デンドロビウム植物からの生物活性抽出物、その用途及びその調整方法
【課題】眼科疾病、特に網膜色素上皮細胞関連疾患の治療及び／又は予防に有用な新規化合物、及び該化合物を含有する医薬組成物の提供。
【解決手段】下式の構造を有する化合物、及び該化合物を含有する医薬組成物。
（式中、Ｒ１とＲ２は単糖成分であり、好ましくはそれぞれα−アラビノース、β−アラビノース及びβ−キシロースの中の一つから選ばれる。）該化合物は、デンドロビウム植物抽出物から得られる。
【解決手段】下式の構造を有する化合物、及び該化合物を含有する医薬組成物。
（式中、Ｒ１とＲ２は単糖成分であり、好ましくはそれぞれα−アラビノース、β−アラビノース及びβ−キシロースの中の一つから選ばれる。）該化合物は、デンドロビウム植物抽出物から得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性を有する植物抽出物の調整方法及び該関連抽出物に関し、特に水溶性有機溶剤又は水溶性有機溶剤と水との混合物を利用して植物抽出物を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アメリカ特許Ｎｏ．７，１０１，５７７に記載しているように、デンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ） 種は早くから眼科疾病の最も貴重な中国産ハーブ（薬剤）として知られている。我々の従来の研究結果によれば、ヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）（伝統的に治療効果を有するものとしてのデンドロビウム植物（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｌａｎｔ）の総称）はもっとも生物活性を有することを発見している。しかしながら、近年の傾向によれば、その茎部で治療効果を有するデンドロビウム植物（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｌａｎｔ）はカウリス・デンドロビー（Ｃａｕｌｉｓ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）と通称され、その植物全体で治療効果を有するデンドロビウム植物（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｌａｎｔ）はヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｉｉ）と通称されている。
【０００３】
上記アメリカ特許において開示された内容によれば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は網膜表層の単層細胞であり、ブルーフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）と光受容体との間に位置していることが知られている。ＲＰＥ細胞が効果的に脈絡膜及び網膜層との有毒物質及び代謝物を除去又は輸送できるので、非常に重要な網膜血管障壁の役割を果たしている。更に、ＲＰＥ細胞は多くの機能、例えば光線の受容、食桿状細胞及び錐状細胞が光線の刺激を受けて脱落した桿体セグメント（ＲＯＳ）の食作用、食作用胞の代謝、細胞外基質と黒色素（メラニン）とを合成、薬物を解毒、光受容体の外節再生時に不可欠な物質を提供、ビタミンＡを貯蔵及び運送、ロドプシンを合成、網膜の接着力を形成の機能が挙げられる。ＲＰＥ細胞の正常な食作用は網膜中の光受容体の健康状態の維持に対して相当大きな関連性を有しているので、一旦食作用機能が降下すると光受容体の退化を引起す。ＲＰＥ細胞は年齢の増加につれて死滅又は他所に転移するが、老化したＲＰＥ細胞はなお食作用能力を有する。更に、桿状細胞の損失は錐状細胞の損失よりも多く、老人の視力減退及び疾病の発生を来たす場合があるので、ＲＰＥ細胞機能の維持は視覚器官にとって非常に重要である。
【０００４】
免疫系等において一酸化窒素（ＮＯ）は防御の役割を演ずると共に細胞に対して毒性を有し、血管系において一酸化窒素ＮＯはいわゆる内皮細胞由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）であり、そして中枢神経系統において一酸化窒素ＮＯは神経伝達物質として作用する。
【０００５】
一酸化窒素ＮＯは、一酸化窒素シーンテターゼ（ＮＯＳ）を介してＬ−アルギニンをＬ−シトルリンに転換する過程から解離される。一酸化窒素シーンテターゼ（ＮＯＳ）はそれぞれニューロンＮＯＳ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ＮＯＳ），内皮ＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ＮＯＳ）及び免疫ＮＯＳ（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ＮＯＳ）の三種の異性体がある。その中で、ニューロンＮＯＳ及び内皮ＮＯＳは基本型であって、ｃＮＯＳと略称され、その活性はカルシウムイオンＣａ＋＋及びカルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）により調節をされ、解離した一酸化窒素ＮＯの濃度はｎＭ（１０−９Ｍ）レベルであり、免疫ＮＯＳは誘導可能型であって、ｉＮＯＳと略称されるがその活性はＣａ＋＋及びカルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）の調節を受けず、解離した一酸化窒素ＮＯの濃度はｍＭ（１０−６Ｍ）レベルである。また、ｃＮＯＳとｉＮＯＳの遺伝子はそれぞれ異なる染色体上に位置する。
【０００６】
網膜中において、一酸化窒素シーンテターゼ（ＮＯＳ）は網膜神経細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎ）、ＲＰＥ細胞、無軸索細胞（ａｍａｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌ）及び視神経節細胞（ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ）、粘質細胞（Ｍｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）中に発見されていて、酸化窒素ＮＯは生理学及び病理学において、重要な役割を演じ、眼の機能と密接に関係があることは明らかである。
【０００７】
基礎環境又は局所貧血環境（ｉｓｃｈｅｍｉａ）下において、一酸化窒素（ＮＯ）が網膜血流量を制御する能力を有することが既に発見されている。更には、一酸化窒素ＮＯは糖尿病により引起こされた網膜内血管損害の程度を調節する可能性を有している。しかも、網膜グリア細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）及びＲＰＥ細胞がＬＰＳ， ＩＦＮ−γ， ＴＮＦ−αの刺激を受けた場合、一酸化窒素シーンテターゼ（ＮＯＳ）を大きく発現し、一酸化窒素（ＮＯ）を大量生産することから、つまり、一酸化窒素（ＮＯ）は網膜が発症し又は感染を受けた状況下において、防御、保護機構の役割を演ずることができることがわかる。
【０００８】
しかしながら、現在に至るまで、光受容体におけるｃＮＯＳの位置及び特性はまだ明白ではなく、ある文献では光受容体の本体はｃＮＯＳ活性を有しており、また他の文献では光受容体セグメントにおいてのみｃＮＯＳ活性があり、そして解離した一酸化窒素（ＮＯ）は光の伝達、神経シナプスの信号伝達、生理学的状態下又は局所貧血状態下の網膜血流量等を調節することができると開示している。ｉＮＯＳの活性は、また網膜の一部の細胞、例えばＲＰＥ細胞及び粘質細胞（Ｍｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）等の細胞中において発見されており、そしてある文献では牛網膜色素上皮細胞中の培地において、ＩＦＮ−γ，ＬＰＳ，ＴＮＦ−αの刺激後約１２時間経過すれば、大量の一酸化窒素（ＮＯ）を解離し、少なくとも９６時間持続すると示唆している。サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）のＲＰＥ細胞のｉＮＯＳ活性上における影響は非常に複雑であり、例えば、牛ＲＰＥにおいて、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αの刺激が、大量の一酸化窒素（ＮＯ）を解離するのに必要である。ｂＦＧＦはＮＯＳを抑制する作用を有するが、ＴＧＦ−βは僅かにＮＯＳの機能を促進する作用を有するにすぎない。ヒトＲＰＥ細胞については、必ずインターロイキン−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）の刺激があってから大量の一酸化窒素（ＮＯ）を解離できるが、ＬＰＳはヒトＲＰＥ刺激するために必要な要素ではなく、ＴＧＦ−βは明らかにヒトＲＰＥ中の一酸化窒素（ＮＯ）の解離を抑制できる。
【０００９】
細菌の感染を受けた場合、ｉＮＯＳの発現は有益であり、それにより解離した一酸化窒素（ＮＯ）は侵入した微生物を殺すことができ、反対に、ある状況下において、解離した一酸化窒素（ＮＯ）を大量に発生しすぎると、却って解離した一酸化窒素ＮＯは自己免疫疾患又は敗血性ショックを引起す。１９９４年に初めて一酸化窒素ＮＯと眼底の炎症との間係を説明する証拠が提出され、本願出願人はｉＮＯＳ抑制剤が内毒素により引起された葡萄膜炎を断絶できることをも発見した。他方、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳでＲＰＥを処理して大量の一酸化窒素（ＮＯ）を発生させる作用がａＦＧＦ、ｂＦＧＦにより抑制され、且つ抑制はｉＮＯＳの発現であり、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの安定性でないと示唆された。したがって、本願出願人は、ＦＧＦは内毒素又はサイトカインにより引起された傷害を受けないようにＲＰＥを保護できると推測した。これからｉＮＯＳは網膜中において免役調節の役割をも演ずることができることがわかる。
【００１０】
通常の網膜疾患は、糖尿病により引起こされた増殖性糖尿病性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）増殖性ガラス体網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）及び老年性黄斑部変性（Ａｇｅｄ−ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）等があり、そして網膜の疾患はあらゆる眼科疾病において最も治療しにくい疾病である。高血糖（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）が糖化作用の発生を加速して高度に糖化した最終生産物（ＡＧＥｓ）を産出するのは、ずっと糖尿病末期に発症した各種血管・神経併発症と緊密に関係するものと信じられてきた。ＡＧＥの形成は還元糖のアルデヒド基又はケトン基が蛋白質の第一級アミノ酸と非酵素的な作用を通して不安定なシッフ塩基（Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）を形成し、更にアマドリ転移（Ａｍａｄｏｒｉ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を通してアマドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）産物を産出してなる。非酵素糖化作用は不可逆反応で且つ多くは長期半減期を有する蛋白質上に発生するのは周知であり、ＡＧＥの形成が交差反応（クロス・リンキング）を生じる場合、蛋白質分子はプロテアーゼに対して抵抗性を有するようになるので、ＡＧＥの累積は老化の兆候である。年齢の増加につれて、脳部位錐状神経（ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）、ブルーフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、膠原質蛋白（コラーゲン）中のＡＧＥの含量もこれに伴って上昇する。非酵素糖化作用の反応速度は一次反応であり、反応速度は還元糖と蛋白質の濃度に依存する。通常、糖尿病患者の血糖値は健常人よりも高いので、糖化作用は加速するようになる。糖尿病患者の病気または症状は、動脈粥状硬化、腎臓損傷、血管損傷、神経変性、網膜変性及び卒中を含み、糖尿病患者が健常人よりも高い罹患可能性をもつのは周知のことであり、いずれもＡＧＥと直接的な関係を有する。糖尿病に由来する赤血球の凝集は、主としてアルブミンが糖化された後、その三次構造に変化を生じ、抗凝集の機能を喪失することに起因する。他の研究によれば、糖尿病が腎臓絲球体の透過性の変化を誘引するのは、アルブミンの糖化に起因するもので、賢小球基膜（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の糖化によるものでない。そして糖化された蛋白質はその脳血管障壁のより高い通透能力を持つ。
【００１１】
ＡＧＥは細胞表面上の一部の受容体又は蛋白質と結合できる。公知の受容体として、スカベンジャ受容体第一型および第二型、ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）、ＯＳＴ−４８ （ＡＧＥ−Ｒ１）， ８０Ｋ−Ｈ リンタンパク質（ＡＧＥ−Ｒ２）， 及び ガレクチン−３（ｇａｌｅｃｔｉｎ−３） （ＡＧＥ−Ｒ３）が知られている。また、単核球、マクロファージ、内皮細胞、グリア細胞において、ＡＧＥ受容体が発見された。これらの細胞がＡＧＥに活性化されたとき、細胞外基質蛋白、血管附着分子及び生長因子の発現量を増加させ、異なる細胞型及び信号伝達に依存して、例えば、走化性（ケモタキシス）、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、酸化ストレス、細胞増殖又はプログラム細胞死を前記状況に伴って生じる。ヒト脳部の各種細胞は、異なる高度糖化終産物受容体を発現可能であり、ＡＧＥを遊離する。この遊離能力が喪失した時、細胞外にＡＧＥの累積をもたらし、中枢神経系統の炎症反応を誘発する。そしてＡＧＥはＰＲＥ細胞の網膜血管内皮細胞生長因子、及びＰＤＧＦ−βの発現を誘導させる。ＡＧＥは老化過程中において重要な役割を演ずるので、糖化アルブミンによる病理モデルは新薬の開発に非常に重要である。
【００１２】
肝細胞成長因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は肝臓で最も重要な成長因子であり、６０ＫＤａの重鎖（α鎖）及び３０ＫＤａの軽鎖（β鎖）をジスルフィド結合で結合して形成されたものである。新しく形成したＨＧＦ／ＳＦはプレプロ ＨＧＦ／ＳＦであり、酵素で修飾が必要で、ヘテロダイメトリック形に形成した後、生物活性を有する。ＨＧＦは多機能の生長因子であり、種々の細胞に対して生長を調節する能力があるばかりでなく、組織回復及び器管再生においても重要な役割を演じている。ＨＧＦは体内に十分広く分布しており、その内肝臓の生産量が最大であり、更に、膵臓、胸腺、血液、小腸、胎盤等でも発見されている。また、ＨＧＦ／ＳＦ又はＨＧＦ／ＳＦ受容体は眼の分泌物及び組織中、例えば涙液・涙腺・角膜に存在しており、これからＨＧＦは眼を調整する役割を有すると推測される。更に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は同時にＨＧＦ及びＨＧＦ受容体があるばかりでなく、ｃ−Ｍｅｔのチロシン燐酸化反応もずっと持続的に発現しているので、ＨＧＦは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞について自己刺激作用をもつ成長因子であり、且つ網膜の分化、傷口の治癒及び網膜血管の新生と関連する。
【００１３】
以上の内容から分かるように、ＲＰＥ細胞は網膜調整機構上で非常に重要な役割を演じている。すなわち、チャイニーズ・ハーブであるデンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）種はＲＰＥ細胞の部分機能もしくは調整制御機制を増強又は抑制することが知られている。特に、デンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）種がＲＰＥ細胞の食作用、ＲＰＥ細胞の一酸化窒素（ＮＯ）の形成及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の遺伝子発現を増強できることにある。デンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）種は、標準状態又は局所失血環境下において、ＲＰＥ細胞中のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βの遺伝子発現量を抑制できる。したがって、ＲＰＥ細胞活性を増強する因子に関する研究は、人体の健康の改善に対して重要である。過去における研究では、ヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）抽出物がＲＰＥ細胞の食作用を加速又はＡＧＥ分解を増加する効果を有すると知られているが、更に、そのＰＲＥの食作用の効果を制御するためにヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）からの抽出物に対してより深く理解しなければならない。したがって、出願人は従来の技術の欠点にかんがみ、鋭意に試験及び研究を重ねた結果、ついに本発明の「デンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）植物からの抽出物及びその製造方法」を案出した。
【００１４】
［発明の内容］
本発明は、以下の式１の構造を有する物質を包含する組成物を提供する。
式中Ｒ１とＲ２は単糖部分である。
【００１５】
好ましくは、式中Ｒ１とＲ２は同一又は異なる官能基の中の一つである。
【００１６】
好ましくは、式中Ｒ１またはＲ２はそれぞれα−アラビノース、β−アラビノース及びβ−キシロースの中の一つから選ばれる。
【００１７】
好ましくは、該物質はアピゼニン６，８−ジ−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル−８−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド−８−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシド及びその混合物の中から一つ選ばれる。
【００１８】
好ましくは、式中Ｒ１又はＲ２は同一または異なる官能基であり、且つ、それぞれＣ−β−Ｄ−グルコピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−アラビノピラノシル，Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル，Ｃ−α−Ｌ−ラムノピラノシル及びＣ−６−デオキシ−キシロ−ヘキソース−４−ウロシルの中の一つから選ばれる。
【００１９】
好ましくは、該物質は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を促進する効果を有する。
【００２０】
本願発明の別の態様によれば、請求項１から４の一つに請求された物質が提供され、該物質はＲＰＥ細胞関連疾患の治療及び／又は予防に用いられる。
【００２１】
好ましくは、ＲＰＥ細胞関連疾患は、網膜色素上皮細胞退化、老年性黄斑変性、光受容体退化、糖尿病、動脈硬化、血管損傷、網膜神経細胞変性、無軸索細胞変性、視神経節細胞変性、ミュラー細胞変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、網膜炎及びブルーフ（Ｂｒｕｃｈ‘ｓ）膜変性の中から少なくとも一つ選ばれるか、これらの合併症である。
【００２２】
本願発明の更に別の態様によれば、請求項１の物質を含む組成物が提供される。
【００２３】
好ましくは、該組成物は該物質の担体にとって生理学的に受容可能な担体を含有する。
【００２４】
好ましくは、該生理学的に受容可能な担体は薬理学的担体である。
【００２５】
好ましくは、該組成物は生理活性組成物である。
【００２６】
好ましくは、該生理活性組成物は薬理学的組成物である。
【００２７】
好ましくは、該組成物はＲＰＥ細胞の食作用を促進させる効果を有する。
【００２８】
好ましくは、該組成物はＲＰＥ細胞関連疾患の治療及び／又は予防に使用される。
【００２９】
本願発明の更に別の態様によれば、請求項１による物質の投与の工程を含む、ＲＰＥ細胞の活性を促進する方法が提供される。
【００３０】
好ましくは、該物質は生理学的に受容可能な担体により運搬される。
【００３１】
好ましくは、該物質及び生理学的に受容可能な担体は生理活性組成物である。
【００３２】
本願発明の更に別の態様によれば、請求項１〜４の一つによる物質の用途はＲＰＥ細胞関連疾患治療及び／又は予防するために薬剤を調整するためである。
【００３３】
好ましくは、ＲＰＥ細胞関連疾患は、網膜色素上皮細胞退化、老年性黄斑変性、光受容体退化、糖尿病、動脈硬化、血管損傷、網膜神経細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、ミュラー細胞変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、網膜炎及びブルーフス（Ｂｒｕｃｈ‘ｓ）膜変性の中から少なくとも一つ選ばれるか、これらの合併症である。
【００３４】
本願発明の更に別の態様によれば、請求項１〜４による物質をＲＰＥ細胞に投与する工程を有する、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を促進するための方法が提供される。
【００３５】
本願発明の目的及び利点は、下記の詳細な説明及び添付の図面詳細に調べられた後、当業者により容易に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の好適な実施例のヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｏｒｏｂｉｉ）抽出物の分離プロトコールのフローチャートである。
【図２】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３がＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得られた結果を示す。
【図３】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３がＨＰＬＣクロマトグラフィで分析して得られた結果を示す。
【図４】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２がＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得られた結果を示す。
【図５】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２がＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで再度分析して得られた結果を示す。
【図６】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３がＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得られた結果を示す。
【図７】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４をメタノール溶液中に溶解したＵＶスペクトラム図である。
【図８】本発明のヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｏｒｏｂｉｉ）抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３がＰＲＥ細胞全食作用に対する効果の柱形図である。
【図９】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３がＰＲＥ細胞内食作用に対する効果の柱形図である。
【図１０】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２がＰＲＥ細胞全食作用に対する効果の柱形図である。
【図１１】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２がＰＲＥ細胞内食作用に対する効果の柱形図である。
【図１２】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３がＰＲＥ細胞全食作用に対する効果の柱形図である。
【図１３】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３がＰＲＥ細胞内食作用に対する効果の柱形図である。
【図１４】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４がＰＲＥ細胞全食作用に対する効果の柱形図である。
【図１５】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４がＰＲＥ細胞内食作用に対する効果の柱形図である。
【００３７】
本願発明は以下の実施例の参照によって、より専門的に述べられる。本願の好ましい実施例の以下の詳細な説明は図示と詳細な説明のためにだけここに提出される。また、開示された精密な様式はそれのみに費やされたり限定されるものではない。
【００３８】
（１）ヘルバ・デンドロビー抽出物の製造及びその精製活性成分の分離。
【００３９】
図１を参照されたい。図１は本発明の好適な実施例のヘルバ・デンドロビー抽出物の分離プロトコールのフローチャートである。以下の方法でヘルバ・デンドロビー中の三種の活性成分を分離できる。１．９ｋｇのヘルバ・デンドロビーをメタノールで三度抽出して、ヘルバ・デンドロビーメタノール抽出物を獲得し、そして該ヘルバ・デンドロビーのメタノール抽出物を再濃縮した後、完全に乾燥させてＤＣＭ（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉアルコール類粗抽出物）標準品を形成した。乾燥したＤＣＭ標準品を２Ｌのエタノール（ＥｔＯＡｃ）中に溶解し、２Ｌの水で分抽を行って、エタノール及び第１水層を得た。該第１水層を再度２Ｌのエタノールで２度抽出して全てのエタノール層を収集した後、濃縮を進行し、完全に乾燥してエタノール抽出物を得た。乾燥したエタノール抽出物をそれぞれ４Ｌのヘキサン及び２Ｌのメタノールで三度分抽してヘキサン層及びメタノール層を得た。濃縮及び乾燥を経た後、乾燥後のヘキサン層及びメタノール層をそれぞれＤＣＭＰｅ／ｈ標準品（Ｐｅ／ｈ）及びＤＣＭＰｅ／ｍ標準品（Ｐｅ／ｍ）と命名した。このほかに脱イオン水を添加して第１水層を２Ｌに調整し、更にブタノール２Ｌで分配抽出してブタノール層及び第２水層を得、減圧、濃縮、乾燥後、乾燥したブタノール層及び第２水層をＤＣＭＰｂ標準品（Ｐｂ）及びＤＣＭＰｗ標準品（Ｐｗ）と命名した。Ｐｂ標準品はＬＨ２０ゲルで分子カラムクロマトグラフィ（２．５ｘ１０７ｃｍ、移動相がメタノール：水＝５０：５０）を行い、活性のスクリーニングを行った後、ＤＣＭＰｂＬ６，７と命名した標準品を得た。これに続いてダイアイオン（Ｄｉａｉｏｎ）ＳＰ−２０ＳＳでカラムクロマトグラフィ（１ｘ３０ｃｍ）の吸着を行い、移動相がイソプロパノール：水＝２０：８０である場合、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２と命名した溶出産物を得ることができた。移動相がイソプロパノール：水＝３０：７０である場合、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３と命名した溶出産物を得ることができた。そして移動相がイソパノール：水＝４０：６０である場合、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４と命名した溶出産物を得ることができた。更にＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２が再びＨＰＬＣ逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ）Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（１０ｘ３００ｍｍ）を通過した移動相がメタノール：水：酢酸＝３５：６５：１にある場合に溶出し、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２と命名した溶出産物を収集した。
【００４０】
従来の研究の成果によれば、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速及び高度糖化最終産物（ＡＧＥ）分解を増加する効果を有する。更に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞食作用の加速の効果を理解するために、更なる操作が実施された。
【００４１】
ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２は再度ＨＰＬＣ逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（１０ｘ３００ｍｍ）により移動相がメタノール：水：酢酸＝４０：６０：１を用いて溶出して、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３と命名した溶出産物を得た。また、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３は再度ＨＰＬＣ逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（４．６ｘ２５０ｍｍ）により移動相がメタノール：水＝３５：６５で溶出して、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２と命名した溶出産物を得た。更に、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ３もＨＰＬＣ逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（４．６ｘ２５０ｍｍ）により移動相がメタノール：水＝４０：６０で溶出した結果、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３と命名した溶出産物を得た。また、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３もＨＰＬＣ逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（４．６ｘ２５０ｍｍ）により、移動相がメタノール：水＝４５：５５で溶出し、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４と命名した溶出産物を得た。
【００４２】
図２は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３をＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析した結果を示す図である。図２中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜８０分間、メタノール／水＝２０／８０から１００％メタノールまでの濃度勾配、８０〜１００分間、１００％メタノールであり；注入容量が５０μｌであり；注入重量が５μｇであり；流速が０．２５ｍｌ／分、ＵＶ波長３３７ｎｍである。
【００４３】
図３は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３をＨＰＬＣでクロマトグラフィ分析して得た結果を示す図である。図３中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜４０分間、メタノール／水＝３５／６５、４０〜４５分間、メタノール／水＝３５／６５から１００％メタノールへの濃度勾配であり、そして４５〜６０分間、１００％メタノールであり；注入容量が２５０μｌ、注入重量２５０μｇであり、流速が０．８ｍｌ／分、ＵＶ波長２８０ｎｍ、３１２ｎｍ及び３３７ｎｍである。Ｈ２はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２を示し、Ｈ３がＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３を示し、そしてＨ４がＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４を示す。
【００４４】
図４は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２をＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得た結果を示す図である。図４中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜８０分間にメタノール／水＝２０／８０から１００％メタノールへの濃度勾配、８０〜１００分間に１００％メタノールであり；注入容積が１００μｌであり、注入重量５μｇであり；流速が０．８ｍｌ／分、ＵＶ波長２２０ｎｍにおいてマススペクトロメータ（ＭＳ）でＡＰＣＩ＋モードの条件に設定した。
【００４５】
図５は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２を別のＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで再度分析して得た結果を示す図である。図５中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜８０分間にメタノール／水＝２０／８０から１００％メタノールへの濃度勾配、８０〜１００分間に１００％メタノールであり；注入容積が１００μｌであり、注入重量５μｇであり；流速が０．８ｍｌ／分、ＵＶ波長２２０ｎｍにおいてマススペクトロメータ（ＭＳ）でＡＰＣＩ＋モードの条件に設定した。
【００４６】
図６は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３をＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得た結果を示す図である。図６中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜８０分間にメタノール／水＝２０／８０から１００％メタノールへの濃度勾配、８０〜１００分間に１００％メタノールであり；注入容積が１００μｌであり、注入重量５μｇであり；流速が０．８ｍｌ／分、ＵＶ波長２２０ｎｍにおいてマススペクトロメータ（ＭＳ）でＡＰＣＩ＋モードの条件に設定した。
【００４７】
図７は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４（５０μｇ／ｍｌ）をメタノール溶液中に溶解したＵＶスペクトラム図である。図７に示すようにＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４は波長（入）が３３４ｎｍでｂａｎｄＩを有し、波長２７５ｎｍでｂａｎｄＩＩを有しているので該化合物は一種のフラボノイド化合物と推論することができる。
【００４８】
以上の結果から、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３の分子量は約５３４であり、そしてアピゼニン６，８−ジ−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル−８−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル−８−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシド及びその混合物からその中の一つを選ぶことができるのを発見できる。その中でアピゼニン６−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル−８−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシドの構造は下記に示すとおりである。
【００４９】
また、他に、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３の赤外吸収スペクトル（ＩＲ）分析結果（図示せず）もＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３の構造特徴がアピゼニンの６，８−ジ−Ｃ−グリコシドの構造特徴と符合していることを示している。
【００５０】
更に、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４に試薬（塩化アルミニウム、酢酸ナトリウム又は酢酸ナトリウムと硼酸との混合溶液）を添加した後、紫外吸収スペクトル（ＵＶ）でその結果を分析した。ＵＶ結果からＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４の構造特徴がフラボノイド化合物（Ｃ−５及びＣ−７位置はヒドロキシル基であり、Ｃ−３位置はヒドロキシル基ではない）の構造特徴と符合していることを示している。
【００５１】
更に、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）分析後、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４の水素核磁気共鳴スペクトル（Ｈ−ＮＨＲ）及び炭素核磁気共鳴スペクトル（Ｃ−ＮＭＲ）の結果から、その対応する構造特徴がアピゼニンの６，８−Ｄｉ−Ｃ−グリコシドの構造特徴と符合していることを示している。
【００５２】
上記結果から、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２の物質、例えば、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４は、アピゼニンの６，８−ジ−Ｃ−グリコシド又はその誘導体であり、以下の構造を有していることを発見された。
式中、Ｒ１とＲ２は同一または異なる官能基であり、それぞれα−アラビノース（α−Ａｒａ）、β−アラビノース（β−Ａｒａ）及びキシロース（β−Ｘｙｌ）の中の一つから選ばれる。Ｒ１とＲ２は同一または異なる単糖成分でありうる。
【００５３】
天然のＣ−糖残基のＣ−糖鎖フラボノイドはＣ−β−Ｄ−グルコピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−アラビノピラノシル，Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル，Ｃ−α−Ｌ−ラムノピラノシル及びＣ−６−デオキシ−キシロ−ヘキソース−４−ウロシルを含み、また、上記実験はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３、及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４がいずれも前記したＣ−グリコシドの主構造を有しているので、上記７種の天然のＣ−糖鎖フラボノイドからＲ１及びＲ２が選ばれる時、その中から４８種の対応化合物を得ることができる。同様にＲ１及びＲ２が非天然のＣ−糖鎖残基から選ばれる時、４８２種の対応化合物を得ることができる。これから、もしＣ−４´、Ｃ−５及びＣ−７に位置する官能基がその他の官能基に置換された時、対応誘導体の数は莫大になることがわかる。表１はＲ１とＲ２の単糖成分の可能な天然官能基の組み合わせを表わす。
【表１】
【００５４】
Ｒ１とＲ２の可能な非天然官能基の組み合わせは以下の表２に示すとおりである。
【表２】
【００５５】
図８はＲＰＥ細胞全食作用に対する本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３の効果を示す柱形図である。図８に示すように、種々の濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌ）はいずれも網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速でき、その関連実験を以下のように簡単に説明する。１×１０４ＲＰＥ細胞をウエルごとに９６ウエル・マイクロプレートに注入し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有したＤＭＥＭ培養液中において４８時間培養した後、培養液を２％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭ培養液に取り替えた。しかる後、それぞれ異なる濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３をそれぞれ添加し、２４時間後、５０μｌの２×１０７／ｍｌ標識ＦＩＴＣ蛍光のＲＯＳ細胞（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）を各ウエル中に添加して、４時間培養後、２％蔗糖を混合した燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞表面に付着していないＦＩＴＣ−ＲＯＳを洗浄した。放射波長は４８５ｎｍで、検出波長は５３０ｎｍである。１４２０マルチラブル・カウンター（Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰＥ）測定システムによって、蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度が全食作用の結果を表わす。蛍光クェンチ（Ｑｕｅｎｃｈ）染料を添加すれば、検出された蛍光強度は細胞食作用の結果を表わす。２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で処理したＲＰＥ細胞の食作用と比較した結果、＊はＰ値が０．０５よりも小さいことを表わし，＊＊はＰ値が０．０２よりも小さいことを表わし、＊＊＊はＰ値が０．０１よりも小さいことを表わし、＊＊＊＊はＰ値が０．００１よりも小さいことを表わす。また、図９は、本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３のＲＰＥ細胞内食作用に対する効果を示す柱形図である。
【００５６】
図１０は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２のＲＰＥ細胞全食作用に対する効果を示す柱形図である。図１０に示すように種々の濃度（０．１，１，１０，及び１００μｇ／ｍｌ）のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２はいずれも網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速でき、その関連実験内容は以下のように簡単に説明される。１×１０４ＲＰＥ細胞をウエルごとに９６ウエル・マイクロプレートに注入し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有したＤＭＥＭ培養液中において４８時間培養した後、培養液を２％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭ培養液に取り替えた。しかる後、それぞれ異なる濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２をそれぞれ添加し、２４時間後、５０μｌの２×１０７／ｍｌ標識ＦＩＴＣ蛍光のＲＯＳ細胞（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）を各ウエル中に添加して、４時間培養後、２％蔗糖を混合した燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞表面に付着していないＦＩＴＣ−ＲＯＳを洗浄した。放射波長は４８５ｎｍで、検出波長は５３０ｎｍである。１４２０マルチラブル・カウンター（Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰＥ）測定システムによって、蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度が全食作用の結果を表わす。蛍光クェンチ（Ｑｕｅｎｃｈ）染料を添加すれば、検出された蛍光強度は細胞食作用の結果を表わす。２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で処理したＲＰＥ細胞の食作用と比較した結果、＊はＰ値が０．０５よりも小さいことを表わし，＊＊はＰ値が０．０２よりも小さいことを表わし、＊＊＊はＰ値が０．０１よりも小さいことを表わし、＊＊＊＊はＰ値が０．００１よりも小さいことを表わす。また、図１１は、本発明のヘルバ・デンドリビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２のＲＰＥ細胞内食作用に対する効果を示す柱形図である。
【００５７】
また、図１２は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３のＲＰＥ細胞全食作用に対する効果を示す柱形図である。図１２に示すように種々の濃度（０．１，１，１０，及び１００μｇ／ｍｌ）のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３はいずれも網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速でき、その関連実験内容は以下のように簡単に説明される。１×１０４ＲＰＥ細胞をウエルごとに９６ウエル・マイクロプレートに注入し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有したＤＭＥＭ培養液中において４８時間培養した後、培養液を２％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭ培養液に取り替えた。しかる後、それぞれ異なる濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３をそれぞれ添加し、２４時間後、５０μｌの２×１０７／ｍｌ標識ＦＩＴＣ蛍光のＲＯＳ細胞（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）を各ウエル中に添加して、４時間培養後、２％蔗糖を混合した燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞表面に付着していないＦＩＴＣ−ＲＯＳを洗浄した。放射波長は４８５ｎｍで、検出波長は５３０ｎｍである。１４２０マルチラブル・カウンター（Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰＥ）測定システムによって、蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度が全食作用の結果を表わす。蛍光クェンチ（Ｑｕｅｎｃｈ）染料を添加すれば、検出された蛍光強度は細胞食作用の結果を表わす。２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で処理したＲＰＥ細胞の食作用と比較した結果、＊はＰ値が０．０５よりも小さいことを表わし，＊＊はＰ値が０．０２よりも小さいことを表わし、＊＊＊はＰ値が０．０１よりも小さいことを表わし、＊＊＊＊はＰ値が０．００１よりも小さいことを表わす。また、図１３は、本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３のＲＰＥ細胞内食作用に対する効果を示す柱形図である。
【００５８】
図１４は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４のＲＰＥ細胞全食作用に対する効果を示す柱形図である。図１２に示すように種々の濃度（０．１，１，１０，及び１００μｇ／ｍｌ）のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４はいずれも網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速でき、その関連実験内容は以下のように簡単に説明される。１×１０４ＲＰＥ細胞をウエルごとに９６ウエル・マイクロプレートに注入し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有したＤＭＥＭ培養液中において４８時間培養した後、培養液を２％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭ培養液に取り替えた。しかる後、それぞれ異なる濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３をそれぞれ添加し、２４時間後、５０μｌの２×１０７／ｍｌ標識ＦＩＴＣ蛍光のＲＯＳ細胞（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）を各ウエル中に添加して、４時間培養後、２％蔗糖を混合した燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞表面に付着していないＦＩＴＣ−ＲＯＳを洗浄した。放射波長は４８５ｎｍで、検出波長は５３０ｎｍである。１４２０マルチラブル・カウンターＰＥ）測定システムによって、蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度が全食作用の結果を表わす。蛍光クェンチ染料を添加すれば、検出された蛍光強度は細胞食作用の結果を表わす。２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で処理したＲＰＥ細胞の食作用と比較した結果、＊はＰ値が０．０５よりも小さいことを表わし，＊＊はＰ値が０．０２よりも小さいことを表わし、＊＊＊はＰ値が０．０１よりも小さいことを表わし、＊＊＊＊はＰ値が０．００１よりも小さいことを表わす。また、図１５は、本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４のＲＰＥ細胞内食作用に対する効果を示す柱形図である。
【００５９】
図２〜７によれば、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４はアピゼニンの６，８−ジ−Ｃ−グリコシドまたはその誘導体の可能性があり、以下の構造を有する。
式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なる官能基であり、それぞれ表１及び表２中の一つから選ばれる。
【００６０】
図８ないし図１５によれば、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速することができる。上記に説明したように、上記構造を有する物質は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速できることが理解される。
【００６１】
従来の文献の研究に基づき、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速できる物質を含む組成物は、下記の変性に対して効果を有し、該変性は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞退化、老人性黄斑変性、光受容体退化、糖尿病、動脈硬化、血管損傷、網膜細胞変性、無軸索細胞変性、視神経節細胞変性、粘質（ミュラー）細胞変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、網膜炎及びブルーフ膜変性及びその合併症の中から少なくとも一つ選ばれる。上記疾患は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞関連疾患として一般化されうる。
他に、本発明の実用範囲は極めて広いので、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に対する食作用に局限せず、網膜上皮（ＲＰＥ）細胞機能の増強及び損傷機能の回復に対しても寄与し、且つ関連する抽出物中に明確な化学構造の新規物質を有しているので、本発明は顕著な新規性及び進歩性を有する。本発明の技術的思想は上記の実施の態様に局限されるものではなく、クレームの範囲を逸脱しない限り、当業者による単純な技術的変更、修飾及び付加はいずれも本発明の技術的範囲に属する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性を有する植物抽出物の調整方法及び該関連抽出物に関し、特に水溶性有機溶剤又は水溶性有機溶剤と水との混合物を利用して植物抽出物を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アメリカ特許Ｎｏ．７，１０１，５７７に記載しているように、デンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ） 種は早くから眼科疾病の最も貴重な中国産ハーブ（薬剤）として知られている。我々の従来の研究結果によれば、ヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）（伝統的に治療効果を有するものとしてのデンドロビウム植物（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｌａｎｔ）の総称）はもっとも生物活性を有することを発見している。しかしながら、近年の傾向によれば、その茎部で治療効果を有するデンドロビウム植物（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｌａｎｔ）はカウリス・デンドロビー（Ｃａｕｌｉｓ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）と通称され、その植物全体で治療効果を有するデンドロビウム植物（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｌａｎｔ）はヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｉｉ）と通称されている。
【０００３】
上記アメリカ特許において開示された内容によれば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は網膜表層の単層細胞であり、ブルーフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）と光受容体との間に位置していることが知られている。ＲＰＥ細胞が効果的に脈絡膜及び網膜層との有毒物質及び代謝物を除去又は輸送できるので、非常に重要な網膜血管障壁の役割を果たしている。更に、ＲＰＥ細胞は多くの機能、例えば光線の受容、食桿状細胞及び錐状細胞が光線の刺激を受けて脱落した桿体セグメント（ＲＯＳ）の食作用、食作用胞の代謝、細胞外基質と黒色素（メラニン）とを合成、薬物を解毒、光受容体の外節再生時に不可欠な物質を提供、ビタミンＡを貯蔵及び運送、ロドプシンを合成、網膜の接着力を形成の機能が挙げられる。ＲＰＥ細胞の正常な食作用は網膜中の光受容体の健康状態の維持に対して相当大きな関連性を有しているので、一旦食作用機能が降下すると光受容体の退化を引起す。ＲＰＥ細胞は年齢の増加につれて死滅又は他所に転移するが、老化したＲＰＥ細胞はなお食作用能力を有する。更に、桿状細胞の損失は錐状細胞の損失よりも多く、老人の視力減退及び疾病の発生を来たす場合があるので、ＲＰＥ細胞機能の維持は視覚器官にとって非常に重要である。
【０００４】
免疫系等において一酸化窒素（ＮＯ）は防御の役割を演ずると共に細胞に対して毒性を有し、血管系において一酸化窒素ＮＯはいわゆる内皮細胞由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）であり、そして中枢神経系統において一酸化窒素ＮＯは神経伝達物質として作用する。
【０００５】
一酸化窒素ＮＯは、一酸化窒素シーンテターゼ（ＮＯＳ）を介してＬ−アルギニンをＬ−シトルリンに転換する過程から解離される。一酸化窒素シーンテターゼ（ＮＯＳ）はそれぞれニューロンＮＯＳ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ＮＯＳ），内皮ＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ＮＯＳ）及び免疫ＮＯＳ（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ＮＯＳ）の三種の異性体がある。その中で、ニューロンＮＯＳ及び内皮ＮＯＳは基本型であって、ｃＮＯＳと略称され、その活性はカルシウムイオンＣａ＋＋及びカルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）により調節をされ、解離した一酸化窒素ＮＯの濃度はｎＭ（１０−９Ｍ）レベルであり、免疫ＮＯＳは誘導可能型であって、ｉＮＯＳと略称されるがその活性はＣａ＋＋及びカルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）の調節を受けず、解離した一酸化窒素ＮＯの濃度はｍＭ（１０−６Ｍ）レベルである。また、ｃＮＯＳとｉＮＯＳの遺伝子はそれぞれ異なる染色体上に位置する。
【０００６】
網膜中において、一酸化窒素シーンテターゼ（ＮＯＳ）は網膜神経細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎ）、ＲＰＥ細胞、無軸索細胞（ａｍａｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌ）及び視神経節細胞（ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ）、粘質細胞（Ｍｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）中に発見されていて、酸化窒素ＮＯは生理学及び病理学において、重要な役割を演じ、眼の機能と密接に関係があることは明らかである。
【０００７】
基礎環境又は局所貧血環境（ｉｓｃｈｅｍｉａ）下において、一酸化窒素（ＮＯ）が網膜血流量を制御する能力を有することが既に発見されている。更には、一酸化窒素ＮＯは糖尿病により引起こされた網膜内血管損害の程度を調節する可能性を有している。しかも、網膜グリア細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）及びＲＰＥ細胞がＬＰＳ， ＩＦＮ−γ， ＴＮＦ−αの刺激を受けた場合、一酸化窒素シーンテターゼ（ＮＯＳ）を大きく発現し、一酸化窒素（ＮＯ）を大量生産することから、つまり、一酸化窒素（ＮＯ）は網膜が発症し又は感染を受けた状況下において、防御、保護機構の役割を演ずることができることがわかる。
【０００８】
しかしながら、現在に至るまで、光受容体におけるｃＮＯＳの位置及び特性はまだ明白ではなく、ある文献では光受容体の本体はｃＮＯＳ活性を有しており、また他の文献では光受容体セグメントにおいてのみｃＮＯＳ活性があり、そして解離した一酸化窒素（ＮＯ）は光の伝達、神経シナプスの信号伝達、生理学的状態下又は局所貧血状態下の網膜血流量等を調節することができると開示している。ｉＮＯＳの活性は、また網膜の一部の細胞、例えばＲＰＥ細胞及び粘質細胞（Ｍｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）等の細胞中において発見されており、そしてある文献では牛網膜色素上皮細胞中の培地において、ＩＦＮ−γ，ＬＰＳ，ＴＮＦ−αの刺激後約１２時間経過すれば、大量の一酸化窒素（ＮＯ）を解離し、少なくとも９６時間持続すると示唆している。サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）のＲＰＥ細胞のｉＮＯＳ活性上における影響は非常に複雑であり、例えば、牛ＲＰＥにおいて、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αの刺激が、大量の一酸化窒素（ＮＯ）を解離するのに必要である。ｂＦＧＦはＮＯＳを抑制する作用を有するが、ＴＧＦ−βは僅かにＮＯＳの機能を促進する作用を有するにすぎない。ヒトＲＰＥ細胞については、必ずインターロイキン−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）の刺激があってから大量の一酸化窒素（ＮＯ）を解離できるが、ＬＰＳはヒトＲＰＥ刺激するために必要な要素ではなく、ＴＧＦ−βは明らかにヒトＲＰＥ中の一酸化窒素（ＮＯ）の解離を抑制できる。
【０００９】
細菌の感染を受けた場合、ｉＮＯＳの発現は有益であり、それにより解離した一酸化窒素（ＮＯ）は侵入した微生物を殺すことができ、反対に、ある状況下において、解離した一酸化窒素（ＮＯ）を大量に発生しすぎると、却って解離した一酸化窒素ＮＯは自己免疫疾患又は敗血性ショックを引起す。１９９４年に初めて一酸化窒素ＮＯと眼底の炎症との間係を説明する証拠が提出され、本願出願人はｉＮＯＳ抑制剤が内毒素により引起された葡萄膜炎を断絶できることをも発見した。他方、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳでＲＰＥを処理して大量の一酸化窒素（ＮＯ）を発生させる作用がａＦＧＦ、ｂＦＧＦにより抑制され、且つ抑制はｉＮＯＳの発現であり、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの安定性でないと示唆された。したがって、本願出願人は、ＦＧＦは内毒素又はサイトカインにより引起された傷害を受けないようにＲＰＥを保護できると推測した。これからｉＮＯＳは網膜中において免役調節の役割をも演ずることができることがわかる。
【００１０】
通常の網膜疾患は、糖尿病により引起こされた増殖性糖尿病性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）増殖性ガラス体網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）及び老年性黄斑部変性（Ａｇｅｄ−ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）等があり、そして網膜の疾患はあらゆる眼科疾病において最も治療しにくい疾病である。高血糖（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）が糖化作用の発生を加速して高度に糖化した最終生産物（ＡＧＥｓ）を産出するのは、ずっと糖尿病末期に発症した各種血管・神経併発症と緊密に関係するものと信じられてきた。ＡＧＥの形成は還元糖のアルデヒド基又はケトン基が蛋白質の第一級アミノ酸と非酵素的な作用を通して不安定なシッフ塩基（Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）を形成し、更にアマドリ転移（Ａｍａｄｏｒｉ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を通してアマドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）産物を産出してなる。非酵素糖化作用は不可逆反応で且つ多くは長期半減期を有する蛋白質上に発生するのは周知であり、ＡＧＥの形成が交差反応（クロス・リンキング）を生じる場合、蛋白質分子はプロテアーゼに対して抵抗性を有するようになるので、ＡＧＥの累積は老化の兆候である。年齢の増加につれて、脳部位錐状神経（ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）、ブルーフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、膠原質蛋白（コラーゲン）中のＡＧＥの含量もこれに伴って上昇する。非酵素糖化作用の反応速度は一次反応であり、反応速度は還元糖と蛋白質の濃度に依存する。通常、糖尿病患者の血糖値は健常人よりも高いので、糖化作用は加速するようになる。糖尿病患者の病気または症状は、動脈粥状硬化、腎臓損傷、血管損傷、神経変性、網膜変性及び卒中を含み、糖尿病患者が健常人よりも高い罹患可能性をもつのは周知のことであり、いずれもＡＧＥと直接的な関係を有する。糖尿病に由来する赤血球の凝集は、主としてアルブミンが糖化された後、その三次構造に変化を生じ、抗凝集の機能を喪失することに起因する。他の研究によれば、糖尿病が腎臓絲球体の透過性の変化を誘引するのは、アルブミンの糖化に起因するもので、賢小球基膜（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の糖化によるものでない。そして糖化された蛋白質はその脳血管障壁のより高い通透能力を持つ。
【００１１】
ＡＧＥは細胞表面上の一部の受容体又は蛋白質と結合できる。公知の受容体として、スカベンジャ受容体第一型および第二型、ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）、ＯＳＴ−４８ （ＡＧＥ−Ｒ１）， ８０Ｋ−Ｈ リンタンパク質（ＡＧＥ−Ｒ２）， 及び ガレクチン−３（ｇａｌｅｃｔｉｎ−３） （ＡＧＥ−Ｒ３）が知られている。また、単核球、マクロファージ、内皮細胞、グリア細胞において、ＡＧＥ受容体が発見された。これらの細胞がＡＧＥに活性化されたとき、細胞外基質蛋白、血管附着分子及び生長因子の発現量を増加させ、異なる細胞型及び信号伝達に依存して、例えば、走化性（ケモタキシス）、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、酸化ストレス、細胞増殖又はプログラム細胞死を前記状況に伴って生じる。ヒト脳部の各種細胞は、異なる高度糖化終産物受容体を発現可能であり、ＡＧＥを遊離する。この遊離能力が喪失した時、細胞外にＡＧＥの累積をもたらし、中枢神経系統の炎症反応を誘発する。そしてＡＧＥはＰＲＥ細胞の網膜血管内皮細胞生長因子、及びＰＤＧＦ−βの発現を誘導させる。ＡＧＥは老化過程中において重要な役割を演ずるので、糖化アルブミンによる病理モデルは新薬の開発に非常に重要である。
【００１２】
肝細胞成長因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は肝臓で最も重要な成長因子であり、６０ＫＤａの重鎖（α鎖）及び３０ＫＤａの軽鎖（β鎖）をジスルフィド結合で結合して形成されたものである。新しく形成したＨＧＦ／ＳＦはプレプロ ＨＧＦ／ＳＦであり、酵素で修飾が必要で、ヘテロダイメトリック形に形成した後、生物活性を有する。ＨＧＦは多機能の生長因子であり、種々の細胞に対して生長を調節する能力があるばかりでなく、組織回復及び器管再生においても重要な役割を演じている。ＨＧＦは体内に十分広く分布しており、その内肝臓の生産量が最大であり、更に、膵臓、胸腺、血液、小腸、胎盤等でも発見されている。また、ＨＧＦ／ＳＦ又はＨＧＦ／ＳＦ受容体は眼の分泌物及び組織中、例えば涙液・涙腺・角膜に存在しており、これからＨＧＦは眼を調整する役割を有すると推測される。更に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は同時にＨＧＦ及びＨＧＦ受容体があるばかりでなく、ｃ−Ｍｅｔのチロシン燐酸化反応もずっと持続的に発現しているので、ＨＧＦは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞について自己刺激作用をもつ成長因子であり、且つ網膜の分化、傷口の治癒及び網膜血管の新生と関連する。
【００１３】
以上の内容から分かるように、ＲＰＥ細胞は網膜調整機構上で非常に重要な役割を演じている。すなわち、チャイニーズ・ハーブであるデンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）種はＲＰＥ細胞の部分機能もしくは調整制御機制を増強又は抑制することが知られている。特に、デンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）種がＲＰＥ細胞の食作用、ＲＰＥ細胞の一酸化窒素（ＮＯ）の形成及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の遺伝子発現を増強できることにある。デンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）種は、標準状態又は局所失血環境下において、ＲＰＥ細胞中のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βの遺伝子発現量を抑制できる。したがって、ＲＰＥ細胞活性を増強する因子に関する研究は、人体の健康の改善に対して重要である。過去における研究では、ヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）抽出物がＲＰＥ細胞の食作用を加速又はＡＧＥ分解を増加する効果を有すると知られているが、更に、そのＰＲＥの食作用の効果を制御するためにヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）からの抽出物に対してより深く理解しなければならない。したがって、出願人は従来の技術の欠点にかんがみ、鋭意に試験及び研究を重ねた結果、ついに本発明の「デンドロビウム（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）植物からの抽出物及びその製造方法」を案出した。
【００１４】
［発明の内容］
本発明は、以下の式１の構造を有する物質を包含する組成物を提供する。
式中Ｒ１とＲ２は単糖部分である。
【００１５】
好ましくは、式中Ｒ１とＲ２は同一又は異なる官能基の中の一つである。
【００１６】
好ましくは、式中Ｒ１またはＲ２はそれぞれα−アラビノース、β−アラビノース及びβ−キシロースの中の一つから選ばれる。
【００１７】
好ましくは、該物質はアピゼニン６，８−ジ−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル−８−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド−８−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシド及びその混合物の中から一つ選ばれる。
【００１８】
好ましくは、式中Ｒ１又はＲ２は同一または異なる官能基であり、且つ、それぞれＣ−β−Ｄ−グルコピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−アラビノピラノシル，Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル，Ｃ−α−Ｌ−ラムノピラノシル及びＣ−６−デオキシ−キシロ−ヘキソース−４−ウロシルの中の一つから選ばれる。
【００１９】
好ましくは、該物質は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を促進する効果を有する。
【００２０】
本願発明の別の態様によれば、請求項１から４の一つに請求された物質が提供され、該物質はＲＰＥ細胞関連疾患の治療及び／又は予防に用いられる。
【００２１】
好ましくは、ＲＰＥ細胞関連疾患は、網膜色素上皮細胞退化、老年性黄斑変性、光受容体退化、糖尿病、動脈硬化、血管損傷、網膜神経細胞変性、無軸索細胞変性、視神経節細胞変性、ミュラー細胞変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、網膜炎及びブルーフ（Ｂｒｕｃｈ‘ｓ）膜変性の中から少なくとも一つ選ばれるか、これらの合併症である。
【００２２】
本願発明の更に別の態様によれば、請求項１の物質を含む組成物が提供される。
【００２３】
好ましくは、該組成物は該物質の担体にとって生理学的に受容可能な担体を含有する。
【００２４】
好ましくは、該生理学的に受容可能な担体は薬理学的担体である。
【００２５】
好ましくは、該組成物は生理活性組成物である。
【００２６】
好ましくは、該生理活性組成物は薬理学的組成物である。
【００２７】
好ましくは、該組成物はＲＰＥ細胞の食作用を促進させる効果を有する。
【００２８】
好ましくは、該組成物はＲＰＥ細胞関連疾患の治療及び／又は予防に使用される。
【００２９】
本願発明の更に別の態様によれば、請求項１による物質の投与の工程を含む、ＲＰＥ細胞の活性を促進する方法が提供される。
【００３０】
好ましくは、該物質は生理学的に受容可能な担体により運搬される。
【００３１】
好ましくは、該物質及び生理学的に受容可能な担体は生理活性組成物である。
【００３２】
本願発明の更に別の態様によれば、請求項１〜４の一つによる物質の用途はＲＰＥ細胞関連疾患治療及び／又は予防するために薬剤を調整するためである。
【００３３】
好ましくは、ＲＰＥ細胞関連疾患は、網膜色素上皮細胞退化、老年性黄斑変性、光受容体退化、糖尿病、動脈硬化、血管損傷、網膜神経細胞変性、無軸突細胞変性、視神経節細胞変性、ミュラー細胞変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、網膜炎及びブルーフス（Ｂｒｕｃｈ‘ｓ）膜変性の中から少なくとも一つ選ばれるか、これらの合併症である。
【００３４】
本願発明の更に別の態様によれば、請求項１〜４による物質をＲＰＥ細胞に投与する工程を有する、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を促進するための方法が提供される。
【００３５】
本願発明の目的及び利点は、下記の詳細な説明及び添付の図面詳細に調べられた後、当業者により容易に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の好適な実施例のヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｏｒｏｂｉｉ）抽出物の分離プロトコールのフローチャートである。
【図２】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３がＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得られた結果を示す。
【図３】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３がＨＰＬＣクロマトグラフィで分析して得られた結果を示す。
【図４】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２がＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得られた結果を示す。
【図５】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２がＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで再度分析して得られた結果を示す。
【図６】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３がＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得られた結果を示す。
【図７】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４をメタノール溶液中に溶解したＵＶスペクトラム図である。
【図８】本発明のヘルバ・デンドロビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｏｒｏｂｉｉ）抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３がＰＲＥ細胞全食作用に対する効果の柱形図である。
【図９】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３がＰＲＥ細胞内食作用に対する効果の柱形図である。
【図１０】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２がＰＲＥ細胞全食作用に対する効果の柱形図である。
【図１１】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２がＰＲＥ細胞内食作用に対する効果の柱形図である。
【図１２】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３がＰＲＥ細胞全食作用に対する効果の柱形図である。
【図１３】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３がＰＲＥ細胞内食作用に対する効果の柱形図である。
【図１４】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４がＰＲＥ細胞全食作用に対する効果の柱形図である。
【図１５】本発明のヘルバ・デンドロビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４がＰＲＥ細胞内食作用に対する効果の柱形図である。
【００３７】
本願発明は以下の実施例の参照によって、より専門的に述べられる。本願の好ましい実施例の以下の詳細な説明は図示と詳細な説明のためにだけここに提出される。また、開示された精密な様式はそれのみに費やされたり限定されるものではない。
【００３８】
（１）ヘルバ・デンドロビー抽出物の製造及びその精製活性成分の分離。
【００３９】
図１を参照されたい。図１は本発明の好適な実施例のヘルバ・デンドロビー抽出物の分離プロトコールのフローチャートである。以下の方法でヘルバ・デンドロビー中の三種の活性成分を分離できる。１．９ｋｇのヘルバ・デンドロビーをメタノールで三度抽出して、ヘルバ・デンドロビーメタノール抽出物を獲得し、そして該ヘルバ・デンドロビーのメタノール抽出物を再濃縮した後、完全に乾燥させてＤＣＭ（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉアルコール類粗抽出物）標準品を形成した。乾燥したＤＣＭ標準品を２Ｌのエタノール（ＥｔＯＡｃ）中に溶解し、２Ｌの水で分抽を行って、エタノール及び第１水層を得た。該第１水層を再度２Ｌのエタノールで２度抽出して全てのエタノール層を収集した後、濃縮を進行し、完全に乾燥してエタノール抽出物を得た。乾燥したエタノール抽出物をそれぞれ４Ｌのヘキサン及び２Ｌのメタノールで三度分抽してヘキサン層及びメタノール層を得た。濃縮及び乾燥を経た後、乾燥後のヘキサン層及びメタノール層をそれぞれＤＣＭＰｅ／ｈ標準品（Ｐｅ／ｈ）及びＤＣＭＰｅ／ｍ標準品（Ｐｅ／ｍ）と命名した。このほかに脱イオン水を添加して第１水層を２Ｌに調整し、更にブタノール２Ｌで分配抽出してブタノール層及び第２水層を得、減圧、濃縮、乾燥後、乾燥したブタノール層及び第２水層をＤＣＭＰｂ標準品（Ｐｂ）及びＤＣＭＰｗ標準品（Ｐｗ）と命名した。Ｐｂ標準品はＬＨ２０ゲルで分子カラムクロマトグラフィ（２．５ｘ１０７ｃｍ、移動相がメタノール：水＝５０：５０）を行い、活性のスクリーニングを行った後、ＤＣＭＰｂＬ６，７と命名した標準品を得た。これに続いてダイアイオン（Ｄｉａｉｏｎ）ＳＰ−２０ＳＳでカラムクロマトグラフィ（１ｘ３０ｃｍ）の吸着を行い、移動相がイソプロパノール：水＝２０：８０である場合、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２と命名した溶出産物を得ることができた。移動相がイソプロパノール：水＝３０：７０である場合、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ３と命名した溶出産物を得ることができた。そして移動相がイソパノール：水＝４０：６０である場合、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ４と命名した溶出産物を得ることができた。更にＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２が再びＨＰＬＣ逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ）Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（１０ｘ３００ｍｍ）を通過した移動相がメタノール：水：酢酸＝３５：６５：１にある場合に溶出し、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２と命名した溶出産物を収集した。
【００４０】
従来の研究の成果によれば、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速及び高度糖化最終産物（ＡＧＥ）分解を増加する効果を有する。更に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞食作用の加速の効果を理解するために、更なる操作が実施された。
【００４１】
ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２は再度ＨＰＬＣ逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（１０ｘ３００ｍｍ）により移動相がメタノール：水：酢酸＝４０：６０：１を用いて溶出して、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３と命名した溶出産物を得た。また、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３は再度ＨＰＬＣ逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（４．６ｘ２５０ｍｍ）により移動相がメタノール：水＝３５：６５で溶出して、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２と命名した溶出産物を得た。更に、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ３もＨＰＬＣ逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（４．６ｘ２５０ｍｍ）により移動相がメタノール：水＝４０：６０で溶出した結果、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３と命名した溶出産物を得た。また、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３もＨＰＬＣ逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィ（４．６ｘ２５０ｍｍ）により、移動相がメタノール：水＝４５：５５で溶出し、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４と命名した溶出産物を得た。
【００４２】
図２は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３をＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析した結果を示す図である。図２中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜８０分間、メタノール／水＝２０／８０から１００％メタノールまでの濃度勾配、８０〜１００分間、１００％メタノールであり；注入容量が５０μｌであり；注入重量が５μｇであり；流速が０．２５ｍｌ／分、ＵＶ波長３３７ｎｍである。
【００４３】
図３は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３をＨＰＬＣでクロマトグラフィ分析して得た結果を示す図である。図３中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜４０分間、メタノール／水＝３５／６５、４０〜４５分間、メタノール／水＝３５／６５から１００％メタノールへの濃度勾配であり、そして４５〜６０分間、１００％メタノールであり；注入容量が２５０μｌ、注入重量２５０μｇであり、流速が０．８ｍｌ／分、ＵＶ波長２８０ｎｍ、３１２ｎｍ及び３３７ｎｍである。Ｈ２はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２を示し、Ｈ３がＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３を示し、そしてＨ４がＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４を示す。
【００４４】
図４は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２をＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得た結果を示す図である。図４中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜８０分間にメタノール／水＝２０／８０から１００％メタノールへの濃度勾配、８０〜１００分間に１００％メタノールであり；注入容積が１００μｌであり、注入重量５μｇであり；流速が０．８ｍｌ／分、ＵＶ波長２２０ｎｍにおいてマススペクトロメータ（ＭＳ）でＡＰＣＩ＋モードの条件に設定した。
【００４５】
図５は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２を別のＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで再度分析して得た結果を示す図である。図５中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜８０分間にメタノール／水＝２０／８０から１００％メタノールへの濃度勾配、８０〜１００分間に１００％メタノールであり；注入容積が１００μｌであり、注入重量５μｇであり；流速が０．８ｍｌ／分、ＵＶ波長２２０ｎｍにおいてマススペクトロメータ（ＭＳ）でＡＰＣＩ＋モードの条件に設定した。
【００４６】
図６は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３をＬＣ−ＭＳクロマトグラフィで分析して得た結果を示す図である。図６中の分析条件は：マイテイシル（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ）ＲＰ−Ｃ１８カラムが４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍであり；移動相が０〜８０分間にメタノール／水＝２０／８０から１００％メタノールへの濃度勾配、８０〜１００分間に１００％メタノールであり；注入容積が１００μｌであり、注入重量５μｇであり；流速が０．８ｍｌ／分、ＵＶ波長２２０ｎｍにおいてマススペクトロメータ（ＭＳ）でＡＰＣＩ＋モードの条件に設定した。
【００４７】
図７は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４（５０μｇ／ｍｌ）をメタノール溶液中に溶解したＵＶスペクトラム図である。図７に示すようにＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４は波長（入）が３３４ｎｍでｂａｎｄＩを有し、波長２７５ｎｍでｂａｎｄＩＩを有しているので該化合物は一種のフラボノイド化合物と推論することができる。
【００４８】
以上の結果から、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３の分子量は約５３４であり、そしてアピゼニン６，８−ジ−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル−８−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル−８−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシド及びその混合物からその中の一つを選ぶことができるのを発見できる。その中でアピゼニン６−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル−８−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシドの構造は下記に示すとおりである。
【００４９】
また、他に、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３の赤外吸収スペクトル（ＩＲ）分析結果（図示せず）もＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３の構造特徴がアピゼニンの６，８−ジ−Ｃ−グリコシドの構造特徴と符合していることを示している。
【００５０】
更に、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４に試薬（塩化アルミニウム、酢酸ナトリウム又は酢酸ナトリウムと硼酸との混合溶液）を添加した後、紫外吸収スペクトル（ＵＶ）でその結果を分析した。ＵＶ結果からＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４の構造特徴がフラボノイド化合物（Ｃ−５及びＣ−７位置はヒドロキシル基であり、Ｃ−３位置はヒドロキシル基ではない）の構造特徴と符合していることを示している。
【００５１】
更に、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）分析後、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４の水素核磁気共鳴スペクトル（Ｈ−ＮＨＲ）及び炭素核磁気共鳴スペクトル（Ｃ−ＮＭＲ）の結果から、その対応する構造特徴がアピゼニンの６，８−Ｄｉ−Ｃ−グリコシドの構造特徴と符合していることを示している。
【００５２】
上記結果から、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２の物質、例えば、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４は、アピゼニンの６，８−ジ−Ｃ−グリコシド又はその誘導体であり、以下の構造を有していることを発見された。
式中、Ｒ１とＲ２は同一または異なる官能基であり、それぞれα−アラビノース（α−Ａｒａ）、β−アラビノース（β−Ａｒａ）及びキシロース（β−Ｘｙｌ）の中の一つから選ばれる。Ｒ１とＲ２は同一または異なる単糖成分でありうる。
【００５３】
天然のＣ−糖残基のＣ−糖鎖フラボノイドはＣ−β−Ｄ−グルコピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル，Ｃ−β−Ｄ−アラビノピラノシル，Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル，Ｃ−α−Ｌ−ラムノピラノシル及びＣ−６−デオキシ−キシロ−ヘキソース−４−ウロシルを含み、また、上記実験はＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３、及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４がいずれも前記したＣ−グリコシドの主構造を有しているので、上記７種の天然のＣ−糖鎖フラボノイドからＲ１及びＲ２が選ばれる時、その中から４８種の対応化合物を得ることができる。同様にＲ１及びＲ２が非天然のＣ−糖鎖残基から選ばれる時、４８２種の対応化合物を得ることができる。これから、もしＣ−４´、Ｃ−５及びＣ−７に位置する官能基がその他の官能基に置換された時、対応誘導体の数は莫大になることがわかる。表１はＲ１とＲ２の単糖成分の可能な天然官能基の組み合わせを表わす。
【表１】
【００５４】
Ｒ１とＲ２の可能な非天然官能基の組み合わせは以下の表２に示すとおりである。
【表２】
【００５５】
図８はＲＰＥ細胞全食作用に対する本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３の効果を示す柱形図である。図８に示すように、種々の濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌ）はいずれも網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速でき、その関連実験を以下のように簡単に説明する。１×１０４ＲＰＥ細胞をウエルごとに９６ウエル・マイクロプレートに注入し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有したＤＭＥＭ培養液中において４８時間培養した後、培養液を２％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭ培養液に取り替えた。しかる後、それぞれ異なる濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３をそれぞれ添加し、２４時間後、５０μｌの２×１０７／ｍｌ標識ＦＩＴＣ蛍光のＲＯＳ細胞（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）を各ウエル中に添加して、４時間培養後、２％蔗糖を混合した燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞表面に付着していないＦＩＴＣ−ＲＯＳを洗浄した。放射波長は４８５ｎｍで、検出波長は５３０ｎｍである。１４２０マルチラブル・カウンター（Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰＥ）測定システムによって、蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度が全食作用の結果を表わす。蛍光クェンチ（Ｑｕｅｎｃｈ）染料を添加すれば、検出された蛍光強度は細胞食作用の結果を表わす。２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で処理したＲＰＥ細胞の食作用と比較した結果、＊はＰ値が０．０５よりも小さいことを表わし，＊＊はＰ値が０．０２よりも小さいことを表わし、＊＊＊はＰ値が０．０１よりも小さいことを表わし、＊＊＊＊はＰ値が０．００１よりも小さいことを表わす。また、図９は、本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３のＲＰＥ細胞内食作用に対する効果を示す柱形図である。
【００５６】
図１０は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２のＲＰＥ細胞全食作用に対する効果を示す柱形図である。図１０に示すように種々の濃度（０．１，１，１０，及び１００μｇ／ｍｌ）のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２はいずれも網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速でき、その関連実験内容は以下のように簡単に説明される。１×１０４ＲＰＥ細胞をウエルごとに９６ウエル・マイクロプレートに注入し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有したＤＭＥＭ培養液中において４８時間培養した後、培養液を２％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭ培養液に取り替えた。しかる後、それぞれ異なる濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２をそれぞれ添加し、２４時間後、５０μｌの２×１０７／ｍｌ標識ＦＩＴＣ蛍光のＲＯＳ細胞（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）を各ウエル中に添加して、４時間培養後、２％蔗糖を混合した燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞表面に付着していないＦＩＴＣ−ＲＯＳを洗浄した。放射波長は４８５ｎｍで、検出波長は５３０ｎｍである。１４２０マルチラブル・カウンター（Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰＥ）測定システムによって、蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度が全食作用の結果を表わす。蛍光クェンチ（Ｑｕｅｎｃｈ）染料を添加すれば、検出された蛍光強度は細胞食作用の結果を表わす。２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で処理したＲＰＥ細胞の食作用と比較した結果、＊はＰ値が０．０５よりも小さいことを表わし，＊＊はＰ値が０．０２よりも小さいことを表わし、＊＊＊はＰ値が０．０１よりも小さいことを表わし、＊＊＊＊はＰ値が０．００１よりも小さいことを表わす。また、図１１は、本発明のヘルバ・デンドリビー（Ｈｅｒｂａ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２のＲＰＥ細胞内食作用に対する効果を示す柱形図である。
【００５７】
また、図１２は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３のＲＰＥ細胞全食作用に対する効果を示す柱形図である。図１２に示すように種々の濃度（０．１，１，１０，及び１００μｇ／ｍｌ）のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３はいずれも網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速でき、その関連実験内容は以下のように簡単に説明される。１×１０４ＲＰＥ細胞をウエルごとに９６ウエル・マイクロプレートに注入し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有したＤＭＥＭ培養液中において４８時間培養した後、培養液を２％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭ培養液に取り替えた。しかる後、それぞれ異なる濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３をそれぞれ添加し、２４時間後、５０μｌの２×１０７／ｍｌ標識ＦＩＴＣ蛍光のＲＯＳ細胞（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）を各ウエル中に添加して、４時間培養後、２％蔗糖を混合した燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞表面に付着していないＦＩＴＣ−ＲＯＳを洗浄した。放射波長は４８５ｎｍで、検出波長は５３０ｎｍである。１４２０マルチラブル・カウンター（Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰＥ）測定システムによって、蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度が全食作用の結果を表わす。蛍光クェンチ（Ｑｕｅｎｃｈ）染料を添加すれば、検出された蛍光強度は細胞食作用の結果を表わす。２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で処理したＲＰＥ細胞の食作用と比較した結果、＊はＰ値が０．０５よりも小さいことを表わし，＊＊はＰ値が０．０２よりも小さいことを表わし、＊＊＊はＰ値が０．０１よりも小さいことを表わし、＊＊＊＊はＰ値が０．００１よりも小さいことを表わす。また、図１３は、本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３のＲＰＥ細胞内食作用に対する効果を示す柱形図である。
【００５８】
図１４は本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４のＲＰＥ細胞全食作用に対する効果を示す柱形図である。図１２に示すように種々の濃度（０．１，１，１０，及び１００μｇ／ｍｌ）のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４はいずれも網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速でき、その関連実験内容は以下のように簡単に説明される。１×１０４ＲＰＥ細胞をウエルごとに９６ウエル・マイクロプレートに注入し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有したＤＭＥＭ培養液中において４８時間培養した後、培養液を２％ウシ胎児血清を含有したＤＭＥＭ培養液に取り替えた。しかる後、それぞれ異なる濃度のＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３をそれぞれ添加し、２４時間後、５０μｌの２×１０７／ｍｌ標識ＦＩＴＣ蛍光のＲＯＳ細胞（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）を各ウエル中に添加して、４時間培養後、２％蔗糖を混合した燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞表面に付着していないＦＩＴＣ−ＲＯＳを洗浄した。放射波長は４８５ｎｍで、検出波長は５３０ｎｍである。１４２０マルチラブル・カウンターＰＥ）測定システムによって、蛍光強度を検出し、検出した蛍光強度が全食作用の結果を表わす。蛍光クェンチ染料を添加すれば、検出された蛍光強度は細胞食作用の結果を表わす。２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で処理したＲＰＥ細胞の食作用と比較した結果、＊はＰ値が０．０５よりも小さいことを表わし，＊＊はＰ値が０．０２よりも小さいことを表わし、＊＊＊はＰ値が０．０１よりも小さいことを表わし、＊＊＊＊はＰ値が０．００１よりも小さいことを表わす。また、図１５は、本発明のヘルバ・デンドリビー抽出物ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４のＲＰＥ細胞内食作用に対する効果を示す柱形図である。
【００５９】
図２〜７によれば、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４はアピゼニンの６，８−ジ−Ｃ−グリコシドまたはその誘導体の可能性があり、以下の構造を有する。
式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なる官能基であり、それぞれ表１及び表２中の一つから選ばれる。
【００６０】
図８ないし図１５によれば、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ２、ＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ３及びＤＣＭＰｂＬ６，７Ｄ２Ｈ２Ｈ３Ｈ４は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速することができる。上記に説明したように、上記構造を有する物質は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速できることが理解される。
【００６１】
従来の文献の研究に基づき、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速できる物質を含む組成物は、下記の変性に対して効果を有し、該変性は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞退化、老人性黄斑変性、光受容体退化、糖尿病、動脈硬化、血管損傷、網膜細胞変性、無軸索細胞変性、視神経節細胞変性、粘質（ミュラー）細胞変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性網膜変性、網膜炎及びブルーフ膜変性及びその合併症の中から少なくとも一つ選ばれる。上記疾患は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞関連疾患として一般化されうる。
他に、本発明の実用範囲は極めて広いので、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に対する食作用に局限せず、網膜上皮（ＲＰＥ）細胞機能の増強及び損傷機能の回復に対しても寄与し、且つ関連する抽出物中に明確な化学構造の新規物質を有しているので、本発明は顕著な新規性及び進歩性を有する。本発明の技術的思想は上記の実施の態様に局限されるものではなく、クレームの範囲を逸脱しない限り、当業者による単純な技術的変更、修飾及び付加はいずれも本発明の技術的範囲に属する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の構造を有する物質：
式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なる単糖成分の一つである。
【請求項２】
請求項１の物質であって、式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれα−アラビノース、β−アラビノース及びβ−キシロースの中の一つから選ばれることを特徴とする物質。
【請求項３】
請求項１の物質であって、式中、該物質はアピゼニン６，８−ジ−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル−８−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル−８−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシド及びその混合物から選ばれることを特徴とする物質。
【請求項４】
請求項１の物質であって、式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なる官能基であり、それぞれＣ−β−Ｄ−グルコピラノシル基，Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基，Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル基，Ｃ−β−Ｄ−アラビノピラノシル基，Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル基，Ｃ−α−Ｌ−ラムノピラノシル基及びＣ−６−デオキシ−キシロ−ヘキソース−４−ウロシル基の中の一つから選ばれることを特徴とする物質。
【請求項５】
請求項１の物質を含有することを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項５記載の組成物であって、前記物質を運搬する生理学的に受容可能な担体を更に含有することを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１記載の物質を投与する工程からなることを特徴とする網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の活性を促進する方法。
【請求項８】
請求項１から４項のいずれか１項に記載の物質を網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に投与する工程からなることを特徴とする網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速する方法。
【請求項９】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞関連疾患の治療及び／又は予防のための治療薬の調整物のために、請求項１〜４項いずれか１項に記載の物質の用途。
【請求項１０】
前記生理活性を有する組成物は変性に対して薬理活性を有し、前記網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞関連疾患は網膜色素上皮細胞退化、老人性黄斑変性、光受容体退化、糖尿病、動脈硬化、血管損傷、網膜神経細胞変性、無軸索細胞変性、視神経節細胞変性、ミュラー（粘質）細胞変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性視網膜変性、網膜炎及びブルーフ（Ｂｒｕｃｈ‘ｓ）膜変性及びこれら合併症の中から少なくとも一つ選ばれることを特徴とする請求項９記載の用途。
【請求項１】
式１の構造を有する物質：
式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なる単糖成分の一つである。
【請求項２】
請求項１の物質であって、式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれα−アラビノース、β−アラビノース及びβ−キシロースの中の一つから選ばれることを特徴とする物質。
【請求項３】
請求項１の物質であって、式中、該物質はアピゼニン６，８−ジ−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル−８−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシド，アピゼニン６−Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル−８−Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシド及びその混合物から選ばれることを特徴とする物質。
【請求項４】
請求項１の物質であって、式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なる官能基であり、それぞれＣ−β−Ｄ−グルコピラノシル基，Ｃ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基，Ｃ−β−Ｄ−キシロピラノシル基，Ｃ−β−Ｄ−アラビノピラノシル基，Ｃ−α−Ｌ−アラビノピラノシル基，Ｃ−α−Ｌ−ラムノピラノシル基及びＣ−６−デオキシ−キシロ−ヘキソース−４−ウロシル基の中の一つから選ばれることを特徴とする物質。
【請求項５】
請求項１の物質を含有することを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項５記載の組成物であって、前記物質を運搬する生理学的に受容可能な担体を更に含有することを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１記載の物質を投与する工程からなることを特徴とする網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の活性を促進する方法。
【請求項８】
請求項１から４項のいずれか１項に記載の物質を網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に投与する工程からなることを特徴とする網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用を加速する方法。
【請求項９】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞関連疾患の治療及び／又は予防のための治療薬の調整物のために、請求項１〜４項いずれか１項に記載の物質の用途。
【請求項１０】
前記生理活性を有する組成物は変性に対して薬理活性を有し、前記網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞関連疾患は網膜色素上皮細胞退化、老人性黄斑変性、光受容体退化、糖尿病、動脈硬化、血管損傷、網膜神経細胞変性、無軸索細胞変性、視神経節細胞変性、ミュラー（粘質）細胞変性、葡萄膜炎、網膜血管新生、増殖性視網膜変性、網膜炎及びブルーフ（Ｂｒｕｃｈ‘ｓ）膜変性及びこれら合併症の中から少なくとも一つ選ばれることを特徴とする請求項９記載の用途。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−１５０１５３（Ｐ２０１０−１５０１５３Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−３２７５１４（Ｐ２００８−３２７５１４）
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５０４００４４６３）國立陽明大學 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２７５１４（Ｐ２００８−３２７５１４）
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５０４００４４６３）國立陽明大學 (4)
【Ｆターム（参考）】
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