ビフェニルジメチルジカルボキシレート及びシリビンを含む経口用マイクロエマルション組成物
【課題】 本発明の目的は活性成分としてビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン又は、シリビン誘導体、又はシリビン及びその誘導体を含むカルドゥスマリアナス（Ｃａｒｄｕｕｓ ｍａｒｉａｎｕｓ）抽出物；共界面活性剤；界面活性剤；及びオイルを含むマイクロエマルション組成物を提供する。
【解決手段】 本発明によるマイクロエマルション組成物は他の何ら副作用又は拮抗作用を誘発することなく互いに異なる作用機能を有する二種の活性成分の補完作用によって肝疾患に対する向上した治療効果を提供し、経口投与された際に前記活性成分二つとも高い生体内生体利用率を示す。
【解決手段】 本発明によるマイクロエマルション組成物は他の何ら副作用又は拮抗作用を誘発することなく互いに異なる作用機能を有する二種の活性成分の補完作用によって肝疾患に対する向上した治療効果を提供し、経口投与された際に前記活性成分二つとも高い生体内生体利用率を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン又はその誘導体を活性成分として含有する、肝疾患を治療するための経口用マイクロエマルション組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シザンドラチネシス（Ｓｈｉｚａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｓｉｓ）から分離した活性成分の一つであるシザンドリンＣ（Ｓｈｉｚａｎｄｒｉｎ Ｃ）の合成誘導体であるビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）はこれが投与された患者の血清グルタミンピルベート転移酵素（ＳＧＰＴ）の濃度を減少させると知られており、従って、ウイルスによる急性／慢性肝炎、慢性肝疾患及び薬物毒性による肝損傷を含む肝疾患の治療に有用である（H.S. Lee, M.D., Y.T. Kim, M.D. et al、慢性活動性肝疾患患者においてビフェニル−ジメチル−ジカルボキシレート（biphenyl-dimethyl-dicarboxylate）を用いた前向的無作為選定研究；血清アラニンアミノ転移酵素（alanine aminotransferase）を低下させる効果、内科学部及び肝研究所、ソウル大学校、医科大学、ソウル、韓国）。
【０００３】
また、カルドゥスマリアナス（Ｃａｒｄｕｕｓ ｍａｒｉａｎｕｓ）抽出物の主成分であるシリビンは喫煙、飲酒、過労、環境汚染、ストレス又は肝−損傷誘発薬物から引き起こされる有害効果から肝細胞を保護し、肝細胞を再生させると知られている。しかし、経口投与されたＢＤＤ又はシリビンの生体利用率は、その水に対する溶解度が非常に低いため十分でない。
【０００４】
肝疾患は多くの他の要因の組み合わせによって引き起こされ、従って、特定作用機作を有する薬物を単独で用いる場合は満足できる治療効果を期待できない。それにもかかわらず、二つ以上の薬物の組み合わせの投与は、前記薬物間の物理的又は化学的相互作用によって誘導される好ましくない副作用又は拮抗作用を引き起こし得る。
【０００５】
従って、全く異なる作用機能を有する二種以上の薬物を含むが、前記薬物の高い生体内生体利用率を示し、何ら有害な副作用も誘発しない肝疾患を治療するための改善された経口投与用組成物の開発が要求されている。
【非特許文献１】H.S. Lee, M.D., Y.T. Kim, M.D. et al、慢性活動性肝疾患患者においてビフェニル−ジメチル−ジカルボキシレート（biphenyl-dimethyl-dicarboxylate）を用いた前向的無作為選定研究；血清アラニンアミノ転移酵素（alanine aminotransferase）を低下させる効果、内科学部及び肝研究所、ソウル大学校、医科大学、ソウル、韓国
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、活性成分としてビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビンを含む経口用マイクロエマルション組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するため、本発明は活性成分としてビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン、シリビン誘導体、又はシリビンとその誘導体を含むカルドゥスマリアナス抽出物；共界面活性剤；界面活性剤；及びオイルを含む、肝疾患治療用経口用マイクロエマルション組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマイクロエマルション組成物は、活性成分としてＢＤＤとシリビン、シリビン誘導体、又はシリビンとその誘導体を含むカルドゥスマリアナス抽出物を安定したマイクロエマルション状態で含み、これらの活性成分のそれぞれを単独で或いは単純混合して経口投与する場合に比べて顕著に向上された肝疾患治療効果及び活性成分の生体内吸収率を示し、肝疾患治療に非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の組成物はビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン、シリビン誘導体、又はシリビンとその誘導体を含むカルドゥスマリアナス抽出物を活性成分として安定したエマルション形態で含み、前記活性成分全部が非常に高い生体内生体利用率を示すことを特徴とする。
【００１０】
以下、本発明のマイクロエマルション組成物の製造に用いられる各成分の特性及び種類を説明する。
【００１１】
（１）活性成分
本発明では、水難溶性（ｗａｔｅｒ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）ビフェニルジメチルジカルボキシレート、及びカルドゥスマリアナス抽出物、又はこれから精製されたシリビン又はその誘導体が活性成分として用いられる。代表的なシリビン誘導体としてはシリクリスチン（ｓｉｌｙｃｒｉｓｔｉｎ）、シリジアニン（ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ）及びイソシリビン（ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ）を含む。商業的に利用可能なカルドゥスマリアナス抽出物は、通常３０重量％以上の量のシリビンを含有する。例えば、ＩＶＡＸ社（チェコ）のカルドゥスマリアナス抽出物は４２重量％のシリビンを含む反面、Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｈｅｎｇｄｉａｎ社（中国）のカルドゥスマリアナス抽出物は３３重量％のシリビンを含む。
【００１２】
（２）共界面活性剤
本発明の組成物は両親媒性、即ち親水性と親油性を共に有する有機溶媒を共界面活性剤として含む。前記共界面活性剤は、水に対する溶解度が非常に低い活性成分を乳化させ、保管する間に前記活性成分が乳化された安定な形態で保持できるようにする。代表的な共界面活性剤の例としては、エタノール、プロピレングリコール（１，２−ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール（好ましくは、分子量２００〜６００）、プロピレンカーボネート（４−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソラン）、トランスキュトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ：ジエチレングリコールモノエチルエーテル）、グリコフロール（ｇｌｙｃｏｆｕｒｏｌ：テトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテル）、ジメチルイソソルビド（１，４：３，６−ジアンヒドロ−２，５−ジメチル−Ｄ−グルシトール）及びこれらの混合物を含み、トランスキュトールが好ましい。
【００１３】
（３）界面活性剤
本発明に用いられる界面活性剤は安定したマイクロエマルションを形成するために共界面活性剤の作用で水中でオイル成分を乳化させる役割をし、薬剤学的に許容可能な陰イオン系、陽イオン系、非イオン系又は両性界面活性剤のいずれか一つであってもよい。
【００１４】
界面活性剤の代表的な例としては次のものを含む：
(i)ポリオキシエチレングリコール化された天然又は水素化植物性オイル、例えばポリオキシエチレングリコール化された天然又は水素化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ，ＢＡＳＦ；及びＨＣＯ，Ｎｉｋｋｏｌ）、
(ii)脂肪酸がモノ−又はトリ−ラウリル、パルミチル、ステアリル又はオレイルであるポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル類（Ｔｗｅｅｎ，ＩＣＩ）、
(iii)ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類、例えばポリオキシエチレンステアリン酸エステル（Ｍｙｒｊ，ＩＣＩ）、
(iv)ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ，ＢＡＳＦ）、
(v)ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ，ＢＡＳＦ）、
(vi)ソジウムジオクチルスルホサクシネート又はソジウムラウリルスルホネート、
(vii)リン脂質類、
(viii)プロピレングリコールモノ−又はジ−脂肪酸エステル類、例えばプロピレングリコールジカプリレート、プロピレングリコールジラウレート、プロピレングリコールイソステアレート、プロピレングリコールラウレート、プロピレングリコールリシノレエート又はプロピレングリコールカプリル酸−カプリン酸ジエステル（Ｍｉｇｌｙｏｌ ８４０，Ｈｕｌｓ）、
(ix)天然植物性オイルトリグリセリドとポリアルキレンポリオールのトランス−エステル化反応生成物（Ｌａｂｒａｆｉｌ Ｍ，Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ）、
(x)モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド、例えばカプリル／カプリン酸モノ−又はジ−グリセリド（Ｉｍｗｉｔｏｒ，Ｈｕｌｓ）、
(xi)ソルビタン脂肪酸エステル類、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート又はソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ，ＩＣＩ）、及び
(xii)ステロール又はその誘導体、例えばコレステロール、ピトステロール又はシトステロール
上記の界面活性剤は単独で又は混合して用いられ得、ポリオキシエチレングリコール化された天然又は水素化植物性オイル、ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル類及びこれらの混合物が好ましい。
【００１５】
（４）オイル
本発明で用いられるオイルは共界面活性剤及び界面活性剤との作用によって、水中で乳化されて安定したマイクロエマルションを形成できる、薬剤学的に許容可能なオイル類の一つであり得る。前記オイルの代表的な例としては次のものを含む：
(i)脂肪酸トリグリセリド類、好ましくは中級脂肪酸トリグリセリド、例えば分別されたココナッツオイル（Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１２Ｎ，Ｈｕｌｓ）、
(ii)モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド類、好ましくはオレイン酸のモノ−又はジ−グリセリド類、
(iii)脂肪酸と一価アルカノールのエステル化合物、好ましくは炭素数８〜２０個の脂肪酸と炭素数２〜３個の一価アルカノールのエステル化合物、例えばイソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、エチルリノレエート及びエチルオレエート、
(iv)天然植物性又は動物性オイル、例えばコーンオイル、オリブ油、大豆油（ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ）及び魚油（ｆｉｓｈ ｏｉｌ）、
(v)炭化水素類、例えばスクアレン又はスクアラン、及び
(vi)遊離脂肪酸類、好ましくは液状のオレイン酸及びリノール酸
上記のオイルは単独で又は他のオイルと共に混合物の形態で用いられ得、中級脂肪酸トリグリセリド、モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド類、脂肪酸と一価アルカノールのエステル化合物及びこれらの混合物が好ましい。
【００１６】
本発明のマイクロエマルション組成物の製造において、ビフェニルジメチルジカルボキシレート、カルドゥスマリアナス抽出物（シリビン又はその誘導体）、共界面活性剤、界面活性剤及びオイルは１：１〜１００（０．３〜３３）：１０〜１５０：５〜１００：１〜５０、好ましくは１：５〜６０（１．７〜２０）：２０〜１００：１０〜８０：５〜２０の重量比に相応する量で用いられ得る。
【００１７】
また、本発明の組成物は経口投与のための薬剤学的に許容可能な添加剤、例えば粘度調節剤、芳香剤、抗酸化剤（例えば、エリトルビン酸及びＤ−α−トコフェロール）又は防腐剤などを含み得る。
【００１８】
本発明の組成物は、前記構成成分を混合して、均質に溶解させて製造でき、水溶性媒質と接触すると平均粒径１μｍ以下の乳化された微細粒子を形成する。
【００１９】
本発明のマイクロエマルション組成物は通常の薬剤学的製造工程によって硬質カプセル又は軟質カプセルに充填して製剤化し得る。
【００２０】
ビフェニルジメチルジカルボキシレート及びカルドゥスマリアナス抽出物の１日投与量はそれぞれ３〜１２０ｍｇ／ｋｇ及び２５〜１７５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは３〜６０ｍｇ／ｋｇ及び２５〜１７５ｍｇ／ｋｇ範囲であってもよく、１回投与又は分割投与で投与され得る。しかし、実質的に投与される活性成分の量は患者個人の治療条件、年齢、性別及び体重と患者症状の深刻性を含む多様な関連要因に照らして決定しなければならず；従って、前記投与量はいずれの方式であれ本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２１】
下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００２２】
［実施例１］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １２０（３６）
ＢＤＤ ３
トランスキュトール ３１５
ＨＣＯ(登録商標)５０ １７０
ツイーン(登録商標)２０ １３０
エリトルビン酸 ８
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ １２
エチルリノリエート ４５
グリセリルモノ−オレエート ２０
Ｄ−α−トコフェロール ７。
【００２３】
ビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びカルドゥスマリアナス抽出物（ＩＶＡＸ社、チェコ、シリビン含量：４２％）をトランスキュトールに均質に溶解させ、さらに他の成分をこれに溶解させてマイクロエマルションの予備濃縮液（ｐｒｅ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を製造した。次いで、この予備濃縮液を大韓薬典（Ｋｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の一般的調剤規定（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｒｕｌｅ）に記載された通常の方法によって軟質カプセル内に充填して製剤化した。前記軟質カプセルはコハク酸、ゼラチン、グリセリン及び純水を用いて通常の方法で製造した。
【００２４】
［実施例２］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） ６０（１８）
ＢＤＤ ３
トランスキュトール ３１５
ＨＣＯ(登録商標)５０ １５０
ツイーン(登録商標)２０ １００
エリトルビン酸 ８
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ １０
エチルリノリエート ３０
グリセリルモノ−オレエート １０
Ｄ−α−トコフェロール ５。
【００２５】
［実施例３］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １７５（５２．５）
ＢＤＤ ３
トランスキュトール ４６０
ＨＣＯ(登録商標)５０ ２４６
ツイーン(登録商標)２０ １８８
エリトルビン酸 １０
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ １７
エチルリノリエート ６５
グリセリルモノ−オレエート ２９
Ｄ−α−トコフェロール １０。
【００２６】
［実施例４］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １７５（５２．５）
ＢＤＤ ２５
トランスキュトール ６００
ＨＣＯ(登録商標)５０ ２２０
ツイーン(登録商標)２０ １１７０
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ ２０
エチルリノリエート ２０
グリセリルモノ−オレエート ５０
Ｄ−α−トコフェロール １０。
【００２７】
［実施例５］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １２０（３６）
ＢＤＤ ３
ジメチルイソソルビド ３１０
ＨＣＯ(登録商標)５０ １６０
ポロキサマー １３０
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ ４０
オレイン酸 ２０
グリセリルモノ−オレエート ５０
Ｄ−α−トコフェロール ６。
【００２８】
［実施例６］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １２０（３６）
ＢＤＤ ７．５
トランスキュトール ３４０
ＨＣＯ(登録商標)５０ １８０
ツイーン(登録商標)２０ １５０
エリトルビン酸 ９
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ １８
エチルリノリエート ６０
グリセリルモノ−オレエート ２０
Ｄ−α−トコフェロール １０。
【００２９】
［試験例１］：四塩化炭素によって損傷された肝に対する治療効果
四塩化炭素（ＣＣｌ４）によって損傷された肝に対する本発明の経口マイクロエマルション組成物の治療効果を下記のように調査した。
【００３０】
３６匹の４〜５週齢の雄性スプラグ−ドウリー系ラットを各群が平均体重２０２±５ｇである６匹のラットからなるように６グループに分けた。前記ラットを温度２３±２℃及び相対湿度５５±５％に設定された実験動物室に適応させた。次いで、コーンオイルに混合された四塩化炭素の５０％（ｖ／ｖ）溶液を５グループの実験群（グループ１〜５）の各ラットに０．７５ｍｌ／ｋｇの量で１週間に２回（月曜日及び金曜日）腹腔内に投与して肝毒性を誘発した。
【００３１】
第１群のラット（陰性対照群）に対しては、四塩化炭素を投与した後、どのような治療薬物も投与しなかった。第２群のラット（陽性対照群）に対しては、四塩化炭素を投与した後に１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）溶液に懸濁されたＢＤＤを２５ｍｇ／ｋｇ ＢＤＤに相応する量で１日１回、１週間に６回経口投与し；第３群のラットには、１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたカルドゥスマリアナス抽出物を１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量（シリビンで５２．５ｍｇ／ｋｇ）で経口投与し；第４群のラットには、１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたＢＤＤ及びカルドゥスマリアナス抽出物の単純混合物を２５ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量で経口投与した。第５群のラットに対しては、３ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量で実施例３で製造された製剤を１日１回、１週間に６回経口投与し；第６群のラット（正常群）は四塩化炭素に露出させず、どのような治療薬物も投与しなかった。
【００３２】
以上の薬物投与を４週間持続した後、ラットを致死させて血清試料を既設定されたスケジュールによって取った。血清中のALT(alanine aminotransferase, GPT)及びAST(aspartate aminotransferase, GOT)濃度を通常の方法によって測定し、その結果をそれぞれ下記表１及び２に示す。
【表１】
【表２】
【００３３】
前記表１及び２から、ＢＤＤ及びシリビンが同時に投与された第４群（ＢＤＤ＋シリビン）及び第５群（実施例３）の場合、四塩化炭素によって誘導されたＡＬＴ及びＡＳＴ濃度の上昇は第２群（ＢＤＤ）又は第３群（シリビン）に比べて２〜３倍程低かった。
【００３４】
特に、前記２種の活性成分をマイクロエマルション状態で含む本発明のマイクロエマルション製剤（第５群）は第５群に投与されたＢＤＤの量が第４群より少ないにもかかわらず、ＢＤＤ及びシリビンの単純混合物が投与された場合に比べてより非常に高い抑制効果を表わした。
【００３５】
本発明のマイクロエマルション製剤は、その二つの含有活性成分が共に高い生体利用率を示すので四塩化炭素−誘導性肝損傷に対して優れた治療効果を有するという事実を上記結果が証明している。
【００３６】
［試験例２］：四塩化炭素−誘導性の肝損傷に対する容量−依存性治療効果
活性成分の含量による経口用マイクロエマルション組成物の治療効果の変化を調査するために、四塩化炭素−誘導性の肝損傷に対する実験を次のように行った。
【００３７】
各々６匹ずつからなるスプラグ−ドウリー系ラット５グループを用いたことを除いては、試験例１と同様な方法で四塩化炭素の投与によってラットに肝毒性を誘発した。
【００３８】
第１群のラット（陰性対照群）に対しては四塩化炭素を投与した後にどのような治療薬物も投与せず；第２群〜第４群のラットには四塩化炭素を投与した後にそれぞれ実施例２、１及び３で製造された製剤を体重１ｋｇ当り１カプセルの容量で１日１回、１週間に６回経口投与した。第５群のラット（正常群）に対しては四塩化炭素も治療薬物も投与しなかった。
【００３９】
４週間の薬物投与後、血清中のＡＬＴ及びＡＳＴ濃度を測定し、その結果をそれぞれ下記表３及び４に示す。
【表３】
【表４】
【００４０】
前記表３及び４に示したように、血清中のＡＬＴ及びＡＳＴ濃度に対する本発明のマイクロエマルション製剤の抑制効果は活性成分であるＢＤＤ及びカルドゥスマリアナス抽出物の量によって変わる。カルドゥスマリアナス抽出物／ＢＤＤの割合（ｗ／ｗ）が４０以上である場合、ＡＬＴ及びＡＳＴ濃度の上昇抑制率には大きな変化はなかった。
【００４１】
［試験例３］：ｄｌ−エチオニン（ｄｌ−ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）−誘導脂肪肝に対する治療効果
本発明による経口用マイクロエマルション組成物の治療効果を調査するために、ｄｌ−エチオニンによって誘導された脂肪肝を回復させる活性を測定するために次のような実験を行った。
【００４２】
試験例１と同様な方法で各群が６匹ずつからなる６グループのラットを用意した。２％（ｗ／ｖ）ｄｌ−エチオニン食塩水溶液を五つの実験グループの各々のラットに２００ｍｇ／ｋｇの量で１週間に２回皮下注射して脂肪肝を誘発した。
【００４３】
第１群のラット（陰性対照群）対してはエチオニン投与後にどのような治療薬物も投与しなかった。第２群のラット（陽性対照群）にはエチオニン投与後に２５ｍｇ／ｋｇのＢＤＤに相応する量で１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたＢＤＤを１日１回、１週間に５回経口投与し；第３群のラットには１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量（シリビンで５２．５ｍｇ／ｋｇ）で１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたカルドゥスマリアナス抽出物を経口投与し；第４群のラットには２５ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量で１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたＢＤＤ及びカルドゥスマリアナス抽出物の単純混合液を経口投与した。第５群のラットにはエチオニン投与後に３ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量で実施例３で製造された製剤を１日１回、１週間に５回経口投与し；第６群のラット（正常群）に対してはエチオニンも治療薬物も投与しなかった。
【００４４】
以上の薬物投与を１週間持続した後、各々のラットを致死させて肝を摘出した。
【００４５】
摘出した肝を生理食塩水で洗浄し、４倍体積のリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．５）に浸してテフロン（登録商標）−ガラス（ｔｅｆｌｏｎｅ（登録商標）−ｇｌａｓｓ）ホモジナイザーを用いて均質化させた。均質化した肝を６００×ｇで１０分間遠心分離して上澄液を回収し、これをさらに１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上澄液のみを回収した後、さらに１０，０００×ｇで１時間遠心分離して得た上澄液を分離した。
【００４６】
その後、通常の方法によって前記分離上澄液を用いてそれぞれの肝試料の総コレステロール及びトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）濃度を測定し、その結果を下記表５及び６に示す。
【表５】
【表６】
【００４７】
前記表５及び６に記載されたように、ＢＤＤ及びシリビンが共に投与された第４群（ＢＤＤ＋シリビン）及び第５群（実施例３）の場合、脂肪肝でコレステロール及びトリグリセリド濃度における上昇に対する抑制効果が第２群（ＢＤＤ）又は第３群（シリビン）の場合より遥かに高い。
【００４８】
特に、前記２種の活性成分を含む本発明のマイクロエマルション製剤（第５群）は第５群に投与されたＢＤＤの量が第４群より少ないにもかかわらず、ＢＤＤとシリビンとの単純混合物（第４群）より遥かに高い抑制効果を示した。
【００４９】
このような結果は本発明のマイクロエマルション製剤がその含有活性成分全ての向上した生体利用率に起因し、ｄｌ−エチオニン−誘導性脂肪肝に対して遥かに優れた治療効果を達成することを証明するものである。
【００５０】
［試験例４］：ｄｌ−エチオニン−誘導性脂肪肝に対する容量−依存性治療効果
活性成分の容量別に経口用マイクロエマルション組成物の治療効果における変化を調査するために、ｄｌ−エチオニン−誘導性脂肪肝に対する実験を次のように行った。
【００５１】
各々６匹ずつからなるスプラグ−ドウリー系ラット５グループを用いたことを除いては、試験例３と同様な方法でｄｌ−エチオニン投与によってラットに肝毒性を誘発した。
【００５２】
第１群のラット（陰性対照群）に対してはエチオニン投与後にどのような治療薬物も投与せず；第２群〜第４群のラットには四塩化炭素を投与した後にそれぞれ実施例２、１及び３で製造された製剤を体重１ｋｇ当り１カプセルの容量で１日１回、１週間に６回経口投与した。第５群のラット（正常群）にはエチオニンも治療薬物も投与しなかった。
【００５３】
１週間の薬物投与後、血清中の総コレステロール及びトリグリセリド濃度を測定し、その結果をそれぞれ下記表７及び８に示す。
【表７】
【表８】
【００５４】
前記表７及び８から、血清中のコレステロール及びトリグリセリド濃度に対する本発明のマイクロエマルション製剤の抑制効果は、活性成分であるＢＤＤ及びカルドゥスマリアナス抽出物の量によって変わる。カルドゥスマリアナス抽出物／ＢＤＤの割合（ｗ／ｗ）が４０以上の場合は、コレステロール及びトリグリセリド濃度の上昇抑制率に大きな変化はなかった。
【００５５】
［試験例５］：急性毒性試験
ＢＤＤとシリビンの両方とも含む経口投与された製剤の急性毒性を平均体重２０〜２５ｇのＩＣＲ系マウスを用いて下記のように調査した。
【００５６】
下記表９に示すような多様な重量比でＢＤＤ及びシリビンを混合して試験薬剤を製造し、それぞれを０．１、０．２、０．５、１及び２ｇ／ｋｇの量で１０匹のラットからなる群に経口投与した。投与してから１週間後に、死亡したマウス数を数えて致死率を測定し、その結果を表９に示す。
【表９】
【００５７】
前記表９に表わされたように、ＢＤＤとシリビンの両方とも含む製剤の２ｇ／ｋｇの量はどのような致死毒性反応も表わさなかった。従って、本発明の組成物は毒性がなくて安全であることを確認した。
【００５８】
［試験例６］：吸収率試験
本発明による経口用製剤の活性成分の生体利用率を調査するために、実施例４で製造された製剤（実験群）を２５ｍｇのＢＤＤと１７５ｍｇのカルドゥスマリアナス抽出物と単純混合して製造した製剤（比較群）を用いて生体内吸収率の比較試験を次のように行った。
【００５９】
１０匹の１４−〜１５−週齢の雄性スプラグ−ドウリー系ラット（体重約２５０ｇ）を４日以上適応させながら飼料と水を自由に摂取するようにした。次いで、これらのラットを４８時間絶食させた後に試験に用い、絶食間に水は自由に摂取するようにした。
【００６０】
前記レットを五匹のラットからなる二つのグループに分け、２５ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで５８ｍｇ／ｋｇ）に相応する量で実験群及び比較群製剤のそれぞれを経口投与した。血液試料を投与前及び投与後に０．５時間、１時間、１．５時間、４時間、８時間及び２４時間経過した時に採血し、これから血漿試料を得た。
【００６１】
血漿ＢＤＤ濃度の分析は次のように行った。
【００６２】
血漿１００μｌにメタノール２００μｌを添加し、その混合物を振盪した。前記混合物を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を取った後、０．２２μｍろ過紙でろ過し、下記条件下でＬＣ−ＭＳを用いて分析した。
【００６３】
カラム：Waters MS C18(2.1×150mm with guard column)
移動相：５０％メタノール
注入容量：１０μｌ
流速：０．２ｍｌ／分
検出器：SIR mode m/z:441.2(Na adduct)。
【００６４】
前記結果を下記表１０に示す。
【表１０】
【００６５】
一方、血漿シリビン濃度の分析は次のように行った。
【００６６】
内部標準溶液５０μｌ（２．０μｇ／ｍｌのナリンゲニンを含むメタノール溶液）、０．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）９００μｌ、及び酵素溶液（β−グルクロニダーゼ１３．４８単位／スルファターゼ４．５単位の０．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０））１００μｌをそれぞれの血漿試料５００μｌに添加して５分間混合した後、この混合物を３７℃で４時間反応させた。次いで、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．５）１．５ｍｌを添加して１０分間振盪した後、これにエーテル５ｍｌを添加し１５分間振盪して抽出液を得た。前記抽出液を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を分離し、この上澄液４．２ｍｌを３０℃窒素気流下で蒸発濃縮した。得た残留物にメタノールと１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム（sodium dihydrogen phosphate）の混合液（５０：５０）２５０μｌを添加して溶解させた後、下記条件下で高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００６７】
カラム：イナルトシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）ＯＤＳ２（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）
移動相：メタノール：１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム＝５０：５０（ｖ：ｖ、リン酸でｐＨ３．０に調整）
注入量：５０μｌ
流速：１．０ｍｌ／分
検出器：２８５ｎｍ。
【００６８】
前記結果を下記表１１に示す。
【表１１】
【００６９】
前記表１０及び１１に示すように、本発明の製剤で観察されるＢＤＤ及びシリビンは比較群製剤のそれより各々１５倍及び１０倍以上という遥かに高い生体利用率を示した。
【００７０】
本発明を前記具体的な実施例と関連して記述しましたが、添付された特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内で当分野の熟練者が本発明を多様に変形及び変化させ得ることを理解しなければならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明はビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン又はその誘導体を活性成分として含有する、肝疾患を治療するための経口用マイクロエマルション組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シザンドラチネシス（Ｓｈｉｚａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｓｉｓ）から分離した活性成分の一つであるシザンドリンＣ（Ｓｈｉｚａｎｄｒｉｎ Ｃ）の合成誘導体であるビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）はこれが投与された患者の血清グルタミンピルベート転移酵素（ＳＧＰＴ）の濃度を減少させると知られており、従って、ウイルスによる急性／慢性肝炎、慢性肝疾患及び薬物毒性による肝損傷を含む肝疾患の治療に有用である（H.S. Lee, M.D., Y.T. Kim, M.D. et al、慢性活動性肝疾患患者においてビフェニル−ジメチル−ジカルボキシレート（biphenyl-dimethyl-dicarboxylate）を用いた前向的無作為選定研究；血清アラニンアミノ転移酵素（alanine aminotransferase）を低下させる効果、内科学部及び肝研究所、ソウル大学校、医科大学、ソウル、韓国）。
【０００３】
また、カルドゥスマリアナス（Ｃａｒｄｕｕｓ ｍａｒｉａｎｕｓ）抽出物の主成分であるシリビンは喫煙、飲酒、過労、環境汚染、ストレス又は肝−損傷誘発薬物から引き起こされる有害効果から肝細胞を保護し、肝細胞を再生させると知られている。しかし、経口投与されたＢＤＤ又はシリビンの生体利用率は、その水に対する溶解度が非常に低いため十分でない。
【０００４】
肝疾患は多くの他の要因の組み合わせによって引き起こされ、従って、特定作用機作を有する薬物を単独で用いる場合は満足できる治療効果を期待できない。それにもかかわらず、二つ以上の薬物の組み合わせの投与は、前記薬物間の物理的又は化学的相互作用によって誘導される好ましくない副作用又は拮抗作用を引き起こし得る。
【０００５】
従って、全く異なる作用機能を有する二種以上の薬物を含むが、前記薬物の高い生体内生体利用率を示し、何ら有害な副作用も誘発しない肝疾患を治療するための改善された経口投与用組成物の開発が要求されている。
【非特許文献１】H.S. Lee, M.D., Y.T. Kim, M.D. et al、慢性活動性肝疾患患者においてビフェニル−ジメチル−ジカルボキシレート（biphenyl-dimethyl-dicarboxylate）を用いた前向的無作為選定研究；血清アラニンアミノ転移酵素（alanine aminotransferase）を低下させる効果、内科学部及び肝研究所、ソウル大学校、医科大学、ソウル、韓国
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、活性成分としてビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビンを含む経口用マイクロエマルション組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するため、本発明は活性成分としてビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン、シリビン誘導体、又はシリビンとその誘導体を含むカルドゥスマリアナス抽出物；共界面活性剤；界面活性剤；及びオイルを含む、肝疾患治療用経口用マイクロエマルション組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマイクロエマルション組成物は、活性成分としてＢＤＤとシリビン、シリビン誘導体、又はシリビンとその誘導体を含むカルドゥスマリアナス抽出物を安定したマイクロエマルション状態で含み、これらの活性成分のそれぞれを単独で或いは単純混合して経口投与する場合に比べて顕著に向上された肝疾患治療効果及び活性成分の生体内吸収率を示し、肝疾患治療に非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の組成物はビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン、シリビン誘導体、又はシリビンとその誘導体を含むカルドゥスマリアナス抽出物を活性成分として安定したエマルション形態で含み、前記活性成分全部が非常に高い生体内生体利用率を示すことを特徴とする。
【００１０】
以下、本発明のマイクロエマルション組成物の製造に用いられる各成分の特性及び種類を説明する。
【００１１】
（１）活性成分
本発明では、水難溶性（ｗａｔｅｒ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）ビフェニルジメチルジカルボキシレート、及びカルドゥスマリアナス抽出物、又はこれから精製されたシリビン又はその誘導体が活性成分として用いられる。代表的なシリビン誘導体としてはシリクリスチン（ｓｉｌｙｃｒｉｓｔｉｎ）、シリジアニン（ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ）及びイソシリビン（ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ）を含む。商業的に利用可能なカルドゥスマリアナス抽出物は、通常３０重量％以上の量のシリビンを含有する。例えば、ＩＶＡＸ社（チェコ）のカルドゥスマリアナス抽出物は４２重量％のシリビンを含む反面、Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｈｅｎｇｄｉａｎ社（中国）のカルドゥスマリアナス抽出物は３３重量％のシリビンを含む。
【００１２】
（２）共界面活性剤
本発明の組成物は両親媒性、即ち親水性と親油性を共に有する有機溶媒を共界面活性剤として含む。前記共界面活性剤は、水に対する溶解度が非常に低い活性成分を乳化させ、保管する間に前記活性成分が乳化された安定な形態で保持できるようにする。代表的な共界面活性剤の例としては、エタノール、プロピレングリコール（１，２−ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール（好ましくは、分子量２００〜６００）、プロピレンカーボネート（４−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソラン）、トランスキュトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ：ジエチレングリコールモノエチルエーテル）、グリコフロール（ｇｌｙｃｏｆｕｒｏｌ：テトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテル）、ジメチルイソソルビド（１，４：３，６−ジアンヒドロ−２，５−ジメチル−Ｄ−グルシトール）及びこれらの混合物を含み、トランスキュトールが好ましい。
【００１３】
（３）界面活性剤
本発明に用いられる界面活性剤は安定したマイクロエマルションを形成するために共界面活性剤の作用で水中でオイル成分を乳化させる役割をし、薬剤学的に許容可能な陰イオン系、陽イオン系、非イオン系又は両性界面活性剤のいずれか一つであってもよい。
【００１４】
界面活性剤の代表的な例としては次のものを含む：
(i)ポリオキシエチレングリコール化された天然又は水素化植物性オイル、例えばポリオキシエチレングリコール化された天然又は水素化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ，ＢＡＳＦ；及びＨＣＯ，Ｎｉｋｋｏｌ）、
(ii)脂肪酸がモノ−又はトリ−ラウリル、パルミチル、ステアリル又はオレイルであるポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル類（Ｔｗｅｅｎ，ＩＣＩ）、
(iii)ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類、例えばポリオキシエチレンステアリン酸エステル（Ｍｙｒｊ，ＩＣＩ）、
(iv)ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ，ＢＡＳＦ）、
(v)ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ，ＢＡＳＦ）、
(vi)ソジウムジオクチルスルホサクシネート又はソジウムラウリルスルホネート、
(vii)リン脂質類、
(viii)プロピレングリコールモノ−又はジ−脂肪酸エステル類、例えばプロピレングリコールジカプリレート、プロピレングリコールジラウレート、プロピレングリコールイソステアレート、プロピレングリコールラウレート、プロピレングリコールリシノレエート又はプロピレングリコールカプリル酸−カプリン酸ジエステル（Ｍｉｇｌｙｏｌ ８４０，Ｈｕｌｓ）、
(ix)天然植物性オイルトリグリセリドとポリアルキレンポリオールのトランス−エステル化反応生成物（Ｌａｂｒａｆｉｌ Ｍ，Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ）、
(x)モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド、例えばカプリル／カプリン酸モノ−又はジ−グリセリド（Ｉｍｗｉｔｏｒ，Ｈｕｌｓ）、
(xi)ソルビタン脂肪酸エステル類、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート又はソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ，ＩＣＩ）、及び
(xii)ステロール又はその誘導体、例えばコレステロール、ピトステロール又はシトステロール
上記の界面活性剤は単独で又は混合して用いられ得、ポリオキシエチレングリコール化された天然又は水素化植物性オイル、ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル類及びこれらの混合物が好ましい。
【００１５】
（４）オイル
本発明で用いられるオイルは共界面活性剤及び界面活性剤との作用によって、水中で乳化されて安定したマイクロエマルションを形成できる、薬剤学的に許容可能なオイル類の一つであり得る。前記オイルの代表的な例としては次のものを含む：
(i)脂肪酸トリグリセリド類、好ましくは中級脂肪酸トリグリセリド、例えば分別されたココナッツオイル（Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１２Ｎ，Ｈｕｌｓ）、
(ii)モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド類、好ましくはオレイン酸のモノ−又はジ−グリセリド類、
(iii)脂肪酸と一価アルカノールのエステル化合物、好ましくは炭素数８〜２０個の脂肪酸と炭素数２〜３個の一価アルカノールのエステル化合物、例えばイソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、エチルリノレエート及びエチルオレエート、
(iv)天然植物性又は動物性オイル、例えばコーンオイル、オリブ油、大豆油（ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ）及び魚油（ｆｉｓｈ ｏｉｌ）、
(v)炭化水素類、例えばスクアレン又はスクアラン、及び
(vi)遊離脂肪酸類、好ましくは液状のオレイン酸及びリノール酸
上記のオイルは単独で又は他のオイルと共に混合物の形態で用いられ得、中級脂肪酸トリグリセリド、モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド類、脂肪酸と一価アルカノールのエステル化合物及びこれらの混合物が好ましい。
【００１６】
本発明のマイクロエマルション組成物の製造において、ビフェニルジメチルジカルボキシレート、カルドゥスマリアナス抽出物（シリビン又はその誘導体）、共界面活性剤、界面活性剤及びオイルは１：１〜１００（０．３〜３３）：１０〜１５０：５〜１００：１〜５０、好ましくは１：５〜６０（１．７〜２０）：２０〜１００：１０〜８０：５〜２０の重量比に相応する量で用いられ得る。
【００１７】
また、本発明の組成物は経口投与のための薬剤学的に許容可能な添加剤、例えば粘度調節剤、芳香剤、抗酸化剤（例えば、エリトルビン酸及びＤ−α−トコフェロール）又は防腐剤などを含み得る。
【００１８】
本発明の組成物は、前記構成成分を混合して、均質に溶解させて製造でき、水溶性媒質と接触すると平均粒径１μｍ以下の乳化された微細粒子を形成する。
【００１９】
本発明のマイクロエマルション組成物は通常の薬剤学的製造工程によって硬質カプセル又は軟質カプセルに充填して製剤化し得る。
【００２０】
ビフェニルジメチルジカルボキシレート及びカルドゥスマリアナス抽出物の１日投与量はそれぞれ３〜１２０ｍｇ／ｋｇ及び２５〜１７５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは３〜６０ｍｇ／ｋｇ及び２５〜１７５ｍｇ／ｋｇ範囲であってもよく、１回投与又は分割投与で投与され得る。しかし、実質的に投与される活性成分の量は患者個人の治療条件、年齢、性別及び体重と患者症状の深刻性を含む多様な関連要因に照らして決定しなければならず；従って、前記投与量はいずれの方式であれ本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２１】
下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００２２】
［実施例１］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １２０（３６）
ＢＤＤ ３
トランスキュトール ３１５
ＨＣＯ(登録商標)５０ １７０
ツイーン(登録商標)２０ １３０
エリトルビン酸 ８
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ １２
エチルリノリエート ４５
グリセリルモノ−オレエート ２０
Ｄ−α−トコフェロール ７。
【００２３】
ビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びカルドゥスマリアナス抽出物（ＩＶＡＸ社、チェコ、シリビン含量：４２％）をトランスキュトールに均質に溶解させ、さらに他の成分をこれに溶解させてマイクロエマルションの予備濃縮液（ｐｒｅ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を製造した。次いで、この予備濃縮液を大韓薬典（Ｋｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の一般的調剤規定（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｒｕｌｅ）に記載された通常の方法によって軟質カプセル内に充填して製剤化した。前記軟質カプセルはコハク酸、ゼラチン、グリセリン及び純水を用いて通常の方法で製造した。
【００２４】
［実施例２］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） ６０（１８）
ＢＤＤ ３
トランスキュトール ３１５
ＨＣＯ(登録商標)５０ １５０
ツイーン(登録商標)２０ １００
エリトルビン酸 ８
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ １０
エチルリノリエート ３０
グリセリルモノ−オレエート １０
Ｄ−α−トコフェロール ５。
【００２５】
［実施例３］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １７５（５２．５）
ＢＤＤ ３
トランスキュトール ４６０
ＨＣＯ(登録商標)５０ ２４６
ツイーン(登録商標)２０ １８８
エリトルビン酸 １０
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ １７
エチルリノリエート ６５
グリセリルモノ−オレエート ２９
Ｄ−α−トコフェロール １０。
【００２６】
［実施例４］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １７５（５２．５）
ＢＤＤ ２５
トランスキュトール ６００
ＨＣＯ(登録商標)５０ ２２０
ツイーン(登録商標)２０ １１７０
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ ２０
エチルリノリエート ２０
グリセリルモノ−オレエート ５０
Ｄ−α−トコフェロール １０。
【００２７】
［実施例５］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １２０（３６）
ＢＤＤ ３
ジメチルイソソルビド ３１０
ＨＣＯ(登録商標)５０ １６０
ポロキサマー １３０
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ ４０
オレイン酸 ２０
グリセリルモノ−オレエート ５０
Ｄ−α−トコフェロール ６。
【００２８】
［実施例６］：マイクロエマルション組成物を含む軟質カプセルの製造
下記成分を用いて実施例１と同様な方法で軟質カプセルを製造した：
量（ｍｇ／カプセル）
カルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで） １２０（３６）
ＢＤＤ ７．５
トランスキュトール ３４０
ＨＣＯ(登録商標)５０ １８０
ツイーン(登録商標)２０ １５０
エリトルビン酸 ９
ミグリオール(登録商標)８１２Ｎ １８
エチルリノリエート ６０
グリセリルモノ−オレエート ２０
Ｄ−α−トコフェロール １０。
【００２９】
［試験例１］：四塩化炭素によって損傷された肝に対する治療効果
四塩化炭素（ＣＣｌ４）によって損傷された肝に対する本発明の経口マイクロエマルション組成物の治療効果を下記のように調査した。
【００３０】
３６匹の４〜５週齢の雄性スプラグ−ドウリー系ラットを各群が平均体重２０２±５ｇである６匹のラットからなるように６グループに分けた。前記ラットを温度２３±２℃及び相対湿度５５±５％に設定された実験動物室に適応させた。次いで、コーンオイルに混合された四塩化炭素の５０％（ｖ／ｖ）溶液を５グループの実験群（グループ１〜５）の各ラットに０．７５ｍｌ／ｋｇの量で１週間に２回（月曜日及び金曜日）腹腔内に投与して肝毒性を誘発した。
【００３１】
第１群のラット（陰性対照群）に対しては、四塩化炭素を投与した後、どのような治療薬物も投与しなかった。第２群のラット（陽性対照群）に対しては、四塩化炭素を投与した後に１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）溶液に懸濁されたＢＤＤを２５ｍｇ／ｋｇ ＢＤＤに相応する量で１日１回、１週間に６回経口投与し；第３群のラットには、１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたカルドゥスマリアナス抽出物を１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量（シリビンで５２．５ｍｇ／ｋｇ）で経口投与し；第４群のラットには、１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたＢＤＤ及びカルドゥスマリアナス抽出物の単純混合物を２５ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量で経口投与した。第５群のラットに対しては、３ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量で実施例３で製造された製剤を１日１回、１週間に６回経口投与し；第６群のラット（正常群）は四塩化炭素に露出させず、どのような治療薬物も投与しなかった。
【００３２】
以上の薬物投与を４週間持続した後、ラットを致死させて血清試料を既設定されたスケジュールによって取った。血清中のALT(alanine aminotransferase, GPT)及びAST(aspartate aminotransferase, GOT)濃度を通常の方法によって測定し、その結果をそれぞれ下記表１及び２に示す。
【表１】
【表２】
【００３３】
前記表１及び２から、ＢＤＤ及びシリビンが同時に投与された第４群（ＢＤＤ＋シリビン）及び第５群（実施例３）の場合、四塩化炭素によって誘導されたＡＬＴ及びＡＳＴ濃度の上昇は第２群（ＢＤＤ）又は第３群（シリビン）に比べて２〜３倍程低かった。
【００３４】
特に、前記２種の活性成分をマイクロエマルション状態で含む本発明のマイクロエマルション製剤（第５群）は第５群に投与されたＢＤＤの量が第４群より少ないにもかかわらず、ＢＤＤ及びシリビンの単純混合物が投与された場合に比べてより非常に高い抑制効果を表わした。
【００３５】
本発明のマイクロエマルション製剤は、その二つの含有活性成分が共に高い生体利用率を示すので四塩化炭素−誘導性肝損傷に対して優れた治療効果を有するという事実を上記結果が証明している。
【００３６】
［試験例２］：四塩化炭素−誘導性の肝損傷に対する容量−依存性治療効果
活性成分の含量による経口用マイクロエマルション組成物の治療効果の変化を調査するために、四塩化炭素−誘導性の肝損傷に対する実験を次のように行った。
【００３７】
各々６匹ずつからなるスプラグ−ドウリー系ラット５グループを用いたことを除いては、試験例１と同様な方法で四塩化炭素の投与によってラットに肝毒性を誘発した。
【００３８】
第１群のラット（陰性対照群）に対しては四塩化炭素を投与した後にどのような治療薬物も投与せず；第２群〜第４群のラットには四塩化炭素を投与した後にそれぞれ実施例２、１及び３で製造された製剤を体重１ｋｇ当り１カプセルの容量で１日１回、１週間に６回経口投与した。第５群のラット（正常群）に対しては四塩化炭素も治療薬物も投与しなかった。
【００３９】
４週間の薬物投与後、血清中のＡＬＴ及びＡＳＴ濃度を測定し、その結果をそれぞれ下記表３及び４に示す。
【表３】
【表４】
【００４０】
前記表３及び４に示したように、血清中のＡＬＴ及びＡＳＴ濃度に対する本発明のマイクロエマルション製剤の抑制効果は活性成分であるＢＤＤ及びカルドゥスマリアナス抽出物の量によって変わる。カルドゥスマリアナス抽出物／ＢＤＤの割合（ｗ／ｗ）が４０以上である場合、ＡＬＴ及びＡＳＴ濃度の上昇抑制率には大きな変化はなかった。
【００４１】
［試験例３］：ｄｌ−エチオニン（ｄｌ−ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）−誘導脂肪肝に対する治療効果
本発明による経口用マイクロエマルション組成物の治療効果を調査するために、ｄｌ−エチオニンによって誘導された脂肪肝を回復させる活性を測定するために次のような実験を行った。
【００４２】
試験例１と同様な方法で各群が６匹ずつからなる６グループのラットを用意した。２％（ｗ／ｖ）ｄｌ−エチオニン食塩水溶液を五つの実験グループの各々のラットに２００ｍｇ／ｋｇの量で１週間に２回皮下注射して脂肪肝を誘発した。
【００４３】
第１群のラット（陰性対照群）対してはエチオニン投与後にどのような治療薬物も投与しなかった。第２群のラット（陽性対照群）にはエチオニン投与後に２５ｍｇ／ｋｇのＢＤＤに相応する量で１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたＢＤＤを１日１回、１週間に５回経口投与し；第３群のラットには１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量（シリビンで５２．５ｍｇ／ｋｇ）で１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたカルドゥスマリアナス抽出物を経口投与し；第４群のラットには２５ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量で１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液に懸濁されたＢＤＤ及びカルドゥスマリアナス抽出物の単純混合液を経口投与した。第５群のラットにはエチオニン投与後に３ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物に相応する量で実施例３で製造された製剤を１日１回、１週間に５回経口投与し；第６群のラット（正常群）に対してはエチオニンも治療薬物も投与しなかった。
【００４４】
以上の薬物投与を１週間持続した後、各々のラットを致死させて肝を摘出した。
【００４５】
摘出した肝を生理食塩水で洗浄し、４倍体積のリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．５）に浸してテフロン（登録商標）−ガラス（ｔｅｆｌｏｎｅ（登録商標）−ｇｌａｓｓ）ホモジナイザーを用いて均質化させた。均質化した肝を６００×ｇで１０分間遠心分離して上澄液を回収し、これをさらに１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上澄液のみを回収した後、さらに１０，０００×ｇで１時間遠心分離して得た上澄液を分離した。
【００４６】
その後、通常の方法によって前記分離上澄液を用いてそれぞれの肝試料の総コレステロール及びトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）濃度を測定し、その結果を下記表５及び６に示す。
【表５】
【表６】
【００４７】
前記表５及び６に記載されたように、ＢＤＤ及びシリビンが共に投与された第４群（ＢＤＤ＋シリビン）及び第５群（実施例３）の場合、脂肪肝でコレステロール及びトリグリセリド濃度における上昇に対する抑制効果が第２群（ＢＤＤ）又は第３群（シリビン）の場合より遥かに高い。
【００４８】
特に、前記２種の活性成分を含む本発明のマイクロエマルション製剤（第５群）は第５群に投与されたＢＤＤの量が第４群より少ないにもかかわらず、ＢＤＤとシリビンとの単純混合物（第４群）より遥かに高い抑制効果を示した。
【００４９】
このような結果は本発明のマイクロエマルション製剤がその含有活性成分全ての向上した生体利用率に起因し、ｄｌ−エチオニン−誘導性脂肪肝に対して遥かに優れた治療効果を達成することを証明するものである。
【００５０】
［試験例４］：ｄｌ−エチオニン−誘導性脂肪肝に対する容量−依存性治療効果
活性成分の容量別に経口用マイクロエマルション組成物の治療効果における変化を調査するために、ｄｌ−エチオニン−誘導性脂肪肝に対する実験を次のように行った。
【００５１】
各々６匹ずつからなるスプラグ−ドウリー系ラット５グループを用いたことを除いては、試験例３と同様な方法でｄｌ−エチオニン投与によってラットに肝毒性を誘発した。
【００５２】
第１群のラット（陰性対照群）に対してはエチオニン投与後にどのような治療薬物も投与せず；第２群〜第４群のラットには四塩化炭素を投与した後にそれぞれ実施例２、１及び３で製造された製剤を体重１ｋｇ当り１カプセルの容量で１日１回、１週間に６回経口投与した。第５群のラット（正常群）にはエチオニンも治療薬物も投与しなかった。
【００５３】
１週間の薬物投与後、血清中の総コレステロール及びトリグリセリド濃度を測定し、その結果をそれぞれ下記表７及び８に示す。
【表７】
【表８】
【００５４】
前記表７及び８から、血清中のコレステロール及びトリグリセリド濃度に対する本発明のマイクロエマルション製剤の抑制効果は、活性成分であるＢＤＤ及びカルドゥスマリアナス抽出物の量によって変わる。カルドゥスマリアナス抽出物／ＢＤＤの割合（ｗ／ｗ）が４０以上の場合は、コレステロール及びトリグリセリド濃度の上昇抑制率に大きな変化はなかった。
【００５５】
［試験例５］：急性毒性試験
ＢＤＤとシリビンの両方とも含む経口投与された製剤の急性毒性を平均体重２０〜２５ｇのＩＣＲ系マウスを用いて下記のように調査した。
【００５６】
下記表９に示すような多様な重量比でＢＤＤ及びシリビンを混合して試験薬剤を製造し、それぞれを０．１、０．２、０．５、１及び２ｇ／ｋｇの量で１０匹のラットからなる群に経口投与した。投与してから１週間後に、死亡したマウス数を数えて致死率を測定し、その結果を表９に示す。
【表９】
【００５７】
前記表９に表わされたように、ＢＤＤとシリビンの両方とも含む製剤の２ｇ／ｋｇの量はどのような致死毒性反応も表わさなかった。従って、本発明の組成物は毒性がなくて安全であることを確認した。
【００５８】
［試験例６］：吸収率試験
本発明による経口用製剤の活性成分の生体利用率を調査するために、実施例４で製造された製剤（実験群）を２５ｍｇのＢＤＤと１７５ｍｇのカルドゥスマリアナス抽出物と単純混合して製造した製剤（比較群）を用いて生体内吸収率の比較試験を次のように行った。
【００５９】
１０匹の１４−〜１５−週齢の雄性スプラグ−ドウリー系ラット（体重約２５０ｇ）を４日以上適応させながら飼料と水を自由に摂取するようにした。次いで、これらのラットを４８時間絶食させた後に試験に用い、絶食間に水は自由に摂取するようにした。
【００６０】
前記レットを五匹のラットからなる二つのグループに分け、２５ｍｇ／ｋｇのＢＤＤ及び１７５ｍｇ／ｋｇのカルドゥスマリアナス抽出物（シリビンで５８ｍｇ／ｋｇ）に相応する量で実験群及び比較群製剤のそれぞれを経口投与した。血液試料を投与前及び投与後に０．５時間、１時間、１．５時間、４時間、８時間及び２４時間経過した時に採血し、これから血漿試料を得た。
【００６１】
血漿ＢＤＤ濃度の分析は次のように行った。
【００６２】
血漿１００μｌにメタノール２００μｌを添加し、その混合物を振盪した。前記混合物を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を取った後、０．２２μｍろ過紙でろ過し、下記条件下でＬＣ−ＭＳを用いて分析した。
【００６３】
カラム：Waters MS C18(2.1×150mm with guard column)
移動相：５０％メタノール
注入容量：１０μｌ
流速：０．２ｍｌ／分
検出器：SIR mode m/z:441.2(Na adduct)。
【００６４】
前記結果を下記表１０に示す。
【表１０】
【００６５】
一方、血漿シリビン濃度の分析は次のように行った。
【００６６】
内部標準溶液５０μｌ（２．０μｇ／ｍｌのナリンゲニンを含むメタノール溶液）、０．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）９００μｌ、及び酵素溶液（β−グルクロニダーゼ１３．４８単位／スルファターゼ４．５単位の０．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０））１００μｌをそれぞれの血漿試料５００μｌに添加して５分間混合した後、この混合物を３７℃で４時間反応させた。次いで、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．５）１．５ｍｌを添加して１０分間振盪した後、これにエーテル５ｍｌを添加し１５分間振盪して抽出液を得た。前記抽出液を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を分離し、この上澄液４．２ｍｌを３０℃窒素気流下で蒸発濃縮した。得た残留物にメタノールと１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム（sodium dihydrogen phosphate）の混合液（５０：５０）２５０μｌを添加して溶解させた後、下記条件下で高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００６７】
カラム：イナルトシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）ＯＤＳ２（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）
移動相：メタノール：１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム＝５０：５０（ｖ：ｖ、リン酸でｐＨ３．０に調整）
注入量：５０μｌ
流速：１．０ｍｌ／分
検出器：２８５ｎｍ。
【００６８】
前記結果を下記表１１に示す。
【表１１】
【００６９】
前記表１０及び１１に示すように、本発明の製剤で観察されるＢＤＤ及びシリビンは比較群製剤のそれより各々１５倍及び１０倍以上という遥かに高い生体利用率を示した。
【００７０】
本発明を前記具体的な実施例と関連して記述しましたが、添付された特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内で当分野の熟練者が本発明を多様に変形及び変化させ得ることを理解しなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としてビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン、シリビン誘導体、又はシリビン及びその誘導体を含むカルドゥスマリアナス（Ｃａｒｄｕｕｓ ｍａｒｉａｎｕｓ）抽出物；共界面活性剤；界面活性剤；及びオイルを含む、肝疾患治療のための経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項２】
前記シリビン誘導体がシリクリスチン（ｓｉｌｙｃｒｉｓｔｉｎ）、シリジアニン（ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ）又はイソシリビン（ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ）であることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項３】
前記ビフェニルジメチルジカルボキシレート：カルドゥスマリアナス抽出物：共界面活性剤：界面活性剤：オイルの重量比が１：１〜１００：１０〜１５０：５〜１００：１〜５０であることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項４】
前記ビフェニルジメチルジカルボキシレート：シリビン又はシリビン誘導体：共界面活性剤：界面活性剤：オイルの重量比が１：０．３〜３３：１０〜１５０：５〜１００：１〜５０であることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項５】
前記共界面活性剤がエタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレンカーボネート、トランスキュトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、グリコフロール（ｇｌｙｃｏｆｕｒｏｌ）、ジメチルイソソルビド及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項６】
前記共界面活性剤がトランスキュトールであることを特徴とする請求項５に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール化された天然又は水素化植物性オイル類、ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体類；ソジウムジオクチルスルホサクシネート；ソジウムラウリルスルフェート；リン脂質類；プロピレングリコールモノ−又はジ−脂肪酸エステル類；天然植物性オイルトリグリセリド類とポリアルキレンポリオール類のトランス−エステル化反応生成物；モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル類、ステロール類又はその誘導体；及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項８】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール化された天然又は水素化植物性オイル類、ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル類及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項９】
前記オイルが中級脂肪酸トリグリセリド類；モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド類；脂肪酸の一価アルカノールエステル類；天然植物性又は動物性オイル類；スクアレン；スクアラン；オレイン酸；リノール酸；及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項１０】
前記オイルが中級脂肪酸トリグリセリド類、モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド類、脂肪酸と一価アルカノールのエステル化合物及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項１１】
水溶性媒質と接触する際に１μｍ以下の平均粒径を有する微細粒子を形成することを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項１】
活性成分としてビフェニルジメチルジカルボキシレート（ＢＤＤ）及びシリビン、シリビン誘導体、又はシリビン及びその誘導体を含むカルドゥスマリアナス（Ｃａｒｄｕｕｓ ｍａｒｉａｎｕｓ）抽出物；共界面活性剤；界面活性剤；及びオイルを含む、肝疾患治療のための経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項２】
前記シリビン誘導体がシリクリスチン（ｓｉｌｙｃｒｉｓｔｉｎ）、シリジアニン（ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ）又はイソシリビン（ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ）であることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項３】
前記ビフェニルジメチルジカルボキシレート：カルドゥスマリアナス抽出物：共界面活性剤：界面活性剤：オイルの重量比が１：１〜１００：１０〜１５０：５〜１００：１〜５０であることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項４】
前記ビフェニルジメチルジカルボキシレート：シリビン又はシリビン誘導体：共界面活性剤：界面活性剤：オイルの重量比が１：０．３〜３３：１０〜１５０：５〜１００：１〜５０であることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項５】
前記共界面活性剤がエタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレンカーボネート、トランスキュトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、グリコフロール（ｇｌｙｃｏｆｕｒｏｌ）、ジメチルイソソルビド及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項６】
前記共界面活性剤がトランスキュトールであることを特徴とする請求項５に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール化された天然又は水素化植物性オイル類、ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体類；ソジウムジオクチルスルホサクシネート；ソジウムラウリルスルフェート；リン脂質類；プロピレングリコールモノ−又はジ−脂肪酸エステル類；天然植物性オイルトリグリセリド類とポリアルキレンポリオール類のトランス−エステル化反応生成物；モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル類、ステロール類又はその誘導体；及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項８】
前記界面活性剤がポリエチレングリコール化された天然又は水素化植物性オイル類、ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル類及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項９】
前記オイルが中級脂肪酸トリグリセリド類；モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド類；脂肪酸の一価アルカノールエステル類；天然植物性又は動物性オイル類；スクアレン；スクアラン；オレイン酸；リノール酸；及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項１０】
前記オイルが中級脂肪酸トリグリセリド類、モノ−、ジ−又はモノ／ジ−グリセリド類、脂肪酸と一価アルカノールのエステル化合物及びこれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【請求項１１】
水溶性媒質と接触する際に１μｍ以下の平均粒径を有する微細粒子を形成することを特徴とする請求項１に記載の経口用マイクロエマルション組成物。
【公表番号】特表２００７−５０９１３６（Ｐ２００７−５０９１３６Ａ）
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３６４５１（Ｐ２００６−５３６４５１）
【出願日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２６９８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３７２４９
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（５９９１３９５３４）ハンミ ファーム． シーオー．， エルティーディー． (56)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２６９８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３７２４９
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（５９９１３９５３４）ハンミ ファーム． シーオー．， エルティーディー． (56)
【Ｆターム（参考）】
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