マイクロ流体デバイスおよびその使用方法
エラストマー基材において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーからの蒸発を防止する蒸気バリアと、該複数の反応チャンバーの各々を隔離する連続相流体とを含むマイクロ流体デバイス。本発明は、マイクロ流体デバイスに関する。本発明はまた、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーからの蒸発を防止する蒸気バリアと、該複数の反応チャンバーの各々を隔離する連続相流体とを含むマイクロ流体デバイスにも関する。マイクロ流体デバイスを用いる標的核酸のデジタル定量法もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年１１月７日出願の米国仮特許出願６０／９９６，２３６（これはその全体が参考として本明細書において援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、マイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
現行のマイクロ流体デバイス（「チップ」）およびシステムは、小容量、一般に数ナノリットルの半自動的および自動的な操作を可能とする。サンプル処理およびアッセイの微細化により、速度および感度の両方が増大するほか、スケールの節約ももたらされ、すなわち、アッセイを実行し、所望の情報を得るのに必要とされる試薬、サンプル、および空間がより少量およびより狭小となり、個々のサンプルおよび試薬に対する操作の減少により誤差の可能性が低下する。マイクロ流体デバイスおよびマイクロ流体システムは、タンパク質結晶解析、無細胞タンパク質合成、ガスクロマトグラフィー、細胞分離、電気泳動、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを含む各種の化学的分析および生化学的分析による使用に適応または提供されている。
【０００４】
ＰＣＲおよび他の核酸に基づく方法の出現、ならびにヒトゲノム配列決定の完了により、各種の核酸に基づく診断および検査がもたらされ、このため、より正確で高感度な分析ツールに対する要求はとどまることがない。遺伝子の発現、多型、変異（遺伝性または他の形での）などについての知識が医療の改善へと置き換えられ、これが、より正確で高感度な分析ツールを要求している。遺伝子疾患、癌、および感染症のより早期の検出および診断により、即時の有益な影響がもたらされる。疾患の早期段階はより効果的に治療することができ、成功度がより高いことが多く、したがって、対象の転帰および生活の質を大きく改善する。
【０００５】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、比較的まれな遺伝子多型を検出する最新の「ゴールドスタンダード」であるが、配列の違いを信頼できる形で検出する前に、サンプル中に約２０％以上の配列の違いの存在を必要とする。ＰＣＲは、指数関数的増幅法であり、本来極めて高感度であり、原理的には単一分子の検出を可能とする。しかし、任意の非特異的な増幅または汚染により偽陽性がもたらされる場合があり、これにより、まれな配列を信頼できる形で検出することが極めて困難となる。標的配列がより高レベルで存在し得る他の分子種と極めて類似し、したがって、まれな分子種の検出におけるアッセイ感度を制限し得る場合、すなわちほぼ同一の配列を有する正常な分子によるバックグラウンドが大きいために、まれな癌細胞集団内における一塩基多型の存在が見えなくなりうる場合に、これは特に当てはまる。加えて、指数関数的増幅反応のリアルタイムでのモニタリングは、ダイナミックレンジが大きいが、識別力が制限され、２つの配列の相対度数の差が約２０％未満である場合は、検出が困難であり得る。多くの適用では、はるかに大きな感度が必要とされる可能性がある。例として述べると、循環血液からの胎児異数性の検出は、約１〜６％の対立遺伝子の違いの正確な検出を必要とする（Ｌｏら、１９９８年、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。
【０００６】
デジタルＰＣＲは、１９９９年にＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒにより初めて説明された（Ｐｒｏｔ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、第９６巻、９２３６〜９２４１頁）。デジタルＰＣＲ法は単一分子の増幅をもたらすが、従来の９６ウェルプレートおよび３８４ウェルプレートを用いるマイクロリットル容量のリアクター内における肉眼での実施は、非特異的な増幅、汚染、高額な試薬費用、および少ない反応数を克服しなければならない場合がある。したがって、デジタルＰＣＲによる定量的分析の実施には、低い偽陽性率で単一分子を信頼できる形で増幅することが必要である。これは、マイクロリットル容量のリアクターで注意深く最適化を行うことが必要とされることがらである。加えて、デジタルＰＣＲによる分析の精度は、反応数に依存する。１％の違いを信頼できる形で検出するには、数十万〜百万の反応を必要とする。これは、既存の方法を用いる場合、実際的でない。
【０００７】
新しく出現したマイクロ流体技術は、小容量の区画化、高いスケーラビリティー、およびスケールの節約による感度の増大を提供し、これにより、デジタルＰＣＲの最大限の力を実現することが可能となる。
【０００８】
アッセイサイズの縮小は、単なるスケールの節約を超えるものをもたらし、より少量のサンプルを用いることができ、１つのサンプルに対してより多くの検査を実施できることが最も明らかな有益性であるが、「従来の」容量サイズおよびサンプルサイズを用いては非実際的であるか、不可能であった生物学的アッセイもまた可能とすることができる。ある場合には、従来のアッセイを容易に縮小する（例えば、１００ｕｌの代わりに１ｕｌの容量を用いる）ことができる一方、他の場合には、アッセイを準備する方法、データを分析する方法、または他の点において大きな改変を必要とし得る。Ｚｈａｎｇら、２００６年（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ、第２４巻、２４３〜２８４頁）は、ＤＮＡ増幅ならびにマイクロ流体工学の適用に有用となりうる各種の方法、材料、および技法のためのＰＣＲ用マイクロ流体デバイスについて総説している。
【０００９】
溶液を多数の小容量反応に区画化することは、多くの分野で有用である。バルブおよび流路を含むマイクロ流体デバイスは、均一の空間配置により、平面的（２次元的）なエマルジョンの形成を可能とする。この均一なアレイには、各液滴を経時的に追跡または画像化し得る利点がある。これは、リードアウトの経時的モニタリングを必要とするアッセイ（例えば、リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応）において特に重要である。さらに、このような方法により、各液滴の容量が実質的に同じである、正確に規定されたアレイが可能となる。
【００１０】
バルブによる区画化を用いるマイクロ流体によるデジタルＰＣＲが、環境菌に対する多重遺伝子解析（Ｗａｒｒｅｎら、２００６年、ＰＮＡＳ、第１０３巻、１７８０７〜１７８１２頁）において、また、造血細胞の転写因子プロファイリング（Ｏｔｔｅｓｅｎら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３１４巻、１４６４〜１４６７頁）のために、用いられている。これらの実験で用いられるマイクロ流体デバイスでは、約９０００の個別の１０ｎＬ反応による区画化アレイが与えられる。
【００１１】
現行のマイクロ流体デバイスにおいて達成可能なＰＣＲ反応の密度および最小容量は、実際的な制限を受ける場合がある。アレイの密度が増加するにつれ、個別の反応チャンバー容量は減少し、バルブが過大な空間を占めるために実現可能でなくなる場合がある。マイクロ流体バルブを信頼できる形で作製し得る最大密度（ピッチ（ｐｉｔｃｈ）が約２００μｍである５０個×５０個のチャンバーアレイに基づく約２５００ｃｍ２であることが典型的）により、熱サイクリング時における過度の試薬の蒸発なしに気体透過性エラストマーによるデバイス内において実装し得るＰＣＲ反応の最小容量（約１ｎＬ）を伴って作製し得る、バルブにより画定される個々の反応チャンバーの数に対する上限（Ｔｈｏｒｓｅｎら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９８巻、５８０〜５８４頁）が与えられる。正確な測定は、単一のサンプルを数千〜数百万の個別の反応に区画化することを必要とし、このため、デバイス面積および試薬消費のいずれの点でもこれを高価なものとするので、デジタルＰＣＲでは密度およびスケールが特に重要である。したがって、アッセイ密度を劇的に増大させ、アッセイ容量を劇的に低減する新たな方法が、この技法の潜在力の全面的な実現における中心的な課題である。
【００１２】
各種の材料が、マイクロ流体工学の適用では公知であり用いられているが、操作の容易さおよびマイクロ流体デバイスのモノリシックの構築に対する適性ではシリコーンゴム材料（例えば、ポリジメチルシロキサン、またはＰＤＭＳ）が好ましく、ＰＤＭＳは、高度の気体透過性を示し、このため、デッドエンド構造の充填を可能とする。加えて、ＰＤＭＳは、水蒸気に対しても透過性が高い。こうして、ＰＤＭＳで構築されたマイクロ流体デバイス内において実施される一部の工程において、特に、高温が必要とされる場合、このようなＰＣＲは、急速な蒸発による小容量の水性反応物からの乾燥を被る可能性があり、反応は失敗する可能性がある。
【００１３】
この限界を克服しようとする試みでは、外部水分補給法が用いられている。これにより、蒸発速度がある程度低下するが、この水分補給を用いても、用いて成功し得るサンプル容量サイズは、やはり蒸発により制限される。このため、このようなシステムが、高密度アレイを可能とするであろう極めて小容量のサンプルサイズ（例えば、ピコリットル以下のオーダーにおける）、したがって、デバイスの有用性を向上させる大きなサンプル数を組み込む能力は制限される。
【００１４】
特許文献１は、ＰＣＲアッセイを実施するためのマイクロ流体デバイスを開示しており、マイクロ流体デバイスからの流体の蒸発を低下させる、該デバイス内における流体で満たした防護チャネルの使用もさらに開示している。
【００１５】
特許文献２は、失われた流体を、流体レザバーから毛細管チャネルを介して補充することによる、マイクロ流体デバイス内における蒸発に対する補完法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７，１１８，９１０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５５５，３８９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、マイクロ流体デバイスに関する。本発明はまた、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーからの蒸発を防止する蒸気バリアと、該複数の反応チャンバーの各々を隔離する連続相流体とを含むマイクロ流体デバイスにも関する。マイクロ流体デバイスを用いる標的核酸のデジタル定量法もまた提供される。
【００１８】
本発明は、反応チャンバー密度を３桁分上昇させて、平方インチ当たりの反応チャンバー約１０，０００，０００個（約１．５×１０６個／ｃｍ２）までの密度を達成する一方、各アッセイ容量を相応量だけ低下させるマイクロ流体デバイスを提供する。該デバイスは、個々の反応チャンバーを分離するバルブの必要なしに、ｐＬ容量のエマルジョンアレイへとアッセイを区画化する。
【００１９】
本発明の一局面により、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーからの蒸発を防止する蒸気バリアと、該複数の反応チャンバーの各々を隔離する連続相流体とを含むマイクロ流体デバイスが提供される。
【００２０】
本発明の一局面により、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーと同一平面で適用されており、エラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアとを含むマイクロ流体デバイスが提供される。
【００２１】
本発明の別の局面により、マイクロ流体デバイスは、流路に沿って配置されており、各々が流路と交わる１つまたは複数の制御チャネルを含む複数のバルブをさらに含む。
【００２２】
本発明の別の局面により、バルブは流路の第１および第２の端部に配置されている。
【００２３】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である。
【００２４】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである。
【００２５】
本発明の別の局面では、反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている。
【００２６】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、５０００個／ｃｍ２以上の密度で存在する。
【００２７】
本発明の別の局面により、マイクロ流体デバイス内において流体を区画化する方法であって、第１の流体を有する流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該第１の流体とは非混和性の第２の流体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の流体を移動させる工程とを含み、該複数の反応チャンバーの各々における該第１の流体を、該流路内における該第２の流体により他の反応チャンバーの各々における該第１の流体から隔離する方法が提供される。
【００２８】
本発明の別の局面により、標的核酸のデジタル定量法であって、マイクロ流体アレイの流路と流体連絡した複数の反応チャンバーに標的核酸を含む第１の流体を充填する工程と、該第１の流体とは非混和性の第２の流体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の流体を移動させる工程であって、該複数の反応チャンバーの各々における該第１の流体を、該流路内における該第２の流体により他の反応チャンバーの各々における該第１の流体から隔離する工程と、該マイクロ流体アレイをインキュベートする工程とを含む方法が提供される。
【００２９】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である。
【００３０】
本発明の別の局面により、第１の流体は水溶液である。
【００３１】
本発明の別の局面により、第２の流体は非水性流体である。
【００３２】
本発明の別の局面により、第１の流体は、ＰＣＲ用の反応混合物を含む。
【００３３】
本発明の別の局面により、第１の流体はサンプルを含む。
【００３４】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである。
【００３５】
本発明の別の局面では、反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置される。本発明の別の局面により、標的核酸は、第１の流体中において、複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約１個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である。
【００３６】
本発明の別の局面により、標的核酸は、第１の流体中において、複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約０．５個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である。
【００３７】
本発明の別の局面により、インキュベートする工程は、熱サイクリングを含む。
【００３８】
本発明の別の局面により、エラストマー基材内において形成されている流路と連絡した複数の反応チャンバーと、２つ以上の反応チャンバー間の流体連絡を阻止する流体バリアとを含むマイクロ流体デバイスが提供される。
【００３９】
本発明の別の局面により、デバイスは、複数の反応チャンバーと同一平面で適用されており、エラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアをさらに含む。
【００４０】
本発明のこの概要は、本発明のすべての特徴を必ずしも説明するものではない。本発明の特定の実施形態についての以下の説明を吟味すれば、当業者には、本発明の他の局面、特徴、および利点が明らかとなろう。
【００４１】
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面が参照される以下の説明からより明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、マイクロ流体デバイスの作製工程についての概略図を示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態によるマイクロ流体アレイの概略図を示す。（ａ）１インチ×１インチ（２．５４ｃｍ×２．５４ｃｍ）の面積において１，０００，０００個の反応チャンバーをフィーチャするマイクロ流体アレイを示す図である。（ｂ）サンプル充填領域を示す挿入図Ａである。（ｃ）マイクロ作製された反応チャンバーおよびフィードチャネルを示す挿入図Ｂである。（ｄ）反応チャンバー形状の３次元的描画である。この例において、該チャンバーは、底面の１辺が１０ミクロン、高さ４０ミクロンで、総容量が４ピコリットル（ｐＬ）である。（ｅ）バルブチャネルを欠く、（ａ）と同様のマイクロ流体アレイを示す図である。（ｆ）挿入図Ｄである。（ｇ）バルブチャネルを欠き、水分補給チャネルを含む、（ａ）と同様のマイクロ流体アレイを示す図である。
【図３】図３は、反応チャンバー内における流体の隔離を示す概略図を示す。（Ａ）では、チャネルおよび反応チャンバーに第１の流体（Ｆ１：ドット）が充填されている。（Ｂ）では、第２の流体（Ｆ２：チェック）が導入されてチャネル内に流入し、第２の流体が第１の流体をチャネルから移動させるが、第１の流体は反応チャンバー内に残存する（第２の流体の流動により「取り除かれる」）。（Ｃ）では、第１の流体がチャネルから移動し、反応チャンバー、および反応チャンバーアクセスチャネルの一部だけに残存する。矢印により流体流動の方向を示す。
【図４】図４は、容量に関するスケーリングの精度および特異性についての統計学的プロットを示す。（Ａ）チャンバー数の関数としてのデジタルＰＣＲを用いて１％だけ異なる２つの対立遺伝子に対して測定された平均の分離についての数値計算を示す図である。差は、確率論的二項分布ノイズ（サンプリングノイズ）により決定される予測標準偏差（シグマ）により標準化される。反応チャンバーの５０％における陽性増幅に対応するテンプレート濃度について、計算を実施した。約１，０００，０００個のチャンバーで５シグマの分離が達成されている。（Ｂ）１００万個中に１個の頻度で存在するまれな分子種を検出するために、チャンバー容量の関数としての特異的増幅と非特異的増幅との効率比についての数値計算を示す図である。
【図５】図５は、チャンバー当たり１０コピーで充填されたゲノムＤＮＡ（ポジティブコントロール）およびテンプレートなしのコントロール（ネガティブコントロール）サンプルに由来するＧＡＰＤＨ増幅の蛍光画像を示す。細線は、同じ流路に連絡された反応チャンバーのセットの輪郭を示す。太線は、蒸気バリアの境界を示す。デバイス底部において、サンプルの脱水による増幅失敗のエッジ効果が見られる。ポジティブコントロールの反応チャンバー（領域Ａ、Ｄ、およびＥ）内におけるＰＣＲ反応が標的ＤＮＡおよび増幅に必要な試薬を含む一方、領域ＢおよびＣにおけるネガティブコントロールの反応チャンバーは標的ＤＮＡを欠いた。明色の領域は、標的ＤＮＡに対するＰＣＲ増幅の成功を示す。
【図６】図６は、本発明によるマイクロ流体デバイスにおけるＰＣＲ反応の増幅プロットを示す。
【図７】図７は、本発明の平面エマルジョンアレイを用いる、第９番染色体（Ｃ９）に対する第２１番染色体（Ｃ２１）の３％の増加の検出についての結果を示す。ゲノムＤＮＡサンプルを６％のトリソミー２１ ＤＮＡでスパイクしたところ、最終的に、Ｃ９に対してＣ２１が３％増加した（黒色ダイヤモンド）。染色体が正常な個体に由来する純粋なゲノムＤＮＡは、１：１のＣ２１：Ｃ９比を有する（黒色四角）。
【図８ａ】図８は、ＪＡＫ２におけるＶ６１７変異体に対して異なる比の野生型を検出するアッセイの結果を示す。一定量の野生型に異なる量の変異体プラスミドを添加した（曲線因子（Ｆｉｌｌ ｆａｃｔｏｒ）０．５）。（Ａ）は、得られた比（濃色バー）および理論比（薄色バー）を示す。（Ｂ）は、０．１％のサンプルおよびコントロールサンプルを除き、Ａの場合と同じ比を示す。
【図８ｂ】図８は、ＪＡＫ２におけるＶ６１７変異体に対して異なる比の野生型を検出するアッセイの結果を示す。一定量の野生型に異なる量の変異体プラスミドを添加した（曲線因子（Ｆｉｌｌ ｆａｃｔｏｒ）０．５）。（Ａ）は、得られた比（濃色バー）および理論比（薄色バー）を示す。（Ｂ）は、０．１％のサンプルおよびコントロールサンプルを除き、Ａの場合と同じ比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーを覆う蒸気バリアと、該複数の反応チャンバーの各々を隔離する連続相流体とを含むマイクロ流体デバイスに関する。該マイクロ流体デバイスを用いる、標的核酸のデジタル定量法もまた提供される。
【００４４】
「流路（ｆｌｏｗ ｃｈａｎｎｅｌ）」とは、流体が流動する経路を一般に指す。
【００４５】
「反応チャンバー」、「反応ウェル」、または「ウェル」とは、化学的反応または酵素的反応が発生する境界づけられた領域である。それは、壁および１つまたは複数のバルブにより境界づけることができる。代替的に、反応チャンバーは、壁および流体バリアにより境界づけることもできる。反応チャンバーの「壁」は、該チャンバーを境界づけるすべての表面（流体、固体、または半固体）を含む。反応チャンバーは、１つまたは複数の流路と連絡され、該連絡は、１つまたは複数の流路による反応チャンバーの充填および／または排出を可能とする開口部を含む。本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイス内における複数の反応チャンバーは、均一なアレイに配置することができる−この配置をマイクロ流体アレイと呼ぶことができる。
【００４６】
「隔離された反応チャンバー」とは、別の反応チャンバーまたは流路と流体連絡されていない反応チャンバーである。流体連絡は、例えば、バルブ、または流体バリアにより阻止することができる。流体バリアは、例えば、反応チャンバー内における材料（通常、別の流体）とは非混和性の流体により形成することができる。
【００４７】
「出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバー」とは、流体の流入を可能とする単一のアクセスポートまたは開口部を有するが、別個の流出口を欠くチャンバーである。
【００４８】
「デッドエンド充填（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ｆｉｌｌ）」とは、圧力下にある流体によりデッドエンドであるかまたは出口のない反応チャンバーに充填する方法である。最初に流体をチャネル構造に注入すると、それは、最小抵抗経路に従い、一部の領域を充填されていないかまたは部分的に充填された状態のままに放置する。マイクロ流体の作製において用いられる一部のエラストマー材料の気体透過性を利用して、デッドエンドチャネルに充填することが可能となる。すべての流出バルブを閉じて、圧力下（約３００ｐｓｉまたは約２００ｋＰａまでの）において流体を注入することにより、押圧された流体が該チャネルに充填され、該デバイスのチャンバーまたはチャネル内における任意の気体（空気）を圧迫する。押圧された気体はエラストマー内全体に拡散し、デッドエンドであるかまたは出口のない反応チャンバーを流体で充填して消失する。
【００４９】
「試薬」とは、分析対象（例えば、分析される細胞、代謝物、または核酸）以外で反応において用いられる任意の作用物質を広く指す。核酸増幅反応用の試薬の例は、緩衝液、界面活性剤、金属イオン、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、キナーゼまたはホスファターゼ、プライマー、テンプレート核酸または標的核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼなどを含むがこれらに限定されない。酵素反応用の試薬は、例えば、基質、補因子、緩衝液、金属イオン、阻害剤、および活性化剤を含む。細胞ベースの反応用の試薬は、酵素反応または核酸検出用の上記の試薬のほか、細胞、細胞特異的色素、または細胞受容体に結合するリガンド（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）を含むがこれらに限定されない。エラストマー表面への試薬の吸着を低下させるため、試薬混合物中にＴＷＥＥＮ−２０などの界面活性剤を組み入れることができる。
【００５０】
プライマーとは、標的核酸にアニールし、核酸ポリメラーゼにより伸長する短い（一般に、１０〜３０ヌクレオチドの）核酸またはオリゴヌクレオチドである。プライマーは、標的核酸と完全に相補的な（プライマーのすべてのヌクレオチドと標的核酸との間で１００％マッチする）場合もあり、プライマーが標的核酸の部位において選択的にハイブリダイズするように実質的に（１００％未満）相補的な場合もある。
【００５１】
プローブとは、標的核酸と特異的にハイブリダイズする核酸配列である。ハイブリダイゼーションは、例えば、二本鎖の立体構造の形成だけによって蛍光発光するように改変された特性を有する蛍光標識または蛍光色素（例えば、ＤＮＡ染色色素）または蛍光発光（例えば、分子ビーコン）により検出可能である。プローブは、標的核酸配列に対する十分な相補性をもたらし、反応条件下においてアニールするのに適する任意の長さであり得る。ハイブリダイゼーションにおいて用いられるプローブは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）プローブ、ならびにペプチド核酸を含みうる。一塩基多型または数個のヌクレオチドに関与する他の変異を同定するためのハイブリダイゼーション法は、米国特許第６，２７０，９６１号、同第６，０２５，１３６号、および同第６，８７２，５３０号において説明されている。本発明による使用に適するハイブリダイゼーションプローブは、約６〜約４００ヌクレオチド、約２０〜約２００ヌクレオチド、または約３０〜約１００ヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＬＮＡ、およびＰＮＡを含む。
【００５２】
オリゴヌクレオチドとは、特定の核酸の検出および／または増幅のためのプローブ、プライマーとして有用であり得る可変長の核酸である。オリゴヌクレオチドを合成するための公知の方法は数多い−例えば、Ｂｏｎｏｒａ ＧＭ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９０年）、第１８巻、第１１号、３１５５〜９頁；Ｌａｓｈｋａｒｉ ＤＡ．ら、ＰＮＡＳ（１９９５年）、第９２巻、第１７号、７９１２〜５頁；ＭｅＧａｌｌ Ｇ．ら、ＰＮＡＳ（１９９６年）、第９３巻、第２４号、１３５５５〜６０頁；Ａｌｂｅｒｔ ＴＪ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（２００３年）、第３１巻、第７号、ｅ３５頁；Ｇａｏ Ｘ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２００４年）、第７３巻、第５号、５７９〜９６頁；およびＭｏｏｒｃｒｏｆｔ ＭＪ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（２００５年）、第３３巻、第８号、ｅ７５頁： Ｇａｉｔ、１〜２２頁；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、３５〜８１頁；Ｓｐｒｏａｔら、８３〜１１５頁；およびＷｕら、１３５〜１５１頁、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４年、オックスフォード、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ社；または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ社を参照されたい。
【００５３】
一部の核酸またはオリゴヌクレオチドには、該オリゴヌクレオチドにおける酵素的安定性の変化もしくは改善、または立体構造上の制約をもたらす単量体を組み込むことができる。例えば、二重環状ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに対する立体構造上の制約をもたらす可能性があり、非修飾のオリゴヌクレオチドと比較して、異なるハイブリダイゼーションプロファイルまたは安定性プロファイルをもたらし得る。ＬＮＡヌクレオシドは二重環状ヌクレオシドの例であり、ＵＳ６，２６８，４９０、ＵＳ６，７９４，４９９、ＵＳ７，０３４，１３３（参照によりこれらの各々を本明細書に組み込む）において説明される通り、２’−４’環状結合を有する。ＬＮＡ単量体を含む核酸ポリマーの合成および重合化の方法は、例えば、ＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ０１／２５２４８、ＷＯ０１４８１９０、ＷＯ０２／２８８７５、ＷＯ０３／００６４７５、ＷＯ０３／０９５４７、ＷＯ２００４／０８３４３０、ＵＳ６，２６８，４９０、ＵＳ６，７９４，４９９、米国特許第７，０３４，１３３号において説明されている。
【００５４】
「ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）」の工程または反応とは、試薬の添加および反応の複数にわたる個別の工程なしに、単一の反応チャンバー内において実行される工程である。ワンポット反応では、反応に必要な試薬を単一の反応媒体内で、実質的に同時に、一体に混合する。例えば、ワンポットのＰＣＲ反応は、単一の反応チャンバー内において増幅反応および検出の両方のための試薬を混合し得る増幅および検出の両方が同じ反応チャンバー内で実行される。特定の標的核酸の増幅および検出に必要なすべての試薬（標的核酸、プライマー、プローブ、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液、塩などを含む）を含む反応混合物を混合することができ、この単一の混合物を本発明のマイクロ流体デバイス内に注入することができる。反応混合物ですべての反応チャンバーに充填し、該チャンバーを隔離し、熱サイクリングを実施する。特定の増幅産物の検出は、熱サイクリングの発生時、もしくはその発生後、またはその両方において実施することができる。ワンポット工程の変形形態として、本発明のマイクロ流体デバイスの合成時またはその後において、該デバイスの反応チャンバーのアレイまたはサブアレイ内に試薬を配置することができる。増幅に必要な残るすべての試薬を含む反応混合物を本発明のマイクロ流体デバイス内に注入し、反応チャンバー内においてプライマーおよびプローブを反応混合物と最終的に混合する。ここでもまた、特定の増幅産物の検出は、熱サイクリングの発生時、またはその両方において実施することができる。
【００５５】
「流体連絡（ｆｌｕｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）」−マイクロ流体デバイスの２つ以上のエレメント（例えば、流路、注入ポート、流出ポート、ビア、反応チャンバー、流入口、または境界により画定される他のスペース）は、該２つのエレメントを連絡させる、流体を除外しない連続経路が存在する場合、流体連絡される。流体連絡は、バリア、バルブ、ポンプ、または該流体連絡の断絶の制御、およびマイクロ流体デバイスの１つまたは複数のエレメントの隔離を可能とする他の制御デバイスを介在させる場合がある。それらの中に第１相の第１の流体を有する２つ以上のエレメントの間の流体連絡はまた、非混和性の第２相の流体も介在させる場合がある。非混和性の流体を該エレメントの１つに導入することで、第１の流体を移動させる。例として述べると、エマルジョン中において、分散相の液滴の流体連絡は、連続相のエマルジョンにより断絶または阻止される。
【００５６】
本発明の一部の実施形態において、非混和性の流体とは、本発明のマイクロ流体デバイスの反応チャンバー内における液滴間の流体連絡に介在するかまたはこれを阻止するバリアまたはバルブ（「流体バリア」または「流体バルブ」）であり得る。
【００５７】
理論により拘束されることは望まないが、本明細書に記載の方法では、第１の流体と、１つもしくは複数のチャネル壁または反応チャンバー壁と、第１の流体とは非混和性の第２の流体との間における表面張力を利用して、その位置およびサイズがマイクロ流体チャネルの構造により正確に規定されるマイクロスケールの液滴の均一なアレイを創出する。
【００５８】
２つの非混和性の流体が混合し、１つの流体（分散相）が他の流体（連続相）中に液滴またはコロイドとして懸濁すると、エマルジョンが形成される。連続相が液滴間におけるバリアを形成し、該エマルジョンが安定化される（液滴の合体が阻止される）場合、各液滴は、隔離された反応容器であり得る。界面活性剤の使用は、エマルジョンを安定化する１つの方法である。別の方法は、マイクロ流体デバイスの構造によりその位置およびサイズが正確に規定され、したがって、接触することが不可能なマイクロスケールの液滴の均一なアレイを可能とするチャンバー式のマイクロ流体デバイスと組み合わせて、分散相と、１つもしくは複数のチャネル壁または反応チャンバー壁と、連続相との間の表面張力を利用することである。
【００５９】
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスの構成は、アクセスチャネルを介して一連のナノリットル（ｎＬ）容量、ピコリットル（ｐＬ）容量、またはフェムトリットル（ｆＬ）容量のチャンバーに連絡されるマイクロ流体チャネルの直線アレイを含む。第１の流体、例えば、ＰＣＲ増幅に必要とされるすべての成分を含むアッセイ混合物を、圧力下において流路内にまず導入し、すべての反応チャンバーにデッドエンド充填する。周囲空気は、反応チャンバーから気体透過性エラストマーによるデバイスのバルク内へと押し出される。限界希釈率で投入されたテンプレート分子は、ポアソン統計に従い、チャンバーアレイ全体に無作為に分配される。チャンバーに充填したら、流路を介して第２の流体を注入し、第１の流体を移動させる。理論により拘束されることは望まないが、相界面が各チャンバーを流過して前進すると、チャネルの狭窄部では表面張力による不安定が生じる結果、その位置および容量がチャンバーの形状により正確に規定された水溶液滴が分離する。これらの水溶液滴は、表面張力のためにチャンバーの大きな断面内にとどめられた状態を保ち、これにより、熱サイクリング時における各液滴の正確な配置が可能となる。
【００６０】
多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）は、数百〜数千の微細な反応チャンバー、バルブ、ポンプ、流体論理エレメント、および他の構成要素を有するマイクロ流体デバイスの容易かつ頑健な作製を可能とする軟質エラストマー処理における周知の作製法である。ＸｉａおよびＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、１９９８年（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、第３７巻、５５１〜５７５頁；参照により本明細書に組み込まれる）は、ＭＳＬを含むソフトリソグラフィーの手順、材料、および技法を説明し、総説している。
【００６１】
略述すると、多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）の全般的な発想は、厚さの異なるエラストマー、例えば、ＰＤＭＳの層を、各々の上面に繰り返し積み重ねることである。それぞれ１０：１未満の化学量論比およびこれを超える化学量論比を有するＰＤＭＳの薄層および厚層を個別のウェハー上で形成する。既にウェハー上で作製されたフォトレジストパターンにより、デバイスのマイクロ流体チャネルを規定する。次いで、厚層をウェハーから剥離させて薄層のウェハー上面に置く。ベーキングすると、各層の余剰成分が結合し、２層のチャネルからなるＰＤＭＳ「チップ」が形成される。エラストマーを加工し、マイクロ流体的に適用する方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９２９，０３０号；Ｓｃｈｅｒｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第２９０巻、１５３６〜１５３９頁；Ｕｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第２８８巻、１１３〜１１６頁；ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．、２００２年、第３５巻、４９１〜４９９頁；Ｔｈｏｒｓｅｎ， Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９８巻、５８０〜５８４頁；Ｌｉｕ， Ｊ．ら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、２００３年、第７５巻、４７１８〜４７２３頁；Ｒｏｌｌａｎｄら、２００４年、ＪＡＣＳ、第１２６巻、２３２２〜２３２３頁；ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３６１５号および同第ＷＯ０１／０１０２５号を参照されたい。
【００６２】
一般にエラストマー（ｅｌａｓｔｏｍｅｒ）と呼ばれる各種の軟質ポリマーを、マイクロ流体デバイスおよびマイクロ流体システムで用いることができる。エラストマーは一般に、広範な熱安定性、高潤滑性、撥水性、および生理学的不活性を特徴とする。エラストマーの他の望ましい特性は、適用に伴い変化し得る。所望の目的に適するエラストマーまたはエラストマーの組合せを選択することは、当業者の能力内にある。エラストマーの例は、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、光硬化性ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、フルオロシリコーン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン、ポリイソブチレン、ポリウレタン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ビニル−シラン間架橋シリコーンなどを含む。エラストマーは、光学的に透明の場合もあり、不透明の場合もあり、多様な程度に透明な場合もある。本発明の一部の実施形態では、生体適合性エラストマーを用いることが望ましい場合がある。ＰＤＭＳは、ソフトリソグラフィーへの適用において最初に開発されより広く用いられているエラストマーの１つである。ＰＤＭＳを本発明の各種の実施形態で用いられるエラストマーとして説明する場合、それは例示的な目的に過ぎず、代替的なエラストマーの選択も当業者の知識内にある。マイクロ流体的な適用において用いるのに適する各種のエラストマー、およびこれらの多様な特性および適用例は、米国特許第６，９２９，０３０号において説明されている。
【００６３】
シリコンウェハーまたは他の適切な支持体上にレイアウトされたフォトレジストパターンにより、該層を成形するためのテンプレートがもたらされる。一般に、フォトレジストは、ポジティブ型またはネガティブ型として分類することができる。ポジティブ型フォトレジストは、極めて精細な分解能が可能である。これらは、ＫＯＨなどのアルカリ溶液中でよく溶けるが、ジアゾナフタキノン（ＤＱ）などの感光性溶解阻害剤を用いてこの作用を遮断することが典型的である。紫外（ＵＶ）光との光反応によりＤＱが破壊され、現像液による該フォトレジストの溶解が可能となる。フォトレジストに対するこの種の処理の発想は、ＵＶ光に露光されたすべての区画が除去されるということである。ポジティブ型フォトレジストの例は、ＳＰＲ２２０−７（Ｓｈｉｐｌｅｙ Ｃｏｍｐａｎｙ ＬＬＣ社製）である。
【００６４】
ネガティブ型フォトレジストは一般に、非感光性基質、感光性架橋形成剤、およびコーティング溶剤を含む。ＵＶ光への露光時に架橋形成剤が活性化され、硬質のエポキシを形成させる。該フォトレジストの残りの非露光区画は、現像液により洗い流される。ＳＵ８（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ社製）が、いずれのＭＳＬテンプレートにおいても用いうるネガティブ型フォトレジストの例である。加えて、ＳＵ８は、エポキシとして極めて強力であり、後続のフォトリソグラフィー工程に対して耐性であり得る。特定のフォトレジストを加工する詳細な方法および技法は各製造元から入手できるので、本明細書ではこれ以上立ち入らない。具体的なフォトレジストの例は例示的な目的に過ぎず、本発明の限定として考えるべきではない。
【００６５】
作製時には、他の構成要素をマイクロ流体デバイスに組み込み得、ＭＬＳ時には、ミクロンスケールのバルブ、ポンプ、チャネル、流体マルチプレクサー、灌流チャンバーなどを集積化することができる。このような構成要素を作製し集積化する方法は、例えば、米国特許第７，１４４，６１６号、同第７，１１３，９１０号、同第７，０４０，３３８号、同第６，９２９，０３０号、同第６，８９９，１３７号、同第６，４０８，８７８号、同第６，７９３，７５３号、同第６，５４０，８９５号；米国特許出願第２００４／０２２４３８０号、同第２００４／０１１２４４２号；ＰＣＴ出願第ＷＯ２００６／０６０７４８号において説明されている。
【００６６】
蒸発は、ピコリットルの容量範囲にあるアッセイを実施する場合に克服すべき障害である。マイクロ流体デバイスの作製時には、そこに流体が配置されるかまたは移送され、そこでの流体の喪失が望ましくない、反応チャンバーおよび反応チャネルに近接する形で、デバイス内に蒸気バリアを組み込むことができる。蒸気バリアは、任意の適切な材料であり得る。適切な材料は、光学的に透明であり、水蒸気に対して不透過性であり、マイクロ流体デバイスを含む基材、およびアッセイ混合物中で用いられる流体、または流路内においてアッセイ混合物を移動させるのに用いられる非混和性の油もしくは流体と非反応性であり、マイクロ流体アレイの作製およびそれらが用いられるアッセイにおいて用いられる温度範囲に対して耐性であり得ることが好ましい。加えて、用いられるエラストマーに結合し得る材料を用いることが望ましい。良好な結合は、エラストマーの特性の場合もあり、１つまたは複数の接着層の適用により達成する場合もあり、材料表面の改変（例えば、酸素プラズマへの曝露による）による場合もある。適切な材料の例は、アセテート、ポリエチレン、またはポリエチレンベースのシート、ポリキシレンポリマー（Ｐａｒｙｌｅｎｅ（商標）Ｎ、同Ｃ、同Ｄ）であり、他の例は、ガラス、シリコン、石英、雲母を含む。同様に、他のポリマー材料も用いることができ、これらのポリマー材料は、あらかじめ作製された膜として沈着させることもでき、膜として配置される液体（例は、樹脂調合物、ポリマー溶液、前駆体混合物などを含む）の沈着など他のポリマー処理法を用いて沈着させることもでき、ポリマー（Ｐａｒｙｌｅｎｅなどの）の蒸着によって沈着させることもでき、材料を表面上に凝縮させる蒸発によって沈着させることもでき、エアゾールの噴霧などによって沈着させることもできる。
【００６７】
蒸気バリア（ｖａｐｏｒ ｂａｒｒｉｅｒ）は、アレイの少なくとも１つの側と同一平面にあるマイクロ流体デバイスの作製時において適用または配置される。蒸気バリアは、デッドエンド充填によりエラストマー内に押し出された気体を吸収するのに十分な厚さのエラストマー層により、アレイの反応チャンバーの１つの壁から分離される。この厚さは、例えば、約１０〜約５００μｍ、約５０〜約２５０μｍ、または約７５〜約２２５μｍ、または約１００〜約２００μｍ、または約１２５〜約１７５μｍであり得る。理論に束縛されることは望まないが、この形状により、移送（蒸発）がアレイの側面だけを介して生じるように、水蒸気の実質的に二次元的な勾配が確立される。
【００６８】
好ましい例において、アレイは、平面の両側において蒸気バリアにより挟みこまれる。本発明の一部の実施形態において、マイクロ流体アレイは、シリコン基材（アレイの底部）と、アレイの上部におけるアセテートまたはポリエチレンによるシートとの間に配置され、から分離される。説明した通りに構成される２枚の蒸気バリアを用いるデバイスの場合、バリアは、反応チャンバーの高さ、および反応チャンバーアレイの上方または下方に配置される流路、バルブなど、任意の付加層の存在に応じて変化する任意の適切な距離だけ分離させることができる。
【００６９】
作製工程の簡単な概略図を図１に示す。（Ａ）標準的なソフトリソグラフィー法を用いて、ウェハー１２１上にテンプレートフィーチャ１２０を成形する。（Ｂ）その厚さがフィーチャの高さよりもわずかに高くなるように、ウェハー上面に液体ＰＤＭＳをスピンコート（ｓｐｉｎ）し、部分的に硬化させる。（Ｃ）蒸気バリア１２３をＰＤＭＳ層１２２の上面に適用し、第２のＰＤＭＳ層１２４により被覆する。（Ｄ）脱気およびベーキング後、テンプレートからデバイスを剥離させると、硬化したＰＤＭＳ上にネガティブインプリントが残る。
【００７０】
図２ａ〜ｄを参照すると、本発明の一実施形態によるデバイスの概略図が１００において全体的に示される。図２ｂは、図２ａの挿入図Ａを示し、図２ｃは、図２ｄの挿入図Ｂを示し、図２ｄは、図２ｃの挿入図Ｃで示される反応チャンバー１１４の三次元描画を示す。この例示的なデバイスは、反応チャンバー１１４に充填するための、一連のカスケード流路１０５、１０７、１０９と流体連絡した１３本の一次流路１０３を含む。各一次流路はサブアレイへと通じ、これに反応混合物、サンプルなどを含む流体を充填することができ、これは流路から独立でありえ、したがって、同じデバイス上において複数のサンプルまたは同じサンプルに対する複数の反応を充填し処理することが可能となる。
【００７１】
バルブ流路１０２ａ、１０２ｂは、一次流路１０３と交差し、反応チャンバーのアレイを挟む。注入ポート１０４からの流体の流動はバルブ１０８により調整され、バルブ１０８はバルブ流路１０２ａ、ｂ内における流体圧により開閉する。バルブ流路１０２ａに沿うすべてのバルブは、注入ポート１０６ａにより同時に操作することができ、バルブ流路１０２ｂに沿うすべてのバルブは、注入ポート１０６ｂにより同時に操作することができる。反応チャンバー１１４は、反応チャンバーアクセスチャネル１１２を介して反応チャンバー流路１１０と流体連絡している。図２ｃおよび２ｄに示す実施形態では、反応チャンバー１１４が出口のないチャンバーであり、単一の充填ポートを有し、別個の流出ポートを有さない。図２ｄに示される反応チャンバー１１４は幅よりも高さが高く、反応チャンバーの底部にアクセス流路を有する。反応チャンバーの他の構成も可能である。例えば、図２ｄに示す場合などの反応チャンバーは、「専有」面積（幅×奥行き）が小さく、幅または奥行きよりも高さの方が高い。このような「垂直方向の」構成では、サンプル容量がより大きくなり、チャンバーの平面密度が最大化される。より大きな反応容量により、反応チャンバー内により大量のフルオロフォア（または他の検出可能な標識もしくはシグナル発生試薬）を組み入れることができ、したがって、検出のためのより強いシグナルとなる。
【００７２】
図２ｅおよび２ｆを参照すると、バルブチャネル１０２ａ、ｂ、バルブ１０８、およびバルブ流路流入口１０６ａ、ｂを欠く本発明の代替的な実施形態の概略図が１３０において全般的に示される。図２ｆは図２ｅの挿入図Ｄを示し、図２ｆの挿入図Ｂは図２ｃに示される通りである。反応チャンバー１１４に充填するための流路１０３、１０５、１０７、１０９は、前出で検討した通りである。
【００７３】
バルブ流路および一次流路とは別個に充填されて操作される水分補給（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）チャネルをアレイの周囲に組み入れ、アレイエッジ近傍の反応チャンバーに水分補給することができる。図２ｇを参照すると、本発明の代替的な実施形態の概略図が、１４０において全般的に示される。この実施形態は、図２ａ〜ｄおよびｅ〜ｆにおいて示される注入ポート１０４および流路を含み、水分補給チャネル１４２および水分補給ポート１４４をさらに含む。水分補給チャネル１４２は、一次流路１０３の上層または下層に形成され、水分補給チャネル内における流体の流動および圧力が、一次流路１０３または流路１０５、１０７、もしくは１０９（示さない）における流体の流動を実質的に制限するように、十分な厚さのエラストマーにより一次流路１０３を含む流路および反応チャンバーから分離されている。「実質的に制限する」という用語（または類似の用語）は、水分補給チャネルが流体を含有しないか、または圧力下にある条件下での、流路または反応サイトにおける流体の流動であるか、これに向かう流体の流動であるか、またはこれを介する流体の流動と比較して、流路または反応チャンバーにおける流体の流動であるか、これの外の流体の流動であるか、またはこれを介する流体の流動が４０％を超えて低下しない（典型的には３０％未満、好ましくは２０％未満、またはより好ましくは１０％未満低下する）ことを示すものと理解されたい。水分補給チャネル１４２は、流路１０３、１０５、１０７、または１０９の場合とほぼ同じ内径を有し得る。
【００７４】
当業者は、本発明の一部の実施形態では、本明細書で開示される多様な特徴を組み合わせ得ることを理解するであろう。例えば、マイクロ流体デバイスは、図２ａおよびｂで示されるバルブ流路のほか、水分補給チャネルも含む場合がある。水分補給チャネルの他の構成もまた意図され、例えば、一連の個別の水分補給チャネルをマイクロ流体デバイスのエッジに沿って配置することができる。
【００７５】
本発明の一部の実施形態によるデバイスは、各々が個別の区画またはサブアレイと連結される複数の個別の注入ポートを含むように作製することができる−高密度のアレイにより、単一のデバイス上における空間の多重化を用いる多重サンプル分析が可能となる。例えば、約１，０００，０００の反応のアレイを、各々が約２５，０００個の反応チャンバーを含む４０の独立した区画に分割することができる。各々の独立したサブアレイと連結される個別の注入ポートにより、多重サンプル分析の実装が可能となる。
【００７６】
先行充填戦略を用いて、規定のアレイ領域内において、個別のアッセイを空間的に多重化させることができる。略述すると、１つまたは複数のバルブを用いて、溶液中における異なる試薬セット（例えば、異なるプライマーおよび／またはプローブのセット）をその中へとデッドエンド充填し得るアレイ区画を隔離することができる。次いで、流路を空気でフラッシュして余剰の試薬を除去し、約８０℃でデバイスをインキュベートして反応混合物から水を蒸発させ、アレイの規定の区画内に乾燥したプライマーおよびプローブを残す。このような先行充填されたデバイスを用いて、溶液中に標的核酸を含むサンプルをアレイのすべての反応チャンバーへと導入し、複数種の標的核酸について分析することができる（例えば、４０の独立した区画を有するアレイの場合、最大４０種の個別の標的核酸を分析することができる。）
図２ａ〜ｄで例示されるデバイスでは、バルブ流路により、デバイスのエッジにバルブが配置される。図２ｅ〜ｇに示す通り、マイクロ流体デバイスのバルブなしの実施形態もまた用いることができる。このような実施形態では、マイクロ流体デバイス外部のバルブにより、流路または水分補給チャネルへの、これらからの、およびこれらを介する流体の流動を制御することができる。
【００７７】
反応チャンバーに反応混合物（第１の流体）を充填するには、反応チャンバー（１１４）に、注入ポート１０４を介して注入された第１の流体（Ｆ１、図３）をデッドエンド充填する。こうして、すべての反応チャンバーが、反応チャンバーアクセスチャネルを介して流路と流体連絡される。次いで、注入ポートに第２の流体（Ｆ２）を注入する−流路を流動するＦ２によりＦ１が移動する。
【００７８】
第１の流体は、アッセイで用いる反応混合物などの水溶液であり得る。例として述べると、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイの場合、第１の流体はＰＣＲに必要なすべての試薬であるテンプレート核酸、ヌクレオチド、プライマー、適切な核酸ポリメラーゼ、緩衝液、塩を含みうる。アッセイの意図する使用に応じて、第１の流体は、色素、標識、プローブ、またはＰＣＲアッセイの産物を検出する他の試薬をさらに含みうる。第２の流体は、第１の流体とは非混和性であり、また、マイクロ流体デバイスが構築される材料と適合的でもある。第２の流体はデバイスが作製されるＰＤＭＳエラストマーと適合性のある油、例えば、フッ素化油であり得る。「適合性」とは、第２の流体がデバイスと望ましくない形で相互作用または反応しないこと、−例えば、該流体に曝露されたときに該エラストマーが該流体を吸収したり膨張したりせず、デバイスの物理的特性が変化しない（弾力性または剛性に実質的な変化がない）こと−を意味する。ＰＤＭＳを含むマイクロ流体デバイスと共に用いうる第２の流体の例は、ペルフルオロヘキサン（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標））、フッ素化シリコーン油、フッ素化油（例えば、３Ｍ社または他の供給元から市販されるＦＣ４０、ＦＣ４３、ＦＣ７０、ＦＣ−７２、ＦＣ−７７、ＦＣ−８４、ＦＣ−８７など）、およびパラフィン油などの高分子量油を含む。
【００７９】
本発明によるマイクロ流体デバイスの反応チャンバーおよび他のフィーチャの具体的な寸法および密度は、多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）法自体の限界だけにより制約されうる。最新のＭＳＬ法は、１μｍまでの小さなフィーチャの作製が日常的に可能である。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスは、デバイス全体のサイズに応じて、約５０，０００〜約１０８個もしくはその間の任意の総数、または約１００，０００〜約５×１０６個もしくはその間の任意の総数、または約２００，０００〜約２×１０６個もしくはその間の任意の総数、または約２５０，０００〜約１０６個もしくはその間の任意の総数の反応チャンバーによるアレイを含みうる。
【００８０】
反応チャンバーの密度は、単位面積当たりの量との関係で表すことができる。例えば、一部のデバイスは、平方センチメートル当たり約１０００〜約２×１０６個もしくはその間の任意の量、平方センチメートル当たり約５０００〜約１０６個もしくはその間の任意の量、または平方センチメートル当たり約１００００〜約５００，０００個もしくはその間の任意の量の反応チャンバー密度を有し得る。例えば、反応チャンバー密度は、平方センチメートル当たり約
【００８１】
【化１】
個であり得る。
【００８２】
マイクロ流体アレイ内において反応チャンバーを配置し得る密度はまた、変化させることもできる。例として述べると、約１０μｍのピッチ（ｐｉｔｃｈ）を有する５μｍ３の反応チャンバーのアレイは、平方センチメートル当たりの反応チャンバー１０６個（チャンバー当たり約１２５ｆＬ）の総密度を表す。チャンバーのピッチ（ｐｉｔｃｈ）はデバイスの意図される使用に応じて変化し、より高容量を必要とする反応（例えば、反応チャンバー内に全細胞を入れる場合、または、標的分子を簡便な方法で十分に濃縮できない場合）のために、より大きな分離が必要な場合もある。一部のマイクロ流体アレイの場合、ピッチ（ｐｉｔｃｈ）は、経験的に決定しなければならない場合がある−最適なピッチ（ｐｉｔｃｈ）の決定は、当業者の能力内にある。例として述べると、ピッチ（ｐｉｔｃｈ）は、約１〜約１０００μｍもしくはその間の任意の量、約２〜約８０μｍもしくはその間の任意の量、約５〜約６０μｍもしくはその間の任意の量、約１０〜約４０μｍもしくはその間の任意の量、または約２０〜約５０μｍもしくはその間の任意の量であり得る。例えば、ピッチ（ｐｉｔｃｈ）は、
【００８３】
【化２】
であり得る。
【００８４】
単一の粒子を小容量の液滴内に区画化することにより、この粒子、細胞、または分子の有効濃度を高めることができる。区画化の１つの方法は、油など第２の液相により少なくとも１つの側面において水溶液滴を分離するエマルジョンの使用である。本発明の一部の実施形態により規定されるマイクロチャンバー（反応チャンバー）を伴う流路を含むマイクロ流体デバイスにより、均一の空間配置により平面（２次元的なエマルジョン）の形成が可能となり、反応チャンバーを画定するのにバルブを必要とせず、したがって反応チャンバーアレイにおける反応チャンバーのピッチ（ｐｉｔｃｈ）および密度に対してそれらが賦与し得る制約が取り除かれる。この濃度の濃縮を増幅法と組み合わせることで、単一分子の数え上げ、すなわちデジタル定量化が可能となる。理論により拘束されることは望まないが、このような区画化により生物学的物質の濃度を濃縮することで、検出感度およびアッセイ感度を上昇させるための手段が得られる。粒子濃度は、アレイのウェル当たりの平均個数との関係で表すことができる。例えば、各ウェルが平均１個の粒子を有する反応チャンバーアレイにおいて、０個の粒子を含有する反応チャンバーもありえ、１個の粒子を含有する反応チャンバーもありえ、２個以上の粒子を含有する反応チャンバーもありうる。別の例として述べると、各ウェルが平均０．１個の粒子を有する反応チャンバーアレイでは、大半の反応チャンバーが０個の粒子を有することが見込まれ、約１０％の反応チャンバーが１個の粒子を有することが見込まれ、極めて少数の反応チャンバーが２個以上の粒子を有することが見込まれる。本発明の一部の実施形態において、粒子は、反応チャンバー１個当たり約
【００８５】
【化３】
またはこれらの間の任意の量の平均濃度で供給することができる。
【００８６】
粒子は、マイクロスケールシステム内で流動し得る任意の離散的な物質であり得る。例となる粒子は、ビーズ、核酸、標的核酸、タンパク質、生体細胞、生体分子などを含む。例えば、ポリマービーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、ナイロン、および他の多くのポリマーによる）、シリカまたはシリコンによるビーズ、クレイまたはクレイビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、磁性ビーズ、金属ビーズ、無機化合物ビーズ、および有機化合物ビーズを用いることができる。例えば、クロマトグラフィーに用いられることが典型的な粒子（例えば、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州、セントルイス）による１９９９年Ｓｉｇｍａ社製品カタログ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、例えば、１９２１〜２００７頁；１９９９年Ｓｕｐｐｌｅｃｏ社製品カタログ「Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、その他を参照されたい）のほか、アフィニティー精製に一般に用いられる粒子（例えば、Ｄｙｎａｌ社製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）のほか、多くの誘導体化ビーズ、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｇｒｏｕｐ社、および他の多くの販売元により市販される、例えば、各種の誘導体化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（例えば、一般に共役試薬を含む各種の磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）））など、多種多様な粒子が市販されている。
【００８７】
例えば、単一のＤＮＡ分子を含有する１マイクロリットル容量の溶液による区画化では、１０６個Ｌ−１の濃度が得られる。この溶液を、各々の容量が１ピコリットルである１，０００，０００個の液滴に区画化すると、結果として、濃度が０の液滴９９９，９９９個と、有効濃度が１０１２個Ｌ−１の液滴１個とが得られ、１，０００，０００倍の濃縮となる。別の例において、本発明のマイクロ流体デバイスを用いて、反応チャンバー（例えば、約１００ｐＬの容量）内に細胞を区画化することができる。単一の細胞の隔離により、細胞がその環境に対して大きな影響を及ぼし、検出されるのに十分な程度に濃縮された分子を分泌することが可能となる。
【００８８】
ピコリットル（ｐＬ）容量の液滴は、容量に対する表面積比が大きく、単一分子の信頼できる形での増幅は、蒸気透過性が極めて高いことが公知のＰＤＭＳで作製されたデバイスにおいては特に明瞭な現象である、熱サイクル時における試薬の蒸発により困難に遭遇する可能性がある。この蒸発は、平面に対する垂直方向において著明な勾配が生じる平面状のエマルジョンアレイにおいて顕著であり得る。この蒸発を制御するため、デバイス内に蒸気バリアを埋め込み、アレイを挟み込むことができる。これにより、アレイ平面に対して垂直な勾配における蒸気の喪失をなくすことで、ｐＬ容量の反応における標的核酸の増幅を成功させることができる。「ピコリットル容量」とは一般に、約１〜約１０００ｐＬもしくはその間の任意の量、約１〜約５００ｐＬもしくはその間の任意の量、約１〜約２００ｐＬもしくはその間の任意の量、約１〜約１００ｐＬもしくはその間の任意の量、または約１〜約５０ｐＬもしくはその間の任意の量の小容量について述べる。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスにより形成される反応混合物の容量、または本発明の方法において用いられる反応混合物の容量は、
【００８９】
【化４】
であり得る。
【００９０】
本発明の各種の実施形態により、ピコリットル未満（ｓｕｂ−ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ）の反応容量もまた実際的であり有用である。論じた通り、従来のリソグラフィー作製法は、１ｕｍまでの小さなフィーチャの達成が可能であり、これにより、フェムトリットルからピコリットルのスケールにおける容量によるチャンバーの画定が可能である。例えば、マイクロ流体アレイ内における１μｍ３のチャンバーは、容量が約１フェムトリットル（ｆＬ）であり、約５μｍ３のチャンバーは、容量が約１２５フェムトリットル（ｆＬ）である。ピコリットル未満（ｓｕｂ−ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ）の容量とは一般に、約１ｆＬ〜約１０００ｆＬもしくはその間の任意の量、約１０ｆＬ〜約５００ｆＬもしくはその間の任意の量、または約１００ｆＬ〜約５００ｆＬもしくはその間の任意の量の小容量について述べる。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスにより形成される反応混合物の容量、または本発明の方法において用いられる反応混合物の容量は、約
【００９１】
【化５】
であり得る。
【００９２】
反応チャンバーは、代替的に、液滴容量によってではなく、立方マイクロメートル単位または同等の寸法でのチャンバー容量により記載され得る。例えば、立方マイクロメートルからピコリットルへなど、必要な単位間の変換を決定することは、当業者の能力内にある。
【００９３】
反応チャンバー内における反応混合物の蒸発を制限または防止することに加え、反応条件も制御される。
【００９４】
該デバイスを温度制御反応（例えば、単回のインキュベーションまたは一連の温度循環、例えば、ＰＣＲまたは他の増幅反応もしくは伸長反応において用いられる熱サイクリングとして、ある時間にわたり１つまたは複数の温度でインキュベートする）で用いる場合、エラストマーによるデバイスを、スライドガラスまたはシリコンウェハーなどの支持体に固定することができる。デバイスは、温度および／または環境制御インキュベーター内に入れることもでき、熱サイクリング反応の場合、デバイスを任意の枚数の熱サイクリングプレート上に置くこともできる。熱サイクリング用のデバイスは公知であり、市販されている。一般に、反応チャンバーアレイを含むマイクロ流体デバイスを熱サイクリングプレート上に置き、反応の熱サイクリングを実施することができる。各種のこのような熱サイクリングプレートは、例えば、ＢｉｏＲａｄ社、Ｔｈｅｒｍｏ社、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、Ｔｅｃｈｎｅ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などの販売元から市販されている。代替的に、デバイスの基材が能動的な加熱エレメントおよび温度感知エレメントを含有することで、必要な熱サイクリング条件をもたらすことも可能である。例えば、シリコン基材内におけるヒーターおよび温度センサーの作製は、当技術分野において周知である。
【００９５】
ＰＣＲの場合、熱サイクリングは、温度および特定の温度において反応がインキュベートされる時間の正確な制御を必要とする。テンプレート核酸または標的核酸の変性、アニーリング、および伸長のための温度範囲は、実施される特定の増幅反応、用いられるプライマーの相補性、標的核酸の組成、および選択される特定のポリメラーゼに応じて異なる。他の増幅法は、複数ラウンドの熱サイクリングを必要としない場合もあるが、反応条件の熱および時間の制御からやはり利益を得る可能性がある。例えば、ローリングサイクル増幅など、各種の等温での核酸増幅戦略が公知であり、本発明により想定されている。
【００９６】
デバイスおよび反応チャンバーの熱プロファイルをモニタリングする能力もまた、有用であり得る。マイクロ流体デバイスには、センサー（例えば、熱電対、サーミスター、または焦電センサー）を組み込むことができる。温度は、赤外線カメラを用いて、または熱発色物質を用いてモニタリングすることができる。マイクロ流体デバイス内において温度プロファイルをモニタリングするこれらおよび他の方法は、米国特許第７，１１８，９１０号において説明されている。
【００９７】
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスおよび方法の適用は、多数であり、多様である。本明細書で説明されるマイクロ流体デバイスおよび方法の使用または適用を含む使用または適用および方法は、その任意の特定の適用または使用に限定されない。本発明の一部の実施形態では、以下の使用および適用が意図される。
【００９８】
（サンプル、アッセイ、およびアッセイ条件）
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスを適用し得る無数のアッセイおよび使用が存在する。このような使用についての総説、ならびに方法およびプロトコールについての参考文献および開示は、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／５０１７２号に記載されている。本明細書において選択されるアッセイは例示的な目的で例示するものであり、限定的なものであると考えるべきではない。
【００９９】
（単一細胞アッセイ）−各種の目的、例えば、細胞分類、核酸の精製および増幅、パッチクランプ法、カルシウム流の測定、ならびに全細胞電気泳動に、マイクロ流体ベースの単一細胞分析を用いることができる。加えて、マイクロ作製されたデバイス内における１個または数個の単一細胞の捕捉および画像化を用いて、多様な濃度にわたる１種または複数種の化学的刺激に対する細胞応答をモニタリングすることもできる。
【０１００】
マイクロ流体デバイスまたはこのようなデバイスを含むシステムにより、後続の刺激および分析を可能とする形式において細胞の部分集団を分類および捕捉する細胞操作能力をもたらすことができる。このようなシステムにより、集団からの単一細胞の選択、チャンバーのアドレス可能なアレイ内の任意の位置におけるこの細胞の捕捉、１種または複数種の反応条件の適用、および各反応チャンバーの画像化を可能とし得る。この機能性により、複数個の単一細胞に対する化学的な遺伝子研究のための測定器をもたらすことができる。細胞ベースのマイクロ流体アッセイの例は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／００２３１号および同第ＷＯ９８／４５４８１号において説明されている。細胞ベースのマイクロ流体アッセイは、細胞リガンド、例えば、受容体リガンド、薬剤、補因子などの結合および／または内部化のスクリーニングに有用であり得る。
【０１０１】
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体アレイ内における粒子により、任意の各種の結合化学反応のための固体表面または半固体表面を提示することができ、これにより、アレイの粒子メンバー内への対象の生物学的成分および化学的成分の組込みが可能となる。天然および合成両方の多種多様な有機ポリマーおよび無機ポリマーを、固体表面用の材料として用いることができる。例示的なポリマーは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどを含む。多種多様な固体粒子または半固体粒子の支持エレメントに対して分子を結合させるのに、多種多様な結合化学反応を用いることができる。当業者は、意図される適用に応じて、適切な化学反応を認め、これを容易に選択することができる。
【０１０２】
（タンパク質構造の研究）−本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスは、構造生物学への適用、例えば、タンパク質結晶構造解析への適用に有用であり得る。このような適用に有用な方法および技法は、例えば、ＨａｎｓｅｎおよびＱｕａｋｅ、２００３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１３巻、５３８〜５４４頁；Ｈａｎｓｅｎら、２００６年、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．、第１２８巻、３１４２〜３１４３頁；米国特許第７，２１７，３２１号において説明されている。
【０１０３】
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスは、細胞、抗体、抗体リガンド、タンパク質、ペプチドなどを含む他の生物学的成分のスクリーニングを含む使用にも適応させることができる。このような細胞、抗体、および抗体リガンドの存在または不在はまた、望ましいものであれ望ましくないものであれ何らかの特徴と相関することも公知である。限界希釈率のサンプルをマイクロ流体デバイスに適用し、反応チャンバー内へと流入させることができ、説明した流体バリアにより該チャンバーを隔離する。適用の前に、サンプルを標識抗体（例えば、蛍光タグによる）または類似のマーカーなどのマーカーと混合することができる。隔離後、マーカーの存在についてスクリーニングすることにより、生物学的成分の存在または不在について、個々のチャンバーを吟味することができる。スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、タンパク質同定アッセイなどの例は、例えば、米国特許第６，６３２，６５５号において説明されている。
【０１０４】
（多型の配列決定、同定）−本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスは、核酸の配列決定、特に、配列決定ライブラリーの作製に用いることができる。ポリメラーゼおよびプライマーならびに他の必要な試薬と共に、配列決定されるＤＮＡ（標的核酸）を供給し、次いで、塩基の組込みについて迅速にアッセイするため、１度に１種のＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ）に曝露する。１つまたは複数のヌクレオチド配列を決定するための各種の技法については、以下に説明されている。本発明の一部の実施形態では、本発明のマイクロ流体デバイスを、核酸の配列決定に用いることができる。本発明のデバイスは、場合によって、生物学的アッセイまたは化学的アッセイを実施するための試薬（これらは、アレイの一部の場合もあり、例えば、試薬トレーンにおいて、流動してアレイと接触する場合もある）を含む。配列決定のための反応混合物は、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ類似体、蛍光ｄＮＴＰ、または蛍光ｄＮＴＰ、無機リン酸、ＡＴＰ、熱安定性ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ホスファターゼ、挿入色素、標識プローブ、還元剤、Ｍｇ＋＋、分子密集化剤、例えば、ＰＥＧ、緩衝液、塩、ＤＴＴ、ＢＳＡ、洗浄剤、または界面活性剤、電気浸透流を阻害もしくは増強する化学物質（例えば、ポリアクリルアミド）などの一部または全部を含みうる。
【０１０５】
標的核酸の他の分析法は、以下に説明されている。
【０１０６】
標的核酸とは、対象の１つまたは複数の配列を含む核酸である。サンプルまたは反応混合物中における標的核酸の存在は検出が可能であり、アッセイのデザインに応じて、定量化も可能である。標的核酸は、生物学的サンプル（「サンプル」）から得ることができる。
【０１０７】
「多型」とは、集団内における標的核酸の１つまたは複数の形態の発生である。多型部位は、核酸配列内における公知の位置である場合もあり、本明細書で説明される方法を用いて標的核酸内において存在することが決定される場合もある。代替的に、多型は、配列の変異または配列の変異体：ＤＮＡ内で生じる場合は「ＤＮＡ配列の変異」、ＲＮＡ内で生じる場合は「ＲＮＡ配列の変異」としても説明することができる。一塩基多型、すなわちＳＮＰは、単一の塩基変化からなる多型である。
【０１０８】
組織サンプルは、例えば、掻爬、針吸引生検もしくは針（コア）生検、組織をサンプル採取するための切開生検、または対象組織の全切除を伴いうる切除生検により得ることができる。代替的に、例えば、毛髪、血液、血漿、血清、痰、尿、便、精液、羊膜液、絨毛膜絨毛、または当技術分野で公知の方法を用いる他の胎児組織もしくは胚組織など、遺伝子物質を含有する他の生体サンプルを用いることもできる。
【０１０９】
ＤＮＡおよびＲＮＡは、当技術分野で公知の任意の各種の方法により個別にまたは一体に、生物学的サンプルから単離することができる。方法の選択は、アッセイされる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、アッセイに用いられる方法などに依存し得る。生物学的サンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡを単離する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社（１９８９年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ， ＦＭら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社（１９９４年）；Ｂｏｔｗｅｌｌ， ＤＤＬ．、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７年）、第１６２巻、４６３〜４６５頁；米国特許第５，１３０，４２３号；米国特許第５，９４５，５１５号；米国特許第５，９８９，４３１号；米国特許第５，１２８，２４７号など、当技術分野において公知である。単一細胞の分析など、一部の場合では、分析前にＤＮＡまたはＲＮＡを精製する必要がないこともある。
【０１１０】
サンプル中における標的核酸の特定の配列を、当技術分野において公知である複数の方法のいずれか、例えば、タッチダウンＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆ＰＣＲ、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ネストＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などにより、増幅し得る。例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｊ．、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、第３５０巻、９１〜９２頁；Ｍａｌｅｋら、１９９４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第２８巻、２５３〜６０頁；Ｉｎｎｉｓら（編）、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、６０〜６６頁、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、１９９０年；Ｒｏｕｘ Ｋ．、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１６巻、８１２〜４頁；Ｈｅｃｋｅｒ ＫおよびＲｏｕｘ， Ｌ．、１９９６年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２０巻、４７８〜８５頁；Ｏｃｈｍａｎら、１９８８年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１２０巻、６２１〜３頁；米国特許第５，２９９，４９１号を参照されたい。これらのパラメータ、手法、および試薬、ならびに特定の反応条件に応じてこれらを最適化する方法は、当業者の能力内にある。
【０１１１】
本発明のマイクロ流体デバイスの高密度反応チャンバーアレイはまた、単一のデバイス上において、複数種の標的核酸、もしくは複数種のサンプル、またはこれらの両方の分析も可能とする。例えば、１，０００，０００の反応のアレイを、各々が２５，０００個の離散的なＰＣＲチャンバーを含む４０の独立した区画に分割することができる。独立したサブアレイと連結される個別の注入ポートを組み入れることにより、多重サンプル分析の実装が可能となる。別の例では、先行充填戦略を用いて、規定のアレイ領域内において、個別のアッセイを空間的に多重化することができる。説明した通りに、マイクロバルブを用いて、異なるプライマーおよびプローブのセットをその中へとデッドエンド充填し得るアレイ区画を隔離することができる。次いで、流路を空気でフラッシュして余剰のアッセイ混合物を除去し、先行充填したデバイスをインキュベート（例えば、約７０〜８０℃で）して先行充填したアッセイ混合物中における試薬を脱水し、規定の区画内に乾燥したプライマーおよびプローブを残す。この脱水工程の後、１種または複数種の標的核酸およびＰＣＲに必要な他の試薬（しかし、先行充填したプライマーおよびプローブではない）を含む反応混合物を、上記で説明したマイクロ流体デバイスの１つまたは複数のサブアレイ内に注入し、脱水された試薬に再度水分補給する。次いで、流路をフラッシュして反応チャンバーを隔離し、反応を熱サイクルさせる。増幅反応時またはその後において、増幅産物をモニタリングすることができる。
【０１１２】
別の例では、単一の反応において、２種以上の増幅産物を検出し、定量することができる。これは、反応混合物中に、スペクトルが異なるフルオロフォアにより標識された複数種の配列特異的な蛍光プローブを組み込むことにより達成することができる。このような形での多重化は、単一のサンプル中においてアッセイし得る標的核酸の数が増大し、基準核酸による結果の標準化を可能とすることにより、１種または複数種の標的核酸の定量的な分析において重要な役割を果たす。
【０１１３】
標的核酸またはその増幅産物の検出もまた有用である。本明細書で説明されるマイクロ流体デバイスおよび方法と共に各種の戦略を用いることができ、適切なシステムの選択はまた、反応の詳細、反応条件に対する検出システムおよび検出試薬の適格性、反応数の規模（例えば、反応チャンバーの数、密度）、ならびにアッセイ時において、または終点として、標的核酸またはその増幅産物がモニタリングされるかどうかにも依存する。検出されるシグナルは、フルオロフォア、発色団、化学発光、比色反応、放射能、酵素反応に由来する基質などに由来するシグナルを含みうる。
【０１１４】
シグナルを検出するための例示的な手法は、共焦点レーザー走査顕微鏡、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、シンチレーション検出、蛍光相関分光分析、散光、吸光（ＵＶまたは可視光）、反射などを含む。
【０１１５】
標的核酸またはその増幅産物の存在は、例えば、二本鎖核酸に特異的な色素の取り込みによるか、またはプローブに対する増幅された核酸部分のハイブリダイゼーションにより決定することができる。
【０１１６】
二本鎖核酸に結合した場合だけ蛍光発光するＤＮＡ染色色素は、増幅産物の検出に有用であり得る。このような色素の例は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、同ＩＩ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＹＯ（オキサゾールイエロー）、ＴＯ（チアゾールオレンジ）、ピコグリーン（ＰＧ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販される）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ＤＡＰＩなどを含む。ＤＮＡ染色色素の使用に関するさらなる議論は、例えば、Ｇｌａｚｅｒら、１９９７年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第８巻、９４〜１０２頁；ならびにＧｌａｚｅｒ， ＡＮおよびＲｙｅ， ＨＳ、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ、第３５９巻、８５９〜６１頁；Ｈｉｇｕｃｈｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、４１３〜４１７頁において見出すことができる。
【０１１７】
「分子ビーコン」とは、標的核酸にハイブリダイズしない場合、ヘアピン形態で存在する一本鎖オリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドの第１端は蛍光色素に結合させ、第２端は消光分子に結合させてある。ヘアピン形態にあるとき、消光分子の近接により蛍光は消光され、蛍光は観察されない。該オリゴヌクレオチド「ビーコン」が標的核酸にハイブリダイズすると、蛍光色素が消光分子から十分に分離され、蛍光が検出可能となる。色素の発光の変化をモニタリングすることにより、増幅産物の間接的なモニタリングが可能となる。当業者を導くのに十分なさらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１３３９９号；Ｔｙａｇｉ Ｓら、１９９８年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第１巻、４９〜５３頁；Ｔｙａｇｉ ＳおよびＫｒａｍｅｒ ＦＲ、１９９６年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第３巻、３０３〜８頁；ならびにＭａｒｒａｓ ＳＡら、１９９９年、Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ、第５〜６巻、１５１〜６頁において見出すことができる。
【０１１８】
蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）とは、ドナーの発光スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重複するように選択されたドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアの対の間における距離に依存する相互作用である。フルオロフォアが十分に近接すると、第１の規定波長によるドナーフルオロフォアの励起がドナーからアクセプターへと移動し、第２の規定波長における蛍光を検出することができる。核酸ハイブリダイゼーションを検出する場合、特定のプローブをドナー／アクセプター対の１つのメンバーで標識し、ヌクレオチドをドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識する。溶液中における遊離時（例えば、核酸の重合化またはハイブリダイゼーションが生じる前）、ドナー／アクセプター対は、エネルギー移動を阻止するのに十分な距離だけ離れている。重合化反応が進むにつれ、標識されたヌクレオチドは分子内に組み込まれ、標識されたプライマーに対して、エネルギー移動が生じ、蛍光が検出されるのに十分な程度近づく。標的核酸における多型を検出するのに用いうる方法の例は、例えば、米国特許第６，５００，６５０号、米国特許第５，９４５，２８３号、米国特許出願第２００４／０００５６１３号、およびＷＯ９７／２２７１９において説明されている。
【０１１９】
リアルタイム定量ＰＣＲを用いて、増幅時および／または増幅後において形成される増幅産物の量を測定することにより、サンプル中における標的核酸配列の量を決定することができる。市販されるＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）は、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを移動させて切断し、蛍光シグナルを発生させる、Ｔａｑポリメラーゼの５’側ヌクレアーゼ活性に基づく。１つのプローブが「正常な」配列に対して相補的であり、他のプローブが対象の突然変異に対して相補的な、多型部位において異なる２つのプローブを有することが必要である。これらのプローブは、５’端に結合した異なる蛍光色素と、プローブが接触しないときは、蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）によりフルオロフォアと相互作用してプローブの蛍光を消光する３’端に結合した消光物質とを有する。ＰＣＲのアニーリング工程では、ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズする。伸長工程では、５’側蛍光色素がＴａｑポリメラーゼの５’側ヌクレアーゼ活性により切断され、レポーター色素の蛍光発光が増大する。ミスマッチしたプローブは、断片化されることなく置換される。サンプル中における突然変異の存在は、２種の異なる色素のシグナル強度を測定することにより決定される。米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，４８７，９７２号もまた参照されたい。
【０１２０】
侵襲的切断法では、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドと、１ヌクレオチドの重複により標的ＤＮＡにアニールする配列特異的なプローブとを用いる。該配列特異的なプローブが多型塩基に対して相補的な場合、インベーダーオリゴヌクレオチドの３’端が、対立遺伝子特異的なプローブの５’側アームを放出するフラップエンドヌクレアーゼにより認識されて切断される構造を形成する。当業者を導くのに十分なさらなる詳細は、例えば、Ｎｅｒｉ Ｂ．ら、２０００年、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３８２６巻、１１７〜１２５頁；米国特許第６，９６４，８４８号により提供されている。
【０１２１】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブシステムの使用を含むアッセイもまた、有用であり得る。このようなプローブおよびシステムは、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年、第２８巻、３７５２〜３７６１頁；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９９／６６０７１号において説明されている。
【０１２２】
プライマー伸長反応（すなわち、ミニ配列決定、ヌクレオチド特異的な伸長、または単純なＰＣＲ増幅）もまた、標的核酸における多型を同定する配列識別反応において有用であり得る。例えば、ミニ配列決定反応では、プライマーが、ＳＮＰのすぐ上流にあるその標的核酸（通常はＤＮＡ）にアニールし、多型部位に相補的な単一のヌクレオチドにより伸長する。該ヌクレオチドが相補的でない場合、伸長は生じない。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）は、ＳＮＰ当たり２つの配列特異的プローブ、および１つの一般的ライゲーションプローブを必要とする。一般的ライゲーションプローブは、配列特異的プローブに隣接してハイブリダイズし、適切な配列特異的プローブが完全にマッチすると、リガーゼが配列特異的プローブおよび一般的プローブの両方に結合する。完全にマッチしない場合は、リガーゼが配列特異的プローブおよび一般的プローブに結合できない。プローブのアニーリングは、例えば、酵素イムノアッセイにより検出することができる（Ｖｉｌｌａｈｅｒｍｏｓａ ＭＬ．、Ｊ Ｈｕｍ Ｖｉｒｏｌ（２００１年）、第４巻、第５号、２３８〜４８頁；Ｒｏｍｐｐａｎｅｎ ＥＬ、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ（２００１年）、第６１巻、第２号、１２３〜９頁；Ｉａｎｎｏｎｅ ＭＡ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（２０００年）、第３９巻、第２号、１３１〜４０頁）。
【０１２４】
ライゲーションローリングサークル増幅（Ｌ−ＲＣＡ）もまた、Ｑｉ Ｘ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００１年）、第２９巻、第２２号、Ｅ１１６頁において説明される通り、一塩基多型の遺伝子型解析に用いられて成功している。
【０１２５】
Ｓａｎｇｅｒ配列決定（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７年、ＰＮＡＳ、第７４巻、５４６３〜５４６７頁）では、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、多様な長さの配列依存的なフラグメントを合成する。フラグメントの長さは、ジデオキシヌクレオチド塩基特異的なターミネーターの無作為的な組込みにより決定される。次いで、これらのフラグメントをゲル中において分離し、可視化し、配列決定する。上記の方法を洗練し、配列決定手順を自動化するために、多岐にわたる改善がなされている。同様に、ＲＮＡ配列決定法もまた公知であり、例えば、Ｚｉｍｍｅｒｎ Ｄ．およびＫａｅｓｂｅｒｇ Ｐ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７８年）、第７５巻、第９号、４２５７〜４２６１頁）ならびにＭｉｌｌｓ ＤＲ．およびＫｒａｍｅｒ ＦＲ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７９年）、第７６巻、第５号、２２３２〜２２３５頁）を参照されたい。直接的にＲＮＡを配列決定する化学的方法もまた公知である（Ｐｅａｔｔｉｅ ＤＡ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７９年）、第７６巻、第４号、１７６０〜１７６４頁）。他の方法は、Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒら（１９７７年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第４巻、２５２７〜２５３８頁）、Ｓｉｍｏｎｃｓｉｔｓ Ａ．ら（Ｎａｔｕｒｅ（１９７７年）、第２６９巻、第５６３１号、８３３〜８３６頁）、Ａｘｅｌｒｏｄ ＶＤ．ら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９７８年）、第５巻、第１０号、３５４９〜３５６３頁）、ならびにＫｒａｍｅｒ ＦＲ．およびＭｉｌｌｓ ＤＲ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７８年）、第７５巻、第１１号、５３３４〜５３３８頁）による方法を含む。
【０１２６】
核酸配列はまた、該単一のヌクレオチドが蛍光増強マトリックス中に含有される場合、切断されたヌクレオチドの天然の蛍光発光をレーザーで刺激することによっても読み取ることができる（米国特許第５，６７４，７４３号）。ミニ配列決定反応では、多型部位に相補的な単一のヌクレオチドを伴うＤＮＡポリメラーゼにより、ＳＮＰに隣接する標的ＤＮＡにアニールするプライマーを伸長させる。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド組込みの高精度に基づく。プライマー伸長産物の分析には、異なる技法が存在する。例えば、ミニ配列決定反応における標識もしくは未標識のヌクレオチド、ｄＮＴＰと組み合わせたｄｄＮＴＰ、またはｄｄＮＴＰだけのいずれを用いるかは、該産物を検出するために選択される方法に依存する。
【０１２７】
（テンプレート指示（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）法）−一例では、大スケールのスクリーニングについて、Ｆｒｅｅｍａｎ ＢＤ．ら（Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（２００２年）、第４巻、第４号、２０９〜２１５頁）により、蛍光偏光検出を伴うテンプレート指示による色素−ターミネーター組込み（ＴＤＩ−ＦＰ）法が説明されている。一塩基多型の遺伝子型解析には、５’ヌクレアーゼアッセイもまた用いることができる（Ａｙｄｉｎ Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００１年）、第４巻、９２０〜２、９２４、９２６〜８頁）。ＷＯ０１８１６３１において説明される通り、ＳＮＰの識別を決定するには、ポリメラーゼ校正法もまた用いることができる。酵素増幅電子変換による単一塩基対におけるＤＮＡ突然変異の検出は、Ｐａｔｏｌｓｋｙ Ｆら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１年）、第１９巻、第３号、２５３〜２５７頁において説明されている。
【０１２８】
配列特異的ＰＣＲ法もまた、一塩基多型の遺伝子型解析に用いられて成功している（Ｈａｗｋｉｎｓ ＪＲ．ら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ（２００２年）、第１９巻、第５号、５４３〜５５３頁）。代替的には、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）アッセイまたは切断フラグメント長多型（ＣＦＬＰ）アッセイを用いて、本明細書で説明される多型を検出することもできる。
【０１２９】
（マイクロ流体デバイスの適用）
説明したピコリットルまたはフェムトリットルの反応チャンバーのアレイを含むマイクロ流体デバイスは、生物学的なアッセイおよび診断に有用である。例えば、数十万〜百万の反応を用いる核酸のデジタル定量化により、１）極めて少数の対立遺伝子不均衡に対する高度の統計学的検定力による識別、２）長いゲノム距離にわたる単一分子上における標的配列の共局在化、および３）高度に相同的な遺伝子バックグラウンド内におけるまれな事象の検出における固有の能力がもたらされる。
【０１３０】
デジタルＰＣＲアッセイのダイナミックレンジは、予測される陽性反応数がテンプレート濃度と共に直線的に増加する濃度範囲として説明することができる。理論により拘束されることは望まないが、各チャンバーの平均専有数が１に近づく結果として飽和がもたらされるまで直線的な応答が観察されるよう、アレイ全体における分子の分布は無作為である。したがって、デジタルアレイのダイナミックレンジは、チャンバー総数と共に増大する。ピコリットル容量での区画化により、配列相同性の高い大きなバックグラウンド内においてまれな配列を検出するのに用いうる、濃度の有効な濃縮がもたらされる。この点を説明するため、１００万コピー当たり１コピーの相対濃度にある野生型のバックグラウンド中の１０コピーの一塩基多型（ＳＮＰ）（１０００万コピーの野生型のバックグラウンド中の１０コピーのＳＮＰ）を検出する作業を考えてみよう。このような状況では、野生型配列に対するごく微量の非特異的増幅によっても、結果として偽陽性がもたらされる可能性があり、いずれのＰＣＲ法による検出も極めて困難であるかまたは不可能となっている。しかし、このサンプルを１，０００，０００個のチャンバーに分割すると、反応チャンバー１個当たり平均１０コピーの野生型配列が結果としてもたらされる。これらの反応チャンバーの大半は標的配列を有さないが、ちょうど１０個の反応チャンバーは、（高い確率で）ＳＮＰの単一コピーを含有する。このような状況では、バックグラウンドを１００万分の１に低下させることができ、１０個の分子中１個だけの分子の識別が可能なアッセイであればＳＮＰの検出を達成することができる。図４は、配列相同性が高い１００万個の分子によるバックグラウンド中において単一の分子を検出するのに必要とされる特異的反応および非特異的反応に必要な相対的効率の容量依存性を示す。例えば、３０サイクルのＰＣＲ反応により、非特異的な単位複製配列に対する特異的な単位複製配列の比として定義されるノイズ対シグナル比として１０が必要であるとすると、１μＬのリアクター内において必要とされる相対反応効率は約６倍である。比較として述べると、この同じサンプルを、容量が１０ｐＬのリアクター１００，０００個に分割する場合、必要とされる反応効率比は１．４となる。
【０１３１】
反応容量を２〜３（ａ ｆｅｗ）ピコリットルまで減少させ、サンプル中における核酸を反応当たり１コピー未満の平均で存在するように分散させることにより、高い有効濃度がもたらされる。これはまた、そうしなければバックグラウンドを増大させる非特異的増幅および競合反応を低下させる利点も有する。
【０１３２】
デジタルＰＣＲにより、同じＤＮＡ分子上において２つの標的配列を結果として存在させる遺伝子再配列の頻度を測定する光学的多重ＰＣＲを用いることが可能となる。多数の区画内に投入すると、分子は、おのずと無作為的かつ独立に分布する。サンプルが２つの標的配列を保有するまれな分子のサブセットを含有する場合、反応チャンバー内における増幅の共局在が偶然により予測されるよりも高頻度となり、これにより、この分子種の存在が示される。アレイ数が極めて多い場合、この解析の統計学的検定力は総チャンバー数と共に向上するので、正確な融合部位に依存しない両方の標的配列を有する少数の分子種を検出することが可能となる。この能力により、遺伝子融合、遺伝子転移、選択的スプライシング、および逆位を含む、各種のまれな遺伝子再配列の検出が可能となるであろう。例えば、このような手法は、単一の２色法多重アッセイを用いて、十分に特徴づけされたＢＣＲ／ＡＢＬ融合癌遺伝子の変異体を検出するのに用いることができる。２２ｑ１１上のＢＣＲの９ｑ３４上のＡＢＬとの融合体は、成人における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）症例の９５％および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）症例の約２５％ならびに小児におけるＡＬＬ症例の約２〜５％において存在する、周知の染色体異常である（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、２０００年、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、第１４巻、１８５０頁）。ＲＴ−ｑＰＣＲによる一般的な融合体転写物の検出は、診断および予後診断のゴールドスタンダードとして日常的に用いられている。しかし、内部のエキソンを架橋するには法外に長い単位複製配列を必要とするため、潜在的な切断点が多数であると、すべての転写物変異体を検出するプライマーの設計が困難となり、単一セットのプライマーを用いることができなくなる。融合の大半では、エキソンＥ１（ＢＣＲ）およびＡ１１（ＡＢＬ）が融合部位を挟む。個別の２色（ＦＡＭおよびＣａｌ Ｏｒａｎｇｅ）で報告するＦＲＥＴプローブを用いてエキソンＥ１およびＡ１１を独立に検出するのに２つのプライマーセットが用いられた多重アッセイは、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合を含む細胞（例えば、慢性骨髄性白血病初代細胞、または同様の融合を有する細胞系）のｃＤＮＡクローンの段階希釈液でスパイクしたゲノムＤＮＡサンプル中における共局在化の頻度について調べ、共局在化の統計学的に有意な濃縮をもたらす融合の最小限の画分を決定するのに用いることができる。
【０１３３】
配列内における多型位置の数値表示が特定の配列に関するものであることは、当業者により理解されるであろう。また、配列が番号付けされ配列が選択される方式に応じて、同じ位置に異なる数値表示が割り当てられる可能性もある。さらに、挿入または欠失などの配列変異により、突然変異部位におけるかまたは同部位の付近における特定のヌクレオチドの相対的な位置が変化し、次いで、同ヌクレオチドの数値表示が変化する可能性がある。
【０１３４】
（表１：配列）
【０１３５】
【表１】
（実験法）
チップの作製：標準的な多層ソフトリソグラフィーを用いて、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）によるマイクロ流体デバイスを作製した。２０，０００ｄｐｉの透明マスク（ＣＡＤ／Ａｒｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社製）を用いることによるフォトレジストのパターン形成には、標準的なリソグラフィーを用いる。ＭｅｇａＰｉｘｅｌテンプレート（アルバータ大学Ｎａｎｏｆａｂ製）を作製するために、色マスクを作製した。ソフトリソグラフィーを用いてネガティブ型のテンプレートを作製した。２５マイクロメートルのチャネル厚をもたらす制御層にＳＵ８−２０２５を用いる一方、立方体の反応チャンバーを創出するにはＳＵ８−１００を用いた。ＳＵ８−５で作製した高さ１０ｕｍのチャネルにより反応チャンバーを連絡した。ＳＰＲ−２２０をスピンコート（ｓｐｉｎ）して１０ｕｍの厚さを達成し、これを用いてバルブが交差する流動ライン区画を創出する（Ｕｎｇｅｒ Ｍ．Ａ．ら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８８巻、１１３頁）。
【０１３６】
略述すると、テンプレート上にエラストマー層（５：１ ＧＥ ＲＴＶ）をスピンコート（ｓｐｉｎ）（２５０ｒｐｍ×１分間）し、部分的に硬化させる。反応チャンバー領域上に蒸気バリア（ＩＰＡで洗浄した透明なもの）を配置し、約７ｍｍのエラストマー層（５：１ ＧＥ ＲＴＶ）で覆い、脱気し、８０℃で９０分間にわたりベーキングしてエラストマーを硬化させ、１時間にわたり冷却した。硬化した反応チャンバー層をテンプレートから剥離させ、エラストマー制御層にかみ合わせた（支持マトリックス上に２０：１ ＧＥ ＲＴＶをあらかじめスピンコート（ｓｐｉｎ）−５００ＲＰＭ×３０秒間＋１８７５ＲＰＭ×９０秒間−した後で、８０℃で４５分間にわたりベーキングした）。８０℃で１時間にわたり２相をベーキングして結合させ、冷却し、支持マトリックスから剥離させた。デバイスにポートを穿孔し、基底層（２０：１ ＧＥ ＲＴＶ、説明した通りにスピンコート（ｓｐｉｎ））にデバイスを取り付けた。８０℃で一晩にわたり最終アセンブリーをベーキングして、エラストマーを硬化させた。
【０１３７】
上記デバイスは、シリコンウェハーに結合した２層のＰＤＭＳから構成され、プッシュアップ形状を有する。まず、８２０ＲＰＭでＰＤＭＳ（５：１ ＲＴＶ Ａ：Ｂ）層をスピンコート（ｓｐｉｎ）することにより、流動層を得た。次いで、水蒸気制御用のポリエチレンによる透明スライドを関連するフィーチャ上に配置し、約４０ｇのＰＤＭＳをシリコンウェハー全体の上に流し込み、これを後に１時間にわたりベーキングした。制御層の場合は、ウェハーをＰＤＭＳ（１０：１ ＲＴＶ Ａ：Ｂ）でコーティングし、１８００ＲＰＭでスピンコート（ｓｐｉｎ）し、次いで、４５分間にわたりベーキングした。次いで、制御層および流動層をかみ合わせて、共にベーキングした。
【０１３８】
（チップ操作）：まず、分析するサンプルを反応に必要とされるすべての試薬（プライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２）と混合し、次いで、リソグラフィーにより規定されたチャンバーの大規模アレイをフィーチャするマイクロ流体チャネル構造に注入する。まず、ＰＣＲ反応チャンバーにＰＣＲ反応混合物を加圧充填する。次いで、主流路に油を加圧充填する。
【０１３９】
チャンバーの形状により、高表面張力が確保され、流体を注入するには、高圧を加える（約１０ＰＳＩ）必要がある。チャンバーを水性流体で満たした後では、流動ラインを加圧する結果、チャンバー自体においてではなく、連絡チャネルだけにおいて溶液が油により置換されるので、該形状が後の区画化の一助となる。
【０１４０】
（ＰＣＲアッセイおよび分析）：別段に注記しない限り、本発明のマイクロ流体デバイスを用いて実施されるすべてのＰＣＲ反応は、ＦＡＭプローブに対して５００ｎＭのプローブ濃度、Ｃａｌ Ｏｒａｎｇｅプローブに対して２５０ｎＭのプローブ濃度で、製造元の指示書に従い、ＡＢＩ ＴＡＱ ＦＡＳＴマスターミックスにより実行した。反応混合物には、界面活性剤（０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）を添加した。各プライマーは、７５０ｎＭの濃度であった。熱サイクリングのプロトコールは、２０秒間の加熱開始、ならびに１秒間にわたる９５度および３０秒間にわたる６０度の４０サイクルを含んだ。熱サイクリングおよび画像化は、ＢｉｏＭａｒｋ（商標）システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）を用いて実施した。終点の測定値を得、Ｍａｔｌａｂを用いて画像を解析した。テンプレート（標的ＤＮＡ）は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社により合成され、ＰＡＧＥ精製された、配列番号１によるヒトＢＣＬ２遺伝子の一部を含んだ。このテンプレートは既に、リアルタイムＰＣＲにより、１００％のＰＣＲ効率を示していた。用いられたプライマーは、ＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴ（配列番号２）およびＴＧＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＣＧＡＡＧＴＣＧ（配列番号３）であり、プローブはＦＡＭ−ＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＣＴ−ＢＨＱ（配列番号４）であり、すべてＩＤＴ社により合成された。
【０１４１】
デバイス間のばらつきをモニタリングするため、以下の通りに、異なる色のアッセイにおいてコントロールを用いた。ヒトＡＢＬ１１遺伝子に由来するテンプレート（配列番号５）は、ＩＤＴ社により合成され、ＰＡＧＥ精製された。以下のプライマー：ＡＴＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＡＧＴＧ（配列番号６）およびＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＴＡＣＴＧＴＧ（配列番号７）がＩＤＴ社により合成された。Ｃａｌ Ｏｒａｎｇｅによる以下のプローブ：ＡＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣ（配列番号８）は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により合成された。
【０１４２】
（トリソミー２１の差別化）：以下のプライマーおよびプローブ：Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のＡＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号９）、ＴＧＣＣＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号１０）、およびＬＮＡプローブ１（ＧＣＴＣＣＡＧＧ）（配列番号１１）により、第２１番染色体上のＡＩＲＥ遺伝子上の領域を標的とした。
【０１４３】
第９番染色体上のＡＢＬ遺伝子を、以下のプライマーおよびプローブ：ＡＴＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＡＧＴＧ（配列番号１２）、ＡＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＴ（配列番号１３）（ＩＤＴ社により合成される）、およびＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＣａｌＯｒａｎｇｅ−ＡＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣ−ＢＨＱ１（配列番号１４）により、標的とした。ブリティッシュコロンビア州、バンクーバー、小児家族研究所から入手した６％の純粋なトリソミー２１ ＤＮＡによりゲノムＤＮＡをスパイクした。約２０％の曲線因子（Ｆｉｌｌ ｆａｃｔｏｒ）を得るように、デジタルＰＣＲ反応において用いられる最終ＤＮＡサンプルをセットした。この適用には、９０，０００個のチャンバーを有するデバイスを用いた。
【０１４４】
（ＪＡＫ２アッセイ）
Ｊａｋ２の野生型および変異体のプラスミドは、ヘテロ接合患者に由来する単位複製配列から作製した。略述すると、プライマーＪａｋ２ｆｗｄ：ＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧ（配列番号２１）およびＪａｋ２ｒｅｖ：ＡＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡＴ（配列番号２２）を用いて、４５３ｂｐの標的を増幅した。増幅の条件は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡで開始し、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２濃度で、５０℃のアニーリング温度であった。７％のポリアクリルアミドゲル上でＰＣＲ産物を泳動させ、適正なサイズのフラグメントを確認した。製造元の指示書に従い、ＴＯＰＯ ＴＡサブクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてサブクローニングを達成した。略述すると、１ｕｌのＰＣＲ産物を１ｕｌの緩衝液および１ｕｌの直鎖化され活性化されたベクターおよび３ｕｌのｄＨ２Ｏと混合し、５分間にわたり室温でインキュベートし、次いで、氷上に置いた。４μｌのクローニング反応物を、キットと共に供給された１アリコートのコンピテント細胞と混合し、５分間にわたり氷上でインキュベートした。５０μｌのトランスフェクション反応物をＬＢアンピシリンプレート上に播種し、３７℃で一晩にわたり増殖させた。１０個の単一コロニーを採取してＬＢアンピシリン培地に入れ、一晩にわたり増殖させ、次いで、ＤＮＡを単離した。
【０１４５】
プラスミドＤＮＡを、Ｑｕｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉプラスミド精製キットを用いて単離した。１０個の単一コロニーに由来するＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎベースの対立遺伝子識別アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）中で個別に調べた。進行中の試験のために、Ｊａｋ２野生型（プラスミドＡ）およびＪａｋ２変異体（プラスミドＢ）１つずつをさらに単離した。
【０１４６】
上記プラスミドを、野生型（ｗｔまたはＷＴ）のバックグラウンドを一定とし、変異体（ｍｔまたはＭＴ）量を増加させる（１：１ｗｔ：ｍｔ〜１：１０００）形で、テンプレートとして用いた。反応では、以下の配列：
【０１４７】
【化６】
を有する最終濃度７５０ｎＭのプライマーおよびプローブを用いた。
【０１４８】
野生型の濃度は、チャンバー当たりプラスミド約０．５個であった。本適用では、９０，０００個のチャンバーおよび５本の流入ラインを有するデバイスを用いた。４０サイクルのＰＣＲを適用し、Ｍａｔｌａｂプログラムを用いることにより陽性チャンバー数をカウントした。
【実施例】
【０１４９】
（実施例１）
（大型スケールのマイクロ流体エマルジョンアレイ内における標的核酸の増幅）
蒸気バリアによる選択的な被覆を組み込むデバイスを用いて、ＰＣＲ実験時における蒸発作用を裏付けた。同じチップ上において異なるサンプルを調べるために、図２ｄに示すチャンバー形状を有し、チャンバー密度が１個／１６００ｕｍ２のマイクロ流体デバイスを、５枚の個別のチャンバーアレイにより設計した。デバイス内にＰＣＲ溶液を導入し、図３で概括した通りに区画化した。ＴａｑＭａｎマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と共に、ＧＡＰＤＨ用の標準的なＴａｑＭａｎアッセイを用いて、反応チャンバー１個当たり約１０コピーのテンプレートＤＮＡ濃度による反応の進行をモニタリングした。４０サイクルを超えて反応を進行させ、その終点画像を図５に示す。
【０１５０】
図５の顕微鏡写真は、１つの実験結果を示す。蒸気バリアにより被覆されたポジティブコントロールを伴う反応チャンバー（ポジティブコントロール領域ＡおよびＤ）が標的核酸の増幅に成功したのに対し、領域外において蒸気バリアにより被覆されたポジティブコントロールを伴う反応チャンバー（ポジティブコントロール領域Ｅの一部）は、増幅が不成功であった。
【０１５１】
マイクロ流体デバイス内に蒸気バリアを組み込むことにより、本発明者らは、約３０ピコリットルの容量を有する最大９０，０００個の反応チャンバーによるアレイにおける単一分子の信頼できる形での増幅を裏付けた。
【０１５２】
（実施例２）
（標的ＤＮＡの単一コピー増幅）
各反応チャンバーが１個だけのＤＮＡ分子を含有するかまたはＤＮＡ分子を全く含有しないように、初期ＤＮＡ（標的核酸）を希釈することにより、サンプル中に存在するＤＮＡ初期量を定量的に同定することができた。光学シグナルを有する各チャンバーがＰＣＲ増幅前における標的核酸の存在を示すように、標的核酸のコピーを有する反応チャンバーだけが検出用の蛍光シグナルをもたらす。
【０１５３】
説明した通り、希釈されたＤＮＡを含有するＰＣＲ溶液の加圧レザバーに流体ラインを連絡させることにより、マイクロ流体チップに充填した。すべてのチャンバーの充填後、主流動ライン内にＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）油を加圧充填し、これにより、チャンバー内以外のすべての場所の流体を移動させ、チップの熱サイクル準備を整える。ＰＣＲ反応が進むのに応じて、各サイクルにおけるチップ画像を収集した。これにより、各サイクルを経て増加するＤＮＡ産物を見る（蛍光シグナルにより）ことができる。これを図６に示す。反応チャンバーは、１辺３０マイクロメートルであった。サイクル数が進むのに応じて、ネガティブコントロールの反応チャンバーに由来するシグナルがバックグラウンドにとどまる一方、ポジティブコントロールに由来するシグナルは指数関数的に増大した。
【０１５４】
本発明者らは、１００万個の反応チャンバーを有するチップ上においてデジタルＰＣＲを実行することにより、大幅なダイナミックレンジの増大のために、ＤＮＡ分子を極めて正確にカウントし得ることを示した。特に、この種の分析は、公知のコントロールに対するまれな遺伝子発現産物をカウントする場合に不可欠である。複数の異なるプローブを用いる可能性のために、複数の遺伝子にわたる発現プロファイルを定量的に同定することが可能となる。
【０１５５】
（実施例３）
（微小な対立遺伝子不均衡の識別：胎児トリソミー２１の非侵襲的検出）
本明細書で説明したマイクロ流体アレイを用いるデジタルＰＣＲ法を用いて、染色体数の微小な不均衡を検出した。サンプル中におけるＣ２１の１．５％の増加を決定するためには、５シグマの確実性で約９００，０００のＰＣＲ反応が必要とされた：
【０１５６】
【化７】
ｍは、ゲノム等価性（１ゲノムセット＝各染色体２本ずつ）数である。サンプルノイズであるシグマは、第２１番染色体数の平方根である。論じた通り、従来のＰＣＲ法を用いる場合、この反応数は法外に大きく、事実上不可能である。１０６個の反応チャンバーを含むマイクロ流体アレイの使用により、この反応数が、可能で有効なスケールに凝縮される。
【０１５７】
第２１番染色体（Ｃ２１）および第９番染色体（Ｃ９）のコピー数は、それぞれ、第２１番染色体および第９番染色体上の単一のコピーに存在することが公知であるＡＩＲＥ遺伝子およびＡＢＬ遺伝子のデジタル検出を用いて決定された。６％のトリソミー２１ ＤＮＡでスパイクしたサンプルに対する、デジタルチャンバー９０，０００個にわたる測定値を、正常なゲノムサンプル中で得られるカウントにより標準化したところ、ＡＩＲＥ遺伝子について予測される３％の濃縮が示された（図７）。これらの測定値は、現在報告される任意のＰＣＲ法で最高の識別力を表し、１％未満の配列の違いの検出までそのままの形で拡張することができる。興味深いことに、正常なゲノムＤＮＡにおけるＡＩＲＥおよびＡＢＬの測定値は、陽性反応チャンバーの絶対数で一致する違いを示した。
【０１５８】
（実施例４）
（大きな相同のバックグラウンドにおけるまれな配列の検出：ＪＡＫ２アッセイ）
概念実証として、Ｊａｋ２遺伝子中においてＳＮＰ突然変異（Ｖ６１７Ｆ）を含有するプラスミドサンプルを分析した。Ｖ６１７Ｆ突然変異は、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症、および複数種の白血病など、複数種の骨髄増殖性障害に特異的である。共通のプライマーを用いる一方で、ＳＮＰ領域に特異的なプローブにより、野生型Ｊａｋ２遺伝子またはＶ６１７Ｆ変異体を含有するプラスミドを調べた。Ｖ６１７Ｆ変異体にはＶＩＣによるプローブを用いる一方で、ＦＡＭによるプローブを用いてＳＮＰを調べた。一定の野生型バックグラウンドにわたり異なる量の変異体を含有するサンプルを調べたところ、該アッセイにより、文献（Ｂｏｓｄｑｕｅｔら、２００６年、Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ、第３７巻、１４５８頁）により報告される５：１００の最小値と比較して小さな１：１０００の対野生型変異体比を検出することができた。これらの結果を図８Ａ、Ｂに示す。
【０１５９】
ピコリットル容量での区画化により、配列相同性の高い大きなバックグラウンド内においてまれな配列を検出するのに用いうる、濃度の有効な濃縮がもたらされる。１０００コピー当たり１コピーの相対濃度にある野生型のバックグラウンド（１０００コピーの野生型によるバックグラウンド中に１コピーのＳＮＰ）中における数コピーの一塩基多型（ＳＮＰ）の非デジタル法による検出は容易でない。このような状況では、野生型配列に対するごく微量の非特異的増幅によっても、結果として偽陽性がもたらされ、いずれのＰＣＲ法による検出も極めて困難であるかまたは不可能となっている。しかし、このサンプルを１００，０００個のチャンバーに分割したところ、反応チャンバー１個当たり平均１００コピーの野生型配列が結果としてもたらされた。これらの反応チャンバーの大半は標的配列を有さなかったが、１００個の反応チャンバーは、（高い確率で）ＳＮＰを含む標的核酸の単一コピーを含有した。このような状況では、バックグラウンドがこのように４桁分低下し、ＳＮＰの検出は、１０個の分子中において１個の分子だけの識別が可能なアッセイにより達成することができる。
【０１６０】
（実施例５）
（マイクロ流体アレイの配列決定ライブラリーへの適用）
伸長による配列決定またはライゲーションによる配列決定に依拠する自動配列決定装置または自動配列決定システムと共に用いられる配列決定ライブラリーを作製することができる。これらの配列決定法において重要な工程は、配列決定前における単一分子の増幅の局在化である。この工程では、配列決定される単一のＤＮＡテンプレート分子をそれらの隣接分子から単離して、ポリメラーゼ連鎖反応またはローリングサイクル増幅を用いる増幅にかける。例として述べると、本発明によるマイクロ流体デバイスには、チャンバー当たり数個のビーズを与えるように選択される濃度で、ミクロンスケールのビーズを充填することができる。約１０，０００，０００個の反応チャンバーを含むデバイスには、標的核酸を含むＰＣＲ反応混合物中約０．１個〜約０．５個の濃度にあるビーズ懸濁液を充填することができる。十分な量のビーズを供給して、チャンバー当たりの平均ビーズ数を約５個とする。ポアソン統計に基づくなら、この充填の結果、各々がその中にサンプルを有し、これらの約９５％が単一のテンプレートを有し、これらのほとんどすべてが少なくとも１個（平均５個）のビーズを有する約１，０００，０００個のチャンバーがもたらされる。増幅後、チャンバーからビーズを除去することができる。チャンバーからビーズを除去する方法の例は、洗浄工程または支持体（例えば、ガラス）からのマイクロ流体デバイスの剥離を含む。ビーズを回収して配列決定することができる。この結果、そのうちの約９５％が唯一の配列に結合し、分子約１，０００，０００個の総サンプルサイズを表す、ビーズ約５，０００，０００個のライブラリーがもたらされる。これらのライブラリーのサイズは、より多くのチャンバーを有するデバイスの作製によってさらに増大させることもでき、複数のデバイスの使用によってさらに増大させることもできる。
【０１６１】
すべての引用物は、参考として本明細書に援用される。
【０１６２】
本明細書で好ましい１つまたは複数の実施形態を、例として説明してきた。特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、各種の変更および改変を行いうることは、当業者に明らかであろう。
【０１６３】
本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
エラストマー基材において形成された流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、
該複数の反応チャンバーと同一平面で適用されており、エラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアと
を含むマイクロ流体デバイス。
・（項目２）
前記流路に沿って配置された複数のバルブをさらに含む、項目１に記載のデバイスであって、該複数のバルブの各々は、該流路と交わる１つまたは複数の制御チャネルを含む、デバイス。
・（項目３）
前記バルブが前記流路の第１の端部および第２の端部に配置されている、項目２に記載のデバイス。
・（項目４）
前記反応チャンバーが、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である、項目１に記載のデバイス。
・（項目５）
前記反応チャンバーが、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである、項目１に記載のデバイス。
・（項目６）
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、項目５に記載のデバイス。
・（項目７）
前記反応チャンバーが、５０００個／ｃｍ２またはそれよりも大きい密度で存在する、項目１に記載のデバイス。
・（項目８）
マイクロ流体デバイス内において流体を区画化する方法であって、
第１の流体を有する流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、
該第１の流体とは非混和性の第２の流体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の流体を移動させる工程と
を含み、
該複数の反応チャンバーの各々における第１の流体が、該流路内における該第２の流体により他の反応チャンバーの各々における第１の流体から隔離される、方法。
・（項目９）
サンプルが、ＰＣＲ用の１種または複数種の試薬をさらに含む、項目８に記載の方法。
・（項目１０）
前記反応チャンバーが、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である、項目８に記載の方法。
・（項目１１）
前記第１の流体が水溶液である、項目８に記載の方法。
・（項目１２）
前記第２の流体が非水性流体である、項目８に記載の方法。
・（項目１３）
前記第１の流体が、ＰＣＲ用の反応混合物を含む、項目８に記載の方法。
・（項目１４）
前記第１の流体がサンプルを含む、項目８に記載の方法。
・（項目１５）
前記反応チャンバーが、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである、項目８に記載の方法。
・（項目１６）
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、項目８に記載の方法。
・（項目１７）
標的核酸のデジタル定量法であって、
マイクロ流体アレイの流路と流体連絡した複数の反応チャンバーに、標的核酸を含む第１の流体を充填する工程と、
該第１の流体とは非混和性の第２の流体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の流体を移動させる工程であって、該複数の反応チャンバーの各々における第１の流体が、該流路内における第２の流体により他の反応チャンバーの各々における該第１の流体から隔離される工程と、
該マイクロ流体アレイをインキュベートする工程と
を含む方法。
・（項目１８）
前記反応チャンバーが、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である、項目１７に記載の方法。
・（項目１９）
前記第１の流体が水溶液である、項目１７に記載の方法。
・（項目２０）
前記第２の流体が非水性流体である、項目１７に記載の方法。
・（項目２１）
前記第１の流体が、ＰＣＲ用の反応混合物を含む、項目１７に記載の方法。
・（項目２２）
前記第１の流体がサンプルを含む、項目１７に記載の方法。
・（項目２３）
前記反応チャンバーが、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである、項目１７に記載の方法。
・（項目２４）
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、項目１７に記載の方法。
・（項目２５）
前記標的核酸が、前記第１の流体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約１個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、項目１７に記載の方法。
・（項目２６）
前記標的核酸が、前記第１の流体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約０．５個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、項目１７に記載の方法。
・（項目２７）
前記インキュベートする工程が熱サイクリングを含む、項目１７に記載の方法。
・（項目２８）
エラストマー基材において形成された流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、
２つ以上の反応チャンバー間の流体連絡を阻止する流体バリアと
を含むマイクロ流体デバイス。
・（項目２９）
前記複数の反応チャンバーと同一平面で適用されており、エラストマー層により前記反応チャンバーから分離された蒸気バリアをさらに含む、項目２８に記載のデバイス。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図２ｇ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年１１月７日出願の米国仮特許出願６０／９９６，２３６（これはその全体が参考として本明細書において援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、マイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
現行のマイクロ流体デバイス（「チップ」）およびシステムは、小容量、一般に数ナノリットルの半自動的および自動的な操作を可能とする。サンプル処理およびアッセイの微細化により、速度および感度の両方が増大するほか、スケールの節約ももたらされ、すなわち、アッセイを実行し、所望の情報を得るのに必要とされる試薬、サンプル、および空間がより少量およびより狭小となり、個々のサンプルおよび試薬に対する操作の減少により誤差の可能性が低下する。マイクロ流体デバイスおよびマイクロ流体システムは、タンパク質結晶解析、無細胞タンパク質合成、ガスクロマトグラフィー、細胞分離、電気泳動、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを含む各種の化学的分析および生化学的分析による使用に適応または提供されている。
【０００４】
ＰＣＲおよび他の核酸に基づく方法の出現、ならびにヒトゲノム配列決定の完了により、各種の核酸に基づく診断および検査がもたらされ、このため、より正確で高感度な分析ツールに対する要求はとどまることがない。遺伝子の発現、多型、変異（遺伝性または他の形での）などについての知識が医療の改善へと置き換えられ、これが、より正確で高感度な分析ツールを要求している。遺伝子疾患、癌、および感染症のより早期の検出および診断により、即時の有益な影響がもたらされる。疾患の早期段階はより効果的に治療することができ、成功度がより高いことが多く、したがって、対象の転帰および生活の質を大きく改善する。
【０００５】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、比較的まれな遺伝子多型を検出する最新の「ゴールドスタンダード」であるが、配列の違いを信頼できる形で検出する前に、サンプル中に約２０％以上の配列の違いの存在を必要とする。ＰＣＲは、指数関数的増幅法であり、本来極めて高感度であり、原理的には単一分子の検出を可能とする。しかし、任意の非特異的な増幅または汚染により偽陽性がもたらされる場合があり、これにより、まれな配列を信頼できる形で検出することが極めて困難となる。標的配列がより高レベルで存在し得る他の分子種と極めて類似し、したがって、まれな分子種の検出におけるアッセイ感度を制限し得る場合、すなわちほぼ同一の配列を有する正常な分子によるバックグラウンドが大きいために、まれな癌細胞集団内における一塩基多型の存在が見えなくなりうる場合に、これは特に当てはまる。加えて、指数関数的増幅反応のリアルタイムでのモニタリングは、ダイナミックレンジが大きいが、識別力が制限され、２つの配列の相対度数の差が約２０％未満である場合は、検出が困難であり得る。多くの適用では、はるかに大きな感度が必要とされる可能性がある。例として述べると、循環血液からの胎児異数性の検出は、約１〜６％の対立遺伝子の違いの正確な検出を必要とする（Ｌｏら、１９９８年、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。
【０００６】
デジタルＰＣＲは、１９９９年にＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒにより初めて説明された（Ｐｒｏｔ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、第９６巻、９２３６〜９２４１頁）。デジタルＰＣＲ法は単一分子の増幅をもたらすが、従来の９６ウェルプレートおよび３８４ウェルプレートを用いるマイクロリットル容量のリアクター内における肉眼での実施は、非特異的な増幅、汚染、高額な試薬費用、および少ない反応数を克服しなければならない場合がある。したがって、デジタルＰＣＲによる定量的分析の実施には、低い偽陽性率で単一分子を信頼できる形で増幅することが必要である。これは、マイクロリットル容量のリアクターで注意深く最適化を行うことが必要とされることがらである。加えて、デジタルＰＣＲによる分析の精度は、反応数に依存する。１％の違いを信頼できる形で検出するには、数十万〜百万の反応を必要とする。これは、既存の方法を用いる場合、実際的でない。
【０００７】
新しく出現したマイクロ流体技術は、小容量の区画化、高いスケーラビリティー、およびスケールの節約による感度の増大を提供し、これにより、デジタルＰＣＲの最大限の力を実現することが可能となる。
【０００８】
アッセイサイズの縮小は、単なるスケールの節約を超えるものをもたらし、より少量のサンプルを用いることができ、１つのサンプルに対してより多くの検査を実施できることが最も明らかな有益性であるが、「従来の」容量サイズおよびサンプルサイズを用いては非実際的であるか、不可能であった生物学的アッセイもまた可能とすることができる。ある場合には、従来のアッセイを容易に縮小する（例えば、１００ｕｌの代わりに１ｕｌの容量を用いる）ことができる一方、他の場合には、アッセイを準備する方法、データを分析する方法、または他の点において大きな改変を必要とし得る。Ｚｈａｎｇら、２００６年（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ、第２４巻、２４３〜２８４頁）は、ＤＮＡ増幅ならびにマイクロ流体工学の適用に有用となりうる各種の方法、材料、および技法のためのＰＣＲ用マイクロ流体デバイスについて総説している。
【０００９】
溶液を多数の小容量反応に区画化することは、多くの分野で有用である。バルブおよび流路を含むマイクロ流体デバイスは、均一の空間配置により、平面的（２次元的）なエマルジョンの形成を可能とする。この均一なアレイには、各液滴を経時的に追跡または画像化し得る利点がある。これは、リードアウトの経時的モニタリングを必要とするアッセイ（例えば、リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応）において特に重要である。さらに、このような方法により、各液滴の容量が実質的に同じである、正確に規定されたアレイが可能となる。
【００１０】
バルブによる区画化を用いるマイクロ流体によるデジタルＰＣＲが、環境菌に対する多重遺伝子解析（Ｗａｒｒｅｎら、２００６年、ＰＮＡＳ、第１０３巻、１７８０７〜１７８１２頁）において、また、造血細胞の転写因子プロファイリング（Ｏｔｔｅｓｅｎら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３１４巻、１４６４〜１４６７頁）のために、用いられている。これらの実験で用いられるマイクロ流体デバイスでは、約９０００の個別の１０ｎＬ反応による区画化アレイが与えられる。
【００１１】
現行のマイクロ流体デバイスにおいて達成可能なＰＣＲ反応の密度および最小容量は、実際的な制限を受ける場合がある。アレイの密度が増加するにつれ、個別の反応チャンバー容量は減少し、バルブが過大な空間を占めるために実現可能でなくなる場合がある。マイクロ流体バルブを信頼できる形で作製し得る最大密度（ピッチ（ｐｉｔｃｈ）が約２００μｍである５０個×５０個のチャンバーアレイに基づく約２５００ｃｍ２であることが典型的）により、熱サイクリング時における過度の試薬の蒸発なしに気体透過性エラストマーによるデバイス内において実装し得るＰＣＲ反応の最小容量（約１ｎＬ）を伴って作製し得る、バルブにより画定される個々の反応チャンバーの数に対する上限（Ｔｈｏｒｓｅｎら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９８巻、５８０〜５８４頁）が与えられる。正確な測定は、単一のサンプルを数千〜数百万の個別の反応に区画化することを必要とし、このため、デバイス面積および試薬消費のいずれの点でもこれを高価なものとするので、デジタルＰＣＲでは密度およびスケールが特に重要である。したがって、アッセイ密度を劇的に増大させ、アッセイ容量を劇的に低減する新たな方法が、この技法の潜在力の全面的な実現における中心的な課題である。
【００１２】
各種の材料が、マイクロ流体工学の適用では公知であり用いられているが、操作の容易さおよびマイクロ流体デバイスのモノリシックの構築に対する適性ではシリコーンゴム材料（例えば、ポリジメチルシロキサン、またはＰＤＭＳ）が好ましく、ＰＤＭＳは、高度の気体透過性を示し、このため、デッドエンド構造の充填を可能とする。加えて、ＰＤＭＳは、水蒸気に対しても透過性が高い。こうして、ＰＤＭＳで構築されたマイクロ流体デバイス内において実施される一部の工程において、特に、高温が必要とされる場合、このようなＰＣＲは、急速な蒸発による小容量の水性反応物からの乾燥を被る可能性があり、反応は失敗する可能性がある。
【００１３】
この限界を克服しようとする試みでは、外部水分補給法が用いられている。これにより、蒸発速度がある程度低下するが、この水分補給を用いても、用いて成功し得るサンプル容量サイズは、やはり蒸発により制限される。このため、このようなシステムが、高密度アレイを可能とするであろう極めて小容量のサンプルサイズ（例えば、ピコリットル以下のオーダーにおける）、したがって、デバイスの有用性を向上させる大きなサンプル数を組み込む能力は制限される。
【００１４】
特許文献１は、ＰＣＲアッセイを実施するためのマイクロ流体デバイスを開示しており、マイクロ流体デバイスからの流体の蒸発を低下させる、該デバイス内における流体で満たした防護チャネルの使用もさらに開示している。
【００１５】
特許文献２は、失われた流体を、流体レザバーから毛細管チャネルを介して補充することによる、マイクロ流体デバイス内における蒸発に対する補完法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７，１１８，９１０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５５５，３８９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、マイクロ流体デバイスに関する。本発明はまた、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーからの蒸発を防止する蒸気バリアと、該複数の反応チャンバーの各々を隔離する連続相流体とを含むマイクロ流体デバイスにも関する。マイクロ流体デバイスを用いる標的核酸のデジタル定量法もまた提供される。
【００１８】
本発明は、反応チャンバー密度を３桁分上昇させて、平方インチ当たりの反応チャンバー約１０，０００，０００個（約１．５×１０６個／ｃｍ２）までの密度を達成する一方、各アッセイ容量を相応量だけ低下させるマイクロ流体デバイスを提供する。該デバイスは、個々の反応チャンバーを分離するバルブの必要なしに、ｐＬ容量のエマルジョンアレイへとアッセイを区画化する。
【００１９】
本発明の一局面により、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーからの蒸発を防止する蒸気バリアと、該複数の反応チャンバーの各々を隔離する連続相流体とを含むマイクロ流体デバイスが提供される。
【００２０】
本発明の一局面により、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーと同一平面で適用されており、エラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアとを含むマイクロ流体デバイスが提供される。
【００２１】
本発明の別の局面により、マイクロ流体デバイスは、流路に沿って配置されており、各々が流路と交わる１つまたは複数の制御チャネルを含む複数のバルブをさらに含む。
【００２２】
本発明の別の局面により、バルブは流路の第１および第２の端部に配置されている。
【００２３】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である。
【００２４】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである。
【００２５】
本発明の別の局面では、反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている。
【００２６】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、５０００個／ｃｍ２以上の密度で存在する。
【００２７】
本発明の別の局面により、マイクロ流体デバイス内において流体を区画化する方法であって、第１の流体を有する流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該第１の流体とは非混和性の第２の流体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の流体を移動させる工程とを含み、該複数の反応チャンバーの各々における該第１の流体を、該流路内における該第２の流体により他の反応チャンバーの各々における該第１の流体から隔離する方法が提供される。
【００２８】
本発明の別の局面により、標的核酸のデジタル定量法であって、マイクロ流体アレイの流路と流体連絡した複数の反応チャンバーに標的核酸を含む第１の流体を充填する工程と、該第１の流体とは非混和性の第２の流体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の流体を移動させる工程であって、該複数の反応チャンバーの各々における該第１の流体を、該流路内における該第２の流体により他の反応チャンバーの各々における該第１の流体から隔離する工程と、該マイクロ流体アレイをインキュベートする工程とを含む方法が提供される。
【００２９】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である。
【００３０】
本発明の別の局面により、第１の流体は水溶液である。
【００３１】
本発明の別の局面により、第２の流体は非水性流体である。
【００３２】
本発明の別の局面により、第１の流体は、ＰＣＲ用の反応混合物を含む。
【００３３】
本発明の別の局面により、第１の流体はサンプルを含む。
【００３４】
本発明の別の局面により、反応チャンバーは、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである。
【００３５】
本発明の別の局面では、反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置される。本発明の別の局面により、標的核酸は、第１の流体中において、複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約１個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である。
【００３６】
本発明の別の局面により、標的核酸は、第１の流体中において、複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約０．５個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である。
【００３７】
本発明の別の局面により、インキュベートする工程は、熱サイクリングを含む。
【００３８】
本発明の別の局面により、エラストマー基材内において形成されている流路と連絡した複数の反応チャンバーと、２つ以上の反応チャンバー間の流体連絡を阻止する流体バリアとを含むマイクロ流体デバイスが提供される。
【００３９】
本発明の別の局面により、デバイスは、複数の反応チャンバーと同一平面で適用されており、エラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアをさらに含む。
【００４０】
本発明のこの概要は、本発明のすべての特徴を必ずしも説明するものではない。本発明の特定の実施形態についての以下の説明を吟味すれば、当業者には、本発明の他の局面、特徴、および利点が明らかとなろう。
【００４１】
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面が参照される以下の説明からより明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、マイクロ流体デバイスの作製工程についての概略図を示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態によるマイクロ流体アレイの概略図を示す。（ａ）１インチ×１インチ（２．５４ｃｍ×２．５４ｃｍ）の面積において１，０００，０００個の反応チャンバーをフィーチャするマイクロ流体アレイを示す図である。（ｂ）サンプル充填領域を示す挿入図Ａである。（ｃ）マイクロ作製された反応チャンバーおよびフィードチャネルを示す挿入図Ｂである。（ｄ）反応チャンバー形状の３次元的描画である。この例において、該チャンバーは、底面の１辺が１０ミクロン、高さ４０ミクロンで、総容量が４ピコリットル（ｐＬ）である。（ｅ）バルブチャネルを欠く、（ａ）と同様のマイクロ流体アレイを示す図である。（ｆ）挿入図Ｄである。（ｇ）バルブチャネルを欠き、水分補給チャネルを含む、（ａ）と同様のマイクロ流体アレイを示す図である。
【図３】図３は、反応チャンバー内における流体の隔離を示す概略図を示す。（Ａ）では、チャネルおよび反応チャンバーに第１の流体（Ｆ１：ドット）が充填されている。（Ｂ）では、第２の流体（Ｆ２：チェック）が導入されてチャネル内に流入し、第２の流体が第１の流体をチャネルから移動させるが、第１の流体は反応チャンバー内に残存する（第２の流体の流動により「取り除かれる」）。（Ｃ）では、第１の流体がチャネルから移動し、反応チャンバー、および反応チャンバーアクセスチャネルの一部だけに残存する。矢印により流体流動の方向を示す。
【図４】図４は、容量に関するスケーリングの精度および特異性についての統計学的プロットを示す。（Ａ）チャンバー数の関数としてのデジタルＰＣＲを用いて１％だけ異なる２つの対立遺伝子に対して測定された平均の分離についての数値計算を示す図である。差は、確率論的二項分布ノイズ（サンプリングノイズ）により決定される予測標準偏差（シグマ）により標準化される。反応チャンバーの５０％における陽性増幅に対応するテンプレート濃度について、計算を実施した。約１，０００，０００個のチャンバーで５シグマの分離が達成されている。（Ｂ）１００万個中に１個の頻度で存在するまれな分子種を検出するために、チャンバー容量の関数としての特異的増幅と非特異的増幅との効率比についての数値計算を示す図である。
【図５】図５は、チャンバー当たり１０コピーで充填されたゲノムＤＮＡ（ポジティブコントロール）およびテンプレートなしのコントロール（ネガティブコントロール）サンプルに由来するＧＡＰＤＨ増幅の蛍光画像を示す。細線は、同じ流路に連絡された反応チャンバーのセットの輪郭を示す。太線は、蒸気バリアの境界を示す。デバイス底部において、サンプルの脱水による増幅失敗のエッジ効果が見られる。ポジティブコントロールの反応チャンバー（領域Ａ、Ｄ、およびＥ）内におけるＰＣＲ反応が標的ＤＮＡおよび増幅に必要な試薬を含む一方、領域ＢおよびＣにおけるネガティブコントロールの反応チャンバーは標的ＤＮＡを欠いた。明色の領域は、標的ＤＮＡに対するＰＣＲ増幅の成功を示す。
【図６】図６は、本発明によるマイクロ流体デバイスにおけるＰＣＲ反応の増幅プロットを示す。
【図７】図７は、本発明の平面エマルジョンアレイを用いる、第９番染色体（Ｃ９）に対する第２１番染色体（Ｃ２１）の３％の増加の検出についての結果を示す。ゲノムＤＮＡサンプルを６％のトリソミー２１ ＤＮＡでスパイクしたところ、最終的に、Ｃ９に対してＣ２１が３％増加した（黒色ダイヤモンド）。染色体が正常な個体に由来する純粋なゲノムＤＮＡは、１：１のＣ２１：Ｃ９比を有する（黒色四角）。
【図８ａ】図８は、ＪＡＫ２におけるＶ６１７変異体に対して異なる比の野生型を検出するアッセイの結果を示す。一定量の野生型に異なる量の変異体プラスミドを添加した（曲線因子（Ｆｉｌｌ ｆａｃｔｏｒ）０．５）。（Ａ）は、得られた比（濃色バー）および理論比（薄色バー）を示す。（Ｂ）は、０．１％のサンプルおよびコントロールサンプルを除き、Ａの場合と同じ比を示す。
【図８ｂ】図８は、ＪＡＫ２におけるＶ６１７変異体に対して異なる比の野生型を検出するアッセイの結果を示す。一定量の野生型に異なる量の変異体プラスミドを添加した（曲線因子（Ｆｉｌｌ ｆａｃｔｏｒ）０．５）。（Ａ）は、得られた比（濃色バー）および理論比（薄色バー）を示す。（Ｂ）は、０．１％のサンプルおよびコントロールサンプルを除き、Ａの場合と同じ比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、エラストマー基材内において形成されている流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、該複数の反応チャンバーを覆う蒸気バリアと、該複数の反応チャンバーの各々を隔離する連続相流体とを含むマイクロ流体デバイスに関する。該マイクロ流体デバイスを用いる、標的核酸のデジタル定量法もまた提供される。
【００４４】
「流路（ｆｌｏｗ ｃｈａｎｎｅｌ）」とは、流体が流動する経路を一般に指す。
【００４５】
「反応チャンバー」、「反応ウェル」、または「ウェル」とは、化学的反応または酵素的反応が発生する境界づけられた領域である。それは、壁および１つまたは複数のバルブにより境界づけることができる。代替的に、反応チャンバーは、壁および流体バリアにより境界づけることもできる。反応チャンバーの「壁」は、該チャンバーを境界づけるすべての表面（流体、固体、または半固体）を含む。反応チャンバーは、１つまたは複数の流路と連絡され、該連絡は、１つまたは複数の流路による反応チャンバーの充填および／または排出を可能とする開口部を含む。本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイス内における複数の反応チャンバーは、均一なアレイに配置することができる−この配置をマイクロ流体アレイと呼ぶことができる。
【００４６】
「隔離された反応チャンバー」とは、別の反応チャンバーまたは流路と流体連絡されていない反応チャンバーである。流体連絡は、例えば、バルブ、または流体バリアにより阻止することができる。流体バリアは、例えば、反応チャンバー内における材料（通常、別の流体）とは非混和性の流体により形成することができる。
【００４７】
「出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバー」とは、流体の流入を可能とする単一のアクセスポートまたは開口部を有するが、別個の流出口を欠くチャンバーである。
【００４８】
「デッドエンド充填（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ｆｉｌｌ）」とは、圧力下にある流体によりデッドエンドであるかまたは出口のない反応チャンバーに充填する方法である。最初に流体をチャネル構造に注入すると、それは、最小抵抗経路に従い、一部の領域を充填されていないかまたは部分的に充填された状態のままに放置する。マイクロ流体の作製において用いられる一部のエラストマー材料の気体透過性を利用して、デッドエンドチャネルに充填することが可能となる。すべての流出バルブを閉じて、圧力下（約３００ｐｓｉまたは約２００ｋＰａまでの）において流体を注入することにより、押圧された流体が該チャネルに充填され、該デバイスのチャンバーまたはチャネル内における任意の気体（空気）を圧迫する。押圧された気体はエラストマー内全体に拡散し、デッドエンドであるかまたは出口のない反応チャンバーを流体で充填して消失する。
【００４９】
「試薬」とは、分析対象（例えば、分析される細胞、代謝物、または核酸）以外で反応において用いられる任意の作用物質を広く指す。核酸増幅反応用の試薬の例は、緩衝液、界面活性剤、金属イオン、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、キナーゼまたはホスファターゼ、プライマー、テンプレート核酸または標的核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼなどを含むがこれらに限定されない。酵素反応用の試薬は、例えば、基質、補因子、緩衝液、金属イオン、阻害剤、および活性化剤を含む。細胞ベースの反応用の試薬は、酵素反応または核酸検出用の上記の試薬のほか、細胞、細胞特異的色素、または細胞受容体に結合するリガンド（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）を含むがこれらに限定されない。エラストマー表面への試薬の吸着を低下させるため、試薬混合物中にＴＷＥＥＮ−２０などの界面活性剤を組み入れることができる。
【００５０】
プライマーとは、標的核酸にアニールし、核酸ポリメラーゼにより伸長する短い（一般に、１０〜３０ヌクレオチドの）核酸またはオリゴヌクレオチドである。プライマーは、標的核酸と完全に相補的な（プライマーのすべてのヌクレオチドと標的核酸との間で１００％マッチする）場合もあり、プライマーが標的核酸の部位において選択的にハイブリダイズするように実質的に（１００％未満）相補的な場合もある。
【００５１】
プローブとは、標的核酸と特異的にハイブリダイズする核酸配列である。ハイブリダイゼーションは、例えば、二本鎖の立体構造の形成だけによって蛍光発光するように改変された特性を有する蛍光標識または蛍光色素（例えば、ＤＮＡ染色色素）または蛍光発光（例えば、分子ビーコン）により検出可能である。プローブは、標的核酸配列に対する十分な相補性をもたらし、反応条件下においてアニールするのに適する任意の長さであり得る。ハイブリダイゼーションにおいて用いられるプローブは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）プローブ、ならびにペプチド核酸を含みうる。一塩基多型または数個のヌクレオチドに関与する他の変異を同定するためのハイブリダイゼーション法は、米国特許第６，２７０，９６１号、同第６，０２５，１３６号、および同第６，８７２，５３０号において説明されている。本発明による使用に適するハイブリダイゼーションプローブは、約６〜約４００ヌクレオチド、約２０〜約２００ヌクレオチド、または約３０〜約１００ヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＬＮＡ、およびＰＮＡを含む。
【００５２】
オリゴヌクレオチドとは、特定の核酸の検出および／または増幅のためのプローブ、プライマーとして有用であり得る可変長の核酸である。オリゴヌクレオチドを合成するための公知の方法は数多い−例えば、Ｂｏｎｏｒａ ＧＭ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９０年）、第１８巻、第１１号、３１５５〜９頁；Ｌａｓｈｋａｒｉ ＤＡ．ら、ＰＮＡＳ（１９９５年）、第９２巻、第１７号、７９１２〜５頁；ＭｅＧａｌｌ Ｇ．ら、ＰＮＡＳ（１９９６年）、第９３巻、第２４号、１３５５５〜６０頁；Ａｌｂｅｒｔ ＴＪ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（２００３年）、第３１巻、第７号、ｅ３５頁；Ｇａｏ Ｘ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２００４年）、第７３巻、第５号、５７９〜９６頁；およびＭｏｏｒｃｒｏｆｔ ＭＪ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（２００５年）、第３３巻、第８号、ｅ７５頁： Ｇａｉｔ、１〜２２頁；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、３５〜８１頁；Ｓｐｒｏａｔら、８３〜１１５頁；およびＷｕら、１３５〜１５１頁、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４年、オックスフォード、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ社；または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ社を参照されたい。
【００５３】
一部の核酸またはオリゴヌクレオチドには、該オリゴヌクレオチドにおける酵素的安定性の変化もしくは改善、または立体構造上の制約をもたらす単量体を組み込むことができる。例えば、二重環状ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに対する立体構造上の制約をもたらす可能性があり、非修飾のオリゴヌクレオチドと比較して、異なるハイブリダイゼーションプロファイルまたは安定性プロファイルをもたらし得る。ＬＮＡヌクレオシドは二重環状ヌクレオシドの例であり、ＵＳ６，２６８，４９０、ＵＳ６，７９４，４９９、ＵＳ７，０３４，１３３（参照によりこれらの各々を本明細書に組み込む）において説明される通り、２’−４’環状結合を有する。ＬＮＡ単量体を含む核酸ポリマーの合成および重合化の方法は、例えば、ＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ０１／２５２４８、ＷＯ０１４８１９０、ＷＯ０２／２８８７５、ＷＯ０３／００６４７５、ＷＯ０３／０９５４７、ＷＯ２００４／０８３４３０、ＵＳ６，２６８，４９０、ＵＳ６，７９４，４９９、米国特許第７，０３４，１３３号において説明されている。
【００５４】
「ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）」の工程または反応とは、試薬の添加および反応の複数にわたる個別の工程なしに、単一の反応チャンバー内において実行される工程である。ワンポット反応では、反応に必要な試薬を単一の反応媒体内で、実質的に同時に、一体に混合する。例えば、ワンポットのＰＣＲ反応は、単一の反応チャンバー内において増幅反応および検出の両方のための試薬を混合し得る増幅および検出の両方が同じ反応チャンバー内で実行される。特定の標的核酸の増幅および検出に必要なすべての試薬（標的核酸、プライマー、プローブ、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液、塩などを含む）を含む反応混合物を混合することができ、この単一の混合物を本発明のマイクロ流体デバイス内に注入することができる。反応混合物ですべての反応チャンバーに充填し、該チャンバーを隔離し、熱サイクリングを実施する。特定の増幅産物の検出は、熱サイクリングの発生時、もしくはその発生後、またはその両方において実施することができる。ワンポット工程の変形形態として、本発明のマイクロ流体デバイスの合成時またはその後において、該デバイスの反応チャンバーのアレイまたはサブアレイ内に試薬を配置することができる。増幅に必要な残るすべての試薬を含む反応混合物を本発明のマイクロ流体デバイス内に注入し、反応チャンバー内においてプライマーおよびプローブを反応混合物と最終的に混合する。ここでもまた、特定の増幅産物の検出は、熱サイクリングの発生時、またはその両方において実施することができる。
【００５５】
「流体連絡（ｆｌｕｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）」−マイクロ流体デバイスの２つ以上のエレメント（例えば、流路、注入ポート、流出ポート、ビア、反応チャンバー、流入口、または境界により画定される他のスペース）は、該２つのエレメントを連絡させる、流体を除外しない連続経路が存在する場合、流体連絡される。流体連絡は、バリア、バルブ、ポンプ、または該流体連絡の断絶の制御、およびマイクロ流体デバイスの１つまたは複数のエレメントの隔離を可能とする他の制御デバイスを介在させる場合がある。それらの中に第１相の第１の流体を有する２つ以上のエレメントの間の流体連絡はまた、非混和性の第２相の流体も介在させる場合がある。非混和性の流体を該エレメントの１つに導入することで、第１の流体を移動させる。例として述べると、エマルジョン中において、分散相の液滴の流体連絡は、連続相のエマルジョンにより断絶または阻止される。
【００５６】
本発明の一部の実施形態において、非混和性の流体とは、本発明のマイクロ流体デバイスの反応チャンバー内における液滴間の流体連絡に介在するかまたはこれを阻止するバリアまたはバルブ（「流体バリア」または「流体バルブ」）であり得る。
【００５７】
理論により拘束されることは望まないが、本明細書に記載の方法では、第１の流体と、１つもしくは複数のチャネル壁または反応チャンバー壁と、第１の流体とは非混和性の第２の流体との間における表面張力を利用して、その位置およびサイズがマイクロ流体チャネルの構造により正確に規定されるマイクロスケールの液滴の均一なアレイを創出する。
【００５８】
２つの非混和性の流体が混合し、１つの流体（分散相）が他の流体（連続相）中に液滴またはコロイドとして懸濁すると、エマルジョンが形成される。連続相が液滴間におけるバリアを形成し、該エマルジョンが安定化される（液滴の合体が阻止される）場合、各液滴は、隔離された反応容器であり得る。界面活性剤の使用は、エマルジョンを安定化する１つの方法である。別の方法は、マイクロ流体デバイスの構造によりその位置およびサイズが正確に規定され、したがって、接触することが不可能なマイクロスケールの液滴の均一なアレイを可能とするチャンバー式のマイクロ流体デバイスと組み合わせて、分散相と、１つもしくは複数のチャネル壁または反応チャンバー壁と、連続相との間の表面張力を利用することである。
【００５９】
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスの構成は、アクセスチャネルを介して一連のナノリットル（ｎＬ）容量、ピコリットル（ｐＬ）容量、またはフェムトリットル（ｆＬ）容量のチャンバーに連絡されるマイクロ流体チャネルの直線アレイを含む。第１の流体、例えば、ＰＣＲ増幅に必要とされるすべての成分を含むアッセイ混合物を、圧力下において流路内にまず導入し、すべての反応チャンバーにデッドエンド充填する。周囲空気は、反応チャンバーから気体透過性エラストマーによるデバイスのバルク内へと押し出される。限界希釈率で投入されたテンプレート分子は、ポアソン統計に従い、チャンバーアレイ全体に無作為に分配される。チャンバーに充填したら、流路を介して第２の流体を注入し、第１の流体を移動させる。理論により拘束されることは望まないが、相界面が各チャンバーを流過して前進すると、チャネルの狭窄部では表面張力による不安定が生じる結果、その位置および容量がチャンバーの形状により正確に規定された水溶液滴が分離する。これらの水溶液滴は、表面張力のためにチャンバーの大きな断面内にとどめられた状態を保ち、これにより、熱サイクリング時における各液滴の正確な配置が可能となる。
【００６０】
多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）は、数百〜数千の微細な反応チャンバー、バルブ、ポンプ、流体論理エレメント、および他の構成要素を有するマイクロ流体デバイスの容易かつ頑健な作製を可能とする軟質エラストマー処理における周知の作製法である。ＸｉａおよびＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、１９９８年（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、第３７巻、５５１〜５７５頁；参照により本明細書に組み込まれる）は、ＭＳＬを含むソフトリソグラフィーの手順、材料、および技法を説明し、総説している。
【００６１】
略述すると、多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）の全般的な発想は、厚さの異なるエラストマー、例えば、ＰＤＭＳの層を、各々の上面に繰り返し積み重ねることである。それぞれ１０：１未満の化学量論比およびこれを超える化学量論比を有するＰＤＭＳの薄層および厚層を個別のウェハー上で形成する。既にウェハー上で作製されたフォトレジストパターンにより、デバイスのマイクロ流体チャネルを規定する。次いで、厚層をウェハーから剥離させて薄層のウェハー上面に置く。ベーキングすると、各層の余剰成分が結合し、２層のチャネルからなるＰＤＭＳ「チップ」が形成される。エラストマーを加工し、マイクロ流体的に適用する方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９２９，０３０号；Ｓｃｈｅｒｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第２９０巻、１５３６〜１５３９頁；Ｕｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第２８８巻、１１３〜１１６頁；ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．、２００２年、第３５巻、４９１〜４９９頁；Ｔｈｏｒｓｅｎ， Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９８巻、５８０〜５８４頁；Ｌｉｕ， Ｊ．ら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、２００３年、第７５巻、４７１８〜４７２３頁；Ｒｏｌｌａｎｄら、２００４年、ＪＡＣＳ、第１２６巻、２３２２〜２３２３頁；ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３６１５号および同第ＷＯ０１／０１０２５号を参照されたい。
【００６２】
一般にエラストマー（ｅｌａｓｔｏｍｅｒ）と呼ばれる各種の軟質ポリマーを、マイクロ流体デバイスおよびマイクロ流体システムで用いることができる。エラストマーは一般に、広範な熱安定性、高潤滑性、撥水性、および生理学的不活性を特徴とする。エラストマーの他の望ましい特性は、適用に伴い変化し得る。所望の目的に適するエラストマーまたはエラストマーの組合せを選択することは、当業者の能力内にある。エラストマーの例は、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、光硬化性ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、フルオロシリコーン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン、ポリイソブチレン、ポリウレタン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ビニル−シラン間架橋シリコーンなどを含む。エラストマーは、光学的に透明の場合もあり、不透明の場合もあり、多様な程度に透明な場合もある。本発明の一部の実施形態では、生体適合性エラストマーを用いることが望ましい場合がある。ＰＤＭＳは、ソフトリソグラフィーへの適用において最初に開発されより広く用いられているエラストマーの１つである。ＰＤＭＳを本発明の各種の実施形態で用いられるエラストマーとして説明する場合、それは例示的な目的に過ぎず、代替的なエラストマーの選択も当業者の知識内にある。マイクロ流体的な適用において用いるのに適する各種のエラストマー、およびこれらの多様な特性および適用例は、米国特許第６，９２９，０３０号において説明されている。
【００６３】
シリコンウェハーまたは他の適切な支持体上にレイアウトされたフォトレジストパターンにより、該層を成形するためのテンプレートがもたらされる。一般に、フォトレジストは、ポジティブ型またはネガティブ型として分類することができる。ポジティブ型フォトレジストは、極めて精細な分解能が可能である。これらは、ＫＯＨなどのアルカリ溶液中でよく溶けるが、ジアゾナフタキノン（ＤＱ）などの感光性溶解阻害剤を用いてこの作用を遮断することが典型的である。紫外（ＵＶ）光との光反応によりＤＱが破壊され、現像液による該フォトレジストの溶解が可能となる。フォトレジストに対するこの種の処理の発想は、ＵＶ光に露光されたすべての区画が除去されるということである。ポジティブ型フォトレジストの例は、ＳＰＲ２２０−７（Ｓｈｉｐｌｅｙ Ｃｏｍｐａｎｙ ＬＬＣ社製）である。
【００６４】
ネガティブ型フォトレジストは一般に、非感光性基質、感光性架橋形成剤、およびコーティング溶剤を含む。ＵＶ光への露光時に架橋形成剤が活性化され、硬質のエポキシを形成させる。該フォトレジストの残りの非露光区画は、現像液により洗い流される。ＳＵ８（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ社製）が、いずれのＭＳＬテンプレートにおいても用いうるネガティブ型フォトレジストの例である。加えて、ＳＵ８は、エポキシとして極めて強力であり、後続のフォトリソグラフィー工程に対して耐性であり得る。特定のフォトレジストを加工する詳細な方法および技法は各製造元から入手できるので、本明細書ではこれ以上立ち入らない。具体的なフォトレジストの例は例示的な目的に過ぎず、本発明の限定として考えるべきではない。
【００６５】
作製時には、他の構成要素をマイクロ流体デバイスに組み込み得、ＭＬＳ時には、ミクロンスケールのバルブ、ポンプ、チャネル、流体マルチプレクサー、灌流チャンバーなどを集積化することができる。このような構成要素を作製し集積化する方法は、例えば、米国特許第７，１４４，６１６号、同第７，１１３，９１０号、同第７，０４０，３３８号、同第６，９２９，０３０号、同第６，８９９，１３７号、同第６，４０８，８７８号、同第６，７９３，７５３号、同第６，５４０，８９５号；米国特許出願第２００４／０２２４３８０号、同第２００４／０１１２４４２号；ＰＣＴ出願第ＷＯ２００６／０６０７４８号において説明されている。
【００６６】
蒸発は、ピコリットルの容量範囲にあるアッセイを実施する場合に克服すべき障害である。マイクロ流体デバイスの作製時には、そこに流体が配置されるかまたは移送され、そこでの流体の喪失が望ましくない、反応チャンバーおよび反応チャネルに近接する形で、デバイス内に蒸気バリアを組み込むことができる。蒸気バリアは、任意の適切な材料であり得る。適切な材料は、光学的に透明であり、水蒸気に対して不透過性であり、マイクロ流体デバイスを含む基材、およびアッセイ混合物中で用いられる流体、または流路内においてアッセイ混合物を移動させるのに用いられる非混和性の油もしくは流体と非反応性であり、マイクロ流体アレイの作製およびそれらが用いられるアッセイにおいて用いられる温度範囲に対して耐性であり得ることが好ましい。加えて、用いられるエラストマーに結合し得る材料を用いることが望ましい。良好な結合は、エラストマーの特性の場合もあり、１つまたは複数の接着層の適用により達成する場合もあり、材料表面の改変（例えば、酸素プラズマへの曝露による）による場合もある。適切な材料の例は、アセテート、ポリエチレン、またはポリエチレンベースのシート、ポリキシレンポリマー（Ｐａｒｙｌｅｎｅ（商標）Ｎ、同Ｃ、同Ｄ）であり、他の例は、ガラス、シリコン、石英、雲母を含む。同様に、他のポリマー材料も用いることができ、これらのポリマー材料は、あらかじめ作製された膜として沈着させることもでき、膜として配置される液体（例は、樹脂調合物、ポリマー溶液、前駆体混合物などを含む）の沈着など他のポリマー処理法を用いて沈着させることもでき、ポリマー（Ｐａｒｙｌｅｎｅなどの）の蒸着によって沈着させることもでき、材料を表面上に凝縮させる蒸発によって沈着させることもでき、エアゾールの噴霧などによって沈着させることもできる。
【００６７】
蒸気バリア（ｖａｐｏｒ ｂａｒｒｉｅｒ）は、アレイの少なくとも１つの側と同一平面にあるマイクロ流体デバイスの作製時において適用または配置される。蒸気バリアは、デッドエンド充填によりエラストマー内に押し出された気体を吸収するのに十分な厚さのエラストマー層により、アレイの反応チャンバーの１つの壁から分離される。この厚さは、例えば、約１０〜約５００μｍ、約５０〜約２５０μｍ、または約７５〜約２２５μｍ、または約１００〜約２００μｍ、または約１２５〜約１７５μｍであり得る。理論に束縛されることは望まないが、この形状により、移送（蒸発）がアレイの側面だけを介して生じるように、水蒸気の実質的に二次元的な勾配が確立される。
【００６８】
好ましい例において、アレイは、平面の両側において蒸気バリアにより挟みこまれる。本発明の一部の実施形態において、マイクロ流体アレイは、シリコン基材（アレイの底部）と、アレイの上部におけるアセテートまたはポリエチレンによるシートとの間に配置され、から分離される。説明した通りに構成される２枚の蒸気バリアを用いるデバイスの場合、バリアは、反応チャンバーの高さ、および反応チャンバーアレイの上方または下方に配置される流路、バルブなど、任意の付加層の存在に応じて変化する任意の適切な距離だけ分離させることができる。
【００６９】
作製工程の簡単な概略図を図１に示す。（Ａ）標準的なソフトリソグラフィー法を用いて、ウェハー１２１上にテンプレートフィーチャ１２０を成形する。（Ｂ）その厚さがフィーチャの高さよりもわずかに高くなるように、ウェハー上面に液体ＰＤＭＳをスピンコート（ｓｐｉｎ）し、部分的に硬化させる。（Ｃ）蒸気バリア１２３をＰＤＭＳ層１２２の上面に適用し、第２のＰＤＭＳ層１２４により被覆する。（Ｄ）脱気およびベーキング後、テンプレートからデバイスを剥離させると、硬化したＰＤＭＳ上にネガティブインプリントが残る。
【００７０】
図２ａ〜ｄを参照すると、本発明の一実施形態によるデバイスの概略図が１００において全体的に示される。図２ｂは、図２ａの挿入図Ａを示し、図２ｃは、図２ｄの挿入図Ｂを示し、図２ｄは、図２ｃの挿入図Ｃで示される反応チャンバー１１４の三次元描画を示す。この例示的なデバイスは、反応チャンバー１１４に充填するための、一連のカスケード流路１０５、１０７、１０９と流体連絡した１３本の一次流路１０３を含む。各一次流路はサブアレイへと通じ、これに反応混合物、サンプルなどを含む流体を充填することができ、これは流路から独立でありえ、したがって、同じデバイス上において複数のサンプルまたは同じサンプルに対する複数の反応を充填し処理することが可能となる。
【００７１】
バルブ流路１０２ａ、１０２ｂは、一次流路１０３と交差し、反応チャンバーのアレイを挟む。注入ポート１０４からの流体の流動はバルブ１０８により調整され、バルブ１０８はバルブ流路１０２ａ、ｂ内における流体圧により開閉する。バルブ流路１０２ａに沿うすべてのバルブは、注入ポート１０６ａにより同時に操作することができ、バルブ流路１０２ｂに沿うすべてのバルブは、注入ポート１０６ｂにより同時に操作することができる。反応チャンバー１１４は、反応チャンバーアクセスチャネル１１２を介して反応チャンバー流路１１０と流体連絡している。図２ｃおよび２ｄに示す実施形態では、反応チャンバー１１４が出口のないチャンバーであり、単一の充填ポートを有し、別個の流出ポートを有さない。図２ｄに示される反応チャンバー１１４は幅よりも高さが高く、反応チャンバーの底部にアクセス流路を有する。反応チャンバーの他の構成も可能である。例えば、図２ｄに示す場合などの反応チャンバーは、「専有」面積（幅×奥行き）が小さく、幅または奥行きよりも高さの方が高い。このような「垂直方向の」構成では、サンプル容量がより大きくなり、チャンバーの平面密度が最大化される。より大きな反応容量により、反応チャンバー内により大量のフルオロフォア（または他の検出可能な標識もしくはシグナル発生試薬）を組み入れることができ、したがって、検出のためのより強いシグナルとなる。
【００７２】
図２ｅおよび２ｆを参照すると、バルブチャネル１０２ａ、ｂ、バルブ１０８、およびバルブ流路流入口１０６ａ、ｂを欠く本発明の代替的な実施形態の概略図が１３０において全般的に示される。図２ｆは図２ｅの挿入図Ｄを示し、図２ｆの挿入図Ｂは図２ｃに示される通りである。反応チャンバー１１４に充填するための流路１０３、１０５、１０７、１０９は、前出で検討した通りである。
【００７３】
バルブ流路および一次流路とは別個に充填されて操作される水分補給（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）チャネルをアレイの周囲に組み入れ、アレイエッジ近傍の反応チャンバーに水分補給することができる。図２ｇを参照すると、本発明の代替的な実施形態の概略図が、１４０において全般的に示される。この実施形態は、図２ａ〜ｄおよびｅ〜ｆにおいて示される注入ポート１０４および流路を含み、水分補給チャネル１４２および水分補給ポート１４４をさらに含む。水分補給チャネル１４２は、一次流路１０３の上層または下層に形成され、水分補給チャネル内における流体の流動および圧力が、一次流路１０３または流路１０５、１０７、もしくは１０９（示さない）における流体の流動を実質的に制限するように、十分な厚さのエラストマーにより一次流路１０３を含む流路および反応チャンバーから分離されている。「実質的に制限する」という用語（または類似の用語）は、水分補給チャネルが流体を含有しないか、または圧力下にある条件下での、流路または反応サイトにおける流体の流動であるか、これに向かう流体の流動であるか、またはこれを介する流体の流動と比較して、流路または反応チャンバーにおける流体の流動であるか、これの外の流体の流動であるか、またはこれを介する流体の流動が４０％を超えて低下しない（典型的には３０％未満、好ましくは２０％未満、またはより好ましくは１０％未満低下する）ことを示すものと理解されたい。水分補給チャネル１４２は、流路１０３、１０５、１０７、または１０９の場合とほぼ同じ内径を有し得る。
【００７４】
当業者は、本発明の一部の実施形態では、本明細書で開示される多様な特徴を組み合わせ得ることを理解するであろう。例えば、マイクロ流体デバイスは、図２ａおよびｂで示されるバルブ流路のほか、水分補給チャネルも含む場合がある。水分補給チャネルの他の構成もまた意図され、例えば、一連の個別の水分補給チャネルをマイクロ流体デバイスのエッジに沿って配置することができる。
【００７５】
本発明の一部の実施形態によるデバイスは、各々が個別の区画またはサブアレイと連結される複数の個別の注入ポートを含むように作製することができる−高密度のアレイにより、単一のデバイス上における空間の多重化を用いる多重サンプル分析が可能となる。例えば、約１，０００，０００の反応のアレイを、各々が約２５，０００個の反応チャンバーを含む４０の独立した区画に分割することができる。各々の独立したサブアレイと連結される個別の注入ポートにより、多重サンプル分析の実装が可能となる。
【００７６】
先行充填戦略を用いて、規定のアレイ領域内において、個別のアッセイを空間的に多重化させることができる。略述すると、１つまたは複数のバルブを用いて、溶液中における異なる試薬セット（例えば、異なるプライマーおよび／またはプローブのセット）をその中へとデッドエンド充填し得るアレイ区画を隔離することができる。次いで、流路を空気でフラッシュして余剰の試薬を除去し、約８０℃でデバイスをインキュベートして反応混合物から水を蒸発させ、アレイの規定の区画内に乾燥したプライマーおよびプローブを残す。このような先行充填されたデバイスを用いて、溶液中に標的核酸を含むサンプルをアレイのすべての反応チャンバーへと導入し、複数種の標的核酸について分析することができる（例えば、４０の独立した区画を有するアレイの場合、最大４０種の個別の標的核酸を分析することができる。）
図２ａ〜ｄで例示されるデバイスでは、バルブ流路により、デバイスのエッジにバルブが配置される。図２ｅ〜ｇに示す通り、マイクロ流体デバイスのバルブなしの実施形態もまた用いることができる。このような実施形態では、マイクロ流体デバイス外部のバルブにより、流路または水分補給チャネルへの、これらからの、およびこれらを介する流体の流動を制御することができる。
【００７７】
反応チャンバーに反応混合物（第１の流体）を充填するには、反応チャンバー（１１４）に、注入ポート１０４を介して注入された第１の流体（Ｆ１、図３）をデッドエンド充填する。こうして、すべての反応チャンバーが、反応チャンバーアクセスチャネルを介して流路と流体連絡される。次いで、注入ポートに第２の流体（Ｆ２）を注入する−流路を流動するＦ２によりＦ１が移動する。
【００７８】
第１の流体は、アッセイで用いる反応混合物などの水溶液であり得る。例として述べると、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイの場合、第１の流体はＰＣＲに必要なすべての試薬であるテンプレート核酸、ヌクレオチド、プライマー、適切な核酸ポリメラーゼ、緩衝液、塩を含みうる。アッセイの意図する使用に応じて、第１の流体は、色素、標識、プローブ、またはＰＣＲアッセイの産物を検出する他の試薬をさらに含みうる。第２の流体は、第１の流体とは非混和性であり、また、マイクロ流体デバイスが構築される材料と適合的でもある。第２の流体はデバイスが作製されるＰＤＭＳエラストマーと適合性のある油、例えば、フッ素化油であり得る。「適合性」とは、第２の流体がデバイスと望ましくない形で相互作用または反応しないこと、−例えば、該流体に曝露されたときに該エラストマーが該流体を吸収したり膨張したりせず、デバイスの物理的特性が変化しない（弾力性または剛性に実質的な変化がない）こと−を意味する。ＰＤＭＳを含むマイクロ流体デバイスと共に用いうる第２の流体の例は、ペルフルオロヘキサン（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標））、フッ素化シリコーン油、フッ素化油（例えば、３Ｍ社または他の供給元から市販されるＦＣ４０、ＦＣ４３、ＦＣ７０、ＦＣ−７２、ＦＣ−７７、ＦＣ−８４、ＦＣ−８７など）、およびパラフィン油などの高分子量油を含む。
【００７９】
本発明によるマイクロ流体デバイスの反応チャンバーおよび他のフィーチャの具体的な寸法および密度は、多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）法自体の限界だけにより制約されうる。最新のＭＳＬ法は、１μｍまでの小さなフィーチャの作製が日常的に可能である。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスは、デバイス全体のサイズに応じて、約５０，０００〜約１０８個もしくはその間の任意の総数、または約１００，０００〜約５×１０６個もしくはその間の任意の総数、または約２００，０００〜約２×１０６個もしくはその間の任意の総数、または約２５０，０００〜約１０６個もしくはその間の任意の総数の反応チャンバーによるアレイを含みうる。
【００８０】
反応チャンバーの密度は、単位面積当たりの量との関係で表すことができる。例えば、一部のデバイスは、平方センチメートル当たり約１０００〜約２×１０６個もしくはその間の任意の量、平方センチメートル当たり約５０００〜約１０６個もしくはその間の任意の量、または平方センチメートル当たり約１００００〜約５００，０００個もしくはその間の任意の量の反応チャンバー密度を有し得る。例えば、反応チャンバー密度は、平方センチメートル当たり約
【００８１】
【化１】
個であり得る。
【００８２】
マイクロ流体アレイ内において反応チャンバーを配置し得る密度はまた、変化させることもできる。例として述べると、約１０μｍのピッチ（ｐｉｔｃｈ）を有する５μｍ３の反応チャンバーのアレイは、平方センチメートル当たりの反応チャンバー１０６個（チャンバー当たり約１２５ｆＬ）の総密度を表す。チャンバーのピッチ（ｐｉｔｃｈ）はデバイスの意図される使用に応じて変化し、より高容量を必要とする反応（例えば、反応チャンバー内に全細胞を入れる場合、または、標的分子を簡便な方法で十分に濃縮できない場合）のために、より大きな分離が必要な場合もある。一部のマイクロ流体アレイの場合、ピッチ（ｐｉｔｃｈ）は、経験的に決定しなければならない場合がある−最適なピッチ（ｐｉｔｃｈ）の決定は、当業者の能力内にある。例として述べると、ピッチ（ｐｉｔｃｈ）は、約１〜約１０００μｍもしくはその間の任意の量、約２〜約８０μｍもしくはその間の任意の量、約５〜約６０μｍもしくはその間の任意の量、約１０〜約４０μｍもしくはその間の任意の量、または約２０〜約５０μｍもしくはその間の任意の量であり得る。例えば、ピッチ（ｐｉｔｃｈ）は、
【００８３】
【化２】
であり得る。
【００８４】
単一の粒子を小容量の液滴内に区画化することにより、この粒子、細胞、または分子の有効濃度を高めることができる。区画化の１つの方法は、油など第２の液相により少なくとも１つの側面において水溶液滴を分離するエマルジョンの使用である。本発明の一部の実施形態により規定されるマイクロチャンバー（反応チャンバー）を伴う流路を含むマイクロ流体デバイスにより、均一の空間配置により平面（２次元的なエマルジョン）の形成が可能となり、反応チャンバーを画定するのにバルブを必要とせず、したがって反応チャンバーアレイにおける反応チャンバーのピッチ（ｐｉｔｃｈ）および密度に対してそれらが賦与し得る制約が取り除かれる。この濃度の濃縮を増幅法と組み合わせることで、単一分子の数え上げ、すなわちデジタル定量化が可能となる。理論により拘束されることは望まないが、このような区画化により生物学的物質の濃度を濃縮することで、検出感度およびアッセイ感度を上昇させるための手段が得られる。粒子濃度は、アレイのウェル当たりの平均個数との関係で表すことができる。例えば、各ウェルが平均１個の粒子を有する反応チャンバーアレイにおいて、０個の粒子を含有する反応チャンバーもありえ、１個の粒子を含有する反応チャンバーもありえ、２個以上の粒子を含有する反応チャンバーもありうる。別の例として述べると、各ウェルが平均０．１個の粒子を有する反応チャンバーアレイでは、大半の反応チャンバーが０個の粒子を有することが見込まれ、約１０％の反応チャンバーが１個の粒子を有することが見込まれ、極めて少数の反応チャンバーが２個以上の粒子を有することが見込まれる。本発明の一部の実施形態において、粒子は、反応チャンバー１個当たり約
【００８５】
【化３】
またはこれらの間の任意の量の平均濃度で供給することができる。
【００８６】
粒子は、マイクロスケールシステム内で流動し得る任意の離散的な物質であり得る。例となる粒子は、ビーズ、核酸、標的核酸、タンパク質、生体細胞、生体分子などを含む。例えば、ポリマービーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、ナイロン、および他の多くのポリマーによる）、シリカまたはシリコンによるビーズ、クレイまたはクレイビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、磁性ビーズ、金属ビーズ、無機化合物ビーズ、および有機化合物ビーズを用いることができる。例えば、クロマトグラフィーに用いられることが典型的な粒子（例えば、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州、セントルイス）による１９９９年Ｓｉｇｍａ社製品カタログ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、例えば、１９２１〜２００７頁；１９９９年Ｓｕｐｐｌｅｃｏ社製品カタログ「Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、その他を参照されたい）のほか、アフィニティー精製に一般に用いられる粒子（例えば、Ｄｙｎａｌ社製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）のほか、多くの誘導体化ビーズ、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｇｒｏｕｐ社、および他の多くの販売元により市販される、例えば、各種の誘導体化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（例えば、一般に共役試薬を含む各種の磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）））など、多種多様な粒子が市販されている。
【００８７】
例えば、単一のＤＮＡ分子を含有する１マイクロリットル容量の溶液による区画化では、１０６個Ｌ−１の濃度が得られる。この溶液を、各々の容量が１ピコリットルである１，０００，０００個の液滴に区画化すると、結果として、濃度が０の液滴９９９，９９９個と、有効濃度が１０１２個Ｌ−１の液滴１個とが得られ、１，０００，０００倍の濃縮となる。別の例において、本発明のマイクロ流体デバイスを用いて、反応チャンバー（例えば、約１００ｐＬの容量）内に細胞を区画化することができる。単一の細胞の隔離により、細胞がその環境に対して大きな影響を及ぼし、検出されるのに十分な程度に濃縮された分子を分泌することが可能となる。
【００８８】
ピコリットル（ｐＬ）容量の液滴は、容量に対する表面積比が大きく、単一分子の信頼できる形での増幅は、蒸気透過性が極めて高いことが公知のＰＤＭＳで作製されたデバイスにおいては特に明瞭な現象である、熱サイクル時における試薬の蒸発により困難に遭遇する可能性がある。この蒸発は、平面に対する垂直方向において著明な勾配が生じる平面状のエマルジョンアレイにおいて顕著であり得る。この蒸発を制御するため、デバイス内に蒸気バリアを埋め込み、アレイを挟み込むことができる。これにより、アレイ平面に対して垂直な勾配における蒸気の喪失をなくすことで、ｐＬ容量の反応における標的核酸の増幅を成功させることができる。「ピコリットル容量」とは一般に、約１〜約１０００ｐＬもしくはその間の任意の量、約１〜約５００ｐＬもしくはその間の任意の量、約１〜約２００ｐＬもしくはその間の任意の量、約１〜約１００ｐＬもしくはその間の任意の量、または約１〜約５０ｐＬもしくはその間の任意の量の小容量について述べる。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスにより形成される反応混合物の容量、または本発明の方法において用いられる反応混合物の容量は、
【００８９】
【化４】
であり得る。
【００９０】
本発明の各種の実施形態により、ピコリットル未満（ｓｕｂ−ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ）の反応容量もまた実際的であり有用である。論じた通り、従来のリソグラフィー作製法は、１ｕｍまでの小さなフィーチャの達成が可能であり、これにより、フェムトリットルからピコリットルのスケールにおける容量によるチャンバーの画定が可能である。例えば、マイクロ流体アレイ内における１μｍ３のチャンバーは、容量が約１フェムトリットル（ｆＬ）であり、約５μｍ３のチャンバーは、容量が約１２５フェムトリットル（ｆＬ）である。ピコリットル未満（ｓｕｂ−ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ）の容量とは一般に、約１ｆＬ〜約１０００ｆＬもしくはその間の任意の量、約１０ｆＬ〜約５００ｆＬもしくはその間の任意の量、または約１００ｆＬ〜約５００ｆＬもしくはその間の任意の量の小容量について述べる。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスにより形成される反応混合物の容量、または本発明の方法において用いられる反応混合物の容量は、約
【００９１】
【化５】
であり得る。
【００９２】
反応チャンバーは、代替的に、液滴容量によってではなく、立方マイクロメートル単位または同等の寸法でのチャンバー容量により記載され得る。例えば、立方マイクロメートルからピコリットルへなど、必要な単位間の変換を決定することは、当業者の能力内にある。
【００９３】
反応チャンバー内における反応混合物の蒸発を制限または防止することに加え、反応条件も制御される。
【００９４】
該デバイスを温度制御反応（例えば、単回のインキュベーションまたは一連の温度循環、例えば、ＰＣＲまたは他の増幅反応もしくは伸長反応において用いられる熱サイクリングとして、ある時間にわたり１つまたは複数の温度でインキュベートする）で用いる場合、エラストマーによるデバイスを、スライドガラスまたはシリコンウェハーなどの支持体に固定することができる。デバイスは、温度および／または環境制御インキュベーター内に入れることもでき、熱サイクリング反応の場合、デバイスを任意の枚数の熱サイクリングプレート上に置くこともできる。熱サイクリング用のデバイスは公知であり、市販されている。一般に、反応チャンバーアレイを含むマイクロ流体デバイスを熱サイクリングプレート上に置き、反応の熱サイクリングを実施することができる。各種のこのような熱サイクリングプレートは、例えば、ＢｉｏＲａｄ社、Ｔｈｅｒｍｏ社、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、Ｔｅｃｈｎｅ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などの販売元から市販されている。代替的に、デバイスの基材が能動的な加熱エレメントおよび温度感知エレメントを含有することで、必要な熱サイクリング条件をもたらすことも可能である。例えば、シリコン基材内におけるヒーターおよび温度センサーの作製は、当技術分野において周知である。
【００９５】
ＰＣＲの場合、熱サイクリングは、温度および特定の温度において反応がインキュベートされる時間の正確な制御を必要とする。テンプレート核酸または標的核酸の変性、アニーリング、および伸長のための温度範囲は、実施される特定の増幅反応、用いられるプライマーの相補性、標的核酸の組成、および選択される特定のポリメラーゼに応じて異なる。他の増幅法は、複数ラウンドの熱サイクリングを必要としない場合もあるが、反応条件の熱および時間の制御からやはり利益を得る可能性がある。例えば、ローリングサイクル増幅など、各種の等温での核酸増幅戦略が公知であり、本発明により想定されている。
【００９６】
デバイスおよび反応チャンバーの熱プロファイルをモニタリングする能力もまた、有用であり得る。マイクロ流体デバイスには、センサー（例えば、熱電対、サーミスター、または焦電センサー）を組み込むことができる。温度は、赤外線カメラを用いて、または熱発色物質を用いてモニタリングすることができる。マイクロ流体デバイス内において温度プロファイルをモニタリングするこれらおよび他の方法は、米国特許第７，１１８，９１０号において説明されている。
【００９７】
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスおよび方法の適用は、多数であり、多様である。本明細書で説明されるマイクロ流体デバイスおよび方法の使用または適用を含む使用または適用および方法は、その任意の特定の適用または使用に限定されない。本発明の一部の実施形態では、以下の使用および適用が意図される。
【００９８】
（サンプル、アッセイ、およびアッセイ条件）
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスを適用し得る無数のアッセイおよび使用が存在する。このような使用についての総説、ならびに方法およびプロトコールについての参考文献および開示は、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／５０１７２号に記載されている。本明細書において選択されるアッセイは例示的な目的で例示するものであり、限定的なものであると考えるべきではない。
【００９９】
（単一細胞アッセイ）−各種の目的、例えば、細胞分類、核酸の精製および増幅、パッチクランプ法、カルシウム流の測定、ならびに全細胞電気泳動に、マイクロ流体ベースの単一細胞分析を用いることができる。加えて、マイクロ作製されたデバイス内における１個または数個の単一細胞の捕捉および画像化を用いて、多様な濃度にわたる１種または複数種の化学的刺激に対する細胞応答をモニタリングすることもできる。
【０１００】
マイクロ流体デバイスまたはこのようなデバイスを含むシステムにより、後続の刺激および分析を可能とする形式において細胞の部分集団を分類および捕捉する細胞操作能力をもたらすことができる。このようなシステムにより、集団からの単一細胞の選択、チャンバーのアドレス可能なアレイ内の任意の位置におけるこの細胞の捕捉、１種または複数種の反応条件の適用、および各反応チャンバーの画像化を可能とし得る。この機能性により、複数個の単一細胞に対する化学的な遺伝子研究のための測定器をもたらすことができる。細胞ベースのマイクロ流体アッセイの例は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／００２３１号および同第ＷＯ９８／４５４８１号において説明されている。細胞ベースのマイクロ流体アッセイは、細胞リガンド、例えば、受容体リガンド、薬剤、補因子などの結合および／または内部化のスクリーニングに有用であり得る。
【０１０１】
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体アレイ内における粒子により、任意の各種の結合化学反応のための固体表面または半固体表面を提示することができ、これにより、アレイの粒子メンバー内への対象の生物学的成分および化学的成分の組込みが可能となる。天然および合成両方の多種多様な有機ポリマーおよび無機ポリマーを、固体表面用の材料として用いることができる。例示的なポリマーは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどを含む。多種多様な固体粒子または半固体粒子の支持エレメントに対して分子を結合させるのに、多種多様な結合化学反応を用いることができる。当業者は、意図される適用に応じて、適切な化学反応を認め、これを容易に選択することができる。
【０１０２】
（タンパク質構造の研究）−本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスは、構造生物学への適用、例えば、タンパク質結晶構造解析への適用に有用であり得る。このような適用に有用な方法および技法は、例えば、ＨａｎｓｅｎおよびＱｕａｋｅ、２００３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１３巻、５３８〜５４４頁；Ｈａｎｓｅｎら、２００６年、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．、第１２８巻、３１４２〜３１４３頁；米国特許第７，２１７，３２１号において説明されている。
【０１０３】
本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスは、細胞、抗体、抗体リガンド、タンパク質、ペプチドなどを含む他の生物学的成分のスクリーニングを含む使用にも適応させることができる。このような細胞、抗体、および抗体リガンドの存在または不在はまた、望ましいものであれ望ましくないものであれ何らかの特徴と相関することも公知である。限界希釈率のサンプルをマイクロ流体デバイスに適用し、反応チャンバー内へと流入させることができ、説明した流体バリアにより該チャンバーを隔離する。適用の前に、サンプルを標識抗体（例えば、蛍光タグによる）または類似のマーカーなどのマーカーと混合することができる。隔離後、マーカーの存在についてスクリーニングすることにより、生物学的成分の存在または不在について、個々のチャンバーを吟味することができる。スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、タンパク質同定アッセイなどの例は、例えば、米国特許第６，６３２，６５５号において説明されている。
【０１０４】
（多型の配列決定、同定）−本発明の一部の実施形態によるマイクロ流体デバイスは、核酸の配列決定、特に、配列決定ライブラリーの作製に用いることができる。ポリメラーゼおよびプライマーならびに他の必要な試薬と共に、配列決定されるＤＮＡ（標的核酸）を供給し、次いで、塩基の組込みについて迅速にアッセイするため、１度に１種のＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ）に曝露する。１つまたは複数のヌクレオチド配列を決定するための各種の技法については、以下に説明されている。本発明の一部の実施形態では、本発明のマイクロ流体デバイスを、核酸の配列決定に用いることができる。本発明のデバイスは、場合によって、生物学的アッセイまたは化学的アッセイを実施するための試薬（これらは、アレイの一部の場合もあり、例えば、試薬トレーンにおいて、流動してアレイと接触する場合もある）を含む。配列決定のための反応混合物は、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ類似体、蛍光ｄＮＴＰ、または蛍光ｄＮＴＰ、無機リン酸、ＡＴＰ、熱安定性ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ホスファターゼ、挿入色素、標識プローブ、還元剤、Ｍｇ＋＋、分子密集化剤、例えば、ＰＥＧ、緩衝液、塩、ＤＴＴ、ＢＳＡ、洗浄剤、または界面活性剤、電気浸透流を阻害もしくは増強する化学物質（例えば、ポリアクリルアミド）などの一部または全部を含みうる。
【０１０５】
標的核酸の他の分析法は、以下に説明されている。
【０１０６】
標的核酸とは、対象の１つまたは複数の配列を含む核酸である。サンプルまたは反応混合物中における標的核酸の存在は検出が可能であり、アッセイのデザインに応じて、定量化も可能である。標的核酸は、生物学的サンプル（「サンプル」）から得ることができる。
【０１０７】
「多型」とは、集団内における標的核酸の１つまたは複数の形態の発生である。多型部位は、核酸配列内における公知の位置である場合もあり、本明細書で説明される方法を用いて標的核酸内において存在することが決定される場合もある。代替的に、多型は、配列の変異または配列の変異体：ＤＮＡ内で生じる場合は「ＤＮＡ配列の変異」、ＲＮＡ内で生じる場合は「ＲＮＡ配列の変異」としても説明することができる。一塩基多型、すなわちＳＮＰは、単一の塩基変化からなる多型である。
【０１０８】
組織サンプルは、例えば、掻爬、針吸引生検もしくは針（コア）生検、組織をサンプル採取するための切開生検、または対象組織の全切除を伴いうる切除生検により得ることができる。代替的に、例えば、毛髪、血液、血漿、血清、痰、尿、便、精液、羊膜液、絨毛膜絨毛、または当技術分野で公知の方法を用いる他の胎児組織もしくは胚組織など、遺伝子物質を含有する他の生体サンプルを用いることもできる。
【０１０９】
ＤＮＡおよびＲＮＡは、当技術分野で公知の任意の各種の方法により個別にまたは一体に、生物学的サンプルから単離することができる。方法の選択は、アッセイされる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、アッセイに用いられる方法などに依存し得る。生物学的サンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡを単離する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社（１９８９年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ， ＦＭら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社（１９９４年）；Ｂｏｔｗｅｌｌ， ＤＤＬ．、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７年）、第１６２巻、４６３〜４６５頁；米国特許第５，１３０，４２３号；米国特許第５，９４５，５１５号；米国特許第５，９８９，４３１号；米国特許第５，１２８，２４７号など、当技術分野において公知である。単一細胞の分析など、一部の場合では、分析前にＤＮＡまたはＲＮＡを精製する必要がないこともある。
【０１１０】
サンプル中における標的核酸の特定の配列を、当技術分野において公知である複数の方法のいずれか、例えば、タッチダウンＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆ＰＣＲ、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ネストＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などにより、増幅し得る。例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｊ．、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、第３５０巻、９１〜９２頁；Ｍａｌｅｋら、１９９４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第２８巻、２５３〜６０頁；Ｉｎｎｉｓら（編）、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、６０〜６６頁、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、１９９０年；Ｒｏｕｘ Ｋ．、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１６巻、８１２〜４頁；Ｈｅｃｋｅｒ ＫおよびＲｏｕｘ， Ｌ．、１９９６年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２０巻、４７８〜８５頁；Ｏｃｈｍａｎら、１９８８年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１２０巻、６２１〜３頁；米国特許第５，２９９，４９１号を参照されたい。これらのパラメータ、手法、および試薬、ならびに特定の反応条件に応じてこれらを最適化する方法は、当業者の能力内にある。
【０１１１】
本発明のマイクロ流体デバイスの高密度反応チャンバーアレイはまた、単一のデバイス上において、複数種の標的核酸、もしくは複数種のサンプル、またはこれらの両方の分析も可能とする。例えば、１，０００，０００の反応のアレイを、各々が２５，０００個の離散的なＰＣＲチャンバーを含む４０の独立した区画に分割することができる。独立したサブアレイと連結される個別の注入ポートを組み入れることにより、多重サンプル分析の実装が可能となる。別の例では、先行充填戦略を用いて、規定のアレイ領域内において、個別のアッセイを空間的に多重化することができる。説明した通りに、マイクロバルブを用いて、異なるプライマーおよびプローブのセットをその中へとデッドエンド充填し得るアレイ区画を隔離することができる。次いで、流路を空気でフラッシュして余剰のアッセイ混合物を除去し、先行充填したデバイスをインキュベート（例えば、約７０〜８０℃で）して先行充填したアッセイ混合物中における試薬を脱水し、規定の区画内に乾燥したプライマーおよびプローブを残す。この脱水工程の後、１種または複数種の標的核酸およびＰＣＲに必要な他の試薬（しかし、先行充填したプライマーおよびプローブではない）を含む反応混合物を、上記で説明したマイクロ流体デバイスの１つまたは複数のサブアレイ内に注入し、脱水された試薬に再度水分補給する。次いで、流路をフラッシュして反応チャンバーを隔離し、反応を熱サイクルさせる。増幅反応時またはその後において、増幅産物をモニタリングすることができる。
【０１１２】
別の例では、単一の反応において、２種以上の増幅産物を検出し、定量することができる。これは、反応混合物中に、スペクトルが異なるフルオロフォアにより標識された複数種の配列特異的な蛍光プローブを組み込むことにより達成することができる。このような形での多重化は、単一のサンプル中においてアッセイし得る標的核酸の数が増大し、基準核酸による結果の標準化を可能とすることにより、１種または複数種の標的核酸の定量的な分析において重要な役割を果たす。
【０１１３】
標的核酸またはその増幅産物の検出もまた有用である。本明細書で説明されるマイクロ流体デバイスおよび方法と共に各種の戦略を用いることができ、適切なシステムの選択はまた、反応の詳細、反応条件に対する検出システムおよび検出試薬の適格性、反応数の規模（例えば、反応チャンバーの数、密度）、ならびにアッセイ時において、または終点として、標的核酸またはその増幅産物がモニタリングされるかどうかにも依存する。検出されるシグナルは、フルオロフォア、発色団、化学発光、比色反応、放射能、酵素反応に由来する基質などに由来するシグナルを含みうる。
【０１１４】
シグナルを検出するための例示的な手法は、共焦点レーザー走査顕微鏡、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、シンチレーション検出、蛍光相関分光分析、散光、吸光（ＵＶまたは可視光）、反射などを含む。
【０１１５】
標的核酸またはその増幅産物の存在は、例えば、二本鎖核酸に特異的な色素の取り込みによるか、またはプローブに対する増幅された核酸部分のハイブリダイゼーションにより決定することができる。
【０１１６】
二本鎖核酸に結合した場合だけ蛍光発光するＤＮＡ染色色素は、増幅産物の検出に有用であり得る。このような色素の例は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、同ＩＩ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＹＯ（オキサゾールイエロー）、ＴＯ（チアゾールオレンジ）、ピコグリーン（ＰＧ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販される）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ＤＡＰＩなどを含む。ＤＮＡ染色色素の使用に関するさらなる議論は、例えば、Ｇｌａｚｅｒら、１９９７年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第８巻、９４〜１０２頁；ならびにＧｌａｚｅｒ， ＡＮおよびＲｙｅ， ＨＳ、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ、第３５９巻、８５９〜６１頁；Ｈｉｇｕｃｈｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、４１３〜４１７頁において見出すことができる。
【０１１７】
「分子ビーコン」とは、標的核酸にハイブリダイズしない場合、ヘアピン形態で存在する一本鎖オリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドの第１端は蛍光色素に結合させ、第２端は消光分子に結合させてある。ヘアピン形態にあるとき、消光分子の近接により蛍光は消光され、蛍光は観察されない。該オリゴヌクレオチド「ビーコン」が標的核酸にハイブリダイズすると、蛍光色素が消光分子から十分に分離され、蛍光が検出可能となる。色素の発光の変化をモニタリングすることにより、増幅産物の間接的なモニタリングが可能となる。当業者を導くのに十分なさらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１３３９９号；Ｔｙａｇｉ Ｓら、１９９８年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第１巻、４９〜５３頁；Ｔｙａｇｉ ＳおよびＫｒａｍｅｒ ＦＲ、１９９６年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第３巻、３０３〜８頁；ならびにＭａｒｒａｓ ＳＡら、１９９９年、Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ、第５〜６巻、１５１〜６頁において見出すことができる。
【０１１８】
蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）とは、ドナーの発光スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重複するように選択されたドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアの対の間における距離に依存する相互作用である。フルオロフォアが十分に近接すると、第１の規定波長によるドナーフルオロフォアの励起がドナーからアクセプターへと移動し、第２の規定波長における蛍光を検出することができる。核酸ハイブリダイゼーションを検出する場合、特定のプローブをドナー／アクセプター対の１つのメンバーで標識し、ヌクレオチドをドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識する。溶液中における遊離時（例えば、核酸の重合化またはハイブリダイゼーションが生じる前）、ドナー／アクセプター対は、エネルギー移動を阻止するのに十分な距離だけ離れている。重合化反応が進むにつれ、標識されたヌクレオチドは分子内に組み込まれ、標識されたプライマーに対して、エネルギー移動が生じ、蛍光が検出されるのに十分な程度近づく。標的核酸における多型を検出するのに用いうる方法の例は、例えば、米国特許第６，５００，６５０号、米国特許第５，９４５，２８３号、米国特許出願第２００４／０００５６１３号、およびＷＯ９７／２２７１９において説明されている。
【０１１９】
リアルタイム定量ＰＣＲを用いて、増幅時および／または増幅後において形成される増幅産物の量を測定することにより、サンプル中における標的核酸配列の量を決定することができる。市販されるＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）は、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを移動させて切断し、蛍光シグナルを発生させる、Ｔａｑポリメラーゼの５’側ヌクレアーゼ活性に基づく。１つのプローブが「正常な」配列に対して相補的であり、他のプローブが対象の突然変異に対して相補的な、多型部位において異なる２つのプローブを有することが必要である。これらのプローブは、５’端に結合した異なる蛍光色素と、プローブが接触しないときは、蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）によりフルオロフォアと相互作用してプローブの蛍光を消光する３’端に結合した消光物質とを有する。ＰＣＲのアニーリング工程では、ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズする。伸長工程では、５’側蛍光色素がＴａｑポリメラーゼの５’側ヌクレアーゼ活性により切断され、レポーター色素の蛍光発光が増大する。ミスマッチしたプローブは、断片化されることなく置換される。サンプル中における突然変異の存在は、２種の異なる色素のシグナル強度を測定することにより決定される。米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，４８７，９７２号もまた参照されたい。
【０１２０】
侵襲的切断法では、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドと、１ヌクレオチドの重複により標的ＤＮＡにアニールする配列特異的なプローブとを用いる。該配列特異的なプローブが多型塩基に対して相補的な場合、インベーダーオリゴヌクレオチドの３’端が、対立遺伝子特異的なプローブの５’側アームを放出するフラップエンドヌクレアーゼにより認識されて切断される構造を形成する。当業者を導くのに十分なさらなる詳細は、例えば、Ｎｅｒｉ Ｂ．ら、２０００年、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３８２６巻、１１７〜１２５頁；米国特許第６，９６４，８４８号により提供されている。
【０１２１】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブシステムの使用を含むアッセイもまた、有用であり得る。このようなプローブおよびシステムは、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年、第２８巻、３７５２〜３７６１頁；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９９／６６０７１号において説明されている。
【０１２２】
プライマー伸長反応（すなわち、ミニ配列決定、ヌクレオチド特異的な伸長、または単純なＰＣＲ増幅）もまた、標的核酸における多型を同定する配列識別反応において有用であり得る。例えば、ミニ配列決定反応では、プライマーが、ＳＮＰのすぐ上流にあるその標的核酸（通常はＤＮＡ）にアニールし、多型部位に相補的な単一のヌクレオチドにより伸長する。該ヌクレオチドが相補的でない場合、伸長は生じない。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）は、ＳＮＰ当たり２つの配列特異的プローブ、および１つの一般的ライゲーションプローブを必要とする。一般的ライゲーションプローブは、配列特異的プローブに隣接してハイブリダイズし、適切な配列特異的プローブが完全にマッチすると、リガーゼが配列特異的プローブおよび一般的プローブの両方に結合する。完全にマッチしない場合は、リガーゼが配列特異的プローブおよび一般的プローブに結合できない。プローブのアニーリングは、例えば、酵素イムノアッセイにより検出することができる（Ｖｉｌｌａｈｅｒｍｏｓａ ＭＬ．、Ｊ Ｈｕｍ Ｖｉｒｏｌ（２００１年）、第４巻、第５号、２３８〜４８頁；Ｒｏｍｐｐａｎｅｎ ＥＬ、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ（２００１年）、第６１巻、第２号、１２３〜９頁；Ｉａｎｎｏｎｅ ＭＡ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（２０００年）、第３９巻、第２号、１３１〜４０頁）。
【０１２４】
ライゲーションローリングサークル増幅（Ｌ−ＲＣＡ）もまた、Ｑｉ Ｘ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００１年）、第２９巻、第２２号、Ｅ１１６頁において説明される通り、一塩基多型の遺伝子型解析に用いられて成功している。
【０１２５】
Ｓａｎｇｅｒ配列決定（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７年、ＰＮＡＳ、第７４巻、５４６３〜５４６７頁）では、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、多様な長さの配列依存的なフラグメントを合成する。フラグメントの長さは、ジデオキシヌクレオチド塩基特異的なターミネーターの無作為的な組込みにより決定される。次いで、これらのフラグメントをゲル中において分離し、可視化し、配列決定する。上記の方法を洗練し、配列決定手順を自動化するために、多岐にわたる改善がなされている。同様に、ＲＮＡ配列決定法もまた公知であり、例えば、Ｚｉｍｍｅｒｎ Ｄ．およびＫａｅｓｂｅｒｇ Ｐ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７８年）、第７５巻、第９号、４２５７〜４２６１頁）ならびにＭｉｌｌｓ ＤＲ．およびＫｒａｍｅｒ ＦＲ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７９年）、第７６巻、第５号、２２３２〜２２３５頁）を参照されたい。直接的にＲＮＡを配列決定する化学的方法もまた公知である（Ｐｅａｔｔｉｅ ＤＡ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７９年）、第７６巻、第４号、１７６０〜１７６４頁）。他の方法は、Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒら（１９７７年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第４巻、２５２７〜２５３８頁）、Ｓｉｍｏｎｃｓｉｔｓ Ａ．ら（Ｎａｔｕｒｅ（１９７７年）、第２６９巻、第５６３１号、８３３〜８３６頁）、Ａｘｅｌｒｏｄ ＶＤ．ら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９７８年）、第５巻、第１０号、３５４９〜３５６３頁）、ならびにＫｒａｍｅｒ ＦＲ．およびＭｉｌｌｓ ＤＲ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７８年）、第７５巻、第１１号、５３３４〜５３３８頁）による方法を含む。
【０１２６】
核酸配列はまた、該単一のヌクレオチドが蛍光増強マトリックス中に含有される場合、切断されたヌクレオチドの天然の蛍光発光をレーザーで刺激することによっても読み取ることができる（米国特許第５，６７４，７４３号）。ミニ配列決定反応では、多型部位に相補的な単一のヌクレオチドを伴うＤＮＡポリメラーゼにより、ＳＮＰに隣接する標的ＤＮＡにアニールするプライマーを伸長させる。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド組込みの高精度に基づく。プライマー伸長産物の分析には、異なる技法が存在する。例えば、ミニ配列決定反応における標識もしくは未標識のヌクレオチド、ｄＮＴＰと組み合わせたｄｄＮＴＰ、またはｄｄＮＴＰだけのいずれを用いるかは、該産物を検出するために選択される方法に依存する。
【０１２７】
（テンプレート指示（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）法）−一例では、大スケールのスクリーニングについて、Ｆｒｅｅｍａｎ ＢＤ．ら（Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（２００２年）、第４巻、第４号、２０９〜２１５頁）により、蛍光偏光検出を伴うテンプレート指示による色素−ターミネーター組込み（ＴＤＩ−ＦＰ）法が説明されている。一塩基多型の遺伝子型解析には、５’ヌクレアーゼアッセイもまた用いることができる（Ａｙｄｉｎ Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００１年）、第４巻、９２０〜２、９２４、９２６〜８頁）。ＷＯ０１８１６３１において説明される通り、ＳＮＰの識別を決定するには、ポリメラーゼ校正法もまた用いることができる。酵素増幅電子変換による単一塩基対におけるＤＮＡ突然変異の検出は、Ｐａｔｏｌｓｋｙ Ｆら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１年）、第１９巻、第３号、２５３〜２５７頁において説明されている。
【０１２８】
配列特異的ＰＣＲ法もまた、一塩基多型の遺伝子型解析に用いられて成功している（Ｈａｗｋｉｎｓ ＪＲ．ら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ（２００２年）、第１９巻、第５号、５４３〜５５３頁）。代替的には、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）アッセイまたは切断フラグメント長多型（ＣＦＬＰ）アッセイを用いて、本明細書で説明される多型を検出することもできる。
【０１２９】
（マイクロ流体デバイスの適用）
説明したピコリットルまたはフェムトリットルの反応チャンバーのアレイを含むマイクロ流体デバイスは、生物学的なアッセイおよび診断に有用である。例えば、数十万〜百万の反応を用いる核酸のデジタル定量化により、１）極めて少数の対立遺伝子不均衡に対する高度の統計学的検定力による識別、２）長いゲノム距離にわたる単一分子上における標的配列の共局在化、および３）高度に相同的な遺伝子バックグラウンド内におけるまれな事象の検出における固有の能力がもたらされる。
【０１３０】
デジタルＰＣＲアッセイのダイナミックレンジは、予測される陽性反応数がテンプレート濃度と共に直線的に増加する濃度範囲として説明することができる。理論により拘束されることは望まないが、各チャンバーの平均専有数が１に近づく結果として飽和がもたらされるまで直線的な応答が観察されるよう、アレイ全体における分子の分布は無作為である。したがって、デジタルアレイのダイナミックレンジは、チャンバー総数と共に増大する。ピコリットル容量での区画化により、配列相同性の高い大きなバックグラウンド内においてまれな配列を検出するのに用いうる、濃度の有効な濃縮がもたらされる。この点を説明するため、１００万コピー当たり１コピーの相対濃度にある野生型のバックグラウンド中の１０コピーの一塩基多型（ＳＮＰ）（１０００万コピーの野生型のバックグラウンド中の１０コピーのＳＮＰ）を検出する作業を考えてみよう。このような状況では、野生型配列に対するごく微量の非特異的増幅によっても、結果として偽陽性がもたらされる可能性があり、いずれのＰＣＲ法による検出も極めて困難であるかまたは不可能となっている。しかし、このサンプルを１，０００，０００個のチャンバーに分割すると、反応チャンバー１個当たり平均１０コピーの野生型配列が結果としてもたらされる。これらの反応チャンバーの大半は標的配列を有さないが、ちょうど１０個の反応チャンバーは、（高い確率で）ＳＮＰの単一コピーを含有する。このような状況では、バックグラウンドを１００万分の１に低下させることができ、１０個の分子中１個だけの分子の識別が可能なアッセイであればＳＮＰの検出を達成することができる。図４は、配列相同性が高い１００万個の分子によるバックグラウンド中において単一の分子を検出するのに必要とされる特異的反応および非特異的反応に必要な相対的効率の容量依存性を示す。例えば、３０サイクルのＰＣＲ反応により、非特異的な単位複製配列に対する特異的な単位複製配列の比として定義されるノイズ対シグナル比として１０が必要であるとすると、１μＬのリアクター内において必要とされる相対反応効率は約６倍である。比較として述べると、この同じサンプルを、容量が１０ｐＬのリアクター１００，０００個に分割する場合、必要とされる反応効率比は１．４となる。
【０１３１】
反応容量を２〜３（ａ ｆｅｗ）ピコリットルまで減少させ、サンプル中における核酸を反応当たり１コピー未満の平均で存在するように分散させることにより、高い有効濃度がもたらされる。これはまた、そうしなければバックグラウンドを増大させる非特異的増幅および競合反応を低下させる利点も有する。
【０１３２】
デジタルＰＣＲにより、同じＤＮＡ分子上において２つの標的配列を結果として存在させる遺伝子再配列の頻度を測定する光学的多重ＰＣＲを用いることが可能となる。多数の区画内に投入すると、分子は、おのずと無作為的かつ独立に分布する。サンプルが２つの標的配列を保有するまれな分子のサブセットを含有する場合、反応チャンバー内における増幅の共局在が偶然により予測されるよりも高頻度となり、これにより、この分子種の存在が示される。アレイ数が極めて多い場合、この解析の統計学的検定力は総チャンバー数と共に向上するので、正確な融合部位に依存しない両方の標的配列を有する少数の分子種を検出することが可能となる。この能力により、遺伝子融合、遺伝子転移、選択的スプライシング、および逆位を含む、各種のまれな遺伝子再配列の検出が可能となるであろう。例えば、このような手法は、単一の２色法多重アッセイを用いて、十分に特徴づけされたＢＣＲ／ＡＢＬ融合癌遺伝子の変異体を検出するのに用いることができる。２２ｑ１１上のＢＣＲの９ｑ３４上のＡＢＬとの融合体は、成人における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）症例の９５％および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）症例の約２５％ならびに小児におけるＡＬＬ症例の約２〜５％において存在する、周知の染色体異常である（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、２０００年、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、第１４巻、１８５０頁）。ＲＴ−ｑＰＣＲによる一般的な融合体転写物の検出は、診断および予後診断のゴールドスタンダードとして日常的に用いられている。しかし、内部のエキソンを架橋するには法外に長い単位複製配列を必要とするため、潜在的な切断点が多数であると、すべての転写物変異体を検出するプライマーの設計が困難となり、単一セットのプライマーを用いることができなくなる。融合の大半では、エキソンＥ１（ＢＣＲ）およびＡ１１（ＡＢＬ）が融合部位を挟む。個別の２色（ＦＡＭおよびＣａｌ Ｏｒａｎｇｅ）で報告するＦＲＥＴプローブを用いてエキソンＥ１およびＡ１１を独立に検出するのに２つのプライマーセットが用いられた多重アッセイは、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合を含む細胞（例えば、慢性骨髄性白血病初代細胞、または同様の融合を有する細胞系）のｃＤＮＡクローンの段階希釈液でスパイクしたゲノムＤＮＡサンプル中における共局在化の頻度について調べ、共局在化の統計学的に有意な濃縮をもたらす融合の最小限の画分を決定するのに用いることができる。
【０１３３】
配列内における多型位置の数値表示が特定の配列に関するものであることは、当業者により理解されるであろう。また、配列が番号付けされ配列が選択される方式に応じて、同じ位置に異なる数値表示が割り当てられる可能性もある。さらに、挿入または欠失などの配列変異により、突然変異部位におけるかまたは同部位の付近における特定のヌクレオチドの相対的な位置が変化し、次いで、同ヌクレオチドの数値表示が変化する可能性がある。
【０１３４】
（表１：配列）
【０１３５】
【表１】
（実験法）
チップの作製：標準的な多層ソフトリソグラフィーを用いて、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）によるマイクロ流体デバイスを作製した。２０，０００ｄｐｉの透明マスク（ＣＡＤ／Ａｒｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社製）を用いることによるフォトレジストのパターン形成には、標準的なリソグラフィーを用いる。ＭｅｇａＰｉｘｅｌテンプレート（アルバータ大学Ｎａｎｏｆａｂ製）を作製するために、色マスクを作製した。ソフトリソグラフィーを用いてネガティブ型のテンプレートを作製した。２５マイクロメートルのチャネル厚をもたらす制御層にＳＵ８−２０２５を用いる一方、立方体の反応チャンバーを創出するにはＳＵ８−１００を用いた。ＳＵ８−５で作製した高さ１０ｕｍのチャネルにより反応チャンバーを連絡した。ＳＰＲ−２２０をスピンコート（ｓｐｉｎ）して１０ｕｍの厚さを達成し、これを用いてバルブが交差する流動ライン区画を創出する（Ｕｎｇｅｒ Ｍ．Ａ．ら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８８巻、１１３頁）。
【０１３６】
略述すると、テンプレート上にエラストマー層（５：１ ＧＥ ＲＴＶ）をスピンコート（ｓｐｉｎ）（２５０ｒｐｍ×１分間）し、部分的に硬化させる。反応チャンバー領域上に蒸気バリア（ＩＰＡで洗浄した透明なもの）を配置し、約７ｍｍのエラストマー層（５：１ ＧＥ ＲＴＶ）で覆い、脱気し、８０℃で９０分間にわたりベーキングしてエラストマーを硬化させ、１時間にわたり冷却した。硬化した反応チャンバー層をテンプレートから剥離させ、エラストマー制御層にかみ合わせた（支持マトリックス上に２０：１ ＧＥ ＲＴＶをあらかじめスピンコート（ｓｐｉｎ）−５００ＲＰＭ×３０秒間＋１８７５ＲＰＭ×９０秒間−した後で、８０℃で４５分間にわたりベーキングした）。８０℃で１時間にわたり２相をベーキングして結合させ、冷却し、支持マトリックスから剥離させた。デバイスにポートを穿孔し、基底層（２０：１ ＧＥ ＲＴＶ、説明した通りにスピンコート（ｓｐｉｎ））にデバイスを取り付けた。８０℃で一晩にわたり最終アセンブリーをベーキングして、エラストマーを硬化させた。
【０１３７】
上記デバイスは、シリコンウェハーに結合した２層のＰＤＭＳから構成され、プッシュアップ形状を有する。まず、８２０ＲＰＭでＰＤＭＳ（５：１ ＲＴＶ Ａ：Ｂ）層をスピンコート（ｓｐｉｎ）することにより、流動層を得た。次いで、水蒸気制御用のポリエチレンによる透明スライドを関連するフィーチャ上に配置し、約４０ｇのＰＤＭＳをシリコンウェハー全体の上に流し込み、これを後に１時間にわたりベーキングした。制御層の場合は、ウェハーをＰＤＭＳ（１０：１ ＲＴＶ Ａ：Ｂ）でコーティングし、１８００ＲＰＭでスピンコート（ｓｐｉｎ）し、次いで、４５分間にわたりベーキングした。次いで、制御層および流動層をかみ合わせて、共にベーキングした。
【０１３８】
（チップ操作）：まず、分析するサンプルを反応に必要とされるすべての試薬（プライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２）と混合し、次いで、リソグラフィーにより規定されたチャンバーの大規模アレイをフィーチャするマイクロ流体チャネル構造に注入する。まず、ＰＣＲ反応チャンバーにＰＣＲ反応混合物を加圧充填する。次いで、主流路に油を加圧充填する。
【０１３９】
チャンバーの形状により、高表面張力が確保され、流体を注入するには、高圧を加える（約１０ＰＳＩ）必要がある。チャンバーを水性流体で満たした後では、流動ラインを加圧する結果、チャンバー自体においてではなく、連絡チャネルだけにおいて溶液が油により置換されるので、該形状が後の区画化の一助となる。
【０１４０】
（ＰＣＲアッセイおよび分析）：別段に注記しない限り、本発明のマイクロ流体デバイスを用いて実施されるすべてのＰＣＲ反応は、ＦＡＭプローブに対して５００ｎＭのプローブ濃度、Ｃａｌ Ｏｒａｎｇｅプローブに対して２５０ｎＭのプローブ濃度で、製造元の指示書に従い、ＡＢＩ ＴＡＱ ＦＡＳＴマスターミックスにより実行した。反応混合物には、界面活性剤（０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）を添加した。各プライマーは、７５０ｎＭの濃度であった。熱サイクリングのプロトコールは、２０秒間の加熱開始、ならびに１秒間にわたる９５度および３０秒間にわたる６０度の４０サイクルを含んだ。熱サイクリングおよび画像化は、ＢｉｏＭａｒｋ（商標）システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）を用いて実施した。終点の測定値を得、Ｍａｔｌａｂを用いて画像を解析した。テンプレート（標的ＤＮＡ）は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社により合成され、ＰＡＧＥ精製された、配列番号１によるヒトＢＣＬ２遺伝子の一部を含んだ。このテンプレートは既に、リアルタイムＰＣＲにより、１００％のＰＣＲ効率を示していた。用いられたプライマーは、ＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴ（配列番号２）およびＴＧＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＣＧＡＡＧＴＣＧ（配列番号３）であり、プローブはＦＡＭ−ＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＣＴ−ＢＨＱ（配列番号４）であり、すべてＩＤＴ社により合成された。
【０１４１】
デバイス間のばらつきをモニタリングするため、以下の通りに、異なる色のアッセイにおいてコントロールを用いた。ヒトＡＢＬ１１遺伝子に由来するテンプレート（配列番号５）は、ＩＤＴ社により合成され、ＰＡＧＥ精製された。以下のプライマー：ＡＴＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＡＧＴＧ（配列番号６）およびＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＴＡＣＴＧＴＧ（配列番号７）がＩＤＴ社により合成された。Ｃａｌ Ｏｒａｎｇｅによる以下のプローブ：ＡＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣ（配列番号８）は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により合成された。
【０１４２】
（トリソミー２１の差別化）：以下のプライマーおよびプローブ：Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のＡＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号９）、ＴＧＣＣＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号１０）、およびＬＮＡプローブ１（ＧＣＴＣＣＡＧＧ）（配列番号１１）により、第２１番染色体上のＡＩＲＥ遺伝子上の領域を標的とした。
【０１４３】
第９番染色体上のＡＢＬ遺伝子を、以下のプライマーおよびプローブ：ＡＴＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＡＧＴＧ（配列番号１２）、ＡＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＴ（配列番号１３）（ＩＤＴ社により合成される）、およびＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＣａｌＯｒａｎｇｅ−ＡＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣ−ＢＨＱ１（配列番号１４）により、標的とした。ブリティッシュコロンビア州、バンクーバー、小児家族研究所から入手した６％の純粋なトリソミー２１ ＤＮＡによりゲノムＤＮＡをスパイクした。約２０％の曲線因子（Ｆｉｌｌ ｆａｃｔｏｒ）を得るように、デジタルＰＣＲ反応において用いられる最終ＤＮＡサンプルをセットした。この適用には、９０，０００個のチャンバーを有するデバイスを用いた。
【０１４４】
（ＪＡＫ２アッセイ）
Ｊａｋ２の野生型および変異体のプラスミドは、ヘテロ接合患者に由来する単位複製配列から作製した。略述すると、プライマーＪａｋ２ｆｗｄ：ＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧ（配列番号２１）およびＪａｋ２ｒｅｖ：ＡＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡＴ（配列番号２２）を用いて、４５３ｂｐの標的を増幅した。増幅の条件は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡで開始し、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２濃度で、５０℃のアニーリング温度であった。７％のポリアクリルアミドゲル上でＰＣＲ産物を泳動させ、適正なサイズのフラグメントを確認した。製造元の指示書に従い、ＴＯＰＯ ＴＡサブクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてサブクローニングを達成した。略述すると、１ｕｌのＰＣＲ産物を１ｕｌの緩衝液および１ｕｌの直鎖化され活性化されたベクターおよび３ｕｌのｄＨ２Ｏと混合し、５分間にわたり室温でインキュベートし、次いで、氷上に置いた。４μｌのクローニング反応物を、キットと共に供給された１アリコートのコンピテント細胞と混合し、５分間にわたり氷上でインキュベートした。５０μｌのトランスフェクション反応物をＬＢアンピシリンプレート上に播種し、３７℃で一晩にわたり増殖させた。１０個の単一コロニーを採取してＬＢアンピシリン培地に入れ、一晩にわたり増殖させ、次いで、ＤＮＡを単離した。
【０１４５】
プラスミドＤＮＡを、Ｑｕｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉプラスミド精製キットを用いて単離した。１０個の単一コロニーに由来するＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎベースの対立遺伝子識別アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）中で個別に調べた。進行中の試験のために、Ｊａｋ２野生型（プラスミドＡ）およびＪａｋ２変異体（プラスミドＢ）１つずつをさらに単離した。
【０１４６】
上記プラスミドを、野生型（ｗｔまたはＷＴ）のバックグラウンドを一定とし、変異体（ｍｔまたはＭＴ）量を増加させる（１：１ｗｔ：ｍｔ〜１：１０００）形で、テンプレートとして用いた。反応では、以下の配列：
【０１４７】
【化６】
を有する最終濃度７５０ｎＭのプライマーおよびプローブを用いた。
【０１４８】
野生型の濃度は、チャンバー当たりプラスミド約０．５個であった。本適用では、９０，０００個のチャンバーおよび５本の流入ラインを有するデバイスを用いた。４０サイクルのＰＣＲを適用し、Ｍａｔｌａｂプログラムを用いることにより陽性チャンバー数をカウントした。
【実施例】
【０１４９】
（実施例１）
（大型スケールのマイクロ流体エマルジョンアレイ内における標的核酸の増幅）
蒸気バリアによる選択的な被覆を組み込むデバイスを用いて、ＰＣＲ実験時における蒸発作用を裏付けた。同じチップ上において異なるサンプルを調べるために、図２ｄに示すチャンバー形状を有し、チャンバー密度が１個／１６００ｕｍ２のマイクロ流体デバイスを、５枚の個別のチャンバーアレイにより設計した。デバイス内にＰＣＲ溶液を導入し、図３で概括した通りに区画化した。ＴａｑＭａｎマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と共に、ＧＡＰＤＨ用の標準的なＴａｑＭａｎアッセイを用いて、反応チャンバー１個当たり約１０コピーのテンプレートＤＮＡ濃度による反応の進行をモニタリングした。４０サイクルを超えて反応を進行させ、その終点画像を図５に示す。
【０１５０】
図５の顕微鏡写真は、１つの実験結果を示す。蒸気バリアにより被覆されたポジティブコントロールを伴う反応チャンバー（ポジティブコントロール領域ＡおよびＤ）が標的核酸の増幅に成功したのに対し、領域外において蒸気バリアにより被覆されたポジティブコントロールを伴う反応チャンバー（ポジティブコントロール領域Ｅの一部）は、増幅が不成功であった。
【０１５１】
マイクロ流体デバイス内に蒸気バリアを組み込むことにより、本発明者らは、約３０ピコリットルの容量を有する最大９０，０００個の反応チャンバーによるアレイにおける単一分子の信頼できる形での増幅を裏付けた。
【０１５２】
（実施例２）
（標的ＤＮＡの単一コピー増幅）
各反応チャンバーが１個だけのＤＮＡ分子を含有するかまたはＤＮＡ分子を全く含有しないように、初期ＤＮＡ（標的核酸）を希釈することにより、サンプル中に存在するＤＮＡ初期量を定量的に同定することができた。光学シグナルを有する各チャンバーがＰＣＲ増幅前における標的核酸の存在を示すように、標的核酸のコピーを有する反応チャンバーだけが検出用の蛍光シグナルをもたらす。
【０１５３】
説明した通り、希釈されたＤＮＡを含有するＰＣＲ溶液の加圧レザバーに流体ラインを連絡させることにより、マイクロ流体チップに充填した。すべてのチャンバーの充填後、主流動ライン内にＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）油を加圧充填し、これにより、チャンバー内以外のすべての場所の流体を移動させ、チップの熱サイクル準備を整える。ＰＣＲ反応が進むのに応じて、各サイクルにおけるチップ画像を収集した。これにより、各サイクルを経て増加するＤＮＡ産物を見る（蛍光シグナルにより）ことができる。これを図６に示す。反応チャンバーは、１辺３０マイクロメートルであった。サイクル数が進むのに応じて、ネガティブコントロールの反応チャンバーに由来するシグナルがバックグラウンドにとどまる一方、ポジティブコントロールに由来するシグナルは指数関数的に増大した。
【０１５４】
本発明者らは、１００万個の反応チャンバーを有するチップ上においてデジタルＰＣＲを実行することにより、大幅なダイナミックレンジの増大のために、ＤＮＡ分子を極めて正確にカウントし得ることを示した。特に、この種の分析は、公知のコントロールに対するまれな遺伝子発現産物をカウントする場合に不可欠である。複数の異なるプローブを用いる可能性のために、複数の遺伝子にわたる発現プロファイルを定量的に同定することが可能となる。
【０１５５】
（実施例３）
（微小な対立遺伝子不均衡の識別：胎児トリソミー２１の非侵襲的検出）
本明細書で説明したマイクロ流体アレイを用いるデジタルＰＣＲ法を用いて、染色体数の微小な不均衡を検出した。サンプル中におけるＣ２１の１．５％の増加を決定するためには、５シグマの確実性で約９００，０００のＰＣＲ反応が必要とされた：
【０１５６】
【化７】
ｍは、ゲノム等価性（１ゲノムセット＝各染色体２本ずつ）数である。サンプルノイズであるシグマは、第２１番染色体数の平方根である。論じた通り、従来のＰＣＲ法を用いる場合、この反応数は法外に大きく、事実上不可能である。１０６個の反応チャンバーを含むマイクロ流体アレイの使用により、この反応数が、可能で有効なスケールに凝縮される。
【０１５７】
第２１番染色体（Ｃ２１）および第９番染色体（Ｃ９）のコピー数は、それぞれ、第２１番染色体および第９番染色体上の単一のコピーに存在することが公知であるＡＩＲＥ遺伝子およびＡＢＬ遺伝子のデジタル検出を用いて決定された。６％のトリソミー２１ ＤＮＡでスパイクしたサンプルに対する、デジタルチャンバー９０，０００個にわたる測定値を、正常なゲノムサンプル中で得られるカウントにより標準化したところ、ＡＩＲＥ遺伝子について予測される３％の濃縮が示された（図７）。これらの測定値は、現在報告される任意のＰＣＲ法で最高の識別力を表し、１％未満の配列の違いの検出までそのままの形で拡張することができる。興味深いことに、正常なゲノムＤＮＡにおけるＡＩＲＥおよびＡＢＬの測定値は、陽性反応チャンバーの絶対数で一致する違いを示した。
【０１５８】
（実施例４）
（大きな相同のバックグラウンドにおけるまれな配列の検出：ＪＡＫ２アッセイ）
概念実証として、Ｊａｋ２遺伝子中においてＳＮＰ突然変異（Ｖ６１７Ｆ）を含有するプラスミドサンプルを分析した。Ｖ６１７Ｆ突然変異は、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症、および複数種の白血病など、複数種の骨髄増殖性障害に特異的である。共通のプライマーを用いる一方で、ＳＮＰ領域に特異的なプローブにより、野生型Ｊａｋ２遺伝子またはＶ６１７Ｆ変異体を含有するプラスミドを調べた。Ｖ６１７Ｆ変異体にはＶＩＣによるプローブを用いる一方で、ＦＡＭによるプローブを用いてＳＮＰを調べた。一定の野生型バックグラウンドにわたり異なる量の変異体を含有するサンプルを調べたところ、該アッセイにより、文献（Ｂｏｓｄｑｕｅｔら、２００６年、Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ、第３７巻、１４５８頁）により報告される５：１００の最小値と比較して小さな１：１０００の対野生型変異体比を検出することができた。これらの結果を図８Ａ、Ｂに示す。
【０１５９】
ピコリットル容量での区画化により、配列相同性の高い大きなバックグラウンド内においてまれな配列を検出するのに用いうる、濃度の有効な濃縮がもたらされる。１０００コピー当たり１コピーの相対濃度にある野生型のバックグラウンド（１０００コピーの野生型によるバックグラウンド中に１コピーのＳＮＰ）中における数コピーの一塩基多型（ＳＮＰ）の非デジタル法による検出は容易でない。このような状況では、野生型配列に対するごく微量の非特異的増幅によっても、結果として偽陽性がもたらされ、いずれのＰＣＲ法による検出も極めて困難であるかまたは不可能となっている。しかし、このサンプルを１００，０００個のチャンバーに分割したところ、反応チャンバー１個当たり平均１００コピーの野生型配列が結果としてもたらされた。これらの反応チャンバーの大半は標的配列を有さなかったが、１００個の反応チャンバーは、（高い確率で）ＳＮＰを含む標的核酸の単一コピーを含有した。このような状況では、バックグラウンドがこのように４桁分低下し、ＳＮＰの検出は、１０個の分子中において１個の分子だけの識別が可能なアッセイにより達成することができる。
【０１６０】
（実施例５）
（マイクロ流体アレイの配列決定ライブラリーへの適用）
伸長による配列決定またはライゲーションによる配列決定に依拠する自動配列決定装置または自動配列決定システムと共に用いられる配列決定ライブラリーを作製することができる。これらの配列決定法において重要な工程は、配列決定前における単一分子の増幅の局在化である。この工程では、配列決定される単一のＤＮＡテンプレート分子をそれらの隣接分子から単離して、ポリメラーゼ連鎖反応またはローリングサイクル増幅を用いる増幅にかける。例として述べると、本発明によるマイクロ流体デバイスには、チャンバー当たり数個のビーズを与えるように選択される濃度で、ミクロンスケールのビーズを充填することができる。約１０，０００，０００個の反応チャンバーを含むデバイスには、標的核酸を含むＰＣＲ反応混合物中約０．１個〜約０．５個の濃度にあるビーズ懸濁液を充填することができる。十分な量のビーズを供給して、チャンバー当たりの平均ビーズ数を約５個とする。ポアソン統計に基づくなら、この充填の結果、各々がその中にサンプルを有し、これらの約９５％が単一のテンプレートを有し、これらのほとんどすべてが少なくとも１個（平均５個）のビーズを有する約１，０００，０００個のチャンバーがもたらされる。増幅後、チャンバーからビーズを除去することができる。チャンバーからビーズを除去する方法の例は、洗浄工程または支持体（例えば、ガラス）からのマイクロ流体デバイスの剥離を含む。ビーズを回収して配列決定することができる。この結果、そのうちの約９５％が唯一の配列に結合し、分子約１，０００，０００個の総サンプルサイズを表す、ビーズ約５，０００，０００個のライブラリーがもたらされる。これらのライブラリーのサイズは、より多くのチャンバーを有するデバイスの作製によってさらに増大させることもでき、複数のデバイスの使用によってさらに増大させることもできる。
【０１６１】
すべての引用物は、参考として本明細書に援用される。
【０１６２】
本明細書で好ましい１つまたは複数の実施形態を、例として説明してきた。特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、各種の変更および改変を行いうることは、当業者に明らかであろう。
【０１６３】
本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
エラストマー基材において形成された流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、
該複数の反応チャンバーと同一平面で適用されており、エラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアと
を含むマイクロ流体デバイス。
・（項目２）
前記流路に沿って配置された複数のバルブをさらに含む、項目１に記載のデバイスであって、該複数のバルブの各々は、該流路と交わる１つまたは複数の制御チャネルを含む、デバイス。
・（項目３）
前記バルブが前記流路の第１の端部および第２の端部に配置されている、項目２に記載のデバイス。
・（項目４）
前記反応チャンバーが、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である、項目１に記載のデバイス。
・（項目５）
前記反応チャンバーが、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである、項目１に記載のデバイス。
・（項目６）
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、項目５に記載のデバイス。
・（項目７）
前記反応チャンバーが、５０００個／ｃｍ２またはそれよりも大きい密度で存在する、項目１に記載のデバイス。
・（項目８）
マイクロ流体デバイス内において流体を区画化する方法であって、
第１の流体を有する流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、
該第１の流体とは非混和性の第２の流体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の流体を移動させる工程と
を含み、
該複数の反応チャンバーの各々における第１の流体が、該流路内における該第２の流体により他の反応チャンバーの各々における第１の流体から隔離される、方法。
・（項目９）
サンプルが、ＰＣＲ用の１種または複数種の試薬をさらに含む、項目８に記載の方法。
・（項目１０）
前記反応チャンバーが、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である、項目８に記載の方法。
・（項目１１）
前記第１の流体が水溶液である、項目８に記載の方法。
・（項目１２）
前記第２の流体が非水性流体である、項目８に記載の方法。
・（項目１３）
前記第１の流体が、ＰＣＲ用の反応混合物を含む、項目８に記載の方法。
・（項目１４）
前記第１の流体がサンプルを含む、項目８に記載の方法。
・（項目１５）
前記反応チャンバーが、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである、項目８に記載の方法。
・（項目１６）
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、項目８に記載の方法。
・（項目１７）
標的核酸のデジタル定量法であって、
マイクロ流体アレイの流路と流体連絡した複数の反応チャンバーに、標的核酸を含む第１の流体を充填する工程と、
該第１の流体とは非混和性の第２の流体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の流体を移動させる工程であって、該複数の反応チャンバーの各々における第１の流体が、該流路内における第２の流体により他の反応チャンバーの各々における該第１の流体から隔離される工程と、
該マイクロ流体アレイをインキュベートする工程と
を含む方法。
・（項目１８）
前記反応チャンバーが、ピコリットル容量またはフェムトリットル容量である、項目１７に記載の方法。
・（項目１９）
前記第１の流体が水溶液である、項目１７に記載の方法。
・（項目２０）
前記第２の流体が非水性流体である、項目１７に記載の方法。
・（項目２１）
前記第１の流体が、ＰＣＲ用の反応混合物を含む、項目１７に記載の方法。
・（項目２２）
前記第１の流体がサンプルを含む、項目１７に記載の方法。
・（項目２３）
前記反応チャンバーが、出口のない（ｂｌｉｎｄ）反応チャンバーである、項目１７に記載の方法。
・（項目２４）
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、項目１７に記載の方法。
・（項目２５）
前記標的核酸が、前記第１の流体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約１個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、項目１７に記載の方法。
・（項目２６）
前記標的核酸が、前記第１の流体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約０．５個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、項目１７に記載の方法。
・（項目２７）
前記インキュベートする工程が熱サイクリングを含む、項目１７に記載の方法。
・（項目２８）
エラストマー基材において形成された流路と流体連絡した複数の反応チャンバーと、
２つ以上の反応チャンバー間の流体連絡を阻止する流体バリアと
を含むマイクロ流体デバイス。
・（項目２９）
前記複数の反応チャンバーと同一平面で適用されており、エラストマー層により前記反応チャンバーから分離された蒸気バリアをさらに含む、項目２８に記載のデバイス。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図２ｇ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラストマー基材において形成されている流路とマイクロ流体的にバルブなしで流体連絡した、同一平面アレイにある複数の出口のない反応チャンバーと、
該複数の反応チャンバーと平行な平面において適用されかつエラストマー層により該反応チャンバーから分離された、蒸気バリアと
を含むマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記流路に沿って配置された複数のバルブをさらに含む、請求項１に記載のデバイスであって、該複数のバルブの各々は該流路と交わる１つまたは複数の制御チャネルを含む、デバイス。
【請求項３】
前記バルブが前記流路の第１の端部および第２の端部に配置されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記反応チャンバーが、１ナノリットル容量未満である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記反応チャンバーが、約１０ｐＬ容量〜約１００ｐＬ容量である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
同一平面アレイにある前記出口のない反応チャンバーが、約２００μｍ未満のピッチを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記エラストマー層が、約１０μｍ〜約１０００μｍの厚さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記反応チャンバーが、５０００個／ｃｍ２またはそれよりも大きい密度で存在する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
マイクロ流体デバイスにおいて液体を区画化する方法であって、
流路と、流路と同一平面アレイにありかつ該流路と流体連絡した複数の出口のない反応チャンバーとに、圧力下で第１の液体を充填し、該出口のない反応チャンバーにある空気を、液体に対しては透過性でないが気体に対しては透過性である該反応チャンバーの壁を介して移動させる工程と、
該第１の液体とは非混和性の第２の液体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の液体を移動させる工程と
を含み、
該複数の反応チャンバーの各々における第１の液体が、該流路における該第２の液体により他の反応チャンバーの各々における該第１の液体から隔離される方法。
【請求項１１】
サンプルが、ＰＣＲ用の１種または複数種の試薬をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応チャンバーが、１ナノリットル容量未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応チャンバーが、約１０ｐＬ〜約１００ｐＬの容量である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の液体が水溶液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の液体が非水性液体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の液体が、ＰＣＲ用の反応混合物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の液体がサンプルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロ流体デバイスが、前記複数の反応チャンバーと平行な平面にありかつエラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸のデジタル定量法であって、
流路と、マイクロ流体アレイの流路と同一平面アレイにありかつ流体連絡した複数の出口のない反応チャンバーとに、圧力下で、標的核酸を含む第１の液体を充填し、該出口のない反応チャンバーにある空気を、液体に対しては透過性でないが気体に対しては透過性である該反応チャンバーの壁を介して移動させる工程と、
該第１の液体とは非混和性の第２の液体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の液体を移動させる工程であって、該複数の反応チャンバーの各々における第１の液体が、該流路における該第２の液体により他の反応チャンバーの各々における該第１の液体から隔離される工程と、
該マイクロ流体アレイをインキュベートする工程と
を含む方法。
【請求項２１】
前記反応チャンバーが、１ナノリットル容量未満である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記反応チャンバーが、約１０ｐＬ〜約１００ｐＬの容量である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の液体が水溶液である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の液体が非水性液体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の液体が、ＰＣＲ用の反応混合物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の液体がサンプルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約３個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的核酸が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約１個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的核酸が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約０．５個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的核酸が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約０．１個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記インキュベートする工程が熱サイクリングを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の液体が、少なくとも２種の標的核酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも２種の標的核酸の各々が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約３個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記インキュベートする工程が、光学的に多重化されたアッセイを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
エラストマー基材において形成されている流路と連絡された、同一平面アレイにある複数の出口のない反応チャンバーと、
２つ以上の反応チャンバー間の流体連絡を阻止する流体バリアと、
を含むマイクロ流体デバイスであって、
該複数の出口のない反応チャンバーの各々は、壁により境界付けられた、デバイス。
【請求項３７】
前記複数の反応チャンバーと平行な平面で適用されておりかつエラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアをさらに含む、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項１】
エラストマー基材において形成されている流路とマイクロ流体的にバルブなしで流体連絡した、同一平面アレイにある複数の出口のない反応チャンバーと、
該複数の反応チャンバーと平行な平面において適用されかつエラストマー層により該反応チャンバーから分離された、蒸気バリアと
を含むマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記流路に沿って配置された複数のバルブをさらに含む、請求項１に記載のデバイスであって、該複数のバルブの各々は該流路と交わる１つまたは複数の制御チャネルを含む、デバイス。
【請求項３】
前記バルブが前記流路の第１の端部および第２の端部に配置されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記反応チャンバーが、１ナノリットル容量未満である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記反応チャンバーが、約１０ｐＬ容量〜約１００ｐＬ容量である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
同一平面アレイにある前記出口のない反応チャンバーが、約２００μｍ未満のピッチを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記エラストマー層が、約１０μｍ〜約１０００μｍの厚さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記反応チャンバーが、５０００個／ｃｍ２またはそれよりも大きい密度で存在する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
マイクロ流体デバイスにおいて液体を区画化する方法であって、
流路と、流路と同一平面アレイにありかつ該流路と流体連絡した複数の出口のない反応チャンバーとに、圧力下で第１の液体を充填し、該出口のない反応チャンバーにある空気を、液体に対しては透過性でないが気体に対しては透過性である該反応チャンバーの壁を介して移動させる工程と、
該第１の液体とは非混和性の第２の液体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の液体を移動させる工程と
を含み、
該複数の反応チャンバーの各々における第１の液体が、該流路における該第２の液体により他の反応チャンバーの各々における該第１の液体から隔離される方法。
【請求項１１】
サンプルが、ＰＣＲ用の１種または複数種の試薬をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応チャンバーが、１ナノリットル容量未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応チャンバーが、約１０ｐＬ〜約１００ｐＬの容量である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の液体が水溶液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の液体が非水性液体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の液体が、ＰＣＲ用の反応混合物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の液体がサンプルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロ流体デバイスが、前記複数の反応チャンバーと平行な平面にありかつエラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸のデジタル定量法であって、
流路と、マイクロ流体アレイの流路と同一平面アレイにありかつ流体連絡した複数の出口のない反応チャンバーとに、圧力下で、標的核酸を含む第１の液体を充填し、該出口のない反応チャンバーにある空気を、液体に対しては透過性でないが気体に対しては透過性である該反応チャンバーの壁を介して移動させる工程と、
該第１の液体とは非混和性の第２の液体により該流路をフラッシュし、該反応チャンバーからではなくて該流路から該第１の液体を移動させる工程であって、該複数の反応チャンバーの各々における第１の液体が、該流路における該第２の液体により他の反応チャンバーの各々における該第１の液体から隔離される工程と、
該マイクロ流体アレイをインキュベートする工程と
を含む方法。
【請求項２１】
前記反応チャンバーが、１ナノリットル容量未満である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記反応チャンバーが、約１０ｐＬ〜約１００ｐＬの容量である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の液体が水溶液である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の液体が非水性液体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の液体が、ＰＣＲ用の反応混合物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の液体がサンプルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応チャンバーに、１種または複数種の試薬があらかじめ配置されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約３個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的核酸が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約１個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的核酸が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約０．５個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的核酸が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約０．１個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記インキュベートする工程が熱サイクリングを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の液体が、少なくとも２種の標的核酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも２種の標的核酸の各々が、前記第１の液体中において、前記複数の反応チャンバー全体で平均して反応チャンバー１個当たり約３個未満の標的核酸を供給するのに適する濃度である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記インキュベートする工程が、光学的に多重化されたアッセイを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
エラストマー基材において形成されている流路と連絡された、同一平面アレイにある複数の出口のない反応チャンバーと、
２つ以上の反応チャンバー間の流体連絡を阻止する流体バリアと、
を含むマイクロ流体デバイスであって、
該複数の出口のない反応チャンバーの各々は、壁により境界付けられた、デバイス。
【請求項３７】
前記複数の反応チャンバーと平行な平面で適用されておりかつエラストマー層により該反応チャンバーから分離された蒸気バリアをさらに含む、請求項３４に記載のデバイス。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５０４０９４（Ｐ２０１１−５０４０９４Ａ）
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１３８９（Ｐ２０１０−５３１３８９）
【出願日】平成２０年１１月７日（２００８．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１９８５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９４３０
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０２０８７９３２）ザ ユニヴァーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月７日（２００８．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１９８５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９４３０
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０２０８７９３２）ザ ユニヴァーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア (10)
【Ｆターム（参考）】
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