ピリドカルバゾール型化合物及びその適用
本発明は、薬物としての以下の一般式（Ｉ）：
に対応するピリドカルバゾール型化合物の使用、より具体的には抗がん化学療法におけるそれらの適用に関する。本発明の別の主題は、特定の式（Ｉ）の化合物、及び本発明の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物でもある。最終的には本発明は、神経変性型の病変、例えばアルツハイマー病及び統合失調症の予防及び／又は治療を目的とした薬物の調製のための、寄生虫病、例えばマラリアの予防及び／又は治療を目的とした薬物の調製のための、又は緑内障の予防及び／又は治療を目的とした薬物の調製のための式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
に対応するピリドカルバゾール型化合物の使用、より具体的には抗がん化学療法におけるそれらの適用に関する。本発明の別の主題は、特定の式（Ｉ）の化合物、及び本発明の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物でもある。最終的には本発明は、神経変性型の病変、例えばアルツハイマー病及び統合失調症の予防及び／又は治療を目的とした薬物の調製のための、寄生虫病、例えばマラリアの予防及び／又は治療を目的とした薬物の調製のための、又は緑内障の予防及び／又は治療を目的とした薬物の調製のための式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物としてのピリドカルバゾール型化合物の使用、より具体的には抗がん化学療法における、及びまた他のタイプの疾患（精神疾患、ウイルス疾患、寄生虫疾患又は真菌疾患）の治療のためのその適用に関する。これらの化合物が式（Ｉ）に対応し、その構造原型（archetype）をエリプチシンのものと比較することができる。本発明は特定の式（Ｉ）の化合物、及び式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
紡錘体は長い間、細胞分裂において重要な役割を果たすため、抗がん化学療法における重要な標的として特定されてきた。微小管の機能障害は細胞の生存に対して劇的な影響を有し、細胞周期の停止を引き起こし、さらには場合によって細胞アポトーシスを誘導する可能性がある。
【０００３】
微小管はアクチンマイクロフィラメント及び中間径フィラメントと共に、真核細胞の細胞骨格を形成する。これらは単一の二量体タンパク質、すなわちチューブリンで構成される中空の管状凝集体である。哺乳動物細胞では、微小管ネットワークは通例、微小管形成中心（中心体）で核を形成する。これらのネットワークは細胞質の組織化、オルガネラの配置、細胞の運動性及び細胞分裂等の複合的でかつ極めて重要な役割を果たす。有糸分裂中、微小管ネットワークは再組織化され、２つの娘細胞へと切断する前に、重複染色体を２つの同一のセットに分離するために細胞で利用される機構である紡錘体を形成する。紡錘体の完全性は特定のチェックポイントで制御される。任意の検出されない紡錘体の機能障害がゲノム不安定性の発端である場合があり、このため潜在的な腫瘍形成原因を表す（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
微小管はチューブリンのα−二量体、β−二量体の重合により集合化する。微小管は遊離チューブリン二量体から迅速に重合すると共に、同じように迅速に脱重合することが可能である極めて動的な重合体である。微小管の動態は有糸分裂に極めて重要である（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００５】
微小管の動的挙動ネットワークは細胞において強く制御される。このネットワークは細胞型に応じて、いわゆる微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）のファミリーである、ＳＴＯＰタンパク質、タウタンパク質、スルビビン、スタスミン／Ｏｐ１８、Ｔｏｇ、並びに微小管脱重合キネシン、ＭＣＡＫ及びＫｉｆ２Ａを含む、微小管安定化タンパク質と微小管不安定化タンパク質の間の活性のバランスにより調節される。さらに、微小管伸長端（growing tips）と幾つかのタンパク質、例えばＣＬＩＰ １７０との相互作用により、微小管が安定化する。これらの見かけ上無関係なタンパク質は全て、微小管格子に沿って又は微小管末端でチューブリン二量体と結合していることが共通している。これらのタンパク質とチューブリンとの結合は、リン酸化／脱リン酸化プロセスにより、又はチューブリン翻訳後修飾、例えばチューブリンチロシン化サイクル（図１）により強く調節される（例えば非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。この翻訳後修飾は、特徴付けられていないチューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）によるα−チューブリン鎖のカルボキシ末端のチロシン残基の環状（cyclic）除去、及びチューブリンチロシンリガーゼ（ＴＴＬ）による同じ位置でのチロシン残基の再付加を伴う。最近になって、チューブリンのチロシン化が微小管プラス端トラッキングタンパク質、例えばＣＬＩＰ−１７０のＣＡＰ−Ｇｌｙとの微小管相互作用を調節することが分かってきた（非特許文献８）。
【０００６】
チューブリンのチロシン化反応を触媒する酵素であるＴＴＬは、チロシンを可溶性の脱チロシン化チューブリンに付加するが、一度チューブリンが微小管へと集合化すると、チューブリンとは効率的に反応しない。ＴＣＰについては、主に未だに均一になるまで精製できていないという理由で、あまり知られていない。間接的な証拠により、ＴＣＰが重合基質を選択すると考えられ、微小管との結合がその機能に必要とされ得ることが示される。ＴＣＰは微小管に対してゆっくりと作用するが、ＴＴＬは微小管から放出されると迅速にＧｌｕ−チューブリンを再充填させる（図１）（非特許文献７）。
【０００７】
ＴＴＬの基質特異性及びＴＴＬとＴＣＰとの動態の違いの結果として、チロシン化チューブリン（Ｔｙｒ−チューブリン）は動的微小管の主成分であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの周期細胞における優勢のチューブリン変異体である一方で、Ｇｌｕ−チューブリンは長期安定な微小管のマーカーである（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。細胞型によっては、これらの脱チロシン化微小管が検出されず、又は小さい細胞亜集団を示す。微小管がエフェクタータンパク質又は薬剤、例えばパクリタキセルにより安定化する場合、脱チロシン化微小管が集積する（非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００８】
ビンカ・アルカロイド系抗がん剤であるビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン、並びにタキサン系抗がん剤であるパクリタキセル及びドセタキセルを含む臨床的に重要な幾つかの抗がん剤が、チューブリンを特異的に標的とし、微小管の動態を変更させる。これらの抗がん剤の臨床的成果を考慮すると、チューブリンはこれまでに同定された最も有効性が高いがん標的の１つである。
【０００９】
さらにがんに加えて、例えば精神障害（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）及び神経変性疾患（非特許文献１８、非特許文献１９）、並びにウイルス感染（非特許文献２０）、細菌感染（非特許文献２１）及び寄生虫感染（非特許文献２２）等の多くの疾患の病因における微小管細胞骨格の関与が説明されている。そのため微小管の細胞骨格及びその様々なエフェクターを標的とする薬理学的作用物質は多くの疾患の治療に関して治療上の利点を示し得る（非特許文献２３）。
【００１０】
このため、抗がん化学療法に用いられる治療は好ましくは、微小管の動的挙動を標的としている。特に、微小管の動的挙動はチューブリンの異なる部位と結合することができる多くの作用物質により妨げられ得る。現在ではチューブリン上でのこれらの様々な作用物質の結合に関する構造データが取得されている。パクリタキセルで安定化させたチューブリンプロトフィラメントの亜鉛誘導シートをパクリタキセルが結合したチューブリンモデルの構築に使用している。このモデルを電子密度微小管図に適合させた後、著者らはパクリタキセルが微小管腔に面するβ−チューブリンと結合すると結論付けた（非特許文献２４）。タンパク質スタスミンと複合体を形成してチューブリンと結合したビンブラスチンのＸ線構造により、ビンブラスチンが２つのチューブリン分子の接点に楔を導入し、それによりチューブリンアセンブリに干渉することが分かっている（非特許文献２５）。
【００１１】
これらの研究によりこれまで、チューブリンに対する微小管毒の３つの結合部位が特徴付けられている：２つのα／β−チューブリン二量体間の接点に位置するニチニチソウのアルカロイドのドメイン、βサブユニット上に位置するタキソイド部位、及びαサブユニットとβサブユニットとの間の接点に位置するコルヒチン部位。
【００１２】
微小管を不安定化又は安定化させるかに従って、これらの様々な作用物質を分類する。
微小管を不安定化させる作用物質：
ニチニチソウアルカロイド（微小管を脱重合することのできる）を、異常な紡錘体により有糸分裂の際に細胞を停止させることのできる作用物質として特定している。続いて１９６０年代に、ビンクリスチン及びビンブラスチンが臨床薬に導入され、未だに精巣がん、ホジキン病又は急性リンパ性白血病の化学療法に広く用いられている。
【００１３】
微小管の重合を阻害するコルヒチン又はコンブレタスタチン、及びまたノコダゾールも言及され得る。
微小管を安定化させる作用物質：
タキサン、より具体的にはパクリタキセルがチューブリン１モル当たり約１モルのタキサンの化学量論で微小管と特異的かつ可逆的に相互作用する。この相互作用は微小管の安定化を伴い、そのため冷温（４℃）又はＣａ２＋イオンの存在によりｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導される脱重合に耐性になる。
【００１４】
パクリタキセル及び他のタキサンは、主に微小管で発揮される安定化効果により他の抗チューブリン毒とは区別される。パクリタキセル又はビンカ・アルカロイド等の抗がん剤はこれまでは反対の機構を介して働くと考えられてきた。現在ではこれらは微小管の全体量を増減させるのではなく微小管の動態を変更することにより作用することが知られている。特に乳がん、卵巣がん及び肺がんにおけるそれらの抗腫瘍有効性にかかわらず、増殖の際に非癌性細胞（造血細胞、粘液細胞等）の微小管にも作用するため、タキサンは極めて毒性が高い。最後にこれらは末梢ニューロンに悪影響を与え、重大な副作用を引き起こす可能性がある。
【００１５】
エポチロン及びディスコデルモリド等の微小管を安定化させる特性を示す他の天然産物の抗腫瘍特性に関してヒトの臨床試験において現在研究されている。
【００１６】
パクリタキセルの治療成果により、チューブリンを標的とする治療剤への探求に対する優位性が維持されている。これらの作用物質の臨床的成果を考慮すると、チューブリンは現在、抗がん化学療法における最も有効な標的の一つである（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８）。
【００１７】
しかしながら従来技術で知られている物質のほとんどは有益ではあるものの、理想的なものではない。それらには幾つかの副作用、主に骨髄抑制及び末梢神経毒性がある。チューブリン薬に関連する神経毒性の副作用は、チューブリンが細胞分裂だけでなく有糸分裂と独立した細胞骨格機能においても重要な因子であるので驚くべきことではない。さらに多くのがんがこれらの薬剤に本質的に耐性であるか、又は長期治療中に耐性になる。これは薬剤排出ポンプとして機能するＰ−糖タンパク質、又は他の薬剤排出ポンプ（例えば乳がん耐性タンパク質（ＢＣＲＰ））の過剰発現により引き起こされる多剤耐性の結果であることが多い。他の耐性原因としては、特定の薬剤があまり効果的に結合しないチューブリンアイソタイプの発現の増大、及びこれにより結合が低減される翻訳後修飾又は突然変異によるチューブリン構造の変化が挙げられる。
【００１８】
潜在的により効果的であり、かつ毒性の低い薬剤の開発のために幾つかの戦略が提案されている。その一つは既存の薬剤を改良すること又はチューブリンを標的とする新たな薬剤を見つけることである。
【００１９】
別のアプローチは、分裂細胞でのみ発現し、また阻害により有糸分裂が停止する他のタンパク質、例えば（such）有糸分裂チェックポイントタンパク質を標的とすることにある。様々なタンパク質ファミリーの成員（キナーゼ及びキネシン）が現在研究中である。これらのタンパク質の多くが、別々の段階の有糸分裂で非常に特殊化し、かつ特異的な機能を有すると考えられるため、これらのタンパク質の阻害により、チューブリンを標的とする既存の抗有糸分裂療法に比べて治療指数の改善が潜在的に可能であったと推測された。しかしながら、副作用が潜在的に低いという、新規の抗チューブリン剤の代わりに、紡錘体機能の特定の阻害因子の探求することの基礎をなす論拠は弱くなっている。一方で、有糸分裂における特異的な作用が知られているＡｕｒｏｒａ Ａ等のキナーゼが中間期の微小管骨格に対する効果を示すことが近年分かってきている。他方でこのことから、微小管毒の抗腫瘍効果の幾つかがチューブリン細胞骨格との中間期の相互作用にも起因し得る（非特許文献２９、非特許文献３０）。
【００２０】
チューブリン（又は微小管）を直接標的とする、又は微小管の動態を調節することができるタンパク質を標的とする微小管の動態を破壊する作用物質（非特許文献３１、非特許文献３２）の探求は依然として癌腫学における重要な問題となっている。
【００２１】
驚くべきことに出願人は、本発明による式（Ｉ）の化合物が従来技術で知られている化合物と比較して幾つかの利点を有することを見出している：
これらの化合物がＧｌｕ−チューブリンを生成すると共に、ノコダゾールにより誘導される脱重合に対する微小管ネットワークの耐性を誘導することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、これらの化合物はチューブリンとは直接作用しない。そのためこれらの化合物は微小管を安定化させるが、チューブリンと結合することができる他の既知の微小管を安定化させる化合物、例えばタキサン又はエポチロンとは異なる作用機序を有する。
これらの化合物は従来技術で知られている化合物よりも著しく毒性が低く、従来技術の化合物で観察される高い耐性の場合であっても活性である。
さらにこれらの化合物はアクチン細胞骨格に対する効果がある。アクチン細胞骨格は再組織化され、ラトランクリンにより誘導される脱重合に或る程度耐性となる。細胞の運動性が阻害される。このようにして細胞の運動性を阻害することにより、これらの化合物は腫瘍の遠隔播種を低減することができ、このためさらなる抗転移特性を有する。
このためこれらの化合物は、特に例えば他の治療（タキサン）に対する耐性の出現が観察される場合に、有益な代替治療を構成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Castillo et al., 2007
【非特許文献２】Kops et al., 2005
【非特許文献３】Jordan and Wilson, 2004
【非特許文献４】Niethammer et al., 2007
【非特許文献５】Barra et al., 1998
【非特許文献６】Lafanechere and Job, 2000
【非特許文献７】MacRae, 1997
【非特許文献８】Peris et al., 2006
【非特許文献９】Peris et al., 2009
【非特許文献１０】Gundersen et al., 1984
【非特許文献１１】Gundersen et al., 1987
【非特許文献１２】Wheland and Weber 1987
【非特許文献１３】Fonrose et al., 2007
【非特許文献１４】Vassal et al., 2006
【非特許文献１５】Andrieux et al., 2006
【非特許文献１６】Andrieux et al., 2002
【非特許文献１７】Begou et al., 2008
【非特許文献１８】Dermaut et al., 2005
【非特許文献１９】Garcia et Cleveland, 2001
【非特許文献２０】Ruthel et al., 2005
【非特許文献２１】Margalit et al., 2004
【非特許文献２２】Morrissette and Sibley, 2002
【非特許文献２３】Lafanechere, 2008
【非特許文献２４】Snyder et al., 2001
【非特許文献２５】Gigant et al., 2005
【非特許文献２６】Giannakakou et al., 2000
【非特許文献２７】Jackson et al., 2007
【非特許文献２８】Zhou and Giannakakou, 2005
【非特許文献２９】Pan and Snell, 2007
【非特許文献３０】Pugacheva et al., 2007
【非特許文献３１】Bhat and Setaluri, 2007
【非特許文献３２】Muller et al., 2007
【発明の概要】
【００２３】
したがって本発明の主題の一つは薬物としての式（Ｉ）の化合物である。
【００２４】
このため本発明の第１の主題は、以下の式（Ｉ）：
【００２５】
【化１】
【００２６】
（式中、
Ｒ１は水素原子、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個〜４個の炭素原子を有するアミノアルキル基、又はモノアルキルアミノアルキル基若しくはジアルキルアミノアルキル基（該２つのアルキル基が１個〜４個の炭素原子を有する）を表し、
Ｒ２は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒ３は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
−ＯＲ４はヒドロキシル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基若しくは式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚのアルコキシ基、若しくは１個〜４個の炭素原子を有するエステル基若しくは式−ＯＣ（Ｏ）Ｚのエステル基を表し、ここで
Ｚは３個〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基、又はフェニル基、ベンジル基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジル基及びオキサゾリル基から選択されるアリール基（該アリール基はハロゲン原子、−ＯＨ基、−ＮＯ２基又は−ＮＨ２基、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基及び１個〜４個の炭素原子を有するモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基から選択される、同一の又は異なる１つ、２つ又は３つの置換基によりオルト位、メタ位又はパラ位で必要に応じて置換されていてもよい）であり、
ｎは１〜４の範囲の、好ましくは１に等しい整数であり、又は
−ＯＲ４基は式：
【００２７】
【化２】
【００２８】
に対応し、ここで
ＶはＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＮ−アルキルから選択され、該アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有し、
ｎ’は２又は３に等しく、
Ｒ５は水素原子又はジアルキルアミノメチル基（ここで該アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有する）を表し、
Ｒ６は二重結合によりＤ環と結合した酸素原子、ハロゲン原子、又は１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ７は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒ８は水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、式
【００２９】
【化３】
【００３０】
のアルキルカルボキシアルキレン基、若しくは式
【００３１】
【化４】
【００３２】
のジアルキルホスフェートアルキレン基（ここで該アルキル基及び該アルキレン基が１個〜４個の炭素原子を有する）、又は１個〜４個の炭素原子を有するエステル基を表し、Ｒ６が二重結合によりＤ環と結合した酸素原子である場合にのみＲ８が存在する）に対応する薬物としての四環系化合物及びそれらの薬学的に許容される塩に関する。
【００３３】
上で規定された式（Ｉ）の化合物の幾つかは既に中間生成物として従来技術で説明されているが、これまでに薬物としては説明されていない（J.C.S. Perkin I, 1979, 7, 1706-1711、Tetrahedron, 1993, 49(4), 2915-2938、J. Med. Chem., 1983, 26, 181-185、特許出願（欧州特許第０ ３１７ ４１６号及び欧州特許第０ ０１０ ０２９号））。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物は以下の構造により表すことができる。
【００３５】
【化５】
【００３６】
本発明の式（Ｉ）の化合物は塩形態であってもよい。この場合、塩酸、臭化水素酸、マレイン酸又はメタンスルホン酸の塩が好ましい。
【００３７】
上記化合物の有益な用途のうち、がんの治療、転移の治療、及び他のタイプの疾患（例えば精神疾患、ウイルス疾患、寄生虫疾患又は真菌疾患）の治療に言及することができる。
【００３８】
驚くべきことに、上で規定された式（Ｉ）の化合物は、細胞に浸透すると共に、微小管及びマイクロフィラメントを安定化させることができ、それによりＧｌｕ−チューブリンの形成、微小管の動的挙動の減速、アクチンマイクロフィラメントの再組織化及び安定化（ラトランクリン誘導性の脱重合に対する幾らかの耐性により示される）が引き起こされる。これらの化合物は、タキサン若しくはエポチロン等の他の既知の微小管を安定化させる化合物、又はジャスプラキノリド等のアクチンフィラメントを安定化させる既知の化合物とは異なる作用機序を有する。
【００３９】
より具体的には、本発明による化合物は細胞の運動性の阻害と結び付いたアクチンフィラメントの再組織化を誘導し、本発明者らはこれより、ＬＩＭＫ１が式（Ｉ）の化合物の標的であり得ることを見出した。
【００４０】
本発明による化合物の構造原型は、オクロシア・エリプティカ（Ochrosia elliptica）から単離された精製アルカロイドであるエリプチシンのものと同様であり、以下の式に対応する。
【００４１】
【化６】
【００４２】
エリプチシン及びエリプチシン誘導体は或る特定のがんにおける抗がん活性及び細胞毒性に関して知られており（Dodion et al., 1982、Hayat et al., 1974、Juret et al., 1980、Le Mee et al., 1998、Paoletti et al., 1980、Tura et al., 1984）、それらの作用機序は主に、ＤＮＡ挿入、トポイソメラーゼＩＩ阻害、及びＰ４５０シトクロム及びペルオキシダーゼによるＤＮＡを有する共有結合付加体の形成の特性に応じて変わる。本発明による化合物とは異なり、エリプチシンは細胞微小管の安定化にも、アクチンマイクロフィラメントの安定化にも全く効果を有しない。
【００４３】
多くのエリプチシンの誘導体又は類似体が説明されている：
ＰＣＴ国際出願（国際公開第２００７／１３５５３８号）は、転移がん又は従来の細胞毒性を有する化学療法では治療することができないがんの治療のためのエリプチシン（ellipticium）誘導体（９−ヒドロキシエリプチシン）の使用を記載している。記載の化合物は、細胞の運動性の低減及び細胞接着性の回復を伴う、腫瘍細胞におけるアクチンの細胞骨格の再構築を誘導する。
【００４４】
欧州出願（欧州特許第０ ２０９ ５１１号）は、式：
【００４５】
【化７】
【００４６】
（式中、−Ａｌｋは低級アルキレン基を表し、−Ａｍはジ（低級アルキル）アミノ基を表す）の２−アミノアルキル−９−ヒドロキシエリプチシニウム誘導体の塩化物塩酸塩を記載しており、これらの化合物は抗腫瘍作用を有する医薬組成物における有効成分として使用することが可能である。
【００４７】
仏国出願（仏国特許第２ ８５９ ４７４号）は、細胞中でプレメッセンジャーＲＮＡをスプライシングするプロセスに関連する疾患を治療するため、より具体的にはプレメッセンジャーＲＮＡのスプライシングが変更された遺伝子疾患、例えば広範なスプライシングプロセスに作用する或る特定のがん（乳がん、結腸がん及び或る特定のリンパ腫）を治療するために使用することができる薬物の調製のためのインドール由来の化合物及びこのような化合物の使用を記載している。
【００４８】
これらの様々な文献に記載されている化合物とは構造が異なる本発明による化合物は驚くべきことに、微小管を安定化させる特性を有し、またアクチンネットワークを再組織化する特性も有し、或る程度までアクチンネットワークを安定化させると共に、主にＬＩＭＫ１阻害因子として作用する。
【００４９】
ＬＩＭＫ１（ＬＩＭキナーゼ１）はアクチン脱重合因子であるコフィリンをリン酸化させることによりアクチン重合を調節し、ＬＩＭＫ１はタンパク質ｐ２５をリン酸化させることにより微小管解離及び微小管（ＭＴ）不安定化の調節にも関与する。このためＬＩＭＫ１は微小管解離とアクチン重合との両方を連動させる（Gorovoy et al., 2005、Acevedo et al., 2007）。
【００５０】
そのためより正確には、ＬＩＭドメイン及びＰＤＺドメインを含有するセリン／トレオニンキナーゼであるＬＩＭＫ１は、セリン３上でコフィリンをリン酸化し、アクチン切断活性を不活性化することによりアクチン細胞骨格の調節において中心的な役割を果たす（Arber et al., 1998、Yang et al., 1998）。アクチン細胞骨格の重要性を考慮すると、ＬＩＭＫ１は多くの生物学的プロセス、具体的には細胞の形態及び運動性の調節において中心的な役割を果たす。
【００５１】
腫瘍細胞の転移表現型への進行中に、接触阻害の喪失から始まり、運動性が増大し、腫瘍細胞が原発腫瘍部位から移動し、遠隔臓器に浸潤して、血管新生を誘導し、転移を引き起こすという一連の変化が起こる（Yoshioka et al., 2003）。
【００５２】
腫瘍細胞が転移性になると、浸潤が促進するように、アクチン細胞骨格、細胞の形状及び運動性を制御する正常な機構が破壊される可能性がある。コフィリンのリン酸化におけるＬＩＭＫ１の役割を考慮すると、ＬＩＭＫ１は腫瘍の浸潤及び転移において中心的でかつ重要な役割を果たす。リン酸化コフィリンと非リン酸化コフィリンとの間のバランスにより腫瘍細胞の転移能が決定されることが提案されている。実際、リン酸化コフィリンの増大が観察された場合、ＬＩＭＫ１は悪性のメラノーマ細胞、乳がん腫瘍、前立腺腫瘍及び腫瘍細胞株で過剰発現することが分かっている（Scott and Olson, 2007、Wang et al., 2007）。
【００５３】
このため本発明による化合物は様々ながん株（株及び化合物に応じて１μＭ〜６０μＭ程度のＩＣ５０）、具体的に抗がん化学療法に用いられる薬剤（タキサン、ビンカ・アルカロイド、アントラサイクリン（antracyclines）等）に対する耐性機構を発達させた株に対する毒性がある。
【００５４】
したがって本発明による化合物は、特に現行の化学療法に耐性があるがんに、及び転移において有用である、新規の抗がん剤群を示す。
【００５５】
ＬＩＭＫ１阻害因子として作用する本発明の化合物はＬＩＭＫ１が関与する他の病態、例えば神経変性疾患（Bernard, 2007、Heredia et al., 2006）、原発性肺高血圧症（Scott and Olson, 2007）及び緑内障にも使用することができる。
【００５６】
有益には、Ｒ１基は水素原子である。しかしながらＲ１基は、式−（ＣＨ２）ｎ’’ＮＲ’Ｒ’’
（式中、
Ｒ’及びＲ’’（同一の又は異なる）は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
ｎ’’は１〜４と様々である）のジアルキルアミノアルキル基でもあり得る。
【００５７】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物はＲ２基が水素原子又はメチル基、より好ましくはさらにはメチル基である構造に対応する。
【００５８】
Ｒ３基に関しては、メチル基であるのが好ましい。
【００５９】
−ＯＲ４基は有利には、−ＯＨ基又はメトキシ基であり得る。
【００６０】
−ＯＲ４基が式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚのアルコキシ基又は式−ＯＣ（Ｏ）Ｚのエステル基である場合、該−ＯＲ４基は式−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５のベンジルエーテル基又は式−ＯＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５のエステル基であるのが好ましく、該基は−ＮＯ２基、−ＮＨ２基、−Ｎ（ＣＨ３）２基、−ＣＮ基、−ＣＨ２ＮＨ２基又は−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２基から選択される置換基によりオルト位、メタ位又はパラ位で任意に置換していてもよい。
【００６１】
−ＯＲ４基は上で規定されたような式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚのアルコキシ基及び式−ＯＣ（Ｏ）Ｚのエステルであるのが最も好ましい。
【００６２】
Ｒ５基は有利には、水素原子、又はＲ５基がジアルキルアミノアルキル基である場合、ジメチルアミノメチルであり得る。
【００６３】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物のＲ８基は水素原子である。
【００６４】
Ｒ６基は好ましくは二重結合によりＤ環と結合した酸素原子、又はハロゲン原子であり、より好ましくはさらには二重結合によりＤ環と結合した酸素原子である。
【００６５】
１つの好ましい実施の形態によれば、Ｒ６基は二重結合によりＤ環と結合した酸素原子を表し、Ｒ８基は水素原子を表し、この場合Ｒ６基を有する炭素原子とＲ８基を有する窒素原子との間の結合は単結合である。この場合、本発明による式（Ｉ）の化合物は以下の構造（Ｉｂ）に対応する。
【００６６】
【化８】
【００６７】
式（Ｉ）の化合物の中で、構造（Ｉｂ）の化合物がＬＩＭＫ１阻害因子として最も活性が高く、好ましくは該構造（Ｉｂ）の化合物の中で、
−ＯＲ４が上で規定したようにヒドロキシル基、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚの基、又は式−ＯＣ（Ｏ）Ｚの基を表し、
Ｒ１が水素原子であり、
Ｒ８が水素原子であるものが特に好ましいと思われる。
【００６８】
別の変形形態によれば、Ｒ６基はハロゲン原子、より好ましくは塩素原子、又は１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表す。
【００６９】
この場合、本発明による式（Ｉ）の化合物は以下の構造（Ｉａ）に対応する。
【００７０】
【化９】
【００７１】
最も好ましい実施の形態では、式（Ｉ）の化合物は、式：
【００７２】
【化１０】
【００７３】
又は式：
【００７４】
【化１１】
【００７５】
又は式：
【００７６】
【化１２】
【００７７】
又は式：
【００７８】
【化１３】
【００７９】
又は式：
【００８０】
【化１４】
【００８１】
に対応する。
【００８２】
本発明の別の主題は以下の特定の式（Ｉ）の化合物である。
【００８３】
【化１５】
【００８４】
本発明の別の主題は、有効成分としての少なくとも１つの上で規定した化合物と少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物である。
【００８５】
上記医薬組成物の１つの有益な実施の形態によれば、医薬組成物は別の抗がん有効成分も含む。
【００８６】
上記医薬組成物には固体形態の組成物（錠剤、ゲルカプセル、カプセル等）、及び液体形態の組成物（溶液、懸濁液又はエマルション）の両方が含まれ、経口投与、局所投与又は非経口投与に好適な賦形剤を含む。
【００８７】
本発明による化合物又は組成物の投与を経口経路で又は非経口経路（特にかん流又は静脈注射）で行うのが好ましい。好適な期間、通例２時間〜２４時間、好ましくは２時間〜１２時間にわたるかん流による投与が一般的には好ましい。
【００８８】
化合物の用量は選択される製剤、投与方法及び治療対象の腫瘍によって変わる。年齢、体重、身長又は性別等の他の因子、及び或る特定の生物学的パラメータ（排出率、他の薬物との関連性、アレルギー等）も考慮しなければならない。以下の実施例により、当業者が最も好適な用量を決定することが可能である。
【００８９】
本発明の別の主題は上で規定したような式（Ｉ）の化合物の微小管を安定化させる活性を評価する方法である。
【００９０】
スクリーニング試験はJ. Biomol. Screen（非特許文献１４）の刊行物の主題であったが、式（Ｉ）の化合物を評価するために適合させた。このため上記方法は以下を含む。
１．真核細胞を試験対象の化合物とインキュベートした後の、微小管ネットワークを保護するが脱重合したチューブリンの排出を可能にするバッファーによる細胞の透過処理、
２．細胞の固定後、Ｔｙｒ−チューブリンを抗チロシン化チューブリン一次抗体及び波長λ１で（例えば赤色領域（シアニン３）で）発光する二次抗体で標識化し、Ｇｌｕ−チューブリンを抗脱チロシン化チューブリン一次抗体及び波長λ２で（例えば緑色領域（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）で）発光する二次抗体で標識化した後の、特に単純なリーダーを用いた脱重合剤に最も感受性がある動的微小管及び安定化した微小管を同定するための様々な波長での蛍光の定量化、
３．細胞層の状態を評価するための核の補助的な標識化（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、
４．工程１と同じ条件下での試験対象の化合物とＨｅＬａ細胞とのインキュベーション、及び蛍光が波長λ２で（例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体と同じ波長で）観察される場合の化合物の選抜。これにより微小管に対する評価対象の化合物の実際の効果を可視化することにより微小管ネットワークの免疫蛍光分析を介して偽陽性を排除することが可能になり、実際に細胞を洗浄した後でも残存する凝集体の緑色標識化は微小管に特有のものではない。
５．ミトコンドリアに対するアジ化ナトリウムの効果と試験対象の化合物の効果とを比較することによるミトコンドリアの位置及び形状に対する効果の分析、及びミトコンドリアマーカー、例えばクロロメチル−Ｘ−ロザミン（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）マーカー）（ミトコンドリア膜を通って受動的に拡散し、活性ミトコンドリアに集積する特性を有する）を用いた標識化による、試験対象の化合物がアジ化ナトリウムと同様の作用機序を示す場合の試験対象の化合物の除外。
【００９１】
アジ化ナトリウムが安定化した微小管の生成を誘導し、これによりＧｌｕ−チューブリンを生成することができることが知られている（De Brabander et al., 1982、非特許文献１１）。アジ化ナトリウムはミトコンドリアの呼吸の阻害因子である。この現象の説明は酸化的リン酸化中に電子伝達を妨げることにより、この物質がＡＴＰ枯渇を引き起こすことである。これは特定されていない微小管の脱重合工程を妨げ、細胞におけるＧｌｕ−微小管の増大を引き起こす。
６．微小管ネットワークの動態に対する試験対象の化合物の効果を分析する工程。これに関して、ＨｅＬａ細胞を試験対象の化合物と２時間インキュベートした後、必要に応じて３０分間１０μＭのノコダゾールで処理する。それからノコダゾールにより誘導される脱重合に対する試験対象の化合物の考え得る保護効果を、微小管ネットワークの免疫蛍光標識化の分析、及びマイクロプレートリーダー又は顕微鏡分析を用いた定量化により明らかにする。
７．ＨｅＬａ細胞と試験対象の化合物とのインキュベーションを介した、アクチンネットワークに対する試験対象の化合物の効果を分析する工程。このインキュベーション工程は、アクチンネットワークの脱重合剤であるラトランクリンＢとの同時インキュベーション工程により必要に応じて延長される。最後にはフルオロフォア（λ２で発光、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）と結び付いたファロトキシンによるＦ−アクチンの標識化。アクチンネットワークが安定化する場合、アクチンネットワークのラトランクリン誘導性の脱重合が制限される。
【００９２】
チューブリンと同じようにアクチンもネットワークを形成する。これらのネットワークは細胞膜を機械的に支持するため、その形状及び可塑性を決定し、細胞を移動させ、粒子を取り込み、分裂するのを可能とする。アクチンネットワーク及び微小管ネットワークのそれぞれを標的とする特異的な物質があったとしても、これらのネットワークは密接に相互調節することが知られている。そのため、微小管に作用する或る特定の分子はアクチンネットワークにも影響を与える可能性がある（Baudouin et al., 2008、Enomoto, 1996、Mogilner and Keren, 2009）。
【００９３】
最後に本発明の別の主題は、具体的に
神経変性型の病変を予防及び／又は治療するため、より具体的にはアルツハイマー病及び統合失調症を予防及び／又は治療するための、
寄生虫病を予防及び／又は治療するため、より具体的にはマラリアを予防及び／又は治療するための、或いは
緑内障を予防及び／又は治療するための、
薬物として用いられる式（Ｉ）の化合物である。
【００９４】
別の用途は殺虫剤としての式（Ｉ）の化合物の使用でもあり得る。
【００９５】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＩＭＫ１の活性を阻害又は安定化させやすい分子をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＬＩＭＫ１を必要に応じて標識化された本発明による式（Ｉ）の化合物に接触させること、
（ｉｉ）試験対象の化合物を添加すること、及び
（ｉｉｉ）式（Ｉ）の化合物の試験対象の化合物による置き換えを評価すること、
を含む、方法にも関する。
【００９６】
式（Ｉ）の化合物が標識化されていない場合、工程（ｉｉｉ）の評価はＨＰＬＣ又は同様の方法で行われる。
【００９７】
式（Ｉ）の化合物が標識化されている（フルオロフォア、放射性標識化同位体、ビオチン化又は同様の標識化方法）場合、工程（ｉｉｉ）の評価は適切な固体支持体（例えばマイクロプレート）上で行われ、ラベルは該固体支持体上で測定される。ラベルの低減は試験対象の化合物が式（Ｉ）の化合物の競合因子であり、そのためＬＩＭＫ１阻害因子であることを示す。
【００９８】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで直接的若しくは間接的なＬＩＭＫ１活性化因子、又はホスファターゼ阻害因子をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物を真核細胞、好ましくはヒト細胞に接触させること、
（ｉｉ）ＬＩＭＫ１基質、例えばコフィリンのリン酸化の低減を測定することにより、上記式（Ｉ）の化合物の阻害効果を評価すること、
（ｉｉｉ）試験対象の化合物を添加すること、及び
（ｉｖ）ＬＩＭＫ１基質のリン酸化の阻害に対する試験対象の化合物の効果を測定すること、
を含む、方法にも関する。
【００９９】
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）を別々に又は同時に行うことができる。
【０１００】
工程（ｉｖ）はＬＩＭＫ１基質のリン酸化レベルを測定すること、及び測定されたＬＩＭＫ１基質のリン酸化レベルを工程（ｉｉ）で得られた測定レベルと比較することからなる。
【０１０１】
リン酸化が回復又は増大する場合、試験対象の化合物はＬＩＭＫ１の直接的若しくは間接的な活性化因子、又はホスファターゼ阻害因子である。
【０１０２】
上述の構成の他に、本発明は以下の残りの記載から明らかとなる他の構成も含む。該残りの記載は本発明による式（Ｉ）の四環系化合物の安定化特性に注目した実施例及び添付の図面にも関する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】チューブリンの脱チロシン化／チロシン化サイクルに対応する図である。
【図２】ＨｅＬａ細胞の微小管に対するノコダゾールの脱重合効果を示す図である。
【図３】低温での微小管の安定性に対する本発明の化合物１の効果を示す図である。ＨｅＬａ細胞をパクリタキセルと又はパクリタキセルではなく本発明の化合物１と２時間インキュベートした後、４℃に３０分間曝露する。本発明の化合物１で処理した細胞におけるチューブリンの量をマイクロプレートリーダーを用いて測定した後、パクリタキセルで処理した細胞の入ったウェルで測定されたチューブリンの量（１００％）の百分率として報告する。
【図４】本発明の化合物１で処理したＨｅＬａ細胞の微小管に対するノコダゾールの効果を示す図である。ＨｅＬａ細胞をパクリタキセルと又はパクリタキセルではなく本発明の化合物１と２時間インキュベートした後、３０分間ノコダゾールに曝露する。本発明の化合物１で処理した細胞におけるチューブリンの量をマイクロプレートリーダーを用いて測定した後、パクリタキセルで処理した細胞の入ったウェルで測定されたチューブリンの量の百分率として報告する。
【図５】ｉｎ ｖｉｔｒｏで精製されたチューブリンのアセンブリに対する本発明の化合物１の効果をパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））の効果と比較した図である。精製されたチューブリン（１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で、ＧＴＰ（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ）、ＤＡＰＩ（１０μＭ）の存在下においてＰＥＭバッファー中でインキュベートする。様々な濃度（× ２５μＭ、◎ ５０μＭ及び△ １００μＭ）で本発明の化合物１の効果をパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（■）及びＤＭＳＯ（□）の効果と比較する。
【図６】アクチンネットワークに対するラトランクリンＢにより誘導される脱重合に関する化合物１の保護効果を示す図である。
【図７】ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に対する本発明の化合物１の毒性を示す図である。細胞を様々な濃度の本発明の化合物１で４８時間処理し、細胞の生存率をＭＴＴ試験を用いて測定した。
【図８】Ｇｌｕ−微小管の位置及び形態に対する化合物１の効果を示す図である。
【図９】ミトコンドリアの位置及び形態に対する化合物１の効果を示す図である。
【図１０】化合物１によるＬＩＭＫ１の阻害を示す図である。
【図１１】化合物１によるＬＩＭＫ１の用量依存的な阻害を示す図である。
【図１２】化合物１によるＬＩＭＫ１のラインウェーバー・バーク阻害プロットを示す図である。
【図１３】化合物１によるＬＩＭＫ１阻害のｉｎ ｖｉｔｒｏでの可逆性を示す図である。
【図１４】ＨｅＬａ細胞における化合物１により誘導されたコフィリンのＳｅｒ３におけるリン酸化の阻害の可逆性の分析を示す図である。
【図１５】化合物１による細胞のＬＩＭＫ１活性の用量依存的な阻害を示す図である。
【図１６】ＨｅＬａ細胞における化合物１によるｓｅｒ３におけるコフィリンのリン酸化の阻害の動態分析を示す図である。
【図１７】従来技術の化合物Ｃ６及び化合物Ｃ８と比較した本発明の化合物１（Ｈ０６）のＬＩＭＫ１に対する相対的活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
実施例１：生成物の特性決定
シリカカラムクロマトグラフィ：
シリカカラムクロマトグラフィを行う。
【０１０５】
予め所定の溶媒／溶離液の懸濁液中に入れられた、０．０４０μｍ〜０．０６３μｍ厚のシリカゲル（Merck）上でクロマトグラフィを行う（シリカの量は精製される粗反応混合物の量の１０倍〜１００倍に相当していなければならない）。分離させる生成物の混合物を最小量のシリカゲル上に吸着させるか、又は最小量の溶媒中に溶解し、カラムの最上部に慎重に堆積させた後、好適な溶離液を用いてクロマトグラフィを行う。
【０１０６】
表Ｉの化合物１〜化合物６及び化合物９〜化合物１１を合成すると共に評価した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
化合物１〜化合物６及び化合物９は合成の中間体として文献に記載されている。
化合物１：９−ベンゾイルオキシ−５，１１−ジメチル−２Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Med. Chem., 1983, 26, 181に記載及び公開されているように合成する。
化合物２：９−メトキシ−５，１１−ジメチル−２Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706、及びTetrahedron, 1993, 2915に記載及び公開されているように合成する。
化合物３：９−ベンジルオキシ−５，１１−ジメチル−２Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に記載及び公開されているように合成する。
化合物４：９−ヒドロキシ−５，１１−ジメチル−２Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Med. Chem., 1983, 26, 181に記載及び公開されているように合成する。
化合物５：１−クロロ−９−メトキシ−５，１１−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706、及びTetrahedron, 1993, 2915に記載及び公開されているように合成する。
化合物６：１−クロロ−９−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に記載及び公開されているように合成する。
化合物７：９−ベンジルオキシ−１−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
【０１０９】
【化１６】
【０１１０】
臭化ベンジル（２３０μｌ、１．９ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（６ｍｌ）を１−クロロ−９−ヒドロキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（化合物１０）（４９０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）、アセトン（７ｍｌ）、ＤＭＦ（２ｍｌ）及びＫ２ＣＯ３（４００ｍｇ）を含有する混合物に室温で１５分かけて添加する。アセンブリを２４時間攪拌した後、続いて溶媒を真空下で蒸発させる。それから水を添加する（３０ｍｌ）。
【０１１１】
再びアセンブリを２４時間攪拌する。固形物を濾過により回収し、水で洗浄した後、室温で１８時間乾燥させる。溶離液としてジクロロメタン／酢酸エチル（９９％／１％から９５％／５％まで）を用いたシリカカラムによるクロマトグラフィ後に、中間体として１−クロロ−９−ベンジルオキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（３３０ｍｇ、収率５１％）が得られる。
【０１１２】
得られた生成物はJ. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に記載の方法に従って得られたものと同一である。
【０１１３】
上で得られた１−クロロ−９−ベンジルオキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（３２０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（７ｍｌ）及びナトリウムメトキシド（メタノール中、３０％溶液、１０ｍｌ）の混合物を２０時間加熱還流する。反応混合物を６０ｍｌの水に注いだ後、２時間攪拌する。濾過により回収した形成固体を水で洗浄した後、乾燥させる。
【０１１４】
溶離液としてジクロロメタン／酢酸エチル（９９．５％／０．５％から９９％／１％まで）を用いたシリカカラムによるクロマトグラフィ後に、２８０ｍｇ（収率８８％）の期待化合物９−ベンジルオキシ−１−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（化合物７）が得られる。
【０１１５】
化合物７のプロトンＮＭＲスペクトルは以下の通りである：
ＣＤＣｌ３ δ（ｐｐｍ）：８．８７（ｓ，１Ｈ）、８．００（ｄ，１Ｈ）、７．８８（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．８０（ｄ，１Ｈ）、７．５５〜７．３３（ｍ，８Ｈ）、５．２１（ｓ，２Ｈ）、４．２２（ｓ，３Ｈ）、２．７６（ｓ，３Ｈ）。
微量分析：
Ｃ２４Ｈ２０Ｎ２Ｏ １．７５Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ、７２．０９；Ｈ、５．８８；Ｎ、７．０１；
実測値：Ｃ、７２．２２；Ｈ、５．５１；Ｎ、７．１８。
化合物８：１，９−ジメトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
【０１１６】
【化１７】
【０１１７】
１−クロロ−９−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に従って調製した）（４２７ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）及びナトリウムメトキシド（メタノール中、３０％溶液、３ｍｌ）の混合物を２４時間加熱還流する。それから反応混合物を５０ｍｌの水に注いだ後、２時間攪拌する。濾過により回収した形成固体を水で洗浄した後、乾燥させる。
【０１１８】
溶離液としてジクロロメタン／エタノール（９９％／１％から９８％／２％まで）を用いたシリカカラムによるクロマトグラフィ後に、４００ｍｇ（収率９５％）の期待化合物１，９−ジメトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（化合物８）が得られる。
【０１１９】
化合物８のプロトンＮＭＲスペクトルは以下の通りである：
ＣＤＣｌ３ δ（ｐｐｍ）：８．８５（ｓ，１Ｈ）、７．９８（ｄ，１Ｈ）、７．９１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．６８（ｄ，１Ｈ）、７．４１（ｄ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，１Ｈ）、７．１１（ｄｄ，１Ｈ）、４．２１（ｓ，３Ｈ）、３．９５（ｓ，３Ｈ）、２．７２（ｓ，３Ｈ）。
微量分析：
Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ２ ０．５Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ、７１．７９；Ｈ、５．６５；Ｎ、９．３０；
実測値：Ｃ、７１．８４；Ｈ、５．４９；Ｎ、９．１２。
化合物９：９−ベンジルオキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に記載及び公開されているように合成する。
化合物１０：１−クロロ−９−ヒドロキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
５ｍｌ容の封管において、１−クロロ−９−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）（J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に従って調製した）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（２２５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）及び３７％塩酸（４ｍｌ）の混合物を１４０℃の油浴で２４時間加熱する。
【０１２０】
それから反応混合物を真空下で蒸発させた後、２０ｍｌの水を添加する。それから媒体を２８％水酸化アンモニウム（０．５ｍｌ）の添加により塩基性にし、固体を低温濾過により回収した後、水で洗浄し、２００℃の温度で１８時間、減圧デシケーターを用いて乾燥させる。
【０１２１】
それにより６５ｍｇ（収率９０％）の化合物１０が得られる。化合物１０のプロトンＮＭＲスペクトルは以下の通りである：
ＤＭＳＯ−ｄ６ δ（ｐｐｍ）：１１．３０（ｓ，１Ｈ）、９．２１（ｓ，１Ｈ）、８．８７（ｓ，１Ｈ）、８．１６（ｄ，１Ｈ）、７．９８（ｄ，１Ｈ）、７．７１（ｄ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ）、７．０７（ｄｄ，１Ｈ）、２．８３（ｓ，３Ｈ）。
微量分析：
Ｃ１６Ｈ１１ＣｌＮ２Ｏ ０．２５Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ、６６．９１；Ｈ、４．０４；Ｎ、９．７５；
実測値：Ｃ、６６．９９；Ｈ、４．２６；Ｎ、９．３４。
化合物１１：９−ヒドロキシ−２，５，１１−トリメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
１−クロロ−９−メトキシ−５，１１−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（２５０ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）（化合物５、参考文献J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706、及びTetrahedron, 1993, 2915に従って調製した）、アセトニトリル（５０ｍｌ）及びヨードメタン（１０ｍｌ）の混合物を６５℃の温度で３時間加熱する。
【０１２２】
それから得られた混合物を真空下で蒸発させた後、３０ｍｌの３Ｎ 水酸化ナトリウムを添加する。それから混合物を３０分間攪拌する。得られた赤レンガ色の固体を濾過により回収した後、水で洗浄し、室温で１８時間乾燥させる。
【０１２３】
それにより中間体９−メトキシ−２，５，１１−トリメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンが得られ、それをそのまま全く精製せずに用いる。
【０１２４】
上で得られた中間体化合物９−メトキシ−２，５，１１−トリメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オン及びピリジン塩酸塩（２ｇ）を含む混合物を３０分間加熱還流する。
【０１２５】
得られた溶液を６０ｍｌの氷水に注いだ後、形成固体を低温濾過により回収し、２つの５ｍｌの水で洗浄した後、１８時間、２０℃の温度で減圧デシケーターを用いて乾燥させる。
【０１２６】
それから固体を２０ｍｌのトルエンに混合した後、５分間沸騰し、その後２０℃に冷却する。
【０１２７】
それにより１３０ｍｇ（収率５５％）の化合物１１が得られ、これを濾過により回収し、２つの５ｍｌのトルエンで洗浄した後、１８時間、室温で乾燥させる。化合物１１のプロトンＮＭＲスペクトルは以下の通りである：
ＤＭＳＯ−ｄ６ δ（ｐｐｍ）：１１．０７（ｓ，１Ｈ）、９．０１（ｄ，１Ｈ）、７．６９（ｄ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，１Ｈ）、６．９５（ｄｄ，１Ｈ）、６．６８（ｄ，１Ｈ）、３．４５（ｓ，３Ｈ）、３．３９（ｓ，３Ｈ）、２．５９（ｓ，３Ｈ）。
微量分析：
Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ２ １．３３Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ、６８．３５；Ｈ、５．９０；Ｎ、８．８６；
実測値：Ｃ、６８．２２；Ｈ、５．７４；Ｎ、９．２７。
本発明の範囲外の化合物の合成：
化合物Ｃ６：J. Med. Chem., 1980, 181に記載及び公開されているように合成する。
【０１２８】
【化１８】
【０１２９】
化合物Ｃ８：この化合物を、J. Med. Chem., 1983, 181に記載及び公開されているように、Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミンの代わりにＮ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン中で９−ベンゾイルオキシ−１−クロロ−５，１１−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールを還流することにより得た。
【０１３０】
【化１９】
【０１３１】
実施例２：材料及び方法
１）細胞株
株の名称、参照番号及び起源を以下の表ＩＩに挙げる。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
２）一次抗体
用いられる一次抗体を以下の表ＩＩＩに挙げる：
【０１３４】
【表３】
【０１３５】
３）二次抗体
用いられる二次抗体は以下の通りである：
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
４）細胞生物学
細胞培養：
全ての株を３７℃及び５％ ＣＯ２で加湿インキュベーターにおいてＴ７５フラスコ中の１５ｍｌの培養培地で増殖させる。培養物を維持するために、コンフルエントに達したら、細胞を０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco, Invitrogen）の溶液を用いて解離させることにより細胞を分割し、１／５〜１／２０と様々な希釈率で再播種する。細胞特性の任意の推移（drift）及び変動を避けるために、或る特定数の継代培養後にこれらの細胞が分裂を停止するので、６回の継代培養を越えて使用することが勧められないＭＥＦ株（初代細胞）を除いて、これらの株は最大で２０回の継代培養に使用する。
【０１３８】
ＨｅＬａ株、ＮＣＩ−Ｈ４６０株及び７８６−Ｏ株を１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、Hyclone, Thermo Fisher Scientific）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco, Invitrogen）を添加したＧｌｕｔａＭＡＸＩ（商標）（Gibco, Invitrogen）を有するＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させる。
【０１３９】
ＭＣＦ−７株を１０％ ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び０．１ｍｇ／ｍｌのインスリン（Sigma Aldrich）を添加したＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中で増殖させる。
【０１４０】
ＭＥＳ−ＳＡ株及びＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５株を１回目の継代培養では１０％ ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したマッコイ５Ａ（ＡＴＣＣ）中で、その後１０％ ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させる。
免疫蛍光：
チューブリン（Ｔｙｒ、Ｇｌｕ）及び核の染色：
ガラスカバースリップ上で２日間増殖させた細胞をＯＰＴバッファー（Ｐｉｐｅｓ ８０ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＭｇＣｌ １ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５％及びグリセロール １０％（ｐＨ６．８））を用いて又は用いずに３７℃で３分間インキュベートした後、予め−２０℃で１０分間維持したメタノール中で固定した。それから細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で洗浄し、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３の溶液で希釈した適切な一次抗体（表ＩＩＩの抗体を参照されたい）を用いて室温で最低１５分間インキュベートする。その後、細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄する。細胞を、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３で希釈した二次抗体（表ＩＶの抗体を参照されたい）と１μｇ／ｍｌの最終濃度のＨｏｅｃｈｓｔとの溶液を用いて室温で１５分間インキュベートする。最後に、細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した後、純粋なエタノールで脱水し、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（商標）マウンティング（mounting）溶液（Calbiochem, Merck）を用いてスライドに固定する。
アクチンの染色：
チューブリン染色と同じように、細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、インキュベートする。培地の除去後、細胞を温かいＰＢＳで洗浄した後、３７℃で３０分間ＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒドの溶液を添加することにより固定する。細胞をＰＢＳで洗浄した後、室温で１５分間、ＰＢＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００の溶液を用いて透過処理する。さらにＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で３０分間、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡの溶液を用いてインキュベートする。それから細胞を室温で２０分間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Molecular Probes, Invitrogen）で標識化したファロイジン（０．１６５μＭの最終濃度）を用いてインキュベートする。もう１度細胞をＰＢＳで洗浄した後、純粋なエタノールで脱水する。最後に、細胞をＦｌｕｏｒｓａｖｅ（商標）マウンティング溶液を用いてスライドに固定する。
ミトコンドリアの染色：
チューブリン染色と同じように、細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、３７℃で５％ ＣＯ２下でインキュベートする。播種後３日目に、２５０ｎＭの最終濃度に到達させるために、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Molecular Probes, Invitrogen）を培養培地に添加する。それから細胞を３７℃で３０分間、５％ ＣＯ２下でインキュベートする。このマーカーが細胞膜を通じて受動的に拡散し、活性ミトコンドリアに集積する。培地の除去後、細胞を温かい媒体で洗浄した後、３７℃で３０分間ＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒドの溶液を添加することにより固定する。他の免疫蛍光染色が必要な場合、細胞をＰＢＳでリンスした後、室温で１５分間、ＰＢＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００の溶液を用いて透過処理することができる。
【０１４１】
５）顕微鏡検査
顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ ５０、Zeiss, Oberkochen, Germany）、並びに１００×／１．３ Ｐｌａｎ Ｎｅｏｆｌｕａｒ対物レンズ、ＣｏｌｏｌＳｎａｐ ＥＳ電荷結合素子カメラ（Roper Scientific, Trenton, NJ, USA）及びＭｅｔａｖｉｅｗ（Universal Imaging Corp.）ソフトウェアを用いて蛍光画像を撮影し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて処理した。
【０１４２】
代替的には、スライドを様々な蛍光顕微鏡で又は共焦点顕微鏡を用いて読み取る。
６）細胞培養試験
（細胞株に応じて）２×１０５細胞／ｍｌ〜５×１０５細胞／ｍｌの細胞溶液を１００μｌ／ウェル播種した後、細胞培養試験を透明な９６ウェルマイクロプレート（Greiner）で行う。５％ ＣＯ２下で３７℃で２４時間インキュベートした後、培養培地を取り除き、様々な濃度の試験対象の分子の溶液に置き換える。細胞を５％ ＣＯ２下で３７℃でさらに４８時間、これらの分子を用いてインキュベートする。培地の除去後、細胞をブランク（blank）ＲＰＭＩ（Gibco, Invitrogen）で洗浄した後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドすなわちＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度）と共に５％ ＣＯ２下で３７℃で４時間インキュベートする。ＭＴＴ（Sigma Aldrich）は、ミトコンドリア酵素の活性を測定することにより、細胞の生存率を推定することが可能である。実際、生細胞では、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼはテトラゾリウム環を切断することが可能であり、これにより水性媒体に不溶であるホルマザン結晶が形成される。可溶化溶液（イソプロパノール、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１Ｎ ＨＣｌ）を添加してこれらの結晶を溶解する。攪拌後、吸光度をＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡマイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍで測定する。
【０１４３】
７）マイクロプレートにおいて微小管を安定化又は不安定化する分子の検出を可能にする試験
４００００細胞／ｍｌの細胞溶液を１ウェル当たり９０μｌ分配することにより、ＨｅＬａ細胞を底が黒色のブラック９６ウェルマイクロプレート（Greiner ６５５０８６）で播種し、５％ ＣＯ２下で３７℃でインキュベートする。２４時間後、５％ ＣＯ２下で３７℃で２時間、試験対象の分子と共に細胞をインキュベートする。それから細胞を３７℃で６分間、温かいＯＰＴバッファーを用いて透過処理した後、室温で１０分間メタノールで固定する。細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で２回リンスし、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３の溶液で１／４０００に希釈した一次抗体ＹＬ１／２及びＬ４（表ＩＩＩの抗体を参照されたい）と共に３７℃で一晩インキュベートする。それから細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した後、１μｇ／ｍｌの最終濃度のＨｏｅｃｈｓｔと、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３で１／５００及び１／１０００でそれぞれ希釈した抗ラットシアニン３二次抗体及び抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体との溶液を用いて３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄後、ＰＢＳ／５０％グリセロールをそれぞれのウェルに分配する。様々な蛍光強度をＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡリーダーを用いて測定する。
【０１４４】
８）アクチン細胞骨格に対する作用に関する試験：細胞においてラトランクリンＢにより誘導される脱重合に対するアクチンネットワークの安定性を評価するプロトコル
実験の３日前に、ガラスカバースリップを滅菌条件下で２４ウェルマイクロプレートに置く。それぞれのウェルで、指数増殖期にあるＨｅＬａ細胞（１つのウェル当たり１５０００個の細胞）を５００μｌのＲＰＭＩ培地に播種する。
【０１４５】
試薬：
ストック試薬：
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、参照番号Ｐ４４１７、Sigma）、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、参照番号Ａ３０５９、Sigma）、−２０℃で保存した１５ｍｌのアリコート；ＰＢＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（参照番号Ｔ８７８７、Sigma）；ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（参照番号Ｐ９９１６、Sigma）；ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３（ＮａＮ３に関する参照番号６６８８、Merck）、−２０℃で保存した１５ｍｌのアリコート。
ファロイジンＡ４８８（参照番号Ａ１２３７９、Invitrogen）。
Ｌ４：ウサギ抗脱チロシン化チューブリンポリクローナル抗体（非特許文献１３を参照されたい）。
シアニン３に連結した抗ウサギ抗体（参照番号１１１．１６５．１４４、Jackson Laboratories）。
１ｍｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ Ｈ ３３２５８、参照番号Ｂ２８８３、Sigma）の再蒸留水ストック溶液。
Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（登録商標）マウンティング液（参照番号３４５７８９、Calbiochem）。
エタノール（参照番号４１４−５８７、Carlo Erba）。
同じ日に調製するもの：
ラトランクリンＢ（参照番号Ｌ５２９８、Sigma）５μＭ：５００μｌのＲＰＭＩ中、５μｌの５００μＭ ラトランクリン。
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、参照番号Ｄ５８７９、Sigma）０．２５％：１０００μｌのＲＰＭＩ中、２．５μｌの純粋なＤＭＳＯ。
パクリタキセル（参照番号Ｔ１９１２、Sigma）５μＭ：１０００μｌのＲＰＭＩ中、５μｌの１ｍＭ パクリタキセル。
試験対象の化合物（２５μＭ、最終濃度）：１０００μｌのＲＰＭＩ中、１０ｍＭ（ＤＭＳＯ中で）の濃度の２．５μｌの化合物。
ＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒド：１．２ｍｌの３７％ホルムアルデヒド（参照番号Ｆ１６３５、Sigma）＋１２ｍｌのＰＢＳ（用時（extemporaneously）調製する）。
ファロイジンＡ４８８をＰＢＳ／１％ ＢＳＡで０．１６５μＭの濃度まで希釈する。
ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３でＬ４一次抗体を１／４０００まで希釈する。
ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３で抗ウサギシアニン３二次抗体を１／１０００まで希釈する。
ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３でＨｏｅｃｈｓｔを１／１０００（＝１μｇ／ｍｌ）まで希釈する。
考え得る凝集体を排除するため、１５０００ｇで１０分間これらの様々な希釈生成物を遠心分離する。
試験の実施：
それぞれのウェルに試験対象の化合物を２５μＭの濃度で添加する。０．２５％ ＤＭＳＯ及び５μＭ パクリタキセルを対照として用いる。全ての条件を二連で行う。
細胞インキュベーター（湿潤雰囲気下で３７℃、５％ ＣＯ２）において２時間インキュベートする。
２時間のインキュベーションの終了時に、１０μｌの５μＭ ラトランクリンを２つのウェルごとに添加する（ラトランクリンの最終濃度：０．１μＭ）。
インキュベーションを１０分間続けた後、細胞を固定し、脱チロシン化チューブリンの免疫染色及びアクチンの染色を行う。
細胞の固定、並びに脱チロシン化チューブリン及びアクチンネットワークの染色：
細胞を３７℃で５００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄した後、３７℃で予熱したＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒド（５００μｌ／ウェル）を用いて３７℃で３０分間インキュベートすることにより固定する。
３７℃で３０分間のインキュベーション。
以下の工程を室温で行う。
ＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒドの吸引。
５００μｌ／ウェルのＰＢＳによる３回の洗浄。
それからカバースリップをピンセットを用いて回収し、好適な支持体上に置く。
ＰＢＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００による透過処理（１００μｌ／カバースリップ）。
それからカバースリップをＰＢＳで３回洗浄する。
３０分間のＰＢＳ／１％ ＢＳＡ（１００μｌ／カバースリップ）による飽和。
それからカバースリップをＰＢＳで３回洗浄する。
２０分間の０．１６５μＭの蛍光ファロイジンＡ４８８（５０μｌ／カバースリップ）を用いたインキュベーション。
それからカバースリップをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
１５分間の１／４０００に希釈したＬ４一次抗体（５０μｌ／カバースリップ）を用いたインキュベーション。
それからカバースリップをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
１５分間の抗ウサギシアニン３蛍光二次抗体（１／１０００）及びＨｏｅｃｈｓｔ（１／１０００）（５０μｌ／カバースリップ）を用いたインキュベーション。
それからカバースリップをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
カバースリップを１００％エタノール浴に浸漬することによる調製物の脱水。
Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（登録商標）マウンティング溶液（Calbiochem, Merck）を用いてカバースリップをスライドに固定する。
【０１４６】
９）ＬＩＭＫ１キナーゼアッセイ
放射ＬＩＭＫ１アッセイにおいて、３μｌの化合物又は対照として同量のＤＭＳＯと、２μｌ（１ｎｇ）のＮ末端６Ｈｉｓタグ付け組換えヒトＬＩＭＫ１（Millipore ＃１４−６５６、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ＝７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＮＰ−４０、５％グリセロール、０．１％ β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン中で）と、８μＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ＝７．０）、２００μＭ ＥＤＴＡ、７０μＭの組換えＧＳＴ−コフィリン１、２５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２及び３６０μＭ ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを含有する混合物とを含有する２５μｌの最終容量で化合物を試験した。アッセイを３０℃で１０分間行った後、５μｌの３％オルトリン酸の添加により停止させた。それから２５μＬのアリコートをＰ８０の四角いフィルター（４ｃｍ２）上にスポットした。フィルターを０．５％オルトリン酸により４℃で５分間、３回リンスし、シンチレーションバイアルに移した。シンチレーションカクテル（Ultima Gold, Perkin-Elmer）を添加した後、シンチレーションカウンターを用いて３２Ｐの取り込みを測定した。
【０１４７】
１０）ＬＩＭＫ１阻害可逆性アッセイ
Ｎ末端６Ｈｉｓタグ付け組換えヒトＬＩＭＫ１（Millipore ＃１４−６５６、６２．５ｎｇ）を２５μＭの化合物１（又は同量のＤＭＳＯ）と共に１００μＬの最終容量で４℃で１０分間、インキュベートした。その後この混合物のサイズ排除クロマトグラフィを１ｍｌのＢｉｏｓｐｉｎ Ｐ−６カラム（Biorad、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ＝７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＮＰ−４０、５％グリセロール、０．１％ β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンで平衡化した）を用いて行った。それからｉｎｐｕｔ及びｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈにおけるＬＩＭＫ１キナーゼ活性を放射ＬＩＭＫ１キナーゼアッセイにより検査した。
【０１４８】
１１）細胞のＬＩＭＫ１活性アッセイ
指定の濃度及び時間でＨｅＬａ細胞を化合物（又は対照として同量のＤＭＳＯ）により処理した。全細胞抽出物をプロテアーゼ阻害因子（Sigma、Ｐ８３４０）及びホスファターゼ阻害因子（Sigma、Ｐ５７２６）を添加したＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）を用いて調製した。約３０マイクログラムのタンパク質を１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに投入し、泳動させた。電気泳動後、ニトロセルロース膜をＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、５％ウシ血清アルブミンで飽和させた（satured）。ポリクローナル抗体である抗コフィリン（Cytoskeleton、＃ＡＣＦＬ０２）及び抗ホスホコフィリン（Ｓｅｒ３）（Cell Signaling、＃３３１１）を用いてコフィリンの量及びリン酸化状態を推定した。結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Biosource、＃ＡＬＩ０４０４）を二次抗体として用いた。ＥＣＬ ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（GE Healthcare）を用いて検出を行った。
【０１４９】
実施例３：本発明の式（Ｉ）の化合物の安定化特性の実証
生細胞において、微小管は集合化段階と解離段階との間を行き来する動的構造である。微小管ネットワークに対する分子の安定化効果を評価するために、様々なタイプの試験を行うことができる。このため、パクリタキセルと微小管との結合、又はＳＴＯＰタンパク質等の安定化タンパク質と微小管との結合（Bosc et al., 2003）が微小管ネットワークを４℃での細胞のインキュベーションにより誘導される脱重合から保護することができる。さらに、微小管の動態を遅らせることのできる分子を、ノコダゾールにより誘導される脱重合に対する細胞微小管の耐性を分析することにより同定することができる。安定化化合物がなければ、微小管はノコダゾールの存在下で脱重合する（図２）。
【０１５０】
これらの様々な試験を用いて、細胞微小管に対する本発明の化合物１の安定化効果をパクリタキセルのものと比較している。これらの実験は、この化合物が微小管を低温により誘導される低温誘導性の脱重合から保護することはできないが（図３）、用量依存的にノコダゾール誘導性の脱重合を防ぐことを示している（図４）。そのためこの化合物は微小管の動態を遅らせることができる。
【０１５１】
上記の表Ｉは顕微鏡を用いた二重盲検評価により定性基準に従って、本発明による化合物の安定化特性を要約している。
実施例４：エフェクターによる本発明の化合物１の安定化効果
例えばパクリタキセルがそうであるようにチューブリンに対する直接的な作用を介して、又はエフェクターによって本発明の化合物１が安定化効果を示すかを知るために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの微小管におけるチューブリンのアセンブリに対する本発明の化合物１の効果を分析している。第１の実験を精製チューブリン（１ｍｇ／ｍｌ）で行った。パクリタキセルだけがこれらの条件下でチューブリンのアセンブリを誘導することができる。試験した濃度に関係なく本発明の化合物１ではアセンブリは観察されない（図５）。この結果は、おそらくこの化合物の安定化効果がこれらの分子とチューブリンとの直接的な相互作用によるものではなく、そのためこの化合物は独自の作用機序を有することを示す。
実施例５：アクチンに対する本発明による化合物の効果
本発明による化合物の別の効果は、細胞移動を大幅に遅らせることができることである。この効果は、実施例３に規定のように免疫蛍光実験により特徴付けされたアクチン細胞骨格に対する作用によるものである。しかしながら、チューブリンと同じように、アクチン細胞骨格に対する化合物の効果はアクチンの重合に対する直接的な効果によるものではない。図６は本発明の化合物１で得られた結果を示し、これはこの化合物がアクチンネットワークをラトランクリンＢによる脱重合から保護することを示す（図６）。ＤＭＳＯもパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））もこのような保護効果を誘導することはできない。
【０１５２】
共焦点顕微鏡を用いて観察を行う。
【０１５３】
これらの条件下で、アクチンネットワークが安定化しなければ（ＤＭＳＯ又はパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）））、ラトランクリンはアクチンネットワークのほぼ完全な脱重合を誘導する。化合物１はアクチンネットワークの再組織化を誘導し、アクチンネットワークをラトランクリンβ誘導性の脱重合から部分的に保護する。
【０１５４】
これらの条件下で、微小管ネットワークが安定化する場合、ＤＭＳＯを用いて処理した細胞と比較して（例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）による）脱チロシン化微小管の非常に高い増大が観察される。図８は得られた結果を示す。
実施例６：がん株に関する細胞毒性の研究
がん株の増殖に対するこれらの化合物の効果を評価するために、活性化合物の存在下での幾つかの形質転換細胞株、例えばＨｅＬａ細胞（子宮腺癌）、７８６−Ｏ細胞（腎臓腺癌）、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞（肺癌）、ＭＣＦ−７細胞（乳腺腺癌）、ＭＥＳ−ＳＡ細胞（子宮肉腫）及びＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５細胞（子宮肉腫）の生存率をＤＭＳＯの存在下での生存率と比較した。
【０１５５】
より具体的には、ＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５株は高レベルのＰ−糖タンパク質を発現し、そのため多くの薬理学的作用物質による処理により誘導された毒性に耐性であるがん株である。Ｐ−糖タンパク質をがんの化学療法に対する耐性の主因の一つとして同定した。Ｐ−糖タンパク質は（「多剤耐性」に関して）ＭＤＲ１として知られる遺伝子によりコードされる。その正常な機能は細胞から外に環境由来の異物及び毒素を排出することである。関係のある薬物は、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン、ビンカ・アルカロイド、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ミトキサントロン及びダクチノマイシン等の幾つかの挿入剤、並びにカンプトテシンの或る特定の誘導体である。
【０１５６】
様々な濃度の分子（１００μＭ〜０．００１μＭ）に４８時間曝露した後、ＭＴＴ試験を用いて細胞の生存率を評価した。このようにして用量効果曲線を取得し、これにより細胞増殖の５０％を阻害するのに必要な濃度（ＩＣ５０）を決定することが可能になった。細胞毒性曲線の一例を図７に示す。
【０１５７】
様々な細胞株に対する本発明の化合物１及び化合物３の効果を分析した。得られたＩＣ５０の値を以下の表Ｖに提示する。
【０１５８】
【表５】
【０１５９】
分子の毒性は細胞株に応じて変わる。ＭＣＦ−７細胞は最も耐性のある株であると思われる。この細胞株に関しては、高濃度では溶解することが難しい本発明の化合物３のＩＣ５０を決定することができていない。しかしながら、ＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５多剤耐性株は両方の分子に感受性である。
【０１６０】
最後に、７８６−Ｏ株、ＮＣＩ−Ｈ４６０株及びＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５株に関して、本発明の化合物３は本発明の化合物１よりも毒性が強い。
実施例７：ミトコンドリアに対する効果
２５μＭでの２時間の処理の後（実施例２〜実施例４を参照されたい）、化合物１は細胞をアジ化ナトリウムタイプで処理した場合に観察されるミトコンドリア表現型を誘導しない（図９）。
実施例８：ＥＣ５０の決定：
ｉｎ ｖｉｖｏで分子の生物活性を評価し、それらの活性を比較するために、選択された分子のＥＣ５０（効果全体の５０％の効果を有する濃度）を決定した。分子の濃度に応じた細胞におけるＴｙｒ−チューブリン又はＧｌｕ−チューブリンのシグナルの変動を測定することが可能となる用量効果曲線を確立した。それからこれらの曲線を用いて、求められる効果全体の５０％に相当する活性を生じる生物活性分子の濃度を規定することが可能である。
【０１６１】
Ｇｌｕ−チューブリンの量の変動を測定するための用量効果曲線を本発明の化合物１に関して作成した。このために、ＨｅＬａ細胞を様々な濃度の分子を用いて２時間インキュベートした後、マイクロプレートにおいて免疫蛍光プロトコルに従って処理した。それからマイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度を測定した。
【０１６２】
測定されたシグナルの割合は生物活性の対照（パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）））及び生物不活性の対照（ＤＭＳＯ）との隔たりを表す。ＥＣ５０をＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（登録商標）３．６０ソフトウェアを用いて決定した。
【０１６３】
本発明の化合物１は最も高い濃度でパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））よりもわずかに小さいＧｌｕシグナルの増大を引き起こすことができる。
実施例９：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物１によるＬＩＭＫ１の阻害
図１０は化合物１（Ｈ０６）によるＬＩＭＫ１の阻害を示す。放射ＬＩＭＫ１キナーゼアッセイを実施例２に記載のように行った。以下の条件を試験した：ＬＩＭＫ１なし（「−ＬＩＭＫ１」）、５μＭ Ｈ０６（「５μＭ Ｈ０６」）、２５μＭ Ｈ０６（「２５μＭ Ｈ０６」）又は同量のＤＭＳＯ（「Ｃｔｌ」）の存在下でＬＩＭＫ１（１ｎｇ）を用いて。
【０１６４】
上記阻害は異なるＡＴＰ濃度：１８０μＭ（白丸）又は３６０μＭ（黒四角）で図１１に示されるように用量依存的である。誤差バーは平均値の標準誤差を表す。
【０１６５】
阻害機構を、化合物１（Ｈ０６）の非存在下で（●）又は７０ｎＭ（▲）及び２８０ｎＭ（■）の化合物１（Ｈ０６）の存在下でＬＩＭＫ１キナーゼ活性を決定することにより、ＬＩＭＫ１のラインウェーバー・バークプロットを表す図１２に示した。Ｖ０はＧＳＴ−コフィリンのリン酸化反応の初期速度である。この結果は化合物１がＬＩＭＫ１に対するＡＴＰ競合因子であり、Ｋｉが約６０ｎＭであり、Ｋｍ（ＡＴＰ）が約９０μＭであることを示す。
【０１６６】
サイズ排除クロマトグラフィの前（「ｉｎｐｕｔ」）又は後（「ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ」）、ＬＩＭＫ１阻害の可逆性を２μＭの化合物１（Ｈ０６）の存在下、実施例２の条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで分析した。誤差バーは平均値の標準誤差を表す。図１３は結果を示し、化合物１の作用が可逆的であることを示す。
【０１６７】
化合物１の阻害の可逆性の分析をｉｎ ｖｉｖｏでも試験した。
【０１６８】
ＨｅＬａ細胞を２時間、２５μＭの化合物１（Ｈ０６）により処理した（レーン２）。それから培養培地を棄て、新たな培地（ＲＰＭＩ）を添加した。様々な時間で、ＲＰＭＩ添加後（レーン３、３０分；レーン４、１時間；レーン５、１．５時間；レーン６、２時間；レーン７、４時間）、コフィリンの量及びリン酸化状態を実施例２に記載のように決定した。レーン１は時間「０」、すなわち化合物１で処理していない細胞の細胞抽出物に対応している。
【０１６９】
図１４は結果を示し、化合物１をＲＰＭＩ培地に置き換える場合、再びホスホ−コフィリンが合成されることをはっきりと示している（図１４のレーン４を参照されたい）。
実施例１０：ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物１による細胞のＬＩＭＫ１活性の阻害
コフィリンはＬＩＭＫ１の基質である。化合物１はＨｅＬａ細胞における用量依存的なＳｅｒ３におけるコフィリンのリン酸化の阻害を誘導する。
【０１７０】
ＨｅＬａ細胞を指定の濃度の化合物１（又は陰性対照としてエリプチシン）により２時間処理した。
【０１７１】
コフィリンの量及びリン酸化状態を実施例２に記載のように決定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリン酸化コフィリン（左側）を対照として用いた。
【０１７２】
結果（図１５）は、エリプチシンはコフィリンのリン酸化を回避しないが、化合物１はＬＩＭＫ１を阻害することにより用量依存的にホスホ−コフィリンの形成をはっきりと阻害することを示す。
【０１７３】
ＨｅＬａ細胞を指定の時間、２５μＭの化合物１により処理した。コフィリンの量及びリン酸化状態を実施例２に記載のように決定した。
【０１７４】
図１６はこの実験を説明している。図１６は化合物１による処理のわずか３０分後に化合物１の阻害効果を容易に検出することができることを示す。
実施例１１：本発明の式Ｉの化合物（式中、Ｒ６は二重結合によりＤ環と結合した酸素原子を表す）とＲ６としてアミン誘導基を有する化合物との間の比較研究
【０１７５】
【表６】
【０１７６】
これらの比較データは本発明によるＲ６の選択の極めて重要な役割を示す。
【０１７７】
実際、Ｒ６が本発明で規定されるようなもの、好ましくは二重結合によりＤ環と結合した酸素原子ではない場合、ＬＩＭＫ１に対する阻害作用は見られない。
【０１７８】
図１７はこれらの結果の幾つかを示す。
【０１７９】
【表７−１】
【０１８０】
【表７−２】
【０１８１】
【表７−３】
【０１８２】
【表７−４】
【０１８３】
【表７−５】
【０１８４】
【表７−６】
【０１８５】
【表７−７】
【配列表フリーテキスト】
【０１８６】
配列番号１：チューブリンエピトープ
配列番号２：チューブリンエピトープ
配列番号３：チューブリンエピトープ
配列番号４：チューブリンエピトープ
配列番号５：アルファチューブリン誘導ペプチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物としてのピリドカルバゾール型化合物の使用、より具体的には抗がん化学療法における、及びまた他のタイプの疾患（精神疾患、ウイルス疾患、寄生虫疾患又は真菌疾患）の治療のためのその適用に関する。これらの化合物が式（Ｉ）に対応し、その構造原型（archetype）をエリプチシンのものと比較することができる。本発明は特定の式（Ｉ）の化合物、及び式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
紡錘体は長い間、細胞分裂において重要な役割を果たすため、抗がん化学療法における重要な標的として特定されてきた。微小管の機能障害は細胞の生存に対して劇的な影響を有し、細胞周期の停止を引き起こし、さらには場合によって細胞アポトーシスを誘導する可能性がある。
【０００３】
微小管はアクチンマイクロフィラメント及び中間径フィラメントと共に、真核細胞の細胞骨格を形成する。これらは単一の二量体タンパク質、すなわちチューブリンで構成される中空の管状凝集体である。哺乳動物細胞では、微小管ネットワークは通例、微小管形成中心（中心体）で核を形成する。これらのネットワークは細胞質の組織化、オルガネラの配置、細胞の運動性及び細胞分裂等の複合的でかつ極めて重要な役割を果たす。有糸分裂中、微小管ネットワークは再組織化され、２つの娘細胞へと切断する前に、重複染色体を２つの同一のセットに分離するために細胞で利用される機構である紡錘体を形成する。紡錘体の完全性は特定のチェックポイントで制御される。任意の検出されない紡錘体の機能障害がゲノム不安定性の発端である場合があり、このため潜在的な腫瘍形成原因を表す（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
微小管はチューブリンのα−二量体、β−二量体の重合により集合化する。微小管は遊離チューブリン二量体から迅速に重合すると共に、同じように迅速に脱重合することが可能である極めて動的な重合体である。微小管の動態は有糸分裂に極めて重要である（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００５】
微小管の動的挙動ネットワークは細胞において強く制御される。このネットワークは細胞型に応じて、いわゆる微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）のファミリーである、ＳＴＯＰタンパク質、タウタンパク質、スルビビン、スタスミン／Ｏｐ１８、Ｔｏｇ、並びに微小管脱重合キネシン、ＭＣＡＫ及びＫｉｆ２Ａを含む、微小管安定化タンパク質と微小管不安定化タンパク質の間の活性のバランスにより調節される。さらに、微小管伸長端（growing tips）と幾つかのタンパク質、例えばＣＬＩＰ １７０との相互作用により、微小管が安定化する。これらの見かけ上無関係なタンパク質は全て、微小管格子に沿って又は微小管末端でチューブリン二量体と結合していることが共通している。これらのタンパク質とチューブリンとの結合は、リン酸化／脱リン酸化プロセスにより、又はチューブリン翻訳後修飾、例えばチューブリンチロシン化サイクル（図１）により強く調節される（例えば非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。この翻訳後修飾は、特徴付けられていないチューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）によるα−チューブリン鎖のカルボキシ末端のチロシン残基の環状（cyclic）除去、及びチューブリンチロシンリガーゼ（ＴＴＬ）による同じ位置でのチロシン残基の再付加を伴う。最近になって、チューブリンのチロシン化が微小管プラス端トラッキングタンパク質、例えばＣＬＩＰ−１７０のＣＡＰ−Ｇｌｙとの微小管相互作用を調節することが分かってきた（非特許文献８）。
【０００６】
チューブリンのチロシン化反応を触媒する酵素であるＴＴＬは、チロシンを可溶性の脱チロシン化チューブリンに付加するが、一度チューブリンが微小管へと集合化すると、チューブリンとは効率的に反応しない。ＴＣＰについては、主に未だに均一になるまで精製できていないという理由で、あまり知られていない。間接的な証拠により、ＴＣＰが重合基質を選択すると考えられ、微小管との結合がその機能に必要とされ得ることが示される。ＴＣＰは微小管に対してゆっくりと作用するが、ＴＴＬは微小管から放出されると迅速にＧｌｕ−チューブリンを再充填させる（図１）（非特許文献７）。
【０００７】
ＴＴＬの基質特異性及びＴＴＬとＴＣＰとの動態の違いの結果として、チロシン化チューブリン（Ｔｙｒ−チューブリン）は動的微小管の主成分であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの周期細胞における優勢のチューブリン変異体である一方で、Ｇｌｕ−チューブリンは長期安定な微小管のマーカーである（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。細胞型によっては、これらの脱チロシン化微小管が検出されず、又は小さい細胞亜集団を示す。微小管がエフェクタータンパク質又は薬剤、例えばパクリタキセルにより安定化する場合、脱チロシン化微小管が集積する（非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００８】
ビンカ・アルカロイド系抗がん剤であるビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン、並びにタキサン系抗がん剤であるパクリタキセル及びドセタキセルを含む臨床的に重要な幾つかの抗がん剤が、チューブリンを特異的に標的とし、微小管の動態を変更させる。これらの抗がん剤の臨床的成果を考慮すると、チューブリンはこれまでに同定された最も有効性が高いがん標的の１つである。
【０００９】
さらにがんに加えて、例えば精神障害（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）及び神経変性疾患（非特許文献１８、非特許文献１９）、並びにウイルス感染（非特許文献２０）、細菌感染（非特許文献２１）及び寄生虫感染（非特許文献２２）等の多くの疾患の病因における微小管細胞骨格の関与が説明されている。そのため微小管の細胞骨格及びその様々なエフェクターを標的とする薬理学的作用物質は多くの疾患の治療に関して治療上の利点を示し得る（非特許文献２３）。
【００１０】
このため、抗がん化学療法に用いられる治療は好ましくは、微小管の動的挙動を標的としている。特に、微小管の動的挙動はチューブリンの異なる部位と結合することができる多くの作用物質により妨げられ得る。現在ではチューブリン上でのこれらの様々な作用物質の結合に関する構造データが取得されている。パクリタキセルで安定化させたチューブリンプロトフィラメントの亜鉛誘導シートをパクリタキセルが結合したチューブリンモデルの構築に使用している。このモデルを電子密度微小管図に適合させた後、著者らはパクリタキセルが微小管腔に面するβ−チューブリンと結合すると結論付けた（非特許文献２４）。タンパク質スタスミンと複合体を形成してチューブリンと結合したビンブラスチンのＸ線構造により、ビンブラスチンが２つのチューブリン分子の接点に楔を導入し、それによりチューブリンアセンブリに干渉することが分かっている（非特許文献２５）。
【００１１】
これらの研究によりこれまで、チューブリンに対する微小管毒の３つの結合部位が特徴付けられている：２つのα／β−チューブリン二量体間の接点に位置するニチニチソウのアルカロイドのドメイン、βサブユニット上に位置するタキソイド部位、及びαサブユニットとβサブユニットとの間の接点に位置するコルヒチン部位。
【００１２】
微小管を不安定化又は安定化させるかに従って、これらの様々な作用物質を分類する。
微小管を不安定化させる作用物質：
ニチニチソウアルカロイド（微小管を脱重合することのできる）を、異常な紡錘体により有糸分裂の際に細胞を停止させることのできる作用物質として特定している。続いて１９６０年代に、ビンクリスチン及びビンブラスチンが臨床薬に導入され、未だに精巣がん、ホジキン病又は急性リンパ性白血病の化学療法に広く用いられている。
【００１３】
微小管の重合を阻害するコルヒチン又はコンブレタスタチン、及びまたノコダゾールも言及され得る。
微小管を安定化させる作用物質：
タキサン、より具体的にはパクリタキセルがチューブリン１モル当たり約１モルのタキサンの化学量論で微小管と特異的かつ可逆的に相互作用する。この相互作用は微小管の安定化を伴い、そのため冷温（４℃）又はＣａ２＋イオンの存在によりｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導される脱重合に耐性になる。
【００１４】
パクリタキセル及び他のタキサンは、主に微小管で発揮される安定化効果により他の抗チューブリン毒とは区別される。パクリタキセル又はビンカ・アルカロイド等の抗がん剤はこれまでは反対の機構を介して働くと考えられてきた。現在ではこれらは微小管の全体量を増減させるのではなく微小管の動態を変更することにより作用することが知られている。特に乳がん、卵巣がん及び肺がんにおけるそれらの抗腫瘍有効性にかかわらず、増殖の際に非癌性細胞（造血細胞、粘液細胞等）の微小管にも作用するため、タキサンは極めて毒性が高い。最後にこれらは末梢ニューロンに悪影響を与え、重大な副作用を引き起こす可能性がある。
【００１５】
エポチロン及びディスコデルモリド等の微小管を安定化させる特性を示す他の天然産物の抗腫瘍特性に関してヒトの臨床試験において現在研究されている。
【００１６】
パクリタキセルの治療成果により、チューブリンを標的とする治療剤への探求に対する優位性が維持されている。これらの作用物質の臨床的成果を考慮すると、チューブリンは現在、抗がん化学療法における最も有効な標的の一つである（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８）。
【００１７】
しかしながら従来技術で知られている物質のほとんどは有益ではあるものの、理想的なものではない。それらには幾つかの副作用、主に骨髄抑制及び末梢神経毒性がある。チューブリン薬に関連する神経毒性の副作用は、チューブリンが細胞分裂だけでなく有糸分裂と独立した細胞骨格機能においても重要な因子であるので驚くべきことではない。さらに多くのがんがこれらの薬剤に本質的に耐性であるか、又は長期治療中に耐性になる。これは薬剤排出ポンプとして機能するＰ−糖タンパク質、又は他の薬剤排出ポンプ（例えば乳がん耐性タンパク質（ＢＣＲＰ））の過剰発現により引き起こされる多剤耐性の結果であることが多い。他の耐性原因としては、特定の薬剤があまり効果的に結合しないチューブリンアイソタイプの発現の増大、及びこれにより結合が低減される翻訳後修飾又は突然変異によるチューブリン構造の変化が挙げられる。
【００１８】
潜在的により効果的であり、かつ毒性の低い薬剤の開発のために幾つかの戦略が提案されている。その一つは既存の薬剤を改良すること又はチューブリンを標的とする新たな薬剤を見つけることである。
【００１９】
別のアプローチは、分裂細胞でのみ発現し、また阻害により有糸分裂が停止する他のタンパク質、例えば（such）有糸分裂チェックポイントタンパク質を標的とすることにある。様々なタンパク質ファミリーの成員（キナーゼ及びキネシン）が現在研究中である。これらのタンパク質の多くが、別々の段階の有糸分裂で非常に特殊化し、かつ特異的な機能を有すると考えられるため、これらのタンパク質の阻害により、チューブリンを標的とする既存の抗有糸分裂療法に比べて治療指数の改善が潜在的に可能であったと推測された。しかしながら、副作用が潜在的に低いという、新規の抗チューブリン剤の代わりに、紡錘体機能の特定の阻害因子の探求することの基礎をなす論拠は弱くなっている。一方で、有糸分裂における特異的な作用が知られているＡｕｒｏｒａ Ａ等のキナーゼが中間期の微小管骨格に対する効果を示すことが近年分かってきている。他方でこのことから、微小管毒の抗腫瘍効果の幾つかがチューブリン細胞骨格との中間期の相互作用にも起因し得る（非特許文献２９、非特許文献３０）。
【００２０】
チューブリン（又は微小管）を直接標的とする、又は微小管の動態を調節することができるタンパク質を標的とする微小管の動態を破壊する作用物質（非特許文献３１、非特許文献３２）の探求は依然として癌腫学における重要な問題となっている。
【００２１】
驚くべきことに出願人は、本発明による式（Ｉ）の化合物が従来技術で知られている化合物と比較して幾つかの利点を有することを見出している：
これらの化合物がＧｌｕ−チューブリンを生成すると共に、ノコダゾールにより誘導される脱重合に対する微小管ネットワークの耐性を誘導することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、これらの化合物はチューブリンとは直接作用しない。そのためこれらの化合物は微小管を安定化させるが、チューブリンと結合することができる他の既知の微小管を安定化させる化合物、例えばタキサン又はエポチロンとは異なる作用機序を有する。
これらの化合物は従来技術で知られている化合物よりも著しく毒性が低く、従来技術の化合物で観察される高い耐性の場合であっても活性である。
さらにこれらの化合物はアクチン細胞骨格に対する効果がある。アクチン細胞骨格は再組織化され、ラトランクリンにより誘導される脱重合に或る程度耐性となる。細胞の運動性が阻害される。このようにして細胞の運動性を阻害することにより、これらの化合物は腫瘍の遠隔播種を低減することができ、このためさらなる抗転移特性を有する。
このためこれらの化合物は、特に例えば他の治療（タキサン）に対する耐性の出現が観察される場合に、有益な代替治療を構成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Castillo et al., 2007
【非特許文献２】Kops et al., 2005
【非特許文献３】Jordan and Wilson, 2004
【非特許文献４】Niethammer et al., 2007
【非特許文献５】Barra et al., 1998
【非特許文献６】Lafanechere and Job, 2000
【非特許文献７】MacRae, 1997
【非特許文献８】Peris et al., 2006
【非特許文献９】Peris et al., 2009
【非特許文献１０】Gundersen et al., 1984
【非特許文献１１】Gundersen et al., 1987
【非特許文献１２】Wheland and Weber 1987
【非特許文献１３】Fonrose et al., 2007
【非特許文献１４】Vassal et al., 2006
【非特許文献１５】Andrieux et al., 2006
【非特許文献１６】Andrieux et al., 2002
【非特許文献１７】Begou et al., 2008
【非特許文献１８】Dermaut et al., 2005
【非特許文献１９】Garcia et Cleveland, 2001
【非特許文献２０】Ruthel et al., 2005
【非特許文献２１】Margalit et al., 2004
【非特許文献２２】Morrissette and Sibley, 2002
【非特許文献２３】Lafanechere, 2008
【非特許文献２４】Snyder et al., 2001
【非特許文献２５】Gigant et al., 2005
【非特許文献２６】Giannakakou et al., 2000
【非特許文献２７】Jackson et al., 2007
【非特許文献２８】Zhou and Giannakakou, 2005
【非特許文献２９】Pan and Snell, 2007
【非特許文献３０】Pugacheva et al., 2007
【非特許文献３１】Bhat and Setaluri, 2007
【非特許文献３２】Muller et al., 2007
【発明の概要】
【００２３】
したがって本発明の主題の一つは薬物としての式（Ｉ）の化合物である。
【００２４】
このため本発明の第１の主題は、以下の式（Ｉ）：
【００２５】
【化１】
【００２６】
（式中、
Ｒ１は水素原子、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個〜４個の炭素原子を有するアミノアルキル基、又はモノアルキルアミノアルキル基若しくはジアルキルアミノアルキル基（該２つのアルキル基が１個〜４個の炭素原子を有する）を表し、
Ｒ２は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒ３は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
−ＯＲ４はヒドロキシル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基若しくは式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚのアルコキシ基、若しくは１個〜４個の炭素原子を有するエステル基若しくは式−ＯＣ（Ｏ）Ｚのエステル基を表し、ここで
Ｚは３個〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基、又はフェニル基、ベンジル基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジル基及びオキサゾリル基から選択されるアリール基（該アリール基はハロゲン原子、−ＯＨ基、−ＮＯ２基又は−ＮＨ２基、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基及び１個〜４個の炭素原子を有するモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基から選択される、同一の又は異なる１つ、２つ又は３つの置換基によりオルト位、メタ位又はパラ位で必要に応じて置換されていてもよい）であり、
ｎは１〜４の範囲の、好ましくは１に等しい整数であり、又は
−ＯＲ４基は式：
【００２７】
【化２】
【００２８】
に対応し、ここで
ＶはＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＮ−アルキルから選択され、該アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有し、
ｎ’は２又は３に等しく、
Ｒ５は水素原子又はジアルキルアミノメチル基（ここで該アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有する）を表し、
Ｒ６は二重結合によりＤ環と結合した酸素原子、ハロゲン原子、又は１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ７は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒ８は水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、式
【００２９】
【化３】
【００３０】
のアルキルカルボキシアルキレン基、若しくは式
【００３１】
【化４】
【００３２】
のジアルキルホスフェートアルキレン基（ここで該アルキル基及び該アルキレン基が１個〜４個の炭素原子を有する）、又は１個〜４個の炭素原子を有するエステル基を表し、Ｒ６が二重結合によりＤ環と結合した酸素原子である場合にのみＲ８が存在する）に対応する薬物としての四環系化合物及びそれらの薬学的に許容される塩に関する。
【００３３】
上で規定された式（Ｉ）の化合物の幾つかは既に中間生成物として従来技術で説明されているが、これまでに薬物としては説明されていない（J.C.S. Perkin I, 1979, 7, 1706-1711、Tetrahedron, 1993, 49(4), 2915-2938、J. Med. Chem., 1983, 26, 181-185、特許出願（欧州特許第０ ３１７ ４１６号及び欧州特許第０ ０１０ ０２９号））。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物は以下の構造により表すことができる。
【００３５】
【化５】
【００３６】
本発明の式（Ｉ）の化合物は塩形態であってもよい。この場合、塩酸、臭化水素酸、マレイン酸又はメタンスルホン酸の塩が好ましい。
【００３７】
上記化合物の有益な用途のうち、がんの治療、転移の治療、及び他のタイプの疾患（例えば精神疾患、ウイルス疾患、寄生虫疾患又は真菌疾患）の治療に言及することができる。
【００３８】
驚くべきことに、上で規定された式（Ｉ）の化合物は、細胞に浸透すると共に、微小管及びマイクロフィラメントを安定化させることができ、それによりＧｌｕ−チューブリンの形成、微小管の動的挙動の減速、アクチンマイクロフィラメントの再組織化及び安定化（ラトランクリン誘導性の脱重合に対する幾らかの耐性により示される）が引き起こされる。これらの化合物は、タキサン若しくはエポチロン等の他の既知の微小管を安定化させる化合物、又はジャスプラキノリド等のアクチンフィラメントを安定化させる既知の化合物とは異なる作用機序を有する。
【００３９】
より具体的には、本発明による化合物は細胞の運動性の阻害と結び付いたアクチンフィラメントの再組織化を誘導し、本発明者らはこれより、ＬＩＭＫ１が式（Ｉ）の化合物の標的であり得ることを見出した。
【００４０】
本発明による化合物の構造原型は、オクロシア・エリプティカ（Ochrosia elliptica）から単離された精製アルカロイドであるエリプチシンのものと同様であり、以下の式に対応する。
【００４１】
【化６】
【００４２】
エリプチシン及びエリプチシン誘導体は或る特定のがんにおける抗がん活性及び細胞毒性に関して知られており（Dodion et al., 1982、Hayat et al., 1974、Juret et al., 1980、Le Mee et al., 1998、Paoletti et al., 1980、Tura et al., 1984）、それらの作用機序は主に、ＤＮＡ挿入、トポイソメラーゼＩＩ阻害、及びＰ４５０シトクロム及びペルオキシダーゼによるＤＮＡを有する共有結合付加体の形成の特性に応じて変わる。本発明による化合物とは異なり、エリプチシンは細胞微小管の安定化にも、アクチンマイクロフィラメントの安定化にも全く効果を有しない。
【００４３】
多くのエリプチシンの誘導体又は類似体が説明されている：
ＰＣＴ国際出願（国際公開第２００７／１３５５３８号）は、転移がん又は従来の細胞毒性を有する化学療法では治療することができないがんの治療のためのエリプチシン（ellipticium）誘導体（９−ヒドロキシエリプチシン）の使用を記載している。記載の化合物は、細胞の運動性の低減及び細胞接着性の回復を伴う、腫瘍細胞におけるアクチンの細胞骨格の再構築を誘導する。
【００４４】
欧州出願（欧州特許第０ ２０９ ５１１号）は、式：
【００４５】
【化７】
【００４６】
（式中、−Ａｌｋは低級アルキレン基を表し、−Ａｍはジ（低級アルキル）アミノ基を表す）の２−アミノアルキル−９−ヒドロキシエリプチシニウム誘導体の塩化物塩酸塩を記載しており、これらの化合物は抗腫瘍作用を有する医薬組成物における有効成分として使用することが可能である。
【００４７】
仏国出願（仏国特許第２ ８５９ ４７４号）は、細胞中でプレメッセンジャーＲＮＡをスプライシングするプロセスに関連する疾患を治療するため、より具体的にはプレメッセンジャーＲＮＡのスプライシングが変更された遺伝子疾患、例えば広範なスプライシングプロセスに作用する或る特定のがん（乳がん、結腸がん及び或る特定のリンパ腫）を治療するために使用することができる薬物の調製のためのインドール由来の化合物及びこのような化合物の使用を記載している。
【００４８】
これらの様々な文献に記載されている化合物とは構造が異なる本発明による化合物は驚くべきことに、微小管を安定化させる特性を有し、またアクチンネットワークを再組織化する特性も有し、或る程度までアクチンネットワークを安定化させると共に、主にＬＩＭＫ１阻害因子として作用する。
【００４９】
ＬＩＭＫ１（ＬＩＭキナーゼ１）はアクチン脱重合因子であるコフィリンをリン酸化させることによりアクチン重合を調節し、ＬＩＭＫ１はタンパク質ｐ２５をリン酸化させることにより微小管解離及び微小管（ＭＴ）不安定化の調節にも関与する。このためＬＩＭＫ１は微小管解離とアクチン重合との両方を連動させる（Gorovoy et al., 2005、Acevedo et al., 2007）。
【００５０】
そのためより正確には、ＬＩＭドメイン及びＰＤＺドメインを含有するセリン／トレオニンキナーゼであるＬＩＭＫ１は、セリン３上でコフィリンをリン酸化し、アクチン切断活性を不活性化することによりアクチン細胞骨格の調節において中心的な役割を果たす（Arber et al., 1998、Yang et al., 1998）。アクチン細胞骨格の重要性を考慮すると、ＬＩＭＫ１は多くの生物学的プロセス、具体的には細胞の形態及び運動性の調節において中心的な役割を果たす。
【００５１】
腫瘍細胞の転移表現型への進行中に、接触阻害の喪失から始まり、運動性が増大し、腫瘍細胞が原発腫瘍部位から移動し、遠隔臓器に浸潤して、血管新生を誘導し、転移を引き起こすという一連の変化が起こる（Yoshioka et al., 2003）。
【００５２】
腫瘍細胞が転移性になると、浸潤が促進するように、アクチン細胞骨格、細胞の形状及び運動性を制御する正常な機構が破壊される可能性がある。コフィリンのリン酸化におけるＬＩＭＫ１の役割を考慮すると、ＬＩＭＫ１は腫瘍の浸潤及び転移において中心的でかつ重要な役割を果たす。リン酸化コフィリンと非リン酸化コフィリンとの間のバランスにより腫瘍細胞の転移能が決定されることが提案されている。実際、リン酸化コフィリンの増大が観察された場合、ＬＩＭＫ１は悪性のメラノーマ細胞、乳がん腫瘍、前立腺腫瘍及び腫瘍細胞株で過剰発現することが分かっている（Scott and Olson, 2007、Wang et al., 2007）。
【００５３】
このため本発明による化合物は様々ながん株（株及び化合物に応じて１μＭ〜６０μＭ程度のＩＣ５０）、具体的に抗がん化学療法に用いられる薬剤（タキサン、ビンカ・アルカロイド、アントラサイクリン（antracyclines）等）に対する耐性機構を発達させた株に対する毒性がある。
【００５４】
したがって本発明による化合物は、特に現行の化学療法に耐性があるがんに、及び転移において有用である、新規の抗がん剤群を示す。
【００５５】
ＬＩＭＫ１阻害因子として作用する本発明の化合物はＬＩＭＫ１が関与する他の病態、例えば神経変性疾患（Bernard, 2007、Heredia et al., 2006）、原発性肺高血圧症（Scott and Olson, 2007）及び緑内障にも使用することができる。
【００５６】
有益には、Ｒ１基は水素原子である。しかしながらＲ１基は、式−（ＣＨ２）ｎ’’ＮＲ’Ｒ’’
（式中、
Ｒ’及びＲ’’（同一の又は異なる）は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
ｎ’’は１〜４と様々である）のジアルキルアミノアルキル基でもあり得る。
【００５７】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物はＲ２基が水素原子又はメチル基、より好ましくはさらにはメチル基である構造に対応する。
【００５８】
Ｒ３基に関しては、メチル基であるのが好ましい。
【００５９】
−ＯＲ４基は有利には、−ＯＨ基又はメトキシ基であり得る。
【００６０】
−ＯＲ４基が式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚのアルコキシ基又は式−ＯＣ（Ｏ）Ｚのエステル基である場合、該−ＯＲ４基は式−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５のベンジルエーテル基又は式−ＯＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５のエステル基であるのが好ましく、該基は−ＮＯ２基、−ＮＨ２基、−Ｎ（ＣＨ３）２基、−ＣＮ基、−ＣＨ２ＮＨ２基又は−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２基から選択される置換基によりオルト位、メタ位又はパラ位で任意に置換していてもよい。
【００６１】
−ＯＲ４基は上で規定されたような式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚのアルコキシ基及び式−ＯＣ（Ｏ）Ｚのエステルであるのが最も好ましい。
【００６２】
Ｒ５基は有利には、水素原子、又はＲ５基がジアルキルアミノアルキル基である場合、ジメチルアミノメチルであり得る。
【００６３】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物のＲ８基は水素原子である。
【００６４】
Ｒ６基は好ましくは二重結合によりＤ環と結合した酸素原子、又はハロゲン原子であり、より好ましくはさらには二重結合によりＤ環と結合した酸素原子である。
【００６５】
１つの好ましい実施の形態によれば、Ｒ６基は二重結合によりＤ環と結合した酸素原子を表し、Ｒ８基は水素原子を表し、この場合Ｒ６基を有する炭素原子とＲ８基を有する窒素原子との間の結合は単結合である。この場合、本発明による式（Ｉ）の化合物は以下の構造（Ｉｂ）に対応する。
【００６６】
【化８】
【００６７】
式（Ｉ）の化合物の中で、構造（Ｉｂ）の化合物がＬＩＭＫ１阻害因子として最も活性が高く、好ましくは該構造（Ｉｂ）の化合物の中で、
−ＯＲ４が上で規定したようにヒドロキシル基、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚの基、又は式−ＯＣ（Ｏ）Ｚの基を表し、
Ｒ１が水素原子であり、
Ｒ８が水素原子であるものが特に好ましいと思われる。
【００６８】
別の変形形態によれば、Ｒ６基はハロゲン原子、より好ましくは塩素原子、又は１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表す。
【００６９】
この場合、本発明による式（Ｉ）の化合物は以下の構造（Ｉａ）に対応する。
【００７０】
【化９】
【００７１】
最も好ましい実施の形態では、式（Ｉ）の化合物は、式：
【００７２】
【化１０】
【００７３】
又は式：
【００７４】
【化１１】
【００７５】
又は式：
【００７６】
【化１２】
【００７７】
又は式：
【００７８】
【化１３】
【００７９】
又は式：
【００８０】
【化１４】
【００８１】
に対応する。
【００８２】
本発明の別の主題は以下の特定の式（Ｉ）の化合物である。
【００８３】
【化１５】
【００８４】
本発明の別の主題は、有効成分としての少なくとも１つの上で規定した化合物と少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物である。
【００８５】
上記医薬組成物の１つの有益な実施の形態によれば、医薬組成物は別の抗がん有効成分も含む。
【００８６】
上記医薬組成物には固体形態の組成物（錠剤、ゲルカプセル、カプセル等）、及び液体形態の組成物（溶液、懸濁液又はエマルション）の両方が含まれ、経口投与、局所投与又は非経口投与に好適な賦形剤を含む。
【００８７】
本発明による化合物又は組成物の投与を経口経路で又は非経口経路（特にかん流又は静脈注射）で行うのが好ましい。好適な期間、通例２時間〜２４時間、好ましくは２時間〜１２時間にわたるかん流による投与が一般的には好ましい。
【００８８】
化合物の用量は選択される製剤、投与方法及び治療対象の腫瘍によって変わる。年齢、体重、身長又は性別等の他の因子、及び或る特定の生物学的パラメータ（排出率、他の薬物との関連性、アレルギー等）も考慮しなければならない。以下の実施例により、当業者が最も好適な用量を決定することが可能である。
【００８９】
本発明の別の主題は上で規定したような式（Ｉ）の化合物の微小管を安定化させる活性を評価する方法である。
【００９０】
スクリーニング試験はJ. Biomol. Screen（非特許文献１４）の刊行物の主題であったが、式（Ｉ）の化合物を評価するために適合させた。このため上記方法は以下を含む。
１．真核細胞を試験対象の化合物とインキュベートした後の、微小管ネットワークを保護するが脱重合したチューブリンの排出を可能にするバッファーによる細胞の透過処理、
２．細胞の固定後、Ｔｙｒ−チューブリンを抗チロシン化チューブリン一次抗体及び波長λ１で（例えば赤色領域（シアニン３）で）発光する二次抗体で標識化し、Ｇｌｕ−チューブリンを抗脱チロシン化チューブリン一次抗体及び波長λ２で（例えば緑色領域（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）で）発光する二次抗体で標識化した後の、特に単純なリーダーを用いた脱重合剤に最も感受性がある動的微小管及び安定化した微小管を同定するための様々な波長での蛍光の定量化、
３．細胞層の状態を評価するための核の補助的な標識化（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、
４．工程１と同じ条件下での試験対象の化合物とＨｅＬａ細胞とのインキュベーション、及び蛍光が波長λ２で（例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体と同じ波長で）観察される場合の化合物の選抜。これにより微小管に対する評価対象の化合物の実際の効果を可視化することにより微小管ネットワークの免疫蛍光分析を介して偽陽性を排除することが可能になり、実際に細胞を洗浄した後でも残存する凝集体の緑色標識化は微小管に特有のものではない。
５．ミトコンドリアに対するアジ化ナトリウムの効果と試験対象の化合物の効果とを比較することによるミトコンドリアの位置及び形状に対する効果の分析、及びミトコンドリアマーカー、例えばクロロメチル−Ｘ−ロザミン（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）マーカー）（ミトコンドリア膜を通って受動的に拡散し、活性ミトコンドリアに集積する特性を有する）を用いた標識化による、試験対象の化合物がアジ化ナトリウムと同様の作用機序を示す場合の試験対象の化合物の除外。
【００９１】
アジ化ナトリウムが安定化した微小管の生成を誘導し、これによりＧｌｕ−チューブリンを生成することができることが知られている（De Brabander et al., 1982、非特許文献１１）。アジ化ナトリウムはミトコンドリアの呼吸の阻害因子である。この現象の説明は酸化的リン酸化中に電子伝達を妨げることにより、この物質がＡＴＰ枯渇を引き起こすことである。これは特定されていない微小管の脱重合工程を妨げ、細胞におけるＧｌｕ−微小管の増大を引き起こす。
６．微小管ネットワークの動態に対する試験対象の化合物の効果を分析する工程。これに関して、ＨｅＬａ細胞を試験対象の化合物と２時間インキュベートした後、必要に応じて３０分間１０μＭのノコダゾールで処理する。それからノコダゾールにより誘導される脱重合に対する試験対象の化合物の考え得る保護効果を、微小管ネットワークの免疫蛍光標識化の分析、及びマイクロプレートリーダー又は顕微鏡分析を用いた定量化により明らかにする。
７．ＨｅＬａ細胞と試験対象の化合物とのインキュベーションを介した、アクチンネットワークに対する試験対象の化合物の効果を分析する工程。このインキュベーション工程は、アクチンネットワークの脱重合剤であるラトランクリンＢとの同時インキュベーション工程により必要に応じて延長される。最後にはフルオロフォア（λ２で発光、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）と結び付いたファロトキシンによるＦ−アクチンの標識化。アクチンネットワークが安定化する場合、アクチンネットワークのラトランクリン誘導性の脱重合が制限される。
【００９２】
チューブリンと同じようにアクチンもネットワークを形成する。これらのネットワークは細胞膜を機械的に支持するため、その形状及び可塑性を決定し、細胞を移動させ、粒子を取り込み、分裂するのを可能とする。アクチンネットワーク及び微小管ネットワークのそれぞれを標的とする特異的な物質があったとしても、これらのネットワークは密接に相互調節することが知られている。そのため、微小管に作用する或る特定の分子はアクチンネットワークにも影響を与える可能性がある（Baudouin et al., 2008、Enomoto, 1996、Mogilner and Keren, 2009）。
【００９３】
最後に本発明の別の主題は、具体的に
神経変性型の病変を予防及び／又は治療するため、より具体的にはアルツハイマー病及び統合失調症を予防及び／又は治療するための、
寄生虫病を予防及び／又は治療するため、より具体的にはマラリアを予防及び／又は治療するための、或いは
緑内障を予防及び／又は治療するための、
薬物として用いられる式（Ｉ）の化合物である。
【００９４】
別の用途は殺虫剤としての式（Ｉ）の化合物の使用でもあり得る。
【００９５】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＩＭＫ１の活性を阻害又は安定化させやすい分子をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＬＩＭＫ１を必要に応じて標識化された本発明による式（Ｉ）の化合物に接触させること、
（ｉｉ）試験対象の化合物を添加すること、及び
（ｉｉｉ）式（Ｉ）の化合物の試験対象の化合物による置き換えを評価すること、
を含む、方法にも関する。
【００９６】
式（Ｉ）の化合物が標識化されていない場合、工程（ｉｉｉ）の評価はＨＰＬＣ又は同様の方法で行われる。
【００９７】
式（Ｉ）の化合物が標識化されている（フルオロフォア、放射性標識化同位体、ビオチン化又は同様の標識化方法）場合、工程（ｉｉｉ）の評価は適切な固体支持体（例えばマイクロプレート）上で行われ、ラベルは該固体支持体上で測定される。ラベルの低減は試験対象の化合物が式（Ｉ）の化合物の競合因子であり、そのためＬＩＭＫ１阻害因子であることを示す。
【００９８】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで直接的若しくは間接的なＬＩＭＫ１活性化因子、又はホスファターゼ阻害因子をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物を真核細胞、好ましくはヒト細胞に接触させること、
（ｉｉ）ＬＩＭＫ１基質、例えばコフィリンのリン酸化の低減を測定することにより、上記式（Ｉ）の化合物の阻害効果を評価すること、
（ｉｉｉ）試験対象の化合物を添加すること、及び
（ｉｖ）ＬＩＭＫ１基質のリン酸化の阻害に対する試験対象の化合物の効果を測定すること、
を含む、方法にも関する。
【００９９】
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）を別々に又は同時に行うことができる。
【０１００】
工程（ｉｖ）はＬＩＭＫ１基質のリン酸化レベルを測定すること、及び測定されたＬＩＭＫ１基質のリン酸化レベルを工程（ｉｉ）で得られた測定レベルと比較することからなる。
【０１０１】
リン酸化が回復又は増大する場合、試験対象の化合物はＬＩＭＫ１の直接的若しくは間接的な活性化因子、又はホスファターゼ阻害因子である。
【０１０２】
上述の構成の他に、本発明は以下の残りの記載から明らかとなる他の構成も含む。該残りの記載は本発明による式（Ｉ）の四環系化合物の安定化特性に注目した実施例及び添付の図面にも関する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】チューブリンの脱チロシン化／チロシン化サイクルに対応する図である。
【図２】ＨｅＬａ細胞の微小管に対するノコダゾールの脱重合効果を示す図である。
【図３】低温での微小管の安定性に対する本発明の化合物１の効果を示す図である。ＨｅＬａ細胞をパクリタキセルと又はパクリタキセルではなく本発明の化合物１と２時間インキュベートした後、４℃に３０分間曝露する。本発明の化合物１で処理した細胞におけるチューブリンの量をマイクロプレートリーダーを用いて測定した後、パクリタキセルで処理した細胞の入ったウェルで測定されたチューブリンの量（１００％）の百分率として報告する。
【図４】本発明の化合物１で処理したＨｅＬａ細胞の微小管に対するノコダゾールの効果を示す図である。ＨｅＬａ細胞をパクリタキセルと又はパクリタキセルではなく本発明の化合物１と２時間インキュベートした後、３０分間ノコダゾールに曝露する。本発明の化合物１で処理した細胞におけるチューブリンの量をマイクロプレートリーダーを用いて測定した後、パクリタキセルで処理した細胞の入ったウェルで測定されたチューブリンの量の百分率として報告する。
【図５】ｉｎ ｖｉｔｒｏで精製されたチューブリンのアセンブリに対する本発明の化合物１の効果をパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））の効果と比較した図である。精製されたチューブリン（１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で、ＧＴＰ（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ）、ＤＡＰＩ（１０μＭ）の存在下においてＰＥＭバッファー中でインキュベートする。様々な濃度（× ２５μＭ、◎ ５０μＭ及び△ １００μＭ）で本発明の化合物１の効果をパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（■）及びＤＭＳＯ（□）の効果と比較する。
【図６】アクチンネットワークに対するラトランクリンＢにより誘導される脱重合に関する化合物１の保護効果を示す図である。
【図７】ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に対する本発明の化合物１の毒性を示す図である。細胞を様々な濃度の本発明の化合物１で４８時間処理し、細胞の生存率をＭＴＴ試験を用いて測定した。
【図８】Ｇｌｕ−微小管の位置及び形態に対する化合物１の効果を示す図である。
【図９】ミトコンドリアの位置及び形態に対する化合物１の効果を示す図である。
【図１０】化合物１によるＬＩＭＫ１の阻害を示す図である。
【図１１】化合物１によるＬＩＭＫ１の用量依存的な阻害を示す図である。
【図１２】化合物１によるＬＩＭＫ１のラインウェーバー・バーク阻害プロットを示す図である。
【図１３】化合物１によるＬＩＭＫ１阻害のｉｎ ｖｉｔｒｏでの可逆性を示す図である。
【図１４】ＨｅＬａ細胞における化合物１により誘導されたコフィリンのＳｅｒ３におけるリン酸化の阻害の可逆性の分析を示す図である。
【図１５】化合物１による細胞のＬＩＭＫ１活性の用量依存的な阻害を示す図である。
【図１６】ＨｅＬａ細胞における化合物１によるｓｅｒ３におけるコフィリンのリン酸化の阻害の動態分析を示す図である。
【図１７】従来技術の化合物Ｃ６及び化合物Ｃ８と比較した本発明の化合物１（Ｈ０６）のＬＩＭＫ１に対する相対的活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
実施例１：生成物の特性決定
シリカカラムクロマトグラフィ：
シリカカラムクロマトグラフィを行う。
【０１０５】
予め所定の溶媒／溶離液の懸濁液中に入れられた、０．０４０μｍ〜０．０６３μｍ厚のシリカゲル（Merck）上でクロマトグラフィを行う（シリカの量は精製される粗反応混合物の量の１０倍〜１００倍に相当していなければならない）。分離させる生成物の混合物を最小量のシリカゲル上に吸着させるか、又は最小量の溶媒中に溶解し、カラムの最上部に慎重に堆積させた後、好適な溶離液を用いてクロマトグラフィを行う。
【０１０６】
表Ｉの化合物１〜化合物６及び化合物９〜化合物１１を合成すると共に評価した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
化合物１〜化合物６及び化合物９は合成の中間体として文献に記載されている。
化合物１：９−ベンゾイルオキシ−５，１１−ジメチル−２Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Med. Chem., 1983, 26, 181に記載及び公開されているように合成する。
化合物２：９−メトキシ−５，１１−ジメチル−２Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706、及びTetrahedron, 1993, 2915に記載及び公開されているように合成する。
化合物３：９−ベンジルオキシ−５，１１−ジメチル−２Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に記載及び公開されているように合成する。
化合物４：９−ヒドロキシ−５，１１−ジメチル−２Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Med. Chem., 1983, 26, 181に記載及び公開されているように合成する。
化合物５：１−クロロ−９−メトキシ−５，１１−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706、及びTetrahedron, 1993, 2915に記載及び公開されているように合成する。
化合物６：１−クロロ−９−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に記載及び公開されているように合成する。
化合物７：９−ベンジルオキシ−１−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
【０１０９】
【化１６】
【０１１０】
臭化ベンジル（２３０μｌ、１．９ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（６ｍｌ）を１−クロロ−９−ヒドロキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（化合物１０）（４９０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）、アセトン（７ｍｌ）、ＤＭＦ（２ｍｌ）及びＫ２ＣＯ３（４００ｍｇ）を含有する混合物に室温で１５分かけて添加する。アセンブリを２４時間攪拌した後、続いて溶媒を真空下で蒸発させる。それから水を添加する（３０ｍｌ）。
【０１１１】
再びアセンブリを２４時間攪拌する。固形物を濾過により回収し、水で洗浄した後、室温で１８時間乾燥させる。溶離液としてジクロロメタン／酢酸エチル（９９％／１％から９５％／５％まで）を用いたシリカカラムによるクロマトグラフィ後に、中間体として１−クロロ−９−ベンジルオキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（３３０ｍｇ、収率５１％）が得られる。
【０１１２】
得られた生成物はJ. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に記載の方法に従って得られたものと同一である。
【０１１３】
上で得られた１−クロロ−９−ベンジルオキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（３２０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（７ｍｌ）及びナトリウムメトキシド（メタノール中、３０％溶液、１０ｍｌ）の混合物を２０時間加熱還流する。反応混合物を６０ｍｌの水に注いだ後、２時間攪拌する。濾過により回収した形成固体を水で洗浄した後、乾燥させる。
【０１１４】
溶離液としてジクロロメタン／酢酸エチル（９９．５％／０．５％から９９％／１％まで）を用いたシリカカラムによるクロマトグラフィ後に、２８０ｍｇ（収率８８％）の期待化合物９−ベンジルオキシ−１−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（化合物７）が得られる。
【０１１５】
化合物７のプロトンＮＭＲスペクトルは以下の通りである：
ＣＤＣｌ３ δ（ｐｐｍ）：８．８７（ｓ，１Ｈ）、８．００（ｄ，１Ｈ）、７．８８（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．８０（ｄ，１Ｈ）、７．５５〜７．３３（ｍ，８Ｈ）、５．２１（ｓ，２Ｈ）、４．２２（ｓ，３Ｈ）、２．７６（ｓ，３Ｈ）。
微量分析：
Ｃ２４Ｈ２０Ｎ２Ｏ １．７５Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ、７２．０９；Ｈ、５．８８；Ｎ、７．０１；
実測値：Ｃ、７２．２２；Ｈ、５．５１；Ｎ、７．１８。
化合物８：１，９−ジメトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
【０１１６】
【化１７】
【０１１７】
１−クロロ−９−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に従って調製した）（４２７ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）及びナトリウムメトキシド（メタノール中、３０％溶液、３ｍｌ）の混合物を２４時間加熱還流する。それから反応混合物を５０ｍｌの水に注いだ後、２時間攪拌する。濾過により回収した形成固体を水で洗浄した後、乾燥させる。
【０１１８】
溶離液としてジクロロメタン／エタノール（９９％／１％から９８％／２％まで）を用いたシリカカラムによるクロマトグラフィ後に、４００ｍｇ（収率９５％）の期待化合物１，９−ジメトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（化合物８）が得られる。
【０１１９】
化合物８のプロトンＮＭＲスペクトルは以下の通りである：
ＣＤＣｌ３ δ（ｐｐｍ）：８．８５（ｓ，１Ｈ）、７．９８（ｄ，１Ｈ）、７．９１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．６８（ｄ，１Ｈ）、７．４１（ｄ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，１Ｈ）、７．１１（ｄｄ，１Ｈ）、４．２１（ｓ，３Ｈ）、３．９５（ｓ，３Ｈ）、２．７２（ｓ，３Ｈ）。
微量分析：
Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ２ ０．５Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ、７１．７９；Ｈ、５．６５；Ｎ、９．３０；
実測値：Ｃ、７１．８４；Ｈ、５．４９；Ｎ、９．１２。
化合物９：９−ベンジルオキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に記載及び公開されているように合成する。
化合物１０：１−クロロ−９−ヒドロキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールの合成
５ｍｌ容の封管において、１−クロロ−９−メトキシ−５−メチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）（J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706に従って調製した）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（２２５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）及び３７％塩酸（４ｍｌ）の混合物を１４０℃の油浴で２４時間加熱する。
【０１２０】
それから反応混合物を真空下で蒸発させた後、２０ｍｌの水を添加する。それから媒体を２８％水酸化アンモニウム（０．５ｍｌ）の添加により塩基性にし、固体を低温濾過により回収した後、水で洗浄し、２００℃の温度で１８時間、減圧デシケーターを用いて乾燥させる。
【０１２１】
それにより６５ｍｇ（収率９０％）の化合物１０が得られる。化合物１０のプロトンＮＭＲスペクトルは以下の通りである：
ＤＭＳＯ−ｄ６ δ（ｐｐｍ）：１１．３０（ｓ，１Ｈ）、９．２１（ｓ，１Ｈ）、８．８７（ｓ，１Ｈ）、８．１６（ｄ，１Ｈ）、７．９８（ｄ，１Ｈ）、７．７１（ｄ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ）、７．０７（ｄｄ，１Ｈ）、２．８３（ｓ，３Ｈ）。
微量分析：
Ｃ１６Ｈ１１ＣｌＮ２Ｏ ０．２５Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ、６６．９１；Ｈ、４．０４；Ｎ、９．７５；
実測値：Ｃ、６６．９９；Ｈ、４．２６；Ｎ、９．３４。
化合物１１：９−ヒドロキシ−２，５，１１−トリメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンの合成
１−クロロ−９−メトキシ−５，１１−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール（２５０ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）（化合物５、参考文献J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706、及びTetrahedron, 1993, 2915に従って調製した）、アセトニトリル（５０ｍｌ）及びヨードメタン（１０ｍｌ）の混合物を６５℃の温度で３時間加熱する。
【０１２２】
それから得られた混合物を真空下で蒸発させた後、３０ｍｌの３Ｎ 水酸化ナトリウムを添加する。それから混合物を３０分間攪拌する。得られた赤レンガ色の固体を濾過により回収した後、水で洗浄し、室温で１８時間乾燥させる。
【０１２３】
それにより中間体９−メトキシ−２，５，１１−トリメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オンが得られ、それをそのまま全く精製せずに用いる。
【０１２４】
上で得られた中間体化合物９−メトキシ−２，５，１１−トリメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−オン及びピリジン塩酸塩（２ｇ）を含む混合物を３０分間加熱還流する。
【０１２５】
得られた溶液を６０ｍｌの氷水に注いだ後、形成固体を低温濾過により回収し、２つの５ｍｌの水で洗浄した後、１８時間、２０℃の温度で減圧デシケーターを用いて乾燥させる。
【０１２６】
それから固体を２０ｍｌのトルエンに混合した後、５分間沸騰し、その後２０℃に冷却する。
【０１２７】
それにより１３０ｍｇ（収率５５％）の化合物１１が得られ、これを濾過により回収し、２つの５ｍｌのトルエンで洗浄した後、１８時間、室温で乾燥させる。化合物１１のプロトンＮＭＲスペクトルは以下の通りである：
ＤＭＳＯ−ｄ６ δ（ｐｐｍ）：１１．０７（ｓ，１Ｈ）、９．０１（ｄ，１Ｈ）、７．６９（ｄ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，１Ｈ）、６．９５（ｄｄ，１Ｈ）、６．６８（ｄ，１Ｈ）、３．４５（ｓ，３Ｈ）、３．３９（ｓ，３Ｈ）、２．５９（ｓ，３Ｈ）。
微量分析：
Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ２ １．３３Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ、６８．３５；Ｈ、５．９０；Ｎ、８．８６；
実測値：Ｃ、６８．２２；Ｈ、５．７４；Ｎ、９．２７。
本発明の範囲外の化合物の合成：
化合物Ｃ６：J. Med. Chem., 1980, 181に記載及び公開されているように合成する。
【０１２８】
【化１８】
【０１２９】
化合物Ｃ８：この化合物を、J. Med. Chem., 1983, 181に記載及び公開されているように、Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミンの代わりにＮ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン中で９−ベンゾイルオキシ−１−クロロ−５，１１−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾールを還流することにより得た。
【０１３０】
【化１９】
【０１３１】
実施例２：材料及び方法
１）細胞株
株の名称、参照番号及び起源を以下の表ＩＩに挙げる。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
２）一次抗体
用いられる一次抗体を以下の表ＩＩＩに挙げる：
【０１３４】
【表３】
【０１３５】
３）二次抗体
用いられる二次抗体は以下の通りである：
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
４）細胞生物学
細胞培養：
全ての株を３７℃及び５％ ＣＯ２で加湿インキュベーターにおいてＴ７５フラスコ中の１５ｍｌの培養培地で増殖させる。培養物を維持するために、コンフルエントに達したら、細胞を０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco, Invitrogen）の溶液を用いて解離させることにより細胞を分割し、１／５〜１／２０と様々な希釈率で再播種する。細胞特性の任意の推移（drift）及び変動を避けるために、或る特定数の継代培養後にこれらの細胞が分裂を停止するので、６回の継代培養を越えて使用することが勧められないＭＥＦ株（初代細胞）を除いて、これらの株は最大で２０回の継代培養に使用する。
【０１３８】
ＨｅＬａ株、ＮＣＩ−Ｈ４６０株及び７８６−Ｏ株を１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、Hyclone, Thermo Fisher Scientific）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco, Invitrogen）を添加したＧｌｕｔａＭＡＸＩ（商標）（Gibco, Invitrogen）を有するＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させる。
【０１３９】
ＭＣＦ−７株を１０％ ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び０．１ｍｇ／ｍｌのインスリン（Sigma Aldrich）を添加したＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中で増殖させる。
【０１４０】
ＭＥＳ−ＳＡ株及びＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５株を１回目の継代培養では１０％ ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したマッコイ５Ａ（ＡＴＣＣ）中で、その後１０％ ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させる。
免疫蛍光：
チューブリン（Ｔｙｒ、Ｇｌｕ）及び核の染色：
ガラスカバースリップ上で２日間増殖させた細胞をＯＰＴバッファー（Ｐｉｐｅｓ ８０ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＭｇＣｌ １ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５％及びグリセロール １０％（ｐＨ６．８））を用いて又は用いずに３７℃で３分間インキュベートした後、予め−２０℃で１０分間維持したメタノール中で固定した。それから細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で洗浄し、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３の溶液で希釈した適切な一次抗体（表ＩＩＩの抗体を参照されたい）を用いて室温で最低１５分間インキュベートする。その後、細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄する。細胞を、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３で希釈した二次抗体（表ＩＶの抗体を参照されたい）と１μｇ／ｍｌの最終濃度のＨｏｅｃｈｓｔとの溶液を用いて室温で１５分間インキュベートする。最後に、細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した後、純粋なエタノールで脱水し、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（商標）マウンティング（mounting）溶液（Calbiochem, Merck）を用いてスライドに固定する。
アクチンの染色：
チューブリン染色と同じように、細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、インキュベートする。培地の除去後、細胞を温かいＰＢＳで洗浄した後、３７℃で３０分間ＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒドの溶液を添加することにより固定する。細胞をＰＢＳで洗浄した後、室温で１５分間、ＰＢＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００の溶液を用いて透過処理する。さらにＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で３０分間、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡの溶液を用いてインキュベートする。それから細胞を室温で２０分間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Molecular Probes, Invitrogen）で標識化したファロイジン（０．１６５μＭの最終濃度）を用いてインキュベートする。もう１度細胞をＰＢＳで洗浄した後、純粋なエタノールで脱水する。最後に、細胞をＦｌｕｏｒｓａｖｅ（商標）マウンティング溶液を用いてスライドに固定する。
ミトコンドリアの染色：
チューブリン染色と同じように、細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、３７℃で５％ ＣＯ２下でインキュベートする。播種後３日目に、２５０ｎＭの最終濃度に到達させるために、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Molecular Probes, Invitrogen）を培養培地に添加する。それから細胞を３７℃で３０分間、５％ ＣＯ２下でインキュベートする。このマーカーが細胞膜を通じて受動的に拡散し、活性ミトコンドリアに集積する。培地の除去後、細胞を温かい媒体で洗浄した後、３７℃で３０分間ＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒドの溶液を添加することにより固定する。他の免疫蛍光染色が必要な場合、細胞をＰＢＳでリンスした後、室温で１５分間、ＰＢＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００の溶液を用いて透過処理することができる。
【０１４１】
５）顕微鏡検査
顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ ５０、Zeiss, Oberkochen, Germany）、並びに１００×／１．３ Ｐｌａｎ Ｎｅｏｆｌｕａｒ対物レンズ、ＣｏｌｏｌＳｎａｐ ＥＳ電荷結合素子カメラ（Roper Scientific, Trenton, NJ, USA）及びＭｅｔａｖｉｅｗ（Universal Imaging Corp.）ソフトウェアを用いて蛍光画像を撮影し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて処理した。
【０１４２】
代替的には、スライドを様々な蛍光顕微鏡で又は共焦点顕微鏡を用いて読み取る。
６）細胞培養試験
（細胞株に応じて）２×１０５細胞／ｍｌ〜５×１０５細胞／ｍｌの細胞溶液を１００μｌ／ウェル播種した後、細胞培養試験を透明な９６ウェルマイクロプレート（Greiner）で行う。５％ ＣＯ２下で３７℃で２４時間インキュベートした後、培養培地を取り除き、様々な濃度の試験対象の分子の溶液に置き換える。細胞を５％ ＣＯ２下で３７℃でさらに４８時間、これらの分子を用いてインキュベートする。培地の除去後、細胞をブランク（blank）ＲＰＭＩ（Gibco, Invitrogen）で洗浄した後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドすなわちＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度）と共に５％ ＣＯ２下で３７℃で４時間インキュベートする。ＭＴＴ（Sigma Aldrich）は、ミトコンドリア酵素の活性を測定することにより、細胞の生存率を推定することが可能である。実際、生細胞では、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼはテトラゾリウム環を切断することが可能であり、これにより水性媒体に不溶であるホルマザン結晶が形成される。可溶化溶液（イソプロパノール、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１Ｎ ＨＣｌ）を添加してこれらの結晶を溶解する。攪拌後、吸光度をＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡマイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍで測定する。
【０１４３】
７）マイクロプレートにおいて微小管を安定化又は不安定化する分子の検出を可能にする試験
４００００細胞／ｍｌの細胞溶液を１ウェル当たり９０μｌ分配することにより、ＨｅＬａ細胞を底が黒色のブラック９６ウェルマイクロプレート（Greiner ６５５０８６）で播種し、５％ ＣＯ２下で３７℃でインキュベートする。２４時間後、５％ ＣＯ２下で３７℃で２時間、試験対象の分子と共に細胞をインキュベートする。それから細胞を３７℃で６分間、温かいＯＰＴバッファーを用いて透過処理した後、室温で１０分間メタノールで固定する。細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で２回リンスし、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３の溶液で１／４０００に希釈した一次抗体ＹＬ１／２及びＬ４（表ＩＩＩの抗体を参照されたい）と共に３７℃で一晩インキュベートする。それから細胞をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した後、１μｇ／ｍｌの最終濃度のＨｏｅｃｈｓｔと、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３で１／５００及び１／１０００でそれぞれ希釈した抗ラットシアニン３二次抗体及び抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体との溶液を用いて３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄後、ＰＢＳ／５０％グリセロールをそれぞれのウェルに分配する。様々な蛍光強度をＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡリーダーを用いて測定する。
【０１４４】
８）アクチン細胞骨格に対する作用に関する試験：細胞においてラトランクリンＢにより誘導される脱重合に対するアクチンネットワークの安定性を評価するプロトコル
実験の３日前に、ガラスカバースリップを滅菌条件下で２４ウェルマイクロプレートに置く。それぞれのウェルで、指数増殖期にあるＨｅＬａ細胞（１つのウェル当たり１５０００個の細胞）を５００μｌのＲＰＭＩ培地に播種する。
【０１４５】
試薬：
ストック試薬：
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、参照番号Ｐ４４１７、Sigma）、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、参照番号Ａ３０５９、Sigma）、−２０℃で保存した１５ｍｌのアリコート；ＰＢＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（参照番号Ｔ８７８７、Sigma）；ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（参照番号Ｐ９９１６、Sigma）；ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３（ＮａＮ３に関する参照番号６６８８、Merck）、−２０℃で保存した１５ｍｌのアリコート。
ファロイジンＡ４８８（参照番号Ａ１２３７９、Invitrogen）。
Ｌ４：ウサギ抗脱チロシン化チューブリンポリクローナル抗体（非特許文献１３を参照されたい）。
シアニン３に連結した抗ウサギ抗体（参照番号１１１．１６５．１４４、Jackson Laboratories）。
１ｍｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ Ｈ ３３２５８、参照番号Ｂ２８８３、Sigma）の再蒸留水ストック溶液。
Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（登録商標）マウンティング液（参照番号３４５７８９、Calbiochem）。
エタノール（参照番号４１４−５８７、Carlo Erba）。
同じ日に調製するもの：
ラトランクリンＢ（参照番号Ｌ５２９８、Sigma）５μＭ：５００μｌのＲＰＭＩ中、５μｌの５００μＭ ラトランクリン。
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、参照番号Ｄ５８７９、Sigma）０．２５％：１０００μｌのＲＰＭＩ中、２．５μｌの純粋なＤＭＳＯ。
パクリタキセル（参照番号Ｔ１９１２、Sigma）５μＭ：１０００μｌのＲＰＭＩ中、５μｌの１ｍＭ パクリタキセル。
試験対象の化合物（２５μＭ、最終濃度）：１０００μｌのＲＰＭＩ中、１０ｍＭ（ＤＭＳＯ中で）の濃度の２．５μｌの化合物。
ＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒド：１．２ｍｌの３７％ホルムアルデヒド（参照番号Ｆ１６３５、Sigma）＋１２ｍｌのＰＢＳ（用時（extemporaneously）調製する）。
ファロイジンＡ４８８をＰＢＳ／１％ ＢＳＡで０．１６５μＭの濃度まで希釈する。
ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３でＬ４一次抗体を１／４０００まで希釈する。
ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３で抗ウサギシアニン３二次抗体を１／１０００まで希釈する。
ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ／０．０２％ ＮａＮ３でＨｏｅｃｈｓｔを１／１０００（＝１μｇ／ｍｌ）まで希釈する。
考え得る凝集体を排除するため、１５０００ｇで１０分間これらの様々な希釈生成物を遠心分離する。
試験の実施：
それぞれのウェルに試験対象の化合物を２５μＭの濃度で添加する。０．２５％ ＤＭＳＯ及び５μＭ パクリタキセルを対照として用いる。全ての条件を二連で行う。
細胞インキュベーター（湿潤雰囲気下で３７℃、５％ ＣＯ２）において２時間インキュベートする。
２時間のインキュベーションの終了時に、１０μｌの５μＭ ラトランクリンを２つのウェルごとに添加する（ラトランクリンの最終濃度：０．１μＭ）。
インキュベーションを１０分間続けた後、細胞を固定し、脱チロシン化チューブリンの免疫染色及びアクチンの染色を行う。
細胞の固定、並びに脱チロシン化チューブリン及びアクチンネットワークの染色：
細胞を３７℃で５００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄した後、３７℃で予熱したＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒド（５００μｌ／ウェル）を用いて３７℃で３０分間インキュベートすることにより固定する。
３７℃で３０分間のインキュベーション。
以下の工程を室温で行う。
ＰＢＳ／３．７％ホルムアルデヒドの吸引。
５００μｌ／ウェルのＰＢＳによる３回の洗浄。
それからカバースリップをピンセットを用いて回収し、好適な支持体上に置く。
ＰＢＳ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００による透過処理（１００μｌ／カバースリップ）。
それからカバースリップをＰＢＳで３回洗浄する。
３０分間のＰＢＳ／１％ ＢＳＡ（１００μｌ／カバースリップ）による飽和。
それからカバースリップをＰＢＳで３回洗浄する。
２０分間の０．１６５μＭの蛍光ファロイジンＡ４８８（５０μｌ／カバースリップ）を用いたインキュベーション。
それからカバースリップをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
１５分間の１／４０００に希釈したＬ４一次抗体（５０μｌ／カバースリップ）を用いたインキュベーション。
それからカバースリップをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
１５分間の抗ウサギシアニン３蛍光二次抗体（１／１０００）及びＨｏｅｃｈｓｔ（１／１０００）（５０μｌ／カバースリップ）を用いたインキュベーション。
それからカバースリップをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
カバースリップを１００％エタノール浴に浸漬することによる調製物の脱水。
Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（登録商標）マウンティング溶液（Calbiochem, Merck）を用いてカバースリップをスライドに固定する。
【０１４６】
９）ＬＩＭＫ１キナーゼアッセイ
放射ＬＩＭＫ１アッセイにおいて、３μｌの化合物又は対照として同量のＤＭＳＯと、２μｌ（１ｎｇ）のＮ末端６Ｈｉｓタグ付け組換えヒトＬＩＭＫ１（Millipore ＃１４−６５６、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ＝７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＮＰ−４０、５％グリセロール、０．１％ β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン中で）と、８μＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ＝７．０）、２００μＭ ＥＤＴＡ、７０μＭの組換えＧＳＴ−コフィリン１、２５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２及び３６０μＭ ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを含有する混合物とを含有する２５μｌの最終容量で化合物を試験した。アッセイを３０℃で１０分間行った後、５μｌの３％オルトリン酸の添加により停止させた。それから２５μＬのアリコートをＰ８０の四角いフィルター（４ｃｍ２）上にスポットした。フィルターを０．５％オルトリン酸により４℃で５分間、３回リンスし、シンチレーションバイアルに移した。シンチレーションカクテル（Ultima Gold, Perkin-Elmer）を添加した後、シンチレーションカウンターを用いて３２Ｐの取り込みを測定した。
【０１４７】
１０）ＬＩＭＫ１阻害可逆性アッセイ
Ｎ末端６Ｈｉｓタグ付け組換えヒトＬＩＭＫ１（Millipore ＃１４−６５６、６２．５ｎｇ）を２５μＭの化合物１（又は同量のＤＭＳＯ）と共に１００μＬの最終容量で４℃で１０分間、インキュベートした。その後この混合物のサイズ排除クロマトグラフィを１ｍｌのＢｉｏｓｐｉｎ Ｐ−６カラム（Biorad、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ＝７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＮＰ−４０、５％グリセロール、０．１％ β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンで平衡化した）を用いて行った。それからｉｎｐｕｔ及びｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈにおけるＬＩＭＫ１キナーゼ活性を放射ＬＩＭＫ１キナーゼアッセイにより検査した。
【０１４８】
１１）細胞のＬＩＭＫ１活性アッセイ
指定の濃度及び時間でＨｅＬａ細胞を化合物（又は対照として同量のＤＭＳＯ）により処理した。全細胞抽出物をプロテアーゼ阻害因子（Sigma、Ｐ８３４０）及びホスファターゼ阻害因子（Sigma、Ｐ５７２６）を添加したＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）を用いて調製した。約３０マイクログラムのタンパク質を１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに投入し、泳動させた。電気泳動後、ニトロセルロース膜をＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、５％ウシ血清アルブミンで飽和させた（satured）。ポリクローナル抗体である抗コフィリン（Cytoskeleton、＃ＡＣＦＬ０２）及び抗ホスホコフィリン（Ｓｅｒ３）（Cell Signaling、＃３３１１）を用いてコフィリンの量及びリン酸化状態を推定した。結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Biosource、＃ＡＬＩ０４０４）を二次抗体として用いた。ＥＣＬ ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（GE Healthcare）を用いて検出を行った。
【０１４９】
実施例３：本発明の式（Ｉ）の化合物の安定化特性の実証
生細胞において、微小管は集合化段階と解離段階との間を行き来する動的構造である。微小管ネットワークに対する分子の安定化効果を評価するために、様々なタイプの試験を行うことができる。このため、パクリタキセルと微小管との結合、又はＳＴＯＰタンパク質等の安定化タンパク質と微小管との結合（Bosc et al., 2003）が微小管ネットワークを４℃での細胞のインキュベーションにより誘導される脱重合から保護することができる。さらに、微小管の動態を遅らせることのできる分子を、ノコダゾールにより誘導される脱重合に対する細胞微小管の耐性を分析することにより同定することができる。安定化化合物がなければ、微小管はノコダゾールの存在下で脱重合する（図２）。
【０１５０】
これらの様々な試験を用いて、細胞微小管に対する本発明の化合物１の安定化効果をパクリタキセルのものと比較している。これらの実験は、この化合物が微小管を低温により誘導される低温誘導性の脱重合から保護することはできないが（図３）、用量依存的にノコダゾール誘導性の脱重合を防ぐことを示している（図４）。そのためこの化合物は微小管の動態を遅らせることができる。
【０１５１】
上記の表Ｉは顕微鏡を用いた二重盲検評価により定性基準に従って、本発明による化合物の安定化特性を要約している。
実施例４：エフェクターによる本発明の化合物１の安定化効果
例えばパクリタキセルがそうであるようにチューブリンに対する直接的な作用を介して、又はエフェクターによって本発明の化合物１が安定化効果を示すかを知るために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの微小管におけるチューブリンのアセンブリに対する本発明の化合物１の効果を分析している。第１の実験を精製チューブリン（１ｍｇ／ｍｌ）で行った。パクリタキセルだけがこれらの条件下でチューブリンのアセンブリを誘導することができる。試験した濃度に関係なく本発明の化合物１ではアセンブリは観察されない（図５）。この結果は、おそらくこの化合物の安定化効果がこれらの分子とチューブリンとの直接的な相互作用によるものではなく、そのためこの化合物は独自の作用機序を有することを示す。
実施例５：アクチンに対する本発明による化合物の効果
本発明による化合物の別の効果は、細胞移動を大幅に遅らせることができることである。この効果は、実施例３に規定のように免疫蛍光実験により特徴付けされたアクチン細胞骨格に対する作用によるものである。しかしながら、チューブリンと同じように、アクチン細胞骨格に対する化合物の効果はアクチンの重合に対する直接的な効果によるものではない。図６は本発明の化合物１で得られた結果を示し、これはこの化合物がアクチンネットワークをラトランクリンＢによる脱重合から保護することを示す（図６）。ＤＭＳＯもパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））もこのような保護効果を誘導することはできない。
【０１５２】
共焦点顕微鏡を用いて観察を行う。
【０１５３】
これらの条件下で、アクチンネットワークが安定化しなければ（ＤＭＳＯ又はパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）））、ラトランクリンはアクチンネットワークのほぼ完全な脱重合を誘導する。化合物１はアクチンネットワークの再組織化を誘導し、アクチンネットワークをラトランクリンβ誘導性の脱重合から部分的に保護する。
【０１５４】
これらの条件下で、微小管ネットワークが安定化する場合、ＤＭＳＯを用いて処理した細胞と比較して（例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）による）脱チロシン化微小管の非常に高い増大が観察される。図８は得られた結果を示す。
実施例６：がん株に関する細胞毒性の研究
がん株の増殖に対するこれらの化合物の効果を評価するために、活性化合物の存在下での幾つかの形質転換細胞株、例えばＨｅＬａ細胞（子宮腺癌）、７８６−Ｏ細胞（腎臓腺癌）、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞（肺癌）、ＭＣＦ−７細胞（乳腺腺癌）、ＭＥＳ−ＳＡ細胞（子宮肉腫）及びＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５細胞（子宮肉腫）の生存率をＤＭＳＯの存在下での生存率と比較した。
【０１５５】
より具体的には、ＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５株は高レベルのＰ−糖タンパク質を発現し、そのため多くの薬理学的作用物質による処理により誘導された毒性に耐性であるがん株である。Ｐ−糖タンパク質をがんの化学療法に対する耐性の主因の一つとして同定した。Ｐ−糖タンパク質は（「多剤耐性」に関して）ＭＤＲ１として知られる遺伝子によりコードされる。その正常な機能は細胞から外に環境由来の異物及び毒素を排出することである。関係のある薬物は、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン、ビンカ・アルカロイド、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ミトキサントロン及びダクチノマイシン等の幾つかの挿入剤、並びにカンプトテシンの或る特定の誘導体である。
【０１５６】
様々な濃度の分子（１００μＭ〜０．００１μＭ）に４８時間曝露した後、ＭＴＴ試験を用いて細胞の生存率を評価した。このようにして用量効果曲線を取得し、これにより細胞増殖の５０％を阻害するのに必要な濃度（ＩＣ５０）を決定することが可能になった。細胞毒性曲線の一例を図７に示す。
【０１５７】
様々な細胞株に対する本発明の化合物１及び化合物３の効果を分析した。得られたＩＣ５０の値を以下の表Ｖに提示する。
【０１５８】
【表５】
【０１５９】
分子の毒性は細胞株に応じて変わる。ＭＣＦ−７細胞は最も耐性のある株であると思われる。この細胞株に関しては、高濃度では溶解することが難しい本発明の化合物３のＩＣ５０を決定することができていない。しかしながら、ＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５多剤耐性株は両方の分子に感受性である。
【０１６０】
最後に、７８６−Ｏ株、ＮＣＩ−Ｈ４６０株及びＭＥＳ−ＳＡ ＤＸ５株に関して、本発明の化合物３は本発明の化合物１よりも毒性が強い。
実施例７：ミトコンドリアに対する効果
２５μＭでの２時間の処理の後（実施例２〜実施例４を参照されたい）、化合物１は細胞をアジ化ナトリウムタイプで処理した場合に観察されるミトコンドリア表現型を誘導しない（図９）。
実施例８：ＥＣ５０の決定：
ｉｎ ｖｉｖｏで分子の生物活性を評価し、それらの活性を比較するために、選択された分子のＥＣ５０（効果全体の５０％の効果を有する濃度）を決定した。分子の濃度に応じた細胞におけるＴｙｒ−チューブリン又はＧｌｕ−チューブリンのシグナルの変動を測定することが可能となる用量効果曲線を確立した。それからこれらの曲線を用いて、求められる効果全体の５０％に相当する活性を生じる生物活性分子の濃度を規定することが可能である。
【０１６１】
Ｇｌｕ−チューブリンの量の変動を測定するための用量効果曲線を本発明の化合物１に関して作成した。このために、ＨｅＬａ細胞を様々な濃度の分子を用いて２時間インキュベートした後、マイクロプレートにおいて免疫蛍光プロトコルに従って処理した。それからマイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度を測定した。
【０１６２】
測定されたシグナルの割合は生物活性の対照（パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）））及び生物不活性の対照（ＤＭＳＯ）との隔たりを表す。ＥＣ５０をＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（登録商標）３．６０ソフトウェアを用いて決定した。
【０１６３】
本発明の化合物１は最も高い濃度でパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））よりもわずかに小さいＧｌｕシグナルの増大を引き起こすことができる。
実施例９：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物１によるＬＩＭＫ１の阻害
図１０は化合物１（Ｈ０６）によるＬＩＭＫ１の阻害を示す。放射ＬＩＭＫ１キナーゼアッセイを実施例２に記載のように行った。以下の条件を試験した：ＬＩＭＫ１なし（「−ＬＩＭＫ１」）、５μＭ Ｈ０６（「５μＭ Ｈ０６」）、２５μＭ Ｈ０６（「２５μＭ Ｈ０６」）又は同量のＤＭＳＯ（「Ｃｔｌ」）の存在下でＬＩＭＫ１（１ｎｇ）を用いて。
【０１６４】
上記阻害は異なるＡＴＰ濃度：１８０μＭ（白丸）又は３６０μＭ（黒四角）で図１１に示されるように用量依存的である。誤差バーは平均値の標準誤差を表す。
【０１６５】
阻害機構を、化合物１（Ｈ０６）の非存在下で（●）又は７０ｎＭ（▲）及び２８０ｎＭ（■）の化合物１（Ｈ０６）の存在下でＬＩＭＫ１キナーゼ活性を決定することにより、ＬＩＭＫ１のラインウェーバー・バークプロットを表す図１２に示した。Ｖ０はＧＳＴ−コフィリンのリン酸化反応の初期速度である。この結果は化合物１がＬＩＭＫ１に対するＡＴＰ競合因子であり、Ｋｉが約６０ｎＭであり、Ｋｍ（ＡＴＰ）が約９０μＭであることを示す。
【０１６６】
サイズ排除クロマトグラフィの前（「ｉｎｐｕｔ」）又は後（「ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ」）、ＬＩＭＫ１阻害の可逆性を２μＭの化合物１（Ｈ０６）の存在下、実施例２の条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで分析した。誤差バーは平均値の標準誤差を表す。図１３は結果を示し、化合物１の作用が可逆的であることを示す。
【０１６７】
化合物１の阻害の可逆性の分析をｉｎ ｖｉｖｏでも試験した。
【０１６８】
ＨｅＬａ細胞を２時間、２５μＭの化合物１（Ｈ０６）により処理した（レーン２）。それから培養培地を棄て、新たな培地（ＲＰＭＩ）を添加した。様々な時間で、ＲＰＭＩ添加後（レーン３、３０分；レーン４、１時間；レーン５、１．５時間；レーン６、２時間；レーン７、４時間）、コフィリンの量及びリン酸化状態を実施例２に記載のように決定した。レーン１は時間「０」、すなわち化合物１で処理していない細胞の細胞抽出物に対応している。
【０１６９】
図１４は結果を示し、化合物１をＲＰＭＩ培地に置き換える場合、再びホスホ−コフィリンが合成されることをはっきりと示している（図１４のレーン４を参照されたい）。
実施例１０：ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物１による細胞のＬＩＭＫ１活性の阻害
コフィリンはＬＩＭＫ１の基質である。化合物１はＨｅＬａ細胞における用量依存的なＳｅｒ３におけるコフィリンのリン酸化の阻害を誘導する。
【０１７０】
ＨｅＬａ細胞を指定の濃度の化合物１（又は陰性対照としてエリプチシン）により２時間処理した。
【０１７１】
コフィリンの量及びリン酸化状態を実施例２に記載のように決定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリン酸化コフィリン（左側）を対照として用いた。
【０１７２】
結果（図１５）は、エリプチシンはコフィリンのリン酸化を回避しないが、化合物１はＬＩＭＫ１を阻害することにより用量依存的にホスホ−コフィリンの形成をはっきりと阻害することを示す。
【０１７３】
ＨｅＬａ細胞を指定の時間、２５μＭの化合物１により処理した。コフィリンの量及びリン酸化状態を実施例２に記載のように決定した。
【０１７４】
図１６はこの実験を説明している。図１６は化合物１による処理のわずか３０分後に化合物１の阻害効果を容易に検出することができることを示す。
実施例１１：本発明の式Ｉの化合物（式中、Ｒ６は二重結合によりＤ環と結合した酸素原子を表す）とＲ６としてアミン誘導基を有する化合物との間の比較研究
【０１７５】
【表６】
【０１７６】
これらの比較データは本発明によるＲ６の選択の極めて重要な役割を示す。
【０１７７】
実際、Ｒ６が本発明で規定されるようなもの、好ましくは二重結合によりＤ環と結合した酸素原子ではない場合、ＬＩＭＫ１に対する阻害作用は見られない。
【０１７８】
図１７はこれらの結果の幾つかを示す。
【０１７９】
【表７−１】
【０１８０】
【表７−２】
【０１８１】
【表７−３】
【０１８２】
【表７−４】
【０１８３】
【表７−５】
【０１８４】
【表７−６】
【０１８５】
【表７−７】
【配列表フリーテキスト】
【０１８６】
配列番号１：チューブリンエピトープ
配列番号２：チューブリンエピトープ
配列番号３：チューブリンエピトープ
配列番号４：チューブリンエピトープ
配列番号５：アルファチューブリン誘導ペプチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ１は水素原子、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個〜４個の炭素原子を有するアミノアルキル基、又はモノアルキルアミノアルキル基若しくはジアルキルアミノアルキル基（該２つのアルキル基が１個〜４個の炭素原子を有する）を表し、
Ｒ２は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒ３は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
−ＯＲ４はヒドロキシル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基若しくは式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚのアルコキシ基、若しくは１個〜４個の炭素原子を有するエステル基若しくは式−ＯＣ（Ｏ）Ｚのエステル基を表し、ここで
Ｚは３個〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基、又はフェニル基、ベンジル基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジル基及びオキサゾリル基から選択されるアリール基（該アリール基はハロゲン原子、−ＯＨ基、−ＮＯ２基又は−ＮＨ２基、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基及び１個〜４個の炭素原子を有するモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基から選択される、同一の又は異なる１つ、２つ又は３つの置換基によりオルト位、メタ位又はパラ位で必要に応じて置換されていてもよい）であり、
ｎは１〜４の範囲の、好ましくは１に等しい整数であり、又は
−ＯＲ４基は式：
【化２】
に対応し、ここで
ＶはＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＮ−アルキルから選択され、該アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有し、
ｎ’は２又は３に等しく、
Ｒ５は水素原子又はジアルキルアミノメチル基（ここで該アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有する）を表し、
Ｒ６は二重結合によりＤ環と結合した酸素原子、ハロゲン原子、又は１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ７は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒ８は水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、式
【化３】
のアルキルカルボキシアルキレン基、若しくは式
【化４】
のジアルキルホスフェートアルキレン基（ここで該アルキル基及び該アルキレン基が１個〜４個の炭素原子を有する）、又は１個〜４個の炭素原子を有するエステル基を表し、Ｒ６が二重結合によりＤ環と結合した酸素原子である場合にのみＲ８が存在する）に対応することを特徴とする薬物としての四環系化合物及びそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２がメチル基であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３がメチル基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記−ＯＲ４基が−ＯＨ基又はメトキシ基であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記−ＯＲ４基が式−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５のベンジルエーテル基、又は式−ＯＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５のエステル基（該基が−ＮＯ２基、−ＮＨ２基、−Ｎ（ＣＨ３）２基、−ＣＮ基、−ＣＨ２ＮＨ２基又は−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２基から選択される置換基によりオルト位、メタ位又はパラ位で必要に応じて置換されていてもよい）であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記Ｒ５基が水素原子又はジメチルアミノメチル基であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記Ｒ６基が二重結合によりＤ環と結合した酸素原子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記Ｒ８基が水素原子であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
以下の式（Ｉ）：
【化５】
化合物１
又は式：
【化６】
又は式：
【化７】
又は式：
【化８】
又は式：
【化９】
に対応することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
以下の式（Ｉ）：
【化１０】
に対応することを特徴とする化合物。
【請求項１２】
有効成分としての少なくとも１つの請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物と少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルとを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
別の抗がん有効成分も含むことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の抗がん活性を評価する方法であって、
１．真核細胞を試験対象の前記化合物とインキュベートした後の、微小管ネットワークを保護するが脱重合したチューブリンの排出を可能にするバッファーによる該細胞の透過処理、
２．前記細胞の固定後、Ｔｙｒ−チューブリンを抗チロシン化チューブリン一次抗体及び波長λ１で発光する二次抗体で標識化し、Ｇｌｕ−チューブリンを抗脱チロシン化チューブリン一次抗体及び波長λ２で発光する二次抗体で標識化した後の脱重合剤に最も感受性がある動的微小管及び安定化した微小管を同定するための様々な波長での蛍光の定量化、
３．細胞層の状態を評価するための核の補助的な標識化、
４．工程１と同じ条件下での試験対象の前記化合物とＨｅＬａ細胞とのインキュベーション、及び蛍光が波長λ２で観察される場合の該化合物の選抜、
５．インキュベートした細胞試料のミトコンドリアマーカーによる染色及びインキュベートした細胞試料のアジ化ナトリウムによる染色、並びにミトコンドリアに対するアジ化ナトリウムの効果と試験対象の前記化合物の効果との比較、並びに該化合物がアジ化ナトリウムと同様のミトコンドリア染色の変更を示す場合の該化合物の除外、
６．ＨｅＬａ細胞と試験対象の分子とのインキュベーション、ノコダゾールによる任意の処理、その後の微小管ネットワークの免疫蛍光標識化の分析及びリーダーを用いた定量化、並びに
７．前記ＨｅＬａ細胞と試験対象の前記化合物とのインキュベーション、任意のその後のラトランクリンＢとの同時インキュベーション、及びアクチンネットワークに対する試験対象の前記化合物の効果を分析し、該化合物が該アクチンネットワークの形態を変更しない場合該化合物を選抜するためのフルオロフォア（λ２で発光）と連結したファロトキシンによるＦ−アクチンの標識化、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
神経変性型の病変を予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１６】
アルツハイマー病及び統合失調症を予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１７】
寄生虫病を予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１８】
マラリアを予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１７に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１９】
緑内障を予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＩＭＫ１の活性を阻害又は安定化させやすい分子をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＬＩＭＫ１を、必要に応じて標識化した請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物に接触させること、
（ｉｉ）試験対象の前記化合物を添加すること、及び
（ｉｉｉ）試験対象の前記化合物による式（Ｉ）の化合物の置き換えを評価すること（avaluating）、
を含む、方法。
【請求項２１】
ｉｎ ｖｉｖｏで直接的若しくは間接的なＬＩＭＫ１活性化因子、又はホスファターゼ阻害因子をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を真核細胞、好ましくはヒト細胞に接触させること、
（ｉｉ）ＬＩＭＫ１基質、例えばコフィリンのリン酸化の低減を測定することにより、式（Ｉ）の前記化合物の阻害効果を評価すること、
（ｉｉｉ）試験対象の前記化合物を添加すること、及び
（ｉｖ）ＬＩＭＫ１基質のリン酸化の阻害に対する試験対象の前記化合物の効果を測定すること、
を含む、方法。
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ１は水素原子、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個〜４個の炭素原子を有するアミノアルキル基、又はモノアルキルアミノアルキル基若しくはジアルキルアミノアルキル基（該２つのアルキル基が１個〜４個の炭素原子を有する）を表し、
Ｒ２は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒ３は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
−ＯＲ４はヒドロキシル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基若しくは式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚのアルコキシ基、若しくは１個〜４個の炭素原子を有するエステル基若しくは式−ＯＣ（Ｏ）Ｚのエステル基を表し、ここで
Ｚは３個〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基、又はフェニル基、ベンジル基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジル基及びオキサゾリル基から選択されるアリール基（該アリール基はハロゲン原子、−ＯＨ基、−ＮＯ２基又は−ＮＨ２基、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基、１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基及び１個〜４個の炭素原子を有するモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基から選択される、同一の又は異なる１つ、２つ又は３つの置換基によりオルト位、メタ位又はパラ位で必要に応じて置換されていてもよい）であり、
ｎは１〜４の範囲の、好ましくは１に等しい整数であり、又は
−ＯＲ４基は式：
【化２】
に対応し、ここで
ＶはＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＮ−アルキルから選択され、該アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有し、
ｎ’は２又は３に等しく、
Ｒ５は水素原子又はジアルキルアミノメチル基（ここで該アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有する）を表し、
Ｒ６は二重結合によりＤ環と結合した酸素原子、ハロゲン原子、又は１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ７は水素原子又は１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒ８は水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、式
【化３】
のアルキルカルボキシアルキレン基、若しくは式
【化４】
のジアルキルホスフェートアルキレン基（ここで該アルキル基及び該アルキレン基が１個〜４個の炭素原子を有する）、又は１個〜４個の炭素原子を有するエステル基を表し、Ｒ６が二重結合によりＤ環と結合した酸素原子である場合にのみＲ８が存在する）に対応することを特徴とする薬物としての四環系化合物及びそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２がメチル基であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３がメチル基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記−ＯＲ４基が−ＯＨ基又はメトキシ基であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記−ＯＲ４基が式−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５のベンジルエーテル基、又は式−ＯＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５のエステル基（該基が−ＮＯ２基、−ＮＨ２基、−Ｎ（ＣＨ３）２基、−ＣＮ基、−ＣＨ２ＮＨ２基又は−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２基から選択される置換基によりオルト位、メタ位又はパラ位で必要に応じて置換されていてもよい）であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記Ｒ５基が水素原子又はジメチルアミノメチル基であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記Ｒ６基が二重結合によりＤ環と結合した酸素原子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記Ｒ８基が水素原子であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
以下の式（Ｉ）：
【化５】
化合物１
又は式：
【化６】
又は式：
【化７】
又は式：
【化８】
又は式：
【化９】
に対応することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
以下の式（Ｉ）：
【化１０】
に対応することを特徴とする化合物。
【請求項１２】
有効成分としての少なくとも１つの請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物と少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルとを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
別の抗がん有効成分も含むことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の抗がん活性を評価する方法であって、
１．真核細胞を試験対象の前記化合物とインキュベートした後の、微小管ネットワークを保護するが脱重合したチューブリンの排出を可能にするバッファーによる該細胞の透過処理、
２．前記細胞の固定後、Ｔｙｒ−チューブリンを抗チロシン化チューブリン一次抗体及び波長λ１で発光する二次抗体で標識化し、Ｇｌｕ−チューブリンを抗脱チロシン化チューブリン一次抗体及び波長λ２で発光する二次抗体で標識化した後の脱重合剤に最も感受性がある動的微小管及び安定化した微小管を同定するための様々な波長での蛍光の定量化、
３．細胞層の状態を評価するための核の補助的な標識化、
４．工程１と同じ条件下での試験対象の前記化合物とＨｅＬａ細胞とのインキュベーション、及び蛍光が波長λ２で観察される場合の該化合物の選抜、
５．インキュベートした細胞試料のミトコンドリアマーカーによる染色及びインキュベートした細胞試料のアジ化ナトリウムによる染色、並びにミトコンドリアに対するアジ化ナトリウムの効果と試験対象の前記化合物の効果との比較、並びに該化合物がアジ化ナトリウムと同様のミトコンドリア染色の変更を示す場合の該化合物の除外、
６．ＨｅＬａ細胞と試験対象の分子とのインキュベーション、ノコダゾールによる任意の処理、その後の微小管ネットワークの免疫蛍光標識化の分析及びリーダーを用いた定量化、並びに
７．前記ＨｅＬａ細胞と試験対象の前記化合物とのインキュベーション、任意のその後のラトランクリンＢとの同時インキュベーション、及びアクチンネットワークに対する試験対象の前記化合物の効果を分析し、該化合物が該アクチンネットワークの形態を変更しない場合該化合物を選抜するためのフルオロフォア（λ２で発光）と連結したファロトキシンによるＦ−アクチンの標識化、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
神経変性型の病変を予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１６】
アルツハイマー病及び統合失調症を予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１７】
寄生虫病を予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１８】
マラリアを予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１７に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１９】
緑内障を予防及び／又は治療する薬物として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＩＭＫ１の活性を阻害又は安定化させやすい分子をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＬＩＭＫ１を、必要に応じて標識化した請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物に接触させること、
（ｉｉ）試験対象の前記化合物を添加すること、及び
（ｉｉｉ）試験対象の前記化合物による式（Ｉ）の化合物の置き換えを評価すること（avaluating）、
を含む、方法。
【請求項２１】
ｉｎ ｖｉｖｏで直接的若しくは間接的なＬＩＭＫ１活性化因子、又はホスファターゼ阻害因子をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を真核細胞、好ましくはヒト細胞に接触させること、
（ｉｉ）ＬＩＭＫ１基質、例えばコフィリンのリン酸化の低減を測定することにより、式（Ｉ）の前記化合物の阻害効果を評価すること、
（ｉｉｉ）試験対象の前記化合物を添加すること、及び
（ｉｖ）ＬＩＭＫ１基質のリン酸化の阻害に対する試験対象の前記化合物の効果を測定すること、
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１２−５１８６２６（Ｐ２０１２−５１８６２６Ａ）
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５０６７０（Ｐ２０１１−５５０６７０）
【出願日】平成２２年２月１９日（２０１０．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００５３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９５０４２
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【出願人】（５０００５６４７１）
【出願人】（５０６４２３２９１）コミサリア ア レネルジィ アトミーク エ オ ゼネ ルジイ アルテアナティーフ (85)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１９日（２０１０．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００５３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９５０４２
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【出願人】（５０００５６４７１）
【出願人】（５０６４２３２９１）コミサリア ア レネルジィ アトミーク エ オ ゼネ ルジイ アルテアナティーフ (85)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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