抗炎症化合物
【課題】 沙棘由来の抗炎症効果を持つ化合物を明らかにするとともに、該化合物の新規用途を開発することを目的とする。
【解決手段】 下記一般式（１）に示すトリテルペン誘導体並びに該トリテルペン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、一酸化窒素産生抑制剤及びラジカル消去剤により解決する。
【化１】
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同時に又は各々独立して水酸基、水素原子、Ｃ1-6アルキル基又はアルキルエーテル基を意味する。）
【解決手段】 下記一般式（１）に示すトリテルペン誘導体並びに該トリテルペン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、一酸化窒素産生抑制剤及びラジカル消去剤により解決する。
【化１】
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同時に又は各々独立して水酸基、水素原子、Ｃ1-6アルキル基又はアルキルエーテル基を意味する。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗炎症効果を持つ化合物に係り、特に、沙棘から分離された抗炎症化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
沙棘（Hippophae rhamnoides L．）は、グミ科の落葉低木で、主に中国黄河流域に多く自生する他、ヨーロッパ、旧ソ連、西アジア、中東など広範囲にも分布している。中国では、古くから沙棘の果実を喘息、消化不良、炎症などに利用されてきた。
【０００３】
また、近年では、沙棘は、動脈硬化、狭心症、潰瘍、放射線傷害などにも応用されている。本植物の化学的成分には、果実、種子、茎と葉に含まれる、フラボノイド配糖体、ステロール、精油、トリテルペン誘導体があることが報告されている。薬理作用としては、血圧低下、抗動脈硬化、鎮咳、去痰、平喘、抗菌作用が知られている。
【０００４】
例えば、特開２００４−２１７５４５号公報には、沙棘由来でタンパク質非酵素的糖化抑制活性、アルドース還元酵素阻害活性及びフリーラジカル消去活性を示す新規なフラボノイド配糖体であって、糖尿病又は糖尿病合併症の予防・治療、老化や癌、動脈硬化、脳梗塞等の疾病の予防・治療に有効であることが記載されている。
【特許文献１】特開２００４−２１７５４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、沙棘に抗炎症効果があると知られていたものの、有効成分については未知であった。本発明は、沙棘由来の抗炎症効果を持つ化合物を明らかにするとともに、該化合物の新規用途を開発することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは沙棘由来の有効成分について鋭意検討を行った結果、抗炎症効果を有する化合物を明らかにするに至った。本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、下記一般式（１）に示すトリテルペン誘導体を提供するものである。このトリテルペン誘導体、及び薬理学的に許容される塩は、抗炎症作用（一酸化窒素産生抑制作用）、ラジカル消去作用を有している。
【０００７】
【化１】
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同時に又は各々独立して水酸基、水素原子、Ｃ1-6アルキル基又はアルキルエーテル基を意味する。）
【０００８】
また、本発明は、下記一般式（２）に示すベンゾピラン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、一酸化窒素抑制剤を提供するものである。このベンゾピラン誘導体、又は薬理学的に許容される塩は、ラジカル消去作用をも有している。
【０００９】
【化２】
（上記式中、Ｒ４は水素原子、アルキル基、アシル基、糖類を意味する。）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上記一般式（１）に示すトリテルペン誘導体及び上記一般式（２）に示すベンゾピラン誘導体並びにこれらの薬理学的に許容される塩は、抗炎症作用（一酸化窒素産生抑制作用）、ラジカル消去作用を有している。そのため、各種炎症性疾患、各種アレルギー性疾患、糖尿病等の治療に有効であると考えられる。
【００１１】
新規トリテルペン誘導体及びベンゾピラン誘導体並びにそれらの薬理学的に許容される塩を治療目的で使用するためには、各化合物及びその無毒性塩を有効成分とし、経口または非経口的に投与される。投与量は症状、年齢、性別、体重、投与形態等により異なるが、例えば成人に経口的に投与する場合には、通常１日量は０．１−１０００ｍｇである。
【００１２】
新規トリテルペン誘導体及びベンゾピラン誘導体並びにそれらの薬理学的に許容される塩を製剤化するための剤型に制限はなく錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等の固形剤、溶液、懸濁液、乳剤などの液状製剤を経口的に、静脈内、筋肉内、皮下などの注射剤、坐剤、貼付剤などを非経口的に使用することができる。
【００１３】
固形剤となす場合には澱粉、乳糖、グルコース、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロースなどの賦形剤を用いることができ、必要であれば滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、着色剤なども使用することができる。注射剤、及び液状製剤になす場合には安定化剤、溶液助剤、懸濁化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤などを含有させることができる。
【００１４】
次に、上記一般式（１）にて示されるトリテルペン誘導体及び上記一般式（２）にて示されるベンゾピラン誘導体の製造例を説明する。
【００１５】
沙棘（Hippophae rhamnoides L．）の枝皮（３ｋｇ）を８０％アセトン（１０Ｌ）中に48時間浸漬して抽出物を得た。これを３回繰り返し、得られた抽出物を濃縮、乾固しエキス９２９．８４ｇを得た。
【００１６】
このエキス９２９．８４ｇを水に溶かし、ｎ−へキサン、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ブタノールで順次分配抽出し、減圧下濃縮してｎ−へキサン画分（２１．１４ｇ）、クロロホルム画分（２９．３４ｇ）、酢酸エチル画分（３７．１２ｇ）、ｎ−ブタノール画分（１８０．２３ｇ）、水画分（６３１．７３ｇ）をそれぞれ得た。
【００１７】
それぞれの画分について、サンプル濃度１００μｇ／ｍＬにおいて、後述する一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制試験を行ったところ、それぞれｎ−へキサン画分（８９．５％）、クロロホルム画分（９０．３％）、酢酸エチル画分（６７．２％）、ブタノール画分（２４．６％) 、水画分（０．８％）にＮＯ産生抑制活性が認められた。
【００１８】
続いて、それぞれの分画についてＭＴＴアッセイを行い、そこで活性の一番強かったクロロホルム画分２８．１ｇについて、シリカゲルカラム（ｗａｋｏ ｇｅｌ Ｃ−３００、６．５×１８ｃｍ）に付し、ｎ−へキサン、酢酸エチル：ｎ−へキサン（２：９８、４：９６、８：９２、１５：８５、２０：８０、４０：６０、８０：２０）、酢酸エチルおよびメタノールで順次溶出し、６つの画分ｆｒ．１（１．３ｇ）、ｆｒ．２（１．０ｇ）、ｆｒ．３（２．０ｇ）、ｆｒ．４（１．５ｇ）、ｆｒ．５（２．８ｇ）、ｆｒ．６（１２．２ｇ）を得た。
【００１９】
次に、ｆｒ．３画分について順相のＨＰＬＣ、カラムはＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｓｉｌｉｃａ ＳＧ ８０Ａ １０×２５０ｍｍ、移動相はへキサン：酢酸エチル７０：３０、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ（室温）で溶出させ、保持時間８分２０秒に溶出するピークをＳｈｏｄｅｘ ＲＩ−７２（示差屈折計）を用いて分取した。この画分（２３０ｍｇ）を再び逆相のＨＰＬＣにより、カラムＣａｐｃｅｌｌ ＰＡＫ Ｃ１８ １０×２５０ｍｍ、移動相はメタノール：水９５：５、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ（室温）で溶出させ、保持時間１０分４０秒に溶出するピークをＵＶ（２１０ｎｍ）を用いて分取し、化合物１（２４．９mｇ）を得た。下記に化合物１の構造式（３）を示す。
【００２０】
【化３】
【００２１】
ｆｒ．４画分についてＯＤＳカラム（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ１００−２００ｍｅｓｈ、５．５×１５ｃｍ）に付し、水：メタノール（５０：５０→０：１００）で溶出し、９個（ｆｒ．４−１乃至ｆｒ．４−９）の画分を得た。このうち、ｆｒ．４−１（０．１２ｇ）について逆相のＨＰＬＣ、カラムＣａｐｃｅｌｌ ＰＡＫ Ｃ１８ １０×２５０ｍｍ、移動相はメタノール：水 ３５：６５、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ（室温）で溶出させ、保持時間１３分４０秒に溶出するピークをＵＶ（２５４ｎｍ）を用いて分取し、化合物３（１２．８ｍｇ）を得た。下記に化合物２の構造式（４）を示す。
【００２２】
【化４】
【００２３】
以下に、得られた化合物の1H- 及び13C-NMRのデータ、MS、IR、UVのデータを示す。なお、化合物３及び４はVSRIAN Mercury 300により測定し、1H-NMRは300MHz、13C-NMRは75MHzにより測定した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
また、表２に、化合物２の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータ(300 MHz, in Chloroform-d)を示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
ｆｒ．４−６ (０．０７ｇ）について順相のＨＰＬＣ、カラムＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｓｉｌｉｃａ ＳＧ ８０Ａ １０×２５０ｍｍ、移動相はへキサン：酢酸エチル：アセトン６０：３５：５、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ（室温）で溶出させ、保持時間１１分１３秒に溶出するピークを、ＵＶ（２５４ｎｍ）を用いて分取し、化合物３（６．０ｍｇ）を得た。下記に化合物３の構造式（５）を示す。
【００２８】
【化５】
【００２９】
化合物３の性状に関するデータを表３に示す。なお、HR-FAB-MS (m/z)の測定はJOEL GC mateを用いて行い、UV λmaxnm (logε)の測定Shimadzu UV-160を用いて行い、IR νcm-1maxの測定はJASCO IR A-2を用いて行った。
【００３０】
【表３】
【００３１】
また、化合物４の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータ(600 MHz, in Methanol-d4)を表４に示す。
【表４】
【００３２】
［試験例１］ＮＯ産生抑制活性試験
化合物１〜３をサンプルとして、下記の要領で一酸化窒素産生抑制活性試験を行った。各サンプルをＤＭＳＯに溶解した。別途、F-12HAM培地５００ｍＬにＬ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍＬ、ＦＢＳ５０ｍＬを加えた培地を調製し、該倍地中のＤＭＳＯが０．２重量％になるように調製した。次に、コンフエルエントになったＲＡＷ２６４．７細胞５０ｍＬを調製した培地に添加し、細胞懸濁液とした。この細胞懸濁液をＦａｌｃｏｎチューブに入れた。
【００３３】
遠心器 (１０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃) でＲＡＷ２６４．７細胞を遠沈し、上清をアスピレーターを用いて除いた。次いで上清を除いたＦａｌｃｏｎチューブに新鮮培地を２０ｍＬ加え、懸濁することにより１．５×１０5個／ｍＬの濃度に調製した懸濁液を得た。そして、９６穴プレート (住友ベークライト社製８０９６Ｒ) に上記懸濁液を２００μＬずつ分注し、１時間、ＣＯ2インキュベーターにて細胞を密着させた。
【００３４】
インキュベート後、９６穴プレートにＬＰＳ(１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製Ｏ５５：Ｂ５) ２μＬとｍｏｕｓｅ ＩＮＦ−γ(３３ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製) ２μＬ及び化合物溶液０．４μＬを加えた。これを１６時間、ＣＯ2インキュベーターにて培養し、培養上清１００μＬを採取した。
【００３５】
これに、０．１％ナフチルジアミン溶液５０μＬとスルファニルアミド溶液５０μＬを加え、室温にて１０分間遮光して放置後、分光光度計にてＯ．Ｄ．５７０ｎｍ (対照６５５ｎｍ) で測定した。細胞生存率（Cell viability）については、鏡検による観察とＭＴＴ法により判定した。
抑制率（％）＝｛１−（Ｘ−Ｙ）／（Ｚ−Ｙ）｝×１００
Ｘ：試験化合物の存在下でＩＦＮ−γとＬＰＳにより誘導されるＮＯ2-の量
Ｙ：試験化合物、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳがない状態で誘導されるＮＯ2-の量
Ｚ：ＩＦＮ−γとＬＰＳにより誘導されるＮＯ2−の量
更に、算出した値から、サンプル化合物によるＮＯ産生抑制活が５０％阻害された濃度（ＩＣ50）を求めた。細胞生存率（Cell viability）の結果と併せて表５に示す。なお、表中、「Ａ」はＮＯ産生抑制率(%)を意味し、「Ｂ」は細胞生存率（％）を意味する。
評価基準
【００３６】
【表５】
【００３７】
［試験例２］ラジカル消去活性試験
化合物１〜３をサンプルとして、Ｏｋａｄａらの方法に基づきラジカル消去活性試験を行った。９６穴プレート（住友ベークライト社製、＃８０９６Ｒ）に０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）４０μＬ、１２％含水エタノール溶液１２０μＬ、ジメチルスルホキシドで溶解した試験化合物０．４μＬを加えた後、０．５ｍＭ ＤＰＰＨ溶液４０μＬを加えて暗所で３０分間放置した。その後、プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製３５５０プレートリーダー）により５２０nmの吸光度を測定した。そして、得られた測定値につき、下記計算式を用いてＤＰＰＨラジカルの消去率を算出した。更に、算出した値から、サンプル化合物によるラジカル消去活性が５０％阻害された濃度（ＩＣ50）を求め、結果を表６に示した。
消去率（％）＝｛１−（Ｘ−Ｚ）／（Ｙ−Ｚ）｝×１００
Ｘ：試験化合物を添加したときの吸光度
Ｙ：試験化合物を添加していないときの吸光度
Ｚ：ジメチルスルホキシドと１２％エタノール溶液のみの吸光度
【００３８】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗炎症効果を持つ化合物に係り、特に、沙棘から分離された抗炎症化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
沙棘（Hippophae rhamnoides L．）は、グミ科の落葉低木で、主に中国黄河流域に多く自生する他、ヨーロッパ、旧ソ連、西アジア、中東など広範囲にも分布している。中国では、古くから沙棘の果実を喘息、消化不良、炎症などに利用されてきた。
【０００３】
また、近年では、沙棘は、動脈硬化、狭心症、潰瘍、放射線傷害などにも応用されている。本植物の化学的成分には、果実、種子、茎と葉に含まれる、フラボノイド配糖体、ステロール、精油、トリテルペン誘導体があることが報告されている。薬理作用としては、血圧低下、抗動脈硬化、鎮咳、去痰、平喘、抗菌作用が知られている。
【０００４】
例えば、特開２００４−２１７５４５号公報には、沙棘由来でタンパク質非酵素的糖化抑制活性、アルドース還元酵素阻害活性及びフリーラジカル消去活性を示す新規なフラボノイド配糖体であって、糖尿病又は糖尿病合併症の予防・治療、老化や癌、動脈硬化、脳梗塞等の疾病の予防・治療に有効であることが記載されている。
【特許文献１】特開２００４−２１７５４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、沙棘に抗炎症効果があると知られていたものの、有効成分については未知であった。本発明は、沙棘由来の抗炎症効果を持つ化合物を明らかにするとともに、該化合物の新規用途を開発することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは沙棘由来の有効成分について鋭意検討を行った結果、抗炎症効果を有する化合物を明らかにするに至った。本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、下記一般式（１）に示すトリテルペン誘導体を提供するものである。このトリテルペン誘導体、及び薬理学的に許容される塩は、抗炎症作用（一酸化窒素産生抑制作用）、ラジカル消去作用を有している。
【０００７】
【化１】
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同時に又は各々独立して水酸基、水素原子、Ｃ1-6アルキル基又はアルキルエーテル基を意味する。）
【０００８】
また、本発明は、下記一般式（２）に示すベンゾピラン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、一酸化窒素抑制剤を提供するものである。このベンゾピラン誘導体、又は薬理学的に許容される塩は、ラジカル消去作用をも有している。
【０００９】
【化２】
（上記式中、Ｒ４は水素原子、アルキル基、アシル基、糖類を意味する。）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上記一般式（１）に示すトリテルペン誘導体及び上記一般式（２）に示すベンゾピラン誘導体並びにこれらの薬理学的に許容される塩は、抗炎症作用（一酸化窒素産生抑制作用）、ラジカル消去作用を有している。そのため、各種炎症性疾患、各種アレルギー性疾患、糖尿病等の治療に有効であると考えられる。
【００１１】
新規トリテルペン誘導体及びベンゾピラン誘導体並びにそれらの薬理学的に許容される塩を治療目的で使用するためには、各化合物及びその無毒性塩を有効成分とし、経口または非経口的に投与される。投与量は症状、年齢、性別、体重、投与形態等により異なるが、例えば成人に経口的に投与する場合には、通常１日量は０．１−１０００ｍｇである。
【００１２】
新規トリテルペン誘導体及びベンゾピラン誘導体並びにそれらの薬理学的に許容される塩を製剤化するための剤型に制限はなく錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等の固形剤、溶液、懸濁液、乳剤などの液状製剤を経口的に、静脈内、筋肉内、皮下などの注射剤、坐剤、貼付剤などを非経口的に使用することができる。
【００１３】
固形剤となす場合には澱粉、乳糖、グルコース、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロースなどの賦形剤を用いることができ、必要であれば滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、着色剤なども使用することができる。注射剤、及び液状製剤になす場合には安定化剤、溶液助剤、懸濁化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤などを含有させることができる。
【００１４】
次に、上記一般式（１）にて示されるトリテルペン誘導体及び上記一般式（２）にて示されるベンゾピラン誘導体の製造例を説明する。
【００１５】
沙棘（Hippophae rhamnoides L．）の枝皮（３ｋｇ）を８０％アセトン（１０Ｌ）中に48時間浸漬して抽出物を得た。これを３回繰り返し、得られた抽出物を濃縮、乾固しエキス９２９．８４ｇを得た。
【００１６】
このエキス９２９．８４ｇを水に溶かし、ｎ−へキサン、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ブタノールで順次分配抽出し、減圧下濃縮してｎ−へキサン画分（２１．１４ｇ）、クロロホルム画分（２９．３４ｇ）、酢酸エチル画分（３７．１２ｇ）、ｎ−ブタノール画分（１８０．２３ｇ）、水画分（６３１．７３ｇ）をそれぞれ得た。
【００１７】
それぞれの画分について、サンプル濃度１００μｇ／ｍＬにおいて、後述する一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制試験を行ったところ、それぞれｎ−へキサン画分（８９．５％）、クロロホルム画分（９０．３％）、酢酸エチル画分（６７．２％）、ブタノール画分（２４．６％) 、水画分（０．８％）にＮＯ産生抑制活性が認められた。
【００１８】
続いて、それぞれの分画についてＭＴＴアッセイを行い、そこで活性の一番強かったクロロホルム画分２８．１ｇについて、シリカゲルカラム（ｗａｋｏ ｇｅｌ Ｃ−３００、６．５×１８ｃｍ）に付し、ｎ−へキサン、酢酸エチル：ｎ−へキサン（２：９８、４：９６、８：９２、１５：８５、２０：８０、４０：６０、８０：２０）、酢酸エチルおよびメタノールで順次溶出し、６つの画分ｆｒ．１（１．３ｇ）、ｆｒ．２（１．０ｇ）、ｆｒ．３（２．０ｇ）、ｆｒ．４（１．５ｇ）、ｆｒ．５（２．８ｇ）、ｆｒ．６（１２．２ｇ）を得た。
【００１９】
次に、ｆｒ．３画分について順相のＨＰＬＣ、カラムはＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｓｉｌｉｃａ ＳＧ ８０Ａ １０×２５０ｍｍ、移動相はへキサン：酢酸エチル７０：３０、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ（室温）で溶出させ、保持時間８分２０秒に溶出するピークをＳｈｏｄｅｘ ＲＩ−７２（示差屈折計）を用いて分取した。この画分（２３０ｍｇ）を再び逆相のＨＰＬＣにより、カラムＣａｐｃｅｌｌ ＰＡＫ Ｃ１８ １０×２５０ｍｍ、移動相はメタノール：水９５：５、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ（室温）で溶出させ、保持時間１０分４０秒に溶出するピークをＵＶ（２１０ｎｍ）を用いて分取し、化合物１（２４．９mｇ）を得た。下記に化合物１の構造式（３）を示す。
【００２０】
【化３】
【００２１】
ｆｒ．４画分についてＯＤＳカラム（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ１００−２００ｍｅｓｈ、５．５×１５ｃｍ）に付し、水：メタノール（５０：５０→０：１００）で溶出し、９個（ｆｒ．４−１乃至ｆｒ．４−９）の画分を得た。このうち、ｆｒ．４−１（０．１２ｇ）について逆相のＨＰＬＣ、カラムＣａｐｃｅｌｌ ＰＡＫ Ｃ１８ １０×２５０ｍｍ、移動相はメタノール：水 ３５：６５、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ（室温）で溶出させ、保持時間１３分４０秒に溶出するピークをＵＶ（２５４ｎｍ）を用いて分取し、化合物３（１２．８ｍｇ）を得た。下記に化合物２の構造式（４）を示す。
【００２２】
【化４】
【００２３】
以下に、得られた化合物の1H- 及び13C-NMRのデータ、MS、IR、UVのデータを示す。なお、化合物３及び４はVSRIAN Mercury 300により測定し、1H-NMRは300MHz、13C-NMRは75MHzにより測定した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
また、表２に、化合物２の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータ(300 MHz, in Chloroform-d)を示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
ｆｒ．４−６ (０．０７ｇ）について順相のＨＰＬＣ、カラムＳｈｉｓｅｉｄｏ Ｓｉｌｉｃａ ＳＧ ８０Ａ １０×２５０ｍｍ、移動相はへキサン：酢酸エチル：アセトン６０：３５：５、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ（室温）で溶出させ、保持時間１１分１３秒に溶出するピークを、ＵＶ（２５４ｎｍ）を用いて分取し、化合物３（６．０ｍｇ）を得た。下記に化合物３の構造式（５）を示す。
【００２８】
【化５】
【００２９】
化合物３の性状に関するデータを表３に示す。なお、HR-FAB-MS (m/z)の測定はJOEL GC mateを用いて行い、UV λmaxnm (logε)の測定Shimadzu UV-160を用いて行い、IR νcm-1maxの測定はJASCO IR A-2を用いて行った。
【００３０】
【表３】
【００３１】
また、化合物４の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータ(600 MHz, in Methanol-d4)を表４に示す。
【表４】
【００３２】
［試験例１］ＮＯ産生抑制活性試験
化合物１〜３をサンプルとして、下記の要領で一酸化窒素産生抑制活性試験を行った。各サンプルをＤＭＳＯに溶解した。別途、F-12HAM培地５００ｍＬにＬ−グルタミン（２００ｍＭ）５ｍＬ、ＦＢＳ５０ｍＬを加えた培地を調製し、該倍地中のＤＭＳＯが０．２重量％になるように調製した。次に、コンフエルエントになったＲＡＷ２６４．７細胞５０ｍＬを調製した培地に添加し、細胞懸濁液とした。この細胞懸濁液をＦａｌｃｏｎチューブに入れた。
【００３３】
遠心器 (１０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃) でＲＡＷ２６４．７細胞を遠沈し、上清をアスピレーターを用いて除いた。次いで上清を除いたＦａｌｃｏｎチューブに新鮮培地を２０ｍＬ加え、懸濁することにより１．５×１０5個／ｍＬの濃度に調製した懸濁液を得た。そして、９６穴プレート (住友ベークライト社製８０９６Ｒ) に上記懸濁液を２００μＬずつ分注し、１時間、ＣＯ2インキュベーターにて細胞を密着させた。
【００３４】
インキュベート後、９６穴プレートにＬＰＳ(１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製Ｏ５５：Ｂ５) ２μＬとｍｏｕｓｅ ＩＮＦ−γ(３３ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製) ２μＬ及び化合物溶液０．４μＬを加えた。これを１６時間、ＣＯ2インキュベーターにて培養し、培養上清１００μＬを採取した。
【００３５】
これに、０．１％ナフチルジアミン溶液５０μＬとスルファニルアミド溶液５０μＬを加え、室温にて１０分間遮光して放置後、分光光度計にてＯ．Ｄ．５７０ｎｍ (対照６５５ｎｍ) で測定した。細胞生存率（Cell viability）については、鏡検による観察とＭＴＴ法により判定した。
抑制率（％）＝｛１−（Ｘ−Ｙ）／（Ｚ−Ｙ）｝×１００
Ｘ：試験化合物の存在下でＩＦＮ−γとＬＰＳにより誘導されるＮＯ2-の量
Ｙ：試験化合物、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳがない状態で誘導されるＮＯ2-の量
Ｚ：ＩＦＮ−γとＬＰＳにより誘導されるＮＯ2−の量
更に、算出した値から、サンプル化合物によるＮＯ産生抑制活が５０％阻害された濃度（ＩＣ50）を求めた。細胞生存率（Cell viability）の結果と併せて表５に示す。なお、表中、「Ａ」はＮＯ産生抑制率(%)を意味し、「Ｂ」は細胞生存率（％）を意味する。
評価基準
【００３６】
【表５】
【００３７】
［試験例２］ラジカル消去活性試験
化合物１〜３をサンプルとして、Ｏｋａｄａらの方法に基づきラジカル消去活性試験を行った。９６穴プレート（住友ベークライト社製、＃８０９６Ｒ）に０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）４０μＬ、１２％含水エタノール溶液１２０μＬ、ジメチルスルホキシドで溶解した試験化合物０．４μＬを加えた後、０．５ｍＭ ＤＰＰＨ溶液４０μＬを加えて暗所で３０分間放置した。その後、プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製３５５０プレートリーダー）により５２０nmの吸光度を測定した。そして、得られた測定値につき、下記計算式を用いてＤＰＰＨラジカルの消去率を算出した。更に、算出した値から、サンプル化合物によるラジカル消去活性が５０％阻害された濃度（ＩＣ50）を求め、結果を表６に示した。
消去率（％）＝｛１−（Ｘ−Ｚ）／（Ｙ−Ｚ）｝×１００
Ｘ：試験化合物を添加したときの吸光度
Ｙ：試験化合物を添加していないときの吸光度
Ｚ：ジメチルスルホキシドと１２％エタノール溶液のみの吸光度
【００３８】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）に示すトリテルペン誘導体。
【化１】
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同時に又は各々独立して水酸基、水素原子、Ｃ1-6アルキル基又はアルキルエーテル基を意味する。）
【請求項２】
請求項１記載のトリテルペン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載のトリテルペン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、ラジカル消去剤。
【請求項４】
下記一般式（２）に示すベンゾピラン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、一酸化窒素産生抑制剤。
【化２】
（上記式中、Ｒ４は水素原子、アルキル基、アシル基、糖類を意味する。）
【請求項５】
請求項４記載のベンゾピラン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、ラジカル消去剤。
【請求項１】
下記一般式（１）に示すトリテルペン誘導体。
【化１】
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同時に又は各々独立して水酸基、水素原子、Ｃ1-6アルキル基又はアルキルエーテル基を意味する。）
【請求項２】
請求項１記載のトリテルペン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、一酸化窒素産生抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載のトリテルペン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、ラジカル消去剤。
【請求項４】
下記一般式（２）に示すベンゾピラン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、一酸化窒素産生抑制剤。
【化２】
（上記式中、Ｒ４は水素原子、アルキル基、アシル基、糖類を意味する。）
【請求項５】
請求項４記載のベンゾピラン誘導体、又は薬理学的に許容される塩を有効成分とする、ラジカル消去剤。
【公開番号】特開２００７−５１１０１（Ｐ２００７−５１１０１Ａ）
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３８０５３（Ｐ２００５−２３８０５３）
【出願日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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