ピリミジン合成インヒビターに関する組成物および方法
本明細書で提供されるのは、ピリミジン合成インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物である。この種の組成物が、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスを増加させる方法；被験体における肺疾患を処置する方法；被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法；ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定し、そして有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法；ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定し、そしてこの被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法；ならびに肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法において使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００４年５月２１日に出願された米国仮出願第６０／５７３，５５８号の利益を主張する。米国仮出願第６０／５７３，５５８号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（謝辞）
本発明は、国立衛生研究所から助成金番号ＲＲ１７６２６、ＨＬ３１１９７、ＨＬ０７５５４０、ＨＬ５１１７３およびＨＬ７２８１７の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、世界中の乳児および小児の下気道（ＬＲＴ）疾患の最も一般的な原因であり、成人における市中感染性ＬＲＴ感染の原因と過小診断されることもある。
【０００４】
１９８０年〜１９９６年の間に、推定１６５万人の細気管支炎による入院患者が５年より若い小児で発生し、７００万の入院日数を占めた。これらの入院の５７パーセントは６ヵ月より若い小児に発生し、そして８１％は１歳より若い小児に発生した。１歳より若い小児では、毎年の細気管支炎入院率は、１９９６年の１０００人につき１２．９人から、１９８０年の１０００人につき３１．２人まで、２．４倍増加した。細気管支炎と関連した１歳より若い小児の中の下気道疾患による入院の比率は、１９８０年の２２．２％から１９９６年の４７．４％まで増加した；入院全体では、この比率は、５．４％から１６．４％まで増加した。１歳より若い小児での推定５１，２４０〜８１，９８５の毎年の細気管支炎入院は、ＲＳＶ感染に関連していた。肺炎を有する細気管支炎による入院も考慮される場合、ＲＳＶ感染は、米国単独において、１年当たりの１２６，０００までの入院の原因である。現在、ＲＳＶに関する有効な処置がない。
【０００５】
鼻漏、肺うっ血および低酸素血症は、ＲＳＶ感染を含め、大部分の呼吸器感染の重要な構成要素であるが、この種の疾患における変化した肺流体力学の基礎をなしている機構はほとんど理解されていない。さらに、疫学研究は、乳児期における重篤なＲＳウイルス（ＲＳＶ）誘発性細気管支炎とアレルギー疾患との強い関連を示唆する。ウシにおけるＲＳＶ感染もまた、主に重要な感染であり、ここで、この種の感染は重篤な呼吸器疾患をもたらし得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当該分野において必要なのは、ＲＳＶ感染を含め、呼吸器感染を予防および処置するための改善された方法および組成物である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本明細書において提供されるのは、ピリミジン合成インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物である。この組成物は、被験体の肺上皮細胞への局所投与に適している。本明細書においてまた提供されるのは、治療量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を少なくとも１測定用量（ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ）含むデバイスである。各測定用量は、被験体における肺疾患を処置するための治療量またはその一部のピリミジン合成インヒビターを含む。
【０００８】
本明細書においてさらに提供されるのは、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスを増加させる方法、被験体における肺疾患を処置する方法、被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法、ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定し、そして有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法、ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定し、そしてこの被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法、ならびに肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法である。
【０００９】
さらなる利点は、以下に続く記載に部分的に示されており、そしてこの記載から部分的に明らかであるか、または下記の局面の実施により学ばれ得る。後述する利点は、添付の請求の範囲において、特に指摘される要素および組合せにより理解されて、実現および獲得される。前述の一般的説明および以下の詳細な説明が例示および説明にすぎず、限定的ではないことを理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書に組み込まれて、その一部を構成する、添付の図面は、下記のいくつかの局面を例示する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明およびその中に含まれる実施例、ならびに図面およびそれらの上記および下記の説明を参照することでより容易に理解され得る。
【００１２】
本願全体を通して、さまざまな刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本願が関係する技術水準をより完全に記載するために、その全体が本願において本明細書中に参考として援用される。開示される参考文献はまた、この参考文献を記載する文章で考察される参考文献に含まれる主題が、個々に、そして、具体的に本明細書中に参考として援用される。
【００１３】
明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数系の言及を含む。従って、例えば、「ピリミジン合成インヒビター」の言及は、一つ以上のピリミジン合成インヒビターの混合物を含む、などである。同様に、「肺上皮細胞」の言及は、一つ以上の肺上皮細胞を含む。従って、例えば、「肺上皮細胞」への投与に適した組成物は、一つ以上のこの種の細胞への投与に適している。
【００１４】
略号が、全体に使われることができ、これは、以下の意味を有し得る。この種の略号としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＡＦＣ（肺胞の流体クリアランス）、ＡＬＦ（気腔の内側を覆う流体；Ａｉｒｓｐａｃｅ ｌｉｎｉｎｇ ｆｌｕｉｄ）、ＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）、ΔＮＰＤ（鼻の電位差の変化）、ＤＨＯＤ（ジヒドロ−オロト酸デヒドロゲナーゼ）、ＨＸＡ（ヒポキサンチン）、ＨＲＳＴＡＲＴ（換気期間開始時の心拍数）、ＨＲＥＮＤ（換気期間終了時の心拍数）、ＬＥＦ（レフルノミド）、ＭＰＡ（ミコフェノール酸）、６−ＭＰ（６−メルカプトプリン）、ＮＰＤ（鼻の電位差）、ＮＰＤＡＭＩＬ（鼻の電位差のアミロライド感受性成分）、ＮＲｔｅ（鼻の経上皮抵抗）、％ΔＨＲ３０（３０分の換気期間にわたる心拍数の変化％）、Ｐ２ＹＲ（Ｐ２Ｙプリン作動性ヌクレオチドレセプター）、ＲＳＶ（ＲＳウイルス）、ＳｍＯ２（平均ヘモグロビンＯ２飽和）およびＶＲＡＣ（体積が調整された陰イオンチャネル）。さらに、他の略号もまた使用され得る。そして、それは当業者に明らかであり、そして／または所定の略号が使われる文脈から明白である。
【００１５】
範囲は、「約」１つの特定の値から、そして／または「約」別の特定の値までとして本明細書において表現され得る。この種の範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、そして／または他の特定の値までを含む。同様に、値を近似値として表現する場合、先行詞「約」を用いることにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲の各々の終点が、他の終点に関して、そして、他の終点とは独立して、の両方において重要であるとさらに理解される。
【００１６】
全体で使用される場合、「被験体」によって、個体が意味される。従って、「被験体」は、家庭用動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および鳥類を含むことができる。一つの局面では、被験体は、ウシ種（例えば、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｂｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓまたはその交配種）である。別の局面においては、被験体は、哺乳類（例えば、霊長類またはヒト）である。
【００１７】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載されている事象または環境が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、この記載は、この事象または環境が起こる例とそれが起こらない例とを包含する。例えば、語句「必要に応じて、この組成物は、組合せを含み得る」は、この組成物が、異なる分子の組合せを含んでもよく、または組合せを含まなくてもよく、この記載が、組合せおよび組合せが存在しない（すなわち、組合せの個々のメンバー）ことの両方を包含することを意味する。
【００１８】
用語「より高い」、「増加する」、「上昇する」または「上昇」とは、コントロール値（例えば、基底レベル）を上回る増加を言及する。用語「低い」、「より低い」、「減少する」または「減少」とは、コントロール値（例えば、基底レベル）未満への減少を言及する。例えば、基底レベルは、薬剤（例えば、レフルノミド、Ａ７７−１７２６または他のピリミジン合成インヒビター）の添加前または添加なしでの正常なインビトロレベルである。コントロールレベルはまた、疾患状態の非存在下の被験体またはサンプルからのレベルを含み得る。コントロール値は、疾患または処置の前または後に、同じ被験体またはサンプルから決定され得る。コントロール値は、疾患または処置が存在しない、異なる被験体またはサンプルに由来し得る。
【００１９】
本明細書において提供されるのは、ピリミジン合成インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物である。この種の組成物は、以下の方法において使用され得る：肺上皮細胞によるＮａ＋依存流体クリアランスを増加させる方法；被験体における肺疾患を処置する方法；被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法；ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定し、そして有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法；ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定し、そしてこの被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法；ならびに肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法。これらの方法は、以下でより詳細に記載される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「処置」は、被験体における所定の呼吸器感染の症状または身体的徴候の減少を包含する。従って、開示された組成物および方法は、被験体における呼吸器感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らすために用いられ得る。この種の症状および身体的徴候としては、鼻漏、低酸素血症、肺水腫、減少した心機能、咳、体重減少、喘鳴、悪液質および肺うっ血が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２１】
開示された組成物および方法を用いた処置が有用な１つの例示的な疾患は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染である。ＲＳＶは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮａ＋依存性肺胞流体クリアランス（ＡＦＣ）を阻害する。そして、Ｐ２Ｙヌクレオチドレセプターアンタゴニストおよびピリミジノ溶解性酵素はＡＦＣの阻害を防止する。ＲＳＶ感染は、ＡＬＦへのＵＴＰおよびＡＴＰの両方の放出をもたらし、そしてＡＦＣにおける減少は、結果として宿主の重要な生理学的障害をもたらすＲＳＶ感染の初期相と関係している。
【００２２】
重篤なＲＳＶ感染のために肺換気が行われる乳児の肺において、サーファクタントタンパク質ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄのレベルは低下し、主要なサーファクタントリン脂質であるジパルミトイルホスファチジルコリンの量が減少し、そして回収されたサーファクタントの生物物理学的界面活性は、コントロールの乳児と比較して損なわれる（ＫｅｒｒおよびＰａｔｔｏｎ，１９９９）。βアドレナリン作用性レセプターアゴニスト（βＡＲＡ）気管支拡張剤は、細胞内サイクリックＡＭＰを上昇させることによって成人呼吸窮迫症候群において肺胞流体クリアランスを改善するために用いられているが、呼吸上皮におけるβアドレナリン作用性レセプターによって媒介されるシグナル伝達は、ＲＳＶ感染後に異常であり、これは、ＲＳＶ治療におけるβＡＲＡの乏しい効力を説明し得る。従って、ＲＳＶ感染の場合、開示された方法および組成物は、乳児においてジパルミトイルホスファチジルコリンのようなサーファクタントリン脂質のレベルを上昇させるために、またはβアドレナリン作用性レセプターアゴニスト（βＡＲＡ）気管支拡張剤の効力を高めるために用いられる。
【００２３】
さらに、疫学研究は、乳児期の重篤なＲＳウイルス（ＲＳＶ）誘発性細気管支炎とアレルギー疾患との強い関連を示唆する。本明細書において提供される組成物および方法は、ＲＳＶ誘発性気道過敏およびその後の喘息発症への素因を低減するために、ＲＳＶ感染の間、有用である。ＲＳＶ感染はまた、ウシ（すなわち、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓおよびＢｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓ、またはその交配種）においても主に重要であり、そして重篤な呼吸器疾患をもたらし得る。
【００２４】
肺胞流体クリアランスは、肺上皮細胞におけるイオン輸送と関連する。例えば、肺胞上皮の壁は、２種類の細胞からなる：Ｉ細胞およびＩＩ型細胞。Ｉ型細胞は、肺胞上皮のうちの最も大きい割合をカバーする（約９５％）。ＩＩ型細胞は、サーファクタントを生成する。Ｉ型細胞およびＩＩ型細胞の両方が能動的な様式でナトリウムイオンを輸送すると現在考えられている。上皮細胞の基底外側表面に位置するナトリウム−カリウムポンプは、先端膜をまたがる電気化学的勾配を設定し、このことは、ナトリウムイオンが肺胞腔から細胞質へと入るのに有利である。ナトリウムは、主にチャネルと呼ばれているタンパク質によって肺胞上皮を越える。細胞質において、それらは、一旦、ＡＴＰを利用するナトリウム−カリウムポンプによって基底外側膜を越えて押し出される。電気的中性を保存するために、塩化物イオンは、細胞間に位置する経路を通って、または細胞チャネルによってのいずれかによるナトリウムイオンの動きに続く。イオンの動きは、流体の再吸収に有利な間質腔と肺胞腔との間に浸透圧差を生じる。
【００２５】
ナトリウム能動輸送は、多くの病的状態（ウイルス感染、肺炎、急性肺傷害など）の肺胞腔の流体の量を制限することにおいて、重要な役割を果たす。基底状態では、気道上皮の主なイオン輸送プロセスは、内腔流体から上皮の基礎をなす間質腔への、能動的なアミロライド感受性のＮａ＋イオン輸送である。肺の内側を覆う流体（ＡＬＦ）におけるＮａ＋イオンは、主に、先端膜におけるカチオンおよびＮａ＋選択的なアミロライド感受性の上皮Ｎａ＋チャネル（ＥＮａＣ）を通して、気管支肺胞上皮細胞へと受動拡散する。Ｃｌ−イオンは、傍細胞経路を介して、または、おそらく嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）を介して、Ｎａ＋の動きを追って、電気的中性を維持する。ＮａＣｌの輸送は、上皮を経た浸透圧勾配を生じる。呼吸上皮の経上皮透水性が高いので、この勾配により、水は気腔から間隙へと受動的に移動し、それによって、気腔流体がクリアランスされる。
【００２６】
ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害は、低酸素血症、心機能障害、ならびに気管支肺胞洗浄液のＵＴＰ含有量およびＡＴＰ含有量の増加と関係している。さらに、肺中のＲＳＶ複製に対する直接の抗ウイルス効果がないにもかかわらず、レフルノミドを用いたデノボピリミジン合成の全身阻害は、ＡＦＣおよび肺水分含有量だけでなく、ＲＳＶ感染マウスにおける生理学的障害（体重減少、ＳｍＯ２低下および心機能低下、ならびに鼻の電位差の変化を含む）を改善する。そのデノボＵＴＰ合成およびＶＲＡＣによる放出はＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害が生じるために必要であることを示しており、そしてデノボピリミジン合成および放出経路が、ＲＳＶ感染または他の呼吸器感染の症状を緩和するように設計されたインヒビター療法についての魅力的な標的であることを証明している、体積が調整された陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）の薬理学的遮断により、ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害が防止され得る。
【００２７】
図１は、ピリミジン生合成経路およびプリン生合成経路を例示している概略図である。ＵＴＰは、グルタミン、ＡＴＰおよびＨＣＯ３−からデノボ合成される。ＵＴＰはまた、サルベージ経路を介してウリジンから合成されることもできる。レフルノミドおよびその活性代謝産物（Ａ７７−１７２６）は両方ともジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼの活性を阻害する。ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼは、ジヒドロオロテートをオロテートに変換する。両方の薬剤は、デノボでのピリミジン合成を妨害するが、ピリミジンサルベージ経路にもプリン合成にも影響を及ぼすわけではない。
【００２８】
必要に応じて、この組成物は、レフルノミドであるピリミジン合成インヒビターを含む。必要に応じて、この組成物は、Ａ７７−１７２６であるピリミジン合成インヒビターを含む。必要に応じて、この組成物は、レフルノミドとＡ７７−１７２６との組合せおよび／または別のピリミジン合成インヒビターとレフルノミドまたはＡ７７−１７２６との組合せを含む。取引名ＡＲＡＶＡ（登録商標）（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）の下で、レフルノミド（活性な代謝産物がＡ７７−１７２６であるプロドラッグ）は、関節リウマチの処置のために使われる。レフルノミドおよびＡ７７−１７２６は両方とも、酵素ジヒドロオロト酸レダクターゼ（ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼまたはジヒドロオロターゼとしても公知）のインヒビターとして働く。ジヒドロオロト酸レダクターゼは、デノボピリミジン合成経路の中心的な構成要素である三機能性酵素複合体ＣＡＤ（カルバミルリンシンテターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼ）の構成要素である。従って、レフルノミドおよびＡ７７−１７２６と同様に、この組成物は、ジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターであり得る。
【００２９】
この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアにおいて、インビボで投与され得る。「薬学的に受容可能な」によって、生物学的にも他の点でも望ましくない点がない物質を意味する。従って、望ましくない生物学的影響を引き起こすもなく、それが含まれる医薬組成物中の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することもなく、この物質は、被験体に投与され得る。キャリアは当然、当業者にとって周知であるように、活性成分のいかなる分解も最小化して、被験体におけるいかなる有害な副作用も最小にするように選択される。この物質は、溶液、懸濁液中に存在してもよい（例えば、微粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれる）。これらは、抗体、レセプターまたはレセプターリガンドを介して特定の細胞型へと標的化され得る。
【００３０】
適切なキャリアおよびそれらの処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。代表的には、適切な量の薬学的に受容可能な塩が、処方物を等張にするために、処方物において使われる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水、リンゲル液およびブドウ糖溶液が挙げられるがこれらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８．５、より好ましくは、約７．８〜約８．２である。さらなるキャリアとしては、抗体を含んでいる固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリクス（このマトリックスは、成形品（例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子）の形態である）のような徐放性調製物が挙げられる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度によって、特定のキャリアがより好適であり得ることは、当業者にとって明らかである。例えば、吸入性投与および／もしくは鼻腔内投与または肺上皮細胞に対する局所投与に適している組成物のために適している特定のキャリアを選択することは、当該分野の従来範囲内にある。
【００３１】
この組成物はまた、この組成物およびキャリアに加えて、増粘剤、希釈液、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含み得る。この組成物はまた、一つ以上の活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤など）を含み得る。
【００３２】
開示された組成物は、被験体の肺上皮細胞への局所投与に適している。従って、ピリミジン合成インヒビターを含む組成物は、必要に応じて、吸入による投与に適している（すなわち、組成物は吸入剤である）。さらに、この組成物は、必要に応じてエアロゾル化される。そしてさらに、この組成物は、必要に応じて霧状にされる。吸入によるこの組成物の投与は、スプレー機構または液滴機構による送達によって、鼻または口を通してであり得る。送達はまた、挿管法を介して呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接的に行われ得る。必要に応じて、組成物が投与される肺上皮細胞は、被験体の鼻腔、鼻の通路、鼻咽頭、咽頭、気管、気管支、細気管支または肺胞に位置する。必要に応じて、組成物が投与される肺上皮細胞は、気管支肺胞上皮細胞である。さらに、組成物が複数の肺上皮細胞に投与される場合、細胞は、上記の解剖学位置のどこかもしくは全てに、またはこのような位置の組合せに、必要に応じて配置され得る。
【００３３】
従って、肺上皮細胞に対する局所投与は、噴霧化、エアロゾル化または直接の肺滴下注入による肺送達によって行われ得る。それゆえ、被験体の肺上皮細胞に対する局所投与に適した組成物は、例えば、霧状にされたか調製物またはエアロゾル化調製物としての、吸入剤投与に適した組成物を含む。例えば、この組成物は、吸入器（例えば、計量吸入器または乾燥粉末吸入器）、注入器、ネブライザまたは吸入可能な薬物を投与する従来公知の方法の他の任意のものによって個体に投与され得る。
【００３４】
本発明の組成物は、吸入可能な溶液であり得る。吸入可能な溶液は、噴霧化による投与に適していてもよい。この組成物はまた、水性懸濁液として提供され得る。必要に応じて、本発明の処方物は、水性懸濁液中に治療有効量のピリミジン合成インヒビターを含む。
【００３５】
必要に応じて、この組成物は、ピリミジン合成インヒビターまたはその塩もしくはエステルを、少なくとも１つの適切なプロペラントまたはサーファクタントまたはサーファクタント混合物と別々に含んでいる加圧エアゾールによって投与され得る。任意の従来公知のプロペラントが用いられ得る。
【００３６】
また本明細書において提供されるのは、本明細書において提供される組成物およびネブライザを含む組合せである。また本明細書において開示されるのは、本明細書において教示される薬剤および組成物を含む容器である。この容器は、例えば、鼻用スプレヤ、ネブライザ、吸入器、瓶または粘膜表面への投与のための形態の組成物を含む他の任意の手段であり得る。必要に応じて、この容器は、測定用量の組成物を送達し得る。
【００３７】
開示された組成物および方法を含む任意のネブライザを使用し得る。特に、本明細書において使用するためのネブライザは、本明細書において提供される組成物を含め、プロペラントを含まない液状処方物を霧状にする。ネブライザは、圧縮空気、超音波または振動を含むがこれらに限定されない当業者に公知の任意の方法によって、霧状にされた霧を生成し得る。ネブライザは、内部バッフルをさらに有し得る。内部バッフルは、ネブライザのハウジングと共に、密着によって霧から大きい液滴を選択的に除去して、液滴が貯蔵部に戻るのを可能にする。このように生成される微細なエーロゾル液滴は、空気／酸素を吸入することによって、肺に入る。
【００３８】
従って、プロペラントを含まない液状処方物を霧状にするネブライザは、本明細書において提供される組成物を用いた用途に適している。この種のネブライザの例は当該分野において公知であり、市販されている。本明細書にでの使用のためのネブライザとしてはまた、ジェットネブライザ、超音波ネブライザなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なジェットネブライザは、当該分野で公知であり、そして市販されている。
【００３９】
この組成物は、濾過滅菌されてバイアル（ネブライザにおいて使用される、適切には霧状にされる、無菌の単位用量処方物を提供する単位用量バイアルを含む）に充填され得る。各単位用量バイアルは、無菌であり得、そして、他のバイアルまたは次の用量を汚染せずに適切に霧状にされ得る。
【００４０】
必要に応じて、開示された組成物は、鼻腔内投与に適した形態である。この種の組成物は、鼻孔の一方または両方を通る鼻および鼻の通路への送達に適しており、スプレー機構もしくは液滴機構による、または、エアロゾル化による送達を含み得る。
【００４１】
組成物が局所肺投与を使わない方法で使用される場合、この組成物は、当該分野で公知の他の手段により（例えば、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内投与によって、腹腔内投与によって、そして経皮的に）投与され得る。
【００４２】
本明細書においてさらに提供されるのは、治療量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を少なくとも１測定用量含むデバイスであり、ここで、各測定用量は、被験体における肺疾患を処置するための治療量またはその一部のピリミジン合成インヒビターを含む。このピリミジン合成インヒビターは、本明細書中に開示される通りのピリミジン合成インヒビターまたはその組合せを含み得る。
【００４３】
本明細書においてさらに提供されるのは、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスを増加させる方法であり、この方法は、この細胞と有効量のピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程を包含する。この接触により、この細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスの増加が引き起こされる。必要に応じて、この肺上皮細胞を、インビボで接触させる。必要に応じて、この肺上皮細胞を、インビトロで接触させる。
【００４４】
さらに提供されるのは、被験体における肺疾患を処置する方法であり、この方法は、この被験体における複数の肺上皮細胞と有効量のピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程を包含する。この有効量のピリミジン合成インヒビターは、この被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体クリアランスの増加を引き起こす。この方法が用いられ得、ここで、この被験体はＲＳウイルス感染を有するかまたはＲＳウイルス感染を発症する危険がある。開示された方法が用いられ得る疾患を引き起こす他の肺病原体としては、パラミクソウイルス（ＲＳウイルス［ヒトおよびウシ］、メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザ、麻疹ウイルス）、オルトミクソウイルス（インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルス）、ポックスウイルス（痘瘡ウイルス、サル痘ウイルス）、新世界ハンタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群因子）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
さらに提供されるのは、ＲＳウイルス感染の危険がある被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法であり、この方法は、有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する工程を包含する。上述の通り、この種の症状または身体的徴候としては、鼻漏、低酸素血症、肺水腫、減少した心機能、咳、体重減少、喘鳴、悪液質および肺うっ血が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＳウイルス感染の危険がある被験体は、当業者によって直ちに決定され得る。例えば、この種の決定は、症状／身体的徴候、身体検査、診断試験またはそれらの任意の組み合わせを提示する、被験体の病歴に基づいて医師または獣医師によってなされ得る。
【００４６】
また提供されるのは、ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定する工程、および有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する工程を包含する方法である。さらに提供されるのは、ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定する工程、およびこの被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する工程を包含する方法である。
【００４７】
開示された方法において、ピリミジン合成インヒビターは、必要に応じて、レフルノミド、Ａ７７−１７２６またはそれらの組み合わせである。さらに、レフルノミドおよび／またはＡ７７−１７２６が、一つ以上の他のピリミジン合成インヒビターと結合して、開示された方法において使用され得る。
【００４８】
用語「有効量」および「有効投与量」または「治療量」は、交換可能に使用される。用語「有効量」は、所望の生理学的応答を生じるのに必要な任意の量と定義される。開示された方法で使用される組成物を投与するための有効な量およびスケジュールは、経験的に決定され得、そしてこの種の決定をすることは当該分野の技術範囲内である。開示された方法で使用される組成物の投与のための有効な投与量範囲は、障害の症状が影響を受ける、所望の効果を生じるのに十分大きな投与量である。投与量は、有害な副作用（例えば、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応など）を引き起こすほど大きくてはならない。
【００４９】
一般に、治療量または投与量は、年齢、状態、性別および被験体における疾患の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるかどうかによって変化し、そして当業者によって決定され得る。投与量は、任意の反対指示（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の場合には、個々の医師または獣医師により調整され得る。投与量は変化し得、そして１日または数日間にわたって毎日一つ以上の用量の投与において投与され得る。必要な開示された方法で使用される組成物の有効量は、使用される方法、ならびに処置される気道疾患、特定のピリミジン合成インヒビターならびに／または使用されるキャリアおよび投与様式などに応じて変化し得る。従って、すべての組成物についての正確な量を特定することは可能でない。しかし、適切な量は、従来技術において、本明細書における教示を考慮して単なる慣用実験を使用して、当業者によって決定され得る。例えば、インビボで使用されるジヒドロオロト酸レダクターゼまたはピリミジン合成インヒビターは、約１０〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、約２５〜４５ｍｇ／ｋｇの用量で、または約３０〜４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
【００５０】
Ａ７７−１７２６、レフルノミドおよび／または他のピリミジンインヒビターの治療量、有効量または有効投与量は、合理的な間隔で、有効なまま、エアゾールにより投与され得る。例えば、本明細書において記載される組成物の有効用量は、１日、数日間、１週間以上にわたって、１日１回、１日２回、１日４回、または１時間に１回以上投与され得る。従って、例えば、この組成物は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または１週間以上の持続期間にわたって、１時間毎、２時間毎、４時間毎、８時間毎、１２時間毎もしくは２４時間毎またはそれらの任意の組合せまたは間隔毎に１回投与され得る。間隔によって、提供された値の範囲内の任意の時間増分を意味する。従って、この組成物は、例えば、１２時間にわたって３時間毎に投与され得るなどである。必要に応じて、この組成物は、一度に投与される。この種の時間経過は、例えば、有効用量を決定するために上記のパラメータを使用して、当業者によって決定され得る。
【００５１】
本明細書において記載される方法による組成物の特定の用量の投与の効力は、病歴、徴候、症状、および肺感染（例えば、ＲＳＶ感染）を有する被験体またはこの種の感染に罹る危険がある被験体の状態を評価することに有用であることが公知である客観的な実験室試験の特定の局面を評価することにより決定され得る。これらの徴候、症状および客観的な実験室試験は、この種の患者を処置する任意の臨床医またはこの分野の実験を行っている研究者に公知の通り、処置または予防される特定の疾患または状態によって変化する。例えば、適切なコントロール群および／または一般集団または特定の個体の疾患の通常の進行についての知識を有する比較に基づいて：１）被験体の身体状態が改善されることが示される（例えば、肺うっ血が減らされるかまたは除去される）；（２）この疾患（感染）の進行が安定するか、遅くなるか、または、逆転することが示される、または（３）この疾患または状態を処置するための他の薬物の必要が少なくされるかまたは取り除かれるならば、特定の処置レジメンは有効であると考えられる。この種の効果は、集団中の単一の被験体において、例えば、疫学研究を用いて決定され得る。
【００５２】
本明細書における教示はまた、スクリーニング方法で用いられ得る。例えば、本明細書において提供されるのは、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法であり、この方法は、肺上皮細胞とこの試験化合物とを、過剰のＵＴＰの存在下で接触させる工程、この肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを検出する工程、を包含し、コントロールと比較したＮａ＋依存性流体取り込みの増加は、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す。必要に応じて、この細胞をインビボで接触させる。必要に応じて、この細胞をインビトロで接触させる。この方法は、ＵＴＰを除去する工程、およびＮａ＋依存性流体取り込みの増加の可逆性を検出する工程を必要に応じてさらに含むことができる。
【００５３】
別のスクリーニング方法の例では、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法は、この試験化合物と、ピリミジン合成遺伝子をコードする異種核酸を発現する細胞とを接触させる工程、およびこの細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを検出する工程、を包含し、コントロールレベルと比較したＮａ＋依存性流体取り込みの増加は、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す。必要に応じて、この細胞をインビボで接触させる。必要に応じて、この細胞をインビトロで接触させる。
【００５４】
細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする別の方法は、Ｈ４４１細胞またはＨ４４１細胞株にＲＳウイルスを感染させる工程、この感染した細胞または細胞株と試験化合物とを接触させる工程、およびこの感染した細胞またはこの感染した細胞株の細胞を越えるイオン輸送を測定する工程を包含する。コントロールと比較した場合の、この感染した細胞またはこの感染した細胞株の細胞を越えるイオン輸送の増加は、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す。イオン輸送はコントロール細胞またはコントロール細胞株を越えるイオン輸送と比較され得る。このコントロールの細胞または細胞株は、必要に応じて、ＲＳＶに感染していないＨ４４１細胞株であってもよく、または試験化合物が存在しない、感染したＨ４４１細胞またはＨ４４１細胞株であってもよい。必要に応じて、試験化合物は、ピリミジン合成インヒビターを含む。必要に応じて、細胞をインビボで接触させる。必要に応じて、細胞をインビトロで接触させる。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本明細書において請求される方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されており、そして、純粋に本発明の例示を意図しており、添付の特許請求の範囲に含まれるものを除いて、そしてその程度まで、本発明者らが発明と考える範囲を制限することは意図していない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にする努力を行ったが、何らかの誤差および偏差が考慮されるべきである。
【００５６】
（方法）
（ウイルス接種物の調製およびマウスの感染）
ウイルスストックの調製およびいずれかの性別の８〜１２週齢の病原体を含まないＢＡＬＢ／ｃマウスの、ＲＳＶ Ａ２株（１００μｌ中１０６ ＰＦＵ）による鼻腔内感染を、Ｄａｖｉｓら，「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｖｅｏｌａｒ ｆｌｕｉｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８６：Ｌ１１２−Ｌ１２０（２００４）に記載の通りに行った。各実験群についてのデータは、最低２つの独立感染に由来した。
【００５７】
（平均末梢血酸素飽和の測定）
末梢血酸素飽和を、ＴＵＦＦＳＡＴＴＭパルスオキシメータ（Ｄａｔｅｘ−Ｏｈｍｅｄａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に接続したＰＲＥＥＭＩＥ ＯＸＹＴＩＰ（登録商標）センサ（Ｄａｔｅｘ−Ｏｈｍｅｄａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して意識のあるマウスにおいて測定した。マウスの極めて急速な脈拍数のため、酸素測定値は、動脈血および静脈血からの平均ヘモグロビンＯ２飽和（ＳｍＯ２）値である。
【００５８】
心拍数の測定は、換気によって変化する。ＥＣＧ追跡を用いて、ＡＦＣアッセイの開始時（ＨＲＳＴＡＲＴ）および終了時（ＨＲＥＮＤ）において心拍数（ＱＲＳ群数／ｃｍ）を測定した。３０分間の換気期間にわたる心拍数の変化％（ΔＨＲ３０％）を、（ＨＲＳＴＡＲＴ − ＨＲＥＮＤ）／ＨＲＳＴＡＲＴとして算出した。
【００５９】
（鼻の電位差の測定）
麻酔したマウスの外鼻孔にまたがる電位差（尾部を参照として用いる）を、Ｇｒｕｂｂら，（１９９４）「Ｈｙｐｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａ＋ ａｎｄ ｒａｉｓｅｄ Ｃａ（２＋）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉ，ｏｎ ｉｎ ｎａｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｏｆ ＣＦ ｍｉｃｅ」，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６６：Ｃ１４７８−Ｃ１４８３に以前に記載された通りに測定した。ベースラインＮＰＤを、乳酸加リンゲル溶液を用いた鼻上皮の灌流の間、記録した。ＮＰＤのアミロライド感受性成分（ＮＰＤＡＭＩＬ）を、１００μＭアミロライドを含む乳酸加リンゲル溶液を用いた灌流によって測定した。±６０ｎＡの電流パルスを、２００ＭΩのレジスタと直列にした１２Ｖの電池によって、上皮にまたがって印加した。（鼻の経上皮抵抗（ＮＲｔｅ）と比例する）電流パルスに応答したＮＰＤの変化を記録した（ΔＮＰＤ）。
【００６０】
（気管支肺胞洗浄液）
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を、サイトカインＥＬＩＳＡ用の無菌正常生理食塩溶液ｌｍｌまたはヌクレオチドアッセイ用の無菌生理食塩水０．３ｍｌを用いて、Ｄａｖｉｓら（２００４）に以前に記載されたとおりに集めた。洗浄液を遠心分離して細胞を除去し、そして上清を−８０℃で保存した。
【００６１】
（ＢＡＬＦ中のヌクレオチドの測定）
ＢＡＬＦ中の内因性ヌクレオチダーゼを熱変性（１００℃、３分間）し、そしてＵＴＰ／ＡＴＰ含有量を、それぞれ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼおよびルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。
【００６２】
（ＢＡＬＦ中のヘムの測定）
ＢＡＬＦヘム含有量を、Ｄｒａｂｋｉｎｓアッセイを使用して、分光光度学的に測定した。
【００６３】
（デノボのピリミジン合成およびプリン合成の全身阻害）
レフルノミド（５−メチルイソキサゾール−４−［４−トリフルオロメチル］カルボキシアニリド、１％のメチルセルロースを含んでいる蒸留水中３５ｍｇ／ｋｇ）を、感染前８日間にわたって、次いで感染期間全体を通して、３００μｌ／マウスの体積の経口栄養法によって、１日１回投与した。ビヒクルコントロールを、等しい体積の蒸留水中の１％メチルセルロースとして栄養法により与えた。ウリジン（０．９％ＮａＣｌ中１ｇ／ｋｇ）を、１００μｌの体積で１２時間毎に、腹腔内注入により投与した（８）。６−ＭＰ（１Ｎ ＮａＯＨ中３５ｍｇ／ｋｇ、２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨを７．９に調整した）を、感染前５日間にわたって、次いで感染期間全体を通して、１００μｌの体積で２４時間毎に注入することにより腹腔内投与した。
【００６４】
（ＢＡＬＦ中の炎症誘発性サイトカインの測定）
サイトカインレベルを、製造業者の指示に従ってＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定した。
【００６５】
（統計解析）
記述統計を、Ｉｎｓｔａｔソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して算出した。群平均間の差を、適切な事後検定を用いて、ＡＮＯＶＡまたはスチューデントｔ検定により解析した。すべてのデータ値を、平均±ＳＥで示す。
【００６６】
（結果）
（末梢血酸素化に対するＲＳＶ感染の影響）
ｄ２における基底ＡＦＣの減損は、偽感染動物と比較した、末梢血ＳｍＯ２の小さいが、重要な減少と関係していた（図２Ａ）。ＳｍＯ２の低下は、他の時点では見出されなかった。
【００６７】
低酸素血症のさらなる指標として、３−リードＥＣＧ記録は、ＡＦＣ測定過程の間での心拍数の変化（ΔＨＲ３０％）の証拠について、ｄ２における偽感染マウスおよびＲＳＶ感染マウスから評価した。ＲＳＶによる感染は、ｄ２でのΔＨＲ３０％における有意な増加と関連していた（図２Ｂおよび図２Ｃ）。２群間で麻酔の持続時間の差はなかった。
【００６８】
（鼻の電位差に対するＲＳＶ感染の影響）
偽感染動物と比較すると、２日間のＲＳＶ感染は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける基底ＮＰＤ（鼻の電位差）にもＮＰＤＡＭＩＬ（鼻の電位差のアミロライド感受性成分）にも影響を及ぼさなかった。しかし、基底ＮＰＤおよびＮＰＤＡＭＩＬは、ｄ４およびｄ８において著しく減少した（図３Ａ〜図３Ｃ）。
【００６９】
ＲＳＶ感染後のＮＲｔｅ（鼻の経上皮抵抗）の評価として、±６０ｎＡのパルスを鼻上皮に印加することによって惹起されるＮＰＤの変化（ΔＮＰＤ）を測定した。ΔＮＰＤは、ｄ４およびｄ８において偽感染コントロールよりも有意に大きかった（図３Ｄ〜図３Ｅ）。
【００７０】
（ＢＡＬＦヌクレオチドに対するＲＳＶ感染およびヌクレオチド合成阻害の影響）
未感染マウスからのＢＡＬＦは、等しいレベルのＡＴＰおよびＵＴＰを含んでいた。これらは偽感染によって影響を受けなかった。しかし、ＲＳＶ感染は、ＢＡＬＦヘム含有量の付随した増加を伴わずに（未感染マウスにおいて７．３±０．７μＭであるのに対して、ｄ２にて７．３±１．４μＭ）、ｄ２においてＵＴＰレベルおよびＡＴＰレベルの倍加をもたらした。ＢＡＬＦヌクレオチドは、ｄ６においてコントロールレベルに戻った（表１）。
【００７１】
ＢＡＬＦヌクレオチドレベルの上昇は、レフルノミド処置を受けたＲＳＶ感染マウスにおいてｄ２にて検出されなかった。事実、レフルノミド処置は、両方のヌクレオチドのＢＡＬＦ含有量を、未処置の非感染性マウスにおけるＢＡＬＦ含有量未満のレベルまで引き下げた（表１）。ウリジンの併用処置は、ＢＡＬＦのＵＴＰレベルおよびＡＴＰレベルに対するレフルノミドの効果を逆転させるだけでなく、未処置ＲＳＶ感染マウスにおけるＢＡＬＦヌクレオチド含有量を越えるＢＡＬＦヌクレオチド含有量の有意な増加を引き起こした。
【００７２】
【表１】
（マウスの体重に対するヌクレオチド合成阻害の影響）
前処置期間の間に、メチルセルロース処置マウスまたは未処置マウスと比較して、レフルノミドは、体重の有意な低下を引き起こさなかった。さらに重要なことに、感染期間の間、レフルノミド処置は、Ｄｌおよびｄ２において通常見られるＢＡＬＢ／ｃマウスの体重減少の程度を有意に減少させた（図４）。レフルノミド処置期間全体にわたるウリジンの併用投与は、この影響を妨げなかった。
【００７３】
この知見とは対照的に、６−ＭＰでの処置は、未処置のＲＳＶ感染マウスおよびレフルノミドで処置されたＲＳＶ感染マウスと比較して、前感染期間全体にわたる体重の有意な減少失、麻酔に対する乏しい寛容性（散発的な死をもたらす）およびＤｌおよびｄ２における体重減少の有意な増加をもたらした（図４Ｂ）。
【００７４】
（ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に対するヌクレオチド合成阻害の影響）
ＲＳＶ感染マウスのレフルノミド前処置は、ｄ２におけるＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害を遮断した（表２）。この影響は、メチルセルロース単独を栄養法で与えることによって模倣されず、併用ウリジン処置によって逆転された。ウリジン処置単独は、ＡＦＣに影響を及ぼさなかった。レフルノミド処置はまた、ＡＦＣに正常なアミロライド感受性の回復をもたらした：ｄ２における未処置マウスでは６１％であり、未感染性マウスでは−８％であるのに対して、ｄ２にてレフルノミド処置マウスのＡＦＣの５７％はアミロライド感受性であった。
【００７５】
レフルノミド治療の有益な効果とは対照的に、デノボプリン合成インヒビター６‐メルカプトプリン（６−ＭＰ）を用いた全身前処置の類似のレジメンは、ｄ２においてＡＦＣに影響を及ぼさなかった（表２）。最後に、レフルノミドを用いた未感染性マウスの処置は、ＡＦＣの有意な阻害をもたらした。
【００７６】
【表２】
デノボピリミジン合成を全身的に遮断するために、マウスに、感染前に、次いで感染後０時間および２４時間において、３００ｍｌ／マウスのジヒドロオロト酸レダクターゼ（ＤＨＯＲ）インヒビターレフルノミド（１％メチルセルロース中に懸濁された５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを１日１回８日間にわたって栄養法により与えた。感染後４８時間において、ＡＦＣ滴注物（ｉｎｓｔｉｌｌａｔｅ）への添加なしで、ＡＦＣ研究を行った。
【００７７】
示される場合、レフルノミド処置期間（１ｍｇ／ｋｇのＩ．Ｐ．、ｑｌ２ｈ）の全体を通して、ウリジンの併用投与により、レフルノミド（ＬＥＦ）の影響を逆転させる試みを行った。図５に示すように、レフルノミド（ＬＥＦ）をマウスへ栄養法により与えることにより、感染後２日目におけるＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害が逆転された。ＬＥＦの影響は、ウリジンの併用投与により防止される。ＬＥＦは、正常マウスにおけるＡＦＣに対して影響を及ぼさなかった。
【００７８】
ＬＥＦ処置はまた、感染後１日目および２日目の体重減少の、そして、肺胞洗浄液の炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮ−ａ、Ｉｌ−１ｂ、ＴＮＦ−ａ、ＫＣ）濃度の有意な減少をもたらした。図６に示すように、レフルノミド（ＬＥＦ）をマウスに栄養法により与えることにより、感染後２日目に肺の水分含量におけるＲＳＶ誘発性増加を逆転させた。レフルノミドの影響は、ウリジンの併用投与により防止された。重要なことに、ＬＥＦおよび／またはウリジンを用いたマウスの処置は、感染後２日目に肺組織におけるウイルス複製に影響を及ぼさなかった。
【００７９】
図７に示すように、ＡＦＣ滴注物中への体積を調整した陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）の広い範囲のインヒビターの添加は、感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を逆転させた。使用したいくつかのインヒビターはまた、様々な他の細胞機能に対して別の影響を及ぼしたが、これらの薬剤は共通の影響としてＶＲＡＣ阻害のみを有する。しかし、ＮＰＰＢ（１００ｍＭ）は、比較的ＶＲＡＣ特異的である。この知見は、ＵＴＰが初期ＲＳＶ感染間、ＶＲＡＣを介して細胞から放出されることを証明した。フルオキセチン（１０ｍＭ）は、選択的セロトニン再取り込みインヒビターとしても作用する。ベラパミル（１０ｍＭ）は、Ｃａ＋＋チャネル遮断剤としても作用する。タモキシフェン（２５ｍＭ）は、抗エストロゲンでもある。
【００８０】
ＲＳウイルスは、重大な呼吸上皮細胞病理を誘発することなく、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルの感染の後の初期の時点でアミロライド感受性ＡＦＣ（能動的なＮａ＋輸送を表す）を阻害する。さらに、ＡＦＣに対するＲＳＶの阻害効果は、肺のＰ２Ｙプリン作用性レセプターに対するその作用によって、ＵＴＰにより媒介される。
【００８１】
感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害を媒介するＵＴＰは、デノボ合成に由来し、そして、この経路の阻害はＡＦＣのＲＳＶ誘発性減少を防止し、ウイルス複製を変えることなく肺水分含量を増加させる。さらに、感染後２日目にＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害を媒介するＵＴＰは、体積が調整された陰イオンチャネルを介して放出される。
【００８２】
感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害に対するレフルノミドの影響を実証した。マウスを、経口栄養法によって８日間、レフルノミド（５ｍｇ／ｋｇ、１％メチルセルロース中に懸濁、１日１回）を用いて前処置し、次いでＲＳＶに感染させ、そして感染後２４時間目に再びレフルノミドで処置した。このレジメンにより、感染後２日目にＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害が防止された。この影響は、メチルセルロースを単独で栄養法により与えることによって模倣されず、レフルノミド処置期間全体を通してのウリジンの併用投与（１０日間の１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．ｑｌ２ｈ）によって逆転された。さらに、ウリジン処置単独は、ＡＦＣに影響を及ぼさなかった。レフルノミド処置も、正常な（偽感染）マウスのＡＦＣに対して有害な影響を有さなかった。
【００８３】
【表３】
レフルノミドの阻害効果は、単なる抗ウイルス効果の結果でなかった。ウイルス複製は、メチルセルロース、レフルノミドまたはウリジンでの処置によって影響を受けなかった。それゆえ、ＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害の抑制は、ウイルス複製を防止することの単純な結果ではなく、デノボピリミジン合成に対するレフルノミドの特異的阻害効果の結果であった。
【００８４】
レフルノミド治療は、肺の湿重量：乾燥重量の比率（肺の水分含量および水腫形成の指標）の正常化と関係していた。この比率は、ＲＳＶ感染後２日目に増加する。ウリジンの併用処置は、この影響を逆転させ、湿重量：乾燥重量の比率を（偽感染マウスと比較して）増加させた。レフルノミド治療は、感染後１日目および２日目のＢＡＬＢ／ｃマウスに通常見られる体重減少の程度を有意に減少させた。このことは、食欲（おそらく抗炎症効果に関連がある）に対する有益な効果を示唆する。これはまた、この用量での非常に限られたレフルノミド毒性を示唆した。ある程度の低酸素血症が通常明白である場合、レフルノミド治療は、感染後２日目の平均血中Ｏ２飽和度を改善した。レフルノミド治療は、肺胞洗浄液の炎症誘発性サイトカイン（インターフェロン−α、インターロイキン−１β、ＫＣ［ヒトインターロイキン８のネズミホモログ］および腫瘍壊死因子−α）のレベルを有意に低下させた。これは、併用ウリジン治療によって、ほんの部分的に逆転された（従って、この薬物による非特異的チロシンキナーゼ阻害の結果で一部あり得る）効果である。
【００８５】
まとめると、これらのデータは、レフルノミドが、直接的な抗ウイルス効果を有せずに、ＲＳＶ疾患に対していくつかの有益な効果を有することを証明した。これらの効果は、低酸素血症および肺水腫の排除、体重の改善および肺の炎症の減少を含んでいた。
【００８６】
（肺水分含量に対するヌクレオチド合成阻害の影響）
レフルノミドを用いた全身治療は、２日目の正常な肺湿重量：乾燥重量の比率を回復させ、一方、レフルノミド処置期間の全体を通してのウリジンの併用投与はこの効果を防止した（図８Ａ）。しかし、６−ＭＰ（これは、２日目にＡＦＣに対して有益な効果を有さなかった）を用いた全身治療は、２日目の正常な肺湿重量：乾燥重量の比率を変化させなかった（図８Ｂ）。
【００８７】
（炎症誘発性サイトカインに対するヌクレオチド合成阻害の影響）
レフルノミドは、免疫抑制剤として臨床的に使われる。治療レジメンの効力を確認するために、ＢＡＬＦ中の炎症誘発性サイトカインのレベルに対するその効果を分析した。ＩＬ−４もＩＬ−１０も、感染後のいかなる時点でも検出可能ではなかった。ほんの少量のＩＬ−１βおよびＫＣ（ヒトＩＬ−８のネズミホモログ）は、偽感染マウスからのＢＡＬＦ中で検出された（表４）。ＩＦＮ−γ以外の他の全てのサイトカインの有意な量がｄ２に存在したが、ＩＬ−１β、ＫＣおよびＴＮＦ−γのレベルは、ｄ４〜ｄ８で減少した。有意な量のＩＦＮ−γが、ｄ６およびｄ８においてＢＡＬＦ中でのみ見出された。
【００８８】
レフルノミド治療は、ｄ２におけるＢＡＬＦ中のＩＦＮ−α、ＩＬ−１β、ＫＣおよびＴＮＦ−αのレベルを顕著に低下させた（表４）。ＩＦＮ−αを除いて、この効果は、併用ウリジン治療によってほんの部分的に逆転された。
【００８９】
重要なことに、６−ＭＰ治療は、レフルノミド治療によって引き起こされるレベルに匹敵する、ＢＡＬＦ中のＩＦＮ−α、ＩＬ−１β、ＫＣ、およびＴＮＦ−αのレベルの低下をもたらした（表４）。ｄ２においていずれかの薬剤で処置しマウスにおいて、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１β、ＫＣ、およびＴＮＦ−αのレベルの間に有意差は存在しなかった。
【００９０】
【表４】
（マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響）
ｄ２でのウイルス複製は、レフルノミド処置でもウリジン処置でも影響を受けなかった（図９Ａ）。同様に、６−ＭＰ前処置は、ｄ２においてマウス肺のウイルス複製に対して有意な阻害効果を有しなかった（図９Ｂ）。レフルノミド処置を８日間の感染期間全体を通して続けた場合、ウイルス複製はｄ８において高レベルで維持された（図９Ｃ）。しかし、ｄ２においてレフルノミド処置を中断した場合、ウイルス複製はｄ８において最小限増加するだけであった（図９Ｄ）。
【００９１】
（ＲＳＶ感染後の低酸素血症に対するレフルノミド治療の影響）
レフルノミド治療は、ｄ２においてＳｍＯ２読み取り値の正常化をもたらした（図１０Ａ）。同様に、レフルノミド治療は、ｄ２においてＡＦＣ手順の間にＲＳＶ感染マウスに見られるΔＨＲ３０％の増加を防止した（図１０Ｂ）。
【００９２】
（ＲＳＶ感染後の鼻の電位差に対するレフルノミド治療の影響）
感染期間全体を通してのレフルノミドを用いた処置は、基底ＮＰＤおよびＮＰＤＡＭＩＬ（図１１Ａ〜１１Ｃ）のＲＳＶ誘発性低下を防止した。
【００９３】
（ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に対する陰イオンチャネル遮断の影響）
ｄ２でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害は、いくつかの構造的に無関係なＶＲＡＣインヒビターの各々のＡＦＣ滴注物への添加により遮断された：フルオキセチン、タモキシフェン、クロミフェン、ベラパミル、ＮＰＰＢまたはＩＡＡ−９４（表５）。この効果は、５００ｎＭ ＵＴＰの滴注物への併用添加によって逆転された。対照的に、ｄ２でのＡＦＣは、それぞれ、グリベンクラミドおよびニフルム酸による、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質およびＣａ２＋活性化Ｃｌ−チャネル活性の阻害によって影響を受けなかった。
【００９４】
【表５】
（ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害のＡ７７−１７２６の影響）
以前から公知のように、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ａ２株を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内感染は、感染後（ｐ．ｉ．）２日目および４日目での基底ＡＦＣおよびアミロライド感受性ＡＦＣの減少をもたらし、この阻害は、ＵＴＰにより媒介され、Ｐ２Ｙレセプター（ＡＪＰＬＣＭＰ，２００４）を経て作用した。感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害は、ＡＦＣ滴注物への２５ｍＭのＡ７７−１７２６（これは、デノボピリミジン合成を遮断した）の添加により防止されるが、２５ｍＭのミコフェノール酸または６‐メルカプトプリン（両方とも、デノボプリン合成を遮断する）のいずれによっても防止されないことがさらに示された。Ａ７７−１７２６により媒介される遮断は、５０ｍＭウリジン（これは、サルベージ経路を介するピリミジン合成を許容する）の添加によって逆転されたが、２５ｍＭゲニステイン（これは、Ａ７７−１７２６の非特異的チロシンキナーゼインヒビター効果を模倣する）によっては再現されなかった。このことは、Ａ７７−１７２６の遮断効果がデノボピリミジン合成経路により媒介されたことを示す。同様に、デノボピリミジン合成インヒビターレフルノミド（１％メチルセルロース中５ｍｇ／ｋｇのｐ．ｏ．を１０日間）を用いたマウスの処置は、ＡＦＣに対するＲＳＶの阻害効果を逆転させた。さらに、体積を調整した陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）機能のインヒビター（例えば、フルオキセチン（１０ｍＭ）、ベラパミル（１０ｍＭ）およびタモキシフェン（２５ｍＭ））はまた、感染後２日目にＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を遮断した。まとめて考えると、これらのデータは、ＲＳＶ感染の間にＡＦＣを阻害するＵＴＰがデノボピリミジン合成に由来するとともにＶＲＡＣを介して放出されることを実証した。これらの経路は、ＡＦＣのＵＴＰによって誘導される減少を防止する新しい治療アプローチを提供する。これは、ＲＳＶ感染後の、体積が増加した流体粘液、気道うっ血および鼻漏の形成に寄与する。
【００９５】
図１２に示すように、ＲＳＶでの感染は、感染後（ｐ．ｉ．）２日目および４日目での基底肺胞流体クリアランス（ＡＦＣ）を有意に阻害する。非感染マウス（Ｕ）と比較して、偽感染（Ｍ）は、ＡＦＣに影響を及ぼさない。基底ＡＦＣは、２日目において（偽感染値から）４３％阻害され、４日目において２６％阻害された。ＡＦＣのアミロライド感受性もまた、１日目に減少しており、２日目および４日目には存在しなかった。
【００９６】
感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害は、アピラーゼ（これはＵＴＰおよびＡＴＰの両方を分解する）またはＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（これは、グルコース一リン酸および無機ピロホスファターゼの存在下でＵＴＰを分解する）をＡＦＣ滴注物に添加することによって逆転されたが、ヘキソキナーゼ（これは、ブドウ糖の存在下でＡＴＰを分解する）の添加によっては逆転されなかった。Ｐ２Ｙレセプター特異的アンタゴニスト（２００ｍＭ ＸＡＭＲ０７２１）を滴注物に添加することによっても、感染後２日目にてＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害が逆転した。
【００９７】
５％脂肪酸非含有ＢＳＡを含む０．３ｍｌの等モル量の（ｉｓｏｓｍｏｌａｒ）ＮａＣｌの気管内滴注後３０分間の期間にわたって、正常な体温および血中ガスを有する、麻酔をかけ、通気されたＢＡＬＢ／ｃマウスについて、ＡＦＣ研究を行った。１群あたりで分析したマウス数を、各グラフの関連した棒に列挙する。
【００９８】
図１３に示すように、ＡＦＣ滴注物にジヒドロオロト酸レダクターゼインヒビター（２５μＭ Ａ７７−１７２６）を添加することにより、感染後２日目にてＡＦＣのＲＳＶり媒介性阻害が逆転した。Ａ７７−１７２６の効果は、ＡＦＣ滴注物への５０ｍＭウリジンの併用添加によって完全に逆転されたが、２５ｍＭゲニステイン（非特異的なチロシンキナーゼインヒビター）によっては再現されない。従って、Ａ７７−１７２６の効果は、デノボピリミジン合成経路に特異的である。
【００９９】
図１４に示すように、ＡＦＣ滴注物に対するＩＭＰデヒドロゲナーゼインヒビター（２５μＭの６−ＭＰまたはＭＰＡ）の添加は、感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に対してごく軽微な影響しか及ぼさなかった。ＩＭＰデヒドロゲナーゼインヒビターの影響が小さいのは、ＡＴＰの枯渇の結果であった。ＡＴＰは、デノボピリミジン合成のために必要な前駆体である。ＭＰＡの影響は、プリンサルベージ経路を介したＡＴＰの合成を許容する、ＡＦＣ滴注物への５０ｍＭヒポキサンチン（ＨＸＡ）の併用添加によって完全に逆転された。この知見は、ＲＳＶ感染注のＡＴＰ貯蔵が少ないことを実証した。
【０１００】
（感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害は、デノボピリミジン合成のインヒビターであるＡ７７−１７２６によって防止される）
Ａ７７−１７２６の影響は、外因性ウリジンの添加により遮断された。外因性ウリジンは、サルベージ経路を介したＵＴＰ合成を促進する。そして、Ａ７７−１７２６の影響は、ゲニステインによって再現されない。ゲニステインは、Ａ７７−１７２６の非特異的チロシンキナーゼ阻害効果を模倣する。おそらくＡＴＰ合成（ＡＴＰは、デノボでのピリミジン合成のために必要な前駆体である）の減少の結果として、デノボプリン合成のインヒビター（例えば、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）および６‐メルカプトプリン（６−ＭＰ）は、ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に対してごくわずかな遮断効果を有した。さらに、この影響は、外因性ヒポキサンチンの添加により遮断された。外因性ヒポキサンチンは、サルベージ経路を介したＡＴＰ合成を促進する。興味深いことに、感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害はまた、体積を調整された陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）（これは、ＡＴＰおよびＵＴＰについて放出機構と提唱されている）の様々な異なるインヒビターによって防止され、そしてＲｈｏキナーゼ（これは、ＲＳＶにより活性化されることが公知であり、ＶＲＡＣを活性化することもまた公知である）の阻害により防止された。
【０１０１】
【表６】
（感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害に対する感染後でのＡ７７−１７２６処置）
マウスを、Ａ７７−１７２６の鼻腔内投与（１００μｌ正常生理食塩水中５０μＭ、両方の鼻孔に分けた）によって感染後２４時間にて処置した場合、感染後２４時間でのＡＦＣに対するＲＳＶの阻害効果は完全に遮断された。このことは、肺に局所的に投与した場合、Ａ７７−１７２６がデノボピリミジン合成に対して長期にわたる阻害効果を有したことを実証する。Ａ７７−１７２６の鼻腔内前処置はまた、ＲＳＶ感染の翌日に増加する肺の湿重量：乾燥重量の比率（肺の水分含量および水腫形成の指標）の正常化とも関係していた。
【０１０２】
【表７】
さまざまな改変および変更は、本明細書において記載されている化合物、組成物および方法になされ得る。本明細書において記載されている化合物、組成物および方法の他の局面は、明細書を考慮することにより、そして本明細書において開示される化合物、組成物および方法を実施することにより、明らかである。明細書および実施例が例示とみなされることが意図される。
【０１０３】
【表８−１】
【０１０４】
【表８−２】
【０１０５】
【表８−３】
【０１０６】
【表８−４】
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、ピリミジン生合成経路およびプリン生合成経路を図示している概略図である。
【図２Ａ】図２は、末梢酸素化に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ａ）意識のあるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳｍＯ２（混合酸素飽和）に対するＲＳＶ感染の影響の時間経過（１日につきｎ＝１０〜３６）。＊偽感染したマウスと比較して、ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】図２は、末梢酸素化に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｂ）ｄ２での偽感染したマウスおよびＲＳＶ感染したマウスについての肺胞流体クリアランス（ＡＦＣ）期間の始めと終わりのサンプル３−リードＥＣＧ（心電図）トレース。
【図２Ｃ】図２は、末梢酸素化に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｃ）ｄ２でのΔＨＲ３０％でのＲＳＶ感染の影響（偽感染したマウスについてｎ＝１７、ＲＳＶ感染したマウスについてｎ＝１１）。
【図３Ａ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ａ）ｄ４での偽感染したマウスおよびＲＳＶ感染したマウスにおけるＮＰＤの代表的トレース。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図３Ｂ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｂ）基底ＮＰＤに対するＲＳＶ感染の影響。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図３Ｃ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｃ）ＮＰＤのアミロライド感受性成分（ＮＰＤ ＡＭＩＬ）に対するＲＳＶ感染の影響。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図３Ｄ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｄ）ｄ４にて偽感染したマウスおよびＲＳＶ感染マウスの鼻上皮に対して±６０ｎＡパルスを印加したＮＰＤにおける変化の中でサンプルトレース。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図３Ｅ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｅ）鼻上皮に対して±６０ｎＡパルスを印加したΔＮＰＤに対するＲＳＶ感染の影響。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図４Ａ】図４は、ＲＳＶ感染後の、体重に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ感染後の急な体重減少に対するレフルノミド（ＵＴＰ合成のインヒビター）の影響（未処置マウスについてｎ＝３５、レフルノミド処置したマウスについてｎ＝１９）。＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．００５、＊＊＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図４Ｂ】図４は、ＲＳＶ感染後の、体重に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ感染後の急な体重減少に対する６−ＭＰ処置の影響（未処置マウスについてｎ＝３５、６−ＭＰ処置マウスについてｎ＝３０）。＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．００５、＊＊＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図５】図５は、レフルノミド（ＬＥＦ）をマウスに栄養法で与えることの効果により、感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を逆転させることを示す。ＬＥＦの影響は、ウリジンの併用投与により防止される。
【図６】図６は、レフルノミド（ＬＥＦ）をマウスに栄養法で与えることの効果により、感染後２日目での肺水含量におけるＲＳＶ誘導性増加を逆転させることを示す。レフルノミドの影響は、ウリジンの併用投与により防止される。重要なことに、ＬＥＦおよび／またはウリジンを用いたマウスの処置は、感染後２日目に肺組織のウイルス複製に対して影響を及ぼさない。
【図７】図７は、ＡＦＣ滴注物に対する体積を調整した陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）のの広範囲のインヒビターの添加の影響により、感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を逆転させることを示す。
【図８Ａ】図８は、ＲＳＶ感染後の肺水分含量に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ａ）ｄ２での肺水分含量に対するレフルノミドおよびウリジン処置の影響（すべての群についてｎ＝７〜８）。＊＊＊未感染マウスにおける湿重量：乾燥重量比率と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図８Ｂ】図８は、ＲＳＶ感染後の肺水分含量に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｂ）ｄ２での肺水分含量に対する６−ＭＰの影響（未感染マウスについてｎ＝８；未処置のＲＳＶ感染マウスについてｎ＝７；６−ＭＰ処置マウスについてｎ＝１５）。肺水分含量を、湿重量：乾燥重量比率によって測定した。＊＊＊未感染マウスにおける湿重量：乾燥重量比率と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図９Ａ】図９は、マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ａ）ｄ２でのウイルス複製に対するレフルノミドおよびウリジン処置の影響（未処置のウリジン処置マウスおよびレフルノミドおよびウリジン処置マウスについてｎ＝６；レフルノミド処置マウスについてｎ＝１２）。破線は、アッセイの検出限界を示す。＊＊＊未処置マウスにおけるウイルス力価と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図９Ｂ】図９は、マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｂ）ｄ２でのウイルス複製に対する６−ＭＰの影響（未処置マウスについてｎ＝６；６−ＭＰ処置マウスについてｎ＝１２）。破線は、アッセイの検出限界を示す。＊＊＊未処置マウスにおけるウイルス力価と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図９Ｃ】図９は、マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｃ）ｄ８でのウイルス複製に対する継続したレフルノミド処置の影響（未処置マウスについてｎ＝６；レフルノミド処置マウスについてｎ＝１２）。破線は、アッセイの検出限界を示す。＊＊＊未処置マウスにおけるウイルス力価と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図９Ｄ】図９は、マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｄ）ｄ８でのウイルス複製に対するｄ２へのレフルノミド処置の影響（両群についてｎ＝６）。破線は、アッセイの検出限界を示す。＊＊＊未処置マウスにおけるウイルス力価と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図１０Ａ】図１０は、ＲＳＶ感染後の低酸素血症に対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ａ）ｄ２でのマウスのＳｍＯ２に対するレフルノミド処置の影響（未処置のＲＳＶ感染マウスについてｎ＝８；レフルノミド処置したＲＳＶ感染マウスについてｎ＝７）。＊未処置の値と比較して、ｐ＜０．０５。
【図１０Ｂ】図１０は、ＲＳＶ感染後の低酸素血症に対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ｂ）ＲＳＶ感染およびｄ２でのΔＨＲ３０％でのレフルノミド処置の影響（未処置のＲＳＶ感染マウスについてｎ＝１１；レフルノミド処置したＲＳＶ感染マウスについてｎ＝９）。＊未処置の値と比較して、ｐ＜０．０５。
【図１１Ａ】図１１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＰＤに対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ａ）ｄ４でのレフルノミド処置したＲＳＶ感染マウスにおけるＮＰＤのサンプルトレース。すべての群についてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、そして矢印は１００μＭアミロライド添加時間を示す。＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．０５、＊＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．００５。
【図１１Ｂ】図１１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＰＤに対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ｂ）ＲＳＶ感染マウスにおける基底ＮＰＤに対するレフルノミド処置の影響。すべての群についてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、そして矢印は１００μＭアミロライド添加時間を示す。＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．０５、＊＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．００５。
【図１１Ｃ】図１１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＰＤに対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ｃ）ＲＳＶ感染マウスにおけるＮＰＤＡＭＩＬに対するレフルノミド処置の影響。すべての群についてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、そして矢印は１００μＭアミロライド添加時間を示す。＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．０５、＊＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．００５。
【図１２】図１２は、ＲＳＶでの感染が、感染後（ｉ．ｐ．）２日目および４日目の基底肺胞流体クリアランス（ＡＦＣ）を有意に阻害することを示す。偽感染（Ｍ）は、非感染マウス（Ｕ）と比較して、ＡＦＣに影響を及ぼさない。基底ＡＦＣは、２日目に（偽感染の値から）４３％阻害され、そして４日目に２６％阻害された。ＡＦＣのアミロライド感受性はまた、１日目に減少しており、そして感染後２日目および４日目には存在しなかった。
【図１３】図１３は、ＡＦＣ滴注物に対するジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビター（２５ｍμ Ａ７７−１７２６）の添加が、感染後２日目にＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を逆転させることを示す。Ａ７７−１７２６の影響は、５０ｍＭウリジンのＡＦＣ滴注物への併用添加によって完全に逆転されるが、２５ｍＭゲニステイン（非特異的チロシンキナーゼインヒビター）により再現されない。
【図１４】図１４は、ＡＦＣ滴注物に対するＩＭＰデヒドロゲナーゼのインヒビター（２５μＭの６−ＭＰまたはＭＰＡ）の添加が感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に軽微な影響しか及ぼさないことを示す。ＩＭＰデヒドロゲナーゼインヒビターの小さい効果はＡＴＰ枯渇の結果であり、そしてそれはデノボピリミジン合成のために必要な前駆体である。ＭＰＡ効果は５０ｍＭヒポキサンチン（ＨＸＡ）のＡＦＣ滴注物への併用添加によって完全に逆転され、プリンサルベージ経路を介するＡＴＰ合成を許容した。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００４年５月２１日に出願された米国仮出願第６０／５７３，５５８号の利益を主張する。米国仮出願第６０／５７３，５５８号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（謝辞）
本発明は、国立衛生研究所から助成金番号ＲＲ１７６２６、ＨＬ３１１９７、ＨＬ０７５５４０、ＨＬ５１１７３およびＨＬ７２８１７の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、世界中の乳児および小児の下気道（ＬＲＴ）疾患の最も一般的な原因であり、成人における市中感染性ＬＲＴ感染の原因と過小診断されることもある。
【０００４】
１９８０年〜１９９６年の間に、推定１６５万人の細気管支炎による入院患者が５年より若い小児で発生し、７００万の入院日数を占めた。これらの入院の５７パーセントは６ヵ月より若い小児に発生し、そして８１％は１歳より若い小児に発生した。１歳より若い小児では、毎年の細気管支炎入院率は、１９９６年の１０００人につき１２．９人から、１９８０年の１０００人につき３１．２人まで、２．４倍増加した。細気管支炎と関連した１歳より若い小児の中の下気道疾患による入院の比率は、１９８０年の２２．２％から１９９６年の４７．４％まで増加した；入院全体では、この比率は、５．４％から１６．４％まで増加した。１歳より若い小児での推定５１，２４０〜８１，９８５の毎年の細気管支炎入院は、ＲＳＶ感染に関連していた。肺炎を有する細気管支炎による入院も考慮される場合、ＲＳＶ感染は、米国単独において、１年当たりの１２６，０００までの入院の原因である。現在、ＲＳＶに関する有効な処置がない。
【０００５】
鼻漏、肺うっ血および低酸素血症は、ＲＳＶ感染を含め、大部分の呼吸器感染の重要な構成要素であるが、この種の疾患における変化した肺流体力学の基礎をなしている機構はほとんど理解されていない。さらに、疫学研究は、乳児期における重篤なＲＳウイルス（ＲＳＶ）誘発性細気管支炎とアレルギー疾患との強い関連を示唆する。ウシにおけるＲＳＶ感染もまた、主に重要な感染であり、ここで、この種の感染は重篤な呼吸器疾患をもたらし得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当該分野において必要なのは、ＲＳＶ感染を含め、呼吸器感染を予防および処置するための改善された方法および組成物である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本明細書において提供されるのは、ピリミジン合成インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物である。この組成物は、被験体の肺上皮細胞への局所投与に適している。本明細書においてまた提供されるのは、治療量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を少なくとも１測定用量（ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ）含むデバイスである。各測定用量は、被験体における肺疾患を処置するための治療量またはその一部のピリミジン合成インヒビターを含む。
【０００８】
本明細書においてさらに提供されるのは、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスを増加させる方法、被験体における肺疾患を処置する方法、被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法、ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定し、そして有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法、ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定し、そしてこの被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法、ならびに肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法である。
【０００９】
さらなる利点は、以下に続く記載に部分的に示されており、そしてこの記載から部分的に明らかであるか、または下記の局面の実施により学ばれ得る。後述する利点は、添付の請求の範囲において、特に指摘される要素および組合せにより理解されて、実現および獲得される。前述の一般的説明および以下の詳細な説明が例示および説明にすぎず、限定的ではないことを理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書に組み込まれて、その一部を構成する、添付の図面は、下記のいくつかの局面を例示する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明およびその中に含まれる実施例、ならびに図面およびそれらの上記および下記の説明を参照することでより容易に理解され得る。
【００１２】
本願全体を通して、さまざまな刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本願が関係する技術水準をより完全に記載するために、その全体が本願において本明細書中に参考として援用される。開示される参考文献はまた、この参考文献を記載する文章で考察される参考文献に含まれる主題が、個々に、そして、具体的に本明細書中に参考として援用される。
【００１３】
明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数系の言及を含む。従って、例えば、「ピリミジン合成インヒビター」の言及は、一つ以上のピリミジン合成インヒビターの混合物を含む、などである。同様に、「肺上皮細胞」の言及は、一つ以上の肺上皮細胞を含む。従って、例えば、「肺上皮細胞」への投与に適した組成物は、一つ以上のこの種の細胞への投与に適している。
【００１４】
略号が、全体に使われることができ、これは、以下の意味を有し得る。この種の略号としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＡＦＣ（肺胞の流体クリアランス）、ＡＬＦ（気腔の内側を覆う流体；Ａｉｒｓｐａｃｅ ｌｉｎｉｎｇ ｆｌｕｉｄ）、ＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）、ΔＮＰＤ（鼻の電位差の変化）、ＤＨＯＤ（ジヒドロ−オロト酸デヒドロゲナーゼ）、ＨＸＡ（ヒポキサンチン）、ＨＲＳＴＡＲＴ（換気期間開始時の心拍数）、ＨＲＥＮＤ（換気期間終了時の心拍数）、ＬＥＦ（レフルノミド）、ＭＰＡ（ミコフェノール酸）、６−ＭＰ（６−メルカプトプリン）、ＮＰＤ（鼻の電位差）、ＮＰＤＡＭＩＬ（鼻の電位差のアミロライド感受性成分）、ＮＲｔｅ（鼻の経上皮抵抗）、％ΔＨＲ３０（３０分の換気期間にわたる心拍数の変化％）、Ｐ２ＹＲ（Ｐ２Ｙプリン作動性ヌクレオチドレセプター）、ＲＳＶ（ＲＳウイルス）、ＳｍＯ２（平均ヘモグロビンＯ２飽和）およびＶＲＡＣ（体積が調整された陰イオンチャネル）。さらに、他の略号もまた使用され得る。そして、それは当業者に明らかであり、そして／または所定の略号が使われる文脈から明白である。
【００１５】
範囲は、「約」１つの特定の値から、そして／または「約」別の特定の値までとして本明細書において表現され得る。この種の範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、そして／または他の特定の値までを含む。同様に、値を近似値として表現する場合、先行詞「約」を用いることにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲の各々の終点が、他の終点に関して、そして、他の終点とは独立して、の両方において重要であるとさらに理解される。
【００１６】
全体で使用される場合、「被験体」によって、個体が意味される。従って、「被験体」は、家庭用動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および鳥類を含むことができる。一つの局面では、被験体は、ウシ種（例えば、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｂｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓまたはその交配種）である。別の局面においては、被験体は、哺乳類（例えば、霊長類またはヒト）である。
【００１７】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載されている事象または環境が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、この記載は、この事象または環境が起こる例とそれが起こらない例とを包含する。例えば、語句「必要に応じて、この組成物は、組合せを含み得る」は、この組成物が、異なる分子の組合せを含んでもよく、または組合せを含まなくてもよく、この記載が、組合せおよび組合せが存在しない（すなわち、組合せの個々のメンバー）ことの両方を包含することを意味する。
【００１８】
用語「より高い」、「増加する」、「上昇する」または「上昇」とは、コントロール値（例えば、基底レベル）を上回る増加を言及する。用語「低い」、「より低い」、「減少する」または「減少」とは、コントロール値（例えば、基底レベル）未満への減少を言及する。例えば、基底レベルは、薬剤（例えば、レフルノミド、Ａ７７−１７２６または他のピリミジン合成インヒビター）の添加前または添加なしでの正常なインビトロレベルである。コントロールレベルはまた、疾患状態の非存在下の被験体またはサンプルからのレベルを含み得る。コントロール値は、疾患または処置の前または後に、同じ被験体またはサンプルから決定され得る。コントロール値は、疾患または処置が存在しない、異なる被験体またはサンプルに由来し得る。
【００１９】
本明細書において提供されるのは、ピリミジン合成インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物である。この種の組成物は、以下の方法において使用され得る：肺上皮細胞によるＮａ＋依存流体クリアランスを増加させる方法；被験体における肺疾患を処置する方法；被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法；ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定し、そして有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法；ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定し、そしてこの被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する方法；ならびに肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法。これらの方法は、以下でより詳細に記載される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「処置」は、被験体における所定の呼吸器感染の症状または身体的徴候の減少を包含する。従って、開示された組成物および方法は、被験体における呼吸器感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らすために用いられ得る。この種の症状および身体的徴候としては、鼻漏、低酸素血症、肺水腫、減少した心機能、咳、体重減少、喘鳴、悪液質および肺うっ血が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２１】
開示された組成物および方法を用いた処置が有用な１つの例示的な疾患は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染である。ＲＳＶは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮａ＋依存性肺胞流体クリアランス（ＡＦＣ）を阻害する。そして、Ｐ２Ｙヌクレオチドレセプターアンタゴニストおよびピリミジノ溶解性酵素はＡＦＣの阻害を防止する。ＲＳＶ感染は、ＡＬＦへのＵＴＰおよびＡＴＰの両方の放出をもたらし、そしてＡＦＣにおける減少は、結果として宿主の重要な生理学的障害をもたらすＲＳＶ感染の初期相と関係している。
【００２２】
重篤なＲＳＶ感染のために肺換気が行われる乳児の肺において、サーファクタントタンパク質ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄのレベルは低下し、主要なサーファクタントリン脂質であるジパルミトイルホスファチジルコリンの量が減少し、そして回収されたサーファクタントの生物物理学的界面活性は、コントロールの乳児と比較して損なわれる（ＫｅｒｒおよびＰａｔｔｏｎ，１９９９）。βアドレナリン作用性レセプターアゴニスト（βＡＲＡ）気管支拡張剤は、細胞内サイクリックＡＭＰを上昇させることによって成人呼吸窮迫症候群において肺胞流体クリアランスを改善するために用いられているが、呼吸上皮におけるβアドレナリン作用性レセプターによって媒介されるシグナル伝達は、ＲＳＶ感染後に異常であり、これは、ＲＳＶ治療におけるβＡＲＡの乏しい効力を説明し得る。従って、ＲＳＶ感染の場合、開示された方法および組成物は、乳児においてジパルミトイルホスファチジルコリンのようなサーファクタントリン脂質のレベルを上昇させるために、またはβアドレナリン作用性レセプターアゴニスト（βＡＲＡ）気管支拡張剤の効力を高めるために用いられる。
【００２３】
さらに、疫学研究は、乳児期の重篤なＲＳウイルス（ＲＳＶ）誘発性細気管支炎とアレルギー疾患との強い関連を示唆する。本明細書において提供される組成物および方法は、ＲＳＶ誘発性気道過敏およびその後の喘息発症への素因を低減するために、ＲＳＶ感染の間、有用である。ＲＳＶ感染はまた、ウシ（すなわち、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓおよびＢｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓ、またはその交配種）においても主に重要であり、そして重篤な呼吸器疾患をもたらし得る。
【００２４】
肺胞流体クリアランスは、肺上皮細胞におけるイオン輸送と関連する。例えば、肺胞上皮の壁は、２種類の細胞からなる：Ｉ細胞およびＩＩ型細胞。Ｉ型細胞は、肺胞上皮のうちの最も大きい割合をカバーする（約９５％）。ＩＩ型細胞は、サーファクタントを生成する。Ｉ型細胞およびＩＩ型細胞の両方が能動的な様式でナトリウムイオンを輸送すると現在考えられている。上皮細胞の基底外側表面に位置するナトリウム−カリウムポンプは、先端膜をまたがる電気化学的勾配を設定し、このことは、ナトリウムイオンが肺胞腔から細胞質へと入るのに有利である。ナトリウムは、主にチャネルと呼ばれているタンパク質によって肺胞上皮を越える。細胞質において、それらは、一旦、ＡＴＰを利用するナトリウム−カリウムポンプによって基底外側膜を越えて押し出される。電気的中性を保存するために、塩化物イオンは、細胞間に位置する経路を通って、または細胞チャネルによってのいずれかによるナトリウムイオンの動きに続く。イオンの動きは、流体の再吸収に有利な間質腔と肺胞腔との間に浸透圧差を生じる。
【００２５】
ナトリウム能動輸送は、多くの病的状態（ウイルス感染、肺炎、急性肺傷害など）の肺胞腔の流体の量を制限することにおいて、重要な役割を果たす。基底状態では、気道上皮の主なイオン輸送プロセスは、内腔流体から上皮の基礎をなす間質腔への、能動的なアミロライド感受性のＮａ＋イオン輸送である。肺の内側を覆う流体（ＡＬＦ）におけるＮａ＋イオンは、主に、先端膜におけるカチオンおよびＮａ＋選択的なアミロライド感受性の上皮Ｎａ＋チャネル（ＥＮａＣ）を通して、気管支肺胞上皮細胞へと受動拡散する。Ｃｌ−イオンは、傍細胞経路を介して、または、おそらく嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）を介して、Ｎａ＋の動きを追って、電気的中性を維持する。ＮａＣｌの輸送は、上皮を経た浸透圧勾配を生じる。呼吸上皮の経上皮透水性が高いので、この勾配により、水は気腔から間隙へと受動的に移動し、それによって、気腔流体がクリアランスされる。
【００２６】
ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害は、低酸素血症、心機能障害、ならびに気管支肺胞洗浄液のＵＴＰ含有量およびＡＴＰ含有量の増加と関係している。さらに、肺中のＲＳＶ複製に対する直接の抗ウイルス効果がないにもかかわらず、レフルノミドを用いたデノボピリミジン合成の全身阻害は、ＡＦＣおよび肺水分含有量だけでなく、ＲＳＶ感染マウスにおける生理学的障害（体重減少、ＳｍＯ２低下および心機能低下、ならびに鼻の電位差の変化を含む）を改善する。そのデノボＵＴＰ合成およびＶＲＡＣによる放出はＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害が生じるために必要であることを示しており、そしてデノボピリミジン合成および放出経路が、ＲＳＶ感染または他の呼吸器感染の症状を緩和するように設計されたインヒビター療法についての魅力的な標的であることを証明している、体積が調整された陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）の薬理学的遮断により、ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害が防止され得る。
【００２７】
図１は、ピリミジン生合成経路およびプリン生合成経路を例示している概略図である。ＵＴＰは、グルタミン、ＡＴＰおよびＨＣＯ３−からデノボ合成される。ＵＴＰはまた、サルベージ経路を介してウリジンから合成されることもできる。レフルノミドおよびその活性代謝産物（Ａ７７−１７２６）は両方ともジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼの活性を阻害する。ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼは、ジヒドロオロテートをオロテートに変換する。両方の薬剤は、デノボでのピリミジン合成を妨害するが、ピリミジンサルベージ経路にもプリン合成にも影響を及ぼすわけではない。
【００２８】
必要に応じて、この組成物は、レフルノミドであるピリミジン合成インヒビターを含む。必要に応じて、この組成物は、Ａ７７−１７２６であるピリミジン合成インヒビターを含む。必要に応じて、この組成物は、レフルノミドとＡ７７−１７２６との組合せおよび／または別のピリミジン合成インヒビターとレフルノミドまたはＡ７７−１７２６との組合せを含む。取引名ＡＲＡＶＡ（登録商標）（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）の下で、レフルノミド（活性な代謝産物がＡ７７−１７２６であるプロドラッグ）は、関節リウマチの処置のために使われる。レフルノミドおよびＡ７７−１７２６は両方とも、酵素ジヒドロオロト酸レダクターゼ（ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼまたはジヒドロオロターゼとしても公知）のインヒビターとして働く。ジヒドロオロト酸レダクターゼは、デノボピリミジン合成経路の中心的な構成要素である三機能性酵素複合体ＣＡＤ（カルバミルリンシンテターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼ）の構成要素である。従って、レフルノミドおよびＡ７７−１７２６と同様に、この組成物は、ジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターであり得る。
【００２９】
この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアにおいて、インビボで投与され得る。「薬学的に受容可能な」によって、生物学的にも他の点でも望ましくない点がない物質を意味する。従って、望ましくない生物学的影響を引き起こすもなく、それが含まれる医薬組成物中の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することもなく、この物質は、被験体に投与され得る。キャリアは当然、当業者にとって周知であるように、活性成分のいかなる分解も最小化して、被験体におけるいかなる有害な副作用も最小にするように選択される。この物質は、溶液、懸濁液中に存在してもよい（例えば、微粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれる）。これらは、抗体、レセプターまたはレセプターリガンドを介して特定の細胞型へと標的化され得る。
【００３０】
適切なキャリアおよびそれらの処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。代表的には、適切な量の薬学的に受容可能な塩が、処方物を等張にするために、処方物において使われる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水、リンゲル液およびブドウ糖溶液が挙げられるがこれらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８．５、より好ましくは、約７．８〜約８．２である。さらなるキャリアとしては、抗体を含んでいる固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリクス（このマトリックスは、成形品（例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子）の形態である）のような徐放性調製物が挙げられる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度によって、特定のキャリアがより好適であり得ることは、当業者にとって明らかである。例えば、吸入性投与および／もしくは鼻腔内投与または肺上皮細胞に対する局所投与に適している組成物のために適している特定のキャリアを選択することは、当該分野の従来範囲内にある。
【００３１】
この組成物はまた、この組成物およびキャリアに加えて、増粘剤、希釈液、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含み得る。この組成物はまた、一つ以上の活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤など）を含み得る。
【００３２】
開示された組成物は、被験体の肺上皮細胞への局所投与に適している。従って、ピリミジン合成インヒビターを含む組成物は、必要に応じて、吸入による投与に適している（すなわち、組成物は吸入剤である）。さらに、この組成物は、必要に応じてエアロゾル化される。そしてさらに、この組成物は、必要に応じて霧状にされる。吸入によるこの組成物の投与は、スプレー機構または液滴機構による送達によって、鼻または口を通してであり得る。送達はまた、挿管法を介して呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接的に行われ得る。必要に応じて、組成物が投与される肺上皮細胞は、被験体の鼻腔、鼻の通路、鼻咽頭、咽頭、気管、気管支、細気管支または肺胞に位置する。必要に応じて、組成物が投与される肺上皮細胞は、気管支肺胞上皮細胞である。さらに、組成物が複数の肺上皮細胞に投与される場合、細胞は、上記の解剖学位置のどこかもしくは全てに、またはこのような位置の組合せに、必要に応じて配置され得る。
【００３３】
従って、肺上皮細胞に対する局所投与は、噴霧化、エアロゾル化または直接の肺滴下注入による肺送達によって行われ得る。それゆえ、被験体の肺上皮細胞に対する局所投与に適した組成物は、例えば、霧状にされたか調製物またはエアロゾル化調製物としての、吸入剤投与に適した組成物を含む。例えば、この組成物は、吸入器（例えば、計量吸入器または乾燥粉末吸入器）、注入器、ネブライザまたは吸入可能な薬物を投与する従来公知の方法の他の任意のものによって個体に投与され得る。
【００３４】
本発明の組成物は、吸入可能な溶液であり得る。吸入可能な溶液は、噴霧化による投与に適していてもよい。この組成物はまた、水性懸濁液として提供され得る。必要に応じて、本発明の処方物は、水性懸濁液中に治療有効量のピリミジン合成インヒビターを含む。
【００３５】
必要に応じて、この組成物は、ピリミジン合成インヒビターまたはその塩もしくはエステルを、少なくとも１つの適切なプロペラントまたはサーファクタントまたはサーファクタント混合物と別々に含んでいる加圧エアゾールによって投与され得る。任意の従来公知のプロペラントが用いられ得る。
【００３６】
また本明細書において提供されるのは、本明細書において提供される組成物およびネブライザを含む組合せである。また本明細書において開示されるのは、本明細書において教示される薬剤および組成物を含む容器である。この容器は、例えば、鼻用スプレヤ、ネブライザ、吸入器、瓶または粘膜表面への投与のための形態の組成物を含む他の任意の手段であり得る。必要に応じて、この容器は、測定用量の組成物を送達し得る。
【００３７】
開示された組成物および方法を含む任意のネブライザを使用し得る。特に、本明細書において使用するためのネブライザは、本明細書において提供される組成物を含め、プロペラントを含まない液状処方物を霧状にする。ネブライザは、圧縮空気、超音波または振動を含むがこれらに限定されない当業者に公知の任意の方法によって、霧状にされた霧を生成し得る。ネブライザは、内部バッフルをさらに有し得る。内部バッフルは、ネブライザのハウジングと共に、密着によって霧から大きい液滴を選択的に除去して、液滴が貯蔵部に戻るのを可能にする。このように生成される微細なエーロゾル液滴は、空気／酸素を吸入することによって、肺に入る。
【００３８】
従って、プロペラントを含まない液状処方物を霧状にするネブライザは、本明細書において提供される組成物を用いた用途に適している。この種のネブライザの例は当該分野において公知であり、市販されている。本明細書にでの使用のためのネブライザとしてはまた、ジェットネブライザ、超音波ネブライザなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なジェットネブライザは、当該分野で公知であり、そして市販されている。
【００３９】
この組成物は、濾過滅菌されてバイアル（ネブライザにおいて使用される、適切には霧状にされる、無菌の単位用量処方物を提供する単位用量バイアルを含む）に充填され得る。各単位用量バイアルは、無菌であり得、そして、他のバイアルまたは次の用量を汚染せずに適切に霧状にされ得る。
【００４０】
必要に応じて、開示された組成物は、鼻腔内投与に適した形態である。この種の組成物は、鼻孔の一方または両方を通る鼻および鼻の通路への送達に適しており、スプレー機構もしくは液滴機構による、または、エアロゾル化による送達を含み得る。
【００４１】
組成物が局所肺投与を使わない方法で使用される場合、この組成物は、当該分野で公知の他の手段により（例えば、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内投与によって、腹腔内投与によって、そして経皮的に）投与され得る。
【００４２】
本明細書においてさらに提供されるのは、治療量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を少なくとも１測定用量含むデバイスであり、ここで、各測定用量は、被験体における肺疾患を処置するための治療量またはその一部のピリミジン合成インヒビターを含む。このピリミジン合成インヒビターは、本明細書中に開示される通りのピリミジン合成インヒビターまたはその組合せを含み得る。
【００４３】
本明細書においてさらに提供されるのは、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスを増加させる方法であり、この方法は、この細胞と有効量のピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程を包含する。この接触により、この細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスの増加が引き起こされる。必要に応じて、この肺上皮細胞を、インビボで接触させる。必要に応じて、この肺上皮細胞を、インビトロで接触させる。
【００４４】
さらに提供されるのは、被験体における肺疾患を処置する方法であり、この方法は、この被験体における複数の肺上皮細胞と有効量のピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程を包含する。この有効量のピリミジン合成インヒビターは、この被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体クリアランスの増加を引き起こす。この方法が用いられ得、ここで、この被験体はＲＳウイルス感染を有するかまたはＲＳウイルス感染を発症する危険がある。開示された方法が用いられ得る疾患を引き起こす他の肺病原体としては、パラミクソウイルス（ＲＳウイルス［ヒトおよびウシ］、メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザ、麻疹ウイルス）、オルトミクソウイルス（インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルス）、ポックスウイルス（痘瘡ウイルス、サル痘ウイルス）、新世界ハンタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群因子）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
さらに提供されるのは、ＲＳウイルス感染の危険がある被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法であり、この方法は、有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する工程を包含する。上述の通り、この種の症状または身体的徴候としては、鼻漏、低酸素血症、肺水腫、減少した心機能、咳、体重減少、喘鳴、悪液質および肺うっ血が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＳウイルス感染の危険がある被験体は、当業者によって直ちに決定され得る。例えば、この種の決定は、症状／身体的徴候、身体検査、診断試験またはそれらの任意の組み合わせを提示する、被験体の病歴に基づいて医師または獣医師によってなされ得る。
【００４６】
また提供されるのは、ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定する工程、および有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する工程を包含する方法である。さらに提供されるのは、ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定する工程、およびこの被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物をこの被験体に投与する工程を包含する方法である。
【００４７】
開示された方法において、ピリミジン合成インヒビターは、必要に応じて、レフルノミド、Ａ７７−１７２６またはそれらの組み合わせである。さらに、レフルノミドおよび／またはＡ７７−１７２６が、一つ以上の他のピリミジン合成インヒビターと結合して、開示された方法において使用され得る。
【００４８】
用語「有効量」および「有効投与量」または「治療量」は、交換可能に使用される。用語「有効量」は、所望の生理学的応答を生じるのに必要な任意の量と定義される。開示された方法で使用される組成物を投与するための有効な量およびスケジュールは、経験的に決定され得、そしてこの種の決定をすることは当該分野の技術範囲内である。開示された方法で使用される組成物の投与のための有効な投与量範囲は、障害の症状が影響を受ける、所望の効果を生じるのに十分大きな投与量である。投与量は、有害な副作用（例えば、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応など）を引き起こすほど大きくてはならない。
【００４９】
一般に、治療量または投与量は、年齢、状態、性別および被験体における疾患の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるかどうかによって変化し、そして当業者によって決定され得る。投与量は、任意の反対指示（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の場合には、個々の医師または獣医師により調整され得る。投与量は変化し得、そして１日または数日間にわたって毎日一つ以上の用量の投与において投与され得る。必要な開示された方法で使用される組成物の有効量は、使用される方法、ならびに処置される気道疾患、特定のピリミジン合成インヒビターならびに／または使用されるキャリアおよび投与様式などに応じて変化し得る。従って、すべての組成物についての正確な量を特定することは可能でない。しかし、適切な量は、従来技術において、本明細書における教示を考慮して単なる慣用実験を使用して、当業者によって決定され得る。例えば、インビボで使用されるジヒドロオロト酸レダクターゼまたはピリミジン合成インヒビターは、約１０〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、約２５〜４５ｍｇ／ｋｇの用量で、または約３０〜４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
【００５０】
Ａ７７−１７２６、レフルノミドおよび／または他のピリミジンインヒビターの治療量、有効量または有効投与量は、合理的な間隔で、有効なまま、エアゾールにより投与され得る。例えば、本明細書において記載される組成物の有効用量は、１日、数日間、１週間以上にわたって、１日１回、１日２回、１日４回、または１時間に１回以上投与され得る。従って、例えば、この組成物は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または１週間以上の持続期間にわたって、１時間毎、２時間毎、４時間毎、８時間毎、１２時間毎もしくは２４時間毎またはそれらの任意の組合せまたは間隔毎に１回投与され得る。間隔によって、提供された値の範囲内の任意の時間増分を意味する。従って、この組成物は、例えば、１２時間にわたって３時間毎に投与され得るなどである。必要に応じて、この組成物は、一度に投与される。この種の時間経過は、例えば、有効用量を決定するために上記のパラメータを使用して、当業者によって決定され得る。
【００５１】
本明細書において記載される方法による組成物の特定の用量の投与の効力は、病歴、徴候、症状、および肺感染（例えば、ＲＳＶ感染）を有する被験体またはこの種の感染に罹る危険がある被験体の状態を評価することに有用であることが公知である客観的な実験室試験の特定の局面を評価することにより決定され得る。これらの徴候、症状および客観的な実験室試験は、この種の患者を処置する任意の臨床医またはこの分野の実験を行っている研究者に公知の通り、処置または予防される特定の疾患または状態によって変化する。例えば、適切なコントロール群および／または一般集団または特定の個体の疾患の通常の進行についての知識を有する比較に基づいて：１）被験体の身体状態が改善されることが示される（例えば、肺うっ血が減らされるかまたは除去される）；（２）この疾患（感染）の進行が安定するか、遅くなるか、または、逆転することが示される、または（３）この疾患または状態を処置するための他の薬物の必要が少なくされるかまたは取り除かれるならば、特定の処置レジメンは有効であると考えられる。この種の効果は、集団中の単一の被験体において、例えば、疫学研究を用いて決定され得る。
【００５２】
本明細書における教示はまた、スクリーニング方法で用いられ得る。例えば、本明細書において提供されるのは、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法であり、この方法は、肺上皮細胞とこの試験化合物とを、過剰のＵＴＰの存在下で接触させる工程、この肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを検出する工程、を包含し、コントロールと比較したＮａ＋依存性流体取り込みの増加は、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す。必要に応じて、この細胞をインビボで接触させる。必要に応じて、この細胞をインビトロで接触させる。この方法は、ＵＴＰを除去する工程、およびＮａ＋依存性流体取り込みの増加の可逆性を検出する工程を必要に応じてさらに含むことができる。
【００５３】
別のスクリーニング方法の例では、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法は、この試験化合物と、ピリミジン合成遺伝子をコードする異種核酸を発現する細胞とを接触させる工程、およびこの細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを検出する工程、を包含し、コントロールレベルと比較したＮａ＋依存性流体取り込みの増加は、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す。必要に応じて、この細胞をインビボで接触させる。必要に応じて、この細胞をインビトロで接触させる。
【００５４】
細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする別の方法は、Ｈ４４１細胞またはＨ４４１細胞株にＲＳウイルスを感染させる工程、この感染した細胞または細胞株と試験化合物とを接触させる工程、およびこの感染した細胞またはこの感染した細胞株の細胞を越えるイオン輸送を測定する工程を包含する。コントロールと比較した場合の、この感染した細胞またはこの感染した細胞株の細胞を越えるイオン輸送の増加は、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す。イオン輸送はコントロール細胞またはコントロール細胞株を越えるイオン輸送と比較され得る。このコントロールの細胞または細胞株は、必要に応じて、ＲＳＶに感染していないＨ４４１細胞株であってもよく、または試験化合物が存在しない、感染したＨ４４１細胞またはＨ４４１細胞株であってもよい。必要に応じて、試験化合物は、ピリミジン合成インヒビターを含む。必要に応じて、細胞をインビボで接触させる。必要に応じて、細胞をインビトロで接触させる。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本明細書において請求される方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されており、そして、純粋に本発明の例示を意図しており、添付の特許請求の範囲に含まれるものを除いて、そしてその程度まで、本発明者らが発明と考える範囲を制限することは意図していない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にする努力を行ったが、何らかの誤差および偏差が考慮されるべきである。
【００５６】
（方法）
（ウイルス接種物の調製およびマウスの感染）
ウイルスストックの調製およびいずれかの性別の８〜１２週齢の病原体を含まないＢＡＬＢ／ｃマウスの、ＲＳＶ Ａ２株（１００μｌ中１０６ ＰＦＵ）による鼻腔内感染を、Ｄａｖｉｓら，「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｖｅｏｌａｒ ｆｌｕｉｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８６：Ｌ１１２−Ｌ１２０（２００４）に記載の通りに行った。各実験群についてのデータは、最低２つの独立感染に由来した。
【００５７】
（平均末梢血酸素飽和の測定）
末梢血酸素飽和を、ＴＵＦＦＳＡＴＴＭパルスオキシメータ（Ｄａｔｅｘ−Ｏｈｍｅｄａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に接続したＰＲＥＥＭＩＥ ＯＸＹＴＩＰ（登録商標）センサ（Ｄａｔｅｘ−Ｏｈｍｅｄａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して意識のあるマウスにおいて測定した。マウスの極めて急速な脈拍数のため、酸素測定値は、動脈血および静脈血からの平均ヘモグロビンＯ２飽和（ＳｍＯ２）値である。
【００５８】
心拍数の測定は、換気によって変化する。ＥＣＧ追跡を用いて、ＡＦＣアッセイの開始時（ＨＲＳＴＡＲＴ）および終了時（ＨＲＥＮＤ）において心拍数（ＱＲＳ群数／ｃｍ）を測定した。３０分間の換気期間にわたる心拍数の変化％（ΔＨＲ３０％）を、（ＨＲＳＴＡＲＴ − ＨＲＥＮＤ）／ＨＲＳＴＡＲＴとして算出した。
【００５９】
（鼻の電位差の測定）
麻酔したマウスの外鼻孔にまたがる電位差（尾部を参照として用いる）を、Ｇｒｕｂｂら，（１９９４）「Ｈｙｐｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａ＋ ａｎｄ ｒａｉｓｅｄ Ｃａ（２＋）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉ，ｏｎ ｉｎ ｎａｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｏｆ ＣＦ ｍｉｃｅ」，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６６：Ｃ１４７８−Ｃ１４８３に以前に記載された通りに測定した。ベースラインＮＰＤを、乳酸加リンゲル溶液を用いた鼻上皮の灌流の間、記録した。ＮＰＤのアミロライド感受性成分（ＮＰＤＡＭＩＬ）を、１００μＭアミロライドを含む乳酸加リンゲル溶液を用いた灌流によって測定した。±６０ｎＡの電流パルスを、２００ＭΩのレジスタと直列にした１２Ｖの電池によって、上皮にまたがって印加した。（鼻の経上皮抵抗（ＮＲｔｅ）と比例する）電流パルスに応答したＮＰＤの変化を記録した（ΔＮＰＤ）。
【００６０】
（気管支肺胞洗浄液）
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を、サイトカインＥＬＩＳＡ用の無菌正常生理食塩溶液ｌｍｌまたはヌクレオチドアッセイ用の無菌生理食塩水０．３ｍｌを用いて、Ｄａｖｉｓら（２００４）に以前に記載されたとおりに集めた。洗浄液を遠心分離して細胞を除去し、そして上清を−８０℃で保存した。
【００６１】
（ＢＡＬＦ中のヌクレオチドの測定）
ＢＡＬＦ中の内因性ヌクレオチダーゼを熱変性（１００℃、３分間）し、そしてＵＴＰ／ＡＴＰ含有量を、それぞれ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼおよびルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。
【００６２】
（ＢＡＬＦ中のヘムの測定）
ＢＡＬＦヘム含有量を、Ｄｒａｂｋｉｎｓアッセイを使用して、分光光度学的に測定した。
【００６３】
（デノボのピリミジン合成およびプリン合成の全身阻害）
レフルノミド（５−メチルイソキサゾール−４−［４−トリフルオロメチル］カルボキシアニリド、１％のメチルセルロースを含んでいる蒸留水中３５ｍｇ／ｋｇ）を、感染前８日間にわたって、次いで感染期間全体を通して、３００μｌ／マウスの体積の経口栄養法によって、１日１回投与した。ビヒクルコントロールを、等しい体積の蒸留水中の１％メチルセルロースとして栄養法により与えた。ウリジン（０．９％ＮａＣｌ中１ｇ／ｋｇ）を、１００μｌの体積で１２時間毎に、腹腔内注入により投与した（８）。６−ＭＰ（１Ｎ ＮａＯＨ中３５ｍｇ／ｋｇ、２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨを７．９に調整した）を、感染前５日間にわたって、次いで感染期間全体を通して、１００μｌの体積で２４時間毎に注入することにより腹腔内投与した。
【００６４】
（ＢＡＬＦ中の炎症誘発性サイトカインの測定）
サイトカインレベルを、製造業者の指示に従ってＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定した。
【００６５】
（統計解析）
記述統計を、Ｉｎｓｔａｔソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して算出した。群平均間の差を、適切な事後検定を用いて、ＡＮＯＶＡまたはスチューデントｔ検定により解析した。すべてのデータ値を、平均±ＳＥで示す。
【００６６】
（結果）
（末梢血酸素化に対するＲＳＶ感染の影響）
ｄ２における基底ＡＦＣの減損は、偽感染動物と比較した、末梢血ＳｍＯ２の小さいが、重要な減少と関係していた（図２Ａ）。ＳｍＯ２の低下は、他の時点では見出されなかった。
【００６７】
低酸素血症のさらなる指標として、３−リードＥＣＧ記録は、ＡＦＣ測定過程の間での心拍数の変化（ΔＨＲ３０％）の証拠について、ｄ２における偽感染マウスおよびＲＳＶ感染マウスから評価した。ＲＳＶによる感染は、ｄ２でのΔＨＲ３０％における有意な増加と関連していた（図２Ｂおよび図２Ｃ）。２群間で麻酔の持続時間の差はなかった。
【００６８】
（鼻の電位差に対するＲＳＶ感染の影響）
偽感染動物と比較すると、２日間のＲＳＶ感染は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける基底ＮＰＤ（鼻の電位差）にもＮＰＤＡＭＩＬ（鼻の電位差のアミロライド感受性成分）にも影響を及ぼさなかった。しかし、基底ＮＰＤおよびＮＰＤＡＭＩＬは、ｄ４およびｄ８において著しく減少した（図３Ａ〜図３Ｃ）。
【００６９】
ＲＳＶ感染後のＮＲｔｅ（鼻の経上皮抵抗）の評価として、±６０ｎＡのパルスを鼻上皮に印加することによって惹起されるＮＰＤの変化（ΔＮＰＤ）を測定した。ΔＮＰＤは、ｄ４およびｄ８において偽感染コントロールよりも有意に大きかった（図３Ｄ〜図３Ｅ）。
【００７０】
（ＢＡＬＦヌクレオチドに対するＲＳＶ感染およびヌクレオチド合成阻害の影響）
未感染マウスからのＢＡＬＦは、等しいレベルのＡＴＰおよびＵＴＰを含んでいた。これらは偽感染によって影響を受けなかった。しかし、ＲＳＶ感染は、ＢＡＬＦヘム含有量の付随した増加を伴わずに（未感染マウスにおいて７．３±０．７μＭであるのに対して、ｄ２にて７．３±１．４μＭ）、ｄ２においてＵＴＰレベルおよびＡＴＰレベルの倍加をもたらした。ＢＡＬＦヌクレオチドは、ｄ６においてコントロールレベルに戻った（表１）。
【００７１】
ＢＡＬＦヌクレオチドレベルの上昇は、レフルノミド処置を受けたＲＳＶ感染マウスにおいてｄ２にて検出されなかった。事実、レフルノミド処置は、両方のヌクレオチドのＢＡＬＦ含有量を、未処置の非感染性マウスにおけるＢＡＬＦ含有量未満のレベルまで引き下げた（表１）。ウリジンの併用処置は、ＢＡＬＦのＵＴＰレベルおよびＡＴＰレベルに対するレフルノミドの効果を逆転させるだけでなく、未処置ＲＳＶ感染マウスにおけるＢＡＬＦヌクレオチド含有量を越えるＢＡＬＦヌクレオチド含有量の有意な増加を引き起こした。
【００７２】
【表１】
（マウスの体重に対するヌクレオチド合成阻害の影響）
前処置期間の間に、メチルセルロース処置マウスまたは未処置マウスと比較して、レフルノミドは、体重の有意な低下を引き起こさなかった。さらに重要なことに、感染期間の間、レフルノミド処置は、Ｄｌおよびｄ２において通常見られるＢＡＬＢ／ｃマウスの体重減少の程度を有意に減少させた（図４）。レフルノミド処置期間全体にわたるウリジンの併用投与は、この影響を妨げなかった。
【００７３】
この知見とは対照的に、６−ＭＰでの処置は、未処置のＲＳＶ感染マウスおよびレフルノミドで処置されたＲＳＶ感染マウスと比較して、前感染期間全体にわたる体重の有意な減少失、麻酔に対する乏しい寛容性（散発的な死をもたらす）およびＤｌおよびｄ２における体重減少の有意な増加をもたらした（図４Ｂ）。
【００７４】
（ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に対するヌクレオチド合成阻害の影響）
ＲＳＶ感染マウスのレフルノミド前処置は、ｄ２におけるＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害を遮断した（表２）。この影響は、メチルセルロース単独を栄養法で与えることによって模倣されず、併用ウリジン処置によって逆転された。ウリジン処置単独は、ＡＦＣに影響を及ぼさなかった。レフルノミド処置はまた、ＡＦＣに正常なアミロライド感受性の回復をもたらした：ｄ２における未処置マウスでは６１％であり、未感染性マウスでは−８％であるのに対して、ｄ２にてレフルノミド処置マウスのＡＦＣの５７％はアミロライド感受性であった。
【００７５】
レフルノミド治療の有益な効果とは対照的に、デノボプリン合成インヒビター６‐メルカプトプリン（６−ＭＰ）を用いた全身前処置の類似のレジメンは、ｄ２においてＡＦＣに影響を及ぼさなかった（表２）。最後に、レフルノミドを用いた未感染性マウスの処置は、ＡＦＣの有意な阻害をもたらした。
【００７６】
【表２】
デノボピリミジン合成を全身的に遮断するために、マウスに、感染前に、次いで感染後０時間および２４時間において、３００ｍｌ／マウスのジヒドロオロト酸レダクターゼ（ＤＨＯＲ）インヒビターレフルノミド（１％メチルセルロース中に懸濁された５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを１日１回８日間にわたって栄養法により与えた。感染後４８時間において、ＡＦＣ滴注物（ｉｎｓｔｉｌｌａｔｅ）への添加なしで、ＡＦＣ研究を行った。
【００７７】
示される場合、レフルノミド処置期間（１ｍｇ／ｋｇのＩ．Ｐ．、ｑｌ２ｈ）の全体を通して、ウリジンの併用投与により、レフルノミド（ＬＥＦ）の影響を逆転させる試みを行った。図５に示すように、レフルノミド（ＬＥＦ）をマウスへ栄養法により与えることにより、感染後２日目におけるＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害が逆転された。ＬＥＦの影響は、ウリジンの併用投与により防止される。ＬＥＦは、正常マウスにおけるＡＦＣに対して影響を及ぼさなかった。
【００７８】
ＬＥＦ処置はまた、感染後１日目および２日目の体重減少の、そして、肺胞洗浄液の炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮ−ａ、Ｉｌ−１ｂ、ＴＮＦ−ａ、ＫＣ）濃度の有意な減少をもたらした。図６に示すように、レフルノミド（ＬＥＦ）をマウスに栄養法により与えることにより、感染後２日目に肺の水分含量におけるＲＳＶ誘発性増加を逆転させた。レフルノミドの影響は、ウリジンの併用投与により防止された。重要なことに、ＬＥＦおよび／またはウリジンを用いたマウスの処置は、感染後２日目に肺組織におけるウイルス複製に影響を及ぼさなかった。
【００７９】
図７に示すように、ＡＦＣ滴注物中への体積を調整した陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）の広い範囲のインヒビターの添加は、感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を逆転させた。使用したいくつかのインヒビターはまた、様々な他の細胞機能に対して別の影響を及ぼしたが、これらの薬剤は共通の影響としてＶＲＡＣ阻害のみを有する。しかし、ＮＰＰＢ（１００ｍＭ）は、比較的ＶＲＡＣ特異的である。この知見は、ＵＴＰが初期ＲＳＶ感染間、ＶＲＡＣを介して細胞から放出されることを証明した。フルオキセチン（１０ｍＭ）は、選択的セロトニン再取り込みインヒビターとしても作用する。ベラパミル（１０ｍＭ）は、Ｃａ＋＋チャネル遮断剤としても作用する。タモキシフェン（２５ｍＭ）は、抗エストロゲンでもある。
【００８０】
ＲＳウイルスは、重大な呼吸上皮細胞病理を誘発することなく、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルの感染の後の初期の時点でアミロライド感受性ＡＦＣ（能動的なＮａ＋輸送を表す）を阻害する。さらに、ＡＦＣに対するＲＳＶの阻害効果は、肺のＰ２Ｙプリン作用性レセプターに対するその作用によって、ＵＴＰにより媒介される。
【００８１】
感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害を媒介するＵＴＰは、デノボ合成に由来し、そして、この経路の阻害はＡＦＣのＲＳＶ誘発性減少を防止し、ウイルス複製を変えることなく肺水分含量を増加させる。さらに、感染後２日目にＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害を媒介するＵＴＰは、体積が調整された陰イオンチャネルを介して放出される。
【００８２】
感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害に対するレフルノミドの影響を実証した。マウスを、経口栄養法によって８日間、レフルノミド（５ｍｇ／ｋｇ、１％メチルセルロース中に懸濁、１日１回）を用いて前処置し、次いでＲＳＶに感染させ、そして感染後２４時間目に再びレフルノミドで処置した。このレジメンにより、感染後２日目にＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害が防止された。この影響は、メチルセルロースを単独で栄養法により与えることによって模倣されず、レフルノミド処置期間全体を通してのウリジンの併用投与（１０日間の１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．ｑｌ２ｈ）によって逆転された。さらに、ウリジン処置単独は、ＡＦＣに影響を及ぼさなかった。レフルノミド処置も、正常な（偽感染）マウスのＡＦＣに対して有害な影響を有さなかった。
【００８３】
【表３】
レフルノミドの阻害効果は、単なる抗ウイルス効果の結果でなかった。ウイルス複製は、メチルセルロース、レフルノミドまたはウリジンでの処置によって影響を受けなかった。それゆえ、ＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害の抑制は、ウイルス複製を防止することの単純な結果ではなく、デノボピリミジン合成に対するレフルノミドの特異的阻害効果の結果であった。
【００８４】
レフルノミド治療は、肺の湿重量：乾燥重量の比率（肺の水分含量および水腫形成の指標）の正常化と関係していた。この比率は、ＲＳＶ感染後２日目に増加する。ウリジンの併用処置は、この影響を逆転させ、湿重量：乾燥重量の比率を（偽感染マウスと比較して）増加させた。レフルノミド治療は、感染後１日目および２日目のＢＡＬＢ／ｃマウスに通常見られる体重減少の程度を有意に減少させた。このことは、食欲（おそらく抗炎症効果に関連がある）に対する有益な効果を示唆する。これはまた、この用量での非常に限られたレフルノミド毒性を示唆した。ある程度の低酸素血症が通常明白である場合、レフルノミド治療は、感染後２日目の平均血中Ｏ２飽和度を改善した。レフルノミド治療は、肺胞洗浄液の炎症誘発性サイトカイン（インターフェロン−α、インターロイキン−１β、ＫＣ［ヒトインターロイキン８のネズミホモログ］および腫瘍壊死因子−α）のレベルを有意に低下させた。これは、併用ウリジン治療によって、ほんの部分的に逆転された（従って、この薬物による非特異的チロシンキナーゼ阻害の結果で一部あり得る）効果である。
【００８５】
まとめると、これらのデータは、レフルノミドが、直接的な抗ウイルス効果を有せずに、ＲＳＶ疾患に対していくつかの有益な効果を有することを証明した。これらの効果は、低酸素血症および肺水腫の排除、体重の改善および肺の炎症の減少を含んでいた。
【００８６】
（肺水分含量に対するヌクレオチド合成阻害の影響）
レフルノミドを用いた全身治療は、２日目の正常な肺湿重量：乾燥重量の比率を回復させ、一方、レフルノミド処置期間の全体を通してのウリジンの併用投与はこの効果を防止した（図８Ａ）。しかし、６−ＭＰ（これは、２日目にＡＦＣに対して有益な効果を有さなかった）を用いた全身治療は、２日目の正常な肺湿重量：乾燥重量の比率を変化させなかった（図８Ｂ）。
【００８７】
（炎症誘発性サイトカインに対するヌクレオチド合成阻害の影響）
レフルノミドは、免疫抑制剤として臨床的に使われる。治療レジメンの効力を確認するために、ＢＡＬＦ中の炎症誘発性サイトカインのレベルに対するその効果を分析した。ＩＬ−４もＩＬ−１０も、感染後のいかなる時点でも検出可能ではなかった。ほんの少量のＩＬ−１βおよびＫＣ（ヒトＩＬ−８のネズミホモログ）は、偽感染マウスからのＢＡＬＦ中で検出された（表４）。ＩＦＮ−γ以外の他の全てのサイトカインの有意な量がｄ２に存在したが、ＩＬ−１β、ＫＣおよびＴＮＦ−γのレベルは、ｄ４〜ｄ８で減少した。有意な量のＩＦＮ−γが、ｄ６およびｄ８においてＢＡＬＦ中でのみ見出された。
【００８８】
レフルノミド治療は、ｄ２におけるＢＡＬＦ中のＩＦＮ−α、ＩＬ−１β、ＫＣおよびＴＮＦ−αのレベルを顕著に低下させた（表４）。ＩＦＮ−αを除いて、この効果は、併用ウリジン治療によってほんの部分的に逆転された。
【００８９】
重要なことに、６−ＭＰ治療は、レフルノミド治療によって引き起こされるレベルに匹敵する、ＢＡＬＦ中のＩＦＮ−α、ＩＬ−１β、ＫＣ、およびＴＮＦ−αのレベルの低下をもたらした（表４）。ｄ２においていずれかの薬剤で処置しマウスにおいて、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１β、ＫＣ、およびＴＮＦ−αのレベルの間に有意差は存在しなかった。
【００９０】
【表４】
（マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響）
ｄ２でのウイルス複製は、レフルノミド処置でもウリジン処置でも影響を受けなかった（図９Ａ）。同様に、６−ＭＰ前処置は、ｄ２においてマウス肺のウイルス複製に対して有意な阻害効果を有しなかった（図９Ｂ）。レフルノミド処置を８日間の感染期間全体を通して続けた場合、ウイルス複製はｄ８において高レベルで維持された（図９Ｃ）。しかし、ｄ２においてレフルノミド処置を中断した場合、ウイルス複製はｄ８において最小限増加するだけであった（図９Ｄ）。
【００９１】
（ＲＳＶ感染後の低酸素血症に対するレフルノミド治療の影響）
レフルノミド治療は、ｄ２においてＳｍＯ２読み取り値の正常化をもたらした（図１０Ａ）。同様に、レフルノミド治療は、ｄ２においてＡＦＣ手順の間にＲＳＶ感染マウスに見られるΔＨＲ３０％の増加を防止した（図１０Ｂ）。
【００９２】
（ＲＳＶ感染後の鼻の電位差に対するレフルノミド治療の影響）
感染期間全体を通してのレフルノミドを用いた処置は、基底ＮＰＤおよびＮＰＤＡＭＩＬ（図１１Ａ〜１１Ｃ）のＲＳＶ誘発性低下を防止した。
【００９３】
（ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に対する陰イオンチャネル遮断の影響）
ｄ２でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害は、いくつかの構造的に無関係なＶＲＡＣインヒビターの各々のＡＦＣ滴注物への添加により遮断された：フルオキセチン、タモキシフェン、クロミフェン、ベラパミル、ＮＰＰＢまたはＩＡＡ−９４（表５）。この効果は、５００ｎＭ ＵＴＰの滴注物への併用添加によって逆転された。対照的に、ｄ２でのＡＦＣは、それぞれ、グリベンクラミドおよびニフルム酸による、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質およびＣａ２＋活性化Ｃｌ−チャネル活性の阻害によって影響を受けなかった。
【００９４】
【表５】
（ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害のＡ７７−１７２６の影響）
以前から公知のように、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ａ２株を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内感染は、感染後（ｐ．ｉ．）２日目および４日目での基底ＡＦＣおよびアミロライド感受性ＡＦＣの減少をもたらし、この阻害は、ＵＴＰにより媒介され、Ｐ２Ｙレセプター（ＡＪＰＬＣＭＰ，２００４）を経て作用した。感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害は、ＡＦＣ滴注物への２５ｍＭのＡ７７−１７２６（これは、デノボピリミジン合成を遮断した）の添加により防止されるが、２５ｍＭのミコフェノール酸または６‐メルカプトプリン（両方とも、デノボプリン合成を遮断する）のいずれによっても防止されないことがさらに示された。Ａ７７−１７２６により媒介される遮断は、５０ｍＭウリジン（これは、サルベージ経路を介するピリミジン合成を許容する）の添加によって逆転されたが、２５ｍＭゲニステイン（これは、Ａ７７−１７２６の非特異的チロシンキナーゼインヒビター効果を模倣する）によっては再現されなかった。このことは、Ａ７７−１７２６の遮断効果がデノボピリミジン合成経路により媒介されたことを示す。同様に、デノボピリミジン合成インヒビターレフルノミド（１％メチルセルロース中５ｍｇ／ｋｇのｐ．ｏ．を１０日間）を用いたマウスの処置は、ＡＦＣに対するＲＳＶの阻害効果を逆転させた。さらに、体積を調整した陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）機能のインヒビター（例えば、フルオキセチン（１０ｍＭ）、ベラパミル（１０ｍＭ）およびタモキシフェン（２５ｍＭ））はまた、感染後２日目にＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を遮断した。まとめて考えると、これらのデータは、ＲＳＶ感染の間にＡＦＣを阻害するＵＴＰがデノボピリミジン合成に由来するとともにＶＲＡＣを介して放出されることを実証した。これらの経路は、ＡＦＣのＵＴＰによって誘導される減少を防止する新しい治療アプローチを提供する。これは、ＲＳＶ感染後の、体積が増加した流体粘液、気道うっ血および鼻漏の形成に寄与する。
【００９５】
図１２に示すように、ＲＳＶでの感染は、感染後（ｐ．ｉ．）２日目および４日目での基底肺胞流体クリアランス（ＡＦＣ）を有意に阻害する。非感染マウス（Ｕ）と比較して、偽感染（Ｍ）は、ＡＦＣに影響を及ぼさない。基底ＡＦＣは、２日目において（偽感染値から）４３％阻害され、４日目において２６％阻害された。ＡＦＣのアミロライド感受性もまた、１日目に減少しており、２日目および４日目には存在しなかった。
【００９６】
感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害は、アピラーゼ（これはＵＴＰおよびＡＴＰの両方を分解する）またはＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（これは、グルコース一リン酸および無機ピロホスファターゼの存在下でＵＴＰを分解する）をＡＦＣ滴注物に添加することによって逆転されたが、ヘキソキナーゼ（これは、ブドウ糖の存在下でＡＴＰを分解する）の添加によっては逆転されなかった。Ｐ２Ｙレセプター特異的アンタゴニスト（２００ｍＭ ＸＡＭＲ０７２１）を滴注物に添加することによっても、感染後２日目にてＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害が逆転した。
【００９７】
５％脂肪酸非含有ＢＳＡを含む０．３ｍｌの等モル量の（ｉｓｏｓｍｏｌａｒ）ＮａＣｌの気管内滴注後３０分間の期間にわたって、正常な体温および血中ガスを有する、麻酔をかけ、通気されたＢＡＬＢ／ｃマウスについて、ＡＦＣ研究を行った。１群あたりで分析したマウス数を、各グラフの関連した棒に列挙する。
【００９８】
図１３に示すように、ＡＦＣ滴注物にジヒドロオロト酸レダクターゼインヒビター（２５μＭ Ａ７７−１７２６）を添加することにより、感染後２日目にてＡＦＣのＲＳＶり媒介性阻害が逆転した。Ａ７７−１７２６の効果は、ＡＦＣ滴注物への５０ｍＭウリジンの併用添加によって完全に逆転されたが、２５ｍＭゲニステイン（非特異的なチロシンキナーゼインヒビター）によっては再現されない。従って、Ａ７７−１７２６の効果は、デノボピリミジン合成経路に特異的である。
【００９９】
図１４に示すように、ＡＦＣ滴注物に対するＩＭＰデヒドロゲナーゼインヒビター（２５μＭの６−ＭＰまたはＭＰＡ）の添加は、感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に対してごく軽微な影響しか及ぼさなかった。ＩＭＰデヒドロゲナーゼインヒビターの影響が小さいのは、ＡＴＰの枯渇の結果であった。ＡＴＰは、デノボピリミジン合成のために必要な前駆体である。ＭＰＡの影響は、プリンサルベージ経路を介したＡＴＰの合成を許容する、ＡＦＣ滴注物への５０ｍＭヒポキサンチン（ＨＸＡ）の併用添加によって完全に逆転された。この知見は、ＲＳＶ感染注のＡＴＰ貯蔵が少ないことを実証した。
【０１００】
（感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害は、デノボピリミジン合成のインヒビターであるＡ７７−１７２６によって防止される）
Ａ７７−１７２６の影響は、外因性ウリジンの添加により遮断された。外因性ウリジンは、サルベージ経路を介したＵＴＰ合成を促進する。そして、Ａ７７−１７２６の影響は、ゲニステインによって再現されない。ゲニステインは、Ａ７７−１７２６の非特異的チロシンキナーゼ阻害効果を模倣する。おそらくＡＴＰ合成（ＡＴＰは、デノボでのピリミジン合成のために必要な前駆体である）の減少の結果として、デノボプリン合成のインヒビター（例えば、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）および６‐メルカプトプリン（６−ＭＰ）は、ＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に対してごくわずかな遮断効果を有した。さらに、この影響は、外因性ヒポキサンチンの添加により遮断された。外因性ヒポキサンチンは、サルベージ経路を介したＡＴＰ合成を促進する。興味深いことに、感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害はまた、体積を調整された陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）（これは、ＡＴＰおよびＵＴＰについて放出機構と提唱されている）の様々な異なるインヒビターによって防止され、そしてＲｈｏキナーゼ（これは、ＲＳＶにより活性化されることが公知であり、ＶＲＡＣを活性化することもまた公知である）の阻害により防止された。
【０１０１】
【表６】
（感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ誘発性阻害に対する感染後でのＡ７７−１７２６処置）
マウスを、Ａ７７−１７２６の鼻腔内投与（１００μｌ正常生理食塩水中５０μＭ、両方の鼻孔に分けた）によって感染後２４時間にて処置した場合、感染後２４時間でのＡＦＣに対するＲＳＶの阻害効果は完全に遮断された。このことは、肺に局所的に投与した場合、Ａ７７−１７２６がデノボピリミジン合成に対して長期にわたる阻害効果を有したことを実証する。Ａ７７−１７２６の鼻腔内前処置はまた、ＲＳＶ感染の翌日に増加する肺の湿重量：乾燥重量の比率（肺の水分含量および水腫形成の指標）の正常化とも関係していた。
【０１０２】
【表７】
さまざまな改変および変更は、本明細書において記載されている化合物、組成物および方法になされ得る。本明細書において記載されている化合物、組成物および方法の他の局面は、明細書を考慮することにより、そして本明細書において開示される化合物、組成物および方法を実施することにより、明らかである。明細書および実施例が例示とみなされることが意図される。
【０１０３】
【表８−１】
【０１０４】
【表８−２】
【０１０５】
【表８−３】
【０１０６】
【表８−４】
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、ピリミジン生合成経路およびプリン生合成経路を図示している概略図である。
【図２Ａ】図２は、末梢酸素化に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ａ）意識のあるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳｍＯ２（混合酸素飽和）に対するＲＳＶ感染の影響の時間経過（１日につきｎ＝１０〜３６）。＊偽感染したマウスと比較して、ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】図２は、末梢酸素化に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｂ）ｄ２での偽感染したマウスおよびＲＳＶ感染したマウスについての肺胞流体クリアランス（ＡＦＣ）期間の始めと終わりのサンプル３−リードＥＣＧ（心電図）トレース。
【図２Ｃ】図２は、末梢酸素化に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｃ）ｄ２でのΔＨＲ３０％でのＲＳＶ感染の影響（偽感染したマウスについてｎ＝１７、ＲＳＶ感染したマウスについてｎ＝１１）。
【図３Ａ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ａ）ｄ４での偽感染したマウスおよびＲＳＶ感染したマウスにおけるＮＰＤの代表的トレース。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図３Ｂ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｂ）基底ＮＰＤに対するＲＳＶ感染の影響。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図３Ｃ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｃ）ＮＰＤのアミロライド感受性成分（ＮＰＤ ＡＭＩＬ）に対するＲＳＶ感染の影響。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図３Ｄ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｄ）ｄ４にて偽感染したマウスおよびＲＳＶ感染マウスの鼻上皮に対して±６０ｎＡパルスを印加したＮＰＤにおける変化の中でサンプルトレース。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図３Ｅ】図３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける鼻の電位差（ＮＰＤ）に対するＲＳＶ感染の影響を示す。（Ｅ）鼻上皮に対して±６０ｎＡパルスを印加したΔＮＰＤに対するＲＳＶ感染の影響。すべてのグループについてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、矢印は、１００μＭアミロライド添加の時間を示す。＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊偽感染した動物と比較して、ｐ＜０．００５。
【図４Ａ】図４は、ＲＳＶ感染後の、体重に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ感染後の急な体重減少に対するレフルノミド（ＵＴＰ合成のインヒビター）の影響（未処置マウスについてｎ＝３５、レフルノミド処置したマウスについてｎ＝１９）。＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．００５、＊＊＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図４Ｂ】図４は、ＲＳＶ感染後の、体重に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ感染後の急な体重減少に対する６−ＭＰ処置の影響（未処置マウスについてｎ＝３５、６−ＭＰ処置マウスについてｎ＝３０）。＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．００５、＊＊＊各時点の未処置マウスにおける体重と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図５】図５は、レフルノミド（ＬＥＦ）をマウスに栄養法で与えることの効果により、感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を逆転させることを示す。ＬＥＦの影響は、ウリジンの併用投与により防止される。
【図６】図６は、レフルノミド（ＬＥＦ）をマウスに栄養法で与えることの効果により、感染後２日目での肺水含量におけるＲＳＶ誘導性増加を逆転させることを示す。レフルノミドの影響は、ウリジンの併用投与により防止される。重要なことに、ＬＥＦおよび／またはウリジンを用いたマウスの処置は、感染後２日目に肺組織のウイルス複製に対して影響を及ぼさない。
【図７】図７は、ＡＦＣ滴注物に対する体積を調整した陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）のの広範囲のインヒビターの添加の影響により、感染後２日目でのＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を逆転させることを示す。
【図８Ａ】図８は、ＲＳＶ感染後の肺水分含量に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ａ）ｄ２での肺水分含量に対するレフルノミドおよびウリジン処置の影響（すべての群についてｎ＝７〜８）。＊＊＊未感染マウスにおける湿重量：乾燥重量比率と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図８Ｂ】図８は、ＲＳＶ感染後の肺水分含量に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｂ）ｄ２での肺水分含量に対する６−ＭＰの影響（未感染マウスについてｎ＝８；未処置のＲＳＶ感染マウスについてｎ＝７；６−ＭＰ処置マウスについてｎ＝１５）。肺水分含量を、湿重量：乾燥重量比率によって測定した。＊＊＊未感染マウスにおける湿重量：乾燥重量比率と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図９Ａ】図９は、マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ａ）ｄ２でのウイルス複製に対するレフルノミドおよびウリジン処置の影響（未処置のウリジン処置マウスおよびレフルノミドおよびウリジン処置マウスについてｎ＝６；レフルノミド処置マウスについてｎ＝１２）。破線は、アッセイの検出限界を示す。＊＊＊未処置マウスにおけるウイルス力価と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図９Ｂ】図９は、マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｂ）ｄ２でのウイルス複製に対する６−ＭＰの影響（未処置マウスについてｎ＝６；６−ＭＰ処置マウスについてｎ＝１２）。破線は、アッセイの検出限界を示す。＊＊＊未処置マウスにおけるウイルス力価と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図９Ｃ】図９は、マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｃ）ｄ８でのウイルス複製に対する継続したレフルノミド処置の影響（未処置マウスについてｎ＝６；レフルノミド処置マウスについてｎ＝１２）。破線は、アッセイの検出限界を示す。＊＊＊未処置マウスにおけるウイルス力価と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図９Ｄ】図９は、マウス肺におけるＲＳＶ複製に対するヌクレオチド合成阻害の影響を示す。（Ｄ）ｄ８でのウイルス複製に対するｄ２へのレフルノミド処置の影響（両群についてｎ＝６）。破線は、アッセイの検出限界を示す。＊＊＊未処置マウスにおけるウイルス力価と比較して、ｐ＜０．０００５。
【図１０Ａ】図１０は、ＲＳＶ感染後の低酸素血症に対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ａ）ｄ２でのマウスのＳｍＯ２に対するレフルノミド処置の影響（未処置のＲＳＶ感染マウスについてｎ＝８；レフルノミド処置したＲＳＶ感染マウスについてｎ＝７）。＊未処置の値と比較して、ｐ＜０．０５。
【図１０Ｂ】図１０は、ＲＳＶ感染後の低酸素血症に対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ｂ）ＲＳＶ感染およびｄ２でのΔＨＲ３０％でのレフルノミド処置の影響（未処置のＲＳＶ感染マウスについてｎ＝１１；レフルノミド処置したＲＳＶ感染マウスについてｎ＝９）。＊未処置の値と比較して、ｐ＜０．０５。
【図１１Ａ】図１１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＰＤに対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ａ）ｄ４でのレフルノミド処置したＲＳＶ感染マウスにおけるＮＰＤのサンプルトレース。すべての群についてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、そして矢印は１００μＭアミロライド添加時間を示す。＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．０５、＊＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．００５。
【図１１Ｂ】図１１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＰＤに対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ｂ）ＲＳＶ感染マウスにおける基底ＮＰＤに対するレフルノミド処置の影響。すべての群についてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、そして矢印は１００μＭアミロライド添加時間を示す。＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．０５、＊＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．００５。
【図１１Ｃ】図１１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＰＤに対するレフルノミド処置の影響を示す。（Ｃ）ＲＳＶ感染マウスにおけるＮＰＤＡＭＩＬに対するレフルノミド処置の影響。すべての群についてｎ＝５〜９。サンプルトレース上の破線は、チャート上の０ｍＶを示し、そして矢印は１００μＭアミロライド添加時間を示す。＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．０５、＊＊未処置動物におけるＮＰＤと比較して、ｐ＜０．００５。
【図１２】図１２は、ＲＳＶでの感染が、感染後（ｉ．ｐ．）２日目および４日目の基底肺胞流体クリアランス（ＡＦＣ）を有意に阻害することを示す。偽感染（Ｍ）は、非感染マウス（Ｕ）と比較して、ＡＦＣに影響を及ぼさない。基底ＡＦＣは、２日目に（偽感染の値から）４３％阻害され、そして４日目に２６％阻害された。ＡＦＣのアミロライド感受性はまた、１日目に減少しており、そして感染後２日目および４日目には存在しなかった。
【図１３】図１３は、ＡＦＣ滴注物に対するジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビター（２５ｍμ Ａ７７−１７２６）の添加が、感染後２日目にＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害を逆転させることを示す。Ａ７７−１７２６の影響は、５０ｍＭウリジンのＡＦＣ滴注物への併用添加によって完全に逆転されるが、２５ｍＭゲニステイン（非特異的チロシンキナーゼインヒビター）により再現されない。
【図１４】図１４は、ＡＦＣ滴注物に対するＩＭＰデヒドロゲナーゼのインヒビター（２５μＭの６−ＭＰまたはＭＰＡ）の添加が感染後２日目のＡＦＣのＲＳＶ媒介性阻害に軽微な影響しか及ぼさないことを示す。ＩＭＰデヒドロゲナーゼインヒビターの小さい効果はＡＴＰ枯渇の結果であり、そしてそれはデノボピリミジン合成のために必要な前駆体である。ＭＰＡ効果は５０ｍＭヒポキサンチン（ＨＸＡ）のＡＦＣ滴注物への併用添加によって完全に逆転され、プリンサルベージ経路を介するＡＴＰ合成を許容した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリミジン合成インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、被験体の肺上皮細胞への局所投与に適している、組成物。
【請求項２】
前記組成物が吸入剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がエアロゾル化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が霧状にされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ピリミジン合成インヒビターがジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が鼻腔内投与に適した形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記肺上皮細胞が、前記被験体の鼻腔、鼻の通路、鼻咽頭、咽頭、気管、気管支、細気管支または肺胞に位置する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記肺上皮細胞が気管支肺胞上皮細胞である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
治療量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を少なくとも１測定用量含むデバイスであって、各測定用量は、被験体における肺疾患を処置するための治療量またはその一部のピリミジン合成インヒビターを含む、デバイス。
【請求項１２】
組成物が、被験体の肺上皮細胞への局所投与に適応可能な形態である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記組成物が吸入剤である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記組成物がエアロゾル化される、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記組成物が霧状にされる、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記ピリミジン合成インヒビターがジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記組成物が鼻腔内投与に適した形態である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記肺疾患がＲＳウイルス感染である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２１】
肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスを増加させる方法であって、該細胞と有効量のピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程を包含し、該接触により、該細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスの増加が引き起こされる、方法。
【請求項２２】
前記肺上皮細胞をインビボで接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記肺上皮細胞をインビトロで接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ピリミジン合成インヒビターがジヒドロオロト酸レダクターゼインヒビターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
被験体における肺疾患を処置する方法であって、該被験体における複数の肺上皮細胞と有効量のピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程を包含し、該有効量のピリミジン合成インヒビターは、該被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体クリアランスの増加を引き起こす、方法。
【請求項２８】
前記肺上皮細胞が鼻腔、鼻の通路、鼻咽頭、咽頭、気管、気管支、細気管支または肺胞に位置する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記肺上皮細胞が気管支肺胞上皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記肺疾患がＲＳウイルス感染である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記有効量のピリミジン合成インヒビターがジヒドロオロト酸レダクターゼインヒビターを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＳウイルス感染の危険がある被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法であって、有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記ピリミジン合成インヒビターが、ジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定する工程、および有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
前記ピリミジン合成インヒビターが、ジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定する工程、および該被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４３】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、請求項１に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、請求項２に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、請求項５に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４６】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、請求項８に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法であって、肺上皮細胞と該試験化合物とを、過剰のＵＴＰの存在下で接触させる工程、該肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを検出する工程、を包含し、コントロールと比較したＮａ＋依存性流体取り込みの増加は、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す、方法。
【請求項４８】
前記細胞をインビボで接触させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞をインビトロで接触させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＵＴＰを除去する工程、および前記Ｎａ＋依存性流体取り込みの増加の可逆性を検出する工程をさらに包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法であって、該試験化合物と、ピリミジン合成遺伝子をコードする異種核酸を発現する細胞とを接触させる工程、および該細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを検出する工程、を包含し、コントロールレベルと比較したＮａ＋依存性流体取り込みの増加は、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す、方法。
【請求項５２】
前記細胞をインビボで接触させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞をインビトロで接触させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
呼吸上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法であって、Ｈ４４１細胞またはＨ４４１細胞株にＲＳウイルスを感染させる工程、該感染した細胞または細胞株とピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程、および該感染した細胞または該感染した細胞株の細胞を越えるイオン輸送を測定する工程を包含し、コントロールレベルと比較したイオン輸送の増加は、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す、方法。
【請求項５５】
前記細胞をインビボで接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞をインビトロで接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項１】
ピリミジン合成インヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、被験体の肺上皮細胞への局所投与に適している、組成物。
【請求項２】
前記組成物が吸入剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がエアロゾル化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が霧状にされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ピリミジン合成インヒビターがジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が鼻腔内投与に適した形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記肺上皮細胞が、前記被験体の鼻腔、鼻の通路、鼻咽頭、咽頭、気管、気管支、細気管支または肺胞に位置する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記肺上皮細胞が気管支肺胞上皮細胞である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
治療量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を少なくとも１測定用量含むデバイスであって、各測定用量は、被験体における肺疾患を処置するための治療量またはその一部のピリミジン合成インヒビターを含む、デバイス。
【請求項１２】
組成物が、被験体の肺上皮細胞への局所投与に適応可能な形態である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記組成物が吸入剤である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記組成物がエアロゾル化される、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記組成物が霧状にされる、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記ピリミジン合成インヒビターがジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記組成物が鼻腔内投与に適した形態である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記肺疾患がＲＳウイルス感染である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２１】
肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスを増加させる方法であって、該細胞と有効量のピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程を包含し、該接触により、該細胞によるＮａ＋依存性流体クリアランスの増加が引き起こされる、方法。
【請求項２２】
前記肺上皮細胞をインビボで接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記肺上皮細胞をインビトロで接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ピリミジン合成インヒビターがジヒドロオロト酸レダクターゼインヒビターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
被験体における肺疾患を処置する方法であって、該被験体における複数の肺上皮細胞と有効量のピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程を包含し、該有効量のピリミジン合成インヒビターは、該被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体クリアランスの増加を引き起こす、方法。
【請求項２８】
前記肺上皮細胞が鼻腔、鼻の通路、鼻咽頭、咽頭、気管、気管支、細気管支または肺胞に位置する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記肺上皮細胞が気管支肺胞上皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記肺疾患がＲＳウイルス感染である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記有効量のピリミジン合成インヒビターがジヒドロオロト酸レダクターゼインヒビターを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＳウイルス感染の危険がある被験体におけるＲＳウイルス感染の一つ以上の症状または身体的徴候を減らす方法であって、有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記ピリミジン合成インヒビターが、ジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
ＲＳウイルス感染の危険がある被験体を同定する工程、および有効量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
前記ピリミジン合成インヒビターが、ジヒドロオロト酸レダクターゼのインヒビターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ピリミジン合成インヒビターがレフルノミドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ピリミジン合成インヒビターがＡ７７−１７２６である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を同定する工程、および該被験体におけるＮａ＋依存性肺胞流体を減らすのに有効な量のピリミジン合成インヒビターを含む組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４３】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、請求項１に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、請求項２に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、請求項５に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４６】
ＲＳウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、請求項８に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法であって、肺上皮細胞と該試験化合物とを、過剰のＵＴＰの存在下で接触させる工程、該肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを検出する工程、を包含し、コントロールと比較したＮａ＋依存性流体取り込みの増加は、肺上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す、方法。
【請求項４８】
前記細胞をインビボで接触させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞をインビトロで接触させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＵＴＰを除去する工程、および前記Ｎａ＋依存性流体取り込みの増加の可逆性を検出する工程をさらに包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法であって、該試験化合物と、ピリミジン合成遺伝子をコードする異種核酸を発現する細胞とを接触させる工程、および該細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを検出する工程、を包含し、コントロールレベルと比較したＮａ＋依存性流体取り込みの増加は、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す、方法。
【請求項５２】
前記細胞をインビボで接触させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞をインビトロで接触させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
呼吸上皮細胞によるＮａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物についてスクリーニングする方法であって、Ｈ４４１細胞またはＨ４４１細胞株にＲＳウイルスを感染させる工程、該感染した細胞または細胞株とピリミジン合成インヒビターとを接触させる工程、および該感染した細胞または該感染した細胞株の細胞を越えるイオン輸送を測定する工程を包含し、コントロールレベルと比較したイオン輸送の増加は、Ｎａ＋依存性流体取り込みを増加させる試験化合物を示す、方法。
【請求項５５】
前記細胞をインビボで接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞をインビトロで接触させる、請求項５４に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５００３９３（Ｐ２００８−５００３９３Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７５１６（Ｐ２００７−５２７５１６）
【出願日】平成１７年５月２０日（２００５．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７９３９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００１９６１
【国際公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【出願人】（５０６３８７４８７）ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２０日（２００５．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７９３９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００１９６１
【国際公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【出願人】（５０６３８７４８７）ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション (4)
【Ｆターム（参考）】
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