マクロライド免疫抑制剤の水溶性ポリエチレングリコール複合体を調製するためのプロセス
リパーゼの存在下、ラパマイシンとアシル化剤を反応させてアシル化されたラパマイシンを形成する段階および塩基の存在下、アシル化されたラパマイシンとメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体を反応させる段階を含む、４２−ペグ化されたラパマイシンを調製するためのプロセスを開示する。また、これらの段階を用いて３２−ペグ化されたタクロリムスおよび／またはアスコマイシンを調製するためのプロセスも開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロライド免疫抑制剤シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムス、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、タクロリムス（ＦＫ５０６）およびアスコマイシン（ＦＫ５２０）の水溶性ポリ（エチレングリコール）複合体を調製するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシン（１）、タクロリムス（ＦＫ５０６、２）およびアスコマイシン（ＦＫ５２０、３）は構造的に類似の大環状ポリケチドであり、全てが、同じ細胞内受容体と相互作用するが、異なる作用機構を有する有力な免疫抑制剤であり、異なる段階でＴ細胞活性化を抑制する（Rosen et al., 「Natural products as probes of cellular function: studies of immunophilins」 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31, 384-400）。これらのマクロライド類は抗菌活性を有し、実験的アレルギー性脳脊髄炎を含む自己免疫疾患の動物モデル、関節炎、糖尿病の動物モデル、ＳＬＥのＭＲＬ／ｌｐｒマウスモデル、過剰増殖性の皮膚疾患(ski diseases)および網膜ブドウ膜炎においても有効である。
【化１０】
【０００３】
ラパマイシンおよびタクロリムスは、移植拒絶反応を抑制するとして認可されている。しかし、両化合物は、それらの非常に限定された水溶解度のために組成物を処方する際に同様の問題を共に有している。例えば、タクロリムスの水中での溶解度は１２μｇ／ｍＬである。そのように低い溶解度は、やや複雑な処方を必要とする。例えば、静脈注射用のタクロリムス５ｍｇを溶解するために、２００ｍｇ／ｍＬの水素化ポリオキシ６０ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）および８０％（ｖ／ｖ）無水アルコールが可溶化助剤として必要とされる。ラパマイシンの水中溶解度は約２．６μｇ／ｍＬであり、経口バイオアベイラビリティが低い（＜１５％）（Yatscoff et al., 「Rapamycin: distribution, pharmacokinetics, and therapeutic range investigations」 Ther. Drug Monit. 1995, 17, 666-671）。ラパマイシンが、様々な固形腫瘍に対して典型的なＩＣ５０が５０ｎｍ未満の、腫瘍増殖の有力な阻害剤でもあるにも関わらず、これらの特徴は、免疫抑制などの低用量治療以外のラパマイシンの臨床適用を限定する。
【０００４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、多分散性が低く（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．０５）、多様な分子量で入手できる線状または分枝状の中性ポリマーである。これらの水／有機溶媒溶解性の無毒のポリマーは、生物学的用途および製薬用途において有用であることが見出されている。そのような用途の１つは、ペグ化と呼ばれる、水溶性ＰＥＧ−薬剤複合体を作成するためのこれらのポリマーと非水溶性または水難溶性の小分子治療薬の結合である。有機分子のペグ化は、有機分子の水溶解度を増強し、その他の有益な特性、例えば改善された血漿半減期、改善された生物学的分布および低下された毒性などを付与することが報告されている（Greenwald et al., 「Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates」, Advanced Drug Delivery Rev. 2003, 55, 217-250; Pasut et al., 「Protein, peptide and non-peptide drug PEGylation for therapeutic application」, Expert Opin. Ther. Patents 2004, 14, 859-894）。
【０００５】
ラパマイシンのリパーゼ触媒アセチル化は、米国特許出願公開第ＵＳ−２００５／０２３４２３４号に考察されている。この触媒プロセスにより、ラパマイシンの４２のエステル誘導体がラパマイシンから位置特異的に穏和な条件下で優れた収率で得られる。前記米国特許出願公開は参照文献により本明細書に組み込まれる。
【０００６】
ラパマイシンまたはその誘導体のＰＥＧ複合体の調製は、米国特許第５，９５５，４５７号；同第５，７８０，４６２号；同第６，４３２，９７３号および同第６，３３１，５４７号に記載されている。ペグ化されたＣＣＩ−７７９がそれから作成されるラパマイシンＣＣＩ−７７９のヒドロキシエステルの調製は、米国特許第５，３６２，７１８号に記載された。これらの米国特許はすべて参照により本明細書に組み込まれる。これらの特許は、ラパマイシンまたはその誘導体とチオール誘導体（ｍＰＥＧＳＨ）などのメトキシポリエチレングリコール化合物をエステル結合によって化学的に結合することにより形成された複合体を記載する。所望のＰＥＧ複合体を回収するために、溶媒抽出法およびクロマトグラフィー精製がそれにより必要とされた。そのようにすることによって、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製の後にラパマイシン４２−ヨードアセテートが５５％の収率で調製された。
【０００７】
水溶性ＰＥＧ−タクロリムス（ＦＫ５０６）複合体の調製は、同様の手順を用いる国際特許公開第ＷＯ９９／０３８６０号に考察されている。これらの手順の主な欠点の１つは、ラパマイシン／タクロリムス骨格中に複数のＯＨ官能基が存在するために、エステル結合の樹立(installation)の選択性が低いことである。その上、ペグ化中に炭酸水素ナトリウム水溶液を塩基として使用することにより、いくつかの副生成物が生じ、低または中程度の回収収率の複数の精製段階を必要とする。
【０００８】
エベロリムスの合成は、米国特許第６，４４０，９９０号に記載され、ＰＥＧ−エベロリムス（ＩＩ）の合成は、米国特許第６，３３１，５４７号に記載されている。これらの米国特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当分野で必要とされるものは、マクロライド免疫抑制剤の水溶性ポリ（エチレングリコール）複合体を調製するための代わりとなるプロセスである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、免疫抑制性マクロライドのポリエチレングリコール複合体を調製するためのプロセスが提供される。
【００１１】
別の態様では、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、タクロリムスおよびアスコマイシンのポリエチレングリコール複合体を調製するためのプロセスが提供される。
【００１２】
本発明のその他の態様および利点は、以下のその好ましい実施形態の詳細な説明においてさらに説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ラパマイシン（ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス；タクロリムス；またはアスコマイシンを含む）とのポリエチレングリコール複合体を高い収率で調製するための新規で有効なプロセスが提供される。本プロセスには、簡単な単離段階が含まれ、それは完全な位置選択性のリパーゼを用いるこれらのマクロライドにおけるエステル結合の樹立および優れた収率のペグ化複合体を軸とする。
【００１４】
本明細書において用いられる場合、ポリエチレングリコール、略して（ＰＥＧ）は、各末端にヒドロキシル基を有する線状ポリマーである。
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
この式はＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表すことができ、この場合、−ＰＥＧ−は末端基を含まないポリマー主鎖を表すことが理解される。
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−
ポリエチレングリコールにはまた、モノ活性化、アルキル末端ポリエチレングリコール、例えばメトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧＯＨ）が含まれ得る。
ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
（式中、一方の末端は不活性メトキシ基であるが、もう一方の末端は化学修飾のできる状態のヒドロキシル基である）。一実施形態では、活性化ｍＰＥＧの末端はメトキシ−ＰＥＧ−ＳＨ（ｍＰＥＧＳＨ）である。
ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ
別の実施形態では、ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ（ＰＥＧＳＨ）などの、ビス活性化、チオール末端ポリエチレングリコール：
ＨＳ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ
が含まれ得るポリエチレングリコールもまたそのような目的に企図される。
【００１５】
ポリエチレングリコールは実質的に分子量によって異なるが、分子量が約４００〜約３０，０００の範囲のポリマーが通常選択される。一例では、約１０００〜約３０，０００の分子量のポリエチレングリコールが選択される。別の例では、約２５００〜約２０，０００の分子量のポリエチレングリコールが選択される。さらなる例では、約５０００〜約２０，０００の分子量のポリエチレングリコールが選択される。これらの式において、ｎは、典型的には１０〜１０００の範囲内の整数であることは、当業者は容易に理解する。
【００１６】
本明細書において定義される「ラパマイシン」とは、ラパマイシンおよびラパマイシン核の誘導体として化学的または生物学的に修飾されるが、なお生物学的活性を保持し得る化合物を指す。従って、用語「ラパマイシン」には、ラパマイシンのエステル、エーテル、カルボネート、カルバメート、オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミン、ならびにその核上の官能基が、例えば還元または酸化によって修飾されているラパマイシンが含まれる。また、用語「ラパマイシン」には、酸性または塩基性部分を含むことによってそのような塩を形成することのできるラパマイシンの製薬上許容される塩も含まれる。
【００１７】
一実施形態では、ラパマイシンのエステルおよびエーテルは、ラパマイシン核の３１位のヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、（２７位のケトンの化学的還元後の）２７位のヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、４２位のヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、特にラパマイシンの４２位のヒドロキシル基のヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキルアリールエステルまたはエーテルである。オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンは、ラパマイシン核のケトンのものである。
【００１８】
他の実施形態では、ラパマイシンの３１−エステルおよびエーテルは以下の特許に記載されている。アルキルエステル（米国特許第４，３１６，８８５号）；アミノアルキルエステル（米国特許第４，６５０，８０３号）；フッ素化エステル（米国特許第５，１００，８８３号）；アミドエステル（米国特許第５，１１８，６７７号）；カルバメートエステル（米国特許第５，１１８，６７８号；同第５，４４１，９６７号；同第５，４３４，２６０号；同第５，４８０，９８８号；同第５，４８０，９８９号；および同第５，４８９，６８０号）；シリルエーテル（米国特許第５，１２０，８４２号）；アミノエステル（米国特許第５，１３０，３０７号）；アセタール（米国特許第５，５１，４１３号）；アミノジエステル（米国特許第５，１６２，３３３号）；スルホネートおよびスルフェートエステル（米国特許第５，１７７，２０３号）；エステル（米国特許第５，２２１，６７０号）；アルコキシエステル（米国特許第５，２３３，０３６号）；Ｏ−アリール、−アルキル、−アルケニルおよび−アルキニルエーテル（米国特許第５，２５８，３８９号）；カルボネートエステル（米国特許第５，２６０，３００号）；アリールカルボニルおよびアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第５，２６２，４２３号）；カルバメート（米国特許第５，３０２，５８４号）；ヒドロキシエステル（米国特許第５，３６２，７１８号）；ヒンダードエステル（米国特許第５，３８５，９０８号）；複素環エステル（米国特許第５，３８５，９０９号）；ｇｅｍ二置換エステル（米国特許第５，３８５，９１０号）；アミノアルカン酸エステル（米国特許第５，３８９，６３９号）；ホスホリルカルバメートエステル（米国特許第５，３９１，７３０号）；アミノカルバメートエステル（米国特許第５，４６３，０４８号）；ヒンダードＮ−オキシドエステル（米国特許第５，４９１，２３１号）；ビオチンエステル（米国特許第５，５０４，０９１号）；およびＯ−アルキルエーテル（米国特許第５，６６５，７７２号）。これらのエステルおよびエーテルの調製は上記に列挙した特許に記載されている。
【００１９】
さらにその他の実施形態では、ラパマイシンの２７−エステルおよびエーテルが米国特許第５，２５６，７９０号において考察されている。これらのエステルおよびエーテルの調製は上記に列挙した特許に記載されている。
【００２０】
さらにその他の実施形態では、ラパマイシンの４２−ヒドロキシアルキル、４２−ヒドロキシアルケニル、４２−ヒドロキシアルキルアリールエーテルが米国特許第６，４４０，９９０号；同第５，６６５，７７２号；および同第５，２５８，３８９号に開示されている。ラパマイシンの４２−ヒドロキシアルキル、４２−ヒドロキシアルケニル、４２−ヒドロキシアルキルアリールエステルは米国特許第５，３６２，７１８号に開示されている。これらのエステルおよびエーテルの調製は上記に列挙した特許に記載されている。
【００２１】
一実施形態では、免疫抑制性マクロライドはシキミ酸由来シクロヘキシル領域を含む。一例では、免疫抑制性マクロライドはラパマイシン、タクロリムスまたはアスコマイシンである。
【００２２】
別の実施形態では、免疫抑制性マクロライドはラパマイシンであり、下記構造：
【化１１】
（式中、Ｒ１は、Ｈ、ならびにアルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルの中から選択され；Ｒ２は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルの中から選択され；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ３１の中から選択され；Ｒ３１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルの中から選択され；Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルの中から選択され；Ｒ５は、Ｈ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシアラルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ５１の中から選択され；かつ、Ｒ５１は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアリールおよびヒドロキシアラルキルの中から選択される）
を有するものである。
【００２３】
「ラパマイシン」の例としては、制限されないが、ラパマイシン（米国特許第３，９２９，９９２号）、３２−デスメチルラパマイシン、３２−デスメトキシラパマイシン、４１−デスメチルラパマイシン、４１−デスメトキシラパマイシン（国際特許公開第ＷＯ−２００４／００７７０９号）、７，３２−ビス−デスメチルラパマイシン、プロリン−ラパマイシン、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９、米国特許第５，３６２，７１８号）および４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン（エベロリムス、ＲＡＤ００１、米国特許第５，６６５，７７２号）が挙げられる。
【００２４】
従って、本明細書に記載されるプロセスは、免疫抑制性マクロライドのポリエチレングリコール複合体の調製を提供する。本プロセスには、リパーゼの存在下、アシル化剤とシキミ酸由来シクロヘキシル領域を有する免疫抑制性マクロライドを反応させて、アシル化されたマクロライドを形成することが含まれる。アシル化されたマクロライドを次に塩基の存在下でメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させる。一実施形態では、免疫抑制性マクロライドはラパマイシン化合物である。
【００２５】
一実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造：
【化１２】
（式中、Ｒ１は、Ｈ、ならびにアルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルの中から選択され；Ｒ２は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルの中から選択され；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒ３１であり；Ｒ３１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルの中から選択され；Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルの中から選択され；Ｘは、酸素（−Ｏ−）、−Ｏ−アルキル−Ｏ−、−Ｏ−アルケニル−Ｏ、−Ｏ−アリール−Ｏ−、−Ｏ−アリールアルキル−Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７の中から選択され；Ｒ７は、−アルキル−Ｏ−、−アルケニル−Ｏ−、−アリール−Ｏ−および−アリールアルキル−Ｏ−の中から選択され；ｎは１０〜１０００の整数であり；かつ、ＸはＯまたはＳである）を有するものである。
【００２６】
さらなる実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造（Ｉ）：
【化１３】
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
を有するものである。
【００２７】
別の実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造（ＩＩ）：
【化１４】
（式中、Ｘおよびｎは上記に定義されるとおりである）
を有するものである。
【００２８】
さらに別の実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造（ＩＩＩ）：
【化１５】
（式中、Ｘおよびｎは上記に定義されるとおりである）
を有するものである。
【００２９】
さらに別の実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造（ＩＶ）：
【化１６】
（式中、Ｘおよびｎは上記に定義されるとおりである）
を有するものである。
【００３０】
本プロセスは、ラパマイシン化合物以外のイムノフィリンとのＰＥＧ複合体を調製するためにも有用である。イムノフィリンは、ラパマイシン化合物の４２−ＯＨ官能基に類似するシキミ酸由来シクロヘキシル領域を含有し、それには、制限されないが、ＦＫ５０６関連天然物が含まれる。
【００３１】
本明細書において、用語「ＦＫ５０６関連天然物」とは、下記コア構造：
【化１７】
（式中、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、独立して、Ｈまたはアルキルであり；Ｒはエチルまたはアリルである）
を有する化合物を指す。一例では、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、Ｍｅであり；ＲはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。別の例では、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、Ｍｅであり；ＲはＣＨ２ＣＨ３である。
【００３２】
本明細書において使用される用語「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０）、例えば、１〜８個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）、１〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６）あるいは１〜４個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）を有する、直鎖および分岐鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を指す。用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合と、２〜８個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）、２〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６）あるいは２〜４個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）を含む、直鎖および分岐鎖両方のアルキル基を指す。用語「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合と、２〜８個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８、２〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６）あるいは２〜４個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）を含む、直鎖および分岐鎖両方のアルキル基を指す。
【００３３】
本明細書において使用される用語「アリール」は、融合または結合した環の少なくとも一部が共役芳香族系を形成するように一緒に融合または結合した単一の環または複数の芳香環であり得る炭素環式芳香族系を指す。アリール基としては、限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、テトラヒドロナフチル、フェナントリルおよびインダンが挙げられる。
【００３４】
用語「アリールアルキル」とは、アリール基で置換されているアルキル基を指す。アルキル基は、その結合が安定な化学結合を構成するならば、アリール基のどのポイントに位置していてもよい。
【００３５】
本明細書において使用される用語「アラルキル」とは、アルキル基上の任意の炭素原子と結合しているアリール基を有するアルキル基を指す。
【００３６】
用語「ヒドロキシアルキル」、「ヒドロキシアルケニル」、「ヒドロキシアリール」および「ヒドロキシアラルキル」とは、このように、その結合が安定な化学結合を構成するならば、アルキル、アルケニル、アリールまたはアラルキル基の任意の炭素原子と結合している−ＯＨ基を有するアルキル、アルケニル、アリールおよびアラルキル基を指す。
【００３７】
用語「ハロゲン」とは、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦまたはＩを指す。
【００３８】
一実施形態では、ＦＫ５０６関連天然物複合体は、下記式（Ｖ）の構造：
【化１８】
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
を有するＰＥＧ−タクロリムスである。
【００３９】
別の実施形態では、ＦＫ５０６関連天然物複合体は、下記式（ＶＩ）の構造：
【化１９】
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
を有するＰＥＧ−アスコマイシンである。
【００４０】
従って、一実施形態では、式Ｉの水溶性複合体を調製するためのプロセスが提供される（下記スキーム１を参照）。
【化２０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は上記に定義されているものである）。
【００４１】
別の実施形態では、下記スキーム２に概説されるように、２段階シーケンスによる、式（Ｉ）で表される水溶性ＰＥＧ−ラパマイシン複合体を調製するためのプロセスが提供される。
【化２１】
（式中、ＸはＳまたはＯであり；Ｙはハロゲンなどの脱離基であり；かつ、Ｒ６はＨまたはメチルである）。
【００４２】
スキーム１および２から分かるように、ラパマイシン複合体は、メトキシポリエチレングリコールが４２位の位置でエステルリンカーによってラパマイシンと結合しているエステルの形態である。当分野の方法と対照的に、本明細書に記載されるこの活性化ラパマイシン４２−エステル誘導体の合成は、リパーゼに触媒されるラパマイシンと、下記一般式：
【化２２】
（式中、Ｒ６はＨまたはＣＨ３であり；Ｙは脱離基である）
を有する活性化エステル（Ａ）のアシル化を介して達成される。
【００４３】
脱離基の例としては、限定されるものではないが、ハロゲンおよびスルホネート、例えばメタンスルホネート（メシレート、ＭｓＯ）およびｐ−トルエンスルホネート（トシレート、ＴｓＯ）などが挙げられる。一実施形態では、脱離基はハロゲン、例えばＩ、ＢｒまたはＣｌなどである。別の実施形態では、活性化エステルは２−ハロ酢酸のビニルエステルである（Ｒ６＝ＣＨ３）。さらなる実施形態では、活性化エステルはブロモ酢酸のビニルエステルである。その他の２−ハロ酢酸の活性化エステル、例えばイソプロペニルエステル（Ｒ６＝ＣＨ３）、オキシムエステル、トリクロロエチルまたはトリフルオロエチルエステルなどは当業者に公知であり、本明細書に包含される。
【００４４】
本明細書に記載される本プロセスの利点は、ラパマイシンのアシル化されたラパマイシン（ＶＩＩ）への変換が、ほぼ定量的収率で行われ得ることである。望ましくは、アシル化されたラパマイシン（ＶＩＩ）は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より大きな収率で調製される。
【００４５】
多様なリパーゼを利用することができる。一実施形態では、リパーゼは微生物リパーゼ、すなわち加水分解およびエステル結合の形成を触媒する、微生物起源のリパーゼである。微生物リパーゼとしては、例えば、カンジダ・アンタークティカ(Candida antarctica)、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、リゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)およびアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)が挙げられる。しかし、本明細書における使用のために選択されたリパーゼは、元の供給源から直接に単離および精製される必要はなく、合成によってまたは組換えによって、あるいはその他の適した手段によって調製することができる。多様なこれらの酵素は一部の商業的供給源から入手でき、さらに、これらの酵素調製物は、様々な供給者による異なる商品名の異なる微生物起源からの未精製物、部分精製物、精製物または固定化物として使用することができる。
【００４６】
一実施形態では、カンジダ・アンタークティカ由来のＢ型リパーゼが利用される。Ｃ．アンタークティカリパーゼは、例えば、Ｎｏｖｏ ＳＰ４３（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３（商標）(Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）またはＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２（商標）(Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）の製品名で市販されている。別の実施形態では、シュードモナス・セパシア由来のリパーゼが使用される。シュードモナス・セパシアは、例えば、リパーゼＰＳ（天野エンザイム株式会社）の製品名で市販されている。望ましくは、酵素は固定化された形態で使用される。一実施形態では、固定化されたリパーゼは、リパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩ（商標）またはリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」Ｉ（商標）(天野エンザイム株式会社）である。別の実施形態では、固定化されたリパーゼは、リパーゼＰＳ−Ｄ「Ａｍａｎｏ」Ｉ（商標）(天野エンザイム株式会社）である。
【００４７】
リパーゼは効果的な触媒量で、すなわち、アシル化を妥当な速度で効果的に触媒する量で使用される。当業者には、酵素が（ラパマイシンまたはＦＫ５０６／ＦＫ５２０の量に対して）約２０〜約８００重量％の量で使用され得ることが理解される。一実施形態では、酵素は約２５〜約５００重量％の量で使用される。別の実施形態では、酵素は約５０〜約２５０重量％の量で使用される。さらなる実施形態では、酵素は約７５〜約１５０重量％の量で使用される。
【００４８】
反応は典型的には有機溶媒中で実施される。適した溶媒としては、限定されるものではないが、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、エチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、メチレンクロライド（ＣＨ２Ｃｌ２）、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジ−イソプロピルエーテル（ｉＰｒ２Ｏ）、ヘキサン、ジオキサンまたはこれらの溶媒を含む混合物が挙げられる。一実施形態では、ＴＢＭＥが使用される。当業者であれば、溶媒が、初めに出発ラパマイシンの全てまたは一部を効果的に溶解し、妥当な速度で反応を進行させることのできる量で使用されることを理解する。例えば、溶媒、例えばＴＢＭＥなどは、少なくとも４重量容積（すなわち、ラパマイシンの量の４倍（４×）過剰な容積）から約１０重量容積の量で用いることができる。一例では、溶媒は約５〜８重量容積の量（すなわちラパマイシンの量の５〜８倍過剰な容積）で用いられ得る。
【００４９】
ＴＢＭＥは、ラパマイシン化合物を分解し得る残留水（例えば、約０.０５％）を含み得る。この副反応を最小限にするために、少量の水分が反応系中で維持される。一実施形態では、無水ＴＢＭＥはリパーゼ触媒の標準的な市販調製品とともに使用される。別の実施形態では、水分は、乾燥剤を添加することによりリパーゼ溶液中に存在する水の量を調節することによって制御され得る。さらに別の実施形態では、モレキュラーシーブを用いて水分を制御することができる。モレキュラーシーブは反応を遅くするので、補償するためにより多くの酵素を添加するか、または長い反応時間を用いることができる。一実施形態では、５Åモレキュラーシーブが使用される。しかし、限定されるものではないが、４Åおよび３Åを含むその他のシーブサイズが容易に使用され得る。適したモレキュラーシーブスは多様な商業的供給源から入手可能である。さらに別の実施形態では、乾燥剤、例えば、数ある中でＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４が、含水量を制御するために使用され得る。
【００５０】
アシル化反応は、望ましくない副生成物の形成を低減するために十分低いが、不当に長い反応時間を必要としない程度までの低い温度で行われる。一実施形態では、アシル化は、約２０〜約５５℃で行われる。別の実施形態では、アシル化反応は、約２５〜５０℃で行われる。さらなる実施形態では、アシル化反応は、約３５〜４５℃で行われる。
【００５１】
一実施形態では、アシル化は、無水ＴＢＭＥ中でラパマイシン、ビニルブロモアセテートおよびリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩ（商標）(ラパマイシンとして１００％ ｗ／ｗ)を合わせることにより行われる。この混合物を窒素下で４０℃にて約８時間、または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬＣでモニターしてラパマイシン出発物質が消失するまで過熱する。濾過により酵素を除去した後、ラパマイシン４２−ブロモアセテートがほぼ定量的収率で得られた。
【００５２】
一度エステルリンカーが導入されると、次の段階にはＰＥＧ分子とこの活性化ラパマイシンアセテート（ＶＩＩ）との結合が含まれる。ペグ化は、非求核性塩基の存在下、有機溶媒中、（ＶＩＩ）と、一般式ＨＸ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ３（Ｂ）（式中、Ｘおよびｎは上記に定義されるとおりである）を有するメトキシポリエチレン誘導体を反応させることにより達成された。
【００５３】
本明細書において、用語「非求核性塩基」とは、求核性を有さない塩基として機能する化合物を指す。望ましくは、非求核性塩基は他の化合物およびペグ化の試薬と反応しない。多様な非求核性塩基が当業者に公知である。例えば、Richard C. Larock, in 「Comprehensive Organic Transformation」, 2nd edition, 1999を参照のこと。一実施形態では、非求核性塩基は第三級アミンである。一例では、第三級アミンは脂肪族アミンである。別の例では、第三級アミンは芳香族アミンである。さらなる例では、第三級アミンはトリアルキルアミン、例えばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどである。
【００５４】
ペグ化において有用な、適した溶媒としては、限定されるものではないが、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨＣｌ３、ジオキサン、ジメチルホルムアミド(dimethylforamide)（ＤＭＦ）またはこれらの溶媒を含む混合物が挙げられる。一実施形態では、ＭｅＣＮは溶媒である。
【００５５】
ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、数ある中でも、沈殿、抽出、濾過を含む、当業者に周知の手順を用いて単離することができる。
【００５６】
従って、一実施形態では、ラパマイシン４２−ブロモアセテートとｍＰＥＧチオール（ＭＷ約５０００）を、アセトニトリル中、ジイソプロピルエチルアミンを用いて一定時間処理した。そのようにすることにより、イソプロパノールを反応混合物に添加することによる単純な沈殿の後、所望のＰＥＧ−ラパマイシン複合体（Ｉ）を優れた収率で得ることができる。
【００５７】
別の実施形態では、スキーム３に概説される２段階シーケンスによる、式（ＩＩ）で表される水溶性ＰＥＧ−エベロリムス（４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン、ＲＡＤ００１）複合体を調製するための方法が提供される。ＰＥＧ−エベロリムス複合体（ＩＩ）は、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体（Ｉ）について記載されるものと同様の方法で調製され得る。要約すれば、反応は、式（Ａ）のアシル化剤を用いるリパーゼ触媒アシル化により得られる中間体（ＶＩＩＩ）を経て行われる。次に、上に記載される有機溶媒中、非求核性塩基の存在下で化合物（ＶＩＩＩ）を式（Ｂ）のメトキシポリエチレン誘導体と反応させる。一例では、非求核性塩基はトリアルキルアミンである。別の例では、有機溶媒はアセトニトリルである。化合物ＩＩはそれにより優れた収率で、かつ、さらなる精製を必要としないほど高い純度で調製される。
【化２３】
【００５８】
別の実施形態では、同様の２段階シーケンスによる、式（ＩＩＩ）、(ＩＶ)またはそれらの組合せで表される水溶性ＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体を調製するためのプロセスが提供される。スキーム４を参照のこと。ＣＣＩ−７７９分子の４２位のエステル側鎖中の一方または両方のＯＨ基は、スキーム３に記載されるように、リパーゼにより触媒される式（Ａ）のアシル化剤でアシル化され得る。モノアシル化生成物（ＩＸ）とビスアシル化生成物（Ｘ）の比は、リパーゼの量、ビニルエステル（Ａ）の量、反応時間および温度を変更することにより変えることができる。さらに、式（ＩＸ）および（Ｘ）の化合物は、クロマトグラフィーを用いて混合物からそれぞれ分離することができる。化合物（ＩＸ）および（Ｘ）は、次に、別々に使用されて対応するＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）が調製され得る。あるいは、化合物（ＩＸ）および（Ｘ）は混合物として保持されてもよく、その混合物は対応するＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を調製するために使用される。
【００５９】
ＰＥＧ−複合体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の調製は、上記の有機溶媒中、上記の非求核性塩基の存在下、化合物（ＩＸ）および（Ｘ）と式（Ｂ）のメトキシポリエチレン誘導体を反応させることにより行われた。一例では、非求核性塩基はトリアルキルアミンである。別の例では、有機溶媒はアセトニトリルである。そのようにすることにより、複合体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）は、それぞれ、優れた収率で、かつ、さらなる精製を必要としないほど高い純度で調製され得る。
【化２４】
【００６０】
さらに別の実施形態では、式（Ｖ）および（ＶＩ）で表される水溶性ＰＥＧ−タクロリムスおよびＰＥＧ−アスコマイシン複合体を別々に調製するための方法が提供される。スキーム５に記載されるように、それぞれの３２−エステル化中間体（ＸＩ）は、リパーゼの存在下、タクロリムス（ＦＫ５０６）またはアスコリムス(ascolimus)（ＦＫ５２０）を式（Ａ）のアシル化剤を用いて位置特異的な方法で、優れた収率でアシル化することにより得ることができる。その後の上記有機溶媒中、上記非求核性塩基の存在下での、（ＸＩ）の式（Ｂ）のメトキシポリエチレン誘導体での処理により、式（Ｖ）のＰＥＧ−タクロリムス複合体または式（ＶＩ）のＰＥＧ−アスコリムス複合体が、それぞれ優れた収率かつ高純度で得られた。一例では、非求核性塩基はトリアルキルアミンである。別の例では、有機溶媒はアセトニトリルである。
【化２５】
【００６１】
本明細書に記載される経路は、米国特許第５，９５５，４５７号；同第６，３３１，５４７号；同第５，７８０，４６２号；および同第６，４３２，９７３号ならびに国際特許公開第ＷＯ９９／０３８６０号に公開されている合成手順よりも明確な利点をいくつか提供する。これらの利点には、余計な精製段階を必要としない処理の容易さと、より高い全収率が含まれる。これは、エステルリンカーを位置特異的に導入するための触媒としてリパーゼを使用することにより達成される。また、高い収率は、その後の共役反応において、出発物質および生成物を分解する無機塩基、例えば重炭酸ナトリウムなどを使用する代わりに、有機塩基、例えばトリアルキルアミンなどを使用することに起因する。例えば、米国特許第５，９５５，４５７号に記載される合成経路は、４２−ペグ化されたラパマイシンを２回のＨＰＬＣ精製後に５０％未満の収率で供給するのに対し、本明細書に記載の本プロセスは、精製の必要なく、ほぼ定量的収率で生成物を供給する。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の限定するものではない。Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５は、アクリル樹脂上に固定化されているカンジダ・アンタークティカリパーゼＢの商標である。
【００６３】
実施例１ − ラパマイシン４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）を経由するＰＥＧ−ラパマイシン複合体（Ｉ）の調製
【化２６】
【００６４】
Ａ．ラパマイシン４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）の調製
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（８ｍＬ）中、ラパマイシン（９１４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ビニルブロモアセテート（６６０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、５Åモレキュラーシーブス（１００ｍｇ）およびＮｏｖｏｚｙｍ４３５（商標）リパーゼ（１．０ｇ）の混合物をＮ２下で４０℃にて８時間加熱した。酵素を濾過により除去し、ＴＢＭＥで洗浄した。混合物を濃縮し、ヘキサンに沈殿させた。ラパマイシン４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）を濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：１．０１ｇ（９８％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ １０３５（Ｍ−）
【００６５】
Ｂ．ＰＥＧ−ラパマイシン複合体（Ｉ）の調製
ｍＰＥＧＳＨ（５００ｍｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（１．５ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１７ｍｇ）、続いてラパマイシン４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）（９５ｍｇ）を添加した。次に、混合物を室温にて３時間攪拌した。２−プロパノール（１８ｍＬ）を添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。沈殿したペグ化ラパマイシンを濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：５５０ｍｇ（９５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２.８４（ｔ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２）、３．２７（ｓ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ）、３．３６（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）、４．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４２）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）ｍ／ｚ ５８７７.４７（平均ＭＷ）。
【００６６】
実施例２ − エベロリムス４２−ブロモアセテート（ＶＩＩＩ）を経由するＰＥＧ−エベロリムス複合体（ＩＩ）の調製
【化２７】
【００６７】
Ａ．エベロリムス４２−ブロモアセテート（ＶＩＩＩ）の調製
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（３ｍＬ）中、エベロリムス（２５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ビニルブロモアセテート（１６５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、５Åモレキュラーシーブス（２０ｍｇ）およびＮｏｖｏｚｙｍ４３５（商標）リパーゼ（２００ｍｇ）の混合物をＮ２下で３５℃にて１０時間加熱した。酵素を濾過により除去し、ＴＢＭＥで洗浄した。混合物を濃縮し、ヘキサンでトリチュレートした。エベロリムス４２−ブロモアセテート（ＶＩＩＩ）を濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：２７５ｍｇ（９６％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ １０７８（Ｍ−）
【００６８】
Ｂ．ＰＥＧ−エベロリムス複合体（ＩＩ）の調製
ｍＰＥＧＳＨ（５００ｍｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（１．５ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１８ｍｇ）、続いてエベロリムス４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）（１１０ｍｇ）を添加した。次に、混合物を室温にて３時間攪拌した。２−プロパノール（１８ｍＬ）を１０分間にわたり添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。白色の粉末を濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：５３０ｍｇ（８７％）。
【００６９】
実施例３ − ＣＣＩ−７７９モノ−ブロモアセテート（ＩＸ）およびＣＣＩ−７７９ビス−ブロモアセテート（Ｘ）の調製
【化２８】
【００７０】
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（１３０ｍＬ）中、ＣＣＩ−７７９（７．０ｇ、６．８ｍｍｏｌ）、ビニルブロモアセテート（４．０ｇ、２４．２４ｍｍｏｌ）、５Åモレキュラーシーブス（２．０ｇ）およびＮｏｖｏｚｙｍ４３５（商標）リパーゼ（１．３ｇ）の混合物を、室温にてＮ２下で８時間攪拌した。ＨＰＬＣは、反応混合物が６４％モノ−ブロモアセテート、２０％ビス−ブロモアセテートおよび１２％ＣＣＩ−７７９出発物質を含有することを示した。酵素を濾過により除去し、ＴＢＭＥで洗浄した。混合物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。少ないほうの極性画分にビス−ブロモアセテート（Ｘ）が含まれ、それを回収した（１．４１ｇ）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ １３１７（Ｍ＋４５）−。多い方の極性画分にはモノ−ブロモアセテート（ＩＸ）（４．５６ｇ）が含有され、それを次に白色の粉末として単離した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ １１９６（Ｍ＋４５）−。
【００７１】
実施例４ − ＰＥＧ−ＣＣＩ７７９複合体（ＩＩＩ）の調製
【化２９】
【００７２】
ｍＰＥＧＳＨ（２０．０ｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（４５ｍＬ）溶液に、実施例３で調製したように、ジイソプロピルエチルアミン（７２２ｍｇ、５．６ｍｍｏｌ）、続いてＣＣＩ−７７９モノブロモアセテート（ＩＸ）（４．６０ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。次に、混合物を室温にて４時間攪拌した。２−プロパノール（５４０ｍＬ）を１０分間にわたり添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。ＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＩＩ）を白色の粉末として濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：２０．３ｇ（８３％）。
【００７３】
実施例５ − ＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＶ）の調製
【化３０】
【００７４】
ｍＰＥＧＳＨ（３．０ｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（９ｍＬ）溶液に、実施例３で調製したように、ジイソプロピルエチルアミン（１０１ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）、続いてＣＣＩ−７７９ビスブロモアセテート（Ｘ）（４１４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。次に、混合物を室温にて４時間攪拌した。２−プロパノール（１０８ｍＬ）を１０分間にわたり添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。ＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＶ）を白色の粉末として回収し、真空乾燥させた。収量：３．２５ｇ（９６％）。
【００７５】
実施例６： タクロリムス３２−ブロモアセテート（ＸＩ）を経由するＰＥＧ−タクロリムス複合体（Ｖ）の調製
【化３１】
【００７６】
Ａ．タクロリムス３２−ブロモアセテート（ＸＩ）の調製
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（０．２ｍＬ）中、タクロリムス（１０ｍｇ）、ビニルブロモアセテート（２０ｍｇ）およびＮｏｖｏｚｙｍ４３５（商標）リパーゼ（２０ｍｇ）の混合物をＮ２下で４０℃にて１２時間加熱した。酵素を濾過により除去し、ＴＢＭＥで洗浄した。濾液をシリカゲルパッドに通し、ヘキサン−アセトン（３：１）で洗浄した。タクロリムス３２−ブロモアセテートを回収し、真空乾燥させた。収量：１０．５ｍｇ（９１％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ９２４（Ｍ−）
【００７７】
Ｂ．ＰＥＧ−タクロリムス複合体（Ｖ）の調製
ｍＰＥＧＳＨ（２５ｍｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（０.１ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１ｍｇ）、続いてタクロリムス３２−ブロモアセテート（５ｍｇ）を添加した。次に、混合物を室温にて３時間攪拌した。２−プロパノール（１.５ｍＬ）を添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。沈殿したＰＥＧ−タクロリムス複合体（Ｖ）を濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：２４ｍｇ（８０％）。
【００７８】
本明細書に引用されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は特定の実施形態を参照して説明されたが、本発明の精神を逸脱することなく変更がなされ得ることは当然理解される。そのような変更は添付の特許請求の範囲内にあるものと意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロライド免疫抑制剤シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムス、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、タクロリムス（ＦＫ５０６）およびアスコマイシン（ＦＫ５２０）の水溶性ポリ（エチレングリコール）複合体を調製するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシン（１）、タクロリムス（ＦＫ５０６、２）およびアスコマイシン（ＦＫ５２０、３）は構造的に類似の大環状ポリケチドであり、全てが、同じ細胞内受容体と相互作用するが、異なる作用機構を有する有力な免疫抑制剤であり、異なる段階でＴ細胞活性化を抑制する（Rosen et al., 「Natural products as probes of cellular function: studies of immunophilins」 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31, 384-400）。これらのマクロライド類は抗菌活性を有し、実験的アレルギー性脳脊髄炎を含む自己免疫疾患の動物モデル、関節炎、糖尿病の動物モデル、ＳＬＥのＭＲＬ／ｌｐｒマウスモデル、過剰増殖性の皮膚疾患(ski diseases)および網膜ブドウ膜炎においても有効である。
【化１０】
【０００３】
ラパマイシンおよびタクロリムスは、移植拒絶反応を抑制するとして認可されている。しかし、両化合物は、それらの非常に限定された水溶解度のために組成物を処方する際に同様の問題を共に有している。例えば、タクロリムスの水中での溶解度は１２μｇ／ｍＬである。そのように低い溶解度は、やや複雑な処方を必要とする。例えば、静脈注射用のタクロリムス５ｍｇを溶解するために、２００ｍｇ／ｍＬの水素化ポリオキシ６０ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）および８０％（ｖ／ｖ）無水アルコールが可溶化助剤として必要とされる。ラパマイシンの水中溶解度は約２．６μｇ／ｍＬであり、経口バイオアベイラビリティが低い（＜１５％）（Yatscoff et al., 「Rapamycin: distribution, pharmacokinetics, and therapeutic range investigations」 Ther. Drug Monit. 1995, 17, 666-671）。ラパマイシンが、様々な固形腫瘍に対して典型的なＩＣ５０が５０ｎｍ未満の、腫瘍増殖の有力な阻害剤でもあるにも関わらず、これらの特徴は、免疫抑制などの低用量治療以外のラパマイシンの臨床適用を限定する。
【０００４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、多分散性が低く（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．０５）、多様な分子量で入手できる線状または分枝状の中性ポリマーである。これらの水／有機溶媒溶解性の無毒のポリマーは、生物学的用途および製薬用途において有用であることが見出されている。そのような用途の１つは、ペグ化と呼ばれる、水溶性ＰＥＧ−薬剤複合体を作成するためのこれらのポリマーと非水溶性または水難溶性の小分子治療薬の結合である。有機分子のペグ化は、有機分子の水溶解度を増強し、その他の有益な特性、例えば改善された血漿半減期、改善された生物学的分布および低下された毒性などを付与することが報告されている（Greenwald et al., 「Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates」, Advanced Drug Delivery Rev. 2003, 55, 217-250; Pasut et al., 「Protein, peptide and non-peptide drug PEGylation for therapeutic application」, Expert Opin. Ther. Patents 2004, 14, 859-894）。
【０００５】
ラパマイシンのリパーゼ触媒アセチル化は、米国特許出願公開第ＵＳ−２００５／０２３４２３４号に考察されている。この触媒プロセスにより、ラパマイシンの４２のエステル誘導体がラパマイシンから位置特異的に穏和な条件下で優れた収率で得られる。前記米国特許出願公開は参照文献により本明細書に組み込まれる。
【０００６】
ラパマイシンまたはその誘導体のＰＥＧ複合体の調製は、米国特許第５，９５５，４５７号；同第５，７８０，４６２号；同第６，４３２，９７３号および同第６，３３１，５４７号に記載されている。ペグ化されたＣＣＩ−７７９がそれから作成されるラパマイシンＣＣＩ−７７９のヒドロキシエステルの調製は、米国特許第５，３６２，７１８号に記載された。これらの米国特許はすべて参照により本明細書に組み込まれる。これらの特許は、ラパマイシンまたはその誘導体とチオール誘導体（ｍＰＥＧＳＨ）などのメトキシポリエチレングリコール化合物をエステル結合によって化学的に結合することにより形成された複合体を記載する。所望のＰＥＧ複合体を回収するために、溶媒抽出法およびクロマトグラフィー精製がそれにより必要とされた。そのようにすることによって、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製の後にラパマイシン４２−ヨードアセテートが５５％の収率で調製された。
【０００７】
水溶性ＰＥＧ−タクロリムス（ＦＫ５０６）複合体の調製は、同様の手順を用いる国際特許公開第ＷＯ９９／０３８６０号に考察されている。これらの手順の主な欠点の１つは、ラパマイシン／タクロリムス骨格中に複数のＯＨ官能基が存在するために、エステル結合の樹立(installation)の選択性が低いことである。その上、ペグ化中に炭酸水素ナトリウム水溶液を塩基として使用することにより、いくつかの副生成物が生じ、低または中程度の回収収率の複数の精製段階を必要とする。
【０００８】
エベロリムスの合成は、米国特許第６，４４０，９９０号に記載され、ＰＥＧ−エベロリムス（ＩＩ）の合成は、米国特許第６，３３１，５４７号に記載されている。これらの米国特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当分野で必要とされるものは、マクロライド免疫抑制剤の水溶性ポリ（エチレングリコール）複合体を調製するための代わりとなるプロセスである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、免疫抑制性マクロライドのポリエチレングリコール複合体を調製するためのプロセスが提供される。
【００１１】
別の態様では、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、タクロリムスおよびアスコマイシンのポリエチレングリコール複合体を調製するためのプロセスが提供される。
【００１２】
本発明のその他の態様および利点は、以下のその好ましい実施形態の詳細な説明においてさらに説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ラパマイシン（ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス；タクロリムス；またはアスコマイシンを含む）とのポリエチレングリコール複合体を高い収率で調製するための新規で有効なプロセスが提供される。本プロセスには、簡単な単離段階が含まれ、それは完全な位置選択性のリパーゼを用いるこれらのマクロライドにおけるエステル結合の樹立および優れた収率のペグ化複合体を軸とする。
【００１４】
本明細書において用いられる場合、ポリエチレングリコール、略して（ＰＥＧ）は、各末端にヒドロキシル基を有する線状ポリマーである。
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
この式はＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表すことができ、この場合、−ＰＥＧ−は末端基を含まないポリマー主鎖を表すことが理解される。
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−
ポリエチレングリコールにはまた、モノ活性化、アルキル末端ポリエチレングリコール、例えばメトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧＯＨ）が含まれ得る。
ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
（式中、一方の末端は不活性メトキシ基であるが、もう一方の末端は化学修飾のできる状態のヒドロキシル基である）。一実施形態では、活性化ｍＰＥＧの末端はメトキシ−ＰＥＧ−ＳＨ（ｍＰＥＧＳＨ）である。
ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ
別の実施形態では、ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ（ＰＥＧＳＨ）などの、ビス活性化、チオール末端ポリエチレングリコール：
ＨＳ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ
が含まれ得るポリエチレングリコールもまたそのような目的に企図される。
【００１５】
ポリエチレングリコールは実質的に分子量によって異なるが、分子量が約４００〜約３０，０００の範囲のポリマーが通常選択される。一例では、約１０００〜約３０，０００の分子量のポリエチレングリコールが選択される。別の例では、約２５００〜約２０，０００の分子量のポリエチレングリコールが選択される。さらなる例では、約５０００〜約２０，０００の分子量のポリエチレングリコールが選択される。これらの式において、ｎは、典型的には１０〜１０００の範囲内の整数であることは、当業者は容易に理解する。
【００１６】
本明細書において定義される「ラパマイシン」とは、ラパマイシンおよびラパマイシン核の誘導体として化学的または生物学的に修飾されるが、なお生物学的活性を保持し得る化合物を指す。従って、用語「ラパマイシン」には、ラパマイシンのエステル、エーテル、カルボネート、カルバメート、オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミン、ならびにその核上の官能基が、例えば還元または酸化によって修飾されているラパマイシンが含まれる。また、用語「ラパマイシン」には、酸性または塩基性部分を含むことによってそのような塩を形成することのできるラパマイシンの製薬上許容される塩も含まれる。
【００１７】
一実施形態では、ラパマイシンのエステルおよびエーテルは、ラパマイシン核の３１位のヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、（２７位のケトンの化学的還元後の）２７位のヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、４２位のヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、特にラパマイシンの４２位のヒドロキシル基のヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキルアリールエステルまたはエーテルである。オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンは、ラパマイシン核のケトンのものである。
【００１８】
他の実施形態では、ラパマイシンの３１−エステルおよびエーテルは以下の特許に記載されている。アルキルエステル（米国特許第４，３１６，８８５号）；アミノアルキルエステル（米国特許第４，６５０，８０３号）；フッ素化エステル（米国特許第５，１００，８８３号）；アミドエステル（米国特許第５，１１８，６７７号）；カルバメートエステル（米国特許第５，１１８，６７８号；同第５，４４１，９６７号；同第５，４３４，２６０号；同第５，４８０，９８８号；同第５，４８０，９８９号；および同第５，４８９，６８０号）；シリルエーテル（米国特許第５，１２０，８４２号）；アミノエステル（米国特許第５，１３０，３０７号）；アセタール（米国特許第５，５１，４１３号）；アミノジエステル（米国特許第５，１６２，３３３号）；スルホネートおよびスルフェートエステル（米国特許第５，１７７，２０３号）；エステル（米国特許第５，２２１，６７０号）；アルコキシエステル（米国特許第５，２３３，０３６号）；Ｏ−アリール、−アルキル、−アルケニルおよび−アルキニルエーテル（米国特許第５，２５８，３８９号）；カルボネートエステル（米国特許第５，２６０，３００号）；アリールカルボニルおよびアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第５，２６２，４２３号）；カルバメート（米国特許第５，３０２，５８４号）；ヒドロキシエステル（米国特許第５，３６２，７１８号）；ヒンダードエステル（米国特許第５，３８５，９０８号）；複素環エステル（米国特許第５，３８５，９０９号）；ｇｅｍ二置換エステル（米国特許第５，３８５，９１０号）；アミノアルカン酸エステル（米国特許第５，３８９，６３９号）；ホスホリルカルバメートエステル（米国特許第５，３９１，７３０号）；アミノカルバメートエステル（米国特許第５，４６３，０４８号）；ヒンダードＮ−オキシドエステル（米国特許第５，４９１，２３１号）；ビオチンエステル（米国特許第５，５０４，０９１号）；およびＯ−アルキルエーテル（米国特許第５，６６５，７７２号）。これらのエステルおよびエーテルの調製は上記に列挙した特許に記載されている。
【００１９】
さらにその他の実施形態では、ラパマイシンの２７−エステルおよびエーテルが米国特許第５，２５６，７９０号において考察されている。これらのエステルおよびエーテルの調製は上記に列挙した特許に記載されている。
【００２０】
さらにその他の実施形態では、ラパマイシンの４２−ヒドロキシアルキル、４２−ヒドロキシアルケニル、４２−ヒドロキシアルキルアリールエーテルが米国特許第６，４４０，９９０号；同第５，６６５，７７２号；および同第５，２５８，３８９号に開示されている。ラパマイシンの４２−ヒドロキシアルキル、４２−ヒドロキシアルケニル、４２−ヒドロキシアルキルアリールエステルは米国特許第５，３６２，７１８号に開示されている。これらのエステルおよびエーテルの調製は上記に列挙した特許に記載されている。
【００２１】
一実施形態では、免疫抑制性マクロライドはシキミ酸由来シクロヘキシル領域を含む。一例では、免疫抑制性マクロライドはラパマイシン、タクロリムスまたはアスコマイシンである。
【００２２】
別の実施形態では、免疫抑制性マクロライドはラパマイシンであり、下記構造：
【化１１】
（式中、Ｒ１は、Ｈ、ならびにアルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルの中から選択され；Ｒ２は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルの中から選択され；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ３１の中から選択され；Ｒ３１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルの中から選択され；Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルの中から選択され；Ｒ５は、Ｈ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシアラルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ５１の中から選択され；かつ、Ｒ５１は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアリールおよびヒドロキシアラルキルの中から選択される）
を有するものである。
【００２３】
「ラパマイシン」の例としては、制限されないが、ラパマイシン（米国特許第３，９２９，９９２号）、３２−デスメチルラパマイシン、３２−デスメトキシラパマイシン、４１−デスメチルラパマイシン、４１−デスメトキシラパマイシン（国際特許公開第ＷＯ−２００４／００７７０９号）、７，３２−ビス−デスメチルラパマイシン、プロリン−ラパマイシン、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９、米国特許第５，３６２，７１８号）および４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン（エベロリムス、ＲＡＤ００１、米国特許第５，６６５，７７２号）が挙げられる。
【００２４】
従って、本明細書に記載されるプロセスは、免疫抑制性マクロライドのポリエチレングリコール複合体の調製を提供する。本プロセスには、リパーゼの存在下、アシル化剤とシキミ酸由来シクロヘキシル領域を有する免疫抑制性マクロライドを反応させて、アシル化されたマクロライドを形成することが含まれる。アシル化されたマクロライドを次に塩基の存在下でメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体と反応させる。一実施形態では、免疫抑制性マクロライドはラパマイシン化合物である。
【００２５】
一実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造：
【化１２】
（式中、Ｒ１は、Ｈ、ならびにアルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルの中から選択され；Ｒ２は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルの中から選択され；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒ３１であり；Ｒ３１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルの中から選択され；Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルの中から選択され；Ｘは、酸素（−Ｏ−）、−Ｏ−アルキル−Ｏ−、−Ｏ−アルケニル−Ｏ、−Ｏ−アリール−Ｏ−、−Ｏ−アリールアルキル−Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７の中から選択され；Ｒ７は、−アルキル−Ｏ−、−アルケニル−Ｏ−、−アリール−Ｏ−および−アリールアルキル−Ｏ−の中から選択され；ｎは１０〜１０００の整数であり；かつ、ＸはＯまたはＳである）を有するものである。
【００２６】
さらなる実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造（Ｉ）：
【化１３】
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
を有するものである。
【００２７】
別の実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造（ＩＩ）：
【化１４】
（式中、Ｘおよびｎは上記に定義されるとおりである）
を有するものである。
【００２８】
さらに別の実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造（ＩＩＩ）：
【化１５】
（式中、Ｘおよびｎは上記に定義されるとおりである）
を有するものである。
【００２９】
さらに別の実施形態では、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、下記構造（ＩＶ）：
【化１６】
（式中、Ｘおよびｎは上記に定義されるとおりである）
を有するものである。
【００３０】
本プロセスは、ラパマイシン化合物以外のイムノフィリンとのＰＥＧ複合体を調製するためにも有用である。イムノフィリンは、ラパマイシン化合物の４２−ＯＨ官能基に類似するシキミ酸由来シクロヘキシル領域を含有し、それには、制限されないが、ＦＫ５０６関連天然物が含まれる。
【００３１】
本明細書において、用語「ＦＫ５０６関連天然物」とは、下記コア構造：
【化１７】
（式中、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、独立して、Ｈまたはアルキルであり；Ｒはエチルまたはアリルである）
を有する化合物を指す。一例では、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、Ｍｅであり；ＲはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。別の例では、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、Ｍｅであり；ＲはＣＨ２ＣＨ３である。
【００３２】
本明細書において使用される用語「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０）、例えば、１〜８個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）、１〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６）あるいは１〜４個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）を有する、直鎖および分岐鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を指す。用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合と、２〜８個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）、２〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６）あるいは２〜４個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）を含む、直鎖および分岐鎖両方のアルキル基を指す。用語「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合と、２〜８個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８、２〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６）あるいは２〜４個の炭素原子（例えば、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４）を含む、直鎖および分岐鎖両方のアルキル基を指す。
【００３３】
本明細書において使用される用語「アリール」は、融合または結合した環の少なくとも一部が共役芳香族系を形成するように一緒に融合または結合した単一の環または複数の芳香環であり得る炭素環式芳香族系を指す。アリール基としては、限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、テトラヒドロナフチル、フェナントリルおよびインダンが挙げられる。
【００３４】
用語「アリールアルキル」とは、アリール基で置換されているアルキル基を指す。アルキル基は、その結合が安定な化学結合を構成するならば、アリール基のどのポイントに位置していてもよい。
【００３５】
本明細書において使用される用語「アラルキル」とは、アルキル基上の任意の炭素原子と結合しているアリール基を有するアルキル基を指す。
【００３６】
用語「ヒドロキシアルキル」、「ヒドロキシアルケニル」、「ヒドロキシアリール」および「ヒドロキシアラルキル」とは、このように、その結合が安定な化学結合を構成するならば、アルキル、アルケニル、アリールまたはアラルキル基の任意の炭素原子と結合している−ＯＨ基を有するアルキル、アルケニル、アリールおよびアラルキル基を指す。
【００３７】
用語「ハロゲン」とは、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦまたはＩを指す。
【００３８】
一実施形態では、ＦＫ５０６関連天然物複合体は、下記式（Ｖ）の構造：
【化１８】
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
を有するＰＥＧ−タクロリムスである。
【００３９】
別の実施形態では、ＦＫ５０６関連天然物複合体は、下記式（ＶＩ）の構造：
【化１９】
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
を有するＰＥＧ−アスコマイシンである。
【００４０】
従って、一実施形態では、式Ｉの水溶性複合体を調製するためのプロセスが提供される（下記スキーム１を参照）。
【化２０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は上記に定義されているものである）。
【００４１】
別の実施形態では、下記スキーム２に概説されるように、２段階シーケンスによる、式（Ｉ）で表される水溶性ＰＥＧ−ラパマイシン複合体を調製するためのプロセスが提供される。
【化２１】
（式中、ＸはＳまたはＯであり；Ｙはハロゲンなどの脱離基であり；かつ、Ｒ６はＨまたはメチルである）。
【００４２】
スキーム１および２から分かるように、ラパマイシン複合体は、メトキシポリエチレングリコールが４２位の位置でエステルリンカーによってラパマイシンと結合しているエステルの形態である。当分野の方法と対照的に、本明細書に記載されるこの活性化ラパマイシン４２−エステル誘導体の合成は、リパーゼに触媒されるラパマイシンと、下記一般式：
【化２２】
（式中、Ｒ６はＨまたはＣＨ３であり；Ｙは脱離基である）
を有する活性化エステル（Ａ）のアシル化を介して達成される。
【００４３】
脱離基の例としては、限定されるものではないが、ハロゲンおよびスルホネート、例えばメタンスルホネート（メシレート、ＭｓＯ）およびｐ−トルエンスルホネート（トシレート、ＴｓＯ）などが挙げられる。一実施形態では、脱離基はハロゲン、例えばＩ、ＢｒまたはＣｌなどである。別の実施形態では、活性化エステルは２−ハロ酢酸のビニルエステルである（Ｒ６＝ＣＨ３）。さらなる実施形態では、活性化エステルはブロモ酢酸のビニルエステルである。その他の２−ハロ酢酸の活性化エステル、例えばイソプロペニルエステル（Ｒ６＝ＣＨ３）、オキシムエステル、トリクロロエチルまたはトリフルオロエチルエステルなどは当業者に公知であり、本明細書に包含される。
【００４４】
本明細書に記載される本プロセスの利点は、ラパマイシンのアシル化されたラパマイシン（ＶＩＩ）への変換が、ほぼ定量的収率で行われ得ることである。望ましくは、アシル化されたラパマイシン（ＶＩＩ）は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より大きな収率で調製される。
【００４５】
多様なリパーゼを利用することができる。一実施形態では、リパーゼは微生物リパーゼ、すなわち加水分解およびエステル結合の形成を触媒する、微生物起源のリパーゼである。微生物リパーゼとしては、例えば、カンジダ・アンタークティカ(Candida antarctica)、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、リゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)およびアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)が挙げられる。しかし、本明細書における使用のために選択されたリパーゼは、元の供給源から直接に単離および精製される必要はなく、合成によってまたは組換えによって、あるいはその他の適した手段によって調製することができる。多様なこれらの酵素は一部の商業的供給源から入手でき、さらに、これらの酵素調製物は、様々な供給者による異なる商品名の異なる微生物起源からの未精製物、部分精製物、精製物または固定化物として使用することができる。
【００４６】
一実施形態では、カンジダ・アンタークティカ由来のＢ型リパーゼが利用される。Ｃ．アンタークティカリパーゼは、例えば、Ｎｏｖｏ ＳＰ４３（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３（商標）(Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）またはＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２（商標）(Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ）の製品名で市販されている。別の実施形態では、シュードモナス・セパシア由来のリパーゼが使用される。シュードモナス・セパシアは、例えば、リパーゼＰＳ（天野エンザイム株式会社）の製品名で市販されている。望ましくは、酵素は固定化された形態で使用される。一実施形態では、固定化されたリパーゼは、リパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩ（商標）またはリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」Ｉ（商標）(天野エンザイム株式会社）である。別の実施形態では、固定化されたリパーゼは、リパーゼＰＳ−Ｄ「Ａｍａｎｏ」Ｉ（商標）(天野エンザイム株式会社）である。
【００４７】
リパーゼは効果的な触媒量で、すなわち、アシル化を妥当な速度で効果的に触媒する量で使用される。当業者には、酵素が（ラパマイシンまたはＦＫ５０６／ＦＫ５２０の量に対して）約２０〜約８００重量％の量で使用され得ることが理解される。一実施形態では、酵素は約２５〜約５００重量％の量で使用される。別の実施形態では、酵素は約５０〜約２５０重量％の量で使用される。さらなる実施形態では、酵素は約７５〜約１５０重量％の量で使用される。
【００４８】
反応は典型的には有機溶媒中で実施される。適した溶媒としては、限定されるものではないが、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、エチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、メチレンクロライド（ＣＨ２Ｃｌ２）、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジ−イソプロピルエーテル（ｉＰｒ２Ｏ）、ヘキサン、ジオキサンまたはこれらの溶媒を含む混合物が挙げられる。一実施形態では、ＴＢＭＥが使用される。当業者であれば、溶媒が、初めに出発ラパマイシンの全てまたは一部を効果的に溶解し、妥当な速度で反応を進行させることのできる量で使用されることを理解する。例えば、溶媒、例えばＴＢＭＥなどは、少なくとも４重量容積（すなわち、ラパマイシンの量の４倍（４×）過剰な容積）から約１０重量容積の量で用いることができる。一例では、溶媒は約５〜８重量容積の量（すなわちラパマイシンの量の５〜８倍過剰な容積）で用いられ得る。
【００４９】
ＴＢＭＥは、ラパマイシン化合物を分解し得る残留水（例えば、約０.０５％）を含み得る。この副反応を最小限にするために、少量の水分が反応系中で維持される。一実施形態では、無水ＴＢＭＥはリパーゼ触媒の標準的な市販調製品とともに使用される。別の実施形態では、水分は、乾燥剤を添加することによりリパーゼ溶液中に存在する水の量を調節することによって制御され得る。さらに別の実施形態では、モレキュラーシーブを用いて水分を制御することができる。モレキュラーシーブは反応を遅くするので、補償するためにより多くの酵素を添加するか、または長い反応時間を用いることができる。一実施形態では、５Åモレキュラーシーブが使用される。しかし、限定されるものではないが、４Åおよび３Åを含むその他のシーブサイズが容易に使用され得る。適したモレキュラーシーブスは多様な商業的供給源から入手可能である。さらに別の実施形態では、乾燥剤、例えば、数ある中でＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４が、含水量を制御するために使用され得る。
【００５０】
アシル化反応は、望ましくない副生成物の形成を低減するために十分低いが、不当に長い反応時間を必要としない程度までの低い温度で行われる。一実施形態では、アシル化は、約２０〜約５５℃で行われる。別の実施形態では、アシル化反応は、約２５〜５０℃で行われる。さらなる実施形態では、アシル化反応は、約３５〜４５℃で行われる。
【００５１】
一実施形態では、アシル化は、無水ＴＢＭＥ中でラパマイシン、ビニルブロモアセテートおよびリパーゼＰＳ−Ｃ「Ａｍａｎｏ」ＩＩ（商標）(ラパマイシンとして１００％ ｗ／ｗ)を合わせることにより行われる。この混合物を窒素下で４０℃にて約８時間、または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬＣでモニターしてラパマイシン出発物質が消失するまで過熱する。濾過により酵素を除去した後、ラパマイシン４２−ブロモアセテートがほぼ定量的収率で得られた。
【００５２】
一度エステルリンカーが導入されると、次の段階にはＰＥＧ分子とこの活性化ラパマイシンアセテート（ＶＩＩ）との結合が含まれる。ペグ化は、非求核性塩基の存在下、有機溶媒中、（ＶＩＩ）と、一般式ＨＸ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ３（Ｂ）（式中、Ｘおよびｎは上記に定義されるとおりである）を有するメトキシポリエチレン誘導体を反応させることにより達成された。
【００５３】
本明細書において、用語「非求核性塩基」とは、求核性を有さない塩基として機能する化合物を指す。望ましくは、非求核性塩基は他の化合物およびペグ化の試薬と反応しない。多様な非求核性塩基が当業者に公知である。例えば、Richard C. Larock, in 「Comprehensive Organic Transformation」, 2nd edition, 1999を参照のこと。一実施形態では、非求核性塩基は第三級アミンである。一例では、第三級アミンは脂肪族アミンである。別の例では、第三級アミンは芳香族アミンである。さらなる例では、第三級アミンはトリアルキルアミン、例えばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどである。
【００５４】
ペグ化において有用な、適した溶媒としては、限定されるものではないが、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨＣｌ３、ジオキサン、ジメチルホルムアミド(dimethylforamide)（ＤＭＦ）またはこれらの溶媒を含む混合物が挙げられる。一実施形態では、ＭｅＣＮは溶媒である。
【００５５】
ＰＥＧ−ラパマイシン複合体は、数ある中でも、沈殿、抽出、濾過を含む、当業者に周知の手順を用いて単離することができる。
【００５６】
従って、一実施形態では、ラパマイシン４２−ブロモアセテートとｍＰＥＧチオール（ＭＷ約５０００）を、アセトニトリル中、ジイソプロピルエチルアミンを用いて一定時間処理した。そのようにすることにより、イソプロパノールを反応混合物に添加することによる単純な沈殿の後、所望のＰＥＧ−ラパマイシン複合体（Ｉ）を優れた収率で得ることができる。
【００５７】
別の実施形態では、スキーム３に概説される２段階シーケンスによる、式（ＩＩ）で表される水溶性ＰＥＧ−エベロリムス（４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン、ＲＡＤ００１）複合体を調製するための方法が提供される。ＰＥＧ−エベロリムス複合体（ＩＩ）は、ＰＥＧ−ラパマイシン複合体（Ｉ）について記載されるものと同様の方法で調製され得る。要約すれば、反応は、式（Ａ）のアシル化剤を用いるリパーゼ触媒アシル化により得られる中間体（ＶＩＩＩ）を経て行われる。次に、上に記載される有機溶媒中、非求核性塩基の存在下で化合物（ＶＩＩＩ）を式（Ｂ）のメトキシポリエチレン誘導体と反応させる。一例では、非求核性塩基はトリアルキルアミンである。別の例では、有機溶媒はアセトニトリルである。化合物ＩＩはそれにより優れた収率で、かつ、さらなる精製を必要としないほど高い純度で調製される。
【化２３】
【００５８】
別の実施形態では、同様の２段階シーケンスによる、式（ＩＩＩ）、(ＩＶ)またはそれらの組合せで表される水溶性ＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体を調製するためのプロセスが提供される。スキーム４を参照のこと。ＣＣＩ−７７９分子の４２位のエステル側鎖中の一方または両方のＯＨ基は、スキーム３に記載されるように、リパーゼにより触媒される式（Ａ）のアシル化剤でアシル化され得る。モノアシル化生成物（ＩＸ）とビスアシル化生成物（Ｘ）の比は、リパーゼの量、ビニルエステル（Ａ）の量、反応時間および温度を変更することにより変えることができる。さらに、式（ＩＸ）および（Ｘ）の化合物は、クロマトグラフィーを用いて混合物からそれぞれ分離することができる。化合物（ＩＸ）および（Ｘ）は、次に、別々に使用されて対応するＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）が調製され得る。あるいは、化合物（ＩＸ）および（Ｘ）は混合物として保持されてもよく、その混合物は対応するＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を調製するために使用される。
【００５９】
ＰＥＧ−複合体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の調製は、上記の有機溶媒中、上記の非求核性塩基の存在下、化合物（ＩＸ）および（Ｘ）と式（Ｂ）のメトキシポリエチレン誘導体を反応させることにより行われた。一例では、非求核性塩基はトリアルキルアミンである。別の例では、有機溶媒はアセトニトリルである。そのようにすることにより、複合体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）は、それぞれ、優れた収率で、かつ、さらなる精製を必要としないほど高い純度で調製され得る。
【化２４】
【００６０】
さらに別の実施形態では、式（Ｖ）および（ＶＩ）で表される水溶性ＰＥＧ−タクロリムスおよびＰＥＧ−アスコマイシン複合体を別々に調製するための方法が提供される。スキーム５に記載されるように、それぞれの３２−エステル化中間体（ＸＩ）は、リパーゼの存在下、タクロリムス（ＦＫ５０６）またはアスコリムス(ascolimus)（ＦＫ５２０）を式（Ａ）のアシル化剤を用いて位置特異的な方法で、優れた収率でアシル化することにより得ることができる。その後の上記有機溶媒中、上記非求核性塩基の存在下での、（ＸＩ）の式（Ｂ）のメトキシポリエチレン誘導体での処理により、式（Ｖ）のＰＥＧ−タクロリムス複合体または式（ＶＩ）のＰＥＧ−アスコリムス複合体が、それぞれ優れた収率かつ高純度で得られた。一例では、非求核性塩基はトリアルキルアミンである。別の例では、有機溶媒はアセトニトリルである。
【化２５】
【００６１】
本明細書に記載される経路は、米国特許第５，９５５，４５７号；同第６，３３１，５４７号；同第５，７８０，４６２号；および同第６，４３２，９７３号ならびに国際特許公開第ＷＯ９９／０３８６０号に公開されている合成手順よりも明確な利点をいくつか提供する。これらの利点には、余計な精製段階を必要としない処理の容易さと、より高い全収率が含まれる。これは、エステルリンカーを位置特異的に導入するための触媒としてリパーゼを使用することにより達成される。また、高い収率は、その後の共役反応において、出発物質および生成物を分解する無機塩基、例えば重炭酸ナトリウムなどを使用する代わりに、有機塩基、例えばトリアルキルアミンなどを使用することに起因する。例えば、米国特許第５，９５５，４５７号に記載される合成経路は、４２−ペグ化されたラパマイシンを２回のＨＰＬＣ精製後に５０％未満の収率で供給するのに対し、本明細書に記載の本プロセスは、精製の必要なく、ほぼ定量的収率で生成物を供給する。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の限定するものではない。Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５は、アクリル樹脂上に固定化されているカンジダ・アンタークティカリパーゼＢの商標である。
【００６３】
実施例１ − ラパマイシン４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）を経由するＰＥＧ−ラパマイシン複合体（Ｉ）の調製
【化２６】
【００６４】
Ａ．ラパマイシン４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）の調製
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（８ｍＬ）中、ラパマイシン（９１４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ビニルブロモアセテート（６６０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、５Åモレキュラーシーブス（１００ｍｇ）およびＮｏｖｏｚｙｍ４３５（商標）リパーゼ（１．０ｇ）の混合物をＮ２下で４０℃にて８時間加熱した。酵素を濾過により除去し、ＴＢＭＥで洗浄した。混合物を濃縮し、ヘキサンに沈殿させた。ラパマイシン４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）を濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：１．０１ｇ（９８％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ １０３５（Ｍ−）
【００６５】
Ｂ．ＰＥＧ−ラパマイシン複合体（Ｉ）の調製
ｍＰＥＧＳＨ（５００ｍｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（１．５ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１７ｍｇ）、続いてラパマイシン４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）（９５ｍｇ）を添加した。次に、混合物を室温にて３時間攪拌した。２−プロパノール（１８ｍＬ）を添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。沈殿したペグ化ラパマイシンを濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：５５０ｍｇ（９５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２.８４（ｔ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２）、３．２７（ｓ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ）、３．３６（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）、４．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４２）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）ｍ／ｚ ５８７７.４７（平均ＭＷ）。
【００６６】
実施例２ − エベロリムス４２−ブロモアセテート（ＶＩＩＩ）を経由するＰＥＧ−エベロリムス複合体（ＩＩ）の調製
【化２７】
【００６７】
Ａ．エベロリムス４２−ブロモアセテート（ＶＩＩＩ）の調製
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（３ｍＬ）中、エベロリムス（２５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ビニルブロモアセテート（１６５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、５Åモレキュラーシーブス（２０ｍｇ）およびＮｏｖｏｚｙｍ４３５（商標）リパーゼ（２００ｍｇ）の混合物をＮ２下で３５℃にて１０時間加熱した。酵素を濾過により除去し、ＴＢＭＥで洗浄した。混合物を濃縮し、ヘキサンでトリチュレートした。エベロリムス４２−ブロモアセテート（ＶＩＩＩ）を濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：２７５ｍｇ（９６％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ １０７８（Ｍ−）
【００６８】
Ｂ．ＰＥＧ−エベロリムス複合体（ＩＩ）の調製
ｍＰＥＧＳＨ（５００ｍｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（１．５ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１８ｍｇ）、続いてエベロリムス４２−ブロモアセテート（ＶＩＩ）（１１０ｍｇ）を添加した。次に、混合物を室温にて３時間攪拌した。２−プロパノール（１８ｍＬ）を１０分間にわたり添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。白色の粉末を濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：５３０ｍｇ（８７％）。
【００６９】
実施例３ − ＣＣＩ−７７９モノ−ブロモアセテート（ＩＸ）およびＣＣＩ−７７９ビス−ブロモアセテート（Ｘ）の調製
【化２８】
【００７０】
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（１３０ｍＬ）中、ＣＣＩ−７７９（７．０ｇ、６．８ｍｍｏｌ）、ビニルブロモアセテート（４．０ｇ、２４．２４ｍｍｏｌ）、５Åモレキュラーシーブス（２．０ｇ）およびＮｏｖｏｚｙｍ４３５（商標）リパーゼ（１．３ｇ）の混合物を、室温にてＮ２下で８時間攪拌した。ＨＰＬＣは、反応混合物が６４％モノ−ブロモアセテート、２０％ビス−ブロモアセテートおよび１２％ＣＣＩ−７７９出発物質を含有することを示した。酵素を濾過により除去し、ＴＢＭＥで洗浄した。混合物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。少ないほうの極性画分にビス−ブロモアセテート（Ｘ）が含まれ、それを回収した（１．４１ｇ）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ １３１７（Ｍ＋４５）−。多い方の極性画分にはモノ−ブロモアセテート（ＩＸ）（４．５６ｇ）が含有され、それを次に白色の粉末として単離した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ １１９６（Ｍ＋４５）−。
【００７１】
実施例４ − ＰＥＧ−ＣＣＩ７７９複合体（ＩＩＩ）の調製
【化２９】
【００７２】
ｍＰＥＧＳＨ（２０．０ｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（４５ｍＬ）溶液に、実施例３で調製したように、ジイソプロピルエチルアミン（７２２ｍｇ、５．６ｍｍｏｌ）、続いてＣＣＩ−７７９モノブロモアセテート（ＩＸ）（４．６０ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。次に、混合物を室温にて４時間攪拌した。２−プロパノール（５４０ｍＬ）を１０分間にわたり添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。ＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＩＩ）を白色の粉末として濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：２０．３ｇ（８３％）。
【００７３】
実施例５ − ＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＶ）の調製
【化３０】
【００７４】
ｍＰＥＧＳＨ（３．０ｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（９ｍＬ）溶液に、実施例３で調製したように、ジイソプロピルエチルアミン（１０１ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）、続いてＣＣＩ−７７９ビスブロモアセテート（Ｘ）（４１４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。次に、混合物を室温にて４時間攪拌した。２−プロパノール（１０８ｍＬ）を１０分間にわたり添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。ＰＥＧ−ＣＣＩ−７７９複合体（ＩＶ）を白色の粉末として回収し、真空乾燥させた。収量：３．２５ｇ（９６％）。
【００７５】
実施例６： タクロリムス３２−ブロモアセテート（ＸＩ）を経由するＰＥＧ−タクロリムス複合体（Ｖ）の調製
【化３１】
【００７６】
Ａ．タクロリムス３２−ブロモアセテート（ＸＩ）の調製
無水ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（０．２ｍＬ）中、タクロリムス（１０ｍｇ）、ビニルブロモアセテート（２０ｍｇ）およびＮｏｖｏｚｙｍ４３５（商標）リパーゼ（２０ｍｇ）の混合物をＮ２下で４０℃にて１２時間加熱した。酵素を濾過により除去し、ＴＢＭＥで洗浄した。濾液をシリカゲルパッドに通し、ヘキサン−アセトン（３：１）で洗浄した。タクロリムス３２−ブロモアセテートを回収し、真空乾燥させた。収量：１０．５ｍｇ（９１％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ９２４（Ｍ−）
【００７７】
Ｂ．ＰＥＧ−タクロリムス複合体（Ｖ）の調製
ｍＰＥＧＳＨ（２５ｍｇ、ＭＷ＝５０００）のＭｅＣＮ（０.１ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１ｍｇ）、続いてタクロリムス３２−ブロモアセテート（５ｍｇ）を添加した。次に、混合物を室温にて３時間攪拌した。２−プロパノール（１.５ｍＬ）を添加し、混合物を１０〜１５℃まで冷却し、３０分間維持した。沈殿したＰＥＧ−タクロリムス複合体（Ｖ）を濾過により回収し、真空乾燥させた。収量：２４ｍｇ（８０％）。
【００７８】
本明細書に引用されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は特定の実施形態を参照して説明されたが、本発明の精神を逸脱することなく変更がなされ得ることは当然理解される。そのような変更は添付の特許請求の範囲内にあるものと意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制性マクロライドのポリエチレングリコール複合体を調製するためのプロセスであって、
（ａ）リパーゼの存在下、アシル化剤とシキミ酸由来シクロヘキシル領域を有する免疫抑制性マクロライドを反応させて、アシル化されたマクロライドを形成する段階と；
（ｂ）塩基の存在下、アシル化されたマクロライドとメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体またはチオール末端ポリ（エチレングリコール）誘導体を反応させる段階とを含む、プロセス。
【請求項２】
免疫抑制性マクロライドがラパマイシンであり、前記ラパマイシンが４２位で位置特異的にアシル化されている、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
免疫抑制性マクロライドが、下記構造：
【化１】
（式中、Ｒ１は、Ｈ、ならびにアルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ３１からなる群より選択され；
Ｒ３１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルからなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシアラルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ５１からなる群より選択され；かつ
Ｒ５１は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアリールおよびヒドロキシアラルキルからなる群より選択される）
のものである、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項４】
免疫抑制性マクロライドが４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシンである、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項５】
免疫抑制性マクロライドがＣＣＩ−７７９である、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項６】
免疫抑制性マクロライドが、タクロリムスおよびアスコマイシンからなる群より選択され、前記タクロリムスおよび前記アスコマイシンが３２位で位置特異的にアシル化されている、請求項１記載のプロセス。
【請求項７】
前記免疫抑制性マクロライドが、下記構造：
【化２】
（式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、独立して、Ｈまたはアルキルであり；Ｒはエチルまたはアリルである）
のものである、請求項１または６記載のプロセス。
【請求項８】
下記式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖおよび式ＶＩ：
【化３】
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
からなる群より選択されるペグ化された免疫抑制性マクロライドを調製するためのプロセスであって、
（ａ）リパーゼの存在下、マクロライドとアシル化剤を反応させてアシル化されたマクロライドを形成する段階を含み、前記アシル化剤が、下記構造：
【化４】
（式中、Ｒ６はＨまたはＣＨ３であり；Ｙは脱離基である）のものであり；かつ
（ｂ）塩基の存在下、アシル化されたマクロライドとメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体を反応させる段階を含み、前記メトキシポリ（エチレングリコール）誘導体が、下記構造：
ＨＸ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ３
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
のものである、
前記プロセス。
【請求項９】
前記リパーゼが、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、カンジダ・アンタークティカ(Candida antarctica)、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)またはリゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)を含む微生物由来の微生物リパーゼである、請求項１から８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
前記リパーゼが、カンジダ・アンタークティカ由来である、請求項１から９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
前記リパーゼが、固定化されたカンジダ・アンタークティカＢ型（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）である、請求項１から１０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
前記リパーゼが、シュードモナス・セパシア由来のリパーゼＰＳである、請求項１から９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
前記リパーゼが、酵素が珪藻土またはセラミック担体上に固定化されている、シュードモナス・セパシア由来の固定化されたリパーゼＰＳ−Ｃ、例えば、Ａｍａｎｏ ＩＩ（商標）リパーゼまたはリパーゼＰＳ−Ｄ Ａｍａｎｏ Ｉ（商標）リパーゼである、請求項１から９または１２のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１４】
段階（ａ）が、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メチレンクロライド、クロロホルム、ヘキサン、ジオキサンおよびそれらの混合物からなる群より選択される有機溶媒中で行われる、請求項１から８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１５】
段階（ａ）が、２０〜７０℃にて行われる、請求項１から１４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１６】
段階（ａ）が、モレキュラーシーブスの使用をさらに含む、請求項１から１５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１７】
段階（ａ）が、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中４０℃にて行われ、前記アシル化剤がビニルブロモアセテートであり、前記リパーゼが固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）であり、かつ、前記モレキュラーシーブスが５Åモレキュラーシーブスである、請求項１６記載のプロセス。
【請求項１８】
Ｙが、Ｉ、ＢｒまたはＣｌである、請求項８から１７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１９】
アシル化剤がビニルブロモアセテートである、請求項１から１８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２０】
段階（ｂ）中の前記塩基が第三級アミンである、請求項１から１９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２１】
前記第三級アミンが脂肪族または芳香族である、請求項２０記載のプロセス。
【請求項２２】
前記第三級アミンがトリアルキルアミンである、請求項２０記載のプロセス。
【請求項２３】
前記塩基がジイソプロピルエチルアミンである、請求項１から１９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２４】
前記メトキシポリ（エチレングリコール）誘導体がメトキシポリ（エチレングリコール）チオール化合物である、請求項８から２３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２５】
前記メトキシポリ（エチレングリコール）チオールの平均分子量が４００〜３００００である、請求項２４記載のプロセス。
【請求項２６】
前記メトキシポリ（エチレングリコール）チオールの平均分子量が５０００である、請求項２５記載のプロセス。
【請求項２７】
下記構造：
【化５】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたラパマイシンを調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、ラパマイシンとビニルブロモアセテートを反応させてアシル化されたラパマイシンを形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたラパマイシンと平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項２８】
下記構造：
【化６】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたエベロリムスを調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、エベロリムスとビニルブロモアセテートを反応させてアシル化されたエベロリムスを形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたエベロリムスと平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項２９】
下記構造：
【化７】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたＣＣＩ−７７９を調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、ＣＣＩ−７７９とビニルブロモアセテートを反応させてモノアシル化またはビスアシル化されたＣＣＩ−７７９を形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたＣＣＩ−７７９と平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項３０】
下記構造：
【化８】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたタクロリムスを調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、タクロリムスとビニルブロモアセテートを反応させてアシル化されたタクロリムスを形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたタクロリムスと平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項３１】
下記構造：
【化９】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたタクロリムスを調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、タクロリムスとビニルブロモアセテートを反応させてアシル化されたタクロリムスを形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたタクロリムスと平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれかに記載のプロセスにより調製される、生成物。
【請求項１】
免疫抑制性マクロライドのポリエチレングリコール複合体を調製するためのプロセスであって、
（ａ）リパーゼの存在下、アシル化剤とシキミ酸由来シクロヘキシル領域を有する免疫抑制性マクロライドを反応させて、アシル化されたマクロライドを形成する段階と；
（ｂ）塩基の存在下、アシル化されたマクロライドとメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体またはチオール末端ポリ（エチレングリコール）誘導体を反応させる段階とを含む、プロセス。
【請求項２】
免疫抑制性マクロライドがラパマイシンであり、前記ラパマイシンが４２位で位置特異的にアシル化されている、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
免疫抑制性マクロライドが、下記構造：
【化１】
（式中、Ｒ１は、Ｈ、ならびにアルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ３１からなる群より選択され；
Ｒ３１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリールおよびアリールアルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシルおよび−Ｏ−アルキルからなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシアラルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｒ５１からなる群より選択され；かつ
Ｒ５１は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアリールおよびヒドロキシアラルキルからなる群より選択される）
のものである、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項４】
免疫抑制性マクロライドが４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシンである、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項５】
免疫抑制性マクロライドがＣＣＩ−７７９である、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項６】
免疫抑制性マクロライドが、タクロリムスおよびアスコマイシンからなる群より選択され、前記タクロリムスおよび前記アスコマイシンが３２位で位置特異的にアシル化されている、請求項１記載のプロセス。
【請求項７】
前記免疫抑制性マクロライドが、下記構造：
【化２】
（式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、独立して、Ｈまたはアルキルであり；Ｒはエチルまたはアリルである）
のものである、請求項１または６記載のプロセス。
【請求項８】
下記式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖおよび式ＶＩ：
【化３】
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
からなる群より選択されるペグ化された免疫抑制性マクロライドを調製するためのプロセスであって、
（ａ）リパーゼの存在下、マクロライドとアシル化剤を反応させてアシル化されたマクロライドを形成する段階を含み、前記アシル化剤が、下記構造：
【化４】
（式中、Ｒ６はＨまたはＣＨ３であり；Ｙは脱離基である）のものであり；かつ
（ｂ）塩基の存在下、アシル化されたマクロライドとメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体を反応させる段階を含み、前記メトキシポリ（エチレングリコール）誘導体が、下記構造：
ＨＸ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ３
（式中、ｎは１０〜１０００の整数であり；ＸはＯまたはＳである）
のものである、
前記プロセス。
【請求項９】
前記リパーゼが、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、カンジダ・アンタークティカ(Candida antarctica)、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)またはリゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)を含む微生物由来の微生物リパーゼである、請求項１から８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
前記リパーゼが、カンジダ・アンタークティカ由来である、請求項１から９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
前記リパーゼが、固定化されたカンジダ・アンタークティカＢ型（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）である、請求項１から１０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
前記リパーゼが、シュードモナス・セパシア由来のリパーゼＰＳである、請求項１から９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
前記リパーゼが、酵素が珪藻土またはセラミック担体上に固定化されている、シュードモナス・セパシア由来の固定化されたリパーゼＰＳ−Ｃ、例えば、Ａｍａｎｏ ＩＩ（商標）リパーゼまたはリパーゼＰＳ−Ｄ Ａｍａｎｏ Ｉ（商標）リパーゼである、請求項１から９または１２のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１４】
段階（ａ）が、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メチレンクロライド、クロロホルム、ヘキサン、ジオキサンおよびそれらの混合物からなる群より選択される有機溶媒中で行われる、請求項１から８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１５】
段階（ａ）が、２０〜７０℃にて行われる、請求項１から１４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１６】
段階（ａ）が、モレキュラーシーブスの使用をさらに含む、請求項１から１５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１７】
段階（ａ）が、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中４０℃にて行われ、前記アシル化剤がビニルブロモアセテートであり、前記リパーゼが固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）であり、かつ、前記モレキュラーシーブスが５Åモレキュラーシーブスである、請求項１６記載のプロセス。
【請求項１８】
Ｙが、Ｉ、ＢｒまたはＣｌである、請求項８から１７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１９】
アシル化剤がビニルブロモアセテートである、請求項１から１８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２０】
段階（ｂ）中の前記塩基が第三級アミンである、請求項１から１９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２１】
前記第三級アミンが脂肪族または芳香族である、請求項２０記載のプロセス。
【請求項２２】
前記第三級アミンがトリアルキルアミンである、請求項２０記載のプロセス。
【請求項２３】
前記塩基がジイソプロピルエチルアミンである、請求項１から１９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２４】
前記メトキシポリ（エチレングリコール）誘導体がメトキシポリ（エチレングリコール）チオール化合物である、請求項８から２３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２５】
前記メトキシポリ（エチレングリコール）チオールの平均分子量が４００〜３００００である、請求項２４記載のプロセス。
【請求項２６】
前記メトキシポリ（エチレングリコール）チオールの平均分子量が５０００である、請求項２５記載のプロセス。
【請求項２７】
下記構造：
【化５】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたラパマイシンを調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、ラパマイシンとビニルブロモアセテートを反応させてアシル化されたラパマイシンを形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたラパマイシンと平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項２８】
下記構造：
【化６】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたエベロリムスを調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、エベロリムスとビニルブロモアセテートを反応させてアシル化されたエベロリムスを形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたエベロリムスと平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項２９】
下記構造：
【化７】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたＣＣＩ−７７９を調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、ＣＣＩ−７７９とビニルブロモアセテートを反応させてモノアシル化またはビスアシル化されたＣＣＩ−７７９を形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたＣＣＩ−７７９と平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項３０】
下記構造：
【化８】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたタクロリムスを調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、タクロリムスとビニルブロモアセテートを反応させてアシル化されたタクロリムスを形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたタクロリムスと平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項３１】
下記構造：
【化９】
（式中、ｎは１０５〜１１５である）
のペグ化されたタクロリムスを調製するためのプロセスであって、
（ａ）固定化されたカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（好ましくは、アクリル樹脂上に固定化されている）の存在下、タクロリムスとビニルブロモアセテートを反応させてアシル化されたタクロリムスを形成する段階と；
（ｂ）ジイソプロピルエチルアミンの存在下、アシル化されたタクロリムスと平均分子量が５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）チオールを反応させる段階と
を含む、前記プロセス。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれかに記載のプロセスにより調製される、生成物。
【公表番号】特表２００９−５２９０５０（Ｐ２００９−５２９０５０Ａ）
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８３４７（Ｐ２００８−５５８３４７）
【出願日】平成１９年３月５日（２００７．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５６４６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３３４８
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月５日（２００７．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５６４６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３３４８
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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