真核遺伝コードの拡張
本発明は真核細胞で遺伝的にコードされるアミノ酸の数を拡大する翻訳成分を作製するための組成物と方法を提供する。これらの成分としては、直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、ｔＲＮＡ／シンテターゼの直交対及び非天然アミノ酸が挙げられる。蛋白質と、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を真核細胞で生産する方法も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む真核細胞であって、Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を真核細胞において少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する前記細胞。
【請求項２】
Ｏ−ＲＳが配列番号８６に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸でアミノアシル化する請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
少なくとも１種の非天然アミノ酸が２種以上の非天然アミノ酸を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
Ｏ−ＲＳ、又はその一部が配列番号３−１９のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
Ｏ−ＲＳが配列番号３６−４７もしくは８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する場合の少なくとも１０倍の効率でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸でアミノアシル化する請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
Ｏ−ＲＳが天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、
Ａ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；
Ｂ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；
Ｄ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び
Ｅ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニン
から構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
Ｏ−ＲＳが非真核生物に由来する請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
非真核生物が大腸菌、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
真核細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項１１】
真核細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
Ｏ−ＲＳが天然アミノ酸に比較して少なくとも１種の非天然アミノ酸に１種以上の改善又は強化された酵素性質をもち、前記性質がＫｍ増加、Ｋｍ低下、ｋｃａｔ増加、ｋｃａｔ低下、ｋｃａｔ／ｋｍ低下、及びｋｃａｔ／ｋｍ増加から構成される群から選択される請求項１に記載の細胞。
【請求項１３】
少なくとも１種の非天然アミノ酸がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ、又はその組み合わせで置換されたアミノ酸；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸から構成される群から選択される請求項１に記載の細胞。
【請求項１４】
更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項１５】
更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
Ｏ−ｔＲＮＡが非真核生物に由来する請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
非真核生物が大腸菌、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸の細胞内プロセシングにより生産されるｔＲＮＡの少なくとも５０％の効率で少なくとも１種の非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に対応する核酸の細胞内プロセシングにより細胞内で生産され、Ｏ−ＲＳが配列番号３６−４７、８６、及びその保存変異体から構成される群から選択されるポリペプチド配列を含む請求項１５に記載の細胞。
【請求項２０】
該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を更に含み、前記ポリヌクレオチドがＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む請求項１５に記載の細胞。
【請求項２１】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む該当ポリペプチドの収率がポリヌクレオチドにセレクターコドンを含まない細胞から天然に存在する該当ポリペプチドで得られる収率の少なくとも５％である請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
細胞が少なくとも１種の非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の３０％未満の収率で少なくとも１種の非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する請求項２０に記載の細胞。
【請求項２３】
細胞が少なくとも１種の非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の５％未満の収率で少なくとも１種の非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
該当ポリペプチドが治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分である請求項２０に記載の細胞。
【請求項２５】
該当ポリペプチドがサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、ＤＨＦＲ、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、及びコルチコステロンから構成される群から選択される蛋白質又は蛋白質の一部を含む請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
核酸によりコードされる該当ポリペプチド又はその部分を更に含む請求項２０に記載の細胞。
【請求項２７】
該当ポリペプチドが転写モジュレーター蛋白質、又はその一部を含む請求項２０に記載の細胞。
【請求項２８】
転写モジュレーター蛋白質が転写アクチベーター蛋白質である請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
転写アクチベーター蛋白質がＧＡＬ４である請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
転写モジュレーター蛋白質が転写リプレッサー蛋白質である請求項２７に記載の細胞。
【請求項３１】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、非天然アミノ酸、及び該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む真核細胞であって、ポリヌクレオチドがＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含み、Ｏ−ＲＳが真核細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、細胞が非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の３０％未満の収率で非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する前記細胞。
【請求項３２】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む真核細胞であって、Ｏ−ｔＲＮＡがＯ−ｔＲＮＡによりｉｎ ｖｉｖｏ認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の組込みを媒介する前記細胞。
【請求項３３】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に記載の配列を含むポリヌクレオチド配列の細胞内プロセシングにより生産されるｔＲＮＡの少なくとも５０％の効率で非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列、その細胞内プロセシング形、又はその保存変異体を含む請求項３２に記載の細胞。
【請求項３５】
Ｏ−ｔＲＮＡが転写後修飾される請求項３２に記載の細胞。
【請求項３６】
請求項３２に記載のＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸、又はその相補的ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
核酸がＡボックスとＢボックスを含む請求項３６に記載の核酸。
【請求項３８】
真核細胞中にＧＡＬ４蛋白質又はその部分を含有する組成物であって、ＧＡＬ４蛋白質又はその部分が少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む前記組成物。
【請求項３９】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質が少なくとも１種の翻訳後修飾を含む少なくとも１種の非天然アミノ酸を含み、前記少なくとも１種の翻訳後修飾が糖部分を含む前記組成物。
【請求項４０】
少なくとも１種の非天然アミノ酸がケト非天然アミノ酸である請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
少なくとも１種の翻訳後修飾が真核細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで行われる請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質が少なくとも１種の非天然アミノ酸と、真核細胞によりｉｎ ｖｉｖｏで行われる少なくとも１種の翻訳後修飾を含み、前記翻訳後修飾が天然には原核細胞により行われない前記組成物。
【請求項４３】
翻訳後修飾がＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖とアスパラギンの結合を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃを含む請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
翻訳後修飾がＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合によるオリゴ糖とセリン又はスレオニンの結合を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
オリゴ糖がＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃを含む請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
翻訳後修飾がアセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、及び糖脂質結合修飾から構成される群から選択される請求項４２に記載の組成物。
【請求項４８】
蛋白質が治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項４９】
蛋白質の天然形に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが、少なくとも１種が非天然アミノ酸で置換されている請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
蛋白質が少なくとも２個の非天然アミノ酸を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項５１】
蛋白質が少なくとも２個の異なる非天然アミノ酸を含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
蛋白質が少なくとも３個の非天然アミノ酸を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項５３】
蛋白質が４個以上の非天然アミノ酸を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項５４】
組成物が更に医薬的に許容可能な賦形剤を含有する請求項４２に記載の組成物。
【請求項５５】
組成物が少なくとも１００μｇの蛋白質を含有する請求項４２に記載の組成物。
【請求項５６】
組成物が少なくとも５０μｇ／ｌの蛋白質を含有する請求項４２に記載の組成物。
【請求項５７】
蛋白質が分泌もしくは局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、又はＧＳＴ融合配列を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項５８】
（ａ）配列番号３６−４７、又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号３−１９のいずれか１種に記載のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的免疫反応性のポリペプチド；
（ｄ）天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号３６−４７、又は８６の少なくとも２０個の連続アミノ酸を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸置換を含むポリペプチド（但し、アミノ酸の番号は大腸菌ＴｙｒＲＳの番号に対応する）；並びに
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）の保存変異体を含むアミノ酸配列から構成される群から選択されるポリペプチド。
【請求項５９】
請求項５８に記載のポリペプチドと賦形剤を含有する組成物。
【請求項６０】
請求項５８に記載のポリペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項６１】
（ａ）配列番号３−１９、又は６４−８５のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３６−４７、もしくは８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）請求項５８に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）高ストリンジェント条件下で核酸の実質的に全長にわたって（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；
（ｆ）天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから構成される群から選択される２種以上の突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；並びに
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、又は（ｇ）の保存変異体を含むポリヌクレオチドから構成される群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項６２】
請求項６１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６３】
ベクターがプラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスを含む請求項６２に記載のベクター。
【請求項６４】
ベクターが発現ベクターである請求項６２に記載のベクター。
【請求項６５】
請求項６２に記載のベクターを含む細胞。
【請求項６６】
真核細胞において直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法であって、
（ａ）ｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーのメンバーと、ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、ｉｉｉ）ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、ｉｖ）ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを各々含む第１の種の真核細胞の集団について非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択を実施し、ポジティブ選択後に生存している細胞が非天然アミノ酸の存在下で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性ＲＳを含むと判定する段階と；
（ｂ）ポジティブ選択後に生存している細胞について非天然アミノ酸の不在下でネガティブ選択を実施し、Ｏ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する活性ＲＳを排除することにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを得る段階を含む前記方法。
【請求項６７】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが応答エレメントに機能的に連結されており、細胞が、ａ）応答エレメントからの転写を調節する転写モジュレーター蛋白質をコードすると共に、ｂ）少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを更に含み；
非天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡにより非天然アミノ酸が転写モジュレーター蛋白質に組込まれる結果としてポジティブ選択マーカーが転写される請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
転写モジュレーター蛋白質が真核転写モジュレーター蛋白質である請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
転写モジュレーター蛋白質が転写アクチベーター蛋白質であり、セレクターコドンがアンバー終止コドンである請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
アンバー終止コドンが転写アクチベーター蛋白質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの一部又は実質的にその近傍に配置されている請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
転写アクチベーター蛋白質がＧＡＬ４である請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ポジティブ選択マーカーが増殖用栄養補助剤を提供し、選択が栄養補助剤を含まない培地で実施される請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドがｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、又はｌａｃＺ遺伝子である請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ｈｉｓ３遺伝子がイミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素であり、前記脱水素酵素が３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）の添加により検出される請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ポジティブ選択マーカーが適切な反応体の存在下に蛍光発光するか又は発光反応を触媒する請求項６７に記載の方法。
【請求項７６】
ポジティブ選択マーカーの生成物が蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光により検出される請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ポジティブ選択マーカーが親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項７８】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドがセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項７９】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが転写モジュレーター蛋白質により転写を媒介される応答エレメントに機能的に連結されており；
天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡにより天然アミノ酸が転写モジュレーター蛋白質に組込まれる結果としてネガティブ選択マーカーが転写される請求項６７に記載の方法。
【請求項８０】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドがｕｒａ３遺伝子を含み、ネガティブ選択が５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を含む培地で実施される請求項６６に記載の方。
【請求項８１】
ネガティブ選択に使用される培地がネガティブ選択マーカーにより検出可能な物質に変換される選択又はスクリーニング物質を含む請求項６６に記載の方法。
【請求項８２】
検出可能な物質が毒性物質である請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ネガティブ選択マーカーが適切な反応体の存在下に蛍光発光するか又は発光反応を触媒する請求項６６に記載の方法。
【請求項８４】
ネガティブ選択マーカーの生成物が蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光により検出される請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ネガティブ選択マーカーが親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項８６】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドがセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項８７】
セレクターコドンがアンバーコドン、オーカーコドン又はオパール終止コドンを含む請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
同一ポリヌクレオチドがポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両者をコードする請求項６６に記載の方法。
【請求項８９】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが少なくとも２個のセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９０】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが少なくとも２個のセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９１】
ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの一方又は両方が各々少なくとも２個の異なるセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９２】
ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの一方又は両方が各々少なくとも２個の同一セレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９３】
非天然アミノ酸がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ、又はその組み合わせで置換されたアミノ酸；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸から構成される群から選択される請求項６６に記載の方法。
【請求項９４】
段階（ａ）、（ｂ）又は（ａ）と（ｂ）の両者が変動量の不活性シンテターゼを提供することを更に含み、変動量が付加レベルの選択又はスクリーニングストリンジェンシーを提供する請求項６６に記載の方法。
【請求項９５】
Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳについて付加ポジティブ選択ラウンドを実施する段階を更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９６】
段階（ａ）、（ｂ）又は（ａ）と（ｂ）の両方が選択又はスクリーニングストリンジェンシーを変動させることを更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９７】
ＲＳのライブラリーが非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９８】
ＲＳのライブラリーが不活性ＲＳに由来する請求項６６に記載の方法。
【請求項９９】
不活性ＲＳが活性ＲＳを突然変異させることにより作製される請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
不活性ＲＳがアミノ酸結合ポケットを含み、結合ポケットを構成する１種以上のアミノ酸が１種以上の異なるアミノ酸で置換されている請求項９９に記載の方法
【請求項１０１】
置換アミノ酸がアラニンで置換されている請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ＲＳのライブラリーが突然変異体ＲＳのライブラリーを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項１０３】
ＲＳをコードする核酸でランダム突然変異、部位特異的突然変異、組換え、キメラ構築、又はその任意組み合わせを実施することにより、突然変異体ＲＳのライブラリーを作製する段階を更に含む請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
（ｃ）Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離する段階と；
（ｄ）突然変異Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドセットを核酸から作製する段階と；
（ｅ）Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ａ）及び／又は（ｂ）を繰り返す段階を更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項１０５】
段階（ｃ）−（ｅ）を少なくとも２回実施することを更に含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
段階（ｄ）がランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、キメラ構築、組換え又はその任意組み合わせを含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項６６に記載の方法により生産されたＯ−ＲＳ。
【請求項１０８】
Ｏ−ｔＲＮＡがｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の真核細胞の集団についてネガティブ選択を実施し、真核細胞に内在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む細胞を排除することにより得られ、それにより第１の種の真核細胞に直交なｔＲＮＡのプールを得る請求項６６に記載の方法。
【請求項１０９】
ｔＲＮＡのライブラリーが非真核生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡを含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーが非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
ｔＲＮＡのライブラリーが第１の非真核生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡを含み、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーが第２の非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
第１の非真核生物と第２の非真核生物が同一である請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
第１の非真核生物と第２の非真核生物が異なる請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする核酸と、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を第２の種の真核細胞に導入する段階を更に含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
第１の種が酵母である請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
第２の種が哺乳動物、昆虫、真菌、藻類、及び植物から構成される群から選択される請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
請求項１０８に記載の方法により生産されたＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対。
【請求項１１８】
選択又はスクリーニングがアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、及び翻訳忠実度の変化から構成される群から選択される１種以上のポジティブ又はネガティブ選択又はスクリーニングを含み、１種以上の変化が蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく請求項６６又は１０８に記載の方法。
【請求項１１９】
真核細胞において直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法であって、
（ａ）ｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーのメンバーと、ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、ｉｉｉ）ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、ｉｖ）ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを各々含む第１の種の真核細胞の集団について非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択を実施し、ポジティブ選択後に生存している細胞が非天然アミノ酸の存在下に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性ＲＳを含むと判定する段階と；
（ｂ）ポジティブ選択後に生存している細胞について非天然アミノ酸の不在下でネガティブ選択を実施し、Ｏ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する活性ＲＳを排除することにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを得る段階（ここでＯ−ｔＲＮＡはｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の真核細胞の集団についてネガティブ選択を実施し、真核細胞に内在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む細胞を排除することにより、第１の種の真核細胞に直交なｔＲＮＡのプールを提供することにより得られる）段階と；
（ｃ）Ｏ−ｔＲＮＡをコードする核酸と、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を第２の種の真核細胞に導入する段階を含み、
第１の種が酵母であり、第２の種が哺乳動物、昆虫、真菌、藻類、及び植物から構成される群から選択される前記方法。
【請求項１２０】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種の蛋白質を真核細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を含む真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含み；
培地が非天然アミノ酸を含み、真核細胞が、
前記細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む前記方法。
【請求項１２１】
Ｏ−ＲＳが配列番号８６に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６４もしくは６５、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか、前記配列から細胞内プロセシングされるか、又は前記配列によりコードされる請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
Ｏ−ＲＳが配列番号３６−４８又は８６を含む請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
非天然アミノ酸がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ、又はその組み合わせで置換されたアミノ酸；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸から構成される群から選択される請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
蛋白質が治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分を含む請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２６】
蛋白質がサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、ＤＨＦＲ、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、及びコルチコステロンから構成される群から選択される蛋白質又は蛋白質の一部を含む請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２７】
蛋白質が転写モジュレーター蛋白質又はその一部を含む請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２８】
転写モジュレーター蛋白質が転写アクチベーター蛋白質である請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
転写アクチベーター蛋白質がＧＡＬ４である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
転写モジュレーター蛋白質が転写リプレッサー蛋白質である請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
請求項１２０に記載の方法により生産された蛋白質。
【請求項１３２】
蛋白質が更に非天然アミノ酸により修飾されている請求項１３１に記載の蛋白質。
【請求項１３３】
蛋白質が少なくとも１種のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳後修飾により修飾されており、前記翻訳後修飾がＮ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、及び糖脂質結合修飾から構成される群から選択される請求項１３１に記載の蛋白質。
【請求項１３４】
スクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質の生産方法であって、
核酸結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド配列を選択する段階と；
少なくとも１個のセレクターコドンを含むように第１のポリヌクレオチド配列を突然変異させることにより、スクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列を得る段階と；
転写活性化ドメインをコードする第２のポリヌクレオチド配列を選択する段階と；
第２のポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたスクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列を含む構築物を得る段階と；
前記構築物と、非天然アミノ酸と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、セレクターコドンを認識し、スクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列のセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を核酸結合ドメインに組込む直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を細胞に導入することにより、スクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質を得る段階を含む前記方法。
【請求項１３５】
請求項１３４に記載の方法により生産されたスクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質。
【請求項１３６】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む蛋白質を細胞で生産するためのキットであって、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列又はＯ−ＲＳを収容する容器を含む前記キット。
【請求項１３７】
キットが更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む請求項１３６に記載のキット。
【請求項１３８】
キットが更に蛋白質を生産するための説明書を含む請求項１３６に記載のキット。
【請求項１】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む真核細胞であって、Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を真核細胞において少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する前記細胞。
【請求項２】
Ｏ−ＲＳが配列番号８６に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸でアミノアシル化する請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
少なくとも１種の非天然アミノ酸が２種以上の非天然アミノ酸を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
Ｏ−ＲＳ、又はその一部が配列番号３−１９のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
Ｏ−ＲＳが配列番号３６−４７もしくは８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する場合の少なくとも１０倍の効率でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸でアミノアシル化する請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
Ｏ−ＲＳが天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、
Ａ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；
Ｂ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；
Ｄ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び
Ｅ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニン
から構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
Ｏ−ＲＳが非真核生物に由来する請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
非真核生物が大腸菌、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
真核細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項１１】
真核細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
Ｏ−ＲＳが天然アミノ酸に比較して少なくとも１種の非天然アミノ酸に１種以上の改善又は強化された酵素性質をもち、前記性質がＫｍ増加、Ｋｍ低下、ｋｃａｔ増加、ｋｃａｔ低下、ｋｃａｔ／ｋｍ低下、及びｋｃａｔ／ｋｍ増加から構成される群から選択される請求項１に記載の細胞。
【請求項１３】
少なくとも１種の非天然アミノ酸がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ、又はその組み合わせで置換されたアミノ酸；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸から構成される群から選択される請求項１に記載の細胞。
【請求項１４】
更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項１５】
更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
Ｏ−ｔＲＮＡが非真核生物に由来する請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
非真核生物が大腸菌、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸の細胞内プロセシングにより生産されるｔＲＮＡの少なくとも５０％の効率で少なくとも１種の非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に対応する核酸の細胞内プロセシングにより細胞内で生産され、Ｏ−ＲＳが配列番号３６−４７、８６、及びその保存変異体から構成される群から選択されるポリペプチド配列を含む請求項１５に記載の細胞。
【請求項２０】
該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を更に含み、前記ポリヌクレオチドがＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む請求項１５に記載の細胞。
【請求項２１】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む該当ポリペプチドの収率がポリヌクレオチドにセレクターコドンを含まない細胞から天然に存在する該当ポリペプチドで得られる収率の少なくとも５％である請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
細胞が少なくとも１種の非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の３０％未満の収率で少なくとも１種の非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する請求項２０に記載の細胞。
【請求項２３】
細胞が少なくとも１種の非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の５％未満の収率で少なくとも１種の非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
該当ポリペプチドが治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分である請求項２０に記載の細胞。
【請求項２５】
該当ポリペプチドがサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、ＤＨＦＲ、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、及びコルチコステロンから構成される群から選択される蛋白質又は蛋白質の一部を含む請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
核酸によりコードされる該当ポリペプチド又はその部分を更に含む請求項２０に記載の細胞。
【請求項２７】
該当ポリペプチドが転写モジュレーター蛋白質、又はその一部を含む請求項２０に記載の細胞。
【請求項２８】
転写モジュレーター蛋白質が転写アクチベーター蛋白質である請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
転写アクチベーター蛋白質がＧＡＬ４である請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
転写モジュレーター蛋白質が転写リプレッサー蛋白質である請求項２７に記載の細胞。
【請求項３１】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、非天然アミノ酸、及び該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む真核細胞であって、ポリヌクレオチドがＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含み、Ｏ−ＲＳが真核細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、細胞が非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の３０％未満の収率で非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する前記細胞。
【請求項３２】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む真核細胞であって、Ｏ−ｔＲＮＡがＯ−ｔＲＮＡによりｉｎ ｖｉｖｏ認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の組込みを媒介する前記細胞。
【請求項３３】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に記載の配列を含むポリヌクレオチド配列の細胞内プロセシングにより生産されるｔＲＮＡの少なくとも５０％の効率で非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列、その細胞内プロセシング形、又はその保存変異体を含む請求項３２に記載の細胞。
【請求項３５】
Ｏ−ｔＲＮＡが転写後修飾される請求項３２に記載の細胞。
【請求項３６】
請求項３２に記載のＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸、又はその相補的ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
核酸がＡボックスとＢボックスを含む請求項３６に記載の核酸。
【請求項３８】
真核細胞中にＧＡＬ４蛋白質又はその部分を含有する組成物であって、ＧＡＬ４蛋白質又はその部分が少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む前記組成物。
【請求項３９】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質が少なくとも１種の翻訳後修飾を含む少なくとも１種の非天然アミノ酸を含み、前記少なくとも１種の翻訳後修飾が糖部分を含む前記組成物。
【請求項４０】
少なくとも１種の非天然アミノ酸がケト非天然アミノ酸である請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
少なくとも１種の翻訳後修飾が真核細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで行われる請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質が少なくとも１種の非天然アミノ酸と、真核細胞によりｉｎ ｖｉｖｏで行われる少なくとも１種の翻訳後修飾を含み、前記翻訳後修飾が天然には原核細胞により行われない前記組成物。
【請求項４３】
翻訳後修飾がＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖とアスパラギンの結合を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃを含む請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
翻訳後修飾がＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合によるオリゴ糖とセリン又はスレオニンの結合を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
オリゴ糖がＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃを含む請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
翻訳後修飾がアセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、及び糖脂質結合修飾から構成される群から選択される請求項４２に記載の組成物。
【請求項４８】
蛋白質が治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項４９】
蛋白質の天然形に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが、少なくとも１種が非天然アミノ酸で置換されている請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
蛋白質が少なくとも２個の非天然アミノ酸を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項５１】
蛋白質が少なくとも２個の異なる非天然アミノ酸を含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
蛋白質が少なくとも３個の非天然アミノ酸を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項５３】
蛋白質が４個以上の非天然アミノ酸を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項５４】
組成物が更に医薬的に許容可能な賦形剤を含有する請求項４２に記載の組成物。
【請求項５５】
組成物が少なくとも１００μｇの蛋白質を含有する請求項４２に記載の組成物。
【請求項５６】
組成物が少なくとも５０μｇ／ｌの蛋白質を含有する請求項４２に記載の組成物。
【請求項５７】
蛋白質が分泌もしくは局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、又はＧＳＴ融合配列を含む請求項４２に記載の組成物。
【請求項５８】
（ａ）配列番号３６−４７、又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号３−１９のいずれか１種に記載のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的免疫反応性のポリペプチド；
（ｄ）天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号３６−４７、又は８６の少なくとも２０個の連続アミノ酸を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから構成される群から選択される２種以上のアミノ酸置換を含むポリペプチド（但し、アミノ酸の番号は大腸菌ＴｙｒＲＳの番号に対応する）；並びに
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）の保存変異体を含むアミノ酸配列から構成される群から選択されるポリペプチド。
【請求項５９】
請求項５８に記載のポリペプチドと賦形剤を含有する組成物。
【請求項６０】
請求項５８に記載のポリペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項６１】
（ａ）配列番号３−１９、又は６４−８５のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３６−４７、もしくは８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）請求項５８に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）高ストリンジェント条件下で核酸の実質的に全長にわたって（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；
（ｆ）天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから構成される群から選択される２種以上の突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；並びに
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、又は（ｇ）の保存変異体を含むポリヌクレオチドから構成される群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項６２】
請求項６１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６３】
ベクターがプラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスを含む請求項６２に記載のベクター。
【請求項６４】
ベクターが発現ベクターである請求項６２に記載のベクター。
【請求項６５】
請求項６２に記載のベクターを含む細胞。
【請求項６６】
真核細胞において直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法であって、
（ａ）ｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーのメンバーと、ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、ｉｉｉ）ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、ｉｖ）ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを各々含む第１の種の真核細胞の集団について非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択を実施し、ポジティブ選択後に生存している細胞が非天然アミノ酸の存在下で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性ＲＳを含むと判定する段階と；
（ｂ）ポジティブ選択後に生存している細胞について非天然アミノ酸の不在下でネガティブ選択を実施し、Ｏ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する活性ＲＳを排除することにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを得る段階を含む前記方法。
【請求項６７】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが応答エレメントに機能的に連結されており、細胞が、ａ）応答エレメントからの転写を調節する転写モジュレーター蛋白質をコードすると共に、ｂ）少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを更に含み；
非天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡにより非天然アミノ酸が転写モジュレーター蛋白質に組込まれる結果としてポジティブ選択マーカーが転写される請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
転写モジュレーター蛋白質が真核転写モジュレーター蛋白質である請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
転写モジュレーター蛋白質が転写アクチベーター蛋白質であり、セレクターコドンがアンバー終止コドンである請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
アンバー終止コドンが転写アクチベーター蛋白質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの一部又は実質的にその近傍に配置されている請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
転写アクチベーター蛋白質がＧＡＬ４である請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ポジティブ選択マーカーが増殖用栄養補助剤を提供し、選択が栄養補助剤を含まない培地で実施される請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドがｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、又はｌａｃＺ遺伝子である請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ｈｉｓ３遺伝子がイミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素であり、前記脱水素酵素が３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）の添加により検出される請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ポジティブ選択マーカーが適切な反応体の存在下に蛍光発光するか又は発光反応を触媒する請求項６７に記載の方法。
【請求項７６】
ポジティブ選択マーカーの生成物が蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光により検出される請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ポジティブ選択マーカーが親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項７８】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドがセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項７９】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが転写モジュレーター蛋白質により転写を媒介される応答エレメントに機能的に連結されており；
天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡにより天然アミノ酸が転写モジュレーター蛋白質に組込まれる結果としてネガティブ選択マーカーが転写される請求項６７に記載の方法。
【請求項８０】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドがｕｒａ３遺伝子を含み、ネガティブ選択が５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を含む培地で実施される請求項６６に記載の方。
【請求項８１】
ネガティブ選択に使用される培地がネガティブ選択マーカーにより検出可能な物質に変換される選択又はスクリーニング物質を含む請求項６６に記載の方法。
【請求項８２】
検出可能な物質が毒性物質である請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ネガティブ選択マーカーが適切な反応体の存在下に蛍光発光するか又は発光反応を触媒する請求項６６に記載の方法。
【請求項８４】
ネガティブ選択マーカーの生成物が蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光により検出される請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ネガティブ選択マーカーが親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項８６】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドがセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項８７】
セレクターコドンがアンバーコドン、オーカーコドン又はオパール終止コドンを含む請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
同一ポリヌクレオチドがポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両者をコードする請求項６６に記載の方法。
【請求項８９】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが少なくとも２個のセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９０】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドが少なくとも２個のセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９１】
ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの一方又は両方が各々少なくとも２個の異なるセレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９２】
ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの一方又は両方が各々少なくとも２個の同一セレクターコドンを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９３】
非天然アミノ酸がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ、又はその組み合わせで置換されたアミノ酸；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸から構成される群から選択される請求項６６に記載の方法。
【請求項９４】
段階（ａ）、（ｂ）又は（ａ）と（ｂ）の両者が変動量の不活性シンテターゼを提供することを更に含み、変動量が付加レベルの選択又はスクリーニングストリンジェンシーを提供する請求項６６に記載の方法。
【請求項９５】
Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳについて付加ポジティブ選択ラウンドを実施する段階を更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９６】
段階（ａ）、（ｂ）又は（ａ）と（ｂ）の両方が選択又はスクリーニングストリンジェンシーを変動させることを更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９７】
ＲＳのライブラリーが非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項９８】
ＲＳのライブラリーが不活性ＲＳに由来する請求項６６に記載の方法。
【請求項９９】
不活性ＲＳが活性ＲＳを突然変異させることにより作製される請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
不活性ＲＳがアミノ酸結合ポケットを含み、結合ポケットを構成する１種以上のアミノ酸が１種以上の異なるアミノ酸で置換されている請求項９９に記載の方法
【請求項１０１】
置換アミノ酸がアラニンで置換されている請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ＲＳのライブラリーが突然変異体ＲＳのライブラリーを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項１０３】
ＲＳをコードする核酸でランダム突然変異、部位特異的突然変異、組換え、キメラ構築、又はその任意組み合わせを実施することにより、突然変異体ＲＳのライブラリーを作製する段階を更に含む請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
（ｃ）Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離する段階と；
（ｄ）突然変異Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドセットを核酸から作製する段階と；
（ｅ）Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ａ）及び／又は（ｂ）を繰り返す段階を更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項１０５】
段階（ｃ）−（ｅ）を少なくとも２回実施することを更に含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
段階（ｄ）がランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、キメラ構築、組換え又はその任意組み合わせを含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項６６に記載の方法により生産されたＯ−ＲＳ。
【請求項１０８】
Ｏ−ｔＲＮＡがｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の真核細胞の集団についてネガティブ選択を実施し、真核細胞に内在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む細胞を排除することにより得られ、それにより第１の種の真核細胞に直交なｔＲＮＡのプールを得る請求項６６に記載の方法。
【請求項１０９】
ｔＲＮＡのライブラリーが非真核生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡを含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーが非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
ｔＲＮＡのライブラリーが第１の非真核生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡを含み、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーが第２の非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
第１の非真核生物と第２の非真核生物が同一である請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
第１の非真核生物と第２の非真核生物が異なる請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする核酸と、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を第２の種の真核細胞に導入する段階を更に含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
第１の種が酵母である請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
第２の種が哺乳動物、昆虫、真菌、藻類、及び植物から構成される群から選択される請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
請求項１０８に記載の方法により生産されたＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対。
【請求項１１８】
選択又はスクリーニングがアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、及び翻訳忠実度の変化から構成される群から選択される１種以上のポジティブ又はネガティブ選択又はスクリーニングを含み、１種以上の変化が蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく請求項６６又は１０８に記載の方法。
【請求項１１９】
真核細胞において直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法であって、
（ａ）ｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーのメンバーと、ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、ｉｉｉ）ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、ｉｖ）ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを各々含む第１の種の真核細胞の集団について非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択を実施し、ポジティブ選択後に生存している細胞が非天然アミノ酸の存在下に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性ＲＳを含むと判定する段階と；
（ｂ）ポジティブ選択後に生存している細胞について非天然アミノ酸の不在下でネガティブ選択を実施し、Ｏ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する活性ＲＳを排除することにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを得る段階（ここでＯ−ｔＲＮＡはｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の真核細胞の集団についてネガティブ選択を実施し、真核細胞に内在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む細胞を排除することにより、第１の種の真核細胞に直交なｔＲＮＡのプールを提供することにより得られる）段階と；
（ｃ）Ｏ−ｔＲＮＡをコードする核酸と、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を第２の種の真核細胞に導入する段階を含み、
第１の種が酵母であり、第２の種が哺乳動物、昆虫、真菌、藻類、及び植物から構成される群から選択される前記方法。
【請求項１２０】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種の蛋白質を真核細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を含む真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含み；
培地が非天然アミノ酸を含み、真核細胞が、
前記細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む前記方法。
【請求項１２１】
Ｏ−ＲＳが配列番号８６に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６４もしくは６５、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか、前記配列から細胞内プロセシングされるか、又は前記配列によりコードされる請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
Ｏ−ＲＳが配列番号３６−４８又は８６を含む請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
非天然アミノ酸がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ、又はその組み合わせで置換されたアミノ酸；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸から構成される群から選択される請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
蛋白質が治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分を含む請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２６】
蛋白質がサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、ＤＨＦＲ、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、及びコルチコステロンから構成される群から選択される蛋白質又は蛋白質の一部を含む請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２７】
蛋白質が転写モジュレーター蛋白質又はその一部を含む請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２８】
転写モジュレーター蛋白質が転写アクチベーター蛋白質である請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
転写アクチベーター蛋白質がＧＡＬ４である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
転写モジュレーター蛋白質が転写リプレッサー蛋白質である請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
請求項１２０に記載の方法により生産された蛋白質。
【請求項１３２】
蛋白質が更に非天然アミノ酸により修飾されている請求項１３１に記載の蛋白質。
【請求項１３３】
蛋白質が少なくとも１種のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳後修飾により修飾されており、前記翻訳後修飾がＮ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、及び糖脂質結合修飾から構成される群から選択される請求項１３１に記載の蛋白質。
【請求項１３４】
スクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質の生産方法であって、
核酸結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド配列を選択する段階と；
少なくとも１個のセレクターコドンを含むように第１のポリヌクレオチド配列を突然変異させることにより、スクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列を得る段階と；
転写活性化ドメインをコードする第２のポリヌクレオチド配列を選択する段階と；
第２のポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたスクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列を含む構築物を得る段階と；
前記構築物と、非天然アミノ酸と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、セレクターコドンを認識し、スクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列のセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を核酸結合ドメインに組込む直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を細胞に導入することにより、スクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質を得る段階を含む前記方法。
【請求項１３５】
請求項１３４に記載の方法により生産されたスクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質。
【請求項１３６】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む蛋白質を細胞で生産するためのキットであって、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列又はＯ−ＲＳを収容する容器を含む前記キット。
【請求項１３７】
キットが更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む請求項１３６に記載のキット。
【請求項１３８】
キットが更に蛋白質を生産するための説明書を含む請求項１３６に記載のキット。
【図２】
【図３】
【図６】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【図３】
【図６】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【公表番号】特表２００７−５２５９４３（Ｐ２００７−５２５９４３Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１３０６８（Ｐ２００６−５１３０６８）
【出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４５９３
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４５９３
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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