ニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞を保存及び／又は貯蔵する方法
本発明は、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行なわれる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行なわれる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が産する酵素は、化学的製造方法で生体触媒として用いられることが多くなってきている。特に、アミド、カルボン酸又はα−ヒドロキシカルボン酸を得るためのニトリルの酵素による加水分解は、経済的に非常に重要な工程である。ニトリル加水分解酵素は、ニトリルヒドラターゼ及びニトリラーゼファミリーに分類することができる。ニトリルヒドラターゼとニトリラーゼは、それらの活性中心に触媒に必須のシステイン分子を有する（Levy-Schil（1995）Gene 161:15-20）。ニトリルヒドラターゼは、１モル当量の水の付加を触媒することにより、対応するアミドを生じる。ニトリラーゼは、２モル当量の水の付加を触媒することにより、対応するカルボン酸を生じる。概して、上記酵素は、光学的に選択性の水和又は加水分解をもたらし、これによって光学的に活性の（キラル）生成物が得られる。キラルカルボン酸は、合成有機化学で需要の多い化合物である。これらは、多数の医薬活性化合物、又は植物保護用の活性化合物のための出発化合物である。キラルカルボン酸は、ジアステレオマー塩を用いた古典的ラセミ混合物分割のために用いることができる。従って、Ｒ−（−）−又はＳ−（−）−マンデル酸は、例えば、ラセミアミンのラセミ混合物分割に用いられる。Ｒ−（−）−マンデル酸は、合成において中間体としても用いられる。
【０００３】
酵素反応には、通常、精製又は部分的に精製した酵素を用いるが、対応する酵素活性を有する微生物を用いることも可能である。酵素は、天然又は組換え体に由来するものでよい。一般に、酵素は、反応を進行させるステップで製造される（発現される）。これに関して、比較的多量の酵素を製造し、これらを必要に応じて触媒工程に導入することが望ましい。しかし、この場合、酵素の活性を保持しつつ酵素を貯蔵することが必要になってくる。これに関して、冷却及び／又は凍結が標準的方法である。しかし、凍結は通常、複雑な凍結／解凍方法を必要とし、概して酵素活性の大きな喪失につながる。一般に、冷却は精密なロジスティック及びエネルギー消費を必要とする。
【０００４】
ＥＰ−Ａ１ ０ ６６６ ３２０には、対応するニトリルからαヒドロキシ酸／アミドを製造する方法が記載されており、その方法では、反応の前に、用いる微生物を亜硫酸ナトリウム（１Ｍ）とリン酸バッファー（５０ｍＭ）の存在下でインキュベートする。さらに、反応中の酵素活性は、亜リン酸塩又は次亜リン酸塩の添加により安定化させることもでき、この添加により、遊離の酵素阻害アルデヒドが錯化する。ＥＰ−Ａ１０ ６１０ ０４８には、微生物を用いてα−ヒドロキシ酸を製造する方法が記載されており、この方法では、亜硫酸ナトリウムの添加により反応中の酵素活性を安定化させ、この添加によって同様に、遊離の酵素阻害アルデヒドが錯化する。前記の方法では、添加剤は、いずれも例外なく、ニトリルの変換中に添加される。反応での使用前の安定化方法は開示されていない。
【０００５】
システイン依存活性を保存するための典型的方法は、ジチオトレイトール及び／又はメルカプトエタノール及び／又はエチレンジアミンテトラ酢酸を添加するものである（例：ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous） Ｊ１ニトリラーゼ； Kobayashi M (1989) Eur J Biochem 182: 349-356）。
【０００６】
ロドコッカスｓｐ．ＡＴＣＣ ３９４８４ニトリラーゼの安定化は、基質（ベンゾニトリル）を添加することにより達成されている（Stevenson DE (1992) Biotechnol Appl Biochem 15:283-302）。ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＢ １１２１６ニトリラーゼの場合には、基質濃度以外に、塩基性ｐＨ、温度及び酵素濃度が安定化の速度に寄与する（Harper BH (1976) Biochem Soc Trans 4:502-504; Harper BH (1977) Biochem J 165:309-319）。これらの事例における問題点は、安定剤が酵素により改変されるため、時間が経過するにつれその効果を失うことである。
【０００７】
ロドコッカス・ロドクラウスＪ1ニトリラーゼの場合、酵素活性を安定化させるために、無機塩（２０％以下の（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む）とアルコール（５０％以下のグリセロール、１０％エタノール）を添加することが記載されている（Nagasawa T (2000) Eur J Biochem 267:138-144）。
【０００８】
アルカリゲネス・フェカーリスＪＭ３ニトリラーゼの場合には、酵素活性を安定化するために、６０％硫酸アンモニウム、２Ｍ ＮａＣｌ又は３０％プロパンジオールの添加が記載されている（Nagasawa T (1990) Eur J Biochem 194:765-772）。
【０００９】
ＥＰ−Ａ１ ０ ７０７ ０６１には、少なくとも１００ｍＭから飽和点までの濃度で、無機塩（リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩および塩酸塩）を貯蔵バッファーに添加することにより、ニトリラーゼ含有細胞を安定化する方法が記載されている。
【００１０】
米国特許第４，９３１，３９１号、ＥＰ−Ａ１ ０ ２４３ ９６７及び米国特許第４，９００，６７２号には、細胞懸濁液にアミド若しくはカルボン酸（又は物質の組合せ）の添加によるニトリルヒドラターゼ活性の安定化が記載されている。
【００１１】
米国特許第４，３４３，９００号には、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法であって、用いる固定細胞の膨潤に関連する活性の喪失を防止する目的で、反応混合物に炭酸アルカリ金属を添加することが記載されている。
【００１２】
米国特許第６，２５１，６４６号及び米国特許第６，３６８，８０４号には、少なくとも０．１Ｍから飽和濃度までの濃度で炭酸（水素）アンモニウム、ナトリウム若しくはカリウムを添加することにより、ニトリラーゼ活性担持微生物を安定化する方法が記載されている。
【００１３】
反応性アルデヒド基のために、アルデヒドは酵素阻害物質として分類される。産生過程におけるニトリラーゼに対するその阻害作用については、多数の刊行物で主張されている（ＥＰ−Ｂ１ ０ ７７３ ２９７ Ｂ１、ｐ．４、パラグラフ［００１３］及び［００２５］；ＥＰ−Ｂ１ ０ ７０７ ０６１ Ｂ１、ｐ．２、パラグラフ［０００５］；ＥＰ−Ｂ１ ０ ６６６ ３２０、ｐ．２、パラグラフ［０００４］並びにその箇所で引用されている参照文献；ＥＰ−Ａ２ ０ ４８６ ２８９、ｐ．２、第３０行、並びにその箇所で引用されている参照文献；Yamamoto (1992) J Ferm Technol 73:425-430、特に、ｐ．４２９、最後のパラグラフ）。
【００１４】
前記酵素を工業的に用いることに関して、貯蔵中のニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼ活性の不活性化は重要なコスト要因である。例えば、４℃及びｐＨ６．０で、６．６日の期間後に活性は３６％低下するが、これは活性の喪失が１日当たり５．５％であることを示している（図１；実施例３での比較実験を参照）。ニトリラーゼの場合、活性の喪失は、例えば、酵素多量体がそのモノマーに分解し、これらモノマーにはニトリラーゼ活性が全くないためと考えられる（Nagasawa T (1990) Eur J Biochem 194:765-772）。記載されている方法は、非常に限られた程度までしかこの問題を解決することができない。さらに、前記の方法は、生体触媒を安定化するために高濃度の添加剤を用いるが、これらの添加剤は、生体触媒を使用した後、入念に分離し、処分しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の目的は、不要な付随物質で反応混合物を汚染することなく、ニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼ活性を可能な限り長期間にわたり安定化させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の方法はこの目的を達成する。
【００１７】
本発明の第１ステップは、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を有する微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行われる方法に関する。
【００１８】
上記保存ステップは、細胞により触媒しようとする反応の反応物質で該細胞を処理する前に実施するのが好ましい。好ましい実施形態では、水性媒体は、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物を含み、その総濃度は、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である。特に好ましい実施形態では、保存及び／又は貯蔵に適した水性媒体は前記シアン化物化合物の添加を一切含まない。
【００１９】
「アルデヒド」という用語は、広く理解されるべきであり、脂肪族及び芳香族アルデヒドの両方を含む。好ましい実施形態では、アルデヒドは、式ＩＩＩ：
【化１】
【００２０】
（式中、Ｒ６は、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル−、あるいは置換又は非置換のアリール−又はヘタリール−でありうる）
の化合物を意味する。特に、芳香族アルデヒドが好ましく、非置換ベンズアルデヒド及び置換ベンズアルデヒド、例えば、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｏ−ブロモベンズアルデヒド、ｍ−ブロモベンズアルデヒド、ｐ−ブロモベンズアルデヒド、ｏ−メチルベンズアルデヒド、ｍ−メチルベンズアルデヒド及びｐ−メチルベンズアルデヒドが極めて好ましい。
【００２１】
保存／貯蔵される微生物を用いて、例えば、式（ＩＩ）のラセミニトリルを式（Ｉａ）のキラルカルボン酸又は式（Ｉｂ）のキラルアミドに変換することができる：
【化２】
【００２２】
（式中、
*は任意により活性中心であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立に、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル−、置換又は非置換のアリール−、ヘタリール−、ＯＲ４又はＮＲ４Ｒ５であり、基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は常に異なるものであり、
Ｒ４は、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル−、Ｃ１−Ｃ１０−アルキルカルボニル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニルカルボニル−、アリール−、アリールカルボニル−、ヘタリール−又はヘタリールカルボニル−であり、
Ｒ５は、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル−、アリール−又はヘタリール−である）。
【００２３】
最も好ましいニトリルは、マンデロニトリル、ｏ−クロロマンデロニトリル、ｐ−クロロマンデロニトリル、ｍ−クロロマンデロニトリル、ｏ−ブロモマンデロニトリル、ｐ−ブロモマンデロニトリル、ｍ−ブロモマンデロニトリル、ｏ−メチルマンデロニトリル、ｐ−メチルマンデロニトリル又はｍ−メチルマンデロニトリルである。最も好ましいキラルカルボン酸は、Ｒ−マンデル酸、Ｓ−マンデル酸、Ｒ−ｐ−クロロマンデル酸、Ｓ−ｐ−クロロマンデル酸、Ｒ−ｍ−クロロマンデル酸、Ｓ−ｍ−クロロマンデル酸、Ｒ−ｏ−クロロマンデル酸、Ｓ−ｏ−クロロマンデル酸、Ｓ−ｏ−ブロモマンデル酸、Ｓ−ｐ−ブロモマンデル酸、Ｓ−ｍ−ブロモマンデル酸、Ｓ−ｏ−メチルマンデル酸、Ｓ−ｐ−メチルマンデル酸、Ｓ−ｍ−メチルマンデル酸、Ｒ−ｏ−ブロモマンデル酸、Ｒ−ｐ−ブロモマンデル酸、Ｒ−ｍ−ブロモマンデル酸、Ｒ−ｏ−メチルマンデル酸、Ｒ−ｐ−メチルマンデル酸及びＲ−ｍ−メチルマンデル酸である。
【００２４】
目的とするニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼ触媒反応のための出発化合物として、式（ＶＩ）のα−ヒドロキシニトリル：
【化３】
【００２５】
（式中、Ｒ６は、式（ＩＩＩ）と同じ定義とする）
を用いる場合には、保存／貯蔵に用いられるアルデヒドは、水素シアン酸又はシアン化物との反応により前記αヒドロキシニトリルを生じる同じアルデヒドである、すなわち、基Ｒ６は式ＩＩＩ及びＩＶにおいて同一のものが選択される。
【００２６】
保存及び／又は貯蔵に適した水性媒体中のアルデヒドの総濃度は、０．１〜１００ｍＭ／ｌ、好ましくは０．２〜５０ｍＭ／ｌ、特に好ましくは０．５〜１０ｍＭ／ｌ、非常に好ましくは０．３〜５ｍＭ／ｌ、最も好ましくは０．４〜２ｍＭ／ｌである。
【００２７】
水性媒体は、中性、弱塩基又は弱酸性ｐＨを有する。従って、ｐＨは、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲にある。保存温度は、好ましくは０〜４０℃、特に好ましくは１〜１０℃、非常に好ましくは２〜５℃である。
【００２８】
本発明の方法は、実験室条件下及び製造条件下の両方で、酵素活性の長期間持続を確実にするのに極めて適していることが証明された。生体触媒は、３７日の観察期間中全く不活性化を示さない。
【００２９】
本発明に関して、「微生物」とは、グラム陽性又はグラム陰性細菌を意味する。
【００３０】
エンテロバクテリア科のすべての属及び種、又は放線菌目の科、属及び種が好ましく、特に、エンテロバクテリア科のエッシェリヒア、セラチア、プロテウス、エンテロバクター、クレブシエラ、サルモネラ、シゲラ、エドワードシーラ、シトロバクター、モルガネラ、プロビデンシア及びエルシニアの種が非常に好ましい。
【００３１】
さらには、シュードモナス属、バークホルデリア属、ノカルジア属、アセトバクター属、グルコノバクター菌、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、シアノバクター属、スタフィロコッカス属、アエロバクター属、アルカリゲネス属、ロドコッカス属並びにペニシリウム属の種も好ましい。
【００３２】
最も好ましいのは、エッシェリヒア属の種、特に大腸菌（Escherichia coli）である。
【００３３】
本発明の方法に際し、微生物は、増殖、休止、固定化又は破砕された状態で存在することができる。「破砕された細胞」とは、例えば、溶剤での処理により透過性にされた細胞、例えば、酵素処理、機械的処理（例：フレンチプレス若しくは超音波）又は別の方法により開口させた細胞を意味する。このようにして得られる粗抽出物は、本発明の方法に有利に適している。部分的又は完全に精製した酵素調製物もまた本発明の方法に用いることができる。反応において有利に用いられる固定化微生物又は酵素も同様に好適である。固定化は、例えば、１種以上のアクリルモノマー（例：アクリルアミド、アクリル酸、メタクリルアミド、メタクリル酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、ジエチルアミノプロピルアクリルアミド若しくはジエチルアミノプロピルメタクリルアミド）、並びにまた、必要に応じて、１種以上の架橋剤（例：メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミド、１，２−ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド若しくはビスアクリルアミド酢酸）を細胞又は酵素調製物に添加した後、フリーラジカル重合（例えば、過硫酸アンモニウムにより開始される）を行うことにより、実施することができる。
【００３４】
異種細菌又は真菌による汚染を防ぐために、必要に応じて、抗菌又は殺菌効果のある好適な活性化合物又は他の塩（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸）を保存／貯蔵溶液に添加することもできる。
【００３５】
本発明の方法に用いる微生物は、保存／貯蔵前に、これらの微生物が増殖可能な培地で培養することができる。この培地は、合成培地又は天然培地のいずれでもよい。生物に応じて、当業者に公知の培地を用いる。微生物を増殖させるために、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機塩、並びに必要に応じて、少量のビタミン及び微量元素を含む。
【００３６】
有利な炭素源の例として、以下のものが挙げられる：ポリオール（例えば、グリセロール）、糖、例えば、単−、二−若しくは多糖（例：グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン又はセルロース）、複合糖源（例えば、メラッセ（melasse））、糖リン酸（例：フルクトース−１，６−二リン酸）、糖アルコール（例：マンニトール）、アルコール（例：メタノール又はエタノール）、カルボン酸（例：クエン酸、乳酸若しくは酢酸）、脂肪（例：ダイズ油又はナタネ油）、アミノ酸、例えば、アミノ酸混合物（例：カザミノ酸（Difco））、又は個々のアミノ酸（例：グリシン又はアスパラギン酸）、あるいはアミノ糖（後者は、窒素源として同時に用いることも可能である）。特に好ましいのはポリオールであり、中でもグリセロールが好ましい。
【００３７】
有利な窒素源は、有機又は無機窒素化合物、あるいはこれらの化合物を含む材料である。例として、アンモニウム塩（例：ＮＨ４Ｃｌ又は（ＮＨ４）２ＳＯ４）、硝酸塩、尿素、若しくは複合窒素源（例：コーンスティープリカー）、ビール酵母自己分解物、ダイズミール、コムギグルテン、酵母抽出物、ペプトン、食肉抽出物、カゼイン加水分解物、酵母又はジャガイモタンパク質が挙げられ、これらは、窒素源として同時に用いられることも多い。
【００３８】
無機塩の例として、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、マンガン、カリウム、亜鉛、銅及び鉄の塩がある。これら塩のアニオンとしては、塩素イオン、硫酸イオン及びリン酸イオンを挙げることができる。本発明の方法での生産性を高める上で重要な要因は、生産培地中のＦｅ２＋又はＦｅ３＋イオン濃度の制御である。
【００３９】
必要に応じて、その他の増殖因子（例えば、ビタミン）、又は増殖プロモーター（例えば、ビオチン、２−ＫＬＧ、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩若しくはピリドキシン）、アミノ酸（例えば、アラニン、システイン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、フェニルアラニン、オルニチン若しくはバリン）、カルボン酸（例えば、クエン酸、ギ酸、ピメリン酸若しくは乳酸）、あるいはジチオトレイトールのような物質を栄養培地に添加する。
【００４０】
上記栄養素を混合する比率は、発酵の種類に応じて変動し、各々のケースで指定される。培地成分は、必要であれば、別々に又は一緒に滅菌した後、発酵の開始時に全部導入するか、あるいは、その後の発酵中に、必要に応じて、連続的に又は非連続的に添加することができる。
【００４１】
培養条件は、生物が増殖して、得られる最高収率（例えば、発現させる組換えタンパク質の総活性により決定する）を達成できるように指定する。好ましい培養温度は、１５℃〜４０℃である。２５℃〜３７℃の温度が特に有利である。ｐＨは３〜９の範囲に維持するのが好ましい。５〜８のｐＨ値が特に有利である。一般に、数時間〜数日、好ましくは８時間〜２１日、特に好ましくは４時間〜１４日のインキュベーションが十分である。
【００４２】
当業者は、例えば、培地の有利な最適化について、応用微生物生理学のテキスト、“A Practical Approach（編集：PM Rhodes, PF Stanbury, IRL-Press, 1997, pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3）から情報を得ることができる。
【００４３】
保存／貯蔵の目的で、微生物培養の前、その間又は後に、アルデヒドを添加してもよい。従って、例えば、微生物をそれ以上分離することなく、発酵混合物にアルデヒドを添加することによって、活性の最大限の保存を達成することが可能である。
【００４４】
しかし、上記のように培養しておいた微生物細胞又は微生物を分離することも可能であり、分離は、例えば、培養培地からそれらを遠心分離し、任意により適当なバッファー（ホウ酸バッファー又はリン酸バッファー）で１回又は数回洗浄してから、保存／貯蔵の目的で、少なくとも１種のアルデヒドを含む水溶液中に溶解又は再懸濁させることにより実施する。少なくとも１種のアルデヒドを含む上記水溶液における微生物の濃度は任意に選択することができる。
【００４５】
本発明に関して用いられる微生物は、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ及び／又はニトリラーゼ活性を呈示する。
【００４６】
一般に、「ニトリルヒドラターゼ」活性は、以下に示すように、ニトリルに対する１モル当量の水の付加を触媒し、これによって対応するアミドを形成する特性を意味する：
Ｒ−ＣＮ ＋ Ｈ２Ｏ → Ｒ−ＣＯ−ＮＨ２
その際、ニトリルヒドラターゼはＥＣクラス４．２．１．８４（ニトリルヒドラターゼ）の酵素を含むのが好ましい。
【００４７】
一般に、「ニトリラーゼ」活性は、以下に示すように、ニトリルに対する２モル当量の水の付加を触媒し、これによって対応するカルボン酸を形成する特性を意味する：
Ｒ−ＣＮ ＋ ２Ｈ２Ｏ → Ｒ−ＣＯＯＨ−ＮＨ３
ニトリラーゼは、好ましくは、ＥＣクラス３．５．５．１（ニトリラーゼ）、３．５．５．２（リシニンニトリラーゼ）、３．５．５．４（シアノアラニンニトリラーゼ）、３．５．５．５（アリールアセトニトリラーゼ）、３．５．５．６（ブロモキシニルニトリラーゼ）並びに３．５．５．７（脂肪族ニトリラーゼ）を含む。
【００４８】
前記微生物細胞のニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性は、天然又は組換え体由来のものでよい。
【００４９】
これに関して、「天然由来の」とは、人為的作用によってもたらされる遺伝的変化を一切含まないそのままの微生物が、ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性を呈示することを意味する。多数のこのような微生物が当業者に知られている。特に、ロドコッカス属及びゴルドナ属の微生物、例えば、ロドコッカスｓｐ．ＨＴ４０−６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２３１）、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ３３２７８、ロドコッカス・ロドクラウスＪ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）、並びにゴルドナ・テラエ（Gordona terrae）ＭＡ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５３５）（ＪＰ−Ａ−４−２２２５９１、ＪＰ−Ｂ−６−５５１４８、ＥＰ−Ａ１ ０ ７０７ ０６１）が好ましい。
【００５０】
これに関連し、「組換え体由来の」とは、ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列を微生物から単離し、別の種の微生物において発現させることを意味する。ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする多数の配列が当業者に知られている。例として以下に示すものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：
１．アシドボラクス・ファシリス（Acidovorax facilis）ニトリラーゼ７２Ｗ （Gavagan JEら(1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:654-659）
２．アシネトバクターｓｐ．ＡＫ２２６ニトリラーゼ（Yamamoto K及びKomatsu K (1991) Agric Biol Chem 55(6):1459-1466）
３．アシネトバクターｓｐ．ＲＦＢ１ニトリラーゼ（Finnegan Iら (1991) Appl Microbiol Biotechnol 36:142-144）
４．アルカリゲネス・フェカーリスＡＴＣＣ８７５０ニトリラーゼ（Yamamoto Kら (1991) Appl Environ Microbiol 57(10):3028-3032）
５．アルカリゲネス・フェカーリスＪＭ３ニトリラーゼ（Nagasawa Tら (1990) Eur J Biochem 194:765-772）
６．アラビドプシス・タリアーナニトリラーゼ（ＮＩＴ１／ＮＩＴ２／ＮＩＴ３）（Vorwerk S ら (2001) Planta 212:508-516）
７．アルスロバクターｓｐ．Ｊ−１ニトリラーゼ（Bandyopadhyay AKら(1986) Appl Environ Microbiol 51(2):302-306）
８．バチルス・パリダス（Bacillus pallidus）Ｄａｃ５２１ニトリラーゼ （Cramp Rら(1997) Microbiology 143:2313-2320）
９．コマモナスｓｐ．ＮＩ１ニトリラーゼ（Cerbelaud Eら(1996) Ind Chem Libr 8:189-200）
１０．コマモナス・テストステロニｓｐ．ニトリラーゼ（Levy-Schil Sら (1995) Gene 161:15-20）
１１．フザリウム・オキシスポラムｆ．ｓｐ．メロニスニトリラーゼ（Goldlust A及びBohak Z (1989) Biotechnol Appl Biochem 11:581-601）
１２．フザリウム・ソラニニトリラーゼ（Harper BH (1977) Biochem J 167:685-692）
１３．クレブシエラ・オザエナニトリラーゼ（McBride KEら(1986) Appl Environ Microbiol 52(2):325-330）
１４．シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluoreszenz）ＤＳＭ ７１５５ニトリラーゼ（Layh Nら(1998) J Mol Catal B: Enzym 5:467-474）
１５．シュードモナスｓｐ．ニトリラーゼ（Layh Nら(1992) Arch Microbiol 158:405-411）
１６．シュードモナスｓｐ．（Ｓ１）ニトリラーゼ（Dhillon Jら (1999) Can J Microbiol 45: 811-815）
１７．シュードモナスｓｐ．１３ ニトリラーゼ（Yanase Hら(1982) Agric Biol Chem 46:2925）
１８．ロドコッカス・ロドクラウスＪ１ニトリラーゼ（Kobayashi Mら(1989) Eur J Biochem 182:349-356）
１９．ロドコッカス・ロドクラウスＫ２２ニトリラーゼ（Kobayashi Mら(1990) J Bacteriol 172(9):4807-4815）
２０．ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＢ１１２１５ニトリラーゼ（Harper BH (1985) Int J Biochem 17(6):677-683）
２１．ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＢ１１２１６ニトリラーゼ（Harper BH (1977) Biochem J 165:309-319）
２２．ロドコッカス・ロドクラウスＰＡ３４ニトリラーゼ（Bhalla TCら(1992) Appl Microbiol Biotechnol 37:184-190）
２３．ロドコッカスｓｐ．ＡＴＣＣ３９４８４ニトリラーゼ（Stevenson DEら (1992) Biotechnol Appl Biochem 15:283-302）。
【００５１】
好ましい実施形態では、ニトリラーゼは、以下からなる群より選択される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列により示される：
ａ）配列番号１に記載の配列を有する核酸配列、
ｂ）遺伝暗号の縮合により配列番号１に記載の核酸配列から誘導される核酸配列、
ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、アミノ酸レベルで少なくとも３５％の相同性を示すと共に、少なくとも１つのニトリルを対応するカルボン酸に変換することができる、配列番号１に記載の核酸配列の誘導体。
【００５２】
組換えニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼの発現は、例えば、微生物に導入しておいた適当なＤＮＡ構築物を用いて実施することができる。ＤＮＡ構築物はベクターであるのが好ましい。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド又はファージでありうる。組換え形態で発現させる核酸配列を含み、かつ、原核宿主細胞において自律複製が可能な環状プラスミドであるベクターが好ましい。ベクターの例として以下のものが挙げられる：
ａ）好ましくは、大腸菌におけるｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９（QIAGEN, Inc.）； ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、 ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene Cloning Systems, Inc）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia Biotech, Inc.）；ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１若しくはｐＢｄＣＩ、
ｂ）好ましくは、ストレプトミセス属におけるｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２若しくはｐＩＪ３６１、
ｃ）好ましくは、バチルス属におけるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４若しくはｐＢＤ２１４、
ｄ）コリネバクテリウム属におけるｐＳＡ７７若しくはｐＡＪ６６７、
又は前記プラスミドの誘導体。これらのプラスミドは、使用可能なプラスミドのほんの一部の選択に過ぎない。その他のプラスミドは当業者にはよく知られており、例えば、書籍：Cloning Vectors（編集：Pouwels P. H.ら、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018）に記載されている。
【００５３】
ＤＮＡ構築物は、発現させようとする少なくとも１つの核酸配列であって、ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素をコードし、かつ、使用する特定の微生物で機能するプロモーターに機能的に連結した上記核酸配列を含む。
【００５４】
当業者には、微生物において機能する多数のプロモーターが知られており、そのような例として、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ若しくはλ−ＰＬプロモーターのようなプロモーターを挙げることができる。大腸菌ラムノースオペロンプロモーター（ｒｈａプロモーター）が特に好ましく、これはラムノースを添加することにより誘導することができる。
【００５５】
一般に、機能的連結とは、遺伝子制御配列（例えば、プロモーター）が、発現させようとする核酸配列に関してその機能を発揮することができるような配置を意味する。これに関連して、「機能」とは、例えば、核酸配列の発現の制御、すなわち、転写及び／又は翻訳の制御を意味する。これに関し、「制御」は、例えば、発現、すなわち転写及び場合に応じて翻訳、の開始、増強、調節又は抑制を包含する。機能的連結とは、例えば、調節エレメントの各々が、核酸配列の発現に関してその機能を果たすことができるように、プロモーター、発現させようとする核酸配列、また必要に応じてその他の調節エレメント（例えば、ターミネーター）の連続的配置を意味するものとする。当業者であれば、本発明のＤＮＡ構築物のいずれかを取得する多様な方法を熟知している。ＤＮＡ構築物は、通常の組換え及びクローニング方法を用いて作製することができ、そのような方法は、例えば、以下の文献に記載されている：T Maniatis、EF Fritsch及びJ Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)；TJ Silhavy, ML Berman及びLW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)；並びにAusubel, FMら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)。
【００５６】
前記ＤＮＡ構築物は、別の機能的エレメントを含んでいてもよい。機能的エレメントという用語は、広く理解されているものであり、本発明のＤＮＡ構築物又は生物の発生、複製又は機能に対して影響を及ぼすあらゆる配列を意味する。例えば、機能的エレメントは、対応する宿主生物における転写、並びに場合に応じて翻訳を保証、増強、調節又は改変する。
【００５７】
機能的エレメントは、例えば、”Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)”又は”Gruber及びCrosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, 編集：Glick及びThompson、第７章、89-108”、並びにこれらの刊行物に含まれる引用文献に記載されている。以下にさらに詳しく説明する宿主生物又は出発生物に応じて、様々な制御配列が適しており、発現カセット又はベクターの導入により、このような生物は、遺伝的に改変された生物又はトランスジェニック生物に変換される。
【００５８】
「遺伝子制御配列」は、例えば、遺伝子の５’非翻訳領域又は非コード３’領域を含む。加えて、「遺伝子制御配列」という用語は、シグナルペプチド配列からなる融合タンパク質をコードする配列を意味する。例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００５９】
ａ）選択マーカー
選択マーカーは、概して、形質転換細胞を首尾よく選択し、かつ、時間経過による、及び細胞分裂中の、宿主細胞からのＤＮＡ構築物の喪失を防止するために必要である。このような喪失は、特に、発現させようとする核酸配列によりコードされる組換えタンパク質が原核生物に有毒な作用を及ぼす場合に起こりうる。発現構築物と一緒に導入される選択マーカーは、首尾よく形質転換された細胞に対して生物致死剤（例えば、アンピシリン、カナマイシン又はヒグロマイシンのような抗生物質）に対する耐性を賦与する。選択マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
−Ａｍｐ（アンピシリン耐性；ｂ−ラクタマーゼ）
−Ｃａｂ（カルベニシリン耐性）
−Ｃａｍ（クロラムフェニコール耐性）
−Ｋａｎ（カナマイシン耐性）
−Ｒｉｆ（リファンピシン耐性）
−Ｔｅｔ（テトラサイクリン耐性）
−Ｚｅｏ（ゼオシン耐性）
−Ｓｐｅｃ（スペクチノマイシン）
適量の抗生物質を用いることにより、選択圧を維持する。例として以下のものが挙げられる：アンピシリン、１００ｍｇ／ｌ、カルベニシリン、１００ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール、３５ｍｇ／ｌ、カナマイシン、３０ｍｇ／ｌ、リファンピシン、２００ｍｇ／ｌ、テトラサイクリン、１２．５ｍｇ／ｌ並びにスペクチノマイシン、５０ｍｇ／ｌ。
【００６０】
選択マーカーは、例えば、アミノ酸又はヌクレオチド合成における遺伝的欠失を補完することにより、対応して形質転換された宿主細胞を選択することができる遺伝子及び遺伝子産物をさらに含む。この目的のためには、中でも、前記のアミノ酸又はヌクレオチド構成ブロックを含まない培地を用いる。当業者はこのような多種の系を熟知している。例として、例えば、大腸菌株ＫＣ８（Clontech）に存在するように、トリプトファン（例：ｔｒｐＣ）、ロイシン（例：ｌｅｕＢ）及びヒスチジン（例：ｈｉｓＢ）生合成の欠失が挙げられる。これらの欠失は、中でも、選択マーカーＴＲＰ１、Ｌｅｕ２及びＨＩＳ３により補完することができる。
【００６１】
ｂ）転写ターミネーター
転写ターミネーターは、不要な転写を低減し、プラスミド及びｍＲＮＡ安定性を増強する。
【００６２】
ｃ）シャイン−ダルガーノ配列
シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列は、翻訳を開始するのに必要であり、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的である。開始コドンでの翻訳の開始の効率は実際の配列に左右される。大腸菌に適したコンセンサス配列の例として、5’-TAAGGAGG-3’がある。これは、開始コドンの約４〜１４ヌクレオチド上流に位置し、８ヌクレオチドが最適である。二次構造の形成（発現を低減する可能性がある）を防止するために、この領域はＡ／Ｔヌクレオチドが豊富であるのが好ましい。
【００６３】
ｄ）開始コドン
開始コドンは、翻訳が開始される位置である。ＡＴＧは大腸菌で最も多く用いられる開始コドンであり、これに代わり、ＧＴＧを用いることもできる。
【００６４】
ｅ）タグ及び融合タンパク質
比較的短いペプチド（タグ）又は他方のタンパク質（融合パートナー）を有する、発現させようとする組換えタンパク質のＮ又はＣ末端融合物が有利である。これらにより、例えば、発現、溶解度、検出可能性及び精製の改善を達成することができる。このような融合物と、発現及び精製後にタグ又は融合パートナーを除去することができるプロテアーゼ切断配列（例：トロンビン又は第Ｘ因子の場合）との組合せが好ましい。
【００６５】
ｆ）マルチクローニング領域（マルチクローニング部位；ＭＣＳ）により、１以上の核酸配列の挿入が可能及び容易になる。
【００６６】
ｇ）停止コドン／翻訳ターミネーター
考えられる３つの停止コドンのうち、ＴＡＧおよびＴＧＡを用いた場合、翻訳は全く終結していないのにリードスルーが起こりうることから、ＴＡＡが好ましい。信頼できる終結を確実にするため、いくつかの停止コドンの配列を用いてもよい。
【００６７】
ｈ）リポーター遺伝子
リポーター遺伝子は、容易に定量可能なタンパク質をコードし、これらのタンパク質は、固有の色又は酵素活性により、形質転換の効率、発現レベル、並びに発現の部位又は時間を評価することができる。リポーター遺伝子は、例えば、以下のタンパク質をコードする：加水分解酵素、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、グルコシダーゼ又はペルオキシダーゼ。ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、アセチルトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ及びアデニルトランスフェラーゼが好ましい（Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44も参照）。
【００６８】
形質転換微生物の作製には、対応する宿主細胞に、対応するＤＮＡ（例えば、本発明の発現カセット又はベクター）を導入する必要がある。形質転換と呼ばれるこの手順には、多数の方法が利用可能である（Keownら (1990) Methods in Enzymology 185:527-537も参照）。従って、ＤＮＡは、例えば、マイクロインジェクション若しくはエレクトロポレーション、又はＤＮＡをコードする微粒子によるボンバードメント（パーティクルボンバードメントジーンキャノンを用いたパーティクルガン法）により、直接導入することができる。また、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、細胞を化学的に透過性にし、ＤＮＡが拡散により細胞中に進入できるようにすることも可能である。ＤＮＡは、ミニセル、細胞、リソソーム若しくはリポソームのようなその他のＤＮＡ含有単位との融合により実施することもできる。電気的刺激により細胞を可逆的に透過性にするエレクトロポレーションも、ＤＮＡを挿入するのに適したもう１つの方法である。好ましい一般的方法として、リン酸カルシウム媒介形質転換、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質転換、カチオン脂質媒介形質転換、エレクトロポレーション、形質導入及び感染を挙げることができる。これらの方法は、当業者には周知であり、例えば、以下の文献に記載されている：Davisら、(1986) Basic Methods In Molecular Biology；Sambrook Jら、(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel FMら、(1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons；Glover DMら、(1995) DNA Cloning Vol.1, IRL Press ISBN 019-963476-9。
【００６９】
形質転換された細胞、すなわち、挿入されたＤＮＡを含む細胞は、選択マーカーが、挿入ＤＮＡの一部を形成する場合、非形質転換細胞から選択することができる。前記のように様々な選択マーカーがある。
【００７０】
本発明はさらに、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を含む微生物の調製物に関し、この調製物は、以下のものを含む：
ａ）０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度をもたらす少なくとも１種のアルデヒド、及び
ｂ）総濃度が、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物。
【００７１】
特に好ましい実施形態では、本発明の調製物は上記シアン化物化合物の添加を全く含まない。
【００７２】
本発明はさらに、食料品、飼料、医薬品又はファインケミカルの製造のための、本発明の調製物の使用に関する。「ファインケミカル」とは、好ましくはタンパク質、酵素、ビタミン、アミノ酸、糖、脂肪酸、並びに天然及び合成調味剤、着香剤並びに色素を意味する。
【００７３】
本発明はさらに、本発明の微生物の調製物の１つを用いて、組換えタンパク質、酵素（好ましくは、ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性）、あるいは、その他のファインケミカル、例えば、アミド又はカルボン酸（好ましくは、キラルカルボン酸及びアミド）を製造する方法、又はその調製物に関する。
【００７４】
本発明の好ましい部分は、カルボン酸及び／又はアミド（好ましくは、キラルカルボン酸／アミド）を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を有する微生物を培養するステップ、
ｂ）少なくとも１種のアルデヒドを添加するステップであって、総アルデヒド濃度が０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲であるステップ、
ｃ）前記微生物のアルデヒド処理調製物を少なくとも１種のニトリルと接触させ、このニトリルをカルボン酸及び／又はアミドに変換させるステップ
を含む方法に関する。
【００７５】
好ましい実施形態では、微生物の調製物は、アルデヒドの添加と共に、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である濃度で、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物を含む。特に好ましい実施形態では、前記調製物は、シアン化物化合物の添加を一切含まない。さらに好ましい実施形態では、調製物は、アルデヒドの添加（ステップｂ）後、反応ステップｃ）で用いるまで貯蔵することができる。本発明の方法は、バッチ方式又は供給バッチ方式で連続的又は非連続的に実施することができる。この場合、微生物の調製物と、基質としてのラセミニトリルを後に添加してもよい。
【００７６】
反応の実施及び／又は生成物の精製などに関する詳細は、例えば、ＷＯ００／２３５７７号に記載されている。この文献に記載されている出発化合物、生成物、並びに方法に関するパラメーターは、本明細書に参照としてその全体を組み込むものとする。
【００７７】
別の好ましい実施形態では、酵素、特にニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼを安定化、保存及び／又は貯蔵するための他の方法と、前記方法を組み合わせることができる。これらの方法は、限定するものではないが、例えば、以下のステップを含む：
ａ）少なくとも１００ｍＭ、好ましくは３００〜７００ｍＭの濃度で、少なくとも１種の無機塩（好ましくは、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩及び塩酸塩からなる群より選択される）を添加するステップ；
ｂ）ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ補欠分子族として機能する金属カチオンを有する金属塩（例：塩化コバルト又は硫酸鉄）を添加するステップ；
ｃ）ニトリル（例：ベンゾニトリル、イソブチロニトリル若しくはスクシノニトリル）及び／又はアミド（ｓ−カプロラクタム、イソブチルアミド若しくはプロピオンアミド）を添加するステップ。
【００７８】
別途記載のない限り、クローニング、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の結合、微生物の形質転換、細菌の増殖、並びに組換えＤＮＡ配列の分析をSambrookら、 (1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6）等の一般的な核酸の方法に記載されているように実施した。ＡＢＩレーザー蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて、サンガー（Sanger）法（Sangerら、(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467）により組換えＤＮＡ分子の配列決定を実施した。 発現させようとする構築物におけるポリメラーゼの誤りを防止するために、ポリメラーゼ連鎖反応により得られた断片を配列決定して、確認した。
【実施例１】
【００７９】
ニトリラーゼ活性を有する細胞の作製
大腸菌株（TG10 pDHE1650 pAgro4 pHSG575）を２０ｌの生物反応器で発酵させた。１０ｌの作業容量を含むこの反応器に、振盪器付きフラスコから２００ｍｌの前培養物を接種した。前培養培地は、主要培養培地と一致する。
【００８０】
培地：
４０ｇの９９．５％グリセロール
１５ｇのトリプトン
１３．３ｇのリン酸二水素カリウム
５ｇの酵母エキス
４ｇのリン酸水素二アンモニウム
１．７ｇのクエン酸
１．１ｇの硫酸マグネシウム七水和物
１ｍｌのＳＬ Ｋｏｒｚ １０００Ｃ微量元素溶液
０．１ｍｌのＴｅｇｏ ＫＳ９１１消泡剤
０．０６２ｇの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
１０ｍｇの塩酸チアミン
１ｌになるよう脱イオン水を添加する
培地を１２１℃で３０分滅菌する。次に、０．１ｇのアンピシリンを滅菌条件下で添加する。
【００８１】
微量元素溶液
クエン酸＊Ｈ２０ ２０ｇ
塩化コバルト（ＩＩ）六塩化物 ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ ２．５ｇ
塩化マンガン（ＩＩ）四塩化物 ＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ ３．０ｇ
塩化銅（ＩＩ）二水和物 ＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ ０．３ｇ
ホウ酸 Ｈ３ＢＯ３ ０．６ｇ
モリブデン酸ナトリウム二水和物 Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
酢酸亜鉛脱水和物（dehydrate） Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２＊２Ｈ２Ｏ ２．６ｇ
１ｌになるよう脱イオンＨ２Ｏを添加する
グリセロール供給溶液
２ｌの脱イオン水
２１１ｇの硫酸ナトリウム
１３．６ｇの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
８．８ｋｇの９９．５％グリセロール
２２０ｍｌの微量元素溶液
ラムノース供給溶液
７０３ｇの脱イオン水
２９７ｇのラムノース一水和物
３７℃の温度で発酵を実施する。攪拌器の回転速度を４００〜１５００ｌ／分に調節しながら、ガス抜きを８〜３０ｌ／分に調節することにより、ｐＯ２を２０％以上に維持する。１時間の発酵時間後、ＩＰＴＧ（０．１５ｍＭ）を用いて培養を誘導する。次に、１８．５ｇのラムノース供給溶液を添加する。最初に導入した量のグリセロールが消費されたら、グリセロールを連続的に供給する。４４時間にわたる発酵時間の後、１ｌ当たり５０ｇＤＢＭ及び１ｌ当たり５０〜６０ｋＵの細胞懸濁液を得る。前記細胞を４℃まで冷却する。
【実施例２】
【００８２】
活性試験
５０μｌの細胞懸濁液をピペットで８８０μｌのリン酸ナトリウムカリウムバッファー（１０ｍＭ）へと移し、全体を３０℃で平衡化させる。２０μｌのマンデロニトリルのメタノール溶液（１２％）を添加することにより、反応を開始する。１０分後、５０μｌの１Ｍ ＨＣを添加することにより、酵素反応を停止させる。細胞塊を遠心して分離し、上清中のマンデル酸の濃度をＨＰＬＣ（ODS Hypersil １００＊２．０ｍｍ、移動相：７５％Ｈ３ＰＯ４（１４．８ｍＭ）／２５％メタノール；流速：０．５ｍｌ／分；注入量：２μｌ；カラム温度：４０℃；検出：２１０ｎｍ；マンデル酸滞留時間：０．９分）により測定する。
【実施例３】
【００８３】
ベンズアルデヒドを用いた貯蔵
発酵終了から１４時間後、ＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４で細胞懸濁液のｐＨを６．０、６．６若しくは７．２に調節した後、ベンズアルデヒドで処理した。サンプルを４℃又は２２℃で貯蔵した。発酵終了から０．６日、３．６日及び６．６日後、酵素活性を測定した。
【表１】
【実施例４】
【００８４】
ＣＢＡを用いた貯蔵
発酵終了から１４時間後、ＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４で細胞懸濁液のｐＨを６．０、６．６若しくは７．２に調節した後、２−クロロベンズアルデヒドで処理した。サンプルを４℃又は２２℃で貯蔵した。発酵終了から０．６日、３．６日及び６．６日後、酵素活性を測定した。
【表２】
【実施例５】
【００８５】
長期貯蔵
細胞懸濁液をｐＨ６．６に調節した後、2-クロロベンズアルデヒドを１．３５ｍＭの濃度まで添加してから、細胞懸濁液を４℃で保存した。活性の推移を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】（Ｒ）−マンデル酸の製造のためのニトリラーゼの貯蔵安定性を示す。２０日（ｄ）までの期間にわたり、アルデヒドを添加していない（比較実験）、大腸菌発現ニトリラーゼの３つの独立した調製物の活性（Ａ；初期活性の％で表す）の低下を示す。
【図２】（Ｒ）−マンデル酸の製造のためのニトリラーゼの貯蔵安定性を示す。２−クロロベンズアルデヒドを添加した同様の別の調製物（黒丸）と比較した、２−クロロベンズアルデヒドを添加しない大腸菌発現ニトリラーゼの調製物（白丸）の活性（Ａ；初期活性の％で表す）の低下を示す。この図は、３２日（ｄ）までの期間（ｔ）を示す。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行なわれる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が産する酵素は、化学的製造方法で生体触媒として用いられることが多くなってきている。特に、アミド、カルボン酸又はα−ヒドロキシカルボン酸を得るためのニトリルの酵素による加水分解は、経済的に非常に重要な工程である。ニトリル加水分解酵素は、ニトリルヒドラターゼ及びニトリラーゼファミリーに分類することができる。ニトリルヒドラターゼとニトリラーゼは、それらの活性中心に触媒に必須のシステイン分子を有する（Levy-Schil（1995）Gene 161:15-20）。ニトリルヒドラターゼは、１モル当量の水の付加を触媒することにより、対応するアミドを生じる。ニトリラーゼは、２モル当量の水の付加を触媒することにより、対応するカルボン酸を生じる。概して、上記酵素は、光学的に選択性の水和又は加水分解をもたらし、これによって光学的に活性の（キラル）生成物が得られる。キラルカルボン酸は、合成有機化学で需要の多い化合物である。これらは、多数の医薬活性化合物、又は植物保護用の活性化合物のための出発化合物である。キラルカルボン酸は、ジアステレオマー塩を用いた古典的ラセミ混合物分割のために用いることができる。従って、Ｒ−（−）−又はＳ−（−）−マンデル酸は、例えば、ラセミアミンのラセミ混合物分割に用いられる。Ｒ−（−）−マンデル酸は、合成において中間体としても用いられる。
【０００３】
酵素反応には、通常、精製又は部分的に精製した酵素を用いるが、対応する酵素活性を有する微生物を用いることも可能である。酵素は、天然又は組換え体に由来するものでよい。一般に、酵素は、反応を進行させるステップで製造される（発現される）。これに関して、比較的多量の酵素を製造し、これらを必要に応じて触媒工程に導入することが望ましい。しかし、この場合、酵素の活性を保持しつつ酵素を貯蔵することが必要になってくる。これに関して、冷却及び／又は凍結が標準的方法である。しかし、凍結は通常、複雑な凍結／解凍方法を必要とし、概して酵素活性の大きな喪失につながる。一般に、冷却は精密なロジスティック及びエネルギー消費を必要とする。
【０００４】
ＥＰ−Ａ１ ０ ６６６ ３２０には、対応するニトリルからαヒドロキシ酸／アミドを製造する方法が記載されており、その方法では、反応の前に、用いる微生物を亜硫酸ナトリウム（１Ｍ）とリン酸バッファー（５０ｍＭ）の存在下でインキュベートする。さらに、反応中の酵素活性は、亜リン酸塩又は次亜リン酸塩の添加により安定化させることもでき、この添加により、遊離の酵素阻害アルデヒドが錯化する。ＥＰ−Ａ１０ ６１０ ０４８には、微生物を用いてα−ヒドロキシ酸を製造する方法が記載されており、この方法では、亜硫酸ナトリウムの添加により反応中の酵素活性を安定化させ、この添加によって同様に、遊離の酵素阻害アルデヒドが錯化する。前記の方法では、添加剤は、いずれも例外なく、ニトリルの変換中に添加される。反応での使用前の安定化方法は開示されていない。
【０００５】
システイン依存活性を保存するための典型的方法は、ジチオトレイトール及び／又はメルカプトエタノール及び／又はエチレンジアミンテトラ酢酸を添加するものである（例：ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous） Ｊ１ニトリラーゼ； Kobayashi M (1989) Eur J Biochem 182: 349-356）。
【０００６】
ロドコッカスｓｐ．ＡＴＣＣ ３９４８４ニトリラーゼの安定化は、基質（ベンゾニトリル）を添加することにより達成されている（Stevenson DE (1992) Biotechnol Appl Biochem 15:283-302）。ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＢ １１２１６ニトリラーゼの場合には、基質濃度以外に、塩基性ｐＨ、温度及び酵素濃度が安定化の速度に寄与する（Harper BH (1976) Biochem Soc Trans 4:502-504; Harper BH (1977) Biochem J 165:309-319）。これらの事例における問題点は、安定剤が酵素により改変されるため、時間が経過するにつれその効果を失うことである。
【０００７】
ロドコッカス・ロドクラウスＪ1ニトリラーゼの場合、酵素活性を安定化させるために、無機塩（２０％以下の（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む）とアルコール（５０％以下のグリセロール、１０％エタノール）を添加することが記載されている（Nagasawa T (2000) Eur J Biochem 267:138-144）。
【０００８】
アルカリゲネス・フェカーリスＪＭ３ニトリラーゼの場合には、酵素活性を安定化するために、６０％硫酸アンモニウム、２Ｍ ＮａＣｌ又は３０％プロパンジオールの添加が記載されている（Nagasawa T (1990) Eur J Biochem 194:765-772）。
【０００９】
ＥＰ−Ａ１ ０ ７０７ ０６１には、少なくとも１００ｍＭから飽和点までの濃度で、無機塩（リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩および塩酸塩）を貯蔵バッファーに添加することにより、ニトリラーゼ含有細胞を安定化する方法が記載されている。
【００１０】
米国特許第４，９３１，３９１号、ＥＰ−Ａ１ ０ ２４３ ９６７及び米国特許第４，９００，６７２号には、細胞懸濁液にアミド若しくはカルボン酸（又は物質の組合せ）の添加によるニトリルヒドラターゼ活性の安定化が記載されている。
【００１１】
米国特許第４，３４３，９００号には、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法であって、用いる固定細胞の膨潤に関連する活性の喪失を防止する目的で、反応混合物に炭酸アルカリ金属を添加することが記載されている。
【００１２】
米国特許第６，２５１，６４６号及び米国特許第６，３６８，８０４号には、少なくとも０．１Ｍから飽和濃度までの濃度で炭酸（水素）アンモニウム、ナトリウム若しくはカリウムを添加することにより、ニトリラーゼ活性担持微生物を安定化する方法が記載されている。
【００１３】
反応性アルデヒド基のために、アルデヒドは酵素阻害物質として分類される。産生過程におけるニトリラーゼに対するその阻害作用については、多数の刊行物で主張されている（ＥＰ−Ｂ１ ０ ７７３ ２９７ Ｂ１、ｐ．４、パラグラフ［００１３］及び［００２５］；ＥＰ−Ｂ１ ０ ７０７ ０６１ Ｂ１、ｐ．２、パラグラフ［０００５］；ＥＰ−Ｂ１ ０ ６６６ ３２０、ｐ．２、パラグラフ［０００４］並びにその箇所で引用されている参照文献；ＥＰ−Ａ２ ０ ４８６ ２８９、ｐ．２、第３０行、並びにその箇所で引用されている参照文献；Yamamoto (1992) J Ferm Technol 73:425-430、特に、ｐ．４２９、最後のパラグラフ）。
【００１４】
前記酵素を工業的に用いることに関して、貯蔵中のニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼ活性の不活性化は重要なコスト要因である。例えば、４℃及びｐＨ６．０で、６．６日の期間後に活性は３６％低下するが、これは活性の喪失が１日当たり５．５％であることを示している（図１；実施例３での比較実験を参照）。ニトリラーゼの場合、活性の喪失は、例えば、酵素多量体がそのモノマーに分解し、これらモノマーにはニトリラーゼ活性が全くないためと考えられる（Nagasawa T (1990) Eur J Biochem 194:765-772）。記載されている方法は、非常に限られた程度までしかこの問題を解決することができない。さらに、前記の方法は、生体触媒を安定化するために高濃度の添加剤を用いるが、これらの添加剤は、生体触媒を使用した後、入念に分離し、処分しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の目的は、不要な付随物質で反応混合物を汚染することなく、ニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼ活性を可能な限り長期間にわたり安定化させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の方法はこの目的を達成する。
【００１７】
本発明の第１ステップは、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を有する微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行われる方法に関する。
【００１８】
上記保存ステップは、細胞により触媒しようとする反応の反応物質で該細胞を処理する前に実施するのが好ましい。好ましい実施形態では、水性媒体は、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物を含み、その総濃度は、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である。特に好ましい実施形態では、保存及び／又は貯蔵に適した水性媒体は前記シアン化物化合物の添加を一切含まない。
【００１９】
「アルデヒド」という用語は、広く理解されるべきであり、脂肪族及び芳香族アルデヒドの両方を含む。好ましい実施形態では、アルデヒドは、式ＩＩＩ：
【化１】
【００２０】
（式中、Ｒ６は、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル−、あるいは置換又は非置換のアリール−又はヘタリール−でありうる）
の化合物を意味する。特に、芳香族アルデヒドが好ましく、非置換ベンズアルデヒド及び置換ベンズアルデヒド、例えば、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｏ−ブロモベンズアルデヒド、ｍ−ブロモベンズアルデヒド、ｐ−ブロモベンズアルデヒド、ｏ−メチルベンズアルデヒド、ｍ−メチルベンズアルデヒド及びｐ−メチルベンズアルデヒドが極めて好ましい。
【００２１】
保存／貯蔵される微生物を用いて、例えば、式（ＩＩ）のラセミニトリルを式（Ｉａ）のキラルカルボン酸又は式（Ｉｂ）のキラルアミドに変換することができる：
【化２】
【００２２】
（式中、
*は任意により活性中心であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立に、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル−、置換又は非置換のアリール−、ヘタリール−、ＯＲ４又はＮＲ４Ｒ５であり、基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は常に異なるものであり、
Ｒ４は、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル−、Ｃ１−Ｃ１０−アルキルカルボニル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニルカルボニル−、アリール−、アリールカルボニル−、ヘタリール−又はヘタリールカルボニル−であり、
Ｒ５は、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル−、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル−、アリール−又はヘタリール−である）。
【００２３】
最も好ましいニトリルは、マンデロニトリル、ｏ−クロロマンデロニトリル、ｐ−クロロマンデロニトリル、ｍ−クロロマンデロニトリル、ｏ−ブロモマンデロニトリル、ｐ−ブロモマンデロニトリル、ｍ−ブロモマンデロニトリル、ｏ−メチルマンデロニトリル、ｐ−メチルマンデロニトリル又はｍ−メチルマンデロニトリルである。最も好ましいキラルカルボン酸は、Ｒ−マンデル酸、Ｓ−マンデル酸、Ｒ−ｐ−クロロマンデル酸、Ｓ−ｐ−クロロマンデル酸、Ｒ−ｍ−クロロマンデル酸、Ｓ−ｍ−クロロマンデル酸、Ｒ−ｏ−クロロマンデル酸、Ｓ−ｏ−クロロマンデル酸、Ｓ−ｏ−ブロモマンデル酸、Ｓ−ｐ−ブロモマンデル酸、Ｓ−ｍ−ブロモマンデル酸、Ｓ−ｏ−メチルマンデル酸、Ｓ−ｐ−メチルマンデル酸、Ｓ−ｍ−メチルマンデル酸、Ｒ−ｏ−ブロモマンデル酸、Ｒ−ｐ−ブロモマンデル酸、Ｒ−ｍ−ブロモマンデル酸、Ｒ−ｏ−メチルマンデル酸、Ｒ−ｐ−メチルマンデル酸及びＲ−ｍ−メチルマンデル酸である。
【００２４】
目的とするニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼ触媒反応のための出発化合物として、式（ＶＩ）のα−ヒドロキシニトリル：
【化３】
【００２５】
（式中、Ｒ６は、式（ＩＩＩ）と同じ定義とする）
を用いる場合には、保存／貯蔵に用いられるアルデヒドは、水素シアン酸又はシアン化物との反応により前記αヒドロキシニトリルを生じる同じアルデヒドである、すなわち、基Ｒ６は式ＩＩＩ及びＩＶにおいて同一のものが選択される。
【００２６】
保存及び／又は貯蔵に適した水性媒体中のアルデヒドの総濃度は、０．１〜１００ｍＭ／ｌ、好ましくは０．２〜５０ｍＭ／ｌ、特に好ましくは０．５〜１０ｍＭ／ｌ、非常に好ましくは０．３〜５ｍＭ／ｌ、最も好ましくは０．４〜２ｍＭ／ｌである。
【００２７】
水性媒体は、中性、弱塩基又は弱酸性ｐＨを有する。従って、ｐＨは、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲にある。保存温度は、好ましくは０〜４０℃、特に好ましくは１〜１０℃、非常に好ましくは２〜５℃である。
【００２８】
本発明の方法は、実験室条件下及び製造条件下の両方で、酵素活性の長期間持続を確実にするのに極めて適していることが証明された。生体触媒は、３７日の観察期間中全く不活性化を示さない。
【００２９】
本発明に関して、「微生物」とは、グラム陽性又はグラム陰性細菌を意味する。
【００３０】
エンテロバクテリア科のすべての属及び種、又は放線菌目の科、属及び種が好ましく、特に、エンテロバクテリア科のエッシェリヒア、セラチア、プロテウス、エンテロバクター、クレブシエラ、サルモネラ、シゲラ、エドワードシーラ、シトロバクター、モルガネラ、プロビデンシア及びエルシニアの種が非常に好ましい。
【００３１】
さらには、シュードモナス属、バークホルデリア属、ノカルジア属、アセトバクター属、グルコノバクター菌、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、シアノバクター属、スタフィロコッカス属、アエロバクター属、アルカリゲネス属、ロドコッカス属並びにペニシリウム属の種も好ましい。
【００３２】
最も好ましいのは、エッシェリヒア属の種、特に大腸菌（Escherichia coli）である。
【００３３】
本発明の方法に際し、微生物は、増殖、休止、固定化又は破砕された状態で存在することができる。「破砕された細胞」とは、例えば、溶剤での処理により透過性にされた細胞、例えば、酵素処理、機械的処理（例：フレンチプレス若しくは超音波）又は別の方法により開口させた細胞を意味する。このようにして得られる粗抽出物は、本発明の方法に有利に適している。部分的又は完全に精製した酵素調製物もまた本発明の方法に用いることができる。反応において有利に用いられる固定化微生物又は酵素も同様に好適である。固定化は、例えば、１種以上のアクリルモノマー（例：アクリルアミド、アクリル酸、メタクリルアミド、メタクリル酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、ジエチルアミノプロピルアクリルアミド若しくはジエチルアミノプロピルメタクリルアミド）、並びにまた、必要に応じて、１種以上の架橋剤（例：メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミド、１，２−ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド若しくはビスアクリルアミド酢酸）を細胞又は酵素調製物に添加した後、フリーラジカル重合（例えば、過硫酸アンモニウムにより開始される）を行うことにより、実施することができる。
【００３４】
異種細菌又は真菌による汚染を防ぐために、必要に応じて、抗菌又は殺菌効果のある好適な活性化合物又は他の塩（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸）を保存／貯蔵溶液に添加することもできる。
【００３５】
本発明の方法に用いる微生物は、保存／貯蔵前に、これらの微生物が増殖可能な培地で培養することができる。この培地は、合成培地又は天然培地のいずれでもよい。生物に応じて、当業者に公知の培地を用いる。微生物を増殖させるために、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機塩、並びに必要に応じて、少量のビタミン及び微量元素を含む。
【００３６】
有利な炭素源の例として、以下のものが挙げられる：ポリオール（例えば、グリセロール）、糖、例えば、単−、二−若しくは多糖（例：グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン又はセルロース）、複合糖源（例えば、メラッセ（melasse））、糖リン酸（例：フルクトース−１，６−二リン酸）、糖アルコール（例：マンニトール）、アルコール（例：メタノール又はエタノール）、カルボン酸（例：クエン酸、乳酸若しくは酢酸）、脂肪（例：ダイズ油又はナタネ油）、アミノ酸、例えば、アミノ酸混合物（例：カザミノ酸（Difco））、又は個々のアミノ酸（例：グリシン又はアスパラギン酸）、あるいはアミノ糖（後者は、窒素源として同時に用いることも可能である）。特に好ましいのはポリオールであり、中でもグリセロールが好ましい。
【００３７】
有利な窒素源は、有機又は無機窒素化合物、あるいはこれらの化合物を含む材料である。例として、アンモニウム塩（例：ＮＨ４Ｃｌ又は（ＮＨ４）２ＳＯ４）、硝酸塩、尿素、若しくは複合窒素源（例：コーンスティープリカー）、ビール酵母自己分解物、ダイズミール、コムギグルテン、酵母抽出物、ペプトン、食肉抽出物、カゼイン加水分解物、酵母又はジャガイモタンパク質が挙げられ、これらは、窒素源として同時に用いられることも多い。
【００３８】
無機塩の例として、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、マンガン、カリウム、亜鉛、銅及び鉄の塩がある。これら塩のアニオンとしては、塩素イオン、硫酸イオン及びリン酸イオンを挙げることができる。本発明の方法での生産性を高める上で重要な要因は、生産培地中のＦｅ２＋又はＦｅ３＋イオン濃度の制御である。
【００３９】
必要に応じて、その他の増殖因子（例えば、ビタミン）、又は増殖プロモーター（例えば、ビオチン、２−ＫＬＧ、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩若しくはピリドキシン）、アミノ酸（例えば、アラニン、システイン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、フェニルアラニン、オルニチン若しくはバリン）、カルボン酸（例えば、クエン酸、ギ酸、ピメリン酸若しくは乳酸）、あるいはジチオトレイトールのような物質を栄養培地に添加する。
【００４０】
上記栄養素を混合する比率は、発酵の種類に応じて変動し、各々のケースで指定される。培地成分は、必要であれば、別々に又は一緒に滅菌した後、発酵の開始時に全部導入するか、あるいは、その後の発酵中に、必要に応じて、連続的に又は非連続的に添加することができる。
【００４１】
培養条件は、生物が増殖して、得られる最高収率（例えば、発現させる組換えタンパク質の総活性により決定する）を達成できるように指定する。好ましい培養温度は、１５℃〜４０℃である。２５℃〜３７℃の温度が特に有利である。ｐＨは３〜９の範囲に維持するのが好ましい。５〜８のｐＨ値が特に有利である。一般に、数時間〜数日、好ましくは８時間〜２１日、特に好ましくは４時間〜１４日のインキュベーションが十分である。
【００４２】
当業者は、例えば、培地の有利な最適化について、応用微生物生理学のテキスト、“A Practical Approach（編集：PM Rhodes, PF Stanbury, IRL-Press, 1997, pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3）から情報を得ることができる。
【００４３】
保存／貯蔵の目的で、微生物培養の前、その間又は後に、アルデヒドを添加してもよい。従って、例えば、微生物をそれ以上分離することなく、発酵混合物にアルデヒドを添加することによって、活性の最大限の保存を達成することが可能である。
【００４４】
しかし、上記のように培養しておいた微生物細胞又は微生物を分離することも可能であり、分離は、例えば、培養培地からそれらを遠心分離し、任意により適当なバッファー（ホウ酸バッファー又はリン酸バッファー）で１回又は数回洗浄してから、保存／貯蔵の目的で、少なくとも１種のアルデヒドを含む水溶液中に溶解又は再懸濁させることにより実施する。少なくとも１種のアルデヒドを含む上記水溶液における微生物の濃度は任意に選択することができる。
【００４５】
本発明に関して用いられる微生物は、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ及び／又はニトリラーゼ活性を呈示する。
【００４６】
一般に、「ニトリルヒドラターゼ」活性は、以下に示すように、ニトリルに対する１モル当量の水の付加を触媒し、これによって対応するアミドを形成する特性を意味する：
Ｒ−ＣＮ ＋ Ｈ２Ｏ → Ｒ−ＣＯ−ＮＨ２
その際、ニトリルヒドラターゼはＥＣクラス４．２．１．８４（ニトリルヒドラターゼ）の酵素を含むのが好ましい。
【００４７】
一般に、「ニトリラーゼ」活性は、以下に示すように、ニトリルに対する２モル当量の水の付加を触媒し、これによって対応するカルボン酸を形成する特性を意味する：
Ｒ−ＣＮ ＋ ２Ｈ２Ｏ → Ｒ−ＣＯＯＨ−ＮＨ３
ニトリラーゼは、好ましくは、ＥＣクラス３．５．５．１（ニトリラーゼ）、３．５．５．２（リシニンニトリラーゼ）、３．５．５．４（シアノアラニンニトリラーゼ）、３．５．５．５（アリールアセトニトリラーゼ）、３．５．５．６（ブロモキシニルニトリラーゼ）並びに３．５．５．７（脂肪族ニトリラーゼ）を含む。
【００４８】
前記微生物細胞のニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性は、天然又は組換え体由来のものでよい。
【００４９】
これに関して、「天然由来の」とは、人為的作用によってもたらされる遺伝的変化を一切含まないそのままの微生物が、ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性を呈示することを意味する。多数のこのような微生物が当業者に知られている。特に、ロドコッカス属及びゴルドナ属の微生物、例えば、ロドコッカスｓｐ．ＨＴ４０−６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２３１）、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ３３２７８、ロドコッカス・ロドクラウスＪ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）、並びにゴルドナ・テラエ（Gordona terrae）ＭＡ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５３５）（ＪＰ−Ａ−４−２２２５９１、ＪＰ−Ｂ−６−５５１４８、ＥＰ−Ａ１ ０ ７０７ ０６１）が好ましい。
【００５０】
これに関連し、「組換え体由来の」とは、ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列を微生物から単離し、別の種の微生物において発現させることを意味する。ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする多数の配列が当業者に知られている。例として以下に示すものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：
１．アシドボラクス・ファシリス（Acidovorax facilis）ニトリラーゼ７２Ｗ （Gavagan JEら(1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:654-659）
２．アシネトバクターｓｐ．ＡＫ２２６ニトリラーゼ（Yamamoto K及びKomatsu K (1991) Agric Biol Chem 55(6):1459-1466）
３．アシネトバクターｓｐ．ＲＦＢ１ニトリラーゼ（Finnegan Iら (1991) Appl Microbiol Biotechnol 36:142-144）
４．アルカリゲネス・フェカーリスＡＴＣＣ８７５０ニトリラーゼ（Yamamoto Kら (1991) Appl Environ Microbiol 57(10):3028-3032）
５．アルカリゲネス・フェカーリスＪＭ３ニトリラーゼ（Nagasawa Tら (1990) Eur J Biochem 194:765-772）
６．アラビドプシス・タリアーナニトリラーゼ（ＮＩＴ１／ＮＩＴ２／ＮＩＴ３）（Vorwerk S ら (2001) Planta 212:508-516）
７．アルスロバクターｓｐ．Ｊ−１ニトリラーゼ（Bandyopadhyay AKら(1986) Appl Environ Microbiol 51(2):302-306）
８．バチルス・パリダス（Bacillus pallidus）Ｄａｃ５２１ニトリラーゼ （Cramp Rら(1997) Microbiology 143:2313-2320）
９．コマモナスｓｐ．ＮＩ１ニトリラーゼ（Cerbelaud Eら(1996) Ind Chem Libr 8:189-200）
１０．コマモナス・テストステロニｓｐ．ニトリラーゼ（Levy-Schil Sら (1995) Gene 161:15-20）
１１．フザリウム・オキシスポラムｆ．ｓｐ．メロニスニトリラーゼ（Goldlust A及びBohak Z (1989) Biotechnol Appl Biochem 11:581-601）
１２．フザリウム・ソラニニトリラーゼ（Harper BH (1977) Biochem J 167:685-692）
１３．クレブシエラ・オザエナニトリラーゼ（McBride KEら(1986) Appl Environ Microbiol 52(2):325-330）
１４．シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluoreszenz）ＤＳＭ ７１５５ニトリラーゼ（Layh Nら(1998) J Mol Catal B: Enzym 5:467-474）
１５．シュードモナスｓｐ．ニトリラーゼ（Layh Nら(1992) Arch Microbiol 158:405-411）
１６．シュードモナスｓｐ．（Ｓ１）ニトリラーゼ（Dhillon Jら (1999) Can J Microbiol 45: 811-815）
１７．シュードモナスｓｐ．１３ ニトリラーゼ（Yanase Hら(1982) Agric Biol Chem 46:2925）
１８．ロドコッカス・ロドクラウスＪ１ニトリラーゼ（Kobayashi Mら(1989) Eur J Biochem 182:349-356）
１９．ロドコッカス・ロドクラウスＫ２２ニトリラーゼ（Kobayashi Mら(1990) J Bacteriol 172(9):4807-4815）
２０．ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＢ１１２１５ニトリラーゼ（Harper BH (1985) Int J Biochem 17(6):677-683）
２１．ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＢ１１２１６ニトリラーゼ（Harper BH (1977) Biochem J 165:309-319）
２２．ロドコッカス・ロドクラウスＰＡ３４ニトリラーゼ（Bhalla TCら(1992) Appl Microbiol Biotechnol 37:184-190）
２３．ロドコッカスｓｐ．ＡＴＣＣ３９４８４ニトリラーゼ（Stevenson DEら (1992) Biotechnol Appl Biochem 15:283-302）。
【００５１】
好ましい実施形態では、ニトリラーゼは、以下からなる群より選択される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列により示される：
ａ）配列番号１に記載の配列を有する核酸配列、
ｂ）遺伝暗号の縮合により配列番号１に記載の核酸配列から誘導される核酸配列、
ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、アミノ酸レベルで少なくとも３５％の相同性を示すと共に、少なくとも１つのニトリルを対応するカルボン酸に変換することができる、配列番号１に記載の核酸配列の誘導体。
【００５２】
組換えニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼの発現は、例えば、微生物に導入しておいた適当なＤＮＡ構築物を用いて実施することができる。ＤＮＡ構築物はベクターであるのが好ましい。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド又はファージでありうる。組換え形態で発現させる核酸配列を含み、かつ、原核宿主細胞において自律複製が可能な環状プラスミドであるベクターが好ましい。ベクターの例として以下のものが挙げられる：
ａ）好ましくは、大腸菌におけるｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９（QIAGEN, Inc.）； ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、 ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene Cloning Systems, Inc）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia Biotech, Inc.）；ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１若しくはｐＢｄＣＩ、
ｂ）好ましくは、ストレプトミセス属におけるｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２若しくはｐＩＪ３６１、
ｃ）好ましくは、バチルス属におけるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４若しくはｐＢＤ２１４、
ｄ）コリネバクテリウム属におけるｐＳＡ７７若しくはｐＡＪ６６７、
又は前記プラスミドの誘導体。これらのプラスミドは、使用可能なプラスミドのほんの一部の選択に過ぎない。その他のプラスミドは当業者にはよく知られており、例えば、書籍：Cloning Vectors（編集：Pouwels P. H.ら、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018）に記載されている。
【００５３】
ＤＮＡ構築物は、発現させようとする少なくとも１つの核酸配列であって、ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素をコードし、かつ、使用する特定の微生物で機能するプロモーターに機能的に連結した上記核酸配列を含む。
【００５４】
当業者には、微生物において機能する多数のプロモーターが知られており、そのような例として、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ若しくはλ−ＰＬプロモーターのようなプロモーターを挙げることができる。大腸菌ラムノースオペロンプロモーター（ｒｈａプロモーター）が特に好ましく、これはラムノースを添加することにより誘導することができる。
【００５５】
一般に、機能的連結とは、遺伝子制御配列（例えば、プロモーター）が、発現させようとする核酸配列に関してその機能を発揮することができるような配置を意味する。これに関連して、「機能」とは、例えば、核酸配列の発現の制御、すなわち、転写及び／又は翻訳の制御を意味する。これに関し、「制御」は、例えば、発現、すなわち転写及び場合に応じて翻訳、の開始、増強、調節又は抑制を包含する。機能的連結とは、例えば、調節エレメントの各々が、核酸配列の発現に関してその機能を果たすことができるように、プロモーター、発現させようとする核酸配列、また必要に応じてその他の調節エレメント（例えば、ターミネーター）の連続的配置を意味するものとする。当業者であれば、本発明のＤＮＡ構築物のいずれかを取得する多様な方法を熟知している。ＤＮＡ構築物は、通常の組換え及びクローニング方法を用いて作製することができ、そのような方法は、例えば、以下の文献に記載されている：T Maniatis、EF Fritsch及びJ Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)；TJ Silhavy, ML Berman及びLW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)；並びにAusubel, FMら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)。
【００５６】
前記ＤＮＡ構築物は、別の機能的エレメントを含んでいてもよい。機能的エレメントという用語は、広く理解されているものであり、本発明のＤＮＡ構築物又は生物の発生、複製又は機能に対して影響を及ぼすあらゆる配列を意味する。例えば、機能的エレメントは、対応する宿主生物における転写、並びに場合に応じて翻訳を保証、増強、調節又は改変する。
【００５７】
機能的エレメントは、例えば、”Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)”又は”Gruber及びCrosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, 編集：Glick及びThompson、第７章、89-108”、並びにこれらの刊行物に含まれる引用文献に記載されている。以下にさらに詳しく説明する宿主生物又は出発生物に応じて、様々な制御配列が適しており、発現カセット又はベクターの導入により、このような生物は、遺伝的に改変された生物又はトランスジェニック生物に変換される。
【００５８】
「遺伝子制御配列」は、例えば、遺伝子の５’非翻訳領域又は非コード３’領域を含む。加えて、「遺伝子制御配列」という用語は、シグナルペプチド配列からなる融合タンパク質をコードする配列を意味する。例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００５９】
ａ）選択マーカー
選択マーカーは、概して、形質転換細胞を首尾よく選択し、かつ、時間経過による、及び細胞分裂中の、宿主細胞からのＤＮＡ構築物の喪失を防止するために必要である。このような喪失は、特に、発現させようとする核酸配列によりコードされる組換えタンパク質が原核生物に有毒な作用を及ぼす場合に起こりうる。発現構築物と一緒に導入される選択マーカーは、首尾よく形質転換された細胞に対して生物致死剤（例えば、アンピシリン、カナマイシン又はヒグロマイシンのような抗生物質）に対する耐性を賦与する。選択マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
−Ａｍｐ（アンピシリン耐性；ｂ−ラクタマーゼ）
−Ｃａｂ（カルベニシリン耐性）
−Ｃａｍ（クロラムフェニコール耐性）
−Ｋａｎ（カナマイシン耐性）
−Ｒｉｆ（リファンピシン耐性）
−Ｔｅｔ（テトラサイクリン耐性）
−Ｚｅｏ（ゼオシン耐性）
−Ｓｐｅｃ（スペクチノマイシン）
適量の抗生物質を用いることにより、選択圧を維持する。例として以下のものが挙げられる：アンピシリン、１００ｍｇ／ｌ、カルベニシリン、１００ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール、３５ｍｇ／ｌ、カナマイシン、３０ｍｇ／ｌ、リファンピシン、２００ｍｇ／ｌ、テトラサイクリン、１２．５ｍｇ／ｌ並びにスペクチノマイシン、５０ｍｇ／ｌ。
【００６０】
選択マーカーは、例えば、アミノ酸又はヌクレオチド合成における遺伝的欠失を補完することにより、対応して形質転換された宿主細胞を選択することができる遺伝子及び遺伝子産物をさらに含む。この目的のためには、中でも、前記のアミノ酸又はヌクレオチド構成ブロックを含まない培地を用いる。当業者はこのような多種の系を熟知している。例として、例えば、大腸菌株ＫＣ８（Clontech）に存在するように、トリプトファン（例：ｔｒｐＣ）、ロイシン（例：ｌｅｕＢ）及びヒスチジン（例：ｈｉｓＢ）生合成の欠失が挙げられる。これらの欠失は、中でも、選択マーカーＴＲＰ１、Ｌｅｕ２及びＨＩＳ３により補完することができる。
【００６１】
ｂ）転写ターミネーター
転写ターミネーターは、不要な転写を低減し、プラスミド及びｍＲＮＡ安定性を増強する。
【００６２】
ｃ）シャイン−ダルガーノ配列
シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列は、翻訳を開始するのに必要であり、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的である。開始コドンでの翻訳の開始の効率は実際の配列に左右される。大腸菌に適したコンセンサス配列の例として、5’-TAAGGAGG-3’がある。これは、開始コドンの約４〜１４ヌクレオチド上流に位置し、８ヌクレオチドが最適である。二次構造の形成（発現を低減する可能性がある）を防止するために、この領域はＡ／Ｔヌクレオチドが豊富であるのが好ましい。
【００６３】
ｄ）開始コドン
開始コドンは、翻訳が開始される位置である。ＡＴＧは大腸菌で最も多く用いられる開始コドンであり、これに代わり、ＧＴＧを用いることもできる。
【００６４】
ｅ）タグ及び融合タンパク質
比較的短いペプチド（タグ）又は他方のタンパク質（融合パートナー）を有する、発現させようとする組換えタンパク質のＮ又はＣ末端融合物が有利である。これらにより、例えば、発現、溶解度、検出可能性及び精製の改善を達成することができる。このような融合物と、発現及び精製後にタグ又は融合パートナーを除去することができるプロテアーゼ切断配列（例：トロンビン又は第Ｘ因子の場合）との組合せが好ましい。
【００６５】
ｆ）マルチクローニング領域（マルチクローニング部位；ＭＣＳ）により、１以上の核酸配列の挿入が可能及び容易になる。
【００６６】
ｇ）停止コドン／翻訳ターミネーター
考えられる３つの停止コドンのうち、ＴＡＧおよびＴＧＡを用いた場合、翻訳は全く終結していないのにリードスルーが起こりうることから、ＴＡＡが好ましい。信頼できる終結を確実にするため、いくつかの停止コドンの配列を用いてもよい。
【００６７】
ｈ）リポーター遺伝子
リポーター遺伝子は、容易に定量可能なタンパク質をコードし、これらのタンパク質は、固有の色又は酵素活性により、形質転換の効率、発現レベル、並びに発現の部位又は時間を評価することができる。リポーター遺伝子は、例えば、以下のタンパク質をコードする：加水分解酵素、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、グルコシダーゼ又はペルオキシダーゼ。ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、アセチルトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ及びアデニルトランスフェラーゼが好ましい（Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44も参照）。
【００６８】
形質転換微生物の作製には、対応する宿主細胞に、対応するＤＮＡ（例えば、本発明の発現カセット又はベクター）を導入する必要がある。形質転換と呼ばれるこの手順には、多数の方法が利用可能である（Keownら (1990) Methods in Enzymology 185:527-537も参照）。従って、ＤＮＡは、例えば、マイクロインジェクション若しくはエレクトロポレーション、又はＤＮＡをコードする微粒子によるボンバードメント（パーティクルボンバードメントジーンキャノンを用いたパーティクルガン法）により、直接導入することができる。また、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、細胞を化学的に透過性にし、ＤＮＡが拡散により細胞中に進入できるようにすることも可能である。ＤＮＡは、ミニセル、細胞、リソソーム若しくはリポソームのようなその他のＤＮＡ含有単位との融合により実施することもできる。電気的刺激により細胞を可逆的に透過性にするエレクトロポレーションも、ＤＮＡを挿入するのに適したもう１つの方法である。好ましい一般的方法として、リン酸カルシウム媒介形質転換、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質転換、カチオン脂質媒介形質転換、エレクトロポレーション、形質導入及び感染を挙げることができる。これらの方法は、当業者には周知であり、例えば、以下の文献に記載されている：Davisら、(1986) Basic Methods In Molecular Biology；Sambrook Jら、(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel FMら、(1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons；Glover DMら、(1995) DNA Cloning Vol.1, IRL Press ISBN 019-963476-9。
【００６９】
形質転換された細胞、すなわち、挿入されたＤＮＡを含む細胞は、選択マーカーが、挿入ＤＮＡの一部を形成する場合、非形質転換細胞から選択することができる。前記のように様々な選択マーカーがある。
【００７０】
本発明はさらに、少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を含む微生物の調製物に関し、この調製物は、以下のものを含む：
ａ）０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度をもたらす少なくとも１種のアルデヒド、及び
ｂ）総濃度が、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物。
【００７１】
特に好ましい実施形態では、本発明の調製物は上記シアン化物化合物の添加を全く含まない。
【００７２】
本発明はさらに、食料品、飼料、医薬品又はファインケミカルの製造のための、本発明の調製物の使用に関する。「ファインケミカル」とは、好ましくはタンパク質、酵素、ビタミン、アミノ酸、糖、脂肪酸、並びに天然及び合成調味剤、着香剤並びに色素を意味する。
【００７３】
本発明はさらに、本発明の微生物の調製物の１つを用いて、組換えタンパク質、酵素（好ましくは、ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ活性）、あるいは、その他のファインケミカル、例えば、アミド又はカルボン酸（好ましくは、キラルカルボン酸及びアミド）を製造する方法、又はその調製物に関する。
【００７４】
本発明の好ましい部分は、カルボン酸及び／又はアミド（好ましくは、キラルカルボン酸／アミド）を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を有する微生物を培養するステップ、
ｂ）少なくとも１種のアルデヒドを添加するステップであって、総アルデヒド濃度が０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲であるステップ、
ｃ）前記微生物のアルデヒド処理調製物を少なくとも１種のニトリルと接触させ、このニトリルをカルボン酸及び／又はアミドに変換させるステップ
を含む方法に関する。
【００７５】
好ましい実施形態では、微生物の調製物は、アルデヒドの添加と共に、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である濃度で、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物を含む。特に好ましい実施形態では、前記調製物は、シアン化物化合物の添加を一切含まない。さらに好ましい実施形態では、調製物は、アルデヒドの添加（ステップｂ）後、反応ステップｃ）で用いるまで貯蔵することができる。本発明の方法は、バッチ方式又は供給バッチ方式で連続的又は非連続的に実施することができる。この場合、微生物の調製物と、基質としてのラセミニトリルを後に添加してもよい。
【００７６】
反応の実施及び／又は生成物の精製などに関する詳細は、例えば、ＷＯ００／２３５７７号に記載されている。この文献に記載されている出発化合物、生成物、並びに方法に関するパラメーターは、本明細書に参照としてその全体を組み込むものとする。
【００７７】
別の好ましい実施形態では、酵素、特にニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼを安定化、保存及び／又は貯蔵するための他の方法と、前記方法を組み合わせることができる。これらの方法は、限定するものではないが、例えば、以下のステップを含む：
ａ）少なくとも１００ｍＭ、好ましくは３００〜７００ｍＭの濃度で、少なくとも１種の無機塩（好ましくは、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩及び塩酸塩からなる群より選択される）を添加するステップ；
ｂ）ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼ補欠分子族として機能する金属カチオンを有する金属塩（例：塩化コバルト又は硫酸鉄）を添加するステップ；
ｃ）ニトリル（例：ベンゾニトリル、イソブチロニトリル若しくはスクシノニトリル）及び／又はアミド（ｓ−カプロラクタム、イソブチルアミド若しくはプロピオンアミド）を添加するステップ。
【００７８】
別途記載のない限り、クローニング、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の結合、微生物の形質転換、細菌の増殖、並びに組換えＤＮＡ配列の分析をSambrookら、 (1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6）等の一般的な核酸の方法に記載されているように実施した。ＡＢＩレーザー蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて、サンガー（Sanger）法（Sangerら、(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467）により組換えＤＮＡ分子の配列決定を実施した。 発現させようとする構築物におけるポリメラーゼの誤りを防止するために、ポリメラーゼ連鎖反応により得られた断片を配列決定して、確認した。
【実施例１】
【００７９】
ニトリラーゼ活性を有する細胞の作製
大腸菌株（TG10 pDHE1650 pAgro4 pHSG575）を２０ｌの生物反応器で発酵させた。１０ｌの作業容量を含むこの反応器に、振盪器付きフラスコから２００ｍｌの前培養物を接種した。前培養培地は、主要培養培地と一致する。
【００８０】
培地：
４０ｇの９９．５％グリセロール
１５ｇのトリプトン
１３．３ｇのリン酸二水素カリウム
５ｇの酵母エキス
４ｇのリン酸水素二アンモニウム
１．７ｇのクエン酸
１．１ｇの硫酸マグネシウム七水和物
１ｍｌのＳＬ Ｋｏｒｚ １０００Ｃ微量元素溶液
０．１ｍｌのＴｅｇｏ ＫＳ９１１消泡剤
０．０６２ｇの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
１０ｍｇの塩酸チアミン
１ｌになるよう脱イオン水を添加する
培地を１２１℃で３０分滅菌する。次に、０．１ｇのアンピシリンを滅菌条件下で添加する。
【００８１】
微量元素溶液
クエン酸＊Ｈ２０ ２０ｇ
塩化コバルト（ＩＩ）六塩化物 ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ ２．５ｇ
塩化マンガン（ＩＩ）四塩化物 ＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ ３．０ｇ
塩化銅（ＩＩ）二水和物 ＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ ０．３ｇ
ホウ酸 Ｈ３ＢＯ３ ０．６ｇ
モリブデン酸ナトリウム二水和物 Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
酢酸亜鉛脱水和物（dehydrate） Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２＊２Ｈ２Ｏ ２．６ｇ
１ｌになるよう脱イオンＨ２Ｏを添加する
グリセロール供給溶液
２ｌの脱イオン水
２１１ｇの硫酸ナトリウム
１３．６ｇの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
８．８ｋｇの９９．５％グリセロール
２２０ｍｌの微量元素溶液
ラムノース供給溶液
７０３ｇの脱イオン水
２９７ｇのラムノース一水和物
３７℃の温度で発酵を実施する。攪拌器の回転速度を４００〜１５００ｌ／分に調節しながら、ガス抜きを８〜３０ｌ／分に調節することにより、ｐＯ２を２０％以上に維持する。１時間の発酵時間後、ＩＰＴＧ（０．１５ｍＭ）を用いて培養を誘導する。次に、１８．５ｇのラムノース供給溶液を添加する。最初に導入した量のグリセロールが消費されたら、グリセロールを連続的に供給する。４４時間にわたる発酵時間の後、１ｌ当たり５０ｇＤＢＭ及び１ｌ当たり５０〜６０ｋＵの細胞懸濁液を得る。前記細胞を４℃まで冷却する。
【実施例２】
【００８２】
活性試験
５０μｌの細胞懸濁液をピペットで８８０μｌのリン酸ナトリウムカリウムバッファー（１０ｍＭ）へと移し、全体を３０℃で平衡化させる。２０μｌのマンデロニトリルのメタノール溶液（１２％）を添加することにより、反応を開始する。１０分後、５０μｌの１Ｍ ＨＣを添加することにより、酵素反応を停止させる。細胞塊を遠心して分離し、上清中のマンデル酸の濃度をＨＰＬＣ（ODS Hypersil １００＊２．０ｍｍ、移動相：７５％Ｈ３ＰＯ４（１４．８ｍＭ）／２５％メタノール；流速：０．５ｍｌ／分；注入量：２μｌ；カラム温度：４０℃；検出：２１０ｎｍ；マンデル酸滞留時間：０．９分）により測定する。
【実施例３】
【００８３】
ベンズアルデヒドを用いた貯蔵
発酵終了から１４時間後、ＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４で細胞懸濁液のｐＨを６．０、６．６若しくは７．２に調節した後、ベンズアルデヒドで処理した。サンプルを４℃又は２２℃で貯蔵した。発酵終了から０．６日、３．６日及び６．６日後、酵素活性を測定した。
【表１】
【実施例４】
【００８４】
ＣＢＡを用いた貯蔵
発酵終了から１４時間後、ＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４で細胞懸濁液のｐＨを６．０、６．６若しくは７．２に調節した後、２−クロロベンズアルデヒドで処理した。サンプルを４℃又は２２℃で貯蔵した。発酵終了から０．６日、３．６日及び６．６日後、酵素活性を測定した。
【表２】
【実施例５】
【００８５】
長期貯蔵
細胞懸濁液をｐＨ６．６に調節した後、2-クロロベンズアルデヒドを１．３５ｍＭの濃度まで添加してから、細胞懸濁液を４℃で保存した。活性の推移を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】（Ｒ）−マンデル酸の製造のためのニトリラーゼの貯蔵安定性を示す。２０日（ｄ）までの期間にわたり、アルデヒドを添加していない（比較実験）、大腸菌発現ニトリラーゼの３つの独立した調製物の活性（Ａ；初期活性の％で表す）の低下を示す。
【図２】（Ｒ）−マンデル酸の製造のためのニトリラーゼの貯蔵安定性を示す。２−クロロベンズアルデヒドを添加した同様の別の調製物（黒丸）と比較した、２−クロロベンズアルデヒドを添加しない大腸菌発現ニトリラーゼの調製物（白丸）の活性（Ａ；初期活性の％で表す）の低下を示す。この図は、３２日（ｄ）までの期間（ｔ）を示す。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行われる、上記方法。
【請求項２】
細胞により触媒される反応の反応物質で該細胞を処理する前に保存ステップを実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水性媒体が、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物を含み、その総濃度は、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
アルデヒドが、式ＩＩＩ：
【化１】
（式中、Ｒ６は、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル又はＣ２−Ｃ１０−アルケニル、あるいは置換又は非置換のアリール又はヘタリールでありうる）
により表される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アルデヒドが、非置換ベンズアルデヒド及び置換ベンズアルデヒドからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
微生物が、エンテロバクテリア科又はノカルジア科の種から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
微生物が、シュードモナス属、バークホルデリア属、ノカルジア属、アセトバクター属、グルコノバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、シアノバクター属、スタフィロコッカス属、アエロバクター属、アルカリゲネス属、ロドコッカス属並びにペニシリウム属からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法を、酵素を安定化、保存及び／又は貯蔵する別の方法の少なくとも１つと組み合わせるが、該方法が、以下：
ａ）少なくとも１００ｍＭの濃度の少なくとも１種の無機塩を添加する；
ｂ）ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼの補欠分子族として機能する金属カチオンを有する金属塩を添加する；
ｃ）ニトリル及び／又はアミドを添加する
からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物の調製物であって、以下：
ａ）０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度を有する少なくとも１種のアルデヒド、及び
ｂ）総濃度が、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物
を含む、調製物。
【請求項１０】
シアン化物化合物の添加を全く含まない、請求項９に記載の微生物の調製物。
【請求項１１】
食料品、飼料、医薬品又はファインケミカルの製造のための、請求項９又は１０に記載の微生物の調製物の使用。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の微生物の調製物を用いて、組換えタンパク質、酵素若しくはファインケミカルを調製する方法、又はその調製物。
【請求項１３】
カルボン酸及び／又はアミドを製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を培養するステップ、
ｂ）少なくとも１種のアルデヒドを添加するステップであって、総アルデヒド濃度が０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲であるステップ、
ｃ）前記微生物のアルデヒド処理調製物を少なくとも１種のニトリルと接触させ、このニトリルをカルボン酸及び／又はアミドに変換させるステップ
を含む、上記方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行われる、上記方法。
【請求項２】
アルデヒドが、式ＩＩＩ：
【化１】
（式中、Ｒ６は、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル又はＣ２−Ｃ１０−アルケニル、あるいは置換又は非置換のアリール又はヘタリールでありうる）
により表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞により触媒される反応の反応物質で該細胞を処理する前に保存ステップを実施する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
水性媒体が、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物を総アルデヒド濃度の１０モル％以下の総濃度で含む、又は水性媒体が該シアン化物の化合物の添加を全く含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アルデヒドが、非置換ベンズアルデヒド及び置換ベンズアルデヒドからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
微生物が、エンテロバクテリア科又はノカルジア科の種から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
微生物が、シュードモナス属、バークホルデリア属、ノカルジア属、アセトバクター属、グルコノバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、シアノバクター属、スタフィロコッカス属、アエロバクター属、アルカリゲネス属、ロドコッカス属及びペニシリウム属からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法を、酵素を安定化、保存及び／又は貯蔵する別の方法の少なくとも１つと組み合わせるが、該方法が、以下：
（ａ）少なくとも１００ｍＭの濃度の少なくとも１種の無機塩を添加する；
（ｂ）ニトリラーゼの補欠分子族として機能する金属カチオンを有する金属塩を添加する；
（ｃ）ニトリル及び／又はアミドを添加する
からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵するための調製物であって、以下：
（ａ）０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度を有する少なくとも１種のアルデヒド、及び
（ｂ）総濃度が、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物
を含む、調製物。
【請求項１０】
シアン化物化合物の添加を全く含まない、請求項９に記載の微生物の調製物。
【請求項１１】
食料品、飼料、医薬品又はファインケミカルの製造のための、請求項９又は１０に記載の微生物の調製物の使用。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の微生物の調製物を用いて、組換えタンパク質、酵素若しくはファインケミカルを調製する方法、又はその調製物。
【請求項１３】
カルボン酸及び／又はアミドを製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１つのニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を培養するステップ、
（ｂ）総アルデヒド濃度が０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の少なくとも１種のアルデヒドを添加し、ステップ（ｃ）において使用するまで０℃〜２０℃で保存するステップ、
（ｃ）前記微生物のアルデヒド処理調製物を少なくとも１種のニトリルと接触させ、このニトリルをカルボン酸及び／又はアミドに変換させるステップ
を含む、上記方法。
【請求項１】
少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行われる、上記方法。
【請求項２】
細胞により触媒される反応の反応物質で該細胞を処理する前に保存ステップを実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水性媒体が、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物を含み、その総濃度は、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
アルデヒドが、式ＩＩＩ：
【化１】
（式中、Ｒ６は、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル又はＣ２−Ｃ１０−アルケニル、あるいは置換又は非置換のアリール又はヘタリールでありうる）
により表される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アルデヒドが、非置換ベンズアルデヒド及び置換ベンズアルデヒドからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
微生物が、エンテロバクテリア科又はノカルジア科の種から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
微生物が、シュードモナス属、バークホルデリア属、ノカルジア属、アセトバクター属、グルコノバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、シアノバクター属、スタフィロコッカス属、アエロバクター属、アルカリゲネス属、ロドコッカス属並びにペニシリウム属からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法を、酵素を安定化、保存及び／又は貯蔵する別の方法の少なくとも１つと組み合わせるが、該方法が、以下：
ａ）少なくとも１００ｍＭの濃度の少なくとも１種の無機塩を添加する；
ｂ）ニトリラーゼ及び／又はニトリルヒドラターゼの補欠分子族として機能する金属カチオンを有する金属塩を添加する；
ｃ）ニトリル及び／又はアミドを添加する
からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物の調製物であって、以下：
ａ）０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度を有する少なくとも１種のアルデヒド、及び
ｂ）総濃度が、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物
を含む、調製物。
【請求項１０】
シアン化物化合物の添加を全く含まない、請求項９に記載の微生物の調製物。
【請求項１１】
食料品、飼料、医薬品又はファインケミカルの製造のための、請求項９又は１０に記載の微生物の調製物の使用。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の微生物の調製物を用いて、組換えタンパク質、酵素若しくはファインケミカルを調製する方法、又はその調製物。
【請求項１３】
カルボン酸及び／又はアミドを製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）少なくとも１つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を培養するステップ、
ｂ）少なくとも１種のアルデヒドを添加するステップであって、総アルデヒド濃度が０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲であるステップ、
ｃ）前記微生物のアルデヒド処理調製物を少なくとも１種のニトリルと接触させ、このニトリルをカルボン酸及び／又はアミドに変換させるステップ
を含む、上記方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵する方法であって、保存及び／又は貯蔵が、０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも１種のアルデヒドを含む水性媒体中で行われる、上記方法。
【請求項２】
アルデヒドが、式ＩＩＩ：
【化１】
（式中、Ｒ６は、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のＣ１−Ｃ１０−アルキル又はＣ２−Ｃ１０−アルケニル、あるいは置換又は非置換のアリール又はヘタリールでありうる）
により表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞により触媒される反応の反応物質で該細胞を処理する前に保存ステップを実施する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
水性媒体が、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物を総アルデヒド濃度の１０モル％以下の総濃度で含む、又は水性媒体が該シアン化物の化合物の添加を全く含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アルデヒドが、非置換ベンズアルデヒド及び置換ベンズアルデヒドからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
微生物が、エンテロバクテリア科又はノカルジア科の種から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
微生物が、シュードモナス属、バークホルデリア属、ノカルジア属、アセトバクター属、グルコノバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、シアノバクター属、スタフィロコッカス属、アエロバクター属、アルカリゲネス属、ロドコッカス属及びペニシリウム属からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法を、酵素を安定化、保存及び／又は貯蔵する別の方法の少なくとも１つと組み合わせるが、該方法が、以下：
（ａ）少なくとも１００ｍＭの濃度の少なくとも１種の無機塩を添加する；
（ｂ）ニトリラーゼの補欠分子族として機能する金属カチオンを有する金属塩を添加する；
（ｃ）ニトリル及び／又はアミドを添加する
からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び／又は貯蔵するための調製物であって、以下：
（ａ）０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の総アルデヒド濃度を有する少なくとも１種のアルデヒド、及び
（ｂ）総濃度が、総アルデヒド濃度の１０モル％以下である、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物
を含む、調製物。
【請求項１０】
シアン化物化合物の添加を全く含まない、請求項９に記載の微生物の調製物。
【請求項１１】
食料品、飼料、医薬品又はファインケミカルの製造のための、請求項９又は１０に記載の微生物の調製物の使用。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の微生物の調製物を用いて、組換えタンパク質、酵素若しくはファインケミカルを調製する方法、又はその調製物。
【請求項１３】
カルボン酸及び／又はアミドを製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１つのニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を培養するステップ、
（ｂ）総アルデヒド濃度が０．１〜１００ｍＭ／ｌの範囲の少なくとも１種のアルデヒドを添加し、ステップ（ｃ）において使用するまで０℃〜２０℃で保存するステップ、
（ｃ）前記微生物のアルデヒド処理調製物を少なくとも１種のニトリルと接触させ、このニトリルをカルボン酸及び／又はアミドに変換させるステップ
を含む、上記方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５１２９１５（Ｐ２００６−５１２９１５Ａ）
【公表日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６６０３４（Ｐ２００４−５６６０３４）
【出願日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１４８８０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６３３５７
【国際公開日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【出願人】（５９５１２３０６９）ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト (847)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１４８８０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６３３５７
【国際公開日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【出願人】（５９５１２３０６９）ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト (847)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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