日焼け細胞形成抑制剤
【課題】優れた細胞形成抑制効果を発現する日焼け細胞形成抑制剤、ならびに当該日焼け細胞形成抑制剤を含有する皮膚用外用剤および化粧料を提供すること。
【解決手段】有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする日焼け細胞形成抑制剤、ならびに前記日焼け細胞形成抑制剤を含有する皮膚用外用剤および化粧料。
【解決手段】有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする日焼け細胞形成抑制剤、ならびに前記日焼け細胞形成抑制剤を含有する皮膚用外用剤および化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、日焼け細胞形成抑制剤に関する。さらに詳しくは、日焼け細胞形成抑制剤、当該日焼け細胞形成抑制剤を含有する皮膚用外用剤および化粧料、ならびに当該日焼け細胞形成抑制剤に有用な新規化合物である４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンに関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の皮膚が太陽光線に含まれている紫外線に暴露されたとき、その表皮細胞が傷害を受け、壊死した表皮細胞である日焼け細胞（サンバーンセル）が形成されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
本発明者らは、紫外線による皮膚障害に対する皮膚細胞自体の抵抗力を向上させる日焼け細胞形成抑制剤として、シャクヤク抽出物を有効成分として含有するサンバーンセル形成抑制剤を開発している（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、前記日焼け細胞形成抑制剤は、シャクヤク抽出物を有効成分とするものであり、確かに優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現するが、さらに一層優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現する日焼け細胞形成抑制剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２４６４１０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ジョンソン・ビーイー(Johnson BE)ら、「ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・デルマトロジー (Journal of Investigative Dermatology)、１９６９年、第５３巻、ｐ．８５−９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、シャクヤク抽出物を有効成分として含有する日焼け細胞形成抑制剤よりもさらに一層優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現する日焼け細胞形成抑制剤、および当該日焼け細胞形成抑制剤を含有する皮膚用外用剤および化粧料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする日焼け細胞形成抑制剤、
（２）ガロイル基含有アルビフロリンが、式（Ｉ）：
【０００９】
【化１】
【００１０】
で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、式(II):
【００１１】
【化２】
【００１２】
で表される６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、およびそれらの薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルアルビフロリン化合物である前記（１）に記載の日焼け細胞形成抑制剤、
（３）ガロイル基含有ペオニフロリンが式(III):
【００１３】
【化３】
【００１４】
で表されるガロイルペオニフロリンおよびその薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルペオニフロリン化合物である前記（１）または（２）に記載の日焼け細胞形成抑制剤、
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の日焼け細胞形成抑制剤を含有してなる皮膚用外用剤、
（５）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の日焼け細胞形成抑制剤を含有してなる化粧料、ならびに
（６）式（Ｉ）：
【００１５】
【化４】
【００１６】
で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、シャクヤク抽出物を有効成分として含有する日焼け細胞形成抑制剤よりも一層優れた細胞形成抑制効果を発現するという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】シャクヤク抽出物が添加された三次元皮膚モデルの組織片の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、シャクヤク抽出物を有効成分として含有する日焼け細胞形成抑制剤に着目して研究を重ねたところ、シャクヤクに含まれている主要物質であるペオニフロリンおよびアルビフロリンには、日焼け細胞形成抑制効果がほとんど認められず、また没食子酸でも日焼け細胞形成抑制効果がほとんど認められないことが判明した。ところが、本発明者らがさらに鋭意研究を重ねたところ、驚くべきことに、没食子酸エステルのなかでも特定のエステル基を有する没食子酸エステル、すなわちガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンが優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現することが見出された。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００２０】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする。また、ガロイル基含有アルビフロリンのなかでも、式（Ｉ）で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンは、本発明者らによって見出された新規化合物である。
【００２１】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤に含有されるガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンの原料として、例えば、シャクヤクを用いることができる。なお、シャクヤクとは、ボタン科ボタン属芍薬(Paeonia lactiflora PallasまたはPaeonia albiflora Pallas）のことを意味する。原料として用いられるシャクヤクの部位としては、例えば、葉、幹、種子、根茎などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの部位のなかでは、根茎が好ましい。根茎は、例えば、その外皮を除去し、乾燥させた後、粉末化させることによって用いることができる。
【００２２】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤に含有されるガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンの原料としてシャクヤクを用いる場合、シャクヤクを溶媒抽出することによって得られたシャクヤク抽出液を用いることができる。
【００２３】
シャクヤク抽出液は、例えば、シャクヤクを水、親水性溶媒、親油性溶媒などの抽出溶媒に浸漬し、必要に応じて加熱下または加圧下で攪拌することによって得ることができる。
【００２４】
抽出溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコールなどの炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの炭素数２〜５の多価アルコールなどのアルコール系溶媒；アセトン、メチルエチルケトンなどの低級脂肪族ケトンなどに代表される親水性有機溶媒などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。抽出溶媒のなかでは、水と親水性有機溶媒との併用が好ましく、水とアルコール系溶媒との併用がより好ましく、水とエタノールまたは１，３−ブチレングリコールとの併用がさらに好ましい。水と親水性有機溶媒とを併用する場合、水と親水性有機溶媒との比率(水／親水性有機溶媒：容量比)は、特に限定されないが、通常、好ましくは１０／９０〜９０／１０、より好ましくは３０／７０〜７０／３０である。
【００２５】
次に、シャクヤク抽出液をカラムクロマトグラフィーで水およびエタノールを用いて溶出させ、水溶出分および各分画分に粗分画した後、必要により、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどによって分離・精製を行なうことにより、シャクヤク抽出液に含まれているガロイル基含有化合物を単離することができる。単離されたガロイル基含有化合物は、常法に従って同定することにより、その構造および分子量を特定することができる。
【００２６】
以上のようにしてシャクヤク抽出液に含まれている化合物を単離することができる。このシャクヤク抽出液に含まれている化合物のなかでも、式（Ｉ）で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、式(II)で表される６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンなどに代表されるガロイル基含有アルビフロリン、および式(III)で表されるガロイルペオニフロリンなどに代表されるガロイル基含有ペオニフロリンなどのガロイル基含有化合物が優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現することは、以下の実施例で確認されている。なお、ガロイル基含有化合物は、所望により、薬理的に許容しうる塩に変換することもできる。薬理的に許容しうる塩への変換は、慣用の方法に従って行なえばよい。
【００２７】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする。
【００２８】
ガロイル基含有アルビフロリンのなかでは、式（Ｉ）で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、式(II)で表される６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、およびそれらの薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルアルビフロリン化合物は、日焼け細胞形成抑制効果の観点から、好適に使用することができる。
【００２９】
ガロイル基含有ペオニフロリンのなかでは、式(III)で表されるガロイルペオニフロリンおよびその薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルペオニフロリン化合物は、日焼け細胞形成抑制効果の観点から、好適に使用することができる。
【００３０】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、前記ガロイル基含有化合物のみから構成されていてもよく、あるいは製剤化したものであってもよい。
【００３１】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどの薬学的に許容しうるキャリアー、その他の任意の助剤を用い、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状などの任意の剤形に製剤化することができる。助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の皮膚用外用剤は、前記日焼け細胞形成抑制剤を含有するものである。皮膚用外用剤としては、例えば、軟膏剤、外用液剤、貼付剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３３】
皮膚用外用剤における日焼け細胞形成抑制剤の含有量は、その用途や剤形などによって異なるので一概には決定することができないが、通常、好ましくは０．００１〜５０質量％、より好ましくは０．０１〜３０質量％、さらに好ましくは０．１〜１０質量％である。
【００３４】
本発明の化粧料は、前記日焼け細胞形成抑制剤を含有するものである。化粧料としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、メイクアップクリーム、化粧用オイル、パック、ファンデーション、口紅、頬紅、アイライナー、マスカラ、アイシャドー、マニキュア、白粉、浴用剤、美白剤、サンスクリーン剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３５】
化粧料における日焼け細胞形成抑制剤の含有量は、その用途や剤形などによって異なるので一概には決定することができないが、通常、好ましくは０．００１〜５０質量％、より好ましくは０．０１〜３０質量％、さらに好ましくは０．１〜１０質量％である。
【００３６】
本発明の皮膚用外用剤および化粧料には、例えば、油脂、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、粉体、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、保湿剤、香料、ｐＨ調整剤などを使用することができる。また、本発明の皮膚用外用剤および化粧料には、必要に応じて、例えば、ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、殺菌剤などの薬効成分、生理活性成分、希釈剤、賦形剤、結合剤などを含有させてもよい。
【００３７】
なお、本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、ヒトのほか、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどの各種哺乳動物にも適用することができる。
【実施例】
【００３８】
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
（１）抽出
原料として、シャクヤクの根茎の外皮を除去し、乾燥させてフードプロセッサー（粉砕機）にて粉砕させたもの０．４ｋｇおよび抽出溶媒として８０容量％エタノール水溶液２Ｌを丸底フラスコに投入し、水浴上にて８０℃で２時間還流させた後、室温まで放冷し、得られた抽出液を濾過することによって濾液を回収した。
【００４０】
次に、エバポレーターを用いて前記で得られた濾液から溶媒（８０％エタノール水溶液）を減圧留去後、凍結乾燥することにより、シャクヤクの８０％エタノール抽出物１４８．１ｇを得た（収率：約３７％）。
【００４１】
（２）分画
前記で得られたシャクヤクの８０％エタノール抽出物１４８．１ｇを精製水３Ｌに溶解させた溶液を、直径約５ｃｍのカラムの溶出部にガラスウールを詰め、多孔性樹脂〔三菱化学（株）製、商品名：ダイアイオンＨＰ２０〕が充填されたカラムに通すことにより、抽出物を多孔性樹脂に添着させた。
【００４２】
次に、このカラムに、展開溶媒として、精製水２Ｌ（画分１）、２０％エタノール水溶液２Ｌ（画分２）、４０％エタノール水溶液２Ｌ（画分３）、６０％エタノール水溶液２Ｌ（画分４）、８０％エタノール水溶液２Ｌ（画分５）、９９％エタノール水溶液２Ｌ（画分６）を順次通すことにより、各溶媒による溶出を行ない、各画分における溶出液を回収した後、各溶出液に含まれている溶媒を減圧留去し、溶出物を得た。
【００４３】
前記画分３の溶出物（原料に対する収率：約２％、カラムにおける固形分に対する収率：約５．４％）７．０ｇをメタノール１００ｍＬに溶解させ、得られた溶液に添着用シリカゲル〔メルク(MERCK)社製、商品名：Silicagel 60)１５ｇを添加し、溶媒を減圧留去し、前記溶出物をシリカゲルに吸着させた吸着物を得た。
【００４４】
直径８ｃｍ、長さ６０ｃｍのカラムの溶出部にガラスウールを詰め、カラム内にクロロホルムを添加した後、海砂を充填した。このカラム内に、展開用シリカゲル〔メルク(MERCK)社製、商品名：Silicagel 60〕６００ｇにクロロホルム５０００ｍＬを添加したものを充填した後、前記で得られた吸着物を充填し、さらにその上段に海砂を充填した。
【００４５】
次に、このカラムに、展開溶媒として、クロロホルム：メタノール：精製水＝１０：３：１溶液２Ｌ（Ｆｒ．１）、クロロホルム：メタノール：精製水＝１０：３：１溶液２Ｌ（Ｆｒ．２）、クロロホルム：メタノール：精製水＝１０：３：１溶液３Ｌ（Ｆｒ．３）、クロロホルム：メタノール：精製水＝７：３：１溶液３Ｌ（Ｆｒ．４）、クロロホルム：メタノール：精製水＝７：３：１溶液２Ｌ（Ｆｒ．５）を順次通すことにより、各溶媒による溶出を行ない、各画分における溶出液を回収した後、各溶出液に含まれている溶媒を減圧留去し、溶出物を得た。その結果、Ｆｒ．３での収率は、カラムにおける固形分に対し、約１７．７％であり、Ｆｒ．４での収率は、カラムにおける固形分に対し、約８．０％であった。
【００４６】
（３）分取
Ｆｒ．３およびＦｒ．４のそれぞれについて、リサイクル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）〔日本分光工業（株）製、品番：ＬＣ−９０８〕を用い、各成分を分取した。Ｆｒ．３については、移動層で８回カラム内を通過させることにより、各成分を分離した後に分取し、Ｆｒ．３−１およびＦｒ．３−２とした。また、Ｆｒ．４については、移動層で８回カラム内を通過させることにより、各成分を分離した後に分取し、Ｆｒ．４−１〜Ｆｒ．４−５とした。
【００４７】
なお、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の条件は、以下のとおりである。
・分取カラム：日本分析工業（株）製、商品名：JAIGEL GS310（２０ｍｍ×５００ｍｍ）を２本連結させて使用
・カラム温度：３０℃
・流速：５ｍＬ／ｍｉｎ
・検体濃度：１００ｍｇ／ｍＬ[ＨＰＬＣ用メタノール〔和光純薬工業（株）製〕に溶解]
・注入量：３ｍＬ
・検出：２５４ｎｍ
・移動層：メタノール
【００４８】
前記で得られた各画分に含まれている成分を調べたところ、ペオニフロリンがＦｒ．２、Ｆｒ．３−１およびＦｒ．４−２で観察され、アルビフロリンがＦｒ．３−１およびＦｒ．４−１で観察され、ガロイルペオニフロリンがＦｒ．３−２およびＦｒ．４−４で観察され、６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンがＦｒ．４−３で観察され、未知化合物がＦｒ．４−５で観察された。
【００４９】
実施例２
実施例１で得られたＦｒ．４−５に含まれている未知化合物の同定を以下の方法によって行なった。
（１）質量分析
質量分析装置〔日本電子（株）製、商品名：JMS-AX505HA〕を用いてＦｒ．４−５に含まれている未知化合物の質量分析を行なった。その結果、４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンであった。
【００５０】
（２）核磁気共鳴
核磁気共鳴測定機器〔日本電子（株）製、商品名：JNM-AL300〕を用いてＦｒ．４−５に含まれている未知化合物の核磁気共鳴として、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣを調べた。
なお、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣの測定条件は、以下のとおりである。
【００５１】
・1Ｈ−ＮＭＲ：３００ＭＨｚ、室温、積算回数２５６回
・13Ｃ−ＮＭＲ：７５ＭＨｚ、室温、積算回数６０００回
・ＨＭＱＣ：室温、積算回数８０回
・ＨＭＢＣ：室温、測定範囲：1Ｈ（９．９〜−０．１ｐｐｍ）、13Ｃ（２００〜０ｐｐｍ）
・ＰＩ１ ６０ｍｓ、積算回数：２５６回
・ＰＩ１ ６２．５ｍｓ、積算回数：３３６回
・ＰＩ１ ７５ｍｓ、積算回数：２５６回
【００５２】
13Ｃ−ＮＭＲの測定結果において、未知化合物と６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンとは、６'位および４位の炭素のデータを除き、相似性を有していた。また、未知化合物の分子量をＦＡＢＭＳ〔日本電子（株）製、商品名：JMS-AX505HA〕により測定したところ、未知化合物には、６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンと同様に、６３３（ｍ／ｚ）にピークが検出された。
【００５３】
なお、ＦＡＢＭＳによる測定条件は、以下のとおりである。
・分解能：５００
・使用ガスの種類：キセノンガス
・測定質量範囲：５０−８００ｍ／ｚ
・一次加速電圧：６．０ｋＶ
・二次加速電圧：３．０ｋＶ
・イオンマルチプライヤ：１．４ｋＶ
・マトリクス：ｍ−ニトロベンジルアルコール
【００５４】
以上のことから、未知化合物は、アルビフロリンを母核とし、官能基の結合位置が６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンと異なる構造異性体である可能性が強く示唆され、式：
【００５５】
【化５】
【００５６】
で表される化合物であることが推定された。
【００５７】
未知化合物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよびＨＭＢＣ解析によるＣとＨとの相関を表１に示す。なお、表１において、「位置」とは、上記式における位置を示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
表１に示されるように、ＨＭＢＣ解析から６'位のＣのＨ(５．１２ｐｐｍ)から７'''位のカルボニル結合性炭素への関与が認められなかったことから、６'位にエステル結合が存在する可能性が否定された。さらに、８位の炭素に結合するＨ（５．１６ｐｐｍ, ５．１９ｐｐｍ）から７''位および７'''位のカルボニル結合性炭素への関与が認められ、また、４位の炭素に結合するＨ（５．１６ｐｐｍ, ５．１９ｐｐｍ）からも、７''位および７'''位のカルボニル結合性炭素への関与が認められた。
【００６０】
一方で、ＮＭＲの解析により、未知化合物は、ベンゾイル基とガロイル基を有することが、６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンとのスペクトル相同性によって確認されている。したがって、ベンゾイル基とガロイル基が７''位および７'''位にエステル結合していることが判明した。
【００６１】
前記したように、未知化合物の母核構造がアルビフロリンであることが判明していることから、未知化合物は、４位にガロイル基、８位にベンゾイル基が結合している構造の推定が妥当であると考えられることから、未知化合物は、４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンであると同定された。
【００６２】
実験例１
長期維持培地〔マクテック社（Maktek corp.）製、商品名：LEPI-100-LLMM〕を６ウェルの培養プレートに各々添加した後、三次元皮膚モデル〔マクテック社（Maktek corp.）製、商品名：Melano Derm〕を滅菌済みのピンセットで培養プレートに移し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で１時間前培養を行なった。
【００６３】
この前培養を行なった後、培養プレートにあらかじめリン酸緩衝液ＰＢＳ〔マクテック社（Maktek corp.）製〕１ｍＬを加えておいたウェル上に三次元皮膚モデルを置き、この三次元皮膚モデルに紫外線（波長：３０６ｎｍ、紫外線強度：８０ｍＪ／ｃｍ2）を照射した。
【００６４】
三次元皮膚モデルに紫外線を照射した後、滅菌済みのステンレスワッシャー２個をウェルの底に重ねて置き、その上に三次元皮膚モデルを載せ、培地５ｍＬを添加した。その際、三次元皮膚モデルに気泡が存在する場合には、ピンセットで軽く三次元皮膚モデルを振動させて気泡を取り除いた。
【００６５】
その後、この培地を３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で２４時間培養した。培養後、三次元皮膚モデルをリン酸緩衝液ＰＢＳ〔マクテック社（Maktek corp.）製〕で洗浄し、バイオプシーパンチを用いて三次元皮膚モデルを切り出し、４％パラホルムアルデヒド緩衝溶液〔和光純薬工業（株）製〕で固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色（以下、ＨＥ染色という）およびＴＵＮＥＬ染色（TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling）により、組織切片の観察を行なった。
【００６６】
次に、２４時間の前培養を行なった後、以下に示す試料１００μＬを三次元皮膚モデルに添加し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で２４時間培養した。培養後、原料を除去するために、リン酸緩衝液ＰＢＳ〔マクテック社（Maktek corp.）製〕１ｍＬで３回洗浄した。
【００６７】
洗浄後、前記と同様にして紫外線を三次元皮膚モデルに照射し、試料１００μＬを三次元皮膚モデルに再度添加し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で培養した。培養後、三次元皮膚モデルを切り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＨＥ染色した後、組織切片を正立型顕微鏡で観察した。
【００６８】
各試験に用いた三次元皮膚モデルの細胞形態変化を観察するため、組織切片を正立型顕微鏡で観察し、写真撮影した。三次元皮膚モデルは、４％パラホルムアルデヒドによる固定と、パラフィンによる包埋と、ミクロトームによる切片化とを行ない、ＨＥ染色およびＴＵＮＥＬ染色を行なった。
【００６９】
試料として、実施例１の「（１）抽出」において、エタノールの代わりに１，３−ブチレングリコールを用いて抽出したシャクヤクの１，３−ブチレングリコール抽出液(乾燥残分量：４％、従来品、以下、１，３−ＢＧ抽出液という)、画分３（４０％エタノール抽出物）、ペオニフロリン、アルビフロリン、ガロイルペオニフロリン、４−Ｏ−ガロイルペオニフロリン、６’−ガロイルペオニフロリンおよび没食子酸を用い、試験後の組織切片の写真を図１に示す。
【００７０】
なお、１，３−ＢＧ抽出液は、試料濃度が乾燥残分相当量となるように換算した量で用いた。すなわち、試料濃度が０．２％の場合には、１，３−ＢＧ抽出液５％を用いた。
【００７１】
図１において、Ａは紫外線の照射を受けていない三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｂは未処理の三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｃはペオニフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｄはアルビフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｅはガロイルペオニフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｆは４−Ｏ−ガロイルペオニフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｇは６’−ガロイルペオニフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真を示す。また、その日焼け細胞形成抑制効果を以下の評価基準に基づいて評価した。その結果を表２に示す。
【００７２】
〔評価基準〕
＋＋＋＋：日焼け細胞形成抑制効果が非常に強い。
＋＋＋： 日焼け細胞形成抑制効果が強い。
＋＋： 日焼け細胞形成抑制効果が中間。
＋： 日焼け細胞形成抑制効果が弱い。
−： 日焼け細胞形成抑制効果が認められない。
【００７３】
【表２】
【００７４】
図１および表２に示された結果から、ペオニフロリン、アルビフロリンおよび没食子酸には、日焼け細胞形成抑制効果が認められなかったのに対し、ガロイルペオニフロリン、４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンおよび６’−ガロイルアルビフロリンは、優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現することがわかる。このことから、ガロイル基は、ペオニフロリンまたはアルビフロリンと結合することにより、皮膚細胞内で安定した抗酸化活性を示すため、優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現するものと考えられる。また、ガロイルペオニフロリン、４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンおよび６’−ガロイルアルビフロリンは、従来の１，３−ＢＧ抽出液と対比して、優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現するものであることがわかる。
【００７５】
以下に、本発明の処方例を示す。配合量の単位は、質量％である。また、Ｅ．Ｏ．は、エチレンオキサイドの付加モル数を示す。
【００７６】
処方例１〔化粧水〕
４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン ０．１
グリセリン ６．０
ソルビトール ２．０
ヒアルロン酸ナトリウム ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（Ｅ．Ｏ．６０） ０．１
ビタミンＣ−２グルコシド ０．１
香料 適量
防腐剤 適量
エタノール ５．０
精製水 残部
合計 １００．０
【００７７】
処方例２〔化粧水〕
６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン ０．５
グリセリン ３．０
３−ブチレングリコール ３．０
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０） ０．５
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５
クエン酸 ０．１
クエン酸ソーダ ０．１
ビタミンＥ ０．１
アスコルビン酸リン酸ナトリウム ０．１
ハマメリスエキス １．０
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００７８】
処方例３〔化粧水〕
ガロイルペオニフロリン ０．１
１，３−ブチレングリコール ６．０
ヒアルロン酸ナトリウム ０．１
リン酸アスコルビルマグネシウム ０．１
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（Ｅ．Ｏ．６０） ０．１
エタノール １０．０
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００７９】
処方例４〔クリーム〕
４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン ３．０
ポリエチレングリコールモノステアリン酸エステル（Ｅ．Ｏ．４０） ２．０
グリセリンモノステアリン酸エステル ５．０
ステアリン酸 ３．０
ベヘニルアルコール ０．４
スクワラン １５．０
イソオクタン酸セチル ４．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
酢酸トコフェロール ０．１
β−グリチルレチン酸 ０．１
アルブチン ０．１
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００８０】
処方例５〔乳液〕
６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン １．０
スクワラン ５．０
ワセリン ２．０
ミツロウ ０．５
ソルビタンセスキオレイン酸エステル ０．５
ポリオキシエチレンオレイルエーテル ０．８
グリセリン ５．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
水酸化カリウム ０．１
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００８１】
処方例６〔サンスクリーン剤〕
４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン ５．０
酸化チタン ３．０
酸化亜鉛 ２．０
流動パラフィン ８．０
液状ラノリン ２．０
ステアリン酸 ２．０
イソヘキサデシルアルコール ７．０
モノステアリン酸グリセリン ２．０
ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル ０．９
トリエタノールアミン １．０
１，２−ヘキサンジオール ２．０
プロピレングリコール ５．０
防腐剤 適量
香料 適量
酸化防止剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００８２】
処方例７〔サンスクリーン剤〕
ガロイルペオニフロリン ８．０
パラメトキシケイ皮酸オクチル ３．０
オキシベンゾン ２．０
スクワラン １０．０
液状ラノリン １０．０
ジイソステアリン酸グリセリン ３．０
プロピレングリコール ５．０
防腐剤 適量
香料 適量
酸化防止剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、安全性が高い植物抽出物である、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を有効成分としているので、例えば、皮膚用外用剤、化粧料などに好適に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、日焼け細胞形成抑制剤に関する。さらに詳しくは、日焼け細胞形成抑制剤、当該日焼け細胞形成抑制剤を含有する皮膚用外用剤および化粧料、ならびに当該日焼け細胞形成抑制剤に有用な新規化合物である４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンに関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の皮膚が太陽光線に含まれている紫外線に暴露されたとき、その表皮細胞が傷害を受け、壊死した表皮細胞である日焼け細胞（サンバーンセル）が形成されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
本発明者らは、紫外線による皮膚障害に対する皮膚細胞自体の抵抗力を向上させる日焼け細胞形成抑制剤として、シャクヤク抽出物を有効成分として含有するサンバーンセル形成抑制剤を開発している（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、前記日焼け細胞形成抑制剤は、シャクヤク抽出物を有効成分とするものであり、確かに優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現するが、さらに一層優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現する日焼け細胞形成抑制剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２４６４１０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ジョンソン・ビーイー(Johnson BE)ら、「ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・デルマトロジー (Journal of Investigative Dermatology)、１９６９年、第５３巻、ｐ．８５−９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、シャクヤク抽出物を有効成分として含有する日焼け細胞形成抑制剤よりもさらに一層優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現する日焼け細胞形成抑制剤、および当該日焼け細胞形成抑制剤を含有する皮膚用外用剤および化粧料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする日焼け細胞形成抑制剤、
（２）ガロイル基含有アルビフロリンが、式（Ｉ）：
【０００９】
【化１】
【００１０】
で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、式(II):
【００１１】
【化２】
【００１２】
で表される６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、およびそれらの薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルアルビフロリン化合物である前記（１）に記載の日焼け細胞形成抑制剤、
（３）ガロイル基含有ペオニフロリンが式(III):
【００１３】
【化３】
【００１４】
で表されるガロイルペオニフロリンおよびその薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルペオニフロリン化合物である前記（１）または（２）に記載の日焼け細胞形成抑制剤、
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の日焼け細胞形成抑制剤を含有してなる皮膚用外用剤、
（５）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の日焼け細胞形成抑制剤を含有してなる化粧料、ならびに
（６）式（Ｉ）：
【００１５】
【化４】
【００１６】
で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、シャクヤク抽出物を有効成分として含有する日焼け細胞形成抑制剤よりも一層優れた細胞形成抑制効果を発現するという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】シャクヤク抽出物が添加された三次元皮膚モデルの組織片の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、シャクヤク抽出物を有効成分として含有する日焼け細胞形成抑制剤に着目して研究を重ねたところ、シャクヤクに含まれている主要物質であるペオニフロリンおよびアルビフロリンには、日焼け細胞形成抑制効果がほとんど認められず、また没食子酸でも日焼け細胞形成抑制効果がほとんど認められないことが判明した。ところが、本発明者らがさらに鋭意研究を重ねたところ、驚くべきことに、没食子酸エステルのなかでも特定のエステル基を有する没食子酸エステル、すなわちガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンが優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現することが見出された。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００２０】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする。また、ガロイル基含有アルビフロリンのなかでも、式（Ｉ）で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンは、本発明者らによって見出された新規化合物である。
【００２１】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤に含有されるガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンの原料として、例えば、シャクヤクを用いることができる。なお、シャクヤクとは、ボタン科ボタン属芍薬(Paeonia lactiflora PallasまたはPaeonia albiflora Pallas）のことを意味する。原料として用いられるシャクヤクの部位としては、例えば、葉、幹、種子、根茎などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの部位のなかでは、根茎が好ましい。根茎は、例えば、その外皮を除去し、乾燥させた後、粉末化させることによって用いることができる。
【００２２】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤に含有されるガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンの原料としてシャクヤクを用いる場合、シャクヤクを溶媒抽出することによって得られたシャクヤク抽出液を用いることができる。
【００２３】
シャクヤク抽出液は、例えば、シャクヤクを水、親水性溶媒、親油性溶媒などの抽出溶媒に浸漬し、必要に応じて加熱下または加圧下で攪拌することによって得ることができる。
【００２４】
抽出溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコールなどの炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの炭素数２〜５の多価アルコールなどのアルコール系溶媒；アセトン、メチルエチルケトンなどの低級脂肪族ケトンなどに代表される親水性有機溶媒などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。抽出溶媒のなかでは、水と親水性有機溶媒との併用が好ましく、水とアルコール系溶媒との併用がより好ましく、水とエタノールまたは１，３−ブチレングリコールとの併用がさらに好ましい。水と親水性有機溶媒とを併用する場合、水と親水性有機溶媒との比率(水／親水性有機溶媒：容量比)は、特に限定されないが、通常、好ましくは１０／９０〜９０／１０、より好ましくは３０／７０〜７０／３０である。
【００２５】
次に、シャクヤク抽出液をカラムクロマトグラフィーで水およびエタノールを用いて溶出させ、水溶出分および各分画分に粗分画した後、必要により、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどによって分離・精製を行なうことにより、シャクヤク抽出液に含まれているガロイル基含有化合物を単離することができる。単離されたガロイル基含有化合物は、常法に従って同定することにより、その構造および分子量を特定することができる。
【００２６】
以上のようにしてシャクヤク抽出液に含まれている化合物を単離することができる。このシャクヤク抽出液に含まれている化合物のなかでも、式（Ｉ）で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、式(II)で表される６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンなどに代表されるガロイル基含有アルビフロリン、および式(III)で表されるガロイルペオニフロリンなどに代表されるガロイル基含有ペオニフロリンなどのガロイル基含有化合物が優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現することは、以下の実施例で確認されている。なお、ガロイル基含有化合物は、所望により、薬理的に許容しうる塩に変換することもできる。薬理的に許容しうる塩への変換は、慣用の方法に従って行なえばよい。
【００２７】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする。
【００２８】
ガロイル基含有アルビフロリンのなかでは、式（Ｉ）で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、式(II)で表される６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、およびそれらの薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルアルビフロリン化合物は、日焼け細胞形成抑制効果の観点から、好適に使用することができる。
【００２９】
ガロイル基含有ペオニフロリンのなかでは、式(III)で表されるガロイルペオニフロリンおよびその薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルペオニフロリン化合物は、日焼け細胞形成抑制効果の観点から、好適に使用することができる。
【００３０】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、前記ガロイル基含有化合物のみから構成されていてもよく、あるいは製剤化したものであってもよい。
【００３１】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどの薬学的に許容しうるキャリアー、その他の任意の助剤を用い、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状などの任意の剤形に製剤化することができる。助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の皮膚用外用剤は、前記日焼け細胞形成抑制剤を含有するものである。皮膚用外用剤としては、例えば、軟膏剤、外用液剤、貼付剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３３】
皮膚用外用剤における日焼け細胞形成抑制剤の含有量は、その用途や剤形などによって異なるので一概には決定することができないが、通常、好ましくは０．００１〜５０質量％、より好ましくは０．０１〜３０質量％、さらに好ましくは０．１〜１０質量％である。
【００３４】
本発明の化粧料は、前記日焼け細胞形成抑制剤を含有するものである。化粧料としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、メイクアップクリーム、化粧用オイル、パック、ファンデーション、口紅、頬紅、アイライナー、マスカラ、アイシャドー、マニキュア、白粉、浴用剤、美白剤、サンスクリーン剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３５】
化粧料における日焼け細胞形成抑制剤の含有量は、その用途や剤形などによって異なるので一概には決定することができないが、通常、好ましくは０．００１〜５０質量％、より好ましくは０．０１〜３０質量％、さらに好ましくは０．１〜１０質量％である。
【００３６】
本発明の皮膚用外用剤および化粧料には、例えば、油脂、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、粉体、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、保湿剤、香料、ｐＨ調整剤などを使用することができる。また、本発明の皮膚用外用剤および化粧料には、必要に応じて、例えば、ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、殺菌剤などの薬効成分、生理活性成分、希釈剤、賦形剤、結合剤などを含有させてもよい。
【００３７】
なお、本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、ヒトのほか、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどの各種哺乳動物にも適用することができる。
【実施例】
【００３８】
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
（１）抽出
原料として、シャクヤクの根茎の外皮を除去し、乾燥させてフードプロセッサー（粉砕機）にて粉砕させたもの０．４ｋｇおよび抽出溶媒として８０容量％エタノール水溶液２Ｌを丸底フラスコに投入し、水浴上にて８０℃で２時間還流させた後、室温まで放冷し、得られた抽出液を濾過することによって濾液を回収した。
【００４０】
次に、エバポレーターを用いて前記で得られた濾液から溶媒（８０％エタノール水溶液）を減圧留去後、凍結乾燥することにより、シャクヤクの８０％エタノール抽出物１４８．１ｇを得た（収率：約３７％）。
【００４１】
（２）分画
前記で得られたシャクヤクの８０％エタノール抽出物１４８．１ｇを精製水３Ｌに溶解させた溶液を、直径約５ｃｍのカラムの溶出部にガラスウールを詰め、多孔性樹脂〔三菱化学（株）製、商品名：ダイアイオンＨＰ２０〕が充填されたカラムに通すことにより、抽出物を多孔性樹脂に添着させた。
【００４２】
次に、このカラムに、展開溶媒として、精製水２Ｌ（画分１）、２０％エタノール水溶液２Ｌ（画分２）、４０％エタノール水溶液２Ｌ（画分３）、６０％エタノール水溶液２Ｌ（画分４）、８０％エタノール水溶液２Ｌ（画分５）、９９％エタノール水溶液２Ｌ（画分６）を順次通すことにより、各溶媒による溶出を行ない、各画分における溶出液を回収した後、各溶出液に含まれている溶媒を減圧留去し、溶出物を得た。
【００４３】
前記画分３の溶出物（原料に対する収率：約２％、カラムにおける固形分に対する収率：約５．４％）７．０ｇをメタノール１００ｍＬに溶解させ、得られた溶液に添着用シリカゲル〔メルク(MERCK)社製、商品名：Silicagel 60)１５ｇを添加し、溶媒を減圧留去し、前記溶出物をシリカゲルに吸着させた吸着物を得た。
【００４４】
直径８ｃｍ、長さ６０ｃｍのカラムの溶出部にガラスウールを詰め、カラム内にクロロホルムを添加した後、海砂を充填した。このカラム内に、展開用シリカゲル〔メルク(MERCK)社製、商品名：Silicagel 60〕６００ｇにクロロホルム５０００ｍＬを添加したものを充填した後、前記で得られた吸着物を充填し、さらにその上段に海砂を充填した。
【００４５】
次に、このカラムに、展開溶媒として、クロロホルム：メタノール：精製水＝１０：３：１溶液２Ｌ（Ｆｒ．１）、クロロホルム：メタノール：精製水＝１０：３：１溶液２Ｌ（Ｆｒ．２）、クロロホルム：メタノール：精製水＝１０：３：１溶液３Ｌ（Ｆｒ．３）、クロロホルム：メタノール：精製水＝７：３：１溶液３Ｌ（Ｆｒ．４）、クロロホルム：メタノール：精製水＝７：３：１溶液２Ｌ（Ｆｒ．５）を順次通すことにより、各溶媒による溶出を行ない、各画分における溶出液を回収した後、各溶出液に含まれている溶媒を減圧留去し、溶出物を得た。その結果、Ｆｒ．３での収率は、カラムにおける固形分に対し、約１７．７％であり、Ｆｒ．４での収率は、カラムにおける固形分に対し、約８．０％であった。
【００４６】
（３）分取
Ｆｒ．３およびＦｒ．４のそれぞれについて、リサイクル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）〔日本分光工業（株）製、品番：ＬＣ−９０８〕を用い、各成分を分取した。Ｆｒ．３については、移動層で８回カラム内を通過させることにより、各成分を分離した後に分取し、Ｆｒ．３−１およびＦｒ．３−２とした。また、Ｆｒ．４については、移動層で８回カラム内を通過させることにより、各成分を分離した後に分取し、Ｆｒ．４−１〜Ｆｒ．４−５とした。
【００４７】
なお、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の条件は、以下のとおりである。
・分取カラム：日本分析工業（株）製、商品名：JAIGEL GS310（２０ｍｍ×５００ｍｍ）を２本連結させて使用
・カラム温度：３０℃
・流速：５ｍＬ／ｍｉｎ
・検体濃度：１００ｍｇ／ｍＬ[ＨＰＬＣ用メタノール〔和光純薬工業（株）製〕に溶解]
・注入量：３ｍＬ
・検出：２５４ｎｍ
・移動層：メタノール
【００４８】
前記で得られた各画分に含まれている成分を調べたところ、ペオニフロリンがＦｒ．２、Ｆｒ．３−１およびＦｒ．４−２で観察され、アルビフロリンがＦｒ．３−１およびＦｒ．４−１で観察され、ガロイルペオニフロリンがＦｒ．３−２およびＦｒ．４−４で観察され、６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンがＦｒ．４−３で観察され、未知化合物がＦｒ．４−５で観察された。
【００４９】
実施例２
実施例１で得られたＦｒ．４−５に含まれている未知化合物の同定を以下の方法によって行なった。
（１）質量分析
質量分析装置〔日本電子（株）製、商品名：JMS-AX505HA〕を用いてＦｒ．４−５に含まれている未知化合物の質量分析を行なった。その結果、４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンであった。
【００５０】
（２）核磁気共鳴
核磁気共鳴測定機器〔日本電子（株）製、商品名：JNM-AL300〕を用いてＦｒ．４−５に含まれている未知化合物の核磁気共鳴として、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣを調べた。
なお、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣの測定条件は、以下のとおりである。
【００５１】
・1Ｈ−ＮＭＲ：３００ＭＨｚ、室温、積算回数２５６回
・13Ｃ−ＮＭＲ：７５ＭＨｚ、室温、積算回数６０００回
・ＨＭＱＣ：室温、積算回数８０回
・ＨＭＢＣ：室温、測定範囲：1Ｈ（９．９〜−０．１ｐｐｍ）、13Ｃ（２００〜０ｐｐｍ）
・ＰＩ１ ６０ｍｓ、積算回数：２５６回
・ＰＩ１ ６２．５ｍｓ、積算回数：３３６回
・ＰＩ１ ７５ｍｓ、積算回数：２５６回
【００５２】
13Ｃ−ＮＭＲの測定結果において、未知化合物と６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンとは、６'位および４位の炭素のデータを除き、相似性を有していた。また、未知化合物の分子量をＦＡＢＭＳ〔日本電子（株）製、商品名：JMS-AX505HA〕により測定したところ、未知化合物には、６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンと同様に、６３３（ｍ／ｚ）にピークが検出された。
【００５３】
なお、ＦＡＢＭＳによる測定条件は、以下のとおりである。
・分解能：５００
・使用ガスの種類：キセノンガス
・測定質量範囲：５０−８００ｍ／ｚ
・一次加速電圧：６．０ｋＶ
・二次加速電圧：３．０ｋＶ
・イオンマルチプライヤ：１．４ｋＶ
・マトリクス：ｍ−ニトロベンジルアルコール
【００５４】
以上のことから、未知化合物は、アルビフロリンを母核とし、官能基の結合位置が６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンと異なる構造異性体である可能性が強く示唆され、式：
【００５５】
【化５】
【００５６】
で表される化合物であることが推定された。
【００５７】
未知化合物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよびＨＭＢＣ解析によるＣとＨとの相関を表１に示す。なお、表１において、「位置」とは、上記式における位置を示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
表１に示されるように、ＨＭＢＣ解析から６'位のＣのＨ(５．１２ｐｐｍ)から７'''位のカルボニル結合性炭素への関与が認められなかったことから、６'位にエステル結合が存在する可能性が否定された。さらに、８位の炭素に結合するＨ（５．１６ｐｐｍ, ５．１９ｐｐｍ）から７''位および７'''位のカルボニル結合性炭素への関与が認められ、また、４位の炭素に結合するＨ（５．１６ｐｐｍ, ５．１９ｐｐｍ）からも、７''位および７'''位のカルボニル結合性炭素への関与が認められた。
【００６０】
一方で、ＮＭＲの解析により、未知化合物は、ベンゾイル基とガロイル基を有することが、６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリンとのスペクトル相同性によって確認されている。したがって、ベンゾイル基とガロイル基が７''位および７'''位にエステル結合していることが判明した。
【００６１】
前記したように、未知化合物の母核構造がアルビフロリンであることが判明していることから、未知化合物は、４位にガロイル基、８位にベンゾイル基が結合している構造の推定が妥当であると考えられることから、未知化合物は、４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンであると同定された。
【００６２】
実験例１
長期維持培地〔マクテック社（Maktek corp.）製、商品名：LEPI-100-LLMM〕を６ウェルの培養プレートに各々添加した後、三次元皮膚モデル〔マクテック社（Maktek corp.）製、商品名：Melano Derm〕を滅菌済みのピンセットで培養プレートに移し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で１時間前培養を行なった。
【００６３】
この前培養を行なった後、培養プレートにあらかじめリン酸緩衝液ＰＢＳ〔マクテック社（Maktek corp.）製〕１ｍＬを加えておいたウェル上に三次元皮膚モデルを置き、この三次元皮膚モデルに紫外線（波長：３０６ｎｍ、紫外線強度：８０ｍＪ／ｃｍ2）を照射した。
【００６４】
三次元皮膚モデルに紫外線を照射した後、滅菌済みのステンレスワッシャー２個をウェルの底に重ねて置き、その上に三次元皮膚モデルを載せ、培地５ｍＬを添加した。その際、三次元皮膚モデルに気泡が存在する場合には、ピンセットで軽く三次元皮膚モデルを振動させて気泡を取り除いた。
【００６５】
その後、この培地を３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で２４時間培養した。培養後、三次元皮膚モデルをリン酸緩衝液ＰＢＳ〔マクテック社（Maktek corp.）製〕で洗浄し、バイオプシーパンチを用いて三次元皮膚モデルを切り出し、４％パラホルムアルデヒド緩衝溶液〔和光純薬工業（株）製〕で固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色（以下、ＨＥ染色という）およびＴＵＮＥＬ染色（TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling）により、組織切片の観察を行なった。
【００６６】
次に、２４時間の前培養を行なった後、以下に示す試料１００μＬを三次元皮膚モデルに添加し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で２４時間培養した。培養後、原料を除去するために、リン酸緩衝液ＰＢＳ〔マクテック社（Maktek corp.）製〕１ｍＬで３回洗浄した。
【００６７】
洗浄後、前記と同様にして紫外線を三次元皮膚モデルに照射し、試料１００μＬを三次元皮膚モデルに再度添加し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気中で培養した。培養後、三次元皮膚モデルを切り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＨＥ染色した後、組織切片を正立型顕微鏡で観察した。
【００６８】
各試験に用いた三次元皮膚モデルの細胞形態変化を観察するため、組織切片を正立型顕微鏡で観察し、写真撮影した。三次元皮膚モデルは、４％パラホルムアルデヒドによる固定と、パラフィンによる包埋と、ミクロトームによる切片化とを行ない、ＨＥ染色およびＴＵＮＥＬ染色を行なった。
【００６９】
試料として、実施例１の「（１）抽出」において、エタノールの代わりに１，３−ブチレングリコールを用いて抽出したシャクヤクの１，３−ブチレングリコール抽出液(乾燥残分量：４％、従来品、以下、１，３−ＢＧ抽出液という)、画分３（４０％エタノール抽出物）、ペオニフロリン、アルビフロリン、ガロイルペオニフロリン、４−Ｏ−ガロイルペオニフロリン、６’−ガロイルペオニフロリンおよび没食子酸を用い、試験後の組織切片の写真を図１に示す。
【００７０】
なお、１，３−ＢＧ抽出液は、試料濃度が乾燥残分相当量となるように換算した量で用いた。すなわち、試料濃度が０．２％の場合には、１，３−ＢＧ抽出液５％を用いた。
【００７１】
図１において、Ａは紫外線の照射を受けていない三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｂは未処理の三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｃはペオニフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｄはアルビフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｅはガロイルペオニフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｆは４−Ｏ−ガロイルペオニフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真、Ｇは６’−ガロイルペオニフロリンで処理された三次元皮膚モデルの組織切片の顕微鏡写真を示す。また、その日焼け細胞形成抑制効果を以下の評価基準に基づいて評価した。その結果を表２に示す。
【００７２】
〔評価基準〕
＋＋＋＋：日焼け細胞形成抑制効果が非常に強い。
＋＋＋： 日焼け細胞形成抑制効果が強い。
＋＋： 日焼け細胞形成抑制効果が中間。
＋： 日焼け細胞形成抑制効果が弱い。
−： 日焼け細胞形成抑制効果が認められない。
【００７３】
【表２】
【００７４】
図１および表２に示された結果から、ペオニフロリン、アルビフロリンおよび没食子酸には、日焼け細胞形成抑制効果が認められなかったのに対し、ガロイルペオニフロリン、４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンおよび６’−ガロイルアルビフロリンは、優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現することがわかる。このことから、ガロイル基は、ペオニフロリンまたはアルビフロリンと結合することにより、皮膚細胞内で安定した抗酸化活性を示すため、優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現するものと考えられる。また、ガロイルペオニフロリン、４−Ｏ−ガロイルアルビフロリンおよび６’−ガロイルアルビフロリンは、従来の１，３−ＢＧ抽出液と対比して、優れた日焼け細胞形成抑制効果を発現するものであることがわかる。
【００７５】
以下に、本発明の処方例を示す。配合量の単位は、質量％である。また、Ｅ．Ｏ．は、エチレンオキサイドの付加モル数を示す。
【００７６】
処方例１〔化粧水〕
４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン ０．１
グリセリン ６．０
ソルビトール ２．０
ヒアルロン酸ナトリウム ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（Ｅ．Ｏ．６０） ０．１
ビタミンＣ−２グルコシド ０．１
香料 適量
防腐剤 適量
エタノール ５．０
精製水 残部
合計 １００．０
【００７７】
処方例２〔化粧水〕
６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン ０．５
グリセリン ３．０
３−ブチレングリコール ３．０
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０） ０．５
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５
クエン酸 ０．１
クエン酸ソーダ ０．１
ビタミンＥ ０．１
アスコルビン酸リン酸ナトリウム ０．１
ハマメリスエキス １．０
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００７８】
処方例３〔化粧水〕
ガロイルペオニフロリン ０．１
１，３−ブチレングリコール ６．０
ヒアルロン酸ナトリウム ０．１
リン酸アスコルビルマグネシウム ０．１
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（Ｅ．Ｏ．６０） ０．１
エタノール １０．０
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００７９】
処方例４〔クリーム〕
４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン ３．０
ポリエチレングリコールモノステアリン酸エステル（Ｅ．Ｏ．４０） ２．０
グリセリンモノステアリン酸エステル ５．０
ステアリン酸 ３．０
ベヘニルアルコール ０．４
スクワラン １５．０
イソオクタン酸セチル ４．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
酢酸トコフェロール ０．１
β−グリチルレチン酸 ０．１
アルブチン ０．１
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００８０】
処方例５〔乳液〕
６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン １．０
スクワラン ５．０
ワセリン ２．０
ミツロウ ０．５
ソルビタンセスキオレイン酸エステル ０．５
ポリオキシエチレンオレイルエーテル ０．８
グリセリン ５．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
水酸化カリウム ０．１
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００８１】
処方例６〔サンスクリーン剤〕
４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン ５．０
酸化チタン ３．０
酸化亜鉛 ２．０
流動パラフィン ８．０
液状ラノリン ２．０
ステアリン酸 ２．０
イソヘキサデシルアルコール ７．０
モノステアリン酸グリセリン ２．０
ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル ０．９
トリエタノールアミン １．０
１，２−ヘキサンジオール ２．０
プロピレングリコール ５．０
防腐剤 適量
香料 適量
酸化防止剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【００８２】
処方例７〔サンスクリーン剤〕
ガロイルペオニフロリン ８．０
パラメトキシケイ皮酸オクチル ３．０
オキシベンゾン ２．０
スクワラン １０．０
液状ラノリン １０．０
ジイソステアリン酸グリセリン ３．０
プロピレングリコール ５．０
防腐剤 適量
香料 適量
酸化防止剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の日焼け細胞形成抑制剤は、安全性が高い植物抽出物である、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を有効成分としているので、例えば、皮膚用外用剤、化粧料などに好適に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする日焼け細胞形成抑制剤。
【請求項２】
ガロイル基含有アルビフロリンが、式（Ｉ）：
【化１】
で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、式(II):
【化２】
で表される６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、およびそれらの薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルアルビフロリン化合物である請求項１に記載の日焼け細胞形成抑制剤。
【請求項３】
ガロイル基含有ペオニフロリンが式(III):
【化３】
で表されるガロイルペオニフロリンおよびその薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルペオニフロリン化合物である請求項１または２に記載の日焼け細胞形成抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の日焼け細胞形成抑制剤を含有してなる皮膚用外用剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の日焼け細胞形成抑制剤を含有してなる化粧料。
【請求項６】
式（Ｉ）：
【化４】
で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン。
【請求項１】
有効成分として、ガロイル基含有アルビフロリンおよびガロイル基含有ペオニフロリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイル基含有化合物を含有することを特徴とする日焼け細胞形成抑制剤。
【請求項２】
ガロイル基含有アルビフロリンが、式（Ｉ）：
【化１】
で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、式(II):
【化２】
で表される６'−Ｏ−ガロイルアルビフロリン、およびそれらの薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルアルビフロリン化合物である請求項１に記載の日焼け細胞形成抑制剤。
【請求項３】
ガロイル基含有ペオニフロリンが式(III):
【化３】
で表されるガロイルペオニフロリンおよびその薬理的に許容しうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種のガロイルペオニフロリン化合物である請求項１または２に記載の日焼け細胞形成抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の日焼け細胞形成抑制剤を含有してなる皮膚用外用剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の日焼け細胞形成抑制剤を含有してなる化粧料。
【請求項６】
式（Ｉ）：
【化４】
で表される４−Ｏ−ガロイルアルビフロリン。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−４２６１４（Ｐ２０１１−４２６１４Ａ）
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９１３２７（Ｐ２００９−１９１３２７）
【出願日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
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