ファミリー４４のキシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物
本発明は、親キシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコシル加水分解酵素のファミリー４４に属するキシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
キシログルカンは、植物の一次（成長中）細胞壁中の主要構造の多糖類である。構造上、キシログルカンは、しばしば様々な側鎖により置換されるセルロース様β−１，４−結合グルコース主鎖から成る。キシログルカンは、セルロースミクロフィブリルを架橋してセルロース−キシログルカン網状構造を形成することにより、植物の一次細胞壁において機能を果たすと考えられる。
【０００３】
キシログルカンは、キシログルカンからキシログルカンオリゴ糖への可溶化を触媒することができる。一部のキシログルカナーゼはキシログルカナーゼ活性のみを示すが、その他のものはキシログルカナーゼ及びセルロース活性の両方を示す。キシログルカンは、ＥＣ３．２．１．４又はＥＣ．３．２．１．１５１に分類されることができる。キシログルカナーゼ活性を有する酵素は、例えば、Ｖｉｎｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２９８（４）：２９９〜３１０に記載されており、その中で、トリコデルマ・ビリデ（Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）に類似）由来の３種類のエンドグルカナーゼである、エンドＩ、エンドＶ及びエンドＶＩを特徴づけている。エンドＩ、エンドＶ及びエンドＶＩは、それぞれグルコシル加水分解酵素のファミリー５、７及び１２に属する（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１，１９９３）を参照のこと）。ＷＯ ９４／１４９５３は、真菌アスペルギルス・アクレータス（Aspergillus aculeatus）からクローニングされたファミリー１２のキシログルカナーゼ（ＥＧＩＩ）を開示している。ＷＯ ９９／０２６６３は、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）及びバシラス・アガラヘレンス（Bacillus agaradhaerens）からそれぞれクローニングされたファミリー１２及びファミリー５のキシログルカナーゼを開示している。ＷＯ ０１／０６２９０３は、ファミリー４４のキシログルカナーゼを開示している。
【０００４】
特に、ＷＯ ９９／０２６６３及びＷＯ ０１／０６２９０３は、キシログルカナーゼを洗剤で使用する可能性について示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、その親酵素と比べて改善された特性を有するグルコシル加水分解酵素のファミリー４４に属するキシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、位置番号６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５、３６６、１、３７４、７、１４０、８、１４、２１、２１１、３７、４５、１３、７８、８７、４３６、１０１、１０４、１１１、３０６、１１７、１１９、４１４、１３９、２６８、１４２、１５９、１６４、１０２、１６８、１７６、１８０、４８２、１８３、２０２、２０６、２１７、４、２２２、１９、２２４、２２８、２３２、２、２４０、２４４、５、２４７、２４９、３２８、２５２、２５９、４０６、２６７、２６９、２７５、１７９、１６６、２７８、２８１、２８８、２９８、３０１、１８、３０２、１６５、８０、３０３、３１６、１６９、３２２、１２０、１４６、３４２、３４８、１４７、３５３、３８０、４６８、３８２、３８３、３８、３８４、３８９、３９１、１０、３９２、３９６、１７７、３９７、３９９、４０９、２３７、４１３、２５３、４１５、４１８、４０、４４３、４４５、１４８、４４９、２２５、４５０、４５４、３、４５５、４５６、２９９、４６１、４７０、２０４、４７６、４８８、３４７、及び５０７からなる群から選択される１つ以上（いくつか）の位置の改変を含む、親キシログルカナーの単離された変異体を含む洗剤組成物に関し、この位置はアミノ酸配列番号３の位置に対応しており、この改変は独立して、
ｉ）この位置を占めるアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
ｉｉ）この位置を占めるアミノ酸の欠失、又は
ｉｉｉ）この位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸での置換、であり、
親キシログルカナーゼはファミリー４４のキシログルカナーゼであり、変異体はキシログルカナーゼ活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１ａ】コンセンサス配列表。
【図１ｂ】コンセンサス配列表。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、位置の番号付けが配列番号３の位置の番号付けに対応している、１つ以上（いくつか）の位置における好ましくは置換及び／若しくは挿入並びに／又は欠失の形態の改変を含む、ファミリー４４の親キシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物に関する。本発明の変異体はキシログルカナーゼ活性を有し、セルロース分解活性も有する可能性もある。本発明の変異体は、親キシログルカナーゼと比べて改善された特性を有する。一態様において、この変異体は、液体洗剤、特に液体洗濯洗剤組成物中での改善された安定性を有する。
【０００９】
定義
キシログルカナーゼ活性：用語「キシログルカナーゼ活性」は、本明細書においては、キシログルカンの酵素触媒による加水分解として定義される。この反応は、キシログルカンの１，４−β−Ｄ−グルコース結合のエンド加水分解を伴う。本発明の目的上、キシログルカナーゼ活性は、ＡＺＣＬ−キシログルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅより入手）を反応基質として使用して決定される。アッセイは、本出願の実施例２に記載のような、又はＷＯ ０１／６２９０３に記載のような様々な方法で実施され得る。キシログルカナーゼ活性の一単位（ＸｙｌｏＵ）は、ＷＯ ０１／６２９０３の６０頁、３〜１７行目に記載のアッセイ方法を参照することにより定義される。
【００１０】
セルロース活性：用語「セルロース活性」は、本明細書においては、β−１，４−グルカン（セルロース）の１，４−β−Ｄ−グルコース結合の酵素触媒による加水分解として定義される。本発明の目的上、セルロース活性は、ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロース（Ｍｅｇａｚｙｍｅより入手）を反応基質として使用して決定される。
【００１１】
変異体：用語「変異体」は、本明細書においては、１つ以上（いくつか）の特定位置にある１つ以上（いくつか）のアミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失などの改変を含むキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドとして定義され、この特定位置は配列番号３のアミノ酸位置に対応している。本発明の変異体はまたセルロース活性を有してもよい。変性ポリペプチド（変異体）は、人間の介入により親の酵素をコードするポリヌクレオチド配列を修飾することによって得る。親の酵素は、配列番号１、配列番号４、若しくは配列番号６、又はこれらの配列の１つと少なくとも７５％同一である配列によってコードされ得る。変異体ポリペプチド配列は、自然界に見られないものであるのが好ましい。
【００１２】
野生型酵素：用語「野生型」キシログルカナーゼは、自然界に見られる細菌、酵母又は糸状菌等の自然発生微生物によって発現されるキシログルカナーゼを意味する。用語「野生型」は、用語「自然発生的な」と交換可能に使用されてもよい。
【００１３】
親酵素：本明細書で使用されるとき、用語「親」キシログルカナーゼ又は「親の」キシログルカナーゼは、本発明の酵素変異体を生成するために、修飾、例えば、置換、挿入、欠失及び／又はトランケーションが行われるキシログルカナーゼを意味する。この用語はまた、変異体と比較させる及びアラインメントさせるポリペプチドを指す。親は、配列番号２若しくは配列番号３又は配列番号５あるいは配列番号７の酵素等の自然発生的な（野生型）ポリペプチドであってもよい。しかしながら、親ポリペプチドはまた、アミノ酸配列が修飾された又は変化した自然発生的なポリペプチドの変異体であってもよい。親は、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかによってコードされるポリペプチドである対立遺伝子変異体であってもよい。
【００１４】
単離変異体又はポリペプチド：本明細書で使用されるとき、用語「単離変異体」又は「単離ポリペプチド」は、供与源から単離される変異体又はポリペプチドを指し、この供給源は、例えば変異体又はポリペプチドがそこから発現される宿主細胞、又は変異体又はポリペプチドが通常存在する酵素複合体である。好ましくは、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、少なくとも４０％純度、より好ましくは少なくとも６０％純度、更により好ましくは少なくとも８０％純度、最も好ましくは少なくとも９０％純度、及び更に最も好ましくは少なくとも９５％純度である。
【００１５】
実質的に純粋な変異体又はポリペプチド：本明細書において、用語「実質的に純粋な変異体」又は「実質的に純粋なポリペプチド」とは、自然に又は組み換えで付随しているその他のポリペプチド材料を最大限でも１０重量％、好ましくは最大限でも８重量％、より好ましくは最大限でも６重量％、より好ましくは最大限でも５重量％、より好ましくは最大限でも４重量％、最大限でも３重量％、更により好ましくは最大限でも２重量％、最も好ましくは最大限でも１重量％、及び更に最も好ましくは最大限でも０．５重量％含有するポリペプチド製剤を言う。したがって、実質的に純粋な変異体又はポリペプチドは、製剤に存在する全ポリペプチド材料の、少なくとも９２重量％純度、好ましくは少なくとも９４重量％純度、より好ましくは少なくとも９５重量％純度、より好ましくは少なくとも９６重量％純度、より好ましくは少なくとも９６重量％純度、より好ましくは少なくとも９７重量％純度、より好ましくは少なくとも９８重量％純度、更により好ましくは少なくとも９９重量％純度、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純度、及び更に最も好ましくは１００重量％純度であるのが好ましい。本発明の変異体及びポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形である。これは、例えば、変異体又はポリペプチドを既知の組換え方法を用いて、又は古典的な精製法によって調製することにより達成することが可能である。
【００１６】
成熟したポリペプチド：用語「成熟したポリペプチド」は、本明細書では、翻訳及び任意の翻訳後の修飾、例えばＮ末端端プロセシング、グリコシル化、リン酸化反応等に続く最終形態のキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドとして定義される。配列番号２で定義されるポリペプチドでは、成熟したキシログルカナーゼ配列は、理論上は配列番号２の位置２８で始まってもよい。成熟配列は配列番号２の位置５５１で終了する。理論上の成熟したキシログルカナーゼ配列は配列番号３に示される。
【００１７】
成熟したポリペプチドコード配列：用語「成熟したポリペプチドコード配列」は、キシログルカナーゼ活性を有する成熟したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義される。一態様において、成熟したポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３である。
【００１８】
同一性：２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「同一性」によって表される。
【００１９】
本発明の目的上、２つのアミノ酸配列間の同一性の度合は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムで実施されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３）の、好ましくはバージョン３．０．０以降を用いて決定される。使用される所望によるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョンＢＬＯＳＵＭ６２）置換マトリックスである。「最長同一（longestidentity）」と標識されたＮｅｅｄｌｅ出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの合計数）
【００２０】
本発明の目的上、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の度合は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（前掲のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムで実施されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前掲のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）の、好ましくはバージョン３．０．０以降を用いて決定される。使用される所望によるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリックスである。「最長同一（longestidentity）」と標識されたＮｅｅｄｌｅ出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの合計数）。
【００２１】
機能性フラグメント：用語「ポリペプチドの機能性フラグメント」は、長いポリペプチド、例えば、成熟したポリペプチドから誘導され、かつ親ポリペプチドのフラグメントを生成するために、Ｎ末端領域若しくはＣ末端領域のいずれか、又はその両方の領域で切断されているポリペプチドを説明するのに用いられる。機能性ポリペプチドになるために、フラグメントは、完全長の／成熟したポリペプチドのキシログルカナーゼ活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び更に最も好ましくは少なくとも１００％を維持しなければならない。
【００２２】
対立遺伝子変異体：本明細書において用語「対立遺伝子変異体」とは、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態いずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然発生し、個体群内の多形性となり得る。遺伝子の突然変異はサイレント（コード化されたポリペプチドにおいて変化しない）であり得、代替アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもできる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコード化されたポリペプチドである。
【００２３】
単離ポリヌクレオチド：本明細書で使用されるとき、用語「単離ポリヌクレオチド」は、供与源から単離されるポリヌクレオチドを指す。一態様において、単離ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動で測定した場合、少なくとも４０％純度、より好ましくは少なくとも６０％純度、更により好ましくは少なくとも８０％純度、及び最も好ましくは少なくとも９０％純度、及び更に最も好ましくは少なくとも９５％純度である。
【００２４】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書で使用されとき、「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の外来性又は不必要なヌクレオチドのない、及び遺伝子組み換えされたポリペプチド生産システム内での使用に好適な形態のポリヌクレオチド製剤を言う。したがって、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、自然に又は組み換えで付随しているその他のポリヌクレオチドを、最大限でも１０重量％、好ましくは最大限でも８重量％、より好ましくは最大限でも６重量％、より好ましくは最大限でも５重量％、より好ましくは最大限でも４重量％、最大限でも３重量％、更により好ましくは最大限でも２重量％、最も好ましくは最大限でも１重量％、及び更に最も好ましくは最大限でも０．５％含有している。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモーター及びターミネーターのような自然発生する５’及び３’非翻訳領域を含んでいてもよい。実質的に純粋なポリヌクレオチドが、少なくとも９０重量％純度、好ましくは少なくとも９２重量％純度、より好ましくは少なくとも９４重量％純度、より好ましくは少なくとも９５重量％純度、より好ましくは少なくとも９６重量％純度、より好ましくは少なくとも９６重量％純度、より好ましくは少なくとも９７重量％純度、より好ましくは少なくとも９８重量％純度、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％純度、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純度、及び更に最も好ましくは１００重量％純度であるのが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形である、即ち、ポリヌクレオチド製剤は、自然に又は組み換えで付随しているその他のポリペプチド材料を本質的に含んでいない。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はこれらの任意の組合せであってもよい。
【００２５】
コード配列：本明細書において使用されるとき、用語「コード配列」は、ポリヌクレオチドを意味し、ポリヌクレオチドは、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接特定する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームで決定され、通常、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧ及びＴＴＧ等の代替開始コドンにより開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ，及びＴＧＡ等の終止コドンで終了する。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または組換えポリヌクレオチドであり得る。
【００２６】
作動可能にライゲーションされる：本明細書において、用語「作動可能にライゲーションされる」は、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を指示するように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に制御配列を配置する構成を意味する。
【００２７】
宿主細胞：本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構造体又はベクターにより形質転換、トランスフェクション、トランスダクション等を受けやすい任意の細胞型を含む。用語「宿主細胞」は、複製の間に起こる突然変異のために親細胞と同一でない親細胞の任意の子孫を含む。
【００２８】
改善された化学安定性：用語「改善された化学安定性」は、本明細書において、自然発生的又は合成のいずれかの、親酵素の酵素活性を低減する化学物質の存在下におけるインキュベーション期間後に、酵素活性の保持を示す変種酵素として定義される。改善された化学安定性はまた、かかる化学物質の存在下における反応をより良好に触媒することが可能な変異体をもたらすことができる。本発明の特定の態様において、改善された化学安定性は、洗剤、特に液体洗剤中での改善された安定性である。改善された洗剤安定性は、特に、本発明のキシログルカナーゼ変異体が液体洗剤処方の中に混合され、続いて１５〜５０℃の温度で貯蔵される際の、キシログルカナーゼ活性の改善された安定性である。
【００２９】
本発明において、液体洗剤は液体洗濯洗剤として特に有用である。
【００３０】
変異体指定の取り決め
本発明の目的上、配列番号３に開示されるキシログルカナーゼのアミノ酸配列は、別のキシログルカナーゼ中の対応するアミノ酸残基を決定するのに使用される。別のキシログルカナーゼのアミノ酸残基は、配列番号３に開示されるキシログルカナーゼのアミノ酸配列とアラインメントされ、このアラインメントに基づいて、配列番号３に開示されるキシログルカナーゼのアミノ酸配列中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸の位置番号を決定することができる。
【００３１】
ポリペプチド配列の例は、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」を使用して実施することができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，１９９４，ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３〜４６８０）。ＤＮＡ配列のアラインメントは、鋳型としてポリペプチドアラインメントを使用し、アミノ酸をＤＮＡ配列からの対応するコドンで置換することによって実施することができる。
【００３２】
本発明の様々なキシログルカナーゼ変異体を説明するにあたり、参照し易くするために、以下に記載の命名法を適応する。全ての場合において、一般に認められたＩＵＰＡＣの一文字又は三文字アミノ酸略記を採用する。
【００３３】
置換アミノ酸置換に関し、次の命名法、即ち、原形アミノ酸／位置／置換アミノ酸、が使用される。したがって、位置２２６におけるスレオニンとアラニンの置換は「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表わされる。複数の突然変異は、マーク（「＋」）を付加することによって区切られ、例えば、「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５及び４１１で、それぞれ、グリシン（Ｇ）をアルギン（Ｒ）と、及びセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）と置換する突然変異を表している。原型アミノ酸が１つの群から選択されたアミノ酸で置換され得る場合は「Ｋ１２９Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｑ」と表わされ、位置１２９においてリジン（Ｋ）が、アルギン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びグルタミン（Ｑ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることを示している。あるいは、「Ｋ１２９Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｑ」は、Ｋ１２９Ｒ、Ｋ１２９Ｓ、Ｋ１２９Ａ、Ｋ１２９Ｉ、Ｋ１２９Ｆ、又はＫ１２９Ｑと書くこともできる。
【００３４】
欠失アミノ酸欠失に関し、次の命名法、即ち、原型アミノ酸／位置／アルタリスク（＊）が使用される。したがって、位置１９５におけるグリシンの欠失は「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表わされる。複数の欠失は、マーク（「＋」）を付加することによって区切られ、例えば、「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」となる。
【００３５】
挿入アミノ酸挿入に関し、次の命名法、即ち、アルタリスク（＊）／位置／小文字／挿入されたアミノ酸、が使用され、ここで小文字は、位置番号の下流にアミノ酸が付加されたことを示す。したがって、位置１０の下流におけるグルタミン酸（Ｅ）の挿入は「＊１０ａＥ」と表わされる。グルタミン酸（Ｅ）の後に、第２のアミノ酸、例えばバリン（Ｖ）が位置１０の下流に挿入される場合、「＊１０ａＥ＋＊１０ｂＶ」と表わされる。ポリペプチドのＮ末端への追加は０（ゼロ）で表わされる。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸へのグルタミン酸（Ｅ）及びバリン（Ｖ）の追加は、「＊０ａＥ＋＊０ｂＶ」と表わされる。
【００３６】
親キシログルカナーゼ
本発明において、親キシログルカナーゼは、（ａ）ファミリー４４のキシログルカナーゼとも呼ばれる、グルコシル加水分解酵素のファミリー４４に属するキシログルカナーゼ；若しくは（ｂ）配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択されるポリペプチド；又は（ｃ）配列番号３の成熟したポリペプチドと少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；あるいは（ｄ）少なくとも中度のストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の完全長の相補鎖、とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；又は（ｅ）配列番号１の成熟したポリペプチドコード配列と少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；のいずれかである。
【００３７】
第１の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号３の成熟したポリペプチドとの同一性の度合が、好ましくは少なくとも少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、更により好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％又は更に最も好ましくは少なくとも９９％である、キシログルカナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む（以後「相同性のあるポリペプチド」と呼ばれる）。一態様において、相同性のあるポリペプチドは、配列番号３の成熟したポリペプチドと、１０個のアミノ酸が異なる、好ましくは９個のアミノ酸が異なる、より好ましくは８個のアミノ酸が異なる、より好ましくは７個のアミノ酸が異なる、より好ましくは６個のアミノ酸が異なる、より好ましくは５個のアミノ酸が異なる、より好ましくは４個のアミノ酸が異なる、更により好ましくは３個のアミノ酸が異なる、最も好ましくは２個のアミノ酸が異なる、更に最も好ましくは１個のアミノ酸が異なる、アミノ酸配列を有する。
【００３８】
実質的に相同性のある親キシログルカナーゼは、１つ以上（いくつか）のアミノ酸改変、例えば置換、欠失、及び／又は挿入を有していてもよい。これらの変更は軽度のものであるのが好ましく、即ち、タンパク質又はポリペプチドの三次元的折りたたみ又は活性に有意に作用しない保守的なアミノ酸の置換及びその他の置換；典型的には約９個のアミノ酸、好ましくは１〜約１５個のアミノ酸、及び最も好ましくは１〜約３０個のアミノ酸である小さな欠失；及びアミノ末端又はカルボキシル末端の小さな伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基による伸長、最大約５〜１０個の残基、好ましくは１０〜１５個の残基、最も好ましくは２０〜２５個の残基の小さなリンカーペプチドによる伸長、又は精製を容易にする小さな伸長（親和性標識）、例えば、ポリヒスチジン区域又はタンパク質Ａである（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．４：１０７５；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３）。広くは、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５〜１０７も参照のこと。
【００３９】
上記の変更は軽度のものであるのが好ましいが、かかる変更は、アミノ末端又はカルボキシル末端の伸長として最大３００個以上のアミノ酸の大きなポリペプチドの融合などの実質的な性質のものであってもよい。
【００４０】
同類置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性のアミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び微小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群内のものである。一般に比活性度を変化させないアミノ酸の置換は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も普通に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００４１】
本発明のキシログルカナーゼポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニン−スキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜１０８５，１９８９）等の当該技術分野において既知の手段によって同定され得る。後者の技術において、単一のアラニン突然変異は、分子中の全ての残基に導入され、そして得られた突然変異分子は生物活性（即ち、キシログルカナーゼ活性）について検査され、該分子の活性に対して決定的なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８，１９９６も参照のこと。酵素又はその他の生物相互作用の活性部位は、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折、又は光親和性標識などの技術によって決定されるように、構造の物理分析によっても決定することが可能である。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６〜３１２，１９９２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４，１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９〜６４，１９９２を参照のこと。本発明によるポリペプチドに関連するポリペプチドとの同一性の分析から、必須アミノ酸の同一性を推論することもまた可能である。ファミリー４４のグルコシル加水分解酵素に属する酵素の結晶構造は、Ｋｉｔａｇｏ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８２：３５７０３〜３５７１１，２００７により刊行されている。この構造に基づいて、コンピュータによる親キシログルカナーゼ（配列番号３）の三次元構造体を作ることが可能である。公表された構造との比較を基に、配列番号３の以下の残基が、酵素機能Ｅ１８７（触媒−酸／塩基）、Ｅ３５８（触媒−求核剤）、Ｅ５６（Ｃａ２＋に配位結合するカルボキシレート基）、及びＤ１５４（Ｃａ２＋に配位結合するカルボキシレート基）にとって重要であることが同定された。したがって、好ましくはこれらの位置は、親酵素において変異すべきでない。
【００４２】
親キシログルカナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体、又はキシログルカナーゼ活性を有するそのフラグメントを含むのが好ましい。一態様において、親キシログルカナーゼは配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号２の成熟したポリペプチドを含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体、又はキシログルカナーゼ活性を有するそのフラグメントから成る。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号５のアミノ酸配列、若しくはその対立遺伝子変異体、又はキシログルカナーゼ活性を有するそのフラグメントを含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号７のアミノ酸配列、若しくはその対立遺伝子変異体、又はキシログルカナーゼ活性を有するそのフラグメントを含む。
【００４３】
配列番号３の成熟したポリペプチドのフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端からから欠失されているが、なおキシログルカナーゼ活性を有する１つ以上（いくつか）のアミノ酸を有するポリペプチドである。
【００４４】
第２の態様において、親キシログルカナーゼは、ストリンジェンシーが非常に低い条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中度のストリンジェンシー条件で、より好ましくは中の上のストリンジェンシー条件で、更により好ましくは高いストリンジェンシー条件で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件で、（ｉ）配列番号１、配列番号、又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のサブシーケンス、又は（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の完全長の相補鎖、とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。サブシーケンスは、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドのフラグメントをコードしてもよい。一態様において、相補鎖は、配列番号１若しくは配列番号４又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列の完全長の相補鎖である。
【００４５】
配列番号１、配列番号、４又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列のサブシーケンス、又はその相同体は、１つ以上（いくつか）のヌクレオチドが５’末端／又は３’末端から欠失されており、サブシーケンスによってコードされるポリペプチドがキシログルカナーゼ活性を有するヌクレオチド配列である。
【００４６】
親酵素はまた、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体であってもよい。
【００４７】
異なる属又は種の株から、当該技術分野において周知の方法によって、親キシログルカナーゼをコードするＤＮＡを同定及びクローンするために、配列番号１、配列番号４、又は配列番号６のヌクレオチド、あるいはそのサブシーケンス、並びに配列番号３、配列番号５、又は配列番号７のアミノ酸配列又はそのフラグメントを、核酸プローブの設計に使用することが可能である。特に、かかるプローブは、所望の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡをハイブリダイズするために使用可能であり、その中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、続いて通常のサザンブロット法の手順が行なわれる。かかるプローブは全配列より大幅に短くてよいが、少なくとも１４、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、及び最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドの長さでなければならない。しかしながら、核酸プローブの長さが少なくとも１００ヌクレオチドであるのが好ましい。例えば、核酸プローブの長さは、少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであってもよい。さらに長いプローブ、例えば、長さが好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも９００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１１００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１２００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１３００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１４００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも少なくとも１５００ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも１６００ヌクレオチドである核酸プローブを使用してもよい。ＤＮＡとＲＮＡの両方を使用することができる。プローブは、対応する遺伝子（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、又はアビジンを有する）を検出するために、通常標識化される。かかるプローブは本発明に包含される。
【００４８】
他の生物から得られゲノムＤＮＡライブラリーは、上記のプローブでハイブリダイズする、及び親キシログルカナーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。かかるその他の生物からのゲノム又はその他のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミド電気泳動、あるいはその他の分離技術によって分離され得る。ライブラリからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又はその他の好適な担体物質上に移動及び不動化されてもよい。配列番号１又はそのサブシーケンスと相同のクローン又はＤＮＡを同定するために、サザンブロット法において担体物質を用いる。本発明の目的上、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、低〜非常に高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１に示されるポリヌクレオチド、その相補鎖、又はそのサブシーケンスに対応する、標識化されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることを表す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルム又は当該技術分野において既知であるその他の検出手段を用いて検出され得る。
【００４９】
一態様において、核酸プローブは、配列番号１の成熟したポリペプチドコード配列である。別の態様において、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３である。別の態様において、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチド、又はそのサブシーケンスをコードするポリヌクレオチド配列である。別の態様において、核酸プローブは、配列番号１である。
【００５０】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブでは、ストリンジェンシーが非常に低い条件から非常に高い条件は、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍＬの断片化変性サケ精子ＤＮＡ、及び厳密性が非常に低い場合と低い場合には２５％のホルムアミド、ストリンジェンシーが中度である場合と中の上である場合には３５％のホルムアミド、ストリンジェンシーが高い場合と非常に高い場合には５０％のホルムアミド中、４２℃でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行った後に、標準的なサザンブロッティング手順を１２〜２４時間、最適に行うものとして定義する。
【００５１】
長さ少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブについて、担体物質は最終的に、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェント条件）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェント条件）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェント条件）、より好ましくは少なくとも６０℃（中〜高ストリンジェント条件）、更により好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェント条件）、最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェント条件）で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて各々１５分間、３回洗浄される。
【００５２】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブでは、ストリンジェンシー条件は、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１Ｘデンハルト溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸一ナトリウム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び１ｍＬ当たり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中、Ｂｏｌｔｏｎ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ４８：１３９０）に従う計算を用いて計算されるＴｍよりも約５℃〜約１０℃低い温度におけるプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄ポストハイブリダイゼーションを行った後に、標準的なサザンブロッティング手順を１２〜２４時間、最適に行うものとして定義する。
【００５３】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブについて、担体物質を６Ｘ ＳＣＣ、０．１％ＳＤＳで１５分間一度洗い、計算されたＴｍよりも約５℃〜約１０℃低い温度でそれぞれ１５分間２回洗う。
【００５４】
第３の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号１の成熟したポリペプチドコード配列との同一性の度合が、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び更に最も好ましくは９６％、９７％、９８％、又は９９％である、活性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。一態様において、成熟したポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３である。
【００５５】
親キシログルカナーゼは、あらゆる属の微生物から得ることができる。一態様において、親キシログルカナーゼは細胞外に分泌される。
【００５６】
更なる態様において、親キシログルカナーゼは細菌キシログルカナーゼであってもよい。例えば、キシログルカナーゼは、好ましくはペニバチルス属、特にパエニバチルス・ポリミクサ、例えば、パエニバチルス・ポリミクサ、ＡＴＣＣ ８３２からの種からの、好ましくはバチルス／ラクトバチルス細分からのバチルス等のグラム陽性細菌ポリペプチドであってもよく、好ましくはキシログルカナーゼは、例えばＷＯ ０１／６２９０３に記載のファミリー４４のキシログルカン、より好ましくは配列番号５のキシログルカナーゼ、最も好ましくは配列番号２のキシログルカナーゼ、又はその成熟したポリペプチドである。
【００５７】
変異体の生成
親キシログルカナーゼの変異体は、ランダムな及び／又は部位特異的な突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム変異導入法、シャッフル等などの、当該技術分野において既知である任意の突然変異誘発手段に従って調製することができる。
【００５８】
合成遺伝子構築は、目的のポリペプチド分子をコードする設計されたポリヌクレオチド分子の体外合成を必要とする。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ，ｅｔ．ａｌ．，（Ｔｉａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０〜１０５４）に記載されるマルチプレックスなマイクロチップに基づく技術及び同様の技術などの、多くの技術を利用して実施することができ、オリゴヌクレオチドは、フォトプログラム可能なマイクロ流体チップ上で合成され、かつアセンブルされる。
【００５９】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、及び／若しくは部位特異的な突然変異誘発、並びに／又はランダム変異導入法、及び／あるいはシャッフルの側面を組合せることによって達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされた、合成されるポリヌクレオチドのフラグメントを利用する工程によって典型的に象徴される。こうして、遺伝子の規定領域を新たに合成することができる一方で、その他の領域は、部位特異的な突然変異誘発プライマーを用いて増幅されることができ、また、更に他の領域には、変異性のＰＣＲ又は非変異性のＰＣＲ増幅を施すことができる。次に、ポリヌクレオチドのフラグメントはシャッフルされてもよい。
【００６０】
部位特異的な突然変異誘発は、親キシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチド分子の規定部位において１つ又はいくつかの突然変異が作られる技術である。この技術は、生体外又は生体内で行われ得る。
【００６１】
部位特異的な突然変異誘発は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによって、生体外で達成され得る。部位特異的な突然変異誘発はまた、親キシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドの部位の制限酵素による切断、及びそれに続く、ポリヌクレオチド中の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーション、を伴うカセット式変異誘発によって、生体外で実施され得る。通常、このプラスミド及びオリゴヌクレオチドで消化する制限酵素は同じであり、プラスミドの付着末端及び互いをライゲートするためのインサートを可能にする。好適な技術の更なる説明に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄｓ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ」．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９０），及びＷＯ９６／３４９４６；Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９〜４９５５；並びにＢａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：７３４９〜４９６６を参照する。
【００６２】
リガーゼ反応の後、ライゲーション混合物を使用して宿主細胞を形質転換してもよく、クローニングの目的では、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．に記載のように、多くの場合は大腸菌細胞が使用される。形質転換された大腸菌細胞を液体媒体中又は固体寒天平板上で増殖させることができ、形質転換された細胞からプラスミドをレスキューして、枯草菌細胞を形質転換ために用いることができる。ＭＢ１５１０、１６８誘導体（例えば、ＢＧＳＣから受入番号１Ａ１ １６８ ｔｒｐＣ２で入手可能）などの好適な形質転換受容性のあるバチルス細胞を、ＷＯ ０３／０９５６５８に記載の通りに形質転換することができる。ライブラリー構築用の大腸菌プラスミド由来の組込みカセットを、バチルス形質転換に使用してもよい。この方法は、ＷＯ ０３／０９５６５８に詳細に説明がなされている。あるいは、生体外で増幅されたＰＣＲ−ＳＯＥ生成物（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７，１０５６）を使用してもよい。
【００６３】
部位特異的な突然変異誘発は、当該技術分野において既知の方法によって生体内で達成され得る。例えば、米国特許出願第２００４／０１７１１５４合；Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：７７３〜７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５〜２９０；ａｎｄ Ｃａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５〜１６を参照のこと。
【００６４】
本発明では、任意の部位特異的な突然変異誘発手段を用いることができる。親キシログルカナーゼの変異体を調製するために使用することができる多くの市販のキットが入手可能である。
【００６５】
単一又は多重アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入は、突然変異誘発、組み換え、及び／又はシャッフルのための既知の方法、その後の、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３〜５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２〜２１５６；ＷＯ ９５／１７４１３；又はＷＯ ９５／２２６２５に開示されているもののような関連スクリーニング手順、を用いて実施及び試験されることがでる。使用可能なその他の方法には、変異性ＰＣＲ、ファージ提示法（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２〜１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ ９２／０６２０４）及び領域直接的突然変異（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，遺伝子４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ７：１２７）が挙げられる。
【００６６】
上述の突然変異誘発／シャッフル方法は、ハイスループットの自動スクリーニング方法と組み合わされて、上述のように宿主細胞、例えばバチルスによって発現されるクローン化された突然変異ポリペプチドの活性を検出することができる。キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする突然変異したＤＮＡ分子を宿主細胞から回収して当該技術分野で標準の方法を用いて迅速にシーケンスすることが可能である。
【００６７】
変異体
本発明において、親キシログルカナーゼの単離された変異体は、位置番号６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５、３６６、１、３７４、７、１４０、８、１４、２１、２１１、３７、４５、１３、７８、８７、４３６、１０１、１０４、１１１、３０６、１１７、１１９、４１４、１３９、２６８、１４２、１５９、１６４、１０２、１６８、１７６、１８０、４８２、１８３、２０２、２０６、２１７、４、２２２、１９、２２４、２２８、２３２、２、２４０、２４４、５、２４７、２４９、３２８、２５２、２５９、４０６、２６７、２６９、２７５、１７９、１６６、２７８、２８１、２８８、２９８、３０１、１８、３０２、１６５、８０、３０３、３１６、１６９、３２２、１２０、１４６、３４２、３４８、１４７、３５３、３８０、４６８、３８２、３８３、３８、３８４、３８９、３９１、１０、３９２、３９６、１７７、３９７、３９９、４０９、２３７、４１３、２５３、４１５、４１８、４０、４４３、４４５、１４８、４４９、２２５、４５０、４５４、３、４５５、４５６、２９９、４６１、４７０、２０４、４７６、４８８、３４７、及び５０７からなる群から選択される１つ以上（いくつか）における改変を含み、ここで、キシログルカナーゼ活性を有する変異体は、親キシログルカナーゼのアミノ酸配列との同一性の度合が少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも約９７％、最も好ましくは少なくとも９８％、及び更により好ましくは９９％であるアミノ酸配列を含む。位置の番号付けは、配列番号３のアミノ酸配列に関連している。好ましくは、上記で特定した位置の１つ以上における改変を含む変異体は、親キシログルカナーゼと比べて、洗剤、好ましくは液体洗剤中での増加した安定性を有する。
【００６８】
好ましい実施形態において、変異体は、改変の次の組合せの１つ以上（いくつか）のを含む。
Ｖ１＊＋Ｖ２＊＋Ｈ３＊；
Ｖ１Ｑ＋＊１ａＥ＋＊１ｂＶ；
Ｈ３Ａ；
Ｈ３Ａ＋Ｈ４３６Ａ；
Ｋ８Ａ，Ｑ，Ｓ；
Ｔ９Ｄ；
Ｔ９Ｄ＋Ｌ３４Ｆ＋Ａ８３Ｅ＋Ｑ１４９Ｅ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｓ３３２Ｐ＋Ｒ３４０Ｔ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｙ７３Ｆ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ＋Ｅ４８９Ａ＋Ａ４９０Ｖ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｔ３２０Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１５３Ｋ＋Ｒ１５６Ｑ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｄ４２０Ｇ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｑ＋Ｖ１５９Ａ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｙ５３Ｈ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｔ１７２Ｖ＋Ａ１７７Ｔ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｋ１３Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１３Ａ＋Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１３Ａ，Ｒ；
Ｋ１８Ｒ；
Ｒ２０Ａ；
Ｋ２１Ｑ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ２１Ｑ，Ｒ，Ｔ；
Ｑ３２Ｈ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｒ４９Ｇ＋Ｄ６５Ｅ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｋ２０２Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ；
Ｄ３３Ｖ＋Ｑ６８Ｈ＋Ｎ１６８Ｈ＋Ｖ４５０Ｉ；
Ｌ３４Ｆ，Ｉ，Ｍ，Ｖ；
Ｌ３４Ｉ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｄ３７Ｇ，Ｎ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｅ３８Ｉ，Ｖ；
Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１５３Ｋ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｅ４８９Ａ＋Ａ４９０Ｖ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｍ４０Ｖ；
Ｌ４５Ｉ；
Ｑ６８Ｈ，Ｍ，Ｎ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｓ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２７４Ｄ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１２９Ａ，Ｔ＋Ｒ１５６Ｋ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｓ７６Ｗ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｓ，Ｖ，Ｙ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｎ＋Ｄ９７Ｎ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｓ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２７４Ｄ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｅ４４６Ｋ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｎ３３１Ｈ，Ｋ，Ｑ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１４０Ｆ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｄ３２４Ｎ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｌ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ，Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｓ１２３Ｐ，Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｓ４８４Ｃ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｓ７６Ｅ，Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ｗ；
Ｓ７６Ｗ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｓ７６Ｗ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｇ７８Ａ，Ｎ，Ｓ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｌ８０Ｖ；
Ａ８３Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｙ；
Ｋ８７Ｑ；
Ｋ８７Ｖ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｔ９２Ｉ，Ｖ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１０１Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１０１Ｒ；
Ｋ１０１Ｒ＋Ｌ１０２Ｉ；
Ｔ１０４Ａ＋Ｐ１１１Ｑ＋Ａ１１７Ｓ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｐ１１１Ｑ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｆ１４６Ｌ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ＋Ｎ３９９Ｉ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１１８Ａ，Ｒ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｄ１１９Ｌ；
Ｇ１２０Ａ；
Ｓ１２３Ｐ，Ｔ；
Ｓ１２３Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ，Ｆ，Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｓ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１７６Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ２７５Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ４４５Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｖ１３９Ｋ＋Ｎ１４０Ｆ＋Ｑ１４７Ｓ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ１７７Ｔ＋Ｖ１７９Ｉ＋Ａ１８３Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ３２８Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ２４７Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ２４９Ｇ，Ｎ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３０３Ｉ，Ｋ，Ｓ，Ｖ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３２４Ｎ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３６６Ｈ＋Ｔ３７４Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ４６１Ｎ，Ｑ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｅ２８８Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２０４Ｔ＋Ｒ２１１Ｋ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１６４Ｎ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ４３６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｉ１０Ｖ＋Ｖ１４Ｉ＋Ｄ１９Ｅ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｖ２３２Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１７６Ｐ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ２７５Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ３２２Ｉ＋Ｋ４５４Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４０６Ｎ＋Ｎ４１５Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４５４Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｌ３８０Ｆ＋Ｎ３８３Ｙ＋Ｄ３８４Ｇ＋Ｎ３８９Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ２９８Ｆ＋Ｅ２９９Ｎ＋Ｇ３０１Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３０２Ｋ＋Ｄ３０３Ｌ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｐ５０７Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｒ２６７Ｈ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｒ４０９Ｌ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｓ４４３Ｄ＋Ｋ４４５Ｓ＋Ｌ４４９Ｉ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｓ４５５Ｎ＋Ｍ４５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｔ２４４Ｄ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｖ１５９Ｍ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｆ１６５Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｖ２５９Ｉ＋Ｒ２６７Ｋ＋Ｌ２６８Ｋ＋Ｓ２６９Ａ；
Ｑ１３７Ｄ，Ｅ；
Ｎ１４０Ｆ；
Ｋ１４２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｆ１４６Ｃ＋Ｈ１６４Ｃ；
Ｆ１４６Ｋ，Ｌ；
Ｆ１４６Ｌ＋Ｋ３２２Ｉ；
Ｌ１４８Ｋ＋Ｎ１６８Ｄ；
Ｑ１４９Ｅ；
Ｒ１５６Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｖ１５９Ｍ；
Ｈ１６４Ａ，Ｎ；
Ｌ１６６Ｉ；
Ｎ１６８Ｄ；
Ｋ１６９Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ１７６Ｐ；
Ａ１７７Ｅ，Ｔ；
Ｋ１８０Ｒ；
Ｈ１９３Ａ，Ｄ，Ｓ，Ｔ；
Ｒ１９７Ａ，Ｌ；
Ｈ１９９Ａ；
Ｇ２００Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｋ２０２Ｎ，Ｑ，Ｒ；
Ｓ２１４Ｅ；
Ｋ２１７Ａ；
Ａ２２１Ｋ；
Ｇ２２５Ｓ；
Ｖ２３２Ａ；
Ｇ２３７Ａ，Ｓ，Ｖ；
Ｋ２４０Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ２５２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｇ２５３Ａ；
Ｒ２６７Ａ；
Ｌ２６８Ｉ；
Ｋ２７５Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｌ２７８Ｉ；
Ｆ２８１Ｌ；
Ｍ２９０Ｒ；
Ｒ２９５Ａ；
Ｋ３０６Ａ，Ｒ；
Ｋ３０７Ｑ；
Ｍ３１０Ｉ，Ｌ，Ｖ；
Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３９９Ｉ；
Ｒ３１４Ａ；
Ｇ３１６Ｉ；
Ｋ３２２Ａ，Ｒ；
Ｄ３２４Ｎ；
Ｎ３３１Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｓ３３２Ｍ，Ｐ；
Ｓ３３２Ｐ＋Ｖ３９７Ｉ；
Ｒ３４０Ａ，Ｎ，Ｔ；
Ｋ３４２Ａ；
Ｖ３４５Ｉ；
Ｋ３４７Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｄ３４８Ｇ；
Ｋ３５３Ｑ，Ｒ；
Ｄ３６６Ｈ；
Ｍ３７３Ｑ；
Ｔ３７４Ａ；
Ｌ３８０Ｆ；
Ｋ３８２Ａ；
Ｎ３８３Ｙ；
Ｎ３８９Ａ，Ｆ，Ｎ，Ｖ；
Ｗ３９１Ｖ；
Ｋ３９２Ｇ，Ｑ；
Ｄ３９５Ｇ；
Ｇ３９６Ｐ；
Ｖ３９７Ｓ；
Ｎ３９９Ｉ；
Ｋ４０６Ｎ；
Ｇ４１３Ａ，Ｓ；
Ｋ４１４Ａ；
Ｎ４１５Ｓ；
Ｔ４１７Ｋ；
Ｆ４１８Ｉ；
Ｖ４３１Ｅ；
Ｈ４３６Ａ；
Ｎ４４１Ｇ＋Ａ４４２Ｅ＋Ｓ４４３Ｄ；
Ｓ４４３Ｅ，Ｋ，Ｑ；
Ｋ４４５Ａ，Ｒ，Ｓ；
Ｋ４４５Ｃ＋Ｋ４７０Ｃ；
Ｈ４４８Ａ；
Ｋ４５４Ｒ；
Ｓ４６７Ｒ＋Ｇ４６８Ｓ＋Ａ４６９Ｔ；
Ｇ４６８Ｓ，Ｙ；
Ｋ４７０Ｐ，Ｒ，Ｔ；
Ｉ４７３Ｔ；
Ｋ４７６Ｑ；
Ｋ４８２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ４８８Ａ，Ｑ，Ｒ，Ｔ；
Ａ４９０Ｒ；
Ｇ４９８Ａ，Ｄ，Ｓ；
Ｒ５００Ａ，Ｔ，Ｖ；
Ｈ５１２Ａ；
Ｔ５１７Ａ＋Ｇ５１８Ｄ；又は
Ｇ５１８Ｄ。
【００６９】
一態様において、本発明の変異体のアミノ酸改変の数は、好ましくは総数で５５、好ましくは５２、より好ましくは５０、より好ましくは４０、より好ましくは３０、より好ましくは２０、より好ましくは１５、より好ましくは１０、より好ましくは９、より好ましくは８、更により好ましくは７、更により好ましくは６、更により好ましくは５、更により好ましくは４、更により好ましくは３、及び最も好ましくは２つの改変、及び最も好ましくは１つの改変を含む。別の態様において、改変の総数は１、好ましくは２、より好ましくは３、更により好ましくは４、更により好ましくは５、更により好ましくは６、更により好ましくは７、更により好ましくは８、更により好ましくは９、最も好ましくは１０である。改変は、ｉ）この位置を占めるアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、ｉｉ）この位置を占めるアミノ酸の欠失、又はｉｉｉ）この位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸での置換、の形態であり得る。改変は互いに独立して行われてもよく、例えば、親キシログルカナーゼと比較した場合に、第１の位置では挿入が存在してもよく、第２の位置では置換が存在し、第３の位置では欠失が存在する。好ましい実施形態において、変異体は置換のみを含む。
【００７０】
本発明の一態様において、変異を起こすべき位置はコンセンサス配列分析に基づいて特定される。分析は、配列番号３を、配列番号５及び配列番号７、並びに、配列番号３のファミリー４４グリコシドヒドロラーゼ領域と３０％同一であるＵｎｉＰｒｏｔデータベースからのその他の配列とアラインメントすることによって実施される。得られたコンセンサス配列が図１に示されている。コンセンサス配列１はアラインメントからの所定の位置に最も豊富なアミノ酸を含む配列であり、コンセンサス配列２は所定の位置に２番目に豊富なアミノ酸を含む配列であり、以下同様である。本発明の一態様において、配列番号３の１つ以上（いくつか）の残基は、コンセンサス配列１若しくはコンセンサス配列２又はコンセンサス配列３あるいはコンセンサス配列４からの対応する残基によって置換される。本発明の一態様において、変異体は、位置番号１０、１９、６８、８０、８９、１０４、１１１、１１７、１２３、１２９、１３７、１３９、１４０、１４７、１５６、１５９、１６４、１６５、１７７、１７９、１８３、２００、２０４、２１１、２２２、２２４、２２５、２２８、２３２、２５９、２６７、２６８、２６９、２８１、３２８、３４５、３６６、３７４、３８０、３８３、３８４、４０６、４１５、４３６、４４３、４４５、４４９、４５０、４５５、４５６、４８８及び５０７からなるコンセンサス配列分析によって特定された５２の位置の群から選択される１つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。好ましい実施形態において、改変は、Ｉ１０Ｖ、Ｄ１９Ｅ、Ｑ６８Ｈ、Ｌ８０Ｖ、Ｇ８９Ａ、Ｔ１０４Ａ、Ｐ１１１Ｑ、Ａ１１７Ｓ、Ｓ１２３Ｐ、Ｋ１２９Ｔ、Ｑ１３７Ｅ、Ｖ１３９Ｋ、Ｎ１４０Ｆ、Ｑ１４７Ｓ、Ｒ１５６Ｙ、Ｖ１５９Ｍ、Ｈ１６４Ｎ、Ｆ１６５Ｙ、Ａ１７７Ｔ、Ｖ１７９Ｉ、Ａ１８３Ｓ、Ｇ２００Ｐ、Ｇ２０４Ｔ、Ｒ２１１Ｋ、Ｉ２２２Ｖ、Ａ２２４Ｐ、Ｇ２２５Ｓ、Ｖ２２８Ｉ、Ｖ２３２Ａ、Ｖ２５９Ｉ、Ｒ２６７Ｋ、Ｌ２６８Ｋ、Ｓ２６９Ａ、Ｆ２８１Ｌ、Ａ３２８Ｇ、Ｖ３４５Ｉ、Ｄ３６６Ｈ、Ｔ３７４Ａ、Ｌ３８０Ｆ、Ｎ３８３Ｙ、Ｄ３８４Ｇ、Ｋ４０６Ｎ、Ｎ４１５Ｇ、Ｈ４３６Ｙ、Ｓ４４３Ｄ、Ｋ４４５Ｓ、Ｌ４４９Ｉ、Ｖ４５０Ｉ、Ｓ４５５Ｎ、Ｍ４５６Ｙ、Ｋ４８８Ｔ及びＰ５０７Ａからなる群から選択される置換、又はいくつかの置換である。
【００７１】
本発明の別の態様において、変異体は、正電荷を有し、かつ２０オングストロームのカルシウムイオン内に位置する親のペプチドのミノ酸を、中性又は負に荷電されるアミノ酸に変更することによって生成される。本発明の好ましい変異体は、カルシウムイオンからの２０オングストローム以内の総電荷がより負にされている変異体を包含する。そのような変異体においては、正に荷電されたアミノ酸は、その適用条件下で中性又は負に荷電されるアミノ酸で置換されている。従って、好ましい変異体は、「化学安定性」条件又は適用条件下で部分的に又は十分に正に荷電されるアミノ酸残基、即ち負又は中性のアミノ酸で置換されたＬｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓを有していてもよい。好ましい置換アミノ酸は、Ａｓｐ及びＧｌｕのように負に荷電されているアミノ酸、又はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅのように中性のアミノ酸であり得る。本発明の好ましい変異体は、位置番号４９、８７、１１８、１２９、１３４、１４２、１５６、１６９及び１９７からなる群から選択される１つ以上の位置の改変を含む。好ましい実施形態において、改変は、位置番号８７、１１８、１２９、１３４、１４２、１５６、及び１６９からなる群から選択される１つ以上の位置における置換である。好ましい実施形態において、置換は、Ｋ８７Ａ；Ｋ１２９Ａ，Ｓ，Ｆ，Ｉ；Ｋ１１８Ａ；Ｋ１４２Ａ，Ｑ、Ｒ１５６Ｙ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｗ，Ｌ，Ｍ及びＫ１６９Ｑ，Ａからなる群から選択される。
【００７２】
一態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、７６、又は３３１に対応する１つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。好ましくは、変異体は、位置６８の置換と、位置番号１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５及び３６６からなる群から選択される１つ以上の追加位置の１つ以上の置換とを含む。
【００７３】
別の態様において、変異体は、位置１５６の置換と、位置番号１０、１３、１４、１９、３７、６８、７８、９２、１１８、１２３、１２９、１３７、１３９、１４０、１４７、１５９、１６４、１６５、１６９、１７６、１７７、１７９、１８３、２００、２０４、２１１、２２２、２２４、２４４、２４７、２４９、２５９、２６７、２６８、２６９、２７５、２８８、２９９、３０１、３０２、３０３、３１０、３２４、３２８、３３１、３６６、３８０、３８３、３８４、３８９、４０６、４０９、４１５、４３６、４４３、４４５、４４９、４５０、４５４、４５５、４５６、４６１、４７０及び５０７からなる群から選択される１つ以上の追加位置の１つ以上の置換とを含む。
【００７４】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、７６、又は３３１に対応する２つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。好ましくは、変異体は、位置６８、１２３、１５６、１１８、２００、又は１２９の置換を含む。更により好ましくは、変異体は、位置１２９及び位置１５６の置換を含む。
【００７５】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する３つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００７６】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する４つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００７７】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する５つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００７８】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する６つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００７９】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する７つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００８０】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置１２９及び１５６及び３３１及び２００及び１１８に対応する位置の改変を含む。
【００８１】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８及び１２９及び１５６及び３３１及び２００及び１１８に対応する位置の改変を含む。
【００８２】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、６８及び９２及び１２９及び１５６及び３３１及び２００及び１１８に対応する位置の改変を含む。
【００８３】
別の態様において、変異体は、Ｑ６８Ｈ，Ｎ，Ｌ；Ｓ１２３Ｐ，Ｔ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｗ，Ｌ，Ｍ；Ｋ１１８Ａ，Ｒ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ，Ｓ，Ｄ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ，Ｓ；Ｑ１３７Ｅ；Ｈ１９３Ｔ，Ｓ，Ｄ；Ｔ９２Ｖ，Ｉ，Ａ，Ｓ；Ａ８３Ｅ；Ｑ１４９Ｅ；Ｌ３４Ｆ，Ｉ，Ｖ；Ｒ３４０Ｔ，Ｎ；Ｓ３３２Ｐ；Ｔ９Ｄ；Ｓ７６Ｗ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｔ；Ｎ３３１Ｆ，Ｃ；Ｍ３１０Ｉ，Ｖ，Ｌ；Ｄ３２４Ｎ；Ｇ４９８Ａ，Ｄ；Ｄ３９５Ｇ及びＤ３６６Ｈからなる群から選択される１つ以上（いくつか）の置換を含む。好ましくは、置換は、Ｑ６８Ｈ；Ｓ１２３Ｐ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；Ｋ１１８Ａ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ；Ｑ１３７Ｅ；Ｈ１９３Ｔ；Ｔ９２Ｖ及びＮ３３１Ｆからなる群から選択される。より好ましくは、置換は、Ｑ６８Ｈ；Ｓ１２３Ｐ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；Ｋ１１８Ａ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ；Ｑ１３７Ｅ；Ｔ９２Ｖ及びＮ３３１Ｆからなる群から選択される。より好ましくは、変異体は、９若しくは８、７、６、５、４、３、２、又は１つの位置の置換を含有し、ここで置換は、Ｑ６８Ｈ；Ｓ１２３Ｐ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；Ｋ１１８Ａ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ；Ｑ１３７Ｅ；Ｔ９２Ｖ及びＮ３３１Ｆからなる群から選択される。
【００８４】
更なる態様において、変異体は、以下の置換の組合せの１つ以上（いくつか）を含む。
Ｑ６８Ｈ
Ｓ１２３Ｐ
Ｒ１５６Ｙ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｓ１２３Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１２９Ｔ＋Ｒ１５６Ｋ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｓ１２３Ｐ，Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
【００８５】
好ましい実施形態において、上記変異体の全ては、グルコシル加水分解酵素のファミリー４４に属する親キシログルカナーゼの変異体であり、より好ましくは、親キシログルカナーゼは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一性を有するキシログルカナーゼから選択される、より好ましくは、親キシログルカナーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群から選択され、最も好ましくは、親キシログルカナーゼは配列番号３から成る。
【００８６】
組成物
本発明はまた、本発明の変異体キシログルカナーゼ、又はキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物に関する。組成物はかかる変異体又はポリペプチドに濃縮される。用語「濃縮」とは、組成物のキシログルカナーゼ活性が増加して濃縮係数が１．１以上になることを指す。好ましくは、組成物は、薄い色、少ない臭気、及び許容可能な貯蔵安定性などの望ましい特徴を提供するために製剤化される。
【００８７】
組成物は、本発明の変異体又はポリペプチドを主要酵素成分、例えば、１成分組成物として含むことができる。あるいは、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペロキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼ、などの複数の酵素活性を含むことができる。
【００８８】
ポリペプチド組成物は当該技術分野において既知の方法にしたがって調製することが可能であり、液体又は乾燥製剤の形態であってもよい。例えば、ポリペプチドは粒子又は微粒子の形態で製剤化されてもよい。組成物に含まれる変異体又はポリペプチドは、当該技術分野において既知の方法に従って安定させる。好ましい実施形態において、変異体キシログルカナーゼは液体組成物中で製剤される。
【００８９】
使用
本発明はまた、キシログルカナーゼ変異体の使用方法を目的とする。
【００９０】
変異体キシログルカナーゼは、好ましくは、洗剤組成物、例えば洗濯洗剤組成物、例えば家庭用洗濯洗剤組成物、特に液体洗濯洗剤組成物に組み込まれる及び／又はこれらと共に使用される。洗剤組成物は、典型的には、界面活性剤（アニオン性、カチオン性、非イオン性、双性イオン性、両性）、ビルダー、漂白剤、ポリマー、その他の酵素、及びその他の成分、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１３０５６２及びＷＯ２００７／１４９８０６に記載されているようなものなどの、従来の洗剤成分を含む。
【００９１】
洗剤組成物は、固体、液体、ゲル、又はこれらの任意の組合せなどの任意の形態であることができ、好ましくは、組成物は液状であり、好ましくは液体洗濯洗剤組成物である。
【００９２】
本発明の一態様は、布地又は衣類に、毛羽立ち除去及び／若しくは布地の柔軟性並びに／又は色彩澄明化及び／あるいは汚れの除去及び／又汚れの再付着防止及び／又は染料移行防止効果を付与するために、本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物を洗剤組成物と共に使用することである。
【００９３】
更に、本発明は、洗剤組成物と、本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物とを含有する洗浄液で布地を処理することを含む、布地の洗濯方法に関する。洗濯処理は、例えば、機械洗濯方法又は手作業での洗濯方法で行われ得る。洗浄液は、例えば、洗剤組成物を含有し、かつｐＨが３〜１２である水性洗浄液であり得る。
【００９４】
洗浄及び使用中、布地又は衣類の表面は従来、色あせた及び擦り切れた外観を布地に与える可能性のあるちぎれた又はほどけた繊維片で汚れる。これら表面の繊維を布地から除去することにより、布地の元の色及び見た目を部分的に復元して、色彩澄明化及び改良された外観をもたらす。本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物は、１回の又は複数の（繰り返し行われる）洗浄サイクルで用いることによって、色彩澄明化及び／又は改良された外観を提供するために使用され得る。
【００９５】
更に、織物の表面から突き出る微小繊維は、寄り集まって、表面にくっついて布地の外観に支障を来たす、いわゆる毛玉又は毛羽と呼ばれる小さな球状になり得る。本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物は、かかる毛玉を除去するために使用することができ、毛羽立ち除去と呼ばれる効果がある。
【００９６】
色彩澄明化及び毛羽立ち除去は、テストグループのパネルを用いて目視検査によって評価される。効果は、光反射によって、又は光学的測定を用いた綿の毛羽の測定によって、測定される。これらの方法は、一般に当該技術分野において既知であり、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒにより発行されたＥｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｃｙ，１９９７，ｐａｇｅ １３９〜ｐａｇｅ １４０に簡潔に説明されている。
【００９７】
特に洗浄サイクルの回数が増加すると、粒子状の汚れ、可溶性の汚れ、染料及び顔料、並びに不溶性塩類を含むことができる堆積物が、織物の繊維表面上に蓄積する。これは、例えば布地の灰色がかった又は黄色がかった外観の原因となる、洗浄処理の知覚されるクリーニング性能の目に見える劣化をもたらす可能性がある。これは、本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物を洗浄サイクルにおいて用いることによって防止することができる。この効果は、抗再付着、若しくは染料移行防止、又は汚れ除去と呼ばれ、光学的測定によって評価することができる。
【００９８】
布地の表面上、及び繊維の間に捕捉された汚れ粒子又は不溶性塩類粒子は、布地の硬化の原因となり得る。洗浄サイクルに本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物を含ませることにより、布地を柔らかくすることができる。
【００９９】
本発明の方法が施される布地は、従来の洗濯可能な洗濯物、例えば家庭の洗濯物であってもよい。好ましくは、洗濯物の大部分は衣類及び布地であり、綿、綿との混紡、又は天然若しくは人造セルロース（例えば木材パルプ起源）あるいはこれらのブレンドから製造されるニット、織布、デニム、紡ぎ糸、及びタオルを含む。ブレンドの例は、綿又はレーヨン／ビスコースと、１種類以上のコンパニオン材料、例えば、ウール、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ウレタン系繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）、及びセルロース含有繊維（例えばレーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻／亜麻布、黄麻、セルロースアセテート繊維、リオセル）とのブレンドである。
【０１００】
本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物を含有する洗剤溶液で布地及び／又は衣類を処理すると、例えば、新しい繊維及び／若しくは布地並びに／又は衣類の製造に関連して、及び使い古した布地及び／又は衣類の洗濯中、例えば、家庭での洗濯工程中に又は企業での洗濯工程において、意味があることが認識されている。
【０１０１】
本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物の用量、及び洗剤溶液の組成物及び濃度等の組成物が使用される際のその他の条件は、当該技術分野において既知の方法に基づいて決定されてもよい。
【０１０２】
キシログルカナーゼは、セルロース又はヘミセルロースの誘導体を含有する汚れの除去、抗再付着の強化、及び汚れ放出の改善をもたらすために、本発明の組成物中で使用され得る。キシログルカンはまた、後続洗濯工程中に綿に汚れ放出効果を付与するために、本発明の組成物中で使用され得る。汚れ放出効果は、綿織物、及び相当量の綿を含むあらゆる種類の布地、例えば、綿と合成繊維（例えばポリエステル、Ｎｙｌｏｎ（商標）等のポリアミド、及びエラステイン）とのブレンド、に認められる。
【０１０３】
洗濯洗剤組成物
本発明の洗濯洗剤組成物は、親キシログルカナーゼの単離変異体を含む。親キシログルカナーゼの単離変異体は、上記にてより詳細に説明がなされている。組成物は、好ましくは、特定の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーを含む。組成物は、好ましくは、洗浄性界面活性剤、好ましくは低濃度の洗浄性界面活性剤を含む。特定の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーについては、以下に詳しく記述される。洗浄性界面活性剤については、下記に詳しく記述される。組成物は、好ましくは、ランダムグラフトコポリマーを含む。好適なランダムグラフトコポリマーについては、以下に詳しく記述される。
【０１０４】
好ましくは、この組成物は、次の一般構造：ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（ＣＨ３）−Ｎ＋−ＣｘＨ２ｘ−Ｎ＋−（ＣＨ３）−ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（式中、ｎは２０〜３０であり、かつｘは３〜８である）を有する化合物、又はこの硫酸化若しくはスルホン化変異体を含む。
【０１０５】
好ましくは、組成物は、香料マイクロカプセルを含み、好ましくは、香料はメラミンホルムアルデヒドのフィルムに封入される。
【０１０６】
洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％、更には約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色相剤を含む。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色相剤を含んでもよく、これは、組成物が単位用量小袋の形態である場合に特に好ましい。
【０１０７】
この洗濯洗剤組成物は、固体、液体、ゲル、又はこれらの任意の組合せなど、任意の形態であり得る。組成物は、錠剤又は、多区画小袋などの小袋の形態であってもよい。この組成物は、自由流動性粉末の形態であってもよく、例えば、凝集体、スプレードライ粉末、カプセル、押出成形品、針状、ヌードル状、フレーク状、又はこれらの任意の組合せなどであり得る。しかしながら、最も好ましくは、この組成物は液体の形態である。加えて、この組成物は等方性又は異方性のいずれかの形態である。好ましくは、この組成物、又は少なくともその一部分は、層状相である。
【０１０８】
この組成物は、好ましくは、例えば、０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは５重量％、好ましくは〜４重量％、若しくは〜３重量％、又は〜２重量％、あるいは〜１重量％の低濃度の水を含む。これは特に、組成物が小袋の形態である場合、典型的には少なくとも部分的に、好ましくは完全に、水溶性フィルム内に封止されている場合に望ましい。水溶性フィルムは好ましくはポリビニルアルコールを含む。
【０１０９】
この組成物は、硬化ヒマシ油などの構造剤を含み得る。本発明の組成物に特に有用な、１つの好適な構造剤のタイプは、非高分子の（従来のアルコキシル化を除く）結晶性ヒドロキシ官能材質である。これらの構造剤は典型的に、液体マトリックス全体に、互いにライゲーションした糸状の分子間ネットワークを形成し、典型的にはそのマトリックス内でその場で結晶化する。好ましい構造剤は、結晶性のヒドロキシル含有脂肪酸、脂肪酸エステル、又は脂肪酸ろうである。好ましい構造剤は典型的に、次の式を有するものから選択される。
【化１】
【０１１０】
好ましい結晶性ヒドロキシル含有構造剤の具体的な例には、ヒマシ油及びその誘導体が挙げられる。特に好ましいものは、硬化ヒマシ油及び水素添加キャスター蝋などの硬化ヒマシ油誘導体である。市販のヒマシ油系結晶性ヒドロキシル含有構造剤には、Ｒｈｅｏｘ，Ｉｎｃ．（現Ｅｌｅｍｅｎｔｉｓ）製のチキシン（THIXCIN）が挙げられる。
【０１１１】
この組成物は更に、好ましくは、酸性構成成分を中和するためのアルカノールアミンを含む。好適なアルカノールアミンの例には、トリエタノールアミン及びモノエタノールアミンがある。これは、組成物がホウ酸又はその誘導体（例えば、ボロン酸）などのプロテアーゼ安定剤を含む場合に、特に好ましい。好適なボロン酸誘導体の例には、次の式のフェニルボロン酸誘導体がある。
【化２】
式中、Ｒは、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル及び置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニルからなる群から選択される。
【０１１２】
きわめて好ましいプロテアーゼ安定剤は、４−ホルミルフェニルボロン酸である。プロテアーゼ安定剤として好適な、更に好ましいボロン酸誘導体は、米国特許第４，９６３，６５５号、同第５，１５９，０６０号、国際特許第ＷＯ ９５／１２６５５号、同第ＷＯ ９５／２９２２３号、同第ＷＯ ９２／１９７０７号、同第ＷＯ ９４／０４６５３号、同第ＷＯ ９４／０４６５４号、米国特許第５，４４２，１００号、同第５，４８８，１５７号、及び同第５，４７２，６２８号に記述されている。
【０１１３】
この組成物は、可逆性ペプチドプロテアーゼ抑制剤を含んでもよい。好ましくは、可逆的ペプチドプロテアーゼ抑制剤はトリペプチド酵素抑制剤である。好適なトリペプチド酵素抑制剤の代表的な非限定例としては、
【化３】
及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１１４】
可逆的ペプチドプロテアーゼ阻害剤が、あらゆる好適な方法で製造され得る。可逆性ペプチドプロテアーゼ抑制剤の製造に好適な工程の非限定的な具体例は、米国特許第６，１６５，９６６号に見出すことができる。
【０１１５】
一実施形態では、組成物が、組成物の約０．００００１重量％〜約５重量％、具体的には約０．００００１重量％〜約３重量％、より具体的には約０．００００１重量％〜約１重量％の可逆的ペプチドプロテアーゼ阻害剤を含む。
【０１１６】
この組成物は、好ましくは溶媒を含む。この溶媒は典型的には水、又は有機溶媒、又はこれらの混合物である。好ましくはこの溶媒は水と有機溶媒の混合物である。この組成物が単位用量小袋の形態である場合は、好ましくはこの組成物は有機溶媒を含み、１０重量％未満、又は５重量％未満、又は４重量％未満、又は３重量％未満の遊離水を含み、及び無水であってもよく、典型的には、故意に加えられた遊離水を含まない。遊離水は、典型的には、カール・フィッシャー滴定を用いて測定される。２ｇの洗濯洗剤組成物を、室温で２０分間５０ｍＬの無水メタノール中に抽出し、カール・フィッシャー滴定でメタノール１ｍＬを分析する。
【０１１７】
組成物は、０重量％超過から２５重量％、０重量％超過から２０重量％、０重量％超過から１５重量％、０重量％超過から１０重量％、０重量％超過から８重量％、好ましくは０重量％超過から５重量％、最も好ましくは０重量％超過から３重量％の有機溶媒を含むことができる。好適な溶媒としてはＣ４〜Ｃ１４のエーテル及びジエーテル、グリコール、又はアルコキシル化グリコール、Ｃ６〜Ｃ１６グリコールエーテル、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化芳香族アルコール、芳香族アルコール、脂肪族分枝状アルコール、アルコキシル化脂肪族分枝状アルコール、アルコキシル化直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルコール、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルコール、アミン、Ｃ８〜Ｃ１４アルキル及びシクロアルキル炭化水素及びハロ炭化水素、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【０１１８】
好ましい溶媒は、メトキシオクタデカノール、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、ベンジルアルコール、２−エチルブタノール及び／又は２−メチルブタノール、１−メチルプロポキシエタノール及び／又は２−メチルブトキシエタノール、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブチルジグリコールエーテル（ＢＤＧＥ）、ブチルトリグリコールエーテル、第三級アミルアルコール、グリセロール、イソプロパノールなど）、及びこれらの混合物から選択される。本明細書で使用できる特に好ましい溶媒は、ブトキシプロポキシプロパノール、ブチルジグリコールエーテル、ベンジルアルコール、ブトキシプロパノール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、メタノール、イソプロパノール、及びそれらの混合物である。他の好適な溶媒には、プロピレングリコール及びジエチレングリコール、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【０１１９】
組成物は、好ましくは、組成物の約０．１重量％〜約５重量％の、ｐＨ８で約４を超える条件安定度定数を有するカルシウム封鎖剤を含む。一実施態様において、好ましくは液状の組成物は、ｐＨ８で約４を超える条件安定度定数を有するカルシウム封鎖剤を含有してもよい。ｐＨ８で約４を超える条件安定度定数を有するカルシウム封鎖剤は、Ｃａイオンと可溶性錯体を形成することができる。一実施態様において、一実施態様において、カルシウム封鎖剤は、１−ヒドロキシエチリデン１，１ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）及びこれらの組合せから選択される。カルシウム封鎖剤及びその安定度定数の追加情報は、ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｏｍｐａｎｙ出版の「Ｋｅｙｓ ｔｏ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｖｅｒｓｅｎｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ」の表４．４，４．５、４．６、４．７．、及びＭｏｎｓａｎｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５３〜３９（Ｅ）ＭＥ−２に見出すことができる。
【０１２０】
固体洗濯洗剤組成物
本発明の一実施形態では、この組成物は固体洗濯洗剤組成物であり、好ましくは固体洗濯粉末洗剤組成物である。
【０１２１】
組成物は、好ましくは、０重量％〜１０重量％、又は更には５重量％のゼオライトビルダーを含む。組成物はまた、好ましくは、０重量％〜１０重量％、又は更には〜５重量％のリン酸ビルダーを含む。
【０１２２】
この組成物は典型的に、アニオン性洗浄界面活性剤を含み、好ましくは直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩を含み、好ましくは共界面活性剤と組合せて含まれる。好ましい共界面活性剤は、平均１〜１０、好ましくは平均１〜３のエトキシル化度を有するアルキルエトキシル化硫酸塩、及び／又は、平均１〜１０、好ましくは平均１〜３のエトキシル化度を有するエトキシル化アルコールである。
【０１２３】
この組成物は好ましくはキレート剤を含み、好ましくはこの組成物は０．３重量％〜２．０重量％のキレート剤を含む。好適なキレート剤はエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）である。
【０１２４】
この組成物は、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、スルホエチルセルロース、スルホプロピルセルロース、セルロースサルフェート、リン酸化セルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシプロピルセルロース、スルホエチルヒドロキシエチルセルロース、スルホエチルヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルメチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルメチルセルロース、スルホエチルメチルヒドロキシエチルセルロース、スルホエチルメチルセルロース、カルボキシメチルエチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、スルホエチルエチルヒドロキシエチルセルロース、スルホエチルエチルセルロース、カルボキシメチルメチルヒドロキシプロピルセルロース、スルホエチルメチルヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルドデシルセルロース、カルボキシメチルドデコイルセルロース、カルボキシメチルシアノエチルセルロース、及びスルホエチルシアノエチルセルロースのナトリウム又はカリウム塩などの、セルロースポリマーを含み得る。このセルロースは、例えば、メチル及びヒドロキシエチルセルロースなどの２つ以上の異なる置換基によって置換された、置換セルロースであり得る。
【０１２５】
この組成物は、例えばＲｅｐｅｌ−ｏ−Ｔｅｘ（商標）などの汚れ放出ポリマーを含んでもよい。他の好適な汚れ分散ポリマーは、アニオン性汚れ分散ポリマーである。好適な汚れ分散ポリマーの詳細は、国際特許第ＷＯ０５１２３８３５Ａ１号、同第ＷＯ０７０７９８５０Ａ１号及び同第ＷＯ０８１１０３１８Ａ２号に記述されている。
【０１２６】
この組成物は、スプレードライ粉末を含み得る。このスプレードライ粉末は、ケイ酸ナトリウムなどのケイ酸塩を含み得る。
【０１２７】
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー
本発明の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、布地及び表面からグリース粒子を欠失するように親水性と疎水性の特性が釣り合っている任意のアルコキシル化ポリマーを示す。本発明の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーの具体的な実施形態は、コア構造と、そのコア構造に結合した複数のアルコキシレート基と、を含む。
【０１２８】
コア構造は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）
【化４】
の繰り返し単位を縮合形態で含むポリアルキレンイミン構造（式中、＃は、各場合において、窒素原子と式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の２つの隣接する繰り返し単位のＡ１基の遊離結合部位との間の結合の半分を示し、＊は、各場合において、アルコキシレート基のうちの１つに対する結合の半分を示し、Ａ１は、直鎖又は分枝鎖のＣ２〜Ｃ６−アルキレンから独立して選択され、ポリアルキレンイミン構造は、式（Ｉ）の１繰り返し単位、式（ＩＩ）のｘ繰り返し単位、式（ＩＩＩ）のｙ繰り返し単位及び式（ＩＶ）のｙ＋１繰り返し単位からなり、ｘ及びｙは、各場合において、０〜約１５０の範囲の値を有し、ポリアルキレンイミンコア構造の平均重量平均分子量Ｍｗは、約６０〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の値である）を含んでもよい。
【０１２９】
あるいは、コア構造は、式（Ｉ．ａ）及び／又は（Ｉ．ｂ）のＮ−（ヒドロキシアルキル）アミンから選択される少なくとも１つの化合物の縮合生成物のポリアルカノールアミン構造
【化５】
（式中、Ａは、Ｃ１〜Ｃ６−アルキレンから独立して選択され、Ｒ１、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、Ｒ３＊、Ｒ４、Ｒ４＊、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールから独立して選択され、後者３つの言及されたラジカルは所望により置換されてもよく、Ｒ６は、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールから選択され、後者３つの言及されたラジカルは所望により置換されてもよい）かのいずれかを含んでもよい。
【０１３０】
コア構造に結合した複数のアルキレンオキシ基は、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位
【化６】
（式中、＊は、各場合において、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＶ）の繰り返し単位の窒素原子に対する結合の半分を示し、Ａ２は、各場合において、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン及び１，２−イソブチレンから独立して選択され、Ａ３は、１，２−プロピレンであり、Ｒは、各場合において、水素及びＣ１〜Ｃ４−アルキルから独立して選択され、ｍは０〜約２の範囲の平均値を有し、ｎは約２０〜約５０の範囲の平均値を有し、ｐは約１０〜約５０の範囲の平均値を有する）から独立して選択される。
【０１３１】
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーの特定の実施形態は、内側ポリエチレンオキシドブロックと外側ポリプロピレンオキシドブロックとを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンから選択されてもよく、エトキシル化度及びプロポキシル化度は特定の制限値を上回りも下回りもしない。本発明によるアルコキシル化ポリアルキレンイミンの特定の実施形態は、ポリエチレンブロックのポリプロピレンブロックに対する比率（ｎ／ｐ）の最小値が約０．６であり、最大値が約１．５（ｘ＋２ｙ＋１）１／２である。約０．８〜約１．２（ｘ＋２ｙ＋１）１／２のｎ／ｐ比率を有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンは、特に有益な特性を有することが判明している。
【０１３２】
本発明によるアルコキシル化ポリアルキレンイミンは第一級、第二級及び第三級アミン窒素原子からなる主鎖を有し、これらの窒素原子はアルキレンラジカルＡにより互いに結合し、ランダムに配列される。ポリアルキレンイミン主鎖の主鎖及び側鎖を開始又は終止し、その残りの水素原子が引き続いてアルキレンオキシ単位により置換される第一級アミノ部分は、それぞれ式（Ｉ）又は（ＩＶ）の繰り返し単位と呼ばれる。残りの水素原子が引き続いてアルキレンオキシ単位により置換される第二級アミノ部分は、式（ＩＩ）の繰り返し単位と呼ばれる。主鎖と側鎖に分岐する第三級アミノ部分は、式（ＩＩＩ）の繰り返し単位と呼ばれる。
【０１３３】
環化がポリアルキレンイミン主鎖の形成時に生じ得るので、環状アミノ部分が主鎖内に小程度まで存在することも可能である。環状アミノ部分を含有するこのようなポリアルキレンイミンは、無論、非環状第一級及び第二級アミノ部分からなるものと同様にアルコキシル化される。
【０１３４】
窒素原子及びＡ１基からなるポリアルキレンイミン主鎖は、約６０〜約１０，０００ｇ／モル、好ましくは約１００〜約８，０００ｇ／モル、より好ましくは約５００〜約６，０００ｇ／モルの平均分子量Ｍｗを有する。
【０１３５】
和（ｘ＋２ｙ＋１）は、１つの個々のポリアルキレンイミン主鎖内に存在するアルキレンイミン単位の総数に相当し、それゆえにポリアルキレンイミン主鎖の分子量に直接関わる。しかしながら、指定で与えられた値は、混合物中に存在する全てのポリアルキレンイミンの数平均に関わる。和（ｘ＋２ｙ＋２）は、１つの個々のポリアルキレンイミン主鎖内に存在するアミノ基の総数に相当する。
【０１３６】
アミノ窒素原子に接続するラジカルＡ１は、１，２−エチレン、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン、１，２−イソブチレン、１，２−ペンタンジイル、１，２−ヘキサンジイル又はヘキサメチレンなどの、同一又は異なる、直鎖又は分枝鎖Ｃ２〜Ｃ６−アルキレンラジカルであり得る。好ましい分枝状アルキレンは、１，２−プロピレンである。好ましい直鎖アルキレンは、エチレン及びヘキサメチレンである。より好ましいアルキレンは、１，２−エチレンである。
【０１３７】
ポリアルキレンイミン主鎖の第一級及び第二級アミノ基の水素原子は、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位により置換される。
【化７】
この式では、可変因子は、好ましくは、以下に与えられる意味のうちの１つを有する。
【０１３８】
Ａ２は、各場合において、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン及び１，２−イソブチレンから選択され、好ましくはＡ２は、１，２−プロピレンである。Ａ３は１，２−プロピレンであり、Ｒは、各場合において、水素及びＣ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルなど）から選択され、好ましくはＲは水素である。添え字ｍは、各場合において、０〜約２の値を有し、好ましくはｍは０又はおよそ１であり、より好ましくはｍは０である。添え字ｎは、約２０〜約５０の範囲、好ましくは約２２〜約４０の範囲、より好ましくは約２４〜約３０の範囲の平均値を有する。添え字ｐは、約１０〜約５０の範囲、好ましくは約１１〜約４０の範囲、より好ましくは約１２〜約３０の範囲の平均値を有する。
【０１３９】
好ましくは、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位は、アルコキシレートブロックの非ランダム配列である。非ランダム配列により、［−Ａ２−Ｏ−］ｍが１番目に付加され（すなわち、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の繰り返し単位の窒素原子に対する結合に最も近接している）、［−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−］ｎが２番目に付加され、［−Ａ３−Ｏ−］ｐが３番目に付加されることが意味される。この配向は、内側ポリエチレンオキシドブロックと外側ポリプロピレンオキシドブロックとを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンを提供する。
【０１４０】
式（Ｖ）のこれらのアルキレンオキシ単位のかなりの部分は、エチレンオキシ単位−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）］ｎ−及びプロピレンオキシ単位−［ＣＨ２−ＣＨ２（ＣＨ３）−Ｏ］ｐ−により形成される。アルキレンオキシ単位はまた追加的に、小さな比率のプロピレンオキシ又はブチレンオキシ単位−［Ａ２−Ｏ］ｍ−を有してもよく、すなわち、水素原子で飽和したポリアルキレンイミン主鎖は、存在するＮＨ−部分１モル当たりで最大約２モル、特に約０．５〜約１．５モル、特に約０．８〜約１．２モルの、少量のプロピレンオキシド又はブチレンオキシドと最初に反応させてもよい、すなわち、初期にアルコキシル化させてもよい。
【０１４１】
ポリアルキレンイミン主鎖のこの最初の修飾により、必要である場合には、アルコキシル化における反応混合物の粘性を低下させることができる。しかしながら、修飾は一般にアルコキシル化ポリアルキレンイミンの性能特性に影響せず、したがって、好ましい尺度を構成しない。
【０１４２】
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、本発明の洗剤及び洗浄組成物中に、組成物の約０．０５重量％〜約１０重量％の範囲の濃度で存在する。本組成物の実施形態は、約０．１重量％〜約５重量％を含んでもよい。より具体的には、本実施形態は、約０．２５〜約２．５％のグリース洗浄ポリマーを含んでもよい。
【０１４３】
洗浄性界面活性剤
前記組成物は、洗浄性界面活性剤を含む。洗浄性界面活性剤は、アニオン性、非イオン性、カチオン性、及び／又は双性イオン性であり得る。好ましくは、この洗浄性界面活性剤はアニオン性である。この組成物は好ましくは２％〜５０％、より好ましくは５％〜３０％、最も好ましくは７％〜２０％の洗浄性界面活性剤を含む。この組成物は２％〜６％の洗浄性界面活性剤を含み得る。この組成物は好ましくは、洗濯方法で洗浄液中１００ｐｐｍ〜５，０００ｐｐｍの洗浄性界面活性剤を供給するような量の、洗浄性界面活性剤を含む。これは、洗濯方法で１０ｇ〜１２５ｇの液体洗濯洗剤組成物を洗浄液内に投入する場合に、特に好ましい。この組成物は水と接触して、典型的に、０．５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの洗剤組成物を含む洗浄液を形成する。
【０１４４】
ランダムグラフトコポリマー
ランダムグラフトコポリマーは、（ｉ）不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン、飽和ポリアルコール（例えばグリセロールなど）、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖、並びに、（ｉｉ）Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖、を含む。
【０１４５】
このポリマーは好ましくは、次の一般式を有する。
【化８】
式中、Ｘ、Ｙ及びＺはＨ又はＣ１〜６アルキルから独立に選択される末端保護単位であり、各Ｒ１はメチル及びエチルから独立に選択され；各Ｒ２はＨ及びメチルから独立に選択され；各Ｒ３は独立にＣ１〜４アルキルであり、並びに各Ｒ４はピロリドン及びフェニル基から独立に選択される。ポリエチレンオキシド主鎖の重量平均分子量は典型的に、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜約１８，０００ｇ／ｍｏｌ、又は約３，０００ｇ／ｍｏｌ〜約１３，５００ｇ／ｍｏｌ、又は約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜約９，０００ｇ／ｍｏｌである。ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑの値は、ペンダント基がポリマーの少なくとも５０重量％、又は約５０重量％〜約９８重量％、又は約５５重量％〜約９５重量％、又は約６０重量％〜約９０重量％を含むように選択される。本明細書で有用なポリマーは典型的には、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜約１００，０００ｇ／ｍｏｌ、又は好ましくは約２，５００ｇ／ｍｏｌ〜約４５，０００ｇ／ｍｏｌ、又は約７，５００ｇ／ｍｏｌ〜約３３，８００ｇ／ｍｏｌ、又は約１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２２，５００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する。
【０１４６】
好適なグラフトコポリマーについては、国際特許第ＷＯ０７／１３８０５４号、同第ＷＯ０６／１０８８５６号、及び同第ＷＯ０６／１１３３１４号に詳しく記述されている。
【０１４７】
適切な布地色相剤（布地色相剤）
蛍光増白剤は、少なくとも何らかの可視光線を放出する。対照的に、布地色相剤は、可視光線スペクトルの少なくとも一部を吸収するため、表面の色合いを変えることができる。適切な布地色相剤としては、本明細書の試験方法の項に記載の試験方法１の要件を満たす染料、染料−粘土共役体、及び顔料が挙げられる。適切な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙げられる。適切な小分子染料としては、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット、及びベーシックレッドのカラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）分類に該当する染料、又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられ、例えば次のものが挙げられる。
【０１４８】
（１）以下の式のトリス−アゾ系ダイレクトブルー
【化９】
式中、ナプチル環Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも２つがスルホネート基で置換されており、環Ｃは、５位をＮＨ２又はＮＨＰｈ基で置換してもよく、Ｘは、２つ以下のスルホネート基で置換されているベンジル又はナフチル環であり、２位をＯＨ基で置換してもよく、更にＮＨ２又はＮＨＰｈ基で置換してもよい。
【０１４９】
（２）以下の式のビス−アゾ系ダイレクトバイオレット
【化１０】
式中、ＺはＨ又はフェニルであり、環Ａは、好ましくは矢印で示される位置がメチル及びメトキシ基で置換されており、環Ａはナフチル環であってもよく、Ｙ基はベンジル又はナフチル環であり、サルフェート基で置換されており、メチル基で１又は２置換されてもよい。
【０１５０】
（３）以下の式のブルー又はレッドアシッド
【化１１】
式中、Ｘ及びＹの少なくとも１つは芳香族基でなければならない。１つの態様では、芳香族基は双方とも、置換ベンジル又はナフチル基であってよく、このベンジル又はナフチル基はアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換してよく、Ｘ及びＹはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換しなくてもよい。別の態様では、Ｘはニトロ基で置換したベンジル基であり、Ｙはベンジル基である。
【０１５１】
（４）以下の構造のレッドアシッド
【化１２】
式中、Ｂはアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換されてもよいナフチル又はベンジル基であり、Ｂはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換しなくてもよい。
【０１５２】
（５）以下の構造のジアゾ
【化１３】
式中、Ｘ及びＹは、互いに独立してそれぞれ、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４−アルコキシであり、Ｒαは水素又はアリールであり、ＺはＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル又はカルボニルであり、ｎは１又は２であり、及びｍは０、１又は２であり、並びにこれらの対応する塩、並びにこれらの混合物である。
【０１５３】
（６）以下の構造のトリフェニルメタン
【化１４】
【化１５】
及びこれらの混合物。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者及びカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK））番号がダイレクトバイオレット９、ダイレクトバイオレット３５、ダイレクトバイオレット４８、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトバイオレット６６、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトブルー８０、ダイレクトブルー２７９、アシッドレッド１７、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドバイオレット１５、アシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット２４、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドバイオレット４９、アシッドブルー１５、アシッドブルー１７、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４０、アシッドブルー４５、アシッドブルー７５、アシッドブルー８０、アシッドブルー８３、アシッドブルー９０、アシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ベーシックバイオレット１、ベーシックバイオレット３、ベーシックバイオレット４、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット３５、ベーシックブルー３、ベーシックブルー１６、ベーシックブルー２２、ベーシックブルー４７、ベーシックブルー６６、ベーシックブルー７５、ベーシックブルー１５９、及びこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者及びカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK））番号がアシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４５、アシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１、及びこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者及びカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists, Bradford
, UK））番号が、アシッドバイオレット１７、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトブルー１、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２９、アシッドブルー１１３、又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。
【０１５４】
好適なポリマー染料としては、共役色原体を含むポリマー（染料−ポリマー共役体）、ポリマーの骨格に共重合した色原体を有するポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
【０１５５】
別の態様では、適切なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ、米国サウスカロライナ州スパータンバーグ）の名称で市販されている布地直接着色剤、及び少なくとも１つの反応染料と、ヒドロキシル部分、１級アミン部分、２級アミン部分、チオール部分、及びこれらの混合物からなる群から選択される部分を含むポリマーからなる群から選択されるポリマーから形成されている染料−ポリマー共役体が挙げられる。更に別の態様では、好適なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）バイオレットＣＴ、リアクティブブルー、リアクティブバイオレット、又はリアクティブレッド染料で共役されているカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ＣＭＣが共役されているものとしては、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（アイルランド、ウイックロー）からＡＺＯ−ＣＭ−セルロースの商品名、商品コードＳ−ＡＣＭＣで市販されているＣ．Ｉ．リアクティブブルー１９、アルコキシル化トリフェニール−メタン重合着色料、アルコキシル化チオフェン重合着色料、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
【０１５６】
適切な染料粘土共役体としては、少なくとも１つのカチオン性／塩基性染料とスメクタイト粘土を含む群から選択される染料粘土共役体、及びこれらの混合物が挙げられる。別の態様では、好適な染料粘土共役体としては、以下のＣ．Ｉ．からなる群から選択される１つのカチオン性／塩基性染料からなる群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。ベーシックイエロー１〜１０８、Ｃ．Ｉ．ベーシックオレンジ１〜６９、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１〜１１８、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１〜５１、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー１〜１６４、Ｃ．Ｉ．ベーシックグリーン１〜１４、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラウン１〜２３、ＣＩベーシックブラック１〜１１、及びモンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土、及びそれらの組合せからなる群から選択される粘土。別の態様では、好適な染料粘土共役体としては以下の群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。モンモリロナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、モンモリロナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、モンモリロナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、モンモリロナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、モンモリロナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、モンモリロナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、ヘクトライトトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、ヘクトライトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、ヘクトライトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、ヘクトライトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、ヘクトライトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、サポナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、サポナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、サポナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、サポナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、サポナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、サポナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体及びこれらの混合物。
【０１５７】
適切な顔料としては、フラバントロン（flavanthrone）、インダントロン、１〜４個の塩素原子を有する塩素化インダントロン、ピラントロン（pyranthrone）、ジクロロピラントロン（dichloropyranthrone）、モノブロモジクロロピラントロン（monobromodichloropyranthrone）、ジブロモジクロロピラントロン（dibromodichloropyranthrone）、テトラブロモピラントロン（tetrabromopyranthrone）、ペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボン酸ジイミド（イミド基はＣ１〜Ｃ３−アルキル又はフェニル又は置換されていないか又は複素環式ラジカルで置換されていてもよく、フェニル及び複素環式ラジカルは更に水溶性を付与しない置換を有していてもよい）、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン（violanthrone）、イソビオラントロン（isoviolanthrone）、ジオキサジン染料、銅フタロシアニン（１分子当たり２個以下の塩素原子を有していてもよい）、ポリクロロ−銅フタロシアニン、又はポリブロモクロロ−銅フタロシアニン（１分子当たり１４個以下の臭素原子を有する）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
【０１５８】
別の態様において、好適な顔料には、ウルトラマリンブルー（Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ ２９）、ウルトラマリンバイオレット（Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ １５）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
【０１５９】
前述の布地色相剤は、組合せて使用することができる（布地色相剤の任意の混合物を使用することができる）。適切な布地色相剤は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）、Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄａｙｇｌｏ Ｃｏｌｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｄｙｅｓｔｕｆｆｓ Ｃｏｒｐ．（Ｅａｓｔ Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ，ＵＳＡ）、Ｄｙｓｔａｒ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌａｎｘｅｓｓ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｃｌａｒｉａｎｔ（Ｍｕｔｔｅｎｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ａｖｅｃｉａ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）から購入可能であり、及び／又は本明細書に記載の実施例にしたがって調製可能である。
【０１６０】
好適な色調剤については、詳しくは米国特許第７，２０８，４５９（Ｂ２）号に記述されている。
【０１６１】
補助剤成分
適切な補助剤物質としては、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加の酵素及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成済み過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ欠失／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造伸縮性付与剤、柔軟仕上げ剤、キャリア、向水性物質、加工助剤、溶媒、及び／又は顔料が挙げられるが、これらに限らない。下記開示に加えて、このような他の補助剤の適した例、及び使用量は、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号及び同第６，３２６，３４８号に見ることができる。
【０１６２】
本発明は更に以下の例によって説明されるが、これは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６３】
実施例１−キシログルカナーゼ変異体の製造及び精製
本発明のキシログルカナーゼ変異体は、標準的な方法、手短に言えば、ランダムな及び／又は部位特異的な突然変異を遺伝子に導入し、バチルス・ズブチルス宿主細胞を変異遺伝子で形質転換し、形質転換された宿主細胞を発酵させ、発酵ブロスからキシログルカナーゼ変異体を得る、ことによって調製された。参照キシログルカナーゼ（配列番号３）を、同様の方法で、バチルス・ズブチルスにおいて組み換え的に産生した。
【０１６４】
発酵は、５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコの中にＣａＣＯ３のタブレットを１つ含有する１００ｍＬ ＰＳ−１培地を３７℃で４日間振盪させて、振盪フラスコ培養の中で行われた。ＰＳ−１培地組成物は、１００ｇ／Ｌスクロースと、４０ｇ／Ｌ Ｓｏｙｍｅａｌ Ｍｅａｌと、１０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４＊１２Ｈ２Ｏと、０．１ｍＬ／Ｌ Ｄｏｗｆａｘ ６３Ｎ１０と、６μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの形態の抗生物質と、を含有する。
【０１６５】
発酵後、遠心分離（２６０００×ｇ、２０分）によって培養ブロスを採取した。少量の上清を０．４５μｍフィルタを通過させて滅菌濾過し、冷凍貯蔵した。以下に記載の安定性アッセイを開始する直前に、サンプルを解凍した。
【０１６６】
一部の例では、安定性試験で使用される前に酵素サンプルを精製した。
【０１６７】
酵素精製に関しては、残りの宿主細胞を除去するため、ＮＡＬＧＥＮＥ ０．２μｍ濾過ユニット（カタログ番号５６９−００２０）を通過させて上澄みを濾過した。 濾液０．２μｍのｐＨを２０％ ＣＨ３ＣＯＯＨでｐＨ５．０に調整し、５０ｍＭコハク酸／ＮａＯＨ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５．０中で平衡化したＸｐｒｅｓｓＬｉｎｅ ＰｒｏＡカラム（ＵｐＦｒｏｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ／Ｓ）に濾液を加えた。ＸｐｒｅｓｓＬｉｎｅ ＰｒｏＡカラムを平衡緩衝液で十分に洗浄した後、キシログルカナーゼを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０で段階溶出した。溶出の間に分画を収集した。カラムからの分画をキシログルカナーゼ活性について分析し（実施例２）、活性を有する分画をプールした。プールのｐＨを３Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅでｐＨ９．０に調整し、プールを脱塩水で５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０と同じ（又はそれより低い）伝導度まで希釈した。調整溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０中で平衡化したＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを平衡緩衝液で十分に洗浄した後、酵素を５カラム容量にわたって同緩衝液中の直線状ＮａＣｌ勾配（０→０．５Ｍ）で溶出した。そのカラムからの画分を、キシログルカナーゼ活性について分析し、活性を有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより更に分析した。クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１バンドのみが見られた分画を精製品としてプールした。
【０１６８】
実施例２−キシログルカナーゼアッセイ
例えば精製で得た酵素サンプルのキシログルカナーゼ活性をＡＺＣＬ−キシログルカンアッセイで測定した。
【０１６９】
ＡＺＣＬ−キシログルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）をキシログルカナーゼと共にインキュベートし、放出された青色を６５０ｎｍで測定した。キシログルカナーゼ活性を、適切な空試験値を差し引いた後のインキュベーションの間の青色の増加として計算した。
【表１】
【０１７０】
５００μＬ ＡＺＣＬ−キシログルカン基質懸濁液をエッペンドルフ型チューブの中の氷の上に定置した。５００μＬアッセイ緩衝液を添加し、混合物を氷の温度まで冷やした。２０μＬ酵素サンプル（０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈）を添加した。エッペンドルフ型チューブをアッセイ温度に設定されたエッペンドルフ型サーモミキサーに移してアッセイを開始した。チューブを最高振盪速度（１４００ｒｐｍ）のエッペンドルフ型サーモミキサーの上で１５分間インキュベートした。チューブを氷浴に戻してインキュベーションを中止した。チューブが氷のように冷たくなったら、チューブを氷冷の遠心分離機で短時間の間遠心分離機して未反応基質を沈殿させた。２００μＬ上清をマイクロタイタープレートに移してＡ６５０を読み取った。緩衝液ブランク（酵素の代わりに２０μＬ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）をアッセイに含ませ、酵素サンプルと緩衝液ブランクとの間のＡ６５０の差異がキシログルカナーゼ活性の測定値であった。
【０１７１】
実施例３−キシログルカナーゼ変異体の安定性
本発明のキシログルカナーゼ変異体の洗剤安定性を、液体洗剤中でのインキュベーション後の変異体の活性を測定することによって評価した。
【０１７２】
安定性試験は、酵素サンプルを液体洗剤に加え、これを高温、例えば３５℃〜４０℃で貯蔵することによって実施された。所定の貯蔵期間の後、酵素活性を測定し、約−１８℃で同じ期間貯蔵された等量のサンプルの活性と比較した。安定性試験の結果は、低温貯蔵されたサンプルに見られた活性の％で表わされた、高温で貯蔵されたサンプルに見られた活性である。
【０１７３】
キシログルカナーゼ変異体の結果を、同じ条件下で試験した親キシログルカナーゼ（配列番号３）の結果と比較した。２つの安定性結果の間の比が安定性改善度（ＳＩＦ）である。
【０１７４】
ＳＩＦ＞１を有する変異体は、試験条件下で親キシログルカナーゼよりも安定している。好ましい変異体は、この試験で高いＳＩＦを有するものである。
【０１７５】
界面活性剤
安定性試験で使用した液体洗剤は次の組成物を有する。
【表２】
【０１７６】
貯蔵試験
実施例１に従って調製した酵素サンプルを、貯蔵安定性試験を開始する直前に解凍した。
【０１７７】
酵素サンプルを１ｍＬ当たり約０．２５ｍｇ酵素タンパク質の濃度に希釈した。
【０１７８】
液体洗剤を約１２ｍＬの容量でガラス瓶の中に分配して、各グラスの中に１．０±０．０５グラムの洗剤を供給した。
【０１７９】
各酵素サンプル対して２つの複製瓶を準備した。５０μＬの希釈酵素及び小型電磁攪拌棒を瓶に加え、瓶をしっかりと閉じた（貯蔵中の蒸発を防ぐため）。内容物を電磁攪拌棒の助けを借りて約５分間混合した。一対の瓶の一方を約−１８℃の冷凍庫の中に定置した。他方の瓶を、所定の高温、例えば３５℃〜４０℃の好適なインキュベータオーブンの中に定置して試験した。所定の貯蔵期間の後、インキュベータオーブンの中の瓶を冷凍庫に移す。
【０１８０】
活性アッセイ
洗剤の中で貯蔵された酵素サンプルの活性を以下の手段を用いて測定した。
【０１８１】
材料及び試薬：
１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７：
１３８グラムのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを約７５０ｍＬの水の中に溶解する。４Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨ７．０とする。次に、最終容量を１０００ｍＬにする。
【０１８２】
アッセイ緩衝液（５０ｍＭリン酸塩ｐＨ７）：
９５０ｍＬ水、５０ｍＬ １Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７及び５ｍＬのＢｅｒｏｌ ５３７（Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌから供給される非イオン性界面活性剤）を混合する。最終ｐＨを７．００±０．０２に調節する。
【０１８３】
基質：
Ｃｅｌｌａｚｙｍｅ Ｃタブレット、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄより供給、カタログ番号Ｔ−ＣＣＺ。タブレットは架橋染色ＨＥセルロースを含有する。
【０１８４】
手順
アッセイ開始約３０分前に、瓶を冷凍装置から約４℃の冷蔵庫に移した。アッセイ開始直前に瓶を冷蔵庫から取り出し、実験室の卓上の上に置いて開けた。
【０１８５】
１０ｍＬアッセイ緩衝液（室温）をそれぞれの開けた瓶に加えた。次に、サブマージマルチポイント電磁攪拌器を装備した３０℃の水浴に瓶を移した。内容物を穏やかに約５分間撹拌した。
【０１８６】
１つのＣｅｌｌａｚｙｍｅ Ｃタブレットをそれぞれの瓶に加えた。基質粒子を移動させ続け、かつ沈殿を防ぐのにちょうど適切な撹拌速度を用いて撹拌を継続した。タブレットを加えて３０分後に瓶を水浴から取り出し、続いて、室温で１５分間撹拌せずに放置した。
【０１８７】
ピペットを使用して、それぞれの瓶の上部からの特に透明な上澄み約１ｍＬをセミマイクロ分光光度計のキュベットに移した。次に、５９０ｎｍにおける吸光度を、好適な分光光度計を用いて測定した。測定は１５分以内に終了した。
【０１８８】
ブランクサンプル、即ち、キシログルカナーゼ酵素が添加されていない等量の洗剤サンプルをアッセイ含ませた。
【０１８９】
計算
それぞれの酵素サンプルに関し、２つのＡｂｓ５９測定値が存在する。
・−１８℃で貯蔵されたサンプルのＡｂｓ５９０値であるＡ５９０ｆ
・高温で貯蔵されたサンプルのＡｂｓ５９０値であるＡ５９０ｗ
Ａ５９０ｆからＡ５９０ｆを減算し（Ａ５９０ｆ−Ａ５９０ｂ）、Ａ５９０ｗからＡ５９０ｆを減算する（Ａ５９０ｗ−Ａ５９０ｂ）。
【０１９０】
安定性は：
％安定性＝（（Ａ５９０ｗ−Ａ５９０ｂ）／（Ａ５９０ｆ−Ａ５９０ｂ））×１００％として計算された。
【０１９１】
それぞれの酵素に関し、（Ａ５９０ｆ−Ａ５９０ｂ）の結果は０．１〜１．２の範囲内になければならない。値がこの範囲外にあると、その酵素に関する結果は信頼できないと見なされ、異なる希釈の酵素サンプルで試験を繰り返さなければならない。
【０１９２】
最後に、それぞれの酵素変異体の安定性改善度（ＳＩＦ）を次のように計算する。
ＳＩＦ＝酵素サンプルの％安定性／親酵素（配列番号３）の％安定性
【０１９３】
結果
以下に示されるのは、異なる条件下で試験されたキシログルカナーゼ変異体の安定性結果である。
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９−１】
【表９−２】
【表９−３】
【表１０】
【表１１】
【表１２−１】
【表１２−２】
【表１３】
【表１４】
【０１９４】
実施例４−キシログルカナーゼ変異体の安定性
本実施例のキシログルカナーゼ変異体の洗剤安定性を、液体洗剤中でのインキュベーション後の変異体の活性を測定することによって評価した。
【０１９５】
安定性試験は、酵素サンプルを液体洗剤に加え、これを高温、例えば３５℃〜４６℃で貯蔵することによって実施された。所定の貯蔵期間の後、酵素活性を測定し、約＋５℃で同じ期間貯蔵された同一サンプルの活性と比較した。安定性試験の結果は、等量の低温貯蔵されたサンプル（ストレス無負荷サンプル）に見られた活性の％で表わされた、高温で保存されたサンプル（ストレス負荷サンプル）に見られた活性である。
【０１９６】
キシログルカナーゼ変異体の結果を、同じ条件下で試験した親キシログルカナーゼ（配列番号３）の結果と比較した。
【０１９７】
洗剤
安定性試験で使用した液体洗剤は次の組成物を有する。
【表１５】
【０１９８】
貯蔵試験
実施例１に従って調製した酵素サンプルを、貯蔵安定性試験を開始する直前に解凍した。
【０１９９】
酵素サンプルは更に希釈することなく使用された。
【０２００】
液体洗剤を、丸底ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレート（プレート１）に分配して、ウェル当たりの洗剤を１９０μＬとした。
【０２０１】
１０μＬの酵素サンプル及び小型電磁攪拌棒を各ウェルに加え、粘着性アルミ箔の蓋（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してプレートをしっかりと閉じた（蒸発を防ぐため）。内容物を電磁攪拌棒で約３０分間混合した。
【０２０２】
次に、プレート１の各ウエルから、２０μＬの洗剤−酵素混合物を新しい空の同一プレート（プレート２）に移した。次に、両方のプレートを密閉した。
【０２０３】
最初のプレート（プレート１）を、所定の高温、例えば３５℃〜４６℃のインキュベータオーブンの中に置いた。もう一つのプレート（プレート２）を、約５℃の冷蔵庫の中に置いた。
【０２０４】
所定期間のインキュベーションの後、プレートを冷蔵庫及びインキュベータオーブンから取り出した。プレートを実験室の卓上に少なくとも３０分置いて、全てのウェルを室温に達するようにした。
【０２０５】
次に、プレート１の各ウェルからの２０μＬを新しい空の丸底９６ウェルプレート（プレート１ａ）に移した。
【０２０６】
この時プレート１ａは２０μＬのストレス負荷サンプルを収容しており、プレート２は２０μＬのストレス無負荷サンプルを収容している。
【０２０７】
活性アッセイ
洗剤の中で貯蔵された酵素サンプルの活性を以下の手段を用いて室温で測定した。
【０２０８】
アッセイの原理：
パラ−ニトロフェノール−β−Ｄ−セロテトラオシド（ｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシド）は、特定のキシログルカナーゼ酵素の触媒作用によって加水分解された合成基質である。
【０２０９】
基質そのものは無色であるが、還元末端グリコシド結合を加水分解すると、４０５ｎｍにおける強い吸光度によって、ｐＨ８緩衝液中に黄色のパラ−ニトロフェノールが放出される。
【０２１０】
ｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシドそのものは、所与のアッセイ条件下で非常に安定している。したがって、４０５ｎｍにおける吸光度の増加は酵素活性の属性である。
【０２１１】
本発明者らは、４０５ｎｍにおける強力な吸光度の増加によって証明されたように、親キシログルカナーゼ（配列番号３）はｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシドを基質として受け入れたことを見出した。
【０２１２】
材料及び試薬：
アッセイ緩衝液：１００ｍＭ ＥＰＰＳ；０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ８．０。
ｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシド（ＣＡＳ−＃：１２９４１１−６２−７；Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｃａｎａｄａ）
基質溶液：アッセイ緩衝液中の１ｍＭ ｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシド。
【０２１３】
手順：
プレート１ａは２０μＬのストレス負荷サンプルを収容し、プレート２は２０μＬのストレス無負荷サンプルを収容する。
【０２１４】
５０μＬアッセイ緩衝液を加えてサンプルを希釈してプレート１ａ及びプレート２の全ウェルに加え、マイクロタイタープレート振盪器を使用して１時間混合した。次に、追加の５０μＬアッセイ緩衝液を全ウェルに加え、振盪を更に１０分間継続した。
【０２１５】
係数６希釈サンプル２０μＬを透明な３８４ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートに移し、２０μＬ基質溶液を全ウェルに添加した。マイクロタイタープレートをしばらく振盪させることによってサンプルを混合した。３８４ウェル分光光度リーダーを使用して４０５ｎｍにおける吸光度の増加速度を観察することによって、酵素活性の反応速度測定を即座に開始した。
【０２１６】
反応の初期速度（Ａｂｓ／分）を決定した。反応の初期速度は、関連酵素濃度内の線形標準曲線から検証されたサンプルにおける酵素活性の測定値であった。
【０２１７】
計算：
ストレス負荷サンプルの酵素活性を同一のストレス無負荷サンプルの酵素活性で除したものとして％残留活性を計算した。
％残留活性＝「Ａｂｓ／分（ストレス負荷サンプル）」／「Ａｂｓ／分（ストレス無負荷サンプル）」＊１００％。
【０２１８】
結果
以下に示されるのは、異なる条件下で試験されたキシログルカナーゼ変異体の安定性結果である。
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【０２１９】
液体洗濯洗剤組成物
組成物１〜８：フロントローディング式自動洗濯機に好適な液体洗濯洗剤組成物
【表５５】
【０２２０】
組成物９〜１６：トップローディング式自動洗濯機に好適な液体洗濯洗剤組成物
【表５６】
【表５７】
【０２２１】
組成物７：ポリビニルアルコールのフィルムにより封入されている小袋の形態の液体洗濯洗剤組成物
【表５８】
【０２２２】
（実施例１８〜２９）
下記は、布地洗濯に適した、本発明に従って製造された顆粒状洗剤組成物である。
【表５９】
【表６０】
１ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００で、ポリエチレンオキシドとポリ酢酸ビニルの重量比は約４０対６０であり、５０エチレンオキシド単位当たり１グラフト点を超えない。
２−ＮＨにつき２０個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３両親媒性グリース洗浄ポリマーは、−ＮＨにつき２４個のエトキシル基、及び−ＮＨにつき１６個のプロポキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）である。
４次の構造を有する可逆性プロテアーゼ抑制剤。
【化１６】
＊注：酵素濃度はすべて、酵素原材料の％として表わされているが、ただしキシログルカナーゼは、洗剤１００ｇ当たりの活性酵素タンパク質ｍｇ単位で示されている。
【０２２３】
本明細書に開示される寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳しく制限されるものとして理解されるべきでない。それよりむしろ、特に指定されない限り、各こうした寸法は、列挙された値とその値周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味することを意図する。例えば、「４０ｍｍ」として開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコシル加水分解酵素のファミリー４４に属するキシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
キシログルカンは、植物の一次（成長中）細胞壁中の主要構造の多糖類である。構造上、キシログルカンは、しばしば様々な側鎖により置換されるセルロース様β−１，４−結合グルコース主鎖から成る。キシログルカンは、セルロースミクロフィブリルを架橋してセルロース−キシログルカン網状構造を形成することにより、植物の一次細胞壁において機能を果たすと考えられる。
【０００３】
キシログルカンは、キシログルカンからキシログルカンオリゴ糖への可溶化を触媒することができる。一部のキシログルカナーゼはキシログルカナーゼ活性のみを示すが、その他のものはキシログルカナーゼ及びセルロース活性の両方を示す。キシログルカンは、ＥＣ３．２．１．４又はＥＣ．３．２．１．１５１に分類されることができる。キシログルカナーゼ活性を有する酵素は、例えば、Ｖｉｎｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２９８（４）：２９９〜３１０に記載されており、その中で、トリコデルマ・ビリデ（Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）に類似）由来の３種類のエンドグルカナーゼである、エンドＩ、エンドＶ及びエンドＶＩを特徴づけている。エンドＩ、エンドＶ及びエンドＶＩは、それぞれグルコシル加水分解酵素のファミリー５、７及び１２に属する（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１，１９９３）を参照のこと）。ＷＯ ９４／１４９５３は、真菌アスペルギルス・アクレータス（Aspergillus aculeatus）からクローニングされたファミリー１２のキシログルカナーゼ（ＥＧＩＩ）を開示している。ＷＯ ９９／０２６６３は、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）及びバシラス・アガラヘレンス（Bacillus agaradhaerens）からそれぞれクローニングされたファミリー１２及びファミリー５のキシログルカナーゼを開示している。ＷＯ ０１／０６２９０３は、ファミリー４４のキシログルカナーゼを開示している。
【０００４】
特に、ＷＯ ９９／０２６６３及びＷＯ ０１／０６２９０３は、キシログルカナーゼを洗剤で使用する可能性について示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、その親酵素と比べて改善された特性を有するグルコシル加水分解酵素のファミリー４４に属するキシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、位置番号６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５、３６６、１、３７４、７、１４０、８、１４、２１、２１１、３７、４５、１３、７８、８７、４３６、１０１、１０４、１１１、３０６、１１７、１１９、４１４、１３９、２６８、１４２、１５９、１６４、１０２、１６８、１７６、１８０、４８２、１８３、２０２、２０６、２１７、４、２２２、１９、２２４、２２８、２３２、２、２４０、２４４、５、２４７、２４９、３２８、２５２、２５９、４０６、２６７、２６９、２７５、１７９、１６６、２７８、２８１、２８８、２９８、３０１、１８、３０２、１６５、８０、３０３、３１６、１６９、３２２、１２０、１４６、３４２、３４８、１４７、３５３、３８０、４６８、３８２、３８３、３８、３８４、３８９、３９１、１０、３９２、３９６、１７７、３９７、３９９、４０９、２３７、４１３、２５３、４１５、４１８、４０、４４３、４４５、１４８、４４９、２２５、４５０、４５４、３、４５５、４５６、２９９、４６１、４７０、２０４、４７６、４８８、３４７、及び５０７からなる群から選択される１つ以上（いくつか）の位置の改変を含む、親キシログルカナーの単離された変異体を含む洗剤組成物に関し、この位置はアミノ酸配列番号３の位置に対応しており、この改変は独立して、
ｉ）この位置を占めるアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
ｉｉ）この位置を占めるアミノ酸の欠失、又は
ｉｉｉ）この位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸での置換、であり、
親キシログルカナーゼはファミリー４４のキシログルカナーゼであり、変異体はキシログルカナーゼ活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１ａ】コンセンサス配列表。
【図１ｂ】コンセンサス配列表。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、位置の番号付けが配列番号３の位置の番号付けに対応している、１つ以上（いくつか）の位置における好ましくは置換及び／若しくは挿入並びに／又は欠失の形態の改変を含む、ファミリー４４の親キシログルカナーゼの変異体を含む洗剤組成物に関する。本発明の変異体はキシログルカナーゼ活性を有し、セルロース分解活性も有する可能性もある。本発明の変異体は、親キシログルカナーゼと比べて改善された特性を有する。一態様において、この変異体は、液体洗剤、特に液体洗濯洗剤組成物中での改善された安定性を有する。
【０００９】
定義
キシログルカナーゼ活性：用語「キシログルカナーゼ活性」は、本明細書においては、キシログルカンの酵素触媒による加水分解として定義される。この反応は、キシログルカンの１，４−β−Ｄ−グルコース結合のエンド加水分解を伴う。本発明の目的上、キシログルカナーゼ活性は、ＡＺＣＬ−キシログルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅより入手）を反応基質として使用して決定される。アッセイは、本出願の実施例２に記載のような、又はＷＯ ０１／６２９０３に記載のような様々な方法で実施され得る。キシログルカナーゼ活性の一単位（ＸｙｌｏＵ）は、ＷＯ ０１／６２９０３の６０頁、３〜１７行目に記載のアッセイ方法を参照することにより定義される。
【００１０】
セルロース活性：用語「セルロース活性」は、本明細書においては、β−１，４−グルカン（セルロース）の１，４−β−Ｄ−グルコース結合の酵素触媒による加水分解として定義される。本発明の目的上、セルロース活性は、ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロース（Ｍｅｇａｚｙｍｅより入手）を反応基質として使用して決定される。
【００１１】
変異体：用語「変異体」は、本明細書においては、１つ以上（いくつか）の特定位置にある１つ以上（いくつか）のアミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失などの改変を含むキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドとして定義され、この特定位置は配列番号３のアミノ酸位置に対応している。本発明の変異体はまたセルロース活性を有してもよい。変性ポリペプチド（変異体）は、人間の介入により親の酵素をコードするポリヌクレオチド配列を修飾することによって得る。親の酵素は、配列番号１、配列番号４、若しくは配列番号６、又はこれらの配列の１つと少なくとも７５％同一である配列によってコードされ得る。変異体ポリペプチド配列は、自然界に見られないものであるのが好ましい。
【００１２】
野生型酵素：用語「野生型」キシログルカナーゼは、自然界に見られる細菌、酵母又は糸状菌等の自然発生微生物によって発現されるキシログルカナーゼを意味する。用語「野生型」は、用語「自然発生的な」と交換可能に使用されてもよい。
【００１３】
親酵素：本明細書で使用されるとき、用語「親」キシログルカナーゼ又は「親の」キシログルカナーゼは、本発明の酵素変異体を生成するために、修飾、例えば、置換、挿入、欠失及び／又はトランケーションが行われるキシログルカナーゼを意味する。この用語はまた、変異体と比較させる及びアラインメントさせるポリペプチドを指す。親は、配列番号２若しくは配列番号３又は配列番号５あるいは配列番号７の酵素等の自然発生的な（野生型）ポリペプチドであってもよい。しかしながら、親ポリペプチドはまた、アミノ酸配列が修飾された又は変化した自然発生的なポリペプチドの変異体であってもよい。親は、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかによってコードされるポリペプチドである対立遺伝子変異体であってもよい。
【００１４】
単離変異体又はポリペプチド：本明細書で使用されるとき、用語「単離変異体」又は「単離ポリペプチド」は、供与源から単離される変異体又はポリペプチドを指し、この供給源は、例えば変異体又はポリペプチドがそこから発現される宿主細胞、又は変異体又はポリペプチドが通常存在する酵素複合体である。好ましくは、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、少なくとも４０％純度、より好ましくは少なくとも６０％純度、更により好ましくは少なくとも８０％純度、最も好ましくは少なくとも９０％純度、及び更に最も好ましくは少なくとも９５％純度である。
【００１５】
実質的に純粋な変異体又はポリペプチド：本明細書において、用語「実質的に純粋な変異体」又は「実質的に純粋なポリペプチド」とは、自然に又は組み換えで付随しているその他のポリペプチド材料を最大限でも１０重量％、好ましくは最大限でも８重量％、より好ましくは最大限でも６重量％、より好ましくは最大限でも５重量％、より好ましくは最大限でも４重量％、最大限でも３重量％、更により好ましくは最大限でも２重量％、最も好ましくは最大限でも１重量％、及び更に最も好ましくは最大限でも０．５重量％含有するポリペプチド製剤を言う。したがって、実質的に純粋な変異体又はポリペプチドは、製剤に存在する全ポリペプチド材料の、少なくとも９２重量％純度、好ましくは少なくとも９４重量％純度、より好ましくは少なくとも９５重量％純度、より好ましくは少なくとも９６重量％純度、より好ましくは少なくとも９６重量％純度、より好ましくは少なくとも９７重量％純度、より好ましくは少なくとも９８重量％純度、更により好ましくは少なくとも９９重量％純度、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純度、及び更に最も好ましくは１００重量％純度であるのが好ましい。本発明の変異体及びポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形である。これは、例えば、変異体又はポリペプチドを既知の組換え方法を用いて、又は古典的な精製法によって調製することにより達成することが可能である。
【００１６】
成熟したポリペプチド：用語「成熟したポリペプチド」は、本明細書では、翻訳及び任意の翻訳後の修飾、例えばＮ末端端プロセシング、グリコシル化、リン酸化反応等に続く最終形態のキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドとして定義される。配列番号２で定義されるポリペプチドでは、成熟したキシログルカナーゼ配列は、理論上は配列番号２の位置２８で始まってもよい。成熟配列は配列番号２の位置５５１で終了する。理論上の成熟したキシログルカナーゼ配列は配列番号３に示される。
【００１７】
成熟したポリペプチドコード配列：用語「成熟したポリペプチドコード配列」は、キシログルカナーゼ活性を有する成熟したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義される。一態様において、成熟したポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３である。
【００１８】
同一性：２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「同一性」によって表される。
【００１９】
本発明の目的上、２つのアミノ酸配列間の同一性の度合は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムで実施されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３）の、好ましくはバージョン３．０．０以降を用いて決定される。使用される所望によるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョンＢＬＯＳＵＭ６２）置換マトリックスである。「最長同一（longestidentity）」と標識されたＮｅｅｄｌｅ出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの合計数）
【００２０】
本発明の目的上、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の度合は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（前掲のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムで実施されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前掲のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）の、好ましくはバージョン３．０．０以降を用いて決定される。使用される所望によるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリックスである。「最長同一（longestidentity）」と標識されたＮｅｅｄｌｅ出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの合計数）。
【００２１】
機能性フラグメント：用語「ポリペプチドの機能性フラグメント」は、長いポリペプチド、例えば、成熟したポリペプチドから誘導され、かつ親ポリペプチドのフラグメントを生成するために、Ｎ末端領域若しくはＣ末端領域のいずれか、又はその両方の領域で切断されているポリペプチドを説明するのに用いられる。機能性ポリペプチドになるために、フラグメントは、完全長の／成熟したポリペプチドのキシログルカナーゼ活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び更に最も好ましくは少なくとも１００％を維持しなければならない。
【００２２】
対立遺伝子変異体：本明細書において用語「対立遺伝子変異体」とは、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態いずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然発生し、個体群内の多形性となり得る。遺伝子の突然変異はサイレント（コード化されたポリペプチドにおいて変化しない）であり得、代替アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもできる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコード化されたポリペプチドである。
【００２３】
単離ポリヌクレオチド：本明細書で使用されるとき、用語「単離ポリヌクレオチド」は、供与源から単離されるポリヌクレオチドを指す。一態様において、単離ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動で測定した場合、少なくとも４０％純度、より好ましくは少なくとも６０％純度、更により好ましくは少なくとも８０％純度、及び最も好ましくは少なくとも９０％純度、及び更に最も好ましくは少なくとも９５％純度である。
【００２４】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書で使用されとき、「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の外来性又は不必要なヌクレオチドのない、及び遺伝子組み換えされたポリペプチド生産システム内での使用に好適な形態のポリヌクレオチド製剤を言う。したがって、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、自然に又は組み換えで付随しているその他のポリヌクレオチドを、最大限でも１０重量％、好ましくは最大限でも８重量％、より好ましくは最大限でも６重量％、より好ましくは最大限でも５重量％、より好ましくは最大限でも４重量％、最大限でも３重量％、更により好ましくは最大限でも２重量％、最も好ましくは最大限でも１重量％、及び更に最も好ましくは最大限でも０．５％含有している。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモーター及びターミネーターのような自然発生する５’及び３’非翻訳領域を含んでいてもよい。実質的に純粋なポリヌクレオチドが、少なくとも９０重量％純度、好ましくは少なくとも９２重量％純度、より好ましくは少なくとも９４重量％純度、より好ましくは少なくとも９５重量％純度、より好ましくは少なくとも９６重量％純度、より好ましくは少なくとも９６重量％純度、より好ましくは少なくとも９７重量％純度、より好ましくは少なくとも９８重量％純度、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％純度、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純度、及び更に最も好ましくは１００重量％純度であるのが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形である、即ち、ポリヌクレオチド製剤は、自然に又は組み換えで付随しているその他のポリペプチド材料を本質的に含んでいない。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はこれらの任意の組合せであってもよい。
【００２５】
コード配列：本明細書において使用されるとき、用語「コード配列」は、ポリヌクレオチドを意味し、ポリヌクレオチドは、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接特定する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームで決定され、通常、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧ及びＴＴＧ等の代替開始コドンにより開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ，及びＴＧＡ等の終止コドンで終了する。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または組換えポリヌクレオチドであり得る。
【００２６】
作動可能にライゲーションされる：本明細書において、用語「作動可能にライゲーションされる」は、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を指示するように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に制御配列を配置する構成を意味する。
【００２７】
宿主細胞：本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構造体又はベクターにより形質転換、トランスフェクション、トランスダクション等を受けやすい任意の細胞型を含む。用語「宿主細胞」は、複製の間に起こる突然変異のために親細胞と同一でない親細胞の任意の子孫を含む。
【００２８】
改善された化学安定性：用語「改善された化学安定性」は、本明細書において、自然発生的又は合成のいずれかの、親酵素の酵素活性を低減する化学物質の存在下におけるインキュベーション期間後に、酵素活性の保持を示す変種酵素として定義される。改善された化学安定性はまた、かかる化学物質の存在下における反応をより良好に触媒することが可能な変異体をもたらすことができる。本発明の特定の態様において、改善された化学安定性は、洗剤、特に液体洗剤中での改善された安定性である。改善された洗剤安定性は、特に、本発明のキシログルカナーゼ変異体が液体洗剤処方の中に混合され、続いて１５〜５０℃の温度で貯蔵される際の、キシログルカナーゼ活性の改善された安定性である。
【００２９】
本発明において、液体洗剤は液体洗濯洗剤として特に有用である。
【００３０】
変異体指定の取り決め
本発明の目的上、配列番号３に開示されるキシログルカナーゼのアミノ酸配列は、別のキシログルカナーゼ中の対応するアミノ酸残基を決定するのに使用される。別のキシログルカナーゼのアミノ酸残基は、配列番号３に開示されるキシログルカナーゼのアミノ酸配列とアラインメントされ、このアラインメントに基づいて、配列番号３に開示されるキシログルカナーゼのアミノ酸配列中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸の位置番号を決定することができる。
【００３１】
ポリペプチド配列の例は、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」を使用して実施することができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，１９９４，ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３〜４６８０）。ＤＮＡ配列のアラインメントは、鋳型としてポリペプチドアラインメントを使用し、アミノ酸をＤＮＡ配列からの対応するコドンで置換することによって実施することができる。
【００３２】
本発明の様々なキシログルカナーゼ変異体を説明するにあたり、参照し易くするために、以下に記載の命名法を適応する。全ての場合において、一般に認められたＩＵＰＡＣの一文字又は三文字アミノ酸略記を採用する。
【００３３】
置換アミノ酸置換に関し、次の命名法、即ち、原形アミノ酸／位置／置換アミノ酸、が使用される。したがって、位置２２６におけるスレオニンとアラニンの置換は「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表わされる。複数の突然変異は、マーク（「＋」）を付加することによって区切られ、例えば、「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５及び４１１で、それぞれ、グリシン（Ｇ）をアルギン（Ｒ）と、及びセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）と置換する突然変異を表している。原型アミノ酸が１つの群から選択されたアミノ酸で置換され得る場合は「Ｋ１２９Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｑ」と表わされ、位置１２９においてリジン（Ｋ）が、アルギン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びグルタミン（Ｑ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることを示している。あるいは、「Ｋ１２９Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｑ」は、Ｋ１２９Ｒ、Ｋ１２９Ｓ、Ｋ１２９Ａ、Ｋ１２９Ｉ、Ｋ１２９Ｆ、又はＫ１２９Ｑと書くこともできる。
【００３４】
欠失アミノ酸欠失に関し、次の命名法、即ち、原型アミノ酸／位置／アルタリスク（＊）が使用される。したがって、位置１９５におけるグリシンの欠失は「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表わされる。複数の欠失は、マーク（「＋」）を付加することによって区切られ、例えば、「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」となる。
【００３５】
挿入アミノ酸挿入に関し、次の命名法、即ち、アルタリスク（＊）／位置／小文字／挿入されたアミノ酸、が使用され、ここで小文字は、位置番号の下流にアミノ酸が付加されたことを示す。したがって、位置１０の下流におけるグルタミン酸（Ｅ）の挿入は「＊１０ａＥ」と表わされる。グルタミン酸（Ｅ）の後に、第２のアミノ酸、例えばバリン（Ｖ）が位置１０の下流に挿入される場合、「＊１０ａＥ＋＊１０ｂＶ」と表わされる。ポリペプチドのＮ末端への追加は０（ゼロ）で表わされる。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸へのグルタミン酸（Ｅ）及びバリン（Ｖ）の追加は、「＊０ａＥ＋＊０ｂＶ」と表わされる。
【００３６】
親キシログルカナーゼ
本発明において、親キシログルカナーゼは、（ａ）ファミリー４４のキシログルカナーゼとも呼ばれる、グルコシル加水分解酵素のファミリー４４に属するキシログルカナーゼ；若しくは（ｂ）配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択されるポリペプチド；又は（ｃ）配列番号３の成熟したポリペプチドと少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；あるいは（ｄ）少なくとも中度のストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の完全長の相補鎖、とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；又は（ｅ）配列番号１の成熟したポリペプチドコード配列と少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；のいずれかである。
【００３７】
第１の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号３の成熟したポリペプチドとの同一性の度合が、好ましくは少なくとも少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、更により好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％又は更に最も好ましくは少なくとも９９％である、キシログルカナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む（以後「相同性のあるポリペプチド」と呼ばれる）。一態様において、相同性のあるポリペプチドは、配列番号３の成熟したポリペプチドと、１０個のアミノ酸が異なる、好ましくは９個のアミノ酸が異なる、より好ましくは８個のアミノ酸が異なる、より好ましくは７個のアミノ酸が異なる、より好ましくは６個のアミノ酸が異なる、より好ましくは５個のアミノ酸が異なる、より好ましくは４個のアミノ酸が異なる、更により好ましくは３個のアミノ酸が異なる、最も好ましくは２個のアミノ酸が異なる、更に最も好ましくは１個のアミノ酸が異なる、アミノ酸配列を有する。
【００３８】
実質的に相同性のある親キシログルカナーゼは、１つ以上（いくつか）のアミノ酸改変、例えば置換、欠失、及び／又は挿入を有していてもよい。これらの変更は軽度のものであるのが好ましく、即ち、タンパク質又はポリペプチドの三次元的折りたたみ又は活性に有意に作用しない保守的なアミノ酸の置換及びその他の置換；典型的には約９個のアミノ酸、好ましくは１〜約１５個のアミノ酸、及び最も好ましくは１〜約３０個のアミノ酸である小さな欠失；及びアミノ末端又はカルボキシル末端の小さな伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基による伸長、最大約５〜１０個の残基、好ましくは１０〜１５個の残基、最も好ましくは２０〜２５個の残基の小さなリンカーペプチドによる伸長、又は精製を容易にする小さな伸長（親和性標識）、例えば、ポリヒスチジン区域又はタンパク質Ａである（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．４：１０７５；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３）。広くは、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５〜１０７も参照のこと。
【００３９】
上記の変更は軽度のものであるのが好ましいが、かかる変更は、アミノ末端又はカルボキシル末端の伸長として最大３００個以上のアミノ酸の大きなポリペプチドの融合などの実質的な性質のものであってもよい。
【００４０】
同類置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性のアミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び微小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群内のものである。一般に比活性度を変化させないアミノ酸の置換は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も普通に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００４１】
本発明のキシログルカナーゼポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニン−スキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜１０８５，１９８９）等の当該技術分野において既知の手段によって同定され得る。後者の技術において、単一のアラニン突然変異は、分子中の全ての残基に導入され、そして得られた突然変異分子は生物活性（即ち、キシログルカナーゼ活性）について検査され、該分子の活性に対して決定的なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８，１９９６も参照のこと。酵素又はその他の生物相互作用の活性部位は、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折、又は光親和性標識などの技術によって決定されるように、構造の物理分析によっても決定することが可能である。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６〜３１２，１９９２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４，１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９〜６４，１９９２を参照のこと。本発明によるポリペプチドに関連するポリペプチドとの同一性の分析から、必須アミノ酸の同一性を推論することもまた可能である。ファミリー４４のグルコシル加水分解酵素に属する酵素の結晶構造は、Ｋｉｔａｇｏ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８２：３５７０３〜３５７１１，２００７により刊行されている。この構造に基づいて、コンピュータによる親キシログルカナーゼ（配列番号３）の三次元構造体を作ることが可能である。公表された構造との比較を基に、配列番号３の以下の残基が、酵素機能Ｅ１８７（触媒−酸／塩基）、Ｅ３５８（触媒−求核剤）、Ｅ５６（Ｃａ２＋に配位結合するカルボキシレート基）、及びＤ１５４（Ｃａ２＋に配位結合するカルボキシレート基）にとって重要であることが同定された。したがって、好ましくはこれらの位置は、親酵素において変異すべきでない。
【００４２】
親キシログルカナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体、又はキシログルカナーゼ活性を有するそのフラグメントを含むのが好ましい。一態様において、親キシログルカナーゼは配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号２の成熟したポリペプチドを含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体、又はキシログルカナーゼ活性を有するそのフラグメントから成る。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号５のアミノ酸配列、若しくはその対立遺伝子変異体、又はキシログルカナーゼ活性を有するそのフラグメントを含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号７のアミノ酸配列、若しくはその対立遺伝子変異体、又はキシログルカナーゼ活性を有するそのフラグメントを含む。
【００４３】
配列番号３の成熟したポリペプチドのフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端からから欠失されているが、なおキシログルカナーゼ活性を有する１つ以上（いくつか）のアミノ酸を有するポリペプチドである。
【００４４】
第２の態様において、親キシログルカナーゼは、ストリンジェンシーが非常に低い条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中度のストリンジェンシー条件で、より好ましくは中の上のストリンジェンシー条件で、更により好ましくは高いストリンジェンシー条件で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件で、（ｉ）配列番号１、配列番号、又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のサブシーケンス、又は（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の完全長の相補鎖、とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。サブシーケンスは、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドのフラグメントをコードしてもよい。一態様において、相補鎖は、配列番号１若しくは配列番号４又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列の完全長の相補鎖である。
【００４５】
配列番号１、配列番号、４又は配列番号６の成熟したポリペプチドコード配列のサブシーケンス、又はその相同体は、１つ以上（いくつか）のヌクレオチドが５’末端／又は３’末端から欠失されており、サブシーケンスによってコードされるポリペプチドがキシログルカナーゼ活性を有するヌクレオチド配列である。
【００４６】
親酵素はまた、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体であってもよい。
【００４７】
異なる属又は種の株から、当該技術分野において周知の方法によって、親キシログルカナーゼをコードするＤＮＡを同定及びクローンするために、配列番号１、配列番号４、又は配列番号６のヌクレオチド、あるいはそのサブシーケンス、並びに配列番号３、配列番号５、又は配列番号７のアミノ酸配列又はそのフラグメントを、核酸プローブの設計に使用することが可能である。特に、かかるプローブは、所望の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡをハイブリダイズするために使用可能であり、その中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、続いて通常のサザンブロット法の手順が行なわれる。かかるプローブは全配列より大幅に短くてよいが、少なくとも１４、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、及び最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドの長さでなければならない。しかしながら、核酸プローブの長さが少なくとも１００ヌクレオチドであるのが好ましい。例えば、核酸プローブの長さは、少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであってもよい。さらに長いプローブ、例えば、長さが好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも９００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１１００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１２００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１３００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１４００ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも少なくとも１５００ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも１６００ヌクレオチドである核酸プローブを使用してもよい。ＤＮＡとＲＮＡの両方を使用することができる。プローブは、対応する遺伝子（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、又はアビジンを有する）を検出するために、通常標識化される。かかるプローブは本発明に包含される。
【００４８】
他の生物から得られゲノムＤＮＡライブラリーは、上記のプローブでハイブリダイズする、及び親キシログルカナーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。かかるその他の生物からのゲノム又はその他のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミド電気泳動、あるいはその他の分離技術によって分離され得る。ライブラリからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又はその他の好適な担体物質上に移動及び不動化されてもよい。配列番号１又はそのサブシーケンスと相同のクローン又はＤＮＡを同定するために、サザンブロット法において担体物質を用いる。本発明の目的上、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、低〜非常に高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１に示されるポリヌクレオチド、その相補鎖、又はそのサブシーケンスに対応する、標識化されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることを表す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルム又は当該技術分野において既知であるその他の検出手段を用いて検出され得る。
【００４９】
一態様において、核酸プローブは、配列番号１の成熟したポリペプチドコード配列である。別の態様において、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３である。別の態様において、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチド、又はそのサブシーケンスをコードするポリヌクレオチド配列である。別の態様において、核酸プローブは、配列番号１である。
【００５０】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブでは、ストリンジェンシーが非常に低い条件から非常に高い条件は、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍＬの断片化変性サケ精子ＤＮＡ、及び厳密性が非常に低い場合と低い場合には２５％のホルムアミド、ストリンジェンシーが中度である場合と中の上である場合には３５％のホルムアミド、ストリンジェンシーが高い場合と非常に高い場合には５０％のホルムアミド中、４２℃でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行った後に、標準的なサザンブロッティング手順を１２〜２４時間、最適に行うものとして定義する。
【００５１】
長さ少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブについて、担体物質は最終的に、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェント条件）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェント条件）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェント条件）、より好ましくは少なくとも６０℃（中〜高ストリンジェント条件）、更により好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェント条件）、最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェント条件）で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて各々１５分間、３回洗浄される。
【００５２】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブでは、ストリンジェンシー条件は、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１Ｘデンハルト溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸一ナトリウム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び１ｍＬ当たり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中、Ｂｏｌｔｏｎ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ４８：１３９０）に従う計算を用いて計算されるＴｍよりも約５℃〜約１０℃低い温度におけるプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄ポストハイブリダイゼーションを行った後に、標準的なサザンブロッティング手順を１２〜２４時間、最適に行うものとして定義する。
【００５３】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブについて、担体物質を６Ｘ ＳＣＣ、０．１％ＳＤＳで１５分間一度洗い、計算されたＴｍよりも約５℃〜約１０℃低い温度でそれぞれ１５分間２回洗う。
【００５４】
第３の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号１の成熟したポリペプチドコード配列との同一性の度合が、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び更に最も好ましくは９６％、９７％、９８％、又は９９％である、活性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。一態様において、成熟したポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３である。
【００５５】
親キシログルカナーゼは、あらゆる属の微生物から得ることができる。一態様において、親キシログルカナーゼは細胞外に分泌される。
【００５６】
更なる態様において、親キシログルカナーゼは細菌キシログルカナーゼであってもよい。例えば、キシログルカナーゼは、好ましくはペニバチルス属、特にパエニバチルス・ポリミクサ、例えば、パエニバチルス・ポリミクサ、ＡＴＣＣ ８３２からの種からの、好ましくはバチルス／ラクトバチルス細分からのバチルス等のグラム陽性細菌ポリペプチドであってもよく、好ましくはキシログルカナーゼは、例えばＷＯ ０１／６２９０３に記載のファミリー４４のキシログルカン、より好ましくは配列番号５のキシログルカナーゼ、最も好ましくは配列番号２のキシログルカナーゼ、又はその成熟したポリペプチドである。
【００５７】
変異体の生成
親キシログルカナーゼの変異体は、ランダムな及び／又は部位特異的な突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム変異導入法、シャッフル等などの、当該技術分野において既知である任意の突然変異誘発手段に従って調製することができる。
【００５８】
合成遺伝子構築は、目的のポリペプチド分子をコードする設計されたポリヌクレオチド分子の体外合成を必要とする。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ，ｅｔ．ａｌ．，（Ｔｉａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０〜１０５４）に記載されるマルチプレックスなマイクロチップに基づく技術及び同様の技術などの、多くの技術を利用して実施することができ、オリゴヌクレオチドは、フォトプログラム可能なマイクロ流体チップ上で合成され、かつアセンブルされる。
【００５９】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、及び／若しくは部位特異的な突然変異誘発、並びに／又はランダム変異導入法、及び／あるいはシャッフルの側面を組合せることによって達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされた、合成されるポリヌクレオチドのフラグメントを利用する工程によって典型的に象徴される。こうして、遺伝子の規定領域を新たに合成することができる一方で、その他の領域は、部位特異的な突然変異誘発プライマーを用いて増幅されることができ、また、更に他の領域には、変異性のＰＣＲ又は非変異性のＰＣＲ増幅を施すことができる。次に、ポリヌクレオチドのフラグメントはシャッフルされてもよい。
【００６０】
部位特異的な突然変異誘発は、親キシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチド分子の規定部位において１つ又はいくつかの突然変異が作られる技術である。この技術は、生体外又は生体内で行われ得る。
【００６１】
部位特異的な突然変異誘発は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによって、生体外で達成され得る。部位特異的な突然変異誘発はまた、親キシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドの部位の制限酵素による切断、及びそれに続く、ポリヌクレオチド中の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーション、を伴うカセット式変異誘発によって、生体外で実施され得る。通常、このプラスミド及びオリゴヌクレオチドで消化する制限酵素は同じであり、プラスミドの付着末端及び互いをライゲートするためのインサートを可能にする。好適な技術の更なる説明に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄｓ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ」．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９０），及びＷＯ９６／３４９４６；Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９〜４９５５；並びにＢａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：７３４９〜４９６６を参照する。
【００６２】
リガーゼ反応の後、ライゲーション混合物を使用して宿主細胞を形質転換してもよく、クローニングの目的では、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．に記載のように、多くの場合は大腸菌細胞が使用される。形質転換された大腸菌細胞を液体媒体中又は固体寒天平板上で増殖させることができ、形質転換された細胞からプラスミドをレスキューして、枯草菌細胞を形質転換ために用いることができる。ＭＢ１５１０、１６８誘導体（例えば、ＢＧＳＣから受入番号１Ａ１ １６８ ｔｒｐＣ２で入手可能）などの好適な形質転換受容性のあるバチルス細胞を、ＷＯ ０３／０９５６５８に記載の通りに形質転換することができる。ライブラリー構築用の大腸菌プラスミド由来の組込みカセットを、バチルス形質転換に使用してもよい。この方法は、ＷＯ ０３／０９５６５８に詳細に説明がなされている。あるいは、生体外で増幅されたＰＣＲ−ＳＯＥ生成物（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７，１０５６）を使用してもよい。
【００６３】
部位特異的な突然変異誘発は、当該技術分野において既知の方法によって生体内で達成され得る。例えば、米国特許出願第２００４／０１７１１５４合；Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：７７３〜７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５〜２９０；ａｎｄ Ｃａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５〜１６を参照のこと。
【００６４】
本発明では、任意の部位特異的な突然変異誘発手段を用いることができる。親キシログルカナーゼの変異体を調製するために使用することができる多くの市販のキットが入手可能である。
【００６５】
単一又は多重アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入は、突然変異誘発、組み換え、及び／又はシャッフルのための既知の方法、その後の、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３〜５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２〜２１５６；ＷＯ ９５／１７４１３；又はＷＯ ９５／２２６２５に開示されているもののような関連スクリーニング手順、を用いて実施及び試験されることがでる。使用可能なその他の方法には、変異性ＰＣＲ、ファージ提示法（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２〜１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ ９２／０６２０４）及び領域直接的突然変異（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，遺伝子４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ７：１２７）が挙げられる。
【００６６】
上述の突然変異誘発／シャッフル方法は、ハイスループットの自動スクリーニング方法と組み合わされて、上述のように宿主細胞、例えばバチルスによって発現されるクローン化された突然変異ポリペプチドの活性を検出することができる。キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする突然変異したＤＮＡ分子を宿主細胞から回収して当該技術分野で標準の方法を用いて迅速にシーケンスすることが可能である。
【００６７】
変異体
本発明において、親キシログルカナーゼの単離された変異体は、位置番号６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５、３６６、１、３７４、７、１４０、８、１４、２１、２１１、３７、４５、１３、７８、８７、４３６、１０１、１０４、１１１、３０６、１１７、１１９、４１４、１３９、２６８、１４２、１５９、１６４、１０２、１６８、１７６、１８０、４８２、１８３、２０２、２０６、２１７、４、２２２、１９、２２４、２２８、２３２、２、２４０、２４４、５、２４７、２４９、３２８、２５２、２５９、４０６、２６７、２６９、２７５、１７９、１６６、２７８、２８１、２８８、２９８、３０１、１８、３０２、１６５、８０、３０３、３１６、１６９、３２２、１２０、１４６、３４２、３４８、１４７、３５３、３８０、４６８、３８２、３８３、３８、３８４、３８９、３９１、１０、３９２、３９６、１７７、３９７、３９９、４０９、２３７、４１３、２５３、４１５、４１８、４０、４４３、４４５、１４８、４４９、２２５、４５０、４５４、３、４５５、４５６、２９９、４６１、４７０、２０４、４７６、４８８、３４７、及び５０７からなる群から選択される１つ以上（いくつか）における改変を含み、ここで、キシログルカナーゼ活性を有する変異体は、親キシログルカナーゼのアミノ酸配列との同一性の度合が少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも約９７％、最も好ましくは少なくとも９８％、及び更により好ましくは９９％であるアミノ酸配列を含む。位置の番号付けは、配列番号３のアミノ酸配列に関連している。好ましくは、上記で特定した位置の１つ以上における改変を含む変異体は、親キシログルカナーゼと比べて、洗剤、好ましくは液体洗剤中での増加した安定性を有する。
【００６８】
好ましい実施形態において、変異体は、改変の次の組合せの１つ以上（いくつか）のを含む。
Ｖ１＊＋Ｖ２＊＋Ｈ３＊；
Ｖ１Ｑ＋＊１ａＥ＋＊１ｂＶ；
Ｈ３Ａ；
Ｈ３Ａ＋Ｈ４３６Ａ；
Ｋ８Ａ，Ｑ，Ｓ；
Ｔ９Ｄ；
Ｔ９Ｄ＋Ｌ３４Ｆ＋Ａ８３Ｅ＋Ｑ１４９Ｅ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｓ３３２Ｐ＋Ｒ３４０Ｔ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｙ７３Ｆ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ＋Ｅ４８９Ａ＋Ａ４９０Ｖ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｔ３２０Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１５３Ｋ＋Ｒ１５６Ｑ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｄ４２０Ｇ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｑ＋Ｖ１５９Ａ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｙ５３Ｈ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｔ１７２Ｖ＋Ａ１７７Ｔ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｋ１３Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１３Ａ＋Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１３Ａ，Ｒ；
Ｋ１８Ｒ；
Ｒ２０Ａ；
Ｋ２１Ｑ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ２１Ｑ，Ｒ，Ｔ；
Ｑ３２Ｈ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｒ４９Ｇ＋Ｄ６５Ｅ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｋ２０２Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ；
Ｄ３３Ｖ＋Ｑ６８Ｈ＋Ｎ１６８Ｈ＋Ｖ４５０Ｉ；
Ｌ３４Ｆ，Ｉ，Ｍ，Ｖ；
Ｌ３４Ｉ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｄ３７Ｇ，Ｎ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｅ３８Ｉ，Ｖ；
Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１５３Ｋ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｅ４８９Ａ＋Ａ４９０Ｖ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｍ４０Ｖ；
Ｌ４５Ｉ；
Ｑ６８Ｈ，Ｍ，Ｎ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｓ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２７４Ｄ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１２９Ａ，Ｔ＋Ｒ１５６Ｋ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｓ７６Ｗ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｓ，Ｖ，Ｙ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｎ＋Ｄ９７Ｎ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｓ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２７４Ｄ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｅ４４６Ｋ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｎ３３１Ｈ，Ｋ，Ｑ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１４０Ｆ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｄ３２４Ｎ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｌ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ，Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｓ１２３Ｐ，Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｓ４８４Ｃ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｓ７６Ｅ，Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ｗ；
Ｓ７６Ｗ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｓ７６Ｗ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｇ７８Ａ，Ｎ，Ｓ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｌ８０Ｖ；
Ａ８３Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｙ；
Ｋ８７Ｑ；
Ｋ８７Ｖ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｔ９２Ｉ，Ｖ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１０１Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１０１Ｒ；
Ｋ１０１Ｒ＋Ｌ１０２Ｉ；
Ｔ１０４Ａ＋Ｐ１１１Ｑ＋Ａ１１７Ｓ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｐ１１１Ｑ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｆ１４６Ｌ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ＋Ｎ３９９Ｉ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１１８Ａ，Ｒ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｄ１１９Ｌ；
Ｇ１２０Ａ；
Ｓ１２３Ｐ，Ｔ；
Ｓ１２３Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ，Ｆ，Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｓ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１７６Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ２７５Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ４４５Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｖ１３９Ｋ＋Ｎ１４０Ｆ＋Ｑ１４７Ｓ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ１７７Ｔ＋Ｖ１７９Ｉ＋Ａ１８３Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ３２８Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ２４７Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ２４９Ｇ，Ｎ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３０３Ｉ，Ｋ，Ｓ，Ｖ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３２４Ｎ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３６６Ｈ＋Ｔ３７４Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ４６１Ｎ，Ｑ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｅ２８８Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２０４Ｔ＋Ｒ２１１Ｋ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１６４Ｎ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ４３６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｉ１０Ｖ＋Ｖ１４Ｉ＋Ｄ１９Ｅ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｖ２３２Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１７６Ｐ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ２７５Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ３２２Ｉ＋Ｋ４５４Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４０６Ｎ＋Ｎ４１５Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４５４Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｌ３８０Ｆ＋Ｎ３８３Ｙ＋Ｄ３８４Ｇ＋Ｎ３８９Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ２９８Ｆ＋Ｅ２９９Ｎ＋Ｇ３０１Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３０２Ｋ＋Ｄ３０３Ｌ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｐ５０７Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｒ２６７Ｈ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｒ４０９Ｌ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｓ４４３Ｄ＋Ｋ４４５Ｓ＋Ｌ４４９Ｉ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｓ４５５Ｎ＋Ｍ４５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｔ２４４Ｄ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｖ１５９Ｍ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｆ１６５Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｖ２５９Ｉ＋Ｒ２６７Ｋ＋Ｌ２６８Ｋ＋Ｓ２６９Ａ；
Ｑ１３７Ｄ，Ｅ；
Ｎ１４０Ｆ；
Ｋ１４２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｆ１４６Ｃ＋Ｈ１６４Ｃ；
Ｆ１４６Ｋ，Ｌ；
Ｆ１４６Ｌ＋Ｋ３２２Ｉ；
Ｌ１４８Ｋ＋Ｎ１６８Ｄ；
Ｑ１４９Ｅ；
Ｒ１５６Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｖ１５９Ｍ；
Ｈ１６４Ａ，Ｎ；
Ｌ１６６Ｉ；
Ｎ１６８Ｄ；
Ｋ１６９Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ１７６Ｐ；
Ａ１７７Ｅ，Ｔ；
Ｋ１８０Ｒ；
Ｈ１９３Ａ，Ｄ，Ｓ，Ｔ；
Ｒ１９７Ａ，Ｌ；
Ｈ１９９Ａ；
Ｇ２００Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｋ２０２Ｎ，Ｑ，Ｒ；
Ｓ２１４Ｅ；
Ｋ２１７Ａ；
Ａ２２１Ｋ；
Ｇ２２５Ｓ；
Ｖ２３２Ａ；
Ｇ２３７Ａ，Ｓ，Ｖ；
Ｋ２４０Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ２５２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｇ２５３Ａ；
Ｒ２６７Ａ；
Ｌ２６８Ｉ；
Ｋ２７５Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｌ２７８Ｉ；
Ｆ２８１Ｌ；
Ｍ２９０Ｒ；
Ｒ２９５Ａ；
Ｋ３０６Ａ，Ｒ；
Ｋ３０７Ｑ；
Ｍ３１０Ｉ，Ｌ，Ｖ；
Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３９９Ｉ；
Ｒ３１４Ａ；
Ｇ３１６Ｉ；
Ｋ３２２Ａ，Ｒ；
Ｄ３２４Ｎ；
Ｎ３３１Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｓ３３２Ｍ，Ｐ；
Ｓ３３２Ｐ＋Ｖ３９７Ｉ；
Ｒ３４０Ａ，Ｎ，Ｔ；
Ｋ３４２Ａ；
Ｖ３４５Ｉ；
Ｋ３４７Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｄ３４８Ｇ；
Ｋ３５３Ｑ，Ｒ；
Ｄ３６６Ｈ；
Ｍ３７３Ｑ；
Ｔ３７４Ａ；
Ｌ３８０Ｆ；
Ｋ３８２Ａ；
Ｎ３８３Ｙ；
Ｎ３８９Ａ，Ｆ，Ｎ，Ｖ；
Ｗ３９１Ｖ；
Ｋ３９２Ｇ，Ｑ；
Ｄ３９５Ｇ；
Ｇ３９６Ｐ；
Ｖ３９７Ｓ；
Ｎ３９９Ｉ；
Ｋ４０６Ｎ；
Ｇ４１３Ａ，Ｓ；
Ｋ４１４Ａ；
Ｎ４１５Ｓ；
Ｔ４１７Ｋ；
Ｆ４１８Ｉ；
Ｖ４３１Ｅ；
Ｈ４３６Ａ；
Ｎ４４１Ｇ＋Ａ４４２Ｅ＋Ｓ４４３Ｄ；
Ｓ４４３Ｅ，Ｋ，Ｑ；
Ｋ４４５Ａ，Ｒ，Ｓ；
Ｋ４４５Ｃ＋Ｋ４７０Ｃ；
Ｈ４４８Ａ；
Ｋ４５４Ｒ；
Ｓ４６７Ｒ＋Ｇ４６８Ｓ＋Ａ４６９Ｔ；
Ｇ４６８Ｓ，Ｙ；
Ｋ４７０Ｐ，Ｒ，Ｔ；
Ｉ４７３Ｔ；
Ｋ４７６Ｑ；
Ｋ４８２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ４８８Ａ，Ｑ，Ｒ，Ｔ；
Ａ４９０Ｒ；
Ｇ４９８Ａ，Ｄ，Ｓ；
Ｒ５００Ａ，Ｔ，Ｖ；
Ｈ５１２Ａ；
Ｔ５１７Ａ＋Ｇ５１８Ｄ；又は
Ｇ５１８Ｄ。
【００６９】
一態様において、本発明の変異体のアミノ酸改変の数は、好ましくは総数で５５、好ましくは５２、より好ましくは５０、より好ましくは４０、より好ましくは３０、より好ましくは２０、より好ましくは１５、より好ましくは１０、より好ましくは９、より好ましくは８、更により好ましくは７、更により好ましくは６、更により好ましくは５、更により好ましくは４、更により好ましくは３、及び最も好ましくは２つの改変、及び最も好ましくは１つの改変を含む。別の態様において、改変の総数は１、好ましくは２、より好ましくは３、更により好ましくは４、更により好ましくは５、更により好ましくは６、更により好ましくは７、更により好ましくは８、更により好ましくは９、最も好ましくは１０である。改変は、ｉ）この位置を占めるアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、ｉｉ）この位置を占めるアミノ酸の欠失、又はｉｉｉ）この位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸での置換、の形態であり得る。改変は互いに独立して行われてもよく、例えば、親キシログルカナーゼと比較した場合に、第１の位置では挿入が存在してもよく、第２の位置では置換が存在し、第３の位置では欠失が存在する。好ましい実施形態において、変異体は置換のみを含む。
【００７０】
本発明の一態様において、変異を起こすべき位置はコンセンサス配列分析に基づいて特定される。分析は、配列番号３を、配列番号５及び配列番号７、並びに、配列番号３のファミリー４４グリコシドヒドロラーゼ領域と３０％同一であるＵｎｉＰｒｏｔデータベースからのその他の配列とアラインメントすることによって実施される。得られたコンセンサス配列が図１に示されている。コンセンサス配列１はアラインメントからの所定の位置に最も豊富なアミノ酸を含む配列であり、コンセンサス配列２は所定の位置に２番目に豊富なアミノ酸を含む配列であり、以下同様である。本発明の一態様において、配列番号３の１つ以上（いくつか）の残基は、コンセンサス配列１若しくはコンセンサス配列２又はコンセンサス配列３あるいはコンセンサス配列４からの対応する残基によって置換される。本発明の一態様において、変異体は、位置番号１０、１９、６８、８０、８９、１０４、１１１、１１７、１２３、１２９、１３７、１３９、１４０、１４７、１５６、１５９、１６４、１６５、１７７、１７９、１８３、２００、２０４、２１１、２２２、２２４、２２５、２２８、２３２、２５９、２６７、２６８、２６９、２８１、３２８、３４５、３６６、３７４、３８０、３８３、３８４、４０６、４１５、４３６、４４３、４４５、４４９、４５０、４５５、４５６、４８８及び５０７からなるコンセンサス配列分析によって特定された５２の位置の群から選択される１つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。好ましい実施形態において、改変は、Ｉ１０Ｖ、Ｄ１９Ｅ、Ｑ６８Ｈ、Ｌ８０Ｖ、Ｇ８９Ａ、Ｔ１０４Ａ、Ｐ１１１Ｑ、Ａ１１７Ｓ、Ｓ１２３Ｐ、Ｋ１２９Ｔ、Ｑ１３７Ｅ、Ｖ１３９Ｋ、Ｎ１４０Ｆ、Ｑ１４７Ｓ、Ｒ１５６Ｙ、Ｖ１５９Ｍ、Ｈ１６４Ｎ、Ｆ１６５Ｙ、Ａ１７７Ｔ、Ｖ１７９Ｉ、Ａ１８３Ｓ、Ｇ２００Ｐ、Ｇ２０４Ｔ、Ｒ２１１Ｋ、Ｉ２２２Ｖ、Ａ２２４Ｐ、Ｇ２２５Ｓ、Ｖ２２８Ｉ、Ｖ２３２Ａ、Ｖ２５９Ｉ、Ｒ２６７Ｋ、Ｌ２６８Ｋ、Ｓ２６９Ａ、Ｆ２８１Ｌ、Ａ３２８Ｇ、Ｖ３４５Ｉ、Ｄ３６６Ｈ、Ｔ３７４Ａ、Ｌ３８０Ｆ、Ｎ３８３Ｙ、Ｄ３８４Ｇ、Ｋ４０６Ｎ、Ｎ４１５Ｇ、Ｈ４３６Ｙ、Ｓ４４３Ｄ、Ｋ４４５Ｓ、Ｌ４４９Ｉ、Ｖ４５０Ｉ、Ｓ４５５Ｎ、Ｍ４５６Ｙ、Ｋ４８８Ｔ及びＰ５０７Ａからなる群から選択される置換、又はいくつかの置換である。
【００７１】
本発明の別の態様において、変異体は、正電荷を有し、かつ２０オングストロームのカルシウムイオン内に位置する親のペプチドのミノ酸を、中性又は負に荷電されるアミノ酸に変更することによって生成される。本発明の好ましい変異体は、カルシウムイオンからの２０オングストローム以内の総電荷がより負にされている変異体を包含する。そのような変異体においては、正に荷電されたアミノ酸は、その適用条件下で中性又は負に荷電されるアミノ酸で置換されている。従って、好ましい変異体は、「化学安定性」条件又は適用条件下で部分的に又は十分に正に荷電されるアミノ酸残基、即ち負又は中性のアミノ酸で置換されたＬｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓを有していてもよい。好ましい置換アミノ酸は、Ａｓｐ及びＧｌｕのように負に荷電されているアミノ酸、又はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅのように中性のアミノ酸であり得る。本発明の好ましい変異体は、位置番号４９、８７、１１８、１２９、１３４、１４２、１５６、１６９及び１９７からなる群から選択される１つ以上の位置の改変を含む。好ましい実施形態において、改変は、位置番号８７、１１８、１２９、１３４、１４２、１５６、及び１６９からなる群から選択される１つ以上の位置における置換である。好ましい実施形態において、置換は、Ｋ８７Ａ；Ｋ１２９Ａ，Ｓ，Ｆ，Ｉ；Ｋ１１８Ａ；Ｋ１４２Ａ，Ｑ、Ｒ１５６Ｙ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｗ，Ｌ，Ｍ及びＫ１６９Ｑ，Ａからなる群から選択される。
【００７２】
一態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、７６、又は３３１に対応する１つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。好ましくは、変異体は、位置６８の置換と、位置番号１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５及び３６６からなる群から選択される１つ以上の追加位置の１つ以上の置換とを含む。
【００７３】
別の態様において、変異体は、位置１５６の置換と、位置番号１０、１３、１４、１９、３７、６８、７８、９２、１１８、１２３、１２９、１３７、１３９、１４０、１４７、１５９、１６４、１６５、１６９、１７６、１７７、１７９、１８３、２００、２０４、２１１、２２２、２２４、２４４、２４７、２４９、２５９、２６７、２６８、２６９、２７５、２８８、２９９、３０１、３０２、３０３、３１０、３２４、３２８、３３１、３６６、３８０、３８３、３８４、３８９、４０６、４０９、４１５、４３６、４４３、４４５、４４９、４５０、４５４、４５５、４５６、４６１、４７０及び５０７からなる群から選択される１つ以上の追加位置の１つ以上の置換とを含む。
【００７４】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、７６、又は３３１に対応する２つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。好ましくは、変異体は、位置６８、１２３、１５６、１１８、２００、又は１２９の置換を含む。更により好ましくは、変異体は、位置１２９及び位置１５６の置換を含む。
【００７５】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する３つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００７６】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する４つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００７７】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する５つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００７８】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する６つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００７９】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８又は１２３又は１５６又は１１８又は２００又は１２９又は１３７又は１９３又は９２又は７６又は３３１に対応する７つ以上（いくつか）の位置の改変を含む。
【００８０】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置１２９及び１５６及び３３１及び２００及び１１８に対応する位置の改変を含む。
【００８１】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、位置６８及び１２９及び１５６及び３３１及び２００及び１１８に対応する位置の改変を含む。
【００８２】
別の態様において、親キシログルカナーゼの変異体は、６８及び９２及び１２９及び１５６及び３３１及び２００及び１１８に対応する位置の改変を含む。
【００８３】
別の態様において、変異体は、Ｑ６８Ｈ，Ｎ，Ｌ；Ｓ１２３Ｐ，Ｔ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｗ，Ｌ，Ｍ；Ｋ１１８Ａ，Ｒ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ，Ｓ，Ｄ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ，Ｓ；Ｑ１３７Ｅ；Ｈ１９３Ｔ，Ｓ，Ｄ；Ｔ９２Ｖ，Ｉ，Ａ，Ｓ；Ａ８３Ｅ；Ｑ１４９Ｅ；Ｌ３４Ｆ，Ｉ，Ｖ；Ｒ３４０Ｔ，Ｎ；Ｓ３３２Ｐ；Ｔ９Ｄ；Ｓ７６Ｗ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｔ；Ｎ３３１Ｆ，Ｃ；Ｍ３１０Ｉ，Ｖ，Ｌ；Ｄ３２４Ｎ；Ｇ４９８Ａ，Ｄ；Ｄ３９５Ｇ及びＤ３６６Ｈからなる群から選択される１つ以上（いくつか）の置換を含む。好ましくは、置換は、Ｑ６８Ｈ；Ｓ１２３Ｐ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；Ｋ１１８Ａ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ；Ｑ１３７Ｅ；Ｈ１９３Ｔ；Ｔ９２Ｖ及びＮ３３１Ｆからなる群から選択される。より好ましくは、置換は、Ｑ６８Ｈ；Ｓ１２３Ｐ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；Ｋ１１８Ａ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ；Ｑ１３７Ｅ；Ｔ９２Ｖ及びＮ３３１Ｆからなる群から選択される。より好ましくは、変異体は、９若しくは８、７、６、５、４、３、２、又は１つの位置の置換を含有し、ここで置換は、Ｑ６８Ｈ；Ｓ１２３Ｐ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；Ｋ１１８Ａ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ；Ｑ１３７Ｅ；Ｔ９２Ｖ及びＮ３３１Ｆからなる群から選択される。
【００８４】
更なる態様において、変異体は、以下の置換の組合せの１つ以上（いくつか）を含む。
Ｑ６８Ｈ
Ｓ１２３Ｐ
Ｒ１５６Ｙ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｓ１２３Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１２９Ｔ＋Ｒ１５６Ｋ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｓ１２３Ｐ，Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
【００８５】
好ましい実施形態において、上記変異体の全ては、グルコシル加水分解酵素のファミリー４４に属する親キシログルカナーゼの変異体であり、より好ましくは、親キシログルカナーゼは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一性を有するキシログルカナーゼから選択される、より好ましくは、親キシログルカナーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群から選択され、最も好ましくは、親キシログルカナーゼは配列番号３から成る。
【００８６】
組成物
本発明はまた、本発明の変異体キシログルカナーゼ、又はキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物に関する。組成物はかかる変異体又はポリペプチドに濃縮される。用語「濃縮」とは、組成物のキシログルカナーゼ活性が増加して濃縮係数が１．１以上になることを指す。好ましくは、組成物は、薄い色、少ない臭気、及び許容可能な貯蔵安定性などの望ましい特徴を提供するために製剤化される。
【００８７】
組成物は、本発明の変異体又はポリペプチドを主要酵素成分、例えば、１成分組成物として含むことができる。あるいは、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペロキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼ、などの複数の酵素活性を含むことができる。
【００８８】
ポリペプチド組成物は当該技術分野において既知の方法にしたがって調製することが可能であり、液体又は乾燥製剤の形態であってもよい。例えば、ポリペプチドは粒子又は微粒子の形態で製剤化されてもよい。組成物に含まれる変異体又はポリペプチドは、当該技術分野において既知の方法に従って安定させる。好ましい実施形態において、変異体キシログルカナーゼは液体組成物中で製剤される。
【００８９】
使用
本発明はまた、キシログルカナーゼ変異体の使用方法を目的とする。
【００９０】
変異体キシログルカナーゼは、好ましくは、洗剤組成物、例えば洗濯洗剤組成物、例えば家庭用洗濯洗剤組成物、特に液体洗濯洗剤組成物に組み込まれる及び／又はこれらと共に使用される。洗剤組成物は、典型的には、界面活性剤（アニオン性、カチオン性、非イオン性、双性イオン性、両性）、ビルダー、漂白剤、ポリマー、その他の酵素、及びその他の成分、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１３０５６２及びＷＯ２００７／１４９８０６に記載されているようなものなどの、従来の洗剤成分を含む。
【００９１】
洗剤組成物は、固体、液体、ゲル、又はこれらの任意の組合せなどの任意の形態であることができ、好ましくは、組成物は液状であり、好ましくは液体洗濯洗剤組成物である。
【００９２】
本発明の一態様は、布地又は衣類に、毛羽立ち除去及び／若しくは布地の柔軟性並びに／又は色彩澄明化及び／あるいは汚れの除去及び／又汚れの再付着防止及び／又は染料移行防止効果を付与するために、本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物を洗剤組成物と共に使用することである。
【００９３】
更に、本発明は、洗剤組成物と、本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物とを含有する洗浄液で布地を処理することを含む、布地の洗濯方法に関する。洗濯処理は、例えば、機械洗濯方法又は手作業での洗濯方法で行われ得る。洗浄液は、例えば、洗剤組成物を含有し、かつｐＨが３〜１２である水性洗浄液であり得る。
【００９４】
洗浄及び使用中、布地又は衣類の表面は従来、色あせた及び擦り切れた外観を布地に与える可能性のあるちぎれた又はほどけた繊維片で汚れる。これら表面の繊維を布地から除去することにより、布地の元の色及び見た目を部分的に復元して、色彩澄明化及び改良された外観をもたらす。本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物は、１回の又は複数の（繰り返し行われる）洗浄サイクルで用いることによって、色彩澄明化及び／又は改良された外観を提供するために使用され得る。
【００９５】
更に、織物の表面から突き出る微小繊維は、寄り集まって、表面にくっついて布地の外観に支障を来たす、いわゆる毛玉又は毛羽と呼ばれる小さな球状になり得る。本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物は、かかる毛玉を除去するために使用することができ、毛羽立ち除去と呼ばれる効果がある。
【００９６】
色彩澄明化及び毛羽立ち除去は、テストグループのパネルを用いて目視検査によって評価される。効果は、光反射によって、又は光学的測定を用いた綿の毛羽の測定によって、測定される。これらの方法は、一般に当該技術分野において既知であり、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒにより発行されたＥｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｃｙ，１９９７，ｐａｇｅ １３９〜ｐａｇｅ １４０に簡潔に説明されている。
【００９７】
特に洗浄サイクルの回数が増加すると、粒子状の汚れ、可溶性の汚れ、染料及び顔料、並びに不溶性塩類を含むことができる堆積物が、織物の繊維表面上に蓄積する。これは、例えば布地の灰色がかった又は黄色がかった外観の原因となる、洗浄処理の知覚されるクリーニング性能の目に見える劣化をもたらす可能性がある。これは、本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物を洗浄サイクルにおいて用いることによって防止することができる。この効果は、抗再付着、若しくは染料移行防止、又は汚れ除去と呼ばれ、光学的測定によって評価することができる。
【００９８】
布地の表面上、及び繊維の間に捕捉された汚れ粒子又は不溶性塩類粒子は、布地の硬化の原因となり得る。洗浄サイクルに本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物を含ませることにより、布地を柔らかくすることができる。
【００９９】
本発明の方法が施される布地は、従来の洗濯可能な洗濯物、例えば家庭の洗濯物であってもよい。好ましくは、洗濯物の大部分は衣類及び布地であり、綿、綿との混紡、又は天然若しくは人造セルロース（例えば木材パルプ起源）あるいはこれらのブレンドから製造されるニット、織布、デニム、紡ぎ糸、及びタオルを含む。ブレンドの例は、綿又はレーヨン／ビスコースと、１種類以上のコンパニオン材料、例えば、ウール、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ウレタン系繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）、及びセルロース含有繊維（例えばレーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻／亜麻布、黄麻、セルロースアセテート繊維、リオセル）とのブレンドである。
【０１００】
本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物を含有する洗剤溶液で布地及び／又は衣類を処理すると、例えば、新しい繊維及び／若しくは布地並びに／又は衣類の製造に関連して、及び使い古した布地及び／又は衣類の洗濯中、例えば、家庭での洗濯工程中に又は企業での洗濯工程において、意味があることが認識されている。
【０１０１】
本発明のキシログルカナーゼ変異体又はキシログルカナーゼ変異体組成物の用量、及び洗剤溶液の組成物及び濃度等の組成物が使用される際のその他の条件は、当該技術分野において既知の方法に基づいて決定されてもよい。
【０１０２】
キシログルカナーゼは、セルロース又はヘミセルロースの誘導体を含有する汚れの除去、抗再付着の強化、及び汚れ放出の改善をもたらすために、本発明の組成物中で使用され得る。キシログルカンはまた、後続洗濯工程中に綿に汚れ放出効果を付与するために、本発明の組成物中で使用され得る。汚れ放出効果は、綿織物、及び相当量の綿を含むあらゆる種類の布地、例えば、綿と合成繊維（例えばポリエステル、Ｎｙｌｏｎ（商標）等のポリアミド、及びエラステイン）とのブレンド、に認められる。
【０１０３】
洗濯洗剤組成物
本発明の洗濯洗剤組成物は、親キシログルカナーゼの単離変異体を含む。親キシログルカナーゼの単離変異体は、上記にてより詳細に説明がなされている。組成物は、好ましくは、特定の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーを含む。組成物は、好ましくは、洗浄性界面活性剤、好ましくは低濃度の洗浄性界面活性剤を含む。特定の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーについては、以下に詳しく記述される。洗浄性界面活性剤については、下記に詳しく記述される。組成物は、好ましくは、ランダムグラフトコポリマーを含む。好適なランダムグラフトコポリマーについては、以下に詳しく記述される。
【０１０４】
好ましくは、この組成物は、次の一般構造：ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（ＣＨ３）−Ｎ＋−ＣｘＨ２ｘ−Ｎ＋−（ＣＨ３）−ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（式中、ｎは２０〜３０であり、かつｘは３〜８である）を有する化合物、又はこの硫酸化若しくはスルホン化変異体を含む。
【０１０５】
好ましくは、組成物は、香料マイクロカプセルを含み、好ましくは、香料はメラミンホルムアルデヒドのフィルムに封入される。
【０１０６】
洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％、更には約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色相剤を含む。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色相剤を含んでもよく、これは、組成物が単位用量小袋の形態である場合に特に好ましい。
【０１０７】
この洗濯洗剤組成物は、固体、液体、ゲル、又はこれらの任意の組合せなど、任意の形態であり得る。組成物は、錠剤又は、多区画小袋などの小袋の形態であってもよい。この組成物は、自由流動性粉末の形態であってもよく、例えば、凝集体、スプレードライ粉末、カプセル、押出成形品、針状、ヌードル状、フレーク状、又はこれらの任意の組合せなどであり得る。しかしながら、最も好ましくは、この組成物は液体の形態である。加えて、この組成物は等方性又は異方性のいずれかの形態である。好ましくは、この組成物、又は少なくともその一部分は、層状相である。
【０１０８】
この組成物は、好ましくは、例えば、０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは５重量％、好ましくは〜４重量％、若しくは〜３重量％、又は〜２重量％、あるいは〜１重量％の低濃度の水を含む。これは特に、組成物が小袋の形態である場合、典型的には少なくとも部分的に、好ましくは完全に、水溶性フィルム内に封止されている場合に望ましい。水溶性フィルムは好ましくはポリビニルアルコールを含む。
【０１０９】
この組成物は、硬化ヒマシ油などの構造剤を含み得る。本発明の組成物に特に有用な、１つの好適な構造剤のタイプは、非高分子の（従来のアルコキシル化を除く）結晶性ヒドロキシ官能材質である。これらの構造剤は典型的に、液体マトリックス全体に、互いにライゲーションした糸状の分子間ネットワークを形成し、典型的にはそのマトリックス内でその場で結晶化する。好ましい構造剤は、結晶性のヒドロキシル含有脂肪酸、脂肪酸エステル、又は脂肪酸ろうである。好ましい構造剤は典型的に、次の式を有するものから選択される。
【化１】
【０１１０】
好ましい結晶性ヒドロキシル含有構造剤の具体的な例には、ヒマシ油及びその誘導体が挙げられる。特に好ましいものは、硬化ヒマシ油及び水素添加キャスター蝋などの硬化ヒマシ油誘導体である。市販のヒマシ油系結晶性ヒドロキシル含有構造剤には、Ｒｈｅｏｘ，Ｉｎｃ．（現Ｅｌｅｍｅｎｔｉｓ）製のチキシン（THIXCIN）が挙げられる。
【０１１１】
この組成物は更に、好ましくは、酸性構成成分を中和するためのアルカノールアミンを含む。好適なアルカノールアミンの例には、トリエタノールアミン及びモノエタノールアミンがある。これは、組成物がホウ酸又はその誘導体（例えば、ボロン酸）などのプロテアーゼ安定剤を含む場合に、特に好ましい。好適なボロン酸誘導体の例には、次の式のフェニルボロン酸誘導体がある。
【化２】
式中、Ｒは、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル及び置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニルからなる群から選択される。
【０１１２】
きわめて好ましいプロテアーゼ安定剤は、４−ホルミルフェニルボロン酸である。プロテアーゼ安定剤として好適な、更に好ましいボロン酸誘導体は、米国特許第４，９６３，６５５号、同第５，１５９，０６０号、国際特許第ＷＯ ９５／１２６５５号、同第ＷＯ ９５／２９２２３号、同第ＷＯ ９２／１９７０７号、同第ＷＯ ９４／０４６５３号、同第ＷＯ ９４／０４６５４号、米国特許第５，４４２，１００号、同第５，４８８，１５７号、及び同第５，４７２，６２８号に記述されている。
【０１１３】
この組成物は、可逆性ペプチドプロテアーゼ抑制剤を含んでもよい。好ましくは、可逆的ペプチドプロテアーゼ抑制剤はトリペプチド酵素抑制剤である。好適なトリペプチド酵素抑制剤の代表的な非限定例としては、
【化３】
及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１１４】
可逆的ペプチドプロテアーゼ阻害剤が、あらゆる好適な方法で製造され得る。可逆性ペプチドプロテアーゼ抑制剤の製造に好適な工程の非限定的な具体例は、米国特許第６，１６５，９６６号に見出すことができる。
【０１１５】
一実施形態では、組成物が、組成物の約０．００００１重量％〜約５重量％、具体的には約０．００００１重量％〜約３重量％、より具体的には約０．００００１重量％〜約１重量％の可逆的ペプチドプロテアーゼ阻害剤を含む。
【０１１６】
この組成物は、好ましくは溶媒を含む。この溶媒は典型的には水、又は有機溶媒、又はこれらの混合物である。好ましくはこの溶媒は水と有機溶媒の混合物である。この組成物が単位用量小袋の形態である場合は、好ましくはこの組成物は有機溶媒を含み、１０重量％未満、又は５重量％未満、又は４重量％未満、又は３重量％未満の遊離水を含み、及び無水であってもよく、典型的には、故意に加えられた遊離水を含まない。遊離水は、典型的には、カール・フィッシャー滴定を用いて測定される。２ｇの洗濯洗剤組成物を、室温で２０分間５０ｍＬの無水メタノール中に抽出し、カール・フィッシャー滴定でメタノール１ｍＬを分析する。
【０１１７】
組成物は、０重量％超過から２５重量％、０重量％超過から２０重量％、０重量％超過から１５重量％、０重量％超過から１０重量％、０重量％超過から８重量％、好ましくは０重量％超過から５重量％、最も好ましくは０重量％超過から３重量％の有機溶媒を含むことができる。好適な溶媒としてはＣ４〜Ｃ１４のエーテル及びジエーテル、グリコール、又はアルコキシル化グリコール、Ｃ６〜Ｃ１６グリコールエーテル、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化芳香族アルコール、芳香族アルコール、脂肪族分枝状アルコール、アルコキシル化脂肪族分枝状アルコール、アルコキシル化直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルコール、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルコール、アミン、Ｃ８〜Ｃ１４アルキル及びシクロアルキル炭化水素及びハロ炭化水素、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【０１１８】
好ましい溶媒は、メトキシオクタデカノール、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、ベンジルアルコール、２−エチルブタノール及び／又は２−メチルブタノール、１−メチルプロポキシエタノール及び／又は２−メチルブトキシエタノール、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブチルジグリコールエーテル（ＢＤＧＥ）、ブチルトリグリコールエーテル、第三級アミルアルコール、グリセロール、イソプロパノールなど）、及びこれらの混合物から選択される。本明細書で使用できる特に好ましい溶媒は、ブトキシプロポキシプロパノール、ブチルジグリコールエーテル、ベンジルアルコール、ブトキシプロパノール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、メタノール、イソプロパノール、及びそれらの混合物である。他の好適な溶媒には、プロピレングリコール及びジエチレングリコール、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【０１１９】
組成物は、好ましくは、組成物の約０．１重量％〜約５重量％の、ｐＨ８で約４を超える条件安定度定数を有するカルシウム封鎖剤を含む。一実施態様において、好ましくは液状の組成物は、ｐＨ８で約４を超える条件安定度定数を有するカルシウム封鎖剤を含有してもよい。ｐＨ８で約４を超える条件安定度定数を有するカルシウム封鎖剤は、Ｃａイオンと可溶性錯体を形成することができる。一実施態様において、一実施態様において、カルシウム封鎖剤は、１−ヒドロキシエチリデン１，１ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）及びこれらの組合せから選択される。カルシウム封鎖剤及びその安定度定数の追加情報は、ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｏｍｐａｎｙ出版の「Ｋｅｙｓ ｔｏ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｖｅｒｓｅｎｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ」の表４．４，４．５、４．６、４．７．、及びＭｏｎｓａｎｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５３〜３９（Ｅ）ＭＥ−２に見出すことができる。
【０１２０】
固体洗濯洗剤組成物
本発明の一実施形態では、この組成物は固体洗濯洗剤組成物であり、好ましくは固体洗濯粉末洗剤組成物である。
【０１２１】
組成物は、好ましくは、０重量％〜１０重量％、又は更には５重量％のゼオライトビルダーを含む。組成物はまた、好ましくは、０重量％〜１０重量％、又は更には〜５重量％のリン酸ビルダーを含む。
【０１２２】
この組成物は典型的に、アニオン性洗浄界面活性剤を含み、好ましくは直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩を含み、好ましくは共界面活性剤と組合せて含まれる。好ましい共界面活性剤は、平均１〜１０、好ましくは平均１〜３のエトキシル化度を有するアルキルエトキシル化硫酸塩、及び／又は、平均１〜１０、好ましくは平均１〜３のエトキシル化度を有するエトキシル化アルコールである。
【０１２３】
この組成物は好ましくはキレート剤を含み、好ましくはこの組成物は０．３重量％〜２．０重量％のキレート剤を含む。好適なキレート剤はエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）である。
【０１２４】
この組成物は、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、スルホエチルセルロース、スルホプロピルセルロース、セルロースサルフェート、リン酸化セルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシプロピルセルロース、スルホエチルヒドロキシエチルセルロース、スルホエチルヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルメチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルメチルセルロース、スルホエチルメチルヒドロキシエチルセルロース、スルホエチルメチルセルロース、カルボキシメチルエチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、スルホエチルエチルヒドロキシエチルセルロース、スルホエチルエチルセルロース、カルボキシメチルメチルヒドロキシプロピルセルロース、スルホエチルメチルヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルドデシルセルロース、カルボキシメチルドデコイルセルロース、カルボキシメチルシアノエチルセルロース、及びスルホエチルシアノエチルセルロースのナトリウム又はカリウム塩などの、セルロースポリマーを含み得る。このセルロースは、例えば、メチル及びヒドロキシエチルセルロースなどの２つ以上の異なる置換基によって置換された、置換セルロースであり得る。
【０１２５】
この組成物は、例えばＲｅｐｅｌ−ｏ−Ｔｅｘ（商標）などの汚れ放出ポリマーを含んでもよい。他の好適な汚れ分散ポリマーは、アニオン性汚れ分散ポリマーである。好適な汚れ分散ポリマーの詳細は、国際特許第ＷＯ０５１２３８３５Ａ１号、同第ＷＯ０７０７９８５０Ａ１号及び同第ＷＯ０８１１０３１８Ａ２号に記述されている。
【０１２６】
この組成物は、スプレードライ粉末を含み得る。このスプレードライ粉末は、ケイ酸ナトリウムなどのケイ酸塩を含み得る。
【０１２７】
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー
本発明の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、布地及び表面からグリース粒子を欠失するように親水性と疎水性の特性が釣り合っている任意のアルコキシル化ポリマーを示す。本発明の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーの具体的な実施形態は、コア構造と、そのコア構造に結合した複数のアルコキシレート基と、を含む。
【０１２８】
コア構造は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）
【化４】
の繰り返し単位を縮合形態で含むポリアルキレンイミン構造（式中、＃は、各場合において、窒素原子と式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の２つの隣接する繰り返し単位のＡ１基の遊離結合部位との間の結合の半分を示し、＊は、各場合において、アルコキシレート基のうちの１つに対する結合の半分を示し、Ａ１は、直鎖又は分枝鎖のＣ２〜Ｃ６−アルキレンから独立して選択され、ポリアルキレンイミン構造は、式（Ｉ）の１繰り返し単位、式（ＩＩ）のｘ繰り返し単位、式（ＩＩＩ）のｙ繰り返し単位及び式（ＩＶ）のｙ＋１繰り返し単位からなり、ｘ及びｙは、各場合において、０〜約１５０の範囲の値を有し、ポリアルキレンイミンコア構造の平均重量平均分子量Ｍｗは、約６０〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の値である）を含んでもよい。
【０１２９】
あるいは、コア構造は、式（Ｉ．ａ）及び／又は（Ｉ．ｂ）のＮ−（ヒドロキシアルキル）アミンから選択される少なくとも１つの化合物の縮合生成物のポリアルカノールアミン構造
【化５】
（式中、Ａは、Ｃ１〜Ｃ６−アルキレンから独立して選択され、Ｒ１、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、Ｒ３＊、Ｒ４、Ｒ４＊、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールから独立して選択され、後者３つの言及されたラジカルは所望により置換されてもよく、Ｒ６は、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールから選択され、後者３つの言及されたラジカルは所望により置換されてもよい）かのいずれかを含んでもよい。
【０１３０】
コア構造に結合した複数のアルキレンオキシ基は、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位
【化６】
（式中、＊は、各場合において、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＶ）の繰り返し単位の窒素原子に対する結合の半分を示し、Ａ２は、各場合において、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン及び１，２−イソブチレンから独立して選択され、Ａ３は、１，２−プロピレンであり、Ｒは、各場合において、水素及びＣ１〜Ｃ４−アルキルから独立して選択され、ｍは０〜約２の範囲の平均値を有し、ｎは約２０〜約５０の範囲の平均値を有し、ｐは約１０〜約５０の範囲の平均値を有する）から独立して選択される。
【０１３１】
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーの特定の実施形態は、内側ポリエチレンオキシドブロックと外側ポリプロピレンオキシドブロックとを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンから選択されてもよく、エトキシル化度及びプロポキシル化度は特定の制限値を上回りも下回りもしない。本発明によるアルコキシル化ポリアルキレンイミンの特定の実施形態は、ポリエチレンブロックのポリプロピレンブロックに対する比率（ｎ／ｐ）の最小値が約０．６であり、最大値が約１．５（ｘ＋２ｙ＋１）１／２である。約０．８〜約１．２（ｘ＋２ｙ＋１）１／２のｎ／ｐ比率を有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンは、特に有益な特性を有することが判明している。
【０１３２】
本発明によるアルコキシル化ポリアルキレンイミンは第一級、第二級及び第三級アミン窒素原子からなる主鎖を有し、これらの窒素原子はアルキレンラジカルＡにより互いに結合し、ランダムに配列される。ポリアルキレンイミン主鎖の主鎖及び側鎖を開始又は終止し、その残りの水素原子が引き続いてアルキレンオキシ単位により置換される第一級アミノ部分は、それぞれ式（Ｉ）又は（ＩＶ）の繰り返し単位と呼ばれる。残りの水素原子が引き続いてアルキレンオキシ単位により置換される第二級アミノ部分は、式（ＩＩ）の繰り返し単位と呼ばれる。主鎖と側鎖に分岐する第三級アミノ部分は、式（ＩＩＩ）の繰り返し単位と呼ばれる。
【０１３３】
環化がポリアルキレンイミン主鎖の形成時に生じ得るので、環状アミノ部分が主鎖内に小程度まで存在することも可能である。環状アミノ部分を含有するこのようなポリアルキレンイミンは、無論、非環状第一級及び第二級アミノ部分からなるものと同様にアルコキシル化される。
【０１３４】
窒素原子及びＡ１基からなるポリアルキレンイミン主鎖は、約６０〜約１０，０００ｇ／モル、好ましくは約１００〜約８，０００ｇ／モル、より好ましくは約５００〜約６，０００ｇ／モルの平均分子量Ｍｗを有する。
【０１３５】
和（ｘ＋２ｙ＋１）は、１つの個々のポリアルキレンイミン主鎖内に存在するアルキレンイミン単位の総数に相当し、それゆえにポリアルキレンイミン主鎖の分子量に直接関わる。しかしながら、指定で与えられた値は、混合物中に存在する全てのポリアルキレンイミンの数平均に関わる。和（ｘ＋２ｙ＋２）は、１つの個々のポリアルキレンイミン主鎖内に存在するアミノ基の総数に相当する。
【０１３６】
アミノ窒素原子に接続するラジカルＡ１は、１，２−エチレン、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン、１，２−イソブチレン、１，２−ペンタンジイル、１，２−ヘキサンジイル又はヘキサメチレンなどの、同一又は異なる、直鎖又は分枝鎖Ｃ２〜Ｃ６−アルキレンラジカルであり得る。好ましい分枝状アルキレンは、１，２−プロピレンである。好ましい直鎖アルキレンは、エチレン及びヘキサメチレンである。より好ましいアルキレンは、１，２−エチレンである。
【０１３７】
ポリアルキレンイミン主鎖の第一級及び第二級アミノ基の水素原子は、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位により置換される。
【化７】
この式では、可変因子は、好ましくは、以下に与えられる意味のうちの１つを有する。
【０１３８】
Ａ２は、各場合において、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン及び１，２−イソブチレンから選択され、好ましくはＡ２は、１，２−プロピレンである。Ａ３は１，２−プロピレンであり、Ｒは、各場合において、水素及びＣ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルなど）から選択され、好ましくはＲは水素である。添え字ｍは、各場合において、０〜約２の値を有し、好ましくはｍは０又はおよそ１であり、より好ましくはｍは０である。添え字ｎは、約２０〜約５０の範囲、好ましくは約２２〜約４０の範囲、より好ましくは約２４〜約３０の範囲の平均値を有する。添え字ｐは、約１０〜約５０の範囲、好ましくは約１１〜約４０の範囲、より好ましくは約１２〜約３０の範囲の平均値を有する。
【０１３９】
好ましくは、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位は、アルコキシレートブロックの非ランダム配列である。非ランダム配列により、［−Ａ２−Ｏ−］ｍが１番目に付加され（すなわち、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の繰り返し単位の窒素原子に対する結合に最も近接している）、［−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−］ｎが２番目に付加され、［−Ａ３−Ｏ−］ｐが３番目に付加されることが意味される。この配向は、内側ポリエチレンオキシドブロックと外側ポリプロピレンオキシドブロックとを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンを提供する。
【０１４０】
式（Ｖ）のこれらのアルキレンオキシ単位のかなりの部分は、エチレンオキシ単位−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）］ｎ−及びプロピレンオキシ単位−［ＣＨ２−ＣＨ２（ＣＨ３）−Ｏ］ｐ−により形成される。アルキレンオキシ単位はまた追加的に、小さな比率のプロピレンオキシ又はブチレンオキシ単位−［Ａ２−Ｏ］ｍ−を有してもよく、すなわち、水素原子で飽和したポリアルキレンイミン主鎖は、存在するＮＨ−部分１モル当たりで最大約２モル、特に約０．５〜約１．５モル、特に約０．８〜約１．２モルの、少量のプロピレンオキシド又はブチレンオキシドと最初に反応させてもよい、すなわち、初期にアルコキシル化させてもよい。
【０１４１】
ポリアルキレンイミン主鎖のこの最初の修飾により、必要である場合には、アルコキシル化における反応混合物の粘性を低下させることができる。しかしながら、修飾は一般にアルコキシル化ポリアルキレンイミンの性能特性に影響せず、したがって、好ましい尺度を構成しない。
【０１４２】
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、本発明の洗剤及び洗浄組成物中に、組成物の約０．０５重量％〜約１０重量％の範囲の濃度で存在する。本組成物の実施形態は、約０．１重量％〜約５重量％を含んでもよい。より具体的には、本実施形態は、約０．２５〜約２．５％のグリース洗浄ポリマーを含んでもよい。
【０１４３】
洗浄性界面活性剤
前記組成物は、洗浄性界面活性剤を含む。洗浄性界面活性剤は、アニオン性、非イオン性、カチオン性、及び／又は双性イオン性であり得る。好ましくは、この洗浄性界面活性剤はアニオン性である。この組成物は好ましくは２％〜５０％、より好ましくは５％〜３０％、最も好ましくは７％〜２０％の洗浄性界面活性剤を含む。この組成物は２％〜６％の洗浄性界面活性剤を含み得る。この組成物は好ましくは、洗濯方法で洗浄液中１００ｐｐｍ〜５，０００ｐｐｍの洗浄性界面活性剤を供給するような量の、洗浄性界面活性剤を含む。これは、洗濯方法で１０ｇ〜１２５ｇの液体洗濯洗剤組成物を洗浄液内に投入する場合に、特に好ましい。この組成物は水と接触して、典型的に、０．５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの洗剤組成物を含む洗浄液を形成する。
【０１４４】
ランダムグラフトコポリマー
ランダムグラフトコポリマーは、（ｉ）不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン、飽和ポリアルコール（例えばグリセロールなど）、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖、並びに、（ｉｉ）Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖、を含む。
【０１４５】
このポリマーは好ましくは、次の一般式を有する。
【化８】
式中、Ｘ、Ｙ及びＺはＨ又はＣ１〜６アルキルから独立に選択される末端保護単位であり、各Ｒ１はメチル及びエチルから独立に選択され；各Ｒ２はＨ及びメチルから独立に選択され；各Ｒ３は独立にＣ１〜４アルキルであり、並びに各Ｒ４はピロリドン及びフェニル基から独立に選択される。ポリエチレンオキシド主鎖の重量平均分子量は典型的に、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜約１８，０００ｇ／ｍｏｌ、又は約３，０００ｇ／ｍｏｌ〜約１３，５００ｇ／ｍｏｌ、又は約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜約９，０００ｇ／ｍｏｌである。ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑの値は、ペンダント基がポリマーの少なくとも５０重量％、又は約５０重量％〜約９８重量％、又は約５５重量％〜約９５重量％、又は約６０重量％〜約９０重量％を含むように選択される。本明細書で有用なポリマーは典型的には、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜約１００，０００ｇ／ｍｏｌ、又は好ましくは約２，５００ｇ／ｍｏｌ〜約４５，０００ｇ／ｍｏｌ、又は約７，５００ｇ／ｍｏｌ〜約３３，８００ｇ／ｍｏｌ、又は約１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２２，５００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する。
【０１４６】
好適なグラフトコポリマーについては、国際特許第ＷＯ０７／１３８０５４号、同第ＷＯ０６／１０８８５６号、及び同第ＷＯ０６／１１３３１４号に詳しく記述されている。
【０１４７】
適切な布地色相剤（布地色相剤）
蛍光増白剤は、少なくとも何らかの可視光線を放出する。対照的に、布地色相剤は、可視光線スペクトルの少なくとも一部を吸収するため、表面の色合いを変えることができる。適切な布地色相剤としては、本明細書の試験方法の項に記載の試験方法１の要件を満たす染料、染料−粘土共役体、及び顔料が挙げられる。適切な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙げられる。適切な小分子染料としては、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット、及びベーシックレッドのカラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）分類に該当する染料、又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられ、例えば次のものが挙げられる。
【０１４８】
（１）以下の式のトリス−アゾ系ダイレクトブルー
【化９】
式中、ナプチル環Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも２つがスルホネート基で置換されており、環Ｃは、５位をＮＨ２又はＮＨＰｈ基で置換してもよく、Ｘは、２つ以下のスルホネート基で置換されているベンジル又はナフチル環であり、２位をＯＨ基で置換してもよく、更にＮＨ２又はＮＨＰｈ基で置換してもよい。
【０１４９】
（２）以下の式のビス−アゾ系ダイレクトバイオレット
【化１０】
式中、ＺはＨ又はフェニルであり、環Ａは、好ましくは矢印で示される位置がメチル及びメトキシ基で置換されており、環Ａはナフチル環であってもよく、Ｙ基はベンジル又はナフチル環であり、サルフェート基で置換されており、メチル基で１又は２置換されてもよい。
【０１５０】
（３）以下の式のブルー又はレッドアシッド
【化１１】
式中、Ｘ及びＹの少なくとも１つは芳香族基でなければならない。１つの態様では、芳香族基は双方とも、置換ベンジル又はナフチル基であってよく、このベンジル又はナフチル基はアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換してよく、Ｘ及びＹはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換しなくてもよい。別の態様では、Ｘはニトロ基で置換したベンジル基であり、Ｙはベンジル基である。
【０１５１】
（４）以下の構造のレッドアシッド
【化１２】
式中、Ｂはアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換されてもよいナフチル又はベンジル基であり、Ｂはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換しなくてもよい。
【０１５２】
（５）以下の構造のジアゾ
【化１３】
式中、Ｘ及びＹは、互いに独立してそれぞれ、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４−アルコキシであり、Ｒαは水素又はアリールであり、ＺはＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル又はカルボニルであり、ｎは１又は２であり、及びｍは０、１又は２であり、並びにこれらの対応する塩、並びにこれらの混合物である。
【０１５３】
（６）以下の構造のトリフェニルメタン
【化１４】
【化１５】
及びこれらの混合物。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者及びカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK））番号がダイレクトバイオレット９、ダイレクトバイオレット３５、ダイレクトバイオレット４８、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトバイオレット６６、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトブルー８０、ダイレクトブルー２７９、アシッドレッド１７、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドバイオレット１５、アシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット２４、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドバイオレット４９、アシッドブルー１５、アシッドブルー１７、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４０、アシッドブルー４５、アシッドブルー７５、アシッドブルー８０、アシッドブルー８３、アシッドブルー９０、アシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ベーシックバイオレット１、ベーシックバイオレット３、ベーシックバイオレット４、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット３５、ベーシックブルー３、ベーシックブルー１６、ベーシックブルー２２、ベーシックブルー４７、ベーシックブルー６６、ベーシックブルー７５、ベーシックブルー１５９、及びこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者及びカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK））番号がアシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４５、アシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１、及びこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者及びカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists, Bradford
, UK））番号が、アシッドバイオレット１７、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトブルー１、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２９、アシッドブルー１１３、又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。
【０１５４】
好適なポリマー染料としては、共役色原体を含むポリマー（染料−ポリマー共役体）、ポリマーの骨格に共重合した色原体を有するポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
【０１５５】
別の態様では、適切なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ、米国サウスカロライナ州スパータンバーグ）の名称で市販されている布地直接着色剤、及び少なくとも１つの反応染料と、ヒドロキシル部分、１級アミン部分、２級アミン部分、チオール部分、及びこれらの混合物からなる群から選択される部分を含むポリマーからなる群から選択されるポリマーから形成されている染料−ポリマー共役体が挙げられる。更に別の態様では、好適なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）バイオレットＣＴ、リアクティブブルー、リアクティブバイオレット、又はリアクティブレッド染料で共役されているカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ＣＭＣが共役されているものとしては、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（アイルランド、ウイックロー）からＡＺＯ−ＣＭ−セルロースの商品名、商品コードＳ−ＡＣＭＣで市販されているＣ．Ｉ．リアクティブブルー１９、アルコキシル化トリフェニール−メタン重合着色料、アルコキシル化チオフェン重合着色料、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
【０１５６】
適切な染料粘土共役体としては、少なくとも１つのカチオン性／塩基性染料とスメクタイト粘土を含む群から選択される染料粘土共役体、及びこれらの混合物が挙げられる。別の態様では、好適な染料粘土共役体としては、以下のＣ．Ｉ．からなる群から選択される１つのカチオン性／塩基性染料からなる群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。ベーシックイエロー１〜１０８、Ｃ．Ｉ．ベーシックオレンジ１〜６９、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１〜１１８、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１〜５１、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー１〜１６４、Ｃ．Ｉ．ベーシックグリーン１〜１４、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラウン１〜２３、ＣＩベーシックブラック１〜１１、及びモンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土、及びそれらの組合せからなる群から選択される粘土。別の態様では、好適な染料粘土共役体としては以下の群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。モンモリロナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、モンモリロナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、モンモリロナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、モンモリロナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、モンモリロナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、モンモリロナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、ヘクトライトトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、ヘクトライトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、ヘクトライトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、ヘクトライトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、ヘクトライトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、サポナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、サポナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、サポナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、サポナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、サポナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、サポナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体及びこれらの混合物。
【０１５７】
適切な顔料としては、フラバントロン（flavanthrone）、インダントロン、１〜４個の塩素原子を有する塩素化インダントロン、ピラントロン（pyranthrone）、ジクロロピラントロン（dichloropyranthrone）、モノブロモジクロロピラントロン（monobromodichloropyranthrone）、ジブロモジクロロピラントロン（dibromodichloropyranthrone）、テトラブロモピラントロン（tetrabromopyranthrone）、ペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボン酸ジイミド（イミド基はＣ１〜Ｃ３−アルキル又はフェニル又は置換されていないか又は複素環式ラジカルで置換されていてもよく、フェニル及び複素環式ラジカルは更に水溶性を付与しない置換を有していてもよい）、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン（violanthrone）、イソビオラントロン（isoviolanthrone）、ジオキサジン染料、銅フタロシアニン（１分子当たり２個以下の塩素原子を有していてもよい）、ポリクロロ−銅フタロシアニン、又はポリブロモクロロ−銅フタロシアニン（１分子当たり１４個以下の臭素原子を有する）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
【０１５８】
別の態様において、好適な顔料には、ウルトラマリンブルー（Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ ２９）、ウルトラマリンバイオレット（Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ １５）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
【０１５９】
前述の布地色相剤は、組合せて使用することができる（布地色相剤の任意の混合物を使用することができる）。適切な布地色相剤は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）、Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄａｙｇｌｏ Ｃｏｌｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｄｙｅｓｔｕｆｆｓ Ｃｏｒｐ．（Ｅａｓｔ Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ，ＵＳＡ）、Ｄｙｓｔａｒ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌａｎｘｅｓｓ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｃｌａｒｉａｎｔ（Ｍｕｔｔｅｎｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ａｖｅｃｉａ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）から購入可能であり、及び／又は本明細書に記載の実施例にしたがって調製可能である。
【０１６０】
好適な色調剤については、詳しくは米国特許第７，２０８，４５９（Ｂ２）号に記述されている。
【０１６１】
補助剤成分
適切な補助剤物質としては、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加の酵素及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成済み過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ欠失／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造伸縮性付与剤、柔軟仕上げ剤、キャリア、向水性物質、加工助剤、溶媒、及び／又は顔料が挙げられるが、これらに限らない。下記開示に加えて、このような他の補助剤の適した例、及び使用量は、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号及び同第６，３２６，３４８号に見ることができる。
【０１６２】
本発明は更に以下の例によって説明されるが、これは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６３】
実施例１−キシログルカナーゼ変異体の製造及び精製
本発明のキシログルカナーゼ変異体は、標準的な方法、手短に言えば、ランダムな及び／又は部位特異的な突然変異を遺伝子に導入し、バチルス・ズブチルス宿主細胞を変異遺伝子で形質転換し、形質転換された宿主細胞を発酵させ、発酵ブロスからキシログルカナーゼ変異体を得る、ことによって調製された。参照キシログルカナーゼ（配列番号３）を、同様の方法で、バチルス・ズブチルスにおいて組み換え的に産生した。
【０１６４】
発酵は、５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコの中にＣａＣＯ３のタブレットを１つ含有する１００ｍＬ ＰＳ−１培地を３７℃で４日間振盪させて、振盪フラスコ培養の中で行われた。ＰＳ−１培地組成物は、１００ｇ／Ｌスクロースと、４０ｇ／Ｌ Ｓｏｙｍｅａｌ Ｍｅａｌと、１０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４＊１２Ｈ２Ｏと、０．１ｍＬ／Ｌ Ｄｏｗｆａｘ ６３Ｎ１０と、６μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの形態の抗生物質と、を含有する。
【０１６５】
発酵後、遠心分離（２６０００×ｇ、２０分）によって培養ブロスを採取した。少量の上清を０．４５μｍフィルタを通過させて滅菌濾過し、冷凍貯蔵した。以下に記載の安定性アッセイを開始する直前に、サンプルを解凍した。
【０１６６】
一部の例では、安定性試験で使用される前に酵素サンプルを精製した。
【０１６７】
酵素精製に関しては、残りの宿主細胞を除去するため、ＮＡＬＧＥＮＥ ０．２μｍ濾過ユニット（カタログ番号５６９−００２０）を通過させて上澄みを濾過した。 濾液０．２μｍのｐＨを２０％ ＣＨ３ＣＯＯＨでｐＨ５．０に調整し、５０ｍＭコハク酸／ＮａＯＨ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５．０中で平衡化したＸｐｒｅｓｓＬｉｎｅ ＰｒｏＡカラム（ＵｐＦｒｏｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ／Ｓ）に濾液を加えた。ＸｐｒｅｓｓＬｉｎｅ ＰｒｏＡカラムを平衡緩衝液で十分に洗浄した後、キシログルカナーゼを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０で段階溶出した。溶出の間に分画を収集した。カラムからの分画をキシログルカナーゼ活性について分析し（実施例２）、活性を有する分画をプールした。プールのｐＨを３Ｍ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅでｐＨ９．０に調整し、プールを脱塩水で５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０と同じ（又はそれより低い）伝導度まで希釈した。調整溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０中で平衡化したＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを平衡緩衝液で十分に洗浄した後、酵素を５カラム容量にわたって同緩衝液中の直線状ＮａＣｌ勾配（０→０．５Ｍ）で溶出した。そのカラムからの画分を、キシログルカナーゼ活性について分析し、活性を有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより更に分析した。クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１バンドのみが見られた分画を精製品としてプールした。
【０１６８】
実施例２−キシログルカナーゼアッセイ
例えば精製で得た酵素サンプルのキシログルカナーゼ活性をＡＺＣＬ−キシログルカンアッセイで測定した。
【０１６９】
ＡＺＣＬ−キシログルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）をキシログルカナーゼと共にインキュベートし、放出された青色を６５０ｎｍで測定した。キシログルカナーゼ活性を、適切な空試験値を差し引いた後のインキュベーションの間の青色の増加として計算した。
【表１】
【０１７０】
５００μＬ ＡＺＣＬ−キシログルカン基質懸濁液をエッペンドルフ型チューブの中の氷の上に定置した。５００μＬアッセイ緩衝液を添加し、混合物を氷の温度まで冷やした。２０μＬ酵素サンプル（０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈）を添加した。エッペンドルフ型チューブをアッセイ温度に設定されたエッペンドルフ型サーモミキサーに移してアッセイを開始した。チューブを最高振盪速度（１４００ｒｐｍ）のエッペンドルフ型サーモミキサーの上で１５分間インキュベートした。チューブを氷浴に戻してインキュベーションを中止した。チューブが氷のように冷たくなったら、チューブを氷冷の遠心分離機で短時間の間遠心分離機して未反応基質を沈殿させた。２００μＬ上清をマイクロタイタープレートに移してＡ６５０を読み取った。緩衝液ブランク（酵素の代わりに２０μＬ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）をアッセイに含ませ、酵素サンプルと緩衝液ブランクとの間のＡ６５０の差異がキシログルカナーゼ活性の測定値であった。
【０１７１】
実施例３−キシログルカナーゼ変異体の安定性
本発明のキシログルカナーゼ変異体の洗剤安定性を、液体洗剤中でのインキュベーション後の変異体の活性を測定することによって評価した。
【０１７２】
安定性試験は、酵素サンプルを液体洗剤に加え、これを高温、例えば３５℃〜４０℃で貯蔵することによって実施された。所定の貯蔵期間の後、酵素活性を測定し、約−１８℃で同じ期間貯蔵された等量のサンプルの活性と比較した。安定性試験の結果は、低温貯蔵されたサンプルに見られた活性の％で表わされた、高温で貯蔵されたサンプルに見られた活性である。
【０１７３】
キシログルカナーゼ変異体の結果を、同じ条件下で試験した親キシログルカナーゼ（配列番号３）の結果と比較した。２つの安定性結果の間の比が安定性改善度（ＳＩＦ）である。
【０１７４】
ＳＩＦ＞１を有する変異体は、試験条件下で親キシログルカナーゼよりも安定している。好ましい変異体は、この試験で高いＳＩＦを有するものである。
【０１７５】
界面活性剤
安定性試験で使用した液体洗剤は次の組成物を有する。
【表２】
【０１７６】
貯蔵試験
実施例１に従って調製した酵素サンプルを、貯蔵安定性試験を開始する直前に解凍した。
【０１７７】
酵素サンプルを１ｍＬ当たり約０．２５ｍｇ酵素タンパク質の濃度に希釈した。
【０１７８】
液体洗剤を約１２ｍＬの容量でガラス瓶の中に分配して、各グラスの中に１．０±０．０５グラムの洗剤を供給した。
【０１７９】
各酵素サンプル対して２つの複製瓶を準備した。５０μＬの希釈酵素及び小型電磁攪拌棒を瓶に加え、瓶をしっかりと閉じた（貯蔵中の蒸発を防ぐため）。内容物を電磁攪拌棒の助けを借りて約５分間混合した。一対の瓶の一方を約−１８℃の冷凍庫の中に定置した。他方の瓶を、所定の高温、例えば３５℃〜４０℃の好適なインキュベータオーブンの中に定置して試験した。所定の貯蔵期間の後、インキュベータオーブンの中の瓶を冷凍庫に移す。
【０１８０】
活性アッセイ
洗剤の中で貯蔵された酵素サンプルの活性を以下の手段を用いて測定した。
【０１８１】
材料及び試薬：
１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７：
１３８グラムのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを約７５０ｍＬの水の中に溶解する。４Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨ７．０とする。次に、最終容量を１０００ｍＬにする。
【０１８２】
アッセイ緩衝液（５０ｍＭリン酸塩ｐＨ７）：
９５０ｍＬ水、５０ｍＬ １Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７及び５ｍＬのＢｅｒｏｌ ５３７（Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌから供給される非イオン性界面活性剤）を混合する。最終ｐＨを７．００±０．０２に調節する。
【０１８３】
基質：
Ｃｅｌｌａｚｙｍｅ Ｃタブレット、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄより供給、カタログ番号Ｔ−ＣＣＺ。タブレットは架橋染色ＨＥセルロースを含有する。
【０１８４】
手順
アッセイ開始約３０分前に、瓶を冷凍装置から約４℃の冷蔵庫に移した。アッセイ開始直前に瓶を冷蔵庫から取り出し、実験室の卓上の上に置いて開けた。
【０１８５】
１０ｍＬアッセイ緩衝液（室温）をそれぞれの開けた瓶に加えた。次に、サブマージマルチポイント電磁攪拌器を装備した３０℃の水浴に瓶を移した。内容物を穏やかに約５分間撹拌した。
【０１８６】
１つのＣｅｌｌａｚｙｍｅ Ｃタブレットをそれぞれの瓶に加えた。基質粒子を移動させ続け、かつ沈殿を防ぐのにちょうど適切な撹拌速度を用いて撹拌を継続した。タブレットを加えて３０分後に瓶を水浴から取り出し、続いて、室温で１５分間撹拌せずに放置した。
【０１８７】
ピペットを使用して、それぞれの瓶の上部からの特に透明な上澄み約１ｍＬをセミマイクロ分光光度計のキュベットに移した。次に、５９０ｎｍにおける吸光度を、好適な分光光度計を用いて測定した。測定は１５分以内に終了した。
【０１８８】
ブランクサンプル、即ち、キシログルカナーゼ酵素が添加されていない等量の洗剤サンプルをアッセイ含ませた。
【０１８９】
計算
それぞれの酵素サンプルに関し、２つのＡｂｓ５９測定値が存在する。
・−１８℃で貯蔵されたサンプルのＡｂｓ５９０値であるＡ５９０ｆ
・高温で貯蔵されたサンプルのＡｂｓ５９０値であるＡ５９０ｗ
Ａ５９０ｆからＡ５９０ｆを減算し（Ａ５９０ｆ−Ａ５９０ｂ）、Ａ５９０ｗからＡ５９０ｆを減算する（Ａ５９０ｗ−Ａ５９０ｂ）。
【０１９０】
安定性は：
％安定性＝（（Ａ５９０ｗ−Ａ５９０ｂ）／（Ａ５９０ｆ−Ａ５９０ｂ））×１００％として計算された。
【０１９１】
それぞれの酵素に関し、（Ａ５９０ｆ−Ａ５９０ｂ）の結果は０．１〜１．２の範囲内になければならない。値がこの範囲外にあると、その酵素に関する結果は信頼できないと見なされ、異なる希釈の酵素サンプルで試験を繰り返さなければならない。
【０１９２】
最後に、それぞれの酵素変異体の安定性改善度（ＳＩＦ）を次のように計算する。
ＳＩＦ＝酵素サンプルの％安定性／親酵素（配列番号３）の％安定性
【０１９３】
結果
以下に示されるのは、異なる条件下で試験されたキシログルカナーゼ変異体の安定性結果である。
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９−１】
【表９−２】
【表９−３】
【表１０】
【表１１】
【表１２−１】
【表１２−２】
【表１３】
【表１４】
【０１９４】
実施例４−キシログルカナーゼ変異体の安定性
本実施例のキシログルカナーゼ変異体の洗剤安定性を、液体洗剤中でのインキュベーション後の変異体の活性を測定することによって評価した。
【０１９５】
安定性試験は、酵素サンプルを液体洗剤に加え、これを高温、例えば３５℃〜４６℃で貯蔵することによって実施された。所定の貯蔵期間の後、酵素活性を測定し、約＋５℃で同じ期間貯蔵された同一サンプルの活性と比較した。安定性試験の結果は、等量の低温貯蔵されたサンプル（ストレス無負荷サンプル）に見られた活性の％で表わされた、高温で保存されたサンプル（ストレス負荷サンプル）に見られた活性である。
【０１９６】
キシログルカナーゼ変異体の結果を、同じ条件下で試験した親キシログルカナーゼ（配列番号３）の結果と比較した。
【０１９７】
洗剤
安定性試験で使用した液体洗剤は次の組成物を有する。
【表１５】
【０１９８】
貯蔵試験
実施例１に従って調製した酵素サンプルを、貯蔵安定性試験を開始する直前に解凍した。
【０１９９】
酵素サンプルは更に希釈することなく使用された。
【０２００】
液体洗剤を、丸底ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレート（プレート１）に分配して、ウェル当たりの洗剤を１９０μＬとした。
【０２０１】
１０μＬの酵素サンプル及び小型電磁攪拌棒を各ウェルに加え、粘着性アルミ箔の蓋（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してプレートをしっかりと閉じた（蒸発を防ぐため）。内容物を電磁攪拌棒で約３０分間混合した。
【０２０２】
次に、プレート１の各ウエルから、２０μＬの洗剤−酵素混合物を新しい空の同一プレート（プレート２）に移した。次に、両方のプレートを密閉した。
【０２０３】
最初のプレート（プレート１）を、所定の高温、例えば３５℃〜４６℃のインキュベータオーブンの中に置いた。もう一つのプレート（プレート２）を、約５℃の冷蔵庫の中に置いた。
【０２０４】
所定期間のインキュベーションの後、プレートを冷蔵庫及びインキュベータオーブンから取り出した。プレートを実験室の卓上に少なくとも３０分置いて、全てのウェルを室温に達するようにした。
【０２０５】
次に、プレート１の各ウェルからの２０μＬを新しい空の丸底９６ウェルプレート（プレート１ａ）に移した。
【０２０６】
この時プレート１ａは２０μＬのストレス負荷サンプルを収容しており、プレート２は２０μＬのストレス無負荷サンプルを収容している。
【０２０７】
活性アッセイ
洗剤の中で貯蔵された酵素サンプルの活性を以下の手段を用いて室温で測定した。
【０２０８】
アッセイの原理：
パラ−ニトロフェノール−β−Ｄ−セロテトラオシド（ｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシド）は、特定のキシログルカナーゼ酵素の触媒作用によって加水分解された合成基質である。
【０２０９】
基質そのものは無色であるが、還元末端グリコシド結合を加水分解すると、４０５ｎｍにおける強い吸光度によって、ｐＨ８緩衝液中に黄色のパラ−ニトロフェノールが放出される。
【０２１０】
ｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシドそのものは、所与のアッセイ条件下で非常に安定している。したがって、４０５ｎｍにおける吸光度の増加は酵素活性の属性である。
【０２１１】
本発明者らは、４０５ｎｍにおける強力な吸光度の増加によって証明されたように、親キシログルカナーゼ（配列番号３）はｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシドを基質として受け入れたことを見出した。
【０２１２】
材料及び試薬：
アッセイ緩衝液：１００ｍＭ ＥＰＰＳ；０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ８．０。
ｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシド（ＣＡＳ−＃：１２９４１１−６２−７；Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｃａｎａｄａ）
基質溶液：アッセイ緩衝液中の１ｍＭ ｐＮＰ−β−Ｄ−セロテトラオシド。
【０２１３】
手順：
プレート１ａは２０μＬのストレス負荷サンプルを収容し、プレート２は２０μＬのストレス無負荷サンプルを収容する。
【０２１４】
５０μＬアッセイ緩衝液を加えてサンプルを希釈してプレート１ａ及びプレート２の全ウェルに加え、マイクロタイタープレート振盪器を使用して１時間混合した。次に、追加の５０μＬアッセイ緩衝液を全ウェルに加え、振盪を更に１０分間継続した。
【０２１５】
係数６希釈サンプル２０μＬを透明な３８４ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートに移し、２０μＬ基質溶液を全ウェルに添加した。マイクロタイタープレートをしばらく振盪させることによってサンプルを混合した。３８４ウェル分光光度リーダーを使用して４０５ｎｍにおける吸光度の増加速度を観察することによって、酵素活性の反応速度測定を即座に開始した。
【０２１６】
反応の初期速度（Ａｂｓ／分）を決定した。反応の初期速度は、関連酵素濃度内の線形標準曲線から検証されたサンプルにおける酵素活性の測定値であった。
【０２１７】
計算：
ストレス負荷サンプルの酵素活性を同一のストレス無負荷サンプルの酵素活性で除したものとして％残留活性を計算した。
％残留活性＝「Ａｂｓ／分（ストレス負荷サンプル）」／「Ａｂｓ／分（ストレス無負荷サンプル）」＊１００％。
【０２１８】
結果
以下に示されるのは、異なる条件下で試験されたキシログルカナーゼ変異体の安定性結果である。
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【０２１９】
液体洗濯洗剤組成物
組成物１〜８：フロントローディング式自動洗濯機に好適な液体洗濯洗剤組成物
【表５５】
【０２２０】
組成物９〜１６：トップローディング式自動洗濯機に好適な液体洗濯洗剤組成物
【表５６】
【表５７】
【０２２１】
組成物７：ポリビニルアルコールのフィルムにより封入されている小袋の形態の液体洗濯洗剤組成物
【表５８】
【０２２２】
（実施例１８〜２９）
下記は、布地洗濯に適した、本発明に従って製造された顆粒状洗剤組成物である。
【表５９】
【表６０】
１ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００で、ポリエチレンオキシドとポリ酢酸ビニルの重量比は約４０対６０であり、５０エチレンオキシド単位当たり１グラフト点を超えない。
２−ＮＨにつき２０個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３両親媒性グリース洗浄ポリマーは、−ＮＨにつき２４個のエトキシル基、及び−ＮＨにつき１６個のプロポキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）である。
４次の構造を有する可逆性プロテアーゼ抑制剤。
【化１６】
＊注：酵素濃度はすべて、酵素原材料の％として表わされているが、ただしキシログルカナーゼは、洗剤１００ｇ当たりの活性酵素タンパク質ｍｇ単位で示されている。
【０２２３】
本明細書に開示される寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳しく制限されるものとして理解されるべきでない。それよりむしろ、特に指定されない限り、各こうした寸法は、列挙された値とその値周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味することを意図する。例えば、「４０ｍｍ」として開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親キシログルカナーゼの単離変異体を含む洗剤組成物であって、前記変異体が、位置番号６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５、３６６、１、３７４、７、１４０、８、１４、２１、２１１、３７、４５、１３、７８、８７、４３６、１０１、１０４、１１１、３０６、１１７、１１９、４１４、１３９、２６８、１４２、１５９、１６４、１０２、１６８、１７６、１８０、４８２、１８３、２０２、２０６、２１７、４、２２２、１９、２２４、２２８、２３２、２、２４０、２４４、５、２４７、２４９、３２８、２５２、２５９、４０６、２６７、２６９、２７５、１７９、１６６、２７８、２８１、２８８、２９８、３０１、１８、３０２、１６５、８０、３０３、３１６、１６９、３２２、１２０、１４６、３４２、３４８、１４７、３５３、３８０、４６８、３８２、３８３、３８、３８４、３８９、３９１、１０、３９２、３９６、１７７、３９７、３９９、４０９、２３７、４１３、２５３、４１５、４１８、４０、４４３、４４５、１４８、４４９、２２５、４５０、４５４、３、４５５、４５６、２９９、４６１、４７０、２０４、４７６、４８８、３４７、及び５０７からなる群から選択される１つ以上の位置の親キシログルカナーゼの改変を含み、この位置はアミノ酸配列番号３の位置に対応しており、ここで、
ａ）前記改変が、
ｉ）前記位置を占める前記アミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、及び／又は
ｉｉ）前記位置を占める前記アミノ酸の欠失、及び／又は
ｉｉｉ）前記位置を占める前記アミノ酸の異なるアミノ酸での置換であり、
ｂ）前記親キシログルカナーゼがファミリー４４のキシログルカナーゼであり、かつ
ｃ）前記変異型がキシログルカナーゼ活性を有する、組成物。
【請求項２】
前記親キシログルカナーゼが、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択され、又は前記親キシログルカナーゼが、前記配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一性を有するキシログルカナーゼから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記変異体が、以下の改変の組合せの１つ以上を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
Ｖ１＊＋Ｖ２＊＋Ｈ３＊；
Ｖ１Ｑ＋＊１ａＥ＋＊１ｂＶ；
Ｈ３Ａ；
Ｈ３Ａ＋Ｈ４３６Ａ；
Ｋ８Ａ，Ｑ，Ｓ；
Ｔ９Ｄ；
Ｔ９Ｄ＋Ｌ３４Ｆ＋Ａ８３Ｅ＋Ｑ１４９Ｅ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｓ３３２Ｐ＋Ｒ３４０Ｔ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｙ７３Ｆ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ＋Ｅ４８９Ａ＋Ａ４９０Ｖ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ
＋Ｖ２７２Ａ＋Ｔ３２０Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ
＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１５３Ｋ＋Ｒ１５６Ｑ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｄ４２０Ｇ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｑ＋Ｖ１５９Ａ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｙ５３Ｈ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｔ１７２Ｖ＋Ａ１７７Ｔ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｋ１３Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１３Ａ＋Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１３Ａ，Ｒ；
Ｋ１８Ｒ；
Ｒ２０Ａ；
Ｋ２１Ｑ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ２１Ｑ，Ｒ，Ｔ；
Ｑ３２Ｈ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｒ４９Ｇ＋Ｄ６５Ｅ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｋ２０２Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ；
Ｄ３３Ｖ＋Ｑ６８Ｈ＋Ｎ１６８Ｈ＋Ｖ４５０Ｉ；
Ｌ３４Ｆ，Ｉ，Ｍ，Ｖ；
Ｌ３４Ｉ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｄ３７Ｇ，Ｎ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｅ３８Ｉ，Ｖ；
Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１５３Ｋ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｅ４８９Ａ＋Ａ４９０Ｖ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｍ４０Ｖ；
Ｌ４５Ｉ；
Ｑ６８Ｈ，Ｍ，Ｎ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｓ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２７４Ｄ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１２９Ａ，Ｔ＋Ｒ１５６Ｋ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｓ７６Ｗ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｓ，Ｖ，Ｙ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｎ＋Ｄ９７Ｎ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｓ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２７４Ｄ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｅ４４６Ｋ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｎ３３１Ｈ，Ｋ，Ｑ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１４０Ｆ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｄ３２４Ｎ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｌ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ，Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｓ１２３Ｐ，Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｓ４８４Ｃ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｓ７６Ｅ，Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ｗ；
Ｓ７６Ｗ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｓ７６Ｗ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｇ７８Ａ，Ｎ，Ｓ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｌ８０Ｖ；
Ａ８３Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｙ；
Ｋ８７Ｑ；
Ｋ８７Ｖ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｔ９２Ｉ，Ｖ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１０１ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１０１Ｒ；
Ｋ１０１Ｒ＋Ｌ１０２Ｉ；
Ｔ１０４Ａ＋Ｐ１１１Ｑ＋Ａ１１７Ｓ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｐ１１１Ｑ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｆ１４６Ｌ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ＋Ｎ３９９Ｉ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１１８Ａ，Ｒ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｄ１１９Ｌ；
Ｇ１２０Ａ；
Ｓ１２３Ｐ，Ｔ；
Ｓ１２３Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ，Ｆ，Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｓ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１７６Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ２７５Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ４４５Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｖ１３９Ｋ＋Ｎ１４０Ｆ＋Ｑ１４７Ｓ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ１７７Ｔ＋Ｖ１７９Ｉ＋Ａ１８３Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ３２８Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ２４７Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ２４９Ｇ，Ｎ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３０３Ｉ，Ｋ，Ｓ，Ｖ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３２４Ｎ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３６６Ｈ＋Ｔ３７４Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ４６１Ｎ，Ｑ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｅ２８８Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２０４Ｔ＋Ｒ２１１Ｋ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１６４Ｎ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ４３６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｉ１０Ｖ＋Ｖ１４Ｉ＋Ｄ１９Ｅ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｖ２３２Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１７６Ｐ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ２７５Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ３２２Ｉ＋Ｋ４５４Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４０６Ｎ＋Ｎ４１５Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４５４Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｌ３８０Ｆ＋Ｎ３８３Ｙ＋Ｄ３８４Ｇ＋Ｎ３８９Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ２９８Ｆ＋Ｅ２９９Ｎ＋Ｇ３０１Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３０２Ｋ＋Ｄ３０３Ｌ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｐ５０７Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｒ２６７Ｈ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｒ４０９Ｌ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｓ４４３Ｄ＋Ｋ４４５Ｓ＋Ｌ４４９Ｉ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｓ４５５Ｎ＋Ｍ４５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｔ２４４Ｄ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｖ１５９Ｍ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｆ１６５Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｖ２５９Ｉ＋Ｒ２６７Ｋ＋Ｌ２６８Ｋ＋Ｓ２６９Ａ；
Ｑ１３７Ｄ，Ｅ；
Ｎ１４０Ｆ；
Ｋ１４２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｆ１４６Ｃ＋Ｈ１６４Ｃ；
Ｆ１４６Ｋ，Ｌ；
Ｆ１４６Ｌ＋Ｋ３２２Ｉ；
Ｌ１４８Ｋ＋Ｎ１６８Ｄ；
Ｑ１４９Ｅ；
Ｒ１５６Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｖ１５９Ｍ；
Ｈ１６４Ａ，Ｎ；
Ｌ１６６Ｉ；
Ｎ１６８Ｄ；
Ｋ１６９Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ１７６Ｐ；
Ａ１７７Ｅ，Ｔ；
Ｋ１８０Ｒ；
Ｈ１９３Ａ，Ｄ，Ｓ，Ｔ；
Ｒ１９７Ａ，Ｌ；
Ｈ１９９Ａ；
Ｇ２００Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｋ２０２Ｎ，Ｑ，Ｒ；
Ｓ２１４Ｅ；
Ｋ２１７Ａ；
Ａ２２１Ｋ；
Ｇ２２５Ｓ；
Ｖ２３２Ａ；
Ｇ２３７Ａ，Ｓ，Ｖ；
Ｋ２４０Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ２５２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｇ２５３Ａ；
Ｒ２６７Ａ；
Ｌ２６８Ｉ；
Ｋ２７５Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｌ２７８Ｉ；
Ｆ２８１Ｌ；
Ｍ２９０Ｒ；
Ｒ２９５Ａ；
Ｋ３０６Ａ，Ｒ；
Ｋ３０７Ｑ；
Ｍ３１０Ｉ，Ｌ，Ｖ；
Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３９９Ｉ；
Ｒ３１４Ａ；
Ｇ３１６Ｉ；
Ｋ３２２Ａ，Ｒ；
Ｄ３２４Ｎ；
Ｎ３３１Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｓ３３２Ｍ，Ｐ；
Ｓ３３２Ｐ＋Ｖ３９７Ｉ；
Ｒ３４０Ａ，Ｎ，Ｔ；
Ｋ３４２Ａ；
Ｖ３４５Ｉ；
Ｋ３４７Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｄ３４８Ｇ；
Ｋ３５３Ｑ，Ｒ；
Ｄ３６６Ｈ；
Ｍ３７３Ｑ；
Ｔ３７４Ａ；
Ｌ３８０Ｆ；
Ｋ３８２Ａ；
Ｎ３８３Ｙ；
Ｎ３８９Ａ，Ｆ，Ｎ，Ｖ；
Ｗ３９１Ｖ；
Ｋ３９２Ｇ，Ｑ；
Ｄ３９５Ｇ；
Ｇ３９６Ｐ；
Ｖ３９７Ｓ；
Ｎ３９９Ｉ；
Ｋ４０６Ｎ；
Ｇ４１３Ａ，Ｓ；
Ｋ４１４Ａ；
Ｎ４１５Ｓ；
Ｔ４１７Ｋ；
Ｆ４１８Ｉ；
Ｖ４３１Ｅ；
Ｈ４３６Ａ；
Ｎ４４１Ｇ＋Ａ４４２Ｅ＋Ｓ４４３Ｄ；
Ｓ４４３Ｅ，Ｋ，Ｑ；
Ｋ４４５Ａ，Ｒ，Ｓ；
Ｋ４４５Ｃ＋Ｋ４７０Ｃ；
Ｈ４４８Ａ；
Ｋ４５４Ｒ；
Ｓ４６７Ｒ＋Ｇ４６８Ｓ＋Ａ４６９Ｔ；
Ｇ４６８Ｓ，Ｙ；
Ｋ４７０Ｐ，Ｒ，Ｔ；
Ｉ４７３Ｔ；
Ｋ４７６Ｑ；
Ｋ４８２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ４８８Ａ，Ｑ，Ｒ，Ｔ；
Ａ４９０Ｒ；
Ｇ４９８Ａ，Ｄ，Ｓ；
Ｒ５００Ａ，Ｔ，Ｖ；
Ｈ５１２Ａ；
Ｔ５１７Ａ＋Ｇ５１８Ｄ；又は
Ｇ５１８Ｄ。
【請求項４】
前記変異体が、アミノ酸配列番号３に対応する、位置６８、位置１２３、位置１５６、位置１１８、位置２００、位置１２９、位置１３７、位置１９３、位置９２、位置７６、又は位置３３１に対応する位置の１つ以上の改変を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記変異体が、位置６８の置換と、位置番号１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５及び３６６からなる群から選択される１つ以上の追加位置の１つ以上の置換を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記変異体が、位置１５６の置換と、位置番号１０、１３、１４、１９、３７、６８、７８、９２、１１８、１２３、１２９、１３７、１３９、１４０、１４７、１５９、１６４、１６５、１６９、１７６、１７７、１７９、１８３、２００、２０４、２１１、２２２、２２４、２４４、２４７、２４９、２５９、２６７、２６８、２６９、２７５、２８８、２９９、３０１、３０２、３０３、３１０、３２４、３２８、３３１、３６６、３８０、３８３、３８４、３８９、４０６、４０９、４１５、４３６、４４３、４４５、４４９、４５０、４５４、４５５、４５６、４６１、４７０及び５０７からなる群から選択される１つ以上の追加位置の１つ以上の置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記変異体が、位置１２９及び位置１５６の置換を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記変異体が、Ｑ６８Ｈ，Ｎ，Ｌ；Ｓ１２３Ｐ，Ｔ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｗ，Ｌ，Ｍ；Ｋ１１８Ａ，Ｒ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ，Ｓ，Ｄ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ，Ｓ；Ｑ１３７Ｅ；Ｈ１９３Ｔ，Ｓ，Ｄ；Ｔ９２Ｖ，Ｉ，Ａ，Ｓ；Ａ８３Ｅ；Ｑ１４９Ｅ；Ｌ３４Ｆ，Ｉ，Ｖ；Ｒ３４０Ｔ，Ｎ；Ｓ３３２Ｐ；Ｔ９Ｄ；Ｓ７６Ｗ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｔ；Ｎ３３１Ｆ，Ｃ；Ｍ３１０Ｉ，Ｖ，Ｌ；Ｄ３２４Ｎ；Ｇ４９８Ａ，Ｄ；Ｄ３９５Ｇ及びＤ３６６Ｈからなる群から選択される１つ以上の置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記変異体が、Ｑ６８Ｈ；Ｓ１２３Ｐ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；Ｋ１１８Ａ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ；Ｑ１３７Ｅ；Ｈ１９３Ｔ；Ｔ９２Ｖ及びＮ３３１Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記変異体が、以下の置換の組合せの１つ以上を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｑ６８Ｈ
Ｓ１２３Ｐ
Ｒ１５６Ｙ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｓ１２３Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１２９Ｔ＋Ｒ１５６Ｋ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｓ１２３Ｐ，Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
【請求項１１】
前記変異体の改変の総数が、２、更に好ましくは３、更により好ましくは４、更により好ましくは５、更により好ましくは６、更により好ましくは７、更により好ましくは８、更により好ましくは９、及び最も好ましくは１０である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記変異体が、配列番号３の前記親キシログルカナーゼのアミノ酸配列と７５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記変異体が、前記親キシログルカナーゼに比べて改善された化学安定性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記改善された化学安定性が改善された洗剤安定性をもたらす、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が液体洗濯洗剤組成物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、
（ａ）両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー；
（ｂ）ランダムグラフトコポリマー、ここで前記ランダムグラフトコポリマーは、
（ｉ）不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン酸、グリセロールなどの飽和ポリアルコール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖と、
（ｉｉ）Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖と、を含み；
（ｃ）次の一般構造を有する化合物：ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（ＣＨ３）−Ｎ＋−ＣｘＨ２ｘ−Ｎ＋−（ＣＨ３）−ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（式中、ｎは２０〜３０であり、及びｘは３〜８である。）又はその硫酸化若しくはスルホン酸化変異体；
から選択される１つ以上の成分を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が香料マイクロカプセルを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が布地色相剤を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、前記組成物の約０．１重量％〜約５重量％の、ｐＨ８で約４を超える条件安定度定数を有するカルシウム封鎖剤を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が固体形状である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
後続洗濯工程中に綿に汚れ放出効果を付与するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物におけるキシログルカナーゼの使用。
【請求項１】
親キシログルカナーゼの単離変異体を含む洗剤組成物であって、前記変異体が、位置番号６８、１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５、３６６、１、３７４、７、１４０、８、１４、２１、２１１、３７、４５、１３、７８、８７、４３６、１０１、１０４、１１１、３０６、１１７、１１９、４１４、１３９、２６８、１４２、１５９、１６４、１０２、１６８、１７６、１８０、４８２、１８３、２０２、２０６、２１７、４、２２２、１９、２２４、２２８、２３２、２、２４０、２４４、５、２４７、２４９、３２８、２５２、２５９、４０６、２６７、２６９、２７５、１７９、１６６、２７８、２８１、２８８、２９８、３０１、１８、３０２、１６５、８０、３０３、３１６、１６９、３２２、１２０、１４６、３４２、３４８、１４７、３５３、３８０、４６８、３８２、３８３、３８、３８４、３８９、３９１、１０、３９２、３９６、１７７、３９７、３９９、４０９、２３７、４１３、２５３、４１５、４１８、４０、４４３、４４５、１４８、４４９、２２５、４５０、４５４、３、４５５、４５６、２９９、４６１、４７０、２０４、４７６、４８８、３４７、及び５０７からなる群から選択される１つ以上の位置の親キシログルカナーゼの改変を含み、この位置はアミノ酸配列番号３の位置に対応しており、ここで、
ａ）前記改変が、
ｉ）前記位置を占める前記アミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、及び／又は
ｉｉ）前記位置を占める前記アミノ酸の欠失、及び／又は
ｉｉｉ）前記位置を占める前記アミノ酸の異なるアミノ酸での置換であり、
ｂ）前記親キシログルカナーゼがファミリー４４のキシログルカナーゼであり、かつ
ｃ）前記変異型がキシログルカナーゼ活性を有する、組成物。
【請求項２】
前記親キシログルカナーゼが、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択され、又は前記親キシログルカナーゼが、前記配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一性を有するキシログルカナーゼから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記変異体が、以下の改変の組合せの１つ以上を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
Ｖ１＊＋Ｖ２＊＋Ｈ３＊；
Ｖ１Ｑ＋＊１ａＥ＋＊１ｂＶ；
Ｈ３Ａ；
Ｈ３Ａ＋Ｈ４３６Ａ；
Ｋ８Ａ，Ｑ，Ｓ；
Ｔ９Ｄ；
Ｔ９Ｄ＋Ｌ３４Ｆ＋Ａ８３Ｅ＋Ｑ１４９Ｅ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｓ３３２Ｐ＋Ｒ３４０Ｔ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｙ７３Ｆ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｄ３３Ｅ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ＋Ｅ４８９Ａ＋Ａ４９０Ｖ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ
＋Ｖ２７２Ａ＋Ｔ３２０Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ
＋Ｉ４７３Ｓ＋Ｖ４７７Ｉ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２Ｐ＋Ｐ５２３Ｖ＋Ｖ５２４Ｅ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１５３Ｋ＋Ｒ１５６Ｑ＋Ｖ２１９Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｄ４２０Ｇ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｑ＋Ｖ１５９Ａ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｎ１６８Ｋ＋Ｔ１７２Ａ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ；
Ｉ１０Ｖ＋Ｆ１７Ｓ＋Ｙ５３Ｈ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｔ１７２Ｖ＋Ａ１７７Ｔ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｓ２６９Ｎ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｓ４１６Ａ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｈ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｄ４４４Ｙ＋Ａ４６９Ｅ＋Ｋ４７０Ｔ＋Ｉ４７３Ｇ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｋ１３Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１３Ａ＋Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１３Ａ，Ｒ；
Ｋ１８Ｒ；
Ｒ２０Ａ；
Ｋ２１Ｑ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ２１Ｑ，Ｒ，Ｔ；
Ｑ３２Ｈ＋Ｍ４０Ｌ＋Ｒ４９Ｇ＋Ｄ６５Ｅ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｔ９２Ａ＋Ｌ１０２Ｑ＋Ｔ１０４Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｋ２０２Ｅ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｔ３７４Ａ；
Ｄ３３Ｖ＋Ｑ６８Ｈ＋Ｎ１６８Ｈ＋Ｖ４５０Ｉ；
Ｌ３４Ｆ，Ｉ，Ｍ，Ｖ；
Ｌ３４Ｉ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｄ３７Ｇ，Ｎ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｅ３８Ｉ，Ｖ；
Ｍ４０Ｌ＋Ａ４１Ｔ＋Ｑ６７Ｍ＋Ｎ７２Ｓ＋Ｓ７６Ｄ＋Ｇ７８Ａ＋Ｑ８２Ｋ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１５３Ｋ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｄ２４９Ｎ＋Ｖ２７２Ａ＋Ｉ３３７Ｌ＋Ｍ３５６Ｌ＋Ｖ３９７Ａ＋Ｎ４１５Ｓ＋Ｔ４２１Ｉ＋Ｓ４２４Ｎ＋Ｎ４４１Ｄ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｅ４８９Ａ＋Ａ４９０Ｖ＋Ｔ５１７Ａ＋Ｓ５２２＊；
Ｍ４０Ｖ；
Ｌ４５Ｉ；
Ｑ６８Ｈ，Ｍ，Ｎ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｓ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２７４Ｄ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１２９Ａ，Ｔ＋Ｒ１５６Ｋ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｓ７６Ｗ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ａ，Ｄ，Ｉ，Ｓ，Ｖ，Ｙ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｎ＋Ｄ９７Ｎ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｓ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２７４Ｄ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｅ４４６Ｋ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｎ３３１Ｈ，Ｋ，Ｑ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｎ１４０Ｆ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｄ３２４Ｎ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｌ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ，Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｓ１２３Ｐ，Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｓ４８４Ｃ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｖ，Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｆ，Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ；
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｓ７６Ｅ，Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｒ，Ｔ，Ｖ，Ｗ；
Ｓ７６Ｗ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｓ７６Ｗ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｇ７８Ａ，Ｎ，Ｓ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｌ８０Ｖ；
Ａ８３Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｎ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｙ；
Ｋ８７Ｑ；
Ｋ８７Ｖ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｔ９２Ｉ，Ｖ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１０１ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１０１Ｒ；
Ｋ１０１Ｒ＋Ｌ１０２Ｉ；
Ｔ１０４Ａ＋Ｐ１１１Ｑ＋Ａ１１７Ｓ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｐ１１１Ｑ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｆ１４６Ｌ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ＋Ｎ３９９Ｉ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１１８Ａ，Ｒ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｄ１１９Ｌ；
Ｇ１２０Ａ；
Ｓ１２３Ｐ，Ｔ；
Ｓ１２３Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ，Ｆ，Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｓ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１６９Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ１７６Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ２７５Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ４４５Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４７０Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｖ１３９Ｋ＋Ｎ１４０Ｆ＋Ｑ１４７Ｓ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ１７７Ｔ＋Ｖ１７９Ｉ＋Ａ１８３Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ａ３２８Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ２４７Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ２４９Ｇ，Ｎ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３０３Ｉ，Ｋ，Ｓ，Ｖ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３２４Ｎ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ３６６Ｈ＋Ｔ３７４Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｄ４６１Ｎ，Ｑ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｅ２８８Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｇ２０４Ｔ＋Ｒ２１１Ｋ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１６４Ｎ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ４３６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｉ１０Ｖ＋Ｖ１４Ｉ＋Ｄ１９Ｅ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｉ２２２Ｖ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｖ２２８Ｉ＋Ｖ２３２Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１７６Ｐ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ２７５Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ３２２Ｉ＋Ｋ４５４Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４０６Ｎ＋Ｎ４１５Ｇ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ４５４Ｑ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｌ３８０Ｆ＋Ｎ３８３Ｙ＋Ｄ３８４Ｇ＋Ｎ３８９Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ２９８Ｆ＋Ｅ２９９Ｎ＋Ｇ３０１Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３０２Ｋ＋Ｄ３０３Ｌ，Ｓ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｐ５０７Ａ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｒ２６７Ｈ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｒ４０９Ｌ，Ｔ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｓ４４３Ｄ＋Ｋ４４５Ｓ＋Ｌ４４９Ｉ＋Ｖ４５０Ｉ＋Ｓ４５５Ｎ＋Ｍ４５６Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｔ２４４Ｄ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｖ１５９Ｍ＋Ｈ１６４Ｎ＋Ｆ１６５Ｙ；
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｖ２５９Ｉ＋Ｒ２６７Ｋ＋Ｌ２６８Ｋ＋Ｓ２６９Ａ；
Ｑ１３７Ｄ，Ｅ；
Ｎ１４０Ｆ；
Ｋ１４２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｆ１４６Ｃ＋Ｈ１６４Ｃ；
Ｆ１４６Ｋ，Ｌ；
Ｆ１４６Ｌ＋Ｋ３２２Ｉ；
Ｌ１４８Ｋ＋Ｎ１６８Ｄ；
Ｑ１４９Ｅ；
Ｒ１５６Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ；
Ｖ１５９Ｍ；
Ｈ１６４Ａ，Ｎ；
Ｌ１６６Ｉ；
Ｎ１６８Ｄ；
Ｋ１６９Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ１７６Ｐ；
Ａ１７７Ｅ，Ｔ；
Ｋ１８０Ｒ；
Ｈ１９３Ａ，Ｄ，Ｓ，Ｔ；
Ｒ１９７Ａ，Ｌ；
Ｈ１９９Ａ；
Ｇ２００Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ；
Ｋ２０２Ｎ，Ｑ，Ｒ；
Ｓ２１４Ｅ；
Ｋ２１７Ａ；
Ａ２２１Ｋ；
Ｇ２２５Ｓ；
Ｖ２３２Ａ；
Ｇ２３７Ａ，Ｓ，Ｖ；
Ｋ２４０Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ２５２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｇ２５３Ａ；
Ｒ２６７Ａ；
Ｌ２６８Ｉ；
Ｋ２７５Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｌ２７８Ｉ；
Ｆ２８１Ｌ；
Ｍ２９０Ｒ；
Ｒ２９５Ａ；
Ｋ３０６Ａ，Ｒ；
Ｋ３０７Ｑ；
Ｍ３１０Ｉ，Ｌ，Ｖ；
Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３９９Ｉ；
Ｒ３１４Ａ；
Ｇ３１６Ｉ；
Ｋ３２２Ａ，Ｒ；
Ｄ３２４Ｎ；
Ｎ３３１Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ；
Ｓ３３２Ｍ，Ｐ；
Ｓ３３２Ｐ＋Ｖ３９７Ｉ；
Ｒ３４０Ａ，Ｎ，Ｔ；
Ｋ３４２Ａ；
Ｖ３４５Ｉ；
Ｋ３４７Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｄ３４８Ｇ；
Ｋ３５３Ｑ，Ｒ；
Ｄ３６６Ｈ；
Ｍ３７３Ｑ；
Ｔ３７４Ａ；
Ｌ３８０Ｆ；
Ｋ３８２Ａ；
Ｎ３８３Ｙ；
Ｎ３８９Ａ，Ｆ，Ｎ，Ｖ；
Ｗ３９１Ｖ；
Ｋ３９２Ｇ，Ｑ；
Ｄ３９５Ｇ；
Ｇ３９６Ｐ；
Ｖ３９７Ｓ；
Ｎ３９９Ｉ；
Ｋ４０６Ｎ；
Ｇ４１３Ａ，Ｓ；
Ｋ４１４Ａ；
Ｎ４１５Ｓ；
Ｔ４１７Ｋ；
Ｆ４１８Ｉ；
Ｖ４３１Ｅ；
Ｈ４３６Ａ；
Ｎ４４１Ｇ＋Ａ４４２Ｅ＋Ｓ４４３Ｄ；
Ｓ４４３Ｅ，Ｋ，Ｑ；
Ｋ４４５Ａ，Ｒ，Ｓ；
Ｋ４４５Ｃ＋Ｋ４７０Ｃ；
Ｈ４４８Ａ；
Ｋ４５４Ｒ；
Ｓ４６７Ｒ＋Ｇ４６８Ｓ＋Ａ４６９Ｔ；
Ｇ４６８Ｓ，Ｙ；
Ｋ４７０Ｐ，Ｒ，Ｔ；
Ｉ４７３Ｔ；
Ｋ４７６Ｑ；
Ｋ４８２Ａ，Ｑ，Ｒ；
Ｋ４８８Ａ，Ｑ，Ｒ，Ｔ；
Ａ４９０Ｒ；
Ｇ４９８Ａ，Ｄ，Ｓ；
Ｒ５００Ａ，Ｔ，Ｖ；
Ｈ５１２Ａ；
Ｔ５１７Ａ＋Ｇ５１８Ｄ；又は
Ｇ５１８Ｄ。
【請求項４】
前記変異体が、アミノ酸配列番号３に対応する、位置６８、位置１２３、位置１５６、位置１１８、位置２００、位置１２９、位置１３７、位置１９３、位置９２、位置７６、又は位置３３１に対応する位置の１つ以上の改変を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記変異体が、位置６８の置換と、位置番号１２３、１５６、１１８、２００、１２９、１３７、１９３、９２、８３、１４９、３４、３４０、３３２、９、７６、３３１、３１０、３２４、４９８、３９５及び３６６からなる群から選択される１つ以上の追加位置の１つ以上の置換を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記変異体が、位置１５６の置換と、位置番号１０、１３、１４、１９、３７、６８、７８、９２、１１８、１２３、１２９、１３７、１３９、１４０、１４７、１５９、１６４、１６５、１６９、１７６、１７７、１７９、１８３、２００、２０４、２１１、２２２、２２４、２４４、２４７、２４９、２５９、２６７、２６８、２６９、２７５、２８８、２９９、３０１、３０２、３０３、３１０、３２４、３２８、３３１、３６６、３８０、３８３、３８４、３８９、４０６、４０９、４１５、４３６、４４３、４４５、４４９、４５０、４５４、４５５、４５６、４６１、４７０及び５０７からなる群から選択される１つ以上の追加位置の１つ以上の置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記変異体が、位置１２９及び位置１５６の置換を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記変異体が、Ｑ６８Ｈ，Ｎ，Ｌ；Ｓ１２３Ｐ，Ｔ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｗ，Ｌ，Ｍ；Ｋ１１８Ａ，Ｒ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ，Ｓ，Ｄ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ，Ｓ；Ｑ１３７Ｅ；Ｈ１９３Ｔ，Ｓ，Ｄ；Ｔ９２Ｖ，Ｉ，Ａ，Ｓ；Ａ８３Ｅ；Ｑ１４９Ｅ；Ｌ３４Ｆ，Ｉ，Ｖ；Ｒ３４０Ｔ，Ｎ；Ｓ３３２Ｐ；Ｔ９Ｄ；Ｓ７６Ｗ，Ｖ，Ｉ，Ｋ，Ｒ，Ｔ；Ｎ３３１Ｆ，Ｃ；Ｍ３１０Ｉ，Ｖ，Ｌ；Ｄ３２４Ｎ；Ｇ４９８Ａ，Ｄ；Ｄ３９５Ｇ及びＤ３６６Ｈからなる群から選択される１つ以上の置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記変異体が、Ｑ６８Ｈ；Ｓ１２３Ｐ；Ｒ１５６Ｙ，Ｆ；Ｋ１１８Ａ；Ｇ２００Ｐ，Ｅ；Ｋ１２９Ｔ，Ａ；Ｑ１３７Ｅ；Ｈ１９３Ｔ；Ｔ９２Ｖ及びＮ３３１Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記変異体が、以下の置換の組合せの１つ以上を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｑ６８Ｈ
Ｓ１２３Ｐ
Ｒ１５６Ｙ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｓ１２３Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ｒ＋Ｒ１５６Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ
Ｑ６８Ｈ＋Ｒ１５６Ｆ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１２９Ｔ＋Ｒ１５６Ｋ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｇ７８Ａ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｋ１６９Ａ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｍ３１０Ｖ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｈ１９３Ｔ＋Ｄ３６６Ｈ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｓ１２３Ｐ，Ｔ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
Ｑ６８Ｈ＋Ｔ９２Ｖ＋Ｋ１１８Ａ＋Ｋ１２９Ａ＋Ｑ１３７Ｅ＋Ｒ１５６Ｙ＋Ｇ２００Ｐ＋Ａ２２４Ｐ＋Ｎ３３１Ｆ
【請求項１１】
前記変異体の改変の総数が、２、更に好ましくは３、更により好ましくは４、更により好ましくは５、更により好ましくは６、更により好ましくは７、更により好ましくは８、更により好ましくは９、及び最も好ましくは１０である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記変異体が、配列番号３の前記親キシログルカナーゼのアミノ酸配列と７５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記変異体が、前記親キシログルカナーゼに比べて改善された化学安定性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記改善された化学安定性が改善された洗剤安定性をもたらす、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が液体洗濯洗剤組成物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、
（ａ）両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー；
（ｂ）ランダムグラフトコポリマー、ここで前記ランダムグラフトコポリマーは、
（ｉ）不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン酸、グリセロールなどの飽和ポリアルコール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖と、
（ｉｉ）Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖と、を含み；
（ｃ）次の一般構造を有する化合物：ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（ＣＨ３）−Ｎ＋−ＣｘＨ２ｘ−Ｎ＋−（ＣＨ３）−ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（式中、ｎは２０〜３０であり、及びｘは３〜８である。）又はその硫酸化若しくはスルホン酸化変異体；
から選択される１つ以上の成分を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が香料マイクロカプセルを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が布地色相剤を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、前記組成物の約０．１重量％〜約５重量％の、ｐＨ８で約４を超える条件安定度定数を有するカルシウム封鎖剤を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が固体形状である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
後続洗濯工程中に綿に汚れ放出効果を付与するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物におけるキシログルカナーゼの使用。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５２４４３８（Ｐ２０１１−５２４４３８Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２５５３（Ｐ２０１１−５１２５５３）
【出願日】平成２１年６月１日（２００９．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５７７０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４８９８３
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５９０００５０５８）ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー (2,280)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１日（２００９．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５７７０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４８９８３
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５９０００５０５８）ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー (2,280)
【Ｆターム（参考）】
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