可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物の安定性を向上する方法
【課題】
本発明は、可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物の安定性を向上する方法に関するものである。可溶性ＧＤＨとしては、糸状菌由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨが好ましく、特に、Ａ．オリゼ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ、あるいは、Ａ．テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨにおいて、最も効果が認められている。
【解決手段】
可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させることによりＧＤＨの安定性を向上することができ、グルコース測定試薬の測定精度を高めることが期待できる。
本発明は、可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物の安定性を向上する方法に関するものである。可溶性ＧＤＨとしては、糸状菌由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨが好ましく、特に、Ａ．オリゼ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ、あるいは、Ａ．テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨにおいて、最も効果が認められている。
【解決手段】
可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させることによりＧＤＨの安定性を向上することができ、グルコース測定試薬の測定精度を高めることが期待できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補酵素を必要とする可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではグルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨとも記載する。）を含む組成物の安定性を向上する方法および該方法を用いた組成物に関するものである。
さらに詳しくは、フラビン化合物などを補酵素とする可溶性グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法および該方法を用いた組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００４】
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。
【特許文献１】ＷＯ ２００４／０５８９５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素の熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前述のとおり、特許文献１に記載のＦＡＤＧＤＨの熱安定性は５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であると書かれている。
しかし、これは、あくまでも野生株から培養、精製して得られた酵素標品での結果であり、我々が検討したところ、該酵素の大腸菌組換え体においては、酵素表面に多糖が付加されておらず、著しく熱安定性が低下することがわかった。
【０００７】
我々がアスペルギルス・オリゼ株から取得したＦＡＤＧＤＨと、アスペルギルス・オリゼのＦＡＤＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現して取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ＡＯＧＤＨ）の熱安定性を比較したところ、同じ、５０℃、１５分処理において、前者は約７７％の活性を維持していたが、後者のｒＦＡＤＧＤＨでは、約１３％の活性しか維持できていなかった。
また、我々はアスペルギルス・テレウス株（ＮＢＲＣ ３３０２６）から取得したＦＡＤＧＤＨと、アスペルギルス・テレウスのＦＡＤＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現して取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ＡＴＧＤＨ）の熱安定性を比較したところ、同じ、５０℃、１５分処理において、前者は約９０％の活性を維持していたが、後者のｒＦＡＤＧＤＨでは、約２％の活性しか維持できていなかった。
血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、組換え体を利用する場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上させる必要があった。
【０００８】
これまでＰＱＱＧＤＨの安定性を向上する方策に関する報告としては特許文献２があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されているが、酵素の改変を用いずに安定性を増大させる手段については、その可能性すら触れられていなかった。
【特許文献２】ＷＯ０２／０７２８３９
【０００９】
加熱乾燥可能なレベルとは、５０℃、１５分処理後の残存活性が２０％以上存在する状態であり、好ましくは４０％以上の残存活性が存在する状態であり、更に好ましくは、６０％以上の残存活性が存在する状態である。
【００１０】
本発明は以下のような構成からなる。
項１．
補酵素を必要とする可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの安定性を向上させる方法。
項２．
補酵素がピロロキノンキノリンまたはフラビン化合物またはニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）であるＧＤＨを含む組成物における、項１に記載の安定性を向上させる方法。
項３．
溶液中で共存させる各化合物の終濃度が０．０１重量％以上であり、かつ、各化合物の合計の濃度が３０重量％以下である項１または２記載の安定性を向上させる方法。
項４．
添加する化合物がトレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―D−グルコシド、シクロデキストリン、α−D−メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、アラニン、セリン、ＢＳＡ、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、アラビノース、ソルビタン、２−デオキシーDーグルコース、キシロース、フルクトース、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フェニルアラニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１〜３に記載の熱安定性を向上させる方法。
項５．
フラビン化合物を補酵素とするＧＤＨが糸状菌由来であることを特徴とする項１〜４記載の熱安定性を向上する方法。
項６．
項１〜５のいずれかに記載の方法により熱安定性が向上した、可溶性ＧＤＨを含む組成物。
項７．
フラビン化合物結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）組換え体を含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、１５分処理した場合でも、２０％以上のＧＤＨ活性を残存することを特徴とする項６記載のＧＤＨ含有組成物。
項８．
フラビン化合物結合型ＧＤＨを含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、３０分処理した場合でも、１０％以上のＧＤＨ活性を残存することを特徴とする項６記載のＧＤＨ含有組成物。
項９．
項６〜８の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
項１０．
項６〜８の組成物を含むグルコースセンサ。
項１１．
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの熱安定性が向上した組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるＧＤＨ組成物の安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性の優れたＧＤＨ組成物を用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ＧＤＨは、以下の反応を触媒する酵素である。
Ｄ−グルコース ＋ 電子伝達物質（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ 電子伝達物質（還元型）
Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
【００１３】
本発明の方法に適用することができるＧＤＨは、可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）であれば特に限定されない。
補酵素としては、例えばフラビン化合物をとることができる。
【００１４】
本発明の方法に適用することができる、補酵素としてＦＡＤをとるＧＤＨ（ＦＡＤ結合型ＧＤＨ）としては、特に限定されるものではないが、例えば、真核生物の範疇に属する糸状菌のペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属などの微生物に由来するものが挙げられる。これら微生物菌株は各菌株保存機関より分譲を依頼することにより容易に入手することができる。
例えば、ペニシリウム属のペニシリウム・リラシノエキヌラタムは、寄託番号ＮＢＲＣ６２３１として製品評価技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。また、アスペルギルス属のアスペルギルス・テレウスは、寄託番号ＮＢＲＣ ３３０２６として製品評価技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。
【００１５】
アスペルギルス・オリゼについては、以下にＧＤＨ遺伝子の取得手順の概略を示す。
【００１６】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であった。（実験例１［１］）
よって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。
【００１７】
そこで、我々はＧＤＨを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。（実験例１［２］）
次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。（実験例１［３］［４］）
最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定（実験例１［５］）、取得した。
【００１８】
＜実験例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼは、土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。また、我々はアスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Ｏｃｔｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等による精製を試みたが、アスペルギルス・オリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなっているのではないかと推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。
【００１９】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
【００２０】
［３］ｃＤＮＡの作製
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ―（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
【００２１】
［４］ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定
上記で精製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号９）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号１０）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
【００２２】
［５］ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
【００２３】
本発明の方法に適用することができるＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【００２４】
例えば、上記のＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００２５】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００２６】
上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。
【００２７】
本発明におけるＧＤＨの濃度は特に制約がない。用いる酵素の特性等によって適切な範囲は異なるが、実用上、当該酵素を用いてグルコースを十分な信頼性をもって測定できると当業者が判断できる濃度であればよい。
例えば、本発明におけるＦＡＤＧＤＨの濃度は特に制約がないが、溶液中の場合、好ましい下限は、０．０１Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．１Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２Ｕ／ｍＬである。好ましい上限は、５０００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは、５００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは５０Ｕ／ｍＬである。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末標品を調製する目的では、５０００Ｕ／ｍＬ以上の濃度にすることができる。
【００２８】
上記微生物を培養する培地としては、微生物が生育し、かつ本発明に示すＧＤＨを生産しうるものであれば特に限定されないが、より好適には微生物の生育に必要な炭素源、無機窒素源及び／または有機窒素源を含有するものがよく、さらに好ましくは通気攪拌に適した液体培地であるのがよい。液体培地の場合、炭素源としては例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、蔗糖などが、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスティープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、脱脂大豆、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等の無機塩、ビタミン類等）を含んでいてもよい。
【００２９】
培養方法は、当分野において知られている常法に従う。例えば上記栄養素を含む液体培地に微生物の胞子もしくは生育状態の菌体を植菌し、静置もしくは通気攪拌により菌体を増殖させるが、好ましくは通気攪拌により培養するのがよい。培養液のｐＨは好ましくは５〜９であり、さらに好ましくは６〜８である。温度は通常１４〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃で行うのがよい。通常は１４〜１４４時間培養を継続するが、好ましくは各々の培養条件においてＧＤＨの発現量が最大となる時点で培養を終了するのがよい。このような時点を見極める方策としては、培養液のサンプリングを行って培養液中のＧＤＨ活性を測定することでその変化をモニタリングし、経時的なＧＤＨ活性の上昇がなくなった時点をピークとみなして培養停止すればよい。
【００３０】
上記の培養液からＧＤＨを抽出する方法としては、菌体内に蓄積したＧＤＨを回収する場合にあっては遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体のみを集め、この菌体を溶媒、好ましくは水もしくは緩衝液に再懸濁する。再懸濁した菌体は公知の方法により破砕することで菌体中のＧＤＨを溶媒中に抽出することができる。破砕方法としては、溶菌酵素を用いることもでき、また物理的破砕方法を用いてもよい。溶菌酵素としては特に限定されないが、適用可能な酵素の例としてはシグマ社製「Ｌｙｔｉｃａｓｅ」等が挙げられる。また、物理的破砕の方法としては例えば超音波破砕、ガラスビーズ破砕、ホモジナイズ破砕等が挙げられる。破砕処理後の溶液は、遠心分離もしくはろ過により残渣を取り除いてＧＤＨ粗抽出溶液を得ることができる。
【００３１】
また本発明における培養方法としては固体培養によることもできる。好ましくは温度や湿度等を適宜制御の上で小麦等のふすま上に本発明のＧＤＨ生産能を有する真核微生物を生育させる。このとき、培養は静置により行ってもよく、また培養物を攪拌する等して混合してもよい。ＧＤＨの抽出は、培養物に溶媒、このましくは水もしくは緩衝液を加えてＧＤＨを溶解させ、遠心分離もしくはろ過により菌体やふすま等の固形物を取り除くことでなされる。
【００３２】
ＧＤＨの精製は、ＧＤＨ活性の存在する画分に応じて通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。上記ＧＤＨ抽出液から、例えば塩析、溶媒沈殿、透析、限外ろ過、ゲルろ過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことができる。
【００３３】
本発明のＧＤＨの熱安定性を向上させる方法の一形態は、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、（１）該酵素、と、（２）該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む。
添加する化合物として好ましいものとして、トレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―D−グルコシド、シクロデキストリン、α−D−メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、アラニン、セリン、ＢＳＡからなる群より選ばれるいずれか１つ以上を挙げることができる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましい下限は、０．００１重量％、さらに好ましくは、０．０１％、さらに好ましくは０．１％である。夾雑物の持込の危険性から、好ましい上限は、３０重量％、さらに好ましくは、２０％、さらに好ましくは１０％である。なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、溶液中の場合は、溶媒に対する重量％、粉末乾燥物に対しては、GDH酵素に対する重量％で表している。例えば、粉末乾燥物では、４０ｍｇ／ｍｌのＧＤＨに対して６０％の安定化剤を添加したとすると、２４ｍｇ安定化剤を溶解したことになり、その際の溶液中での濃度は約２．４％になる。粉末安定化の検証実験でも、溶液中で熱安定化効果を示した濃度範囲内で粉末安定化効果が見られており、粉末安定性に関しても溶液中の濃度と同様範囲で効果を発揮することが容易に推測できる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましい下限は、０．０１ｍＭ、さらに好ましくは、０．１ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭである。好ましい上限は、１０Ｍ、さらに好ましくは、５Ｍ、さらに好ましくは１Ｍである。
粉末あるいは凍結乾燥物を作製する場合には、溶液中の場合と同程度の化合物濃度を含有する組成にて乾燥処理を施すことにより同様の効果を持った乾燥標品を取得することができる。
なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、ＧＤＨ酵素と共存して保存する時の終濃度である。
【００３４】
また本発明のＧＤＨを含む組成物は液状で供することもできるが、凍結乾燥、真空乾燥あるいはスプレードライ等により粉末化することができる。このとき、ＧＤＨは緩衝液等に溶解したものを用いることができ、さらに賦形剤あるいは安定化剤として本発明で用いる上記化合物以外の糖・糖アルコール類、アミノ酸、タンパク質、ペプチド等を添加することができる。また、粉末化後さらに造粒することもできる。
【００３５】
上記に示すＧＤＨの抽出・精製・粉末化、および安定性試験に用いる緩衝液の組成は特に限定しないが、好ましくはｐＨ５〜８の範囲で緩衝能を有するものであればよく、例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。また、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸などのような、ジカルボン酸をベースとした緩衝剤も挙げることができる。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
粉末あるいは凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜８０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
【００３６】
上記に示す種々の化合物は後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサを作製する前に添加しておくことが望ましいが、測定時に添加してもよい。また、ＧＤＨの抽出・精製・粉末化などの各製造工程において工程液に添加することもできる。
【００３７】
本発明でいう熱安定性の向上とは、ＧＤＨ酵素を含む組成物をある一定の温度で、一定時間熱処理した後、維持されているＧＤＨ酵素の残存率（％）が増大することを意味する。本願発明では、ほぼ完全に活性が維持される４℃保存のサンプルを１００％として、これと一定温度で一定時間熱処理した後のＧＤＨ溶液の活性値を比較して、その酵素の残存率を算出している。この残存率が該化合物無添加のものと比べて増大していた場合、ＧＤＨの熱安定性が向上したと判断した。
【００３８】
具体的に、安定性が向上しているかどうかの判断は、次のように行った。
後述のＧＤＨ酵素活性の測定方法に記載の活性測定法において、４℃保存した溶液のＧＤＨ活性値（ａ）と、一定温度で一定時間熱処理した後のＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、測定値（ａ）を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求めた。この相対値を残存率（％）とした。そして、該化合物の添加の有無を比較して、添加により残存率が増大した場合、熱安定性が向上したと判断した。
【００３９】
本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）と２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）との組み合わせ、ＰＭＳとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組み合わせ、ＤＣＰＩＰ単独、フェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）単独、フェロセン単独、ニトロソアニリン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）が好ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
【００４０】
本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例えば、界面活性剤などを添加しても良い。
【００４１】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
【００４２】
グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００４３】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００４４】
グルコースセンサ
本発明はまた、本発明に従うＧＤＨを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはメディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、また、これらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００４５】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【００４７】
試験例１：ＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性の測定方法
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００４８】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００４９】
実施例５：糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ組換え体標品の調製
アスペルギルス・オリゼＴＩ株（土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。）、および、アスペルギルス・テレウスＮＢＲＣ３３０２６株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３，４、および、配列番号７，８に示す４種類のオリゴＤＮＡを合成し、夫々のｍＲＮＡから調製した夫々のｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてアスペルギルス・オリゼ、および、アスペルギルス・テレウスのＧＤＨ（ＡＯＧＤＨ）遺伝子を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、２種類の組換えプラスミド（ｐＡＯＧＤＨ，ｐＡＴＧＤＨ）を構築した。これらの組換えプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて夫々導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子、および、ＡＴＧＤＨの塩基配列の決定を行った（配列番号１、５）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、アスペルギルス・オリゼで５９３アミノ酸（配列番号２）、および、アスペルギルス・テレウスで５６８アミノ酸（配列番号６）であった。また、同様の手法により、ペニシリウム・イタリカムのＧＤＨ（ＰＩＧＤＨ）遺伝子を含有する組換えプラスミド（ｐＰＩＧＤＨ）を導入した形質転換体も取得した。
これら形質転換体をＴＢ培地（２．４％酵母エキス、１．２％ポリペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、５０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて培養温度２５℃、通気量２Ｌ／分、攪拌回転速度１７０ｒｐｍで４８時間培養した。
培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に６６０ｎｍでの菌体濁度が約５０となるように懸濁し、６５ＭＰａの圧力でホモジナイザー破砕を行った。破砕液を遠心分離して得た上清に終濃度９％となるようポリエチレンイミンを添加することで核酸等を沈殿させ、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去しＧＤＨ組換え体標品を調製した。
実施例６：糸状菌野生株由来ＦＡＤＧＤＨ標品の調製
糸状菌野生株由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨ生産菌としてアスペルギルス・テレウスＮＢＲＣ３３０２６株とアスペルギルス・オリゼＴＩ株を用い、それぞれのＬ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌後に上記の菌糸懸濁液をそれぞれ投入、培養を開始した。培養条件は、温度３０℃、通気量２Ｌ／分、攪拌数３８０ｒｐｍで行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、ヌッチェろ過器を用いて吸引ろ過によりろ紙上にそれぞれの菌株の菌体を集めた。培養液５Ｌを分子量１０，０００カットの限外ろ過用中空糸モジュールで１／１０量に濃縮し、濃縮液にそれぞれ硫酸アンモニウムを終濃度が６０％飽和（４５６ｇ／Ｌ）となるように添加、溶解した。続いて日立高速冷却遠心機で８０００ｒｐｍ１５分遠心し残渣を沈殿させたのち、上清をＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度０．６〜０．０飽和でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５セファロースカラムでゲルろ過を行ってタンパク質画分を回収することで脱塩を行い、脱塩液に０．６飽和相当の硫酸アンモニウムを添加して溶解した。これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度０．６〜０．０飽和でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。さらに、得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５セファロースカラムでゲルろ過を行ってタンパク質画分を回収し、取得した精製酵素をＦＡＤ依存型ＧＬＤ評価標品として使用した。
【００５０】
本発明のグルコース測定用組成物、グルコースアッセイキット、グルコースセンサ、あるいはグルコース測定方法に用いるメディエーターは、特に制限されるものではないが、好ましくは、２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ−ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（略称ＤＣＰＩＰ）、フェロセンあるいはそれらの誘導体（例えばフェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなど）を用いるのがよい。これらのメディエーターは市販のものを入手することができる。
【００５１】
実施例７：グルコース測定系を用いた各種安定化剤のＦＡＤＧＤＨ熱安定化効果の検討
検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、実施例５で所得したアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＬＤ組換え体標品（ｒＡＯＦＡＤＧＤＨ）を約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液０．９ｍｌに、表１記載に各種安定化剤を夫々の終濃度となるように添加して、合計容量を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
これらの検討の結果、ＦＡＤＧＤＨの基質とならない糖類やある種のアミノ酸類を添加することにより、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性が増大することが明らかとなった（表１）。
アミノ酸類よりも糖類の方が高い熱安定化効果が見られ、その中でも、トレハロース、マンノース、グルコン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−メリビオースで高い効果が見られた。
【００５２】
【表１】
【００５３】
実施例８：ＦＡＤＧＤＨ熱安定化効果に及ぼすトレハロース有効濃度の検討
次に、高い熱安定化効果の見られたトレハロースについて、その効果を発揮する有効濃度について検討した。方法は、先の実施例７に準じて行った。その結果、添加濃度の増加にしたがって、効果が増大する傾向が見られ、たとえ終濃度０．０１％トレハロースの添加においても、安定化効果を発揮することが明らかとなった（表２）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例９：その他相乗効果の検討
基本的な方法は、先の実施例７に準じて、その他の安定化剤においても、各々組み合わせることにより、相乗効果が見られないか検討した。その結果、セリンｘＢＳＡの組合せ（表３）やトレハロースｘマンノース、トレハロースｘグリシン、マンノースｘグリシンの組合せ（表４）においても単独で使用した場合と比べて明らかな熱安定化効果が確認できた。
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【００５８】
実施例１０：トレハロースｘグリシン、マンノースｘグリシンの有効濃度の検討
実施例１０の検討で高い熱安定化効果の見られたトレハロースｘグリシン、マンノースｘグリシンの組み合わせについて、その効果を発揮する有効濃度について検討した。方法は、先の実施例７に準じて行った。その結果、これら混合物においても添加濃度の増加にしたがって、効果が増大する傾向が見られた。終濃度０．０１％で各化合物を添加した場合でも、５０℃，３０分間処理において、２０％前後の残存活性が見られ、先の０．０１％トレハロースを単独で使用した場合と比べて２倍近い安定化効果が認められた（表５）。
【００５９】
【表５】
【００６０】
実施例１１：各種ＦＡＤＧＤＨにおける安定化剤の熱安定化効果の検討
基本的な方法は、先の実施例７に準じて、各種ＦＡＤＧＤＨにおける安定化剤の熱安定化効果について検討した。安定化剤として４％Ｄ−グルクロン酸ナトリウムｘ４％グリシンの混合組成を利用した。その結果、野生株由来ＧＤＨ、組換え体ＧＤＨを問わず、安定化剤の効果が見られることが明らかとなった（表６）。
【００６１】
【表６】
【００６２】
実施例１２：グルコース測定系を用いた保存安定性の検討
検討は、実施例５で所得したアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＬＤ組換え体標品（ｒＡＯＦＡＤＧＤＨ）を用い、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。ＦＡＤＧＤＨ酵素溶液中に占めるのＦＡＤＧＤＨタンパク質量を測定し、これに対して６０％あるいは３０％に相当する安定化剤を溶解したものを１ｍｌ用意した。例えば、１０ｍｇのＦＡＤＧＤＨを含有する酵素液に対して、６０％相当のＢＳＡを添加する場合には、６ｍｇのＢＳＡを溶解した。
各種安定化剤を添加した酵素溶液から正確に０．２ｍｌずつバイアルに分取したものを数本用意した。また、コントロールには、安定化剤を添加しないものを用意した。用意したバイアルを凍結真空乾燥（ＦＤＲ）して、水分を完全に蒸発させた後、同じ安定化剤を添加したサンプルの内２本のみ、直ちに、活性測定を行った。一方、検体バイアルでは、２５℃、湿度７０％で数時間処理した後、３７℃で保存して、１週間後の残存活性を測定した。活性残存率は、ＦＤＲ直後の活性平均値を１００％として、３７℃処理後の各サンプルの活性平均値を測定して活性残存率（％）を算出した。そして、活性残存率が高くなっているほど、保存安定性が向上していると判断した。
その結果、ＢＳＡ，セリン，トレハロース単独でも粉末酵素の保存安定性の向上が見られたが、ＢＳＡｘセリンを組み合わせることにより、更なる、保存安定化効果が認められた。酵素標品の量の関係から、２，３の組合せのみで検討を行ったが、熱安定化効果のあった化合物では、いずれにおいても同様の保存安定化効果があるものと思われる。（表７、表８）
【００６３】
【表７】
【００６４】
【表８】
【００６５】
実施例１３：グルコース測定系を用いた各種安定化剤のＦＡＤＧＤＨ熱安定化効果の検討
検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、実施例５で所得したアスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤＧＬＤ組換え体標品（ｒＡＴＦＡＤＧＤＨ）を約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液０．９ｍｌに、表１記載に各種安定化剤を夫々の終濃度となるように添加して、合計容量を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
これらの検討の結果、ＦＡＤＧＤＨの基質とならない糖類やある種のアミノ酸類を添加することにより、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性が増大することが明らかとなった（表９、表１０）。
アミノ酸類よりも糖類の方が高い熱安定化効果が見られ、その中でも、トレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−メリビオース、スクロース、グリシン、アラニン、セリン、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、アラビノース、ソルビタン、２−デオキシーＤーグルコース、キシロース、フルクトース、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フェニルアラニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンで高い効果が見られた。
【００６６】
【表９】
【００６７】
【表１０】
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によるＧＤＨ組成物の安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性の優れたＧＤＨ組成物を用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補酵素を必要とする可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではグルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨとも記載する。）を含む組成物の安定性を向上する方法および該方法を用いた組成物に関するものである。
さらに詳しくは、フラビン化合物などを補酵素とする可溶性グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法および該方法を用いた組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００４】
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。
【特許文献１】ＷＯ ２００４／０５８９５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素の熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前述のとおり、特許文献１に記載のＦＡＤＧＤＨの熱安定性は５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であると書かれている。
しかし、これは、あくまでも野生株から培養、精製して得られた酵素標品での結果であり、我々が検討したところ、該酵素の大腸菌組換え体においては、酵素表面に多糖が付加されておらず、著しく熱安定性が低下することがわかった。
【０００７】
我々がアスペルギルス・オリゼ株から取得したＦＡＤＧＤＨと、アスペルギルス・オリゼのＦＡＤＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現して取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ＡＯＧＤＨ）の熱安定性を比較したところ、同じ、５０℃、１５分処理において、前者は約７７％の活性を維持していたが、後者のｒＦＡＤＧＤＨでは、約１３％の活性しか維持できていなかった。
また、我々はアスペルギルス・テレウス株（ＮＢＲＣ ３３０２６）から取得したＦＡＤＧＤＨと、アスペルギルス・テレウスのＦＡＤＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現して取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ＡＴＧＤＨ）の熱安定性を比較したところ、同じ、５０℃、１５分処理において、前者は約９０％の活性を維持していたが、後者のｒＦＡＤＧＤＨでは、約２％の活性しか維持できていなかった。
血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、組換え体を利用する場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上させる必要があった。
【０００８】
これまでＰＱＱＧＤＨの安定性を向上する方策に関する報告としては特許文献２があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されているが、酵素の改変を用いずに安定性を増大させる手段については、その可能性すら触れられていなかった。
【特許文献２】ＷＯ０２／０７２８３９
【０００９】
加熱乾燥可能なレベルとは、５０℃、１５分処理後の残存活性が２０％以上存在する状態であり、好ましくは４０％以上の残存活性が存在する状態であり、更に好ましくは、６０％以上の残存活性が存在する状態である。
【００１０】
本発明は以下のような構成からなる。
項１．
補酵素を必要とする可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの安定性を向上させる方法。
項２．
補酵素がピロロキノンキノリンまたはフラビン化合物またはニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）であるＧＤＨを含む組成物における、項１に記載の安定性を向上させる方法。
項３．
溶液中で共存させる各化合物の終濃度が０．０１重量％以上であり、かつ、各化合物の合計の濃度が３０重量％以下である項１または２記載の安定性を向上させる方法。
項４．
添加する化合物がトレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―D−グルコシド、シクロデキストリン、α−D−メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、アラニン、セリン、ＢＳＡ、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、アラビノース、ソルビタン、２−デオキシーDーグルコース、キシロース、フルクトース、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フェニルアラニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１〜３に記載の熱安定性を向上させる方法。
項５．
フラビン化合物を補酵素とするＧＤＨが糸状菌由来であることを特徴とする項１〜４記載の熱安定性を向上する方法。
項６．
項１〜５のいずれかに記載の方法により熱安定性が向上した、可溶性ＧＤＨを含む組成物。
項７．
フラビン化合物結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）組換え体を含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、１５分処理した場合でも、２０％以上のＧＤＨ活性を残存することを特徴とする項６記載のＧＤＨ含有組成物。
項８．
フラビン化合物結合型ＧＤＨを含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、３０分処理した場合でも、１０％以上のＧＤＨ活性を残存することを特徴とする項６記載のＧＤＨ含有組成物。
項９．
項６〜８の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
項１０．
項６〜８の組成物を含むグルコースセンサ。
項１１．
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの熱安定性が向上した組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるＧＤＨ組成物の安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性の優れたＧＤＨ組成物を用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ＧＤＨは、以下の反応を触媒する酵素である。
Ｄ−グルコース ＋ 電子伝達物質（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ 電子伝達物質（還元型）
Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
【００１３】
本発明の方法に適用することができるＧＤＨは、可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）であれば特に限定されない。
補酵素としては、例えばフラビン化合物をとることができる。
【００１４】
本発明の方法に適用することができる、補酵素としてＦＡＤをとるＧＤＨ（ＦＡＤ結合型ＧＤＨ）としては、特に限定されるものではないが、例えば、真核生物の範疇に属する糸状菌のペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属などの微生物に由来するものが挙げられる。これら微生物菌株は各菌株保存機関より分譲を依頼することにより容易に入手することができる。
例えば、ペニシリウム属のペニシリウム・リラシノエキヌラタムは、寄託番号ＮＢＲＣ６２３１として製品評価技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。また、アスペルギルス属のアスペルギルス・テレウスは、寄託番号ＮＢＲＣ ３３０２６として製品評価技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。
【００１５】
アスペルギルス・オリゼについては、以下にＧＤＨ遺伝子の取得手順の概略を示す。
【００１６】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であった。（実験例１［１］）
よって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。
【００１７】
そこで、我々はＧＤＨを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。（実験例１［２］）
次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。（実験例１［３］［４］）
最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定（実験例１［５］）、取得した。
【００１８】
＜実験例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼは、土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。また、我々はアスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Ｏｃｔｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等による精製を試みたが、アスペルギルス・オリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなっているのではないかと推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。
【００１９】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
【００２０】
［３］ｃＤＮＡの作製
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ―（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
【００２１】
［４］ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定
上記で精製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号９）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号１０）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
【００２２】
［５］ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
【００２３】
本発明の方法に適用することができるＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【００２４】
例えば、上記のＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００２５】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００２６】
上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。
【００２７】
本発明におけるＧＤＨの濃度は特に制約がない。用いる酵素の特性等によって適切な範囲は異なるが、実用上、当該酵素を用いてグルコースを十分な信頼性をもって測定できると当業者が判断できる濃度であればよい。
例えば、本発明におけるＦＡＤＧＤＨの濃度は特に制約がないが、溶液中の場合、好ましい下限は、０．０１Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．１Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２Ｕ／ｍＬである。好ましい上限は、５０００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは、５００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは５０Ｕ／ｍＬである。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末標品を調製する目的では、５０００Ｕ／ｍＬ以上の濃度にすることができる。
【００２８】
上記微生物を培養する培地としては、微生物が生育し、かつ本発明に示すＧＤＨを生産しうるものであれば特に限定されないが、より好適には微生物の生育に必要な炭素源、無機窒素源及び／または有機窒素源を含有するものがよく、さらに好ましくは通気攪拌に適した液体培地であるのがよい。液体培地の場合、炭素源としては例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、蔗糖などが、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスティープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、脱脂大豆、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等の無機塩、ビタミン類等）を含んでいてもよい。
【００２９】
培養方法は、当分野において知られている常法に従う。例えば上記栄養素を含む液体培地に微生物の胞子もしくは生育状態の菌体を植菌し、静置もしくは通気攪拌により菌体を増殖させるが、好ましくは通気攪拌により培養するのがよい。培養液のｐＨは好ましくは５〜９であり、さらに好ましくは６〜８である。温度は通常１４〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃で行うのがよい。通常は１４〜１４４時間培養を継続するが、好ましくは各々の培養条件においてＧＤＨの発現量が最大となる時点で培養を終了するのがよい。このような時点を見極める方策としては、培養液のサンプリングを行って培養液中のＧＤＨ活性を測定することでその変化をモニタリングし、経時的なＧＤＨ活性の上昇がなくなった時点をピークとみなして培養停止すればよい。
【００３０】
上記の培養液からＧＤＨを抽出する方法としては、菌体内に蓄積したＧＤＨを回収する場合にあっては遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体のみを集め、この菌体を溶媒、好ましくは水もしくは緩衝液に再懸濁する。再懸濁した菌体は公知の方法により破砕することで菌体中のＧＤＨを溶媒中に抽出することができる。破砕方法としては、溶菌酵素を用いることもでき、また物理的破砕方法を用いてもよい。溶菌酵素としては特に限定されないが、適用可能な酵素の例としてはシグマ社製「Ｌｙｔｉｃａｓｅ」等が挙げられる。また、物理的破砕の方法としては例えば超音波破砕、ガラスビーズ破砕、ホモジナイズ破砕等が挙げられる。破砕処理後の溶液は、遠心分離もしくはろ過により残渣を取り除いてＧＤＨ粗抽出溶液を得ることができる。
【００３１】
また本発明における培養方法としては固体培養によることもできる。好ましくは温度や湿度等を適宜制御の上で小麦等のふすま上に本発明のＧＤＨ生産能を有する真核微生物を生育させる。このとき、培養は静置により行ってもよく、また培養物を攪拌する等して混合してもよい。ＧＤＨの抽出は、培養物に溶媒、このましくは水もしくは緩衝液を加えてＧＤＨを溶解させ、遠心分離もしくはろ過により菌体やふすま等の固形物を取り除くことでなされる。
【００３２】
ＧＤＨの精製は、ＧＤＨ活性の存在する画分に応じて通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。上記ＧＤＨ抽出液から、例えば塩析、溶媒沈殿、透析、限外ろ過、ゲルろ過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことができる。
【００３３】
本発明のＧＤＨの熱安定性を向上させる方法の一形態は、可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、（１）該酵素、と、（２）該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む。
添加する化合物として好ましいものとして、トレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―D−グルコシド、シクロデキストリン、α−D−メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、アラニン、セリン、ＢＳＡからなる群より選ばれるいずれか１つ以上を挙げることができる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましい下限は、０．００１重量％、さらに好ましくは、０．０１％、さらに好ましくは０．１％である。夾雑物の持込の危険性から、好ましい上限は、３０重量％、さらに好ましくは、２０％、さらに好ましくは１０％である。なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、溶液中の場合は、溶媒に対する重量％、粉末乾燥物に対しては、GDH酵素に対する重量％で表している。例えば、粉末乾燥物では、４０ｍｇ／ｍｌのＧＤＨに対して６０％の安定化剤を添加したとすると、２４ｍｇ安定化剤を溶解したことになり、その際の溶液中での濃度は約２．４％になる。粉末安定化の検証実験でも、溶液中で熱安定化効果を示した濃度範囲内で粉末安定化効果が見られており、粉末安定性に関しても溶液中の濃度と同様範囲で効果を発揮することが容易に推測できる。
これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の場合、好ましい下限は、０．０１ｍＭ、さらに好ましくは、０．１ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭである。好ましい上限は、１０Ｍ、さらに好ましくは、５Ｍ、さらに好ましくは１Ｍである。
粉末あるいは凍結乾燥物を作製する場合には、溶液中の場合と同程度の化合物濃度を含有する組成にて乾燥処理を施すことにより同様の効果を持った乾燥標品を取得することができる。
なお、実施例で記載されている化合物の濃度は、ＧＤＨ酵素と共存して保存する時の終濃度である。
【００３４】
また本発明のＧＤＨを含む組成物は液状で供することもできるが、凍結乾燥、真空乾燥あるいはスプレードライ等により粉末化することができる。このとき、ＧＤＨは緩衝液等に溶解したものを用いることができ、さらに賦形剤あるいは安定化剤として本発明で用いる上記化合物以外の糖・糖アルコール類、アミノ酸、タンパク質、ペプチド等を添加することができる。また、粉末化後さらに造粒することもできる。
【００３５】
上記に示すＧＤＨの抽出・精製・粉末化、および安定性試験に用いる緩衝液の組成は特に限定しないが、好ましくはｐＨ５〜８の範囲で緩衝能を有するものであればよく、例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。また、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸などのような、ジカルボン酸をベースとした緩衝剤も挙げることができる。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
粉末あるいは凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜８０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
【００３６】
上記に示す種々の化合物は後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサを作製する前に添加しておくことが望ましいが、測定時に添加してもよい。また、ＧＤＨの抽出・精製・粉末化などの各製造工程において工程液に添加することもできる。
【００３７】
本発明でいう熱安定性の向上とは、ＧＤＨ酵素を含む組成物をある一定の温度で、一定時間熱処理した後、維持されているＧＤＨ酵素の残存率（％）が増大することを意味する。本願発明では、ほぼ完全に活性が維持される４℃保存のサンプルを１００％として、これと一定温度で一定時間熱処理した後のＧＤＨ溶液の活性値を比較して、その酵素の残存率を算出している。この残存率が該化合物無添加のものと比べて増大していた場合、ＧＤＨの熱安定性が向上したと判断した。
【００３８】
具体的に、安定性が向上しているかどうかの判断は、次のように行った。
後述のＧＤＨ酵素活性の測定方法に記載の活性測定法において、４℃保存した溶液のＧＤＨ活性値（ａ）と、一定温度で一定時間熱処理した後のＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、測定値（ａ）を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求めた。この相対値を残存率（％）とした。そして、該化合物の添加の有無を比較して、添加により残存率が増大した場合、熱安定性が向上したと判断した。
【００３９】
本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）と２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）との組み合わせ、ＰＭＳとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組み合わせ、ＤＣＰＩＰ単独、フェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）単独、フェロセン単独、ニトロソアニリン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）が好ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
【００４０】
本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例えば、界面活性剤などを添加しても良い。
【００４１】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
【００４２】
グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００４３】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００４４】
グルコースセンサ
本発明はまた、本発明に従うＧＤＨを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはメディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、また、これらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００４５】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【００４７】
試験例１：ＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性の測定方法
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００４８】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００４９】
実施例５：糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ組換え体標品の調製
アスペルギルス・オリゼＴＩ株（土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。）、および、アスペルギルス・テレウスＮＢＲＣ３３０２６株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３，４、および、配列番号７，８に示す４種類のオリゴＤＮＡを合成し、夫々のｍＲＮＡから調製した夫々のｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてアスペルギルス・オリゼ、および、アスペルギルス・テレウスのＧＤＨ（ＡＯＧＤＨ）遺伝子を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、２種類の組換えプラスミド（ｐＡＯＧＤＨ，ｐＡＴＧＤＨ）を構築した。これらの組換えプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて夫々導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子、および、ＡＴＧＤＨの塩基配列の決定を行った（配列番号１、５）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、アスペルギルス・オリゼで５９３アミノ酸（配列番号２）、および、アスペルギルス・テレウスで５６８アミノ酸（配列番号６）であった。また、同様の手法により、ペニシリウム・イタリカムのＧＤＨ（ＰＩＧＤＨ）遺伝子を含有する組換えプラスミド（ｐＰＩＧＤＨ）を導入した形質転換体も取得した。
これら形質転換体をＴＢ培地（２．４％酵母エキス、１．２％ポリペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、５０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて培養温度２５℃、通気量２Ｌ／分、攪拌回転速度１７０ｒｐｍで４８時間培養した。
培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に６６０ｎｍでの菌体濁度が約５０となるように懸濁し、６５ＭＰａの圧力でホモジナイザー破砕を行った。破砕液を遠心分離して得た上清に終濃度９％となるようポリエチレンイミンを添加することで核酸等を沈殿させ、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去しＧＤＨ組換え体標品を調製した。
実施例６：糸状菌野生株由来ＦＡＤＧＤＨ標品の調製
糸状菌野生株由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨ生産菌としてアスペルギルス・テレウスＮＢＲＣ３３０２６株とアスペルギルス・オリゼＴＩ株を用い、それぞれのＬ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌後に上記の菌糸懸濁液をそれぞれ投入、培養を開始した。培養条件は、温度３０℃、通気量２Ｌ／分、攪拌数３８０ｒｐｍで行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、ヌッチェろ過器を用いて吸引ろ過によりろ紙上にそれぞれの菌株の菌体を集めた。培養液５Ｌを分子量１０，０００カットの限外ろ過用中空糸モジュールで１／１０量に濃縮し、濃縮液にそれぞれ硫酸アンモニウムを終濃度が６０％飽和（４５６ｇ／Ｌ）となるように添加、溶解した。続いて日立高速冷却遠心機で８０００ｒｐｍ１５分遠心し残渣を沈殿させたのち、上清をＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度０．６〜０．０飽和でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５セファロースカラムでゲルろ過を行ってタンパク質画分を回収することで脱塩を行い、脱塩液に０．６飽和相当の硫酸アンモニウムを添加して溶解した。これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度０．６〜０．０飽和でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。さらに、得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５セファロースカラムでゲルろ過を行ってタンパク質画分を回収し、取得した精製酵素をＦＡＤ依存型ＧＬＤ評価標品として使用した。
【００５０】
本発明のグルコース測定用組成物、グルコースアッセイキット、グルコースセンサ、あるいはグルコース測定方法に用いるメディエーターは、特に制限されるものではないが、好ましくは、２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ−ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（略称ＤＣＰＩＰ）、フェロセンあるいはそれらの誘導体（例えばフェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなど）を用いるのがよい。これらのメディエーターは市販のものを入手することができる。
【００５１】
実施例７：グルコース測定系を用いた各種安定化剤のＦＡＤＧＤＨ熱安定化効果の検討
検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、実施例５で所得したアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＬＤ組換え体標品（ｒＡＯＦＡＤＧＤＨ）を約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液０．９ｍｌに、表１記載に各種安定化剤を夫々の終濃度となるように添加して、合計容量を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
これらの検討の結果、ＦＡＤＧＤＨの基質とならない糖類やある種のアミノ酸類を添加することにより、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性が増大することが明らかとなった（表１）。
アミノ酸類よりも糖類の方が高い熱安定化効果が見られ、その中でも、トレハロース、マンノース、グルコン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−メリビオースで高い効果が見られた。
【００５２】
【表１】
【００５３】
実施例８：ＦＡＤＧＤＨ熱安定化効果に及ぼすトレハロース有効濃度の検討
次に、高い熱安定化効果の見られたトレハロースについて、その効果を発揮する有効濃度について検討した。方法は、先の実施例７に準じて行った。その結果、添加濃度の増加にしたがって、効果が増大する傾向が見られ、たとえ終濃度０．０１％トレハロースの添加においても、安定化効果を発揮することが明らかとなった（表２）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例９：その他相乗効果の検討
基本的な方法は、先の実施例７に準じて、その他の安定化剤においても、各々組み合わせることにより、相乗効果が見られないか検討した。その結果、セリンｘＢＳＡの組合せ（表３）やトレハロースｘマンノース、トレハロースｘグリシン、マンノースｘグリシンの組合せ（表４）においても単独で使用した場合と比べて明らかな熱安定化効果が確認できた。
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【００５８】
実施例１０：トレハロースｘグリシン、マンノースｘグリシンの有効濃度の検討
実施例１０の検討で高い熱安定化効果の見られたトレハロースｘグリシン、マンノースｘグリシンの組み合わせについて、その効果を発揮する有効濃度について検討した。方法は、先の実施例７に準じて行った。その結果、これら混合物においても添加濃度の増加にしたがって、効果が増大する傾向が見られた。終濃度０．０１％で各化合物を添加した場合でも、５０℃，３０分間処理において、２０％前後の残存活性が見られ、先の０．０１％トレハロースを単独で使用した場合と比べて２倍近い安定化効果が認められた（表５）。
【００５９】
【表５】
【００６０】
実施例１１：各種ＦＡＤＧＤＨにおける安定化剤の熱安定化効果の検討
基本的な方法は、先の実施例７に準じて、各種ＦＡＤＧＤＨにおける安定化剤の熱安定化効果について検討した。安定化剤として４％Ｄ−グルクロン酸ナトリウムｘ４％グリシンの混合組成を利用した。その結果、野生株由来ＧＤＨ、組換え体ＧＤＨを問わず、安定化剤の効果が見られることが明らかとなった（表６）。
【００６１】
【表６】
【００６２】
実施例１２：グルコース測定系を用いた保存安定性の検討
検討は、実施例５で所得したアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＬＤ組換え体標品（ｒＡＯＦＡＤＧＤＨ）を用い、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。ＦＡＤＧＤＨ酵素溶液中に占めるのＦＡＤＧＤＨタンパク質量を測定し、これに対して６０％あるいは３０％に相当する安定化剤を溶解したものを１ｍｌ用意した。例えば、１０ｍｇのＦＡＤＧＤＨを含有する酵素液に対して、６０％相当のＢＳＡを添加する場合には、６ｍｇのＢＳＡを溶解した。
各種安定化剤を添加した酵素溶液から正確に０．２ｍｌずつバイアルに分取したものを数本用意した。また、コントロールには、安定化剤を添加しないものを用意した。用意したバイアルを凍結真空乾燥（ＦＤＲ）して、水分を完全に蒸発させた後、同じ安定化剤を添加したサンプルの内２本のみ、直ちに、活性測定を行った。一方、検体バイアルでは、２５℃、湿度７０％で数時間処理した後、３７℃で保存して、１週間後の残存活性を測定した。活性残存率は、ＦＤＲ直後の活性平均値を１００％として、３７℃処理後の各サンプルの活性平均値を測定して活性残存率（％）を算出した。そして、活性残存率が高くなっているほど、保存安定性が向上していると判断した。
その結果、ＢＳＡ，セリン，トレハロース単独でも粉末酵素の保存安定性の向上が見られたが、ＢＳＡｘセリンを組み合わせることにより、更なる、保存安定化効果が認められた。酵素標品の量の関係から、２，３の組合せのみで検討を行ったが、熱安定化効果のあった化合物では、いずれにおいても同様の保存安定化効果があるものと思われる。（表７、表８）
【００６３】
【表７】
【００６４】
【表８】
【００６５】
実施例１３：グルコース測定系を用いた各種安定化剤のＦＡＤＧＤＨ熱安定化効果の検討
検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、実施例５で所得したアスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤＧＬＤ組換え体標品（ｒＡＴＦＡＤＧＤＨ）を約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液０．９ｍｌに、表１記載に各種安定化剤を夫々の終濃度となるように添加して、合計容量を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
これらの検討の結果、ＦＡＤＧＤＨの基質とならない糖類やある種のアミノ酸類を添加することにより、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性が増大することが明らかとなった（表９、表１０）。
アミノ酸類よりも糖類の方が高い熱安定化効果が見られ、その中でも、トレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−メリビオース、スクロース、グリシン、アラニン、セリン、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、アラビノース、ソルビタン、２−デオキシーＤーグルコース、キシロース、フルクトース、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フェニルアラニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンで高い効果が見られた。
【００６６】
【表９】
【００６７】
【表１０】
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によるＧＤＨ組成物の安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性の優れたＧＤＨ組成物を用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビン化合物を補酵素とする可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの安定性を向上させる方法。
【請求項２】
溶液中で共存させる各化合物の終濃度が０．０１重量％以上であり、かつ、各化合物の合計の濃度が３０重量％以下である請求項１記載の安定性を向上させる方法。
【請求項３】
添加する化合物がトレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―Ｄ−グルコシド、シクロデキストリン、α−Ｄ−メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、アラニン、セリン、ＢＳＡ、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、アラビノース、ソルビタン、２−デオキシーＤーグルコース、キシロース、フルクトース、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フェニルアラニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１〜２に記載の熱安定性を向上させる方法。
【請求項４】
フラビン化合物を補酵素とするＧＤＨが糸状菌由来であることを特徴とする請求項１〜３記載の熱安定性を向上する方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により熱安定性が向上した、可溶性ＧＤＨを含む組成物。
【請求項６】
フラビン化合物結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）組換え体を含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、１５分処理した場合でも、２０％以上のＧＤＨ活性を残存することを特徴とする請求項５記載のＧＤＨ含有組成物。
【請求項７】
フラビン化合物結合型ＧＤＨを含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、３０分処理した場合でも、１０％以上のＧＤＨ活性を残存することを特徴とする請求項５記載のＧＤＨ含有組成物。
【請求項８】
請求項５〜７の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
【請求項９】
請求項５〜７の組成物を含むグルコースセンサ。
【請求項１０】
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの熱安定性が向上した組成物の製造方法。
【請求項１】
フラビン化合物を補酵素とする可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの安定性を向上させる方法。
【請求項２】
溶液中で共存させる各化合物の終濃度が０．０１重量％以上であり、かつ、各化合物の合計の濃度が３０重量％以下である請求項１記載の安定性を向上させる方法。
【請求項３】
添加する化合物がトレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル―α―Ｄ−グルコシド、シクロデキストリン、α−Ｄ−メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、アラニン、セリン、ＢＳＡ、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、アラビノース、ソルビタン、２−デオキシーＤーグルコース、キシロース、フルクトース、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フェニルアラニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１〜２に記載の熱安定性を向上させる方法。
【請求項４】
フラビン化合物を補酵素とするＧＤＨが糸状菌由来であることを特徴とする請求項１〜３記載の熱安定性を向上する方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により熱安定性が向上した、可溶性ＧＤＨを含む組成物。
【請求項６】
フラビン化合物結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）組換え体を含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、１５分処理した場合でも、２０％以上のＧＤＨ活性を残存することを特徴とする請求項５記載のＧＤＨ含有組成物。
【請求項７】
フラビン化合物結合型ＧＤＨを含む組成物において、４℃で保存した該組成物と比べて、５０℃、３０分処理した場合でも、１０％以上のＧＤＨ活性を残存することを特徴とする請求項５記載のＧＤＨ含有組成物。
【請求項８】
請求項５〜７の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
【請求項９】
請求項５〜７の組成物を含むグルコースセンサ。
【請求項１０】
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの熱安定性が向上した組成物の製造方法。
【公開番号】特開２００８−１５４５７３（Ｐ２００８−１５４５７３Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７５０２１（Ｐ２００７−７５０２１）
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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