糖尿病の予防および治療のための天然化合物、その調製方法、およびその薬物的使用。
本発明は、抗糖尿病天然化合物の調製のためのプロセス、および前記化合物の薬物的用途に関する。抗糖尿病セコイトール粉末は、イチイ属の種（Taxus spp.）などのような薬用植物を溶媒により抽出すること、および二相抽出およびクロマトグラフ法によって分離することにより得られ、それはさらに精製されて、その主要成分、有意な抗糖尿病作用を有する天然の単一化合物を得る。前記化合物の構造は、スペクトル、化学合成、およびＸ線単結晶回折パターンにより、５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール（セコイトール）であることが確証される。セコイトールは有意な抗糖尿病活性を有しており、糖尿病の高血糖を有意に緩和することが可能であり、肝臓グリコーゲンの分解およびグルコースの吸収を阻害し、血中脂肪レベルを減少させ、フリーラジカルの代謝を改善し、膵島のβ細胞を保護し、非常に低い毒性を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチイ属の種（Taxus spp.）、特にタクスス・ユンナネンシス（Taxus yunnnanensis Cheng et L. K. Fu）、タクスス・キネンシス・変種マイレ（Taxus chinensis var. mairei（Lemee et Levl）Cheng et L. K. Fu）などから抽出および分離された天然化合物、５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール（セコイトール（Sequoyitol））、その調製方法、およびその薬物的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口の高齢化の進行の加速に伴い、糖尿病は一般的で頻繁に起こる病気となっている。現在、糖尿病の病因はまだ明らかではなく、糖尿病の治療は主として高血糖を緩和すること、および薬物の使用により合併症を予防することである。インスリンおよび経口投与用の主要な化学合成血糖降下薬の発明および適用は、糖尿病患者に役立つものであるが、それら自身には低血糖、乳酸中毒などといった重い副作用があり、そのことがそれらの使用および治療効果を大いに制限している（非特許文献１）。
【非特許文献１】ワン・ヂョンシャオ（Wang Zhongxiao）著、山西医科大学学報（Journal of Shanxi Medical University）、第３１巻、第６号、２０００年、p．５５５−５５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、高効能、低毒性、および高安全性かつ高信頼性の、新規な血糖降下物質を緊急に研究および開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
中国の医学文献によれば、イチイ属の葉は利尿および通経機能を有しており、糖尿病の治療に用いられることが可能であり（グロッサリー・オブ・ハーブズ・アンド・ドラッグズ・イン・チャイナ（Glossary of Herbs and Drugs in China）最新版（第２版）、シェ・ゾンワン（Xie Zongwan）編、人民衛生出版社（People' Medical Publishing House）、ｐ．７２２）、またイチイ属は糖尿病の治療に対して特別の効果を有している（ガン・ウェイソン（Gan Weisong）著、薬用植物学（Pharmaceutical botany）、１９９１年、ｐ．１４０）が、イチイ属の抗糖尿病成分およびその活性についての近代的な研究は、先行技術においては見出されていない。本発明者らは、イチイ属の抗糖尿病活性成分を深く研究し、天然化合物、５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール（セコイトール）が顕著な活性と非常に低い毒性とを有する抗糖尿病活性成分であり、下記構造式Ｉを有することを見出した。
構造式Ｉ
【０００５】
【化１】
【０００６】
セコイトール（５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール）の母核はミオイノシトールであり、シクロヘキサノールの立体異性体の一つである（シクロヘキサノールは数個のキラル中心を有しており、したがっていくつかの立体異性体を有する）。いくつかの論文には、セコイトールがイチイ属、マツ属（Pinus）、オーストラリアヒノキ（Cypress）、セファロタクスス・フォルツネイ（Cephalotaxus fortunei）、スギ科（Taxodiaceae）などのような植物中に存在すると記載されている（フィトケミストリー（Phytochemistry）、１９７１年、第１１巻、ｐ．２４５−２５０）。セコイトールのペンタアセチル誘導体の構造
は、高分解能1Ｈ−ＮＭＲにより同定された（フィトケミストリー、第２７巻、第１号、ｐ．２７９−１８１、１９８８年）。中国薬局方（１９７０年版）には、ミオイノシトールがビタミン様の作用を有することが記録されている。しかしながら、セコイトールの抗糖尿病活性は以前には報告されていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明者らの研究は、セコイトールが糖尿病モデルの高血糖を有意に緩和することが可能であり、肝臓のグリコーゲン分解およびグルコースの吸収を阻害し、血中脂肪レベルを低減し、フリーラジカルの代謝を改善し、膵島のβ細胞を保護し、マウスの正常な血糖値は低減せず、極めて低い毒性を有することを開示している。したがって、セコイトールは糖尿病および合併症の予防および治療のため、代謝障害関連疾患（高脂血症、脂肪肝、肥満などのような）の予防および治療のため、およびフリーラジカルの代謝改善のために使用されることが可能である。
【０００８】
本発明はさらに、イチイ属の種からセコイトールを抽出するための方法を提供するが、前記方法は、有機溶媒を用いてイチイ属の種を抽出して抽出物を得ること、該抽出物を二相抽出しカラムクロマトグラフィーにかけてセコイトールを含有している分画を収集すること、次いで濃縮し、濾過し、乾燥し、再結晶化してセコイトールを含有している粉末を取得することを含有し、抽出に使用された有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、およびそれらの水性混合物を含有し、二相抽出に使用される溶媒は、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルといった水不溶性有機溶媒である。精製は、種々のクロマトグラフ法および再結晶法の、単独または組合せ方式の使用により行なわれることが可能である。再結晶法の溶媒系は、エタノール、アセトン、メチルエチルケトンを含有する溶媒系である。クロマトグラフィーは、マクロポーラス樹脂カラム（Ｄ１０１型、ＮＭ−２００型など）、ポリグルコースまたは修飾グルコースカラム（セファデックス（Sephadex）Ｇまたはセファデックス−ＬＨ−２０など）、セルロースカラム、活性炭カラムなどを用いてよい。最終産物は結晶性粉末であり、主な有効成分は９０％より多い含有量のセコイトールである。
【０００９】
本発明はさらに、前記セコイトールおよび一以上の補助剤および／または賦形剤を含んでなる薬物組成物を提供する。前記薬物組成物は、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤、溶液剤などといった薬物剤形に加工されてよい。
【００１０】
本発明はさらに、糖尿病の治療用薬物の製造における前記セコイトールの用途を提供する。前記薬物は、糖尿病の高血糖を有意に緩和し、肝臓のグリコーゲン分解およびグルコースの吸収を阻害し、血中脂肪レベルを低減し、フリーラジカルの代謝を改善し、膵島のβ細胞を保護することが可能であり、極めて低い毒性を有する。前記薬物は糖尿病および糖尿病性心臓血管および脳血管に関する合併症および糖代謝障害関連疾患の予防および治療のため、フリーラジカルの代謝改善のため、並びにＩＩ型糖尿病および糖尿病性心臓血管及び脳血管に関する合併症の予防および治療のために使用されることが可能である。
【００１１】
さらに具体的には、イチイ属の種から抗糖尿病セコイトールを抽出するための本発明の方法は、イチイ属の種の根、茎または葉を粉砕して粗粉末を得ること、該粗粉末を、エタノール、メタノール、アセトンまたはそれらの水性混合物といった溶媒を用いて、０℃から灌流温度までの温度において、好ましくは室温から灌流温度までの温度において、さらに好ましくは灌流温度において、１〜５回抽出することであって、溶媒の量は１：１〜１：２０（重量／体積）、好ましくは１：２〜１：１０（重量／体積）、さらに好ましくは１：３〜１：６であり、真空内で濃縮して抽出物を得ること、前記抽出物を水と、水不溶性有機溶媒（酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルのような）との間で二相抽出にかけること、および親油性の層を除去することであって、抽出物は好ま
しくは１：０．５から１：１０までの比を有する有機溶媒／水であり、水層を合併すること、濾過すること、およびクロマトグラフィーによって分離することであって、クロマトグラフィーカラムの例は、Ｄ１０１型、ＮＭ−２００型（ピュロライト（PUROLITE））などといったマクロポーラス樹脂カラム、セファデックス−ＬＨ−２０などのようなポリグルコースＧまたは修飾ポリグルコースカラム、セルロースカラム、および活性炭カラムであって、対応する溶出剤が使用され、溶出は同時に検出され、セコイトールを含有している溶出分画を収集すること、真空中で濃縮すること、静置すること、および濾過して固体を得ること、次いでエタノール、メタノール、アセトン、メチルエチルケトンといった溶媒系を用いて前記固体を再結晶すること、および乾燥してセコイトール粉末を得ることを含有する。最終産物は９０％より多いセコイトール含有量を有する結晶状粉末である。
【００１２】
本発明の方法においては、カラムクロマトグラフィーからの分画の検出は、以下の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件を用いることによって行なわれる。
Ｃ１８カラム、５μｍ、４．６x２５０ｍｍ
検出波長２２０ｎｍ
試料注入２０μｌ
移動相、流速１．０ｍｌ／分 メタノール−水（５０：５０）は、０．４５μｍの有機濾過膜を用いた吸引により濾過され、使用に先立ち脱気される。
【００１３】
本発明の産物中のセコイトールの含有量は、以下のＨＰＬＣ法によって検出される。
含有量は、約２５ｍｇの産物を正確に秤量すること、２５ｍｌのメスフラスコ内に入れること、０．６５ｍｌの希硫酸−無水酢酸（１：５０）を添加すること、水浴中で２０分間加熱すること、室温まで冷却すること、１５ｍｌのメタノールを添加すること、均一になるまで振盪すること、目盛りに達するまで水を添加すること、均一になるまで振盪して試料溶液を得ることによって検出された。ＨＰＬＣの条件は上記と同様である。
【００１４】
本発明のセコイトールは、通常の補助剤および／または賦形剤と混合されて、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の予防または治療のための、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤、溶液剤などといった種々の薬物剤形を形成することが可能である。
【００１５】
カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤などといった剤形は、一以上の通常の、デンプン、微結晶セルロースなどのような賦形剤、充填剤および希釈剤、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのような結合剤、グリセロールのような保湿剤、炭酸カルシウムなどのような崩壊剤、吸収剤、カオリンなど、およびタルク末などのような滑沢剤を含有することが可能である。
【００１６】
薬学上許容される賦形剤は、固体、半固体、液体などといった様々な形状でよく、補助剤は種々のタイプであってよい。
【００１７】
溶液は、水、エタノール、グリセロール、ポリビニルグリコール、安息香酸ベンジルなどといった一般的な溶媒、可溶化剤、乳化剤、防腐剤などを含んでよい。
【００１８】
カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤、溶液剤などといった剤形は、セコイトールを一以上の賦形剤と混合することにより、通常の方法に従って調製されることが可能である。
【００１９】
非経口投与用には、剤形、溶液または乳剤は、無菌および等張性であるべきである。
【００２０】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例証しているが、該実施例は、本発明の範囲を限定するよりもむしろ、単に本発明を説明するためのものであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００２１】
（実施例１：天然活性化合物セコイトールの調製（１））
６０ｋｇのイチイ属の種の粗粉末を、４倍体積量の９０％エタノールを用いて３回抽出し、抽出物を合せ、濃縮して粘稠溶液を形成し、該粘稠溶液をさらに濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、１：１（ｖ／ｖ）クロロホルム／水を用いて二相抽出し、水層を合せ、濾過し、マクロポーラス樹脂カラム（Ｄ１０１型、国産）上にロードし、蒸留水および水性エタノール（エタノール：５％−２０％）により勾配溶出し、分画をＨＰＬＣにより個別に同定し、セコイトールを含有している溶出物を合せ、濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、次にエタノールを用いて再結晶化し、濾過して結晶状粉末を得た。結晶状粉末を吸引により乾燥し、９５％エタノールを用いて２回再結晶化し、濾過し、７０℃で乾燥してセコイトール結晶を０．０７％の収率で得た。
【００２２】
（実施例２：天然活性化合物セコイトールの調製（２））
７０ｋｇのイチイ属の種の粗粉末を、３倍体積量の８０％メタノールを用いて３回抽出し、抽出物を合せ、濃縮してスラリー溶液を形成し、該スラリー溶液をさらに濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、１：２（ｖ／ｖ）酢酸エチル／水を用いて二相抽出し、水層を合せ、濾過し、マクロポーラス樹脂カラム（ＭＮ−２００型）上にロードし、蒸留水および水性エタノール（エタノール：５％−２０％）により勾配溶出し、溶出液をＨＰＬＣにより個別に同定し、セコイトールを含有している溶出液を合せ、濃縮し、ロータリーエバポレータにより乾燥し、アセトンを用いて再結晶化し、さらに濾過して結晶状粉末を得た。結晶状粉末を吸引により乾燥し、アセトン：エタノール（１：１）を用いて２回再結晶化し、濾過し、７０℃で乾燥してセコイトール結晶を０．０８％の収率で得た。
【００２３】
（実施例３：天然活性化合物セコイトールの調製（３））
６５ｋｇのイチイ属の種の粗粉末を、４倍体積量の７５％アセトンを用いて３回抽出し、抽出物を合せ、濃縮して粘稠溶液を形成し、該粘稠溶液をさらに濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、２：１（ｖ／ｖ）ジクロロメタン／水を用いて二相抽出し、水層を合せ、濾過し、活性炭カラム（薬学上許容される標準品）上にロードし、蒸留水および水性エタノール（エタノール：５％−３０％）により勾配溶出し、溶出液を個別に同定し、セコイトールを含有している溶出物を合せ、濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、メタノールを用いて再結晶化し、濾過して結晶状粉末を得た。結晶状粉末は吸引により乾燥し、メタノールを用いて２回再結晶化し、濾過し、７０℃で乾燥してセコイトール結晶を０．０７％の収率で得た。
【００２４】
（実施例４：セコイトールカプセル剤の調製）
処方：０．２gカプセルあたり２５ｍｇのセコイトールを含有。
微結晶セルロース １７５g
セコイトール ２５g
―――――――――――――――――
１０００カプセル
【００２５】
補助剤を、粉砕容器内に置き、次いでセコイトールを添加し、１０〜３０分間粉砕し、均一な粉末を得た。該均一な粉末を１＃カプセル中に詰め、各カプセルの含有量は、無作為抽出により０．２gになるよう調整した。
【００２６】
（実施例５：セコイトール錠剤の調整）
２５ｇのセコイトール、４９ｇの微結晶セルロース、１ｇのステアリン酸マグネシウムを充分に混合し、混合物をシングルパンチペレットにより加工し、直径６ｍｍおよび３００ｍｇの重さを有する錠剤を産生した。各錠剤は１００ｍｇのセコイトールを含んでいた
。
【００２７】
（実施例６：セコイトール顆粒剤の調整）
２０ｇのセコイトールおよび１８０ｇのコーンスターチを充分に混合し、次に適量の６０％エタノールを添加して、軟材料を形成した。該軟材料を１２メッシュの篩を通し、乾燥して顆粒を形成した。各顆粒は１００ｍｇのセコイトールを含んでいた。
【００２８】
実施例１において得られた天然化合物の化学構造は、以下のように同定された。
【００２９】
１．天然化合物の構造同定
天然化合物の融点は双眼微量融点測定装置（未校正）により測定し、赤外線スペクトルはパーキン・エルマ９８３赤外線分光光度計（ＫＢｒタブレット）により測定し、エレクトロスプレイ・イオン化質量分光測定はフィニガン社（Finnigan company）のＬＣＱ型質量分析計により測定し、旋光性はＰＥ−２４１ＭＣ型旋光計により測定し、核磁気共鳴スペクトルはブルーサ（Brucer）ＡＣＦ−３００（1Ｈ−ＮＭＲ ３００ＭＨｚ）により、ＴＭＳまたはＤＳＳを内部標準として測定した。
【００３０】
実施例１の産物は、以下の物理／化学的データおよびスペクトルデータを有していた。
無色結晶
ＭＰ２３２〜２３４℃
ＩＲνKBrmax（ｃｍ-1）：３４２７，３３５６，３１８８（ＯＨ），１０３２（Ｃ−Ｏ−Ｃ）
ＥＳＩ（＋）ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１７．１［Ｍ＋Ｎａ］+
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ＋ＤＳＳ，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：３．５３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９，１０．０，Ｈ−１＋Ｈ−３）；４．０４（１Ｈ，ｄｄ，J＝２．９，２．９，Ｈ−２）；３．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，９．７，Ｈ−４＋Ｈ−６），３．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．４，９．４，Ｈ−５）；３．５９（３Ｈ，ｓ，Ｏ−ＣＨ3）
13Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ＋ＤＳＳ，７５ＭＨｚ，ｐｐｍ）：８６．７９（ＣＨ，Ｃ−５），７４．５７（ＣＨ，Ｃ−２），７４．３１（ＣＨ×２，Ｃ−４およびＣ−６），７３．６９（ＣＨ×２，Ｃ−１およびＣ−３），６２．２７（ＯＣＨ3）
結果は、この構造が５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール、すなわちセコイトールであることを示した。
【００３１】
２．ペンタアセチル−セコイトール（Ａｃ−セコイトール）の調製
セコイトールの構造のさらなる確認のため、セコイトールのペンタアセチル化をＡｃ2Ｏを用いて酸性条件下に行い、セコイトールのペンタアセチル誘導体（Ａｃ−セコイトール）を調製し、その構造を同定した。
【００３２】
試薬の調製
１．０ｍｌのＡＲグレードの濃縮硫酸に対し、４ｍｌの水を添加して硫酸溶液を得、１２．５ｍｌのＡｃ2Ｏに対し、０．２５ｍｌの前記硫酸溶液を添加し、均一に混合した。
【００３３】
ペンタアセチル−セコイトール（Ａｃ−セコイトール）の調製
実施例１の２００ｍｇの産物を、５．０ｍｌの前記試薬中に溶解し、水浴中、約８７℃において２０分間反応させ、室温に冷却した後、１００ｍｌの蒸留水を撹拌下に徐々に添加し、再度水浴中にて約８７℃で２０分間加熱し、室温に冷却した後、反応混合物を分液漏斗に移し、ＣＨ2Ｃｌ2／Ｈ2Ｏにより３回にわたり二相抽出し、ＣＨ2Ｃｌ2層を合せ、ロータリーエバポレータ中において蒸発乾燥し、無色の結晶状固体を得、該固体をエチルエーテル／無水エタノールを用いて再結晶化し、無色透明の塊状結晶（すなわち、Ａｃ−セコイトール）を得た。
【００３４】
３．ペンタアセチル−セコイトール（Ａｃ−セコイトール）の構造同定
化合物Ａｃ−セコイトールは無色の塊状結晶である。
ＭＰ２０１〜２０２℃
Ｃ17Ｈ24Ｏ11
ＥＳＩ（＋）ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２７．１［Ｍ＋Ｎａ］+
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：５．５４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．８，Ｈ−２）；５．４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．０５，Ｈ−４およびＨ−６）；５．０１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１０．５，Ｈ−１およびＨ−３）；３．４２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．７，Ｈ−５），３．４５（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ3）；２．１６（３Ｈ，ｓ，Ｃ2−ＯＡｃ）；２．０８（６Ｈ，ｓ，ＯＡｃ×２）；１．９９（６Ｈ，ｓ，ＯＡｃ×２）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，７５ＭＨｚ，ｐｐｍ）：１６９．８５（１Ｃ，Ｃ2−ＯＣＯＣＨ3），１６９．６３（２Ｃ，ＯＣＯＣＨ3×２），１６９．４１（２Ｃ，ＯＣＯＣＨ3×２），８０．０８（１Ｃ，Ｃ−５），７０．６０（２Ｃ，Ｃ−４＋Ｃ−６），６８．７８（２Ｃ，Ｃ−１＋Ｃ−３），６８．３６（１Ｃ，Ｃ−２），６０．０２（１Ｃ，ＯＣＨ3），２０．３９，２０．６７（全５Ｃ，ＯＣＯＣＨ3×５）
Ａｃ−セコイトールの1Ｈ−1Ｈ ＣＯＳＹ 1Ｈ−13Ｃ ＣＯＳＹ、1Ｈ−13Ｃ ＣＯＬＯＧ長距離相関分光を測定し、前記化合物の1Ｈ−13Ｃデータを代入した。セコイトールと比較して、Ａｃ−セコイトールの分子量は２１０（５個のアセチル基に相当）まで増加した。このデータは、Ａｃ−セコイトールがセコイトールのペンタアセチル誘導体であり、以下の構造式を有することを示した。
【００３５】
【化２】
【００３６】
４．Ａｃ−セコイトールのＸ線単結晶回折
Ａｃ−セコイトールの構造を確認するため、Ａｃ−セコイトールについて、そのＸ線単結晶回折を測定した。Ａｃ−セコイトールのＸ線単結晶回折の結果は、Ａｃ−セコイトールの構造を証明した（図１参照）。したがって、セコイトールの構造および相対配置が確認された。
【００３７】
実施例１において調製された天然化合物（セコイトール）の薬力学的、毒性学的、および一般薬理学的研究は、以下のように行なわれた。
【００３８】
［１］ 主要な薬力学的実験
実験材料
動物：昆明マウス、体重２０〜２４g
ＳＤラット、体重２３０〜２９０g、雄
薬物および試薬：
セコイトール（本発明者らにより製造された）
フェンホルミン（ポジティブ・コントロール、江蘇省金壇市ドラッグプラント（Jiangsu Jintan Drug Plant））
アロキサン（シグマ社（Sigma Company），米国）
グルコース検出キット（上海栄盛生物技術社（Shanghai Rongsheng Biological Technology Co. Ltd.））
グリベンクラミド（陽性コントロール、天津太平洋製薬社（Tianjin Pacific Ocean Pharmaceutical Co. , Ltd.））
アドレナリンハイドロクロライド注射液（武漢製薬群社（Wuhan Pharmaceutical
Group Co., Ltd.））
肝グリコーゲン検出キット（南京建成生物工学研究所（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute））
５０％グルコース注射液（江蘇常州国営武進ドラッグプラント（Jiangsu Changzhou Stated-owned Wujin Drug Plant））
コレステロール検出試薬（上海栄盛生物技術社）
マロンアルデヒド検出キット（南京建成生物工学研究所）
タンパク質検出キット（南京建成生物工学研究所）
トリグリセリド検出キット（上海栄盛生物技術社）
ヘパトクプレイン検出キット（南京建成生物工学研究所）
インスリン検出キット（河南省焦作市解放免疫診断試薬研究所（Henan Jiaozuo Jiefang Immunodiagnosis Reagents Institute））
ストレプトゾシン（Ｌｏｔ１１９ Ｈ１０２９、シグマ社、米国）
【００３９】
Ｉ．アロキサンにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの時間効果関係の実験
【００４０】
１．実験法[1,2]
アロキサンは、３０匹のマウスの各々に対し、６５ｍｇ／ｋｇの用量の尾静脈注射により投与され、マウスは文献の方法にしたがってモデリングされ、血糖値によって３群に分けられ、２群は５０ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンを、０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、モデリング群は同体積の蒸留水を別々に投与された。これらの投与は７日間連続して行なわれ、マウスは最後の投与の前２時間は断食され、その血糖値は、グルコースオキシダーゼ法により、投与の１、２、３、および５時間後に検出された。
【００４１】
２．結果
対照群に比較して、アロキサン誘導高血糖は、５０ｍｇ／ｋｇのセコイトールの投与後１時間で緩和され（１００．０ｍｇ／ｄｌ減少）、アロキサン誘導高血糖は、投与後２時間で有意に緩和され（１４０．７ｍｇ／ｄｌ減少）、アロキサン誘導高血糖は、投与後３時間（１９３．９ｍｇ／ｄｌ減少）、および投与後５時間（１７４．６ｍｇ／ｄｌ減少）では非常に有意に緩和された。アロキサン誘導高血糖は、フェンホルミンの投与後１時間（１６３．１ｍｇ／ｄｌ減少）および投与後２時間（１５９．３ｍｇ／ｄｌ減少）で非常に有意に緩和され、投与後３時間では有意に軽減され（１０４．２ｍｇ／ｄｌ減少）、および投与後５時間（５６．６ｍｇ／ｍｌ減少）で緩和された。したがって、５０ｍｇ／ｋｇのセコイトールの高血糖緩和効果は、７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンのものよりも高かった。
【００４２】
ＩＩ．アロキサンにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの効果
【００４３】
１．実験法[1,2]
６０匹のマウスのうち、１０匹のマウスが正常な群として無作為に選ばれ、残りのマウスは尾静脈注射により６５ｍｇ／ｋｇのアロキサンが投与され、文献の方法にしたがってモデリングされ、血糖値によって５群に分けられ、４群は２５、５０、および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンが、各々０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は、同体積の蒸留水を別々に投与された。これらの投与は、７日間連続して行なわれた。血糖値はグルコースオキシダーセ法により検出された。マウスの膵腺は１０％ホルマリン中に浸され、パラフィン包埋され、切片化され、ＨＥ色素により染色された。
【００４４】
２．結果
正常な群と比較して、対照群のマウスの血糖値は非常に有意に増加した（３０８．２ｍｇ／ｄｌ増加）。対照群に比較して、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群の高血糖は緩和され
（９５．６ｍｇ／ｄｌ減少）、５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群並びにフェンホルミン群のアロキサン誘導高血糖は非常に有意に緩和された。高血糖の緩和に関するセコイトールの作用は、用量依存性であった。１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群（３０６．８ｍｇ／ｄｌ減少）および５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群（１９５．２ｍｇ／ｄｌ減少）の効果は、７５ｍｇ／ｋｇフェンホルミン群のもの（１５２．８ｍｇ／ｄｌ減少）よりも優れていた。膵腺の組織病理学的検査は、正常な群の膵島が、明確な境界をもつ塊状の索構造物であって、膵島細胞は豊富な細胞質と中央の丸い核をもつ多角形の形状であることを示した。多数の膵島があり、島内には多数の細胞があり、間質小血管は有意に変化せず、炎症性細胞浸潤は観察されなかった。対照群については、膵島の数は有意に減少しており、膵島の大きさは減少し、膵島内の細胞数は減少し、前記細胞のサイズが減少し、間質小血管のヒアリン化および炎症性細胞浸潤が観察された。モデル群に比較して、セコイトール群の膵島数および島細胞数が有意に増加したのに対し、フェンホルミン群の膵島数および島細胞数はわずかに増加した。組織病理学的検査結果は、セコイトールの効果がフェンホルミンのそれよりも優れていることを確証した。
【００４５】
ＩＩＩ．正常マウスの血糖値に対するセコイトールの影響
【００４６】
１．実験法[3]
５０匹のマウスは無作為に５群に分けられ、４群は２５、５０、および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび５０ｍｇ／ｋｇのグリベンクラミドが、各々０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、正常群は同体積の蒸留水を投与された。これらの投与は、７日間連続して行なわれた。血糖値はグルコースオキシダーセ法により検出された。
【００４７】
２．結果
セコイトール群（２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇ）および正常群の血糖値（１３９．０±１７．８ｍｇ／ｄｌ）は有意差がなかったのに対し、グリベンクラミド群の血糖値（１９．３ｍｇ／ｄｌ減少）は正常群のそれよりも有意に低かった。
【００４８】
ＩＶ．アドレナリンにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの効果
【００４９】
１．実験法[3]
７２匹のマウスは無作為に６群に分けられ、４群は２５、５０、および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび１０ｍｇ／ｋｇのグリベンクラミドが、各々０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は同体積の蒸留水を投与された。これらの投与は、７日間連続して行なわれた。正常群は同体積の生理食塩水が注射により投与されたのに対し、他の群は０．２ｍｇ／ｋｇのアドレナリンが腹腔内注射により投与された。血糖値はグルコースオキシダーセ法により、投与の３０分後に検出された。マウスの肝臓は収集され、肝グリコーゲンレベルはアントロン法により検出された。
【００５０】
２．結果
正常群に比較して、対照群のマウスの血糖値は非常に有意に増加した。対照群に比較して、セコイトール群（３２．２、３５．５、３９．９ｍｇ／ｄｌ減少）およびグリベンクラミド群（４０．１ｍｇ／ｄｌ減少）のアドレナリン誘導高血糖は有意に緩和された。その間に、対照群の肝グリコーゲンレベルは非常に有意に減少した。対照群に比べて、２５ｍｇ／ｋｇのセコイトール群（増加１．７６ｍｇ／ｇ肝組織）および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトール群（増加１．２４ｍｇ／ｇ肝組織）は肝グリコーゲンレベルが非常に増加したのに対し、５０ｍｇ／ｋｇのセコイトール群（増加１．０２ｍｇ／ｇ肝組織）およびグリベンクラミド群（増加１．２８ｍｇ／ｇ肝組織）は肝グリコーゲンレベルを有意に増加した。
【００５１】
Ｖ．グルコースにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの効果
【００５２】
１．実験法[4]
７２匹のマウスは無作為に６群に分けられ、４群は２５、５０、および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンが、各々０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は同体積の蒸留水を投与された。これらの投与は、７日間連続して行なわれた。正常群は同体積の生理食塩水が注射により投与されたのに対し、他の群は２ｍｇ／ｋｇのグルコースが腹腔内注射により投与された。投与の３０、６０、９０、および１２０分後に、眼窩後静脈叢から血液が収集され、血清が分離され、グルコースオキシダーセ法により血糖値が個別に検出された。
【００５３】
２．結果
正常群に比べ、対照群のマウスの血糖値は、腹腔内注射によるグルコース投与の３０、６０、９０、１２０分後に非常に有意に増加した。対照群に比較して、２５および５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群のグルコース誘導高血糖は、腹腔内注射によるグルコース投与の３０、６０、９０分後に有意に緩和され、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群およびフェンホルミン群のグルコース誘導高血糖は、腹腔内注射によるグルコース投与の３０、６０、９０、１２０分後に非常に有意に緩和され、セコイトールの作用は本質的に用量依存性であり、高血糖の緩和に関する１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールの効果（９０分、２４．５ｍｇ／ｄｌ減少）は、７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンのそれに等しかった。
【００５４】
ＶＩ．アロキサンにより誘導されたラット高血糖に対するセコイトールの効果
【００５５】
１．実験法[5,6]
５匹のラットが正常群として無作為に選ばれ、他の５５匹のラットは１４〜１６時間断食され、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールが投与された。麻痺の後、ラットは大腿静脈注射により４８ｍｇ／ｋｇのアロキサンが投与され、文献の方法に従ってモデリングされ、血糖値によって５群に分けられ、各群は１１匹のラットを含み、4群は２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンを、各々１ｍｌ／１００g体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は同体積の水が投与された。これらの投与は連続して１８日間行なわれた。ラットの空腹時血糖値は、投与後６日目および１２日目に個別に測定された。１８日目に、血液は大腿動脈より収集され、血糖値、インスリンレベル、コレステロール含有量、トリグリセリド含有量、マロンアルデヒド含有量、および血清のヘパトクプレイン活性が測定され、肝臓組織はホモジナイズされ、肝臓組織のマロンアルデヒド含有量およびヘパトクプレイン活性が測定され、さらに膵腺は１０％ホルマリン中に浸され、パラフィン包埋され、切片化され、ＨＥ染色された。
【００５６】
２．結果
正常群に比較して、対照群のラットの血糖値は非常に有意に増加した。対照群に比較して、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群のアロキサン誘導高血糖は、投与後１２日目に有意に緩和され、投与後１８日目に非常に有意に緩和された（１９４．４ｍｇ／ｄｌ減少）。５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群（６日目，１２日目、および１８日目に個別に１２９．１、２００．７、２２３．１ｍｇ／ｄｌ減少）、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群（６日目，１２日目、および１８日目に個別に１２０、２１８．２、２４０．３ｍｇ／ｄｌ減少）およびフェンホルミン群は、投与後６日目から非常に有意に緩和された。高血糖の緩和に関するセコイトールの作用は、本質的に用量依存性であった。
【００５７】
正常群に比較して、対照群のラットの血清インスリンレベルは有意に減少した。対照群に比べ、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群（１．０１μＩＵ／ｍｌ増加）、５０ｍｇ／ｋｇ
セコイトール群（１．４５μＩＵ／ｍｌ増加）、およびフェンホルミン群のインスリンレベルは増加し、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群のインスリンレベルは有意に増加した（３．３６μＩＵ／ｍｌ増加）。セコイトールの作用は本質的に用量依存性であった。
【００５８】
正常群に比べて、対照群のラットの血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は、非常に有意に増加した。対照群に比べ、セコイトール群の血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は、有意にまたは非常に有意に減少した（５０ｍｇ／ｋｇ群、血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は個別に１５．７および２２．２ｍｇ／ｄｌ減少した）。フェンホルミン群の血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は、有意に変化することはなかった。
【００５９】
正常群に比較して、対照群のラットの血清中のマロンアルデヒド含有量は有意に増加しており、その間に、対照群のラットの肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は有意に増加した。対照群に比較して、セコイトール群の血清中のマロンアルデヒド含有量は、非常に有意に減少した（１００ｍｇ／ｋｇ群、血清中のマロンアルデヒド含有量は４．１３ｎｍｏｌ／ｄｌ減少）。さらに、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は、有意に減少した（４．２９ｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔ減少）。セコイトールの作用は本質的に用量依存性であった。フェンホルミン群の血清および肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は、わずかに減少したにすぎない。
【００６０】
正常群に比較して、対照群のラットの血清および肝臓組織中のヘパトクプレイン活性は、有意に減少した。対照群に比較して、セコイトール群の血清中のヘパトクプレイン活性は増加した（１００ｍｇ／ｋｇ群、５５．０ＮＵ／ｍｌ増加）。１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の肝臓組織中のヘパトクプレイン活性は増加した（１００ｍｇ／ｋｇ群、１８．３ＮＵ／ｍｇ ｐｒｏｔ）。フェンホルミン群の血清および肝臓組織中のヘパトクプレイン活性は、有意に変化することはなかった。
【００６１】
正常群に比較して、対照群のラットの体重は有意に減少した。対照群に比べて、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群の糖尿病ラットの体重は、１５日目に増加し、１７日目に有意に増加した。５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の糖尿病ラットの体重は、１３日目に増加し、１５日目から有意に増加した。フェンホルミン群のラットの体重は、有意に変化することはなかった。
【００６２】
膵腺の組織病理学的検査は、正常群の膵島が明確な境界をもつ塊状の索構造物であって、島細胞は豊富な細胞質と中央の丸い核をもつ多角形の形状であることを示した。多数の膵島があり、島内には多数の細胞があり、間質小血管は有意に変化せず、明確な炎症性細胞浸潤は観察されなかった。対照群については、膵島の数は有意に減少しており、膵島の大きさは減少し、膵島内の細胞数は減少し、前記細胞のサイズが減少し、間質小血管のヒアリン化および炎症性細胞浸潤が明らかに観察された。モデル群に比較して、セコイトール群の膵島数および膵島内の細胞数は有意に増加し、５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群では間質小血管のヒアリン化が緩和され、かつ炎症性細胞浸潤が減少した。間質小血管のヒアリン化の緩和に関しては、セコイトールの作用はフェンホルミンのそれより優れていた。
【００６３】
ＶＩＩ．ストレプトゾシンにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの効果
【００６４】
１．実験法[7,8]
マウス６６匹中、１０匹のマウスが正常群として無作為に選ばれ、残りのマウスは尾静脈注射により１６０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾシンが投与され、文献の方法に従ってモデリングされ、血糖値によって５群に分けられ、４群は２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇのセ
コイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンを、各々０．１ｍｌ／１０g体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は同体積の蒸留水が投与された。これらの投与は連続して１８日間行なわれた。マウスの血糖値は、投与後６日目および１２日目に個別に測定された。１８日目に、眼球切除により血液が収集され、血清が分離され、血糖値、インスリンレベル、コレステロール含有量、トリグリセリド含有量、マロンアルデヒド含有量、および血清のヘパトクプレイン活性が測定され、肝臓組織はホモジナイズされ、肝臓組織のマロンアルデヒド含有量およびヘパトクプレイン活性が測定され、さらに膵腺は１０％ホルマリン中に浸され、パラフィン包埋され、切片化され、ＨＥ染色された。
【００６５】
２．結果
正常群と比較して、対照群のマウスの血糖値は有意に増加した。対照群と比較して、セコイトール群およびフェンホルミン群のストレプトゾシン誘導高血糖は、投与後１２日目に有意に緩和された（５０ｍｇ／ｋｇ群、１２１．４ｍｇ／ｄｌ減少）。
【００６６】
正常群に比べて、対照群のマウスの血清インスリンレベルは有意に減少した。対照群に比べ、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群およびフェンホルミン群のインスリンレベルは増加し、５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群のインスリンレベルは有意に増加した（１００ｍｇ／ｋｇ群、６．５３μＩＵ／ｍｌ増加）。
【００６７】
正常群に比べて、対照群のマウスの血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は有意に増加した。対照群に比べ、２５および５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群では、血清中のトリグリセリドの含有量は有意に減少し、血清中のコレステロールの含有量は減少し、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群では、血清中のトリグリセリド含有量は非常に有意に減少し、血清中のコレステロール含有量は有意に減少した。セコイトールの作用は本質的に用量依存性であった。フェンホルミン群の血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は、有意に変化することはなかった。
【００６８】
正常群に比較して、対照群のマウスの肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は有意に増加した。対照群に比較して、２５および５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群の肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は有意に減少し、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は非常に有意に減少し、一方フェンホルミン群の肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は、有意に変化することはなかった。
【００６９】
正常群に比べ、対照群のマウスの血清中のヘパトクプレイン活性は有意に減少した。対照群に比べ、セコイトール群の血清中のヘパトクプレイン活性は非常に有意に増加し、一方フェンホルミン群の血清中のヘパトクプレイン活性は、有意に変化することはなかった。
【００７０】
正常群に比べ、対照群のマウスの体重は有意に減少した。対照群に比べ、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群の糖尿病マウスの体重は、１１日目から増加した。５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の糖尿病マウスの体重は、７日目から有意に増加したが、一方フェンホルミン群のマウスの体重は、有意に変化することはなかった。
【００７１】
膵腺の組織病理学的検査は、正常群の膵島が明確な境界をもつ塊状の索構造物であって、島細胞は豊富な細胞質と中央の丸い核をもつ多角形の形状であることを示した。多数の膵島があり、島内には多数の細胞があり、間質小血管は有意に変化せず、明らかな炎症性細胞浸潤は観察されなかった。対照群については、膵島の数は有意に減少しており、膵島の大きさは減少し、膵島内の細胞数は減少し、前記細胞のサイズが減少し、間質小血管のヒアリン化および炎症性細胞浸潤が明らかに観察された。モデル群に比較して、セコイトール群の膵島数および膵島内の細胞数は有意に増加しており、炎症性細胞浸潤は阻害され
た。さらに、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群では間質小血管のヒアリン化が緩和された。フェンホルミン群では、膵島数および膵島内の細胞数はわずかに増加したにすぎず、間質小血管のヒアリン化は緩和されなかった。組織病理学的検査の結果は、５０および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールの作用が，７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンのそれにまさっていたことを確証した。
【００７２】
薬物動態学実験の結論
正常マウス、アロキサン誘導高血糖マウスおよびラット、アドレナリンモデルマウス、グルコース誘導高血糖マウス、およびストレプトゾシン誘導高血糖マウスについての、血糖に対するセコイトールの薬物動態学的研究は、セコイトールが正常マウスの血糖には有意に影響を及ぼさなかったが、アドレナリンにより誘導された高血糖を有意に緩和し、肝臓グリコーゲンレベルを増加し、グルコースにより誘導された高血糖に対する有意な糖耐性の作用を有していたことを示した。身体の血糖値は、血糖の生成および代謝を制御するべく、血中グルコースの吸収、利用および転換、貯蔵の間の動的平衡により維持され、身体の炭水化物の代謝を調節して血糖値を維持するインスリンの他に、肝臓グリコーゲンの分解および合成もまた、血糖値を調節するための重要な因子である。アドレナリンは、直接的に島β細胞を破壊せず、インスリンの分泌に影響を及ぼさないが、肝臓グリコーゲンの分解を促進し、αおよびβ受容体を刺激することにより、血糖値を増加する。セコイトールは正常マウスの血糖値に有意に影響を及ぼさないことから、セコイトールが正常なグルコース代謝には有意に影響しないが、肝臓グリコーゲンの分解およびグルコースの吸収を有意に阻害することが示唆される。
【００７３】
アロキサンおよびストレプトゾシンは、選択的に島β細胞を破壊するため、インスリンの分泌が不十分であり、ヒトの糖尿病のような症状が引き起され、動物は多尿、多飲、痩せ、および有意な血糖増加といった症状を有する。アロキサンおよびストレプトゾシンマウスモデルでは、血糖、血清トリグリセリド、コレステロール、マロンアルデヒドのレベルは有意に増加し、血清インスリンレベルおよびヘパトクプレイン活性は有意に減少した。セコイトールは、高められた血糖、血清トリグリセリド、コレステロール、およびマロンアルデヒド含有量を減少させ、血清インスリンレベルおよびヘパトクプレイン活性を増加することが可能であった（フェンホルミンはそのような作用を欠く）。近年の研究によれば、フリーラジカルの代謝が糖尿病の発生および進行に役割を果たしており、糖尿病状態の間にフリーラジカルは増加し、組織脂質の過酸化度は著しく高く、そのことが組織損傷および合併症を悪化させる。セコイトールはフリーラジカルの代謝を改善し、組織および血液における脂質タンパク質および不飽和脂肪酸残基に対するフリーラジカルの攻撃を低減し、脂質の過酸化を軽減し、したがって糖尿病の発生および進行の間のフリーラジカルによる損傷が緩和される。セコイトールは血清コレステロールおよびトリグリセリド含有量を減少させることから、セコイトールが糖尿病性の心臓血管および脳血管面での合併症の予防および治療に、また糖尿病患者の脂肪肝の予防に一定の作用を有することが示唆される。セコイトールは正常マウスの血糖には何ら有意に影響を及ぼさなかったが、低減されたインスリンレベルを上昇させ、また病理学的研究の結果は、アロキサンまたはストレプトゾシンにより誘導された膵島の損傷をセコイトールが緩和することを示しており、そのことはセコイトールが島β細胞を刺激してインスリンを放出させたのではなく、β細胞を保護しかつ、島β細胞の機能回復または再生を促進したことを示唆した。
【００７４】
上記の結果は、セコイトールが正常マウスの血糖値を減少させずに、しかし肝臓グリコーゲンの分解およびグルコースの吸収を阻害したこと、アロキサンおよびストレプトゾシン糖尿病モデルを治療すること、島β細胞を保護すること、血中脂肪を減少させること、およびフリーラジカルの代謝を改善することができたことを示している。セコイトールは非常に有意な薬物動態作用、卓越した特徴、および明らかな利益を有しており、糖尿病の治療に使用されることが可能である。
【００７５】
薬物動態実験法の参考文献
１．ウ・ユーペン（Wu Yupeng）ら、「ハイポグリセミック・イフェクツ・オブ・「イカン」（Hypoglycemic effects of "YiKang"）」ジャーナル・オブ・リサーチス・オン・トラディショナル・チャイニーズ・メディスン（Journal of Researches on Traditional Chinese Medicine）、１９９７年、第１３巻、第１号、ｐ．５７−５９。
２．ズー・シューユン（Xu Shuyun）ら、メソドロジー・オブ・ファーマコロジー（Methodology of Pharmacology）第２版、人民衛生出版社（People's Medical Publishing House）、１９９４年、ｐ．１２７５−１２７８。
３．チャン・ビン（Zuhang Bing）ら、「イフェクツ・オブ・チコリ・カプセル・オン・マウス・ブラッド−シュガー・レベル（Effects of chicory capsule on mouse blood-sugar level）」、北京中医薬大学学報、１９９９年、第２２巻、第１号、ｐ．２８−３０。
４．チェン・ウェイフイ（Chen Weihui）ら、「イフェクツ・オブ・オフィオポゴンポリサッカライド・オン・ブラッド−シュガー・レベルズ・オブ・ノーマル・アンド・エクスペリメンタル・ダイアベティック・マイス（Effects of ophiopogonpolysaccharide on blood-sugar levels of normal and experimental diabetic mice）」、中国現代応用薬学誌（Chinese Journal of Pharmacology for Modern Application）、１９９８年、第１５巻、第4号、ｐ．２１−２３。
５．リ・シィアンチョン（Li Xiangzhong）ら、「イフェクツ・オブ・「イージン」・ハイポグリセミア・オーラル・ソリューション・フォー・リデューシング・ブラッド−シュガー・アンド・ブラッド−ファット・レベルズ（Effets of "YiJin" hypoglycemia oral solution for reducing blood-sugar and blood-fat levels）」、瀋陽薬科大学学報（Journal of Shengyang University of Pharmaceutical Science）、２０００年、第１７巻、第５号、ｐ．３７１−３７４。
６．ワン・シューロン（Wang Shurong）ら、「オブザベーション・オブ・イフェクツ・オブ・「シィオク・チィアンタン」・グラニュールズ・フォー・リデューシング・ブラッド−シュガー・レベル・オブ・ダイアベティック・ラッツ・アンド・フォー・アゲインスト・フリー・ラジカルズ（Observation of effects of "Xioke Jiangtang" granules for reducing blood-sugar level of diabetic rats and for against free radicals）」、ファーマコロジー・アンド・クリニック・オブ・チャイニーズ・メディスン（Pharmacology
and Clinic of Chinese Medicine）、２０００年、第１６巻（増刊）、ｐ．１０９−１１１。
７．ヤン・シィアオフェン（Yang Xiaofeng）ら、「スタディーズ・オン・イフェクツ・オブ・「シィアオケアン」・フォー・リデューシング・ブラッド−シュガー・アンド・ブラッド−ファット・レベル（Studies on effects of "Xiaokean" for reducing blood-sugar and blood-fat level）」、チャイニーズ・ニュー・ドラッグ・アンド・クリニカル・ファーマコロジー（Chinese New Drug and Clinical Pharmacology）、１９９９年、第１０巻、第５号、ｐ．２８８−２８９。
８．チャン・ジュンティエン（Zhang Juntian）、モダン・ファーマコロジカル・メソドロジー（Modern Pharmacological Methodology）、上巻、第１版、北京医科大学・中国協和医科大学連合出版社（Publishing House of Beijing Medical University and China Union Medical University）、１９９８年、ｐ．９８１−９８３。
【００７６】
［２］ 毒性学についての研究
【００７７】
１．経口投与による急性毒性試験
１）実験方法
２０匹の正常なマウス（半数は雄で半数は雌）は２群（各群は１０匹のマウスを含む）に分けられ、１８．９５g／ｋｇおよび９．４７g／ｋｇを一度に飲薬され、高い方の用量
は最大濃度および最大投与体積に達した。動物の反応が観察された。マウスは７日後に屠殺され、その臓器は肉眼的に観察された。
【００７８】
２）実験結果
すべてのマウスは死亡せず、良好な健康状態、光沢のある毛皮、輝く眼、および良好な運動範囲を有していた、マウスは７日後に屠殺され、その主要な臓器は肉眼的な観察下では異常がなかった。セコイトールは非常に毒性が低いかまたは無毒性であるため、セコイトールの経口投与によるマウスのＬＤ50は測定されなかった。
【００７９】
２．経口投与による最大耐用量
１）実験法
正常なマウス２０匹（半数は雄で半数は雌）は断食され、セコイトールが２４時間以内に２回投与され、間隔は８時間であり、３７．９g／ｋｇが１日に投与された。動物の反応が観察された。マウスは１４日後に屠殺され、その臓器は肉眼的に観察された。
【００８０】
２）実験結果
全てのマウスは死亡せず、良好な健康状態、光沢のある毛皮、輝く眼、および良好な運動範囲を有していた。マウスは１４日後に屠殺され、その主要な臓器は肉眼的な観察下では異常がなかった。
【００８１】
３．静脈内投与による急性毒性試験
１）実験法
正常なマウス２０匹（半数は雄で半数は雌）は、５．０４g／ｋｇのセコイトールが静脈内注射により投与された（最大濃度および最大静脈内投与体積に達した）。動物の反応が観察された。マウスは１４日後に屠殺され、その臓器は肉眼的に観察された。
【００８２】
２）実験結果
全てのマウスは良好な健康状態、光沢のある毛皮、輝く眼、および良好な運動範囲を有していた。マウスは１４日後に屠殺され、その主要な臓器は肉眼的な観察下では異常がなかった。セコイトールは非常に毒性が低いかまたは無毒性であるため、セコイトールの経口投与によるマウスのＬＤ50は測定されなかった。
【００８３】
毒性研究に関する参考文献
１．新薬研究に関するガイドライン（Guidelines for Studying New Drugs）（薬学、薬理学、毒性学）、中華人民共和国、厚生部、薬政局。
２．チェン・チィ（Chen Qi）、メソドロジー・フォー・スタディング・ファーマコロジー・オブ・チャイニーズ・メディスン（Methodology for Studying Pharmacology of Chinese Medicine）、人民衛生出版社、第１版、１９９３年、ｐ．１１８−１１９。
【００８４】
［３］ 一般薬理学についての研究
【００８５】
正常なマウスの一般的な身体的徴候および自発運動、マウスのペントバルビタール睡眠時間、およびラットの呼吸運動、血圧、心臓リズム、および心電図に対するセコイトールの影響が注視された。その結果は、セコイトールがマウスの自発運動、マウスのペントバルビタール睡眠時間、および、ラットの呼吸運動、血圧、心臓リズム、および心電図に対し有意に影響を及ぼさなかったことを示した。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、本発明の方法に従って調製されたＡｃ−セコイトールのＸ線単結晶回折パターンである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチイ属の種（Taxus spp.）、特にタクスス・ユンナネンシス（Taxus yunnnanensis Cheng et L. K. Fu）、タクスス・キネンシス・変種マイレ（Taxus chinensis var. mairei（Lemee et Levl）Cheng et L. K. Fu）などから抽出および分離された天然化合物、５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール（セコイトール（Sequoyitol））、その調製方法、およびその薬物的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口の高齢化の進行の加速に伴い、糖尿病は一般的で頻繁に起こる病気となっている。現在、糖尿病の病因はまだ明らかではなく、糖尿病の治療は主として高血糖を緩和すること、および薬物の使用により合併症を予防することである。インスリンおよび経口投与用の主要な化学合成血糖降下薬の発明および適用は、糖尿病患者に役立つものであるが、それら自身には低血糖、乳酸中毒などといった重い副作用があり、そのことがそれらの使用および治療効果を大いに制限している（非特許文献１）。
【非特許文献１】ワン・ヂョンシャオ（Wang Zhongxiao）著、山西医科大学学報（Journal of Shanxi Medical University）、第３１巻、第６号、２０００年、p．５５５−５５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、高効能、低毒性、および高安全性かつ高信頼性の、新規な血糖降下物質を緊急に研究および開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
中国の医学文献によれば、イチイ属の葉は利尿および通経機能を有しており、糖尿病の治療に用いられることが可能であり（グロッサリー・オブ・ハーブズ・アンド・ドラッグズ・イン・チャイナ（Glossary of Herbs and Drugs in China）最新版（第２版）、シェ・ゾンワン（Xie Zongwan）編、人民衛生出版社（People' Medical Publishing House）、ｐ．７２２）、またイチイ属は糖尿病の治療に対して特別の効果を有している（ガン・ウェイソン（Gan Weisong）著、薬用植物学（Pharmaceutical botany）、１９９１年、ｐ．１４０）が、イチイ属の抗糖尿病成分およびその活性についての近代的な研究は、先行技術においては見出されていない。本発明者らは、イチイ属の抗糖尿病活性成分を深く研究し、天然化合物、５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール（セコイトール）が顕著な活性と非常に低い毒性とを有する抗糖尿病活性成分であり、下記構造式Ｉを有することを見出した。
構造式Ｉ
【０００５】
【化１】
【０００６】
セコイトール（５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール）の母核はミオイノシトールであり、シクロヘキサノールの立体異性体の一つである（シクロヘキサノールは数個のキラル中心を有しており、したがっていくつかの立体異性体を有する）。いくつかの論文には、セコイトールがイチイ属、マツ属（Pinus）、オーストラリアヒノキ（Cypress）、セファロタクスス・フォルツネイ（Cephalotaxus fortunei）、スギ科（Taxodiaceae）などのような植物中に存在すると記載されている（フィトケミストリー（Phytochemistry）、１９７１年、第１１巻、ｐ．２４５−２５０）。セコイトールのペンタアセチル誘導体の構造
は、高分解能1Ｈ−ＮＭＲにより同定された（フィトケミストリー、第２７巻、第１号、ｐ．２７９−１８１、１９８８年）。中国薬局方（１９７０年版）には、ミオイノシトールがビタミン様の作用を有することが記録されている。しかしながら、セコイトールの抗糖尿病活性は以前には報告されていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明者らの研究は、セコイトールが糖尿病モデルの高血糖を有意に緩和することが可能であり、肝臓のグリコーゲン分解およびグルコースの吸収を阻害し、血中脂肪レベルを低減し、フリーラジカルの代謝を改善し、膵島のβ細胞を保護し、マウスの正常な血糖値は低減せず、極めて低い毒性を有することを開示している。したがって、セコイトールは糖尿病および合併症の予防および治療のため、代謝障害関連疾患（高脂血症、脂肪肝、肥満などのような）の予防および治療のため、およびフリーラジカルの代謝改善のために使用されることが可能である。
【０００８】
本発明はさらに、イチイ属の種からセコイトールを抽出するための方法を提供するが、前記方法は、有機溶媒を用いてイチイ属の種を抽出して抽出物を得ること、該抽出物を二相抽出しカラムクロマトグラフィーにかけてセコイトールを含有している分画を収集すること、次いで濃縮し、濾過し、乾燥し、再結晶化してセコイトールを含有している粉末を取得することを含有し、抽出に使用された有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、およびそれらの水性混合物を含有し、二相抽出に使用される溶媒は、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルといった水不溶性有機溶媒である。精製は、種々のクロマトグラフ法および再結晶法の、単独または組合せ方式の使用により行なわれることが可能である。再結晶法の溶媒系は、エタノール、アセトン、メチルエチルケトンを含有する溶媒系である。クロマトグラフィーは、マクロポーラス樹脂カラム（Ｄ１０１型、ＮＭ−２００型など）、ポリグルコースまたは修飾グルコースカラム（セファデックス（Sephadex）Ｇまたはセファデックス−ＬＨ−２０など）、セルロースカラム、活性炭カラムなどを用いてよい。最終産物は結晶性粉末であり、主な有効成分は９０％より多い含有量のセコイトールである。
【０００９】
本発明はさらに、前記セコイトールおよび一以上の補助剤および／または賦形剤を含んでなる薬物組成物を提供する。前記薬物組成物は、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤、溶液剤などといった薬物剤形に加工されてよい。
【００１０】
本発明はさらに、糖尿病の治療用薬物の製造における前記セコイトールの用途を提供する。前記薬物は、糖尿病の高血糖を有意に緩和し、肝臓のグリコーゲン分解およびグルコースの吸収を阻害し、血中脂肪レベルを低減し、フリーラジカルの代謝を改善し、膵島のβ細胞を保護することが可能であり、極めて低い毒性を有する。前記薬物は糖尿病および糖尿病性心臓血管および脳血管に関する合併症および糖代謝障害関連疾患の予防および治療のため、フリーラジカルの代謝改善のため、並びにＩＩ型糖尿病および糖尿病性心臓血管及び脳血管に関する合併症の予防および治療のために使用されることが可能である。
【００１１】
さらに具体的には、イチイ属の種から抗糖尿病セコイトールを抽出するための本発明の方法は、イチイ属の種の根、茎または葉を粉砕して粗粉末を得ること、該粗粉末を、エタノール、メタノール、アセトンまたはそれらの水性混合物といった溶媒を用いて、０℃から灌流温度までの温度において、好ましくは室温から灌流温度までの温度において、さらに好ましくは灌流温度において、１〜５回抽出することであって、溶媒の量は１：１〜１：２０（重量／体積）、好ましくは１：２〜１：１０（重量／体積）、さらに好ましくは１：３〜１：６であり、真空内で濃縮して抽出物を得ること、前記抽出物を水と、水不溶性有機溶媒（酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルのような）との間で二相抽出にかけること、および親油性の層を除去することであって、抽出物は好ま
しくは１：０．５から１：１０までの比を有する有機溶媒／水であり、水層を合併すること、濾過すること、およびクロマトグラフィーによって分離することであって、クロマトグラフィーカラムの例は、Ｄ１０１型、ＮＭ−２００型（ピュロライト（PUROLITE））などといったマクロポーラス樹脂カラム、セファデックス−ＬＨ−２０などのようなポリグルコースＧまたは修飾ポリグルコースカラム、セルロースカラム、および活性炭カラムであって、対応する溶出剤が使用され、溶出は同時に検出され、セコイトールを含有している溶出分画を収集すること、真空中で濃縮すること、静置すること、および濾過して固体を得ること、次いでエタノール、メタノール、アセトン、メチルエチルケトンといった溶媒系を用いて前記固体を再結晶すること、および乾燥してセコイトール粉末を得ることを含有する。最終産物は９０％より多いセコイトール含有量を有する結晶状粉末である。
【００１２】
本発明の方法においては、カラムクロマトグラフィーからの分画の検出は、以下の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件を用いることによって行なわれる。
Ｃ１８カラム、５μｍ、４．６x２５０ｍｍ
検出波長２２０ｎｍ
試料注入２０μｌ
移動相、流速１．０ｍｌ／分 メタノール−水（５０：５０）は、０．４５μｍの有機濾過膜を用いた吸引により濾過され、使用に先立ち脱気される。
【００１３】
本発明の産物中のセコイトールの含有量は、以下のＨＰＬＣ法によって検出される。
含有量は、約２５ｍｇの産物を正確に秤量すること、２５ｍｌのメスフラスコ内に入れること、０．６５ｍｌの希硫酸−無水酢酸（１：５０）を添加すること、水浴中で２０分間加熱すること、室温まで冷却すること、１５ｍｌのメタノールを添加すること、均一になるまで振盪すること、目盛りに達するまで水を添加すること、均一になるまで振盪して試料溶液を得ることによって検出された。ＨＰＬＣの条件は上記と同様である。
【００１４】
本発明のセコイトールは、通常の補助剤および／または賦形剤と混合されて、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の予防または治療のための、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤、溶液剤などといった種々の薬物剤形を形成することが可能である。
【００１５】
カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤などといった剤形は、一以上の通常の、デンプン、微結晶セルロースなどのような賦形剤、充填剤および希釈剤、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのような結合剤、グリセロールのような保湿剤、炭酸カルシウムなどのような崩壊剤、吸収剤、カオリンなど、およびタルク末などのような滑沢剤を含有することが可能である。
【００１６】
薬学上許容される賦形剤は、固体、半固体、液体などといった様々な形状でよく、補助剤は種々のタイプであってよい。
【００１７】
溶液は、水、エタノール、グリセロール、ポリビニルグリコール、安息香酸ベンジルなどといった一般的な溶媒、可溶化剤、乳化剤、防腐剤などを含んでよい。
【００１８】
カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤、溶液剤などといった剤形は、セコイトールを一以上の賦形剤と混合することにより、通常の方法に従って調製されることが可能である。
【００１９】
非経口投与用には、剤形、溶液または乳剤は、無菌および等張性であるべきである。
【００２０】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例証しているが、該実施例は、本発明の範囲を限定するよりもむしろ、単に本発明を説明するためのものであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００２１】
（実施例１：天然活性化合物セコイトールの調製（１））
６０ｋｇのイチイ属の種の粗粉末を、４倍体積量の９０％エタノールを用いて３回抽出し、抽出物を合せ、濃縮して粘稠溶液を形成し、該粘稠溶液をさらに濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、１：１（ｖ／ｖ）クロロホルム／水を用いて二相抽出し、水層を合せ、濾過し、マクロポーラス樹脂カラム（Ｄ１０１型、国産）上にロードし、蒸留水および水性エタノール（エタノール：５％−２０％）により勾配溶出し、分画をＨＰＬＣにより個別に同定し、セコイトールを含有している溶出物を合せ、濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、次にエタノールを用いて再結晶化し、濾過して結晶状粉末を得た。結晶状粉末を吸引により乾燥し、９５％エタノールを用いて２回再結晶化し、濾過し、７０℃で乾燥してセコイトール結晶を０．０７％の収率で得た。
【００２２】
（実施例２：天然活性化合物セコイトールの調製（２））
７０ｋｇのイチイ属の種の粗粉末を、３倍体積量の８０％メタノールを用いて３回抽出し、抽出物を合せ、濃縮してスラリー溶液を形成し、該スラリー溶液をさらに濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、１：２（ｖ／ｖ）酢酸エチル／水を用いて二相抽出し、水層を合せ、濾過し、マクロポーラス樹脂カラム（ＭＮ−２００型）上にロードし、蒸留水および水性エタノール（エタノール：５％−２０％）により勾配溶出し、溶出液をＨＰＬＣにより個別に同定し、セコイトールを含有している溶出液を合せ、濃縮し、ロータリーエバポレータにより乾燥し、アセトンを用いて再結晶化し、さらに濾過して結晶状粉末を得た。結晶状粉末を吸引により乾燥し、アセトン：エタノール（１：１）を用いて２回再結晶化し、濾過し、７０℃で乾燥してセコイトール結晶を０．０８％の収率で得た。
【００２３】
（実施例３：天然活性化合物セコイトールの調製（３））
６５ｋｇのイチイ属の種の粗粉末を、４倍体積量の７５％アセトンを用いて３回抽出し、抽出物を合せ、濃縮して粘稠溶液を形成し、該粘稠溶液をさらに濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、２：１（ｖ／ｖ）ジクロロメタン／水を用いて二相抽出し、水層を合せ、濾過し、活性炭カラム（薬学上許容される標準品）上にロードし、蒸留水および水性エタノール（エタノール：５％−３０％）により勾配溶出し、溶出液を個別に同定し、セコイトールを含有している溶出物を合せ、濃縮し、ロータリーエバポレータ中で乾燥し、メタノールを用いて再結晶化し、濾過して結晶状粉末を得た。結晶状粉末は吸引により乾燥し、メタノールを用いて２回再結晶化し、濾過し、７０℃で乾燥してセコイトール結晶を０．０７％の収率で得た。
【００２４】
（実施例４：セコイトールカプセル剤の調製）
処方：０．２gカプセルあたり２５ｍｇのセコイトールを含有。
微結晶セルロース １７５g
セコイトール ２５g
―――――――――――――――――
１０００カプセル
【００２５】
補助剤を、粉砕容器内に置き、次いでセコイトールを添加し、１０〜３０分間粉砕し、均一な粉末を得た。該均一な粉末を１＃カプセル中に詰め、各カプセルの含有量は、無作為抽出により０．２gになるよう調整した。
【００２６】
（実施例５：セコイトール錠剤の調整）
２５ｇのセコイトール、４９ｇの微結晶セルロース、１ｇのステアリン酸マグネシウムを充分に混合し、混合物をシングルパンチペレットにより加工し、直径６ｍｍおよび３００ｍｇの重さを有する錠剤を産生した。各錠剤は１００ｍｇのセコイトールを含んでいた
。
【００２７】
（実施例６：セコイトール顆粒剤の調整）
２０ｇのセコイトールおよび１８０ｇのコーンスターチを充分に混合し、次に適量の６０％エタノールを添加して、軟材料を形成した。該軟材料を１２メッシュの篩を通し、乾燥して顆粒を形成した。各顆粒は１００ｍｇのセコイトールを含んでいた。
【００２８】
実施例１において得られた天然化合物の化学構造は、以下のように同定された。
【００２９】
１．天然化合物の構造同定
天然化合物の融点は双眼微量融点測定装置（未校正）により測定し、赤外線スペクトルはパーキン・エルマ９８３赤外線分光光度計（ＫＢｒタブレット）により測定し、エレクトロスプレイ・イオン化質量分光測定はフィニガン社（Finnigan company）のＬＣＱ型質量分析計により測定し、旋光性はＰＥ−２４１ＭＣ型旋光計により測定し、核磁気共鳴スペクトルはブルーサ（Brucer）ＡＣＦ−３００（1Ｈ−ＮＭＲ ３００ＭＨｚ）により、ＴＭＳまたはＤＳＳを内部標準として測定した。
【００３０】
実施例１の産物は、以下の物理／化学的データおよびスペクトルデータを有していた。
無色結晶
ＭＰ２３２〜２３４℃
ＩＲνKBrmax（ｃｍ-1）：３４２７，３３５６，３１８８（ＯＨ），１０３２（Ｃ−Ｏ−Ｃ）
ＥＳＩ（＋）ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１７．１［Ｍ＋Ｎａ］+
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ＋ＤＳＳ，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：３．５３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９，１０．０，Ｈ−１＋Ｈ−３）；４．０４（１Ｈ，ｄｄ，J＝２．９，２．９，Ｈ−２）；３．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，９．７，Ｈ−４＋Ｈ−６），３．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．４，９．４，Ｈ−５）；３．５９（３Ｈ，ｓ，Ｏ−ＣＨ3）
13Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ＋ＤＳＳ，７５ＭＨｚ，ｐｐｍ）：８６．７９（ＣＨ，Ｃ−５），７４．５７（ＣＨ，Ｃ−２），７４．３１（ＣＨ×２，Ｃ−４およびＣ−６），７３．６９（ＣＨ×２，Ｃ−１およびＣ−３），６２．２７（ＯＣＨ3）
結果は、この構造が５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール、すなわちセコイトールであることを示した。
【００３１】
２．ペンタアセチル−セコイトール（Ａｃ−セコイトール）の調製
セコイトールの構造のさらなる確認のため、セコイトールのペンタアセチル化をＡｃ2Ｏを用いて酸性条件下に行い、セコイトールのペンタアセチル誘導体（Ａｃ−セコイトール）を調製し、その構造を同定した。
【００３２】
試薬の調製
１．０ｍｌのＡＲグレードの濃縮硫酸に対し、４ｍｌの水を添加して硫酸溶液を得、１２．５ｍｌのＡｃ2Ｏに対し、０．２５ｍｌの前記硫酸溶液を添加し、均一に混合した。
【００３３】
ペンタアセチル−セコイトール（Ａｃ−セコイトール）の調製
実施例１の２００ｍｇの産物を、５．０ｍｌの前記試薬中に溶解し、水浴中、約８７℃において２０分間反応させ、室温に冷却した後、１００ｍｌの蒸留水を撹拌下に徐々に添加し、再度水浴中にて約８７℃で２０分間加熱し、室温に冷却した後、反応混合物を分液漏斗に移し、ＣＨ2Ｃｌ2／Ｈ2Ｏにより３回にわたり二相抽出し、ＣＨ2Ｃｌ2層を合せ、ロータリーエバポレータ中において蒸発乾燥し、無色の結晶状固体を得、該固体をエチルエーテル／無水エタノールを用いて再結晶化し、無色透明の塊状結晶（すなわち、Ａｃ−セコイトール）を得た。
【００３４】
３．ペンタアセチル−セコイトール（Ａｃ−セコイトール）の構造同定
化合物Ａｃ−セコイトールは無色の塊状結晶である。
ＭＰ２０１〜２０２℃
Ｃ17Ｈ24Ｏ11
ＥＳＩ（＋）ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２７．１［Ｍ＋Ｎａ］+
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：５．５４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．８，Ｈ−２）；５．４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．０５，Ｈ−４およびＨ−６）；５．０１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１０．５，Ｈ−１およびＨ−３）；３．４２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．７，Ｈ−５），３．４５（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ3）；２．１６（３Ｈ，ｓ，Ｃ2−ＯＡｃ）；２．０８（６Ｈ，ｓ，ＯＡｃ×２）；１．９９（６Ｈ，ｓ，ＯＡｃ×２）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，７５ＭＨｚ，ｐｐｍ）：１６９．８５（１Ｃ，Ｃ2−ＯＣＯＣＨ3），１６９．６３（２Ｃ，ＯＣＯＣＨ3×２），１６９．４１（２Ｃ，ＯＣＯＣＨ3×２），８０．０８（１Ｃ，Ｃ−５），７０．６０（２Ｃ，Ｃ−４＋Ｃ−６），６８．７８（２Ｃ，Ｃ−１＋Ｃ−３），６８．３６（１Ｃ，Ｃ−２），６０．０２（１Ｃ，ＯＣＨ3），２０．３９，２０．６７（全５Ｃ，ＯＣＯＣＨ3×５）
Ａｃ−セコイトールの1Ｈ−1Ｈ ＣＯＳＹ 1Ｈ−13Ｃ ＣＯＳＹ、1Ｈ−13Ｃ ＣＯＬＯＧ長距離相関分光を測定し、前記化合物の1Ｈ−13Ｃデータを代入した。セコイトールと比較して、Ａｃ−セコイトールの分子量は２１０（５個のアセチル基に相当）まで増加した。このデータは、Ａｃ−セコイトールがセコイトールのペンタアセチル誘導体であり、以下の構造式を有することを示した。
【００３５】
【化２】
【００３６】
４．Ａｃ−セコイトールのＸ線単結晶回折
Ａｃ−セコイトールの構造を確認するため、Ａｃ−セコイトールについて、そのＸ線単結晶回折を測定した。Ａｃ−セコイトールのＸ線単結晶回折の結果は、Ａｃ−セコイトールの構造を証明した（図１参照）。したがって、セコイトールの構造および相対配置が確認された。
【００３７】
実施例１において調製された天然化合物（セコイトール）の薬力学的、毒性学的、および一般薬理学的研究は、以下のように行なわれた。
【００３８】
［１］ 主要な薬力学的実験
実験材料
動物：昆明マウス、体重２０〜２４g
ＳＤラット、体重２３０〜２９０g、雄
薬物および試薬：
セコイトール（本発明者らにより製造された）
フェンホルミン（ポジティブ・コントロール、江蘇省金壇市ドラッグプラント（Jiangsu Jintan Drug Plant））
アロキサン（シグマ社（Sigma Company），米国）
グルコース検出キット（上海栄盛生物技術社（Shanghai Rongsheng Biological Technology Co. Ltd.））
グリベンクラミド（陽性コントロール、天津太平洋製薬社（Tianjin Pacific Ocean Pharmaceutical Co. , Ltd.））
アドレナリンハイドロクロライド注射液（武漢製薬群社（Wuhan Pharmaceutical
Group Co., Ltd.））
肝グリコーゲン検出キット（南京建成生物工学研究所（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute））
５０％グルコース注射液（江蘇常州国営武進ドラッグプラント（Jiangsu Changzhou Stated-owned Wujin Drug Plant））
コレステロール検出試薬（上海栄盛生物技術社）
マロンアルデヒド検出キット（南京建成生物工学研究所）
タンパク質検出キット（南京建成生物工学研究所）
トリグリセリド検出キット（上海栄盛生物技術社）
ヘパトクプレイン検出キット（南京建成生物工学研究所）
インスリン検出キット（河南省焦作市解放免疫診断試薬研究所（Henan Jiaozuo Jiefang Immunodiagnosis Reagents Institute））
ストレプトゾシン（Ｌｏｔ１１９ Ｈ１０２９、シグマ社、米国）
【００３９】
Ｉ．アロキサンにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの時間効果関係の実験
【００４０】
１．実験法[1,2]
アロキサンは、３０匹のマウスの各々に対し、６５ｍｇ／ｋｇの用量の尾静脈注射により投与され、マウスは文献の方法にしたがってモデリングされ、血糖値によって３群に分けられ、２群は５０ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンを、０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、モデリング群は同体積の蒸留水を別々に投与された。これらの投与は７日間連続して行なわれ、マウスは最後の投与の前２時間は断食され、その血糖値は、グルコースオキシダーゼ法により、投与の１、２、３、および５時間後に検出された。
【００４１】
２．結果
対照群に比較して、アロキサン誘導高血糖は、５０ｍｇ／ｋｇのセコイトールの投与後１時間で緩和され（１００．０ｍｇ／ｄｌ減少）、アロキサン誘導高血糖は、投与後２時間で有意に緩和され（１４０．７ｍｇ／ｄｌ減少）、アロキサン誘導高血糖は、投与後３時間（１９３．９ｍｇ／ｄｌ減少）、および投与後５時間（１７４．６ｍｇ／ｄｌ減少）では非常に有意に緩和された。アロキサン誘導高血糖は、フェンホルミンの投与後１時間（１６３．１ｍｇ／ｄｌ減少）および投与後２時間（１５９．３ｍｇ／ｄｌ減少）で非常に有意に緩和され、投与後３時間では有意に軽減され（１０４．２ｍｇ／ｄｌ減少）、および投与後５時間（５６．６ｍｇ／ｍｌ減少）で緩和された。したがって、５０ｍｇ／ｋｇのセコイトールの高血糖緩和効果は、７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンのものよりも高かった。
【００４２】
ＩＩ．アロキサンにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの効果
【００４３】
１．実験法[1,2]
６０匹のマウスのうち、１０匹のマウスが正常な群として無作為に選ばれ、残りのマウスは尾静脈注射により６５ｍｇ／ｋｇのアロキサンが投与され、文献の方法にしたがってモデリングされ、血糖値によって５群に分けられ、４群は２５、５０、および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンが、各々０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は、同体積の蒸留水を別々に投与された。これらの投与は、７日間連続して行なわれた。血糖値はグルコースオキシダーセ法により検出された。マウスの膵腺は１０％ホルマリン中に浸され、パラフィン包埋され、切片化され、ＨＥ色素により染色された。
【００４４】
２．結果
正常な群と比較して、対照群のマウスの血糖値は非常に有意に増加した（３０８．２ｍｇ／ｄｌ増加）。対照群に比較して、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群の高血糖は緩和され
（９５．６ｍｇ／ｄｌ減少）、５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群並びにフェンホルミン群のアロキサン誘導高血糖は非常に有意に緩和された。高血糖の緩和に関するセコイトールの作用は、用量依存性であった。１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群（３０６．８ｍｇ／ｄｌ減少）および５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群（１９５．２ｍｇ／ｄｌ減少）の効果は、７５ｍｇ／ｋｇフェンホルミン群のもの（１５２．８ｍｇ／ｄｌ減少）よりも優れていた。膵腺の組織病理学的検査は、正常な群の膵島が、明確な境界をもつ塊状の索構造物であって、膵島細胞は豊富な細胞質と中央の丸い核をもつ多角形の形状であることを示した。多数の膵島があり、島内には多数の細胞があり、間質小血管は有意に変化せず、炎症性細胞浸潤は観察されなかった。対照群については、膵島の数は有意に減少しており、膵島の大きさは減少し、膵島内の細胞数は減少し、前記細胞のサイズが減少し、間質小血管のヒアリン化および炎症性細胞浸潤が観察された。モデル群に比較して、セコイトール群の膵島数および島細胞数が有意に増加したのに対し、フェンホルミン群の膵島数および島細胞数はわずかに増加した。組織病理学的検査結果は、セコイトールの効果がフェンホルミンのそれよりも優れていることを確証した。
【００４５】
ＩＩＩ．正常マウスの血糖値に対するセコイトールの影響
【００４６】
１．実験法[3]
５０匹のマウスは無作為に５群に分けられ、４群は２５、５０、および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび５０ｍｇ／ｋｇのグリベンクラミドが、各々０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、正常群は同体積の蒸留水を投与された。これらの投与は、７日間連続して行なわれた。血糖値はグルコースオキシダーセ法により検出された。
【００４７】
２．結果
セコイトール群（２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇ）および正常群の血糖値（１３９．０±１７．８ｍｇ／ｄｌ）は有意差がなかったのに対し、グリベンクラミド群の血糖値（１９．３ｍｇ／ｄｌ減少）は正常群のそれよりも有意に低かった。
【００４８】
ＩＶ．アドレナリンにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの効果
【００４９】
１．実験法[3]
７２匹のマウスは無作為に６群に分けられ、４群は２５、５０、および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび１０ｍｇ／ｋｇのグリベンクラミドが、各々０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は同体積の蒸留水を投与された。これらの投与は、７日間連続して行なわれた。正常群は同体積の生理食塩水が注射により投与されたのに対し、他の群は０．２ｍｇ／ｋｇのアドレナリンが腹腔内注射により投与された。血糖値はグルコースオキシダーセ法により、投与の３０分後に検出された。マウスの肝臓は収集され、肝グリコーゲンレベルはアントロン法により検出された。
【００５０】
２．結果
正常群に比較して、対照群のマウスの血糖値は非常に有意に増加した。対照群に比較して、セコイトール群（３２．２、３５．５、３９．９ｍｇ／ｄｌ減少）およびグリベンクラミド群（４０．１ｍｇ／ｄｌ減少）のアドレナリン誘導高血糖は有意に緩和された。その間に、対照群の肝グリコーゲンレベルは非常に有意に減少した。対照群に比べて、２５ｍｇ／ｋｇのセコイトール群（増加１．７６ｍｇ／ｇ肝組織）および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトール群（増加１．２４ｍｇ／ｇ肝組織）は肝グリコーゲンレベルが非常に増加したのに対し、５０ｍｇ／ｋｇのセコイトール群（増加１．０２ｍｇ／ｇ肝組織）およびグリベンクラミド群（増加１．２８ｍｇ／ｇ肝組織）は肝グリコーゲンレベルを有意に増加した。
【００５１】
Ｖ．グルコースにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの効果
【００５２】
１．実験法[4]
７２匹のマウスは無作為に６群に分けられ、４群は２５、５０、および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンが、各々０．１ｍｌ／１０ｇ体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は同体積の蒸留水を投与された。これらの投与は、７日間連続して行なわれた。正常群は同体積の生理食塩水が注射により投与されたのに対し、他の群は２ｍｇ／ｋｇのグルコースが腹腔内注射により投与された。投与の３０、６０、９０、および１２０分後に、眼窩後静脈叢から血液が収集され、血清が分離され、グルコースオキシダーセ法により血糖値が個別に検出された。
【００５３】
２．結果
正常群に比べ、対照群のマウスの血糖値は、腹腔内注射によるグルコース投与の３０、６０、９０、１２０分後に非常に有意に増加した。対照群に比較して、２５および５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群のグルコース誘導高血糖は、腹腔内注射によるグルコース投与の３０、６０、９０分後に有意に緩和され、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群およびフェンホルミン群のグルコース誘導高血糖は、腹腔内注射によるグルコース投与の３０、６０、９０、１２０分後に非常に有意に緩和され、セコイトールの作用は本質的に用量依存性であり、高血糖の緩和に関する１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールの効果（９０分、２４．５ｍｇ／ｄｌ減少）は、７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンのそれに等しかった。
【００５４】
ＶＩ．アロキサンにより誘導されたラット高血糖に対するセコイトールの効果
【００５５】
１．実験法[5,6]
５匹のラットが正常群として無作為に選ばれ、他の５５匹のラットは１４〜１６時間断食され、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールが投与された。麻痺の後、ラットは大腿静脈注射により４８ｍｇ／ｋｇのアロキサンが投与され、文献の方法に従ってモデリングされ、血糖値によって５群に分けられ、各群は１１匹のラットを含み、4群は２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンを、各々１ｍｌ／１００g体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は同体積の水が投与された。これらの投与は連続して１８日間行なわれた。ラットの空腹時血糖値は、投与後６日目および１２日目に個別に測定された。１８日目に、血液は大腿動脈より収集され、血糖値、インスリンレベル、コレステロール含有量、トリグリセリド含有量、マロンアルデヒド含有量、および血清のヘパトクプレイン活性が測定され、肝臓組織はホモジナイズされ、肝臓組織のマロンアルデヒド含有量およびヘパトクプレイン活性が測定され、さらに膵腺は１０％ホルマリン中に浸され、パラフィン包埋され、切片化され、ＨＥ染色された。
【００５６】
２．結果
正常群に比較して、対照群のラットの血糖値は非常に有意に増加した。対照群に比較して、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群のアロキサン誘導高血糖は、投与後１２日目に有意に緩和され、投与後１８日目に非常に有意に緩和された（１９４．４ｍｇ／ｄｌ減少）。５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群（６日目，１２日目、および１８日目に個別に１２９．１、２００．７、２２３．１ｍｇ／ｄｌ減少）、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群（６日目，１２日目、および１８日目に個別に１２０、２１８．２、２４０．３ｍｇ／ｄｌ減少）およびフェンホルミン群は、投与後６日目から非常に有意に緩和された。高血糖の緩和に関するセコイトールの作用は、本質的に用量依存性であった。
【００５７】
正常群に比較して、対照群のラットの血清インスリンレベルは有意に減少した。対照群に比べ、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群（１．０１μＩＵ／ｍｌ増加）、５０ｍｇ／ｋｇ
セコイトール群（１．４５μＩＵ／ｍｌ増加）、およびフェンホルミン群のインスリンレベルは増加し、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群のインスリンレベルは有意に増加した（３．３６μＩＵ／ｍｌ増加）。セコイトールの作用は本質的に用量依存性であった。
【００５８】
正常群に比べて、対照群のラットの血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は、非常に有意に増加した。対照群に比べ、セコイトール群の血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は、有意にまたは非常に有意に減少した（５０ｍｇ／ｋｇ群、血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は個別に１５．７および２２．２ｍｇ／ｄｌ減少した）。フェンホルミン群の血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は、有意に変化することはなかった。
【００５９】
正常群に比較して、対照群のラットの血清中のマロンアルデヒド含有量は有意に増加しており、その間に、対照群のラットの肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は有意に増加した。対照群に比較して、セコイトール群の血清中のマロンアルデヒド含有量は、非常に有意に減少した（１００ｍｇ／ｋｇ群、血清中のマロンアルデヒド含有量は４．１３ｎｍｏｌ／ｄｌ減少）。さらに、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は、有意に減少した（４．２９ｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔ減少）。セコイトールの作用は本質的に用量依存性であった。フェンホルミン群の血清および肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は、わずかに減少したにすぎない。
【００６０】
正常群に比較して、対照群のラットの血清および肝臓組織中のヘパトクプレイン活性は、有意に減少した。対照群に比較して、セコイトール群の血清中のヘパトクプレイン活性は増加した（１００ｍｇ／ｋｇ群、５５．０ＮＵ／ｍｌ増加）。１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の肝臓組織中のヘパトクプレイン活性は増加した（１００ｍｇ／ｋｇ群、１８．３ＮＵ／ｍｇ ｐｒｏｔ）。フェンホルミン群の血清および肝臓組織中のヘパトクプレイン活性は、有意に変化することはなかった。
【００６１】
正常群に比較して、対照群のラットの体重は有意に減少した。対照群に比べて、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群の糖尿病ラットの体重は、１５日目に増加し、１７日目に有意に増加した。５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の糖尿病ラットの体重は、１３日目に増加し、１５日目から有意に増加した。フェンホルミン群のラットの体重は、有意に変化することはなかった。
【００６２】
膵腺の組織病理学的検査は、正常群の膵島が明確な境界をもつ塊状の索構造物であって、島細胞は豊富な細胞質と中央の丸い核をもつ多角形の形状であることを示した。多数の膵島があり、島内には多数の細胞があり、間質小血管は有意に変化せず、明確な炎症性細胞浸潤は観察されなかった。対照群については、膵島の数は有意に減少しており、膵島の大きさは減少し、膵島内の細胞数は減少し、前記細胞のサイズが減少し、間質小血管のヒアリン化および炎症性細胞浸潤が明らかに観察された。モデル群に比較して、セコイトール群の膵島数および膵島内の細胞数は有意に増加し、５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群では間質小血管のヒアリン化が緩和され、かつ炎症性細胞浸潤が減少した。間質小血管のヒアリン化の緩和に関しては、セコイトールの作用はフェンホルミンのそれより優れていた。
【００６３】
ＶＩＩ．ストレプトゾシンにより誘導されたマウス高血糖に対するセコイトールの効果
【００６４】
１．実験法[7,8]
マウス６６匹中、１０匹のマウスが正常群として無作為に選ばれ、残りのマウスは尾静脈注射により１６０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾシンが投与され、文献の方法に従ってモデリングされ、血糖値によって５群に分けられ、４群は２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇのセ
コイトールおよび７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンを、各々０．１ｍｌ／１０g体重により経口投与され、正常群およびモデリング群は同体積の蒸留水が投与された。これらの投与は連続して１８日間行なわれた。マウスの血糖値は、投与後６日目および１２日目に個別に測定された。１８日目に、眼球切除により血液が収集され、血清が分離され、血糖値、インスリンレベル、コレステロール含有量、トリグリセリド含有量、マロンアルデヒド含有量、および血清のヘパトクプレイン活性が測定され、肝臓組織はホモジナイズされ、肝臓組織のマロンアルデヒド含有量およびヘパトクプレイン活性が測定され、さらに膵腺は１０％ホルマリン中に浸され、パラフィン包埋され、切片化され、ＨＥ染色された。
【００６５】
２．結果
正常群と比較して、対照群のマウスの血糖値は有意に増加した。対照群と比較して、セコイトール群およびフェンホルミン群のストレプトゾシン誘導高血糖は、投与後１２日目に有意に緩和された（５０ｍｇ／ｋｇ群、１２１．４ｍｇ／ｄｌ減少）。
【００６６】
正常群に比べて、対照群のマウスの血清インスリンレベルは有意に減少した。対照群に比べ、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群およびフェンホルミン群のインスリンレベルは増加し、５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群のインスリンレベルは有意に増加した（１００ｍｇ／ｋｇ群、６．５３μＩＵ／ｍｌ増加）。
【００６７】
正常群に比べて、対照群のマウスの血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は有意に増加した。対照群に比べ、２５および５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群では、血清中のトリグリセリドの含有量は有意に減少し、血清中のコレステロールの含有量は減少し、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群では、血清中のトリグリセリド含有量は非常に有意に減少し、血清中のコレステロール含有量は有意に減少した。セコイトールの作用は本質的に用量依存性であった。フェンホルミン群の血清中のトリグリセリドおよびコレステロール含有量は、有意に変化することはなかった。
【００６８】
正常群に比較して、対照群のマウスの肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は有意に増加した。対照群に比較して、２５および５０ｍｇ／ｋｇセコイトール群の肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は有意に減少し、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は非常に有意に減少し、一方フェンホルミン群の肝臓組織中のマロンアルデヒド含有量は、有意に変化することはなかった。
【００６９】
正常群に比べ、対照群のマウスの血清中のヘパトクプレイン活性は有意に減少した。対照群に比べ、セコイトール群の血清中のヘパトクプレイン活性は非常に有意に増加し、一方フェンホルミン群の血清中のヘパトクプレイン活性は、有意に変化することはなかった。
【００７０】
正常群に比べ、対照群のマウスの体重は有意に減少した。対照群に比べ、２５ｍｇ／ｋｇセコイトール群の糖尿病マウスの体重は、１１日目から増加した。５０および１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群の糖尿病マウスの体重は、７日目から有意に増加したが、一方フェンホルミン群のマウスの体重は、有意に変化することはなかった。
【００７１】
膵腺の組織病理学的検査は、正常群の膵島が明確な境界をもつ塊状の索構造物であって、島細胞は豊富な細胞質と中央の丸い核をもつ多角形の形状であることを示した。多数の膵島があり、島内には多数の細胞があり、間質小血管は有意に変化せず、明らかな炎症性細胞浸潤は観察されなかった。対照群については、膵島の数は有意に減少しており、膵島の大きさは減少し、膵島内の細胞数は減少し、前記細胞のサイズが減少し、間質小血管のヒアリン化および炎症性細胞浸潤が明らかに観察された。モデル群に比較して、セコイトール群の膵島数および膵島内の細胞数は有意に増加しており、炎症性細胞浸潤は阻害され
た。さらに、１００ｍｇ／ｋｇセコイトール群では間質小血管のヒアリン化が緩和された。フェンホルミン群では、膵島数および膵島内の細胞数はわずかに増加したにすぎず、間質小血管のヒアリン化は緩和されなかった。組織病理学的検査の結果は、５０および１００ｍｇ／ｋｇのセコイトールの作用が，７５ｍｇ／ｋｇのフェンホルミンのそれにまさっていたことを確証した。
【００７２】
薬物動態学実験の結論
正常マウス、アロキサン誘導高血糖マウスおよびラット、アドレナリンモデルマウス、グルコース誘導高血糖マウス、およびストレプトゾシン誘導高血糖マウスについての、血糖に対するセコイトールの薬物動態学的研究は、セコイトールが正常マウスの血糖には有意に影響を及ぼさなかったが、アドレナリンにより誘導された高血糖を有意に緩和し、肝臓グリコーゲンレベルを増加し、グルコースにより誘導された高血糖に対する有意な糖耐性の作用を有していたことを示した。身体の血糖値は、血糖の生成および代謝を制御するべく、血中グルコースの吸収、利用および転換、貯蔵の間の動的平衡により維持され、身体の炭水化物の代謝を調節して血糖値を維持するインスリンの他に、肝臓グリコーゲンの分解および合成もまた、血糖値を調節するための重要な因子である。アドレナリンは、直接的に島β細胞を破壊せず、インスリンの分泌に影響を及ぼさないが、肝臓グリコーゲンの分解を促進し、αおよびβ受容体を刺激することにより、血糖値を増加する。セコイトールは正常マウスの血糖値に有意に影響を及ぼさないことから、セコイトールが正常なグルコース代謝には有意に影響しないが、肝臓グリコーゲンの分解およびグルコースの吸収を有意に阻害することが示唆される。
【００７３】
アロキサンおよびストレプトゾシンは、選択的に島β細胞を破壊するため、インスリンの分泌が不十分であり、ヒトの糖尿病のような症状が引き起され、動物は多尿、多飲、痩せ、および有意な血糖増加といった症状を有する。アロキサンおよびストレプトゾシンマウスモデルでは、血糖、血清トリグリセリド、コレステロール、マロンアルデヒドのレベルは有意に増加し、血清インスリンレベルおよびヘパトクプレイン活性は有意に減少した。セコイトールは、高められた血糖、血清トリグリセリド、コレステロール、およびマロンアルデヒド含有量を減少させ、血清インスリンレベルおよびヘパトクプレイン活性を増加することが可能であった（フェンホルミンはそのような作用を欠く）。近年の研究によれば、フリーラジカルの代謝が糖尿病の発生および進行に役割を果たしており、糖尿病状態の間にフリーラジカルは増加し、組織脂質の過酸化度は著しく高く、そのことが組織損傷および合併症を悪化させる。セコイトールはフリーラジカルの代謝を改善し、組織および血液における脂質タンパク質および不飽和脂肪酸残基に対するフリーラジカルの攻撃を低減し、脂質の過酸化を軽減し、したがって糖尿病の発生および進行の間のフリーラジカルによる損傷が緩和される。セコイトールは血清コレステロールおよびトリグリセリド含有量を減少させることから、セコイトールが糖尿病性の心臓血管および脳血管面での合併症の予防および治療に、また糖尿病患者の脂肪肝の予防に一定の作用を有することが示唆される。セコイトールは正常マウスの血糖には何ら有意に影響を及ぼさなかったが、低減されたインスリンレベルを上昇させ、また病理学的研究の結果は、アロキサンまたはストレプトゾシンにより誘導された膵島の損傷をセコイトールが緩和することを示しており、そのことはセコイトールが島β細胞を刺激してインスリンを放出させたのではなく、β細胞を保護しかつ、島β細胞の機能回復または再生を促進したことを示唆した。
【００７４】
上記の結果は、セコイトールが正常マウスの血糖値を減少させずに、しかし肝臓グリコーゲンの分解およびグルコースの吸収を阻害したこと、アロキサンおよびストレプトゾシン糖尿病モデルを治療すること、島β細胞を保護すること、血中脂肪を減少させること、およびフリーラジカルの代謝を改善することができたことを示している。セコイトールは非常に有意な薬物動態作用、卓越した特徴、および明らかな利益を有しており、糖尿病の治療に使用されることが可能である。
【００７５】
薬物動態実験法の参考文献
１．ウ・ユーペン（Wu Yupeng）ら、「ハイポグリセミック・イフェクツ・オブ・「イカン」（Hypoglycemic effects of "YiKang"）」ジャーナル・オブ・リサーチス・オン・トラディショナル・チャイニーズ・メディスン（Journal of Researches on Traditional Chinese Medicine）、１９９７年、第１３巻、第１号、ｐ．５７−５９。
２．ズー・シューユン（Xu Shuyun）ら、メソドロジー・オブ・ファーマコロジー（Methodology of Pharmacology）第２版、人民衛生出版社（People's Medical Publishing House）、１９９４年、ｐ．１２７５−１２７８。
３．チャン・ビン（Zuhang Bing）ら、「イフェクツ・オブ・チコリ・カプセル・オン・マウス・ブラッド−シュガー・レベル（Effects of chicory capsule on mouse blood-sugar level）」、北京中医薬大学学報、１９９９年、第２２巻、第１号、ｐ．２８−３０。
４．チェン・ウェイフイ（Chen Weihui）ら、「イフェクツ・オブ・オフィオポゴンポリサッカライド・オン・ブラッド−シュガー・レベルズ・オブ・ノーマル・アンド・エクスペリメンタル・ダイアベティック・マイス（Effects of ophiopogonpolysaccharide on blood-sugar levels of normal and experimental diabetic mice）」、中国現代応用薬学誌（Chinese Journal of Pharmacology for Modern Application）、１９９８年、第１５巻、第4号、ｐ．２１−２３。
５．リ・シィアンチョン（Li Xiangzhong）ら、「イフェクツ・オブ・「イージン」・ハイポグリセミア・オーラル・ソリューション・フォー・リデューシング・ブラッド−シュガー・アンド・ブラッド−ファット・レベルズ（Effets of "YiJin" hypoglycemia oral solution for reducing blood-sugar and blood-fat levels）」、瀋陽薬科大学学報（Journal of Shengyang University of Pharmaceutical Science）、２０００年、第１７巻、第５号、ｐ．３７１−３７４。
６．ワン・シューロン（Wang Shurong）ら、「オブザベーション・オブ・イフェクツ・オブ・「シィオク・チィアンタン」・グラニュールズ・フォー・リデューシング・ブラッド−シュガー・レベル・オブ・ダイアベティック・ラッツ・アンド・フォー・アゲインスト・フリー・ラジカルズ（Observation of effects of "Xioke Jiangtang" granules for reducing blood-sugar level of diabetic rats and for against free radicals）」、ファーマコロジー・アンド・クリニック・オブ・チャイニーズ・メディスン（Pharmacology
and Clinic of Chinese Medicine）、２０００年、第１６巻（増刊）、ｐ．１０９−１１１。
７．ヤン・シィアオフェン（Yang Xiaofeng）ら、「スタディーズ・オン・イフェクツ・オブ・「シィアオケアン」・フォー・リデューシング・ブラッド−シュガー・アンド・ブラッド−ファット・レベル（Studies on effects of "Xiaokean" for reducing blood-sugar and blood-fat level）」、チャイニーズ・ニュー・ドラッグ・アンド・クリニカル・ファーマコロジー（Chinese New Drug and Clinical Pharmacology）、１９９９年、第１０巻、第５号、ｐ．２８８−２８９。
８．チャン・ジュンティエン（Zhang Juntian）、モダン・ファーマコロジカル・メソドロジー（Modern Pharmacological Methodology）、上巻、第１版、北京医科大学・中国協和医科大学連合出版社（Publishing House of Beijing Medical University and China Union Medical University）、１９９８年、ｐ．９８１−９８３。
【００７６】
［２］ 毒性学についての研究
【００７７】
１．経口投与による急性毒性試験
１）実験方法
２０匹の正常なマウス（半数は雄で半数は雌）は２群（各群は１０匹のマウスを含む）に分けられ、１８．９５g／ｋｇおよび９．４７g／ｋｇを一度に飲薬され、高い方の用量
は最大濃度および最大投与体積に達した。動物の反応が観察された。マウスは７日後に屠殺され、その臓器は肉眼的に観察された。
【００７８】
２）実験結果
すべてのマウスは死亡せず、良好な健康状態、光沢のある毛皮、輝く眼、および良好な運動範囲を有していた、マウスは７日後に屠殺され、その主要な臓器は肉眼的な観察下では異常がなかった。セコイトールは非常に毒性が低いかまたは無毒性であるため、セコイトールの経口投与によるマウスのＬＤ50は測定されなかった。
【００７９】
２．経口投与による最大耐用量
１）実験法
正常なマウス２０匹（半数は雄で半数は雌）は断食され、セコイトールが２４時間以内に２回投与され、間隔は８時間であり、３７．９g／ｋｇが１日に投与された。動物の反応が観察された。マウスは１４日後に屠殺され、その臓器は肉眼的に観察された。
【００８０】
２）実験結果
全てのマウスは死亡せず、良好な健康状態、光沢のある毛皮、輝く眼、および良好な運動範囲を有していた。マウスは１４日後に屠殺され、その主要な臓器は肉眼的な観察下では異常がなかった。
【００８１】
３．静脈内投与による急性毒性試験
１）実験法
正常なマウス２０匹（半数は雄で半数は雌）は、５．０４g／ｋｇのセコイトールが静脈内注射により投与された（最大濃度および最大静脈内投与体積に達した）。動物の反応が観察された。マウスは１４日後に屠殺され、その臓器は肉眼的に観察された。
【００８２】
２）実験結果
全てのマウスは良好な健康状態、光沢のある毛皮、輝く眼、および良好な運動範囲を有していた。マウスは１４日後に屠殺され、その主要な臓器は肉眼的な観察下では異常がなかった。セコイトールは非常に毒性が低いかまたは無毒性であるため、セコイトールの経口投与によるマウスのＬＤ50は測定されなかった。
【００８３】
毒性研究に関する参考文献
１．新薬研究に関するガイドライン（Guidelines for Studying New Drugs）（薬学、薬理学、毒性学）、中華人民共和国、厚生部、薬政局。
２．チェン・チィ（Chen Qi）、メソドロジー・フォー・スタディング・ファーマコロジー・オブ・チャイニーズ・メディスン（Methodology for Studying Pharmacology of Chinese Medicine）、人民衛生出版社、第１版、１９９３年、ｐ．１１８−１１９。
【００８４】
［３］ 一般薬理学についての研究
【００８５】
正常なマウスの一般的な身体的徴候および自発運動、マウスのペントバルビタール睡眠時間、およびラットの呼吸運動、血圧、心臓リズム、および心電図に対するセコイトールの影響が注視された。その結果は、セコイトールがマウスの自発運動、マウスのペントバルビタール睡眠時間、および、ラットの呼吸運動、血圧、心臓リズム、および心電図に対し有意に影響を及ぼさなかったことを示した。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、本発明の方法に従って調製されたＡｃ−セコイトールのＸ線単結晶回折パターンである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチイ属の種（Taxus species）から抽出された抗糖尿病作用を有する天然化合物であって、構造式Ｉを有する５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール（5-O-methyl-myo-inositol）であることを特徴とする化合物。
構造式Ｉ
【化１】
【請求項２】
イチイ属の種から抽出された抗糖尿病作用を有する天然化合物を抽出するための方法であって、該方法が、
有機溶媒を用いてイチイ属の種を抽出し、抽出物を得ること、
前記抽出物を二相抽出およびクロマトグラフィーにかけること、
ミオ−イノシトール誘導体を含有している分画を収集すること、次いで
濃縮、
結晶化、および
濾過して粉末を取得し、
該粉末を再結晶して、構造式Ｉを有する天然化合物、５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトールを得ることを含有する方法。
構造式Ｉ
【化２】
【請求項３】
前記イチイ属の種が、タクスス・ユンナネンシス（Taxus yunnnanensis Cheng et L. K. Fu）、またはタクスス・キネンシス・変種マイレ（Taxus chinensis var. mairei（Lemee et Levl）Cheng et L. K. Fu）であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抽出に使用される前記有機溶媒が、エタノール、メタノール、アセトン、およびそれらの水性混合物を含有することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
二相抽出に使用される溶媒が水不溶性有機溶媒であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記有機溶媒が、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記クロマトグラフィーが、マクロポーラス樹脂カラム法、グルコースＧまたは修飾されたグルコースカラム法、セルロースカラム法、または活性炭カラム法であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
再結晶に使用される溶媒系が、エタノール、メタノール、アセトン、メチルエチルケトン、またはそれらの混合物を含有する溶媒系であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
糖尿病の治療のための薬物組成物であって、前記薬物組成物が、一以上の補助剤および／または賦形剤と混合され、請求項１に記載の天然化合物を含有することを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の薬物組成物であって、前記薬物組成物が、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤、溶液剤などといった薬物剤形を形成することが可能であることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
糖尿病の治療および予防のための薬物の製造における、請求項１に記載の天然化合物の使用。
【請求項１２】
前記薬物が、糖尿病の高血糖を有意に緩和することが可能であり、肝臓のグリコーゲン分解およびグルコースの吸収を阻害し、血中脂肪レベルを減少させ、フリーラジカルの代謝を改善し、膵島のβ細胞を保護し、極めて低い毒性を有することを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬物が、糖尿病および糖尿病性心臓血管に関する合併症、および他の糖代謝障害関連疾患の予防および治療のため、並びにフリーラジカルの代謝改善のために使用されることが可能であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬物が、ＩＩ型糖尿病および糖尿病性心臓血管に関する合併症の予防および治療のために使用されることが可能であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１】
イチイ属の種（Taxus species）から抽出された抗糖尿病作用を有する天然化合物であって、構造式Ｉを有する５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトール（5-O-methyl-myo-inositol）であることを特徴とする化合物。
構造式Ｉ
【化１】
【請求項２】
イチイ属の種から抽出された抗糖尿病作用を有する天然化合物を抽出するための方法であって、該方法が、
有機溶媒を用いてイチイ属の種を抽出し、抽出物を得ること、
前記抽出物を二相抽出およびクロマトグラフィーにかけること、
ミオ−イノシトール誘導体を含有している分画を収集すること、次いで
濃縮、
結晶化、および
濾過して粉末を取得し、
該粉末を再結晶して、構造式Ｉを有する天然化合物、５−Ｏ−メチル−ミオ−イノシトールを得ることを含有する方法。
構造式Ｉ
【化２】
【請求項３】
前記イチイ属の種が、タクスス・ユンナネンシス（Taxus yunnnanensis Cheng et L. K. Fu）、またはタクスス・キネンシス・変種マイレ（Taxus chinensis var. mairei（Lemee et Levl）Cheng et L. K. Fu）であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抽出に使用される前記有機溶媒が、エタノール、メタノール、アセトン、およびそれらの水性混合物を含有することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
二相抽出に使用される溶媒が水不溶性有機溶媒であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記有機溶媒が、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記クロマトグラフィーが、マクロポーラス樹脂カラム法、グルコースＧまたは修飾されたグルコースカラム法、セルロースカラム法、または活性炭カラム法であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
再結晶に使用される溶媒系が、エタノール、メタノール、アセトン、メチルエチルケトン、またはそれらの混合物を含有する溶媒系であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
糖尿病の治療のための薬物組成物であって、前記薬物組成物が、一以上の補助剤および／または賦形剤と混合され、請求項１に記載の天然化合物を含有することを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の薬物組成物であって、前記薬物組成物が、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、糖衣丸剤、溶液剤などといった薬物剤形を形成することが可能であることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
糖尿病の治療および予防のための薬物の製造における、請求項１に記載の天然化合物の使用。
【請求項１２】
前記薬物が、糖尿病の高血糖を有意に緩和することが可能であり、肝臓のグリコーゲン分解およびグルコースの吸収を阻害し、血中脂肪レベルを減少させ、フリーラジカルの代謝を改善し、膵島のβ細胞を保護し、極めて低い毒性を有することを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬物が、糖尿病および糖尿病性心臓血管に関する合併症、および他の糖代謝障害関連疾患の予防および治療のため、並びにフリーラジカルの代謝改善のために使用されることが可能であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬物が、ＩＩ型糖尿病および糖尿病性心臓血管に関する合併症の予防および治療のために使用されることが可能であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【図１】
【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年9月15日(2005.9.15)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
本発明はさらに、イチイ属の種からセコイトールを抽出するための方法を提供するが、前記方法は、有機溶媒を用いてイチイ属の種を抽出して抽出物を得ること、該抽出物を二相抽出しカラムクロマトグラフィーにかけてセコイトールを含有している分画を収集すること、次いで濃縮し、濾過し、乾燥し、再結晶化してセコイトールを含有している粉末を取得することを含有し、抽出に使用された有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、およびそれらの水性混合物を含有し、二相抽出に使用される溶媒は、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルといった水不溶性有機溶媒である。精製は、種々のクロマトグラフ法および再結晶法の、単独または組合せ方式の使用により行なわれることが可能である。再結晶法の溶媒系は、エタノール、アセトン、メチルエチルケトンを含有する溶媒系である。クロマトグラフィーは、マクロポーラス樹脂カラム（Ｄ１０１型、ＭＮ−２００型など）、ポリグルコースまたは修飾グルコースカラム（セファデックス（Sephadex）Ｇまたはセファデックス−ＬＨ−２０など）、セルロースカラム、活性炭カラムなどを用いてよい。最終産物は結晶性粉末であり、主な有効成分は９０％より多い含有量のセコイトールである。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
さらに具体的には、イチイ属の種から抗糖尿病セコイトールを抽出するための本発明の方法は、イチイ属の種の根、茎または葉を粉砕して粗粉末を得ること、該粗粉末を、エタノール、メタノール、アセトンまたはそれらの水性混合物といった溶媒を用いて、０℃から灌流温度までの温度において、好ましくは室温から灌流温度までの温度において、さらに好ましくは灌流温度において、１〜５回抽出することであって、溶媒の量は１：１〜１：２０（重量／体積）、好ましくは１：２〜１：１０（重量／体積）、さらに好ましくは１：３〜１：６であり、真空内で濃縮して抽出物を得ること、前記抽出物を水と、水不溶性有機溶媒（酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルのような）と
の間で二相抽出にかけること、および親油性の層を除去することであって、抽出物は好ましくは１：０．５から１：１０までの比を有する有機溶媒／水であり、水層を合併すること、濾過すること、およびクロマトグラフィーによって分離することであって、クロマトグラフィーカラムの例は、Ｄ１０１型、ＭＮ−２００型（ピュロライト（PUROLITE））などといったマクロポーラス樹脂カラム、セファデックス−ＬＨ−２０などのようなポリグルコースＧまたは修飾ポリグルコースカラム、セルロースカラム、および活性炭カラムであって、対応する溶出剤が使用され、溶出は同時に検出され、セコイトールを含有している溶出分画を収集すること、真空中で濃縮すること、静置すること、および濾過して固体を得ること、次いでエタノール、メタノール、アセトン、メチルエチルケトンといった溶媒系を用いて前記固体を再結晶すること、および乾燥してセコイトール粉末を得ることを含有する。最終産物は９０％より多いセコイトール含有量を有する結晶状粉末である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
【化２】
【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年9月15日(2005.9.15)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
本発明はさらに、イチイ属の種からセコイトールを抽出するための方法を提供するが、前記方法は、有機溶媒を用いてイチイ属の種を抽出して抽出物を得ること、該抽出物を二相抽出しカラムクロマトグラフィーにかけてセコイトールを含有している分画を収集すること、次いで濃縮し、濾過し、乾燥し、再結晶化してセコイトールを含有している粉末を取得することを含有し、抽出に使用された有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、およびそれらの水性混合物を含有し、二相抽出に使用される溶媒は、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルといった水不溶性有機溶媒である。精製は、種々のクロマトグラフ法および再結晶法の、単独または組合せ方式の使用により行なわれることが可能である。再結晶法の溶媒系は、エタノール、アセトン、メチルエチルケトンを含有する溶媒系である。クロマトグラフィーは、マクロポーラス樹脂カラム（Ｄ１０１型、ＭＮ−２００型など）、ポリグルコースまたは修飾グルコースカラム（セファデックス（Sephadex）Ｇまたはセファデックス−ＬＨ−２０など）、セルロースカラム、活性炭カラムなどを用いてよい。最終産物は結晶性粉末であり、主な有効成分は９０％より多い含有量のセコイトールである。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
さらに具体的には、イチイ属の種から抗糖尿病セコイトールを抽出するための本発明の方法は、イチイ属の種の根、茎または葉を粉砕して粗粉末を得ること、該粗粉末を、エタノール、メタノール、アセトンまたはそれらの水性混合物といった溶媒を用いて、０℃から灌流温度までの温度において、好ましくは室温から灌流温度までの温度において、さらに好ましくは灌流温度において、１〜５回抽出することであって、溶媒の量は１：１〜１：２０（重量／体積）、好ましくは１：２〜１：１０（重量／体積）、さらに好ましくは１：３〜１：６であり、真空内で濃縮して抽出物を得ること、前記抽出物を水と、水不溶性有機溶媒（酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテルのような）と
の間で二相抽出にかけること、および親油性の層を除去することであって、抽出物は好ましくは１：０．５から１：１０までの比を有する有機溶媒／水であり、水層を合併すること、濾過すること、およびクロマトグラフィーによって分離することであって、クロマトグラフィーカラムの例は、Ｄ１０１型、ＭＮ−２００型（ピュロライト（PUROLITE））などといったマクロポーラス樹脂カラム、セファデックス−ＬＨ−２０などのようなポリグルコースＧまたは修飾ポリグルコースカラム、セルロースカラム、および活性炭カラムであって、対応する溶出剤が使用され、溶出は同時に検出され、セコイトールを含有している溶出分画を収集すること、真空中で濃縮すること、静置すること、および濾過して固体を得ること、次いでエタノール、メタノール、アセトン、メチルエチルケトンといった溶媒系を用いて前記固体を再結晶すること、および乾燥してセコイトール粉末を得ることを含有する。最終産物は９０％より多いセコイトール含有量を有する結晶状粉末である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
【化２】
【公表番号】特表２００６−５０３１０２（Ｐ２００６−５０３１０２Ａ）
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４７３３９（Ｐ２００４−５４７３３９）
【出願日】平成１４年１０月１７日（２００２．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００２／０００７２８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９７５９
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５０５１４２０５６）
【出願人】（５０５１４２０６７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年１０月１７日（２００２．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００２／０００７２８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９７５９
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５０５１４２０５６）
【出願人】（５０５１４２０６７）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]