抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤、並びに皮膚化粧料及び美容用飲食品
【課題】白眉草の抽出物を含有する抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤、並びに皮膚化粧料及び美容用飲食品の提供。
【解決手段】白眉草の抽出物を含有し、スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有する抗酸化剤、白眉草の抽出物を含有し、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する抗老化剤、白眉草の抽出物を含有し、ヒスタミン遊離抑制作用、ＮＯ産生抑制作用、及びＣＯＸ−２活性阻害作用の少なくともいずれかを有する抗炎症剤である。
【解決手段】白眉草の抽出物を含有し、スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有する抗酸化剤、白眉草の抽出物を含有し、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する抗老化剤、白眉草の抽出物を含有し、ヒスタミン遊離抑制作用、ＮＯ産生抑制作用、及びＣＯＸ−２活性阻害作用の少なくともいずれかを有する抗炎症剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク科の白眉草の抽出物を含有する抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤、並びにこれらを含む皮膚化粧料及び美容用飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体成分を酸化させる要因として、活性酸素が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。活性酸素は、生体細胞内のエネルギー代謝過程で生じるものであり、スーパーオキサイド〔即ち、酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（１Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）〕等がある。このような活性酸素は食細胞の殺菌機構にとって必須であり、ウイルスや癌細胞の除去に重要な働きを果たしている。
しかし、前記活性酸素の過剰な生成は生体内の膜及び組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。生体内で生産され、他の活性酸素の出発物質ともなっているスーパーオキサイドは、通常、細胞内に含まれているスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）の触媒作用により逐次消去されている。しかし、スーパーオキサイドの産生が過剰な場合、或いはＳＯＤの作用が低下している場合には、スーパーオキサイドの消去が不十分になってスーパーオキサイド濃度が高くなる。このことが、関節リウマチ、ベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、シミ、ソバカス、しわ、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性、皮膚の老化などを起こす原因の一つであると考えられている。これらの中でも、皮膚は紫外線等の環境因子の刺激を直接受けるため、スーパーオキサイドが生成し易い器官であるから、スーパーオキサイド濃度の上昇により、例えば、コラーゲン等の生体組織を分解、変性、又は架橋したり、また油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成して、皮膚のしわを形成したり、皮膚の弾力性低下等の老化、炎症、肌の色素沈着を引き起こすという問題がある（非特許文献１参照）。
そこで、活性酸素消去物質、ラジカル消去物質、過酸化水素消去物質等を安全性の点で有利な天然物から得る試みがなされており、アブラナ科ブラシカ属植物の抽出物（特許文献１参照）、ベンケイソウ科リュウキュウベンケイ属植物の抽出物（特許文献２参照）、タマコチョウの抽出物（特許文献３参照）、スイオウの抽出物（特許文献４参照）、などに有効性が確認されている。
【０００３】
また、グルタチオンはグルタミン酸、システイン、グリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。細胞内におけるグルタチオンの役割はラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、各種酵素のＳＨ供与体であり、抗酸化成分としても知られている。グルタチオンの作用発現はそのシステイン残基に由来すると考えられている。しかし、皮膚中のグルタチオン量は、加齢に伴って低下することが報告されており、このことが皮膚における酸化防御能を低下させ、細胞のＤＮＡ及びタンパク質などの構成成分にダメージを与える一因であると考えられている。
このように皮膚においてグルタチオンの産生を促進することは、加齢により衰える酸化ストレスの防御を高め、かつ紫外線による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化の予防、治療、あるいはシミ等の色素沈着に対する改善が期待できると考えられる。そこで、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、例えばビルベリー抽出物又はウォルナット抽出物（特許文献５参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献６参照）、などが開示されている。
【０００４】
皮膚は、表皮、基底膜、及び真皮から構成されている。前記基底膜は、表皮と真皮との境界部に存在し、表皮と真皮とを繋ぎ止めるだけでなく、皮膚機能の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献２参照）。前記基底膜の主要骨格はＩＶ型コラーゲンからなる網目構造をしている。若い皮膚においては、線維芽細胞の増殖が活発であり、基底膜の働きにより表皮、真皮の相互作用が恒常性を保つことで水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等のある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、線維芽細胞の増殖が遅くなり、細胞外マトリックス産生能力が低下することによって、肌は張りや弾力を失い、肌荒れシワ等の老化症状を呈するようになる。また、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンは分解乃至変質を起こし、基底膜構造が破壊される（非特許文献３参照）。その結果、皮膚の保湿機能及び弾力性が低下し、角質が異常剥離を始め、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、基底膜成分の減少、基底膜の構造変化が関与していることが知られている。
【０００５】
近年、真皮マトリックス成分の減少乃至変性を誘導する因子として、マトリックス系プロテアーゼの関与が指摘されている。このマトリックス系プロテアーゼの中でも、ＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテアーゼ−１）は、皮膚の真皮マトリックスの主な構成成分であるタイプＩコラーゲン、タイプＩＩＩコラーゲンなどを分解する酵素として知られている。その発現は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線によるコラーゲンの減少乃至変性の一因となり、皮膚のシワ形成等の大きな要因であると考えられる。
また、加齢に伴う皮膚老化の一因として、女性ホルモンの一種であるエストロゲンの分泌が減退することがある。エストロゲンは成人女性の健康維持に深く関わっており、その分泌不足は種々の内科的疾患を招く他、肌の過敏症、弾力性低下、潤いの減少等の好ましくない肌の変化の原因となることが知られている。
したがってＩＶ型コラーゲン産生の促進、ＭＭＰ−１活性の阻害、皮膚線維芽細胞増殖の促進、あるいは加齢によるエストロゲン分泌減退を補うことにより、皮膚のしわの形成、弾力性低下等の皮膚の老化を予防乃至治療できると考えられる。
【０００６】
炎症性の疾患、例えば接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他肌荒れを伴う各種皮膚疾患等の原因及び発症機構は多種多様である。その原因としてヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、シクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）によるものが知られている。
前記ヒスタミン遊離は肥満細胞内のヒスタミンが細胞外に遊離する現象であり、遊離されたヒスタミンが炎症反応を引き起こす。このため、ヒスタミン遊離を阻害乃至抑制する物質によりアレルギー性疾患、炎症性疾患を予防乃至治療する試みがなされている。このようなヒスタミン遊離抑制剤として、例えばトラニラスト、クロモグリク酸ナトリウム、バイカリン、バイカレイン、塩酸プロメタジンなどが用いられてきた。しかし、これらの物質はいずれも副作用があり、安全性の点で問題があった。
前記一酸化窒素（ＮＯ）は、大気汚染、酸性雨等の要因となる窒素酸化物である。また、近年、一酸化窒素（ＮＯ）は、血管内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）、神経伝達物質、生体防御における微生物、腫瘍細胞の障害因子等、生体内で多彩な機能を示す生理活性物質であることが報告されている。生理活性物質としては、マクロファージから産生される一酸化窒素が細菌やウイルスの感染を防御することが知られている。しかし、前記マクロファージから産生される一酸化窒素が大量に生合成されると、生体にとって無毒ではなく、自己組織の破壊を引き起こし、炎症の悪化、リューマチ、糖尿病等の病態の原因となることがある。また、大量に生合成された一酸化窒素が血管平滑筋の弛緩と過剰な透過性の増大をもたらし、著しい血圧の低下によってエンドトキシン・ショックを引き起こすこともある。
したがって炎症性疾患において、一酸化窒素（ＮＯ）の過剰な産生を抑制することが重要となる。このような一酸化窒素の産生抑制作用を有する生薬としては、例えば、ローズマリー抽出液、カルノソール、カルノシン酸、コーヒー豆の抽出液、サクラダソウ抽出液、オウレン抽出液、オウバク抽出液、カンゾウ抽出液、イヌノイバラの抽出液、センキュウ抽出液、トウニン抽出液、シャクヤク抽出液、ヨクイニン抽出液、アカブドウ抽出液（いずれも、特許文献７参照）、唐独活、タラ根皮、和続断、車前子、遠子、茜草根、半枝連、槐花、花椒（いずれも、非特許文献４参照）、などが報告されている。
【０００７】
また、炎症は、発赤、浮腫、発熱、痛み、機能障害等の症状を示す複雑な反応である。微視的に見ると、血漿漏出を起こす血管反応、白血球の浸潤、炎症性細胞による組織破壊などの共通する反応からなり、発熱反応、痛覚過敏等の中枢神経系が関与する全身の反応も引き起こす場合がある。このような炎症の個々の反応にはプロスタグランジンが重要な役割を果たしており、炎症時におけるプロスタグランジンの産生には、主として誘導型のシクロオキシゲナーゼであるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の関与が知られている。このため、炎症反応の防止乃至予防を図る目的で、アスピリンに代表される多くのシクロオキシゲナーゼ活性阻害剤が報告されている（非特許文献５参照）。また、植物由来のシクロオキシゲナーゼ活性阻害剤としては、マンゴスチン果皮抽出物中のα−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンが開示されている（特許文献８参照）。また、シクロオキシゲナーゼ−２活性阻害作用を有する化合物として、例えば２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン、２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オンの塩、又は２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オンの水和物が開示されている（特許文献９参照）。
このようにヒスタミンの遊離を抑制し、過剰な一酸化窒素（ＮＯ）の産生を抑制し、シクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）の活性を阻害することは、炎症性疾患を防止乃至改善する上で極めて重要である。
【０００８】
しかしながら、現在までのところ、入手が容易で安価であり、安全性の高い天然物系のものであって、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさず、皮膚化粧料及び美容用飲食物に広く使用可能な抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−８１８４８号公報
【特許文献２】特開２００５−２９４８３号公報
【特許文献３】特開２００６−３２１７３０号公報
【特許文献４】特開２００７−８９０２号公報
【特許文献５】特開２００６−２４１０６２号公報
【特許文献６】特開２００６−３４７９３４号公報
【特許文献７】特開２００２−８７９７５号公報
【特許文献８】特開２００２−４７１８０号公報
【特許文献９】特開２０００−１６９３５号公報
【非特許文献１】フレグランスジャーナル 臨時増刊Ｎｏ．１４、ｐ１５６ １９９５年
【非特許文献２】Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ ＭＰ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２ １９９：６９５−７０３
【非特許文献３】Ｌａｖｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９７９ ７３： ５９−６６
【非特許文献４】「和漢医薬学雑誌」，Ｖｏｌ．１５， ｐ．３０２−３０３，１９９８年発行
【非特許文献５】薬理学アトラス（Ｐ１８４）、福原武彦監訳、文光堂
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、第１に、スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗酸化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第２に、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗老化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第３に、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗炎症剤を提供することを目的とする。
本発明は、第４に、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、及び前記抗炎症剤の少なくともいずれかを有効成分として配合した皮膚化粧料及び美容用飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、入手が容易で安価であり、安全性の高い天然物系のものであって、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさず、皮膚化粧料及び美容用飲食物に広く使用可能な抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤について本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、キク科の白眉草の抽出物が、（１）優れたスーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有し、抗酸化剤として有用であること、（２）優れた皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、抗老化剤として有用であること、及び（３）優れたヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有し、抗炎症剤として有用であることを、それぞれ知見した。
【００１２】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤である。
＜２＞ スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有する前記＜１＞に記載の抗酸化剤である。
＜３＞ 白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤である。
＜４＞ 皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する前記＜３＞に記載の抗老化剤である。
＜５＞ 白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤である。
＜６＞ ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有する前記＜５＞に記載の抗炎症剤である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の白眉草の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚化粧料である。
＜８＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の白眉草の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美容用飲食品である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗酸化剤によると、優れたスーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを通じて、生体内の酸化防止、皮膚の老化を防止乃至改善することができる。
本発明の抗老化剤によると、優れた皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを通じて、皮膚のシワ及び皮膚の弾力低下の防止乃至改善することができる。
本発明の抗炎症剤によると、優れたヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを通じて、炎症性疾患を防止乃至改善することができる。
また、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤は、天然系抽出物であり安全性に優れ、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさないので皮膚化粧料に配合したり、美容用飲食品に添加して用いるのに好適なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤）
本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤は、白眉草の抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１５】
前記抗酸化剤は、抗酸化作用として、スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有している。
前記抗老化剤は、抗老化作用として、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有している。
前記抗炎症剤は、抗炎症作用として、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有している。
前記白眉草の抽出物における抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有する物質の詳細については不明であるが、該白眉草の抽出物がこれらの優れた作用を有し、抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤として有用であることは現在までのところ全く知られておらず、これらのことは、本発明者らの鋭意研究による新知見である。
【００１６】
前記白眉草（ハクビソウ）は、キク科の植物であり、学名はGerberia piloselloides Gerberaであり、毛大丁草（モウダイテイソウ）、満地香（マンチコウ）とも呼ばれる、多年生の草本であって、根茎は太くて厚く、綿毛がある。葉は基部から出て、多少柄があり、略円形乃至卵形、長さは５ｃｍ〜８ｃｍ、花茎は長さ１５ｃｍ〜３０ｃｍで時には４０ｃｍに達することもある。
前記白眉草は、中国の江蘇省、浙江省、四川省、広西壮族自治区、広東省、雲南省等の日の当たる所、山の斜面、道端、田んぼの周辺に野生しており、これらの地域から容易に入手可能である。
前記白眉草には、例えば止咳、発汗、利尿、滋養強壮等の効能が知られている。
【００１７】
前記白眉草の抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法により容易に得ることができる。なお、前記白眉草の抽出物には、白眉草の抽出液、該抽出液の希釈液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１８】
前記白眉草の抽出原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白眉草の葉部、花（蕾）部、枝部、種子、樹皮（これらを地上部という）、根部などを用いることができる。これらの中でも、葉部等の地上部が特に好ましい。
【００１９】
前記抽出原料である白眉草は、乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。なお、前記白眉草は、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。なお、脱脂等の前処理を行うことにより、白眉草の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２０】
前記抽出に用いる溶媒としては、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２１】
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２２】
本発明において、抽出原料である白眉草から、抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有する物質を抽出するにあたって特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。
【００２３】
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、抽出原料としての白眉草の地上部を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０℃〜９５℃にて１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０℃〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤として用いることができる。
【００２４】
得られる白眉草の抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２５】
なお、得られる白眉草の抽出液は、そのままでも抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、前記白眉草の抽出物は、特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料及び美容用飲食品に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製としては、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。
【００２６】
以上のようにして得られる白眉草の抽出物は、スーパーオキサイド消去作用、過酸化水素消去作用、ラジカル消去作用、グルタチオン産生促進作用、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、エストロゲン様作用、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有しており、これらの作用に基づいて、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤として使用することができる。
【００２７】
本発明の抗酸化剤における抗酸化作用は、スーパーオキサイド消去作用、過酸化水素消去作用、ラジカル消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の抗老化剤における抗老化作用は、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の抗炎症剤における抗炎症作用は、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の白眉草の抽出物は、優れた抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有すると共に、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、特に、以下に説明する本発明の皮膚化粧料に配合するのに好適である。
また、本発明の白眉草の抽出物は、優れた抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有すると共に、消化管で消化されるものではないことが確認されているので、特に、以下に説明する本発明の美容用飲食品に配合するのに好適である。
【００２８】
（皮膚化粧料）
本発明の皮膚化粧料は、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、及び前記抗炎症剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
【００２９】
ここで、前記皮膚化粧料の用途としては、特に制限はなく、各種用途から適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤、アストリンゼント、などが挙げられる。
【００３０】
前記抗酸化剤、前記抗老化剤、又は前記抗炎症剤の前記皮膚化粧料全体に対する配合量は、皮膚化粧料の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、前記白眉草の抽出物に換算して０．０００１質量％〜１０質量％が好ましく、０．００１質量％〜１質量％がより好ましい。
【００３１】
前記皮膚化粧料は、更に必要に応じて本発明の目的及び作用効果を損なわない範囲で、その皮膚化粧料の製造に通常使用される各種主剤及び助剤、その他の成分を添加することができる。
前記その他の成分としては、本発明の前記抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の妨げにならない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択した成分が挙げられ、例えば、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、などが挙げられる。これらの成分は、前記白眉草の抽出物と共に併用した場合、相乗的に作用して、通常期待される以上の優れた作用効果をもたらすことがある。
【００３２】
本発明の皮膚化粧料は、皮膚に使用した場合に高い安全性を有し、優れたスーパーオキサイド消去作用、過酸化水素消去作用、ラジカル消去作用、グルタチオン産生促進作用、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、エストロゲン様作用、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを効果的に発揮して、生体内の酸化防止、老化防止、炎症性疾患の予防乃至治療に有用である。
【００３３】
（美容用飲食品）
本発明の美容用飲食品は、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、及び前記抗炎症剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
ここで、前記美容用飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品、などの区分に制限されるものではなく、例えば、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものを意味する。
【００３４】
本発明の前記美容用飲食物は、白眉草の抽出物を、その活性を妨げないように任意の飲食物に配合したものであってもよいし、白眉草の抽出物を主成分とする栄養補助食品であってもよい。
【００３５】
前記美容用飲食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子類；カニ、サケ、アサリ、マグロ、イワシ、エビ、カツオ、サバ、クジラ、カキ、サンマ、イカ、アカガイ、ホタテ、アワビ、ウニ、イクラ、トコブシ等の水産物；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；カレー、シチュー、親子丼、お粥、雑炊、中華丼、かつ丼、天丼、うな丼、ハヤシライス、おでん、マーボドーフ、牛丼、ミートソース、玉子スープ、オムライス、餃子、シューマイ、ハンバーグ、ミートボール等のレトルトパウチ食品；種々の形態の健康食品や栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等の医薬品、医薬部外品などが挙げられる。
【００３６】
前記その他の成分としては、前記美容用飲食品を製造するに当たって通常用いられる補助的原料又は添加物、などが挙げられる。
前記原料又は添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤、などが挙げられる。
【００３７】
前記美容用飲食品における本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、又は前記抗炎症剤の添加量は、対象となる美容用飲食品の種類に応じて異なり一概には規定することができないが、美容用飲食品本来の味を損なわない範囲で添加すればよく、各種対象美容用飲食品に対し、０．００１質量％〜５０質量％が好ましく、０．０１質量％〜２０質量％がより好ましい。また、顆粒、錠剤又はカプセル形態の美容用飲食品の場合には、０．０１質量％〜１００質量％が好ましく、５質量％〜１００質量％がより好ましい。
【００３８】
本発明の美容用飲食品は、日常的に経口摂取することが可能であり、有効成分である白眉草の抽出物の働きによって、抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを極めて効果的に発揮させることができる。
【００３９】
なお、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、抗炎症剤、皮膚化粧料、及び美容用飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４１】
（製造例１）
−白眉草の水抽出物の製造−
抽出原料として白眉草の地上部の粉砕物１００ｇを、水１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００４２】
（製造例２）
−白眉草の５０質量％エタノール抽出物の製造−
抽出原料として白眉草の地上部の粉砕物１００ｇを、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００４３】
（製造例３）
−白眉草のエタノール抽出物の製造−
抽出原料として白眉草の地上部の粉砕物１００ｇを、エタノール１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（実施例１）
−スーパーオキサイド消去試験（ＮＢＴ法）−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりスーパーオキサイド消去作用を試験した。
３ｍｍｏｌ／Ｌのキサンチン、３ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１．５ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液、０．７５ｍｍｏｌ／Ｌのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）０．１ｍＬ、及び０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．２）２．４ｍＬを試験管にとり、これに各試料溶液０．１ｍＬを添加し、２５℃で１０分間放置した。次いで、キサンチンオキシダーゼ溶液を加えて素早く攪拌し、２５℃で２０分間静置した。その後、６ｍｍｏｌ／Ｌの塩化銅０．１ｍＬを加えて反応を停止させ、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。このとき測定した吸光度を「試料溶液添加、酵素溶液添加時の吸光度」とした。
また、同様の操作と吸光度の測定を、酵素溶液を添加せずに行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液添加、酵素溶液無添加時の吸光度」とした。
また、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液無添加、酵素溶液添加時の吸光度」とした。
また、酵素溶液を添加せず、更に試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液無添加、酵素溶液無添加時の吸光度」とした。
そして、測定結果から、下記数式１によりスーパーオキサイド消去率を求めた。
＜数式１＞
スーパーオキサイド消去率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
ただし、前記数式１中、Ａは試料溶液添加、酵素溶液添加時の吸光度、Ｂは試料溶液添加、酵素溶液無添加時の吸光度、Ｃは試料溶液無添加、酵素溶液添加時の吸光度、Ｄは試料溶液無添加、酵素溶液無添加時の吸光度をそれぞれ表す。
【００４６】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記スーパーオキサイド消去率の測定を行い、スーパーオキサイドの消去率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
表２の結果から、製造例１〜３の白眉草抽出物が、高いスーパーオキサイド消去作用を有することが確認できた。
【００４８】
（実施例２）
−過酸化水素消去試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により過酸化水素消去作用を試験した。
過酸化水素の標準溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）１０μＬに、各試料溶液１０μＬを加え、３７℃で２０分間インキュベーションした後、発色試薬〔ＤＡ−６４（和光純薬株式会社製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌ、トライトンＸ−１００を０．５質量％含む０．１ｍｏｌ／ＬのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にペルオキシダーゼ溶液（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、和光純薬株式会社製）１ｍＬを加え、全量を１００ｍＬに調整したもの〕２．９８ｍＬを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、波長７２７ｎｍにおける吸光度を測定した。
上記同様の操作と吸光度測定を、過酸化水素の標準溶液を添加せずに行った。また、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても上記同様の測定を行った。
そして、得られた測定結果から、下記数式２により過酸化水素の消去率を求めた。
＜数式２＞
過酸化水素消去率（％）＝{１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）}×１００
ただし、前記数式２中、Ａは過酸化水素標準溶液添加，試料溶液添加時の吸光度、Ｂは過酸化水素標準溶液無添加，試料溶液添加時の吸光度、Ｃは過酸化水素標準溶液添加，試料溶液無添加時の吸光度、Ｄは過酸化水素標準溶液無添加，試料溶液無添加時の吸光度を表す。
【００４９】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記過酸化水素消去率の測定を行い、該過酸化水素消去率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
表３の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、高い過酸化水素消去作用を有することが確認できた。
【００５１】
（実施例３）
−ＤＰＰＨに対するラジカル消去試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により非常に安定なラジカルである1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（ＤＰＰＨ）を使用してラジカル消去作用を試験した。
１．５×１０−４ｍｏｌ／ＬのＤＰＰＨエタノール溶液３ｍＬに各試料溶液３ｍＬを加え、直ちに容器を密栓して振り混ぜ、３０分間静置した後、波長５２０ｎｍの吸光を測定した。
コントロールとして、試料溶液の代わりに試料溶液を溶解した溶媒を用いて同様に操作し、波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。また、ブランクとして、エタノールに試料溶液３ｍＬを加えた後、直ちに波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。
そして、測定結果から、下記数式３によりラジカル消去率（％）を算出した。
＜数式３＞
ラジカル消去率（％）＝｛１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ｝×１００
ただし、前記数式３中、Ａはコントロールの吸光度、Ｂは試料溶液を添加した場合の吸光度、Ｃはブランクの吸光度をそれぞれ表す。
【００５２】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記ラジカル消去率の測定を行い、ＤＰＰＨラジカルの消去率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
表４の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、高いＤＰＰＨに対するラジカル消去作用を有することが確認できた。
【００５４】
（実施例４）
−グルタチオン産生促進作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりグルタチオン産生促進作用を試験した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）含有−αＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に１０質量％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、４８穴マイクロプレートに１穴当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養後、１質量％のＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した各試料溶液を各穴に２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各穴から培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（登録商標）（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。具体的には、９６穴マイクロプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨを２５μＬ、及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌの５,５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ(２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ)２５μＬを加え、５分間後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線に基づいて算出した。得られた値は総タンパク質量当たりのグルタチオン量に補正した。
そして、得られたグルタチオン量から、下記数式４によりグルタチオン産生促進率を算出した。試料濃度２００μｇ／Ｌでのグルタチオン産生促進率を表５に示す。
＜数式４＞
グルタチオン産生促進率（％）＝（Ｂ／Ａ）×１００
ただし、前記数式４中、Ａは、試料溶液を添加しない細胞中におけるタンパク質量当りのグルタチオン量（対照）、Ｂは、試料溶液を添加した細胞中におけるタンパク質量当りのグルタチオン量を表す。
【００５５】
【表５】
表５の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、グルタチオン産生促進作用を有することが確認できた。
【００５６】
（実施例５）
−皮膚線維芽細胞増殖促進作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により皮膚線維芽細胞増殖促進作用を試験した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により回収した。回収した細胞を５質量％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭで７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬ播種し、一晩培養した。
培養終了後、５質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに溶解した試料溶液（濃度：４００ｐｐｍ）を各穴に１００μＬ添加し、３日間培養した。
次いで、皮膚線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。具体的には、各穴から１００μＬずつ培地を抜き、終濃度５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴ〔3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide〕を各穴に２０μＬずつ添加した。４．５時間培養した後、１０質量％のＳＤＳを溶解した０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を各穴に１００μＬ添加し、一晩培養した後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。
そして、得られた測定結果から、下記数式５により試料濃度２００μｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖促進率を算出した。結果を表６に示す。
＜数式５＞
線維芽細胞増殖促進率（％）＝（Ｓｔ−Ｓｂ）／（Ｃｔ−Ｃｂ）×１００
ただし、前記数式５中、Ｓｔは試料溶液を添加した細胞での吸光度、Ｓｂは試料溶液を添加した空試験の吸光度、Ｃｔは試料溶液を添加しない細胞での吸光度、Ｃｂは試料溶液を添加しない空試験の吸光度、をそれぞれ表す。
【００５７】
【表６】
表６の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、皮膚線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認できた。
【００５８】
（実施例６）
−ＩＶ型コラーゲン産生促進作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、以下のようにしてＩＶ型コラーゲン産生促進作用を試験した。
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにダルベッコＭＥＭ培地を用いて希釈した後、９６穴マイクロプレートに１穴あたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５質量％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した各試料溶液（試料濃度：１００μｇ／ｍＬ）を各穴に１５０μＬずつ添加し、３日間培養した。培養終了後、各穴の培地中のＩＶ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
そして、得られた測定結果から、下記数式６によりＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）を算出した。試料濃度１００μｇ／ｍＬでのＩＶ型コラーゲン産生促進率の結果を表７に示す。
＜数式６＞
ＩＶ型コラーゲン産生促進率(％)＝（Ａ／Ｂ）×１００
ただし、前記数式６中、Ａは試料溶液添加時のＩＶ型コラーゲン量を表し、Ｂは試料溶液無添加時のＩＶ型コラーゲン量を表す。
【００５９】
【表７】
表７の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有することが確認できた。
【００６０】
（実施例６）
−マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、以下のようにしてマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用を試験した。この試験方法は、Ｗｕｎｓｃｈ ａｎｄ Ｈｅｉｄｒｉｃｈ法を一部改変したものである。
蓋付試験管にて、２０ｍｍｏｌ／ｍＬの塩化カルシウム含有０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解した各試料溶液５０μＬ、ＭＭＰ−１溶液５０μＬ、及び基質溶液４００μＬを混合し、３７℃にて３０分間インキュベーションした。次いで、２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液１ｍＬを加え反応を停止し、酢酸エチル５ｍＬを加え、激しく振とうした。これを遠心分離（１６００×ｇ、１０分間）し、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記と同様の酵素反応と吸光度測定を試料溶液の代わりに試料溶液と等量の緩衝液を添加して行った。更に、それぞれの場合について、ＭＭＰ−１溶液の代わりにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加して同じ操作と測定を行った。
なお、ＭＭＰ−１溶液としては、コラゲナーゼ ＴｙｐｅＩＶ（シグマ社製）を緩衝液に溶解させ、０．１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
基質溶液としては、２０ｎｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液にＰｚ−ペプチド（ＢＡＣＨＥＭ Ｆｅｎｉｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ社製）を濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌになるように溶解して使用した。
そして、得られた測定結果から、下記数式７によりＭＭＰ−１活性阻害率を算出した。
＜数式７＞
ＭＭＰ−１活性阻害率（％）＝{１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）}×１００
ただし、前記数式７中、Ａは、試料溶液無添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度、Ｂは、試料溶液無添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度、Ｃは、試料溶液添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度、Ｄは、試料溶液添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度、をそれぞれ表す。
【００６１】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記ＭＭＰ−１活性阻害率の測定を行い、ＭＭＰ−１活性を５０％阻害する試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表８に示す。
【００６２】
【表８】
表８の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用を有することが確認できた。
【００６３】
（実施例８）
−エストロゲン様作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりエストロゲン様作用を試験した。
ヒト乳癌由来細胞（ＭＣＦ−７）を１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、１質量％のＮＥＡＡ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を活性炭処理した１０質量％のＦＢＳ、１質量％のＮＥＡＡ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するフェノールレッド不含ＭＥＭ（Ｔ−ＭＥＭ）を用いて３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、４８穴マイクロプレートに１穴あたり４５０μＬずつ播種し、細胞を定着させるため培養した。６時間後（０日目）にＴ−ＭＥＭで終濃度の１０倍に調製した各試料溶液を各穴に５０μＬずつ添加し、培養を続けた。３日目に培地を抜き、Ｔ−ＭＥＭで終濃度に調製した試料溶液を各穴に５００μＬ添加し、更に培養を続けた。
エストロゲン様作用は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、１質量％のＮＥＡＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭに終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで溶解したＭＴＴ〔3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide〕を各穴に２００μＬずつ添加した。２時間培養した後、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。ポジティブコントロールとして、１０−９ｍｏｌ／Ｌのエストラジオールを使用した。
そして、得られた測定結果から、エストロゲン様作用（エストロゲン依存性増殖作用）を下記数式８から算出した。試料濃度５０μｇ／ｍＬでのエストロゲン様作用率の結果を表９に示す。
【００６４】
＜数式８＞
エストロゲン様作用率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
ただし、前記数式８において、Ａは、試料溶液添加の場合の吸光度を表す。Ｂは、試料溶液無添加の場合の吸光度を表す。
【００６５】
【表９】
表９の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、エストロゲン様作用を有することが確認できた。
【００６６】
（実施例９）
−ヒスタミン遊離抑制（ヘキソサミニダーゼ遊離抑制）作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりヒスタミン遊離抑制作用を試験した。なお、細胞内のヒスタミンが遊離されると同時にヘキソサミニダーゼも遊離されることから、ヘキソサミニダーゼ遊離を指標にヒスタミン遊離抑制作用を評価することができる。
２５ｍＬの培養フラスコ内に入れた培地（１５質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）添加Ｓ−ＭＥＭ培地；以下同じ）にラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞）１．０×１０６個を播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で４日間培養した。次いで、トリプシン処理し、遠心分離（８００ｒｐｍ、４分間）して細胞を集めた。得られた細胞を４．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬで培地に懸濁し、そこに、マウスモノクロナール抗ジニトロフェニル基ＩｇＥ（ＤＮＰ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ）を０．５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。この細胞浮遊液を９６穴マイクロプレートの１穴に付き１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で２４時間培養した。培養終了後、各穴中の培地を除去し、シラガニアン緩衝液で２回洗浄した。
次に、上記緩衝液３０μＬ、及び各試料溶液１０μＬを加え、３７℃で１０分間インキュベーションした。次いで、ジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）１０μＬを加え、３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、氷冷下で上清１０μＬを新たな９６穴マイクロプレートに移し替え、これに１ｍｍｏｌ／Ｌのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド溶液１０μＬを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。反応終了後、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３溶液２５０μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて６５０ｎｍを対照に４１５ｎｍにおける吸光度Ａを測定した。試料溶液の代りにシラガニアン緩衝液を添加した細胞上清についても同様の処理と吸光度測定を行った（このとき測定された吸光度をＢとした）。また、細胞上清と０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３溶液を同様の処理で反応させたものについても、吸光度測定を行った（このとき測定された吸光度をＣとした）。同様の操作をＤＮＰ−ＢＳＡのかわりにシラガニアン緩衝液を加えたものについても行った（このとき測定された吸光度をＤとした）。
そして、得られた測定結果から、下記数式９によりヘキソサミニダーゼ遊離抑制（ヒスタミン遊離抑制）率を算出した。
【００６７】
＜数式９＞
ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率（％）＝
〔１−{(Ａ−Ｃ−Ｄ)／（Ｂ−Ｄ）}〕×１００
ただし、前記数式９中、Ａ〜Ｄは、上記試験方法中の記載と同じ意味を表す。
【００６８】
次に、各試料濃度を段階的に減少させて上記ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率の測定を行い、ヘキソサミニダーゼの遊離を５０％阻害する試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表１０に示す。
【００６９】
【表１０】
表１０の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、ヒスタミン遊離抑制（ヘキソサミニダーゼ遊離抑制）作用を有することが確認できた。
【００７０】
（実施例１０）
−一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験方法により一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用を試験した。
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように１０質量％のＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭで希釈した後、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、終濃度２質量％のＤＭＳＯを含む１０質量％のＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭで溶解した各試料溶液を各穴に１００μＬ添加し、終濃度１μｇ／ｍＬで１０質量％のＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１；Ｂ４、ＤＩＦＣＯ社製）を５０μＬ加え、４８時間培養した。ＮＯ産生量は亜硝酸イオン（ＮＯ２−）量を指標に測定した。培養終了後、各穴の培養液に、同量のグリス試薬（１質量％のスルファニルアミド、０．１質量％のＮ−１−ｎａｐｈｔｈｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｐｒｉｄｅ ｉｎ ５質量％のリン酸溶液）を添加し、１０分間室温にて反応した。反応後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールの一酸化窒素（ＮＯ）産生量を基にして、下記数式１０からＮＯ産生抑制率を算出した。
【００７１】
＜数式１０＞
ＮＯ産生抑制率（％）＝{１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）}×１００
ただし、前記数式１０中、Ａは試料添加、ＬＰＳ刺激時の波長５４０ｎｍにおける吸光度、Ｂは試料添加、ＬＰＳ無刺激時の波長５４０ｎｍにおける吸光度、ＣはコントロールのＬＰＳ刺激時の波長５４０ｎｍにおける吸光度、ＤはコントロールのＬＰＳ無刺激時の波長５４０ｎｍにおける吸光度、をそれぞれ表す。
【００７２】
次に、各試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記ＮＯ産生抑制率を測定し、ＮＯ産生抑制率が５０％になる濃度ＩＣ５０を内挿法により求めた（このＩＣ５０値が小さいほどＮＯ産生抑制作用が強い）。結果を表１１に示す。
【００７３】
【表１１】
表１１の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、高い一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用を有することが認められた。
【００７４】
（実施例１０）
−シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）を介したＰＧＥ２産生抑制作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験方法によりシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）活性阻害作用を試験した。この試験は、Ｈｗａｎｇ，Ｂ．−Ｙ．らの方法（Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ ６７（２００１）、４０６−４１０）に一部修正を加えて行った。
まず、マウス由来マクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７）を前培養後、細胞を集め、２×１０５個／ｍＬに調製して、９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間培養した。培養終了後、既に存在するＣＯＸ−１及び少量発現しているＣＯＸ−２をアセチル化し失活させるため、５００μｍｏｌ／Ｌのアスピリン含有培地に交換して４時間培養した。細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、１μｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を含む培地で溶解した各試料溶液２００μＬを添加し、１８時間培養した。培養終了後、上清中のＰＧＥ２をＰＧＥ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，米国）を用いて定量し、各試料溶液を無添加時の値を１００％として、ＰＧＥ２産生抑制率を算出した。
【００７５】
次に、各試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記ＣＯＸ−２を介したＰＧＥ２産生抑制率を測定し、ＣＯＸ−２を介したＰＧＥ２産生抑制率が５０％になる濃度ＩＣ５０を内挿法により求めた（このＩＣ５０値が小さいほどＣＯＸ−２を介したＰＧＥ２産生抑制作用が強い）。結果を表１２に示す。
【００７６】
【表１２】
表１２の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、ＣＯＸ−２を介したＰＧＥ２産生抑制作用を有することが認められた。
【００７７】
（配合実施例１）
−乳液−
下記組成から乳液を常法により製造した。
・製造例１の白眉草の水抽出物・・・０．１０ｇ
・ホホバオイル・・・４．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．５０ｇ
・オリーブオイル・・・２．００ｇ
・スクワラン・・・２．００ｇ
・セタノール・・・２．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・黄杞エキス・・・０．１０ｇ
・グリチルリチン酸ジカリウム・・・０．１０ｇ
・イチョウ葉エキス・・・０．１０ｇ
・コンキオリン・・・０．１０ｇ
・オウバクエキス・・・０．１０ｇ
・カツミレエキス・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計１００．００ｇ）
【００７８】
（配合実施例２）
−化粧水−
下記組成から化粧水を常法により製造した。
・製造例２の白眉草の５０質量％エタノール抽出物・・・０．１０ｇ
・グリセリン・・・３．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・クエン酸・・・０．１０ｇ
・クエン酸ソーダ・・・０．１０ｇ
・油溶性甘草エキス・・・０．１０ｇ
・海藻エキス・・・０．１０ｇ
・クジンエキス・・・０．１０ｇ
・キシロビオースミクスチャー・・・０．０５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００７９】
（配合実施例３）
−クリーム−
下記組成からクリームを常法により製造した。
・製造例３の白眉草のエタノール抽出物・・・０．１０ｇ
・スクワラン・・・１０．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・６．００ｇ
・流動パラフィン・・・５．００ｇ
・サラシミツロウ・・・４．００ｇ
・セタノール・・・３．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・３．００ｇ
・ラノリン・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．５０ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・１．５０ｇ
・ステアリン酸・・・１．００ｇ
・酵母抽出液・・・０．１０ｇ
・シソ抽出液・・・０．１０ｇ
・シナノキ抽出液・・・０．１０ｇ
・ジユ抽出液・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．１０ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００８０】
（配合実施例４）
−パック−
下記組成からパックを常法により製造した。
・製造例１の白眉草の水抽出物・・・０．２０ｇ
・ポリビニルアルコール・・・１５．００ｇ
・エタノール・・・１０．００ｇ
・プロピレングリコール・・・７．００ｇ
・ポリエチレングリコール・・・３．００ｇ
・セージ抽出液・・・０．１０ｇ
・トウキ抽出液・・・０．１０ｇ
・ニンジン抽出液・・・０．１０ｇ
・パラオキシ安息香酸エチル・・・０．０５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００８１】
（配合実施例５）
−錠剤状栄養補助食品−
下記の混合物を打錠して、錠剤状栄養補助食品を製造した。
・製造例１の白眉草の水抽出物・・・３０ｇ
・粉糖（ショ糖）・・・１７８ｇ
・ソルビット・・・１０ｇ
・グリセリン脂肪酸エステル・・・１２ｇ
【００８２】
（配合実施例６）
−顆粒状栄養補助食品−
下記の混合物を顆粒状に形成して、栄養補助食品を製造した。
・製造例２の白眉草の５０質量％エタノール抽出物・・・２０ｇ
・ビートオリゴ糖・・・１０００ｇ
・ビタミンＣ・・・１６７ｇ
・ステビア抽出物・・・１０ｇ
【００８３】
（配合実施例７）
−顆粒状栄養補助食品−
下記の混合物を顆粒状に形成して、栄養補助食品を製造した。
・製造例３の白眉草のエタノール抽出物・・・２０ｇ
・ビートオリゴ糖・・・１０００ｇ
・ビタミンＣ・・・１６７ｇ
・ステビア抽出物・・・１０ｇ
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤の少なくともいずれかを配合した皮膚化粧料は、優れた抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有し、生体内の酸化防止、皮膚のシワや皮膚の弾力低下の防止及び改善、肌荒れの予防、肌荒れの防止に有効であり、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤、アストリンゼントなどに幅広く用いられる。
また、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤の少なくともいずれかを添加した美容用飲食品は、経口摂取によっても優れた抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有し、安全性にも優れているので、例えば、健康食品、栄養補助食品などに幅広く用いられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク科の白眉草の抽出物を含有する抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤、並びにこれらを含む皮膚化粧料及び美容用飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体成分を酸化させる要因として、活性酸素が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。活性酸素は、生体細胞内のエネルギー代謝過程で生じるものであり、スーパーオキサイド〔即ち、酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（１Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）〕等がある。このような活性酸素は食細胞の殺菌機構にとって必須であり、ウイルスや癌細胞の除去に重要な働きを果たしている。
しかし、前記活性酸素の過剰な生成は生体内の膜及び組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。生体内で生産され、他の活性酸素の出発物質ともなっているスーパーオキサイドは、通常、細胞内に含まれているスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）の触媒作用により逐次消去されている。しかし、スーパーオキサイドの産生が過剰な場合、或いはＳＯＤの作用が低下している場合には、スーパーオキサイドの消去が不十分になってスーパーオキサイド濃度が高くなる。このことが、関節リウマチ、ベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、シミ、ソバカス、しわ、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性、皮膚の老化などを起こす原因の一つであると考えられている。これらの中でも、皮膚は紫外線等の環境因子の刺激を直接受けるため、スーパーオキサイドが生成し易い器官であるから、スーパーオキサイド濃度の上昇により、例えば、コラーゲン等の生体組織を分解、変性、又は架橋したり、また油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成して、皮膚のしわを形成したり、皮膚の弾力性低下等の老化、炎症、肌の色素沈着を引き起こすという問題がある（非特許文献１参照）。
そこで、活性酸素消去物質、ラジカル消去物質、過酸化水素消去物質等を安全性の点で有利な天然物から得る試みがなされており、アブラナ科ブラシカ属植物の抽出物（特許文献１参照）、ベンケイソウ科リュウキュウベンケイ属植物の抽出物（特許文献２参照）、タマコチョウの抽出物（特許文献３参照）、スイオウの抽出物（特許文献４参照）、などに有効性が確認されている。
【０００３】
また、グルタチオンはグルタミン酸、システイン、グリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。細胞内におけるグルタチオンの役割はラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、各種酵素のＳＨ供与体であり、抗酸化成分としても知られている。グルタチオンの作用発現はそのシステイン残基に由来すると考えられている。しかし、皮膚中のグルタチオン量は、加齢に伴って低下することが報告されており、このことが皮膚における酸化防御能を低下させ、細胞のＤＮＡ及びタンパク質などの構成成分にダメージを与える一因であると考えられている。
このように皮膚においてグルタチオンの産生を促進することは、加齢により衰える酸化ストレスの防御を高め、かつ紫外線による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化の予防、治療、あるいはシミ等の色素沈着に対する改善が期待できると考えられる。そこで、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、例えばビルベリー抽出物又はウォルナット抽出物（特許文献５参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献６参照）、などが開示されている。
【０００４】
皮膚は、表皮、基底膜、及び真皮から構成されている。前記基底膜は、表皮と真皮との境界部に存在し、表皮と真皮とを繋ぎ止めるだけでなく、皮膚機能の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献２参照）。前記基底膜の主要骨格はＩＶ型コラーゲンからなる網目構造をしている。若い皮膚においては、線維芽細胞の増殖が活発であり、基底膜の働きにより表皮、真皮の相互作用が恒常性を保つことで水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等のある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、線維芽細胞の増殖が遅くなり、細胞外マトリックス産生能力が低下することによって、肌は張りや弾力を失い、肌荒れシワ等の老化症状を呈するようになる。また、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンは分解乃至変質を起こし、基底膜構造が破壊される（非特許文献３参照）。その結果、皮膚の保湿機能及び弾力性が低下し、角質が異常剥離を始め、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、基底膜成分の減少、基底膜の構造変化が関与していることが知られている。
【０００５】
近年、真皮マトリックス成分の減少乃至変性を誘導する因子として、マトリックス系プロテアーゼの関与が指摘されている。このマトリックス系プロテアーゼの中でも、ＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテアーゼ−１）は、皮膚の真皮マトリックスの主な構成成分であるタイプＩコラーゲン、タイプＩＩＩコラーゲンなどを分解する酵素として知られている。その発現は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線によるコラーゲンの減少乃至変性の一因となり、皮膚のシワ形成等の大きな要因であると考えられる。
また、加齢に伴う皮膚老化の一因として、女性ホルモンの一種であるエストロゲンの分泌が減退することがある。エストロゲンは成人女性の健康維持に深く関わっており、その分泌不足は種々の内科的疾患を招く他、肌の過敏症、弾力性低下、潤いの減少等の好ましくない肌の変化の原因となることが知られている。
したがってＩＶ型コラーゲン産生の促進、ＭＭＰ−１活性の阻害、皮膚線維芽細胞増殖の促進、あるいは加齢によるエストロゲン分泌減退を補うことにより、皮膚のしわの形成、弾力性低下等の皮膚の老化を予防乃至治療できると考えられる。
【０００６】
炎症性の疾患、例えば接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他肌荒れを伴う各種皮膚疾患等の原因及び発症機構は多種多様である。その原因としてヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、シクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）によるものが知られている。
前記ヒスタミン遊離は肥満細胞内のヒスタミンが細胞外に遊離する現象であり、遊離されたヒスタミンが炎症反応を引き起こす。このため、ヒスタミン遊離を阻害乃至抑制する物質によりアレルギー性疾患、炎症性疾患を予防乃至治療する試みがなされている。このようなヒスタミン遊離抑制剤として、例えばトラニラスト、クロモグリク酸ナトリウム、バイカリン、バイカレイン、塩酸プロメタジンなどが用いられてきた。しかし、これらの物質はいずれも副作用があり、安全性の点で問題があった。
前記一酸化窒素（ＮＯ）は、大気汚染、酸性雨等の要因となる窒素酸化物である。また、近年、一酸化窒素（ＮＯ）は、血管内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）、神経伝達物質、生体防御における微生物、腫瘍細胞の障害因子等、生体内で多彩な機能を示す生理活性物質であることが報告されている。生理活性物質としては、マクロファージから産生される一酸化窒素が細菌やウイルスの感染を防御することが知られている。しかし、前記マクロファージから産生される一酸化窒素が大量に生合成されると、生体にとって無毒ではなく、自己組織の破壊を引き起こし、炎症の悪化、リューマチ、糖尿病等の病態の原因となることがある。また、大量に生合成された一酸化窒素が血管平滑筋の弛緩と過剰な透過性の増大をもたらし、著しい血圧の低下によってエンドトキシン・ショックを引き起こすこともある。
したがって炎症性疾患において、一酸化窒素（ＮＯ）の過剰な産生を抑制することが重要となる。このような一酸化窒素の産生抑制作用を有する生薬としては、例えば、ローズマリー抽出液、カルノソール、カルノシン酸、コーヒー豆の抽出液、サクラダソウ抽出液、オウレン抽出液、オウバク抽出液、カンゾウ抽出液、イヌノイバラの抽出液、センキュウ抽出液、トウニン抽出液、シャクヤク抽出液、ヨクイニン抽出液、アカブドウ抽出液（いずれも、特許文献７参照）、唐独活、タラ根皮、和続断、車前子、遠子、茜草根、半枝連、槐花、花椒（いずれも、非特許文献４参照）、などが報告されている。
【０００７】
また、炎症は、発赤、浮腫、発熱、痛み、機能障害等の症状を示す複雑な反応である。微視的に見ると、血漿漏出を起こす血管反応、白血球の浸潤、炎症性細胞による組織破壊などの共通する反応からなり、発熱反応、痛覚過敏等の中枢神経系が関与する全身の反応も引き起こす場合がある。このような炎症の個々の反応にはプロスタグランジンが重要な役割を果たしており、炎症時におけるプロスタグランジンの産生には、主として誘導型のシクロオキシゲナーゼであるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の関与が知られている。このため、炎症反応の防止乃至予防を図る目的で、アスピリンに代表される多くのシクロオキシゲナーゼ活性阻害剤が報告されている（非特許文献５参照）。また、植物由来のシクロオキシゲナーゼ活性阻害剤としては、マンゴスチン果皮抽出物中のα−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンが開示されている（特許文献８参照）。また、シクロオキシゲナーゼ−２活性阻害作用を有する化合物として、例えば２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン、２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オンの塩、又は２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オンの水和物が開示されている（特許文献９参照）。
このようにヒスタミンの遊離を抑制し、過剰な一酸化窒素（ＮＯ）の産生を抑制し、シクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）の活性を阻害することは、炎症性疾患を防止乃至改善する上で極めて重要である。
【０００８】
しかしながら、現在までのところ、入手が容易で安価であり、安全性の高い天然物系のものであって、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさず、皮膚化粧料及び美容用飲食物に広く使用可能な抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−８１８４８号公報
【特許文献２】特開２００５−２９４８３号公報
【特許文献３】特開２００６−３２１７３０号公報
【特許文献４】特開２００７−８９０２号公報
【特許文献５】特開２００６−２４１０６２号公報
【特許文献６】特開２００６−３４７９３４号公報
【特許文献７】特開２００２−８７９７５号公報
【特許文献８】特開２００２−４７１８０号公報
【特許文献９】特開２０００−１６９３５号公報
【非特許文献１】フレグランスジャーナル 臨時増刊Ｎｏ．１４、ｐ１５６ １９９５年
【非特許文献２】Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ ＭＰ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２ １９９：６９５−７０３
【非特許文献３】Ｌａｖｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９７９ ７３： ５９−６６
【非特許文献４】「和漢医薬学雑誌」，Ｖｏｌ．１５， ｐ．３０２−３０３，１９９８年発行
【非特許文献５】薬理学アトラス（Ｐ１８４）、福原武彦監訳、文光堂
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、第１に、スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗酸化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第２に、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗老化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第３に、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗炎症剤を提供することを目的とする。
本発明は、第４に、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、及び前記抗炎症剤の少なくともいずれかを有効成分として配合した皮膚化粧料及び美容用飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、入手が容易で安価であり、安全性の高い天然物系のものであって、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさず、皮膚化粧料及び美容用飲食物に広く使用可能な抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤について本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、キク科の白眉草の抽出物が、（１）優れたスーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有し、抗酸化剤として有用であること、（２）優れた皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、抗老化剤として有用であること、及び（３）優れたヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有し、抗炎症剤として有用であることを、それぞれ知見した。
【００１２】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤である。
＜２＞ スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有する前記＜１＞に記載の抗酸化剤である。
＜３＞ 白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤である。
＜４＞ 皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する前記＜３＞に記載の抗老化剤である。
＜５＞ 白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤である。
＜６＞ ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有する前記＜５＞に記載の抗炎症剤である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の白眉草の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚化粧料である。
＜８＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の白眉草の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美容用飲食品である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗酸化剤によると、優れたスーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを通じて、生体内の酸化防止、皮膚の老化を防止乃至改善することができる。
本発明の抗老化剤によると、優れた皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを通じて、皮膚のシワ及び皮膚の弾力低下の防止乃至改善することができる。
本発明の抗炎症剤によると、優れたヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを通じて、炎症性疾患を防止乃至改善することができる。
また、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤は、天然系抽出物であり安全性に優れ、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさないので皮膚化粧料に配合したり、美容用飲食品に添加して用いるのに好適なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤）
本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤は、白眉草の抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１５】
前記抗酸化剤は、抗酸化作用として、スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有している。
前記抗老化剤は、抗老化作用として、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有している。
前記抗炎症剤は、抗炎症作用として、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有している。
前記白眉草の抽出物における抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有する物質の詳細については不明であるが、該白眉草の抽出物がこれらの優れた作用を有し、抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤として有用であることは現在までのところ全く知られておらず、これらのことは、本発明者らの鋭意研究による新知見である。
【００１６】
前記白眉草（ハクビソウ）は、キク科の植物であり、学名はGerberia piloselloides Gerberaであり、毛大丁草（モウダイテイソウ）、満地香（マンチコウ）とも呼ばれる、多年生の草本であって、根茎は太くて厚く、綿毛がある。葉は基部から出て、多少柄があり、略円形乃至卵形、長さは５ｃｍ〜８ｃｍ、花茎は長さ１５ｃｍ〜３０ｃｍで時には４０ｃｍに達することもある。
前記白眉草は、中国の江蘇省、浙江省、四川省、広西壮族自治区、広東省、雲南省等の日の当たる所、山の斜面、道端、田んぼの周辺に野生しており、これらの地域から容易に入手可能である。
前記白眉草には、例えば止咳、発汗、利尿、滋養強壮等の効能が知られている。
【００１７】
前記白眉草の抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法により容易に得ることができる。なお、前記白眉草の抽出物には、白眉草の抽出液、該抽出液の希釈液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１８】
前記白眉草の抽出原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白眉草の葉部、花（蕾）部、枝部、種子、樹皮（これらを地上部という）、根部などを用いることができる。これらの中でも、葉部等の地上部が特に好ましい。
【００１９】
前記抽出原料である白眉草は、乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。なお、前記白眉草は、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。なお、脱脂等の前処理を行うことにより、白眉草の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２０】
前記抽出に用いる溶媒としては、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２１】
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２２】
本発明において、抽出原料である白眉草から、抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有する物質を抽出するにあたって特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。
【００２３】
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、抽出原料としての白眉草の地上部を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０℃〜９５℃にて１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０℃〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤として用いることができる。
【００２４】
得られる白眉草の抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２５】
なお、得られる白眉草の抽出液は、そのままでも抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、前記白眉草の抽出物は、特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料及び美容用飲食品に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製としては、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。
【００２６】
以上のようにして得られる白眉草の抽出物は、スーパーオキサイド消去作用、過酸化水素消去作用、ラジカル消去作用、グルタチオン産生促進作用、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、エストロゲン様作用、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有しており、これらの作用に基づいて、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤として使用することができる。
【００２７】
本発明の抗酸化剤における抗酸化作用は、スーパーオキサイド消去作用、過酸化水素消去作用、ラジカル消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の抗老化剤における抗老化作用は、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の抗炎症剤における抗炎症作用は、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の白眉草の抽出物は、優れた抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有すると共に、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、特に、以下に説明する本発明の皮膚化粧料に配合するのに好適である。
また、本発明の白眉草の抽出物は、優れた抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有すると共に、消化管で消化されるものではないことが確認されているので、特に、以下に説明する本発明の美容用飲食品に配合するのに好適である。
【００２８】
（皮膚化粧料）
本発明の皮膚化粧料は、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、及び前記抗炎症剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
【００２９】
ここで、前記皮膚化粧料の用途としては、特に制限はなく、各種用途から適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤、アストリンゼント、などが挙げられる。
【００３０】
前記抗酸化剤、前記抗老化剤、又は前記抗炎症剤の前記皮膚化粧料全体に対する配合量は、皮膚化粧料の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、前記白眉草の抽出物に換算して０．０００１質量％〜１０質量％が好ましく、０．００１質量％〜１質量％がより好ましい。
【００３１】
前記皮膚化粧料は、更に必要に応じて本発明の目的及び作用効果を損なわない範囲で、その皮膚化粧料の製造に通常使用される各種主剤及び助剤、その他の成分を添加することができる。
前記その他の成分としては、本発明の前記抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の妨げにならない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択した成分が挙げられ、例えば、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、などが挙げられる。これらの成分は、前記白眉草の抽出物と共に併用した場合、相乗的に作用して、通常期待される以上の優れた作用効果をもたらすことがある。
【００３２】
本発明の皮膚化粧料は、皮膚に使用した場合に高い安全性を有し、優れたスーパーオキサイド消去作用、過酸化水素消去作用、ラジカル消去作用、グルタチオン産生促進作用、皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、エストロゲン様作用、ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを効果的に発揮して、生体内の酸化防止、老化防止、炎症性疾患の予防乃至治療に有用である。
【００３３】
（美容用飲食品）
本発明の美容用飲食品は、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、及び前記抗炎症剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
ここで、前記美容用飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品、などの区分に制限されるものではなく、例えば、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものを意味する。
【００３４】
本発明の前記美容用飲食物は、白眉草の抽出物を、その活性を妨げないように任意の飲食物に配合したものであってもよいし、白眉草の抽出物を主成分とする栄養補助食品であってもよい。
【００３５】
前記美容用飲食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子類；カニ、サケ、アサリ、マグロ、イワシ、エビ、カツオ、サバ、クジラ、カキ、サンマ、イカ、アカガイ、ホタテ、アワビ、ウニ、イクラ、トコブシ等の水産物；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；カレー、シチュー、親子丼、お粥、雑炊、中華丼、かつ丼、天丼、うな丼、ハヤシライス、おでん、マーボドーフ、牛丼、ミートソース、玉子スープ、オムライス、餃子、シューマイ、ハンバーグ、ミートボール等のレトルトパウチ食品；種々の形態の健康食品や栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等の医薬品、医薬部外品などが挙げられる。
【００３６】
前記その他の成分としては、前記美容用飲食品を製造するに当たって通常用いられる補助的原料又は添加物、などが挙げられる。
前記原料又は添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤、などが挙げられる。
【００３７】
前記美容用飲食品における本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、又は前記抗炎症剤の添加量は、対象となる美容用飲食品の種類に応じて異なり一概には規定することができないが、美容用飲食品本来の味を損なわない範囲で添加すればよく、各種対象美容用飲食品に対し、０．００１質量％〜５０質量％が好ましく、０．０１質量％〜２０質量％がより好ましい。また、顆粒、錠剤又はカプセル形態の美容用飲食品の場合には、０．０１質量％〜１００質量％が好ましく、５質量％〜１００質量％がより好ましい。
【００３８】
本発明の美容用飲食品は、日常的に経口摂取することが可能であり、有効成分である白眉草の抽出物の働きによって、抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを極めて効果的に発揮させることができる。
【００３９】
なお、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、抗炎症剤、皮膚化粧料、及び美容用飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４１】
（製造例１）
−白眉草の水抽出物の製造−
抽出原料として白眉草の地上部の粉砕物１００ｇを、水１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００４２】
（製造例２）
−白眉草の５０質量％エタノール抽出物の製造−
抽出原料として白眉草の地上部の粉砕物１００ｇを、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００４３】
（製造例３）
−白眉草のエタノール抽出物の製造−
抽出原料として白眉草の地上部の粉砕物１００ｇを、エタノール１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（実施例１）
−スーパーオキサイド消去試験（ＮＢＴ法）−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりスーパーオキサイド消去作用を試験した。
３ｍｍｏｌ／Ｌのキサンチン、３ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１．５ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液、０．７５ｍｍｏｌ／Ｌのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）０．１ｍＬ、及び０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．２）２．４ｍＬを試験管にとり、これに各試料溶液０．１ｍＬを添加し、２５℃で１０分間放置した。次いで、キサンチンオキシダーゼ溶液を加えて素早く攪拌し、２５℃で２０分間静置した。その後、６ｍｍｏｌ／Ｌの塩化銅０．１ｍＬを加えて反応を停止させ、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。このとき測定した吸光度を「試料溶液添加、酵素溶液添加時の吸光度」とした。
また、同様の操作と吸光度の測定を、酵素溶液を添加せずに行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液添加、酵素溶液無添加時の吸光度」とした。
また、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液無添加、酵素溶液添加時の吸光度」とした。
また、酵素溶液を添加せず、更に試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液無添加、酵素溶液無添加時の吸光度」とした。
そして、測定結果から、下記数式１によりスーパーオキサイド消去率を求めた。
＜数式１＞
スーパーオキサイド消去率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
ただし、前記数式１中、Ａは試料溶液添加、酵素溶液添加時の吸光度、Ｂは試料溶液添加、酵素溶液無添加時の吸光度、Ｃは試料溶液無添加、酵素溶液添加時の吸光度、Ｄは試料溶液無添加、酵素溶液無添加時の吸光度をそれぞれ表す。
【００４６】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記スーパーオキサイド消去率の測定を行い、スーパーオキサイドの消去率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
表２の結果から、製造例１〜３の白眉草抽出物が、高いスーパーオキサイド消去作用を有することが確認できた。
【００４８】
（実施例２）
−過酸化水素消去試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により過酸化水素消去作用を試験した。
過酸化水素の標準溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）１０μＬに、各試料溶液１０μＬを加え、３７℃で２０分間インキュベーションした後、発色試薬〔ＤＡ−６４（和光純薬株式会社製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌ、トライトンＸ−１００を０．５質量％含む０．１ｍｏｌ／ＬのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にペルオキシダーゼ溶液（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、和光純薬株式会社製）１ｍＬを加え、全量を１００ｍＬに調整したもの〕２．９８ｍＬを添加し、３７℃で５分間インキュベーションした後、波長７２７ｎｍにおける吸光度を測定した。
上記同様の操作と吸光度測定を、過酸化水素の標準溶液を添加せずに行った。また、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても上記同様の測定を行った。
そして、得られた測定結果から、下記数式２により過酸化水素の消去率を求めた。
＜数式２＞
過酸化水素消去率（％）＝{１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）}×１００
ただし、前記数式２中、Ａは過酸化水素標準溶液添加，試料溶液添加時の吸光度、Ｂは過酸化水素標準溶液無添加，試料溶液添加時の吸光度、Ｃは過酸化水素標準溶液添加，試料溶液無添加時の吸光度、Ｄは過酸化水素標準溶液無添加，試料溶液無添加時の吸光度を表す。
【００４９】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記過酸化水素消去率の測定を行い、該過酸化水素消去率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
表３の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、高い過酸化水素消去作用を有することが確認できた。
【００５１】
（実施例３）
−ＤＰＰＨに対するラジカル消去試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により非常に安定なラジカルである1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（ＤＰＰＨ）を使用してラジカル消去作用を試験した。
１．５×１０−４ｍｏｌ／ＬのＤＰＰＨエタノール溶液３ｍＬに各試料溶液３ｍＬを加え、直ちに容器を密栓して振り混ぜ、３０分間静置した後、波長５２０ｎｍの吸光を測定した。
コントロールとして、試料溶液の代わりに試料溶液を溶解した溶媒を用いて同様に操作し、波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。また、ブランクとして、エタノールに試料溶液３ｍＬを加えた後、直ちに波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。
そして、測定結果から、下記数式３によりラジカル消去率（％）を算出した。
＜数式３＞
ラジカル消去率（％）＝｛１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ｝×１００
ただし、前記数式３中、Ａはコントロールの吸光度、Ｂは試料溶液を添加した場合の吸光度、Ｃはブランクの吸光度をそれぞれ表す。
【００５２】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記ラジカル消去率の測定を行い、ＤＰＰＨラジカルの消去率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
表４の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、高いＤＰＰＨに対するラジカル消去作用を有することが確認できた。
【００５４】
（実施例４）
−グルタチオン産生促進作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりグルタチオン産生促進作用を試験した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）含有−αＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に１０質量％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、４８穴マイクロプレートに１穴当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養後、１質量％のＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した各試料溶液を各穴に２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各穴から培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（登録商標）（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。具体的には、９６穴マイクロプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨを２５μＬ、及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌの５,５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ(２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ)２５μＬを加え、５分間後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線に基づいて算出した。得られた値は総タンパク質量当たりのグルタチオン量に補正した。
そして、得られたグルタチオン量から、下記数式４によりグルタチオン産生促進率を算出した。試料濃度２００μｇ／Ｌでのグルタチオン産生促進率を表５に示す。
＜数式４＞
グルタチオン産生促進率（％）＝（Ｂ／Ａ）×１００
ただし、前記数式４中、Ａは、試料溶液を添加しない細胞中におけるタンパク質量当りのグルタチオン量（対照）、Ｂは、試料溶液を添加した細胞中におけるタンパク質量当りのグルタチオン量を表す。
【００５５】
【表５】
表５の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、グルタチオン産生促進作用を有することが確認できた。
【００５６】
（実施例５）
−皮膚線維芽細胞増殖促進作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により皮膚線維芽細胞増殖促進作用を試験した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により回収した。回収した細胞を５質量％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭで７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬ播種し、一晩培養した。
培養終了後、５質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに溶解した試料溶液（濃度：４００ｐｐｍ）を各穴に１００μＬ添加し、３日間培養した。
次いで、皮膚線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。具体的には、各穴から１００μＬずつ培地を抜き、終濃度５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴ〔3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide〕を各穴に２０μＬずつ添加した。４．５時間培養した後、１０質量％のＳＤＳを溶解した０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を各穴に１００μＬ添加し、一晩培養した後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。
そして、得られた測定結果から、下記数式５により試料濃度２００μｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖促進率を算出した。結果を表６に示す。
＜数式５＞
線維芽細胞増殖促進率（％）＝（Ｓｔ−Ｓｂ）／（Ｃｔ−Ｃｂ）×１００
ただし、前記数式５中、Ｓｔは試料溶液を添加した細胞での吸光度、Ｓｂは試料溶液を添加した空試験の吸光度、Ｃｔは試料溶液を添加しない細胞での吸光度、Ｃｂは試料溶液を添加しない空試験の吸光度、をそれぞれ表す。
【００５７】
【表６】
表６の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、皮膚線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認できた。
【００５８】
（実施例６）
−ＩＶ型コラーゲン産生促進作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、以下のようにしてＩＶ型コラーゲン産生促進作用を試験した。
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにダルベッコＭＥＭ培地を用いて希釈した後、９６穴マイクロプレートに１穴あたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５質量％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した各試料溶液（試料濃度：１００μｇ／ｍＬ）を各穴に１５０μＬずつ添加し、３日間培養した。培養終了後、各穴の培地中のＩＶ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
そして、得られた測定結果から、下記数式６によりＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）を算出した。試料濃度１００μｇ／ｍＬでのＩＶ型コラーゲン産生促進率の結果を表７に示す。
＜数式６＞
ＩＶ型コラーゲン産生促進率(％)＝（Ａ／Ｂ）×１００
ただし、前記数式６中、Ａは試料溶液添加時のＩＶ型コラーゲン量を表し、Ｂは試料溶液無添加時のＩＶ型コラーゲン量を表す。
【００５９】
【表７】
表７の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有することが確認できた。
【００６０】
（実施例６）
−マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、以下のようにしてマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用を試験した。この試験方法は、Ｗｕｎｓｃｈ ａｎｄ Ｈｅｉｄｒｉｃｈ法を一部改変したものである。
蓋付試験管にて、２０ｍｍｏｌ／ｍＬの塩化カルシウム含有０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解した各試料溶液５０μＬ、ＭＭＰ−１溶液５０μＬ、及び基質溶液４００μＬを混合し、３７℃にて３０分間インキュベーションした。次いで、２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液１ｍＬを加え反応を停止し、酢酸エチル５ｍＬを加え、激しく振とうした。これを遠心分離（１６００×ｇ、１０分間）し、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記と同様の酵素反応と吸光度測定を試料溶液の代わりに試料溶液と等量の緩衝液を添加して行った。更に、それぞれの場合について、ＭＭＰ−１溶液の代わりにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加して同じ操作と測定を行った。
なお、ＭＭＰ−１溶液としては、コラゲナーゼ ＴｙｐｅＩＶ（シグマ社製）を緩衝液に溶解させ、０．１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
基質溶液としては、２０ｎｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液にＰｚ−ペプチド（ＢＡＣＨＥＭ Ｆｅｎｉｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ社製）を濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌになるように溶解して使用した。
そして、得られた測定結果から、下記数式７によりＭＭＰ−１活性阻害率を算出した。
＜数式７＞
ＭＭＰ−１活性阻害率（％）＝{１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）}×１００
ただし、前記数式７中、Ａは、試料溶液無添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度、Ｂは、試料溶液無添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度、Ｃは、試料溶液添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度、Ｄは、試料溶液添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度、をそれぞれ表す。
【００６１】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記ＭＭＰ−１活性阻害率の測定を行い、ＭＭＰ−１活性を５０％阻害する試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表８に示す。
【００６２】
【表８】
表８の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用を有することが確認できた。
【００６３】
（実施例８）
−エストロゲン様作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりエストロゲン様作用を試験した。
ヒト乳癌由来細胞（ＭＣＦ−７）を１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、１質量％のＮＥＡＡ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を活性炭処理した１０質量％のＦＢＳ、１質量％のＮＥＡＡ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するフェノールレッド不含ＭＥＭ（Ｔ−ＭＥＭ）を用いて３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、４８穴マイクロプレートに１穴あたり４５０μＬずつ播種し、細胞を定着させるため培養した。６時間後（０日目）にＴ−ＭＥＭで終濃度の１０倍に調製した各試料溶液を各穴に５０μＬずつ添加し、培養を続けた。３日目に培地を抜き、Ｔ−ＭＥＭで終濃度に調製した試料溶液を各穴に５００μＬ添加し、更に培養を続けた。
エストロゲン様作用は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、１質量％のＮＥＡＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭに終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで溶解したＭＴＴ〔3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide〕を各穴に２００μＬずつ添加した。２時間培養した後、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。ポジティブコントロールとして、１０−９ｍｏｌ／Ｌのエストラジオールを使用した。
そして、得られた測定結果から、エストロゲン様作用（エストロゲン依存性増殖作用）を下記数式８から算出した。試料濃度５０μｇ／ｍＬでのエストロゲン様作用率の結果を表９に示す。
【００６４】
＜数式８＞
エストロゲン様作用率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
ただし、前記数式８において、Ａは、試料溶液添加の場合の吸光度を表す。Ｂは、試料溶液無添加の場合の吸光度を表す。
【００６５】
【表９】
表９の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、エストロゲン様作用を有することが確認できた。
【００６６】
（実施例９）
−ヒスタミン遊離抑制（ヘキソサミニダーゼ遊離抑制）作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりヒスタミン遊離抑制作用を試験した。なお、細胞内のヒスタミンが遊離されると同時にヘキソサミニダーゼも遊離されることから、ヘキソサミニダーゼ遊離を指標にヒスタミン遊離抑制作用を評価することができる。
２５ｍＬの培養フラスコ内に入れた培地（１５質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）添加Ｓ−ＭＥＭ培地；以下同じ）にラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞）１．０×１０６個を播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で４日間培養した。次いで、トリプシン処理し、遠心分離（８００ｒｐｍ、４分間）して細胞を集めた。得られた細胞を４．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬで培地に懸濁し、そこに、マウスモノクロナール抗ジニトロフェニル基ＩｇＥ（ＤＮＰ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ）を０．５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。この細胞浮遊液を９６穴マイクロプレートの１穴に付き１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で２４時間培養した。培養終了後、各穴中の培地を除去し、シラガニアン緩衝液で２回洗浄した。
次に、上記緩衝液３０μＬ、及び各試料溶液１０μＬを加え、３７℃で１０分間インキュベーションした。次いで、ジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）１０μＬを加え、３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、氷冷下で上清１０μＬを新たな９６穴マイクロプレートに移し替え、これに１ｍｍｏｌ／Ｌのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド溶液１０μＬを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。反応終了後、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３溶液２５０μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて６５０ｎｍを対照に４１５ｎｍにおける吸光度Ａを測定した。試料溶液の代りにシラガニアン緩衝液を添加した細胞上清についても同様の処理と吸光度測定を行った（このとき測定された吸光度をＢとした）。また、細胞上清と０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３溶液を同様の処理で反応させたものについても、吸光度測定を行った（このとき測定された吸光度をＣとした）。同様の操作をＤＮＰ−ＢＳＡのかわりにシラガニアン緩衝液を加えたものについても行った（このとき測定された吸光度をＤとした）。
そして、得られた測定結果から、下記数式９によりヘキソサミニダーゼ遊離抑制（ヒスタミン遊離抑制）率を算出した。
【００６７】
＜数式９＞
ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率（％）＝
〔１−{(Ａ−Ｃ−Ｄ)／（Ｂ−Ｄ）}〕×１００
ただし、前記数式９中、Ａ〜Ｄは、上記試験方法中の記載と同じ意味を表す。
【００６８】
次に、各試料濃度を段階的に減少させて上記ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率の測定を行い、ヘキソサミニダーゼの遊離を５０％阻害する試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表１０に示す。
【００６９】
【表１０】
表１０の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、ヒスタミン遊離抑制（ヘキソサミニダーゼ遊離抑制）作用を有することが確認できた。
【００７０】
（実施例１０）
−一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験方法により一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用を試験した。
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を１０質量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように１０質量％のＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭで希釈した後、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、終濃度２質量％のＤＭＳＯを含む１０質量％のＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭで溶解した各試料溶液を各穴に１００μＬ添加し、終濃度１μｇ／ｍＬで１０質量％のＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１；Ｂ４、ＤＩＦＣＯ社製）を５０μＬ加え、４８時間培養した。ＮＯ産生量は亜硝酸イオン（ＮＯ２−）量を指標に測定した。培養終了後、各穴の培養液に、同量のグリス試薬（１質量％のスルファニルアミド、０．１質量％のＮ−１−ｎａｐｈｔｈｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｐｒｉｄｅ ｉｎ ５質量％のリン酸溶液）を添加し、１０分間室温にて反応した。反応後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールの一酸化窒素（ＮＯ）産生量を基にして、下記数式１０からＮＯ産生抑制率を算出した。
【００７１】
＜数式１０＞
ＮＯ産生抑制率（％）＝{１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）}×１００
ただし、前記数式１０中、Ａは試料添加、ＬＰＳ刺激時の波長５４０ｎｍにおける吸光度、Ｂは試料添加、ＬＰＳ無刺激時の波長５４０ｎｍにおける吸光度、ＣはコントロールのＬＰＳ刺激時の波長５４０ｎｍにおける吸光度、ＤはコントロールのＬＰＳ無刺激時の波長５４０ｎｍにおける吸光度、をそれぞれ表す。
【００７２】
次に、各試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記ＮＯ産生抑制率を測定し、ＮＯ産生抑制率が５０％になる濃度ＩＣ５０を内挿法により求めた（このＩＣ５０値が小さいほどＮＯ産生抑制作用が強い）。結果を表１１に示す。
【００７３】
【表１１】
表１１の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、高い一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用を有することが認められた。
【００７４】
（実施例１０）
−シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）を介したＰＧＥ２産生抑制作用試験−
製造例１〜３の各抽出物を試料として用い、下記の試験方法によりシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）活性阻害作用を試験した。この試験は、Ｈｗａｎｇ，Ｂ．−Ｙ．らの方法（Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ ６７（２００１）、４０６−４１０）に一部修正を加えて行った。
まず、マウス由来マクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７）を前培養後、細胞を集め、２×１０５個／ｍＬに調製して、９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間培養した。培養終了後、既に存在するＣＯＸ−１及び少量発現しているＣＯＸ−２をアセチル化し失活させるため、５００μｍｏｌ／Ｌのアスピリン含有培地に交換して４時間培養した。細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、１μｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を含む培地で溶解した各試料溶液２００μＬを添加し、１８時間培養した。培養終了後、上清中のＰＧＥ２をＰＧＥ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，米国）を用いて定量し、各試料溶液を無添加時の値を１００％として、ＰＧＥ２産生抑制率を算出した。
【００７５】
次に、各試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記ＣＯＸ−２を介したＰＧＥ２産生抑制率を測定し、ＣＯＸ−２を介したＰＧＥ２産生抑制率が５０％になる濃度ＩＣ５０を内挿法により求めた（このＩＣ５０値が小さいほどＣＯＸ−２を介したＰＧＥ２産生抑制作用が強い）。結果を表１２に示す。
【００７６】
【表１２】
表１２の結果から、製造例１〜３の白眉草の抽出物が、ＣＯＸ−２を介したＰＧＥ２産生抑制作用を有することが認められた。
【００７７】
（配合実施例１）
−乳液−
下記組成から乳液を常法により製造した。
・製造例１の白眉草の水抽出物・・・０．１０ｇ
・ホホバオイル・・・４．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．５０ｇ
・オリーブオイル・・・２．００ｇ
・スクワラン・・・２．００ｇ
・セタノール・・・２．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・黄杞エキス・・・０．１０ｇ
・グリチルリチン酸ジカリウム・・・０．１０ｇ
・イチョウ葉エキス・・・０．１０ｇ
・コンキオリン・・・０．１０ｇ
・オウバクエキス・・・０．１０ｇ
・カツミレエキス・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計１００．００ｇ）
【００７８】
（配合実施例２）
−化粧水−
下記組成から化粧水を常法により製造した。
・製造例２の白眉草の５０質量％エタノール抽出物・・・０．１０ｇ
・グリセリン・・・３．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・３．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・２．００ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・０．１５ｇ
・クエン酸・・・０．１０ｇ
・クエン酸ソーダ・・・０．１０ｇ
・油溶性甘草エキス・・・０．１０ｇ
・海藻エキス・・・０．１０ｇ
・クジンエキス・・・０．１０ｇ
・キシロビオースミクスチャー・・・０．０５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００７９】
（配合実施例３）
−クリーム−
下記組成からクリームを常法により製造した。
・製造例３の白眉草のエタノール抽出物・・・０．１０ｇ
・スクワラン・・・１０．００ｇ
・１，３−ブチレングリコール・・・６．００ｇ
・流動パラフィン・・・５．００ｇ
・サラシミツロウ・・・４．００ｇ
・セタノール・・・３．００ｇ
・モノステアリン酸グリセリル・・・３．００ｇ
・ラノリン・・・２．００ｇ
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．５０ｇ
・パラオキシ安息香酸メチル・・・１．５０ｇ
・ステアリン酸・・・１．００ｇ
・酵母抽出液・・・０．１０ｇ
・シソ抽出液・・・０．１０ｇ
・シナノキ抽出液・・・０．１０ｇ
・ジユ抽出液・・・０．１０ｇ
・香料・・・０．１０ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００８０】
（配合実施例４）
−パック−
下記組成からパックを常法により製造した。
・製造例１の白眉草の水抽出物・・・０．２０ｇ
・ポリビニルアルコール・・・１５．００ｇ
・エタノール・・・１０．００ｇ
・プロピレングリコール・・・７．００ｇ
・ポリエチレングリコール・・・３．００ｇ
・セージ抽出液・・・０．１０ｇ
・トウキ抽出液・・・０．１０ｇ
・ニンジン抽出液・・・０．１０ｇ
・パラオキシ安息香酸エチル・・・０．０５ｇ
・香料・・・０．０５ｇ
・精製水・・・残部（合計：１００．００ｇ）
【００８１】
（配合実施例５）
−錠剤状栄養補助食品−
下記の混合物を打錠して、錠剤状栄養補助食品を製造した。
・製造例１の白眉草の水抽出物・・・３０ｇ
・粉糖（ショ糖）・・・１７８ｇ
・ソルビット・・・１０ｇ
・グリセリン脂肪酸エステル・・・１２ｇ
【００８２】
（配合実施例６）
−顆粒状栄養補助食品−
下記の混合物を顆粒状に形成して、栄養補助食品を製造した。
・製造例２の白眉草の５０質量％エタノール抽出物・・・２０ｇ
・ビートオリゴ糖・・・１０００ｇ
・ビタミンＣ・・・１６７ｇ
・ステビア抽出物・・・１０ｇ
【００８３】
（配合実施例７）
−顆粒状栄養補助食品−
下記の混合物を顆粒状に形成して、栄養補助食品を製造した。
・製造例３の白眉草のエタノール抽出物・・・２０ｇ
・ビートオリゴ糖・・・１０００ｇ
・ビタミンＣ・・・１６７ｇ
・ステビア抽出物・・・１０ｇ
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤の少なくともいずれかを配合した皮膚化粧料は、優れた抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有し、生体内の酸化防止、皮膚のシワや皮膚の弾力低下の防止及び改善、肌荒れの予防、肌荒れの防止に有効であり、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤、アストリンゼントなどに幅広く用いられる。
また、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、及び抗炎症剤の少なくともいずれかを添加した美容用飲食品は、経口摂取によっても優れた抗酸化作用、抗老化作用、及び抗炎症作用の少なくともいずれかを有し、安全性にも優れているので、例えば、健康食品、栄養補助食品などに幅広く用いられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有する請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項４】
皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する請求項３に記載の抗老化剤。
【請求項５】
白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項６】
ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有する請求項５に記載の抗炎症剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の白眉草の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の白眉草の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美容用飲食品。
【請求項１】
白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、過酸化水素消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有する請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項４】
皮膚線維芽細胞増殖作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する請求項３に記載の抗老化剤。
【請求項５】
白眉草の抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項６】
ヒスタミン遊離抑制作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、及びシクロオキシダーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用の少なくともいずれかを有する請求項５に記載の抗炎症剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の白眉草の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の白眉草の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美容用飲食品。
【公開番号】特開２００８−３０８４３６（Ｐ２００８−３０８４３６Ａ）
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５７３７９（Ｐ２００７−１５７３７９）
【出願日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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