ケラチン繊維染色用組成物及びケラチン繊維の染色方法
【課題】酵素を用いたケラチン繊維染色用組成物及びケラチン繊維の染色方法を提供する。
【解決手段】ＣｕｅＯ、銅イオン、及び、酸化染料を含有するケラチン繊維染色用組成物、並びに、酸素含有雰囲気下、ＣｕｅＯ及び銅イオンの存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることからなる、ケラチン繊維の染色方法。
【解決手段】ＣｕｅＯ、銅イオン、及び、酸化染料を含有するケラチン繊維染色用組成物、並びに、酸素含有雰囲気下、ＣｕｅＯ及び銅イオンの存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることからなる、ケラチン繊維の染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いたケラチン繊維染色用組成物及びケラチン繊維の染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、毛髪や種々の繊維を含むケラチン繊維を染色するにあたって、染色効果を持続させるために、酸化染料が用いられている。酸化染料は、酸化反応及び重合反応を経て発色することによって染色を達成するものであり、永久染色剤を構成するものである。
【０００３】
酸化染料の酸化反応及び重合反応を進行させるために、従来、過酸化水素等の酸化剤が使用されてきた。これによって、毛髪内に浸透した酸化染料が酸化重合して、高分子体の色素が形成されて毛皮質内に沈着する。
しかしながら、過酸化水素は反応性が高いことから取り扱いに十分な注意が必要である。また、アルカリと過酸化水素の併用による頭皮や毛髪へのダメージが問題となっていた。さらに、酸化染料及びアルカリ剤を配合した一剤と、過酸化水素を配合した二剤を使用時に混合するため二剤式となり、使用方法が煩雑であった。
【０００４】
そこで、酸化剤ではなく、酵素を用いることによって酸化染料の直接的酸化重合反応を進行させる試みが行われている。このような酵素として、フェノールオキシダーゼやマルチ銅オキシダーゼの使用が提案されている。フェノールオキシダーゼやマルチ銅オキシダーゼは、大気中の酸素の存在下で種々の基質の酸化を触媒することができるため、酸素存在下で、ラジカル種の生成に起因する発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適するものである。
【０００５】
そのような染色用途における酵素として、具体的には、中性フェノールオキシダーゼ様活性を有するフラムリナ属菌類の培養物（特許文献１を参照）、フラムリナ属に属する担子菌に由来する中性フェノールオキシダーゼ（特許文献２を参照）、マイセリオフトラ・サーモフィラに由来するラッカーゼ（特許文献３を参照）の使用が提案されている。
【０００６】
ケラチン繊維の染色を酸性〜中性条件下で行うと、染色した毛髪は堅牢性が低く、退色がきわめて容易に進行しやすい。ケラチン繊維を膨潤させて酸化染料を毛髪内に浸透させ、高分子体の色素を毛髪内に沈着させることによって、染色効果を向上、持続させるには、酸化染料による染色をアルカリ条件下で行うのが好ましい。
【０００７】
ところが、特許文献１及び特許文献２に記載された中性フェノールオキシダーゼは、中性付近に至適ｐＨを有しており、アルカリ条件下での使用に適したものではなかった。さらに、至適ｐＨである中性付近での安定性が低いことから実用的な使用において難点があった。加えて、これら中性フェノールオキシダーゼは、直接染料の分解・脱色反応を触媒する性質をも持っており、直接染料による調色を困難とする問題点があった。
【０００８】
特許文献３に記載されたマイセリオフトラ・サーモフィラに由来するラッカーゼについても、至適ｐＨが６．５であり、アルカリ条件下での使用に適したものではなかった。
【０００９】
ところで、ＣｕｅＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞内の銅濃度を一定に保つホメオスタシスに関与するタンパク質である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが産出するＣｕｅＯは、５１６残基、分子量５６５５５Ｄａの単量体であるが、Ｎ末端側の２８残基はシグナルペプチドであり、ペリプラズムに移行する際に切断されて、４８８残基、分子量５３４０９Ｄａの成熟タンパク質となる。
【００１０】
ＣｕｅＯは１分子あたり銅４原子を含んでおり、マルチ銅オキシダーゼファミリーに分類される。ラッカーゼとは異なり、２，６−ジメトキシフェノール、カテコールなどのフェノール化合物を酸化しない。５番目の銅が結合するサイトを有しており、外因性の銅の存在下ではフェノールオキシダーゼ活性を示す。ＣｕｅＯは、かつてｙａｃＫと呼ばれていた遺伝子がコードするタンパク質であり、そのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列は非特許文献１で報告されており、その基本的特性については非特許文献２で報告されている。
【００１１】
しかしながら、ＣｕｅＯを染色用途に使用した例は報告されていない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０２０６１７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０７８９５８号パンフレット
【特許文献３】特表平１０−５０１１３７号公報
【非特許文献１】「サイエンス（ＳＣＩＥＮＣＥ）」、１９９７年、２７７（５３３１）、１４５３−１４７４頁
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ）」、Ｖｏｌ．１８３、２００１年８月、４８６６−４８７５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して酸化染料の酸化重合反応が効率よく進行し、一剤型とすることが可能なケラチン繊維染色用組成物であって、アルカリ条件を含む幅広いｐＨ領域での効率的なケラチン繊維の染色が可能で、かつ、直接染料の調色能を害することがなく、幅広い領域での温度及びｐＨにおいて安定なケラチン繊維染色用組成物、並びに、上記酵素を利用したケラチン繊維染色方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＣｕｅＯが以下の特性を有することを見出して、本発明を完成するに至ったものである。
（１）銅イオンの存在下で種々の酸化染料の直接的酸化重合反応を効率よく触媒する性質を有している。
（２）弱酸性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を発揮し、かつ、至適ｐＨをアルカリ領域に有している。
（３）直接染料を分解する性質を有していない。
（４）幅広い領域でのｐＨ及び温度において安定性に優れており、至適ｐＨを含むアルカリ領域においても安定性に優れている。
【００１４】
すなわち本発明は以下のものに関する。
［１］ＣｕｅＯ、銅イオン、及び、酸化染料を含有するケラチン繊維染色用組成物。
［２］ＣｕｅＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するものである［１］記載のケラチン繊維染色用組成物。
［３］ＣｕｅＯは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むものである［１］記載のケラチン繊維染色用組成物。
［４］銅イオンは、２価の銅の無機塩である［１］〜［３］のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
［５］さらに、アルカリ性化合物を含有する［１］〜［４］のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
［６］ケラチン繊維が毛髪である［１］〜［５］のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
［７］酸素含有雰囲気下、ＣｕｅＯ及び銅イオンの存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることからなる、ケラチン繊維の染色方法。
［８］上記接触を、アルカリ条件下で行う［７］記載の染色方法。
以下に本発明を詳述する。
【００１５】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、酵素として、ＣｕｅＯを含有するものである。
本発明において、ＣｕｅＯとして、天然に由来するＣｕｅＯ（天然型ＣｕｅＯ）を使用してもよいし、天然型ＣｕｅＯの性能を維持している限り、天然型ＣｕｅＯに修飾を施した改変型ＣｕｅＯを使用してもよい。
【００１６】
ＣｕｅＯの由来は特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するものが好ましい。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、ＣｕｅＯをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される。
【００１７】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが産出する天然型ＣｕｅＯとしては、配列番号１で示した塩基配列によってコードされるアミノ酸配列から構成される、シグナルペプチドを含んだ未成熟ＣｕｅＯ、配列番号２で表されるアミノ酸配列から構成される、シグナルペプチドを含まない成熟ＣｕｅＯを挙げることができ、いずれも本発明において使用することができる。しかしながら、入手の容易さ及び酸化重合活性の観点から、成熟ＣｕｅＯを用いることが好ましい。
【００１８】
本発明で使用するＣｕｅＯは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むものが好ましい。具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列から構成される成熟ＣｕｅＯ、当該成熟ＣｕｅＯのＣ末端に対してヒスチジンタグを付加した、配列番号４で表されるアミノ酸配列から構成されるＣｕｅＯ、当該成熟ＣｕｅＯに対してその他の修飾を施したもの等を挙げることができる。上記修飾としてはＣｕｅＯの酵素活性を阻害しないものである限り特に限定されないが、例えば、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（商品名、ＩＢＡ社）、ＧＳＴタグ、ビオチン標識等を挙げることができる。
【００１９】
本発明で使用するＣｕｅＯを製造する方法としては特に限定されないが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の菌体を培養して産出させたＣｕｅＯを取得、精製する方法；ＣｕｅＯをコードする塩基配列をベクターに導入し、得られた発現ベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の菌体を形質転換し、得られた形質転換体を培養して産出させたＣｕｅＯを取得、精製する方法等を挙げることができる。
【００２０】
形質転換体を含む菌体が産出したＣｕｅＯを使用する場合には、精製された純粋なＣｕｅＯのほか、ＣｕｅＯを含む粗精製物を使用することも可能である。
【００２１】
本発明のケラチン繊維染色用組成物におけるＣｕｅＯの配合量は、使用するケラチン繊維の種類、染色時の条件、酸化染料の種類等に応じて種々調整することができ、特に限定されるものではないが、組成物全量１００重量部に対して、０．０００１〜１０重量部が好ましく、０．００１〜１重量部がより好ましい。
【００２２】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、ＣｕｅＯに加えて、銅イオンを含有する。ＣｕｅＯは銅イオンを配合しなくともいくつかの酸化染料の直接的酸化重合反応をある程度は触媒する能力を有するが、銅イオンを共存させることによって、広範な種類の酸化染料に対して、十分なケラチン繊維染色力を発揮することができるようになる。
【００２３】
本発明では、銅イオンとして、１価の銅塩又は２価の銅塩等を配合することができる。２価の銅塩としては特に限定されないが、例えば、硫酸銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、炭酸銅（ＩＩ）等の無機塩が挙げられる。１価の銅塩としては特に限定されないが、塩化銅（Ｉ）、シアン化銅（Ｉ）等の無機塩が挙げられる。なかでも、染色力の向上や人体に対する影響の観点から、２価の銅の無機塩が好ましく、硫酸銅がより好ましい。
【００２４】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における銅イオンの配合量は、十分な染色力を達成できる限り特に限定されないが、組成物全量１００重量部に対して、銅塩全体として０．０００１〜１重量部が好ましく、０．００１〜０．１重量部がより好ましい。また、ＣｕｅＯ１モルに対して０．００１〜１０００モルが好ましく、０．０１〜１００モルがより好ましい。
【００２５】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、酸化染料を含有する。酸化染料とは、酸化反応及び重合反応を経て発色することによって、染色を達成するものである。酸化染料には、それ自体が酸化重合して発色し得る「染料前駆体」と、当該染料前駆体と重合することによって種々の色調となる「カップラー」が含まれる。
染料前駆体には、オルト又はパラ体のフェニレンジアミン又はアミノフェノール等が含まれ、カップラーには、メタ体のフェニレンジアミン又はアミノフェノール等が含まれる。
【００２６】
酸化染料としては特に限定されないが、例えば、具体的には、パラフェニレンジアミン、カテコール、ピロガロール、没食子酸、レゾルシン、５−アミノオルトクレゾール、オルトアミノフェノール、メタアミノフェノール、パラアミノフェノール、２，６−ジアミノピリジン、５−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−２−メチルフェノール、Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシ）−パラフェニレンジアミン硫酸塩、パラニトロ−オルトフェニレンジアミン、パラニトロ−２′，４′−ジアミノアゾベンゼン・硫酸ナトリウム、トルエン−２，５−ジアミン、５−アミノオルトクレゾール・硫酸塩、パラアミノフェノール・硫酸塩、オルトクロロ−パラフェニレンジアミン・硫酸塩、４，４′−ジアミノジフェニルアミン・硫酸塩、パラメチルアミノフェノール・硫酸塩、パラフェニレンジアミン・硫酸塩、メタフェニレンジアミン・硫酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノキシエタノール・塩酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・塩酸塩、メタフェニレンジアミン・塩酸塩、２，４−ジアミノフェノール・塩酸塩、３，３′−イミノジフェノール、パラフェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−パラフェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−パラフェニレンジアミン・酢酸塩、１，５−ジヒドロキシナフタレン、トリレン−３，４−ジアミン、パラメチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ′−ビス（４−アミノフェニル）−２，５−ジアミノ−１，４−キノンジイミン、オルトアミノフェノール・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノール・硫酸塩、メタアミノフェノール・硫酸塩等を挙げることができる。以上に例示した化合物は、医薬部外品原料規格に収載されているものである。
【００２７】
本発明においては、酸化染料として、インドリン化合物や、インドール化合物を用いることもできる。
インドリン化合物としては特に限定されないが、例えば、インドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−ブチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドリン、６，７−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドロキシインドリン、４−メトキシ−６−ヒドロキシインドリン、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシインドリン、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドリン、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドリン、４−ヒドロキシプロピルインドリン、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシインドリン、５−ヒドロキシインドリン、７−ヒドロキシインドリン、７−アミノインドリン、５−アミノインドリン、４−アミノインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリンカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、これらの塩類等を挙げることができる。
【００２８】
インドール化合物としては特に限定されないが、例えば、４，５−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール、６，７−ジヒドロキシインドール、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドール、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドール、４−ヒドロキシプロピルインドール、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドール、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、７−アミノインドール、５−アミノインドール、４−アミノインドール、５，６−ジヒドロキシインドールカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール等を挙げることができる。
【００２９】
これらの酸化染料は単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよいが、好ましくは、染料前駆体に属する化合物のうち一種類又は複種類を用いるか、又は、染料前駆体に属する化合物のうち一種類又は複種類と、カップラーに属する化合物のうち一種類又は複種類とを組み合わせて用いる。
【００３０】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における酸化染料の配合量としては特に限定されず、好適な染色能力を発揮することができるよう適宜調整すればよいが、例えば、組成物全量に対して０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の配合量を例示することができる。
【００３１】
本発明のケラチン繊維染色用組成物には、酸化染料以外に、直接染料を配合することによって、得られる色調を調整することができる。
直接染料としては特に限定されないが、例えば、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、１−アミノ−４−メチルアミノアントラキノン、ニトロ−パラフェニレンジアミン・塩酸塩、１，４−ジアミノアントラキノン、ニトロ−パラフェニレンジアミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、２−アミノ−５−ニトロフェノール・硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ−パラフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ−オルトフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ−メタフェニレンジアミン・硫酸塩、ナチュラルオレンジ６（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルー、エバンスブルー、アシッドブルー８０等を挙げることができる。
【００３２】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における直接染料の配合量としては特に限定されず、所望の色調に応じて種々調整することができるが、例えば、組成物全量に対して０．０１〜２０重量％の配合量を例示することができる。
【００３３】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、さらに、アルカリ性化合物を含有することが好ましい。ＣｕｅＯは弱酸性〜アルカリ条件でその酵素能力を発揮するものであるが、至適ｐＨをアルカリ領域に有しているために、アルカリ性化合物の配合によって、本発明の組成物をアルカリ性にすることが、染色能力の観点から好ましい。組成物をアルカリ性にすることによって、ケラチン繊維が膨潤し、染料が毛髪内に浸透、沈着することから染色効果を向上させることができる。
【００３４】
本発明のケラチン繊維染色用組成物に配合できるアルカリ性化合物としては特に限定されないが、一般に染色剤に配合することができるものを使用することができ、例えば、モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン等のアミン化合物、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸アンモニウム等の無機化合物等を挙げることができる。
【００３５】
本発明のケラチン繊維染色用組成物におけるアルカリ性化合物の配合量としては特に限定されず、所望のｐＨ（好ましくはｐＨ７．５〜１０．５）を達成できる量を適宜配合すればよい。例えば、組成物全量に対して、０．１〜２０重量％の配合量を例示することができる。なお、本発明において、アルカリ性化合物は、１種類のみを配合してもよいし、２種類以上を配合してもよい。
【００３６】
本発明のケラチン繊維染色用組成物には、上記の各成分のほか、種々の成分を配合することができる。特に限定されないが、具体的には、チオ乳酸、亜硫酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等の還元剤、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、香料等を挙げることができる。
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、銅イオンを配合するため、当該銅イオンが溶解するよう、水溶液とすることが好ましい。
【００３７】
本発明の組成物はケラチン繊維を染色するためのものであるが、上記ケラチン繊維には、ヒト等の哺乳動物の毛髪のほか、各種繊維が含まれる。繊維としては特に限定されないが、天然繊維、合成繊維のいずれでもよく、例えば、綿、ジアセテート、亜麻、リンネル、リオセル、ポリアクリル、ポリアミド、ポリエステル、ラミー、レーエン、テンセル、トリアセテート、毛皮、獣皮、皮革、絹、ウール等を挙げることができる。繊維の形態としても特に限定されず、布帛、糸、衣料、フィルム等、いずれの形態であってもよい。
【００３８】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、無酸素雰囲気下で上記各成分を混合して、無酸素雰囲気下の容器内に収容することにより、一剤型の組成物として調製することができる。
さらに、本発明のケラチン繊維染色用組成物は、ＣｕｅＯと銅イオンを含む第一組成物と、酸化染料を含む第二組成物からなる二剤型の組成物として調製することもできる。この場合には、各成分の混合及び保存を無酸素雰囲気下で行う必要はない。
【００３９】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、一剤型の組成物の場合には、ケラチン繊維に直接適用することによって、二剤型の組成物の場合には、２つの組成物を混合した後直ちにケラチン繊維に適用することによって、簡便に、効率よく、ケラチン繊維の染色を達成することができる。
【００４０】
本発明のケラチン繊維染色方法は、酸素含有雰囲気下、ＣｕｅＯ及び銅イオンの存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることからなる。酸素含有雰囲気とは、特に限定されないが、通常、空気でよい。接触時の温度は特に限定されないが、１０〜１００℃程度が好ましい。毛髪に適用する場合には、人体に対する影響の観点から、２０〜４０℃程度がより好ましい。
【００４１】
ＣｕｅＯは弱酸性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を発揮するので、上記接触は弱酸性〜アルカリ条件（例えば、ｐＨ６〜１１）下で好適に行うことができるが、ＣｕｅＯは至適ｐＨをアルカリ領域に有するので、上記接触は中性〜アルカリ条件下（好ましくはｐＨ７．５〜１０．５）でより好適に行うことができる。本発明の染色方法に関する詳細は、本発明の組成物について上述したものと同様である。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、上述の構成よりなるので、過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して酸化染料の酸化重合反応が効率よく進行し、一剤型とすることが可能なケラチン繊維染色用組成物であって、アルカリ条件を含む幅広いｐＨ領域での効率的なケラチン繊維の染色が可能で、かつ、直接染料の調色能を害することがなく、幅広い領域での温度及びｐＨにおいて安定なケラチン繊維染色用組成物、並びに、上記酵素を利用したケラチン繊維染色方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
製造例１
ＣｕｅＯの製造と精製
以下では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）をホストにＣｕｅＯの同種発現を行うことによって、ＣｕｅＯを大量に調製した。天然型ＣｕｅＯとの区別及び精製を簡便にすることを目的に、天然型の成熟ＣｕｅＯのＣ末端に対してヒスチジンタグを付加した、配列番号４で表される改変型ＣｕｅＯを作製した。
【００４４】
（１）発現ベクターの作成
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲ法によりＣｕｅＯ遺伝子を増幅した。増幅には、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、以下に示すＰＣＲ反応液を用いた。
N-EcoRI:
5'-gaagaattcatgcaacgtcgtgatttcttaaaat-3'（配列番号５）
（４〜９位のgaattcがＥｃｏＲＩ認識部位である。）
3'-His-Bam:
5'-ttggatccttaatgatgatgatgatgatggcctaccgtaaaccctaac-3'（配列番号６）
（３〜８位のggatccがＢａｍＨＩ認識部位であり、１２〜２９位のatgatgatgatgatgatgがヒスチジンタグをコードする配列である。）
【００４５】
ＰＣＲ反応液
Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ） １μｌ
プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） 各１μｌ
ＰＣＲ緩衝液（Ｘ１０） ５μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ．（２５ｍＭ） ４μｌ
ジメチルスルホキシド ２．５μｌ
精製水 ３５．２５μｌ
Ｔａｋａｒａ ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２５μｌ
【００４６】
増幅した１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同様に消化したプラスミドベクターｐＵＣ１８に連結した。ベクター中に、配列番号３で表される塩基配列を確認した。得られた発現ベクターをｐＵＣ−ＣｕｅＯとする。
【００４７】
（２）形質転換体の作製
ｐＵＣ−ＣｕｅＯによって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を常法に従って形質転換した。得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ−ＣｕｅＯとする。
【００４８】
（３）形質転換体の培養
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ−ＣｕｅＯを以下の二段階で培養してＣｕｅＯを発現させた。
３−１．前培養（試験管）
０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地４ｍＬ中、３７℃で、Ｏ／Ｎ好気培養を行った。
３−２．本培養（２Ｌバッフル付三角フラスコ）
１ｍＭのＣｕＣｌ２、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加した４００ｍＬの上記培地中、３２℃で、１２時間好気培養を行った。
その後、遠心分離により集菌し、０．８５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、直ちに以下のオスモティックショックを行った。
【００４９】
（４）ＣｕｅＯの精製
４−１．オスモティックショック
菌体を、氷冷した２０％ショ糖、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離にかけ菌体を回収した。
次に、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷蒸留水に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離にかけ上清を回収した。これを粗酵素液とした。
【００５０】
４−２．ＩＭＡＣ
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液で平衡化したＢＤ ＴＡＬＯＮカラム（４０ｍＬ）に粗酵素液を重層し、同緩衝液で洗浄した。
１５０ｍＭイミダゾールを含む同緩衝液で、吸着したＣｕｅＯを溶出させた。溶出画分は濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対し透析した。
【００５１】
４−３．陰イオン交換クロマトグラフィー
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＢＩＯ−ＲＡＤ ＵｎｏＱ−１２カラム（１２ ｍＬ）に試料を重層し、同緩衝液で洗浄した（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）。
同緩衝液を用いた０−１Ｍ塩化カリウム水溶液の直線濃度勾配（１２０ｍＬ）により、吸着したＣｕｅＯを溶出させた。活性画分を回収し濃縮した。
【００５２】
４−４．ゲルろ過クロマトグラフィー
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲ１０／３０カラム（２４ｍＬ）に試料を重層し、同緩衝液で展開した（流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）。活性画分を回収し、ＣｕｅＯ水溶液とした。
このようにして得られたＣｕｅＯ水溶液を以下の試験例及び実施例で使用した。
【００５３】
試験例１
ラッカーゼの代表的な基質に対するＣｕｅＯの酸化重合活性の評価
（１）基質溶液の調製
２，６−ジメトキシフェノール、パラフェニレンジアミン、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、２−メトキシフェノール、カテコールはそれぞれ、イオン交換蒸留水に溶解し、５０ｍＭ水溶液とした。
４−ヒドロキシインドール、パラアミノフェノールはそれぞれ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液とした。
【００５４】
オルトアミノフェノールはＤＭＳＯに溶解した後、イオン交換蒸留水に溶解して５０ｍＭＤＭＳＯ（１０％）−水溶液とした。
１−ニトロソ−２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム（ＮＮＳ）はイオン交換蒸留水に溶解し、５ｍＭ水溶液とした。
ビリルビンはＤＭＳＯに溶解し、０．５ｍＭ ＤＭＳＯ溶液とした。
シリンガルダジンはエタノールに溶解し、５ｍＭエタノール溶液とした。
Ｌ−チロシンは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解して、１ｍＭ溶液とした。
【００５５】
（２）活性測定方法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
ＮＮＳ、ビリルビン以外の基質については、キュベット（１．５ｍＬ ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、基質溶液０．１ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表１に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。
【００５６】
銅添加の影響については、０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬの代わりに、０．１Ｍ緩衝液０．８６ｍＬ、及び、５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０２ｍＬを加える以外は同様の操作を行った。
【００５７】
ＮＮＳ、ビリルビンについては、キュベット（１．５ｍＬ ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．９６ｍＬと、基質溶液０．０２ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表１に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。
銅添加の影響については、０．１Ｍ緩衝液０．９６ｍＬの代わりに、０．１Ｍ緩衝液０．９４ｍＬ、及び、５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０２ｍＬを加える以外は同様の操作を行った。
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）とする。なお、上述のとおり測定した３０秒間の吸光度変化を、１分間の吸光度変化に換算して表す（以下、同様）。ＣｕｅＯ水溶液中のタンパク質濃度を、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を標準タンパク質として、Ｌｏｗｒｙ法により定量した。ＣｕｅＯ水溶液中のタンパク質１ｍｇあたりの活性を、比活性（Ｕ／ｍｇ）とする。得られた結果を以下の表１に示した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
以上の結果から、ＣｕｅＯは、銅イオンと共存させることによって、ジアミン化合物、フェノール化合物、及び、アミノフェノール化合物を効率よく酸化重合する能力を発揮することが分かった。
【００６０】
試験例２
種々の基質に対するＣｕｅＯの酸化重合活性の評価
（１）基質溶液の調製
表２に示す各基質をＤＭＳＯに溶解した後、イオン交換蒸留水に溶解して、１ｍＭ ＤＭＳＯ（１．０％）水溶液とした。
【００６１】
（２）活性測定法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
キュベット（１．０ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、基質溶液０．１ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表２に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。
【００６２】
銅添加の影響については、０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬの代わりに、０．１Ｍ緩衝液０．８６ｍＬ、及び、５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０２ｍＬを加える以外は同様の操作を行った。
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）とする。ＣｕｅＯ水溶液中のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準タンパク質として、Ｌｏｗｒｙ法により定量した。ＣｕｅＯ水溶液中のタンパク質１ｍｇあたりの活性を、比活性（Ｕ／ｍｇ）とする。得られた結果を以下の表２に示した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
以上の結果から、ＣｕｅＯは、銅イオンと共存させることによって、オルト位又はパラ位のジアミン化合物、フェノール化合物、及び、アミノフェノール化合物を効率よく酸化重合する能力を発揮することが分かった。また、ナフトール化合物、及び、インドール化合物についても、効率よく酸化重合する能力を発揮することが分かった。
【００６５】
試験例３
ＣｕｅＯの酸化重合活性のｐＨ依存性の評価
パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性のｐＨ依存性を以下の手順で評価した。
キュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中で、ｐＨ２〜１２の範囲のいずれかのｐＨ値を示す２００ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液１．７８ｍＬと、１００ｍＭ パラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、得られた種々のｐＨ値を示す混合物について、０〜３０秒後までの４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００６６】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうちｐＨ８．１７及び８．４２での活性を１００として、酸化重合反応時の各ｐＨ値に関して相対活性（％）を図１に示した。
図１より、ＣｕｅＯがおよそｐＨ６〜１０という弱酸性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を示し、ＣｕｅＯの至適ｐＨは８〜８．５であることが分かった。
【００６７】
試験例４
ＣｕｅＯの酸化重合活性の温度依存性の評価
パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性の温度依存性を以下の手順で評価した。
キュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中で１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．９３ｍＬと、４００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．０５ｍＬとを混合し、種々の温度条件（３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０及び７５℃）でプレヒートした後、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、得られた各混合物について、０〜３０秒後までの４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００６８】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち７５℃での活性を１００として、酸化重合反応時の各温度に関して相対活性（％）を図２に示した。
以上の結果から、高温になるほどＣｕｅＯの酸化重合活性が上昇し、広範な温度範囲で十分な酸化重合活性を示すことが分かった。
【００６９】
試験例５
ＣｕｅＯの直接染料分解活性の評価
種々の直接染料に対するＣｕｅＯの分解活性を以下の手順で評価した。
（１）染料溶液の調製
ナチュラルオレンジ６（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルー、エバンスブルー、アシッドブルー８０をそれぞれ、イオン交換蒸留水に溶解して、０．２ｍｇ／ｍＬ水溶液とした。
【００７０】
（２）活性測定方法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、又は、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を使用した。
キュベット（１．５ｍＬ ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、染料溶液０．１ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０、１及び２時間後の波長３００〜７００ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
【００７１】
銅添加の影響については、０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬの代わりに、０．１Ｍ緩衝液０．８６ｍＬ、及び、５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０２ｍＬを加える以外は同様の操作を行った。
各染料について、極大を示す波長における、混合直後（０時間）から２時間後までの吸光度の変化量を、以下の表３に示した。
【００７２】
【表３】
【００７３】
以上の結果から、ＣｕｅＯが、各ｐＨ条件下で直接染料を分解する活性を有しないことが分かった。
【００７４】
試験例６
ＣｕｅＯのｐＨ安定性の評価
種々のｐＨ条件でＣｕｅＯを前処理した後に、パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性を測定することにより、ＣｕｅＯのｐＨ安定性を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ＣｕｅＯ水溶液を、ｐＨ２〜１２の範囲のいずれかのｐＨ値を示す２００ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に希釈して、１時間インキュベートすることにより、前処理を行った。
【００７５】
次いで、前処理後の混合物０．１５ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．６５ｍＬと、１００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとをキュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後までの４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００７６】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうちｐＨ９．６５で前処理した場合の活性を１００として、前処理時の各ｐＨについて相対活性（％）を図３に示した。
以上の結果から、ＣｕｅＯが、ｐＨ２〜１２と幅広いｐＨ領域において十分な酸化重合活性を保持しており、ｐＨ安定性に優れていることが分かった。
【００７７】
試験例７
ＣｕｅＯの熱安定性の評価
種々の温度条件でＣｕｅＯを前処理した後に、パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性を測定することにより、ＣｕｅＯの熱安定性を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ＣｕｅＯ水溶液を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に希釈して、種々の温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０℃）で３０分間インキュベートすることにより、前処理を行った。
【００７８】
次いで、前処理後の混合物を氷冷し、当該混合物０．０２ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．７８ｍＬと、１００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとをキュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後での４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００７９】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち５０℃で前処理した場合の活性を１００として、前処理時の各温度に関して相対活性（％）を図４に示した。
以上の結果から、ＣｕｅＯが、２０〜６０℃と幅広い温度領域において十分な酸化重合活性を保持しており、熱安定性に優れていることが分かった。
【００８０】
試験例８
ＣｕｅＯの熱安定性の経時的変化の評価
６０℃で適当な時間ＣｕｅＯをインキュベートした後に、パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性を測定することにより、ＣｕｅＯの熱安定性の経時的変化を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ＣｕｅＯ水溶液を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に希釈して、６０℃で適当な時間（０分間、３０分間、６０分間、９０分間又は１２０分間）インキュベートすることにより、前処理を行った。
【００８１】
次いで、前処理後の混合物を氷冷し、当該混合物０．０２ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．７８ｍＬと、１００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとをキュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後の４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００８２】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち前処理をしていない場合（０分間）の活性を１００として、前処理時の各処理時間における相対活性（％）を図５に示した。
以上の結果から、ＣｕｅＯの加熱によってＣｕｅＯの酸化重合活性が経時的に減少すること、及び、６０℃におけるＣｕｅＯの酸化重合活性の半減期がおよそ３９分であることが分かった。
【００８３】
実施例１及び比較例１
本発明の組成物によるケラチン繊維の染色
（１）染色基剤の調製
パラフェニレンジアミン０．５ｇ、ヒドロキシエチルセルロース０．７５ｇ、ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油（ＨＣ−２０）１．０ｇ、及び、乳酸０．５ｇを混合し、モノエタノールアミンでｐＨを９．０に調整して、イオン交換蒸留水で重量を５０ｇに調製した。
【００８４】
（２）染色試験
実施例１では、前記染色基剤２ｇ、ＣｕｅＯ水溶液（４Ｕ相当量）及び５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０４ｍＬを混合し、得られた混合物をヒト白髪毛束１ｇと羊毛布１枚（２×３ｃｍ）とに対して塗布した。塗布後のヒト白髪毛束および羊毛布のそれぞれを、３０℃で３０分間保持した。
比較例１では、前記染色基剤２ｇとＣｕｅＯ水溶液（４Ｕ相当量）を混合することにより得られた混合物を用いたこと以外は同様に行った。
コントロールでは、ＣｕｅＯ水溶液も硫酸銅水溶液も添加せずに前記染色基剤を直接塗布すること以外は同様に行った。
なお、上記の単位Ｕは、１ｍＭの硫酸銅共存下、５ｍＭパラフェニレンジアミンを基質として用い、ｐＨ９．０において、４８７ｎｍの吸光度を１分間で１変化させるＣｕｅＯ量を表す。
【００８５】
（３）色差測定
染色前のヒト白髪毛束及び染色されたヒト白髪毛束について、色差計（ミノルタ社製、商品名：Ｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ ＣＭ−３６１０ｄ）を用いて、Ｌ値、ａ値、ｂ値を測定した。次いで、前記Ｌ値、ａ値、ｂ値に基づき、下記式（１）により、ΔＥ値を算出した。結果を以下の表４に示した。
なお、前記ΔＥ値は、染色前の色調と染色後の色調との色差を示しており、数値が高いほど染色力が高いことを示す。
【００８６】
【数１】
【００８７】
【表４】
【００８８】
以上の結果より、ＣｕｅＯと銅イオンとを併用することによって、高い染色効果を達成できることが示された。
尚、市販のヘアマニキュアのΔＥ値はおよそ４０であるため、以上の結果によって、本発明の組成物が毛髪の染色に好適に使用できることが示された。
【００８９】
調剤例
以下に、本発明のケラチン繊維染色用組成物の調剤例を示す。以下の組成物は、白髪の毛髪に適用すると、白髪を目立たなく染色することができるものである。なお、配合量は重量％で示す。
調剤例１（ジェルタイプ）
パラフェニレンジアミン １．５
レゾルシン ０．３
メタアミノフェノール ０．１
ＣｕｅＯ水溶液 ０．１
硫酸銅 ０．０１
アスコルビン酸ナトリウム １．０
ヒドロキシエチルセルロース １．０
クエン酸 適量
モノエタノールアミン ｐＨ７．５に調整
精製水 残部
合 計 １００．０
【００９０】
調剤例２（クリームタイプ）
パラフェニレンジアミン １．０
パラアミノフェノール ０．８
メタアミノフェノール ０．１
セタノール ６．０
ＣｕｅＯ水溶液 ０．０５
硫酸銅 ０．０５
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル ４．０
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム １．０
Ｌ−システイン塩酸塩 ０．２
クエン酸 適量
モノエタノールアミン ｐＨ９．５に調整
精製水 残部
合 計 １００．０
【００９１】
調剤例３（クリームタイプ）
５，６−ジヒドロキシインドリン １．０
５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸 ０．５
オルトアミノフェノール ０．５
エタノール ５．０
ステアリルアルコール １．５
ＣｕｅＯ水溶液 ０．２
硫酸銅 ０．０３
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油 ３．０
ポリグリセリン脂肪酸エステル ４．０
Ｎ−アセチルシステイン ０．１
キサンタンガム ０．５
アキュリン（登録商標）２２ ０．１
ヒドロキシエチルセルロース ０．１
モノイソプロパノールアミン 適量
モノエタノールアミン 適量
精製水 残部
合 計 １００．０
【００９２】
調剤例４（エアゾールタイプ）
トルエン−２，５−ジアミン １．５
パラアミノフェノール ０．２
レゾルシン ０．１
メタアミノフェノール ０．１
ポリオキシエチレン（５）セチルエーテル ２．０
プロピレングリコール ５．０
亜硫酸ナトリウム ０．３
モノエタノールアミン 適量
クエン酸 適量
ＣｕｅＯ水溶液 ０．３
硫酸銅 ０．０５
液化石油ガス ４．０
精製水 残部
合 計 １００．０
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、ケラチン繊維の染色を、過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して、簡便にかつ効率よく、アルカリ条件下においても行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】試験例３でＣｕｅＯの酸化重合活性のｐＨ依存性を評価した結果を示すグラフ
【図２】試験例４でＣｕｅＯの酸化重合活性の温度依存性を評価した結果を示すグラフ
【図３】試験例６でＣｕｅＯのｐＨ安定性を評価した結果を示すグラフ
【図４】試験例７でＣｕｅＯの熱安定性を評価した結果を示すグラフ
【図５】試験例８でＣｕｅＯの熱安定性の経時的変化を評価した結果を示すグラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いたケラチン繊維染色用組成物及びケラチン繊維の染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、毛髪や種々の繊維を含むケラチン繊維を染色するにあたって、染色効果を持続させるために、酸化染料が用いられている。酸化染料は、酸化反応及び重合反応を経て発色することによって染色を達成するものであり、永久染色剤を構成するものである。
【０００３】
酸化染料の酸化反応及び重合反応を進行させるために、従来、過酸化水素等の酸化剤が使用されてきた。これによって、毛髪内に浸透した酸化染料が酸化重合して、高分子体の色素が形成されて毛皮質内に沈着する。
しかしながら、過酸化水素は反応性が高いことから取り扱いに十分な注意が必要である。また、アルカリと過酸化水素の併用による頭皮や毛髪へのダメージが問題となっていた。さらに、酸化染料及びアルカリ剤を配合した一剤と、過酸化水素を配合した二剤を使用時に混合するため二剤式となり、使用方法が煩雑であった。
【０００４】
そこで、酸化剤ではなく、酵素を用いることによって酸化染料の直接的酸化重合反応を進行させる試みが行われている。このような酵素として、フェノールオキシダーゼやマルチ銅オキシダーゼの使用が提案されている。フェノールオキシダーゼやマルチ銅オキシダーゼは、大気中の酸素の存在下で種々の基質の酸化を触媒することができるため、酸素存在下で、ラジカル種の生成に起因する発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適するものである。
【０００５】
そのような染色用途における酵素として、具体的には、中性フェノールオキシダーゼ様活性を有するフラムリナ属菌類の培養物（特許文献１を参照）、フラムリナ属に属する担子菌に由来する中性フェノールオキシダーゼ（特許文献２を参照）、マイセリオフトラ・サーモフィラに由来するラッカーゼ（特許文献３を参照）の使用が提案されている。
【０００６】
ケラチン繊維の染色を酸性〜中性条件下で行うと、染色した毛髪は堅牢性が低く、退色がきわめて容易に進行しやすい。ケラチン繊維を膨潤させて酸化染料を毛髪内に浸透させ、高分子体の色素を毛髪内に沈着させることによって、染色効果を向上、持続させるには、酸化染料による染色をアルカリ条件下で行うのが好ましい。
【０００７】
ところが、特許文献１及び特許文献２に記載された中性フェノールオキシダーゼは、中性付近に至適ｐＨを有しており、アルカリ条件下での使用に適したものではなかった。さらに、至適ｐＨである中性付近での安定性が低いことから実用的な使用において難点があった。加えて、これら中性フェノールオキシダーゼは、直接染料の分解・脱色反応を触媒する性質をも持っており、直接染料による調色を困難とする問題点があった。
【０００８】
特許文献３に記載されたマイセリオフトラ・サーモフィラに由来するラッカーゼについても、至適ｐＨが６．５であり、アルカリ条件下での使用に適したものではなかった。
【０００９】
ところで、ＣｕｅＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞内の銅濃度を一定に保つホメオスタシスに関与するタンパク質である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが産出するＣｕｅＯは、５１６残基、分子量５６５５５Ｄａの単量体であるが、Ｎ末端側の２８残基はシグナルペプチドであり、ペリプラズムに移行する際に切断されて、４８８残基、分子量５３４０９Ｄａの成熟タンパク質となる。
【００１０】
ＣｕｅＯは１分子あたり銅４原子を含んでおり、マルチ銅オキシダーゼファミリーに分類される。ラッカーゼとは異なり、２，６−ジメトキシフェノール、カテコールなどのフェノール化合物を酸化しない。５番目の銅が結合するサイトを有しており、外因性の銅の存在下ではフェノールオキシダーゼ活性を示す。ＣｕｅＯは、かつてｙａｃＫと呼ばれていた遺伝子がコードするタンパク質であり、そのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列は非特許文献１で報告されており、その基本的特性については非特許文献２で報告されている。
【００１１】
しかしながら、ＣｕｅＯを染色用途に使用した例は報告されていない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０２０６１７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０７８９５８号パンフレット
【特許文献３】特表平１０−５０１１３７号公報
【非特許文献１】「サイエンス（ＳＣＩＥＮＣＥ）」、１９９７年、２７７（５３３１）、１４５３−１４７４頁
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ）」、Ｖｏｌ．１８３、２００１年８月、４８６６−４８７５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して酸化染料の酸化重合反応が効率よく進行し、一剤型とすることが可能なケラチン繊維染色用組成物であって、アルカリ条件を含む幅広いｐＨ領域での効率的なケラチン繊維の染色が可能で、かつ、直接染料の調色能を害することがなく、幅広い領域での温度及びｐＨにおいて安定なケラチン繊維染色用組成物、並びに、上記酵素を利用したケラチン繊維染色方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＣｕｅＯが以下の特性を有することを見出して、本発明を完成するに至ったものである。
（１）銅イオンの存在下で種々の酸化染料の直接的酸化重合反応を効率よく触媒する性質を有している。
（２）弱酸性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を発揮し、かつ、至適ｐＨをアルカリ領域に有している。
（３）直接染料を分解する性質を有していない。
（４）幅広い領域でのｐＨ及び温度において安定性に優れており、至適ｐＨを含むアルカリ領域においても安定性に優れている。
【００１４】
すなわち本発明は以下のものに関する。
［１］ＣｕｅＯ、銅イオン、及び、酸化染料を含有するケラチン繊維染色用組成物。
［２］ＣｕｅＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するものである［１］記載のケラチン繊維染色用組成物。
［３］ＣｕｅＯは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むものである［１］記載のケラチン繊維染色用組成物。
［４］銅イオンは、２価の銅の無機塩である［１］〜［３］のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
［５］さらに、アルカリ性化合物を含有する［１］〜［４］のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
［６］ケラチン繊維が毛髪である［１］〜［５］のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
［７］酸素含有雰囲気下、ＣｕｅＯ及び銅イオンの存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることからなる、ケラチン繊維の染色方法。
［８］上記接触を、アルカリ条件下で行う［７］記載の染色方法。
以下に本発明を詳述する。
【００１５】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、酵素として、ＣｕｅＯを含有するものである。
本発明において、ＣｕｅＯとして、天然に由来するＣｕｅＯ（天然型ＣｕｅＯ）を使用してもよいし、天然型ＣｕｅＯの性能を維持している限り、天然型ＣｕｅＯに修飾を施した改変型ＣｕｅＯを使用してもよい。
【００１６】
ＣｕｅＯの由来は特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するものが好ましい。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、ＣｕｅＯをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される。
【００１７】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが産出する天然型ＣｕｅＯとしては、配列番号１で示した塩基配列によってコードされるアミノ酸配列から構成される、シグナルペプチドを含んだ未成熟ＣｕｅＯ、配列番号２で表されるアミノ酸配列から構成される、シグナルペプチドを含まない成熟ＣｕｅＯを挙げることができ、いずれも本発明において使用することができる。しかしながら、入手の容易さ及び酸化重合活性の観点から、成熟ＣｕｅＯを用いることが好ましい。
【００１８】
本発明で使用するＣｕｅＯは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むものが好ましい。具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列から構成される成熟ＣｕｅＯ、当該成熟ＣｕｅＯのＣ末端に対してヒスチジンタグを付加した、配列番号４で表されるアミノ酸配列から構成されるＣｕｅＯ、当該成熟ＣｕｅＯに対してその他の修飾を施したもの等を挙げることができる。上記修飾としてはＣｕｅＯの酵素活性を阻害しないものである限り特に限定されないが、例えば、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（商品名、ＩＢＡ社）、ＧＳＴタグ、ビオチン標識等を挙げることができる。
【００１９】
本発明で使用するＣｕｅＯを製造する方法としては特に限定されないが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の菌体を培養して産出させたＣｕｅＯを取得、精製する方法；ＣｕｅＯをコードする塩基配列をベクターに導入し、得られた発現ベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の菌体を形質転換し、得られた形質転換体を培養して産出させたＣｕｅＯを取得、精製する方法等を挙げることができる。
【００２０】
形質転換体を含む菌体が産出したＣｕｅＯを使用する場合には、精製された純粋なＣｕｅＯのほか、ＣｕｅＯを含む粗精製物を使用することも可能である。
【００２１】
本発明のケラチン繊維染色用組成物におけるＣｕｅＯの配合量は、使用するケラチン繊維の種類、染色時の条件、酸化染料の種類等に応じて種々調整することができ、特に限定されるものではないが、組成物全量１００重量部に対して、０．０００１〜１０重量部が好ましく、０．００１〜１重量部がより好ましい。
【００２２】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、ＣｕｅＯに加えて、銅イオンを含有する。ＣｕｅＯは銅イオンを配合しなくともいくつかの酸化染料の直接的酸化重合反応をある程度は触媒する能力を有するが、銅イオンを共存させることによって、広範な種類の酸化染料に対して、十分なケラチン繊維染色力を発揮することができるようになる。
【００２３】
本発明では、銅イオンとして、１価の銅塩又は２価の銅塩等を配合することができる。２価の銅塩としては特に限定されないが、例えば、硫酸銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、炭酸銅（ＩＩ）等の無機塩が挙げられる。１価の銅塩としては特に限定されないが、塩化銅（Ｉ）、シアン化銅（Ｉ）等の無機塩が挙げられる。なかでも、染色力の向上や人体に対する影響の観点から、２価の銅の無機塩が好ましく、硫酸銅がより好ましい。
【００２４】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における銅イオンの配合量は、十分な染色力を達成できる限り特に限定されないが、組成物全量１００重量部に対して、銅塩全体として０．０００１〜１重量部が好ましく、０．００１〜０．１重量部がより好ましい。また、ＣｕｅＯ１モルに対して０．００１〜１０００モルが好ましく、０．０１〜１００モルがより好ましい。
【００２５】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、酸化染料を含有する。酸化染料とは、酸化反応及び重合反応を経て発色することによって、染色を達成するものである。酸化染料には、それ自体が酸化重合して発色し得る「染料前駆体」と、当該染料前駆体と重合することによって種々の色調となる「カップラー」が含まれる。
染料前駆体には、オルト又はパラ体のフェニレンジアミン又はアミノフェノール等が含まれ、カップラーには、メタ体のフェニレンジアミン又はアミノフェノール等が含まれる。
【００２６】
酸化染料としては特に限定されないが、例えば、具体的には、パラフェニレンジアミン、カテコール、ピロガロール、没食子酸、レゾルシン、５−アミノオルトクレゾール、オルトアミノフェノール、メタアミノフェノール、パラアミノフェノール、２，６−ジアミノピリジン、５−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−２−メチルフェノール、Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシ）−パラフェニレンジアミン硫酸塩、パラニトロ−オルトフェニレンジアミン、パラニトロ−２′，４′−ジアミノアゾベンゼン・硫酸ナトリウム、トルエン−２，５−ジアミン、５−アミノオルトクレゾール・硫酸塩、パラアミノフェノール・硫酸塩、オルトクロロ−パラフェニレンジアミン・硫酸塩、４，４′−ジアミノジフェニルアミン・硫酸塩、パラメチルアミノフェノール・硫酸塩、パラフェニレンジアミン・硫酸塩、メタフェニレンジアミン・硫酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノキシエタノール・塩酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・塩酸塩、メタフェニレンジアミン・塩酸塩、２，４−ジアミノフェノール・塩酸塩、３，３′−イミノジフェノール、パラフェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−パラフェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−パラフェニレンジアミン・酢酸塩、１，５−ジヒドロキシナフタレン、トリレン−３，４−ジアミン、パラメチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ′−ビス（４−アミノフェニル）−２，５−ジアミノ−１，４−キノンジイミン、オルトアミノフェノール・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノール・硫酸塩、メタアミノフェノール・硫酸塩等を挙げることができる。以上に例示した化合物は、医薬部外品原料規格に収載されているものである。
【００２７】
本発明においては、酸化染料として、インドリン化合物や、インドール化合物を用いることもできる。
インドリン化合物としては特に限定されないが、例えば、インドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−ブチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドリン、６，７−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドロキシインドリン、４−メトキシ−６−ヒドロキシインドリン、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシインドリン、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドリン、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドリン、４−ヒドロキシプロピルインドリン、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシインドリン、５−ヒドロキシインドリン、７−ヒドロキシインドリン、７−アミノインドリン、５−アミノインドリン、４−アミノインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリンカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、これらの塩類等を挙げることができる。
【００２８】
インドール化合物としては特に限定されないが、例えば、４，５−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール、６，７−ジヒドロキシインドール、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドール、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドール、４−ヒドロキシプロピルインドール、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドール、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、７−アミノインドール、５−アミノインドール、４−アミノインドール、５，６−ジヒドロキシインドールカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール等を挙げることができる。
【００２９】
これらの酸化染料は単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよいが、好ましくは、染料前駆体に属する化合物のうち一種類又は複種類を用いるか、又は、染料前駆体に属する化合物のうち一種類又は複種類と、カップラーに属する化合物のうち一種類又は複種類とを組み合わせて用いる。
【００３０】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における酸化染料の配合量としては特に限定されず、好適な染色能力を発揮することができるよう適宜調整すればよいが、例えば、組成物全量に対して０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の配合量を例示することができる。
【００３１】
本発明のケラチン繊維染色用組成物には、酸化染料以外に、直接染料を配合することによって、得られる色調を調整することができる。
直接染料としては特に限定されないが、例えば、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、１−アミノ−４−メチルアミノアントラキノン、ニトロ−パラフェニレンジアミン・塩酸塩、１，４−ジアミノアントラキノン、ニトロ−パラフェニレンジアミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、２−アミノ−５−ニトロフェノール・硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ−パラフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ−オルトフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ−メタフェニレンジアミン・硫酸塩、ナチュラルオレンジ６（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルー、エバンスブルー、アシッドブルー８０等を挙げることができる。
【００３２】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における直接染料の配合量としては特に限定されず、所望の色調に応じて種々調整することができるが、例えば、組成物全量に対して０．０１〜２０重量％の配合量を例示することができる。
【００３３】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、さらに、アルカリ性化合物を含有することが好ましい。ＣｕｅＯは弱酸性〜アルカリ条件でその酵素能力を発揮するものであるが、至適ｐＨをアルカリ領域に有しているために、アルカリ性化合物の配合によって、本発明の組成物をアルカリ性にすることが、染色能力の観点から好ましい。組成物をアルカリ性にすることによって、ケラチン繊維が膨潤し、染料が毛髪内に浸透、沈着することから染色効果を向上させることができる。
【００３４】
本発明のケラチン繊維染色用組成物に配合できるアルカリ性化合物としては特に限定されないが、一般に染色剤に配合することができるものを使用することができ、例えば、モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン等のアミン化合物、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸アンモニウム等の無機化合物等を挙げることができる。
【００３５】
本発明のケラチン繊維染色用組成物におけるアルカリ性化合物の配合量としては特に限定されず、所望のｐＨ（好ましくはｐＨ７．５〜１０．５）を達成できる量を適宜配合すればよい。例えば、組成物全量に対して、０．１〜２０重量％の配合量を例示することができる。なお、本発明において、アルカリ性化合物は、１種類のみを配合してもよいし、２種類以上を配合してもよい。
【００３６】
本発明のケラチン繊維染色用組成物には、上記の各成分のほか、種々の成分を配合することができる。特に限定されないが、具体的には、チオ乳酸、亜硫酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等の還元剤、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、香料等を挙げることができる。
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、銅イオンを配合するため、当該銅イオンが溶解するよう、水溶液とすることが好ましい。
【００３７】
本発明の組成物はケラチン繊維を染色するためのものであるが、上記ケラチン繊維には、ヒト等の哺乳動物の毛髪のほか、各種繊維が含まれる。繊維としては特に限定されないが、天然繊維、合成繊維のいずれでもよく、例えば、綿、ジアセテート、亜麻、リンネル、リオセル、ポリアクリル、ポリアミド、ポリエステル、ラミー、レーエン、テンセル、トリアセテート、毛皮、獣皮、皮革、絹、ウール等を挙げることができる。繊維の形態としても特に限定されず、布帛、糸、衣料、フィルム等、いずれの形態であってもよい。
【００３８】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、無酸素雰囲気下で上記各成分を混合して、無酸素雰囲気下の容器内に収容することにより、一剤型の組成物として調製することができる。
さらに、本発明のケラチン繊維染色用組成物は、ＣｕｅＯと銅イオンを含む第一組成物と、酸化染料を含む第二組成物からなる二剤型の組成物として調製することもできる。この場合には、各成分の混合及び保存を無酸素雰囲気下で行う必要はない。
【００３９】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、一剤型の組成物の場合には、ケラチン繊維に直接適用することによって、二剤型の組成物の場合には、２つの組成物を混合した後直ちにケラチン繊維に適用することによって、簡便に、効率よく、ケラチン繊維の染色を達成することができる。
【００４０】
本発明のケラチン繊維染色方法は、酸素含有雰囲気下、ＣｕｅＯ及び銅イオンの存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることからなる。酸素含有雰囲気とは、特に限定されないが、通常、空気でよい。接触時の温度は特に限定されないが、１０〜１００℃程度が好ましい。毛髪に適用する場合には、人体に対する影響の観点から、２０〜４０℃程度がより好ましい。
【００４１】
ＣｕｅＯは弱酸性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を発揮するので、上記接触は弱酸性〜アルカリ条件（例えば、ｐＨ６〜１１）下で好適に行うことができるが、ＣｕｅＯは至適ｐＨをアルカリ領域に有するので、上記接触は中性〜アルカリ条件下（好ましくはｐＨ７．５〜１０．５）でより好適に行うことができる。本発明の染色方法に関する詳細は、本発明の組成物について上述したものと同様である。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、上述の構成よりなるので、過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して酸化染料の酸化重合反応が効率よく進行し、一剤型とすることが可能なケラチン繊維染色用組成物であって、アルカリ条件を含む幅広いｐＨ領域での効率的なケラチン繊維の染色が可能で、かつ、直接染料の調色能を害することがなく、幅広い領域での温度及びｐＨにおいて安定なケラチン繊維染色用組成物、並びに、上記酵素を利用したケラチン繊維染色方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
製造例１
ＣｕｅＯの製造と精製
以下では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）をホストにＣｕｅＯの同種発現を行うことによって、ＣｕｅＯを大量に調製した。天然型ＣｕｅＯとの区別及び精製を簡便にすることを目的に、天然型の成熟ＣｕｅＯのＣ末端に対してヒスチジンタグを付加した、配列番号４で表される改変型ＣｕｅＯを作製した。
【００４４】
（１）発現ベクターの作成
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲ法によりＣｕｅＯ遺伝子を増幅した。増幅には、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、以下に示すＰＣＲ反応液を用いた。
N-EcoRI:
5'-gaagaattcatgcaacgtcgtgatttcttaaaat-3'（配列番号５）
（４〜９位のgaattcがＥｃｏＲＩ認識部位である。）
3'-His-Bam:
5'-ttggatccttaatgatgatgatgatgatggcctaccgtaaaccctaac-3'（配列番号６）
（３〜８位のggatccがＢａｍＨＩ認識部位であり、１２〜２９位のatgatgatgatgatgatgがヒスチジンタグをコードする配列である。）
【００４５】
ＰＣＲ反応液
Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ） １μｌ
プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） 各１μｌ
ＰＣＲ緩衝液（Ｘ１０） ５μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ．（２５ｍＭ） ４μｌ
ジメチルスルホキシド ２．５μｌ
精製水 ３５．２５μｌ
Ｔａｋａｒａ ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２５μｌ
【００４６】
増幅した１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同様に消化したプラスミドベクターｐＵＣ１８に連結した。ベクター中に、配列番号３で表される塩基配列を確認した。得られた発現ベクターをｐＵＣ−ＣｕｅＯとする。
【００４７】
（２）形質転換体の作製
ｐＵＣ−ＣｕｅＯによって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を常法に従って形質転換した。得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ−ＣｕｅＯとする。
【００４８】
（３）形質転換体の培養
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ−ＣｕｅＯを以下の二段階で培養してＣｕｅＯを発現させた。
３−１．前培養（試験管）
０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地４ｍＬ中、３７℃で、Ｏ／Ｎ好気培養を行った。
３−２．本培養（２Ｌバッフル付三角フラスコ）
１ｍＭのＣｕＣｌ２、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加した４００ｍＬの上記培地中、３２℃で、１２時間好気培養を行った。
その後、遠心分離により集菌し、０．８５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、直ちに以下のオスモティックショックを行った。
【００４９】
（４）ＣｕｅＯの精製
４−１．オスモティックショック
菌体を、氷冷した２０％ショ糖、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離にかけ菌体を回収した。
次に、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷蒸留水に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離にかけ上清を回収した。これを粗酵素液とした。
【００５０】
４−２．ＩＭＡＣ
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液で平衡化したＢＤ ＴＡＬＯＮカラム（４０ｍＬ）に粗酵素液を重層し、同緩衝液で洗浄した。
１５０ｍＭイミダゾールを含む同緩衝液で、吸着したＣｕｅＯを溶出させた。溶出画分は濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対し透析した。
【００５１】
４−３．陰イオン交換クロマトグラフィー
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＢＩＯ−ＲＡＤ ＵｎｏＱ−１２カラム（１２ ｍＬ）に試料を重層し、同緩衝液で洗浄した（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）。
同緩衝液を用いた０−１Ｍ塩化カリウム水溶液の直線濃度勾配（１２０ｍＬ）により、吸着したＣｕｅＯを溶出させた。活性画分を回収し濃縮した。
【００５２】
４−４．ゲルろ過クロマトグラフィー
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲ１０／３０カラム（２４ｍＬ）に試料を重層し、同緩衝液で展開した（流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）。活性画分を回収し、ＣｕｅＯ水溶液とした。
このようにして得られたＣｕｅＯ水溶液を以下の試験例及び実施例で使用した。
【００５３】
試験例１
ラッカーゼの代表的な基質に対するＣｕｅＯの酸化重合活性の評価
（１）基質溶液の調製
２，６−ジメトキシフェノール、パラフェニレンジアミン、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、２−メトキシフェノール、カテコールはそれぞれ、イオン交換蒸留水に溶解し、５０ｍＭ水溶液とした。
４−ヒドロキシインドール、パラアミノフェノールはそれぞれ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液とした。
【００５４】
オルトアミノフェノールはＤＭＳＯに溶解した後、イオン交換蒸留水に溶解して５０ｍＭＤＭＳＯ（１０％）−水溶液とした。
１−ニトロソ−２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム（ＮＮＳ）はイオン交換蒸留水に溶解し、５ｍＭ水溶液とした。
ビリルビンはＤＭＳＯに溶解し、０．５ｍＭ ＤＭＳＯ溶液とした。
シリンガルダジンはエタノールに溶解し、５ｍＭエタノール溶液とした。
Ｌ−チロシンは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解して、１ｍＭ溶液とした。
【００５５】
（２）活性測定方法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
ＮＮＳ、ビリルビン以外の基質については、キュベット（１．５ｍＬ ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、基質溶液０．１ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表１に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。
【００５６】
銅添加の影響については、０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬの代わりに、０．１Ｍ緩衝液０．８６ｍＬ、及び、５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０２ｍＬを加える以外は同様の操作を行った。
【００５７】
ＮＮＳ、ビリルビンについては、キュベット（１．５ｍＬ ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．９６ｍＬと、基質溶液０．０２ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表１に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。
銅添加の影響については、０．１Ｍ緩衝液０．９６ｍＬの代わりに、０．１Ｍ緩衝液０．９４ｍＬ、及び、５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０２ｍＬを加える以外は同様の操作を行った。
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）とする。なお、上述のとおり測定した３０秒間の吸光度変化を、１分間の吸光度変化に換算して表す（以下、同様）。ＣｕｅＯ水溶液中のタンパク質濃度を、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を標準タンパク質として、Ｌｏｗｒｙ法により定量した。ＣｕｅＯ水溶液中のタンパク質１ｍｇあたりの活性を、比活性（Ｕ／ｍｇ）とする。得られた結果を以下の表１に示した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
以上の結果から、ＣｕｅＯは、銅イオンと共存させることによって、ジアミン化合物、フェノール化合物、及び、アミノフェノール化合物を効率よく酸化重合する能力を発揮することが分かった。
【００６０】
試験例２
種々の基質に対するＣｕｅＯの酸化重合活性の評価
（１）基質溶液の調製
表２に示す各基質をＤＭＳＯに溶解した後、イオン交換蒸留水に溶解して、１ｍＭ ＤＭＳＯ（１．０％）水溶液とした。
【００６１】
（２）活性測定法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
キュベット（１．０ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、基質溶液０．１ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表２に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。
【００６２】
銅添加の影響については、０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬの代わりに、０．１Ｍ緩衝液０．８６ｍＬ、及び、５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０２ｍＬを加える以外は同様の操作を行った。
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）とする。ＣｕｅＯ水溶液中のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準タンパク質として、Ｌｏｗｒｙ法により定量した。ＣｕｅＯ水溶液中のタンパク質１ｍｇあたりの活性を、比活性（Ｕ／ｍｇ）とする。得られた結果を以下の表２に示した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
以上の結果から、ＣｕｅＯは、銅イオンと共存させることによって、オルト位又はパラ位のジアミン化合物、フェノール化合物、及び、アミノフェノール化合物を効率よく酸化重合する能力を発揮することが分かった。また、ナフトール化合物、及び、インドール化合物についても、効率よく酸化重合する能力を発揮することが分かった。
【００６５】
試験例３
ＣｕｅＯの酸化重合活性のｐＨ依存性の評価
パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性のｐＨ依存性を以下の手順で評価した。
キュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中で、ｐＨ２〜１２の範囲のいずれかのｐＨ値を示す２００ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液１．７８ｍＬと、１００ｍＭ パラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、得られた種々のｐＨ値を示す混合物について、０〜３０秒後までの４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００６６】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうちｐＨ８．１７及び８．４２での活性を１００として、酸化重合反応時の各ｐＨ値に関して相対活性（％）を図１に示した。
図１より、ＣｕｅＯがおよそｐＨ６〜１０という弱酸性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を示し、ＣｕｅＯの至適ｐＨは８〜８．５であることが分かった。
【００６７】
試験例４
ＣｕｅＯの酸化重合活性の温度依存性の評価
パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性の温度依存性を以下の手順で評価した。
キュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中で１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．９３ｍＬと、４００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．０５ｍＬとを混合し、種々の温度条件（３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０及び７５℃）でプレヒートした後、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、得られた各混合物について、０〜３０秒後までの４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００６８】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち７５℃での活性を１００として、酸化重合反応時の各温度に関して相対活性（％）を図２に示した。
以上の結果から、高温になるほどＣｕｅＯの酸化重合活性が上昇し、広範な温度範囲で十分な酸化重合活性を示すことが分かった。
【００６９】
試験例５
ＣｕｅＯの直接染料分解活性の評価
種々の直接染料に対するＣｕｅＯの分解活性を以下の手順で評価した。
（１）染料溶液の調製
ナチュラルオレンジ６（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルー、エバンスブルー、アシッドブルー８０をそれぞれ、イオン交換蒸留水に溶解して、０．２ｍｇ／ｍＬ水溶液とした。
【００７０】
（２）活性測定方法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、又は、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を使用した。
キュベット（１．５ｍＬ ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、染料溶液０．１ｍＬとを混合し、ＣｕｅＯ水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０、１及び２時間後の波長３００〜７００ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
【００７１】
銅添加の影響については、０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬの代わりに、０．１Ｍ緩衝液０．８６ｍＬ、及び、５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０２ｍＬを加える以外は同様の操作を行った。
各染料について、極大を示す波長における、混合直後（０時間）から２時間後までの吸光度の変化量を、以下の表３に示した。
【００７２】
【表３】
【００７３】
以上の結果から、ＣｕｅＯが、各ｐＨ条件下で直接染料を分解する活性を有しないことが分かった。
【００７４】
試験例６
ＣｕｅＯのｐＨ安定性の評価
種々のｐＨ条件でＣｕｅＯを前処理した後に、パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性を測定することにより、ＣｕｅＯのｐＨ安定性を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ＣｕｅＯ水溶液を、ｐＨ２〜１２の範囲のいずれかのｐＨ値を示す２００ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に希釈して、１時間インキュベートすることにより、前処理を行った。
【００７５】
次いで、前処理後の混合物０．１５ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．６５ｍＬと、１００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとをキュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後までの４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００７６】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうちｐＨ９．６５で前処理した場合の活性を１００として、前処理時の各ｐＨについて相対活性（％）を図３に示した。
以上の結果から、ＣｕｅＯが、ｐＨ２〜１２と幅広いｐＨ領域において十分な酸化重合活性を保持しており、ｐＨ安定性に優れていることが分かった。
【００７７】
試験例７
ＣｕｅＯの熱安定性の評価
種々の温度条件でＣｕｅＯを前処理した後に、パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性を測定することにより、ＣｕｅＯの熱安定性を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ＣｕｅＯ水溶液を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に希釈して、種々の温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０℃）で３０分間インキュベートすることにより、前処理を行った。
【００７８】
次いで、前処理後の混合物を氷冷し、当該混合物０．０２ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．７８ｍＬと、１００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとをキュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後での４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００７９】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち５０℃で前処理した場合の活性を１００として、前処理時の各温度に関して相対活性（％）を図４に示した。
以上の結果から、ＣｕｅＯが、２０〜６０℃と幅広い温度領域において十分な酸化重合活性を保持しており、熱安定性に優れていることが分かった。
【００８０】
試験例８
ＣｕｅＯの熱安定性の経時的変化の評価
６０℃で適当な時間ＣｕｅＯをインキュベートした後に、パラフェニレンジアミンを基質として用いてＣｕｅＯの酸化重合活性を測定することにより、ＣｕｅＯの熱安定性の経時的変化を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ＣｕｅＯ水溶液を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に希釈して、６０℃で適当な時間（０分間、３０分間、６０分間、９０分間又は１２０分間）インキュベートすることにより、前処理を行った。
【００８１】
次いで、前処理後の混合物を氷冷し、当該混合物０．０２ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．７８ｍＬと、１００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとをキュベット（３ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後の４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。
【００８２】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１単位（U）として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち前処理をしていない場合（０分間）の活性を１００として、前処理時の各処理時間における相対活性（％）を図５に示した。
以上の結果から、ＣｕｅＯの加熱によってＣｕｅＯの酸化重合活性が経時的に減少すること、及び、６０℃におけるＣｕｅＯの酸化重合活性の半減期がおよそ３９分であることが分かった。
【００８３】
実施例１及び比較例１
本発明の組成物によるケラチン繊維の染色
（１）染色基剤の調製
パラフェニレンジアミン０．５ｇ、ヒドロキシエチルセルロース０．７５ｇ、ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油（ＨＣ−２０）１．０ｇ、及び、乳酸０．５ｇを混合し、モノエタノールアミンでｐＨを９．０に調整して、イオン交換蒸留水で重量を５０ｇに調製した。
【００８４】
（２）染色試験
実施例１では、前記染色基剤２ｇ、ＣｕｅＯ水溶液（４Ｕ相当量）及び５０ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液０．０４ｍＬを混合し、得られた混合物をヒト白髪毛束１ｇと羊毛布１枚（２×３ｃｍ）とに対して塗布した。塗布後のヒト白髪毛束および羊毛布のそれぞれを、３０℃で３０分間保持した。
比較例１では、前記染色基剤２ｇとＣｕｅＯ水溶液（４Ｕ相当量）を混合することにより得られた混合物を用いたこと以外は同様に行った。
コントロールでは、ＣｕｅＯ水溶液も硫酸銅水溶液も添加せずに前記染色基剤を直接塗布すること以外は同様に行った。
なお、上記の単位Ｕは、１ｍＭの硫酸銅共存下、５ｍＭパラフェニレンジアミンを基質として用い、ｐＨ９．０において、４８７ｎｍの吸光度を１分間で１変化させるＣｕｅＯ量を表す。
【００８５】
（３）色差測定
染色前のヒト白髪毛束及び染色されたヒト白髪毛束について、色差計（ミノルタ社製、商品名：Ｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ ＣＭ−３６１０ｄ）を用いて、Ｌ値、ａ値、ｂ値を測定した。次いで、前記Ｌ値、ａ値、ｂ値に基づき、下記式（１）により、ΔＥ値を算出した。結果を以下の表４に示した。
なお、前記ΔＥ値は、染色前の色調と染色後の色調との色差を示しており、数値が高いほど染色力が高いことを示す。
【００８６】
【数１】
【００８７】
【表４】
【００８８】
以上の結果より、ＣｕｅＯと銅イオンとを併用することによって、高い染色効果を達成できることが示された。
尚、市販のヘアマニキュアのΔＥ値はおよそ４０であるため、以上の結果によって、本発明の組成物が毛髪の染色に好適に使用できることが示された。
【００８９】
調剤例
以下に、本発明のケラチン繊維染色用組成物の調剤例を示す。以下の組成物は、白髪の毛髪に適用すると、白髪を目立たなく染色することができるものである。なお、配合量は重量％で示す。
調剤例１（ジェルタイプ）
パラフェニレンジアミン １．５
レゾルシン ０．３
メタアミノフェノール ０．１
ＣｕｅＯ水溶液 ０．１
硫酸銅 ０．０１
アスコルビン酸ナトリウム １．０
ヒドロキシエチルセルロース １．０
クエン酸 適量
モノエタノールアミン ｐＨ７．５に調整
精製水 残部
合 計 １００．０
【００９０】
調剤例２（クリームタイプ）
パラフェニレンジアミン １．０
パラアミノフェノール ０．８
メタアミノフェノール ０．１
セタノール ６．０
ＣｕｅＯ水溶液 ０．０５
硫酸銅 ０．０５
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル ４．０
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム １．０
Ｌ−システイン塩酸塩 ０．２
クエン酸 適量
モノエタノールアミン ｐＨ９．５に調整
精製水 残部
合 計 １００．０
【００９１】
調剤例３（クリームタイプ）
５，６−ジヒドロキシインドリン １．０
５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸 ０．５
オルトアミノフェノール ０．５
エタノール ５．０
ステアリルアルコール １．５
ＣｕｅＯ水溶液 ０．２
硫酸銅 ０．０３
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油 ３．０
ポリグリセリン脂肪酸エステル ４．０
Ｎ−アセチルシステイン ０．１
キサンタンガム ０．５
アキュリン（登録商標）２２ ０．１
ヒドロキシエチルセルロース ０．１
モノイソプロパノールアミン 適量
モノエタノールアミン 適量
精製水 残部
合 計 １００．０
【００９２】
調剤例４（エアゾールタイプ）
トルエン−２，５−ジアミン １．５
パラアミノフェノール ０．２
レゾルシン ０．１
メタアミノフェノール ０．１
ポリオキシエチレン（５）セチルエーテル ２．０
プロピレングリコール ５．０
亜硫酸ナトリウム ０．３
モノエタノールアミン 適量
クエン酸 適量
ＣｕｅＯ水溶液 ０．３
硫酸銅 ０．０５
液化石油ガス ４．０
精製水 残部
合 計 １００．０
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、ケラチン繊維の染色を、過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して、簡便にかつ効率よく、アルカリ条件下においても行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】試験例３でＣｕｅＯの酸化重合活性のｐＨ依存性を評価した結果を示すグラフ
【図２】試験例４でＣｕｅＯの酸化重合活性の温度依存性を評価した結果を示すグラフ
【図３】試験例６でＣｕｅＯのｐＨ安定性を評価した結果を示すグラフ
【図４】試験例７でＣｕｅＯの熱安定性を評価した結果を示すグラフ
【図５】試験例８でＣｕｅＯの熱安定性の経時的変化を評価した結果を示すグラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｕｅＯ、銅イオン、及び、酸化染料を含有することを特徴とするケラチン繊維染色用組成物。
【請求項２】
ＣｕｅＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するものである請求項１記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項３】
ＣｕｅＯは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むものである請求項１記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項４】
銅イオンは、２価の銅の無機塩である請求項１〜３のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項５】
さらに、アルカリ性化合物を含有する請求項１〜４のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項６】
ケラチン繊維が毛髪である請求項１〜５のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項７】
酸素含有雰囲気下、ＣｕｅＯ及び銅イオンの存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることを特徴とする、ケラチン繊維の染色方法。
【請求項８】
上記接触を、アルカリ条件下で行う請求項７記載の染色方法。
【請求項１】
ＣｕｅＯ、銅イオン、及び、酸化染料を含有することを特徴とするケラチン繊維染色用組成物。
【請求項２】
ＣｕｅＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するものである請求項１記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項３】
ＣｕｅＯは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むものである請求項１記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項４】
銅イオンは、２価の銅の無機塩である請求項１〜３のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項５】
さらに、アルカリ性化合物を含有する請求項１〜４のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項６】
ケラチン繊維が毛髪である請求項１〜５のいずれかに記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項７】
酸素含有雰囲気下、ＣｕｅＯ及び銅イオンの存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることを特徴とする、ケラチン繊維の染色方法。
【請求項８】
上記接触を、アルカリ条件下で行う請求項７記載の染色方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−１１２７９２（Ｐ２００７−１１２７９２Ａ）
【公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５４６３５（Ｐ２００６−２５４６３５）
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]