分光蛍光光度計
【課題】 測定精度の安定性と高い検出感度とを有する分光蛍光光度計を提供する。
【解決手段】 照射部１００と、試料室２０と、光検出器３２とを備える検出部３０と、励起分光器１２を制御することにより、光検出器３２で目的波長領域の光強度を検出させることで、スペクトルを取得する制御部５１とを備える分光蛍光光度計１であって、光検出器３２は、光電子増倍管であり、光電子増倍管３２の陰極に、設定印加電圧値を印加する電圧発生部４３と、光電子増倍管３２の陽極から出力される光強度を示す電荷パルス数をカウントするカウンタ回路４４とを備え、制御部５１は、試料を分析する前に、電圧発生部４３を制御することにより、設定印加電圧値を変更し、各設定印加電圧値におけるそれぞれの電荷パルス数の時間変化を測定し、時間変化に基づいて、試料を分析する際に設定する設定印加電圧値となるプラトー電圧を決定する。
【解決手段】 照射部１００と、試料室２０と、光検出器３２とを備える検出部３０と、励起分光器１２を制御することにより、光検出器３２で目的波長領域の光強度を検出させることで、スペクトルを取得する制御部５１とを備える分光蛍光光度計１であって、光検出器３２は、光電子増倍管であり、光電子増倍管３２の陰極に、設定印加電圧値を印加する電圧発生部４３と、光電子増倍管３２の陽極から出力される光強度を示す電荷パルス数をカウントするカウンタ回路４４とを備え、制御部５１は、試料を分析する前に、電圧発生部４３を制御することにより、設定印加電圧値を変更し、各設定印加電圧値におけるそれぞれの電荷パルス数の時間変化を測定し、時間変化に基づいて、試料を分析する際に設定する設定印加電圧値となるプラトー電圧を決定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に励起光を照射したときに生ずる蛍光を測定する分光蛍光光度計に関する。
【背景技術】
【０００２】
基底状態の分子に光を照射すると、分子はエネルギーレベルの高い励起状態に遷移する。そして、励起状態の分子は、エネルギーの一部を振動や熱により失った後、光放射による失活により基底状態に戻る。このときに分子が発する光が蛍光である。
そこで、分子が発する蛍光がどのようなものであるかを検討するために、設定励起波長λＥＸの光を試料に照射し、そのときに試料から放出されるスペクトル（光の波長分布と強度）を測定する分光蛍光光度計が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
図６は、従来の分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。
分光蛍光光度計１０１は、設定励起波長λＥＸの光を出射する照射部１００と、試料Ｓが配置される試料室２０と、スペクトルを測定する検出部３０と、設定印加電圧値（負高圧）Ｖｎを印加する高電圧発生部４３と、カウンタ回路４４と、デジタル−アナログ（Ｄ／Ａ）変換器４２と、分光蛍光光度計１０１全体を制御するコンピュータ１５０とを備える。
試料室２０には、分析したい試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセル等が配置されるようになっている。
【０００４】
照射部１００は、白色光を出射する高輝度のキセノンアークランプやフラッシュキセノンランプ等を光源とする光源部１１と、白色光を波長分解するための凹面回折格子１２ａと励起側スリット１３とミラー１５とモニター光検出器１４とビームスプリッタ１６とを有する励起分光器１０とを備える。
凹面回折格子１２ａは、コンピュータ１５０によって回転されるようなっており、任意の設定励起波長λＥＸの光を試料Ｓに対して照射することができるようになっている。
【０００５】
ビームスプリッタ１６は、入射した光を、モニター光検出器１４と試料Ｓとに対して分割して出射するようになっている。例えば、入射した光の数％程度を反射光としてモニター光検出器１４に対して出射するとともに、残りの透過光を試料Ｓに対して出射する。
そして、モニター光検出器１４は、Ｓｉ−ＰＤ（シリコンフォトダイオード）や光電子増倍管等であり、ビームスプリッタ１６からの反射光を検出し、波長分解したそれぞれの光の光強度を示す光源モニター値としてコンピュータ１５０に出力する。
【０００６】
検出部３０は、試料Ｓから放出される蛍光を波長分解して目的波長λｎの光を光検出器３２に対して出射する凹面回折格子３１ａと、目的波長λｎの光強度を検出する光検出器３２と、蛍光側スリット３４とを備える。
凹面回折格子３１ａは、コンピュータ１５０によって回転されるようなっており、任意の目的波長λｎの光を光検出器３２に対して出射することができるようになっている。これにより、凹面回折格子３１ａは、コンピュータ１５０によって回転されながら、所定領域の目的波長λｎの光を光検出器３２に対して出射すれば、スペクトルを測定することができるようになっている。
【０００７】
コンピュータ１５０においては、ＣＰＵ（制御部）１５１とメモリ１５４とを備え、さらにキーボードやマウス等を有する入力装置５２と、表示装置５３とが連結されている。また、ＣＰＵ１５１が処理する機能をブロック化して説明すると、照射部１００を制御する光源部制御部１５１ａと、光検出器３２からの光強度信号を取得する光検出器制御部１５１ｂと、表示装置５３にスペクトルを表示する表示制御部１５１ｃとを有する。
【０００８】
このような分光蛍光光度計１０１によれば、分析者が試料Ｓの分析を実行する際には、試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０に配置する。そして、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部１５１ａを制御することにより、試料Ｓに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を照射する。光検出器制御部１５１ｂは、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２からの光強度信号を目的波長範囲（例えば、３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ）で取得していくことで、試料Ｓから放出されるスペクトルを取得する。
その後、試料Ｓの分析が終了すると、表示制御部１５１ｃは、表示装置５３にスペクトルを表示する（図２参照）。
【０００９】
ところで、検出部３０に設置される光検出器３２には、検出感度が高い点から光電子増倍管３２がしばしば用いられる。光電子増倍管３２は、光電面に光が入射すると光電効果によって入射量に応じた電子を発生させ、その電子数を増倍して電流として出力するものである。光電子増倍管３２に所定の印加電圧値Ｖｎを印加することにより、光電面に入射する光量に比例する大きさの電流が出力され、その出力値によって光電面への入射光量を測定することができる。このとき、光電子増倍管３２では、増倍率（印加電圧値Ｖｎ）が高いほど光電面に入射した光量に応じた電子数をより大きく増幅した電流値を出力できるため、高感度の検出が可能となる。
【００１０】
このような光電子増倍管３２の陽極から出力される光強度を示す電流値（電荷パルス）を処理する処理方法には、大きく分けると２通りの処理方法がある。
一つの方法は、電荷パルスを多数の集合体とするアナログ電流として扱うアナログ法である。アナログ法は、比較的信号回路の応答性が低速に設計されるために、陽極からの離散的な電荷パルスはそれぞれが重なりあった揺らぎのある電流信号と見なされ、このアナログ信号（電流信号）から蛍光強度を求めるものである。
【００１１】
もう一つの方法は、電荷パルスをあくまで一つの離散パルスとして扱うデジタル法である。デジタル法は、アナログ法に対して、信号回路の応答性がより高速に設計されているため、ある光の強さを超えるレベルまでは陽極からのパルスが全て離散化されるため、一定時間の間に観測される電荷パルス数をカウンタ回路によってカウントすることにより、信号レベルの強弱を含めた高感度な蛍光測定ができる。特に、デジタル法は、フォトンカウンティング法と称され、フォトンカウンティング法は、光電面に入射する光子によって発生する光電子が多段に構成されたダイノードで増幅された後、陽極から出力される電荷パルスを一つ一つカウントする手法である。このようなフォトンカウンティング法によれば、信号レベルに対する雑音度を示すＳ／Ｎ比が非常に優れているとともに、きわめて微弱な光強度信号も正確に測定できる。
近年、このようなフォトンカウンティング法を用いた分光蛍光光度計も多く製造されており、バイオルミネッセンスやケミルミネッセンスを主とするような微弱な光の蛍光観察を行う分野で用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００６−３００６３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ところで、フォトンカウンティング法を用いた分光蛍光光度計１０１では、高い検出感度が要求されることに加えて、測定精度の安定性という点も非常に重要な要求項目とされる。例えば、同じ試料Ｓを異なる日時に分析する場合に、それぞれの日時における分析結果が異ならないようにする必要がある。しかしながら、光電子増倍管３２は、それぞれ個々に特有な分光特性を有する上に、印加電圧値Ｖｎの大きさによっても感度特性が異なるという特性を示す。
また、光源部１１であるキセノンアークランプやフラッシュキセノンランプ等も、高輝度である反面、輝度再現性については低出力の光源（例えば、タングステンランプ等）と比べると非常に劣る面もあり、具体的には使用時間経過に伴う電極部の消耗等による変性により、輝度そのものが使用当初に比べると数段低下する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そこで、本件発明者は、上記課題を解決するために、測定精度の安定性と高い検出感度とを有する分光蛍光光度計について検討を行った。
まず、検出感度が高い光電子増倍管３２を用いて測定精度の安定性を達成するために、光電子増倍管３２の陰極に印加する最適な印加電圧値Ｖｎについて検討した。光電子増倍管３２は、陰極に印加する印加電圧値Ｖｎを低圧側から昇圧させていくと、陽極から出力される電荷パルス数を表す計数率が徐々に上がっていくが、ある印加電圧値Ｖｔｈを超えた時点から一定となり始め、最終的には平衡して安定するプラトー特性を示す。このような平衡して安定する印加電圧値Ｖｎである環境下においては、印加電圧値Ｖｎの変動が多少発生しても安定した計数率を維持する。しかし、プラトー特性を示す印加電圧値Ｖｎは、光電子増倍管３２ごとに個体差があり、一意に最適な印加電圧値Ｖｎを決め打ちすることは不可能である。
よって、一の分光蛍光光度計１０１で試料Ｓを分析する前に、一の分光蛍光光度計１０１に搭載している光電子増倍管３２のプラトー特性を示す印加電圧値Ｖｎを求め、一の分光蛍光光度計１０１で試料Ｓを分析する際に設定すべき最適な印加電圧値Ｖｎとしてプラトー電圧Ｖを決定することにした。
【００１５】
ここで、一の分光蛍光光度計１０１において、光電子増倍管３２のプラトー特性を示す印加電圧値Ｖｎを決定する決定方法の一例について説明する。
プラトー電圧Ｖを決定するための試料Ｓとして、１０ｍｍキュベットセルに純水を入れたものを用意する。純水は、励起波長λＥＸごとに決まった蛍光波長λｎにラマンシグナルを示す。例えば、励起波長λＥＸを３５０ｎｍに設定し、スペクトルを測定すると、波長が３９７ｎｍ付近に水のラマンピークが現れる。図２は、得られたスペクトルの一例を示す図である。なお、縦軸は光強度であり、横軸は波長である。
【００１６】
よって、目的波長λｎを蛍光波長λｎ（例えば、３９７ｎｍ）に設定し、以降は蛍光波長λｎをこのまま固定した状態で、初期設定の印加電圧値Ｖｎ（例えば、−５００Ｖ）に固定したまま、１秒間隔で１分間電荷パルス数をカウントし、１分間での電荷パルス数の時間変化を求める。図３は、得られた電荷パルス数（パルスカウント値）と時間との関係の一例を示す図である。
そして、図３に示すようなパルスカウント値の時間変化から電荷パルス数の平均値と標準偏差とを求め、標準偏差／平均値より変動計数（ＣＶ値）を計算する。
【００１７】
さらに、このような印加電圧値Ｖｎにおける変動係数の計算を、印加電圧値Ｖｎを−５００Ｖ（初期設定）から−１０Ｖ上げるごとに行って、図４に示すような変動計数と印加電圧値Ｖｎとの関係を示すグラフを作成する。図４は、得られた変動計数（ＣＶ値）と印加電圧値Ｖｎとの関係の一例を示す図である。
図４に示すようなグラフから変動係数がもっとも小さな点を示す印加電圧値Ｖｎをプラトー電圧Ｖとして決定し、試料Ｓを分析する際には、決定したプラトー電圧Ｖに常時自動設定されるようにする。
【００１８】
次に、高輝度である光源部１１を用いても測定精度の安定性を達成するために、キセノンアークランプやフラッシュキセノンランプ等の光源部１１について検討した。
分光蛍光光度計１０１の照射部１００では、試料Ｓに照射する直前の設定励起波長λＥＸの光が光路中に設けたビームスプリッタ１６によりその一部が取り出され、この光量をモニター光検出器１４によって受光し、光源１１のエネルギーのふらつき量として絶えず光源モニター値として記録している。よって、分光蛍光光度計１０１では、光電子増倍管３２から検出された電荷パルスをそのまま蛍光強度として扱わず、電荷パルスを光源モニター値で除算した強度値を最終的な蛍光強度としてスペクトルを表している。これにより、光源部１１のエネルギーがふらつく若しくは使用当初からの相対値の低下が生じても、その影響は蛍光強度に現れなくなる。
【００１９】
また、励起分光器１０の迷光等の環境変化が引き起こすもの、あるいは、光源モニター値は光束の全体を見ているわけではなく、そのうちの限定された一部分のみをモニターしているだけであるので、モニターしきれない光束の部分のふらつきが蛍光強度の安定性を損ねる。
よって、定期的（例えば、２４時間おき）に、決められた標準試料Ｓｂを測定して、標準試料Ｓｂにより求められた蛍光強度が規定強度値の範囲内になるようにする補正係数αｔを算出し、試料Ｓを分析した際に得られた蛍光強度に補正係数αｔを掛ける補正を行うことにした。これにより、変動を抑えることが可能になる。
【００２０】
すなわち、本発明の分光蛍光光度計は、白色光を出射する光源と、当該白色光を波長分解して設定励起波長の光を試料に対して照射する回折格子を有する励起分光器とを備える照射部と、前記試料が配置される試料室と、前記試料から放出される蛍光を波長分解して目的波長の光を光検出器に対して出射する回折格子と、目的波長の光強度を検出する光検出器とを備える検出部と、前記励起分光器を制御することにより、前記光検出器で目的波長領域の光強度を検出させることで、スペクトルを取得する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、前記光検出器は、光電子増倍管であり、前記光電子増倍管の陰極に、設定印加電圧値を印加する電圧発生部と、前記光電子増倍管の陽極から出力される光強度を示す電荷パルス数をカウントするカウンタ回路とを備え、前記制御部は、前記試料を分析する前に、前記電圧発生部を制御することにより、設定印加電圧値を変更し、各設定印加電圧値におけるそれぞれの電荷パルス数の時間変化を測定し、当該時間変化に基づいて、前記試料を分析する際に設定する設定印加電圧値となるプラトー電圧を決定するようにしている。
【００２１】
ここで、「設定励起波長」とは、分析者等によって分析前に予め決められた任意の波長であり、例えば、３５０ｎｍ等となる。
また、「目的波長領域」とは、分析者等によって分析前に予め決められた任意の波長領域であり、例えば、２００ｎｍ〜９００ｎｍ等となる。
【発明の効果】
【００２２】
以上のように、本発明の分光蛍光光度計によれば、検出感度が高い光電子増倍管を用いても、設定印加電圧値として、安定した計数率を維持するプラトー電圧に設定するので、測定精度の安定性を有する。
【００２３】
（他の課題を解決するための手段および効果）
また、上記発明において、前記制御部は、前記電荷パルス数の時間変化から、前記電荷パルス数の平均値と標準偏差とを求め、当該標準偏差を平均値で除算することにより変動計数を計算し、前記変動係数が最小値となるか、あるいは、前記変動係数のグラフが平坦となる印加電圧値をプラトー電圧として決定するようにしてもよい。
そして、上記発明において、前記光源は、キセノンアークランプ又はフラッシュキセノンランプであり、前記照射部は、前記設定励起波長の光強度を検出するモニター光検出器と、前記設定励起波長の光をモニター光検出器と試料とに対して分割して出射するビームスプリッタとを備え、前記制御部は、前記試料を分析する際には、前記モニター光検出器から出力される光強度を示す光源モニター値を取得し、前記光検出器で検出された光強度を光源モニター値で除算した強度値を、蛍光強度としてスペクトルを表すようにしてもよい。
以上のように、本発明の分光蛍光光度計によれば、光源のエネルギーがふらつく若しくは使用当初からの相対値の低下が生じても、その影響は蛍光強度に現れなくなる。
【００２４】
さらに、上記発明において、前記制御部は、定期的に、前記試料室に標準試料が配置され、前記標準試料を分析した蛍光強度が予め決められた規定強度値の範囲内になるようにする補正係数を算出し、前記試料を分析する際には、得られた蛍光強度を補正係数を用いて補正するようにしてもよい。
ここで、「規定強度値の範囲」とは、分光蛍光光度計の性能を示す測定値再現性として規定されている数値の範囲内で制限されるものである。
以上のように、本発明の分光蛍光光度計によれば、分光器の迷光等の環境変化が引き起こすもの、あるいは、モニターしきれない光束の部分のふらつきが測定値の安定性を損ねることがなくなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施形態に係る分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。
【図２】得られたスペクトルの一例を示す図である。
【図３】得られた電荷パルス数（パルスカウント値）と時間との関係の一例を示す図である。
【図４】得られた変動計数（ＣＶ値）と印加電圧値Ｖｎとの関係の一例を示す図である。
【図５ａ】分光蛍光光度計を使用する使用方法の一例について説明するためのフローチャートである。
【図５ｂ】分光蛍光光度計を使用する使用方法の一例について説明するためのフローチャートである。
【図６】従来の分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれる。
【００２７】
図１は、実施形態に係る分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。なお、分光蛍光光度計１０１と同様のものについては、同じ符号を付している。
分光蛍光光度計１は、設定励起波長λＥＸの光を出射する照射部１００と、試料Ｓが配置される試料室２０と、スペクトルを測定する検出部３０と、設定印加電圧値（負高圧）Ｖｎを印加する高電圧発生部４３と、カウンタ回路４４と、デジタル−アナログ（Ｄ／Ａ）変換器４２と、分光蛍光光度計１全体を制御するコンピュータ５０とを備える。
【００２８】
コンピュータ５０においては、ＣＰＵ（制御部）５１とメモリ５４とを備え、さらにキーボードやマウス等を有する入力装置５２と、表示装置５３とが連結されている。また、ＣＰＵ５１が処理する機能をブロック化して説明すると、照射部１００を制御する光源部制御部５１ａと、光検出器３２からの光強度信号を取得する光検出器制御部５１ｂと、表示装置５３にスペクトルを表示する表示制御部５１ｃと、プラトー電圧Ｖを決定してメモリ５４に記憶させるプラトー電圧決定部５１ｄと、補正係数αｔを算出してメモリ５４に記憶させる補正係数算出部５１ｅとを有する。
【００２９】
ここで、分光蛍光光度計１を使用する使用方法の一例について説明する。図５は、分光蛍光光度計１を使用する使用方法の一例について説明するためのフローチャートである。
分光蛍光光度計１の使用方法は、プラトー電圧Ｖを決定する決定ステップＡ（ステップＳ１０１〜ステップＳ１０８）と、補正係数αｔを算出する補正係数算出ステップＢ（ステップＳ１０９〜ステップＳ１１１）と、試料Ｓを分析する分析ステップＣ（ステップＳ１１２〜ステップＳ１１６）とを含む。
【００３０】
（Ａ）決定ステップ（ステップＳ１０１〜ステップＳ１０８）
まず、ステップＳ１０１の処理において、分析者は、プラトー電圧Ｖを決定するための試料Ｓとして、１０ｍｍキュベットセルに純水を入れたものを用意する。ここで、使用する試料Ｓは、純水、蛍光性を示す物質が樹脂形状に固められた蛍光ブロック、あるいは、安定した調製が保証できるような試薬でもよい。
次に、ステップＳ１０２の処理において、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａを制御することにより、試料Ｓに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、測定パラメータ：３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、モニター光検出器１４からの光源モニター値を取得する。光検出器制御部５１ｂは、設定印加電圧値Ｖｎ（例えば、測定パラメータ：−５００Ｖ）を設定するとともに、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２からの光強度信号を目的波長範囲（例えば、測定パラメータ：３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ）を０．１ｎｍ間隔で取得していくことで、試料Ｓから放出されるスペクトルを取得する（図２参照）。
次に、ステップＳ１０３の処理において、図２を観察して水のラマンピークの蛍光波長λｎ（例えば、３９７ｎｍ）を決定し、目的波長λｎを蛍光波長λｎ（例えば、３９７ｎｍ）に設定する。
【００３１】
次に、ステップＳ１０４の処理において、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａを制御することにより、試料Ｓに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、モニター光検出器１４からの光源モニター値を取得する。光検出器制御部５１ｂは、設定印加電圧値Ｖｎ（例えば、−５００Ｖ）を設定するとともに、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２から目的波長（例えば、３９７ｎｍ）の光強度信号を取得する。このとき、１秒間隔で１分間電荷パルス数をカウントし、１分間での電荷パルス数の時間変化を求める（図３参照）。そして、図３に示すようなパルスカウント値の時間変化から電荷パルス数の平均値と標準偏差とを求め、標準偏差／平均値より変動計数（ＣＶ値）を計算する。
次に、ステップＳ１０５の処理において、印加電圧値Ｖｎを変更するか否かを判定する。印加電圧値Ｖｎを変更すると判定したときには、ステップＳ１０６の処理において、印加電圧値Ｖｎを−１０Ｖにする。つまり、変動計数と印加電圧値Ｖｎとの関係の示すグラフを作成するために、様々な印加電圧値Ｖｎにおける変動計数を取得することになる。
一方、印加電圧値Ｖｎを変更しないと判定したときには、ステップＳ１０７の処理において、変動計数と印加電圧値Ｖｎとの関係を示すグラフを作成する（図４参照）。
次に、ステップＳ１０８の処理において、プラトー電圧決定部５１ｄは、図４に示すようなグラフから変動係数がもっとも小さな点を示す印加電圧値Ｖｎをプラトー電圧Ｖとして決定してメモリ５４に記憶させる。なお、プラトー電圧Ｖを決定する際には、変動係数の曲線を微分演算し、より平坦になる点を求めてもよい。
【００３２】
（Ｂ）補正係数算出ステップ（ステップＳ１０９〜ステップＳ１１１）
次に、ステップＳ１０９の処理において、分析者は、標準試料Ｓｂとして１０ｍｍキュベットセルに純水を入れたものを用意する。ここで、使用する標準試料Ｓｂは、純水、蛍光性を示す物質が樹脂形状に固められた蛍光ブロック、あるいは、安定した調製が保証できるような試薬でもよい。
次に、ステップＳ１１０の処理において、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａを制御することにより、標準試料Ｓｂに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、モニター光検出器１４からの光源モニター値を取得する。光検出器制御部５１ｂは、メモリ５４に記憶されたプラトー電圧Ｖに設定するとともに、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２からの光強度信号の目的波長範囲３５０ｎｍ〜４５０ｎｍを０．１ｎｍ間隔で取得していくことで、標準試料Ｓｂから放出されるスペクトルを取得する。
次に、ステップＳ１１１の処理において、補正係数算出部５１ｅは、標準試料Ｓｂにより求められた蛍光強度が規定強度値の範囲内になるようにする補正係数αｔを算出してメモリ５４に記憶させる。なお、どの目的波長λｎで測定するかは任意で指定することができるようにしてもよい。
【００３３】
（Ｃ）分析ステップ（ステップＳ１１２〜ステップＳ１１６）
次に、ステップＳ１１２の処理において、分析者は、１０ｍｍキュベットセルに試料Ｓを入れたものを用意する。
次に、ステップＳ１１３の処理において、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａを制御することにより、試料Ｓに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、モニター光検出器１４からの光源モニター値を取得する。光検出器制御部５１ｂは、メモリ５４に記憶されたプラトー電圧Ｖに設定するとともに、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２からの光強度信号を目的波長範囲３００ｎｍ〜８００ｎｍを０．１ｎｍ間隔で取得していくことで、試料Ｓから放出されるスペクトルを取得する。
次に、ステップＳ１１４の処理において、表示制御部５１ｃは、表示装置５３にスペクトルを表示する。このとき、試料Ｓを分析した蛍光強度に、メモリ５４に現在記憶されている補正係数αｔを掛ける補正を行う。
【００３４】
次に、ステップＳ１１５の処理において、所定の時間（例えば、２４時間）が経過したか否かを判定する。所定の時間が経過していないと判定したときには、ステップＳ１１２の処理に戻る。
一方、所定の時間が経過したと判定したときには、ステップＳ１１６の処理において、分析を行うか否かを判定する。分析を行うと判定したときには、ステップＳ１０９の処理に戻る。つまり、所定の時間が経過して、分析を行うのであれば、補正係数αｔを更新することになる。
一方、分析を行わないと判定したときには、本フローチャートを終了させる。
【００３５】
以上のように、実施形態の分光蛍光光度計１によれば、検出感度が高い光電子増倍管３２を用いても、設定印加電圧値Ｖｎとして、安定した計数率を維持するプラトー電圧Ｖに設定するので、測定精度の安定性を有する。また、光電子増倍管３２で検出された光強度を光源モニター値で除算した強度値を、蛍光強度としてスペクトルを表すので、光源部１１のエネルギーがふらつく若しくは使用当初からの相対値の低下が生じても、その影響は蛍光強度に現れなくなる。さらに、得られた蛍光強度を補正係数αｔを用いて補正するので、励起分光器１２の迷光等の環境変化が引き起こすもの、あるいは、モニターしきれない光束の部分のふらつきが測定値の安定性を損ねることがなくなる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、分光蛍光光度計等に好適に利用できる。
【符号の説明】
【００３７】
１０ 励起分光器
１１ 光源部
１２ａ 凹面回折格子
２０ 試料室
３０ 検出部
３１ａ 凹面回折格子
３２ 光電子増倍管（光検出器）
４３ 高電圧発生部
４４ カウンタ回路
５１ 制御部
１００ 照射部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に励起光を照射したときに生ずる蛍光を測定する分光蛍光光度計に関する。
【背景技術】
【０００２】
基底状態の分子に光を照射すると、分子はエネルギーレベルの高い励起状態に遷移する。そして、励起状態の分子は、エネルギーの一部を振動や熱により失った後、光放射による失活により基底状態に戻る。このときに分子が発する光が蛍光である。
そこで、分子が発する蛍光がどのようなものであるかを検討するために、設定励起波長λＥＸの光を試料に照射し、そのときに試料から放出されるスペクトル（光の波長分布と強度）を測定する分光蛍光光度計が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
図６は、従来の分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。
分光蛍光光度計１０１は、設定励起波長λＥＸの光を出射する照射部１００と、試料Ｓが配置される試料室２０と、スペクトルを測定する検出部３０と、設定印加電圧値（負高圧）Ｖｎを印加する高電圧発生部４３と、カウンタ回路４４と、デジタル−アナログ（Ｄ／Ａ）変換器４２と、分光蛍光光度計１０１全体を制御するコンピュータ１５０とを備える。
試料室２０には、分析したい試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセル等が配置されるようになっている。
【０００４】
照射部１００は、白色光を出射する高輝度のキセノンアークランプやフラッシュキセノンランプ等を光源とする光源部１１と、白色光を波長分解するための凹面回折格子１２ａと励起側スリット１３とミラー１５とモニター光検出器１４とビームスプリッタ１６とを有する励起分光器１０とを備える。
凹面回折格子１２ａは、コンピュータ１５０によって回転されるようなっており、任意の設定励起波長λＥＸの光を試料Ｓに対して照射することができるようになっている。
【０００５】
ビームスプリッタ１６は、入射した光を、モニター光検出器１４と試料Ｓとに対して分割して出射するようになっている。例えば、入射した光の数％程度を反射光としてモニター光検出器１４に対して出射するとともに、残りの透過光を試料Ｓに対して出射する。
そして、モニター光検出器１４は、Ｓｉ−ＰＤ（シリコンフォトダイオード）や光電子増倍管等であり、ビームスプリッタ１６からの反射光を検出し、波長分解したそれぞれの光の光強度を示す光源モニター値としてコンピュータ１５０に出力する。
【０００６】
検出部３０は、試料Ｓから放出される蛍光を波長分解して目的波長λｎの光を光検出器３２に対して出射する凹面回折格子３１ａと、目的波長λｎの光強度を検出する光検出器３２と、蛍光側スリット３４とを備える。
凹面回折格子３１ａは、コンピュータ１５０によって回転されるようなっており、任意の目的波長λｎの光を光検出器３２に対して出射することができるようになっている。これにより、凹面回折格子３１ａは、コンピュータ１５０によって回転されながら、所定領域の目的波長λｎの光を光検出器３２に対して出射すれば、スペクトルを測定することができるようになっている。
【０００７】
コンピュータ１５０においては、ＣＰＵ（制御部）１５１とメモリ１５４とを備え、さらにキーボードやマウス等を有する入力装置５２と、表示装置５３とが連結されている。また、ＣＰＵ１５１が処理する機能をブロック化して説明すると、照射部１００を制御する光源部制御部１５１ａと、光検出器３２からの光強度信号を取得する光検出器制御部１５１ｂと、表示装置５３にスペクトルを表示する表示制御部１５１ｃとを有する。
【０００８】
このような分光蛍光光度計１０１によれば、分析者が試料Ｓの分析を実行する際には、試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０に配置する。そして、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部１５１ａを制御することにより、試料Ｓに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を照射する。光検出器制御部１５１ｂは、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２からの光強度信号を目的波長範囲（例えば、３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ）で取得していくことで、試料Ｓから放出されるスペクトルを取得する。
その後、試料Ｓの分析が終了すると、表示制御部１５１ｃは、表示装置５３にスペクトルを表示する（図２参照）。
【０００９】
ところで、検出部３０に設置される光検出器３２には、検出感度が高い点から光電子増倍管３２がしばしば用いられる。光電子増倍管３２は、光電面に光が入射すると光電効果によって入射量に応じた電子を発生させ、その電子数を増倍して電流として出力するものである。光電子増倍管３２に所定の印加電圧値Ｖｎを印加することにより、光電面に入射する光量に比例する大きさの電流が出力され、その出力値によって光電面への入射光量を測定することができる。このとき、光電子増倍管３２では、増倍率（印加電圧値Ｖｎ）が高いほど光電面に入射した光量に応じた電子数をより大きく増幅した電流値を出力できるため、高感度の検出が可能となる。
【００１０】
このような光電子増倍管３２の陽極から出力される光強度を示す電流値（電荷パルス）を処理する処理方法には、大きく分けると２通りの処理方法がある。
一つの方法は、電荷パルスを多数の集合体とするアナログ電流として扱うアナログ法である。アナログ法は、比較的信号回路の応答性が低速に設計されるために、陽極からの離散的な電荷パルスはそれぞれが重なりあった揺らぎのある電流信号と見なされ、このアナログ信号（電流信号）から蛍光強度を求めるものである。
【００１１】
もう一つの方法は、電荷パルスをあくまで一つの離散パルスとして扱うデジタル法である。デジタル法は、アナログ法に対して、信号回路の応答性がより高速に設計されているため、ある光の強さを超えるレベルまでは陽極からのパルスが全て離散化されるため、一定時間の間に観測される電荷パルス数をカウンタ回路によってカウントすることにより、信号レベルの強弱を含めた高感度な蛍光測定ができる。特に、デジタル法は、フォトンカウンティング法と称され、フォトンカウンティング法は、光電面に入射する光子によって発生する光電子が多段に構成されたダイノードで増幅された後、陽極から出力される電荷パルスを一つ一つカウントする手法である。このようなフォトンカウンティング法によれば、信号レベルに対する雑音度を示すＳ／Ｎ比が非常に優れているとともに、きわめて微弱な光強度信号も正確に測定できる。
近年、このようなフォトンカウンティング法を用いた分光蛍光光度計も多く製造されており、バイオルミネッセンスやケミルミネッセンスを主とするような微弱な光の蛍光観察を行う分野で用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００６−３００６３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ところで、フォトンカウンティング法を用いた分光蛍光光度計１０１では、高い検出感度が要求されることに加えて、測定精度の安定性という点も非常に重要な要求項目とされる。例えば、同じ試料Ｓを異なる日時に分析する場合に、それぞれの日時における分析結果が異ならないようにする必要がある。しかしながら、光電子増倍管３２は、それぞれ個々に特有な分光特性を有する上に、印加電圧値Ｖｎの大きさによっても感度特性が異なるという特性を示す。
また、光源部１１であるキセノンアークランプやフラッシュキセノンランプ等も、高輝度である反面、輝度再現性については低出力の光源（例えば、タングステンランプ等）と比べると非常に劣る面もあり、具体的には使用時間経過に伴う電極部の消耗等による変性により、輝度そのものが使用当初に比べると数段低下する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そこで、本件発明者は、上記課題を解決するために、測定精度の安定性と高い検出感度とを有する分光蛍光光度計について検討を行った。
まず、検出感度が高い光電子増倍管３２を用いて測定精度の安定性を達成するために、光電子増倍管３２の陰極に印加する最適な印加電圧値Ｖｎについて検討した。光電子増倍管３２は、陰極に印加する印加電圧値Ｖｎを低圧側から昇圧させていくと、陽極から出力される電荷パルス数を表す計数率が徐々に上がっていくが、ある印加電圧値Ｖｔｈを超えた時点から一定となり始め、最終的には平衡して安定するプラトー特性を示す。このような平衡して安定する印加電圧値Ｖｎである環境下においては、印加電圧値Ｖｎの変動が多少発生しても安定した計数率を維持する。しかし、プラトー特性を示す印加電圧値Ｖｎは、光電子増倍管３２ごとに個体差があり、一意に最適な印加電圧値Ｖｎを決め打ちすることは不可能である。
よって、一の分光蛍光光度計１０１で試料Ｓを分析する前に、一の分光蛍光光度計１０１に搭載している光電子増倍管３２のプラトー特性を示す印加電圧値Ｖｎを求め、一の分光蛍光光度計１０１で試料Ｓを分析する際に設定すべき最適な印加電圧値Ｖｎとしてプラトー電圧Ｖを決定することにした。
【００１５】
ここで、一の分光蛍光光度計１０１において、光電子増倍管３２のプラトー特性を示す印加電圧値Ｖｎを決定する決定方法の一例について説明する。
プラトー電圧Ｖを決定するための試料Ｓとして、１０ｍｍキュベットセルに純水を入れたものを用意する。純水は、励起波長λＥＸごとに決まった蛍光波長λｎにラマンシグナルを示す。例えば、励起波長λＥＸを３５０ｎｍに設定し、スペクトルを測定すると、波長が３９７ｎｍ付近に水のラマンピークが現れる。図２は、得られたスペクトルの一例を示す図である。なお、縦軸は光強度であり、横軸は波長である。
【００１６】
よって、目的波長λｎを蛍光波長λｎ（例えば、３９７ｎｍ）に設定し、以降は蛍光波長λｎをこのまま固定した状態で、初期設定の印加電圧値Ｖｎ（例えば、−５００Ｖ）に固定したまま、１秒間隔で１分間電荷パルス数をカウントし、１分間での電荷パルス数の時間変化を求める。図３は、得られた電荷パルス数（パルスカウント値）と時間との関係の一例を示す図である。
そして、図３に示すようなパルスカウント値の時間変化から電荷パルス数の平均値と標準偏差とを求め、標準偏差／平均値より変動計数（ＣＶ値）を計算する。
【００１７】
さらに、このような印加電圧値Ｖｎにおける変動係数の計算を、印加電圧値Ｖｎを−５００Ｖ（初期設定）から−１０Ｖ上げるごとに行って、図４に示すような変動計数と印加電圧値Ｖｎとの関係を示すグラフを作成する。図４は、得られた変動計数（ＣＶ値）と印加電圧値Ｖｎとの関係の一例を示す図である。
図４に示すようなグラフから変動係数がもっとも小さな点を示す印加電圧値Ｖｎをプラトー電圧Ｖとして決定し、試料Ｓを分析する際には、決定したプラトー電圧Ｖに常時自動設定されるようにする。
【００１８】
次に、高輝度である光源部１１を用いても測定精度の安定性を達成するために、キセノンアークランプやフラッシュキセノンランプ等の光源部１１について検討した。
分光蛍光光度計１０１の照射部１００では、試料Ｓに照射する直前の設定励起波長λＥＸの光が光路中に設けたビームスプリッタ１６によりその一部が取り出され、この光量をモニター光検出器１４によって受光し、光源１１のエネルギーのふらつき量として絶えず光源モニター値として記録している。よって、分光蛍光光度計１０１では、光電子増倍管３２から検出された電荷パルスをそのまま蛍光強度として扱わず、電荷パルスを光源モニター値で除算した強度値を最終的な蛍光強度としてスペクトルを表している。これにより、光源部１１のエネルギーがふらつく若しくは使用当初からの相対値の低下が生じても、その影響は蛍光強度に現れなくなる。
【００１９】
また、励起分光器１０の迷光等の環境変化が引き起こすもの、あるいは、光源モニター値は光束の全体を見ているわけではなく、そのうちの限定された一部分のみをモニターしているだけであるので、モニターしきれない光束の部分のふらつきが蛍光強度の安定性を損ねる。
よって、定期的（例えば、２４時間おき）に、決められた標準試料Ｓｂを測定して、標準試料Ｓｂにより求められた蛍光強度が規定強度値の範囲内になるようにする補正係数αｔを算出し、試料Ｓを分析した際に得られた蛍光強度に補正係数αｔを掛ける補正を行うことにした。これにより、変動を抑えることが可能になる。
【００２０】
すなわち、本発明の分光蛍光光度計は、白色光を出射する光源と、当該白色光を波長分解して設定励起波長の光を試料に対して照射する回折格子を有する励起分光器とを備える照射部と、前記試料が配置される試料室と、前記試料から放出される蛍光を波長分解して目的波長の光を光検出器に対して出射する回折格子と、目的波長の光強度を検出する光検出器とを備える検出部と、前記励起分光器を制御することにより、前記光検出器で目的波長領域の光強度を検出させることで、スペクトルを取得する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、前記光検出器は、光電子増倍管であり、前記光電子増倍管の陰極に、設定印加電圧値を印加する電圧発生部と、前記光電子増倍管の陽極から出力される光強度を示す電荷パルス数をカウントするカウンタ回路とを備え、前記制御部は、前記試料を分析する前に、前記電圧発生部を制御することにより、設定印加電圧値を変更し、各設定印加電圧値におけるそれぞれの電荷パルス数の時間変化を測定し、当該時間変化に基づいて、前記試料を分析する際に設定する設定印加電圧値となるプラトー電圧を決定するようにしている。
【００２１】
ここで、「設定励起波長」とは、分析者等によって分析前に予め決められた任意の波長であり、例えば、３５０ｎｍ等となる。
また、「目的波長領域」とは、分析者等によって分析前に予め決められた任意の波長領域であり、例えば、２００ｎｍ〜９００ｎｍ等となる。
【発明の効果】
【００２２】
以上のように、本発明の分光蛍光光度計によれば、検出感度が高い光電子増倍管を用いても、設定印加電圧値として、安定した計数率を維持するプラトー電圧に設定するので、測定精度の安定性を有する。
【００２３】
（他の課題を解決するための手段および効果）
また、上記発明において、前記制御部は、前記電荷パルス数の時間変化から、前記電荷パルス数の平均値と標準偏差とを求め、当該標準偏差を平均値で除算することにより変動計数を計算し、前記変動係数が最小値となるか、あるいは、前記変動係数のグラフが平坦となる印加電圧値をプラトー電圧として決定するようにしてもよい。
そして、上記発明において、前記光源は、キセノンアークランプ又はフラッシュキセノンランプであり、前記照射部は、前記設定励起波長の光強度を検出するモニター光検出器と、前記設定励起波長の光をモニター光検出器と試料とに対して分割して出射するビームスプリッタとを備え、前記制御部は、前記試料を分析する際には、前記モニター光検出器から出力される光強度を示す光源モニター値を取得し、前記光検出器で検出された光強度を光源モニター値で除算した強度値を、蛍光強度としてスペクトルを表すようにしてもよい。
以上のように、本発明の分光蛍光光度計によれば、光源のエネルギーがふらつく若しくは使用当初からの相対値の低下が生じても、その影響は蛍光強度に現れなくなる。
【００２４】
さらに、上記発明において、前記制御部は、定期的に、前記試料室に標準試料が配置され、前記標準試料を分析した蛍光強度が予め決められた規定強度値の範囲内になるようにする補正係数を算出し、前記試料を分析する際には、得られた蛍光強度を補正係数を用いて補正するようにしてもよい。
ここで、「規定強度値の範囲」とは、分光蛍光光度計の性能を示す測定値再現性として規定されている数値の範囲内で制限されるものである。
以上のように、本発明の分光蛍光光度計によれば、分光器の迷光等の環境変化が引き起こすもの、あるいは、モニターしきれない光束の部分のふらつきが測定値の安定性を損ねることがなくなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施形態に係る分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。
【図２】得られたスペクトルの一例を示す図である。
【図３】得られた電荷パルス数（パルスカウント値）と時間との関係の一例を示す図である。
【図４】得られた変動計数（ＣＶ値）と印加電圧値Ｖｎとの関係の一例を示す図である。
【図５ａ】分光蛍光光度計を使用する使用方法の一例について説明するためのフローチャートである。
【図５ｂ】分光蛍光光度計を使用する使用方法の一例について説明するためのフローチャートである。
【図６】従来の分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれる。
【００２７】
図１は、実施形態に係る分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。なお、分光蛍光光度計１０１と同様のものについては、同じ符号を付している。
分光蛍光光度計１は、設定励起波長λＥＸの光を出射する照射部１００と、試料Ｓが配置される試料室２０と、スペクトルを測定する検出部３０と、設定印加電圧値（負高圧）Ｖｎを印加する高電圧発生部４３と、カウンタ回路４４と、デジタル−アナログ（Ｄ／Ａ）変換器４２と、分光蛍光光度計１全体を制御するコンピュータ５０とを備える。
【００２８】
コンピュータ５０においては、ＣＰＵ（制御部）５１とメモリ５４とを備え、さらにキーボードやマウス等を有する入力装置５２と、表示装置５３とが連結されている。また、ＣＰＵ５１が処理する機能をブロック化して説明すると、照射部１００を制御する光源部制御部５１ａと、光検出器３２からの光強度信号を取得する光検出器制御部５１ｂと、表示装置５３にスペクトルを表示する表示制御部５１ｃと、プラトー電圧Ｖを決定してメモリ５４に記憶させるプラトー電圧決定部５１ｄと、補正係数αｔを算出してメモリ５４に記憶させる補正係数算出部５１ｅとを有する。
【００２９】
ここで、分光蛍光光度計１を使用する使用方法の一例について説明する。図５は、分光蛍光光度計１を使用する使用方法の一例について説明するためのフローチャートである。
分光蛍光光度計１の使用方法は、プラトー電圧Ｖを決定する決定ステップＡ（ステップＳ１０１〜ステップＳ１０８）と、補正係数αｔを算出する補正係数算出ステップＢ（ステップＳ１０９〜ステップＳ１１１）と、試料Ｓを分析する分析ステップＣ（ステップＳ１１２〜ステップＳ１１６）とを含む。
【００３０】
（Ａ）決定ステップ（ステップＳ１０１〜ステップＳ１０８）
まず、ステップＳ１０１の処理において、分析者は、プラトー電圧Ｖを決定するための試料Ｓとして、１０ｍｍキュベットセルに純水を入れたものを用意する。ここで、使用する試料Ｓは、純水、蛍光性を示す物質が樹脂形状に固められた蛍光ブロック、あるいは、安定した調製が保証できるような試薬でもよい。
次に、ステップＳ１０２の処理において、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａを制御することにより、試料Ｓに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、測定パラメータ：３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、モニター光検出器１４からの光源モニター値を取得する。光検出器制御部５１ｂは、設定印加電圧値Ｖｎ（例えば、測定パラメータ：−５００Ｖ）を設定するとともに、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２からの光強度信号を目的波長範囲（例えば、測定パラメータ：３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ）を０．１ｎｍ間隔で取得していくことで、試料Ｓから放出されるスペクトルを取得する（図２参照）。
次に、ステップＳ１０３の処理において、図２を観察して水のラマンピークの蛍光波長λｎ（例えば、３９７ｎｍ）を決定し、目的波長λｎを蛍光波長λｎ（例えば、３９７ｎｍ）に設定する。
【００３１】
次に、ステップＳ１０４の処理において、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａを制御することにより、試料Ｓに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、モニター光検出器１４からの光源モニター値を取得する。光検出器制御部５１ｂは、設定印加電圧値Ｖｎ（例えば、−５００Ｖ）を設定するとともに、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２から目的波長（例えば、３９７ｎｍ）の光強度信号を取得する。このとき、１秒間隔で１分間電荷パルス数をカウントし、１分間での電荷パルス数の時間変化を求める（図３参照）。そして、図３に示すようなパルスカウント値の時間変化から電荷パルス数の平均値と標準偏差とを求め、標準偏差／平均値より変動計数（ＣＶ値）を計算する。
次に、ステップＳ１０５の処理において、印加電圧値Ｖｎを変更するか否かを判定する。印加電圧値Ｖｎを変更すると判定したときには、ステップＳ１０６の処理において、印加電圧値Ｖｎを−１０Ｖにする。つまり、変動計数と印加電圧値Ｖｎとの関係の示すグラフを作成するために、様々な印加電圧値Ｖｎにおける変動計数を取得することになる。
一方、印加電圧値Ｖｎを変更しないと判定したときには、ステップＳ１０７の処理において、変動計数と印加電圧値Ｖｎとの関係を示すグラフを作成する（図４参照）。
次に、ステップＳ１０８の処理において、プラトー電圧決定部５１ｄは、図４に示すようなグラフから変動係数がもっとも小さな点を示す印加電圧値Ｖｎをプラトー電圧Ｖとして決定してメモリ５４に記憶させる。なお、プラトー電圧Ｖを決定する際には、変動係数の曲線を微分演算し、より平坦になる点を求めてもよい。
【００３２】
（Ｂ）補正係数算出ステップ（ステップＳ１０９〜ステップＳ１１１）
次に、ステップＳ１０９の処理において、分析者は、標準試料Ｓｂとして１０ｍｍキュベットセルに純水を入れたものを用意する。ここで、使用する標準試料Ｓｂは、純水、蛍光性を示す物質が樹脂形状に固められた蛍光ブロック、あるいは、安定した調製が保証できるような試薬でもよい。
次に、ステップＳ１１０の処理において、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａを制御することにより、標準試料Ｓｂに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、モニター光検出器１４からの光源モニター値を取得する。光検出器制御部５１ｂは、メモリ５４に記憶されたプラトー電圧Ｖに設定するとともに、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２からの光強度信号の目的波長範囲３５０ｎｍ〜４５０ｎｍを０．１ｎｍ間隔で取得していくことで、標準試料Ｓｂから放出されるスペクトルを取得する。
次に、ステップＳ１１１の処理において、補正係数算出部５１ｅは、標準試料Ｓｂにより求められた蛍光強度が規定強度値の範囲内になるようにする補正係数αｔを算出してメモリ５４に記憶させる。なお、どの目的波長λｎで測定するかは任意で指定することができるようにしてもよい。
【００３３】
（Ｃ）分析ステップ（ステップＳ１１２〜ステップＳ１１６）
次に、ステップＳ１１２の処理において、分析者は、１０ｍｍキュベットセルに試料Ｓを入れたものを用意する。
次に、ステップＳ１１３の処理において、分析者は入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａを制御することにより、試料Ｓに対して設定励起波長λＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、モニター光検出器１４からの光源モニター値を取得する。光検出器制御部５１ｂは、メモリ５４に記憶されたプラトー電圧Ｖに設定するとともに、凹面回折格子３１ａを回転させながら、光検出器３２からの光強度信号を目的波長範囲３００ｎｍ〜８００ｎｍを０．１ｎｍ間隔で取得していくことで、試料Ｓから放出されるスペクトルを取得する。
次に、ステップＳ１１４の処理において、表示制御部５１ｃは、表示装置５３にスペクトルを表示する。このとき、試料Ｓを分析した蛍光強度に、メモリ５４に現在記憶されている補正係数αｔを掛ける補正を行う。
【００３４】
次に、ステップＳ１１５の処理において、所定の時間（例えば、２４時間）が経過したか否かを判定する。所定の時間が経過していないと判定したときには、ステップＳ１１２の処理に戻る。
一方、所定の時間が経過したと判定したときには、ステップＳ１１６の処理において、分析を行うか否かを判定する。分析を行うと判定したときには、ステップＳ１０９の処理に戻る。つまり、所定の時間が経過して、分析を行うのであれば、補正係数αｔを更新することになる。
一方、分析を行わないと判定したときには、本フローチャートを終了させる。
【００３５】
以上のように、実施形態の分光蛍光光度計１によれば、検出感度が高い光電子増倍管３２を用いても、設定印加電圧値Ｖｎとして、安定した計数率を維持するプラトー電圧Ｖに設定するので、測定精度の安定性を有する。また、光電子増倍管３２で検出された光強度を光源モニター値で除算した強度値を、蛍光強度としてスペクトルを表すので、光源部１１のエネルギーがふらつく若しくは使用当初からの相対値の低下が生じても、その影響は蛍光強度に現れなくなる。さらに、得られた蛍光強度を補正係数αｔを用いて補正するので、励起分光器１２の迷光等の環境変化が引き起こすもの、あるいは、モニターしきれない光束の部分のふらつきが測定値の安定性を損ねることがなくなる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、分光蛍光光度計等に好適に利用できる。
【符号の説明】
【００３７】
１０ 励起分光器
１１ 光源部
１２ａ 凹面回折格子
２０ 試料室
３０ 検出部
３１ａ 凹面回折格子
３２ 光電子増倍管（光検出器）
４３ 高電圧発生部
４４ カウンタ回路
５１ 制御部
１００ 照射部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白色光を出射する光源と、当該白色光を波長分解して設定励起波長の光を試料に対して照射する回折格子を有する励起分光器とを備える照射部と、
前記試料が配置される試料室と、
前記試料から放出される蛍光を波長分解して目的波長の光を光検出器に対して出射する回折格子と、目的波長の光強度を検出する光検出器とを備える検出部と、
前記励起分光器を制御することにより、前記光検出器で目的波長領域の光強度を検出させることで、スペクトルを取得する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、
前記光検出器は、光電子増倍管であり、
前記光電子増倍管の陰極に、設定印加電圧値を印加する電圧発生部と、
前記光電子増倍管の陽極から出力される光強度を示す電荷パルス数をカウントするカウンタ回路とを備え、
前記制御部は、前記試料を分析する前に、前記電圧発生部を制御することにより、設定印加電圧値を変更し、各設定印加電圧値におけるそれぞれの電荷パルス数の時間変化を測定し、当該時間変化に基づいて、前記試料を分析する際に設定する設定印加電圧値となるプラトー電圧を決定することを特徴とする分光蛍光光度計。
【請求項２】
前記制御部は、前記電荷パルス数の時間変化から、前記電荷パルス数の平均値と標準偏差とを求め、当該標準偏差を平均値で除算することにより変動計数を計算し、
前記変動係数が最小値となるか、あるいは、前記変動係数のグラフが平坦となる印加電圧値をプラトー電圧として決定することを特徴とする請求項１に記載の分光蛍光光度計。
【請求項３】
前記光源は、キセノンアークランプ又はフラッシュキセノンランプであり、
前記照射部は、前記設定励起波長の光強度を検出するモニター光検出器と、前記設定励起波長の光をモニター光検出器と試料とに対して分割して出射するビームスプリッタとを備え、
前記制御部は、前記試料を分析する際には、前記モニター光検出器から出力される光強度を示す光源モニター値を取得し、前記光検出器で検出された光強度を光源モニター値で除算した強度値を、蛍光強度としてスペクトルを表すことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分光蛍光光度計。
【請求項４】
前記制御部は、定期的に、前記試料室に標準試料が配置され、前記標準試料を分析した蛍光強度が予め決められた規定強度値の範囲内になるようにする補正係数を算出し、
前記試料を分析する際には、得られた蛍光強度を補正係数を用いて補正することを特徴とする請求項３に記載の分光蛍光光度計。
【請求項１】
白色光を出射する光源と、当該白色光を波長分解して設定励起波長の光を試料に対して照射する回折格子を有する励起分光器とを備える照射部と、
前記試料が配置される試料室と、
前記試料から放出される蛍光を波長分解して目的波長の光を光検出器に対して出射する回折格子と、目的波長の光強度を検出する光検出器とを備える検出部と、
前記励起分光器を制御することにより、前記光検出器で目的波長領域の光強度を検出させることで、スペクトルを取得する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、
前記光検出器は、光電子増倍管であり、
前記光電子増倍管の陰極に、設定印加電圧値を印加する電圧発生部と、
前記光電子増倍管の陽極から出力される光強度を示す電荷パルス数をカウントするカウンタ回路とを備え、
前記制御部は、前記試料を分析する前に、前記電圧発生部を制御することにより、設定印加電圧値を変更し、各設定印加電圧値におけるそれぞれの電荷パルス数の時間変化を測定し、当該時間変化に基づいて、前記試料を分析する際に設定する設定印加電圧値となるプラトー電圧を決定することを特徴とする分光蛍光光度計。
【請求項２】
前記制御部は、前記電荷パルス数の時間変化から、前記電荷パルス数の平均値と標準偏差とを求め、当該標準偏差を平均値で除算することにより変動計数を計算し、
前記変動係数が最小値となるか、あるいは、前記変動係数のグラフが平坦となる印加電圧値をプラトー電圧として決定することを特徴とする請求項１に記載の分光蛍光光度計。
【請求項３】
前記光源は、キセノンアークランプ又はフラッシュキセノンランプであり、
前記照射部は、前記設定励起波長の光強度を検出するモニター光検出器と、前記設定励起波長の光をモニター光検出器と試料とに対して分割して出射するビームスプリッタとを備え、
前記制御部は、前記試料を分析する際には、前記モニター光検出器から出力される光強度を示す光源モニター値を取得し、前記光検出器で検出された光強度を光源モニター値で除算した強度値を、蛍光強度としてスペクトルを表すことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分光蛍光光度計。
【請求項４】
前記制御部は、定期的に、前記試料室に標準試料が配置され、前記標準試料を分析した蛍光強度が予め決められた規定強度値の範囲内になるようにする補正係数を算出し、
前記試料を分析する際には、得られた蛍光強度を補正係数を用いて補正することを特徴とする請求項３に記載の分光蛍光光度計。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−６８１４６（Ｐ２０１２−６８１４６Ａ）
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１３７８４（Ｐ２０１０−２１３７８４）
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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