抗酸化剤
【課題】本発明の課題は抗酸化剤を提供することである。
【解決手段】水及び／又は水溶性有機溶剤によるスイートピーの抽出物、特に、スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する抗酸化剤を提供することである。
【解決手段】水及び／又は水溶性有機溶剤によるスイートピーの抽出物、特に、スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する抗酸化剤を提供することである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成人病、悪性関節リウマチなどの、健康維持上障害となる諸疾患、火傷などの外傷、ニキビ、シミ、ソバカス、皮膚の炎症など、美容上の障害の予防、治療に効果を有する抗酸化剤を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素や不飽和脂質から生成する過酸化脂質が、老化や成人病の発症といった生体への悪影響を及ぼすことが近年明らかとなってきており、各種の研究がなされている。活性酸素消去作用や過酸化脂質の生成抑制作用を有する、いわゆる抗酸化物質の探索や、動脈硬化症、高脂血症、それより発症する脳梗塞、心疾患、およびそれらの後遺症やストレス性潰瘍などの虚血障害、癌、糖尿病などの成人病、悪性リウマチ、ベーチェット病、クーロン病、潰瘍性大腸炎、肝炎、腎炎、パーキンソン病などの難病、農薬などの化学物質により惹起される疾患、光線過敏症、放射線障害などに対する治療薬としてのそれらの応用が一部で試みられている。また、活性酸素や過酸化脂質はシミ、ソバカス、ニキビ、シワ、タルミ、皮膚の炎症などの成因となる他、食品を劣化させ嗜好的品質や栄養の低下を引き起こすことも知られてきている。
これらに対して、特許文献１では天然物であるレモンバームの抗酸化作用に着目し、これから抗酸化作用を有する新規化合物を単離し、医薬品等への応用を試みている。
また、同様に特許文献２ではサンペンズ、ゴカヒ、ジコッピ等の生薬の抽出物に活性酸素消去作用を見出し、これらを医薬品等へ応用しようとしている。
本発明に用いるスイートピー抽出物に関しては、パック剤に配合することが知られているが（特許文献３参照）、スイートピー抽出物が優れた抗酸化効果を有することは知られていない。
【特許文献１】特開平１１−１２２７０号公報
【特許文献２】特開平８−２８３１７２号公報
【特許文献３】ＷＯ９９／４８４５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は抗酸化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の主な構成は次の通りである。
（１）スイートピー抽出物を含有する抗酸化剤。
（２）スイートピー抽出物が水及び／又は水溶性有機溶剤による抽出物であることを特徴とする（１）に記載の抗酸化剤。
（３）スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する抗酸化剤。
（４）スイートピーの花から抽出した抽出物が水及び／又は水溶性有機溶剤による抽出物であることを特徴とする（３）に記載の抗酸化剤。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のスイートピー抽出物を含有する抗酸化剤は、強力な抗酸化作用を有する点で優れている。特に、スイートピーの花の抽出物が抗酸化作用に優れることを確認できた。本発明の抗酸化剤は、医薬、食品、化粧品への応用が可能であり、特に、老化や成人病、シミ、ソバカス、ニキビ、皮膚の炎症などの予防・治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
スイートピー（Lathyrus odoratus L.）は、マメ科レンリソウ属の植物であり、別名、麝香蓮理草、麝香豌豆とも呼ばれる。主に観賞用に用いられる地中海を原産とする園芸品種である。花の色は白、ピンク、青、紫等があり、芳香がある。
スイートピー抽出物については、その植物の全草又は花、茎、葉、根、種子、のうちの一つ以上を常温又は加温下にて溶剤に浸漬して抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる。さらにクロマトグラフィー等を用いて成分を精製しても良い。老化の予防、改善効果により優れる抽出物を得るためには、抽出部位は花が特に好ましい。花びら、がく片、雄しべ、雌しべを含む花全体から抽出しても良く、花びらのみ選択的に採取し、花びらから抽出しても良い。スイートピー抽出物は各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又は抽出液を乾燥や凍結乾燥して得られる乾燥末あるいはペーストの形態で使用することができる。
【０００７】
スイートピー抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。例えば、水、アルコール類のメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等、多価アルコール類のプロピレングリコール、ブチレングリコール等、ケトン類のアセトン、メチルエチルケトン等、エステル類の酢酸メチル、酢酸エチル等、鎖状及び環状エーテル類のテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等、ポリエーテル類のポリエチレングリコール等、ハロゲン化炭化水素類のジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等、炭化水素類のヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等、芳香族炭化水素類のベンゼン、トルエン等、ピリジン類等が挙げられ、これらは２種以上を混合して用いることもできる。
上記の抽出溶剤の中でも、抗酸化効果に優れる抽出物を得るためには水または水溶性有機溶剤が好ましい。水溶性有機溶剤としてはメタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、アセトン等が挙げられる。
【０００８】
本発明の抗酸化剤は医薬、食品、化粧品に配合して使用することができる。また、経口投与、皮膚外用等の非経口投与のいずれも可能である。
【０００９】
本発明でいう、抗酸化剤とは、酸化防止剤とも言われるもので、酸素によって酸化されることによる劣化（抗酸化作用）を防ぐために添加される剤であり、生体内においては活性酸素を消去する作用を有する剤をいう。本発明では、この抗酸化作用を、後述するスーパーオキシドアニオンラジカル消去作用、一重項酸素消去作用、ヒドロキシラジカル消去作用、ＤＰＰＨラジカル消去作用の測定により評価した。
【００１０】
以下に本発明を実施例に基づき、さらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００１１】
スイートピー（Lathyrus odoratus L.）の花１ｋｇに対し約倍量の水を加え、加熱抽出した。得られた液を濃縮し、フィルターにてろ過後、エタノールを添加して冷蔵し、不溶物を除去した。その後、イオン交換カラムにて脱塩した。濾液を脱溶媒し、凍結乾燥し５．１ｇの固形分を得た。
【００１２】
抗酸化作用の測定
１．ＥＳＲ法を用いた抗酸化作用の測定
１．１ ＥＳＲ測定条件並びにラジカル消去率、ラジカル消去IC50算出方法
装置：日本電子製 ＥＳＲ−ＪＥＳ−ＴＥ２００、共鳴周波数：９．４３ＧＨｚ、出力：４．０ｍＷ、磁場変調：１００ｋＨｚ、観測磁場：３３８．５±５ｍＴ、測定時間：１分、変調幅：０．１ｍＴ、増幅率：１００（一重項酸素消去能及びＯＨラジカル消去能測定時）または５００（ＤＰＰＨ（1,1’-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去能及びスーパーオキシドアニオンラジカル消去能測定時）、応答時間：０．１秒
ラジカル消去率[%]は100×{1 − (Sn[sample])／(Sn[control])}より求めた。Sn[sample]は評価検体を添加したときのESRシグナル強度、Sn[control]は評価検体の濃度が０%;w/vのときのESRシグナル強度である。
ラジカル消去IC50は評価検体添加濃度（%;w/v ）vs F/(1−F)[F→ラジカル消去率（％）／100]の一次曲線を用いて決定した。
【００１３】
１．２ 評価検体
スイートピー花抽出物（実施例１で調製したもの）
ブドウ種子エタノール抽出物（１．３で評価に用いた）
フランス海岸松樹皮エタノール抽出物（１．３で評価に用いた）
【００１４】
１．３ スーパーオキシドアニオンラジカル消去能の測定
次の１）〜４）を混合し、最後に５）を添加して全量200μlとした。
１）400μM ヒポキサンチン／Delbecco’s PBS（pH=7.40） 50μl （終濃度100μM）
２）1.33ｍM DETAPAC（Diethylenetriamin-N,N,N’,N”,N”-pentaacetic
anhydride）／Delbecco’s PBS（pH=7.40） 15μl（終濃度100μM）
３）1.33M DMPO（5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide）／蒸留水 15μl（終濃度100mM）
４）各濃度の評価検体／2％DMF水溶液 100μl（終濃度は各濃度の２倍となる）
５）200mU／ml XOD（xanthine oxidase）／Delbecco’s PBS（pH=7.40） 20μl（終濃度20mU／ml）
XOD添加後全量200μlをESR測定用扁平セルに移し、1分後に測定開始した。検体濃度1点についてn=2で平均値を求めて評価した。
その結果、スイートピー花抽出物の添加濃度に依存して、スーパーオキシドアニオンラジカルが消去され、スイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカルの消去作用が確認された。スーパーオキシドアニオンラジカル消去のIC50（%;w/v）は0.0035であった。スーパーオキシドアニオンラジカルの消去能に優れるフ゛トウ種子エタノール抽出物、フランス海岸松樹皮エタノール抽出物について同様の手順で測定した結果、スーパーオキシドアニオンラジカル消去作用のIC50（%;w/v）はブドウ種子抽出物は0.0077、フランス海岸松樹皮抽出物は0.0244であった。それらと比較してスイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去能が優れていることを確認できた。スイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去率のグラフを図１に示す。
【００１５】
１．４ 一重項酸素消去能の測定
次の１）〜４）を混合し、全量200μlとした。
１）各濃度の評価検体／40％(v/v)DMF 100μL（終濃度は各濃度の２倍となる）
２）生理食塩水 20μL
３）100mM 4-OH TEMP（2,2,6,6-tetramethyl-4-hydroxy-piperidine）／蒸留水 40μL（終濃度20ｍM）
４）100μM ローズベンガル／蒸留水 40μL（終濃度20μM）
全量200μlを96well plateに滴下し、緑色光（λmax:525nm）照射によるローズベンガルの光増感反応によって反応する一重項酸素と、溶液中に存在している4-OH TEMPとのadduct［2,2,6,6-tetramethyl-4-hydoxy-piperidinyloxy (4-OH TEMPO)
radical ］についてESR（電子スピン共鳴）測定をおこなった。
光照射装置はLED（Light Emitting Diode Green (lMAX=530nm) 光源のSLL-4100S RGB（(有)シマテック製）を用い、照射時間20minの時の試験結果から一重項酸素消去率を求めた。検体濃度1点についてn=2で平均値を求めて評価した。スイートピー花抽出物の一重項酸素消去率のグラフを図２に示す。スイートピー花抽出物の添加濃度に依存して一重項酸素が消去され、一重項酸素の消去作用が確認できた。一重項酸素消去のIC50（%;w/v）は0.0546であった。
【００１６】
１．５ ヒドロキシラジカル消去能の測定
１）→５）の順でエッペンチューブ（1.5ml容）に溶液を加えた。
１）200μM DETAPAC／Delbecco’s PBS （pH=7.40）100μL（終濃度100μM）
２）500μM Ferrous sulfate ／蒸留水 20μL（終濃度50μM）
３）100mM DMPO／蒸留水 20μL（終濃度10ｍM）
４）各濃度の評価検体／蒸留水 40μL
５）10mM H2O2
／蒸留水 20μL（終濃度1ｍM）
全量200μlをESR測定用扁平セルに移し、５）の溶液添加後、5min以内に測定した。
検体濃度1点についてn=１で評価した。スイートピー花抽出物のヒドロキシラジカル消去率のグラフを図３に示す。スイートピー花抽出物の添加濃度に依存してヒドロキシラジカルが消去され、ヒドロキシラジカルの消去作用が確認できた。ヒドロキシラジカル消去のIC50（%;w/v）は0.163であった。
【００１７】
ＤＰＰＨラジカル消去能の測定
次の１）と２）を混合し、全量200μlとした。
１）100μM DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）／エタノール 100μl（終濃度50μM）
２）各濃度の評価検体溶液 ／10ｍM PBS（pH=7.40） 100μl（終濃度は各濃度の２倍となる）
１）と２）を混合後５分以内に、全量200μl（最終溶媒：50％エタノール、50％PBS）をESR測定用扁平セルに移し、測定した。検体濃度1点についてn=１で評価した。スイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去率のグラフを図４に示す。スイートピー花抽出物の添加濃度に依存してＤＰＰＨラジカルが消去され、ＤＰＰＨラジカルの消去作用が確認できた。ＤＰＰＨラジカル消去のIC50（%;w/v）は0.0025であった。
【００１８】
２．吸光光度法を用いた抗酸化作用の測定
２．１ 評価検体
スイートピー花抽出物（実施例１で調製したもの）
パセリ抽出液（パセリの葉から水抽出し、抽出物0.3%;w/w、１，３−ブチレングリコール30%;w/w、水69.7%;w/wとしたもの）（２．２で評価に用いた）
ルイボス抽出液（ルイボス（アスパラサスリネアリス）の全草から50%;w/w１，３−ブチレングリコール水溶液で抽出し、抽出物0.5%;w/w、１，３−ブチレングリコール49.75%;w/w、水49.75%;w/wとしたもの）（２．３で評価に用いた）
【００１９】
スーパーオキシドアニオンラジカル消去能の測定
96wellプレートにサンプル（評価検体のTris-HCL buffer pH7.8溶液）を50μlずつ入れ、0.75mM Xantine/0.05N NaOH、0.75mM EDTA/0.05N NaOH、0.025% BSA/50mM Tris-HCL buffer pH7.8、0.1875mM Nitro Blue Tetrazolium(NBT)/50mM Tris-HCL buffer pH7.8を20ulずつ順に添加し、25℃で10分間インキュベートした。10分後、0.075U/mlXanthine oxidase（XOD) /50mM Tris-HCL buffer pH7.8を20ulずつ添加し、25℃で20分間インキュベートした。その後、1.5mM CuCl２/50mM
Tris-HCL buffer pH7.8を20ul添加し、反応を止めた。その後、570nmの波長で吸光度を測定し、サンフ゜ル・XOD添加の場合をサンフ゜ル、サンフ゜ル無添加・XOD添加の場合をコントロール、サンフ゜ル添加・XOD無添加の場合をサンフ゜ルフ゛ランク、サンフ゜ル・XOD無添加の場合をコントロールフ゛ランクとして、以下の式により、スーパーオキシドアニオンラジカルの消去率を算出した。スーハ゜ーオキシト゛アニオンラシ゛カル消去率（％）=｛１−（サンフ゜ル吸光度−サンフ゜ルフ゛ランク吸光度）/（コントロール吸光度−コントロールフ゛ランク吸光度）｝×100
その結果、スイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去のIC50（mg/ml）は0.0011となった。スーパーオキシドアニオンラジカル消去能に優れているとされるパセリ抽出物（抽出液を検体に用いたが、抽出物換算した）のIC50（mg/ml）は0.0042であり、スイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去能はパセリ抽出物よりも高いことが分かった。スイートピー花抽出物、パセリ抽出物（抽出液を検体に用いたが、抽出物換算した）のスーパーオキシドアニオンラジカル消去率のグラフを図５に示す。
【００２０】
２．３ ＤＰＰＨラジカル消去能の測定
50μlのサンフ゜ル溶液（評価検体の水溶液）と0.75mM DPPHエタノール溶液を混合し、室温で20分間放置し、515nmで吸光度を測定する。
サンフ゜ル・DPPH添加の場合をサンフ゜ル、サンフ゜ル無添加・DPPH添加の場合をコントロール、サンフ゜ル添加・DPPH無添加の場合をサンフ゜ルフ゛ランク、サンフ゜ル・DPPH無添加の場合をコントロールフ゛ランクとして、以下の式により、DPPHラジカル消去率率を算出する。
DPPHラシ゛カル消去率=｛１−（ サンフ゜ル吸光度−サンフ゜ルフ゛ランク吸光度）/（コントロール吸光度−コントロールフ゛ランク吸光度｝×100
その結果、スイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去のIC50（mg/ml）は0.037となった。ＤＰＰＨラジカル消去能に優れているとされるルイボス抽出物（抽出液を検体に用いたが、抽出物換算した）のIC50（mg/ml）は0.092であり、スイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能はルイボス抽出物よりも高いことが分かった。スイートピー花抽出物、ルイボス抽出物（抽出液を検体に用いたが、抽出物換算した）のＤＰＰＨラジカル消去率のグラフを図６に示す。
【００２１】
以下に処方例を示す。
処方例１
［錠剤の製造］
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
スイートピー花抽出物 24
乳糖 63
コーンスターチ 12
グァーガム 1
【００２２】
処方例２
［ジュースの製造］
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のジュースを製造した。
（組 成） （配合：重量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁 5.0
果糖ブドウ糖液糖 11.0
クエン酸 0.2
Ｌ-アスコルビン酸 0.02
香料 0.2
色素 0.1
スイートピー花抽出物 0.2
水 83.28
【００２３】
処方例3
［化粧品（ハンドクリーム）の製造］
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のハンドクリームを製造した。
（組 成） （配合：重量％）
セタノール 8.0
ステアリルアルコール 2.0
ポリオキシエチレンラウリルエーテル 1.5
プロピレングリコール 6.0
ソルビトール 1.0
パラベン 0.4
スイートピー花抽出物 0.5
ビタミン 0.5
香料 0.1
精製水 66.0
【００２４】
処方例４
〔化粧品（化粧水）の製造〕
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の化粧水を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
精製水 残余
１．３−ブチレングリコール 8.5
グリセリン 1.5
L−セリン 0.1
混合異性化糖 1.0
パセリエキス 0.1
ローズマリーエキス 0.3
スイートピー花抽出物 0.1
【００２５】
処方例５
〔化粧品（乳液）の製造〕
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の乳液を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
精製水 残余
１．３−ブチレングリコール 8.0
カルボキシビニルポリマー 0.12
グリセリン 3.0
混合異性化糖 0.5
L-トレオニン 0.1
ホホバ油 1.5
スクワラン 1.5
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 1.0
パセリエキス 0.1
スイートピー花抽出物 0.2
水酸化カリウム 0.04
【００２６】
処方例６
〔化粧品（美容液）の製造〕
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の美容液を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
精製水 残余
１．３−ブチレングリコール 8.0
トリメチルグリシン 2.0
グリセリン 5.0
混合異性化糖 3.0
スイートピー花抽出物 0.2
カルボキシビニルポリマー 0.15
水酸化カリウム 0.05
ヒアルロン酸ナトリウム（１％水溶液） 0.5
【００２７】
処方例７
〔化粧品（パック化粧料）の製造〕
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のパック化粧料を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
精製水 残余
デキストラン 11.5
カルボキシビニルポリマー 0.3
ジグリセリン 17.0
トリメチルグリシン 2.0
L−セリン 0.1
混合異性化糖 0.5
スイートピー花抽出物 0.2
マルチトール 4.0
１．３−ブチレングリコール 10.0
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.5
カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.4
水酸化カリウム 0.1
塩類含有カプセル 0.1
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＥＳＲ法によるスイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去率のグラフ
【図２】ＥＳＲ法によるスイートピー花抽出物の一重項酸素消去率のグラフ
【図３】ＥＳＲ法によるスイートピー花抽出物のヒドロキシラジカル消去率のグラフ
【図４】ＥＳＲ法によるスイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去率のグラフ
【図５】吸光光度法によるスイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去率のグラフ
【図６】吸光光度法によるスイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去率のグラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成人病、悪性関節リウマチなどの、健康維持上障害となる諸疾患、火傷などの外傷、ニキビ、シミ、ソバカス、皮膚の炎症など、美容上の障害の予防、治療に効果を有する抗酸化剤を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素や不飽和脂質から生成する過酸化脂質が、老化や成人病の発症といった生体への悪影響を及ぼすことが近年明らかとなってきており、各種の研究がなされている。活性酸素消去作用や過酸化脂質の生成抑制作用を有する、いわゆる抗酸化物質の探索や、動脈硬化症、高脂血症、それより発症する脳梗塞、心疾患、およびそれらの後遺症やストレス性潰瘍などの虚血障害、癌、糖尿病などの成人病、悪性リウマチ、ベーチェット病、クーロン病、潰瘍性大腸炎、肝炎、腎炎、パーキンソン病などの難病、農薬などの化学物質により惹起される疾患、光線過敏症、放射線障害などに対する治療薬としてのそれらの応用が一部で試みられている。また、活性酸素や過酸化脂質はシミ、ソバカス、ニキビ、シワ、タルミ、皮膚の炎症などの成因となる他、食品を劣化させ嗜好的品質や栄養の低下を引き起こすことも知られてきている。
これらに対して、特許文献１では天然物であるレモンバームの抗酸化作用に着目し、これから抗酸化作用を有する新規化合物を単離し、医薬品等への応用を試みている。
また、同様に特許文献２ではサンペンズ、ゴカヒ、ジコッピ等の生薬の抽出物に活性酸素消去作用を見出し、これらを医薬品等へ応用しようとしている。
本発明に用いるスイートピー抽出物に関しては、パック剤に配合することが知られているが（特許文献３参照）、スイートピー抽出物が優れた抗酸化効果を有することは知られていない。
【特許文献１】特開平１１−１２２７０号公報
【特許文献２】特開平８−２８３１７２号公報
【特許文献３】ＷＯ９９／４８４５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は抗酸化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の主な構成は次の通りである。
（１）スイートピー抽出物を含有する抗酸化剤。
（２）スイートピー抽出物が水及び／又は水溶性有機溶剤による抽出物であることを特徴とする（１）に記載の抗酸化剤。
（３）スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する抗酸化剤。
（４）スイートピーの花から抽出した抽出物が水及び／又は水溶性有機溶剤による抽出物であることを特徴とする（３）に記載の抗酸化剤。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のスイートピー抽出物を含有する抗酸化剤は、強力な抗酸化作用を有する点で優れている。特に、スイートピーの花の抽出物が抗酸化作用に優れることを確認できた。本発明の抗酸化剤は、医薬、食品、化粧品への応用が可能であり、特に、老化や成人病、シミ、ソバカス、ニキビ、皮膚の炎症などの予防・治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
スイートピー（Lathyrus odoratus L.）は、マメ科レンリソウ属の植物であり、別名、麝香蓮理草、麝香豌豆とも呼ばれる。主に観賞用に用いられる地中海を原産とする園芸品種である。花の色は白、ピンク、青、紫等があり、芳香がある。
スイートピー抽出物については、その植物の全草又は花、茎、葉、根、種子、のうちの一つ以上を常温又は加温下にて溶剤に浸漬して抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる。さらにクロマトグラフィー等を用いて成分を精製しても良い。老化の予防、改善効果により優れる抽出物を得るためには、抽出部位は花が特に好ましい。花びら、がく片、雄しべ、雌しべを含む花全体から抽出しても良く、花びらのみ選択的に採取し、花びらから抽出しても良い。スイートピー抽出物は各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又は抽出液を乾燥や凍結乾燥して得られる乾燥末あるいはペーストの形態で使用することができる。
【０００７】
スイートピー抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。例えば、水、アルコール類のメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等、多価アルコール類のプロピレングリコール、ブチレングリコール等、ケトン類のアセトン、メチルエチルケトン等、エステル類の酢酸メチル、酢酸エチル等、鎖状及び環状エーテル類のテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等、ポリエーテル類のポリエチレングリコール等、ハロゲン化炭化水素類のジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等、炭化水素類のヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等、芳香族炭化水素類のベンゼン、トルエン等、ピリジン類等が挙げられ、これらは２種以上を混合して用いることもできる。
上記の抽出溶剤の中でも、抗酸化効果に優れる抽出物を得るためには水または水溶性有機溶剤が好ましい。水溶性有機溶剤としてはメタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、アセトン等が挙げられる。
【０００８】
本発明の抗酸化剤は医薬、食品、化粧品に配合して使用することができる。また、経口投与、皮膚外用等の非経口投与のいずれも可能である。
【０００９】
本発明でいう、抗酸化剤とは、酸化防止剤とも言われるもので、酸素によって酸化されることによる劣化（抗酸化作用）を防ぐために添加される剤であり、生体内においては活性酸素を消去する作用を有する剤をいう。本発明では、この抗酸化作用を、後述するスーパーオキシドアニオンラジカル消去作用、一重項酸素消去作用、ヒドロキシラジカル消去作用、ＤＰＰＨラジカル消去作用の測定により評価した。
【００１０】
以下に本発明を実施例に基づき、さらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００１１】
スイートピー（Lathyrus odoratus L.）の花１ｋｇに対し約倍量の水を加え、加熱抽出した。得られた液を濃縮し、フィルターにてろ過後、エタノールを添加して冷蔵し、不溶物を除去した。その後、イオン交換カラムにて脱塩した。濾液を脱溶媒し、凍結乾燥し５．１ｇの固形分を得た。
【００１２】
抗酸化作用の測定
１．ＥＳＲ法を用いた抗酸化作用の測定
１．１ ＥＳＲ測定条件並びにラジカル消去率、ラジカル消去IC50算出方法
装置：日本電子製 ＥＳＲ−ＪＥＳ−ＴＥ２００、共鳴周波数：９．４３ＧＨｚ、出力：４．０ｍＷ、磁場変調：１００ｋＨｚ、観測磁場：３３８．５±５ｍＴ、測定時間：１分、変調幅：０．１ｍＴ、増幅率：１００（一重項酸素消去能及びＯＨラジカル消去能測定時）または５００（ＤＰＰＨ（1,1’-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去能及びスーパーオキシドアニオンラジカル消去能測定時）、応答時間：０．１秒
ラジカル消去率[%]は100×{1 − (Sn[sample])／(Sn[control])}より求めた。Sn[sample]は評価検体を添加したときのESRシグナル強度、Sn[control]は評価検体の濃度が０%;w/vのときのESRシグナル強度である。
ラジカル消去IC50は評価検体添加濃度（%;w/v ）vs F/(1−F)[F→ラジカル消去率（％）／100]の一次曲線を用いて決定した。
【００１３】
１．２ 評価検体
スイートピー花抽出物（実施例１で調製したもの）
ブドウ種子エタノール抽出物（１．３で評価に用いた）
フランス海岸松樹皮エタノール抽出物（１．３で評価に用いた）
【００１４】
１．３ スーパーオキシドアニオンラジカル消去能の測定
次の１）〜４）を混合し、最後に５）を添加して全量200μlとした。
１）400μM ヒポキサンチン／Delbecco’s PBS（pH=7.40） 50μl （終濃度100μM）
２）1.33ｍM DETAPAC（Diethylenetriamin-N,N,N’,N”,N”-pentaacetic
anhydride）／Delbecco’s PBS（pH=7.40） 15μl（終濃度100μM）
３）1.33M DMPO（5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide）／蒸留水 15μl（終濃度100mM）
４）各濃度の評価検体／2％DMF水溶液 100μl（終濃度は各濃度の２倍となる）
５）200mU／ml XOD（xanthine oxidase）／Delbecco’s PBS（pH=7.40） 20μl（終濃度20mU／ml）
XOD添加後全量200μlをESR測定用扁平セルに移し、1分後に測定開始した。検体濃度1点についてn=2で平均値を求めて評価した。
その結果、スイートピー花抽出物の添加濃度に依存して、スーパーオキシドアニオンラジカルが消去され、スイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカルの消去作用が確認された。スーパーオキシドアニオンラジカル消去のIC50（%;w/v）は0.0035であった。スーパーオキシドアニオンラジカルの消去能に優れるフ゛トウ種子エタノール抽出物、フランス海岸松樹皮エタノール抽出物について同様の手順で測定した結果、スーパーオキシドアニオンラジカル消去作用のIC50（%;w/v）はブドウ種子抽出物は0.0077、フランス海岸松樹皮抽出物は0.0244であった。それらと比較してスイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去能が優れていることを確認できた。スイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去率のグラフを図１に示す。
【００１５】
１．４ 一重項酸素消去能の測定
次の１）〜４）を混合し、全量200μlとした。
１）各濃度の評価検体／40％(v/v)DMF 100μL（終濃度は各濃度の２倍となる）
２）生理食塩水 20μL
３）100mM 4-OH TEMP（2,2,6,6-tetramethyl-4-hydroxy-piperidine）／蒸留水 40μL（終濃度20ｍM）
４）100μM ローズベンガル／蒸留水 40μL（終濃度20μM）
全量200μlを96well plateに滴下し、緑色光（λmax:525nm）照射によるローズベンガルの光増感反応によって反応する一重項酸素と、溶液中に存在している4-OH TEMPとのadduct［2,2,6,6-tetramethyl-4-hydoxy-piperidinyloxy (4-OH TEMPO)
radical ］についてESR（電子スピン共鳴）測定をおこなった。
光照射装置はLED（Light Emitting Diode Green (lMAX=530nm) 光源のSLL-4100S RGB（(有)シマテック製）を用い、照射時間20minの時の試験結果から一重項酸素消去率を求めた。検体濃度1点についてn=2で平均値を求めて評価した。スイートピー花抽出物の一重項酸素消去率のグラフを図２に示す。スイートピー花抽出物の添加濃度に依存して一重項酸素が消去され、一重項酸素の消去作用が確認できた。一重項酸素消去のIC50（%;w/v）は0.0546であった。
【００１６】
１．５ ヒドロキシラジカル消去能の測定
１）→５）の順でエッペンチューブ（1.5ml容）に溶液を加えた。
１）200μM DETAPAC／Delbecco’s PBS （pH=7.40）100μL（終濃度100μM）
２）500μM Ferrous sulfate ／蒸留水 20μL（終濃度50μM）
３）100mM DMPO／蒸留水 20μL（終濃度10ｍM）
４）各濃度の評価検体／蒸留水 40μL
５）10mM H2O2
／蒸留水 20μL（終濃度1ｍM）
全量200μlをESR測定用扁平セルに移し、５）の溶液添加後、5min以内に測定した。
検体濃度1点についてn=１で評価した。スイートピー花抽出物のヒドロキシラジカル消去率のグラフを図３に示す。スイートピー花抽出物の添加濃度に依存してヒドロキシラジカルが消去され、ヒドロキシラジカルの消去作用が確認できた。ヒドロキシラジカル消去のIC50（%;w/v）は0.163であった。
【００１７】
ＤＰＰＨラジカル消去能の測定
次の１）と２）を混合し、全量200μlとした。
１）100μM DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）／エタノール 100μl（終濃度50μM）
２）各濃度の評価検体溶液 ／10ｍM PBS（pH=7.40） 100μl（終濃度は各濃度の２倍となる）
１）と２）を混合後５分以内に、全量200μl（最終溶媒：50％エタノール、50％PBS）をESR測定用扁平セルに移し、測定した。検体濃度1点についてn=１で評価した。スイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去率のグラフを図４に示す。スイートピー花抽出物の添加濃度に依存してＤＰＰＨラジカルが消去され、ＤＰＰＨラジカルの消去作用が確認できた。ＤＰＰＨラジカル消去のIC50（%;w/v）は0.0025であった。
【００１８】
２．吸光光度法を用いた抗酸化作用の測定
２．１ 評価検体
スイートピー花抽出物（実施例１で調製したもの）
パセリ抽出液（パセリの葉から水抽出し、抽出物0.3%;w/w、１，３−ブチレングリコール30%;w/w、水69.7%;w/wとしたもの）（２．２で評価に用いた）
ルイボス抽出液（ルイボス（アスパラサスリネアリス）の全草から50%;w/w１，３−ブチレングリコール水溶液で抽出し、抽出物0.5%;w/w、１，３−ブチレングリコール49.75%;w/w、水49.75%;w/wとしたもの）（２．３で評価に用いた）
【００１９】
スーパーオキシドアニオンラジカル消去能の測定
96wellプレートにサンプル（評価検体のTris-HCL buffer pH7.8溶液）を50μlずつ入れ、0.75mM Xantine/0.05N NaOH、0.75mM EDTA/0.05N NaOH、0.025% BSA/50mM Tris-HCL buffer pH7.8、0.1875mM Nitro Blue Tetrazolium(NBT)/50mM Tris-HCL buffer pH7.8を20ulずつ順に添加し、25℃で10分間インキュベートした。10分後、0.075U/mlXanthine oxidase（XOD) /50mM Tris-HCL buffer pH7.8を20ulずつ添加し、25℃で20分間インキュベートした。その後、1.5mM CuCl２/50mM
Tris-HCL buffer pH7.8を20ul添加し、反応を止めた。その後、570nmの波長で吸光度を測定し、サンフ゜ル・XOD添加の場合をサンフ゜ル、サンフ゜ル無添加・XOD添加の場合をコントロール、サンフ゜ル添加・XOD無添加の場合をサンフ゜ルフ゛ランク、サンフ゜ル・XOD無添加の場合をコントロールフ゛ランクとして、以下の式により、スーパーオキシドアニオンラジカルの消去率を算出した。スーハ゜ーオキシト゛アニオンラシ゛カル消去率（％）=｛１−（サンフ゜ル吸光度−サンフ゜ルフ゛ランク吸光度）/（コントロール吸光度−コントロールフ゛ランク吸光度）｝×100
その結果、スイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去のIC50（mg/ml）は0.0011となった。スーパーオキシドアニオンラジカル消去能に優れているとされるパセリ抽出物（抽出液を検体に用いたが、抽出物換算した）のIC50（mg/ml）は0.0042であり、スイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去能はパセリ抽出物よりも高いことが分かった。スイートピー花抽出物、パセリ抽出物（抽出液を検体に用いたが、抽出物換算した）のスーパーオキシドアニオンラジカル消去率のグラフを図５に示す。
【００２０】
２．３ ＤＰＰＨラジカル消去能の測定
50μlのサンフ゜ル溶液（評価検体の水溶液）と0.75mM DPPHエタノール溶液を混合し、室温で20分間放置し、515nmで吸光度を測定する。
サンフ゜ル・DPPH添加の場合をサンフ゜ル、サンフ゜ル無添加・DPPH添加の場合をコントロール、サンフ゜ル添加・DPPH無添加の場合をサンフ゜ルフ゛ランク、サンフ゜ル・DPPH無添加の場合をコントロールフ゛ランクとして、以下の式により、DPPHラジカル消去率率を算出する。
DPPHラシ゛カル消去率=｛１−（ サンフ゜ル吸光度−サンフ゜ルフ゛ランク吸光度）/（コントロール吸光度−コントロールフ゛ランク吸光度｝×100
その結果、スイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去のIC50（mg/ml）は0.037となった。ＤＰＰＨラジカル消去能に優れているとされるルイボス抽出物（抽出液を検体に用いたが、抽出物換算した）のIC50（mg/ml）は0.092であり、スイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能はルイボス抽出物よりも高いことが分かった。スイートピー花抽出物、ルイボス抽出物（抽出液を検体に用いたが、抽出物換算した）のＤＰＰＨラジカル消去率のグラフを図６に示す。
【００２１】
以下に処方例を示す。
処方例１
［錠剤の製造］
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
スイートピー花抽出物 24
乳糖 63
コーンスターチ 12
グァーガム 1
【００２２】
処方例２
［ジュースの製造］
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のジュースを製造した。
（組 成） （配合：重量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁 5.0
果糖ブドウ糖液糖 11.0
クエン酸 0.2
Ｌ-アスコルビン酸 0.02
香料 0.2
色素 0.1
スイートピー花抽出物 0.2
水 83.28
【００２３】
処方例3
［化粧品（ハンドクリーム）の製造］
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のハンドクリームを製造した。
（組 成） （配合：重量％）
セタノール 8.0
ステアリルアルコール 2.0
ポリオキシエチレンラウリルエーテル 1.5
プロピレングリコール 6.0
ソルビトール 1.0
パラベン 0.4
スイートピー花抽出物 0.5
ビタミン 0.5
香料 0.1
精製水 66.0
【００２４】
処方例４
〔化粧品（化粧水）の製造〕
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の化粧水を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
精製水 残余
１．３−ブチレングリコール 8.5
グリセリン 1.5
L−セリン 0.1
混合異性化糖 1.0
パセリエキス 0.1
ローズマリーエキス 0.3
スイートピー花抽出物 0.1
【００２５】
処方例５
〔化粧品（乳液）の製造〕
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の乳液を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
精製水 残余
１．３−ブチレングリコール 8.0
カルボキシビニルポリマー 0.12
グリセリン 3.0
混合異性化糖 0.5
L-トレオニン 0.1
ホホバ油 1.5
スクワラン 1.5
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 1.0
パセリエキス 0.1
スイートピー花抽出物 0.2
水酸化カリウム 0.04
【００２６】
処方例６
〔化粧品（美容液）の製造〕
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の美容液を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
精製水 残余
１．３−ブチレングリコール 8.0
トリメチルグリシン 2.0
グリセリン 5.0
混合異性化糖 3.0
スイートピー花抽出物 0.2
カルボキシビニルポリマー 0.15
水酸化カリウム 0.05
ヒアルロン酸ナトリウム（１％水溶液） 0.5
【００２７】
処方例７
〔化粧品（パック化粧料）の製造〕
実施例１の抽出方法で得られたスイートピー花抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のパック化粧料を製造した。
（組 成） （配合：重量％）
精製水 残余
デキストラン 11.5
カルボキシビニルポリマー 0.3
ジグリセリン 17.0
トリメチルグリシン 2.0
L−セリン 0.1
混合異性化糖 0.5
スイートピー花抽出物 0.2
マルチトール 4.0
１．３−ブチレングリコール 10.0
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.5
カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.4
水酸化カリウム 0.1
塩類含有カプセル 0.1
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＥＳＲ法によるスイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去率のグラフ
【図２】ＥＳＲ法によるスイートピー花抽出物の一重項酸素消去率のグラフ
【図３】ＥＳＲ法によるスイートピー花抽出物のヒドロキシラジカル消去率のグラフ
【図４】ＥＳＲ法によるスイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去率のグラフ
【図５】吸光光度法によるスイートピー花抽出物のスーパーオキシドアニオンラジカル消去率のグラフ
【図６】吸光光度法によるスイートピー花抽出物のＤＰＰＨラジカル消去率のグラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スイートピー抽出物を含有する抗酸化剤。
【請求項２】
スイートピー抽出物が水及び／又は水溶性有機溶剤による抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する抗酸化剤。
【請求項４】
スイートピーの花から抽出した抽出物が水及び／又は水溶性有機溶剤による抽出物であることを特徴とする請求項３に記載の抗酸化剤。
【請求項１】
スイートピー抽出物を含有する抗酸化剤。
【請求項２】
スイートピー抽出物が水及び／又は水溶性有機溶剤による抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する抗酸化剤。
【請求項４】
スイートピーの花から抽出した抽出物が水及び／又は水溶性有機溶剤による抽出物であることを特徴とする請求項３に記載の抗酸化剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２８５６３７（Ｐ２００８−２８５６３７Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３４８４１（Ｐ２００７−１３４８４１）
【出願日】平成１９年５月２１日（２００７．５．２１）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２１日（２００７．５．２１）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
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