求核試薬および一酸化炭素を用いるパラジウム触媒ヌクレオシド修飾方法
【課題】本発明は、パラジウム触媒、求核試薬および一酸化炭素を用いる修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドの製造方法を開示する。
【解決手段】本発明の修飾ヌクレオシドの製造方法は、
ヌクレオシド出発原料の炭素原子に結合した離脱基を有するヌクレオシド出発原料をパラジウム触媒の存在下に求核試薬および一酸化炭素と反応させ、ついで上記修飾ヌクレオシドを単離する工程からなる。
【解決手段】本発明の修飾ヌクレオシドの製造方法は、
ヌクレオシド出発原料の炭素原子に結合した離脱基を有するヌクレオシド出発原料をパラジウム触媒の存在下に求核試薬および一酸化炭素と反応させ、ついで上記修飾ヌクレオシドを単離する工程からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸化学の分野、とくに修飾ヌクレオシドの調製方法に関する。ヌクレオシドはピリミジンまたはプリンとすることができる。本発明のピリミジン化合物はピリミジン環の５−または６−位置で修飾することができる。本発明のプリン化合物はプリン環の２−，６−または８−位置で修飾することができる。とくに好ましくは、本発明は、８−位置で修飾されたプリン化合物および５−位置で修飾されたピリミジン化合物の調製方法を包含する。本発明はまたこの方法で製造された修飾ヌクレオシドを包含する。本発明はまた、修飾ヌクレオシドの抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗かび剤もしくは抗新生物剤としてまたはオリゴヌクレオチドの一部としての使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ごく最近まで、オリゴヌクレオチドには厳密な意味での情報的機能以外の機能について考慮されたことはなかった。ある種のオリゴヌクレオチドが興味ある構造的可能性をもち（たとえばｔ−ＲＮＡ）、また他のオリゴヌクレオチドが実際ポリペプチドによって特異的に結合されるという事実にもかかわらず、オリゴヌクレオチドの非情報的能力に焦点を定めた注目はほとんど払われたことがなかったのである。とくにこの理由から、オリゴヌクレオチドを医薬化合物として使用することが考慮されることもほとんどなかった。
【０００３】
現在は、オリゴヌクレオチドの医薬としての使用に関する重要な研究を導いてきた少なくとも３つの領域の探究がある。これらの領域の最前線では、タンパク質の発現防止または多様な細胞機能の遮断のため、アンチセンスオリゴヌクレオチドが生体内のある領域への結合に用いられている。触媒機能をもつＲＮＡ種−リボザイム−の発見は所望の効果を達成する細胞内反応を実施するために作動するＲＮＡが考慮される段階に達している。最後に、セレックス法（ＳＥＬＥＸ；Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）の発見は、生物学的に興味のあるほとんどすべての標的に結合するオリゴヌクレオチドが同定できるという研究コミュニティーを示してきた。
【０００４】
遺伝子発現の制御方法としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用およびオリゴヌクレオチドを医薬素材として使用する可能性は、それらの治療的活性を増大させるため、オリゴヌクレオチドに様々な化学的修飾を導入する研究を促進してきた。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞透過性の増大、ヌクレアーゼおよびオリゴヌクレオチドアナローグの構造もしくは活性を分解もしくは妨害する他の酵素からの生体内におけるそれらの安定化、標的化された核酸に対するそれらの結合の増強、標的化された核酸への配列特異的な結合後におけるある様式での分裂（終結現象）の提供、およびそれらの薬物動態学的性質の改良のために設計される。たとえばＰＣＴ特許出願公開ＷＯ91/14696号（発明の名称：Oligonucleotide-Transport Agent Disulfide Conjugates）には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内侵入を増強する化学的修飾法が記載されている。
【０００５】
エキソヌクレアーゼによる分解に対してオリゴヌクレオチドを抵抗性にするためには様々な方法が使用されてきた。ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ90/15065号（発明の名称：Exonuclease-Resistant Oligonucleotides and Methods for Preparing the Same）には、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に２個またはそれ以上のホスホロアミダイトとホスホロモノチオネートおよび／またはホ２０スホロジチオネート連鎖を導入することによるエキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドの作成方法が記載されている。ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ91/06629号（発明の名称：Oligonucleotide Analogs with Novel Linkages）には、隣接したヌクレオチドの間の１個または２個以上のホスポジエステル結合がＲＮＡもしくはＤＮＡを結合できるホルムアセタール/ケタール型結合によって置換されたオリゴヌクレオチド化合物が記載されている。
【０００６】
エンドヌクレアーゼによる切断に対してＲＮＡを安定化する通常の戦略はリボヌクレオチドの２’位置を修飾することである。塩基特異的なエンドヌクレアーゼ切断に対する安定化のアプローチには、酵素による塩基認識の妨害を使用することができる。この修飾には、数種の戦略たとえば、２’−アミノおよび２’−フルオロ[Hobbsら(1973) Biochemistry 12: 5138; Guschlbauerら(1977) Nucleic Acids Res. 4:1993]および２’−ＯＣＨ３[Shibaharaら(1987) 15: 4403; Sproatら(1989) Nucleic Acids Res. 17: 3373]による修飾が知られている。ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ91/06556号（発明の名称：2' Modified Oligonucleotides）には２’位置に置換基をもっヌクレアーゼ抵抗性オリゴマーが記載されている。ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ91/10671号（発明の名称：Compositions and Methods for Detecting and Modulating RNA Activity and Gene Expression）には２’−位置が化学的に修飾され、触媒、アルキル化または他の方法でＲＮＡの切断に影響することが可能な反応部分、標的化部分、および標的化部分と反応部分を連結するための結合部分を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている。
【０００７】
ピリミジンの５−位置も化学的に修飾することができる。ピリミジンのＣ−５位置への修飾の導入では、ピリミジン特異的エンドヌクレアーゼによる認識の妨害が期待できる。しかしながら、このコンセプトはリボヌクレオチドの２’−位置の修飾の場合のようにクリアーカットではない。
【０００８】
ピリミジンヌクレオシドの５−位置における炭素−炭素結合の形成を触媒するためのパラジウムの使用は既知である。ピリミジンの５−位置の修飾のための優れた方法は米国特許5,428,149号（発明の名称：Method for Palladium Catalysed Carbon-Carbon Coupling and Product）に記載されている。この特許明細書は引用によりその全体が本明細書に導入される。５−位置ピリミジンの修飾の最初の例はBergstrom［Bergstromら(1976) J.Am.Chem.Soc., 98: 1587; (1978) J.Org.Chem. 43: 2870; (1981) J.Org.Chem. 46: 1432 & 2870; (1982) J.Org.Chem., 47: 2174］およびDaves［Arai & Daves (1978) J.Am.Chem.Soc. 100: 287; Lee & Daves (1983) J.Org.Chem. 48: 2870］によって証明された。BergstromおよびDavesはDreyer & Dervan［(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 968］によって用いられたのと同じ５−水銀−デオキシウリジン化合物を、オリゴヌクレオチドに官能基を結合させるために使用した。
【０００９】
ウリジンの５−位置への単純な炭素−炭素カップリング反応のための一方法は、Crisp (1989) Syn.Commun. 19: 2117の論文に記載されている。Crispは、保護された５−ヨード−２’−デオキシウリジンをアセトニトリル中Ｐｄ（II）触媒の存在下にアルケニルスタナンと反応させることによって、５−位が官能化されたデオキシウリジンを形成している。
【００１０】
現在までパラジウム触媒を用いてプリンヌクレオッドを修飾する研究はほとんど行われていない。Aeroschotら［(1993) J.Med.Chem. 36: 2938-2942］ は２−，６−および８−ハロゲン化アデノシンが対称有機錫試薬で修飾できることを報告している。しかしながら、対称有機錫化合物は広範囲には利用できない。Sesslerら［(1993) J.Am.Chem. 115: 10418-10419］は保護された８−プロモグアノシンの４−トリブチル錫ベンズアルデヒドによるアリール化を記載している。しかしながらこの操作を用いた場合、出発原料の有意な量（２８％）が反応しなかった。パラジウム触媒を用いプリンヌクレオシドを修飾する優れた方法が1994年12月01日出願米国特許出願一連番号第08/347,600号（発明の名称：Purine Nucleoside Modification by Palladium Catalyzed Methods）に記載されている。この出願は引用によりその全体が本明細書に導入される。
【００１１】
さらに、パラジウム触媒アミド化の領域においてもほとんど研究は行われていない。Schoenbergら［J.Org.Chem. (1974) 39: 3327］はアリールおよびアルケニルハライドのアミド化を記載しているが、この研究にはヌクレオチド基質もまたＰｄＬ４触媒の使用も含まれたいない。
【００１２】
セレックス（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）は、「核酸抗体」と呼ばれる核酸リガンドたとえば標的分子に選択的に結合する核酸の同定および製造方法である［Tuerk & Gold (1990) Science 249: 505］。この方法は、実際に任意所望の規準の親和性および選択性を達成するために同一の一般的選択スキームを用い、候補混合物からの選択および構造的改良の段階的反復を包含する。核酸混合物に出発し、この方法は、混合物を標的と相互作用に有利な条件下に接触させ、標的分子と相互作用した核酸から非相互作用核酸を分配し、核酸−標的対を解離させ、核酸−標的対から解離した核酸を増幅させて標的と相互作用する核酸が濃縮された核酸の混合物を得、ついで相互作用、分配、解離および増幅の工程を所望の回数再反復する工程を包含する。
【００１３】
本発明の方法は、修飾ヌクレオチドを含有する核酸を製造するためにセレックス法と組み合わせることができる。修飾ヌクレオチドの存在によって、標的分子と相互作用する能力が増強された改変構造を有する核酸を生成させることができる。修飾ヌクレオシドの立体的および電気的影響もヌクレアーゼによる分解を防止するように作用する。オリゴヌクレオチドへの修飾ヌクレオチドの導入は、本技術分野の熟練者には周知の通りである［Dewey,T.ら，J.Am.Chem.Soc. (1995) 117: 8474-8475; Walker G.C.ら，Biochemistry (1975) 14: 817-823; Connolly, B.A. 155-183頁，In Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (1991), F. Eckstein編，IRL Press, NewYork］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の簡単な概要
本発明は、パラジウム触媒と求核試薬および一酸化炭素を用いてヌクレオシド環の様々な位置に化学残基を導入する新規な方法を包含する。好ましくは、修飾はピリミジン環の５−もしくは６−位置またはプリン環の２−，６−または８−位置に行われる。とくに好ましくは、修飾はピリミジン環の５−位置およびプリン環の８−位置に存在する。ヌクレオシド環のとくに好ましい修飾にはアミドまたはエステル残基の導入が包含される。とくに好ましい修飾のためには、求核試薬は一級または二級アミンである。
【００１５】
本発明は、広範囲の修飾ヌクレオシド分子を製造するための反応スキームを包含する。修飾ヌクレオシドの製造において鍵になる要素は求核試薬および一酸化炭素と組み合わせたパラジウム触媒の使用である。
【００１６】
さらに特定すれば、本発明はヌクレオシド出発原料の炭素原子に結合した離脱基を含有するヌクレオシド出発原料をパラジウム触媒の存在下に求核試薬および一酸化炭素と反応させ、っいで修飾ヌクレオシドを単離する工程からなる修飾ヌクレオシドの製造方法を提供する。この方法によって製造される修飾ヌクレオシドも本発明に包含される。
【００１７】
本発明はさらに、修飾ヌクレオシドが２’−位または３’−位で修飾された糖にカップリングさせる安定化された核酸の製造方法を包含する。
【００１８】
本発明の修飾ヌクレオシドは、それらに限定されるものではないが、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗かび剤もしくは抗新生物剤としての使用およびオリゴヌクレオチドの一部としての使用を含む多くの用途を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヌクレオシド出発原料をパラジウム触媒の存在下に求核試薬および一酸化炭素と反応させることによるヌクレオシド環の修飾方法を包含する。本発明はピリミジンおよびプリン両者の修飾を包含する。ピリミジンは以下の構造および慣用位置番号を有する。
【００２０】
【化１】
【００２１】
ピリミジン環は５−または６−位置で修飾することが可能であり、とくに好ましくは５−位置が修飾される。プリンは以下の構造および慣用位置番号を有する。
【００２２】
【化２】
【００２３】
プリンはプリン環の２−，６−または８−位置で修飾することが可能で、とくに好ましくは８−位置が修飾される。本発明によればヌクレオシド環への様々な修飾の導入が意図される。しかしながら、ヌクレオシド環へのとくに好ましい修飾にはアミドまたはエステル残基の導入が包含される。好ましい修飾においては、カルボキシアミド化反応のための求核試薬は一級または二級アミンである。
【００２４】
本発明は、本発明の方法によって製造できるすべての新規化合物に及ぶものである。本発明にはまた、本発明の新規な置換ヌクレオシド１個または２個以上を含有するオリゴヌクレオチドも包含される。本発明はまた、様々な医薬領域とくに抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗かび剤もしくは抗新生物剤としての修飾ヌクレオシドの使用を包含する。
【００２５】
本発明の一般的な反応は以下の式によって特徴づけることができる。
【００２６】
【化３】
【００２７】
本明細書において用いられる「修飾ヌクレオシド」の語は任意のヌクレオシド塩基、ヌクレオシドまたは本発明の方法によって調製されるヌクレオチドを包含することを意図するものである。ヌクレオシド塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの語は本明細書では互いに交換して使用することができる。本発明の修飾ヌクレオシドはその塩基および糖に様々の他の修飾を含有することができる。
【００２８】
「ヌクレオシド出発原料」とは、本明細書においては、受け入れられる離脱基（Ｘ）を有する任意のヌクレオシド塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドと定義される。ヌクレオシド出発原料には、すべてのヌクレオシド、天然に存在するおよび天然に存在しないヌクレオシドの両者が包含される。好ましくは、ヌクレオシド出発原料には、ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンまたはそれらの保護された誘導体を含むプリンおよびピリミジンが包含される。ある実施態様においては、保護された誘導体にはＲ″がジメチルホルムアミド、またはアシル基、好ましくはイソブチリル、アセチル、フェノキシアセチルおよびベンゾイルからなる群より選択されるアシル基である誘導体が包含される。保護されていないヌクレオシドにおいてはＲ″はＨである。離脱基はヌクレオシド出発原料の任意の遊離炭素に結合させることができる。受け入れられる離脱基は触媒反応の間に除去され、Ｃ（Ｏ）ＹＲ化学残基によって置換され本発明の修飾塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを生成する。ヌクレオシド出発原料は、リボース、デオキシリボース、ジデオキシリボースおよびそれらの２’，３’または５’修飾の任意の組合せの形態で結合した糖残基を有することができる。本発明では、上述の糖残基およびそれらの任意の適当な誘導体、たとえばヒドロキシル基が一部またはすべて保護されたリボースまたは２’−デオキシリボースが意図される。たとえば、５’−ヒドロキシルはモノ−，ジ−またはトリ−ホスフェートとして存在することができる。
【００２９】
「ピリミジン出発原料」は本明細書においては、結合した受け入れられる離脱基（Ｘ）を有するピリミジン塩基、ピリミジンヌクレオシドまたはピリミジンヌクレオチドと定義される。ピリミジン出発原料には、すべてのピリミジン、天然に存在するおよび天然に存在しないピリミジンの両者が包含される。好ましくはピリミジン出発原料には、ウラシル、チミンおよびシトシン、またはそれらの保護された誘導体が包含される。離脱基はヌクレオシド塩基の任意の遊離炭素、好ましくは５−または６−位置に結合させることができる。最も好ましい結合位置はピリミジン環の５−位置である。受け入れられる離脱基は触媒反応の間に除去され、化学残基Ｃ（○）ＹＲによって置換されて修飾ピリミジンを生成する。ピリミジン出発原料は、リボース、デオキシリボース、ジデオキシリボースおよびそれらの２’，３’または５’修飾の任意の組合せの形態で結合した糖残基を有することができる。本発明では、上述の糖残基およびそれらの任意の適当な誘導体、たとえばヒドロキシル基が一部またはすべて保護されたリボースまたは２’−デオキシリボースが意図される。たとえば、５’−ヒドロキシルはモノ−，ジ−またはトリ−ボスフェートとして存在することができる。
【００３０】
「プリン出発原料」は、本明細書においては、結合した受け入れられる離脱基（Ｘ）を有するプリン塩基、プリンヌクレオシドまたはプリンヌクレオチドと定義される。プリン出発原料には、アデニンおよびグアニン出発原料またはそれらの保護された誘導体が包含される。離脱基は、プリン塩基の任意の炭素、好ましくはプリン環の２−，６−または８−位置に結合させることができる。最も好ましい結合位置は８−位置である。受け入れられる離脱基は触媒反応の間に除去され、Ｃ（０）ＹＲ化学残基によって置換されて修飾プリンを生成する。プリン出発原料は、リボース、デオキシリボース、ジデオキシリボースおよびそれらの２’，３’または５’修飾の任意の組合せの形態で結合した糖残基を有することができる。本発明では、上述の糖残基およびそれらの任意の適当な誘導体、たとえばヒドロキシル基が一部またはすべて保護されたリボースまたは２’−デオキシリボースが意図される。たとえば、５’−ヒドロキシルはモノ−，ジ−またはトリ−ホスフェートとして存在することができる。
【００３１】
「受け入れられる離脱基」は、本明細書においてはパラジウム（II）の適当な対イオンである基として定義され、本明細書においてはＸで表示される。本発明の最も一般的な実施態様においては、Ｘは本技術分野の熟練者には周知の多くの受け入れられる離脱基の任意の基である。受け入れられる離脱基には、それらに限定されるものではないが、アセテート、トリフルオロアセテート、トリフルオロメチルスルポネート、トシレート、メタンスルポネートならびにホウ酸エステルおよび遊離酸が包含される。好ましい実施態様ではＸはハロゲンであり、最も好ましい実施態様ではＸは臭素またはヨウ素である。離脱基は本技術分野の通常の熟練者には周知の方法によってプリン出発原料の炭素原子に結合させる。
【００３２】
「求核試薬」は本明細書においては、本技術分野の通常の熟練者の理解と同様であると定義される。とくに、求核試薬は離脱基を置換できる電子に富む化学残基である。触媒反応の本質により、上記ヌクレオシド出発原料と上記求核試薬の間にＣＯが挿入される。求核置換反応に使用できる有用な求核試薬は本技術分野の熟練者に知られている通りである。好ましい求核試薬の例には、それらに限定されるものではないが、アミン、アルコールおよびチオールがある。
【００３３】
好ましい実施態様においては、本発明に用いられる求核試薬の一般的構造は、ＲＹＨ（式中，Ｙ＝０，Ｓ，ＮＨまたはＮＲ’）である。ＲおよびＲ’は芳香族、脂肪族または異項環の環状構造の一部であってもよい。本発明の好ましい実施態様においては、求核試薬（ＲＹＨ）は脂肪族または芳香族、一級または二級アミン（環状アミンを含む）、アルコールおよびチオールからなる群より選択され、この場合、ＲおよびＲ′は、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル（直鎖状または分岐状）、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル（直鎖状または分岐状）、アリール、異項環、ならびに天然および非天然アミノ酸からなる群より選択される。
【００３４】
好ましい実施態様においては、求核試薬は構造ＲＹＨを有し、式中、
Ｙは、Ｏ，ＳおよびＮＨからなる群より選択され、
Ｒは、（ＣＨｌ）ｍ（ＣＨ３）ｎ（式中、ｌは０，１または２であり、ｍは０〜１９であり、ｎは０，１，２または３である）であり、この場合１個または２個以上のＨは＝Ｏ，−ＯＨ，＝ＮＨ，ＮＨ２，＋ＮＭｅ３Ｃｌ，
【００３５】
【化４】
【００３６】
またはアミノ酸で置換されていてもよい。
【００３７】
本発明の最も好ましい実施態様においては、求核試薬は以下の群
【００３８】
【化５】
【００３９】
から選択される。
【００４０】
求核試薬のＲおよびＲ’基は、本発明によって調製されるヌクレオシドに広範囲の機能性能力を導入するために使用できる多様な官能基を包含することができる。求核性官能基には本技術分野の通常の熟練者には明らかなように、とくに、アミド、エステル、ニトリル、ニトロ、尿素、ハライド、シアナート、アルコール、アミン、エーテル、チオール、アリール置換基等を包含することができる。求核試薬上の水素または官能基の任意の置換が、定義の目的においては「置換」と呼ばれる。
【００４１】
本発明のパラジウム触媒は、最も一般的には、ＰｄＬ４またはＰｄＬ３（式中、Ｌは一般的に用いられる多くのパラジウムリガンドの一つである）として特徴づけることができる。パラジウム触媒は予め形成されていても（たとえばＰｄＬ４，Ｌはトリフェニル等である）、また本技術分野の通常の熟練者には周知のように、Ｐｄ（０）またはＰｄ（II）およびホスフィンリガンドからインシトゥで作成されてもよい（たとえば、［ビス（ベンジリデンアセトン）Ｐｄ（０）］，Ｐｄ（ＯＡｃ）２など）。ＰｄＬ４は本発明の好ましいパラジウム触媒である。使用できる多様なリガンドの選択は本技術分野の熟練者の技術および知識の範囲内である。一般的なリガンド（Ｌ）の例としては、それらに限定されるものではないが、ＰＰｈ３，（ｏ−ｔｏｌ）３Ｐ，Ｐ（ｐ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ）３，ＣＨ３ＣＮ，ＤＭＳＯ，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），
【００４２】
【化６】
【００４３】
がある。本発明の触媒種の好ましい実施態様においては、ＬはＰＰｈ３（トリフエニルポスフィンもしくはＰ（Ｃ６Ｈ５）３）またはＰ（ｐ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ）３である。本発明の触媒の一部の調製は、1993年06月14日出願の米国特許第5,428,149号（発明の名称：Method for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Products）に記載されている。この記載は引用により本明細書に導入される。
【００４４】
ある種の実施態様においては、反応中に付加的な塩基性、非求核性成分を包含させることが有利である。望ましい塩基の例としてはそれらに限定されるものではないが、Ｅｔ３Ｎ，ＥｔＮ（ｉＰｒ）２，１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）および１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）がある。この反応に使用できる溶媒にはアセトニトリル、１５ジオキサン、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルポキシド、水、ＴＨＦ，ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）およびヘキサメチルポスホン酸トリアミド(HMPT)がある。反応の温度範囲は通常60〜100℃であるが、他の適当な温度範囲も意図される。
【００４５】
本発明の好ましい実施態様においては、以下の反応原料濃度および反応条件が有用である。すなわち、求核試薬は、好ましくは0.0〜2.0Ｍの範囲で使用される。パラジウム触媒の濃度は0.0005〜0.2Ｍの範囲とすることができる。COの圧力は10〜1000psiの範囲とすることができる。ヌクレオシド出発原料の濃度は0.010〜1.0Ｍの範囲とすることができる。
【００４６】
本発明の修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドはオリゴヌクレオチド中に用いることが意図される。ヌクレオシドをオリゴヌクレオチドに導入するための標準的方法に本発明の修飾ヌクレオシドを使用することができる。典型的には、本発明のオリゴヌクレオチドは500塩基未満、通常は100塩基未満、とくに好ましくは50塩基未満である。修飾ヌクレオシドはインビトロ転写操作に適している。修飾ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドは多くの様々な有用性を有する。本発明のオリゴヌクレオチドはとくに生物学的標的と相互作用するか、または促進活性を有する。オリゴヌクレオチドは様々な診断的適用にも使用できる。
【００４７】
ヌクレオシドまたはヌクレオチドは抗新生物、抗細菌、抗かびまたは抗ウイルス活性を示す場合もある。これらのヌクレオシドおよびヌクレオチドには他の治療活性が証明されるものもある。このような活性を測定するための標準アッセイは通常の熟練者には周知である。処方および投与経路は本技術分野の通常の熟練者にはよく知られている。さらに、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチドの送達システムとしてプロドラッグ技術を使用することもできる。とくに、本発明のヌクレオシドまたはヌクレオチドは、様々な性質の中でとくに薬理学的特性および経口利用性を改良するために脂質に結合させることができる。とくに、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチドの５’−ジアシルグリセロ−またはジアルキルグリセロホスフェート誘導体は有用である。修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドはとくに抗ウイルス薬としての適用に興味がもたれる。ヌクレオシドおよび非ヌクレオシドのジアシルグリセロホスフェートは米国特許第5,223,263号に記載のように、薬物動態学的挙動の改良、生物学的利用性の改良、および毒性の改善のために使用されている。この記載は引用により本明細書に導入される。
【００４８】
血清中におけるエンドヌクレアーゼの分解に対する安定性はリガンドのピリミジン位置に２’−デオキシ−２’−フルオロまたは２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドを導入することによって達成できる［Piekenら (1991) Science 253: 314］。本発明の修飾ヌクレオシドはまた、様々な状況で同じく有用な２’−置換種とカップリングきせることもできる。ハロゲン化ヌクレオシドの導入がリガンド−標的間相互作用の増強に価値があることもわかっている。
【実施例】
【００４９】
実施例
以下の実施例は本発明の製造方法および生成物の好ましい実施態様を例示するものであり、本発明をそれらに限定するものではない。
【００５０】
実施例1
プリンのアミンによる修飾
表Ｉの修飾プリンを製造するために以下の一般操作を用いた。
【００５１】
一般スキーム
【００５２】
【化７】
【００５３】
特定スキーム
【００５４】
【化８】
【００５５】
特定スキームに使用できる各種ヌクレオシド塩基出発原料
【００５６】
【化９】
【００５７】
【表１】
【００５８】
ａ反応ではＣＯの挿入がなく求核試薬にヌクレオシド塩基出発原料が直接カップリングした副生成物１６％を生じた。
【００５９】
ｂ反応ではＣＯの挿入がなく求核試薬にヌクレオシド塩基出発原料が直接カップリングした副生成物１５％を生じた。
【００６０】
ｃ反応ではＣＯの挿入がなく求核試薬にヌクレオシド塩基出発原料が直接カップリングした副生成物１４％、およびＣＯが挿入されアミンではなくヒドロキシドが求核試薬として働いた副生成物１４％が生じた。
【００６１】
表Ｉの修飾プリンヌクレオシドの製造は以下の一般操作に従った。
【００６２】
一般操作：１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは内部標準として重水素化溶媒を用いてBruker ARX-300スペクトロメーターによりＣＤ３ＯＤ，Ｄ２Ｏ，ＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−ｄ６中において測定した。陽イオン高速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ＋）はカリフォルニア大学バークレー校質量分析施設にて実施した。
【００６３】
材料：８−ブロモアデノシン、８−ブロモグアノシン二水和物、モルホリン、ｎ−ブチルアミン、イソプロピルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、アニリン、４−アミノメチルピリジン、（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、アルギニンエチルエステル、エタノールアミン、トリエチルアミン、ＤＭＦおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）はAldrich Chemical Companyから購入し、とくに記載のない限りそのまま使用した。Ｎ−（２−アミノエチル）ビオチンアミド臭化水素酸塩はMolecular Probes, Inc.から購入した。
【００６４】
パラジウム触媒カップリング反応の一般操作：テフロン（登録商標）バルブ付き耐圧ガラス瓶に、表Ｉに記載のヌクレオシド(0.5ミリモル)、表Ｉに記載のアミン求核試薬(1.0ミリモル)、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.0015ミリモル）、トリエチルアミン（1.0ミリモル）およびＤＭＦ（またはＤＭＡ）を添加した。耐圧ガラス瓶から空気を抜きＣＯ（50psi）を充填し、ついで所望の温度に２４時間加熱した。溶媒を除去し、残留物を真空中メタノール（5〜30%）とメチレンクロリドの混合物を用いるシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィー、および／またはメタノールもしくはイソプロパノールによる再結晶によって精製した。カップリング生成物のスペクトルデータは次の通りである。
【００６５】
化合物４：２’，３’，５’−トリアセチル−８−Ｎ−モルホリン−アデノシンカルボキシアミド
【００６６】
【化１０】
【００６７】
HRMS (FAB+) m/z 507.1838（Ｃ２１Ｈ２６Ｎ６Ｏ９＋Ｈ＋として計算値507.1840）。
【００６８】
化合物５：２’，３’，５’−トリアセチル−８−Ｎ−（４−メチルピリジル）−アデノシンカルボキシアミド
【００６９】
【化１１】
【００７０】
HRMS (FAB+) m/z 528.1842（Ｃ２３Ｈ２５Ｎ７Ｏ８＋Ｈ＋として計算値528.1843）。
【００７１】
化合物６：８−Ｎ−（４−ピリジルメチル）−アデノシンカルボキシアミド
【００７２】
【化１２】
【００７３】
HRMS (FAB+) m/z 402.1522（Ｃ１７Ｈ１９Ｎ７Ｏ５＋Ｈ＋として計算値402.1526）。
【００７４】
化合物７：８−Ｎ−（ｎ−ブチル）−アデノシンカルボキシアミド
【００７５】
【化１３】
【００７６】
HRMS (FAB) m/z 367.1723（Ｃ１５Ｈ２３Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値367.1729）。
【００７７】
化合物８：８−Ｎ−（２−プロピル）−アデノシンカルボキシアミド
【００７８】
【化１４】
【００７９】
HRMS (FAB+) m/z 353.1574（Ｃ１４Ｈ２０Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値353.1573）。
【００８０】
化合物９：８−Ｎ−（ｔ−ブチル）−アデノシンカルボキシアミド
【００８１】
【化１５】
【００８２】
HRMS (FAB+) m/z 367.1723（Ｃ１５Ｈ２２Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値367.1717）。
【００８３】
化合物１０：８−Ｎ−フェニル−アデノシンカルボキシアミド
【００８４】
【化１６】
【００８５】
HRMS (FAB+) m/z 387.1419（Ｃ１７Ｈ１８Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値387.1417）。
【００８６】
化合物１１：８−Ｎ−（２−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアンモニウム）エチル）−アデノシンカルボキシアミドクロリド
【００８７】
【化１７】
【００８８】
HRMS (FAB+) m/z 396.1995（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ７Ｏ５Ｃｌ−として計算値396.1995）。
【００８９】
化合物１２：８−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−アデノシンカルボキシアミド
【００９０】
【化１８】
【００９１】
HRMS (FAB+) m/z 355.1372（Ｃ１３Ｈ１８Ｎ６Ｏ６＋Ｈ＋として計算値355.1366）。
【００９２】
化合物１３：８−Ｎ−（アルギニンエチルエステル）−アデノシンカルボキシアミド
【００９３】
【化１９】
【００９４】
HRMS (FAB+) m/z（Ｃ１７Ｈ１８Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値387.1417）。
【００９５】
化合物１４：８−Ｎ−（ｔ−ブチル）−グアノシンカルボキシアミド
【００９６】
【化２０】
【００９７】
HRMS (FAB+) m/z 383.1676（Ｃ１５Ｈ２２Ｎ６Ｏ６＋Ｈ＋として計算値383.167256）。
【００９８】
化合物１５：８−Ｎ−（２−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアンモニウム）エチル）−グアノシンカルボキシアミドクロリド
【００９９】
【化２１】
【０１００】
HRMS (FAB+) m/z 412.1950（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ７Ｏ６Ｃｌ−として計算値412.1945）。
【０１０１】
化合物１６：８−Ｎ−（アルギニンエチルエステル）−グアノシンカルボキシアミド
【０１０２】
【化２２】
【０１０３】
HRMS (FAB+) m/z 512.2219（Ｃ１９Ｈ２９Ｎ９Ｏ８＋Ｈ＋として計算値512.2217）。
【０１０４】
化合物１７：８−Ｎ−（４−ピリジルメチル）−グアノシンカルボキシアミド
【０１０５】
【化２３】
【０１０６】
HRMS (FAB+) m/z 418.1482（Ｃ１９Ｈ２１Ｎ４Ｏ７＋Ｈ＋として計算値418.1488）。
【０１０７】
化合物１８：８−Ｎ−（２−アミノエチルビオチンアミド）−グアノシンカルボキシアミド
【０１０８】
【化２４】
【０１０９】
HRMS (FAB+) m/z 596.2251（Ｃ２３Ｈ３３Ｎ９Ｏ８＋Ｈ＋として，計算値:596.2264）。
実施例２
アルコールによるプリン修飾
実施例１に略述した一般操作に従い、以下のスキームによって記載される修飾プリンを製造し、以下の結果を得た。
【０１１０】
【化２５】
【０１１１】
実施例３
アミンおよびアルコールによるウリジン修飾
表ＩＩ記載の修飾ウリジンヌクレオシドの製造のために以下の操作を用いた。
【０１１２】
一般スキーム
【０１１３】
【化２６】
【０１１４】
特定スキーム
【０１１５】
【化２７】
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
出発原料の合成
化合物22は文献記載［P.K.Chang & A.D.Welch, J.Med.Chem. (1963), 6: 428］の操作に従って調製した。他の出発原料(化合物19〜21)は以下の操作によって合成した。
【０１１８】
化合物19．５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
300mLのアセトン中5.00g（13.5ミリモル）の５−ヨードウリジンの溶液を攪拌し、これにp−トルエンスルホン酸250mg（1.30ミリモル）を加えた。フラスコには４Åモルキュラーシープを充墳した滴下ろ斗および還流冷却器を装着した。溶液を還流温度に２時間加熱すると固体はすべて溶消した。フラスコを放置して室温まで冷却させ、溶液を真空中で濃縮した。この溶液をアセトンに溶かして、シリカのプラグを通してろ過しろ液を濃縮すると淡黄色の固体が得られた。この物質をエタノールから再結晶すると生成物が白色の針状晶として定量的な収率で生成した。
【０１１９】
化合物20．５’−ＤＭＴ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
1.0mLの無水ＤＭＦおよび1.8mLの無水ピリジン中５−ヨード−２’，３’−イソプロピリデンウリジン820mg（2.00ミリモル）の溶液をアルゴン下に攪拌し、これに４−ジメチルアミノピリジン24.4mg（0.20ミリモル）およびＤＭＴＣｌ（2.20ミリモル）を添加した。溶液を室温で一夜攪拌し、150mLの酢酸エチルで希釈し、3×75mLのＨ２Ｏ，1×50mLの食塩水で洗浄し、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲル上40％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで精製すると1.28g（収率90％）の生成物が白色の固体として得られた。
【０１２０】
化合物21．５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
無水ピリジン1.9mL中1.00g（2.40ミリモル）の５−ヨード−２’，３’−イソプロピリデンウリジンの溶液を攪拌し、これにＴＢＤＭＳＣｌ 724mg（4.80ミリモル）を添加した。溶液を室温で一夜攪拌し、30mLの酢酸エチルで希釈し、3×20mLのＨ２Ｏ，1×20mLの食塩水で洗浄し、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲル上30％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで精製すると1.15g（収率91％）の生成物が白色の固体として得られた。
【０１２１】
修飾ウリジンの合成
表ＩＩに記載の修飾ウリジンは以下のように合成した。
【０１２２】
化合物23．５−（Ｎ−ブチルカルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において300mLのステンレス鋼のパールボンベに５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.351g，1.00ミリモル,3.0mLのＴＨＦ中）、10mLの1.0 Ｍ Ｅｔ３Ｎ／ＴＨＦ（10ミリモル）、ＴＨＦ中1.0Ｍ ｎ−ブチルアミン3.0mL（3.0ミリモル）およびテトラキス（トリフェニル−ホスフィン）パラジウム（0.116g，0.100ミリモル）を加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、空気を除去して100psiのＣＯを３回充墳し、70℃に24時間加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させて、換気フード内で注意深く排気し、揮発成分を真空中で除去した。粗製の反応物質をシリカゲル上５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製すると、生成物が黄色の固体（0.251g，収率65％）として得られた。分析用サンプルはＭｅＯＨから再結晶して羽毛状白色針状晶の生成物として得られた。
【０１２３】
【化２８】
【０１２４】
ＨＲＭＳ：Ｃ１７Ｈ２６Ｎ３Ｏ７として計算値（測定値）384.1771（384.1772）。元素分析：Ｃ１７Ｈ２５Ｎ３Ｏ７として計算値（測定値）：Ｃ 53.26（53.46）；Ｈ 6.57（6.53）；Ｎ 10.96（10.98）。
【０１２５】
化合物24．５−［Ｎ−（４−ピリジルメチル）カルボキシアミド１−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
肉厚耐圧ガラスボンベに224mg（0.542ミリモル）の２’，３’−イソプロピリデン−５−ヨードウリジン、63mg（0.0542ミリモル）のテトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウムおよび固体が溶けるまで無水ピリジンを加えた。ついでピリジンを真空中で除去し、固体を一夜真空下に乾燥した。ついで耐圧ボンべにアルゴン下4mLの無水ＴＨＦ，0.75mLのトリエチルアミン（5.42ミリモル）および0.22mLの４−アミノメチルピリジン（2.17ミリモル）を加えた。ボンベから空気を除去してＣＯを３回充墳し、70℃に2.5日間加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させ、溶媒を真空中で除去し、粗製の物質をシリカゲルのパッド上にジクロロメタンを用い負荷した。パッドをジクロロメタンで溶出し、ついで所望の生成物を10％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出し、真空中で濃縮して淡黄色の固体を得た。この物質をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに付し、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出すると201mg（収率89%）の生成物が淡黄色の固体として得られた。この物質をメタノールから再結晶すると純粋な生成物の分析用サンプルが白色針状晶として得られた。
【０１２６】
【化２９】
【０１２７】
ＨＲＭＳ：Ｃ１９Ｈ２３Ｎ４Ｏ７として、計算値（測定値）419.1567（419.1569）。ＵＶスペクトル：λｍａｘ 276nm（ε＝13730 Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０１２８】
５−〔Ｎ−（４−ピリジルメチル）カルボキシアミド〕−５’−トリホスフェート−ウリジン
記載のようにして調製された５’−ヒドロキシル化合物をLudwig & Eckstein, J.Org.Chem. 1989, 54, 631-635の改変操作を用いて５’−トリホスフェートに変換した。Ｈ２Ｏ中でDowex H 50W×80と70℃で攪拌して２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン保護基を除去したのち、粗製のトリホスフェートを順次ＤＥＡＥ Sephadex陰イオン交換樹脂ならびにＣ18 ＲＰ−ＨＰＬＣ上、移動相として100ｍＭ Ｅｔ３ＮＨ＋ＨＣＯ３−ならびにＣＨ３ＣＮを用いて精製した。化合物の純度は分析用Ｃ18 ＲＰ−ＨＰＬＣ，１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）によってチェックし、その276nm（ε＝13700Ｍ−１ｃｍ−１）におけるＵＶ吸収によって定量した。
【０１２９】
化合物25．５−（Ｎ−フェニルカルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において肉厚ガラスボンベに２’，３’−イソプロピリデン−５−ヨードウリジン（0.261g，0.636ミリモル）、テトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.083g，0.072ミリモル）および4.5mLの1.OM Ｅｔ３Ｎ／ＴＨＦ（4.5ミリモル）を加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、アルゴン下にシリンジを通して0.3mLのアニリンを添加した。フラスコの空気を除去し50psiのＣＯを３回充填し、70℃に２日間加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させ、真空中で濃縮し、シリカゲル上4〜6.5％ＭｅＯＨ・ＮＨ３／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、わずかに黄色の固体が得られた。この物質をメタノールから再結晶すると純粋な生成物52mg（収率20％）が微小白色針状晶として得られた。
【０１３０】
【化３０】
【０１３１】
HRMS：Ｃ１９Ｈ２２Ｎ３Ｏ７として計算値（測定値）404.1458（404.1468）。
【０１３２】
化合物26．５’−ＴＢＤＭＳ−５−（Ｎ−［２−（Ｎ’−トリフルオロアセトアミド）エチル］−カルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.531g，1.01ミリモル）、テトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.350g，0.303ミリモル）、Et3N(0.704mL,5.05ミリモル)および2mLの乾燥5THFを加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、陽性アルゴン気流下に0.203mLのエチレンジアミン(3.03ミリモル)を添加した。ボンベをアルゴン下に密栓して、空気を除去し50psiのＣＯを３回充填し、70℃に一夜加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させ、徐々に排気し、真空中で溶媒を除去し、粗製の物質をシリカゲル上25％ＭｅＯＨ・ＮＨ３／ＥｔＯＡｃを用いて精製10すると、生成物381mg（収率78％）が白色固体として得られた。この物質を以下のようにＮ−トリフルオロアセトアミドとして保護した。上記生成物381.0mg（0.78ミリモル）の無水ＣＨ２Ｃｌ２ 7.0mL中溶液を0℃にて攪拌しながら、乾燥ピリジン（0.126mL，1.6ミリモル）および（ＣＦ３ＣＯ）２Ｏ（0.13mL，0.94ミリモル）を添加した。この溶液を0℃で30分間攪拌したのち0.19mLの（ＣＦ３ＣＯ）２Ｏ（1.33ミリモル）と0.13mLのピリジン（1.7ミリモル）を加えた。30分後、反応混合物を放置して温度を室温まで上昇させ、真空中で濃縮し、シリカゲル上40％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンによるフラッシュクロマトグラフィーで精製すると、生成物174mg（収率38％，ヨードウリジン出発原料から収率30％）が白色固体として得られた。
【０１３３】
【化３１】
【０１３４】
HRMS：Ｃ２３Ｈ３６Ｆ３Ｎ４Ｏ８Ｓｉとして計算値（測定値）581.2254（581.2249）。
【０１３５】
５’−トリホスフェート−５−［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキシアミド］−ウリジン
ウリジンの５’−ＴＢＤＭＳ保護エチレンジアミンアミド（上述のように調製）を、ＣＨ３ＣＮ中Ｅｔ３ＮＨ＋Ｆ−によって２日間脱シリル化し、シリカゲル上20％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用い精製すると、５’−ヒドロキシル化合物が得られ、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ，ならびにＦＡＢ＋マススペクトルによって同定された。この化合物を用い、Ludwig & Eckstein, J.Org.Chem. 1989, 54, 531-635の改変操作によって５’−トリホスフェートを調製した。Ｈ２Ｏ中でDowex H+ 50W×80と70℃で攪拌して２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン保護基を除去したのち、生成物をＣ18 ＲＰ−ＨＰＬＣ上、移動相として0.05Ｍ ＴＢＫ／ＣＨ３ＣＮを用いて精製すると、所望の生成物が9％の収率で得られた。生成物は１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲならびにＦＡＢ＋ＭＳによって確認された。
【０１３６】
化合物27．５’−ＤＭＴ−５−カルボメトキシ−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
グローブボックス内において、肉厚小型ガラスボンベに５’−ＤＭＴ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.10g/mL溶液1.OmL，0.14ミリモル）を加えた。固体テトラキス（トリフェニルボスフィン）パラジウム（16mg，0.014ミリモル）、ついでＴＨＦ中1.0Ｍ溶液として0.70ミリモルのＥｔ３Ｎおよび無水メタノール（Ｍｇ上で真空蒸留）3.0mLを添加した。ボンベの空気を除去し50psiのＣＯを再充填し（３×）、ついで密栓して70℃で３日間攪拌した。容器を排気し、真空中で溶媒を除去し、ついで残留物を最少量の5％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２に溶解してシリカゲルパッド上に負荷し、順次ＣＨ２Ｃｌ２（廃棄）および5％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出した。得られた物質をシリカゲル上、5％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で精製し無色固体の生成物を得た。
【０１３７】
【化３２】
【０１３８】
化合物28．５’−ＴＢＤＭＳ−５−カルボメトキシ−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
この化合物は５’−ＤＭＴ保護化合物について上述したように、出発原料として５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジンを用いるほかは同様に調製された。生成物はシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーによって無色の固体として単離された。
【０１３９】
【化３３】
【０１４０】
ＨＲＭＳ：Ｃ２０Ｈ３３Ｎ２Ｏ８Ｓｉとして計算値（測定値）457.2006（457.2006）。
【０１４１】
化合物29．５’−ＴＢＤＭＳ−５−（Ｎ−ヒスチジノールカルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン100mg/mL溶液3.5mL（0.491ミリモル）、57mgのテトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.0491ミリモル）、0.2mLのトリエチルアミン（1.473ミリモル）、および0.5mLのＴＨＦを加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、アルゴン下に、ＴＢＤＭＳ保護ヒスチジノールの100mg/mL溶液1.9mL（0.736ミリモル）を添加した。ボンベをアルゴン下に密栓して、空気を除去し50psiのＣＯを３回充填し、70℃で48時間加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させ、排気し、真空中で溶媒を除去した。粗製の物質をシリカゲル上５〜７％または０〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２の勾配によるクロマトグラフィーで精製すると、所望の生成物0.294g（収率69％）が白色固体として得られた。
【０１４２】
【化３４】
【０１４３】
HRMS：Ｃ４６Ｈ５７Ｎ５Ｏ１０Ｓｉとして計算値（測定値）867.3874（867.3884）。
【０１４４】
化合物30．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［Ｎ−（２−［４−イミダゾール］エチル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.260g，0.496ミリモル）、4mLの乾燥ＴＨＦ，およびテトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.073g，0.063ミリモル）を加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、真空中で溶媒を除去した。アルゴン下に無水Ｅｔ３Ｎ（0.35mL，2.48ミリモル）、ヒスタミン（0.263g，2.37ミリモル）、および2mLのＤＭＳＯ−ｄ６を加えた。ボンベから空気を除去して50psiのＣＯを３回充填し、70℃に２日間加熱した。室温まで冷却したのち、ボンベを注意深く排気し、真空中70℃で溶媒を除去した。粗製の物質をシリカゲル上12％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、181mg（収率68％）のわずかに黄色を帯びた固体が得られた。
【０１４５】
【化３５】
【０１４６】
HRMS：Ｃ２４Ｈ３７Ｎ５Ｏ７Ｓｉとして、計算値（測定値）535.2462（535.2456）。ＵＶスペクトル：λｍａｘ278nm（ε=12930 Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０１４７】
５’−トリホスフェート−５−［Ｎ−（２−［４−イミダゾール］エチル）カルボキシアミド］−ウリジン
ウリジンの５’−ＴＢＤＭＳ保護ヒスタミンアミド（上に調製）をＣＨ３ＣＮ中Ｅｔ３ＮＨ＋Ｆ−によって２日間脱シリル化し、シリカゲル上15％ＮＨ３−ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製すると、ウリジンの５’−ヒドロキシルヒスタミンアミドが得られ、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ，およびＦＡＢ＋マススペクトルによって同定された。この化合物を用いてLudwig & Eckstein, J.Org.Chem. 1989, 54, 531-635の改変操作により５’−トリホスフェートを調製した。Ｈ２０中酸性Dowex樹脂と70℃で処理して２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン保護基を除去したのち、粗製のトリホスフェートを順次ＤＥＡＥ Sephadex陰イオン交換樹脂およびＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ上、移動相として100ｍＭ Ｅｔ３ＮＨ＋ＨＣＯ３−水溶液およびＣＨ３ＣＮを用いて精製した。化合物の純度は分析用Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ，１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）によってチェックし、278nm（ヌクレオシド出発原料にっいてのε２７８＝12930Ｍ−１ｃｍ−１を用いて）におけるＵＶ吸収により定量した。
【０１４８】
化合物31．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
この化合物は、３当量のエタノールアミンおよび３当量のトリエチルアミンを用い70℃で48時間反応させることにより、化合物30について上述したのと同様に調製された。生成物はシリカゲル上６％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製し、無色固体0.173g（収率61％）として得られた。
【０１４９】
【化３６】
【０１５０】
ＥｔＯＡｃ／ヘキサンからの分析用サンプル：ＦＡＢ＋ ＨＲＭＳ：Ｃ２４Ｈ３６Ｎ３Ｏ８Ｓｉとして計算値（測定値）486.2272（486.2271）。元素分析Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ８Ｓｉとして、計算値（測定値）Ｃ 51.94（52.03）；Ｈ 7.26（7.36）；Ｎ 8.65（8.61）。
【０１５１】
化合物32．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［Ｎ−（（２−カルボエトキシ）エチル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
この化合物は、1.0当量のグリシンエチルエステル塩酸塩および３当量のトリエチルアミンを用い、化合物30について上述したのと同様に調製された。生成物はシリカゲル上４％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製し、0.262g（収率80％）の無色の固体として得られた。
【０１５２】
【化３７】
【０１５３】
ＥｔＯＡｃ／ヘキサンからの分析用サンプル：ＦＡＢ＋ＨＲＭＳ：Ｃ２３Ｈ３８Ｎ３Ｏ９Ｓｉとして計算値（測定値）528.2377（528.2382）。元素分析Ｃ２３Ｈ３７Ｎ３Ｏ９Ｓｉとして、計算値（測定値）Ｃ 52.36（52.19）；Ｈ 7.07（6.93）；Ｎ 7.96（7.85）。
【０１５４】
化合物33．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［モルホリンカルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
この化合物は、３当量のモルホリンおよび３当量のトリエチルアミンを用いて化合物30について上述したのと同様に調製された。生成物は、シリカゲル上４％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製し、0.2029（収率68％）の無色固体として得られた。
【０１５５】
【化３８】
【０１５６】
ＥｔＯＡｃ／ヘキサンからの分析用サンプル：ＦＡＢ＋ＨＲＭＳ：Ｃ２３Ｈ３８Ｎ３Ｏ８Ｓｉとして計算値（測定値）512.2428（512.2436）。
【０１５７】
化合物34．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［Ｎ−（アルギニンエチルエステル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.238g，0.453ミリモル）、アルギニンエチルエステルの二塩酸塩（0.260g，0.94ミリモル）、テトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.052g，0.045ミリモル）、0.32mLのＥｔ３Ｎ（2.3ミリモル）、3mLの乾燥ＴＨＦおよび2mLのＤＭＳＯを加えた。反応容器の空気を除去して50psiのＣＯを３回充填し、70℃に２日間加熱した。粗製混合物を濃縮しシリカゲル上25％ＭｅＯＨ−ＮＨ３／ＥｔＯＡｃを用いてクロマトグラフィーに付すと、生成物0.160g（収率57％）が灰白色の固体として得られた。
【０１５８】
【化３９】
【０１５９】
化合物35．５’−［Ｎ−（２−［３−インドリル］エチル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（1.13g，2.14ミリモル）、２−（３−インドリル）エチルアミン（1.70g，10.7ミリモル）およびテトラキス（トリフェニルボスフィン）パラジウム（0.2479，0.214ミリモル）、無水トリエチルアミン（1.5mL，10.7ミリモル）、および10mLのＴＨＦを加えた。ボンベを密栓し、空気を除去して50psiのＣＯを３回充填し、70℃に16時間加熱した。冷却後、溶媒を真空中で除去して、粗製の物質をシリカゲル上0〜5％ＭｅＯＨＮＨ３／ＣＨ２Ｃｌ２を用い精製すると、わずかに不純な黄色固体0.895g（粗製収率78％）が得られた。この物質を、2mLの無水ＣＨ３ＣＮ中Ｅｔ３Ｎ・ＨＦ（1.0g，8.4ミリモル）と室温で16時間攪拌して脱シリル化を行った。反応混合物をＥｔＯＡｃ30mLで希釈し、3×20mLのＨ２Ｏ，10mLの食塩水で抽出し、ついで真空中で濃縮し、シリカゲル上0〜5％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製すると、所望の生成物が、淡黄色の固体（0.430g，収率43％）として得られた。
【０１６０】
【化４０】
【０１６１】
５’−トリホスフェート−５−［Ｎ−（２−［３−インドリル］エチル）カルボキシアミド］−ウリジン
ウリジンの５’−ＴＢＤＭＳ保護トリプタミンアミド（上述のように調製）を、ＣＨ３ＣＮ中５当量のＥｔ３ＮＨ＋Ｆ−によって室温で18時間脱シリル化し、シリカゲル上で精製すると、５’−ヒドロキシル化合物が43％の収率で得られ、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲならびにＦＡＢ＋マススペクトルによって同定された。この５’−ヒドロキシル化合物を用いLudwig & Eckstein, J.Org.Chem. 1989, 54, 531-635の改変操作により５’−トリホスフェートを調製した。Ｈ２Ｏ中Dowex H+ 50W×80と70℃で攪拌して２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン保護基を除去したのち、生成物をＤＥＡＥ Sephdex上25％ＣＨ３ＣＮを添加した0.05〜1.5Ｍ ＴＢＫ緩衝液ついでＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣにより溶出液として0.05Ｍ ＴＢＫ／ＣＨ３ＣＮ移動相を用いて精製した。トリホスフェートは１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲならびにＦＡＢ＋ＭＳによって確認された。
【０１６２】
化合物36．５’−ＴＢＤＭＳ−５−（Ｎ−［６−アミノヘキシル］−カルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（1.28g，2.40ミリモル）、１，６−ジアミノヘキサン（1.40g，12.0ミリモル）およびテトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.83g，0.72ミリモル）ならびに10mLのＴＨＦを加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、アルゴン下にシリンジを通してトリエチルアミン（1.7mL，12.0ミリモル）を添加した。容器の空気を除去して50psiのＣＯを３回充填し、70℃で一夜加熱した。ボンベを冷却させたのち、排気し、溶媒を真空中で除去した。粗製の物質を10mLのメタノールに溶解し、ろ過してパラジウム触媒を除去した。ろ液を濃縮し、シリカゲル上ＣＨ２Ｃｌ２中15〜25％ＮＨ３−ＣＨ３ＯＨを用いて精製すると、所望の生成物が白色の固体（0.812g，収率62％）として得られた。
【０１６３】
【化４１】
【０１６４】
５−（Ｎ−〔６−Ｎ’−トリフルオロアセトアミドヘキシル〕−カルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
上記化合物の遊離アミンを以下の方法で保護した。触媒量のトリエチルアミンを含むアセトニトリル中に化合物36を溶解し、この溶液を撹搾しながら、2.0当量のトリフルオロ酢酸エチルを添加した。この溶液を室温で18時間攪拌し、さらに1.6当量のトリフルオロ酢酸エチルを加え、20時間攪拌した。濃縮し、シリカゲル上1〜5%MeOH/CH2C1、を用いて精製すると、所望のトリフルオロアセトアミドが25%の収率で得られ、１Ｈ ＮＭＲで確認された。この化合物をついでＣＨ３ＣＮ中５当量のＥｔ３Ｎ・Ｈ＋Ｆ−により室温で18時間脱シリル化し、シリカゲル上にて精製すると、５−ヒドロキシル化合物が定量的収率で得られ、その１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより確認された。
【０１６５】
化合物37〜43の一般操作
テフロン（登録商標）バルブ装着ガラス耐圧反応容器に、ヌクレオチド（0.1ミリモル）、アミン（0.5ミリモル，５当量）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.01ミリモル，0.1当量）および溶媒としてジメチルスルポキシド（0.5mL）を加えた。反応容器の空気を除去してＣＯ（50psi）を３回充填したのち、60℃に24時間加熱した。粗製の混合物をDEAE Sephadex A-25陰イオン交換カラム上において0.05M〜1.0Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液の直線勾配を用いて精製した。化合物の特性は以下の通りである。
【０１６６】
化合物37．
【０１６７】
【化４２】
【０１６８】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 459.0909（Ｃ１６Ｈ１９Ｎ４Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋として、計算値459.0917）。
【０１６９】
化合物38．
【０１７０】
【化４３】
【０１７１】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 454.0858（Ｃ１４Ｈ２０Ｎ３Ｏ１２Ｐ＋Ｈ＋として計算値454.086153）。
【０１７２】
化合物39．
【０１７３】
【化４４】
【０１７４】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 488.1082（Ｃ１８Ｈ２２Ｎ３Ｏ１１Ｐ＋Ｈ＋として、計算値488.1084）。
【０１７５】
化合物40．
【０１７６】
【化４５】
【０１７７】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 424.1129（Ｃ１４Ｈ２２Ｎ３Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋として、計算値424.1121）。
【０１７８】
化合物41．
【０１７９】
【化４６】
【０１８０】
化合物42．
【０１８１】
【化４７】
【０１８２】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 424.1121（Ｃ１４Ｈ２２Ｎ３Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋として、計算値424.1121）。
【０１８３】
化合物43．
【０１８４】
【化４８】
【０１８５】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 511.1236（Ｃ２０Ｈ２３Ｎ４Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋として、計算値511.1230）。
実施例４
アミンによるシチジンの修飾
表ＩＩＩに示す修飾シチジンを製造するためには以下の操作を使用した。
【０１８６】
一般スキーム
【０１８７】
【化４９】
【０１８８】
特定スキーム
【０１８９】
【化５０】
【０１９０】
【表３】
【０１９１】
ａヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.01ミリモル），ＤＢＵ（0.5ミリモル），ＤＭＳＯ（0.5mL）
ｂヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ２（ｄａｂ）３（2.5マイクロモル），Ｐ（ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＳＯ３Ｎａ）３（0.015ミリモル），ＤＡＢＣＯ（0.7ミリモル），ＤＭＳＯ（0.5mL）
ｃヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.01ミリモル），ＤＢＵまたはＤＡＢＣＯ（0.5ミリモル），ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ93:7（0.5mL）
一般情報
５−ヨードシチジン一リン酸塩は文献（Voytek, P., Chang, P.K., Prusoff, W.H., J.Bio1.Chem. 1971, 246, 1432）記載の操作に従って合成した。トリスルホン化トリフェニルポスフィンナトリウム塩はStrem Chemicals, Inc.から購入した。その他の化合物はすべてAldrich Chemical Co.から購入した。ｎ−ブチルアミン、トリエチルアミン、および１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）はAldrich Chemical Co.から購入し、ＣａＨ２から蒸留した。イソブチルアミン、チラミン塩酸塩、および４−アミノ酪酸（Acros Organics）はそのまま使用した。ヒスタミンはSigma Chemical Co.から購入し、そのまま使用した。シチジン一リン酸塩、Ｐｄ２（ｄａｂ）３，テトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（０），ＤＡＢＣＯ，４−アミノメチルピリジンおよびＤＭＳＯはAldrich Chemical Co.から購入し、そのまま使用した。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルはBruker ARX-300スペクトロメーターを用い溶媒の共鳴を参照してＣＤ３ＯＤ，Ｄ２Ｏ，ＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−ｄ６中において測定した。高速原子衝撃質量スペクトル（ＨＲ ＦＡＢ ＭＳ）はＶＧ70ＳＥ ＆ ＺＡＢ２−ＥＱ／ＦＡＢ（＋）を用いて測定した。
【０１９２】
一般操作
表ＩＩＩの化合物を合成する一般操作を示す。テフロン（登録商標）バルブ付き肉厚耐圧ガラス反応器にヌクレオシド（0.1ミリモル）、アミン（0.5ミリモル），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.01ミリモル），ＤＢＵ（0.5ミリモル），ＤＭＳＯ（0.5mL）を添加した。反応器の空気を抜き、ＣＯ（50psi）を３回充填したのち、60℃に24時間加熱した。粗製の混合物を逆相ＨＰＬＣによって定量的に分析した。生成物はDEAE Sephadex A-25イオン交換カラム上トリエチルアンモニウム重炭酸塩の直線勾配（0.05M〜0.1M）を用い、ついで製造用Ｃ-18逆相ＨＰＬＣ（0.05Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩／ＭｅＯＨ）によって精製した。表ＩＩＩに掲げた化合物の特性は以下の通りである。
【０１９３】
化合物45．５−（Ｎ−ブチルカルボキシアミド）−シチジンモノホスフェート
【０１９４】
【化５１】
【０１９５】
HRMS(FAB+) m/z 423.1275（Ｃ１４Ｈ２３Ｎ４Ｏ９Ｐ＋Ｈ＋として計算値423.1281）。
【０１９６】
化合物46．５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−シチジンモノホスフェート
【０１９７】
【化５２】
【０１９８】
化合物47．５−（Ｎ−イソプロピルカルボキシアミド）−シチジンモノホスフェート
【０１９９】
【化５３】
【０２００】
HRMS(FAB+) m/z 409.1119（Ｃ１３Ｈ２１Ｎ４Ｏ９Ｐ＋Ｈ＋とし計算値409.1124）。
【０２０１】
化合物48．５−［Ｎ−（４−ピリジルメチル）カルボキシアミド］シチジンモノホスフェート
【０２０２】
【化５４】
【０２０３】
HRMS(FAB+) m/z 458.1082（Ｃ１６Ｈ２０Ｎ５Ｏ９Ｐ＋Ｈ＋とし計算値458.1077）。
【０２０４】
化合物49．５−［Ｎ−（２−［４−イミダゾール］エチル）カルボキシアミド］シチジンモノホスフェート
【０２０５】
【化５５】
【０２０６】
HRMS(FAB+) m/z 461.1186（Ｃ１５Ｈ２１Ｎ６Ｏ９Ｐ＋Ｈ＋とし計算値461.1186）。
【０２０７】
化合物50．５−［Ｎ−（２−［４−ヒドロキシフェニル］エチル）カルボキシアミド］シチジンモノホスフェート
【０２０８】
【化５６】
【０２０９】
化合物51．５−［Ｎ−（２−インドリルエチル）カルボキシアミド］シチジンモノホスフェート
【０２１０】
【化５７】
【０２１１】
実施例５
アミンによる２’−デオキシシチジン修飾
表ＩＶに示す修飾２’−デオキシシチジンを製造するためには以下の操作を使用した。
【０２１２】
一般スキーム
【０２１３】
【化５８】
【０２１４】
特定スキーム
【０２１５】
【化５９】
【０２１６】
【表４】
【０２１７】
ａヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ２（ｄａｂ）３（2.5マイクロモル），Ｐ（ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＳＯ３Ｎａ）３（0.015ミリモル），ＤＡＢＣＯ（0.7ミリモル），ＤＭＳＯ（0.5mL）
ｂヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.Olミリモル），ＤＢＵまたはＤＡＢＣＯ（0.5ミリモル），ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ 93:7（0.5mL）
化合物53．５−（Ｎ−ブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジンモノホスフェート
【０２１８】
【化６０】
【０２１９】
化合物54．５−［Ｎ−（２−［４−ヒドロキシフェニル］エチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシシチジンモノホスフェート
【０２２０】
【化６１】
【０２２１】
実施例６
抗ウイルス効果および細胞毒性の測定
この実施例は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染に伴う細胞変性効果を阻害する本発明のヌクレオチドの能力を証明する。この実施例の実験薬物は、ＣＴ1146-26およびＣＴ1146-28と呼ばれる。
【０２２２】
ＣＴ1146-26は化合物30のモノホスフェートであり、以下の構造を有する。
【０２２３】
【化６２】
【０２２４】
ＣＴ1146-28は化合物41のモノホスフェートであり、以下の構造を有する。
【０２２５】
【化６３】
【０２２６】
アッセイ方法および予備的な結果は以下の項に示す。
【０２２７】
細胞の単離および組織培養
ヒト新生児の包皮は包皮切除後直ちに入手し、バンコマイシン、フンギゾン、ペニシリンおよびゲンタマイシン(すべて標準濃度で添加)を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中に置き４時間組織培養条件（37℃，５％ＣＯ２）に維持した。補充MEMをついで除去し、包皮材料を冷浸漬させる。ついで組織断片を完全に洗浄し（補充ＭＥＭを使用）、残った爽雑赤血球を除去した。
【０２２８】
赤血球を含まない細胞フラグメントをっいでトリプシン溶液（0.25%）に絶えず攪拌しながら15分間暴露した。組織フラグメントを懸濁液から沈着させて上清を集めて滅菌チーズ布を通してＭＥＭおよび10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むフラスコ中にろ過した。チーズ布を10％ＦＢＳ含有する付加的容量のMEMで洗浄した（トリプシン処理操作の間を通してＭＥＭおよび10％ＦＢＳ含有フラスコは氷上に維持させた）。新鮮なトリプシン溶液を用いて、組織フラグメントからさらに細胞移動が認められなくなるまで、トリプシン処理操作を反復した。この過程で移動する細胞は主にヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）である。
【０２２９】
10％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中に含まれる細胞を遠心分離してペレット化し（約1000ＲＰＭ，４℃，10分）、上清は捨てペレットは最少容量の10％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中に懸濁した。単離されたＨＦＦをついでＴ-25組織培養フラスコで平板培養した（用いた一次培養フラスコ数は回収された細胞ペレットの容量に基づいた）。ＨＦＦ単離体をついでコンフルーエントに達するまで組織培養条件（37℃，５％ＣＯ２）に維持した。ＨＦＦの一次培養体は標準的組織培養操作を用い、さらに大きなフォーマットの培養フラスコに継代的に拡大させた。ＨＦＦは継代４までバンコマイシンおよびフンギゾンの存在下に維持した。
【０２３０】
細胞毒性アッセイ：ＩＣ５０の測定
HFFを96-ウエル組織培養プレートに2.5×104細胞/mlの濃度で接種し（培養培地としては10％ＦＢＳ含有ＭＥＭ100μlを使用した）、組織培養条件下に24時間維持したのち、実験に供した。プレートから培地を取り、２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ100μlを96-ウエルプレートの最初の列のセルを除くすべてに加えた。各96-ウエルプレートの最初の列には、125μlの対照培地または実験薬物としてＣＴ1146-26もしくはＣＴ1146-28（所望の総濃度範囲により初期濃度を決定した）を三重にウエルに添加した。細胞およびウイルス対照ウエルの両者には培地単独を添加した。ウエルの第一列の含量をプレートの残りの列を横切って系列的（1:5）に希釈した（Ctus液体取扱装置を用いて、中間混合で25μl容量をウエルからウエルに移す）。希釈後、２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中ＣＭＶ（2500ＰＵＦ／ウエル最終濃度）100μ1を、細胞対照を含むウエルを除く96-ウエルプレートの各ウエルに添加した。細胞対照にはさらに100μ1の２％ＦＢＳ含有ＭＥＭを加えた。96-ウエルプレートをついで組織培養条件下にインキュベートした（２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中ＣＭＶ処置ＨＦＦの総インキュベーション期間14日；培養液への培地添加は適宜行った）。
【０２３１】
インキュベーション期間後、すべてのウエルから培地を採取し、細胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液で30分間染色し、ついで数回の洗浄サイクルによって残った染料を除去した。クリスタルバイオレット染色プレートを24時間風乾したのち、Skatronプレートリーダーを用いてウエルの吸収値（620nm）を読み取った。細胞生存能および相当するＩＣ５０値は、ウイルスに暴露されなかった対照細胞に比較した対照および実験薬物処理細胞の吸収値に基づいて決定された。実験薬物のＩＣ５０値（50％阻害濃度）は細胞増殖の50％阻害に必要な薬物の濃度として測定される。
【０２３２】
半固体オーバーレイを用いるプラーク減少テスト：ＥＤ５０の測定
ＨＦＦを６−ウエル組織培養プレートに平板培養し、使用前約２日間組織培養条件に維持した。アッセイ当日に、実験薬物溶液を２×ＭＥＭ中２×濃度に調製する。っいで実験薬物の系列希釈は２×ＭＥＭを用いて実施した（1:5）。実験20薬物のおおよその濃度範囲は200〜0.06μg/mlである。各薬物または対照溶液はついで0.8％アガロース溶液で1:1に希釈した。アガロース溶液による希釈後、最終実験薬物濃度は100〜0.03μg/mlの範囲とし，最終アガロースオーバーレイ濃度は0.4％であった。ウイルス材料（ＣＭＶ）は10％ＦＢＳ含有ＭＥＭに希釈し、濃度をウエルあたりウイルス産生20〜30プラークの濃度とした。
【０２３３】
培地をＨＦＦ培養液から除去し、各６−ウエルプレートのそれぞれのウエルにウイルス含有培地200μlを添加した（ウイルスに暴露されない細胞を含有する対照ウエルにはMEM200μlを添加した）。アガロース／実験薬物混合物のアリコート（2ml）をついで６−ウエル培養プレートの適当なウエルに二重に適用した。対照群には1:1希釈のＭＥＭ／アガロース2mlアリコートを添加した。ＨＦＦおよび各種処置群を含有するプレートはついで組織培養条件下に14日間インキュベートした。日４および８にさらに1mlの1:1 ２×ＭＥＭ：アガロース混合物を各ウエルに加えた。
【０２３４】
インキュベーション後、ＨＦＦを中性レッドの1.5％溶液で4〜6時間染色した。中性レッド／アガロース／ＭＥＭ混合物を吸引し、10×立体顕微鏡を用いてウイルスプラーク数を計数した。ついで各実験薬物のＥＤ５０値（50％有効濃度）をウイルスの細胞変性効果の50％阻害に必要な実験薬物の濃度として測定する。
【０２３５】
各薬物処置の選択係数（ＳＩ）も測定した（ＳＩ＝ＩＣ５０／ＥＤ５０）。実験薬物の効果が高くその薬物の対応する細胞毒性が低いと、ＳＩ比は高くなる（すなわち、候補化合物のＩＣ５０が1μg/ml，ＥＤ５０が0.01μg/mlであると、ＳＩ＝100であるのに対し、候補化合物のＩＣ５０が0.01μg/ml，ＥＤ５０が1μg/mlであると、ＳＩ＝0.01になる）。
【０２３６】
結果
ヌクレオシドＣＴ1146-26およびＣＴ1146-28を用いた初期の研究では、表Ｖに示すようにＣＭＶに関して本質的な抗ウイルス活性が示唆される。
【０２３７】
【表５】
【０２３８】
ＥＤ５０およびＩＣ５０値はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対するものである。新規なヌクレオシドＣＴl146-26およびＣＴ1146-28はヒトＣＭＶに対して有意な抗ウイルス活性を示す。これらの薬物の有効濃度と細胞毒性の間の本質的な差を考慮すると、観察された結果がこれらの薬物処置に応答した細胞毒性を反映するとは到底考えられない。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸化学の分野、とくに修飾ヌクレオシドの調製方法に関する。ヌクレオシドはピリミジンまたはプリンとすることができる。本発明のピリミジン化合物はピリミジン環の５−または６−位置で修飾することができる。本発明のプリン化合物はプリン環の２−，６−または８−位置で修飾することができる。とくに好ましくは、本発明は、８−位置で修飾されたプリン化合物および５−位置で修飾されたピリミジン化合物の調製方法を包含する。本発明はまたこの方法で製造された修飾ヌクレオシドを包含する。本発明はまた、修飾ヌクレオシドの抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗かび剤もしくは抗新生物剤としてまたはオリゴヌクレオチドの一部としての使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ごく最近まで、オリゴヌクレオチドには厳密な意味での情報的機能以外の機能について考慮されたことはなかった。ある種のオリゴヌクレオチドが興味ある構造的可能性をもち（たとえばｔ−ＲＮＡ）、また他のオリゴヌクレオチドが実際ポリペプチドによって特異的に結合されるという事実にもかかわらず、オリゴヌクレオチドの非情報的能力に焦点を定めた注目はほとんど払われたことがなかったのである。とくにこの理由から、オリゴヌクレオチドを医薬化合物として使用することが考慮されることもほとんどなかった。
【０００３】
現在は、オリゴヌクレオチドの医薬としての使用に関する重要な研究を導いてきた少なくとも３つの領域の探究がある。これらの領域の最前線では、タンパク質の発現防止または多様な細胞機能の遮断のため、アンチセンスオリゴヌクレオチドが生体内のある領域への結合に用いられている。触媒機能をもつＲＮＡ種−リボザイム−の発見は所望の効果を達成する細胞内反応を実施するために作動するＲＮＡが考慮される段階に達している。最後に、セレックス法（ＳＥＬＥＸ；Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）の発見は、生物学的に興味のあるほとんどすべての標的に結合するオリゴヌクレオチドが同定できるという研究コミュニティーを示してきた。
【０００４】
遺伝子発現の制御方法としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用およびオリゴヌクレオチドを医薬素材として使用する可能性は、それらの治療的活性を増大させるため、オリゴヌクレオチドに様々な化学的修飾を導入する研究を促進してきた。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞透過性の増大、ヌクレアーゼおよびオリゴヌクレオチドアナローグの構造もしくは活性を分解もしくは妨害する他の酵素からの生体内におけるそれらの安定化、標的化された核酸に対するそれらの結合の増強、標的化された核酸への配列特異的な結合後におけるある様式での分裂（終結現象）の提供、およびそれらの薬物動態学的性質の改良のために設計される。たとえばＰＣＴ特許出願公開ＷＯ91/14696号（発明の名称：Oligonucleotide-Transport Agent Disulfide Conjugates）には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内侵入を増強する化学的修飾法が記載されている。
【０００５】
エキソヌクレアーゼによる分解に対してオリゴヌクレオチドを抵抗性にするためには様々な方法が使用されてきた。ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ90/15065号（発明の名称：Exonuclease-Resistant Oligonucleotides and Methods for Preparing the Same）には、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に２個またはそれ以上のホスホロアミダイトとホスホロモノチオネートおよび／またはホ２０スホロジチオネート連鎖を導入することによるエキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドの作成方法が記載されている。ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ91/06629号（発明の名称：Oligonucleotide Analogs with Novel Linkages）には、隣接したヌクレオチドの間の１個または２個以上のホスポジエステル結合がＲＮＡもしくはＤＮＡを結合できるホルムアセタール/ケタール型結合によって置換されたオリゴヌクレオチド化合物が記載されている。
【０００６】
エンドヌクレアーゼによる切断に対してＲＮＡを安定化する通常の戦略はリボヌクレオチドの２’位置を修飾することである。塩基特異的なエンドヌクレアーゼ切断に対する安定化のアプローチには、酵素による塩基認識の妨害を使用することができる。この修飾には、数種の戦略たとえば、２’−アミノおよび２’−フルオロ[Hobbsら(1973) Biochemistry 12: 5138; Guschlbauerら(1977) Nucleic Acids Res. 4:1993]および２’−ＯＣＨ３[Shibaharaら(1987) 15: 4403; Sproatら(1989) Nucleic Acids Res. 17: 3373]による修飾が知られている。ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ91/06556号（発明の名称：2' Modified Oligonucleotides）には２’位置に置換基をもっヌクレアーゼ抵抗性オリゴマーが記載されている。ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ91/10671号（発明の名称：Compositions and Methods for Detecting and Modulating RNA Activity and Gene Expression）には２’−位置が化学的に修飾され、触媒、アルキル化または他の方法でＲＮＡの切断に影響することが可能な反応部分、標的化部分、および標的化部分と反応部分を連結するための結合部分を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている。
【０００７】
ピリミジンの５−位置も化学的に修飾することができる。ピリミジンのＣ−５位置への修飾の導入では、ピリミジン特異的エンドヌクレアーゼによる認識の妨害が期待できる。しかしながら、このコンセプトはリボヌクレオチドの２’−位置の修飾の場合のようにクリアーカットではない。
【０００８】
ピリミジンヌクレオシドの５−位置における炭素−炭素結合の形成を触媒するためのパラジウムの使用は既知である。ピリミジンの５−位置の修飾のための優れた方法は米国特許5,428,149号（発明の名称：Method for Palladium Catalysed Carbon-Carbon Coupling and Product）に記載されている。この特許明細書は引用によりその全体が本明細書に導入される。５−位置ピリミジンの修飾の最初の例はBergstrom［Bergstromら(1976) J.Am.Chem.Soc., 98: 1587; (1978) J.Org.Chem. 43: 2870; (1981) J.Org.Chem. 46: 1432 & 2870; (1982) J.Org.Chem., 47: 2174］およびDaves［Arai & Daves (1978) J.Am.Chem.Soc. 100: 287; Lee & Daves (1983) J.Org.Chem. 48: 2870］によって証明された。BergstromおよびDavesはDreyer & Dervan［(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 968］によって用いられたのと同じ５−水銀−デオキシウリジン化合物を、オリゴヌクレオチドに官能基を結合させるために使用した。
【０００９】
ウリジンの５−位置への単純な炭素−炭素カップリング反応のための一方法は、Crisp (1989) Syn.Commun. 19: 2117の論文に記載されている。Crispは、保護された５−ヨード−２’−デオキシウリジンをアセトニトリル中Ｐｄ（II）触媒の存在下にアルケニルスタナンと反応させることによって、５−位が官能化されたデオキシウリジンを形成している。
【００１０】
現在までパラジウム触媒を用いてプリンヌクレオッドを修飾する研究はほとんど行われていない。Aeroschotら［(1993) J.Med.Chem. 36: 2938-2942］ は２−，６−および８−ハロゲン化アデノシンが対称有機錫試薬で修飾できることを報告している。しかしながら、対称有機錫化合物は広範囲には利用できない。Sesslerら［(1993) J.Am.Chem. 115: 10418-10419］は保護された８−プロモグアノシンの４−トリブチル錫ベンズアルデヒドによるアリール化を記載している。しかしながらこの操作を用いた場合、出発原料の有意な量（２８％）が反応しなかった。パラジウム触媒を用いプリンヌクレオシドを修飾する優れた方法が1994年12月01日出願米国特許出願一連番号第08/347,600号（発明の名称：Purine Nucleoside Modification by Palladium Catalyzed Methods）に記載されている。この出願は引用によりその全体が本明細書に導入される。
【００１１】
さらに、パラジウム触媒アミド化の領域においてもほとんど研究は行われていない。Schoenbergら［J.Org.Chem. (1974) 39: 3327］はアリールおよびアルケニルハライドのアミド化を記載しているが、この研究にはヌクレオチド基質もまたＰｄＬ４触媒の使用も含まれたいない。
【００１２】
セレックス（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）は、「核酸抗体」と呼ばれる核酸リガンドたとえば標的分子に選択的に結合する核酸の同定および製造方法である［Tuerk & Gold (1990) Science 249: 505］。この方法は、実際に任意所望の規準の親和性および選択性を達成するために同一の一般的選択スキームを用い、候補混合物からの選択および構造的改良の段階的反復を包含する。核酸混合物に出発し、この方法は、混合物を標的と相互作用に有利な条件下に接触させ、標的分子と相互作用した核酸から非相互作用核酸を分配し、核酸−標的対を解離させ、核酸−標的対から解離した核酸を増幅させて標的と相互作用する核酸が濃縮された核酸の混合物を得、ついで相互作用、分配、解離および増幅の工程を所望の回数再反復する工程を包含する。
【００１３】
本発明の方法は、修飾ヌクレオチドを含有する核酸を製造するためにセレックス法と組み合わせることができる。修飾ヌクレオチドの存在によって、標的分子と相互作用する能力が増強された改変構造を有する核酸を生成させることができる。修飾ヌクレオシドの立体的および電気的影響もヌクレアーゼによる分解を防止するように作用する。オリゴヌクレオチドへの修飾ヌクレオチドの導入は、本技術分野の熟練者には周知の通りである［Dewey,T.ら，J.Am.Chem.Soc. (1995) 117: 8474-8475; Walker G.C.ら，Biochemistry (1975) 14: 817-823; Connolly, B.A. 155-183頁，In Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (1991), F. Eckstein編，IRL Press, NewYork］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の簡単な概要
本発明は、パラジウム触媒と求核試薬および一酸化炭素を用いてヌクレオシド環の様々な位置に化学残基を導入する新規な方法を包含する。好ましくは、修飾はピリミジン環の５−もしくは６−位置またはプリン環の２−，６−または８−位置に行われる。とくに好ましくは、修飾はピリミジン環の５−位置およびプリン環の８−位置に存在する。ヌクレオシド環のとくに好ましい修飾にはアミドまたはエステル残基の導入が包含される。とくに好ましい修飾のためには、求核試薬は一級または二級アミンである。
【００１５】
本発明は、広範囲の修飾ヌクレオシド分子を製造するための反応スキームを包含する。修飾ヌクレオシドの製造において鍵になる要素は求核試薬および一酸化炭素と組み合わせたパラジウム触媒の使用である。
【００１６】
さらに特定すれば、本発明はヌクレオシド出発原料の炭素原子に結合した離脱基を含有するヌクレオシド出発原料をパラジウム触媒の存在下に求核試薬および一酸化炭素と反応させ、っいで修飾ヌクレオシドを単離する工程からなる修飾ヌクレオシドの製造方法を提供する。この方法によって製造される修飾ヌクレオシドも本発明に包含される。
【００１７】
本発明はさらに、修飾ヌクレオシドが２’−位または３’−位で修飾された糖にカップリングさせる安定化された核酸の製造方法を包含する。
【００１８】
本発明の修飾ヌクレオシドは、それらに限定されるものではないが、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗かび剤もしくは抗新生物剤としての使用およびオリゴヌクレオチドの一部としての使用を含む多くの用途を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヌクレオシド出発原料をパラジウム触媒の存在下に求核試薬および一酸化炭素と反応させることによるヌクレオシド環の修飾方法を包含する。本発明はピリミジンおよびプリン両者の修飾を包含する。ピリミジンは以下の構造および慣用位置番号を有する。
【００２０】
【化１】
【００２１】
ピリミジン環は５−または６−位置で修飾することが可能であり、とくに好ましくは５−位置が修飾される。プリンは以下の構造および慣用位置番号を有する。
【００２２】
【化２】
【００２３】
プリンはプリン環の２−，６−または８−位置で修飾することが可能で、とくに好ましくは８−位置が修飾される。本発明によればヌクレオシド環への様々な修飾の導入が意図される。しかしながら、ヌクレオシド環へのとくに好ましい修飾にはアミドまたはエステル残基の導入が包含される。好ましい修飾においては、カルボキシアミド化反応のための求核試薬は一級または二級アミンである。
【００２４】
本発明は、本発明の方法によって製造できるすべての新規化合物に及ぶものである。本発明にはまた、本発明の新規な置換ヌクレオシド１個または２個以上を含有するオリゴヌクレオチドも包含される。本発明はまた、様々な医薬領域とくに抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗かび剤もしくは抗新生物剤としての修飾ヌクレオシドの使用を包含する。
【００２５】
本発明の一般的な反応は以下の式によって特徴づけることができる。
【００２６】
【化３】
【００２７】
本明細書において用いられる「修飾ヌクレオシド」の語は任意のヌクレオシド塩基、ヌクレオシドまたは本発明の方法によって調製されるヌクレオチドを包含することを意図するものである。ヌクレオシド塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの語は本明細書では互いに交換して使用することができる。本発明の修飾ヌクレオシドはその塩基および糖に様々の他の修飾を含有することができる。
【００２８】
「ヌクレオシド出発原料」とは、本明細書においては、受け入れられる離脱基（Ｘ）を有する任意のヌクレオシド塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドと定義される。ヌクレオシド出発原料には、すべてのヌクレオシド、天然に存在するおよび天然に存在しないヌクレオシドの両者が包含される。好ましくは、ヌクレオシド出発原料には、ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンまたはそれらの保護された誘導体を含むプリンおよびピリミジンが包含される。ある実施態様においては、保護された誘導体にはＲ″がジメチルホルムアミド、またはアシル基、好ましくはイソブチリル、アセチル、フェノキシアセチルおよびベンゾイルからなる群より選択されるアシル基である誘導体が包含される。保護されていないヌクレオシドにおいてはＲ″はＨである。離脱基はヌクレオシド出発原料の任意の遊離炭素に結合させることができる。受け入れられる離脱基は触媒反応の間に除去され、Ｃ（Ｏ）ＹＲ化学残基によって置換され本発明の修飾塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを生成する。ヌクレオシド出発原料は、リボース、デオキシリボース、ジデオキシリボースおよびそれらの２’，３’または５’修飾の任意の組合せの形態で結合した糖残基を有することができる。本発明では、上述の糖残基およびそれらの任意の適当な誘導体、たとえばヒドロキシル基が一部またはすべて保護されたリボースまたは２’−デオキシリボースが意図される。たとえば、５’−ヒドロキシルはモノ−，ジ−またはトリ−ホスフェートとして存在することができる。
【００２９】
「ピリミジン出発原料」は本明細書においては、結合した受け入れられる離脱基（Ｘ）を有するピリミジン塩基、ピリミジンヌクレオシドまたはピリミジンヌクレオチドと定義される。ピリミジン出発原料には、すべてのピリミジン、天然に存在するおよび天然に存在しないピリミジンの両者が包含される。好ましくはピリミジン出発原料には、ウラシル、チミンおよびシトシン、またはそれらの保護された誘導体が包含される。離脱基はヌクレオシド塩基の任意の遊離炭素、好ましくは５−または６−位置に結合させることができる。最も好ましい結合位置はピリミジン環の５−位置である。受け入れられる離脱基は触媒反応の間に除去され、化学残基Ｃ（○）ＹＲによって置換されて修飾ピリミジンを生成する。ピリミジン出発原料は、リボース、デオキシリボース、ジデオキシリボースおよびそれらの２’，３’または５’修飾の任意の組合せの形態で結合した糖残基を有することができる。本発明では、上述の糖残基およびそれらの任意の適当な誘導体、たとえばヒドロキシル基が一部またはすべて保護されたリボースまたは２’−デオキシリボースが意図される。たとえば、５’−ヒドロキシルはモノ−，ジ−またはトリ−ボスフェートとして存在することができる。
【００３０】
「プリン出発原料」は、本明細書においては、結合した受け入れられる離脱基（Ｘ）を有するプリン塩基、プリンヌクレオシドまたはプリンヌクレオチドと定義される。プリン出発原料には、アデニンおよびグアニン出発原料またはそれらの保護された誘導体が包含される。離脱基は、プリン塩基の任意の炭素、好ましくはプリン環の２−，６−または８−位置に結合させることができる。最も好ましい結合位置は８−位置である。受け入れられる離脱基は触媒反応の間に除去され、Ｃ（０）ＹＲ化学残基によって置換されて修飾プリンを生成する。プリン出発原料は、リボース、デオキシリボース、ジデオキシリボースおよびそれらの２’，３’または５’修飾の任意の組合せの形態で結合した糖残基を有することができる。本発明では、上述の糖残基およびそれらの任意の適当な誘導体、たとえばヒドロキシル基が一部またはすべて保護されたリボースまたは２’−デオキシリボースが意図される。たとえば、５’−ヒドロキシルはモノ−，ジ−またはトリ−ホスフェートとして存在することができる。
【００３１】
「受け入れられる離脱基」は、本明細書においてはパラジウム（II）の適当な対イオンである基として定義され、本明細書においてはＸで表示される。本発明の最も一般的な実施態様においては、Ｘは本技術分野の熟練者には周知の多くの受け入れられる離脱基の任意の基である。受け入れられる離脱基には、それらに限定されるものではないが、アセテート、トリフルオロアセテート、トリフルオロメチルスルポネート、トシレート、メタンスルポネートならびにホウ酸エステルおよび遊離酸が包含される。好ましい実施態様ではＸはハロゲンであり、最も好ましい実施態様ではＸは臭素またはヨウ素である。離脱基は本技術分野の通常の熟練者には周知の方法によってプリン出発原料の炭素原子に結合させる。
【００３２】
「求核試薬」は本明細書においては、本技術分野の通常の熟練者の理解と同様であると定義される。とくに、求核試薬は離脱基を置換できる電子に富む化学残基である。触媒反応の本質により、上記ヌクレオシド出発原料と上記求核試薬の間にＣＯが挿入される。求核置換反応に使用できる有用な求核試薬は本技術分野の熟練者に知られている通りである。好ましい求核試薬の例には、それらに限定されるものではないが、アミン、アルコールおよびチオールがある。
【００３３】
好ましい実施態様においては、本発明に用いられる求核試薬の一般的構造は、ＲＹＨ（式中，Ｙ＝０，Ｓ，ＮＨまたはＮＲ’）である。ＲおよびＲ’は芳香族、脂肪族または異項環の環状構造の一部であってもよい。本発明の好ましい実施態様においては、求核試薬（ＲＹＨ）は脂肪族または芳香族、一級または二級アミン（環状アミンを含む）、アルコールおよびチオールからなる群より選択され、この場合、ＲおよびＲ′は、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル（直鎖状または分岐状）、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル（直鎖状または分岐状）、アリール、異項環、ならびに天然および非天然アミノ酸からなる群より選択される。
【００３４】
好ましい実施態様においては、求核試薬は構造ＲＹＨを有し、式中、
Ｙは、Ｏ，ＳおよびＮＨからなる群より選択され、
Ｒは、（ＣＨｌ）ｍ（ＣＨ３）ｎ（式中、ｌは０，１または２であり、ｍは０〜１９であり、ｎは０，１，２または３である）であり、この場合１個または２個以上のＨは＝Ｏ，−ＯＨ，＝ＮＨ，ＮＨ２，＋ＮＭｅ３Ｃｌ，
【００３５】
【化４】
【００３６】
またはアミノ酸で置換されていてもよい。
【００３７】
本発明の最も好ましい実施態様においては、求核試薬は以下の群
【００３８】
【化５】
【００３９】
から選択される。
【００４０】
求核試薬のＲおよびＲ’基は、本発明によって調製されるヌクレオシドに広範囲の機能性能力を導入するために使用できる多様な官能基を包含することができる。求核性官能基には本技術分野の通常の熟練者には明らかなように、とくに、アミド、エステル、ニトリル、ニトロ、尿素、ハライド、シアナート、アルコール、アミン、エーテル、チオール、アリール置換基等を包含することができる。求核試薬上の水素または官能基の任意の置換が、定義の目的においては「置換」と呼ばれる。
【００４１】
本発明のパラジウム触媒は、最も一般的には、ＰｄＬ４またはＰｄＬ３（式中、Ｌは一般的に用いられる多くのパラジウムリガンドの一つである）として特徴づけることができる。パラジウム触媒は予め形成されていても（たとえばＰｄＬ４，Ｌはトリフェニル等である）、また本技術分野の通常の熟練者には周知のように、Ｐｄ（０）またはＰｄ（II）およびホスフィンリガンドからインシトゥで作成されてもよい（たとえば、［ビス（ベンジリデンアセトン）Ｐｄ（０）］，Ｐｄ（ＯＡｃ）２など）。ＰｄＬ４は本発明の好ましいパラジウム触媒である。使用できる多様なリガンドの選択は本技術分野の熟練者の技術および知識の範囲内である。一般的なリガンド（Ｌ）の例としては、それらに限定されるものではないが、ＰＰｈ３，（ｏ−ｔｏｌ）３Ｐ，Ｐ（ｐ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ）３，ＣＨ３ＣＮ，ＤＭＳＯ，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），
【００４２】
【化６】
【００４３】
がある。本発明の触媒種の好ましい実施態様においては、ＬはＰＰｈ３（トリフエニルポスフィンもしくはＰ（Ｃ６Ｈ５）３）またはＰ（ｐ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ）３である。本発明の触媒の一部の調製は、1993年06月14日出願の米国特許第5,428,149号（発明の名称：Method for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Products）に記載されている。この記載は引用により本明細書に導入される。
【００４４】
ある種の実施態様においては、反応中に付加的な塩基性、非求核性成分を包含させることが有利である。望ましい塩基の例としてはそれらに限定されるものではないが、Ｅｔ３Ｎ，ＥｔＮ（ｉＰｒ）２，１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）および１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）がある。この反応に使用できる溶媒にはアセトニトリル、１５ジオキサン、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルポキシド、水、ＴＨＦ，ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）およびヘキサメチルポスホン酸トリアミド(HMPT)がある。反応の温度範囲は通常60〜100℃であるが、他の適当な温度範囲も意図される。
【００４５】
本発明の好ましい実施態様においては、以下の反応原料濃度および反応条件が有用である。すなわち、求核試薬は、好ましくは0.0〜2.0Ｍの範囲で使用される。パラジウム触媒の濃度は0.0005〜0.2Ｍの範囲とすることができる。COの圧力は10〜1000psiの範囲とすることができる。ヌクレオシド出発原料の濃度は0.010〜1.0Ｍの範囲とすることができる。
【００４６】
本発明の修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドはオリゴヌクレオチド中に用いることが意図される。ヌクレオシドをオリゴヌクレオチドに導入するための標準的方法に本発明の修飾ヌクレオシドを使用することができる。典型的には、本発明のオリゴヌクレオチドは500塩基未満、通常は100塩基未満、とくに好ましくは50塩基未満である。修飾ヌクレオシドはインビトロ転写操作に適している。修飾ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドは多くの様々な有用性を有する。本発明のオリゴヌクレオチドはとくに生物学的標的と相互作用するか、または促進活性を有する。オリゴヌクレオチドは様々な診断的適用にも使用できる。
【００４７】
ヌクレオシドまたはヌクレオチドは抗新生物、抗細菌、抗かびまたは抗ウイルス活性を示す場合もある。これらのヌクレオシドおよびヌクレオチドには他の治療活性が証明されるものもある。このような活性を測定するための標準アッセイは通常の熟練者には周知である。処方および投与経路は本技術分野の通常の熟練者にはよく知られている。さらに、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチドの送達システムとしてプロドラッグ技術を使用することもできる。とくに、本発明のヌクレオシドまたはヌクレオチドは、様々な性質の中でとくに薬理学的特性および経口利用性を改良するために脂質に結合させることができる。とくに、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチドの５’−ジアシルグリセロ−またはジアルキルグリセロホスフェート誘導体は有用である。修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドはとくに抗ウイルス薬としての適用に興味がもたれる。ヌクレオシドおよび非ヌクレオシドのジアシルグリセロホスフェートは米国特許第5,223,263号に記載のように、薬物動態学的挙動の改良、生物学的利用性の改良、および毒性の改善のために使用されている。この記載は引用により本明細書に導入される。
【００４８】
血清中におけるエンドヌクレアーゼの分解に対する安定性はリガンドのピリミジン位置に２’−デオキシ−２’−フルオロまたは２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドを導入することによって達成できる［Piekenら (1991) Science 253: 314］。本発明の修飾ヌクレオシドはまた、様々な状況で同じく有用な２’−置換種とカップリングきせることもできる。ハロゲン化ヌクレオシドの導入がリガンド−標的間相互作用の増強に価値があることもわかっている。
【実施例】
【００４９】
実施例
以下の実施例は本発明の製造方法および生成物の好ましい実施態様を例示するものであり、本発明をそれらに限定するものではない。
【００５０】
実施例1
プリンのアミンによる修飾
表Ｉの修飾プリンを製造するために以下の一般操作を用いた。
【００５１】
一般スキーム
【００５２】
【化７】
【００５３】
特定スキーム
【００５４】
【化８】
【００５５】
特定スキームに使用できる各種ヌクレオシド塩基出発原料
【００５６】
【化９】
【００５７】
【表１】
【００５８】
ａ反応ではＣＯの挿入がなく求核試薬にヌクレオシド塩基出発原料が直接カップリングした副生成物１６％を生じた。
【００５９】
ｂ反応ではＣＯの挿入がなく求核試薬にヌクレオシド塩基出発原料が直接カップリングした副生成物１５％を生じた。
【００６０】
ｃ反応ではＣＯの挿入がなく求核試薬にヌクレオシド塩基出発原料が直接カップリングした副生成物１４％、およびＣＯが挿入されアミンではなくヒドロキシドが求核試薬として働いた副生成物１４％が生じた。
【００６１】
表Ｉの修飾プリンヌクレオシドの製造は以下の一般操作に従った。
【００６２】
一般操作：１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは内部標準として重水素化溶媒を用いてBruker ARX-300スペクトロメーターによりＣＤ３ＯＤ，Ｄ２Ｏ，ＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−ｄ６中において測定した。陽イオン高速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ＋）はカリフォルニア大学バークレー校質量分析施設にて実施した。
【００６３】
材料：８−ブロモアデノシン、８−ブロモグアノシン二水和物、モルホリン、ｎ−ブチルアミン、イソプロピルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、アニリン、４−アミノメチルピリジン、（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド、アルギニンエチルエステル、エタノールアミン、トリエチルアミン、ＤＭＦおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）はAldrich Chemical Companyから購入し、とくに記載のない限りそのまま使用した。Ｎ−（２−アミノエチル）ビオチンアミド臭化水素酸塩はMolecular Probes, Inc.から購入した。
【００６４】
パラジウム触媒カップリング反応の一般操作：テフロン（登録商標）バルブ付き耐圧ガラス瓶に、表Ｉに記載のヌクレオシド(0.5ミリモル)、表Ｉに記載のアミン求核試薬(1.0ミリモル)、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.0015ミリモル）、トリエチルアミン（1.0ミリモル）およびＤＭＦ（またはＤＭＡ）を添加した。耐圧ガラス瓶から空気を抜きＣＯ（50psi）を充填し、ついで所望の温度に２４時間加熱した。溶媒を除去し、残留物を真空中メタノール（5〜30%）とメチレンクロリドの混合物を用いるシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィー、および／またはメタノールもしくはイソプロパノールによる再結晶によって精製した。カップリング生成物のスペクトルデータは次の通りである。
【００６５】
化合物４：２’，３’，５’−トリアセチル−８−Ｎ−モルホリン−アデノシンカルボキシアミド
【００６６】
【化１０】
【００６７】
HRMS (FAB+) m/z 507.1838（Ｃ２１Ｈ２６Ｎ６Ｏ９＋Ｈ＋として計算値507.1840）。
【００６８】
化合物５：２’，３’，５’−トリアセチル−８−Ｎ−（４−メチルピリジル）−アデノシンカルボキシアミド
【００６９】
【化１１】
【００７０】
HRMS (FAB+) m/z 528.1842（Ｃ２３Ｈ２５Ｎ７Ｏ８＋Ｈ＋として計算値528.1843）。
【００７１】
化合物６：８−Ｎ−（４−ピリジルメチル）−アデノシンカルボキシアミド
【００７２】
【化１２】
【００７３】
HRMS (FAB+) m/z 402.1522（Ｃ１７Ｈ１９Ｎ７Ｏ５＋Ｈ＋として計算値402.1526）。
【００７４】
化合物７：８−Ｎ−（ｎ−ブチル）−アデノシンカルボキシアミド
【００７５】
【化１３】
【００７６】
HRMS (FAB) m/z 367.1723（Ｃ１５Ｈ２３Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値367.1729）。
【００７７】
化合物８：８−Ｎ−（２−プロピル）−アデノシンカルボキシアミド
【００７８】
【化１４】
【００７９】
HRMS (FAB+) m/z 353.1574（Ｃ１４Ｈ２０Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値353.1573）。
【００８０】
化合物９：８−Ｎ−（ｔ−ブチル）−アデノシンカルボキシアミド
【００８１】
【化１５】
【００８２】
HRMS (FAB+) m/z 367.1723（Ｃ１５Ｈ２２Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値367.1717）。
【００８３】
化合物１０：８−Ｎ−フェニル−アデノシンカルボキシアミド
【００８４】
【化１６】
【００８５】
HRMS (FAB+) m/z 387.1419（Ｃ１７Ｈ１８Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値387.1417）。
【００８６】
化合物１１：８−Ｎ−（２−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアンモニウム）エチル）−アデノシンカルボキシアミドクロリド
【００８７】
【化１７】
【００８８】
HRMS (FAB+) m/z 396.1995（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ７Ｏ５Ｃｌ−として計算値396.1995）。
【００８９】
化合物１２：８−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−アデノシンカルボキシアミド
【００９０】
【化１８】
【００９１】
HRMS (FAB+) m/z 355.1372（Ｃ１３Ｈ１８Ｎ６Ｏ６＋Ｈ＋として計算値355.1366）。
【００９２】
化合物１３：８−Ｎ−（アルギニンエチルエステル）−アデノシンカルボキシアミド
【００９３】
【化１９】
【００９４】
HRMS (FAB+) m/z（Ｃ１７Ｈ１８Ｎ６Ｏ５＋Ｈ＋として計算値387.1417）。
【００９５】
化合物１４：８−Ｎ−（ｔ−ブチル）−グアノシンカルボキシアミド
【００９６】
【化２０】
【００９７】
HRMS (FAB+) m/z 383.1676（Ｃ１５Ｈ２２Ｎ６Ｏ６＋Ｈ＋として計算値383.167256）。
【００９８】
化合物１５：８−Ｎ−（２−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアンモニウム）エチル）−グアノシンカルボキシアミドクロリド
【００９９】
【化２１】
【０１００】
HRMS (FAB+) m/z 412.1950（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ７Ｏ６Ｃｌ−として計算値412.1945）。
【０１０１】
化合物１６：８−Ｎ−（アルギニンエチルエステル）−グアノシンカルボキシアミド
【０１０２】
【化２２】
【０１０３】
HRMS (FAB+) m/z 512.2219（Ｃ１９Ｈ２９Ｎ９Ｏ８＋Ｈ＋として計算値512.2217）。
【０１０４】
化合物１７：８−Ｎ−（４−ピリジルメチル）−グアノシンカルボキシアミド
【０１０５】
【化２３】
【０１０６】
HRMS (FAB+) m/z 418.1482（Ｃ１９Ｈ２１Ｎ４Ｏ７＋Ｈ＋として計算値418.1488）。
【０１０７】
化合物１８：８−Ｎ−（２−アミノエチルビオチンアミド）−グアノシンカルボキシアミド
【０１０８】
【化２４】
【０１０９】
HRMS (FAB+) m/z 596.2251（Ｃ２３Ｈ３３Ｎ９Ｏ８＋Ｈ＋として，計算値:596.2264）。
実施例２
アルコールによるプリン修飾
実施例１に略述した一般操作に従い、以下のスキームによって記載される修飾プリンを製造し、以下の結果を得た。
【０１１０】
【化２５】
【０１１１】
実施例３
アミンおよびアルコールによるウリジン修飾
表ＩＩ記載の修飾ウリジンヌクレオシドの製造のために以下の操作を用いた。
【０１１２】
一般スキーム
【０１１３】
【化２６】
【０１１４】
特定スキーム
【０１１５】
【化２７】
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
出発原料の合成
化合物22は文献記載［P.K.Chang & A.D.Welch, J.Med.Chem. (1963), 6: 428］の操作に従って調製した。他の出発原料(化合物19〜21)は以下の操作によって合成した。
【０１１８】
化合物19．５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
300mLのアセトン中5.00g（13.5ミリモル）の５−ヨードウリジンの溶液を攪拌し、これにp−トルエンスルホン酸250mg（1.30ミリモル）を加えた。フラスコには４Åモルキュラーシープを充墳した滴下ろ斗および還流冷却器を装着した。溶液を還流温度に２時間加熱すると固体はすべて溶消した。フラスコを放置して室温まで冷却させ、溶液を真空中で濃縮した。この溶液をアセトンに溶かして、シリカのプラグを通してろ過しろ液を濃縮すると淡黄色の固体が得られた。この物質をエタノールから再結晶すると生成物が白色の針状晶として定量的な収率で生成した。
【０１１９】
化合物20．５’−ＤＭＴ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
1.0mLの無水ＤＭＦおよび1.8mLの無水ピリジン中５−ヨード−２’，３’−イソプロピリデンウリジン820mg（2.00ミリモル）の溶液をアルゴン下に攪拌し、これに４−ジメチルアミノピリジン24.4mg（0.20ミリモル）およびＤＭＴＣｌ（2.20ミリモル）を添加した。溶液を室温で一夜攪拌し、150mLの酢酸エチルで希釈し、3×75mLのＨ２Ｏ，1×50mLの食塩水で洗浄し、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲル上40％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで精製すると1.28g（収率90％）の生成物が白色の固体として得られた。
【０１２０】
化合物21．５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
無水ピリジン1.9mL中1.00g（2.40ミリモル）の５−ヨード−２’，３’−イソプロピリデンウリジンの溶液を攪拌し、これにＴＢＤＭＳＣｌ 724mg（4.80ミリモル）を添加した。溶液を室温で一夜攪拌し、30mLの酢酸エチルで希釈し、3×20mLのＨ２Ｏ，1×20mLの食塩水で洗浄し、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲル上30％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで精製すると1.15g（収率91％）の生成物が白色の固体として得られた。
【０１２１】
修飾ウリジンの合成
表ＩＩに記載の修飾ウリジンは以下のように合成した。
【０１２２】
化合物23．５−（Ｎ−ブチルカルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において300mLのステンレス鋼のパールボンベに５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.351g，1.00ミリモル,3.0mLのＴＨＦ中）、10mLの1.0 Ｍ Ｅｔ３Ｎ／ＴＨＦ（10ミリモル）、ＴＨＦ中1.0Ｍ ｎ−ブチルアミン3.0mL（3.0ミリモル）およびテトラキス（トリフェニル−ホスフィン）パラジウム（0.116g，0.100ミリモル）を加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、空気を除去して100psiのＣＯを３回充墳し、70℃に24時間加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させて、換気フード内で注意深く排気し、揮発成分を真空中で除去した。粗製の反応物質をシリカゲル上５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製すると、生成物が黄色の固体（0.251g，収率65％）として得られた。分析用サンプルはＭｅＯＨから再結晶して羽毛状白色針状晶の生成物として得られた。
【０１２３】
【化２８】
【０１２４】
ＨＲＭＳ：Ｃ１７Ｈ２６Ｎ３Ｏ７として計算値（測定値）384.1771（384.1772）。元素分析：Ｃ１７Ｈ２５Ｎ３Ｏ７として計算値（測定値）：Ｃ 53.26（53.46）；Ｈ 6.57（6.53）；Ｎ 10.96（10.98）。
【０１２５】
化合物24．５−［Ｎ−（４−ピリジルメチル）カルボキシアミド１−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
肉厚耐圧ガラスボンベに224mg（0.542ミリモル）の２’，３’−イソプロピリデン−５−ヨードウリジン、63mg（0.0542ミリモル）のテトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウムおよび固体が溶けるまで無水ピリジンを加えた。ついでピリジンを真空中で除去し、固体を一夜真空下に乾燥した。ついで耐圧ボンべにアルゴン下4mLの無水ＴＨＦ，0.75mLのトリエチルアミン（5.42ミリモル）および0.22mLの４−アミノメチルピリジン（2.17ミリモル）を加えた。ボンベから空気を除去してＣＯを３回充墳し、70℃に2.5日間加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させ、溶媒を真空中で除去し、粗製の物質をシリカゲルのパッド上にジクロロメタンを用い負荷した。パッドをジクロロメタンで溶出し、ついで所望の生成物を10％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出し、真空中で濃縮して淡黄色の固体を得た。この物質をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに付し、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出すると201mg（収率89%）の生成物が淡黄色の固体として得られた。この物質をメタノールから再結晶すると純粋な生成物の分析用サンプルが白色針状晶として得られた。
【０１２６】
【化２９】
【０１２７】
ＨＲＭＳ：Ｃ１９Ｈ２３Ｎ４Ｏ７として、計算値（測定値）419.1567（419.1569）。ＵＶスペクトル：λｍａｘ 276nm（ε＝13730 Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０１２８】
５−〔Ｎ−（４−ピリジルメチル）カルボキシアミド〕−５’−トリホスフェート−ウリジン
記載のようにして調製された５’−ヒドロキシル化合物をLudwig & Eckstein, J.Org.Chem. 1989, 54, 631-635の改変操作を用いて５’−トリホスフェートに変換した。Ｈ２Ｏ中でDowex H 50W×80と70℃で攪拌して２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン保護基を除去したのち、粗製のトリホスフェートを順次ＤＥＡＥ Sephadex陰イオン交換樹脂ならびにＣ18 ＲＰ−ＨＰＬＣ上、移動相として100ｍＭ Ｅｔ３ＮＨ＋ＨＣＯ３−ならびにＣＨ３ＣＮを用いて精製した。化合物の純度は分析用Ｃ18 ＲＰ−ＨＰＬＣ，１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）によってチェックし、その276nm（ε＝13700Ｍ−１ｃｍ−１）におけるＵＶ吸収によって定量した。
【０１２９】
化合物25．５−（Ｎ−フェニルカルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において肉厚ガラスボンベに２’，３’−イソプロピリデン−５−ヨードウリジン（0.261g，0.636ミリモル）、テトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.083g，0.072ミリモル）および4.5mLの1.OM Ｅｔ３Ｎ／ＴＨＦ（4.5ミリモル）を加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、アルゴン下にシリンジを通して0.3mLのアニリンを添加した。フラスコの空気を除去し50psiのＣＯを３回充填し、70℃に２日間加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させ、真空中で濃縮し、シリカゲル上4〜6.5％ＭｅＯＨ・ＮＨ３／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、わずかに黄色の固体が得られた。この物質をメタノールから再結晶すると純粋な生成物52mg（収率20％）が微小白色針状晶として得られた。
【０１３０】
【化３０】
【０１３１】
HRMS：Ｃ１９Ｈ２２Ｎ３Ｏ７として計算値（測定値）404.1458（404.1468）。
【０１３２】
化合物26．５’−ＴＢＤＭＳ−５−（Ｎ−［２−（Ｎ’−トリフルオロアセトアミド）エチル］−カルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.531g，1.01ミリモル）、テトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.350g，0.303ミリモル）、Et3N(0.704mL,5.05ミリモル)および2mLの乾燥5THFを加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、陽性アルゴン気流下に0.203mLのエチレンジアミン(3.03ミリモル)を添加した。ボンベをアルゴン下に密栓して、空気を除去し50psiのＣＯを３回充填し、70℃に一夜加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させ、徐々に排気し、真空中で溶媒を除去し、粗製の物質をシリカゲル上25％ＭｅＯＨ・ＮＨ３／ＥｔＯＡｃを用いて精製10すると、生成物381mg（収率78％）が白色固体として得られた。この物質を以下のようにＮ−トリフルオロアセトアミドとして保護した。上記生成物381.0mg（0.78ミリモル）の無水ＣＨ２Ｃｌ２ 7.0mL中溶液を0℃にて攪拌しながら、乾燥ピリジン（0.126mL，1.6ミリモル）および（ＣＦ３ＣＯ）２Ｏ（0.13mL，0.94ミリモル）を添加した。この溶液を0℃で30分間攪拌したのち0.19mLの（ＣＦ３ＣＯ）２Ｏ（1.33ミリモル）と0.13mLのピリジン（1.7ミリモル）を加えた。30分後、反応混合物を放置して温度を室温まで上昇させ、真空中で濃縮し、シリカゲル上40％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンによるフラッシュクロマトグラフィーで精製すると、生成物174mg（収率38％，ヨードウリジン出発原料から収率30％）が白色固体として得られた。
【０１３３】
【化３１】
【０１３４】
HRMS：Ｃ２３Ｈ３６Ｆ３Ｎ４Ｏ８Ｓｉとして計算値（測定値）581.2254（581.2249）。
【０１３５】
５’−トリホスフェート−５−［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキシアミド］−ウリジン
ウリジンの５’−ＴＢＤＭＳ保護エチレンジアミンアミド（上述のように調製）を、ＣＨ３ＣＮ中Ｅｔ３ＮＨ＋Ｆ−によって２日間脱シリル化し、シリカゲル上20％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用い精製すると、５’−ヒドロキシル化合物が得られ、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ，ならびにＦＡＢ＋マススペクトルによって同定された。この化合物を用い、Ludwig & Eckstein, J.Org.Chem. 1989, 54, 531-635の改変操作によって５’−トリホスフェートを調製した。Ｈ２Ｏ中でDowex H+ 50W×80と70℃で攪拌して２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン保護基を除去したのち、生成物をＣ18 ＲＰ−ＨＰＬＣ上、移動相として0.05Ｍ ＴＢＫ／ＣＨ３ＣＮを用いて精製すると、所望の生成物が9％の収率で得られた。生成物は１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲならびにＦＡＢ＋ＭＳによって確認された。
【０１３６】
化合物27．５’−ＤＭＴ−５−カルボメトキシ−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
グローブボックス内において、肉厚小型ガラスボンベに５’−ＤＭＴ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.10g/mL溶液1.OmL，0.14ミリモル）を加えた。固体テトラキス（トリフェニルボスフィン）パラジウム（16mg，0.014ミリモル）、ついでＴＨＦ中1.0Ｍ溶液として0.70ミリモルのＥｔ３Ｎおよび無水メタノール（Ｍｇ上で真空蒸留）3.0mLを添加した。ボンベの空気を除去し50psiのＣＯを再充填し（３×）、ついで密栓して70℃で３日間攪拌した。容器を排気し、真空中で溶媒を除去し、ついで残留物を最少量の5％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２に溶解してシリカゲルパッド上に負荷し、順次ＣＨ２Ｃｌ２（廃棄）および5％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出した。得られた物質をシリカゲル上、5％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で精製し無色固体の生成物を得た。
【０１３７】
【化３２】
【０１３８】
化合物28．５’−ＴＢＤＭＳ−５−カルボメトキシ−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
この化合物は５’−ＤＭＴ保護化合物について上述したように、出発原料として５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジンを用いるほかは同様に調製された。生成物はシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーによって無色の固体として単離された。
【０１３９】
【化３３】
【０１４０】
ＨＲＭＳ：Ｃ２０Ｈ３３Ｎ２Ｏ８Ｓｉとして計算値（測定値）457.2006（457.2006）。
【０１４１】
化合物29．５’−ＴＢＤＭＳ−５−（Ｎ−ヒスチジノールカルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン100mg/mL溶液3.5mL（0.491ミリモル）、57mgのテトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.0491ミリモル）、0.2mLのトリエチルアミン（1.473ミリモル）、および0.5mLのＴＨＦを加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、アルゴン下に、ＴＢＤＭＳ保護ヒスチジノールの100mg/mL溶液1.9mL（0.736ミリモル）を添加した。ボンベをアルゴン下に密栓して、空気を除去し50psiのＣＯを３回充填し、70℃で48時間加熱した。ボンベを放置して温度を室温まで低下させ、排気し、真空中で溶媒を除去した。粗製の物質をシリカゲル上５〜７％または０〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２の勾配によるクロマトグラフィーで精製すると、所望の生成物0.294g（収率69％）が白色固体として得られた。
【０１４２】
【化３４】
【０１４３】
HRMS：Ｃ４６Ｈ５７Ｎ５Ｏ１０Ｓｉとして計算値（測定値）867.3874（867.3884）。
【０１４４】
化合物30．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［Ｎ−（２−［４−イミダゾール］エチル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.260g，0.496ミリモル）、4mLの乾燥ＴＨＦ，およびテトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.073g，0.063ミリモル）を加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、真空中で溶媒を除去した。アルゴン下に無水Ｅｔ３Ｎ（0.35mL，2.48ミリモル）、ヒスタミン（0.263g，2.37ミリモル）、および2mLのＤＭＳＯ−ｄ６を加えた。ボンベから空気を除去して50psiのＣＯを３回充填し、70℃に２日間加熱した。室温まで冷却したのち、ボンベを注意深く排気し、真空中70℃で溶媒を除去した。粗製の物質をシリカゲル上12％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、181mg（収率68％）のわずかに黄色を帯びた固体が得られた。
【０１４５】
【化３５】
【０１４６】
HRMS：Ｃ２４Ｈ３７Ｎ５Ｏ７Ｓｉとして、計算値（測定値）535.2462（535.2456）。ＵＶスペクトル：λｍａｘ278nm（ε=12930 Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０１４７】
５’−トリホスフェート−５−［Ｎ−（２−［４−イミダゾール］エチル）カルボキシアミド］−ウリジン
ウリジンの５’−ＴＢＤＭＳ保護ヒスタミンアミド（上に調製）をＣＨ３ＣＮ中Ｅｔ３ＮＨ＋Ｆ−によって２日間脱シリル化し、シリカゲル上15％ＮＨ３−ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製すると、ウリジンの５’−ヒドロキシルヒスタミンアミドが得られ、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ，およびＦＡＢ＋マススペクトルによって同定された。この化合物を用いてLudwig & Eckstein, J.Org.Chem. 1989, 54, 531-635の改変操作により５’−トリホスフェートを調製した。Ｈ２０中酸性Dowex樹脂と70℃で処理して２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン保護基を除去したのち、粗製のトリホスフェートを順次ＤＥＡＥ Sephadex陰イオン交換樹脂およびＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ上、移動相として100ｍＭ Ｅｔ３ＮＨ＋ＨＣＯ３−水溶液およびＣＨ３ＣＮを用いて精製した。化合物の純度は分析用Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ，１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）によってチェックし、278nm（ヌクレオシド出発原料にっいてのε２７８＝12930Ｍ−１ｃｍ−１を用いて）におけるＵＶ吸収により定量した。
【０１４８】
化合物31．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
この化合物は、３当量のエタノールアミンおよび３当量のトリエチルアミンを用い70℃で48時間反応させることにより、化合物30について上述したのと同様に調製された。生成物はシリカゲル上６％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製し、無色固体0.173g（収率61％）として得られた。
【０１４９】
【化３６】
【０１５０】
ＥｔＯＡｃ／ヘキサンからの分析用サンプル：ＦＡＢ＋ ＨＲＭＳ：Ｃ２４Ｈ３６Ｎ３Ｏ８Ｓｉとして計算値（測定値）486.2272（486.2271）。元素分析Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ８Ｓｉとして、計算値（測定値）Ｃ 51.94（52.03）；Ｈ 7.26（7.36）；Ｎ 8.65（8.61）。
【０１５１】
化合物32．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［Ｎ−（（２−カルボエトキシ）エチル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
この化合物は、1.0当量のグリシンエチルエステル塩酸塩および３当量のトリエチルアミンを用い、化合物30について上述したのと同様に調製された。生成物はシリカゲル上４％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製し、0.262g（収率80％）の無色の固体として得られた。
【０１５２】
【化３７】
【０１５３】
ＥｔＯＡｃ／ヘキサンからの分析用サンプル：ＦＡＢ＋ＨＲＭＳ：Ｃ２３Ｈ３８Ｎ３Ｏ９Ｓｉとして計算値（測定値）528.2377（528.2382）。元素分析Ｃ２３Ｈ３７Ｎ３Ｏ９Ｓｉとして、計算値（測定値）Ｃ 52.36（52.19）；Ｈ 7.07（6.93）；Ｎ 7.96（7.85）。
【０１５４】
化合物33．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［モルホリンカルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
この化合物は、３当量のモルホリンおよび３当量のトリエチルアミンを用いて化合物30について上述したのと同様に調製された。生成物は、シリカゲル上４％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製し、0.2029（収率68％）の無色固体として得られた。
【０１５５】
【化３８】
【０１５６】
ＥｔＯＡｃ／ヘキサンからの分析用サンプル：ＦＡＢ＋ＨＲＭＳ：Ｃ２３Ｈ３８Ｎ３Ｏ８Ｓｉとして計算値（測定値）512.2428（512.2436）。
【０１５７】
化合物34．５’−ＴＢＤＭＳ−５−［Ｎ−（アルギニンエチルエステル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（0.238g，0.453ミリモル）、アルギニンエチルエステルの二塩酸塩（0.260g，0.94ミリモル）、テトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.052g，0.045ミリモル）、0.32mLのＥｔ３Ｎ（2.3ミリモル）、3mLの乾燥ＴＨＦおよび2mLのＤＭＳＯを加えた。反応容器の空気を除去して50psiのＣＯを３回充填し、70℃に２日間加熱した。粗製混合物を濃縮しシリカゲル上25％ＭｅＯＨ−ＮＨ３／ＥｔＯＡｃを用いてクロマトグラフィーに付すと、生成物0.160g（収率57％）が灰白色の固体として得られた。
【０１５８】
【化３９】
【０１５９】
化合物35．５’−［Ｎ−（２−［３−インドリル］エチル）カルボキシアミド］−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（1.13g，2.14ミリモル）、２−（３−インドリル）エチルアミン（1.70g，10.7ミリモル）およびテトラキス（トリフェニルボスフィン）パラジウム（0.2479，0.214ミリモル）、無水トリエチルアミン（1.5mL，10.7ミリモル）、および10mLのＴＨＦを加えた。ボンベを密栓し、空気を除去して50psiのＣＯを３回充填し、70℃に16時間加熱した。冷却後、溶媒を真空中で除去して、粗製の物質をシリカゲル上0〜5％ＭｅＯＨＮＨ３／ＣＨ２Ｃｌ２を用い精製すると、わずかに不純な黄色固体0.895g（粗製収率78％）が得られた。この物質を、2mLの無水ＣＨ３ＣＮ中Ｅｔ３Ｎ・ＨＦ（1.0g，8.4ミリモル）と室温で16時間攪拌して脱シリル化を行った。反応混合物をＥｔＯＡｃ30mLで希釈し、3×20mLのＨ２Ｏ，10mLの食塩水で抽出し、ついで真空中で濃縮し、シリカゲル上0〜5％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて精製すると、所望の生成物が、淡黄色の固体（0.430g，収率43％）として得られた。
【０１６０】
【化４０】
【０１６１】
５’−トリホスフェート−５−［Ｎ−（２−［３−インドリル］エチル）カルボキシアミド］−ウリジン
ウリジンの５’−ＴＢＤＭＳ保護トリプタミンアミド（上述のように調製）を、ＣＨ３ＣＮ中５当量のＥｔ３ＮＨ＋Ｆ−によって室温で18時間脱シリル化し、シリカゲル上で精製すると、５’−ヒドロキシル化合物が43％の収率で得られ、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲならびにＦＡＢ＋マススペクトルによって同定された。この５’−ヒドロキシル化合物を用いLudwig & Eckstein, J.Org.Chem. 1989, 54, 531-635の改変操作により５’−トリホスフェートを調製した。Ｈ２Ｏ中Dowex H+ 50W×80と70℃で攪拌して２’，３’−Ｏ−イソプロピリデン保護基を除去したのち、生成物をＤＥＡＥ Sephdex上25％ＣＨ３ＣＮを添加した0.05〜1.5Ｍ ＴＢＫ緩衝液ついでＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣにより溶出液として0.05Ｍ ＴＢＫ／ＣＨ３ＣＮ移動相を用いて精製した。トリホスフェートは１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲならびにＦＡＢ＋ＭＳによって確認された。
【０１６２】
化合物36．５’−ＴＢＤＭＳ−５−（Ｎ−［６−アミノヘキシル］−カルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
アルゴン雰囲気のグローブボックス内において、肉厚耐圧ガラスボンベに５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（1.28g，2.40ミリモル）、１，６−ジアミノヘキサン（1.40g，12.0ミリモル）およびテトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（0.83g，0.72ミリモル）ならびに10mLのＴＨＦを加えた。ボンベを密栓し、ボックスから取り出し、アルゴン下にシリンジを通してトリエチルアミン（1.7mL，12.0ミリモル）を添加した。容器の空気を除去して50psiのＣＯを３回充填し、70℃で一夜加熱した。ボンベを冷却させたのち、排気し、溶媒を真空中で除去した。粗製の物質を10mLのメタノールに溶解し、ろ過してパラジウム触媒を除去した。ろ液を濃縮し、シリカゲル上ＣＨ２Ｃｌ２中15〜25％ＮＨ３−ＣＨ３ＯＨを用いて精製すると、所望の生成物が白色の固体（0.812g，収率62％）として得られた。
【０１６３】
【化４１】
【０１６４】
５−（Ｎ−〔６−Ｎ’−トリフルオロアセトアミドヘキシル〕−カルボキシアミド）−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
上記化合物の遊離アミンを以下の方法で保護した。触媒量のトリエチルアミンを含むアセトニトリル中に化合物36を溶解し、この溶液を撹搾しながら、2.0当量のトリフルオロ酢酸エチルを添加した。この溶液を室温で18時間攪拌し、さらに1.6当量のトリフルオロ酢酸エチルを加え、20時間攪拌した。濃縮し、シリカゲル上1〜5%MeOH/CH2C1、を用いて精製すると、所望のトリフルオロアセトアミドが25%の収率で得られ、１Ｈ ＮＭＲで確認された。この化合物をついでＣＨ３ＣＮ中５当量のＥｔ３Ｎ・Ｈ＋Ｆ−により室温で18時間脱シリル化し、シリカゲル上にて精製すると、５−ヒドロキシル化合物が定量的収率で得られ、その１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより確認された。
【０１６５】
化合物37〜43の一般操作
テフロン（登録商標）バルブ装着ガラス耐圧反応容器に、ヌクレオチド（0.1ミリモル）、アミン（0.5ミリモル，５当量）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.01ミリモル，0.1当量）および溶媒としてジメチルスルポキシド（0.5mL）を加えた。反応容器の空気を除去してＣＯ（50psi）を３回充填したのち、60℃に24時間加熱した。粗製の混合物をDEAE Sephadex A-25陰イオン交換カラム上において0.05M〜1.0Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液の直線勾配を用いて精製した。化合物の特性は以下の通りである。
【０１６６】
化合物37．
【０１６７】
【化４２】
【０１６８】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 459.0909（Ｃ１６Ｈ１９Ｎ４Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋として、計算値459.0917）。
【０１６９】
化合物38．
【０１７０】
【化４３】
【０１７１】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 454.0858（Ｃ１４Ｈ２０Ｎ３Ｏ１２Ｐ＋Ｈ＋として計算値454.086153）。
【０１７２】
化合物39．
【０１７３】
【化４４】
【０１７４】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 488.1082（Ｃ１８Ｈ２２Ｎ３Ｏ１１Ｐ＋Ｈ＋として、計算値488.1084）。
【０１７５】
化合物40．
【０１７６】
【化４５】
【０１７７】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 424.1129（Ｃ１４Ｈ２２Ｎ３Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋として、計算値424.1121）。
【０１７８】
化合物41．
【０１７９】
【化４６】
【０１８０】
化合物42．
【０１８１】
【化４７】
【０１８２】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 424.1121（Ｃ１４Ｈ２２Ｎ３Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋として、計算値424.1121）。
【０１８３】
化合物43．
【０１８４】
【化４８】
【０１８５】
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）m/z 511.1236（Ｃ２０Ｈ２３Ｎ４Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋として、計算値511.1230）。
実施例４
アミンによるシチジンの修飾
表ＩＩＩに示す修飾シチジンを製造するためには以下の操作を使用した。
【０１８６】
一般スキーム
【０１８７】
【化４９】
【０１８８】
特定スキーム
【０１８９】
【化５０】
【０１９０】
【表３】
【０１９１】
ａヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.01ミリモル），ＤＢＵ（0.5ミリモル），ＤＭＳＯ（0.5mL）
ｂヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ２（ｄａｂ）３（2.5マイクロモル），Ｐ（ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＳＯ３Ｎａ）３（0.015ミリモル），ＤＡＢＣＯ（0.7ミリモル），ＤＭＳＯ（0.5mL）
ｃヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.01ミリモル），ＤＢＵまたはＤＡＢＣＯ（0.5ミリモル），ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ93:7（0.5mL）
一般情報
５−ヨードシチジン一リン酸塩は文献（Voytek, P., Chang, P.K., Prusoff, W.H., J.Bio1.Chem. 1971, 246, 1432）記載の操作に従って合成した。トリスルホン化トリフェニルポスフィンナトリウム塩はStrem Chemicals, Inc.から購入した。その他の化合物はすべてAldrich Chemical Co.から購入した。ｎ−ブチルアミン、トリエチルアミン、および１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）はAldrich Chemical Co.から購入し、ＣａＨ２から蒸留した。イソブチルアミン、チラミン塩酸塩、および４−アミノ酪酸（Acros Organics）はそのまま使用した。ヒスタミンはSigma Chemical Co.から購入し、そのまま使用した。シチジン一リン酸塩、Ｐｄ２（ｄａｂ）３，テトラキス（トリフェニルポスフィン）パラジウム（０），ＤＡＢＣＯ，４−アミノメチルピリジンおよびＤＭＳＯはAldrich Chemical Co.から購入し、そのまま使用した。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルはBruker ARX-300スペクトロメーターを用い溶媒の共鳴を参照してＣＤ３ＯＤ，Ｄ２Ｏ，ＣＤＣｌ３またはＤＭＳＯ−ｄ６中において測定した。高速原子衝撃質量スペクトル（ＨＲ ＦＡＢ ＭＳ）はＶＧ70ＳＥ ＆ ＺＡＢ２−ＥＱ／ＦＡＢ（＋）を用いて測定した。
【０１９２】
一般操作
表ＩＩＩの化合物を合成する一般操作を示す。テフロン（登録商標）バルブ付き肉厚耐圧ガラス反応器にヌクレオシド（0.1ミリモル）、アミン（0.5ミリモル），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.01ミリモル），ＤＢＵ（0.5ミリモル），ＤＭＳＯ（0.5mL）を添加した。反応器の空気を抜き、ＣＯ（50psi）を３回充填したのち、60℃に24時間加熱した。粗製の混合物を逆相ＨＰＬＣによって定量的に分析した。生成物はDEAE Sephadex A-25イオン交換カラム上トリエチルアンモニウム重炭酸塩の直線勾配（0.05M〜0.1M）を用い、ついで製造用Ｃ-18逆相ＨＰＬＣ（0.05Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩／ＭｅＯＨ）によって精製した。表ＩＩＩに掲げた化合物の特性は以下の通りである。
【０１９３】
化合物45．５−（Ｎ−ブチルカルボキシアミド）−シチジンモノホスフェート
【０１９４】
【化５１】
【０１９５】
HRMS(FAB+) m/z 423.1275（Ｃ１４Ｈ２３Ｎ４Ｏ９Ｐ＋Ｈ＋として計算値423.1281）。
【０１９６】
化合物46．５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−シチジンモノホスフェート
【０１９７】
【化５２】
【０１９８】
化合物47．５−（Ｎ−イソプロピルカルボキシアミド）−シチジンモノホスフェート
【０１９９】
【化５３】
【０２００】
HRMS(FAB+) m/z 409.1119（Ｃ１３Ｈ２１Ｎ４Ｏ９Ｐ＋Ｈ＋とし計算値409.1124）。
【０２０１】
化合物48．５−［Ｎ−（４−ピリジルメチル）カルボキシアミド］シチジンモノホスフェート
【０２０２】
【化５４】
【０２０３】
HRMS(FAB+) m/z 458.1082（Ｃ１６Ｈ２０Ｎ５Ｏ９Ｐ＋Ｈ＋とし計算値458.1077）。
【０２０４】
化合物49．５−［Ｎ−（２−［４−イミダゾール］エチル）カルボキシアミド］シチジンモノホスフェート
【０２０５】
【化５５】
【０２０６】
HRMS(FAB+) m/z 461.1186（Ｃ１５Ｈ２１Ｎ６Ｏ９Ｐ＋Ｈ＋とし計算値461.1186）。
【０２０７】
化合物50．５−［Ｎ−（２−［４−ヒドロキシフェニル］エチル）カルボキシアミド］シチジンモノホスフェート
【０２０８】
【化５６】
【０２０９】
化合物51．５−［Ｎ−（２−インドリルエチル）カルボキシアミド］シチジンモノホスフェート
【０２１０】
【化５７】
【０２１１】
実施例５
アミンによる２’−デオキシシチジン修飾
表ＩＶに示す修飾２’−デオキシシチジンを製造するためには以下の操作を使用した。
【０２１２】
一般スキーム
【０２１３】
【化５８】
【０２１４】
特定スキーム
【０２１５】
【化５９】
【０２１６】
【表４】
【０２１７】
ａヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ２（ｄａｂ）３（2.5マイクロモル），Ｐ（ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＳＯ３Ｎａ）３（0.015ミリモル），ＤＡＢＣＯ（0.7ミリモル），ＤＭＳＯ（0.5mL）
ｂヌクレオチド（0.1ミリモル），ＲＮＨ２（0.5ミリモル），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（0.Olミリモル），ＤＢＵまたはＤＡＢＣＯ（0.5ミリモル），ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ 93:7（0.5mL）
化合物53．５−（Ｎ−ブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジンモノホスフェート
【０２１８】
【化６０】
【０２１９】
化合物54．５−［Ｎ−（２−［４−ヒドロキシフェニル］エチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシシチジンモノホスフェート
【０２２０】
【化６１】
【０２２１】
実施例６
抗ウイルス効果および細胞毒性の測定
この実施例は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染に伴う細胞変性効果を阻害する本発明のヌクレオチドの能力を証明する。この実施例の実験薬物は、ＣＴ1146-26およびＣＴ1146-28と呼ばれる。
【０２２２】
ＣＴ1146-26は化合物30のモノホスフェートであり、以下の構造を有する。
【０２２３】
【化６２】
【０２２４】
ＣＴ1146-28は化合物41のモノホスフェートであり、以下の構造を有する。
【０２２５】
【化６３】
【０２２６】
アッセイ方法および予備的な結果は以下の項に示す。
【０２２７】
細胞の単離および組織培養
ヒト新生児の包皮は包皮切除後直ちに入手し、バンコマイシン、フンギゾン、ペニシリンおよびゲンタマイシン(すべて標準濃度で添加)を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中に置き４時間組織培養条件（37℃，５％ＣＯ２）に維持した。補充MEMをついで除去し、包皮材料を冷浸漬させる。ついで組織断片を完全に洗浄し（補充ＭＥＭを使用）、残った爽雑赤血球を除去した。
【０２２８】
赤血球を含まない細胞フラグメントをっいでトリプシン溶液（0.25%）に絶えず攪拌しながら15分間暴露した。組織フラグメントを懸濁液から沈着させて上清を集めて滅菌チーズ布を通してＭＥＭおよび10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むフラスコ中にろ過した。チーズ布を10％ＦＢＳ含有する付加的容量のMEMで洗浄した（トリプシン処理操作の間を通してＭＥＭおよび10％ＦＢＳ含有フラスコは氷上に維持させた）。新鮮なトリプシン溶液を用いて、組織フラグメントからさらに細胞移動が認められなくなるまで、トリプシン処理操作を反復した。この過程で移動する細胞は主にヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）である。
【０２２９】
10％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中に含まれる細胞を遠心分離してペレット化し（約1000ＲＰＭ，４℃，10分）、上清は捨てペレットは最少容量の10％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中に懸濁した。単離されたＨＦＦをついでＴ-25組織培養フラスコで平板培養した（用いた一次培養フラスコ数は回収された細胞ペレットの容量に基づいた）。ＨＦＦ単離体をついでコンフルーエントに達するまで組織培養条件（37℃，５％ＣＯ２）に維持した。ＨＦＦの一次培養体は標準的組織培養操作を用い、さらに大きなフォーマットの培養フラスコに継代的に拡大させた。ＨＦＦは継代４までバンコマイシンおよびフンギゾンの存在下に維持した。
【０２３０】
細胞毒性アッセイ：ＩＣ５０の測定
HFFを96-ウエル組織培養プレートに2.5×104細胞/mlの濃度で接種し（培養培地としては10％ＦＢＳ含有ＭＥＭ100μlを使用した）、組織培養条件下に24時間維持したのち、実験に供した。プレートから培地を取り、２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ100μlを96-ウエルプレートの最初の列のセルを除くすべてに加えた。各96-ウエルプレートの最初の列には、125μlの対照培地または実験薬物としてＣＴ1146-26もしくはＣＴ1146-28（所望の総濃度範囲により初期濃度を決定した）を三重にウエルに添加した。細胞およびウイルス対照ウエルの両者には培地単独を添加した。ウエルの第一列の含量をプレートの残りの列を横切って系列的（1:5）に希釈した（Ctus液体取扱装置を用いて、中間混合で25μl容量をウエルからウエルに移す）。希釈後、２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中ＣＭＶ（2500ＰＵＦ／ウエル最終濃度）100μ1を、細胞対照を含むウエルを除く96-ウエルプレートの各ウエルに添加した。細胞対照にはさらに100μ1の２％ＦＢＳ含有ＭＥＭを加えた。96-ウエルプレートをついで組織培養条件下にインキュベートした（２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中ＣＭＶ処置ＨＦＦの総インキュベーション期間14日；培養液への培地添加は適宜行った）。
【０２３１】
インキュベーション期間後、すべてのウエルから培地を採取し、細胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液で30分間染色し、ついで数回の洗浄サイクルによって残った染料を除去した。クリスタルバイオレット染色プレートを24時間風乾したのち、Skatronプレートリーダーを用いてウエルの吸収値（620nm）を読み取った。細胞生存能および相当するＩＣ５０値は、ウイルスに暴露されなかった対照細胞に比較した対照および実験薬物処理細胞の吸収値に基づいて決定された。実験薬物のＩＣ５０値（50％阻害濃度）は細胞増殖の50％阻害に必要な薬物の濃度として測定される。
【０２３２】
半固体オーバーレイを用いるプラーク減少テスト：ＥＤ５０の測定
ＨＦＦを６−ウエル組織培養プレートに平板培養し、使用前約２日間組織培養条件に維持した。アッセイ当日に、実験薬物溶液を２×ＭＥＭ中２×濃度に調製する。っいで実験薬物の系列希釈は２×ＭＥＭを用いて実施した（1:5）。実験20薬物のおおよその濃度範囲は200〜0.06μg/mlである。各薬物または対照溶液はついで0.8％アガロース溶液で1:1に希釈した。アガロース溶液による希釈後、最終実験薬物濃度は100〜0.03μg/mlの範囲とし，最終アガロースオーバーレイ濃度は0.4％であった。ウイルス材料（ＣＭＶ）は10％ＦＢＳ含有ＭＥＭに希釈し、濃度をウエルあたりウイルス産生20〜30プラークの濃度とした。
【０２３３】
培地をＨＦＦ培養液から除去し、各６−ウエルプレートのそれぞれのウエルにウイルス含有培地200μlを添加した（ウイルスに暴露されない細胞を含有する対照ウエルにはMEM200μlを添加した）。アガロース／実験薬物混合物のアリコート（2ml）をついで６−ウエル培養プレートの適当なウエルに二重に適用した。対照群には1:1希釈のＭＥＭ／アガロース2mlアリコートを添加した。ＨＦＦおよび各種処置群を含有するプレートはついで組織培養条件下に14日間インキュベートした。日４および８にさらに1mlの1:1 ２×ＭＥＭ：アガロース混合物を各ウエルに加えた。
【０２３４】
インキュベーション後、ＨＦＦを中性レッドの1.5％溶液で4〜6時間染色した。中性レッド／アガロース／ＭＥＭ混合物を吸引し、10×立体顕微鏡を用いてウイルスプラーク数を計数した。ついで各実験薬物のＥＤ５０値（50％有効濃度）をウイルスの細胞変性効果の50％阻害に必要な実験薬物の濃度として測定する。
【０２３５】
各薬物処置の選択係数（ＳＩ）も測定した（ＳＩ＝ＩＣ５０／ＥＤ５０）。実験薬物の効果が高くその薬物の対応する細胞毒性が低いと、ＳＩ比は高くなる（すなわち、候補化合物のＩＣ５０が1μg/ml，ＥＤ５０が0.01μg/mlであると、ＳＩ＝100であるのに対し、候補化合物のＩＣ５０が0.01μg/ml，ＥＤ５０が1μg/mlであると、ＳＩ＝0.01になる）。
【０２３６】
結果
ヌクレオシドＣＴ1146-26およびＣＴ1146-28を用いた初期の研究では、表Ｖに示すようにＣＭＶに関して本質的な抗ウイルス活性が示唆される。
【０２３７】
【表５】
【０２３８】
ＥＤ５０およびＩＣ５０値はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対するものである。新規なヌクレオシドＣＴl146-26およびＣＴ1146-28はヒトＣＭＶに対して有意な抗ウイルス活性を示す。これらの薬物の有効濃度と細胞毒性の間の本質的な差を考慮すると、観察された結果がこれらの薬物処置に応答した細胞毒性を反映するとは到底考えられない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾ヌクレオシドの製造方法において、
ヌクレオシド出発原料の炭素原子に結合した離脱基を有するヌクレオシド出発原料をパラジウム触媒の存在下に求核試薬および一酸化炭素と反応させ、ついで上記修飾ヌクレオシドを単離する工程からなる方法。
【請求項２】
ヌクレオシド出発原料は２−，６−または８−位置に結合した離脱基を含有するプリン出発原料である「請求項１」記載の方法。
【請求項３】
離脱基はプリン環の８−位置に結合している「請求項２」記載の方法。
【請求項４】
プリン出発原料はアデニンである「請求項２」記載の方法。
【請求項５】
アデニンは８−ハロ−アデニンである「請求項４」記載の方法。
【請求項６】
８−ハロ−アデニンは８−ヨード−アデニンおよび８−プロモ−アデニンからなる群より選択される「請求項５」記載の方法。
【請求項７】
プリン出発原料はグアニンである「請求項２」記載の方法。
【請求項８】
グアニンは８−ハロ−グアニンである「請求項７」記載の方法。
【請求項９】
８−ハローグアニンは８−ヨード−グアニンおよび８−プロモーグアニンからなる群より選択される「請求項８」記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレオシド出発原料は５−または６−位置に結合した離脱基を含有するピリミジン出発原料である「請求項１」記載の方法。
【請求項１１】
離脱基はピリミジン環の５−位置に結合する「請求項１０」記載の方法。
【請求項１２】
ピリミジン出発原料はシチジンである「請求項１０」記載の方法。
【請求項１３】
シチジンは５−ハロ−シチジンである「請求項１２」記載の方法。
【請求項１４】
５−ハロ−シチジンは５−ヨード−シチジン、５−プロモ−シチジンおよび５−ヨードシチジン−５’−モノホスフェートからなる群より選択される「請求項１３」記載の方法。
【請求項１５】
ピリミジン出発原料はウリジンである「請求項１０」記載の方法。
【請求項１６】
ウリジンは５−ハローウリジンである「請求項１５」記載の方法。
【請求項１７】
５−ハローウリジンは５−ヨード−ウリジン、５−プロモ−ウリジンおよび５−ヨードウリジン−５９−モノホスフェートからなる群より選択される「請求項１６」記載の方法。
【請求項１８】
５−ヨード−ウリジンは５’−ＤＭＴ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジンおよび５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジンからなる群より選択される「請求項１７」記載の方法。
【請求項１９】
求核試薬はアミン、アルコールおよびチオールからなる群より選択される「請求項１」記載の方法。
【請求項２０】
求核試薬は、式：ＲＹＨ
（式中，Ｙは０，Ｓ，ＮＨまたはＮＲ′からなる群より選択され、
ＲおよびＲ′は独立にＣ１〜Ｃ２０アルキル（直鎖状または分岐状）、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル（直鎖状または分岐状）、アリールおよびアミノ酸からなる群より選択され、この場合、ＲおよびＲ′は芳香族、脂肪族または異項環の環構造の一部であってもよい）を有する「請求項１９」記載の方法。
【請求項２１】
ＲおよびＲ′はアミド、エステル、ニトリル、ニトロ、尿素、ハライド、シアナート、アルコール、アミン、エーテル、チオールおよびアリールからなる群より独立に選択される官能基で置換されている「請求項２０」記載の方法。
【請求項２２】
Ｙは、Ｏ，ＳおよびＮＨからなる群より選択され、
Ｒは、（ＣＨｌ）ｍ（ＣＨ３）ｎ（式中、ｌは０，１または２であり、ｍは０〜１９であり、ｎは０，１，２または３である）であり、この場合１個または２個以上のＨは＝Ｏ，−ＯＨ，＝ＮＨ，ＮＨ２，＋ＮＭｅ３Ｃｌ，
【化１】
またはアミノ酸で置換されていてもよい「請求項２０」記載の方法。
【請求項２３】
求核試薬は以下の化合物
【化２】
からなる群より選択される「請求項２０」記載の方法。
【請求項２４】
パラジウム触媒は、式：ＰｄＬ３またはＰｄＬ４
［式中、Ｌは，Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３，Ｐ（ｐ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ）３，
（ｏ−ｔｏ１）３Ｐ，ＣＨ３ＣＮ，ＤＭＳＯ，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），
【化３】
からなる群より選択される］である「請求項１」記載の方法。
【請求項２５】
パラジウム触媒は、Ｐｄ（Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３）４またはＰ（ｐ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ）３である「請求項２４」記載の方法。
【請求項２６】
離脱基はハロゲン、アセテート、トリフルオロアセテート、トシレート、メチルスルポネート、トリフルオロメチルスルポネート、ホウ酸エステルおよびホウ酸からなる群より選択される「請求項１」記載の方法。
【請求項２７】
離脱基はハロゲンである「請求項２６」記載の方法。
【請求項２８】
修飾ヌクレオシドの調製は、ＴＨＦ，水、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセ，トアミド、ジメチルスルポキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、およびヘキサメチルポスホン酸トリアミドからなる群より選択される溶媒中で突施される「請求項１」記載の方法。
【請求項２９】
「請求項１」記載の方法によって調製された修飾ヌクレオシド。
【請求項３０】
「請求項２」記載の方法によって調製されたプリン環の２−，６−または８−位置において修飾されたプリンヌクレオシド。
【請求項３１】
「請求項１０」記載の方法によって調製されたピリミジン環の５−または６−位置において修飾されたピリミジンヌクレオシド。
【請求項３２】
化合物
【化４】
［式中、Ｙは，Ｏ，Ｓ，ＮＨまたはＮＲ′からなる群より選択され、
ＲおよびＲ′は独立にＣ１〜Ｃ２０アルキル（直鎖状または分岐状）、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル（直鎖状または分岐状）、アリール、異項環、天然アミノ酸および非天然アミノ酸からなる群より選択され、この場合、ＲおよびＲ′は芳香族、脂肪族または異項環の環構造の一部であってもよく、
Ｒ″は，Ｈおよびアシルからなる群より選択され、
Ｚは，リボース、デオキシリボース、ジデオキシリボースおよびそれらの２’，３’，および５’修飾の組合せからなる群より選択される］からなる群より選択される化合物。
【請求項３３】
Ｙは，Ｏ，ＳおよびＮＨからなる群より選択され、
Ｒは、（ＣＨｌ）ｍ（ＣＨ３）ｎ（式中、ｌは０，１または２であり、ｍは０〜１９であり、ｎは１，２または３である）であり、この場合１個または２個以上のＨは、＝Ｏ，−ＯＨ，＝ＮＨ，ＮＨ２，＋ＮＭｅ３Ｃｌ，
【化５】
またはアミノ酸で置換されていてもよい「請求項３２」記載の化合物。
【請求項３４】
化合物
【化６】
【化７】
からなる群より選択される「請求項３２」記載の化合物。
【請求項３５】
化合物
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
からなる群より選択される「請求項３２」記載の化合物。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドの部分として導入される「請求項３２」記載の化合物。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドは、リボ核酸である「請求項３６」記載の化合物。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸である「請求項３６」記載の化合物。
【請求項３９】
「請求項３２」記載の化合物の治療有効量を患者に投与することからなるウイルス活性を阻害する方法。
【請求項４０】
サイトメガロウイルス活性を阻害する「請求項３９」記載の方法。
【請求項４１】
ＹはＮＨであり、ＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキルである「請求項３９」記載の方法。
【請求項４２】
化合物は
【化１２】
からなる群より選択される「請求項３９」記載の方法。
【請求項４３】
「請求項３２」記載の化合物の治療有効量を患者に投与することからなるウイルス感染状態の処置方法。
【請求項４４】
ウイルス感染状態はサイトメガロウイルスによって引き起こされる「請求項４３」記載の方法。
【請求項４５】
ＹはＮＨであり、ＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキルである「請求項４３」記載の方法。
【請求項４６】
化合物は
【化１３】
からなる群より選択される「請求項４３」記載の方法。
【請求項１】
修飾ヌクレオシドの製造方法において、
ヌクレオシド出発原料の炭素原子に結合した離脱基を有するヌクレオシド出発原料をパラジウム触媒の存在下に求核試薬および一酸化炭素と反応させ、ついで上記修飾ヌクレオシドを単離する工程からなる方法。
【請求項２】
ヌクレオシド出発原料は２−，６−または８−位置に結合した離脱基を含有するプリン出発原料である「請求項１」記載の方法。
【請求項３】
離脱基はプリン環の８−位置に結合している「請求項２」記載の方法。
【請求項４】
プリン出発原料はアデニンである「請求項２」記載の方法。
【請求項５】
アデニンは８−ハロ−アデニンである「請求項４」記載の方法。
【請求項６】
８−ハロ−アデニンは８−ヨード−アデニンおよび８−プロモ−アデニンからなる群より選択される「請求項５」記載の方法。
【請求項７】
プリン出発原料はグアニンである「請求項２」記載の方法。
【請求項８】
グアニンは８−ハロ−グアニンである「請求項７」記載の方法。
【請求項９】
８−ハローグアニンは８−ヨード−グアニンおよび８−プロモーグアニンからなる群より選択される「請求項８」記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレオシド出発原料は５−または６−位置に結合した離脱基を含有するピリミジン出発原料である「請求項１」記載の方法。
【請求項１１】
離脱基はピリミジン環の５−位置に結合する「請求項１０」記載の方法。
【請求項１２】
ピリミジン出発原料はシチジンである「請求項１０」記載の方法。
【請求項１３】
シチジンは５−ハロ−シチジンである「請求項１２」記載の方法。
【請求項１４】
５−ハロ−シチジンは５−ヨード−シチジン、５−プロモ−シチジンおよび５−ヨードシチジン−５’−モノホスフェートからなる群より選択される「請求項１３」記載の方法。
【請求項１５】
ピリミジン出発原料はウリジンである「請求項１０」記載の方法。
【請求項１６】
ウリジンは５−ハローウリジンである「請求項１５」記載の方法。
【請求項１７】
５−ハローウリジンは５−ヨード−ウリジン、５−プロモ−ウリジンおよび５−ヨードウリジン−５９−モノホスフェートからなる群より選択される「請求項１６」記載の方法。
【請求項１８】
５−ヨード−ウリジンは５’−ＤＭＴ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジンおよび５’−ＴＢＤＭＳ−５−ヨード−２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジンからなる群より選択される「請求項１７」記載の方法。
【請求項１９】
求核試薬はアミン、アルコールおよびチオールからなる群より選択される「請求項１」記載の方法。
【請求項２０】
求核試薬は、式：ＲＹＨ
（式中，Ｙは０，Ｓ，ＮＨまたはＮＲ′からなる群より選択され、
ＲおよびＲ′は独立にＣ１〜Ｃ２０アルキル（直鎖状または分岐状）、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル（直鎖状または分岐状）、アリールおよびアミノ酸からなる群より選択され、この場合、ＲおよびＲ′は芳香族、脂肪族または異項環の環構造の一部であってもよい）を有する「請求項１９」記載の方法。
【請求項２１】
ＲおよびＲ′はアミド、エステル、ニトリル、ニトロ、尿素、ハライド、シアナート、アルコール、アミン、エーテル、チオールおよびアリールからなる群より独立に選択される官能基で置換されている「請求項２０」記載の方法。
【請求項２２】
Ｙは、Ｏ，ＳおよびＮＨからなる群より選択され、
Ｒは、（ＣＨｌ）ｍ（ＣＨ３）ｎ（式中、ｌは０，１または２であり、ｍは０〜１９であり、ｎは０，１，２または３である）であり、この場合１個または２個以上のＨは＝Ｏ，−ＯＨ，＝ＮＨ，ＮＨ２，＋ＮＭｅ３Ｃｌ，
【化１】
またはアミノ酸で置換されていてもよい「請求項２０」記載の方法。
【請求項２３】
求核試薬は以下の化合物
【化２】
からなる群より選択される「請求項２０」記載の方法。
【請求項２４】
パラジウム触媒は、式：ＰｄＬ３またはＰｄＬ４
［式中、Ｌは，Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３，Ｐ（ｐ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ）３，
（ｏ−ｔｏ１）３Ｐ，ＣＨ３ＣＮ，ＤＭＳＯ，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），
【化３】
からなる群より選択される］である「請求項１」記載の方法。
【請求項２５】
パラジウム触媒は、Ｐｄ（Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３）４またはＰ（ｐ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａ）３である「請求項２４」記載の方法。
【請求項２６】
離脱基はハロゲン、アセテート、トリフルオロアセテート、トシレート、メチルスルポネート、トリフルオロメチルスルポネート、ホウ酸エステルおよびホウ酸からなる群より選択される「請求項１」記載の方法。
【請求項２７】
離脱基はハロゲンである「請求項２６」記載の方法。
【請求項２８】
修飾ヌクレオシドの調製は、ＴＨＦ，水、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセ，トアミド、ジメチルスルポキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、およびヘキサメチルポスホン酸トリアミドからなる群より選択される溶媒中で突施される「請求項１」記載の方法。
【請求項２９】
「請求項１」記載の方法によって調製された修飾ヌクレオシド。
【請求項３０】
「請求項２」記載の方法によって調製されたプリン環の２−，６−または８−位置において修飾されたプリンヌクレオシド。
【請求項３１】
「請求項１０」記載の方法によって調製されたピリミジン環の５−または６−位置において修飾されたピリミジンヌクレオシド。
【請求項３２】
化合物
【化４】
［式中、Ｙは，Ｏ，Ｓ，ＮＨまたはＮＲ′からなる群より選択され、
ＲおよびＲ′は独立にＣ１〜Ｃ２０アルキル（直鎖状または分岐状）、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル（直鎖状または分岐状）、アリール、異項環、天然アミノ酸および非天然アミノ酸からなる群より選択され、この場合、ＲおよびＲ′は芳香族、脂肪族または異項環の環構造の一部であってもよく、
Ｒ″は，Ｈおよびアシルからなる群より選択され、
Ｚは，リボース、デオキシリボース、ジデオキシリボースおよびそれらの２’，３’，および５’修飾の組合せからなる群より選択される］からなる群より選択される化合物。
【請求項３３】
Ｙは，Ｏ，ＳおよびＮＨからなる群より選択され、
Ｒは、（ＣＨｌ）ｍ（ＣＨ３）ｎ（式中、ｌは０，１または２であり、ｍは０〜１９であり、ｎは１，２または３である）であり、この場合１個または２個以上のＨは、＝Ｏ，−ＯＨ，＝ＮＨ，ＮＨ２，＋ＮＭｅ３Ｃｌ，
【化５】
またはアミノ酸で置換されていてもよい「請求項３２」記載の化合物。
【請求項３４】
化合物
【化６】
【化７】
からなる群より選択される「請求項３２」記載の化合物。
【請求項３５】
化合物
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
からなる群より選択される「請求項３２」記載の化合物。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドの部分として導入される「請求項３２」記載の化合物。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドは、リボ核酸である「請求項３６」記載の化合物。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸である「請求項３６」記載の化合物。
【請求項３９】
「請求項３２」記載の化合物の治療有効量を患者に投与することからなるウイルス活性を阻害する方法。
【請求項４０】
サイトメガロウイルス活性を阻害する「請求項３９」記載の方法。
【請求項４１】
ＹはＮＨであり、ＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキルである「請求項３９」記載の方法。
【請求項４２】
化合物は
【化１２】
からなる群より選択される「請求項３９」記載の方法。
【請求項４３】
「請求項３２」記載の化合物の治療有効量を患者に投与することからなるウイルス感染状態の処置方法。
【請求項４４】
ウイルス感染状態はサイトメガロウイルスによって引き起こされる「請求項４３」記載の方法。
【請求項４５】
ＹはＮＨであり、ＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキルである「請求項４３」記載の方法。
【請求項４６】
化合物は
【化１３】
からなる群より選択される「請求項４３」記載の方法。
【公開番号】特開２００９−５７３８８（Ｐ２００９−５７３８８Ａ）
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６２２０８（Ｐ２００８−２６２２０８）
【出願日】平成２０年１０月８日（２００８．１０．８）
【分割の表示】特願平８−５３６６５２の分割
【原出願日】平成８年５月３０日（１９９６．５．３０）
【出願人】（５０１３４５３９０）ギリード・サイエンシズ・インコーポレーテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月８日（２００８．１０．８）
【分割の表示】特願平８−５３６６５２の分割
【原出願日】平成８年５月３０日（１９９６．５．３０）
【出願人】（５０１３４５３９０）ギリード・サイエンシズ・インコーポレーテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
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