s, 12 H), 2.54 (s, 12 H), 2.90-3.10 (m, 16 H), 3.42 (t, J = 6.1 Hz, 4 H), 6.91 (s, 4 H), 6.92 (s, 4 H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ= 4.7, 18.9, 21,6, 23.4, 23.5, 24.1, 24.9, 25.7, 26.6, 30.4, 43.5, 43.6, 45.6, 45.7, 62.9, 132.59, 132.64, 133.8, 140.7, 143.0, 143.1 MS-ESI (MeOH): m/z = 1325.85 [M + Na]+, 1303.83 [M + H]+. C66H110N4O10S4Si2 (Mw = 1304.03) 計算値 C 60.79, H 8.50, N 4.30, S 9.84; 実測値C 60.74, H 8.55, N 4.21, S 9.63.
Ｎ１，Ｎ１２−ビス（４−ヒドロキシブチル）スペルミン・テトラヒドロブロミド（４）：酢酸中の臭化水素（３３重量％溶液，８０ｍＬ，１．４ｍｏｌ）が、３（９．８７ｇ，７．５７ｍｍｏｌ）およびフェノール（２９．０ｇ，０．３１ｍｏｌ，４０当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（８０ｍＬ）に滴下された。反応混合物は、室温で終夜攪拌された。氷浴により冷却した際に、冷水（１００ｍＬ）が、攪拌しながら加えられた。有機層が分けられ、水（２０ｍＬ）により３回抽出された。水層が合わせられ、このものは、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）により５回洗浄され、乾燥するまで溶媒留去させられた。得られた湿気を有する固体残渣は、エーテル中に懸濁させられ、スパーテルにより粉砕され、上澄みエーテル層は廃棄された。これらの操作は、固体懸濁液が得られるまで繰り返された（５回）。溶媒留去および真空乾燥の後、化合物４が固体として得られた（５．３２ｇ）。この粗物質は、さらなる精製なしで用いられた：1H NMR (300 MHz, D2O): δ = 1.75-2.10 (m, 12 H), 2.27 (m, 4 H), 3.15-3.35 (m, 16 H), 3.76 (t, J = 12.2 Hz, 4 H). 13C NMR (75 MHz, D2O): δ = 22.9, 23.2, 23.4, 29.0, 45.0, 45.2, 47.7, 48.3, 61.5. MS-ESI (MeOH): m/z = 347.39 [M + H]+.
Ｎ１，Ｎ１２−ビス（４−（トリフルオロアセトキシ）ブチル）−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（トリフルオロアセチル）スペルミン（５）（４からＴＦＡ２Ｏ／ＮＥｔ３により）：４（５．３ｇ，７．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２懸濁液（５０ｍＬ）に、トリエチルアミン（１１．５ｇ，１１４ｍｍｏｌ、１５当量）が、一度に加えられた。混合物は、氷浴で冷却され、無水トリフルオロ酢酸（１９．１ｇ、９０．９ｍｍｏｌ，１２当量）がＮ２下に攪拌しながら滴下された。混合物は、室温で３．５時間にわたって攪拌された。氷浴による冷却後、得られた溶液は、冷水（２０ｍＬ）により３回洗浄され、ＭｇＳＯ４で乾燥させられ、次いで、溶媒留去されて、油状残渣（１１．７ｇ）を得、この油状残渣は、この反応の二次生成物として（ＴＦＡ）２Ｃ＝ＣＨ−ＮＥｔ２を含有する（参照；Schreber, S. L., Tetrahedron Lett. 1980, 21, 1027）。これは、２回の連続するフラッシュ・クロマトグラフィー（溶離液１：１−６０：４０ ＡｃＯＥｔ：シクロヘキサン、次いで、５〜１０％Ｅｔ２Ｏ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって除去され、５（５．５９ｇ，８１％）を油状物として得た：ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン １：１）；Rf = 0.25. IR (KRS-5): 2955, 1789, 1690, 1467, 1352, 1197, 1147, 759, 731, 692 cm-1. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.52-2.06 (m, 16 H), 3.33-3.49 (m, 16 H), 3.38 (m, 4 H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): このスペクトルは、４つのアミド基の回転異性体によって複雑化されている。高強度の共鳴シグナルのみが以下のように記載される：δ = 23.3, 23.9, 24.1, 24.8, 25.3, 25.6, 26.0, 26.55, 26.61, 44.4, 44.8, 45.7, 46.1, 46.4, 47.3, 48.0, 56.6, 67.3, 67.5, 116.6 (q, J = 288 Hz), 156.9, 157.4, 157.8, 158.6.
Ｎ１，Ｎ１２−ビス（４−ヒドロキシブチル）−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（トリフルオロアセチル）スペルミン（６）：５（５．３９ｇ，５．８４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（５０ｍＬ）に、ＮａＨＣＯ３（０．１ｇ，固体）が一度に加えられ、得られた懸濁液は、２時間にわたって室温で攪拌された。溶媒留去の後、油状残渣は、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させられ（若干繊維質のＮａＨＣＯ３）の懸濁液を与える）、５〜１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２により溶離するフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製され、３．６１ｇ（８５％）の６を油状物として得た：ＴＬＣ（ＭｅＯＨ５％／ＣＨ２Ｃｌ２）：Rf=0.14（MeOH10%/CH2Cl2）：Rf=0.45．1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ= 1.51-2.02 (m, 18 H), 3.33-3.51 (m, 16 H), 3.68 (m, 4 H). MS-ESI (MeOH): m/z = 753.33 [M + Na]+. C26H38F12N4O6・H2O (Mw = 748.60) 計算値 C 41.72, H 5.39, N 7.48, F 30.45; 実測値C 41.97, H 5.26, N 7.37, F 30.14.
４からの６の調製（ＴＦＡ２Ｏ／ピリジン、次いでＮａＨＣＯ３による）：４（１５．３ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）およびピリジン（４４ｍＬ，０．５４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、無水トリフルオロ酢酸（４６ｍＬ，０．３３ｍｏｌ）が、氷浴で冷却しながらおよびＮ２下に攪拌しながら滴下された。混合物は、室温で３時間にわたって攪拌された。過剰の無水トリフルオロ酢酸が、氷浴で冷却しながら冷水（１００ｍＬ）を添加することによって分解され、次いで、得られた溶液は、ＣＨ２Ｃｌ２により抽出された（４回１００ｍＬ＋５０ｍＬ＋２５ｍＬ×２）。抽出物を合わせ、このものは、冷水により洗浄され（５０ｍＬ×３）、ＭｇＳＯ４で乾燥させられ、次いで、溶媒が留去されて、粗生成物５を油状物として得た（１９．４ｇ，９２％）。この油状物は、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解させられた。ＮａＨＣＯ３（固体，０．１ｇ）が加えられ、懸濁液は、終夜攪拌された。溶媒を留去した後、残渣は、フラッシュ・クロマトグラフィーによって、溶離液として５〜７％ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製され、１０．１ｇ（６１％）の６を油状物として得た。
【００４６】
Ｎ１−［４−（ジメトキシトリチルオキシ）ブチル］−Ｎ１２−（４−ヒドロキシブチル）−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（トリフルオロ−アセチル）スペルミン（７）：６（１．４６ｇ，２．００ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（３ｍＬ）に、ＤＭＴＣｌ（７５７ｍｇ，２．２３ｍｍｏｌ）が１ｍＬのピリジンを用いて加えられ、リンスされた。反応混合物は、４時間にわたって室温でＮ２下に攪拌され、次いで、ピリジンが、トリエンによる共留去によって繰り返し除去された。残渣は、２回の連続的なフラッシュ・クロマトグラフィー（溶離液 ２〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、次いで、１０〜１５％アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製され、７（８７９ｍｇ，４３％）（発泡体）およびビス−ＤＭＴ誘導体８（６４８ｍｇ，２４％）を得た。出発ジオール６も回収された（３５０ｍｇ，２４％）。７のデータ：ＴＬＣ（アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２ １：９）：Rf=0.20 1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ= 1.51-2.03 (m, 17 H), 3.11 (m, 2 H), 3.32-3.51 (m, 16 H), 3.71 (m, 2 H), 3.81 (s, 6H), 6.84 (m, 4 H), 7.19-7.46 (m, 9 H)． MS-ESI (MeOH): m/z = 1055.52 [M + Na]+. C47H56F12N4O8 (Mw = 1032.95) 計算値 C 54.65, H 5.46, N 5.42, F 22.07; 実測値 C 54.46, H 5.58, N 5.37, F 21.63.
ジオール体（６）およびビス−ＤＭＴ誘導体（８）からの化合物（７）：６（１．４ｇ，１．９ｍｍｏｌ）および８（２．５ｇ，１．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に、トリフルオロ酢酸（５０μＬ，０．６ｍｍｏｌ）が加えられ、室温で３０分間にわたり攪拌された。溶液は、Ｎａ２ＣＯ３の１Ｍ溶液により３回洗浄され、ＭｇＳＯ４で乾燥させられ、溶媒留去された。残渣は、フラッシュ・クロマトグラフィー（カラム径：５０ｍｍ，ＳｉＯ２の高さ：１５ｃｍ）によって、５％ＡｃＯＥｔ／ＣＨ２Ｃｌ２（７５０ｍＬ）、３３％ＡｃＯＥｔ／ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）、７％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）および１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）を連続的に用いて分離され、８（１．１ｇ）、７（１．２ｇ）および６（１．３ｇ）を得た。
【００４７】
スペルミン連結ホスホロアミダイト（１）：７（８４４ｍｇ，８１７μｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２３０μＬ，１．６５ｍｍｏｌ，２当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（４ｍＬ）に、２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスファイト（２０５μＬ，０．９２ｍｍｏｌ，１．１当量）が加えられ、混合物は、Ｎ２下に室温で４０分間にわたり攪拌された。反応混合物は、ＮＥｔ３で飽和された（ＣＨ２Ｃｌ２：シクロヘキサン１：２中ＮＥｔ３ １％；４００ｍＬ）ＳｉＯ２カラム（直径：２０ｍｍ、高さ：１５ｃｍ）に、ＣＨ２Ｃｌ２：シクロヘキサン １：２中ＮＥｔ３ １％（１２５ｍＬ）、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２：シクロヘキサン１：１中ＮＥｔ３ １％（１００ｍＬ）を用いて通され、１（７３５ｍｇ，７３％）を油状物として得た：1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ= 1.13-1.35 (m, 12 H), 1.51-2.06 (m, 16 H), 2.66 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.11 (m, 2 H), 3.32-3.98 (m, 20 H), 3.81 (s, 6H), 6.84 (m, 4 H), 7.15-7.51 (m, 9 H). 31P NMR (81 MHz, CDCl3): 148.06, 148.13, 148.19, 148.3 （アミドの回転異性体に起因して分裂している）
（実施例２：下記式を有するデカマー・オリゴヌクレオチドの合成、精製および特徴付け）
【００４８】
【化２】
【００４９】
前記オリゴヌクレオチドは、以降ではＮ１０Ｓｎ（Ｎ１０＝オリゴヌクレオチド部分；Ｓ＝スペルミン残基およびｎ＝１〜６）によって表されることになる。
【００５０】
自動合成：増加する数のスペルミン残基Ｓが付け加えられた同一配列Ｎ１０＝3’CACCGTAGCG5’の一連のデカマー・オリゴヌクレオチドは、標準固相シアノエチルホスホロアミダイト化学を用いてExpedite DNA合成機により、下記スキームに従って合成された。
【００５１】
【化３】
【００５２】
最後のＮ部は、古典的なオリゴヌクレオチド合成によるヌクレオチドである。
【００５３】
自動ＤＮＡ合成に用いられる試薬は、Glen Research（Eurogentec）から購入された。
【００５４】
自動合成の間、長期にわたるカップリング時間（１５分）によりなされ、わずかにより高濃度ホスホロアミダイト溶液（１ｍＬのアセトニトリル中９０ｍｇのアミダイト）を用いたスペルミンホスホロアミダイト１のカップリング以外は、標準の１μｍｏｌのカップリングサイクルが用いられた。
【００５５】
トリチルフラクションが集められ、希釈され、分光光度計において分析されて、段階的なカップリング収率が測定された。
【００５６】
４種の天然ヌクレオチドのカップリング収率は９７％を超えたが、一方で、
スペルミンホスホロアミダイトのカップリングの収率は上記カップリング条件において９０〜９６％であった。
【００５７】
全ての場合で、ＤＭＴ−ＯＮ（ＯＮ＝オリゴヌクレオチド）の形態が用いられ、精製−同定の目的のためオリゴマー上で開裂されていない５’端のＤＭＴ基が維持された。
【００５８】
合成後処理：自動合成の後、オリゴマーの固体担体からの開裂および完全な脱保護が標準的な条件（開裂のための濃アンモニア水による９０分間にわたる室温での、次いで、脱保護のための終夜にわたる５５℃での処理）を用いてなされた。
【００５９】
精製：最初の２つのアニオン性オリゴヌクレオチドＮ１０Ｓ１およびＮ１０Ｓ２は、最初に、ＤＭＴ−ｏｎ状態で、逆相ヌクレオシルＣ−１８カラム（Macherey-Nagel １０×２５０ｍｍ）による標準ＨＰＬＣ手順によって、２０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７）中アセトニトリルの線形濃度勾配（２０分内で５〜３５％）により精製された。精製されたオリゴヌクレオチドは、次いで、室温で２０分間にわたってＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ＝４／１（５００ｍＬ）による処理によって脱トリチル化された。水（５ｍＬ）による希釈の後、ＤＭＴ−ＯＨが、エーテル抽出（３×２ｍＬ）によって除去され、水相が濃縮され、オリゴマーを得た。
【００６０】
オリゴヌクレオチドＮ１０Ｓ１およびＮ１０Ｓ２のＨＰＬＣ分析は、図１において、逆相ヌクレオシルＣ−１８カラム（Macherey-Nagel ４．６×２５０ｍｍ）で、２０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７）中のアセトニトリルの線形勾配（２０分内の５〜３５％）により与えられる：ａ）Ｎ１０Ｓ１（粗生成物）、ＤＭＴ−ＯＮ；ｂ）Ｎ１０Ｓ１（精製）；ｃ）Ｎ１０Ｓ２（粗生成物）、ＤＭＴ−ＯＮ；ｄ）Ｎ１０Ｓ２（精製）。＊ベンズアミド；＊＊端を切り取った（truncated）配列。
【００６１】
中性オリゴマーＮ１０Ｓ３およびカチオン性オリゴマーＮ１０Ｓ４、Ｎ１０Ｓ５およびＮ１０Ｓ６（ＤＭＴ基を有するかまたは有しない）は、アセトニトリル／濃アンモニア水／水（２０：４：８０）によりなされた最終のオリゴヌクレオチド溶離を除いて、Poly-Pak II（登録商標）（Glen Research/Eurogentec）カラムを用いて、製造業者によって与えられた指示に従って精製された。オリゴヌクレオチドを含むフラクションは、ＴＬＣプレートを用いて明らかにされ得る。フラクションを集めた後、溶媒は、凍結乾燥によって除去された。こうして得られたオリゴマーは、概して、ベンズアミドによって汚染されていた。それは、希アンモニア水溶液（５０ｍＭ）への溶解後のエーテルによる抽出（３回）によって除去された。精製されたオリゴヌクレオチドは、希アンモニア水溶液（５０ｍＭ）に溶解させられ、それらの濃度は、以下の吸光係数（２６０ｎｍ，ｍｏｌ−１ｄｍ３ｃｍ−１）を用いて測定された：
ε＝（１５．４ＮＡ＋１１．５ＮＧ＋７．４ＮＣ＋８．７ＮＴ）×０．９×１０３
精製されたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析は図２に与えられる：線形勾配（ＮａＣｌ（１０分超で１００〜３５０ｍＭ）／ＮａＯＨ２５ｍＭ（ｐＨ１２．４））を有する陰イオン交換カラム（Dionex PA-100g×250mm）：ａ）Ｎ１０Ｓ１、ｂ）Ｎ１０Ｓ２、ｃ）Ｎ１０Ｓ３、ｄ）Ｎ１０Ｓ４、ｅ）Ｎ１０Ｓ５、ｆ）Ｎ１０Ｓ６。
【００６２】
用いられた接合化学（conjugation chemistry）に起因して、各ポリアミンは、リン酸基と同伴し、それ故に、正味の追加のカチオン電荷に寄与する。７種のオリゴヌクレオチド（Ｎ１０Ｓｎ）３ｎ−９ｎ＝０．．．６（完全にイオン化された場合に全体的な電荷−９、−６、−３、０、＋３、＋６、＋９を有する）が、それ故に、８０〜２５０ナノモルの範囲の量で利用可能である。
【００６３】
（電気泳動移動度）
ｐＨ７における電界中のそれらの遊走が、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって研究され、銀鏡染色によって明らかにされた。１０μＬのローディングバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、グリセロール）中の化合物（０．５ｎｍｏｌ）が、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＴＡＥ ｐＨ７中１５％）上に充填された。電気泳動は、５Ｖ／ｃｍで１７時間にわたり４℃で実行された。銀染色は、Rabilloud et al, Electrophoresis, 1987,9, 288-291に従って行われた。結果は、図３に与えられる。スペルミンを有しないオリゴヌクレオチドＮ１０（レーン１）は、アノードに向かって迅速に移動し、ポリアミン含有オリゴヌクレオチドが明らかにされる条件下にかすかな銀染色のみを示した。
【００６４】
（Ｎ１０のＮ１０・Ｃ１０との自発的な交換）
オリゴヌクレオチドＣ１０（ここで、Ｃは、Ｎに相補的なヌクレオチドである）（５０ｐｍｏｌまたは５００ｐｍｏｌ）が、蛍光Ｎ１０・Ｃ１０＊二本鎖体溶液（ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４，ＮａＣｌ １５０ｍＭ中５０ｐｍｏｌ）に加えられた。混合物は、４時間３７℃、２０℃または１０℃でインキュベートされ、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＴＡＥ ｐＨ７中１５％）上に充填された。電気泳動は、４℃で１７時間にわたって５Ｖ／ｃｍで行われた。Ｃ１０＊蛍光は、Typhoon 8600 Imagerを用いてゲルを走査することによって検出された。図４において与えられる結果によって示されるように、Ｎ１０のＮ１０・Ｃ１０との自発的交換は、１０℃において顕著ではない。
【００６５】
（Ｎ１０とＮ１０Ｓｎとの間の鎖の交換）
天然の二本鎖体Ｎ１０・Ｃ１０へのＮ１０Ｓｎの鎖の置換能が生理塩条件において試験された。
【００６６】
スペルミン接合体Ｎ１０Ｓｎ（５０または５００ｐｍｏｌ）が、蛍光Ｎ１０・Ｃ１０＊二本鎖体溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中５０ｐｍｏｌ）に加えられた。混合物は、４時間１０℃でインキュベートされ、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＴＡＥ ｐＨ７中１５％）上に充填された。電気泳動は、４℃で１７時間にわたって５Ｖ／ｃｍで行われた。蛍光は、Typhoon 8600 Imagerを用いてゲルを走査することによって検出された。
【００６７】
スペルミン接合体は、図５に示されるように鎖交換反応に重大な影響を及ぼした。Ｎ１０・Ｃ１０＊に対応するバンドは、増加した競争Ｎ１０Ｓｎのスペルミン残基の数に応じて、よりゆっくり移動する、より乏しいアニオン性のＮ１０Ｓｎ・Ｃ１０＊複合体に有利になるように、より弱くなった。この効果は、特に、Ｎ１０Ｓ３、すなわち、形式的な陰電荷をもはや帯びない接合体について断言される。実際に、スペルミンは、副溝においてＮＨ２＋二座水素結合の鎖間ネットワークを形成することによって二本鎖ＤＮＡ構造を取り囲んでおり、それ故に、Ｎ１０よりもＮ１０Ｓｎバインディングに有利に働くことになる。それでも、事前に形成された（Ｎ１０Ｓｎ）３ｎ−９／（Ｎ１０・Ｃ１０）１８−静電複合体（ｎ＞３についての場合であり得る）において鎖交換が起こる場合にさらなる有利な速度論的因子が作動し得る。
【００６８】
（Ｎ１０Ｓｎ・Ｃ１０二本鎖体の融点）
二本鎖核酸の安定性は、それらの融点、すなわち、相補鎖が協同的にバラバラになる温度を測定することによって比較された。Ｎ１０Ｓｎ・Ｃ１０の溶液の光学密度（optical density：Ｏ．Ｄ．）対温度Ｔが、２６０ｎｍで記録された。
【００６９】
融点Ｔｍは、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４（黒色線，菱形）中およびＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（灰色線、円）中で測定された。全二本鎖体（１ｍＬバッファ中３．７５ｎｍｏｌ）の溶融プロファイルは、温度制御装置を備えたCARY 4000分光光度計を用いて、サンプルを徐々に加熱（１℃／分）しながら、それらの２６０ｎｍでの吸収を記録することによって得られた。二本鎖体の溶融は、結果として、濃色シフト（hyperchromic shift）をもたらし、Ｔｍは、一次導関数曲線ｄＯ．Ｄ．／ｄＴ＝ｆ（Ｔ）が最大に達する温度である。結果は、図５に与えられる。
【００７０】
天然の二本鎖体は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４においてＴｍ＝３０℃で溶解した（図５）。接合体のスペルミン数の増加は、顕著なＴｍの増加につながった。Ｎ１０Ｓ６・Ｃ１０はＴｍ＝７５．２℃で溶解し、いくつかは、天然の二本鎖体より高い４５℃で溶解した。Ｔｍ＝ｆ（ｎ）曲線は、天然のＮ１０Ｓ３オリゴヌクレオチドについては変曲を有するＳ字形状を示した。
【００７１】
融点は、生理塩条件においても記録された。Ｔｍ＝ｆ（ｎ）曲線は大きく減衰するようであり、意外なことに、Ｎ１０Ｓ３についての従前の曲線と交差した。それ故に、ｎ＜３について、Ｎ１０ＳｎおよびＣ１０の両方のオリゴヌクレオチドはアニオン性であり、二本鎖体において互いに反発する；溶液の塩濃度が増加すれば斥力が遮断され、それ故に、Ｔｍが増加する。ｎ＞３について、Ｎ１０Ｓｎはカチオン性になり、Ｃ１０を引きつける；ここでは、塩が誘導する静電的遮断が安定性を減少させる。
【００７２】
天然のＮ１０Ｓ３では、二本鎖体の安定性は、塩濃度とは無関係である。
【００７３】
（5’GTGGCATCGC3’ および5’GTGGCGTCGC3’を有するＮ１０Ｓｎ（ｎ＝０〜６）によって形成された二本鎖体の融点の比較）
オリゴヌクレオチド−スペルミン接合体の単一の塩基対のミスマッチの識別が試験された。Ｃ１０＝5’GTGGCATCGC3’の配列の前後関係の範囲内で、文献データは、最もストリージェントな試験であるので中央に位置するＡからＧへの転換を推奨した。
【００７４】
融点Ｔｍは、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４＋ＮａＣｌ １５０ｍＭにおいて測定された。全二本鎖体（１ｍＭバッファ中３．７５ｎｍｏｌ）の溶融プロファイルは、温度制御装置を備えたCARY 4000分光光度計を用いて、サンプルを徐々に加熱（１℃／分）しながらそれらの２６０ｎｍでの吸収を記録することによって得られた。Ｔｍは、一次導関数曲線ｄＯ．Ｄ．／ｄＴ＝ｆ（Ｔ）がその最大に達する温度である。結果は、図７に与えられる（菱形は5’GTGGCATCGC3’に対応し、三角形は5’GTGGCGTCGC3’に対応する）。
【００７５】
１５０ｍＭのＮａＣｌ中の天然のＮ１０・Ｃ１０二本鎖体の転移温度は、ミスマッチが存在する場合、５０．６℃から４２．９℃に落ち、すなわち、ＤＴｍ＝７．７℃であった。原則として、非特異的な末端接合静電力に起因する安定性の増加は、塩基対の特異性を損なうべきではなく、これは、ΔΔＧとして表される。これは、相補的かつミスマッチなターゲットオリゴヌクレオチドが平均ΔＴｍ＝７．９℃を有する擬似並行Ｔｍ＝ｆ（ｎ）曲線を示したので、実際に観察されたことである。
【００７６】
（精製されたＮ１０ＳｎオリゴヌクレオチドのＥＳ−ＭＳ分析）
オリゴヌクレオチドは、１％トリエチルアミンを含有する５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液に、５×１０−５Ｍの最終濃度で溶解させられた。１００ｍＬの分割量が、Applied Biosystems Mariner 5155質量分析計のイオン源に５ｍＬ／分の流速で導入された。結果は図８に与えられる（挿入：デコンボリューションスペクトル（deconvoluted spectra））：ａ）Ｎ１０Ｓ１、ｂ）Ｎ１０Ｓ２、ｃ）Ｎ１０Ｓ３、ｄ）Ｎ１０Ｓ４、ｅ）Ｎ１０Ｓ５、ｆ）Ｎ１０Ｓ６。中性およびカチオン性オリゴマーＮ１０Ｓ３−６のイオン化は、より困難になり、受け入れ可能なシグナル−ノイズ比を得るために複数のスペクトルを蓄積することが必要であった。
【００７７】
（実施例３：下記式を有する１２ｍｅｒのチオホスファート・オリゴヌクレオチドの合成、精製および特徴付け）
【００７８】
【化４】
【００７９】
前記オリゴヌクレオチドは、以降ではＮ１２ＳｎＦ（Ｎ＝１２ｍｅｒ オリゴヌクレオチド チオホスファート部分；Ｓ＝スペルミン残基およびｎ＝２または１１；Ｆ＝チミンに接合させられたフルオレセイン）によって表されることになる。
【００８０】
自動合成：２または１１個のスペルミン残基Ｓが付け加えられた配列Ｎ１２＝3’GCGACTCATGAA5’の１２ｍｅｒ チオホスファート・オリゴヌクレオチドが、固相シアノエチルホスホロアミダイト化学を用いてExpedite DNA合成機により合成された。仕上げ処理の間のオリゴマーの開裂を避けるために超軽度のＣＥホスホロアミダイトおよび超軽度の支持体（Glen Research/Eurogenetec）が用いられた。１２ｍｅｒ オリゴヌクレオチド部分中にホスホロチオアート結合を生じさせるために標準的な硫化剤（Glen Research/Eurogentec）が用いられた。フルオレセイン−ｄＴホスホロアミダイト（Glen Research/Eurogentec）が、５’末端のラベリングのために用いられた。スペルミンホスホロアミダイトのカップリングは、実施例２に記載されたカップリング手順を用いて行われた。
【００８１】
トリチルフラクションが集められ、希釈され、分光光度計において分析されて、段階的なカップリング収率が決定された。
【００８２】
全ての場合において、ＤＭＴ−ＯＮの形態が用いられ、精製−同定の目的のためにオリゴマー上で開裂されていない５’−末端のＤＭＴ基が維持された。
【００８３】
合成後処理：自動合成後、オリゴマーの固体支持体からの開裂および完全な脱保護は、濃アンモニア水による室温での終夜処理によって行われた。
【００８４】
精製：ＤＭＴ−ＯＮ化合物Ｎ１２Ｓ２ＦおよびＮ１２Ｓ１１Ｆは、Poly-Pak II（登録商標）カラム（Glen Research/Eurogenetec）を用いて、製造業者によって与えられた指示に従って精製された。
【００８５】
精製されたオリゴヌクレオチドＮ１２ＳｎＦ（ｎ＝２、１１）は、陰イオン交換カラム（SAX1000-8）により、塩基性水溶液条件（１００ｍＭ アンモニア，ｐＨ１１）で、ＮａＣｌ勾配（２０分内で０．７５〜２．５Ｍ）を用いて分析された。ＨＰＬＣ追跡は図９に示される（Ａ：Ｎ１２Ｓ１１Ｆ、Ｂ：Ｎ１２Ｓ２Ｆ）。
【００８６】
（精製されたオリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析）
オリゴヌクレオチドは、５００μLの脱イオン水に溶解させられた。サンプルおよびＨＰＡマトリクスが、プレート上で一緒に混合された。一旦結晶化されてから、サンプルは、BRUKER Ultraflex MS装置により分析された。結果は図１０Ａに与えられる：Ｎ１２Ｓ２Ｆ 計算値５４６０、実測値５４５９（上部）および図１０Ｂ：Ｎ１２Ｓ１１Ｆ 計算値：９１３５ 実測値：９１２５（下部）。
【００８７】
（実施例４：プラスミドＤＮＡ鎖の１４ｍｅｒおよび２０ｍｅｒの蛍光オリゴヌクレオチドを伴う侵入）
【００８８】
【化５】
【００８９】
上記に示される化合物は、以降において、Ｎ１４ＳｎＦ（Ｎ＝オリゴヌクレオチド部分；Ｓ＝スペルミン残基（ｎ＝２〜４）；Ｆ＝フルオレセイン残基）およびＮ２０ＳｎＦ（Ｎ＝オリゴヌクレオチド部分；Ｓ＝スペルミン残基（ｎ＝３〜５）；Ｆ＝フルオレセイン残基）によって表されることになる。
【００９０】
これらの蛍光オリゴヌクレオチドは、実施例２に記載された手順の後に合成された。５’−フルオレセイン・ホスホロアミダイト（Glen Research/Eurogentec）が、５’−末端のラベリングのために用いられた。最も置換されたＮ１４Ｓ４ＦおよびＮ２０Ｓ５Ｆ化合物についての分析的ＨＰＬＣ追跡およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルは、純度と構造の証拠として図１１および１２に示される（それぞれ、Ｎ１４Ｓ４Ｆ 計算値６４７０、実測値６４７８；Ｎ２０Ｓ５Ｆ 計算値８８１３、実測値８８１５）。
【００９１】
Ｎ１４ＳｎＦおよびＮ２０ＳｎＦのオリゴヌクレオチド配列は、ｐＧＬ３コントロールプラスミド（Promega）のルシフェラーゼ遺伝子配列の中から選ばれた。鎖侵入の配列特異性を評価するために、ｐＧＬ２コントロールプラスミド（Promega）が用いられた。ＧＬ２ルシフェラーゼ配列は、ＧＬ３と９５％同一であり、Ｎ１４ＳｎＦおよびＮ２０ＳｎＦによってターゲットにされる配列は、それぞれ、１および２のミスマッチを含有する。
【００９２】
ｐＧＬ３プラスミドを鎖侵略する（strand-invade）がｐＧＬ２プラスミドを鎖侵略しないＮ１４ＳｎＦおよびＮ２０ＳｎＦの能力が、生理的な塩および温度条件で試験された。
【００９３】
蛍光接合体Ｎ１４ＳｎＦおよびＮ２０ＳｎＦ（８．６５ｐｍｏｌ）が、プラスミドの溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中１．５μｇ，０．４３ｐｍｏｌ）に加えられた。混合物は、２４時間３７℃でインキュベートされ、アガロースゲル（ＴＡＥ ｐＨ７．４中１．３％）上に充填された。電気泳動は、Typhoon 8600 Imagerを用いてゲルを走査することによって何か蛍光緑色発光が検出された後に室温で４５分間にわたって行われた。ゲルの赤色の蛍光画像が、臭化エチジウム溶液中の１５分のインキュベーションの後にＵＶトランスイルミネーター上で取得された。結果は図１３に与えられる。
【００９４】
赤および緑色の蛍光は、それぞれ、二本鎖プラスミドＤＮＡおよび蛍光オリゴヌクレオチドの証拠である。ｐＧＬ３とは共局在化するがｐＧＬ２とは共局在化しないことは、それ故に、鎖侵入の証拠である。化合物Ｎ１４Ｓ３ＦおよびＮ２０ＳｎＦは、ｐＧＬ３とインキュベートされたがｐＧＬ２とインキュベートされない場合にプラスミドと関連するかすかな蛍光バンドを示した。
【００９５】
（実施例５：カチオン性オリゴヌクレオチドの細胞への浸透）
ＭＥＭ培地を含有する１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清において生育されたヒーラ細胞が、５０−６０×１０３細胞／ウェルで、４−ウェル有孔ボロシリカートLab-Tek皿に、実験の１日前に塗布された。完全培地は、０．５ｍＬの無血清ＭＥＭ培地と置換された。５’−カチオン性フルオレセイン接合オリゴヌクレオチドＦ−Ｓ１８Ｎ１９（ここで、Ｎ１９はTCGAAGTACTCAGCGTAAGである）製剤が滅菌ＰＢＳにおいて調製された。それは、２μＭの最終濃度まで細胞に加えられた。４時間後に、培地は、１ｍＬの新鮮な血清含有培地と置換された。第１の画像は、ＦＩＴＣフィルタを備えたZeiss axiovert 25蛍光顕微鏡により撮られた（図１４Ａ、左）。全ての細胞は蛍光性になり、いくつかの蛍光は細胞内の液胞に位置し、最も重要なことには、細胞質および核の全体にわたっても広がっていた。２４時間後に培地は１ｍＬのフェノールレッド不含有のＭＥＭ培地により置換された。ヨウ化プロピジウム（水中１ｍＭ）が１０μＭの最終濃度まで加えられた。１０分後に、第２の画像が撮られ、これは、大部分のプロピジウムがない健康な細胞であって、依然として蛍光性であったものを示す（図１４Ｂ、右）。Ｆ−Ｎ１９オリゴヌクレオチドにより類似の条件でインキュベートされたコントロール細胞は、非蛍光性を示した。
【００９６】
それ故に、本発明は、カチオン性オリゴヌクレオチドであって、鎖侵入の状況においてさえもそれらの相補的な配列と迅速かつ安定的な複合体を形成するものの多用途の自動合成を提供する。末端の接合に起因して、配列の選択性は、天然のオリゴヌクレオチドと同程度に高いままである。さらに、それらのカチオン性の性質のお陰で、細胞内送達は、カチオン性の運搬分子との複合体の形成を必要としない。まとめると、これらの特性は、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン接合体を、分子生物学、診断並びに治療適用のためのオリゴヌクレオチドに対して魅力的な代替物にする。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】逆相カラムによるカチオン性オリゴヌクレオチドＮ１０Ｓｎ（ｎ＝１〜２）のＨＰＬＣ分析
【図２】陰イオン交換カラムによる精製オリゴヌクレオチドＮ１０Ｓｎ（ｎ＝１〜６）のＨＰＬＣ分析
【図３】ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＮ１０Ｓｎ（ｎ＝１〜６）電気泳動移動度の分析
【図４】種々の温度でのＮ１０のＮ１０・Ｃ１０との自発的交換
【図５】ポリアミドゲル電気泳動によって示されるＮ１０とＮ１０Ｓｎとの間の鎖の交換
【図６】Ｎ１０Ｓ１０・Ｃ１０二本鎖体の融点（ここでＣはＮに相補的なヌクレオチドである）
【図７】5’GTGGCATCGC3’を有するおよび5’GTGGCGTCGC3’を有するＮ１０Ｓｎ（ｎ＝０〜６）によって形成された二本鎖体の融点の比較結果
【図８】精製Ｎ１０Ｓｎ（ｎ＝１〜６）オリゴヌクレオチドのＥＳ−ＭＳ分析
【図９】ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドＮ１２Ｓ１１Ｆ（９Ａ）およびＮ１２Ｓ２Ｆ（９Ｂ）のＨＰＬＣ追跡
【図１０】Ｎ１２Ｓ２Ｆ（１０Ａ）およびＮ１２Ｓ１１Ｆ（１０Ｂ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル
【図１１】Ｎ１４Ｓ４Ｆ（１１Ａ）およびＮ２０Ｓ５Ｆ（１１Ｂ）のＨＰＬＣ追跡
【図１２】Ｎ１４Ｓ４Ｆ（１２Ａ）およびＮ２０Ｓ５Ｆ（１２Ｂ）のＭＬＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル
【図１３】Ｎ１４ＳｎＦ（１３Ａ）およびＮ２０ＳｎＦ（１３Ｂ）によるｐＧＬ２およびｐＧＬ３プラスミドの鎖の侵入
【図１４Ａ】カチオン性オリゴヌクレオチドＦ−Ｓ１８Ｎ１９のヒーラ細胞への透過
【図１４Ｂ】カチオン性オリゴヌクレオチドＦ−Ｓ１８Ｎ１９のヒーラ細胞への透過
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン性オリゴヌクレオチド、すなわち、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子（本明細書において（それらの全体的な電荷に関係なく）カチオン性オリゴヌクレオチドとも呼ばれる）であって、オリゴヌクレオチド合成機で段階的に合成され得るものに関する。本発明はまた、分子生物学、診断および治療適用におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、分子生物学および医療において極めて大多数の適用を見出し、膨大な種類の疾患の治療のための非常に選択的な部類の薬物になり得る。
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、別のポリアニオン核酸によって生み出された相補配列にハイブリッド形成した後にそれらの特異的な活性を発揮するポリアニオンである。
【０００４】
候補薬として、それらはまた、アニオン性の細胞膜を通過することが可能でなければならない。
【０００５】
簡単な静電気的な考察により、ハイブリッド形成エネルギーおよび細胞バインディングは、カチオン基のオリゴヌクレオチド構造への付加から恩恵を受け得ることが暗示される。
【０００６】
この目的に向けて、アンモニウムまたはグアニジニウム残基をオリゴヌクレオチドに導入するための多くの合成的なアプローチが研究された：リン酸骨格の置き換え、リボースまたは核酸塩基の改変、およびポリアニオンの末端接合（end conjugation）。しかしながら、ハイブリッド形成の特異性、核酸プロセシング酵素活性並びに代謝物の毒性が、阻害アプローチへの全ての点に影響し、そこで、最良の解決策としてポリカチオンが他の状態の天然のオリゴヌクレオチドに加えられる。残念なことに、オリゴヌクレオチド−カチオンペプチド接合体の段階的な自動合成は、まだ日常的ではない。一方、予め形成された大きなブロック間の接合化学は、簡単ではなく、特に、水においては、「超」双性イオンが、解決困難な溶解性、精製および特徴的な問題を引き起こす。さらに、分子生物学および診断適用は、任意の有機カチオン長さにつながる任意の所与の塩基配列の迅速で簡単な合成を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らによって、オンライン（コンピュータ駆動）のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の合成は、適切に活性化されかつ保護されたオリゴカチオン誘導体を含むバイアルを、４種の天然塩基のものに加えてオリゴヌクレオチド合成機に詰めることによって可能であることが見出された。
【０００８】
本発明の目的は、それ故に、新規なカチオン性オリゴヌクレオチドを提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記カチオン性オリゴヌクレオチドの高収率の自動合成を提供することにある。
【００１０】
さらなる目的において、本発明は、前記カチオン性オリゴヌクレオチドの適用、特には、分子生物学、診断および治療での適用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
それ故に、本発明は、混合オリゴヌクレオチドオリゴカチオン分子であって、自動ホスホロアミダイト化学、すなわち、ポリホスホジエステルを介して合成され得るものに関する。
【００１２】
より詳細には、本発明のカチオン性オリゴヌクレオチドＡｉＢｊＨは、オリゴヌクレオチド部分Ａｉおよびオリゴカチオン部分Ｂｊを有し、ここで、
Ａｉは、ｉ ｍｅｒ（ｉ個）のオリゴヌクレオチド残基であり、ｉ＝５〜５０であり、ヌクレオチドＡは、天然または非天然に生じた核酸塩基および／またはペンタフラノシル基および／または生来のホスホジエステル結合を有するオリゴマーであり、
Ｂｊは、ｊ ｍｅｒの有機オリゴカチオン部分であり、ｊ＝１〜５０であり、Ｂは、
・ -HPO3-R1-(X-R2n)n1-X-R3-O-（ここで、Ｒ１、Ｒ２ｎおよびＲ３は、同一または異なって、低級アルキレンであり、Ｘは、ＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎは１〜５であり、ｎ１は２〜２０である）、
・ -HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-（ここで、Ｒ４は低級アルキレンであり、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、低級アルキレンであり、Ｘ１は、プトレッシン、スペルミジンまたはスペルミン残基である）、
・ -HPO3-R7-(aa)n2-R8-O-（ここで、Ｒ７は低級アルキレンであり、Ｒ８は低級アルキレン、セリン、天然アミノアルコールであり、(aa)n2は、カチオン性側鎖を有する天然アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸）を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）
を含む基から選択される。
【００１３】
明細書および特許請求の範囲において用いられる場合の「低級アルキル」および「低級アルキレン」は、好ましくは、置換されてもよいＣ１−Ｃ５直鎖（linear）または分枝鎖アルキルまたはアルキレン基をそれぞれ表す。
【００１４】
Ａは、例えば、デオキシリボ、リボ、ロック（ＬＮＡ）ヌクレオチド並びにそれらの化学改変体または置換体、例えば、ホスホロチオアート（チオホスファートとも表される）、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルまたはマーカー基、例えば、蛍光剤を含む群から選択される。
【００１５】
本発明の混合オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子は、３’Ａ５’−Ｂ配列を有する。
【００１６】
本発明の他の分子は、Ｂ−３’Ａ５’配列を有する。
【００１７】
本発明のさらに他の分子は、Ｂ−３’Ａ５’−Ｂまたは３’Ａ５’−Ｂ−３’Ａ５’配列を有する。
【００１８】
このような配列は、実施例において、下記構造を有するオリゴヌクレオチド−スペルミン分子によって例示される：
（３’Ａ５）ｉ−［ＰＯ３−−（ＣＨ２）４−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）３−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）４−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）３−ＮＨ２＋−（ＣＨ２）４−Ｏ］ｊＨ
式中、Ａ、ｉおよびｊは、上記定義の通りである。
【００１９】
Ａがホスホロチオアートヌクレオチドである分子は、それらの生物学的適用の点で特に有利である。ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、生体液中で加水分解されないからである。
【００２０】
上記規定のカチオン性オリゴヌクレオチドは、実施例によって例示されるように、鎖置換の状況下、さらにはプラスミド鎖の侵入の状況下にそれらの相補配列と迅速で安定な複合体を形成する。
【００２１】
末端接合に起因して、配列の選択性は、天然のヌクレオチドと同程度に高いままである。
【００２２】
したがって、本発明のカチオン性オリゴヌクレオチドは、分子生物学、研究試薬および診断適用、例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ジェノタイピング、in situ ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡチップのために非常に興味深いものである。
【００２３】
このような適用もまた本発明によってカバーされ、上記に定義されたようなオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の使用を含む。
【００２４】
アニオン性オリゴヌクレオチドとは対照的に、本発明のカチオン性オリゴヌクレオチドは、実施例において、生細胞の細胞質および核に自発的に入ることが示される。
【００２５】
それらの強化されたハイブリダイゼーションおよび細胞浸透特性の点で、それらはまた、治療適用、例えば、メッセンジャーＲＮＡのアンチセンスおよびｓｉＲＮＡ分解、メッセンジャーＲＮＡの成熟の間のエキソンスキッピング、クロマチンによる三重らせんの形成、クロマチン鎖の侵入（遺伝子修正）等によって媒介されるものに有用である。
【００２６】
本発明は、それ故に、上記規定のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の有効量を、製薬的に許容される担体と関連して含む医薬組成物にも関する。
【００２７】
本発明はまた、上記に規定されたようなオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の有効量を製薬的に許容される担体と関連して用いる工程を包含する治療方法に関する。
【００２８】
上記規定の混合オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子は、有利には、オリゴヌクレオチド合成機により、ホスホロアミダイトルートを介して、
− 活性化されかつ保護されたオリゴカチオンＢを含むバイアルを、上記規定のようなオリゴヌクレオチドＡのバイアルに加えて、またはその逆のようにしてオリゴヌクレオチド合成機に詰める工程と、
− 所望の長さが得られた時に合成を停止させる工程と、
− 固体担体からオリゴマーを開裂させる工程と、
− 保護基を除去する工程と
を包含する方法に従って段階的に合成される。
【００２９】
本発明は、オリゴカチオン反復ブロックＢの構造の自動合成において用いられるホスホロアミダイト試薬と密接に関連する。以下のホスホロアミダイト試薬が、この目的のために用いられ得る：
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2ｎ)n1-X-R3-O-Prot（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎおよびｎ１は、上記定義の通りであり、Ｘは、適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは低級アルキルであり、Ｒ１０が低級アルキルであるかまたは−Ｎ（Ｒ１０）２がピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ基であり、Protは、オリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基、例えば、ＤＭＴ、ＭＭＴである）；
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot（ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は低級アルキレンであり、Ｘ１は適切に保護されたプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミンであり、Ｒ９およびＲ１０は上記の定義通りである）；
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2 -R8-O-Prot（ここで、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２およびProtは、上記定義の通りであり、(aa)n2は、適切に保護されたカチオン性側鎖を有する天然アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸）を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）。
【００３０】
適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２は、試薬が露出させられた化学反応条件に対してアミノ基またはグアニジン残基の機能を不活性にするために保護基がそれら上にそれぞれ存在することを意味する。
【００３１】
そのような保護基は、例えば、フタルイミド（ＰＨＴＨ）、トリフルオロアセタート、アリルオキシカルボニル（Alloc）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、クロロベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびイソニコチニルオキシ（ｉ−Ｎｏｃ）基である。
【００３２】
本発明の実施形態によると、オリゴヌクレオチド配列の段階的合成の後に、オリゴカチオン部分の段階的合成が行われて、配列（３’Ａ５’−Ｂ）を有する化合物が得られる。
【００３３】
別の実施形態によると、逆順の工程が行われ、オリゴカチオン部分の段階的合成の後に、オリゴヌクレオチド配列の段階的合成が行われて、（Ｂ−３’Ａ５’）配列の化合物が得られる。
【００３４】
さらに別の実施形態によると、混合配列が合成される。
【００３５】
特に、両端でキャッピングされたオリゴヌクレオチド配列（Ｂ−３’Ａ５’−Ｂ）は、生体液中でエキソヌクレアーゼに抵抗することができ、カチオンを割り込ませた配列（３’Ａ５’−Ｂ−３’Ａ５’）は、隣接する核酸配列のターゲッティングを可能にする。
【００３６】
天然に生ずるアミン（例えばスペルミン）またはペプチド（例えばオリゴアルギニン）を用いることによって、代謝物の潜在的な毒性は回避される。スペルミンは、リモラー濃度で細胞中に実際に存在し、その末端のアルキル化物は無害である。さらに、塩基性ペプチド配列は、多くの核タンパク質に存在する。
【００３７】
活性化されかつ保護されたオリゴカチオンＢは、有利には、ポリアミンのアミノ基を保護した後に、オリゴヌクレオチド合成に化学反応を起こさないジオールにつながるα，ω−ビスヒドロキシアルキル化を行うことによって得られる。
【００３８】
従来のＤＭＴおよびホスホロアミダイトの延長（elongation）化学は、有利には、塩基不安定ＴＦＡ保護基と一緒に実行される。
【００３９】
化学的に保護されたジオール体は、新規物であり、本発明の範囲に入る。
【００４０】
本発明は、特に、以下を含む群から選択される中間体に関する：
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2ｎ)n1-XR3-O-Prot（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎおよびｎ１は上記に定義された通りであり、Ｘは適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは低級アルキルであり、Ｒ１０は低級アルキルであるかまたは−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ基であり、Protは、オリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基、例えばＤＭＴ、ＭＭＴである）；
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot（ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は低級アルキレンであり、Ｘ１は適切に保護されたプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミンであり、Ｒ９およびＲ１０は上記に定義された通りである）；
・P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2 -R8-O-Prot（ここで、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２およびProtは上記に定義された通りであり、(aa)n2は、適切に保護されたカチオン性側鎖を有する天然アミノ酸、例えば、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）。
【００４１】
本発明の他の特徴および利点は以降に与えられる。特に、スペルミン（Ｓ）を有するデカマーオリゴヌクレオチド配列（Ａ１０）（以下においてＡ１０Ｓｎ）によって表される）の合成が、実例として、本発明の範囲を制限することなく与えられることになる。実施例において、図１〜１４が参照されることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（実施例１：ホスホロアミダイトスペルミン合成素子の合成）
スペルミン連結ホスホロアミダイト１は、以下のスキーム１に示されるようにスペルミンから合成された。
【化１】
【００４３】
（Mes＝２，４，６−トリメチルフェニル；ＴＢＤＭＳ＝ｔ−ブチルジメチルシリル；ＴＦＡ＝ＣＦ３ＣＯ−；ＤＭＴ＝４，４’−ジメトキシトリチル）
テトラキス（メシチルスルホニル）スペルミン２は、スペルミンから調製されるものであり、このものはビスアルキル化されて３を得た。酢酸条件中での３の完全な脱保護の後、粗ビス（Ｃ４−ＯＨ）スペルミン・テトラヒドロブロミド４は、ピリジン中の無水トリフルオロ酢酸によって完全に保護され、次いで、５の２つの末端エステル基は、中性条件下に加水分解されてジオール体６を得た。１モル当量のＤＭＴＣｌ試薬を用いる統計的方法で５のモノトリチル化が行われ、４３％の収率で７を得た。未反応のジオール体６およびビス・トリチル化合物８が回収され、中程度の酸条件（ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸）下、再平衡に達しさせられ、７を得た。７のホスファイト化により、所望のホスホロアミダイト１を得た。
【００４４】
Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（メシチルスルホニル）スペルミン（２）：この化合物は、文献：Bergeron et al. J. Med. Chem. 2001, 44, 232-244.に従って調製された。
【００４５】
Ｎ１，Ｎ１２−ビス［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ブチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（メシチルスルホニル）−スペルミン（３）：水素化ナトリウム（６０％，１．０ｇ，２５ｍｍｏｌ）が、２（９．３１ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）にＮ２下に０℃で攪拌しながら分けて加えられた。室温で３０分間にわたって攪拌した後、ｔ−ブチル（４−ヨードブトキシ）ジメチルシラン（７．８６ｇ，２５ｍｍｏｌ）が、一度に加えられた。混合物は、室温で終夜攪拌され、次いで、Ｈ２Ｏ−ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ／１００ｍＬ）で分液された。有機相が分けられ、水相はＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）により３回抽出された。有機相が合わせられ、このものは、ＮａＨＣＯ３溶液（１Ｍ）により洗浄され、次いで、ＭｇＳＯ４により乾燥させられた。溶媒留去の後、糊状の残渣は、フラッシュ・クロマトグラフィーによって、溶離液として１：４ ＡｃＯＥｔ：シクロヘキサンを用いて精製された。３を含むフラクションは、糊状の油状物にまで溶媒留去され、このものは、冷ペンタンによりさらに洗浄され、迅速な可動不純物（fast moving impurity）が除去され、次いで、ポンプで真空吸引され、９．９７ｇ（７６％）の３を油状物として得た：ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン １：４）：Rf=0.28 IR (KRS-5): 2937, 1604, 1471, 1320, 1151, 1101, 838, 777, 657, 578 cm-1. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ= -0.01 (s, 12 H), 0.85 (s, 18 H), 1.20-1.45 (m, 12 H), 1.62 (m, 4 H), 2.28 (s, 6 H), 2.29 (s, 6 H), 2.53 (s, 12 H), 2.54 (s, 12 H), 2.90-3.10 (m, 16 H), 3.42 (t, J = 6.1 Hz, 4 H), 6.91 (s, 4 H), 6.92 (s, 4 H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ= 4.7, 18.9, 21,6, 23.4, 23.5, 24.1, 24.9, 25.7, 26.6, 30.4, 43.5, 43.6, 45.6, 45.7, 62.9, 132.59, 132.64, 133.8, 140.7, 143.0, 143.1 MS-ESI (MeOH): m/z = 1325.85 [M + Na]+, 1303.83 [M + H]+. C66H110N4O10S4Si2 (Mw = 1304.03) 計算値 C 60.79, H 8.50, N 4.30, S 9.84; 実測値C 60.74, H 8.55, N 4.21, S 9.63.
Ｎ１，Ｎ１２−ビス（４−ヒドロキシブチル）スペルミン・テトラヒドロブロミド（４）：酢酸中の臭化水素（３３重量％溶液，８０ｍＬ，１．４ｍｏｌ）が、３（９．８７ｇ，７．５７ｍｍｏｌ）およびフェノール（２９．０ｇ，０．３１ｍｏｌ，４０当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（８０ｍＬ）に滴下された。反応混合物は、室温で終夜攪拌された。氷浴により冷却した際に、冷水（１００ｍＬ）が、攪拌しながら加えられた。有機層が分けられ、水（２０ｍＬ）により３回抽出された。水層が合わせられ、このものは、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）により５回洗浄され、乾燥するまで溶媒留去させられた。得られた湿気を有する固体残渣は、エーテル中に懸濁させられ、スパーテルにより粉砕され、上澄みエーテル層は廃棄された。これらの操作は、固体懸濁液が得られるまで繰り返された（５回）。溶媒留去および真空乾燥の後、化合物４が固体として得られた（５．３２ｇ）。この粗物質は、さらなる精製なしで用いられた：1H NMR (300 MHz, D2O): δ = 1.75-2.10 (m, 12 H), 2.27 (m, 4 H), 3.15-3.35 (m, 16 H), 3.76 (t, J = 12.2 Hz, 4 H). 13C NMR (75 MHz, D2O): δ = 22.9, 23.2, 23.4, 29.0, 45.0, 45.2, 47.7, 48.3, 61.5. MS-ESI (MeOH): m/z = 347.39 [M + H]+.
Ｎ１，Ｎ１２−ビス（４−（トリフルオロアセトキシ）ブチル）−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（トリフルオロアセチル）スペルミン（５）（４からＴＦＡ２Ｏ／ＮＥｔ３により）：４（５．３ｇ，７．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２懸濁液（５０ｍＬ）に、トリエチルアミン（１１．５ｇ，１１４ｍｍｏｌ、１５当量）が、一度に加えられた。混合物は、氷浴で冷却され、無水トリフルオロ酢酸（１９．１ｇ、９０．９ｍｍｏｌ，１２当量）がＮ２下に攪拌しながら滴下された。混合物は、室温で３．５時間にわたって攪拌された。氷浴による冷却後、得られた溶液は、冷水（２０ｍＬ）により３回洗浄され、ＭｇＳＯ４で乾燥させられ、次いで、溶媒留去されて、油状残渣（１１．７ｇ）を得、この油状残渣は、この反応の二次生成物として（ＴＦＡ）２Ｃ＝ＣＨ−ＮＥｔ２を含有する（参照；Schreber, S. L., Tetrahedron Lett. 1980, 21, 1027）。これは、２回の連続するフラッシュ・クロマトグラフィー（溶離液１：１−６０：４０ ＡｃＯＥｔ：シクロヘキサン、次いで、５〜１０％Ｅｔ２Ｏ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって除去され、５（５．５９ｇ，８１％）を油状物として得た：ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン １：１）；Rf = 0.25. IR (KRS-5): 2955, 1789, 1690, 1467, 1352, 1197, 1147, 759, 731, 692 cm-1. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.52-2.06 (m, 16 H), 3.33-3.49 (m, 16 H), 3.38 (m, 4 H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): このスペクトルは、４つのアミド基の回転異性体によって複雑化されている。高強度の共鳴シグナルのみが以下のように記載される：δ = 23.3, 23.9, 24.1, 24.8, 25.3, 25.6, 26.0, 26.55, 26.61, 44.4, 44.8, 45.7, 46.1, 46.4, 47.3, 48.0, 56.6, 67.3, 67.5, 116.6 (q, J = 288 Hz), 156.9, 157.4, 157.8, 158.6.
Ｎ１，Ｎ１２−ビス（４−ヒドロキシブチル）−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（トリフルオロアセチル）スペルミン（６）：５（５．３９ｇ，５．８４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（５０ｍＬ）に、ＮａＨＣＯ３（０．１ｇ，固体）が一度に加えられ、得られた懸濁液は、２時間にわたって室温で攪拌された。溶媒留去の後、油状残渣は、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させられ（若干繊維質のＮａＨＣＯ３）の懸濁液を与える）、５〜１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２により溶離するフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製され、３．６１ｇ（８５％）の６を油状物として得た：ＴＬＣ（ＭｅＯＨ５％／ＣＨ２Ｃｌ２）：Rf=0.14（MeOH10%/CH2Cl2）：Rf=0.45．1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ= 1.51-2.02 (m, 18 H), 3.33-3.51 (m, 16 H), 3.68 (m, 4 H). MS-ESI (MeOH): m/z = 753.33 [M + Na]+. C26H38F12N4O6・H2O (Mw = 748.60) 計算値 C 41.72, H 5.39, N 7.48, F 30.45; 実測値C 41.97, H 5.26, N 7.37, F 30.14.
４からの６の調製（ＴＦＡ２Ｏ／ピリジン、次いでＮａＨＣＯ３による）：４（１５．３ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）およびピリジン（４４ｍＬ，０．５４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、無水トリフルオロ酢酸（４６ｍＬ，０．３３ｍｏｌ）が、氷浴で冷却しながらおよびＮ２下に攪拌しながら滴下された。混合物は、室温で３時間にわたって攪拌された。過剰の無水トリフルオロ酢酸が、氷浴で冷却しながら冷水（１００ｍＬ）を添加することによって分解され、次いで、得られた溶液は、ＣＨ２Ｃｌ２により抽出された（４回１００ｍＬ＋５０ｍＬ＋２５ｍＬ×２）。抽出物を合わせ、このものは、冷水により洗浄され（５０ｍＬ×３）、ＭｇＳＯ４で乾燥させられ、次いで、溶媒が留去されて、粗生成物５を油状物として得た（１９．４ｇ，９２％）。この油状物は、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解させられた。ＮａＨＣＯ３（固体，０．１ｇ）が加えられ、懸濁液は、終夜攪拌された。溶媒を留去した後、残渣は、フラッシュ・クロマトグラフィーによって、溶離液として５〜７％ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製され、１０．１ｇ（６１％）の６を油状物として得た。
【００４６】
Ｎ１−［４−（ジメトキシトリチルオキシ）ブチル］−Ｎ１２−（４−ヒドロキシブチル）−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（トリフルオロ−アセチル）スペルミン（７）：６（１．４６ｇ，２．００ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（３ｍＬ）に、ＤＭＴＣｌ（７５７ｍｇ，２．２３ｍｍｏｌ）が１ｍＬのピリジンを用いて加えられ、リンスされた。反応混合物は、４時間にわたって室温でＮ２下に攪拌され、次いで、ピリジンが、トリエンによる共留去によって繰り返し除去された。残渣は、２回の連続的なフラッシュ・クロマトグラフィー（溶離液 ２〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、次いで、１０〜１５％アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製され、７（８７９ｍｇ，４３％）（発泡体）およびビス−ＤＭＴ誘導体８（６４８ｍｇ，２４％）を得た。出発ジオール６も回収された（３５０ｍｇ，２４％）。７のデータ：ＴＬＣ（アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２ １：９）：Rf=0.20 1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ= 1.51-2.03 (m, 17 H), 3.11 (m, 2 H), 3.32-3.51 (m, 16 H), 3.71 (m, 2 H), 3.81 (s, 6H), 6.84 (m, 4 H), 7.19-7.46 (m, 9 H)． MS-ESI (MeOH): m/z = 1055.52 [M + Na]+. C47H56F12N4O8 (Mw = 1032.95) 計算値 C 54.65, H 5.46, N 5.42, F 22.07; 実測値 C 54.46, H 5.58, N 5.37, F 21.63.
ジオール体（６）およびビス−ＤＭＴ誘導体（８）からの化合物（７）：６（１．４ｇ，１．９ｍｍｏｌ）および８（２．５ｇ，１．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に、トリフルオロ酢酸（５０μＬ，０．６ｍｍｏｌ）が加えられ、室温で３０分間にわたり攪拌された。溶液は、Ｎａ２ＣＯ３の１Ｍ溶液により３回洗浄され、ＭｇＳＯ４で乾燥させられ、溶媒留去された。残渣は、フラッシュ・クロマトグラフィー（カラム径：５０ｍｍ，ＳｉＯ２の高さ：１５ｃｍ）によって、５％ＡｃＯＥｔ／ＣＨ２Ｃｌ２（７５０ｍＬ）、３３％ＡｃＯＥｔ／ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）、７％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）および１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）を連続的に用いて分離され、８（１．１ｇ）、７（１．２ｇ）および６（１．３ｇ）を得た。
【００４７】
スペルミン連結ホスホロアミダイト（１）：７（８４４ｍｇ，８１７μｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２３０μＬ，１．６５ｍｍｏｌ，２当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（４ｍＬ）に、２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスファイト（２０５μＬ，０．９２ｍｍｏｌ，１．１当量）が加えられ、混合物は、Ｎ２下に室温で４０分間にわたり攪拌された。反応混合物は、ＮＥｔ３で飽和された（ＣＨ２Ｃｌ２：シクロヘキサン１：２中ＮＥｔ３ １％；４００ｍＬ）ＳｉＯ２カラム（直径：２０ｍｍ、高さ：１５ｃｍ）に、ＣＨ２Ｃｌ２：シクロヘキサン １：２中ＮＥｔ３ １％（１２５ｍＬ）、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２：シクロヘキサン１：１中ＮＥｔ３ １％（１００ｍＬ）を用いて通され、１（７３５ｍｇ，７３％）を油状物として得た：1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ= 1.13-1.35 (m, 12 H), 1.51-2.06 (m, 16 H), 2.66 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.11 (m, 2 H), 3.32-3.98 (m, 20 H), 3.81 (s, 6H), 6.84 (m, 4 H), 7.15-7.51 (m, 9 H). 31P NMR (81 MHz, CDCl3): 148.06, 148.13, 148.19, 148.3 （アミドの回転異性体に起因して分裂している）
（実施例２：下記式を有するデカマー・オリゴヌクレオチドの合成、精製および特徴付け）
【００４８】
【化２】
【００４９】
前記オリゴヌクレオチドは、以降ではＮ１０Ｓｎ（Ｎ１０＝オリゴヌクレオチド部分；Ｓ＝スペルミン残基およびｎ＝１〜６）によって表されることになる。
【００５０】
自動合成：増加する数のスペルミン残基Ｓが付け加えられた同一配列Ｎ１０＝3’CACCGTAGCG5’の一連のデカマー・オリゴヌクレオチドは、標準固相シアノエチルホスホロアミダイト化学を用いてExpedite DNA合成機により、下記スキームに従って合成された。
【００５１】
【化３】
【００５２】
最後のＮ部は、古典的なオリゴヌクレオチド合成によるヌクレオチドである。
【００５３】
自動ＤＮＡ合成に用いられる試薬は、Glen Research（Eurogentec）から購入された。
【００５４】
自動合成の間、長期にわたるカップリング時間（１５分）によりなされ、わずかにより高濃度ホスホロアミダイト溶液（１ｍＬのアセトニトリル中９０ｍｇのアミダイト）を用いたスペルミンホスホロアミダイト１のカップリング以外は、標準の１μｍｏｌのカップリングサイクルが用いられた。
【００５５】
トリチルフラクションが集められ、希釈され、分光光度計において分析されて、段階的なカップリング収率が測定された。
【００５６】
４種の天然ヌクレオチドのカップリング収率は９７％を超えたが、一方で、
スペルミンホスホロアミダイトのカップリングの収率は上記カップリング条件において９０〜９６％であった。
【００５７】
全ての場合で、ＤＭＴ−ＯＮ（ＯＮ＝オリゴヌクレオチド）の形態が用いられ、精製−同定の目的のためオリゴマー上で開裂されていない５’端のＤＭＴ基が維持された。
【００５８】
合成後処理：自動合成の後、オリゴマーの固体担体からの開裂および完全な脱保護が標準的な条件（開裂のための濃アンモニア水による９０分間にわたる室温での、次いで、脱保護のための終夜にわたる５５℃での処理）を用いてなされた。
【００５９】
精製：最初の２つのアニオン性オリゴヌクレオチドＮ１０Ｓ１およびＮ１０Ｓ２は、最初に、ＤＭＴ−ｏｎ状態で、逆相ヌクレオシルＣ−１８カラム（Macherey-Nagel １０×２５０ｍｍ）による標準ＨＰＬＣ手順によって、２０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７）中アセトニトリルの線形濃度勾配（２０分内で５〜３５％）により精製された。精製されたオリゴヌクレオチドは、次いで、室温で２０分間にわたってＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ＝４／１（５００ｍＬ）による処理によって脱トリチル化された。水（５ｍＬ）による希釈の後、ＤＭＴ−ＯＨが、エーテル抽出（３×２ｍＬ）によって除去され、水相が濃縮され、オリゴマーを得た。
【００６０】
オリゴヌクレオチドＮ１０Ｓ１およびＮ１０Ｓ２のＨＰＬＣ分析は、図１において、逆相ヌクレオシルＣ−１８カラム（Macherey-Nagel ４．６×２５０ｍｍ）で、２０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７）中のアセトニトリルの線形勾配（２０分内の５〜３５％）により与えられる：ａ）Ｎ１０Ｓ１（粗生成物）、ＤＭＴ−ＯＮ；ｂ）Ｎ１０Ｓ１（精製）；ｃ）Ｎ１０Ｓ２（粗生成物）、ＤＭＴ−ＯＮ；ｄ）Ｎ１０Ｓ２（精製）。＊ベンズアミド；＊＊端を切り取った（truncated）配列。
【００６１】
中性オリゴマーＮ１０Ｓ３およびカチオン性オリゴマーＮ１０Ｓ４、Ｎ１０Ｓ５およびＮ１０Ｓ６（ＤＭＴ基を有するかまたは有しない）は、アセトニトリル／濃アンモニア水／水（２０：４：８０）によりなされた最終のオリゴヌクレオチド溶離を除いて、Poly-Pak II（登録商標）（Glen Research/Eurogentec）カラムを用いて、製造業者によって与えられた指示に従って精製された。オリゴヌクレオチドを含むフラクションは、ＴＬＣプレートを用いて明らかにされ得る。フラクションを集めた後、溶媒は、凍結乾燥によって除去された。こうして得られたオリゴマーは、概して、ベンズアミドによって汚染されていた。それは、希アンモニア水溶液（５０ｍＭ）への溶解後のエーテルによる抽出（３回）によって除去された。精製されたオリゴヌクレオチドは、希アンモニア水溶液（５０ｍＭ）に溶解させられ、それらの濃度は、以下の吸光係数（２６０ｎｍ，ｍｏｌ−１ｄｍ３ｃｍ−１）を用いて測定された：
ε＝（１５．４ＮＡ＋１１．５ＮＧ＋７．４ＮＣ＋８．７ＮＴ）×０．９×１０３
精製されたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析は図２に与えられる：線形勾配（ＮａＣｌ（１０分超で１００〜３５０ｍＭ）／ＮａＯＨ２５ｍＭ（ｐＨ１２．４））を有する陰イオン交換カラム（Dionex PA-100g×250mm）：ａ）Ｎ１０Ｓ１、ｂ）Ｎ１０Ｓ２、ｃ）Ｎ１０Ｓ３、ｄ）Ｎ１０Ｓ４、ｅ）Ｎ１０Ｓ５、ｆ）Ｎ１０Ｓ６。
【００６２】
用いられた接合化学（conjugation chemistry）に起因して、各ポリアミンは、リン酸基と同伴し、それ故に、正味の追加のカチオン電荷に寄与する。７種のオリゴヌクレオチド（Ｎ１０Ｓｎ）３ｎ−９ｎ＝０．．．６（完全にイオン化された場合に全体的な電荷−９、−６、−３、０、＋３、＋６、＋９を有する）が、それ故に、８０〜２５０ナノモルの範囲の量で利用可能である。
【００６３】
（電気泳動移動度）
ｐＨ７における電界中のそれらの遊走が、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって研究され、銀鏡染色によって明らかにされた。１０μＬのローディングバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、グリセロール）中の化合物（０．５ｎｍｏｌ）が、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＴＡＥ ｐＨ７中１５％）上に充填された。電気泳動は、５Ｖ／ｃｍで１７時間にわたり４℃で実行された。銀染色は、Rabilloud et al, Electrophoresis, 1987,9, 288-291に従って行われた。結果は、図３に与えられる。スペルミンを有しないオリゴヌクレオチドＮ１０（レーン１）は、アノードに向かって迅速に移動し、ポリアミン含有オリゴヌクレオチドが明らかにされる条件下にかすかな銀染色のみを示した。
【００６４】
（Ｎ１０のＮ１０・Ｃ１０との自発的な交換）
オリゴヌクレオチドＣ１０（ここで、Ｃは、Ｎに相補的なヌクレオチドである）（５０ｐｍｏｌまたは５００ｐｍｏｌ）が、蛍光Ｎ１０・Ｃ１０＊二本鎖体溶液（ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４，ＮａＣｌ １５０ｍＭ中５０ｐｍｏｌ）に加えられた。混合物は、４時間３７℃、２０℃または１０℃でインキュベートされ、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＴＡＥ ｐＨ７中１５％）上に充填された。電気泳動は、４℃で１７時間にわたって５Ｖ／ｃｍで行われた。Ｃ１０＊蛍光は、Typhoon 8600 Imagerを用いてゲルを走査することによって検出された。図４において与えられる結果によって示されるように、Ｎ１０のＮ１０・Ｃ１０との自発的交換は、１０℃において顕著ではない。
【００６５】
（Ｎ１０とＮ１０Ｓｎとの間の鎖の交換）
天然の二本鎖体Ｎ１０・Ｃ１０へのＮ１０Ｓｎの鎖の置換能が生理塩条件において試験された。
【００６６】
スペルミン接合体Ｎ１０Ｓｎ（５０または５００ｐｍｏｌ）が、蛍光Ｎ１０・Ｃ１０＊二本鎖体溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中５０ｐｍｏｌ）に加えられた。混合物は、４時間１０℃でインキュベートされ、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＴＡＥ ｐＨ７中１５％）上に充填された。電気泳動は、４℃で１７時間にわたって５Ｖ／ｃｍで行われた。蛍光は、Typhoon 8600 Imagerを用いてゲルを走査することによって検出された。
【００６７】
スペルミン接合体は、図５に示されるように鎖交換反応に重大な影響を及ぼした。Ｎ１０・Ｃ１０＊に対応するバンドは、増加した競争Ｎ１０Ｓｎのスペルミン残基の数に応じて、よりゆっくり移動する、より乏しいアニオン性のＮ１０Ｓｎ・Ｃ１０＊複合体に有利になるように、より弱くなった。この効果は、特に、Ｎ１０Ｓ３、すなわち、形式的な陰電荷をもはや帯びない接合体について断言される。実際に、スペルミンは、副溝においてＮＨ２＋二座水素結合の鎖間ネットワークを形成することによって二本鎖ＤＮＡ構造を取り囲んでおり、それ故に、Ｎ１０よりもＮ１０Ｓｎバインディングに有利に働くことになる。それでも、事前に形成された（Ｎ１０Ｓｎ）３ｎ−９／（Ｎ１０・Ｃ１０）１８−静電複合体（ｎ＞３についての場合であり得る）において鎖交換が起こる場合にさらなる有利な速度論的因子が作動し得る。
【００６８】
（Ｎ１０Ｓｎ・Ｃ１０二本鎖体の融点）
二本鎖核酸の安定性は、それらの融点、すなわち、相補鎖が協同的にバラバラになる温度を測定することによって比較された。Ｎ１０Ｓｎ・Ｃ１０の溶液の光学密度（optical density：Ｏ．Ｄ．）対温度Ｔが、２６０ｎｍで記録された。
【００６９】
融点Ｔｍは、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４（黒色線，菱形）中およびＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（灰色線、円）中で測定された。全二本鎖体（１ｍＬバッファ中３．７５ｎｍｏｌ）の溶融プロファイルは、温度制御装置を備えたCARY 4000分光光度計を用いて、サンプルを徐々に加熱（１℃／分）しながら、それらの２６０ｎｍでの吸収を記録することによって得られた。二本鎖体の溶融は、結果として、濃色シフト（hyperchromic shift）をもたらし、Ｔｍは、一次導関数曲線ｄＯ．Ｄ．／ｄＴ＝ｆ（Ｔ）が最大に達する温度である。結果は、図５に与えられる。
【００７０】
天然の二本鎖体は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４においてＴｍ＝３０℃で溶解した（図５）。接合体のスペルミン数の増加は、顕著なＴｍの増加につながった。Ｎ１０Ｓ６・Ｃ１０はＴｍ＝７５．２℃で溶解し、いくつかは、天然の二本鎖体より高い４５℃で溶解した。Ｔｍ＝ｆ（ｎ）曲線は、天然のＮ１０Ｓ３オリゴヌクレオチドについては変曲を有するＳ字形状を示した。
【００７１】
融点は、生理塩条件においても記録された。Ｔｍ＝ｆ（ｎ）曲線は大きく減衰するようであり、意外なことに、Ｎ１０Ｓ３についての従前の曲線と交差した。それ故に、ｎ＜３について、Ｎ１０ＳｎおよびＣ１０の両方のオリゴヌクレオチドはアニオン性であり、二本鎖体において互いに反発する；溶液の塩濃度が増加すれば斥力が遮断され、それ故に、Ｔｍが増加する。ｎ＞３について、Ｎ１０Ｓｎはカチオン性になり、Ｃ１０を引きつける；ここでは、塩が誘導する静電的遮断が安定性を減少させる。
【００７２】
天然のＮ１０Ｓ３では、二本鎖体の安定性は、塩濃度とは無関係である。
【００７３】
（5’GTGGCATCGC3’ および5’GTGGCGTCGC3’を有するＮ１０Ｓｎ（ｎ＝０〜６）によって形成された二本鎖体の融点の比較）
オリゴヌクレオチド−スペルミン接合体の単一の塩基対のミスマッチの識別が試験された。Ｃ１０＝5’GTGGCATCGC3’の配列の前後関係の範囲内で、文献データは、最もストリージェントな試験であるので中央に位置するＡからＧへの転換を推奨した。
【００７４】
融点Ｔｍは、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ ｐＨ７．４＋ＮａＣｌ １５０ｍＭにおいて測定された。全二本鎖体（１ｍＭバッファ中３．７５ｎｍｏｌ）の溶融プロファイルは、温度制御装置を備えたCARY 4000分光光度計を用いて、サンプルを徐々に加熱（１℃／分）しながらそれらの２６０ｎｍでの吸収を記録することによって得られた。Ｔｍは、一次導関数曲線ｄＯ．Ｄ．／ｄＴ＝ｆ（Ｔ）がその最大に達する温度である。結果は、図７に与えられる（菱形は5’GTGGCATCGC3’に対応し、三角形は5’GTGGCGTCGC3’に対応する）。
【００７５】
１５０ｍＭのＮａＣｌ中の天然のＮ１０・Ｃ１０二本鎖体の転移温度は、ミスマッチが存在する場合、５０．６℃から４２．９℃に落ち、すなわち、ＤＴｍ＝７．７℃であった。原則として、非特異的な末端接合静電力に起因する安定性の増加は、塩基対の特異性を損なうべきではなく、これは、ΔΔＧとして表される。これは、相補的かつミスマッチなターゲットオリゴヌクレオチドが平均ΔＴｍ＝７．９℃を有する擬似並行Ｔｍ＝ｆ（ｎ）曲線を示したので、実際に観察されたことである。
【００７６】
（精製されたＮ１０ＳｎオリゴヌクレオチドのＥＳ−ＭＳ分析）
オリゴヌクレオチドは、１％トリエチルアミンを含有する５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液に、５×１０−５Ｍの最終濃度で溶解させられた。１００ｍＬの分割量が、Applied Biosystems Mariner 5155質量分析計のイオン源に５ｍＬ／分の流速で導入された。結果は図８に与えられる（挿入：デコンボリューションスペクトル（deconvoluted spectra））：ａ）Ｎ１０Ｓ１、ｂ）Ｎ１０Ｓ２、ｃ）Ｎ１０Ｓ３、ｄ）Ｎ１０Ｓ４、ｅ）Ｎ１０Ｓ５、ｆ）Ｎ１０Ｓ６。中性およびカチオン性オリゴマーＮ１０Ｓ３−６のイオン化は、より困難になり、受け入れ可能なシグナル−ノイズ比を得るために複数のスペクトルを蓄積することが必要であった。
【００７７】
（実施例３：下記式を有する１２ｍｅｒのチオホスファート・オリゴヌクレオチドの合成、精製および特徴付け）
【００７８】
【化４】
【００７９】
前記オリゴヌクレオチドは、以降ではＮ１２ＳｎＦ（Ｎ＝１２ｍｅｒ オリゴヌクレオチド チオホスファート部分；Ｓ＝スペルミン残基およびｎ＝２または１１；Ｆ＝チミンに接合させられたフルオレセイン）によって表されることになる。
【００８０】
自動合成：２または１１個のスペルミン残基Ｓが付け加えられた配列Ｎ１２＝3’GCGACTCATGAA5’の１２ｍｅｒ チオホスファート・オリゴヌクレオチドが、固相シアノエチルホスホロアミダイト化学を用いてExpedite DNA合成機により合成された。仕上げ処理の間のオリゴマーの開裂を避けるために超軽度のＣＥホスホロアミダイトおよび超軽度の支持体（Glen Research/Eurogenetec）が用いられた。１２ｍｅｒ オリゴヌクレオチド部分中にホスホロチオアート結合を生じさせるために標準的な硫化剤（Glen Research/Eurogentec）が用いられた。フルオレセイン−ｄＴホスホロアミダイト（Glen Research/Eurogentec）が、５’末端のラベリングのために用いられた。スペルミンホスホロアミダイトのカップリングは、実施例２に記載されたカップリング手順を用いて行われた。
【００８１】
トリチルフラクションが集められ、希釈され、分光光度計において分析されて、段階的なカップリング収率が決定された。
【００８２】
全ての場合において、ＤＭＴ−ＯＮの形態が用いられ、精製−同定の目的のためにオリゴマー上で開裂されていない５’−末端のＤＭＴ基が維持された。
【００８３】
合成後処理：自動合成後、オリゴマーの固体支持体からの開裂および完全な脱保護は、濃アンモニア水による室温での終夜処理によって行われた。
【００８４】
精製：ＤＭＴ−ＯＮ化合物Ｎ１２Ｓ２ＦおよびＮ１２Ｓ１１Ｆは、Poly-Pak II（登録商標）カラム（Glen Research/Eurogenetec）を用いて、製造業者によって与えられた指示に従って精製された。
【００８５】
精製されたオリゴヌクレオチドＮ１２ＳｎＦ（ｎ＝２、１１）は、陰イオン交換カラム（SAX1000-8）により、塩基性水溶液条件（１００ｍＭ アンモニア，ｐＨ１１）で、ＮａＣｌ勾配（２０分内で０．７５〜２．５Ｍ）を用いて分析された。ＨＰＬＣ追跡は図９に示される（Ａ：Ｎ１２Ｓ１１Ｆ、Ｂ：Ｎ１２Ｓ２Ｆ）。
【００８６】
（精製されたオリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析）
オリゴヌクレオチドは、５００μLの脱イオン水に溶解させられた。サンプルおよびＨＰＡマトリクスが、プレート上で一緒に混合された。一旦結晶化されてから、サンプルは、BRUKER Ultraflex MS装置により分析された。結果は図１０Ａに与えられる：Ｎ１２Ｓ２Ｆ 計算値５４６０、実測値５４５９（上部）および図１０Ｂ：Ｎ１２Ｓ１１Ｆ 計算値：９１３５ 実測値：９１２５（下部）。
【００８７】
（実施例４：プラスミドＤＮＡ鎖の１４ｍｅｒおよび２０ｍｅｒの蛍光オリゴヌクレオチドを伴う侵入）
【００８８】
【化５】
【００８９】
上記に示される化合物は、以降において、Ｎ１４ＳｎＦ（Ｎ＝オリゴヌクレオチド部分；Ｓ＝スペルミン残基（ｎ＝２〜４）；Ｆ＝フルオレセイン残基）およびＮ２０ＳｎＦ（Ｎ＝オリゴヌクレオチド部分；Ｓ＝スペルミン残基（ｎ＝３〜５）；Ｆ＝フルオレセイン残基）によって表されることになる。
【００９０】
これらの蛍光オリゴヌクレオチドは、実施例２に記載された手順の後に合成された。５’−フルオレセイン・ホスホロアミダイト（Glen Research/Eurogentec）が、５’−末端のラベリングのために用いられた。最も置換されたＮ１４Ｓ４ＦおよびＮ２０Ｓ５Ｆ化合物についての分析的ＨＰＬＣ追跡およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルは、純度と構造の証拠として図１１および１２に示される（それぞれ、Ｎ１４Ｓ４Ｆ 計算値６４７０、実測値６４７８；Ｎ２０Ｓ５Ｆ 計算値８８１３、実測値８８１５）。
【００９１】
Ｎ１４ＳｎＦおよびＮ２０ＳｎＦのオリゴヌクレオチド配列は、ｐＧＬ３コントロールプラスミド（Promega）のルシフェラーゼ遺伝子配列の中から選ばれた。鎖侵入の配列特異性を評価するために、ｐＧＬ２コントロールプラスミド（Promega）が用いられた。ＧＬ２ルシフェラーゼ配列は、ＧＬ３と９５％同一であり、Ｎ１４ＳｎＦおよびＮ２０ＳｎＦによってターゲットにされる配列は、それぞれ、１および２のミスマッチを含有する。
【００９２】
ｐＧＬ３プラスミドを鎖侵略する（strand-invade）がｐＧＬ２プラスミドを鎖侵略しないＮ１４ＳｎＦおよびＮ２０ＳｎＦの能力が、生理的な塩および温度条件で試験された。
【００９３】
蛍光接合体Ｎ１４ＳｎＦおよびＮ２０ＳｎＦ（８．６５ｐｍｏｌ）が、プラスミドの溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中１．５μｇ，０．４３ｐｍｏｌ）に加えられた。混合物は、２４時間３７℃でインキュベートされ、アガロースゲル（ＴＡＥ ｐＨ７．４中１．３％）上に充填された。電気泳動は、Typhoon 8600 Imagerを用いてゲルを走査することによって何か蛍光緑色発光が検出された後に室温で４５分間にわたって行われた。ゲルの赤色の蛍光画像が、臭化エチジウム溶液中の１５分のインキュベーションの後にＵＶトランスイルミネーター上で取得された。結果は図１３に与えられる。
【００９４】
赤および緑色の蛍光は、それぞれ、二本鎖プラスミドＤＮＡおよび蛍光オリゴヌクレオチドの証拠である。ｐＧＬ３とは共局在化するがｐＧＬ２とは共局在化しないことは、それ故に、鎖侵入の証拠である。化合物Ｎ１４Ｓ３ＦおよびＮ２０ＳｎＦは、ｐＧＬ３とインキュベートされたがｐＧＬ２とインキュベートされない場合にプラスミドと関連するかすかな蛍光バンドを示した。
【００９５】
（実施例５：カチオン性オリゴヌクレオチドの細胞への浸透）
ＭＥＭ培地を含有する１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清において生育されたヒーラ細胞が、５０−６０×１０３細胞／ウェルで、４−ウェル有孔ボロシリカートLab-Tek皿に、実験の１日前に塗布された。完全培地は、０．５ｍＬの無血清ＭＥＭ培地と置換された。５’−カチオン性フルオレセイン接合オリゴヌクレオチドＦ−Ｓ１８Ｎ１９（ここで、Ｎ１９はTCGAAGTACTCAGCGTAAGである）製剤が滅菌ＰＢＳにおいて調製された。それは、２μＭの最終濃度まで細胞に加えられた。４時間後に、培地は、１ｍＬの新鮮な血清含有培地と置換された。第１の画像は、ＦＩＴＣフィルタを備えたZeiss axiovert 25蛍光顕微鏡により撮られた（図１４Ａ、左）。全ての細胞は蛍光性になり、いくつかの蛍光は細胞内の液胞に位置し、最も重要なことには、細胞質および核の全体にわたっても広がっていた。２４時間後に培地は１ｍＬのフェノールレッド不含有のＭＥＭ培地により置換された。ヨウ化プロピジウム（水中１ｍＭ）が１０μＭの最終濃度まで加えられた。１０分後に、第２の画像が撮られ、これは、大部分のプロピジウムがない健康な細胞であって、依然として蛍光性であったものを示す（図１４Ｂ、右）。Ｆ−Ｎ１９オリゴヌクレオチドにより類似の条件でインキュベートされたコントロール細胞は、非蛍光性を示した。
【００９６】
それ故に、本発明は、カチオン性オリゴヌクレオチドであって、鎖侵入の状況においてさえもそれらの相補的な配列と迅速かつ安定的な複合体を形成するものの多用途の自動合成を提供する。末端の接合に起因して、配列の選択性は、天然のオリゴヌクレオチドと同程度に高いままである。さらに、それらのカチオン性の性質のお陰で、細胞内送達は、カチオン性の運搬分子との複合体の形成を必要としない。まとめると、これらの特性は、オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン接合体を、分子生物学、診断並びに治療適用のためのオリゴヌクレオチドに対して魅力的な代替物にする。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】逆相カラムによるカチオン性オリゴヌクレオチドＮ１０Ｓｎ（ｎ＝１〜２）のＨＰＬＣ分析
【図２】陰イオン交換カラムによる精製オリゴヌクレオチドＮ１０Ｓｎ（ｎ＝１〜６）のＨＰＬＣ分析
【図３】ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＮ１０Ｓｎ（ｎ＝１〜６）電気泳動移動度の分析
【図４】種々の温度でのＮ１０のＮ１０・Ｃ１０との自発的交換
【図５】ポリアミドゲル電気泳動によって示されるＮ１０とＮ１０Ｓｎとの間の鎖の交換
【図６】Ｎ１０Ｓ１０・Ｃ１０二本鎖体の融点（ここでＣはＮに相補的なヌクレオチドである）
【図７】5’GTGGCATCGC3’を有するおよび5’GTGGCGTCGC3’を有するＮ１０Ｓｎ（ｎ＝０〜６）によって形成された二本鎖体の融点の比較結果
【図８】精製Ｎ１０Ｓｎ（ｎ＝１〜６）オリゴヌクレオチドのＥＳ−ＭＳ分析
【図９】ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドＮ１２Ｓ１１Ｆ（９Ａ）およびＮ１２Ｓ２Ｆ（９Ｂ）のＨＰＬＣ追跡
【図１０】Ｎ１２Ｓ２Ｆ（１０Ａ）およびＮ１２Ｓ１１Ｆ（１０Ｂ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル
【図１１】Ｎ１４Ｓ４Ｆ（１１Ａ）およびＮ２０Ｓ５Ｆ（１１Ｂ）のＨＰＬＣ追跡
【図１２】Ｎ１４Ｓ４Ｆ（１２Ａ）およびＮ２０Ｓ５Ｆ（１２Ｂ）のＭＬＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル
【図１３】Ｎ１４ＳｎＦ（１３Ａ）およびＮ２０ＳｎＦ（１３Ｂ）によるｐＧＬ２およびｐＧＬ３プラスミドの鎖の侵入
【図１４Ａ】カチオン性オリゴヌクレオチドＦ−Ｓ１８Ｎ１９のヒーラ細胞への透過
【図１４Ｂ】カチオン性オリゴヌクレオチドＦ−Ｓ１８Ｎ１９のヒーラ細胞への透過
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動ホスホロアミダイト化学を介して合成され得る、オリゴヌクレオチド部分Ａｉおよびオリゴカチオン部分Ｂｊを有するオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子ＡｉＢｊＨであって、
Ａｉは、ｉ ｍｅｒのオリゴヌクレオチド残基並びにそれらの化学改変体または置換体であり、ここで、ｉ＝５〜５０であり、天然のまたは非天然に発生する核酸塩基および／またはペンタフラノシル基および／または生来のホスホジエステル結合を有し；
Ｂｊは、ｊ ｍｅｒの有機オリゴカチオン部分であり、ｊ＝１〜５０であり、ここで、Ｂは、
・ -HPO3-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、低級アルキレンであり、ＸはＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎ１＝２〜２０である）、
・ -HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-（ここで、Ｒ４は低級アルキレンであり、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、低級アルキレンであり、Ｘ１はプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミン残基である）、
・ -HPO3-R7-(aa)n2-R8-O-（ここで、Ｒ７は低級アルキレンであり、Ｒ８は低級アルキレン、セリン、天然アミノ酸の還元によって得られるアミノアルコールであり、(aa)n2は、カチオン性側鎖を有する天然アミノ酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）
を含む群から選択される
オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子ＡｉＢｊＨ。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ、リボ、ロック（ＬＮＡ）ヌクレオチド並びにそれらの化学改変体または置換体を含む群において選択される、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
改変体または置換体は、ホスホロチオアート、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルである、請求項２に記載の分子。
【請求項４】
マーカー基は、蛍光剤である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の分子。
【請求項５】
アミノ酸は、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の分子。
【請求項６】
３’Ａ５’−Ｂ配列を有する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の分子。
【請求項７】
Ｂ−３’Ａ５’配列を有する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の分子。
【請求項８】
Ｂ−３’Ａ５’−Ｂまたは３’Ａ５’−Ｂ−３’Ａ５’配列並びにそれらの組合せを有する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の分子。
【請求項９】
ホスホロアミダイトルートを介する、オリゴヌクレオチド合成機による段階的な合成を用いることによって、請求項１〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子を得る方法であって、
活性化されかつ保護されたオリゴヌクレオチドＢを含むバイアルをオリゴヌクレオチド合成機に、オリゴヌクレオチドＡのバイアルに加えて詰めるか、またはこれと逆順に詰める工程と、
所望長さが得られた時に合成を停止させる工程と、
固体支持体からオリゴマーを開裂させる工程と、
保護基を除去する工程と
を包含する、方法。
【請求項１０】
ホスホロアミダイト試薬は、
・ P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびｎ１は、上記に定義した通りであり、Ｘは適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは低級アルキルであり、Ｒ１０は低級アルキルであるかまたは−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ基であり、Protはオリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基、例えば、ＤＭＴ、ＭＭＴである）；
・ P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot（ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は低級アルキレンであり、Ｘ１は適切に保護されたプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミンであり、Ｒ９およびＲ１０は上記に定義された通りである）；および
・ P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2 -R8-O-Prot（ここで、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２、(aa)n2およびProtは、上記に定義された通りである）
を含む群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド配列の段階的合成の次にオリゴカチオン部分の段階的合成が行われて、配列（３’Ａ５’−Ｂ）を有する化合物が得られる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
オリゴカチオン部分の段階的合成の次にオリゴヌクレオチド配列の段階的合成が行われて、（Ｂ−３’Ａ５’）配列の化合物が得られる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
混合配列の合成を包含する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１４】
両端部においてキャッピングされたオリゴヌクレオチド配列（Ｂ−３’Ａ５’−Ｂ）またはカチオンを割り込ませたオリゴヌクレオチド配列（３’Ａ５’−Ｂ−３’Ａ５’）の合成を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリアミンのアミノ基を保護し、次いで、α，ω−ビスヒドロキシアルキル化によって、オリゴヌクレオチドの合成により化学反応を起こさないジオールに導くことによって活性化されかつ保護されたオリゴカチオンＢが得られる、請求項９〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
式：P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびｎ１は上記の定義の通りであり、Ｘは適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは低級アルキルであり、Ｒ１０は低級であるかまたは−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ基であり、Protは、オリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基、例えばＤＭＴ、ＭＭＴである）；
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot（ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は低級アルキレンであり、Ｘ１は適切に保護されたプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミンであり、Ｒ９およびＲ１０は上記に定義された通りである）；または、
P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2 -R8-O-Prot（ここで、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびProtは上記に定義された通りである）
の、中間化合物としてのホスホロアミダイト試薬。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の使用を包含する、生物学および診断における使用方法。
【請求項１８】
ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ジェノタイピング、in situハイブリダイゼーションおよびＤＮＡチップ製造における使用のための、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の有効量を、製薬的に許容される担体と関連して含む医薬組成物。
【請求項１】
自動ホスホロアミダイト化学を介して合成され得る、オリゴヌクレオチド部分Ａｉおよびオリゴカチオン部分Ｂｊを有するオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子ＡｉＢｊＨであって、
Ａｉは、ｉ ｍｅｒのオリゴヌクレオチド残基並びにそれらの化学改変体または置換体であり、ここで、ｉ＝５〜５０であり、天然のまたは非天然に発生する核酸塩基および／またはペンタフラノシル基および／または生来のホスホジエステル結合を有し；
Ｂｊは、ｊ ｍｅｒの有機オリゴカチオン部分であり、ｊ＝１〜５０であり、ここで、Ｂは、
・ -HPO3-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、低級アルキレンであり、ＸはＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、ｎ１＝２〜２０である）、
・ -HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-（ここで、Ｒ４は低級アルキレンであり、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、低級アルキレンであり、Ｘ１はプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミン残基である）、
・ -HPO3-R7-(aa)n2-R8-O-（ここで、Ｒ７は低級アルキレンであり、Ｒ８は低級アルキレン、セリン、天然アミノ酸の還元によって得られるアミノアルコールであり、(aa)n2は、カチオン性側鎖を有する天然アミノ酸を含むペプチドであり、ｎ２＝２〜２０である）
を含む群から選択される
オリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子ＡｉＢｊＨ。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ、リボ、ロック（ＬＮＡ）ヌクレオチド並びにそれらの化学改変体または置換体を含む群において選択される、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
改変体または置換体は、ホスホロチオアート、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルである、請求項２に記載の分子。
【請求項４】
マーカー基は、蛍光剤である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の分子。
【請求項５】
アミノ酸は、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジン、ジアミノプロピオン酸である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の分子。
【請求項６】
３’Ａ５’−Ｂ配列を有する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の分子。
【請求項７】
Ｂ−３’Ａ５’配列を有する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の分子。
【請求項８】
Ｂ−３’Ａ５’−Ｂまたは３’Ａ５’−Ｂ−３’Ａ５’配列並びにそれらの組合せを有する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の分子。
【請求項９】
ホスホロアミダイトルートを介する、オリゴヌクレオチド合成機による段階的な合成を用いることによって、請求項１〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子を得る方法であって、
活性化されかつ保護されたオリゴヌクレオチドＢを含むバイアルをオリゴヌクレオチド合成機に、オリゴヌクレオチドＡのバイアルに加えて詰めるか、またはこれと逆順に詰める工程と、
所望長さが得られた時に合成を停止させる工程と、
固体支持体からオリゴマーを開裂させる工程と、
保護基を除去する工程と
を包含する、方法。
【請求項１０】
ホスホロアミダイト試薬は、
・ P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびｎ１は、上記に定義した通りであり、Ｘは適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは低級アルキルであり、Ｒ１０は低級アルキルであるかまたは−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ基であり、Protはオリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基、例えば、ＤＭＴ、ＭＭＴである）；
・ P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot（ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は低級アルキレンであり、Ｘ１は適切に保護されたプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミンであり、Ｒ９およびＲ１０は上記に定義された通りである）；および
・ P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2 -R8-O-Prot（ここで、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ｎ２、(aa)n2およびProtは、上記に定義された通りである）
を含む群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド配列の段階的合成の次にオリゴカチオン部分の段階的合成が行われて、配列（３’Ａ５’−Ｂ）を有する化合物が得られる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
オリゴカチオン部分の段階的合成の次にオリゴヌクレオチド配列の段階的合成が行われて、（Ｂ−３’Ａ５’）配列の化合物が得られる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
混合配列の合成を包含する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１４】
両端部においてキャッピングされたオリゴヌクレオチド配列（Ｂ−３’Ａ５’−Ｂ）またはカチオンを割り込ませたオリゴヌクレオチド配列（３’Ａ５’−Ｂ−３’Ａ５’）の合成を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリアミンのアミノ基を保護し、次いで、α，ω−ビスヒドロキシアルキル化によって、オリゴヌクレオチドの合成により化学反応を起こさないジオールに導くことによって活性化されかつ保護されたオリゴカチオンＢが得られる、請求項９〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
式：P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)n1-X-R3-O-Prot（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびｎ１は上記の定義の通りであり、Ｘは適切に保護されたＮＨまたはＮＣ（ＮＨ２）２であり、Ｒ９は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは低級アルキルであり、Ｒ１０は低級であるかまたは−Ｎ（Ｒ１０）２はピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ基であり、Protは、オリゴヌクレオチド合成において用いられる保護基、例えばＤＭＴ、ＭＭＴである）；
P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5X1)-R6-O-Prot（ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は低級アルキレンであり、Ｘ１は適切に保護されたプトレッシン、スペルミジンまたはスペルミンであり、Ｒ９およびＲ１０は上記に定義された通りである）；または、
P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2 -R8-O-Prot（ここで、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびProtは上記に定義された通りである）
の、中間化合物としてのホスホロアミダイト試薬。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の使用を包含する、生物学および診断における使用方法。
【請求項１８】
ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ジェノタイピング、in situハイブリダイゼーションおよびＤＮＡチップ製造における使用のための、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド−オリゴカチオン分子の有効量を、製薬的に許容される担体と関連して含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００９−５１９３１７（Ｐ２００９−５１９３１７Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５１４４（Ｐ２００８−５４５１４４）
【出願日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００４０８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６９０９２
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０８１１９４３７）サーントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シャーンティフィク （セ エン エール エス） (3)
【出願人】（５０８１７８６８５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００４０８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６９０９２
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０８１１９４３７）サーントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シャーンティフィク （セ エン エール エス） (3)
【出願人】（５０８１７８６８５）
【Ｆターム（参考）】
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