米麹を用いた降圧組成物
【課題】医療用薬剤としてのアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、医師の処方に基づいて使用しなければならなく、さらにその価格が高いという問題がある。また、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを用いる場合、それぞれ加水分解するなどの処理の必要があり、抽出などの手間やコストがかかるという問題がある。このため、少ない費用で入手でき、かつ手間などのかからないアンギオテンシン変換酵素阻害物質が望まれている。
【解決手段】そこで本発明者らは、種々の検討をした結果、米麹及び米麹水抽出物にアンギオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出した。また、米麹中に含まれるタンパク質を部分分解したペプチドにも消化酵素耐性を示すアンギオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出し、そのペプチドも同定した。また、ヒトモニター試験においても、米麹摂取による血圧の降下が確認された。
【解決手段】そこで本発明者らは、種々の検討をした結果、米麹及び米麹水抽出物にアンギオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出した。また、米麹中に含まれるタンパク質を部分分解したペプチドにも消化酵素耐性を示すアンギオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出し、そのペプチドも同定した。また、ヒトモニター試験においても、米麹摂取による血圧の降下が確認された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、清酒醸造原料を用いた組成物に関するものであり、特に高血圧を予防・治療・改善する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は生活習慣病の一つに挙げられているが、高血圧はある程度まで進行しないと特別な自覚症状がない。このため、高血圧はサイレントキラーとも呼ばれ、自覚症状がないままに密かに病状が進行し、数々の合併症を引き起こす可能性がある。血管の壁は本来弾力性があるが、高血圧状態が長く続くと動脈硬化を引き起こし脳出血や脳梗塞、大動脈瘤、心筋梗塞、眼底出血などの原因となる。また、細小動脈の硬化が進むと腎硬化症を発症することにより腎臓の機能が低下し、腎不全や尿毒症になる場合もある。また、心臓に負担がかかることにより心臓肥大や心不全を引き起こすこともある。
【０００３】
日本高血圧学会の高血圧治療ガイドラインでは、血圧値に基づいて至適血圧、正常血圧、正常高値血圧、高血圧に分類されており、収縮期血圧（最高血圧）１４０ｍｍＨｇ以上、又は拡張期血圧（最低血圧）９０ｍｍＨｇ以上を高血圧と定義している。血圧は年齢と共に上がる傾向にあり、高血圧患者は全国で３０００万人から３５００万人と言われており、そのうち約７００万人が治療を受けている（平成１８年現在）。
【０００４】
高血圧患者の数は非常に多いが、現在の医学検査では高血圧の明らかな原因が見つからないものを本態性高血圧と言い、高血圧の９０％以上を占めている。残りの１０％程度の高血圧は二次性高血圧あるいは症候性高血圧と言い、血圧を上げる原因が見つかっている。二次性高血圧としては、大動脈縮窄症、腎血管性高血圧、腎実質性高血圧、原発性アルドステロン症、クッシング症候群、褐色細胞腫、大動脈炎症候群、甲状腺機能異常などが挙げられ、それぞれの原因疾患の治療を行うことが血圧の低下に有効である。
【０００５】
一方、本態性高血圧は遺伝的な因子や生活習慣などの環境因子が関与しており、例えば過剰な塩分摂取・肥満・過度の飲酒・喫煙・精神的ストレス・自律神経の調節異常・過剰の肉体労働・タンパク質や脂質の不適切な摂取などがある。これらの要因は複雑に影響を及ぼしあっているため高血圧の原因となっている因子を特定することは難しい。従って、本態性高血圧を治療する有効な方法として、降圧剤で血圧を下げるということが中心に行われている。
【０００６】
本態性高血圧の原因として考えられる因子のうちで、レニン・アンギオテンシン系は重要な因子と考えられている。このレニン・アンギオテンシン系でアンギオテンシン変換酵素（ＥＣ３．４．１５．１）は中心的な働きをしている。即ち、肝臓で分泌されたアンギオテンシノーゲンは腎臓に存在するレニンによってアンギオテンシン１となり、アンギオテンシン変換酵素により血管壁平滑筋収縮作用のあるアンギオテンシン２が生成され、血圧が上昇する。さらにアンギオテンシン２は副腎皮質球状層のアルドステロン生成促進作用を有しているために、さらに血圧が上昇する。一方、降圧系では、キニノーゲンが血漿中に存在するカリクレインによって分解され、血管壁平滑筋拡張作用があるブラジキニンが生成されるが、このブラジキニンはアンギオテンシン変換酵素により分解され、不活性化される。従って、このアンギオテンシン変換酵素を阻害すれば昇圧性ペプチドであるアンギオテンシン２の生成を抑制し、降圧性ペプチドであるブラジキニンの分解をも抑制して血圧の降下が可能となる。
【０００７】
本態性高血圧の治療としては、アンギオテンシン変換酵素阻害物質を主成分としたアンギオテンシン変換酵素阻害薬が医薬品として実用化されている。また、その他にはアンギオテンシン変換酵素阻害活性を持つペプチドがいくつか発見され、それらアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを得る方法として、牛乳カゼイン、大豆タンパク質、イワシタンパク質、トウモロコシ、小麦、卵白アルブミンなどの加水分解物からの単離が報告されている。また、特許文献４や非特許文献１では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌やＭｏｎａｓｃｕｓ属糸状菌の麹（紅麹）が高血圧の改善に有効であるという報告もある。しかし、非特許文献１では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌の降圧効果成分としては、イソフラボン類が指摘され、Ｍｏｎａｓｃｕｓ属糸状菌の麹では降圧効果成分としてアンギオテンシン変換酵素阻害活性ペプチドの非関与が指摘されている。しかし依然として、降圧効果の作用機序および有効成分は不明であった。また、これらはラットを用いた動物実験の効果であり、ヒトが経口摂取した場合にどのような効果を示すかどうかは不明であった。
【特許文献１】特開平７−７０１８０号公報
【特許文献２】特開２００２−２４７９５５号公報
【特許文献３】特開平５−３３１１９０号公報
【特許文献４】特公平３−３１１７０号公報
【非特許文献１】日本農芸化学会誌Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ８，ｐ１２４１〜１２４６，１９９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
医療用薬剤としてのアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、医師の処方に基づいて使用しなければならなく、さらにその価格が高いという問題がある。また、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを用いる場合、イワシ由来ペプチドや発酵乳のペプチドを用いる場合は、ペプチド自体がえぐ味、雑味を有しており、食品として添加する場合に呈味性の問題がある。さらに、ペプチドで製造したものを摂取しても、胃あるいは膵臓由来の消化酵素に不安定で、小腸吸収時にはアミノ酸に分解され、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を消失することも問題である。また、他のペプチドを用いる場合にしても、それぞれ加水分解するなどの処理の必要があり、抽出、分解、遠心、凍結乾燥などの操作が必要となり、これらの操作専用の高額な装置を購入しなければならず、装置の維持費や装置の購入コストがかかるという問題があり、結果として高額な機能性食品素材として販売されている。さらに、食品タンパク質から機能性ペプチドを工業的に生産する場合に、市販のプロテアーゼ酵素剤は各種プロテアーゼ分子の混合物であり、機能性を発揮しうる構造のペプチドとして残存するように反応を停止させることが工業上難しく、アミノ酸まで分解される過分解が報告されている。過分解されたアミノ酸を多く含むペプチドを用いた場合に、アミノ酸の緩衝能が高いために、食品添加物として使用する場合に、ｐＨ調節のために過剰な有機酸を添加する必要があり、食品本来の風味を破壊する問題がある。このため、安価に製造購入でき、かつ複雑な製造ステップを必要としないアンギオテンシン変換酵素阻害物質が望まれている。また、麹による降圧作用については、その作用機序及び有効成分が不明であり、有効成分を富化することにより、降圧作用を増強した麹を作成できない問題点があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者らは鋭意検討の結果、降圧効果をもたらす要因として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌の米麹及び米麹水抽出物にアンギオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出した。またさらに、米麹中に含まれるタンパク質を人工胃腸消化したペプチドにもアンギオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出し、そのペプチドを同定することにも成功した。当該ペプチドは、経口摂取でも、消化酵素に安定で、小腸に直接吸収されうる。さらに、ヒトモニター試験の結果、米麹の摂取により、正常高値血圧〜軽症高血圧である者の血圧が有意に降下することを確かめた。
【００１０】
本発明は、上記知見に基づき完成されたもので、以下、降圧効果のある組成物、その組成物を有効成分とする高血圧の予防・治療・改善剤、その組成物を含有し、高血圧を予防または改善するために用いられる旨の表示を付した飲食品などを提供すること、及びそれらの製造方法などに関する。
【００１１】
項１． 平均粒子径が３３６０μｍ以下であることを特徴とする米麹を有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１２】
項２． 平均粒子径が５００μｍ以下の粉末であることを特徴とする米麹を有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１３】
項３． 項１〜２のいずれか１項に記載の米麹を水抽出したものを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１４】
項４． 米麹を構成する菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉのうち、少なくとも１つから成る項１〜３記載の組成物。
【００１５】
項５． Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉの米麹を水を含む溶媒又は熱水を含む溶媒で抽出したものを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１６】
項６． 新規ペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ。
【００１７】
項７． 項６記載のペプチドを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１８】
項８． 項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を有効成分とする高血圧予防・治療・改善剤。
【００１９】
項９． 項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を高血圧予防・治療・改善に使用する方法。
【００２０】
項１０． 項１から５記載の組成物の製造方法。
【００２１】
項１１． 米麹をペプシンにより分解して得られる項６記載のペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の結果、高額で副作用の高い医療用アンギオテンシン変換酵素阻害剤や、高額なアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドとは異なり、安価で製造ステップが容易な米麹を有効成分とする血圧降下作用を有する組成物を産業的に提供、量産できることとなった。また、米麹あるいはその抽出されるペプチドは、過分解や消化酵素耐性に問題があるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドとは異なり、経口摂取した場合に、胃あるいは膵臓由来の消化酵素に安定なアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを大量に体内に供給することができる。さらに、胃あるいは膵臓由来の消化酵素に安定なアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの構造を決定することにより、当該ペプチドを富化増強することにより、従来にないアンギオテンシン変換酵素阻害活性が高い米麹を産業的に提供することが可能となった。また、米麹は平均粒子径の大きさにより、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの抽出量が変化することから、米麹を摂取する上で、最適な平均粒子径を決定することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に記述する。
【００２４】
（１）清酒醸造原料を用いた組成物
【００２５】
本発明で言う、清酒醸造原料を用いた組成物とは、麹のことを言い、特に米麹のことを言う。米麹の作成法は常法に従って行えばよいが、例えば次のように行うことができる。吸水させた米を水切りし、蒸米器で４０分〜８０分蒸きょうする。蒸きょうした米に種麹（麹菌の胞子）を接種するが、接種する菌は、黄麹菌と黒麹菌、白麹菌が可能である。白麹菌とは黒麹菌の色素欠失変異体で、遺伝的にはほとんど同種あるいは等価である。黄麹菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉから選ばれるいずれか１つから成るものである。これらは遺伝的に非常に近い菌株であり、それぞれ等価な菌株といえる。また、黒麹菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、から選ばれるいずれか１つから成るものである。これらは遺伝的に非常に近い菌株であり、それぞれ等価な菌株といえる。白麹菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉからなるものである。これについても、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓなどの黒麹菌と遺伝的に同等であり、黒麹菌と等価な菌株であるといえる。これを恒温恒湿器などの温度制御できる容器で３８〜５０時間、３０℃〜４５℃の温度で製麹を行う。これにより作成されたものを米麹と呼ぶ。
【００２６】
本発明において本組成物を、降圧効果のある組成物、その組成物を有効成分とする高血圧の予防・治療・改善剤、その組成物を含有し、高血圧を予防または改善するために用いられる旨の表示を付した飲食品などとして用いる。その場合は、本組成物を平均粒子径３３６０μｍ以下、より好ましくは平均粒子径２０００μｍ以下，さらに好ましくは平均粒子径１０００μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径５００μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径３５５μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径２５０μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径１５０μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径１２５μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径９０μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径６３μｍ以下に粉砕して用いることがより効果的である。
【００２７】
また、本発明の組成物は米麹又は粉砕した米麹を抽出などの工程なしに直接使用することもできるし、さらに米麹又は粉砕した米麹からペプチドを水又は適当なバッファーで抽出したものも使用することができる。抽出としては、米麹１に対して水又は適当なバッファー１〜１０を加え、数秒から１時間以上撹拌した後にこれを遠心、濾過などで固形物を除く。遠心はバッチ式の遠心又は連続式の遠心など、一般的な遠心分離方法を広く用いることができる。濾過は漏斗と濾紙による通常の濾過、ブフナー漏斗を用いた減圧吸引式の濾過などの濾過方法を広く用いることができる。得られた濾液はその後、限外濾過などで濃縮することもできるし、凍結乾燥やスプレードライで乾燥することもできる。
【００２８】
（２）アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定
【００２９】
アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定法として最も利用されているＣｕｓｈｍａｎ＆Ｃｈｅｕｎｇ法を参考に、アンギオテンシン変換酵素により基質から遊離した馬尿酸を、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により直接定量する方法で行った。つまり、適当な濃度（阻害率５０％前後となる濃度）のペプチド溶液６０μｌと、１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶解した０．１ｕｎｉｔ／ｍｌアンギオテンシン変換酵素溶液（ＳＩＧＭＡ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｌｕｎｇ）３０μｌを混和し、３７℃３分保持する。対照は蒸留水を使用する。これに、さらに１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶解した最終濃度５ｍＭヒプリルヒスチジルロイシンと最終濃度４００ｍＭＮａＣｌの基質溶液３００μｌを加え、３７℃３０分反応させる。３０分後に、３％メタリン酸溶液５００μｌ を加え反応を停止させる。遊離する馬尿酸をＨＰＬＣにより定量する。ＨＰＬＣ条件は、カラムがＷａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅＴＭ Ｃ−１８ （１５０ｍｍＸ３．０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）、バッファーが２０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）：メタノール＝５５：４５、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎを採用した。阻害率は、（対照の遊離馬尿酸−サンプルの遊離馬尿酸）／対照の遊離馬尿酸Ｘ１００で算出した。また、ＩＣ５０は阻害率が５０％となる反応溶液中（３９０μｌ）での阻害物質（サンプル）濃度で算出する。
【００３０】
（３）アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド
【００３１】
本発明で用いたアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドは次のようにして調製した。
【００３２】
ペプチドの抽出に用いる米麹としては、そのままの粒状のものを用いても良いし、ミルなどの加工機を用いて物理的に粉状にしたものも用いることができる。抽出条件としては、米麹１に対して等量以上の容量の水、あるいはバッファーを用いて、室温あるいは加熱して抽出することもできる。好ましくは、加熱する場合に、自己消化を促すために麹由来のプロテアーゼ酵素反応が進行しうる３０−６０℃の加熱をすることも可能であり、さらに熱湯抽出することも可能である。抽出時間は、数秒から１時間でも可能であるが、１時間以上の抽出も可能である。抽出した溶液を遠心あるいはろ過により、上清を抽出し、その上清を凍結乾燥あるいはスプレードライを用いて乾燥させ、ペプチド標品とすることができる。また、米麹を水あるいはバッファーに浸し、市販のプロテアーゼ酵素剤を添加して、ペプチドを増強することもできる。ペプチドを増やしてから、その上清を遠心、ろ過で抽出し、その上清を凍結乾燥あるいはスプレードライを用いて乾燥させ、ペプチド標品とすることができる。分解に用いるプロテアーゼは、微生物、植物、動物由来の酵素ならいずれも使用でき、例えば、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼのいずれでもよく、例えば、コクラーゼ、サモアーゼ、レンネット、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ニューラーゼＦ３Ｇ、パパインＷ−４０、ウマミザイムＧ、プロメラインＦ、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、ペプチダーゼＲ、サーモリシン、モルシンＦ、スミチームＡＰ、ニュートラーゼ、アクチナーゼＡＳなどの、市販の食品工業用酵素を広く使用できる。
【００３３】
（４）発酵組成物を有効成分とする高血圧予防・治療剤
【００３４】
本発明の発酵組成物を用いた高血圧予防・治療剤は、そのまま又は薬学的に許容される各種担体（賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤、着色剤、矯味矯臭剤らが含まれる）と配合して、適当な製剤とされる。また、この製剤には慣用の添加剤などを混合して医薬組成物として調製できる。
【００３５】
製剤形態は、特に限定されず、例えばこの医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤などの各種製剤形態）を挙げることができる。経口投与剤の方が、非経口投与剤に比べて患者への負担が小さいために、使用し易い。
【００３６】
賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類、バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、結晶セルロース等の各種セルロース類、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。
【００３７】
結合剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００３８】
崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３９】
潤沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。
【００４０】
付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトールなどが挙げられる。
【００４１】
矯味矯臭剤としては、通常使用される甘味料、酸味料、香料など公知のものを広く使用でき、例えば、白糖、グルコース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ケイヒ油、ハッカ油、メントールなどが挙げられる。
【００４２】
（５）高血圧予防・治療剤を含む飲食品組成物
【００４３】
本発明の高血圧予防・治療剤は食品添加剤として用いることができる。食品添加剤には、本発明の高血圧予防・治療剤の他に、糖類、デンプン類、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、植物油などの担体や、添加剤が含まれていてもよい。食品添加剤の剤形は、特に限定されないが、例えば、粉状、顆粒状、液体状のような剤形とすることができる。
【００４４】
本発明の組成物は、食品の風味を損ねるような味や匂いを有さない。従って、食品の種類は特に限定されない。例えば、飴、ガム、ケーキ、パイ、クッキー、パン、クラッカー、ゼリー、チョコレート、プディング、アイスクリーム、ポテトチップス、羊羹、煎餅、饅頭、中華饅頭のような菓子；酒類、茶類、コーヒー類、スポーツドリンク類、清涼飲料水、スープ、乳飲料のような飲料；ヨーグルト、バター、チーズのような乳製品；ハム、ソーセージ、蒲鉾、竹輪のような練り物；ソース、ドレッシング、マヨネーズ、醤油、味噌、酢、味醂、トマト加工品（ケチャップ、トマトペースト、トマトピューレ）、カレールウ、酒粕、顆粒だしのような調味料；ふりかけ、漬物、佃煮、塩昆布のような常備惣菜類；惣菜；麺、米飯、粥のような主食類などが挙げられる。また、ペットフードに用いることができる。
【００４５】
また、水抽出した本発明の組成物は、飲料や、ソース、ドレッシング、醤油、酢、味醂のような液状調味料などの液状食品に用いることができ、酒類、茶類、コーヒー類、スポーツドリンク類、及び清涼飲料水に用いることがより好ましい。また低ｐＨ条件下でも高い水溶性を示すため、マヨネーズやドレッシングのような液状酸性食品の添加剤としても好適に使用できるという利点がある。さらに高温高圧処理に耐えるため、本発明の組成物を添加した食品の加熱加圧滅菌を行えるとともに、レトルト処理のような特殊な製造工程を経ることもできるという利点もある。加えて本組成物は、清酒製造原料を用いたもの、又はそれに含まれているものであることから、その安全性が歴史的に確認されている点でも、食品添加物として好適である。
【００４６】
本発明の食品組成物には、その他に、加工食品に通常添加される各種の添加剤が含まれていてもよい。食品組成物の調製に当たり慣用されている各種添加剤を添加配合することができる。添加剤としては、例えば、安定化剤、ｐＨ調整剤、糖類、甘味料、香料、各種ビタミン類、ミネラル類、抗酸化剤、賦形剤、可溶化剤、結合剤、滑沢剤、懸濁剤、湿潤剤、皮膜形成物質、矯味剤、矯臭剤、着色料、保存剤等を例示することができる。
【００４７】
また、本発明の食品組成物は、高血圧の予防若しくは改善のための栄養補助食品、即ちサプリメントとしても好適に使用できる。この場合の食品組成物中には、本発明の組成物の他に、サプリメントの担体として公知の成分が含まれていればよい。このような担体として、例えば糖類、デンプン類、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、植物油が挙げられる。
【００４８】
サプリメントの形状は特に限定されないが、例えば、錠剤状、粉状、顆粒状などの形状が挙げられる。
【００４９】
（６）ヒトモニター試験
【００５０】
米麹の血圧降下作用の確認を、in vivo試験として、ヒトに米麹を摂取させるヒトモニター試験により行う。被験者は正常高値血圧〜軽症高血圧を対象とし、以下１）、２）のいずれか、または両方に当てはまるという条件に適合する者で、降圧剤非使用者かつ喫煙習慣なしである者とし、米麹摂取試験を実施する。
１）収縮期血圧130mmHg以上169mmHg以下
２）拡張期血圧85mmHg以上109mmHg以下
また、当該試験は、ヘルシンキ宣言の趣旨に従い、被験者に対しては研究内容、方法等について十分な説明を行い、文書による同意を得て実施する。
【００５１】
モニター試験におけるサンプル摂取に当たっては、本発明により同定された、アンギオテンシン変換酵素阻害活性が確認されたペプチドを使用してもよいが、高血圧予防・治療剤を含む飲食品組成物として実際に摂取する現実的な形態で試験を行うため、単離・精製などの手順を必要としない、血圧降下作用を持つペプチドを含む米麹を用いることの方が好ましい。
【００５２】
用いる米麹は血圧降下作用を持つペプチドを含むものであればどれでも構わないが、血圧降下に有効な量を摂取するモニターの負担なども考慮すると、血圧降下の比活性の高いＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｋａｗａｃｈｉｉの米麹を用いることがより望ましい。この時の１日あたりの摂取量はin vitroの試験結果から計算した、５〜３０ｇが好ましいが、より好ましくは１０〜２０ｇである。摂取期間は、効果を確認するため、２週間〜６週間が好ましいが、より好ましくは３〜５週間である。
【００５３】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
米麹の製麹及び組成物の調製
【００５５】
精米歩合７０％の粳米６ｋｇを井戸水に浸漬し、一晩置いた後、これを蒸米器で１時間蒸きょうし、３０℃まで冷却した後にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＬＡＢ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ３１２９−７、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ１１１７、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＥＫ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅスリー、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅＭ７０、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＢＥＴ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＢＦ１、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅの各種麹をそれぞれ蒸米５００ｇずつに０．５ｇずつ塗布して蒸米を攪拌し、これを固体培養装置（ヤエガキ社製）に入れた。温度を３５℃に調節し、１０時間後から３０時間後まで時々米麹をかき混ぜ、その後温度を４０℃に調節して、固体培養装置に入れてから４８時間後に固体培養装置から出して通風乾燥しそれぞれの製麹を終えた。
【００５６】
製麹した粒状の米麹あるいはそれを粉砕した粉状の米麹について、該米麹の５倍量の水を加え、室温で２時間撹拌した後に、ブフナー漏斗で減圧濾過し、水不溶物を除去して、米麹の水抽出液を得た。この上清を凍結乾燥して得たエキス粉末をアンギオテンシン変換酵素阻害アッセイに供した。
【実施例２】
【００５７】
米麹のアンギオテンシン変換酵素阻害活性の比較
【００５８】
実施例１で製麹した米麹の水抽出物の凍結乾燥エキス粉末を３％の水溶液として、これをアンギオテンシン変換酵素阻害アッセイのペプチド溶液として使用した。上記ペプチド溶液６０μｌと、１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶解した０．１ｕｎｉｔ／ｍｌアンギオテンシン変換酵素溶液（ＳＩＧＭＡ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｌｕｎｇ）３０μｌを混和し、３７℃３分保持する。対照は蒸留水を使用する。これに、さらに１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶解した最終濃度５ｍＭヒプリルヒスチジルロイシンと最終濃度４００ｍＭＮａＣｌの基質溶液３００μｌを加え、３７℃３０分反応させる。３０分後に、３％メタリン酸溶液５００μｌ を加え反応を停止させる。遊離する馬尿酸をＨＰＬＣにより定量する。ＨＰＬＣ条件は、カラムがＷａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅＴＭ Ｃ−１８ （１５０ｍｍＸ３．０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）、バッファーが２０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）：メタノール＝５５：４５、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎを採用した。阻害率は、（対照の遊離馬尿酸−サンプルの遊離馬尿酸）／対照の遊離馬尿酸Ｘ１００で算出した。
【００５９】
その結果を表１に示す。なお、表１及びこれ以降「Ａ．」とあるのは「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」の略記である。
【００６０】
【表１】
表１の結果から、今回検討した中でアンギオテンシン変換酵素阻害活性が高い順としては、焼酎麹で用いるＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１だということが分かった。また、同じＡ．ｏｒｙｚａｅ種であっても、アンギオテンシン変換酵素阻害活性は２３．８％から６２．９％と、幅広かった。なお、Ａ．ｏｒｙｚａｅスリーは清酒醸造用ではなく、醤油醸造用である。また、Ａ．ｏｒｙｚａｅの中で阻害活性が高かったＡ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２０９６１として寄託されている株である。これらのことから、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の麹菌は、種の間、種の中でも阻害の程度に差があるとは言え、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を持っていると言える。
【実施例３】
【００６１】
各焼酎麹のアンギオテンシン変換酵素阻害活性の比較
【００６２】
実施例２で、アンギオテンシン変換酵素阻害活性が最も高かったのが焼酎麹であったことから、各種焼酎麹のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を調べた。調べたのは次の麹である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ。アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は実施例２の方法に準じて行った。市販の飯米に上記４種類の麹菌を植え、４８時間の米麹作成を行った。凍結乾燥した米麹を１０倍量の水で１０分抽出し、得られた上清を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を３％の水溶液として、これをアンギオテンシン変換酵素阻害アッセイのペプチド溶液として使用した。その結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
表２から分かるように、アンギオテンシン変換酵素阻害活性が最も高かったのは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉであった。次に活性が高かったのはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．であった。その次に活性が高かったのはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉであった。このことから、最も高いアンギオテンシン変換酵素阻害活性を得るには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉを用いるのがよいことが分かった。
【実施例４】
【００６４】
米麹の粉末化によるアンギオテンシン変換酵素阻害活性への影響
【００６５】
米麹から抽出できるペプチド量は、米麹の形態が粒状あるいは粉末状で違いがあるかどうかについて検討した。米麹としては、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉのそれぞれの米麹と、対照として米のみをブレンダーで粉末状に粉砕した。これらの粒状又は粉末状とした米麹又は米を１０倍量の水で室温１時間抽出し、得られた上清を凍結乾燥させて、３％水溶液のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を実施例２の方法に準じて測定した。その結果を図１に示す。
【００６６】
その結果、全ての米麹において、粉砕により粉末化した米麹はアンギオテンシン変換酵素阻害活性が上昇しており、活性は粉砕をしない粒状の米麹に比べて約２０％増加した。このことから、米麹を粉末化した方がアンギオテンシン変換酵素阻害に有効であることが分かった。
【００６７】
上記の結果から、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、粉末状の米麹から大幅に抽出量が増加することから、粉末の粒子径と抽出されるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド量の相関について検討した。凍結乾燥したＡ．ｋａｗａｃｈｉｉの米麹をブレンダーで適当に破砕し、１０種類のふるい（開き目（μｍ）：６３，９０，１２５，１５０，２５０，３５５，５００，１０００，２０００，３３６０）にかけ、そのふるいを通した平均粒子径（μｍ）が『１つ小さいサイズのふるいの開き目＜米麹の直径≦ふるいの開き目』となるよう大きさを揃えた。１５ｍｌ容のチューブに各粉末０．５ｇと蒸留水５ｍｌを加え、十分に攪拌し、１０分間室温にて静置したのち、遠心して得られた上清を１ｍｌサンプリングし、１０分間沸騰水中で湯煎したのち遠心して得られた上清を用いて、アンギオテンシン変換酵素阻害活性およびＢｉｕｒｅｔ反応によるトリペプチド以上のペプチド・タンパク質濃度を測定した。
【００６８】
ふるいの開き目（μｍ）、Ｂｉｕｒｅｔ反応（ペプチド・タンパク質量ｍｇ／ｍｌ）およびアンギオテンシン変換酵素阻害活性率（％）のうちの２項目をそれぞれの軸にプロットしたもの（対数表示の場合あり）を図２から図４に示す。
【００６９】
図２では、ふるいの開き目とペプチド・タンパク質量が累乗近似で示され、図３ではふるいの開き目とアンギオテンシン変換酵素阻害活性率が、図４ではペプチド・タンパク質量とアンギオテンシン変換酵素阻害活性率が対数近似で示される関係であることが明らかとなった。いずれも非常に高い正の相関が認められた。これらは、米麹はより細かい粒として摂取するほうがより効果的に血圧上昇抑制作用が得られることを示している。
【実施例５】
【００７０】
米麹の人工胃腸消化試験
【００７１】
米麹からアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する機能性ペプチドが大量に抽出できることが明らかとなった。しかし、これらの機能性ペプチドが経口摂取した場合に、胃あるいは膵臓由来の消化酵素により分解され、小腸の吸収時にはアンギオテンシン変換酵素阻害活性を消失している可能性が高い。米麹由来のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドが経口摂取した場合に、胃あるいは膵臓由来の消化酵素に耐性を有しているかどうかは、実際に生体内でアンギオテンシン変換酵素阻害活性を発揮する上で非常に重要である。
【００７２】
米麹としては、実施例２で活性が高いＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１の米麹を凍結乾燥しブレンダーで粉末化したものを使用した。
【００７３】
１）粗タンパク質測定
【００７４】
消化酵素の使用量を決定するため、各米麹の粗タンパク質含量を常法に従いケルダール法で求めた。
【００７５】
２）人工消化試験
【００７６】
酵素は、ペプシン（豚胃粘膜由来Ｐｅｐｓｉｎ １：６０，０００（和光純薬））とパンクレアチン（豚膵臓由来Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ））を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ胃腸消化試験を行った。５０ｍｌの三角フラスコに、１．６ｇの米麹凍結乾燥粉末、蒸留水１６ｍｌを加え、０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２．０に調整した。ペプシンを各サンプルの粗タンパク質量に対して４％となるように添加し、恒温水槽にて６０分間、３７℃、１２０ｒｐｍで反応させた後、０．９Ｍ ＮａＨＣＯ３を約１ｍｌ加え、ｐＨ６〜７にして反応を停止させた。続いて、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。パンクレアチンを、各サンプルの粗タンパク質量に対して４％となるように添加し、恒温水槽にて１２０分間、３７℃、１２０ｒｐｍで反応させた後、１０分間沸騰水中で加熱し反応を停止させた。
【００７７】
反応開始直後（ｔ＝０ペプシン）からペプシン処理（ｔ＝３０、６０ペプシン）、パンクレアチン処理（ｔ＝１２０、１８０パンクレアチン）の計５回、１ｍｌずつサンプリングし、３分間沸騰水中で加熱し、遠心後の上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、アンギオテンシン変換酵素阻害活性測定時まで−２０℃に冷凍した。ブランクは、酵素を添加せずに各サンプル粉末液を３分間沸騰水中で加熱したものを使用した。
【００７８】
粗タンパク質
【００７９】
粗タンパク質含量を表３に示す。
【００８０】
【表３】
【００８１】
人工消化試験
【００８２】
人工消化試験においては、パンクレアチン処理後はすべてのサンプルの粘性は低くなり、タンパク質もデンプン質が分解されたことを示している。
【００８３】
表４に各酵素処理時間のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を示す。ｔ＝０はペプシンを添加してすぐに沸騰水中で加熱したサンプルであるが、わずかな時間でも酵素反応が進み活性ペプチドが増加したと考えられ、ブランクと比較し２倍〜１０倍以上阻害活性が上昇した。その後、ペプシンを６０分間作用させることで、阻害活性は最大となり、最も強い阻害活性を示したＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ麹では、ブランクと比較し２．４倍の活性増加が認められた（ｔ＝６０）。一方で、ブランクでは阻害活性の低かったＡ．ｓｏｊａｅ ９麹およびＡ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１麹も、ペプシン処理３０分後（ｔ＝３０）、６０分後（ｔ＝６０）には、焼酎麹に近い強いアンギオテンシン変換酵素阻害活性を示した。その後、６０分間のパンクレアチン分解により、阻害活性は１〜２割減少するが（ｔ＝１２０）、さらに６０分間パンクレアチン処理を継続しても、それ以上の阻害活性低下は認められなかった（ｔ＝１８０）。
【００８４】
ペプシン添加は、ヒトなどの哺乳動物の胃でのタンパク質分解のモデルであり、パンクレアチン添加は同様に小腸でのタンパク質分解のモデルである。以上の結果より、米麹を経口摂取した場合、胃で米麹タンパク質がペプシン分解を受けることで、米麹からアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの生成が増加し機能性が向上することが示された。さらに、続いて小腸におけるパンクレアチン分解を受けてもアンギオテンシン阻害活性は維持され、機能性ペプチドとして血管内へ吸収される可能性が高いことが示唆された。また、米麹にすることで、麹菌由来のプロテアーゼが米タンパク質の消化分解を助け、機能性ペプチドの生産が効率よく行われることがわかった。
【００８５】
【表４】
【実施例６】
【００８６】
米麹の熱水抽出の効果
【００８７】
米麹からアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する機能性ペプチドを抽出する場合に、抽出に用いる溶媒の温度が影響するかどうかについて検討した。実施例２で作成したＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１の米麹の粉末を、一方は室温の１０倍量の水で１分以内に抽出し、他方は１０倍量の熱水で１分以内に抽出した。対照として、米のみの抽出を行った。抽出液は不溶成分をろ過後、ろ液を凍結乾燥した。各凍結乾燥物の３％溶液を作成し、実施例２に記載のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を算出した。その結果、表５に示すように、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１の米麹は、室温抽出に比べて、熱水抽出では、抽出されるアンギオテンシン変換酵素阻害活性ペプチドの抽出量が減少した。しかし、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉの米麹については、室温水抽出に比べて、熱水抽出では、抽出されるアンギオテンシン変換酵素阻害活性ペプチドの抽出量が４．４％増加した。よって、産業的には、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉの米麹は、熱水抽出することで、アンギオテンシン変換酵素阻害活性ペプチドを増強できることが示された。また、加熱加工品として摂取してもアンギオテンシン変換酵素阻害活性が維持されることが示された。
【００８８】
【表５】
【実施例７】
【００８９】
米麹中のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの単離と同定
【００９０】
米麹の人工胃消化試験で得られるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの単離と構造決定を試みた。２日間製麹した焼酎米麹（日本晴７０％精米使用）を凍結乾燥後細かく粉砕した米麹粉末８０ｇに対し、蒸留水８００ｍｌ、１ＮＨＣｌを３２ｍｌ加えてｐＨ２．０に調整したものを、８本のバッフル付き３００ｍｌ三角フラスコに分注し、それぞれペプシン２５ｍｇ（米麹粉末の０．２５％）を添加し、３７℃、１２０ストロークで１時間反応させた後、ＮａＯＨでｐＨを７．０ に調整し反応を停止させ、米麹人工胃消化物とした。この消化物を遠心分離した上清を回収し、凍結乾燥させ４６ｇのエキス粉末を得た。この粉末は前回までの試験で、高いアンギオテンシン変換酵素阻害活性が認められ、さらにそのアンギオテンシン変換酵素阻害活性は消化酵素耐性であることが分かっている画分である。上記の米麹の人工胃消化物中のペプチドをオープンタイプのゲルろ過カラムクロマトグラフィー（バイオラッドＰ−２ゲル）により分画した。分離条件として、カラムは直径１．５ｃｍ，高さ７５ｃｍ、溶媒は１０％エタノールで、流速０．０８ｍｌ／分であった。その後Ｃ３０の逆相ＨＰＬＣ（野村化学 Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５）で、溶媒は０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリル系で、５−１００％アセトニトリルのグラジエント分離し、アセトニトリル５％の画分に最も強い活性が確認された。さらにＣ３０の逆相ＨＰＬＣ（野村化学 Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５）で、溶媒は０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−メタノール系で、０−３０％メタノールのグラジエント分離を行った。その結果、メタノール５−１０％で溶出するサンプルに顕著なアンギオテンシン変換酵素阻害活性が検出された。得られたサンプルのペプチドについて、常法であるエドマン分解によるＮ末端シーケンスを行った結果、ペプチド配列はＶａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドであると決定した。
【００９１】
得られたペプチド配列Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐの標品を合成し、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を測定した結果を表６に示した。アンギオテンシン阻害活性は、ペプチド濃度に正比例して増加し、この測定値から、阻害率５０％を示す本Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのアンギオテンシン変換酵素阻害活性のＩＣ５０は４１１ｐｐｍであることが判明した。
【００９２】
【表６】
【実施例８】
【００９３】
米麹中のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのパンクレアチン消化耐性
【００９４】
実施例７においては、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉの焼酎米麹を人工胃消化試験としてペプシン消化を行い、その消化物の中から、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を示すペプチドとして、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドを同定した。よって、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドは、ペプシン消化耐性を有し、経口摂取した場合、胃での消化を受けずに、活性を維持したまま小腸に移行しうるペプチドであるといえる。当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドがパンクレアチン消化耐性を有していれば、活性を維持したまま小腸で吸収されるペプチドであることが立証できる。そこで、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドのパンクレアチン消化酵素耐性について検証した。
【００９５】
サンプルとしては、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐの合成ペプチド溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解させた豚すい臓由来パンクレアチン溶液（ＳＩＧＭＡ）（８９μｇ／ｍｌ）、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）を用意した。
【００９６】
反応物としては、以下のものを検討した。
ブランク 水１０μＬと上記パンクレアチン溶液９０μＬ
対照 上記ペプチド溶液１０μＬと上記リン酸バッファー９０μＬ
試験区 上記ペプチド溶液１０μＬと上記パンクレアチン溶液９０μＬ
上記検体を３７度で反応させ、０、６０、１２０分後に１０分間沸騰させ、反応を停止し、アンギオテンシン変換酵素阻害活性の経時変化を測定した。その結果を表７に示した。
【００９７】
【表７】
表７の結果においては、ブランクでパンクレアチン由来の自己消化物にアンギオテンシン変換酵素阻害活性が認められることが判明した。当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドのアンギオテンシン変換酵素阻害活性の経時変化のみを対照と試験区において比較するために、試験区からブランクを差し引いた値と対照を表８に記載した。
【００９８】
【表８】
表８の結果から、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドは、パンクレアチンの添加に関わらず、消化反応前と比較して、１２０分間の消化で１５％前後アンギオテンシン変換酵素阻害活性の低下が認められた。しかしながら、表７の結果より、該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドとパンクレアチンの混合物のアンギオテンシン変換酵素阻害活性は、１２０分間のパンクレアチン消化処理によってまったく低下しないことが判明した。すなわち、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドのアンギオテンシン変換酵素阻害活性は、ペプシン消化耐性を有し、かつパンクレアチン消化によっても総活性が維持されることが明らかとなった。
【００９９】
よって、米麹から人工胃消化試験で精製するアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドの構造を決定することができた。本ペプチドは、米麹の経口摂取で、麹由来のプロテアーゼ、および経口摂取時における胃のペプシン分解などにより得られることから、麹由来のプロテアーゼ耐性を有し、消化管内において安定な小腸吸収時のペプチド構造を示しているといえる。
【実施例９】
【０１００】
パン
【０１０１】
小麦粉１００ｇ、イースト３ｇ、砂糖５ｇ、食塩２ｇ、イーストフード０．１ｇ、実施例２記載のＡ． ｋａｗａｃｈｉｉの米麹の粉末３ｇをよく混ぜて、焼成した。焼成後も、アンギオテンシン変換酵素阻害活性は保持されていた。
【実施例１０】
【０１０２】
クッキー
【０１０３】
小麦粉１００ｇ、バター６０ｇ、砂糖２７０ｇ、全卵１４０ｇ、食塩３ｇ、実施例２記載のＡ． ｋａｗａｃｈｉｉの米麹の粉末３０ｇをよく混ぜて、焼成した。焼成後も、アンギオテンシン変換酵素阻害活性は保持されていた。
【実施例１１】
【０１０４】
甘酒
【０１０５】
実施例２記載のＡ． ｋａｗａｃｈｉｉの米麹１に対して水２（１：２）の混和物を、５５℃で６時間以上糖化させることにより甘酒を製造した。製造後も、アンギオテンシン変換酵素阻害活性は保持されていた。
【実施例１２】
【０１０６】
ヒトでの血圧降下作用の確認
【０１０７】
ヒトモニター試験による米麹の血圧降下作用の確認を行った。被験者は正常高値血圧〜軽症高血圧を対象とし、以下１）、２）のいずれか、または両方に当てはまるという条件に適合する男性3名（平均年齢46.7±5.7歳、平均体重72.3±12.7kg、降圧剤非使用者かつ喫煙習慣なし）による米麹摂取試験を実施した。
１）収縮期血圧130mmHg以上169mmHg以下
２）拡張期血圧85mmHg以上109mmHg以下
また、当該試験は、ヘルシンキ宣言の趣旨に従い、被験者に対しては研究内容、方法等について十分な説明を行い、文書による同意を得て実施した。
【０１０８】
１）試験材料及び方法
実施例４で作成した、凍結乾燥したＡ．ｋａｗａｃｈｉｉの米麹をブレンダーで適当に破砕し、ふるい（目開き（μｍ）：５００）にかけた粉末を使用した。１日あたり前記粉末１５ｇの摂取を４週間毎日継続した。摂取法は、一日の摂取量を守れば、摂取時間・回数は自由であり、水または嗜好飲料に混ぜたり、他の食品と一緒に食べたりしても構わない条件とした。
【０１０９】
２）血圧測定
血圧測定には、テルモ社電子血圧計Ｐ２０００を使用した。血圧測定は、摂取試験開始の１週間前、摂取期間４週間の毎週、及び摂取試験終了から１週間後に行った。
【０１１０】
３）測定結果
各３名の収縮期血圧を図５に示した。３名ともに、摂取試験開始から４週目までに降下する傾向がみられ、摂取試験終了後１週間は上昇する傾向がみられた。また、その平均値についても図６に示したように、摂取試験開始から４週目までに降下する傾向がみられ、摂取試験終了後１週間は上昇する傾向がみられた。
【０１１１】
次に、各３名の拡張期血圧を図７に示した。３名ともに、摂取試験開始から４週目までに降下する傾向がみられ、摂取試験終了後は上昇する傾向がみられた。また、その平均値についても図８に示したように、摂取試験開始から４週目までに降下する傾向がみられ、摂取試験終了後１週間は上昇する傾向がみられた。また、図９に示すように、摂取試験開始から４週目の拡張期血圧の平均値は、摂取試験開始１週間前の拡張期血圧の平均値と比較して、有意に降下していることが示された(p<0.05)。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】焼酎麹のアンギオテンシン変換酵素阻害活性の比較を示した図である。
【図２】米麹の粉末の平均粒子径と水溶性タンパク質・ペプチド含量の相関を示した図である。
【図３】米麹粉末の粒径とＡＣＥ阻害活性の相関を示した図である。
【図４】水溶性タンパク質・ペプチド含量とＡＣＥ阻害活性の相関を示した図である。
【図５】各人の米麹摂取による収縮期血圧の変化を示した図である。
【図６】米麹摂取による収縮期血圧の変化の平均を示した図である。
【図７】各人の米麹摂取による拡張期血圧の変化を示した図である。
【図８】米麹摂取による拡張期血圧の変化の平均を示した図である。
【図９】米麹摂取前と摂取４週間後の拡張期血圧の平均を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、清酒醸造原料を用いた組成物に関するものであり、特に高血圧を予防・治療・改善する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は生活習慣病の一つに挙げられているが、高血圧はある程度まで進行しないと特別な自覚症状がない。このため、高血圧はサイレントキラーとも呼ばれ、自覚症状がないままに密かに病状が進行し、数々の合併症を引き起こす可能性がある。血管の壁は本来弾力性があるが、高血圧状態が長く続くと動脈硬化を引き起こし脳出血や脳梗塞、大動脈瘤、心筋梗塞、眼底出血などの原因となる。また、細小動脈の硬化が進むと腎硬化症を発症することにより腎臓の機能が低下し、腎不全や尿毒症になる場合もある。また、心臓に負担がかかることにより心臓肥大や心不全を引き起こすこともある。
【０００３】
日本高血圧学会の高血圧治療ガイドラインでは、血圧値に基づいて至適血圧、正常血圧、正常高値血圧、高血圧に分類されており、収縮期血圧（最高血圧）１４０ｍｍＨｇ以上、又は拡張期血圧（最低血圧）９０ｍｍＨｇ以上を高血圧と定義している。血圧は年齢と共に上がる傾向にあり、高血圧患者は全国で３０００万人から３５００万人と言われており、そのうち約７００万人が治療を受けている（平成１８年現在）。
【０００４】
高血圧患者の数は非常に多いが、現在の医学検査では高血圧の明らかな原因が見つからないものを本態性高血圧と言い、高血圧の９０％以上を占めている。残りの１０％程度の高血圧は二次性高血圧あるいは症候性高血圧と言い、血圧を上げる原因が見つかっている。二次性高血圧としては、大動脈縮窄症、腎血管性高血圧、腎実質性高血圧、原発性アルドステロン症、クッシング症候群、褐色細胞腫、大動脈炎症候群、甲状腺機能異常などが挙げられ、それぞれの原因疾患の治療を行うことが血圧の低下に有効である。
【０００５】
一方、本態性高血圧は遺伝的な因子や生活習慣などの環境因子が関与しており、例えば過剰な塩分摂取・肥満・過度の飲酒・喫煙・精神的ストレス・自律神経の調節異常・過剰の肉体労働・タンパク質や脂質の不適切な摂取などがある。これらの要因は複雑に影響を及ぼしあっているため高血圧の原因となっている因子を特定することは難しい。従って、本態性高血圧を治療する有効な方法として、降圧剤で血圧を下げるということが中心に行われている。
【０００６】
本態性高血圧の原因として考えられる因子のうちで、レニン・アンギオテンシン系は重要な因子と考えられている。このレニン・アンギオテンシン系でアンギオテンシン変換酵素（ＥＣ３．４．１５．１）は中心的な働きをしている。即ち、肝臓で分泌されたアンギオテンシノーゲンは腎臓に存在するレニンによってアンギオテンシン１となり、アンギオテンシン変換酵素により血管壁平滑筋収縮作用のあるアンギオテンシン２が生成され、血圧が上昇する。さらにアンギオテンシン２は副腎皮質球状層のアルドステロン生成促進作用を有しているために、さらに血圧が上昇する。一方、降圧系では、キニノーゲンが血漿中に存在するカリクレインによって分解され、血管壁平滑筋拡張作用があるブラジキニンが生成されるが、このブラジキニンはアンギオテンシン変換酵素により分解され、不活性化される。従って、このアンギオテンシン変換酵素を阻害すれば昇圧性ペプチドであるアンギオテンシン２の生成を抑制し、降圧性ペプチドであるブラジキニンの分解をも抑制して血圧の降下が可能となる。
【０００７】
本態性高血圧の治療としては、アンギオテンシン変換酵素阻害物質を主成分としたアンギオテンシン変換酵素阻害薬が医薬品として実用化されている。また、その他にはアンギオテンシン変換酵素阻害活性を持つペプチドがいくつか発見され、それらアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを得る方法として、牛乳カゼイン、大豆タンパク質、イワシタンパク質、トウモロコシ、小麦、卵白アルブミンなどの加水分解物からの単離が報告されている。また、特許文献４や非特許文献１では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌やＭｏｎａｓｃｕｓ属糸状菌の麹（紅麹）が高血圧の改善に有効であるという報告もある。しかし、非特許文献１では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌の降圧効果成分としては、イソフラボン類が指摘され、Ｍｏｎａｓｃｕｓ属糸状菌の麹では降圧効果成分としてアンギオテンシン変換酵素阻害活性ペプチドの非関与が指摘されている。しかし依然として、降圧効果の作用機序および有効成分は不明であった。また、これらはラットを用いた動物実験の効果であり、ヒトが経口摂取した場合にどのような効果を示すかどうかは不明であった。
【特許文献１】特開平７−７０１８０号公報
【特許文献２】特開２００２−２４７９５５号公報
【特許文献３】特開平５−３３１１９０号公報
【特許文献４】特公平３−３１１７０号公報
【非特許文献１】日本農芸化学会誌Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ８，ｐ１２４１〜１２４６，１９９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
医療用薬剤としてのアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、医師の処方に基づいて使用しなければならなく、さらにその価格が高いという問題がある。また、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを用いる場合、イワシ由来ペプチドや発酵乳のペプチドを用いる場合は、ペプチド自体がえぐ味、雑味を有しており、食品として添加する場合に呈味性の問題がある。さらに、ペプチドで製造したものを摂取しても、胃あるいは膵臓由来の消化酵素に不安定で、小腸吸収時にはアミノ酸に分解され、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を消失することも問題である。また、他のペプチドを用いる場合にしても、それぞれ加水分解するなどの処理の必要があり、抽出、分解、遠心、凍結乾燥などの操作が必要となり、これらの操作専用の高額な装置を購入しなければならず、装置の維持費や装置の購入コストがかかるという問題があり、結果として高額な機能性食品素材として販売されている。さらに、食品タンパク質から機能性ペプチドを工業的に生産する場合に、市販のプロテアーゼ酵素剤は各種プロテアーゼ分子の混合物であり、機能性を発揮しうる構造のペプチドとして残存するように反応を停止させることが工業上難しく、アミノ酸まで分解される過分解が報告されている。過分解されたアミノ酸を多く含むペプチドを用いた場合に、アミノ酸の緩衝能が高いために、食品添加物として使用する場合に、ｐＨ調節のために過剰な有機酸を添加する必要があり、食品本来の風味を破壊する問題がある。このため、安価に製造購入でき、かつ複雑な製造ステップを必要としないアンギオテンシン変換酵素阻害物質が望まれている。また、麹による降圧作用については、その作用機序及び有効成分が不明であり、有効成分を富化することにより、降圧作用を増強した麹を作成できない問題点があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者らは鋭意検討の結果、降圧効果をもたらす要因として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌の米麹及び米麹水抽出物にアンギオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出した。またさらに、米麹中に含まれるタンパク質を人工胃腸消化したペプチドにもアンギオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出し、そのペプチドを同定することにも成功した。当該ペプチドは、経口摂取でも、消化酵素に安定で、小腸に直接吸収されうる。さらに、ヒトモニター試験の結果、米麹の摂取により、正常高値血圧〜軽症高血圧である者の血圧が有意に降下することを確かめた。
【００１０】
本発明は、上記知見に基づき完成されたもので、以下、降圧効果のある組成物、その組成物を有効成分とする高血圧の予防・治療・改善剤、その組成物を含有し、高血圧を予防または改善するために用いられる旨の表示を付した飲食品などを提供すること、及びそれらの製造方法などに関する。
【００１１】
項１． 平均粒子径が３３６０μｍ以下であることを特徴とする米麹を有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１２】
項２． 平均粒子径が５００μｍ以下の粉末であることを特徴とする米麹を有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１３】
項３． 項１〜２のいずれか１項に記載の米麹を水抽出したものを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１４】
項４． 米麹を構成する菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉのうち、少なくとも１つから成る項１〜３記載の組成物。
【００１５】
項５． Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉの米麹を水を含む溶媒又は熱水を含む溶媒で抽出したものを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１６】
項６． 新規ペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ。
【００１７】
項７． 項６記載のペプチドを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【００１８】
項８． 項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を有効成分とする高血圧予防・治療・改善剤。
【００１９】
項９． 項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を高血圧予防・治療・改善に使用する方法。
【００２０】
項１０． 項１から５記載の組成物の製造方法。
【００２１】
項１１． 米麹をペプシンにより分解して得られる項６記載のペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の結果、高額で副作用の高い医療用アンギオテンシン変換酵素阻害剤や、高額なアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドとは異なり、安価で製造ステップが容易な米麹を有効成分とする血圧降下作用を有する組成物を産業的に提供、量産できることとなった。また、米麹あるいはその抽出されるペプチドは、過分解や消化酵素耐性に問題があるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドとは異なり、経口摂取した場合に、胃あるいは膵臓由来の消化酵素に安定なアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドを大量に体内に供給することができる。さらに、胃あるいは膵臓由来の消化酵素に安定なアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの構造を決定することにより、当該ペプチドを富化増強することにより、従来にないアンギオテンシン変換酵素阻害活性が高い米麹を産業的に提供することが可能となった。また、米麹は平均粒子径の大きさにより、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの抽出量が変化することから、米麹を摂取する上で、最適な平均粒子径を決定することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に記述する。
【００２４】
（１）清酒醸造原料を用いた組成物
【００２５】
本発明で言う、清酒醸造原料を用いた組成物とは、麹のことを言い、特に米麹のことを言う。米麹の作成法は常法に従って行えばよいが、例えば次のように行うことができる。吸水させた米を水切りし、蒸米器で４０分〜８０分蒸きょうする。蒸きょうした米に種麹（麹菌の胞子）を接種するが、接種する菌は、黄麹菌と黒麹菌、白麹菌が可能である。白麹菌とは黒麹菌の色素欠失変異体で、遺伝的にはほとんど同種あるいは等価である。黄麹菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉから選ばれるいずれか１つから成るものである。これらは遺伝的に非常に近い菌株であり、それぞれ等価な菌株といえる。また、黒麹菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、から選ばれるいずれか１つから成るものである。これらは遺伝的に非常に近い菌株であり、それぞれ等価な菌株といえる。白麹菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉからなるものである。これについても、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓなどの黒麹菌と遺伝的に同等であり、黒麹菌と等価な菌株であるといえる。これを恒温恒湿器などの温度制御できる容器で３８〜５０時間、３０℃〜４５℃の温度で製麹を行う。これにより作成されたものを米麹と呼ぶ。
【００２６】
本発明において本組成物を、降圧効果のある組成物、その組成物を有効成分とする高血圧の予防・治療・改善剤、その組成物を含有し、高血圧を予防または改善するために用いられる旨の表示を付した飲食品などとして用いる。その場合は、本組成物を平均粒子径３３６０μｍ以下、より好ましくは平均粒子径２０００μｍ以下，さらに好ましくは平均粒子径１０００μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径５００μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径３５５μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径２５０μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径１５０μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径１２５μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径９０μｍ以下、さらに好ましくは平均粒子径６３μｍ以下に粉砕して用いることがより効果的である。
【００２７】
また、本発明の組成物は米麹又は粉砕した米麹を抽出などの工程なしに直接使用することもできるし、さらに米麹又は粉砕した米麹からペプチドを水又は適当なバッファーで抽出したものも使用することができる。抽出としては、米麹１に対して水又は適当なバッファー１〜１０を加え、数秒から１時間以上撹拌した後にこれを遠心、濾過などで固形物を除く。遠心はバッチ式の遠心又は連続式の遠心など、一般的な遠心分離方法を広く用いることができる。濾過は漏斗と濾紙による通常の濾過、ブフナー漏斗を用いた減圧吸引式の濾過などの濾過方法を広く用いることができる。得られた濾液はその後、限外濾過などで濃縮することもできるし、凍結乾燥やスプレードライで乾燥することもできる。
【００２８】
（２）アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定
【００２９】
アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定法として最も利用されているＣｕｓｈｍａｎ＆Ｃｈｅｕｎｇ法を参考に、アンギオテンシン変換酵素により基質から遊離した馬尿酸を、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により直接定量する方法で行った。つまり、適当な濃度（阻害率５０％前後となる濃度）のペプチド溶液６０μｌと、１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶解した０．１ｕｎｉｔ／ｍｌアンギオテンシン変換酵素溶液（ＳＩＧＭＡ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｌｕｎｇ）３０μｌを混和し、３７℃３分保持する。対照は蒸留水を使用する。これに、さらに１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶解した最終濃度５ｍＭヒプリルヒスチジルロイシンと最終濃度４００ｍＭＮａＣｌの基質溶液３００μｌを加え、３７℃３０分反応させる。３０分後に、３％メタリン酸溶液５００μｌ を加え反応を停止させる。遊離する馬尿酸をＨＰＬＣにより定量する。ＨＰＬＣ条件は、カラムがＷａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅＴＭ Ｃ−１８ （１５０ｍｍＸ３．０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）、バッファーが２０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）：メタノール＝５５：４５、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎを採用した。阻害率は、（対照の遊離馬尿酸−サンプルの遊離馬尿酸）／対照の遊離馬尿酸Ｘ１００で算出した。また、ＩＣ５０は阻害率が５０％となる反応溶液中（３９０μｌ）での阻害物質（サンプル）濃度で算出する。
【００３０】
（３）アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド
【００３１】
本発明で用いたアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドは次のようにして調製した。
【００３２】
ペプチドの抽出に用いる米麹としては、そのままの粒状のものを用いても良いし、ミルなどの加工機を用いて物理的に粉状にしたものも用いることができる。抽出条件としては、米麹１に対して等量以上の容量の水、あるいはバッファーを用いて、室温あるいは加熱して抽出することもできる。好ましくは、加熱する場合に、自己消化を促すために麹由来のプロテアーゼ酵素反応が進行しうる３０−６０℃の加熱をすることも可能であり、さらに熱湯抽出することも可能である。抽出時間は、数秒から１時間でも可能であるが、１時間以上の抽出も可能である。抽出した溶液を遠心あるいはろ過により、上清を抽出し、その上清を凍結乾燥あるいはスプレードライを用いて乾燥させ、ペプチド標品とすることができる。また、米麹を水あるいはバッファーに浸し、市販のプロテアーゼ酵素剤を添加して、ペプチドを増強することもできる。ペプチドを増やしてから、その上清を遠心、ろ過で抽出し、その上清を凍結乾燥あるいはスプレードライを用いて乾燥させ、ペプチド標品とすることができる。分解に用いるプロテアーゼは、微生物、植物、動物由来の酵素ならいずれも使用でき、例えば、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼのいずれでもよく、例えば、コクラーゼ、サモアーゼ、レンネット、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ニューラーゼＦ３Ｇ、パパインＷ−４０、ウマミザイムＧ、プロメラインＦ、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、ペプチダーゼＲ、サーモリシン、モルシンＦ、スミチームＡＰ、ニュートラーゼ、アクチナーゼＡＳなどの、市販の食品工業用酵素を広く使用できる。
【００３３】
（４）発酵組成物を有効成分とする高血圧予防・治療剤
【００３４】
本発明の発酵組成物を用いた高血圧予防・治療剤は、そのまま又は薬学的に許容される各種担体（賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤、着色剤、矯味矯臭剤らが含まれる）と配合して、適当な製剤とされる。また、この製剤には慣用の添加剤などを混合して医薬組成物として調製できる。
【００３５】
製剤形態は、特に限定されず、例えばこの医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤などの各種製剤形態）を挙げることができる。経口投与剤の方が、非経口投与剤に比べて患者への負担が小さいために、使用し易い。
【００３６】
賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類、バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、結晶セルロース等の各種セルロース類、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。
【００３７】
結合剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００３８】
崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３９】
潤沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。
【００４０】
付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトールなどが挙げられる。
【００４１】
矯味矯臭剤としては、通常使用される甘味料、酸味料、香料など公知のものを広く使用でき、例えば、白糖、グルコース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ケイヒ油、ハッカ油、メントールなどが挙げられる。
【００４２】
（５）高血圧予防・治療剤を含む飲食品組成物
【００４３】
本発明の高血圧予防・治療剤は食品添加剤として用いることができる。食品添加剤には、本発明の高血圧予防・治療剤の他に、糖類、デンプン類、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、植物油などの担体や、添加剤が含まれていてもよい。食品添加剤の剤形は、特に限定されないが、例えば、粉状、顆粒状、液体状のような剤形とすることができる。
【００４４】
本発明の組成物は、食品の風味を損ねるような味や匂いを有さない。従って、食品の種類は特に限定されない。例えば、飴、ガム、ケーキ、パイ、クッキー、パン、クラッカー、ゼリー、チョコレート、プディング、アイスクリーム、ポテトチップス、羊羹、煎餅、饅頭、中華饅頭のような菓子；酒類、茶類、コーヒー類、スポーツドリンク類、清涼飲料水、スープ、乳飲料のような飲料；ヨーグルト、バター、チーズのような乳製品；ハム、ソーセージ、蒲鉾、竹輪のような練り物；ソース、ドレッシング、マヨネーズ、醤油、味噌、酢、味醂、トマト加工品（ケチャップ、トマトペースト、トマトピューレ）、カレールウ、酒粕、顆粒だしのような調味料；ふりかけ、漬物、佃煮、塩昆布のような常備惣菜類；惣菜；麺、米飯、粥のような主食類などが挙げられる。また、ペットフードに用いることができる。
【００４５】
また、水抽出した本発明の組成物は、飲料や、ソース、ドレッシング、醤油、酢、味醂のような液状調味料などの液状食品に用いることができ、酒類、茶類、コーヒー類、スポーツドリンク類、及び清涼飲料水に用いることがより好ましい。また低ｐＨ条件下でも高い水溶性を示すため、マヨネーズやドレッシングのような液状酸性食品の添加剤としても好適に使用できるという利点がある。さらに高温高圧処理に耐えるため、本発明の組成物を添加した食品の加熱加圧滅菌を行えるとともに、レトルト処理のような特殊な製造工程を経ることもできるという利点もある。加えて本組成物は、清酒製造原料を用いたもの、又はそれに含まれているものであることから、その安全性が歴史的に確認されている点でも、食品添加物として好適である。
【００４６】
本発明の食品組成物には、その他に、加工食品に通常添加される各種の添加剤が含まれていてもよい。食品組成物の調製に当たり慣用されている各種添加剤を添加配合することができる。添加剤としては、例えば、安定化剤、ｐＨ調整剤、糖類、甘味料、香料、各種ビタミン類、ミネラル類、抗酸化剤、賦形剤、可溶化剤、結合剤、滑沢剤、懸濁剤、湿潤剤、皮膜形成物質、矯味剤、矯臭剤、着色料、保存剤等を例示することができる。
【００４７】
また、本発明の食品組成物は、高血圧の予防若しくは改善のための栄養補助食品、即ちサプリメントとしても好適に使用できる。この場合の食品組成物中には、本発明の組成物の他に、サプリメントの担体として公知の成分が含まれていればよい。このような担体として、例えば糖類、デンプン類、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、植物油が挙げられる。
【００４８】
サプリメントの形状は特に限定されないが、例えば、錠剤状、粉状、顆粒状などの形状が挙げられる。
【００４９】
（６）ヒトモニター試験
【００５０】
米麹の血圧降下作用の確認を、in vivo試験として、ヒトに米麹を摂取させるヒトモニター試験により行う。被験者は正常高値血圧〜軽症高血圧を対象とし、以下１）、２）のいずれか、または両方に当てはまるという条件に適合する者で、降圧剤非使用者かつ喫煙習慣なしである者とし、米麹摂取試験を実施する。
１）収縮期血圧130mmHg以上169mmHg以下
２）拡張期血圧85mmHg以上109mmHg以下
また、当該試験は、ヘルシンキ宣言の趣旨に従い、被験者に対しては研究内容、方法等について十分な説明を行い、文書による同意を得て実施する。
【００５１】
モニター試験におけるサンプル摂取に当たっては、本発明により同定された、アンギオテンシン変換酵素阻害活性が確認されたペプチドを使用してもよいが、高血圧予防・治療剤を含む飲食品組成物として実際に摂取する現実的な形態で試験を行うため、単離・精製などの手順を必要としない、血圧降下作用を持つペプチドを含む米麹を用いることの方が好ましい。
【００５２】
用いる米麹は血圧降下作用を持つペプチドを含むものであればどれでも構わないが、血圧降下に有効な量を摂取するモニターの負担なども考慮すると、血圧降下の比活性の高いＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｋａｗａｃｈｉｉの米麹を用いることがより望ましい。この時の１日あたりの摂取量はin vitroの試験結果から計算した、５〜３０ｇが好ましいが、より好ましくは１０〜２０ｇである。摂取期間は、効果を確認するため、２週間〜６週間が好ましいが、より好ましくは３〜５週間である。
【００５３】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
米麹の製麹及び組成物の調製
【００５５】
精米歩合７０％の粳米６ｋｇを井戸水に浸漬し、一晩置いた後、これを蒸米器で１時間蒸きょうし、３０℃まで冷却した後にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＬＡＢ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ３１２９−７、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ１１１７、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＥＫ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅスリー、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅＭ７０、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＢＥＴ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＢＦ１、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅの各種麹をそれぞれ蒸米５００ｇずつに０．５ｇずつ塗布して蒸米を攪拌し、これを固体培養装置（ヤエガキ社製）に入れた。温度を３５℃に調節し、１０時間後から３０時間後まで時々米麹をかき混ぜ、その後温度を４０℃に調節して、固体培養装置に入れてから４８時間後に固体培養装置から出して通風乾燥しそれぞれの製麹を終えた。
【００５６】
製麹した粒状の米麹あるいはそれを粉砕した粉状の米麹について、該米麹の５倍量の水を加え、室温で２時間撹拌した後に、ブフナー漏斗で減圧濾過し、水不溶物を除去して、米麹の水抽出液を得た。この上清を凍結乾燥して得たエキス粉末をアンギオテンシン変換酵素阻害アッセイに供した。
【実施例２】
【００５７】
米麹のアンギオテンシン変換酵素阻害活性の比較
【００５８】
実施例１で製麹した米麹の水抽出物の凍結乾燥エキス粉末を３％の水溶液として、これをアンギオテンシン変換酵素阻害アッセイのペプチド溶液として使用した。上記ペプチド溶液６０μｌと、１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶解した０．１ｕｎｉｔ／ｍｌアンギオテンシン変換酵素溶液（ＳＩＧＭＡ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｌｕｎｇ）３０μｌを混和し、３７℃３分保持する。対照は蒸留水を使用する。これに、さらに１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶解した最終濃度５ｍＭヒプリルヒスチジルロイシンと最終濃度４００ｍＭＮａＣｌの基質溶液３００μｌを加え、３７℃３０分反応させる。３０分後に、３％メタリン酸溶液５００μｌ を加え反応を停止させる。遊離する馬尿酸をＨＰＬＣにより定量する。ＨＰＬＣ条件は、カラムがＷａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅＴＭ Ｃ−１８ （１５０ｍｍＸ３．０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）、バッファーが２０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）：メタノール＝５５：４５、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎを採用した。阻害率は、（対照の遊離馬尿酸−サンプルの遊離馬尿酸）／対照の遊離馬尿酸Ｘ１００で算出した。
【００５９】
その結果を表１に示す。なお、表１及びこれ以降「Ａ．」とあるのは「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」の略記である。
【００６０】
【表１】
表１の結果から、今回検討した中でアンギオテンシン変換酵素阻害活性が高い順としては、焼酎麹で用いるＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１だということが分かった。また、同じＡ．ｏｒｙｚａｅ種であっても、アンギオテンシン変換酵素阻害活性は２３．８％から６２．９％と、幅広かった。なお、Ａ．ｏｒｙｚａｅスリーは清酒醸造用ではなく、醤油醸造用である。また、Ａ．ｏｒｙｚａｅの中で阻害活性が高かったＡ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２０９６１として寄託されている株である。これらのことから、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の麹菌は、種の間、種の中でも阻害の程度に差があるとは言え、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を持っていると言える。
【実施例３】
【００６１】
各焼酎麹のアンギオテンシン変換酵素阻害活性の比較
【００６２】
実施例２で、アンギオテンシン変換酵素阻害活性が最も高かったのが焼酎麹であったことから、各種焼酎麹のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を調べた。調べたのは次の麹である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ。アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は実施例２の方法に準じて行った。市販の飯米に上記４種類の麹菌を植え、４８時間の米麹作成を行った。凍結乾燥した米麹を１０倍量の水で１０分抽出し、得られた上清を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を３％の水溶液として、これをアンギオテンシン変換酵素阻害アッセイのペプチド溶液として使用した。その結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
表２から分かるように、アンギオテンシン変換酵素阻害活性が最も高かったのは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉであった。次に活性が高かったのはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．であった。その次に活性が高かったのはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉであった。このことから、最も高いアンギオテンシン変換酵素阻害活性を得るには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉを用いるのがよいことが分かった。
【実施例４】
【００６４】
米麹の粉末化によるアンギオテンシン変換酵素阻害活性への影響
【００６５】
米麹から抽出できるペプチド量は、米麹の形態が粒状あるいは粉末状で違いがあるかどうかについて検討した。米麹としては、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉのそれぞれの米麹と、対照として米のみをブレンダーで粉末状に粉砕した。これらの粒状又は粉末状とした米麹又は米を１０倍量の水で室温１時間抽出し、得られた上清を凍結乾燥させて、３％水溶液のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を実施例２の方法に準じて測定した。その結果を図１に示す。
【００６６】
その結果、全ての米麹において、粉砕により粉末化した米麹はアンギオテンシン変換酵素阻害活性が上昇しており、活性は粉砕をしない粒状の米麹に比べて約２０％増加した。このことから、米麹を粉末化した方がアンギオテンシン変換酵素阻害に有効であることが分かった。
【００６７】
上記の結果から、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、粉末状の米麹から大幅に抽出量が増加することから、粉末の粒子径と抽出されるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド量の相関について検討した。凍結乾燥したＡ．ｋａｗａｃｈｉｉの米麹をブレンダーで適当に破砕し、１０種類のふるい（開き目（μｍ）：６３，９０，１２５，１５０，２５０，３５５，５００，１０００，２０００，３３６０）にかけ、そのふるいを通した平均粒子径（μｍ）が『１つ小さいサイズのふるいの開き目＜米麹の直径≦ふるいの開き目』となるよう大きさを揃えた。１５ｍｌ容のチューブに各粉末０．５ｇと蒸留水５ｍｌを加え、十分に攪拌し、１０分間室温にて静置したのち、遠心して得られた上清を１ｍｌサンプリングし、１０分間沸騰水中で湯煎したのち遠心して得られた上清を用いて、アンギオテンシン変換酵素阻害活性およびＢｉｕｒｅｔ反応によるトリペプチド以上のペプチド・タンパク質濃度を測定した。
【００６８】
ふるいの開き目（μｍ）、Ｂｉｕｒｅｔ反応（ペプチド・タンパク質量ｍｇ／ｍｌ）およびアンギオテンシン変換酵素阻害活性率（％）のうちの２項目をそれぞれの軸にプロットしたもの（対数表示の場合あり）を図２から図４に示す。
【００６９】
図２では、ふるいの開き目とペプチド・タンパク質量が累乗近似で示され、図３ではふるいの開き目とアンギオテンシン変換酵素阻害活性率が、図４ではペプチド・タンパク質量とアンギオテンシン変換酵素阻害活性率が対数近似で示される関係であることが明らかとなった。いずれも非常に高い正の相関が認められた。これらは、米麹はより細かい粒として摂取するほうがより効果的に血圧上昇抑制作用が得られることを示している。
【実施例５】
【００７０】
米麹の人工胃腸消化試験
【００７１】
米麹からアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する機能性ペプチドが大量に抽出できることが明らかとなった。しかし、これらの機能性ペプチドが経口摂取した場合に、胃あるいは膵臓由来の消化酵素により分解され、小腸の吸収時にはアンギオテンシン変換酵素阻害活性を消失している可能性が高い。米麹由来のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドが経口摂取した場合に、胃あるいは膵臓由来の消化酵素に耐性を有しているかどうかは、実際に生体内でアンギオテンシン変換酵素阻害活性を発揮する上で非常に重要である。
【００７２】
米麹としては、実施例２で活性が高いＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１の米麹を凍結乾燥しブレンダーで粉末化したものを使用した。
【００７３】
１）粗タンパク質測定
【００７４】
消化酵素の使用量を決定するため、各米麹の粗タンパク質含量を常法に従いケルダール法で求めた。
【００７５】
２）人工消化試験
【００７６】
酵素は、ペプシン（豚胃粘膜由来Ｐｅｐｓｉｎ １：６０，０００（和光純薬））とパンクレアチン（豚膵臓由来Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ））を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ胃腸消化試験を行った。５０ｍｌの三角フラスコに、１．６ｇの米麹凍結乾燥粉末、蒸留水１６ｍｌを加え、０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２．０に調整した。ペプシンを各サンプルの粗タンパク質量に対して４％となるように添加し、恒温水槽にて６０分間、３７℃、１２０ｒｐｍで反応させた後、０．９Ｍ ＮａＨＣＯ３を約１ｍｌ加え、ｐＨ６〜７にして反応を停止させた。続いて、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。パンクレアチンを、各サンプルの粗タンパク質量に対して４％となるように添加し、恒温水槽にて１２０分間、３７℃、１２０ｒｐｍで反応させた後、１０分間沸騰水中で加熱し反応を停止させた。
【００７７】
反応開始直後（ｔ＝０ペプシン）からペプシン処理（ｔ＝３０、６０ペプシン）、パンクレアチン処理（ｔ＝１２０、１８０パンクレアチン）の計５回、１ｍｌずつサンプリングし、３分間沸騰水中で加熱し、遠心後の上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、アンギオテンシン変換酵素阻害活性測定時まで−２０℃に冷凍した。ブランクは、酵素を添加せずに各サンプル粉末液を３分間沸騰水中で加熱したものを使用した。
【００７８】
粗タンパク質
【００７９】
粗タンパク質含量を表３に示す。
【００８０】
【表３】
【００８１】
人工消化試験
【００８２】
人工消化試験においては、パンクレアチン処理後はすべてのサンプルの粘性は低くなり、タンパク質もデンプン質が分解されたことを示している。
【００８３】
表４に各酵素処理時間のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を示す。ｔ＝０はペプシンを添加してすぐに沸騰水中で加熱したサンプルであるが、わずかな時間でも酵素反応が進み活性ペプチドが増加したと考えられ、ブランクと比較し２倍〜１０倍以上阻害活性が上昇した。その後、ペプシンを６０分間作用させることで、阻害活性は最大となり、最も強い阻害活性を示したＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ麹では、ブランクと比較し２．４倍の活性増加が認められた（ｔ＝６０）。一方で、ブランクでは阻害活性の低かったＡ．ｓｏｊａｅ ９麹およびＡ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１麹も、ペプシン処理３０分後（ｔ＝３０）、６０分後（ｔ＝６０）には、焼酎麹に近い強いアンギオテンシン変換酵素阻害活性を示した。その後、６０分間のパンクレアチン分解により、阻害活性は１〜２割減少するが（ｔ＝１２０）、さらに６０分間パンクレアチン処理を継続しても、それ以上の阻害活性低下は認められなかった（ｔ＝１８０）。
【００８４】
ペプシン添加は、ヒトなどの哺乳動物の胃でのタンパク質分解のモデルであり、パンクレアチン添加は同様に小腸でのタンパク質分解のモデルである。以上の結果より、米麹を経口摂取した場合、胃で米麹タンパク質がペプシン分解を受けることで、米麹からアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの生成が増加し機能性が向上することが示された。さらに、続いて小腸におけるパンクレアチン分解を受けてもアンギオテンシン阻害活性は維持され、機能性ペプチドとして血管内へ吸収される可能性が高いことが示唆された。また、米麹にすることで、麹菌由来のプロテアーゼが米タンパク質の消化分解を助け、機能性ペプチドの生産が効率よく行われることがわかった。
【００８５】
【表４】
【実施例６】
【００８６】
米麹の熱水抽出の効果
【００８７】
米麹からアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する機能性ペプチドを抽出する場合に、抽出に用いる溶媒の温度が影響するかどうかについて検討した。実施例２で作成したＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１の米麹の粉末を、一方は室温の１０倍量の水で１分以内に抽出し、他方は１０倍量の熱水で１分以内に抽出した。対照として、米のみの抽出を行った。抽出液は不溶成分をろ過後、ろ液を凍結乾燥した。各凍結乾燥物の３％溶液を作成し、実施例２に記載のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を算出した。その結果、表５に示すように、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＫＭ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ３１２９−７、Ａ．ｓｏｊａｅ ９、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＯＴ１の米麹は、室温抽出に比べて、熱水抽出では、抽出されるアンギオテンシン変換酵素阻害活性ペプチドの抽出量が減少した。しかし、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉの米麹については、室温水抽出に比べて、熱水抽出では、抽出されるアンギオテンシン変換酵素阻害活性ペプチドの抽出量が４．４％増加した。よって、産業的には、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉの米麹は、熱水抽出することで、アンギオテンシン変換酵素阻害活性ペプチドを増強できることが示された。また、加熱加工品として摂取してもアンギオテンシン変換酵素阻害活性が維持されることが示された。
【００８８】
【表５】
【実施例７】
【００８９】
米麹中のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの単離と同定
【００９０】
米麹の人工胃消化試験で得られるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドの単離と構造決定を試みた。２日間製麹した焼酎米麹（日本晴７０％精米使用）を凍結乾燥後細かく粉砕した米麹粉末８０ｇに対し、蒸留水８００ｍｌ、１ＮＨＣｌを３２ｍｌ加えてｐＨ２．０に調整したものを、８本のバッフル付き３００ｍｌ三角フラスコに分注し、それぞれペプシン２５ｍｇ（米麹粉末の０．２５％）を添加し、３７℃、１２０ストロークで１時間反応させた後、ＮａＯＨでｐＨを７．０ に調整し反応を停止させ、米麹人工胃消化物とした。この消化物を遠心分離した上清を回収し、凍結乾燥させ４６ｇのエキス粉末を得た。この粉末は前回までの試験で、高いアンギオテンシン変換酵素阻害活性が認められ、さらにそのアンギオテンシン変換酵素阻害活性は消化酵素耐性であることが分かっている画分である。上記の米麹の人工胃消化物中のペプチドをオープンタイプのゲルろ過カラムクロマトグラフィー（バイオラッドＰ−２ゲル）により分画した。分離条件として、カラムは直径１．５ｃｍ，高さ７５ｃｍ、溶媒は１０％エタノールで、流速０．０８ｍｌ／分であった。その後Ｃ３０の逆相ＨＰＬＣ（野村化学 Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５）で、溶媒は０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリル系で、５−１００％アセトニトリルのグラジエント分離し、アセトニトリル５％の画分に最も強い活性が確認された。さらにＣ３０の逆相ＨＰＬＣ（野村化学 Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５）で、溶媒は０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−メタノール系で、０−３０％メタノールのグラジエント分離を行った。その結果、メタノール５−１０％で溶出するサンプルに顕著なアンギオテンシン変換酵素阻害活性が検出された。得られたサンプルのペプチドについて、常法であるエドマン分解によるＮ末端シーケンスを行った結果、ペプチド配列はＶａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドであると決定した。
【００９１】
得られたペプチド配列Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐの標品を合成し、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を測定した結果を表６に示した。アンギオテンシン阻害活性は、ペプチド濃度に正比例して増加し、この測定値から、阻害率５０％を示す本Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのアンギオテンシン変換酵素阻害活性のＩＣ５０は４１１ｐｐｍであることが判明した。
【００９２】
【表６】
【実施例８】
【００９３】
米麹中のアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのパンクレアチン消化耐性
【００９４】
実施例７においては、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉの焼酎米麹を人工胃消化試験としてペプシン消化を行い、その消化物の中から、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を示すペプチドとして、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドを同定した。よって、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドは、ペプシン消化耐性を有し、経口摂取した場合、胃での消化を受けずに、活性を維持したまま小腸に移行しうるペプチドであるといえる。当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドがパンクレアチン消化耐性を有していれば、活性を維持したまま小腸で吸収されるペプチドであることが立証できる。そこで、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドのパンクレアチン消化酵素耐性について検証した。
【００９５】
サンプルとしては、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐの合成ペプチド溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解させた豚すい臓由来パンクレアチン溶液（ＳＩＧＭＡ）（８９μｇ／ｍｌ）、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）を用意した。
【００９６】
反応物としては、以下のものを検討した。
ブランク 水１０μＬと上記パンクレアチン溶液９０μＬ
対照 上記ペプチド溶液１０μＬと上記リン酸バッファー９０μＬ
試験区 上記ペプチド溶液１０μＬと上記パンクレアチン溶液９０μＬ
上記検体を３７度で反応させ、０、６０、１２０分後に１０分間沸騰させ、反応を停止し、アンギオテンシン変換酵素阻害活性の経時変化を測定した。その結果を表７に示した。
【００９７】
【表７】
表７の結果においては、ブランクでパンクレアチン由来の自己消化物にアンギオテンシン変換酵素阻害活性が認められることが判明した。当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドのアンギオテンシン変換酵素阻害活性の経時変化のみを対照と試験区において比較するために、試験区からブランクを差し引いた値と対照を表８に記載した。
【００９８】
【表８】
表８の結果から、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドは、パンクレアチンの添加に関わらず、消化反応前と比較して、１２０分間の消化で１５％前後アンギオテンシン変換酵素阻害活性の低下が認められた。しかしながら、表７の結果より、該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドとパンクレアチンの混合物のアンギオテンシン変換酵素阻害活性は、１２０分間のパンクレアチン消化処理によってまったく低下しないことが判明した。すなわち、当該Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐのテトラペプチドのアンギオテンシン変換酵素阻害活性は、ペプシン消化耐性を有し、かつパンクレアチン消化によっても総活性が維持されることが明らかとなった。
【００９９】
よって、米麹から人工胃消化試験で精製するアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドの構造を決定することができた。本ペプチドは、米麹の経口摂取で、麹由来のプロテアーゼ、および経口摂取時における胃のペプシン分解などにより得られることから、麹由来のプロテアーゼ耐性を有し、消化管内において安定な小腸吸収時のペプチド構造を示しているといえる。
【実施例９】
【０１００】
パン
【０１０１】
小麦粉１００ｇ、イースト３ｇ、砂糖５ｇ、食塩２ｇ、イーストフード０．１ｇ、実施例２記載のＡ． ｋａｗａｃｈｉｉの米麹の粉末３ｇをよく混ぜて、焼成した。焼成後も、アンギオテンシン変換酵素阻害活性は保持されていた。
【実施例１０】
【０１０２】
クッキー
【０１０３】
小麦粉１００ｇ、バター６０ｇ、砂糖２７０ｇ、全卵１４０ｇ、食塩３ｇ、実施例２記載のＡ． ｋａｗａｃｈｉｉの米麹の粉末３０ｇをよく混ぜて、焼成した。焼成後も、アンギオテンシン変換酵素阻害活性は保持されていた。
【実施例１１】
【０１０４】
甘酒
【０１０５】
実施例２記載のＡ． ｋａｗａｃｈｉｉの米麹１に対して水２（１：２）の混和物を、５５℃で６時間以上糖化させることにより甘酒を製造した。製造後も、アンギオテンシン変換酵素阻害活性は保持されていた。
【実施例１２】
【０１０６】
ヒトでの血圧降下作用の確認
【０１０７】
ヒトモニター試験による米麹の血圧降下作用の確認を行った。被験者は正常高値血圧〜軽症高血圧を対象とし、以下１）、２）のいずれか、または両方に当てはまるという条件に適合する男性3名（平均年齢46.7±5.7歳、平均体重72.3±12.7kg、降圧剤非使用者かつ喫煙習慣なし）による米麹摂取試験を実施した。
１）収縮期血圧130mmHg以上169mmHg以下
２）拡張期血圧85mmHg以上109mmHg以下
また、当該試験は、ヘルシンキ宣言の趣旨に従い、被験者に対しては研究内容、方法等について十分な説明を行い、文書による同意を得て実施した。
【０１０８】
１）試験材料及び方法
実施例４で作成した、凍結乾燥したＡ．ｋａｗａｃｈｉｉの米麹をブレンダーで適当に破砕し、ふるい（目開き（μｍ）：５００）にかけた粉末を使用した。１日あたり前記粉末１５ｇの摂取を４週間毎日継続した。摂取法は、一日の摂取量を守れば、摂取時間・回数は自由であり、水または嗜好飲料に混ぜたり、他の食品と一緒に食べたりしても構わない条件とした。
【０１０９】
２）血圧測定
血圧測定には、テルモ社電子血圧計Ｐ２０００を使用した。血圧測定は、摂取試験開始の１週間前、摂取期間４週間の毎週、及び摂取試験終了から１週間後に行った。
【０１１０】
３）測定結果
各３名の収縮期血圧を図５に示した。３名ともに、摂取試験開始から４週目までに降下する傾向がみられ、摂取試験終了後１週間は上昇する傾向がみられた。また、その平均値についても図６に示したように、摂取試験開始から４週目までに降下する傾向がみられ、摂取試験終了後１週間は上昇する傾向がみられた。
【０１１１】
次に、各３名の拡張期血圧を図７に示した。３名ともに、摂取試験開始から４週目までに降下する傾向がみられ、摂取試験終了後は上昇する傾向がみられた。また、その平均値についても図８に示したように、摂取試験開始から４週目までに降下する傾向がみられ、摂取試験終了後１週間は上昇する傾向がみられた。また、図９に示すように、摂取試験開始から４週目の拡張期血圧の平均値は、摂取試験開始１週間前の拡張期血圧の平均値と比較して、有意に降下していることが示された(p<0.05)。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】焼酎麹のアンギオテンシン変換酵素阻害活性の比較を示した図である。
【図２】米麹の粉末の平均粒子径と水溶性タンパク質・ペプチド含量の相関を示した図である。
【図３】米麹粉末の粒径とＡＣＥ阻害活性の相関を示した図である。
【図４】水溶性タンパク質・ペプチド含量とＡＣＥ阻害活性の相関を示した図である。
【図５】各人の米麹摂取による収縮期血圧の変化を示した図である。
【図６】米麹摂取による収縮期血圧の変化の平均を示した図である。
【図７】各人の米麹摂取による拡張期血圧の変化を示した図である。
【図８】米麹摂取による拡張期血圧の変化の平均を示した図である。
【図９】米麹摂取前と摂取４週間後の拡張期血圧の平均を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が３３６０μｍ以下であることを特徴とする米麹を有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項２】
平均粒子径が５００μｍ以下の粉末であることを特徴とする米麹を有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の米麹を水抽出したものを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項４】
米麹を構成する菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉのうち、少なくとも１つから成る請求項１〜３記載の組成物。
【請求項５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉの米麹を水を含む溶媒又は熱水を含む溶媒で抽出したものを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項６】
新規ペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ。
【請求項７】
請求項６記載のペプチドを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を有効成分とする高血圧予防・治療・改善剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を高血圧予防・治療・改善に使用する方法。
【請求項１０】
請求項１から５記載の組成物の製造方法。
【請求項１１】
米麹をペプシンにより分解して得られる請求項６記載のペプチドの製造方法。
【請求項１】
平均粒子径が３３６０μｍ以下であることを特徴とする米麹を有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項２】
平均粒子径が５００μｍ以下の粉末であることを特徴とする米麹を有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の米麹を水抽出したものを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項４】
米麹を構成する菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉのうち、少なくとも１つから成る請求項１〜３記載の組成物。
【請求項５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉの米麹を水を含む溶媒又は熱水を含む溶媒で抽出したものを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項６】
新規ペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ。
【請求項７】
請求項６記載のペプチドを有効成分として成る血圧降下作用を持つ組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を有効成分とする高血圧予防・治療・改善剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を高血圧予防・治療・改善に使用する方法。
【請求項１０】
請求項１から５記載の組成物の製造方法。
【請求項１１】
米麹をペプシンにより分解して得られる請求項６記載のペプチドの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２４７８８８（Ｐ２００８−２４７８８８Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３９９６５（Ｐ２００８−３９９６５）
【出願日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]