タンシンの根から単離の認知障害治療予防用タンシノン含有組成とその使用
本発明はタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を含む組成で、ベータアミロイドの凝集と毒性に対して強力な阻害効果を示し、Ｙ字型迷路研究と受動回避研究で確認した記憶学習障害の回復活性を示す組成に関する。それ故認知機能障害を治療予防する治療薬又は健康食品として、安全に使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は認知障害症の予防治療活性を示すタンシン（Salviae Milltiorrhizae）画分含有組成と、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命現象の制御で主要な役割を果たす脳と脊髄からなる中枢神経系（ＣＮＳ）は、感覚運動や（不）随意運動から思考、記憶、運動、言語などに通じる人機能の全てを管理する必須器官である。従って脳卒中、外傷などに起因する神経細胞の急速進行性アポトーシスと同様に、老年認知症、例えばアルツハイマー病又はパーキンソン病などに起因するＣＮＳに現れる変性疾患のような緩徐進行性アポトーシスにより、神経回路網の不可逆な機能障害をもたらし、ついには人機能の永久的不全を生じる。中でも代表的な老年認知症であるアルツハイマー病を患う患者は、寿命の延長と近代的福祉施設の両者に比例して増加した。韓国保健社会福祉研究所（Korea Institute for Health and Social Affair）による公的調査によると、韓国人の中での老人の割合は、２０００年には７％を越し８．３％（３，９７０、０００人）に達し、２０１９年には１４．４％に近づくはずである。特に老年認知症を患う６５才以上の患者の割合は、韓国では８．２％になると推定される。欧米の国々では、６５才以上の患者では約１０％が、８０才以上の患者では約４０−５０％が、老年認知症を患う。５００万人以上の患者がこの疾患を患っているので、これにより生ずる医療費は一年に１０００億ドルと推定される。韓国では２０万人以上の人が認知症を患っていることが分かった。米国では２０３０年には現在の患者数の二倍以上に、２０５０年には１４００万人（３５０％以上）に増加すると推定された。
【０００３】
認知機能障害が始まるアルツハイマー病は、人間性の破綻を生ずる長期変性疾患の一つであるので、現在まで有効な予防薬、例えば、アリセプト（商標名）（Aricept）（ファイザー社（Pfizer Co.））、エクセロン（商標名）（Exelon）（ノバルティス社（Novartis Co.））、ライミニル（商標名）（Reiminyl）（ヤンセンファーマ社）（Janssen Co.））のようなアセチルコリンエステラーゼ阻害薬、又はエビキサ（商標名）（Ebixa）（ルンドベック社（Lundbeck Co.））のようなＮ−メチルーＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニストの開発が試みられた。しかしアセチルコリンエステラーゼ阻害薬は、認知能力低下を緩和するだけで、この疾患の病原学的原因を満足できるようには治療できなかった。これらの薬はいくらかの患者（約４０−５０％）に一時的な緩和効果を示すにすぎず、長期にはその有効性を維持できず、更には長期治療では、肝毒性、嘔吐、食欲不振のような種々の有害な応答を示す。従って現在この疾患を予防治療する新規治療薬開発の緊急な必要性がある。多数の多国籍製薬会社により大規模な開発投資がなされ、特にアルツハイマー病の病原学的因子と推定される約４０のアミノ酸からなるベータアミロイドの再生量を低下するベータセクレターゼ阻害薬、又はガンマセクレターゼ阻害薬の開発に焦点が合わされた。韓国ではアルツハイマー病の基礎研究は活発に試みられたが、アルツハイマー治療薬の開発は現在まで僅かにすぎない。ガンマセクレターゼ阻害薬の開発で毒性と大いに関連することが、動物モデル試験と同様に臨床試験でも見いだされているので、この阻害薬は推奨できないことが証明されたが、ベータセクレターゼ阻害薬の開発が推奨できることが、遺伝子欠如の形質転換動物モデル試験で証明された。又ベータアミロイド凝集が関与する因子に標的を合わすことは、安全な手段と見なされる。米国のアクソニックス社（Axonyx Co.）が開発した“フェセリン”（Phenserine）は、第二相臨床試験が進行中であると報告されており、コリンエステラーゼ阻害と同様にベータアミロイド凝集阻害の二重活性を示す（グリーグら（Greig et al.）、ジャーナルオブメディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、４４巻、４０６２−４０７１頁、２００１年、www.medicalnewstoday.com, www.alzforum.org/drg/drc）。
【０００４】
ベータアミロイドを用いるワクチン開発は、他の可能な方法として知られている。エラン社（Elan Co.）によるワクチンの連続研究の進展は、臨床試験中の脳炎のような予期しない有害応答により失敗したと報告された。しかしベータアミロイドワクチンは、動物モデル試験では認知機能を緩和し、脳細胞の活性と同様に損傷脳神経細胞の活性を改善し、アルツハイマー症候群を緩和することが報告された（ジェナスら（Janus et al.）、ネーチャー（Nature）、４０８巻、９７９−９８２頁、２０００年；モーガンら（Morgan et al.）、ネーチャー（Nature）、４０８巻、９８２−９８５頁、２０００年）。
【０００５】
タンジン（シソ科）抽出物は、種々の疾患、例えば腹痛、外傷、不眠症、発疹などが治療でき、アビエチン系化合物に属する幾つかのジテルペンキニーネ色素、例えばタンシノンＩ、ジヒドロタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩＩＢ、メチレンタンシノンなどを含有する（イルムーチェンら（Il-Moo Chang et al.）、オリエンタルメディシンアンドメディカルサイエンスエンサイクロペディア（Oriental Medicine and Medical Science Encyclopedia）、ソウルナショナルユニバーシティ（Seoul National University）、２００３年）。
【０００６】
又タンジン（シソ科）の薬理活性、例えば抗酸化活性（ユンファキム（Yun-Hwa Kim）、コリアンジャーナルオブソサエティオブフッドクッカリーサイエンス（Korean J. Soc. Food Cookery Sci.）、１９巻、４頁、２００３年）、抗ガン活性（オクヒーキム（Ok-Hee Kim）、ジャーナルオブアプライドファルマコロジー（The Journal of Applied Pharmacology）、７巻、２９−３４頁、１９９９年）、血圧低下効果（韓国特許１０−０３２７８９４）などが報告されている。しかしタンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類の認知機能障害に対する治療効果については、上記文献のいずれにも報告も開示もされていないが、その開示はここに文献として組み入れる。
【０００７】
タンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類の認知機能障害に対する阻害効果を、既に周知のスクリーニング検査により調査するために、本発明の本発明人らは、ベータアミロイド凝集の強力な阻害効果を示す種々の植物を広範囲に選別し、受動回避試験などを用いて記憶学習回復の研究を検査し、タンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類が、ベータアミロイド凝集と細胞毒性を阻害することで神経細胞増殖を刺激し、更には神経細胞損傷に起因する記憶学習損傷を回復することを確認して本発明をついに完成した。
【０００８】
本発明のこれらと他の目的は、以下に与える本発明の詳細な説明で明らかになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って本発明の目的は、神経細胞の増殖を刺激し、更には神経細胞損傷に起因する記憶学習損傷を回復できるベータアミロイド凝集と細胞毒性に関する機構により、認知機能障害を治療予防するために、有効成分としてタンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだ有効量のタンシノン化合物類を含む医薬組成を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に従い認知機能障害を治療予防するために、有効成分として有効量のタンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を含む医薬組成が提供される。
【００１１】
化学式１
【００１２】
ミルチロン
【００１３】
化学式２
【００１４】
１，２−ジジヒドロミルチロン
【００１５】
化学式３
【００１６】
タンシノンＩＩＡ
【００１７】
化学式４
【００１８】
タンシノンＩ
【００１９】
化学式５
【００２０】
ジヒドロイソタンシノンＩ
【００２１】
具体的には本発明は、認知機能障害を治療予防するために、有効成分としてタンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類と、医薬的に容認の担体、希釈剤又はアジュバントとを含む医薬組成を提供する。
【００２２】
本発明の目的は、タンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだ有効量のタンシノン化合物類を、その中に医薬的に容認の担体と一緒に哺乳類に投与することを含む、該哺乳類の認知機能障害を治療又は予防する方法を提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、認知機能障害の治療予防用治療薬の製造に、タンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類の使用を提供することである。
【００２４】
ここで開示の“認知機能障害”という用語は、アルツハイマー型認知症、脳血管障害型認知症、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、頭部損傷に起因する認知症、パーキンソン病などを含み、好ましくはパーキンソン病を含む。
タンジンから単離した発明性のタンシノン化合物類は、以下の好ましい実施形態に従い生成できる。
【００２５】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２６】
タンジンから単離した発明性のタンシノン化合物類は、以下の方法で詳細に生成できる。
【００２７】
タンジンから単離した発明性のタンシノン化合物類は、以下からなる段階を含む方法により生成できる。第一段階で、０．１乃至０．２倍容積のメタノールをタンジンの乾燥地下茎に添加し、還流抽出又は超音波抽出による抽出法で抽出し、溶液をろ過に付し上澄み液を得、３５乃至４５℃範囲の温度でロータリーエバポレーターにより濃縮し、乾燥してタンジンの乾燥粗抽出粉末を得る。第二段階で、該粗抽出物を蒸留水に懸濁し、それにジエチルエーテルを加え、混合と分別を３乃至６回行いタンジンのジエチルエーテル可溶画分を得る。このジエチルエーテル可溶抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０−２３０メッシュ）で溶出溶媒の極性を増加しながら溶媒混合物（ヘキサン：酢酸エチル）による溶出を繰り返し、本発明のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩを得る。又上記方法を改良するか、又は更なる段階に付し、技術的に周知の在来法、例えば文献に開示の方法（ハルボーン、ジェイビー（Harborne, J.B.）、植物化学物質法：植物分析の近代技法ガイド（Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis）、第３版、６−７頁、１９９８年）によりより強力な画分又は化合物に分別単離しても良い。
【００２８】
本発明の別様態に従うと、認知機能障害を治療予防するために、活性成分として有効量の上述の生成法で生成したタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を含む医薬組成を提供する。
【００２９】
本発明の目的は、上述の生成法で生成したタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだ有効量のタンシノン化合物類を、その中に医薬的に容認の担体と一緒に哺乳類に投与することを含む該哺乳類の認知機能障害を治療又は予防する方法を提供することである。
【００３０】
本発明の目的は、認知機能障害の治療予防用治療薬の製造に、上述の生成法で生成したタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類の使用を提供することである。
【００３１】
本発明の医薬組成は、組成全重量に基づいて約０．０１−５０重量％の上記抽出物を含有できる。
【００３２】
認知機能障害に対するタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物の阻害効果を判定するための種々のスクリーニング検査から、タンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類が、ベータアミロイドの凝集と同様にベータアミロイドに起因する毒性と細胞アポトーシスを阻害して、神経細胞増殖を刺激し、更には神経細胞損傷に起因する記憶学習損傷を回復することが確認された。
【００３３】
認知機能障害の治療予防のための発明性の組成は、その組成の全重量に基づいて上記化合物を０．０１−５０重量％含有できる。
【００３４】
発明性の組成は更に技術的に周知の使用法に従い在来の担体、アジュバント又は希釈剤を含有できる。該担体は、使用応用法に従い適切な物質を使用するのが好ましいが、限定はされない。適切な希釈剤はレミントン薬学科学（Remington's Pharmaceutical Science）（マック出版社（Mack Publishing Co.）、イートン（Eaton）、ペンシルバニア州（PA））の文書テキストに記載されている。
【００３５】
下文の以下処方の方法と賦活剤類は、範例にしかすぎずこの発明を決して制限するものではない。
【００３６】
本発明に従う組成は、医薬的に容認の担体、アジュバント又は希釈剤、例えばラクトース、右旋糖、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン類、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油含有の医薬組成として提供できる。処方類は更に、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤及び類似体を含んでも良い。この発明の処方は、技術的に周知の方法のいずれかを用いて患者に投与後、活性成分の急速放除、持続的放除又は遅延放除が提供されるように処方できる。
【００３７】
例えば本発明の化合物類は、油類、プロピレングリコール、又は通常注入を実現するのに用いる溶剤に溶解できる。担体の適切例としては、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピルなどが挙げられるが、これらに限定はされない。局所投与用には、本発明の抽出物は軟膏とクリーム形状に処方できる。
本組成含有の医薬処方類は、経口投薬形状（粉末剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、水薬、シロップ剤、エリキシル薬、粉末剤、小袋、顆粒）、又は局所調剤（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、芳香軟膏、パッチ、ペースト、噴霧溶液、エアロゾル及び類似体）、又は注入可能調剤（溶液、懸濁液、エマルジョン）のような任意の形状で調剤できる。
【００３８】
医薬投薬形状の本発明の組成は、その医薬的容認の塩類形状で使用でき、単独又は他の医薬活性化合物との適切な関連、又は組み合わせで使用できる。
【００３９】
発明性化合物又は組成の望ましい用量は、被験者の健康状態と体重、重症度、薬剤形状、投与経路と期間により変わり、当業者により選択できる。しかし好ましい効果を得るには、通常本発明の発明性抽出物又は化合物類は、体重ｋｇ／一日当たり１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１乃至３ｇ／ｋｇの範囲の量を投与することが推奨される。この用量を一日に一回又は数回に分けて投与できる。組成に関しては、発明性化合物の量が、組成全重量に基づいて０．０１乃至５０重量％、好ましくは０．５乃至４０重量％存在する必要がある。
【００４０】
本発明の医薬組成は、種々の経路を通して哺乳類（ラット、マウス、家畜又は人）のような対象動物に投与できる。全様式の投与が意図され、例えば投与は、経口、経直腸、静脈内注入、筋肉内注入、皮下注入、皮内注入、くも膜下腔内注入、硬膜外注入又は脳室内注入によりできる。
【００４１】
本発明の別の目的は、タンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を含む健康食品、又は食品添加物を、認知機能障害を治療予防するために、食品学的に承認の添加物と一緒に提供することである。
【００４２】
本発明の健康食品は、組成全重量に基づいて上記化合物類を０．０１乃至８０重量％、好ましくは１乃至５０重量％含有する。
【００４３】
上記健康食品は、健康食品、健康飲料などに含有でき、粉末、顆粒、錠剤、咀嚼錠剤、カプセル剤、飲料などとして使用できる。
【００４４】
又本発明は、上述化合物０．０１乃至８０重量％、アミノ酸類０．００１乃至５重量％、ビタミン類０．００１乃至２重量％、糖類０．００１乃至２０重量％、有機酸類０．００１乃至１０重量％、適量の甘味剤とフレイバー類を添加して、認知機能障害を予防治療用の健康食飲料組成を提供する。
【００４５】
健康食品を開発するために、本発明の上記化合物類を含む添加可能食品の例は、種々の食品、飲料、ガム、複合ビタミン剤、健康改善食品、及び類似体であり、粉末、顆粒、錠剤、咀嚼錠剤、カプセル剤又は飲料などとして使用できる。
【００４６】
又本発明の化合物は、調製粉乳、成長期用調製粉乳、成長期用調整食品のような乳幼児食品に添加することにより、認知機能障害を予防改善できる。
【００４７】
上述組成を食品、添加物又は飲料に添加でき、食品又は飲料中の上述化合物の量は、通常健康食品組成用食品の全重量の約０．１乃至８０重量％、好ましくは１乃至５０重量％の範囲であり、健康飲料組成１００ｍｌの割合に１乃至３０ｇ、好ましくは３乃至１０ｇの範囲である。
【００４８】
本発明の健康飲料組成が、必須成分として上述の化合物を指定割合で含有すると定めると、他の液体成分には特別な制限はなく、その他成分は在来飲料のように種々の脱臭剤、天然炭水化物などでもよい。上記の天然炭水化物は、グルコース、果糖などのような単糖類、麦芽糖、サッカロースなどのような二糖類、デキストリン、シクロデキストリンのような在来糖、キシリトール、エリスリトールなどのような糖アルコールがある。上記の物以外の他の脱臭剤としては、タウマチンのような天然脱臭剤、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなどのようなステビア抽出物、サッカリン、アスパルテームなどのような合成脱臭剤が好んで使用できる。上述の天然炭水化物の量は、通常本飲料組成１００ｍｌの割合に、約１乃至２０ｇ、好ましくは５乃至１２ｇの範囲である。
【００４９】
上述の組成以外の成分は、種々の栄養剤類、ビタミン、鉱物又は電解質、合成香味剤、チーズとチョコレートなどの場合の着色改良剤、ペクチン酸とその塩、アルギン酸とその塩、有機酸、保護コロイド接着剤、ｐＨ制御剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸塩飲料で用いる炭酸化剤などである。上述の物以外の成分は、天然果実ジュース生成用の果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料でもよく、その成分は独立でも、組み合わしても使用できる。この成分類の割合は余り重要ではないが、通常本組成１００重量％当たり約０乃至２０重量％の範囲である。上記抽出物を含む添加可能食品の例は、種々の食品、飲料、ガム、複合ビタミン、健康改良食品及び類似体がある。
【００５０】
この発明性の組成は更に、クエン酸、フマール酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸のような有機酸、リン酸塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸塩、ポリリン酸塩のようなリン酸塩、ポリフェノール、カテキン、α―トコフェロール、ローズマリー抽出物、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草根抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸などのような天然抗酸化剤などの一つ以上を含む。
【００５１】
タンジンから単離の上述の化合物は、２０乃至９０％に高濃縮した液体型、粉末型又は顆粒型でもよい。
【００５２】
同様にタンジンから単離の上述の化合物は、更にラクトース、カゼイン、右旋糖、グルコース、サッカロース及びソルビトールの一つ以上を含むことができる。
【００５３】
本発明の発明性化合物は、毒性も有害な影響も持たない。それ故安全に使用できる。
【００５４】
当業者には本発明の組成、使用及び調合で、発明の精神又は範囲から逸脱することなしに、種々の修正と変更ができることが明白である。
【発明の効果】
【００５５】
本発明で説明したように、タンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類は、ベータアミロイドの凝集と、ベータアミロイドに起因する毒性と細胞アポトーシスを阻害し、神経細胞増殖を刺激する。それ故有害作用なしに、認知機能障害の治療予防のための治療薬又は健康食品と使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明を以下の実施例によりより具体的に説明する。しかし本発明はこれらの実施例に如何なる形でも制限されないと理解する必要がある。
【００５７】
以下の参考実施例、実施例及び実験実施例は、更にその範囲を限定することなしに本発明の説明を意図する。
【００５８】
実施例１ タンジン抽出物から単離のタンシノン化合物類の生成
【００５９】
１−１ メタノール可溶抽出物の生成
ソウルにあるキュンドン（Kyung-dong）市場で購入の乾燥タンジン１５ｋｇを小片に切断し、メタノール２．５Ｌと混合し、３時間の還流抽出を３回行った。残渣をろ過して上澄み液を得、濾液を真空エバポレーターにより４０℃で乾燥して、メタノール可溶抽出物３．４ｋｇを得た。
【００６０】
１−２ ジエチルエーテル可溶抽出物の生成
メタノール可溶抽出物３．４ｋｇを蒸留水に懸濁し、それにジエチルエーテル溶媒を加えた。懸濁物を分別に３乃至４回かけ、水溶性抽出物とジエチルエーテル可溶抽出物を得た。ジエチルエーテル可溶抽出物を濃縮乾燥して、タンジンのジエチルエーテル可溶抽出物３００ｇを得た。
【００６１】
１−３タンシノン化合物類の生成
図１に示すように、タンジンのジエチルエーテル可溶抽出物３００ｇを、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０―２３０メッシュ）に負荷し、溶媒混合物（ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１）で溶出して１５の精製画分を得た。更に精製するために、該画分の中の第４画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０―２３０メッシュ）に負荷し、溶媒混合物（ヘキサン：酢酸エチル＝２５：１）で溶出してミルチロンと１，２−ジジヒドロミルチロンを得た。該画分の中の第６画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０―２３０メッシュ）に負荷し、溶媒混合物（ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１）で溶出し、ジクロルメタンで再結晶してタンシノンＩＩＡを得た。該画分の中の第１１画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０―２３０メッシュ）に負荷し、溶媒混合物（ヘキサン：アセトン＝２０：１）で溶出し、ジクロルメタンで再結晶してタンシノンＩとジヒドロイソタンシノンＩを得た。各化合物の測定物理化学物性を以下に示す。
【００６２】
化学式１
ミルチロン
分子式：C19H22O2
分子量：２８２
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 7.59 (1H, d, J=7.9 Hz), 7.11 (1H, d, J=7.9 Hz), 7.07 (1H, s), 3.18 (2H, t, J=6.4 Hz), 3.02 (1H, sept, J=6.8 Hz), 1.79 (2H, m), 1.65 (2H, m), 1.30 (6H, s), 1.16 (6H, d J=6.9 Hz)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 182.5, 181.7, 149.8, 145.2, 144.4, 140.0, 134.6, 133.9, 128.4, 128.0, 38.0, 34.6, 31.9, 30.0, 27.0, 21.7, 19.2
【００６３】
化学式２
１，２−ジジヒドロミルチロン
分子式：C19H20O2
分子量：２８０
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 7.85 (1H, d, J=10.1 Hz), 7.09-7.49 (2H, ABq, J=7.7 Hz), 7.08 (1H, s), 6.31 (1H, td, J=5, 10 Hz), 3.01 (1H, sept, J=7.1 Hz), 2.26 (2H, d, J=4.5 Hz), 1.27 (6H, s), 1.15 (6H, d J=7 Hz)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 183.3, 181.6, 148.1, 145.0, 140.1, 137.3, 134.6, 134.4, 130.7, 129.4, 124.8, 38.5, 34.1, 29.8, 28.5, 27.0, 21.6
【００６４】
化学式３
タンシノンＩＩＡ
分子式：C19H18O3
分子量：２９４
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 7.64 (1H, d, J=8 Hz), 7.56 (1H, d, J=8 Hz), 7.23 (1H, d, J=1 Hz), 3.20 (2H, t, J=6.4 Hz), 2.28 (3H, d, J=1 Hz), 1.80 (2H, m), 1.66 (2H, m), 1.32 (6H, s)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 183.6, 175.7, 171.7, 150.1, 144.1, 141.1, 133.3, 127.4, 126.5, 121.4, 120.8, 119.9, 37.8, 34.7, 31.2, 29.9, 19.1, 17.9
【００６５】
化学式４
タンシノンＩ
分子式：C18H12O3
分子量：２７６
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 9.23 (1H, d, J=8 Hz), 8.27 (1H, d, J=8 Hz), 7.77 (1H, d, J=8 Hz), 7.27-7.55 (3H, m), 2.68 (3H, s), 2.29 (3H, s)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 183.6, 175.8, 161.4, 142.3, 135.4, 133.8, 133.1, 132.9, 130.8, 129.8, 128.6, 125.0, 123.3, 121.9, 120.7, 120.7, 118.9, 20.1, 9.0
【００６６】
化学式５
ジヒドロイソタンシノンＩ
分子式：C18H14O3
分子量：２７８
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 9.28 (1H, d, J=8 Hz), 7.72-8.28 (2H, q, J=8 Hz), 7.39-7.58 (2H, m), 4.97 (1H, t, J=9 Hz), 4.43 (1H, dd, J=9, 6Hz), 3.63-3.68 (1H, m), 2.69 (3H, s), 1.42 (3H, d, J=7 Hz)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 184.5, 175.9, 170.7, 135.2, 134.9, 132.3, 132.1, 130.6, 129.0, 128.4, 126.3, 125.1, 120.5, 118.6, 81.8, 34.9, 20.0, 19.0
【００６７】
実験実施例１ 生体外活性試験
【００６８】
１−１ 実験準備
【００６９】
１−１−１ ベータアミロイド凝集の阻害試験
合成ベータアミロイド１−４２（バッヘム社（BACHEM））をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して２５０μＭ溶液にし、黒色平底マイクロプレート（フルオレッセントブラックプレート）上で１／１０にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、凝集を誘発した。実施例１で生成したタンシンノン化合物類のベータアミロイド凝集に対する阻害活性を比較して、１０μｇ／ｍｌで５０％以上の阻害活性を示す試験サンプルを使用に選び、添加して室温で１時間反応した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を５０ｍＭグリシン緩衝液で希釈し、この希釈溶液を穴当たり１５０μｌずつ各穴に添加した。マイクロプレートリーダー（サファイア（SAFIRE）、テカン社（TECAN））により、励起波長４５０ｎｍ／発光波長４８０ｎｍで吸光度を測定し、ベータアミロイド凝集に対する試験サンプルの阻害活性を５０％抑制濃度（ＩＣ５０）に変換した。
【００７０】
１−１−２ ベータアミロイド毒性の阻害試験
マウス神経細胞株ＨＴ２２を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ハイクロン社（Hyclone））と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ社（Sigma Co））を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ジブコ社（Gibco BRL））でインキュベートした。試験前にＨＴ２２細胞を、穴当たり５×１０３の密度で９６個穴プレートでインキュベートし、更に試験サンプル処理前に無血清ＤＭＥＭ培地で１時間インキュベートした。試験サンプルとして用いる実施例１で生成した種々濃度のジエチルエーテル抽出物をこれに加え、１時間インキュベートした。凝集ベータアミロイド（ＵＳペプチド社（US Peptide））を２５μＭになるようにこれと処理し、１８時間インキュベートし細胞壊死を誘発した。臭化３−（４，５−ジメチルー２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルー２Ｈテトラゾリウム（ＭＴＴ）の５ｍｇ／ｍｌ溶液を、各穴に穴当たり１５μｌ加え、穴で４時間インキュベートした。溶解緩衝液（１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０％ジメチルフォルムアミド、ｐＨ４．７）を各穴に、穴当たり１００μｌ加え一晩反応した。反応１８時間後、溶液の吸光度をマイクロプレートリーダー（サファイア（SAFIRE）、テカン社（TECAN））により、５７０ｎｍ／６３０ｎｍ波長で測定した（ジルラドン、エフら（Gillardon、F, et al）、ブレインリサーチ（Brain Research）、７０６（１）巻、１６９−１７２頁、１９９６年）。
【００７１】
１−１−３ 細胞毒性の測定
試験サンプルの細胞毒性を測定するために、１−１−２に開示と同様の方法に従いＨＴ２２細胞をインキュベートし、実施例１で生成した種々濃度の試験サンプルを細胞に加え１８時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液と溶解緩衝液を細胞に連続に加え、吸光度をマイクロプレートリーダー（サファイア（SAFIRE）、テカン社（TECAN））により、５７０ｎｍで測定した。
【００７２】
１−２ ミルチロン（化合物Ｓ−２−３）活性の結果
図２に示されるように、ミルチロン（化合物Ｓ−２−３）は、ベータアミロイド凝集に強力な阻害効果（０．７２ｍｇ／ｍｌ）を示したが、ベータアミロイド毒性を阻害しなかった。
【００７３】
１−３ １，２−ジジヒドロミルチロン（化合物Ｓ−２−６）活性の結果
図３に示されるように、１，２−ジヒドロミルチロン（化合物Ｓ−２−６）はベータアミロイド凝集に強力な阻害効果（０．４９ｍｇ／ｍｌ）を示したが、ベータアミロイド毒性を阻害しなかった。
【００７４】
１−４ タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）活性の結果
図４に示されるように、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）は、試験サンプルの中でベータアミロイド凝集にもっとも強力な阻害効果（０．１４ｍｇ／ｍｌ）を示し、ベータアミロイド毒性に対し僅かしか阻害効果を示さなかった。
【００７５】
１−５ タンシノンＩ（化合物Ｓ−８−４）活性の結果
図５に示されるように、タンシノンＩ（化合物Ｓ−８−４）は、ベータアミロイド凝集に強力な阻害効果（０．１９ｍｇ／ｍｌ）を示し、ベータアミロイド毒性に対し全く阻害効果を示さなかった。
【００７６】
１−６ ジヒドロタンシノンＩ（化合物Ｓ−８−１１）活性の結果
図６に示されるように、ジヒドロタンシノンＩ（化合物Ｓ−８−１１）は、ベータアミロイド凝集に強力な阻害効果（０．４０ｍｇ／ｍｌ）を示し、ベータアミロイド毒性に対し全く阻害効果を示さなかった。
【００７７】
実験実施例２ 生体内の活性試験
【００７８】
２−１ 実験計画法
受動回避試験のために、サムタッコ社（Samtaco Co.）から購入の体重２５ｇのＩＣＲオスマウスを、檻当たり５匹のマウスを飼育し、檻を以下の温度２２±２℃と相対湿度５０±５％の条件に維持し、１２時間の間隔で規則的に制御した明暗条件に保った。
合成ベータアミロイド１−４２（バッヘム社（BACHEM））をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して２５０μＭ溶液にし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０ｎＭに希釈し、３７℃で４日間（受動回避試験）又は６日間（Ｙ字型迷路試験）で凝集した。
凝集ベータアミロイド１−４２を文献に開示の方法に従いマウスに投与した（ローセン（Lausen）、ベルカンプ（Belknap）、ジャーナルオブファルマコロジカルメソッド（J. Pharmacol. Methods）、１６巻、３５５−３５７頁、１９８６年）。
凝集ベータアミロイド１−４２の５０μｌを、ゲージ２６の針を備えた５０μｌハミルトン（Hamilton）マイクロシリンジで十字縫合領域に深さ２．４ｍｍで投与した。ベータアミロイド投与後、行動試験をＹ字型迷路試験と受動回避（ＰＡ）試験に分割した。Ｙ字型迷路試験を投与後２日間、ＰＡ試験を投与後３日間行った。各試験を１０匹以上のマウスで行った。
実験終了持に、動物の脳を染色のために、１０％フォルマリン溶液に運び保存した。
【００７９】
２−２ 薬物療法
ベータアミロイド投与後、実施例１で生成のタンシノン化合物類を、Ｙ字型迷路試験の場合には１日に一回の間隔でマウスに投与し、受動回避試験の場合には３日間継続的に試験サンプルに投与し、二つの群、即ち一つは５０ｍｇ／ｋｇ処置群と、他の群は１００ｍｇ／ｋｇ処置群に分けた。各試験を投与翌日に行った。
【００８０】
２−３ 行動手段
【００８１】
２−３−１ 急性アルツハイマー病モデル実験―Ｙ字型迷路試験
ベータアミロイド投与後２日目に、Ｙ字型迷路試験を行った。黒色のＹ字型迷路ボックスは、互いに等しい角度を有する三本のアーム（長さ４０ｃｍ；高さ１０ｃｍ、幅５ｃｍ）からなる。迷路の中心にマウスを置き、この迷路で８分間自由に行動させた。マウスの通路へ入る順序を観察し、四肢が経路内に入る場合の進入待ち時間を測定した。空間記憶を測定するために、以下の経験式１により測定自発性進入岐路交替行動を計算し、マウスが持続的に三つの通路に進入した時を、一回の実際交替とした。
自発性進入岐路交替（％）＝（実際交替／アームへの進入総数―２）×１００
タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）が、試験サンプル中でベータアミロイド凝集に対しもっとも強力な阻害効果を示し、経口投与試験（２０００ｍｇ／ｋｇ）で毒性を示さなかったので、この化合物５０ｍｇ／ｋｇをベータアミロイドを脳室内経路で直接処理したマウスに経口投与し、脳損傷に対するこの化合物の回復効果をＹ字型迷路試験で見いだした。タンシノンＩＩＡ１００ｍｇ／ｋｇの処置でも、又タンシノンＩＩＡの１００ｍｇ／ｋｇと同様の効果を示した。図７に見られるように、マウスのベータアミロイド投与に起因する記憶学習障害が、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）処置により回復が示された。
【００８２】
２−３−２ 急性アルツハイマー病モデル実験―受動回避試験
ベータアミロイド投与後３日目に、受動回避試験を行った。黒色の回避シャトル箱を、格納扉（長さ４ｃｍ×幅３．５ｃｍ）で分割した同じ大きさの二つの部屋（長さ１８ｃｍ×幅９．５ｃｍ×高さ１７ｃｍ）に分け、電気により暗室の床上を走れるようにした。明室は蝶番付きプレキシグラス蓋上に２０ワットのランプを備え、マウスが格納扉を通して暗室に進入できるようにした。
実験は訓練セッションと試験セッションからなった。
訓練セッションでは、体重２５ｇのオスマウスを最初明室に置き、慣れさせた。次いで扉を開け、マウスが暗さを好んで明室から出て、暗室に入るやいなや直ちにその扉を閉め、電気ショック（０．２５ｍＡ、３秒間、一回）をグリッド床から３秒間マウスに送った。
訓練セッション後２４時間で、同一実験を再度マウスに行い、明室に留まる待ち時間を測定した。データは、３秒間の０．２５ｍＡの電気ショックによる前回訓練の記憶を意味する指標と見なした。明室から暗室に進入する待ち時間を、待ち時間による段階として測定した。限界時間（３００秒）以内に暗室に進入しない場合には、値３００秒を待ち時間とした。実施例で生成の試験サンプルを経口投与したマウスを用いて、受動回避試験を行った。
図８に示すように、待ち時間の変化は記憶低下又は回復を意味し、待ち時間の延長は記憶の向上を意味する。偽手術の対照群では待ち時間の変化はなく、溶媒投与の媒体対照群では、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）処置の待ち時間は、偽対照群に比べ有意に増加した（ｐ＜０．０５）。
【００８３】
２−３−３ 急性アルツハイマー病モデル実験における染色脳の免疫化学
行動試験の終わりに、マウスの脳を１０％フォルマリンに運び２４時間保持し、３０％サッカロース溶液に移した。この脳を固定後、クリオスタットを用いて、幅４０μｍに脳の冠状切断を行った。脳切片をクレシルバイオレット染色して脳神経細胞の損傷を確認し、アセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）染色してコリン作動性神経の損傷を確認し、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）染色してアストロサイトの活性化を確認した。
【００８４】
（a）クレシルバイオレット染色
組織をゼラチン塗布スライド上に置きクレシルバイオレットで染色後、エタノールを用いて組織を脱水した。組織を約３分間インキュベートし、０．５％クレシルバイオレットに３０分間浸漬した。この溶液をエタノールで再脱水した後に、切片をキシレンに３分間浸漬した。乾燥組織をカナダバルサム封入剤で固定した。
【００８５】
（ｂ）免疫組織化学
全ての抗体培養間の洗浄工程では、組織洗浄にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。内因性ペルオキダーゼの活性を低下するために、組織を０．５％過酸化水素で前処理後、室温で５％ＦＢＳで１時間処理して、非特異的結合を除去した。マウス抗ＧＦＡＰ（１：２００）モノクロナル抗体と、ヤギ抗ＣｈＡＴ（１：２００）ポリクローナル抗体を用いて、組織を一晩４℃でインキュベートした。西洋わさびペオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧと抗ヤギＩｇＧ二次抗体（１：６００）を、室温で１時間インキュベートし、培養後ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）キットで検出した。
図９に示されるように、ベータアミロイドに起因する記憶学習の損傷は、海馬の特定領域と緊密に相関し、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）は記憶学習の損傷を有意に回復することが確認された。ＣｈＡＴ染色とＧＦＡＰ染色の結果では、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）によりベータアミロイドに起因するコリン作用性神経の損傷を回復し、ベータアミロイドに起因する炎症反応と相関するアストロサイト活性の増加が減少した。
以下に賦形剤の処方法と種類を説明するが、本発明はこれらに限定されない。代表的調合例を以下に説明した。
【００８６】
粉末調合
ミルチロン ５０ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
粉末調合は上記成分を混合し、封入包みに詰めて調合した。
【００８７】
錠剤調合
１，２−ジジヒドロミルチロン ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
錠剤調合は上記成分を混合し、錠剤化して調合した。
【００８８】
カプセル剤調合
タンシノンＩＩＡ ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
錠剤調合は上記成分を混合し、在来のゼラチン調合法によりゼラチンカプセルに詰めて調合した。
【００８９】
注射調合
タンシノンＩ ５０ｍｇ
注射用蒸留水 適量
ｐＨ制御剤 適量
注射調合は活性成分を溶解し、ｐＨを約７．５に制御し、次いで全成分を２ｍｌアンプルに詰め、在来の注射調合法により殺菌して調合した。
【００９０】
液体調合
ジヒドロイソタンシノン ０．１−８０ｇ
砂糖 ５−１０ｇ
クエン酸 ０．０５−０．３％
カラメル ０．００５−０．０２％
ビタミンＣ ０．１−１％
蒸留水 ７９−９４％
炭酸ガス ０．５−０．８２％
液体調合は活性成分を溶解し、全成分を詰め、在来の液体調合法により殺菌して調合した。
【００９１】
健康食品の調合
タンシノンＩＩＡ １０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡ酢酸エステル ７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０μｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０μｇ
パンテニン酸カルシウム ０．５ｍｇ
ミネラル混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
第一リン酸カリウム １５ｍｇ
第二リン酸カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上述のビタミン混合物とミネラル混合物は、多くの形に変えられる。そのような変形は本発明の精神と範囲から逸脱するとは見なさない。
【００９２】
健康飲料の調合
ミルチロン １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
アンズ濃縮物 ２ｇ
タウリン １ｇ
蒸留水 ９００ｍｌ
健康飲料の調合は活性成分を溶解し、８５℃で１時間撹拌し、濾過後全成分を１０００ｍｌアンプルの詰め、在来の健康飲料調合法で殺菌して調合した。
この発明をこのように説明したが、同じことが多くの形に変えられることは明白である。そのような変形は本発明の精神と範囲から逸脱するとは見なさなく、そのような修正の全ては当業者には明白であり、以下の特許の請求項の範囲内に含まれることを意図する。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明で説明したように、タンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類は、ベータアミロイドの凝集と同様に、ベータアミロイドに起因する毒性と細胞アポトーシスを阻害し、神経細胞増殖を刺激する。それ故認知機能障害を治療予防する治療薬類又は健康食品として、有害作用なしに使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
本発明の上記と他の目的、特性及び他の利点が、付随図面と組み合わした以下の詳細説明でより明白に理解できる。
【図１】図１にタンジン抽出物からタンシノン化合物類の単離スキームを示す。
【図２】図２にベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するミルチロン（化合物Ｓ−２−３）の阻害効果を示す。
【図３】図３にベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するジジヒドロミルチロン（化合物Ｓ−２−６）の阻害効果を示す。
【図４】図４はベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するタンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）の阻害効果を表す。
【図５】図５はベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するタンシノンＩ（化合物Ｓ−８−４）の阻害効果を表す。
【図６】図６はベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するジヒドロタンシノンＩ（化合物Ｓ−８−１１）の阻害効果を表す。
【図７】図７にタンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）を用いた記憶学習研究（Ｙ字型迷路試験）の結果を示す。
【図８】図８にタンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）を用いた記憶学習試験（受動回避試験）の結果を示す。
【図９】図９に対照群とタンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）で治療した試験群間のマウス染色脳の比較を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は認知障害症の予防治療活性を示すタンシン（Salviae Milltiorrhizae）画分含有組成と、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命現象の制御で主要な役割を果たす脳と脊髄からなる中枢神経系（ＣＮＳ）は、感覚運動や（不）随意運動から思考、記憶、運動、言語などに通じる人機能の全てを管理する必須器官である。従って脳卒中、外傷などに起因する神経細胞の急速進行性アポトーシスと同様に、老年認知症、例えばアルツハイマー病又はパーキンソン病などに起因するＣＮＳに現れる変性疾患のような緩徐進行性アポトーシスにより、神経回路網の不可逆な機能障害をもたらし、ついには人機能の永久的不全を生じる。中でも代表的な老年認知症であるアルツハイマー病を患う患者は、寿命の延長と近代的福祉施設の両者に比例して増加した。韓国保健社会福祉研究所（Korea Institute for Health and Social Affair）による公的調査によると、韓国人の中での老人の割合は、２０００年には７％を越し８．３％（３，９７０、０００人）に達し、２０１９年には１４．４％に近づくはずである。特に老年認知症を患う６５才以上の患者の割合は、韓国では８．２％になると推定される。欧米の国々では、６５才以上の患者では約１０％が、８０才以上の患者では約４０−５０％が、老年認知症を患う。５００万人以上の患者がこの疾患を患っているので、これにより生ずる医療費は一年に１０００億ドルと推定される。韓国では２０万人以上の人が認知症を患っていることが分かった。米国では２０３０年には現在の患者数の二倍以上に、２０５０年には１４００万人（３５０％以上）に増加すると推定された。
【０００３】
認知機能障害が始まるアルツハイマー病は、人間性の破綻を生ずる長期変性疾患の一つであるので、現在まで有効な予防薬、例えば、アリセプト（商標名）（Aricept）（ファイザー社（Pfizer Co.））、エクセロン（商標名）（Exelon）（ノバルティス社（Novartis Co.））、ライミニル（商標名）（Reiminyl）（ヤンセンファーマ社）（Janssen Co.））のようなアセチルコリンエステラーゼ阻害薬、又はエビキサ（商標名）（Ebixa）（ルンドベック社（Lundbeck Co.））のようなＮ−メチルーＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニストの開発が試みられた。しかしアセチルコリンエステラーゼ阻害薬は、認知能力低下を緩和するだけで、この疾患の病原学的原因を満足できるようには治療できなかった。これらの薬はいくらかの患者（約４０−５０％）に一時的な緩和効果を示すにすぎず、長期にはその有効性を維持できず、更には長期治療では、肝毒性、嘔吐、食欲不振のような種々の有害な応答を示す。従って現在この疾患を予防治療する新規治療薬開発の緊急な必要性がある。多数の多国籍製薬会社により大規模な開発投資がなされ、特にアルツハイマー病の病原学的因子と推定される約４０のアミノ酸からなるベータアミロイドの再生量を低下するベータセクレターゼ阻害薬、又はガンマセクレターゼ阻害薬の開発に焦点が合わされた。韓国ではアルツハイマー病の基礎研究は活発に試みられたが、アルツハイマー治療薬の開発は現在まで僅かにすぎない。ガンマセクレターゼ阻害薬の開発で毒性と大いに関連することが、動物モデル試験と同様に臨床試験でも見いだされているので、この阻害薬は推奨できないことが証明されたが、ベータセクレターゼ阻害薬の開発が推奨できることが、遺伝子欠如の形質転換動物モデル試験で証明された。又ベータアミロイド凝集が関与する因子に標的を合わすことは、安全な手段と見なされる。米国のアクソニックス社（Axonyx Co.）が開発した“フェセリン”（Phenserine）は、第二相臨床試験が進行中であると報告されており、コリンエステラーゼ阻害と同様にベータアミロイド凝集阻害の二重活性を示す（グリーグら（Greig et al.）、ジャーナルオブメディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、４４巻、４０６２−４０７１頁、２００１年、www.medicalnewstoday.com, www.alzforum.org/drg/drc）。
【０００４】
ベータアミロイドを用いるワクチン開発は、他の可能な方法として知られている。エラン社（Elan Co.）によるワクチンの連続研究の進展は、臨床試験中の脳炎のような予期しない有害応答により失敗したと報告された。しかしベータアミロイドワクチンは、動物モデル試験では認知機能を緩和し、脳細胞の活性と同様に損傷脳神経細胞の活性を改善し、アルツハイマー症候群を緩和することが報告された（ジェナスら（Janus et al.）、ネーチャー（Nature）、４０８巻、９７９−９８２頁、２０００年；モーガンら（Morgan et al.）、ネーチャー（Nature）、４０８巻、９８２−９８５頁、２０００年）。
【０００５】
タンジン（シソ科）抽出物は、種々の疾患、例えば腹痛、外傷、不眠症、発疹などが治療でき、アビエチン系化合物に属する幾つかのジテルペンキニーネ色素、例えばタンシノンＩ、ジヒドロタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩＩＢ、メチレンタンシノンなどを含有する（イルムーチェンら（Il-Moo Chang et al.）、オリエンタルメディシンアンドメディカルサイエンスエンサイクロペディア（Oriental Medicine and Medical Science Encyclopedia）、ソウルナショナルユニバーシティ（Seoul National University）、２００３年）。
【０００６】
又タンジン（シソ科）の薬理活性、例えば抗酸化活性（ユンファキム（Yun-Hwa Kim）、コリアンジャーナルオブソサエティオブフッドクッカリーサイエンス（Korean J. Soc. Food Cookery Sci.）、１９巻、４頁、２００３年）、抗ガン活性（オクヒーキム（Ok-Hee Kim）、ジャーナルオブアプライドファルマコロジー（The Journal of Applied Pharmacology）、７巻、２９−３４頁、１９９９年）、血圧低下効果（韓国特許１０−０３２７８９４）などが報告されている。しかしタンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類の認知機能障害に対する治療効果については、上記文献のいずれにも報告も開示もされていないが、その開示はここに文献として組み入れる。
【０００７】
タンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類の認知機能障害に対する阻害効果を、既に周知のスクリーニング検査により調査するために、本発明の本発明人らは、ベータアミロイド凝集の強力な阻害効果を示す種々の植物を広範囲に選別し、受動回避試験などを用いて記憶学習回復の研究を検査し、タンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類が、ベータアミロイド凝集と細胞毒性を阻害することで神経細胞増殖を刺激し、更には神経細胞損傷に起因する記憶学習損傷を回復することを確認して本発明をついに完成した。
【０００８】
本発明のこれらと他の目的は、以下に与える本発明の詳細な説明で明らかになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って本発明の目的は、神経細胞の増殖を刺激し、更には神経細胞損傷に起因する記憶学習損傷を回復できるベータアミロイド凝集と細胞毒性に関する機構により、認知機能障害を治療予防するために、有効成分としてタンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだ有効量のタンシノン化合物類を含む医薬組成を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に従い認知機能障害を治療予防するために、有効成分として有効量のタンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を含む医薬組成が提供される。
【００１１】
化学式１
【００１２】
ミルチロン
【００１３】
化学式２
【００１４】
１，２−ジジヒドロミルチロン
【００１５】
化学式３
【００１６】
タンシノンＩＩＡ
【００１７】
化学式４
【００１８】
タンシノンＩ
【００１９】
化学式５
【００２０】
ジヒドロイソタンシノンＩ
【００２１】
具体的には本発明は、認知機能障害を治療予防するために、有効成分としてタンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類と、医薬的に容認の担体、希釈剤又はアジュバントとを含む医薬組成を提供する。
【００２２】
本発明の目的は、タンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだ有効量のタンシノン化合物類を、その中に医薬的に容認の担体と一緒に哺乳類に投与することを含む、該哺乳類の認知機能障害を治療又は予防する方法を提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、認知機能障害の治療予防用治療薬の製造に、タンジン（シソ科）から単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類の使用を提供することである。
【００２４】
ここで開示の“認知機能障害”という用語は、アルツハイマー型認知症、脳血管障害型認知症、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、頭部損傷に起因する認知症、パーキンソン病などを含み、好ましくはパーキンソン病を含む。
タンジンから単離した発明性のタンシノン化合物類は、以下の好ましい実施形態に従い生成できる。
【００２５】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２６】
タンジンから単離した発明性のタンシノン化合物類は、以下の方法で詳細に生成できる。
【００２７】
タンジンから単離した発明性のタンシノン化合物類は、以下からなる段階を含む方法により生成できる。第一段階で、０．１乃至０．２倍容積のメタノールをタンジンの乾燥地下茎に添加し、還流抽出又は超音波抽出による抽出法で抽出し、溶液をろ過に付し上澄み液を得、３５乃至４５℃範囲の温度でロータリーエバポレーターにより濃縮し、乾燥してタンジンの乾燥粗抽出粉末を得る。第二段階で、該粗抽出物を蒸留水に懸濁し、それにジエチルエーテルを加え、混合と分別を３乃至６回行いタンジンのジエチルエーテル可溶画分を得る。このジエチルエーテル可溶抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０−２３０メッシュ）で溶出溶媒の極性を増加しながら溶媒混合物（ヘキサン：酢酸エチル）による溶出を繰り返し、本発明のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩを得る。又上記方法を改良するか、又は更なる段階に付し、技術的に周知の在来法、例えば文献に開示の方法（ハルボーン、ジェイビー（Harborne, J.B.）、植物化学物質法：植物分析の近代技法ガイド（Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis）、第３版、６−７頁、１９９８年）によりより強力な画分又は化合物に分別単離しても良い。
【００２８】
本発明の別様態に従うと、認知機能障害を治療予防するために、活性成分として有効量の上述の生成法で生成したタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を含む医薬組成を提供する。
【００２９】
本発明の目的は、上述の生成法で生成したタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだ有効量のタンシノン化合物類を、その中に医薬的に容認の担体と一緒に哺乳類に投与することを含む該哺乳類の認知機能障害を治療又は予防する方法を提供することである。
【００３０】
本発明の目的は、認知機能障害の治療予防用治療薬の製造に、上述の生成法で生成したタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類の使用を提供することである。
【００３１】
本発明の医薬組成は、組成全重量に基づいて約０．０１−５０重量％の上記抽出物を含有できる。
【００３２】
認知機能障害に対するタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物の阻害効果を判定するための種々のスクリーニング検査から、タンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類が、ベータアミロイドの凝集と同様にベータアミロイドに起因する毒性と細胞アポトーシスを阻害して、神経細胞増殖を刺激し、更には神経細胞損傷に起因する記憶学習損傷を回復することが確認された。
【００３３】
認知機能障害の治療予防のための発明性の組成は、その組成の全重量に基づいて上記化合物を０．０１−５０重量％含有できる。
【００３４】
発明性の組成は更に技術的に周知の使用法に従い在来の担体、アジュバント又は希釈剤を含有できる。該担体は、使用応用法に従い適切な物質を使用するのが好ましいが、限定はされない。適切な希釈剤はレミントン薬学科学（Remington's Pharmaceutical Science）（マック出版社（Mack Publishing Co.）、イートン（Eaton）、ペンシルバニア州（PA））の文書テキストに記載されている。
【００３５】
下文の以下処方の方法と賦活剤類は、範例にしかすぎずこの発明を決して制限するものではない。
【００３６】
本発明に従う組成は、医薬的に容認の担体、アジュバント又は希釈剤、例えばラクトース、右旋糖、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン類、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油含有の医薬組成として提供できる。処方類は更に、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤及び類似体を含んでも良い。この発明の処方は、技術的に周知の方法のいずれかを用いて患者に投与後、活性成分の急速放除、持続的放除又は遅延放除が提供されるように処方できる。
【００３７】
例えば本発明の化合物類は、油類、プロピレングリコール、又は通常注入を実現するのに用いる溶剤に溶解できる。担体の適切例としては、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピルなどが挙げられるが、これらに限定はされない。局所投与用には、本発明の抽出物は軟膏とクリーム形状に処方できる。
本組成含有の医薬処方類は、経口投薬形状（粉末剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、水薬、シロップ剤、エリキシル薬、粉末剤、小袋、顆粒）、又は局所調剤（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、芳香軟膏、パッチ、ペースト、噴霧溶液、エアロゾル及び類似体）、又は注入可能調剤（溶液、懸濁液、エマルジョン）のような任意の形状で調剤できる。
【００３８】
医薬投薬形状の本発明の組成は、その医薬的容認の塩類形状で使用でき、単独又は他の医薬活性化合物との適切な関連、又は組み合わせで使用できる。
【００３９】
発明性化合物又は組成の望ましい用量は、被験者の健康状態と体重、重症度、薬剤形状、投与経路と期間により変わり、当業者により選択できる。しかし好ましい効果を得るには、通常本発明の発明性抽出物又は化合物類は、体重ｋｇ／一日当たり１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１乃至３ｇ／ｋｇの範囲の量を投与することが推奨される。この用量を一日に一回又は数回に分けて投与できる。組成に関しては、発明性化合物の量が、組成全重量に基づいて０．０１乃至５０重量％、好ましくは０．５乃至４０重量％存在する必要がある。
【００４０】
本発明の医薬組成は、種々の経路を通して哺乳類（ラット、マウス、家畜又は人）のような対象動物に投与できる。全様式の投与が意図され、例えば投与は、経口、経直腸、静脈内注入、筋肉内注入、皮下注入、皮内注入、くも膜下腔内注入、硬膜外注入又は脳室内注入によりできる。
【００４１】
本発明の別の目的は、タンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を含む健康食品、又は食品添加物を、認知機能障害を治療予防するために、食品学的に承認の添加物と一緒に提供することである。
【００４２】
本発明の健康食品は、組成全重量に基づいて上記化合物類を０．０１乃至８０重量％、好ましくは１乃至５０重量％含有する。
【００４３】
上記健康食品は、健康食品、健康飲料などに含有でき、粉末、顆粒、錠剤、咀嚼錠剤、カプセル剤、飲料などとして使用できる。
【００４４】
又本発明は、上述化合物０．０１乃至８０重量％、アミノ酸類０．００１乃至５重量％、ビタミン類０．００１乃至２重量％、糖類０．００１乃至２０重量％、有機酸類０．００１乃至１０重量％、適量の甘味剤とフレイバー類を添加して、認知機能障害を予防治療用の健康食飲料組成を提供する。
【００４５】
健康食品を開発するために、本発明の上記化合物類を含む添加可能食品の例は、種々の食品、飲料、ガム、複合ビタミン剤、健康改善食品、及び類似体であり、粉末、顆粒、錠剤、咀嚼錠剤、カプセル剤又は飲料などとして使用できる。
【００４６】
又本発明の化合物は、調製粉乳、成長期用調製粉乳、成長期用調整食品のような乳幼児食品に添加することにより、認知機能障害を予防改善できる。
【００４７】
上述組成を食品、添加物又は飲料に添加でき、食品又は飲料中の上述化合物の量は、通常健康食品組成用食品の全重量の約０．１乃至８０重量％、好ましくは１乃至５０重量％の範囲であり、健康飲料組成１００ｍｌの割合に１乃至３０ｇ、好ましくは３乃至１０ｇの範囲である。
【００４８】
本発明の健康飲料組成が、必須成分として上述の化合物を指定割合で含有すると定めると、他の液体成分には特別な制限はなく、その他成分は在来飲料のように種々の脱臭剤、天然炭水化物などでもよい。上記の天然炭水化物は、グルコース、果糖などのような単糖類、麦芽糖、サッカロースなどのような二糖類、デキストリン、シクロデキストリンのような在来糖、キシリトール、エリスリトールなどのような糖アルコールがある。上記の物以外の他の脱臭剤としては、タウマチンのような天然脱臭剤、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなどのようなステビア抽出物、サッカリン、アスパルテームなどのような合成脱臭剤が好んで使用できる。上述の天然炭水化物の量は、通常本飲料組成１００ｍｌの割合に、約１乃至２０ｇ、好ましくは５乃至１２ｇの範囲である。
【００４９】
上述の組成以外の成分は、種々の栄養剤類、ビタミン、鉱物又は電解質、合成香味剤、チーズとチョコレートなどの場合の着色改良剤、ペクチン酸とその塩、アルギン酸とその塩、有機酸、保護コロイド接着剤、ｐＨ制御剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸塩飲料で用いる炭酸化剤などである。上述の物以外の成分は、天然果実ジュース生成用の果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料でもよく、その成分は独立でも、組み合わしても使用できる。この成分類の割合は余り重要ではないが、通常本組成１００重量％当たり約０乃至２０重量％の範囲である。上記抽出物を含む添加可能食品の例は、種々の食品、飲料、ガム、複合ビタミン、健康改良食品及び類似体がある。
【００５０】
この発明性の組成は更に、クエン酸、フマール酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸のような有機酸、リン酸塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸塩、ポリリン酸塩のようなリン酸塩、ポリフェノール、カテキン、α―トコフェロール、ローズマリー抽出物、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草根抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸などのような天然抗酸化剤などの一つ以上を含む。
【００５１】
タンジンから単離の上述の化合物は、２０乃至９０％に高濃縮した液体型、粉末型又は顆粒型でもよい。
【００５２】
同様にタンジンから単離の上述の化合物は、更にラクトース、カゼイン、右旋糖、グルコース、サッカロース及びソルビトールの一つ以上を含むことができる。
【００５３】
本発明の発明性化合物は、毒性も有害な影響も持たない。それ故安全に使用できる。
【００５４】
当業者には本発明の組成、使用及び調合で、発明の精神又は範囲から逸脱することなしに、種々の修正と変更ができることが明白である。
【発明の効果】
【００５５】
本発明で説明したように、タンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類は、ベータアミロイドの凝集と、ベータアミロイドに起因する毒性と細胞アポトーシスを阻害し、神経細胞増殖を刺激する。それ故有害作用なしに、認知機能障害の治療予防のための治療薬又は健康食品と使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明を以下の実施例によりより具体的に説明する。しかし本発明はこれらの実施例に如何なる形でも制限されないと理解する必要がある。
【００５７】
以下の参考実施例、実施例及び実験実施例は、更にその範囲を限定することなしに本発明の説明を意図する。
【００５８】
実施例１ タンジン抽出物から単離のタンシノン化合物類の生成
【００５９】
１−１ メタノール可溶抽出物の生成
ソウルにあるキュンドン（Kyung-dong）市場で購入の乾燥タンジン１５ｋｇを小片に切断し、メタノール２．５Ｌと混合し、３時間の還流抽出を３回行った。残渣をろ過して上澄み液を得、濾液を真空エバポレーターにより４０℃で乾燥して、メタノール可溶抽出物３．４ｋｇを得た。
【００６０】
１−２ ジエチルエーテル可溶抽出物の生成
メタノール可溶抽出物３．４ｋｇを蒸留水に懸濁し、それにジエチルエーテル溶媒を加えた。懸濁物を分別に３乃至４回かけ、水溶性抽出物とジエチルエーテル可溶抽出物を得た。ジエチルエーテル可溶抽出物を濃縮乾燥して、タンジンのジエチルエーテル可溶抽出物３００ｇを得た。
【００６１】
１−３タンシノン化合物類の生成
図１に示すように、タンジンのジエチルエーテル可溶抽出物３００ｇを、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０―２３０メッシュ）に負荷し、溶媒混合物（ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１）で溶出して１５の精製画分を得た。更に精製するために、該画分の中の第４画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０―２３０メッシュ）に負荷し、溶媒混合物（ヘキサン：酢酸エチル＝２５：１）で溶出してミルチロンと１，２−ジジヒドロミルチロンを得た。該画分の中の第６画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０―２３０メッシュ）に負荷し、溶媒混合物（ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１）で溶出し、ジクロルメタンで再結晶してタンシノンＩＩＡを得た。該画分の中の第１１画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、７０―２３０メッシュ）に負荷し、溶媒混合物（ヘキサン：アセトン＝２０：１）で溶出し、ジクロルメタンで再結晶してタンシノンＩとジヒドロイソタンシノンＩを得た。各化合物の測定物理化学物性を以下に示す。
【００６２】
化学式１
ミルチロン
分子式：C19H22O2
分子量：２８２
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 7.59 (1H, d, J=7.9 Hz), 7.11 (1H, d, J=7.9 Hz), 7.07 (1H, s), 3.18 (2H, t, J=6.4 Hz), 3.02 (1H, sept, J=6.8 Hz), 1.79 (2H, m), 1.65 (2H, m), 1.30 (6H, s), 1.16 (6H, d J=6.9 Hz)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 182.5, 181.7, 149.8, 145.2, 144.4, 140.0, 134.6, 133.9, 128.4, 128.0, 38.0, 34.6, 31.9, 30.0, 27.0, 21.7, 19.2
【００６３】
化学式２
１，２−ジジヒドロミルチロン
分子式：C19H20O2
分子量：２８０
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 7.85 (1H, d, J=10.1 Hz), 7.09-7.49 (2H, ABq, J=7.7 Hz), 7.08 (1H, s), 6.31 (1H, td, J=5, 10 Hz), 3.01 (1H, sept, J=7.1 Hz), 2.26 (2H, d, J=4.5 Hz), 1.27 (6H, s), 1.15 (6H, d J=7 Hz)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 183.3, 181.6, 148.1, 145.0, 140.1, 137.3, 134.6, 134.4, 130.7, 129.4, 124.8, 38.5, 34.1, 29.8, 28.5, 27.0, 21.6
【００６４】
化学式３
タンシノンＩＩＡ
分子式：C19H18O3
分子量：２９４
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 7.64 (1H, d, J=8 Hz), 7.56 (1H, d, J=8 Hz), 7.23 (1H, d, J=1 Hz), 3.20 (2H, t, J=6.4 Hz), 2.28 (3H, d, J=1 Hz), 1.80 (2H, m), 1.66 (2H, m), 1.32 (6H, s)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 183.6, 175.7, 171.7, 150.1, 144.1, 141.1, 133.3, 127.4, 126.5, 121.4, 120.8, 119.9, 37.8, 34.7, 31.2, 29.9, 19.1, 17.9
【００６５】
化学式４
タンシノンＩ
分子式：C18H12O3
分子量：２７６
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 9.23 (1H, d, J=8 Hz), 8.27 (1H, d, J=8 Hz), 7.77 (1H, d, J=8 Hz), 7.27-7.55 (3H, m), 2.68 (3H, s), 2.29 (3H, s)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 183.6, 175.8, 161.4, 142.3, 135.4, 133.8, 133.1, 132.9, 130.8, 129.8, 128.6, 125.0, 123.3, 121.9, 120.7, 120.7, 118.9, 20.1, 9.0
【００６６】
化学式５
ジヒドロイソタンシノンＩ
分子式：C18H14O3
分子量：２７８
1H-NMR （500 MHz, CDCl3, ppm）: 9.28 (1H, d, J=8 Hz), 7.72-8.28 (2H, q, J=8 Hz), 7.39-7.58 (2H, m), 4.97 (1H, t, J=9 Hz), 4.43 (1H, dd, J=9, 6Hz), 3.63-3.68 (1H, m), 2.69 (3H, s), 1.42 (3H, d, J=7 Hz)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 184.5, 175.9, 170.7, 135.2, 134.9, 132.3, 132.1, 130.6, 129.0, 128.4, 126.3, 125.1, 120.5, 118.6, 81.8, 34.9, 20.0, 19.0
【００６７】
実験実施例１ 生体外活性試験
【００６８】
１−１ 実験準備
【００６９】
１−１−１ ベータアミロイド凝集の阻害試験
合成ベータアミロイド１−４２（バッヘム社（BACHEM））をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して２５０μＭ溶液にし、黒色平底マイクロプレート（フルオレッセントブラックプレート）上で１／１０にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、凝集を誘発した。実施例１で生成したタンシンノン化合物類のベータアミロイド凝集に対する阻害活性を比較して、１０μｇ／ｍｌで５０％以上の阻害活性を示す試験サンプルを使用に選び、添加して室温で１時間反応した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を５０ｍＭグリシン緩衝液で希釈し、この希釈溶液を穴当たり１５０μｌずつ各穴に添加した。マイクロプレートリーダー（サファイア（SAFIRE）、テカン社（TECAN））により、励起波長４５０ｎｍ／発光波長４８０ｎｍで吸光度を測定し、ベータアミロイド凝集に対する試験サンプルの阻害活性を５０％抑制濃度（ＩＣ５０）に変換した。
【００７０】
１−１−２ ベータアミロイド毒性の阻害試験
マウス神経細胞株ＨＴ２２を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ハイクロン社（Hyclone））と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ社（Sigma Co））を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ジブコ社（Gibco BRL））でインキュベートした。試験前にＨＴ２２細胞を、穴当たり５×１０３の密度で９６個穴プレートでインキュベートし、更に試験サンプル処理前に無血清ＤＭＥＭ培地で１時間インキュベートした。試験サンプルとして用いる実施例１で生成した種々濃度のジエチルエーテル抽出物をこれに加え、１時間インキュベートした。凝集ベータアミロイド（ＵＳペプチド社（US Peptide））を２５μＭになるようにこれと処理し、１８時間インキュベートし細胞壊死を誘発した。臭化３−（４，５−ジメチルー２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルー２Ｈテトラゾリウム（ＭＴＴ）の５ｍｇ／ｍｌ溶液を、各穴に穴当たり１５μｌ加え、穴で４時間インキュベートした。溶解緩衝液（１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０％ジメチルフォルムアミド、ｐＨ４．７）を各穴に、穴当たり１００μｌ加え一晩反応した。反応１８時間後、溶液の吸光度をマイクロプレートリーダー（サファイア（SAFIRE）、テカン社（TECAN））により、５７０ｎｍ／６３０ｎｍ波長で測定した（ジルラドン、エフら（Gillardon、F, et al）、ブレインリサーチ（Brain Research）、７０６（１）巻、１６９−１７２頁、１９９６年）。
【００７１】
１−１−３ 細胞毒性の測定
試験サンプルの細胞毒性を測定するために、１−１−２に開示と同様の方法に従いＨＴ２２細胞をインキュベートし、実施例１で生成した種々濃度の試験サンプルを細胞に加え１８時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液と溶解緩衝液を細胞に連続に加え、吸光度をマイクロプレートリーダー（サファイア（SAFIRE）、テカン社（TECAN））により、５７０ｎｍで測定した。
【００７２】
１−２ ミルチロン（化合物Ｓ−２−３）活性の結果
図２に示されるように、ミルチロン（化合物Ｓ−２−３）は、ベータアミロイド凝集に強力な阻害効果（０．７２ｍｇ／ｍｌ）を示したが、ベータアミロイド毒性を阻害しなかった。
【００７３】
１−３ １，２−ジジヒドロミルチロン（化合物Ｓ−２−６）活性の結果
図３に示されるように、１，２−ジヒドロミルチロン（化合物Ｓ−２−６）はベータアミロイド凝集に強力な阻害効果（０．４９ｍｇ／ｍｌ）を示したが、ベータアミロイド毒性を阻害しなかった。
【００７４】
１−４ タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）活性の結果
図４に示されるように、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）は、試験サンプルの中でベータアミロイド凝集にもっとも強力な阻害効果（０．１４ｍｇ／ｍｌ）を示し、ベータアミロイド毒性に対し僅かしか阻害効果を示さなかった。
【００７５】
１−５ タンシノンＩ（化合物Ｓ−８−４）活性の結果
図５に示されるように、タンシノンＩ（化合物Ｓ−８−４）は、ベータアミロイド凝集に強力な阻害効果（０．１９ｍｇ／ｍｌ）を示し、ベータアミロイド毒性に対し全く阻害効果を示さなかった。
【００７６】
１−６ ジヒドロタンシノンＩ（化合物Ｓ−８−１１）活性の結果
図６に示されるように、ジヒドロタンシノンＩ（化合物Ｓ−８−１１）は、ベータアミロイド凝集に強力な阻害効果（０．４０ｍｇ／ｍｌ）を示し、ベータアミロイド毒性に対し全く阻害効果を示さなかった。
【００７７】
実験実施例２ 生体内の活性試験
【００７８】
２−１ 実験計画法
受動回避試験のために、サムタッコ社（Samtaco Co.）から購入の体重２５ｇのＩＣＲオスマウスを、檻当たり５匹のマウスを飼育し、檻を以下の温度２２±２℃と相対湿度５０±５％の条件に維持し、１２時間の間隔で規則的に制御した明暗条件に保った。
合成ベータアミロイド１−４２（バッヘム社（BACHEM））をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して２５０μＭ溶液にし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０ｎＭに希釈し、３７℃で４日間（受動回避試験）又は６日間（Ｙ字型迷路試験）で凝集した。
凝集ベータアミロイド１−４２を文献に開示の方法に従いマウスに投与した（ローセン（Lausen）、ベルカンプ（Belknap）、ジャーナルオブファルマコロジカルメソッド（J. Pharmacol. Methods）、１６巻、３５５−３５７頁、１９８６年）。
凝集ベータアミロイド１−４２の５０μｌを、ゲージ２６の針を備えた５０μｌハミルトン（Hamilton）マイクロシリンジで十字縫合領域に深さ２．４ｍｍで投与した。ベータアミロイド投与後、行動試験をＹ字型迷路試験と受動回避（ＰＡ）試験に分割した。Ｙ字型迷路試験を投与後２日間、ＰＡ試験を投与後３日間行った。各試験を１０匹以上のマウスで行った。
実験終了持に、動物の脳を染色のために、１０％フォルマリン溶液に運び保存した。
【００７９】
２−２ 薬物療法
ベータアミロイド投与後、実施例１で生成のタンシノン化合物類を、Ｙ字型迷路試験の場合には１日に一回の間隔でマウスに投与し、受動回避試験の場合には３日間継続的に試験サンプルに投与し、二つの群、即ち一つは５０ｍｇ／ｋｇ処置群と、他の群は１００ｍｇ／ｋｇ処置群に分けた。各試験を投与翌日に行った。
【００８０】
２−３ 行動手段
【００８１】
２−３−１ 急性アルツハイマー病モデル実験―Ｙ字型迷路試験
ベータアミロイド投与後２日目に、Ｙ字型迷路試験を行った。黒色のＹ字型迷路ボックスは、互いに等しい角度を有する三本のアーム（長さ４０ｃｍ；高さ１０ｃｍ、幅５ｃｍ）からなる。迷路の中心にマウスを置き、この迷路で８分間自由に行動させた。マウスの通路へ入る順序を観察し、四肢が経路内に入る場合の進入待ち時間を測定した。空間記憶を測定するために、以下の経験式１により測定自発性進入岐路交替行動を計算し、マウスが持続的に三つの通路に進入した時を、一回の実際交替とした。
自発性進入岐路交替（％）＝（実際交替／アームへの進入総数―２）×１００
タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）が、試験サンプル中でベータアミロイド凝集に対しもっとも強力な阻害効果を示し、経口投与試験（２０００ｍｇ／ｋｇ）で毒性を示さなかったので、この化合物５０ｍｇ／ｋｇをベータアミロイドを脳室内経路で直接処理したマウスに経口投与し、脳損傷に対するこの化合物の回復効果をＹ字型迷路試験で見いだした。タンシノンＩＩＡ１００ｍｇ／ｋｇの処置でも、又タンシノンＩＩＡの１００ｍｇ／ｋｇと同様の効果を示した。図７に見られるように、マウスのベータアミロイド投与に起因する記憶学習障害が、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）処置により回復が示された。
【００８２】
２−３−２ 急性アルツハイマー病モデル実験―受動回避試験
ベータアミロイド投与後３日目に、受動回避試験を行った。黒色の回避シャトル箱を、格納扉（長さ４ｃｍ×幅３．５ｃｍ）で分割した同じ大きさの二つの部屋（長さ１８ｃｍ×幅９．５ｃｍ×高さ１７ｃｍ）に分け、電気により暗室の床上を走れるようにした。明室は蝶番付きプレキシグラス蓋上に２０ワットのランプを備え、マウスが格納扉を通して暗室に進入できるようにした。
実験は訓練セッションと試験セッションからなった。
訓練セッションでは、体重２５ｇのオスマウスを最初明室に置き、慣れさせた。次いで扉を開け、マウスが暗さを好んで明室から出て、暗室に入るやいなや直ちにその扉を閉め、電気ショック（０．２５ｍＡ、３秒間、一回）をグリッド床から３秒間マウスに送った。
訓練セッション後２４時間で、同一実験を再度マウスに行い、明室に留まる待ち時間を測定した。データは、３秒間の０．２５ｍＡの電気ショックによる前回訓練の記憶を意味する指標と見なした。明室から暗室に進入する待ち時間を、待ち時間による段階として測定した。限界時間（３００秒）以内に暗室に進入しない場合には、値３００秒を待ち時間とした。実施例で生成の試験サンプルを経口投与したマウスを用いて、受動回避試験を行った。
図８に示すように、待ち時間の変化は記憶低下又は回復を意味し、待ち時間の延長は記憶の向上を意味する。偽手術の対照群では待ち時間の変化はなく、溶媒投与の媒体対照群では、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）処置の待ち時間は、偽対照群に比べ有意に増加した（ｐ＜０．０５）。
【００８３】
２−３−３ 急性アルツハイマー病モデル実験における染色脳の免疫化学
行動試験の終わりに、マウスの脳を１０％フォルマリンに運び２４時間保持し、３０％サッカロース溶液に移した。この脳を固定後、クリオスタットを用いて、幅４０μｍに脳の冠状切断を行った。脳切片をクレシルバイオレット染色して脳神経細胞の損傷を確認し、アセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）染色してコリン作動性神経の損傷を確認し、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）染色してアストロサイトの活性化を確認した。
【００８４】
（a）クレシルバイオレット染色
組織をゼラチン塗布スライド上に置きクレシルバイオレットで染色後、エタノールを用いて組織を脱水した。組織を約３分間インキュベートし、０．５％クレシルバイオレットに３０分間浸漬した。この溶液をエタノールで再脱水した後に、切片をキシレンに３分間浸漬した。乾燥組織をカナダバルサム封入剤で固定した。
【００８５】
（ｂ）免疫組織化学
全ての抗体培養間の洗浄工程では、組織洗浄にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。内因性ペルオキダーゼの活性を低下するために、組織を０．５％過酸化水素で前処理後、室温で５％ＦＢＳで１時間処理して、非特異的結合を除去した。マウス抗ＧＦＡＰ（１：２００）モノクロナル抗体と、ヤギ抗ＣｈＡＴ（１：２００）ポリクローナル抗体を用いて、組織を一晩４℃でインキュベートした。西洋わさびペオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧと抗ヤギＩｇＧ二次抗体（１：６００）を、室温で１時間インキュベートし、培養後ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）キットで検出した。
図９に示されるように、ベータアミロイドに起因する記憶学習の損傷は、海馬の特定領域と緊密に相関し、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）は記憶学習の損傷を有意に回復することが確認された。ＣｈＡＴ染色とＧＦＡＰ染色の結果では、タンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）によりベータアミロイドに起因するコリン作用性神経の損傷を回復し、ベータアミロイドに起因する炎症反応と相関するアストロサイト活性の増加が減少した。
以下に賦形剤の処方法と種類を説明するが、本発明はこれらに限定されない。代表的調合例を以下に説明した。
【００８６】
粉末調合
ミルチロン ５０ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
粉末調合は上記成分を混合し、封入包みに詰めて調合した。
【００８７】
錠剤調合
１，２−ジジヒドロミルチロン ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
錠剤調合は上記成分を混合し、錠剤化して調合した。
【００８８】
カプセル剤調合
タンシノンＩＩＡ ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
錠剤調合は上記成分を混合し、在来のゼラチン調合法によりゼラチンカプセルに詰めて調合した。
【００８９】
注射調合
タンシノンＩ ５０ｍｇ
注射用蒸留水 適量
ｐＨ制御剤 適量
注射調合は活性成分を溶解し、ｐＨを約７．５に制御し、次いで全成分を２ｍｌアンプルに詰め、在来の注射調合法により殺菌して調合した。
【００９０】
液体調合
ジヒドロイソタンシノン ０．１−８０ｇ
砂糖 ５−１０ｇ
クエン酸 ０．０５−０．３％
カラメル ０．００５−０．０２％
ビタミンＣ ０．１−１％
蒸留水 ７９−９４％
炭酸ガス ０．５−０．８２％
液体調合は活性成分を溶解し、全成分を詰め、在来の液体調合法により殺菌して調合した。
【００９１】
健康食品の調合
タンシノンＩＩＡ １０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡ酢酸エステル ７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０μｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０μｇ
パンテニン酸カルシウム ０．５ｍｇ
ミネラル混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
第一リン酸カリウム １５ｍｇ
第二リン酸カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上述のビタミン混合物とミネラル混合物は、多くの形に変えられる。そのような変形は本発明の精神と範囲から逸脱するとは見なさない。
【００９２】
健康飲料の調合
ミルチロン １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
アンズ濃縮物 ２ｇ
タウリン １ｇ
蒸留水 ９００ｍｌ
健康飲料の調合は活性成分を溶解し、８５℃で１時間撹拌し、濾過後全成分を１０００ｍｌアンプルの詰め、在来の健康飲料調合法で殺菌して調合した。
この発明をこのように説明したが、同じことが多くの形に変えられることは明白である。そのような変形は本発明の精神と範囲から逸脱するとは見なさなく、そのような修正の全ては当業者には明白であり、以下の特許の請求項の範囲内に含まれることを意図する。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明で説明したように、タンジン（シソ科）から単離のタンシノン化合物類は、ベータアミロイドの凝集と同様に、ベータアミロイドに起因する毒性と細胞アポトーシスを阻害し、神経細胞増殖を刺激する。それ故認知機能障害を治療予防する治療薬類又は健康食品として、有害作用なしに使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
本発明の上記と他の目的、特性及び他の利点が、付随図面と組み合わした以下の詳細説明でより明白に理解できる。
【図１】図１にタンジン抽出物からタンシノン化合物類の単離スキームを示す。
【図２】図２にベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するミルチロン（化合物Ｓ−２−３）の阻害効果を示す。
【図３】図３にベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するジジヒドロミルチロン（化合物Ｓ−２−６）の阻害効果を示す。
【図４】図４はベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するタンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）の阻害効果を表す。
【図５】図５はベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するタンシノンＩ（化合物Ｓ−８−４）の阻害効果を表す。
【図６】図６はベータアミロイドの凝集と細胞毒性に対するジヒドロタンシノンＩ（化合物Ｓ−８−１１）の阻害効果を表す。
【図７】図７にタンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）を用いた記憶学習研究（Ｙ字型迷路試験）の結果を示す。
【図８】図８にタンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）を用いた記憶学習試験（受動回避試験）の結果を示す。
【図９】図９に対照群とタンシノンＩＩＡ（化合物Ｓ−４−４−１）で治療した試験群間のマウス染色脳の比較を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
認知機能障害を治療予防するために、有効成分としてタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類と、医薬的に容認の担体、希釈剤又はアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項２】
該認知機能障害が、アルツハイマー型認知症、脳血管型認知症、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、頭部損傷又はパーキンソン病起因の認知症から選んだ、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
有効量のタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類と、その中の医薬的に容認の担体とを一緒に哺乳類に投与することを含む、該哺乳類の認知機能障害の治療又は予防法。
【請求項４】
認知機能障害の治療予防用の治療薬製造にタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選択のタンシノン化合物類の使用。
【請求項５】
認知機能障害を治療予防するために、タンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を、食品学的に容認の添加物と一緒に含む健康食品。
【請求項６】
該健康食品が粉末、顆粒、錠剤、咀嚼錠剤、カプセル剤又は飲料型として提供される、請求項５に記載の健康食品。
【請求項１】
認知機能障害を治療予防するために、有効成分としてタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類と、医薬的に容認の担体、希釈剤又はアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項２】
該認知機能障害が、アルツハイマー型認知症、脳血管型認知症、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、頭部損傷又はパーキンソン病起因の認知症から選んだ、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
有効量のタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類と、その中の医薬的に容認の担体とを一緒に哺乳類に投与することを含む、該哺乳類の認知機能障害の治療又は予防法。
【請求項４】
認知機能障害の治療予防用の治療薬製造にタンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選択のタンシノン化合物類の使用。
【請求項５】
認知機能障害を治療予防するために、タンジンから単離のミルチロン、１，２−ジジヒドロミルチロン、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩ及びジヒドロタンシノンＩからなる一群から選んだタンシノン化合物類を、食品学的に容認の添加物と一緒に含む健康食品。
【請求項６】
該健康食品が粉末、顆粒、錠剤、咀嚼錠剤、カプセル剤又は飲料型として提供される、請求項５に記載の健康食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５１１４６７（Ｐ２００９−５１１４６７Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３４４４３（Ｐ２００８−５３４４４３）
【出願日】平成１８年１０月４日（２００６．１０．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００３９９９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４０３４５
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０５１１４４３３）デジタル バイオテック カンパニー リミテッド (5)
【出願人】（５０８０９５９９１）イルサング ファーマセウティカルズ カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月４日（２００６．１０．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００３９９９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４０３４５
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０５１１４４３３）デジタル バイオテック カンパニー リミテッド (5)
【出願人】（５０８０９５９９１）イルサング ファーマセウティカルズ カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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