細胞応答計測装置および細胞応答計測チップ
【課題】薬剤に対する細胞の応答を計測する細胞応答計測装置及びそのためのチップを提供する。
【解決手段】チップ上に配置した１細胞のみの電気的状態の変化を計測することができる微小電極と、細胞が微小電極上に位置するように電極周囲を覆う細胞非接着性の壁と、細胞培養液が満たされた層と、この細胞培養液を還流し、かつ、必要によって薬剤を添加する手段と、上記微小電極の上方に位置した環状の比較電極と、上記、微小電極と比較電極を用いた細胞電位を計測し記録する手段と、チップ上に配置した１細胞の状態を光学的に計測する手段とからなる細胞応答計測装置。
【解決手段】チップ上に配置した１細胞のみの電気的状態の変化を計測することができる微小電極と、細胞が微小電極上に位置するように電極周囲を覆う細胞非接着性の壁と、細胞培養液が満たされた層と、この細胞培養液を還流し、かつ、必要によって薬剤を添加する手段と、上記微小電極の上方に位置した環状の比較電極と、上記、微小電極と比較電極を用いた細胞電位を計測し記録する手段と、チップ上に配置した１細胞の状態を光学的に計測する手段とからなる細胞応答計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤、電気刺激等に対する細胞の応答を計測する装置および細胞応答計測チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに多用されているのはバイオアッセイである。従来のバイオアッセイでは、一般的に培養細胞を用いることが多い。この系では複数の細胞を用いてアッセイを行うので、細胞集団の値の平均値をあたかも１細胞の特性であるかの様に観察してきた。
【０００３】
しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。このため、刺激に対する応答の結果を解析するときにゆらぎの問題が常に付きまとう。
【０００４】
すなわち、細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎが存在するために、常に、平均的なレスポンスしか得ることができない。これらの問題を解決するために、同調培養等の手法が開発されているが、常に同じステージにある細胞群を使用することは、常にそのような細胞を供給し続けなければならないということで、バイオアッセイを広く一般に広める障害となっている。
【０００５】
また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触・細胞間インタラクションによるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。
【０００６】
細胞の物理的接触・細胞間インタラクションの問題は、バイオアッセイを組織断片のような細胞塊で行うことである程度解決できる。しかし、この場合、培養細胞と異なり、常に均一な素性の細胞塊を得ることができない。そのため、得られるデータがばらついたり、集団の中に情報が埋もれてしまったりする問題がある。
【０００７】
細胞群の細胞の１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために、本願の発明者らは特開２００６‐９４７０３（特許文献１）に示すように、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の細胞培養区画を構成し、隣接する区画間は細胞の通り抜けることができない溝またはトンネルでお互いを連結するとともに、必要に応じて、溝またはトンネルあるいは細胞培養区画に、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンを持つ構造の集合細胞マイクロアレー（バイオアッセイチップ）を提案した。
【特許文献１】特開２００６‐９４７０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のバイオアッセイでは、細胞を組織断片として扱うか、培養細胞のように１細胞として扱うかのいずれかであった。細胞の数が多すぎると上記従来技術の項で述べたように、得られる情報が平均的なものになってしまい、薬剤などに対するレスポンスが正確に得られない問題がある。細胞を１細胞ずつ用いる場合は、本来、多細胞組織の細胞として機能している細胞を、引き離された独立した状態の細胞として使用するために、細胞同士のインタラクションの影響が現れなくなることとなり、やはり正確な薬剤レスポンスすなわちバイオアッセイデータを得る上で問題がある。従って、１細胞で細胞電位、細胞形態が正確に計測できるとともに、必要なら、周辺に細胞を配置して細胞同士のインタラクションの影響を受ける形での１細胞の細胞電位、細胞形態が正確に計測できるデバイスやシステムを開発することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記の課題を解決するものとして、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくとともに、この細胞の細胞電位を計測するための微小電極を前記空間配置領域に形成し、比較電極を前記空間配置領域を含む範囲で前記微小電極の面よりＺ軸方向に離れた位置に配置し、細胞には細胞培養液を還流して細胞の活性を維持できるようにする。細胞電位のより正確な計測のために、微小電極と比較電極間のＸ−Ｙ軸方向の距離及びＺ軸方向の距離を調整可能とする。また、前記細胞に作用する薬剤を添加する手段を付加する。
【００１０】
さらに、細胞相互間のインタラクションの影響を評価できるように、特定の空間配置の中に閉じ込められた１細胞の周辺に適宜細胞を配置することを可能にし、あるいは、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めた構成を規則的に配置した構成とする。また、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めた構成を規則的に配置した構成を恒温層により同じ環境において、それぞれの細胞毎に異なった薬剤を作用させて、反応を評価することを可能にした構成とする。
【発明の効果】
【００１１】
特定の空間配置の中に閉じ込められた１細胞の細胞電位、薬剤に対する細胞の応答を正確に計測することができるとともに、細胞相互間のインタラクションの影響を含めた評価ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図１は本発明の実施例に係る細胞応答計測装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。図２は、図１に示す細胞応答計測装置を光学観察装置のステージに載せて見た断面を示す模式図である。
【００１３】
１００は細胞応答計測装置であり、透明基板１の上に構築されている部品を主体として構成される。透明基板１は光学的に透明な材料、たとえば、ガラス基板あるいはシリコン基板である。２は微小電極であり、たとえば、ＩＴＯによる透明電極とされ、透明基板１上に配置される。２’は微小電極２の引き出し線である。３1，３2，３3及び３4はアガロースゲルによる壁であり、微小電極２の周辺に空間部４1，４2，４3及び４4を介して配置される。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4は中心部が切り欠かれて細胞収納部となる空間を形成している。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間の透明基板１上には微小電極２が配置され、この上に一つの細胞１０0が収納できる。５は金または白金リングによる比較電極であり、細胞収納部となる空間上部、すなわち細胞１０0の上部、でＸ−Ｙ軸方向の距離及びＺ軸方向の距離を調整可能な任意の位置に保持される。５1は比較電極５を保持するリード部で一端が比較電極５に固着され他端が比較電極５の位置調整装置６に保持される。リード部５1は比較電極の引き出し線を兼ねるものである。調整装置６は一端が基板１に固着される。６1はＺ軸方向の駆動装置であり、位置調整装置６に備えられる。Ｚ軸方向の駆動装置６1は後述するパソコン９の与える駆動信号Ｄｚにより駆動されて比較電極５を保持するリード部５1を介して比較電極５を上下方向に移動させる。６2はＹ軸方向の駆動装置であり、位置調整装置６に備えられる。Ｙ軸方向の駆動装置６2は後述するパソコン９の与える駆動信号Ｄｙにより駆動されて比較電極５を保持するリード部５1を介して比較電極５をＹ軸方向に移動させる。６3はＸ軸方向の駆動装置であり、位置調整装置６に備えられる。Ｘ軸方向の駆動装置６3は後述するパソコン９の与える駆動信号Ｄｘにより駆動されて比較電極５を保持するリード部５1を介して比較電極５をＸ軸方向に移動させる。比較電極５の太さおよび直径は必要により変更してリード部５1とともに位置調整装置６に装着できる。７は周辺を取り巻く壁であり、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間を取り巻いている。８1，８2は壁７の内部の領域に、細胞の培養液を還流するためのパイプであり、図の例では、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８1から培養液が供給され、壁７の上面に近い位置のパイプ８2から培養液が排出される。培養液を供給するパイプ８1の培養液の出口の近くにパイプ８3が結合され、このパイプ８3を介して細胞に作用させたい薬剤が供給される。
【００１４】
９はパソコンであり、微小電極２の引き出し線２’と比較電極５を保持するリード部５1との間で細胞電位を計測し記録する。また、パソコン９には操作者の操作信号Ｍｓが加えられる。操作者は、細胞電位、薬剤に対する細胞の応答の計測、記録に先行して、細胞を微小電極２の上に細胞１０0を収納する前に壁７の内部の領域に培養液を入れ、ノイズ電圧を計測して、比較電極５の太さおよび直径の最適値を探索する。また、壁７の内部の領域に培養液を入れただけの状態で、操作者は駆動信号Ｄｘ，ＤｙおよびＤｚを操作して比較電極５のＸ−Ｙ軸方向の距離及びＺ軸方向の距離を調整して最適位置を探索する。
【００１５】
アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の中心部が切り欠かれて形成される細胞収納部となる空間の基板１上には微小電極２が配置され、この上に一つの細胞１０0が載置される。微小電極２の細胞１０0の載置面にはコラーゲン等の細胞が電極表面に接着するのを助ける素材を塗っておくのがよい。一方、アガロースゲルは細胞にとっては非接着性であるため、この壁３1，３2，３3及び３4の高さを細胞と同程度としても、壁を乗り越えて細胞１０0が移動することはない。また、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4中心部が切り欠かれて形成される細胞収納部の周辺の空間部４1，４2，４3及び４4は細胞の大きさより小さいものとされるから、この空間部４1，４2，４3及び４4をすり抜けて細胞１０0が移動することはない。したがって、細胞１０0はパイプ８1，８2により壁７の内部の領域に還流される細胞の培養液に曝されながら、微小電極２の上に安定して保持される。
【００１６】
図１に示す細胞応答計測装置１００の構造の主要なサイズの例を示すと以下のようである。これは、細胞の大きさを１０μｍφとした例である。透明基板１の大きさは１００ｍｍ×１５０ｍｍ、微小電極２は８μｍ×８μｍの大きさ、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の個々の大きさは２０μｍ×２０μｍ×１０μｍ（高さ）、空間部４1，４2，４3及び４4の幅２μｍ、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間は１２μｍφの円柱状、壁７の外形は５ｍｍ×５ｍｍとし高さは５ｍｍ、比較電極５は５０μｍφの太さの白金線で、リングの径は１ｍｍφである。尚、ここでは、微小電極２は８μｍ×８μｍの正方形としたが、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4の幅とで構成する細胞の収納部となる１０μｍφの円状の電極としてもよい。
【００１７】
図２は、図１に示す細胞応答計測装置１００を光学観察装置のステージに載せて細胞１０0の中心位置で見た断面を示す模式図であり、光学系により細胞の振る舞いを観察するときの概要を示す。２１は光学観察装置のＸＹステージであり、光学的に透明であるとともに、パソコン９が与える信号に応じてＸ−Ｙ駆動装置２０により、任意の位置に移動される。図２では、細胞１０0の培養液１１の供給が壁７の内側の領域にパイプ８1から供給され、壁７の上面に近い位置のパイプ８2から排出されている状態を示す。
【００１８】
２２は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。２３は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞１０0の観察の場合には、波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の光を用いることで細胞１０0の損傷を防ぐことができる。２４はシャッターで、ＸＹステージ２１を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。２５はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。ＸＹステージ２１上には基板１上に形成されている細胞応答計測装置１００が載置されＸ−Ｙ駆動装置２０によって前記ＸＹステージ２１を移動させることで前記細胞応答計測装置１００の任意の位置を観察し、計測することができる。前記細胞応答計測装置１００内の細胞１０0の存在状態は、対物レンズ２６で観察される。対物レンズ２６の焦点位置はパソコン９による信号に応じて駆動装置２７によって移動させることができる。対物レンズ２６の倍率は４０倍以上のものが使用できる。
【００１９】
また、蛍光観察のために、光源３１からの光をバンドパスフィルタ３２によって励起光波長のみ透過させ、シャッター３３によって観察するときのみ励起光が細胞１０0に照射されるように制御される。シャッター３３を通過した励起光はダイクロイックミラー３４によって細胞１０0に照射される。このとき対物レンズ２６で観察されるのは、光源２２から透過された光による細胞１０0の位相差像あるいは微分干渉像と、光源３１からの励起光によって細胞１０0が発した蛍光像である。前記バンドパスフィルタ２３を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー３５およびバンドパスフィルタ３６によって、位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ３７によって観察される。他方、蛍光像は、対物レンズ２６を通過した光のうちミラー３８およびバンドパスフィルタ３９によって、蛍光観察の波長帯のみを選択的に透過させて、カメラ４０で観察することができる。カメラ３７で撮った位相差像あるいは微分干渉像は、パソコン９の画像処理機能で解析され、ＸＹステージ２１の移動量の制御、あるいは対物レンズ２６の高さ制御、ピント合わせ等を行うことができる。カメラ３７は１／２００高速カメラが使用でき、拍動の画像解析に使用できる。
【００２０】
図３（Ａ）、図３（Ｂ）および図３（Ｃ）は、細胞電位の計測に関するノイズ信号の評価の概念を示す図である。それぞれ、横軸に微小電極２と比較電極５との距離をＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向に変化させ、縦軸に微小電極２の引き出し線２’と比較電極５のリード５1との間に検出できる電圧の振幅をとったときのノイズ信号の大きさを示す図である。それぞれ、任意の基点からＬｘ，ＬｙおよびＬｚの位置でノイズが急減することが分かる。このデータを計測に先行して計測しておき、パソコン９から駆動信号Ｄｘ，ＤｙおよびＤｚを与えて比較電極５のＸ−Ｙ軸方向の距離及びＺ軸方向の距離を調整して最適位置で計測するようにする。
【００２１】
以下、本発明の細胞応答計測装置１００の構成例とこれを用いた具体的な計測例を説明する。
【００２２】
図４は、図１および図２で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞１０0の拍動時の電位を計測するときの一つの使い方の例を示す図である。図１と対比して分かるように、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4の幅とで構成する細胞の収納部の微小電極２に心筋細胞１０0が載置される他に、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4の周辺で壁７の内側の領域に心筋細胞１０1，１０2，---，１０8が分散配置されている点を除けば、両者は同じである。この構成では、心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の分散配置の状況に応じた微小電極２に載置された心筋細胞１０0の拍動時の電位が微小電極２の引き出し線２’と比較電極５のリード５1との間の電位として計測される。
【００２３】
一方、図５は、図１および図２で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞１０0の拍動時の電位を計測するときの他の一つの使い方の例を示す図である。図４と対比して分かるように、図４の構成では、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4の周辺で壁７の内側の領域に心筋細胞１０1，１０2，---，１０8が分散配置されるのみでこれらの心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の位置を厳密に管理できるものではなかった。これに対して、図５の構成では、心筋細胞１０0のみならず心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の全てをアガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4で囲ったので、心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の位置も厳密に管理できる。さらに、図５の構成では、心筋細胞１０0，１０1，１０2，---，１０8が載置されたそれぞれの微小電極２0，２1，２2，---，２8（図面では参照符号の表示を省略した）と心筋細胞１０0，１０1，１０2，---，１０8のすべてに対して共通に設けられる共通の比較電極５との間でそれぞれの微小電極２に載置されたそれぞれの心筋細胞１０0，１０1，１０2，---，１０8の拍動時の電位がそれぞれの微小電極２の引き出し線２’0，２’1，２’2，---，２’8と比較電極５のリード５1との間の電位として計測できる。
【００２４】
図６（Ａ）は、心筋細胞１０0が孤立している状態、すなわち、図４、図５に示す心筋細胞１０1，１０2，---，１０8が無い状態（図１に示す状態）での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ｂ）は、心筋細胞１０0の周辺に図４、図５に示す心筋細胞１０1，１０2，---，１０8のうちの一つのみが配置された２細胞状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ｃ）は心筋細胞１０0の周辺に図４、図５に示す心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の全てが分散配置された９細胞状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ａ）〜（Ｃ）を対比して分かるように、心筋細胞１０0の孤立状態が最も不安定な拍動状態であり、２細胞状態では少し改善が見られ、９細胞状態は安定な拍動状態であることが分かる。
【００２５】
図７（Ａ）〜（Ｃ）は、心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）について心筋細胞がネットワークを組む細胞の配置パターンに関してネットワークを組む心筋細胞の数との関係を評価した実験結果を示す図である。図の左側に、横軸にネットワークを組む心筋細胞の数を取り、縦軸に心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）を取った特性を示し、図の右側に細胞ネットワークを組む細胞の配置パターンをアガロースゲル３が作る壁の構造として示したものである。すなわち、図７（Ａ）は細胞の配置パターンが格子状である場合、図７（Ｂ）は細胞の配置パターンが放射状である場合、図７（Ｃ）は細胞の配置パターンが直線状である場合である。細胞の配置パターンを放射状とするため、図７（Ｂ）では、対角位置にある外側のアガロースゲル３が作る壁は４５°回転した構成とし、対角位置にある中心位置のアガロースゲル３が作る壁は対角線の方向にも空間部を持つ構成とした。細胞の配置パターンがどういう形になっていても、心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）がネットワークを組む心筋細胞の数の増加によって改善されることが分かる。
【００２６】
図７（Ｄ）は、図７（Ａ）〜（Ｃ）に示す特性を重ねて表示した特性である。図７（Ａ）〜（Ｃ）に示す特性は実質的に重なったものであることが分かる。すなわち、ネットワークを組む心筋細胞の心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）は、細胞の配置パターンには依存しないことが分かる。
【００２７】
図８は、心筋細胞が受ける薬剤の効果を評価するためのタイムスケジュールを最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ａ）〜（ｅ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。拍動の波形は縦軸に信号強度を採り、横軸に時間をとったものであり、拍動分布は縦軸に頻度をとり、横軸に拍動周期をとったものである。図８は、図５に示す構成で４細胞を格子状に配置し、パイプ８1から培養液を供給しながらパイプ８2から排出して培養液を壁７の領域内に還流させながら、パイプ８1に接続されたパイプ８3を通して、抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）を培養液に添加して薬剤の効果を評価する実験の結果を示すものである。
【００２８】
時点（ａ）はコントロール状態であり、薬剤の効果の評価の基準状態となる。コントロール状態の期間には図５のパイプ８1から培養液が供給され、パイプ８2から排出されている。コントロール状態が６分継続された後、パイプ８3を通して抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）が添加された培養液が壁７の領域内に還流されるようにする。時点（ｂ）はＨＰＬ投与１分後であり、時点（ｃ）はＨＰＬ投与５分後である。ＨＰＬ投与を７分間継続した後、パイプ８3を通した抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）の添加を停止し、培養液のみが壁７の領域内に還流されるようにする。すなわち、ＨＰＬにさらされた細胞を洗浄する。時点（ｄ）はＨＰＬ洗浄６分後であり、時点（ｅ）はＨＰＬ洗浄１２分後である。
【００２９】
コントロール状態においては、時点（ａ）の拍動の信号波形は安定しており、拍動分布も拍動周期がほぼ１秒の範囲に収まっている。コントロール状態を６分間継続した後、ＨＰＬ投与を開始した。ＨＰＬ投与１分後の時点（ｂ）について見ると拍動の信号波形に乱れが生じており、矢印で示すように大きな変形を示すときが見られる。さらにＨＰＬ投与が継続され、ＨＰＬ投与６分後の時点（ｃ）について見ると拍動の信号波形の乱れはより大きくなっており、矢印で示すように大きな変形を示す状況が増大している。ＨＰＬ投与を７分間継続した後、ＨＰＬ投与を停止して、培養液のみを還流させて、細胞のＨＰＬを洗浄する。ＨＰＬの洗浄６分後の時点（ｄ）について見ると拍動の周期は伸びているが信号波形の乱れは低下している。さらにＨＰＬの洗浄を継続し、ＨＰＬの洗浄１２分後の時点（ｅ）について見ると拍動の周期も短くなってくるとともに、信号波形の乱れは低下している。
【００３０】
図９（Ａ）、（Ｂ）はＨＰＬ投与・洗浄過程での心筋細胞の拍動ゆらぎ変化を統括的に説明する図であり、図９（Ａ）はコントロール、ＨＰＬ投与および洗浄過程の時間の経過に応じた拍動周期の揺らぎを示し、下向きの三角で示すのがそれぞれの過程の最終状態における値である。図９（Ｂ）は横軸には拍動周期をとり、縦軸に拍動周期の揺らぎをとったときのコントロール、ＨＰＬ投与および洗浄過程の最終状態における値を示す図である。
【００３１】
図９（Ａ）から分かるように、ＨＰＬ投与の時間経過とともにＨＰＬの効果が高まり、拍動状態が不安定になる。すなわち、拍動周期の揺らぎが増大する。次いで、ＨＰＬ投与を停止して、培養液のみを還流させて、細胞のＨＰＬを洗浄しても、しばらくは拍動周期の揺らぎが増大した状態が続き、洗浄を継続することにより、拍動周期の揺らぎは低下する。すなわち、培地交換により徐々に拍動状態が回復する傾向を示す。しかしながら、図９（Ｂ）から分かるように、コントロール、ＨＰＬ投与およびＨＰＬ洗浄のそれぞれの過程の最終状態を見ると、拍動周期および拍動周期の揺らぎはＨＰＬ洗浄によりＨＰＬ投与により受けた影響は低減されるが、太い矢印で示すように、元の状態には戻らない。
【００３２】
図１０は、図５に示す構成で９細胞を格子状に配置して図８で説明したと同様の薬剤の効果の評価をするためのタイムスケジュールを最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ａ）〜（ｄ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。拍動の波形は縦軸に信号強度を採り、横軸に時間をとったものであり、拍動分布は縦軸に頻度を採り、横軸に拍動周期をとったものである。細胞に対してパイプ８1から培養液を供給しながらパイプ８2から排出して培養液を壁７の領域内に還流させ、且つ、パイプ８1に接続されたパイプ８3を通して、抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）を培養液に添加して薬剤の効果を評価する実験の結果を示すものである。
【００３３】
図８および図１０に示す時点（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、（ａ）はコントロール状態、（ｂ）はＨＰＬ投与１分後、（ｃ）はＨＰＬ投与５分後であり、（ｄ）はＨＰＬ投与を７分間継続した後、ＨＰＬにさらされた細胞を洗浄した後の、ＨＰＬ洗浄６分後である。
【００３４】
図８の時点（ａ）から（ｃ）と図１０の時点（ａ）から（ｃ）を対比して見ると、図１０では、９細胞を格子状に配置した細胞群としたので、ＨＰＬ投与による拍動の基本的なパターンの変化が小さい、すなわち、拍動の周期の変化が小さい一方で、本来の拍動の波形の直後に表れるピークが大きいことが観察される。図８（ｄ）と図１０（ｄ）を対比してみると、図１０（ｄ）では、拍動の周期および拍動の波形がともにコントロール状態に近いことが観察される。
【００３５】
図１１は、図１０を参照して説明したタイムスケジュールでの薬剤の効果の評価に続けて、さらにＨＰＬを投与するＨＰＬ再投与およびこのＨＰＬ再投与に続けてＨＰＬを洗浄するＨＰＬ再洗浄をした場合の薬剤の効果の評価を最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ｅ）〜（ｇ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。図１１における時点（ｄ）は図１０における時点（ｄ）と同じ時点である。図１１においても、拍動の波形は縦軸に信号強度を採り、横軸に時間をとったものであり、拍動分布は縦軸に頻度を採り、横軸に拍動周期をとったものである。細胞に対してパイプ８1から培養液を供給しながらパイプ８2から排出して培養液を壁７の領域内に還流させ、且つ、パイプ８1に接続されたパイプ８3を通して、抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）を培養液に添加して薬剤の効果を評価する実験の結果を示すものである。
【００３６】
図１１に示す時点（ｅ）〜（ｇ）は、それぞれ、（ｅ）はＨＰＬの再投与１分後、（ｆ）はＨＰＬの再投与５分後であり、（ｇ）はＨＰＬの再投与を７分間継続した後、ＨＰＬにさらされた細胞を再度洗浄したＨＰＬの再洗浄６分後である。
【００３７】
図１１の時点（ｅ）、（ｆ）と図１０の時点（ｂ）、（ｃ）を対比して見ると、ＨＰＬの再投与による薬剤が細胞に及ぼす影響は、ＨＰＬの最初の投与による薬剤が細胞に及ぼす影響よりはるかに大きなものであることが分かる。すなわち、図１１の時点（ｅ）、（ｆ）では、図１０の時点（ｂ）、（ｃ）に矢印で示す拍動の信号波形の変形と比較してはるかに大きい信号波形の変形が生じている。一方、図１１の時点（ｇ）に示すＨＰＬの再洗浄６分後の拍動の信号波形、拍動周期と図１０の時点（ａ）に示すコントロール状態の拍動の信号波形、拍動周期とは類似したものとなっている。
【００３８】
図１２（Ａ），（Ｂ）はＨＰＬ投与・洗浄過程、ＨＰＬ再投与・再洗浄過程での心筋細胞の拍動ゆらぎ変化を統括的に説明する図であり、図１２（Ａ）はコントロール、ＨＰＬ投与および洗浄過程、これに続くＨＰＬ再投与・再洗浄過程の時間の経過に応じた拍動周期の揺らぎを示し、下向きの三角で示すのがそれぞれの過程の最終状態における値である。図１２（Ｂ）は横軸には拍動周期をとり、縦軸に拍動周期の揺らぎをとったときのコントロール、ＨＰＬ投与および洗浄過程、これに続くＨＰＬ再投与・再洗浄過程の最終状態における値を示す図である。
【００３９】
図１２（Ａ）から分かるように、ＨＰＬ投与の時間経過とともにＨＰＬの効果が高まり、拍動状態が不安定になる。すなわち、拍動周期の揺らぎが増大する。次いで、ＨＰＬ投与を停止して、培養液のみを還流させて、細胞のＨＰＬを洗浄しても、しばらくは拍動周期の揺らぎが増大した状態が続き、洗浄を継続することにより、拍動周期の揺らぎは低下する。すなわち、培地交換により徐々に拍動状態が回復する傾向を示す。次いで、ＨＰＬの再投与によりＨＰＬの効果が非常に強く表れ、拍動周期の揺らぎが大きく増大する。次いで、ＨＰＬ再投与を停止して、培養液のみを還流させて、細胞のＨＰＬを再洗浄すると拍動周期の揺らぎは大きく改善され、再洗浄を継続することにより、拍動周期の揺らぎはコントロールと同程度まで低下する。すなわち、培地交換による拍動状態の回復は再洗浄では大きな効果を示す。
【００４０】
図１２（Ｂ）から分かるように、しかしながら、９細胞を格子状に配置した細胞群により薬剤が細胞に及ぼす影響を評価した場合には、図９（Ｂ）に示した４細胞を格子状に配置した細胞群による評価結果と比較して、洗浄、再洗浄の結果、コントロール状態とほぼ同じ状態まで戻る。すなわち、コントロール、ＨＰＬ洗浄、ＨＰＬ再洗浄の過程の最終状態における拍動周期および拍動周期の揺らぎが狭い範囲に収まり、ＨＰＬ投与およびＨＰＬ再投与の過程の最終状態における拍動周期および拍動周期の揺らぎが狭い範囲に収まる。これは、図８（Ｂ）に示されるコントロール、ＨＰＬ投与およびＨＰＬ洗浄のそれぞれの過程の最終状態がＨＰＬ洗浄によってもＨＰＬ投与により受けた影響は低減されるが、太い矢印で示すように、元の状態には戻らないのとは大きく異なることである。
【００４１】
図１３（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、上述した心筋細胞の集団化効果に着目して、図５で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞の拍動リズム解析への応用の一例を説明する図である。すなわち、数個から成る小細胞集団でも安定性獲得が獲得できることに着目して、電気計測による拍動波形解析および薬剤に対するイオンチャネルレベルの応答の計測により、ＱＴ延長症候群の評価が可能となり、分子レベルの理解・薬剤スクリーニングへの応用が可能となる。
【００４２】
図１３（Ａ）は心臓の拍動波形（心電図）の例を示す図であり、左側に正常な心電図波形を右側にＱＴ延長症候群を発症している心電図波形を示す。ＱＴ延長症候群は致死性不整脈誘導あるいは抗不整脈薬により誘導することができるから、薬剤スクリーニングにおいてＱＴ延長症候群の評価ができることが重要である。図１３（Ｂ）は培養した心筋細胞の電気計測による拍動波形の計測例を示す図であり、左側に細胞外電位記録法による正常な波形を、右側にＱＴ延長症候群の波形を示す。図１３（Ａ）と図１３（Ｂ）とを対比して分かるように、培養心筋細胞の電気計測では、（１）波形の翻訳が心電図と相似、（２）Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ2+チャネルの働き計測可能、（３）再分極の波形がＴ波様の形状を示す、メリットがあり、ＱＴ延長の評価が可能である。図１３（Ｃ）は、図５に示す構成の細胞応答計測装置１００により９個の培養心筋細胞の電気計測による拍動波形の取得（左側）と、パイプ８3経由で付与した抗不整脈薬により誘導した薬剤スクリーニングによるＱＴ延長検出結果（右側）を示す図である。
【００４３】
図１４（Ａ）および（Ｂ）は、上述した心筋細胞の集団化効果を利用した計測における注意点の一つを説明する図である。図１４（Ａ）は、図５で説明した細胞応答計測装置１００の壁７の内部に８×８（＝６４）細胞の配置が可能となるように構成して、その内の１列の８個の細胞を用いて、チャンネルＣＨ１からＣＨ８への心筋細胞の拍動の伝播を計測した結果を示す電圧のピーク波形図である。図１４（Ｂ）は、均等に配列された微小電極上に８個の細胞が載置された列の各微小電極間の伝播時間を解析した結果を示す図である。図１４（Ａ）および（Ｂ）から分かるように、細胞間での伝播時間には大きなばらつきがある。したがって、計測にあたっては、心筋細胞の集団化効果を利用した安定化とともに、集団内の１細胞に着目した計測とすることが重要となる。
【００４４】
さらに、図面による説明は省略するが、細胞が受ける薬剤の効果を評価するに際しては、細胞に刺激を与えない方式の連続還流系の付加が重要であるが、本発明の実施例では、薬剤は培養液の還流系の中に注入されてから細胞に作用することになり、細胞に対する刺激は低減されたものとできる。
【００４５】
図１５は、図５で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、２０細胞からなる細胞群の心筋細胞の拍動リズムを光学的に解析する応用の一例を説明する図である。図１５では、右肩に番号１から２０を付して示すように、２０細胞を配列して、１／３０カメラによる拍動画像解析を行った。２０細胞の輝度の平均変化量を測定し、最初の点を０として表示したものである。
【００４６】
図１６は、図５で説明した細胞応答計測装置１００と対極となる細胞応答計測装置２００の実施例を示す斜視図である。すなわち、図５で説明した細胞応答計測装置１００は壁７で囲われた領域内に複数個の細胞が所定の関係を保持できるように配置され、これらのすべての細胞に共通の培養液が供給されるものとした。これに対して、図１６では図１で説明した細胞応答計測装置１００を単位とする計測装置１００1，１００2，１００3，---，１００9を共通の恒温層２００に収納したものとした。もちろん、図１６でも、図５で説明した細胞応答計測装置１００を単位とする計測装置１００1，１００2，１００3，---，１００9を共通の恒温層２００に収納するものとしてもよい。この実施例では、共通の恒温層２００によって与えられる同一の環境の下で、それぞれの細胞応答計測装置１００にここに設定される条件化での細胞の反応を容易に評価できる。なお、図１６に示す実施例は、図が煩雑となるので、個々の構成要素の参照符号は省略した。
【００４７】
図１、図５で説明した細胞応答計測装置１００は共通の培養液の下での一つの細胞の振る舞い、あるいは、細胞集団での細胞の振る舞い、細胞集団内での個々の細胞の振る舞いを評価するのに適した実施例と言うことができるのに対して、図１６説明した細胞応答計測装置は、共通の環境の下での一つの細胞の振る舞い、あるいは、細胞集団での細胞の振る舞い、細胞集団内での個々の細胞の振る舞いを評価するのに適した実施例と言うことができる。
【００４８】
図１７（Ａ）〜（Ｄ）は、図１で説明した透明基板１、微小電極２、微小電極２の引き出し線２’の具体例を説明する図である。図１７（Ａ）は平面図を示す顕微鏡写真、図１７（Ｂ）は微小電極の部分を拡大して示す顕微鏡写真（左側）、説明図（右側）、図１７（Ｃ）は、図１７（Ｂ）に示す顕微鏡写真のａ−ａ位置で矢印方向に見た断面図、図１７（Ｄ）は微小電極の部分の実体顕微鏡像である。
【００４９】
図１７（Ａ）〜（Ｄ）は、心筋細胞が組むネットワークを図７（Ｃ）に示す細胞の配置パターンを直線状とした場合の評価を一度に多数の心筋細胞グループに対して実施できるように工夫されたものである。すなわち、８個の微小電極２を直線状に縦方向に配列したパターンを４本、８個の微小電極２を直線状に横方向に配列したパターンを４本構成し、それぞれの微小電極２に接続されている引き出し線２’を基板周辺に引き出している構造である。この実施例では、８本のパターンのそれぞれに異なった細胞グループを対応させて評価すれば、一度に８グループの細胞の評価ができる。
【００５０】
この実施例を実現するには、まず、基板１の上面に、微小電極２および引き出し線２’を形成するためのＩＴＯ膜４１を全面に形成する。その後、図１７（Ｂ）右側に示すように、微小電極２および引き出し線２’を一体とした導電パターンとして周辺のＩＴＯ膜を微小電極２（たとえば、４μｍφ）および引き出し線２’（たとえば、幅４μｍ）を一体とした導電パターンに沿った周辺部の狭い幅（たとえば１μｍ）をエッチングしたエッチング部４２，４３により除去する。この結果、全ての微小電極２および引き出し線２’を一体とした導電パターンがＩＴＯ膜４１から切り離されるとともに、残りのＩＴＯ膜４１は全体が接続された導電体として基板１に残る。次いで、ＩＴＯ膜４１からエッチングにより切り出された微小電極２および引き出し線２’を一体とした導電パターンを含む全面にポリイミドによる絶縁膜４７を形成する。これにより、図１７（Ｃ）に示すように、エッチングにより除去された微小電極２および引き出し線２’を一体とした導電パターンに沿った周辺のエッチング部４２，４３をポリイミドによる絶縁膜４７で埋めるとともに全面をポリイミドによる絶縁膜４７で覆う。次いで、図１７（Ｃ）、（Ｄ）に示すように、微小電極２に対応する位置のポリイミドによる絶縁膜４７を除去して微小電極２の上にＰｔ／Ｐｔ−ｂｌａｃｋよりなる細胞載置膜４６を形成する。微小電極２と細胞載置膜４６とは電気的に接続されているのは当然である。
【００５１】
この実施例では微小電極２および引き出し線２’を一体としたパターン以外の部分の全面のＩＴＯ膜はグランド層として利用することができる。したがって、隣接した微小電極２および引き出し線２’相互の間で信号の干渉が起こることはない。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明に関する細胞応答計測装置に関する産業上の利用の形態についてみると、研究者あるいは製薬会社等の細胞応答計測装置を利用する立場と、細胞応答計測装置のためのチップを供給するメーカの立場での利用があり得る。利用する立場から言えば、細胞応答計測装置の細胞収納部となる空間に心筋細胞を収納した細胞応答計測装置のためのチップを供給されるのが簡便である。しかし、チップの状態では、培養液が入れられた状態でも、細胞収納部となる空間に収納された心筋細胞は長時間生存し得ないので、チップを供給するメーカは、使用期限を短期間に限った形でのチップの供給とするか、あるいは、図１に示す基板部分の要素からなるチップの供給とがあり得る。チップの供給の場合は、細胞応答計測装置の細胞収納部となる空間への心筋細胞の収納および全体の組み立てはユーザに任せることになる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の実施例に係る細胞応答計測装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。
【図２】図１に示す細胞応答計測装置を光学観察装置のステージに載せて縦方向の中心位置において奥行方向に見た断面図である。
【図３】（Ａ）は細胞電位の計測に関するノイズ信号の評価の例を示す図、（Ｂ）は、微小電極と比較電極の距離をパラメータとして、横軸に比較電極のリングの径のサイズ、縦軸に微小電極の引き出し線と比較電極のリードとの間に検出できる電圧信号の信号／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を採ったときの特性図、（Ｃ）は、比較電極のリングの径のサイズをパラメータとして、横軸に、微小電極と比較電極の距離、縦軸に微小電極の引き出し線と比較電極のリードとの間に検出できる電圧信号の信号／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を採ったときの特性図、である。
【図４】（Ａ）は、の細胞保持区画の細胞収納部となる空間に一つの心筋細胞を収納して心筋細胞の拍動を計測した測定結果を模式的に示す図、（Ｂ）は細胞保持区画の細胞収納部となる空間の周辺部にいくつかの心筋細胞を入れ、この心筋細胞と周辺部の心筋細胞が突起を伸ばし接触してギャップジャンクションを形成して、お互いの細胞とインタラクションしている状態で心筋細胞の拍動を計測した測定結果を模式的に示す図、である。
【図５】図１および図２で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞１０0の拍動時の電位を計測するときの他の一つの使い方の例を示す図である。
【図６】（Ａ）は、心筋細胞１０0が孤立している状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ｂ）は、心筋細胞１０0の周辺に一つの細胞が配置された２細胞状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ｃ）は心筋細胞１０0の周辺に９細胞が分散配置された９細胞状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。
【図７】（Ａ）〜（Ｃ）は、心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）について心筋細胞がネットワークを組む細胞の配置パターンに関してネットワークを組む心筋細胞の数との関係を評価した実験結果を示す図である。
【図８】心筋細胞が受ける薬剤の効果を評価するためのタイムスケジュールを最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ａ）〜（ｅ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。
【図９】（Ａ）、（Ｂ）はＨＰＬ投与・洗浄過程での心筋細胞の拍動ゆらぎ変化を統括的に説明する図である。
【図１０】図５に示す構成で９細胞を格子状に配置して図８で説明したと同様の薬剤の効果の評価をするためのタイムスケジュールを最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ａ）〜（ｄ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。
【図１１】図１０を参照して説明したタイムスケジュールでの薬剤の効果の評価に続けて、さらにＨＰＬを投与するＨＰＬ再投与およびこのＨＰＬ再投与に続けてＨＰＬを洗浄するＨＰＬ再洗浄をした場合の薬剤の効果の評価を最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ｅ）〜（ｇ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。
【図１２】（Ａ），（Ｂ）はＨＰＬ投与・洗浄過程、ＨＰＬ再投与・再洗浄過程での心筋細胞の拍動ゆらぎ変化を統括的に説明する図である。
【図１３】（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、心筋細胞の集団化効果に着目して、図５で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞の拍動リズム解析への応用の一例を説明する図である。
【図１４】（Ａ）および（Ｂ）は、心筋細胞の集団化効果を利用した計測における注意点の一つを説明する図である。
【図１５】図５で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、２０細胞からなる細胞群の心筋細胞の拍動リズムを光学的に解析する応用の一例を説明する図である。
【図１６】図５で説明した細胞応答計測装置１００と対極となる細胞応答計測装置２００の実施例を示す斜視図である。
【図１７】（Ａ）〜（Ｄ）は、図１で説明した透明基板１、微小電極２、微小電極２の引き出し線２’を含む多電極基板の具体例を説明する図である。
【符号の説明】
【００５４】
１…基板、２…微小電極、２’…微小電極２の引き出し線、３1，３2，３3及び３4…アガロースゲルによる壁、４1，４2，４3及び４4…空間部、５…白金リングによる比較電極、５1…比較電極５を保持するリード部、６…位置調整装置、７…周辺を取り巻く壁、６1…Ｚ軸方向の駆動装置、６2…Ｙ軸方向の駆動装置、６3…Ｘ軸方向の駆動装置、Ｄｘ，ＤｙおよびＤｚ…駆動信号、８1，８2，８3…パイプ、９…パソコン、Ｍｓ…パソコンの操作信号、１０0，１０2，１０3---，１０9…心筋細胞、２０…Ｘ−Ｙ駆動装置、２１…光学観察装置のステージ、２２…光源、２３…バンドパスフィルタ、２４…シャッター、２５…コンデンサレンズ、２６…対物レンズ、２７…駆動装置、３１…光源、３２，３６，３９…バンドパスフィルタ、３３…シャッター、３４，３５…ダイクロイックミラー、３７，４０…カメラ、４１…ＩＴＯ膜、４２，４３…エッチング部、４６…細胞載置膜、４７…ポリイミドによる絶縁膜、２００…恒温層。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤、電気刺激等に対する細胞の応答を計測する装置および細胞応答計測チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに多用されているのはバイオアッセイである。従来のバイオアッセイでは、一般的に培養細胞を用いることが多い。この系では複数の細胞を用いてアッセイを行うので、細胞集団の値の平均値をあたかも１細胞の特性であるかの様に観察してきた。
【０００３】
しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。このため、刺激に対する応答の結果を解析するときにゆらぎの問題が常に付きまとう。
【０００４】
すなわち、細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎが存在するために、常に、平均的なレスポンスしか得ることができない。これらの問題を解決するために、同調培養等の手法が開発されているが、常に同じステージにある細胞群を使用することは、常にそのような細胞を供給し続けなければならないということで、バイオアッセイを広く一般に広める障害となっている。
【０００５】
また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触・細胞間インタラクションによるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。
【０００６】
細胞の物理的接触・細胞間インタラクションの問題は、バイオアッセイを組織断片のような細胞塊で行うことである程度解決できる。しかし、この場合、培養細胞と異なり、常に均一な素性の細胞塊を得ることができない。そのため、得られるデータがばらついたり、集団の中に情報が埋もれてしまったりする問題がある。
【０００７】
細胞群の細胞の１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために、本願の発明者らは特開２００６‐９４７０３（特許文献１）に示すように、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の細胞培養区画を構成し、隣接する区画間は細胞の通り抜けることができない溝またはトンネルでお互いを連結するとともに、必要に応じて、溝またはトンネルあるいは細胞培養区画に、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンを持つ構造の集合細胞マイクロアレー（バイオアッセイチップ）を提案した。
【特許文献１】特開２００６‐９４７０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のバイオアッセイでは、細胞を組織断片として扱うか、培養細胞のように１細胞として扱うかのいずれかであった。細胞の数が多すぎると上記従来技術の項で述べたように、得られる情報が平均的なものになってしまい、薬剤などに対するレスポンスが正確に得られない問題がある。細胞を１細胞ずつ用いる場合は、本来、多細胞組織の細胞として機能している細胞を、引き離された独立した状態の細胞として使用するために、細胞同士のインタラクションの影響が現れなくなることとなり、やはり正確な薬剤レスポンスすなわちバイオアッセイデータを得る上で問題がある。従って、１細胞で細胞電位、細胞形態が正確に計測できるとともに、必要なら、周辺に細胞を配置して細胞同士のインタラクションの影響を受ける形での１細胞の細胞電位、細胞形態が正確に計測できるデバイスやシステムを開発することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記の課題を解決するものとして、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくとともに、この細胞の細胞電位を計測するための微小電極を前記空間配置領域に形成し、比較電極を前記空間配置領域を含む範囲で前記微小電極の面よりＺ軸方向に離れた位置に配置し、細胞には細胞培養液を還流して細胞の活性を維持できるようにする。細胞電位のより正確な計測のために、微小電極と比較電極間のＸ−Ｙ軸方向の距離及びＺ軸方向の距離を調整可能とする。また、前記細胞に作用する薬剤を添加する手段を付加する。
【００１０】
さらに、細胞相互間のインタラクションの影響を評価できるように、特定の空間配置の中に閉じ込められた１細胞の周辺に適宜細胞を配置することを可能にし、あるいは、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めた構成を規則的に配置した構成とする。また、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めた構成を規則的に配置した構成を恒温層により同じ環境において、それぞれの細胞毎に異なった薬剤を作用させて、反応を評価することを可能にした構成とする。
【発明の効果】
【００１１】
特定の空間配置の中に閉じ込められた１細胞の細胞電位、薬剤に対する細胞の応答を正確に計測することができるとともに、細胞相互間のインタラクションの影響を含めた評価ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図１は本発明の実施例に係る細胞応答計測装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。図２は、図１に示す細胞応答計測装置を光学観察装置のステージに載せて見た断面を示す模式図である。
【００１３】
１００は細胞応答計測装置であり、透明基板１の上に構築されている部品を主体として構成される。透明基板１は光学的に透明な材料、たとえば、ガラス基板あるいはシリコン基板である。２は微小電極であり、たとえば、ＩＴＯによる透明電極とされ、透明基板１上に配置される。２’は微小電極２の引き出し線である。３1，３2，３3及び３4はアガロースゲルによる壁であり、微小電極２の周辺に空間部４1，４2，４3及び４4を介して配置される。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4は中心部が切り欠かれて細胞収納部となる空間を形成している。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間の透明基板１上には微小電極２が配置され、この上に一つの細胞１０0が収納できる。５は金または白金リングによる比較電極であり、細胞収納部となる空間上部、すなわち細胞１０0の上部、でＸ−Ｙ軸方向の距離及びＺ軸方向の距離を調整可能な任意の位置に保持される。５1は比較電極５を保持するリード部で一端が比較電極５に固着され他端が比較電極５の位置調整装置６に保持される。リード部５1は比較電極の引き出し線を兼ねるものである。調整装置６は一端が基板１に固着される。６1はＺ軸方向の駆動装置であり、位置調整装置６に備えられる。Ｚ軸方向の駆動装置６1は後述するパソコン９の与える駆動信号Ｄｚにより駆動されて比較電極５を保持するリード部５1を介して比較電極５を上下方向に移動させる。６2はＹ軸方向の駆動装置であり、位置調整装置６に備えられる。Ｙ軸方向の駆動装置６2は後述するパソコン９の与える駆動信号Ｄｙにより駆動されて比較電極５を保持するリード部５1を介して比較電極５をＹ軸方向に移動させる。６3はＸ軸方向の駆動装置であり、位置調整装置６に備えられる。Ｘ軸方向の駆動装置６3は後述するパソコン９の与える駆動信号Ｄｘにより駆動されて比較電極５を保持するリード部５1を介して比較電極５をＸ軸方向に移動させる。比較電極５の太さおよび直径は必要により変更してリード部５1とともに位置調整装置６に装着できる。７は周辺を取り巻く壁であり、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間を取り巻いている。８1，８2は壁７の内部の領域に、細胞の培養液を還流するためのパイプであり、図の例では、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８1から培養液が供給され、壁７の上面に近い位置のパイプ８2から培養液が排出される。培養液を供給するパイプ８1の培養液の出口の近くにパイプ８3が結合され、このパイプ８3を介して細胞に作用させたい薬剤が供給される。
【００１４】
９はパソコンであり、微小電極２の引き出し線２’と比較電極５を保持するリード部５1との間で細胞電位を計測し記録する。また、パソコン９には操作者の操作信号Ｍｓが加えられる。操作者は、細胞電位、薬剤に対する細胞の応答の計測、記録に先行して、細胞を微小電極２の上に細胞１０0を収納する前に壁７の内部の領域に培養液を入れ、ノイズ電圧を計測して、比較電極５の太さおよび直径の最適値を探索する。また、壁７の内部の領域に培養液を入れただけの状態で、操作者は駆動信号Ｄｘ，ＤｙおよびＤｚを操作して比較電極５のＸ−Ｙ軸方向の距離及びＺ軸方向の距離を調整して最適位置を探索する。
【００１５】
アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の中心部が切り欠かれて形成される細胞収納部となる空間の基板１上には微小電極２が配置され、この上に一つの細胞１０0が載置される。微小電極２の細胞１０0の載置面にはコラーゲン等の細胞が電極表面に接着するのを助ける素材を塗っておくのがよい。一方、アガロースゲルは細胞にとっては非接着性であるため、この壁３1，３2，３3及び３4の高さを細胞と同程度としても、壁を乗り越えて細胞１０0が移動することはない。また、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4中心部が切り欠かれて形成される細胞収納部の周辺の空間部４1，４2，４3及び４4は細胞の大きさより小さいものとされるから、この空間部４1，４2，４3及び４4をすり抜けて細胞１０0が移動することはない。したがって、細胞１０0はパイプ８1，８2により壁７の内部の領域に還流される細胞の培養液に曝されながら、微小電極２の上に安定して保持される。
【００１６】
図１に示す細胞応答計測装置１００の構造の主要なサイズの例を示すと以下のようである。これは、細胞の大きさを１０μｍφとした例である。透明基板１の大きさは１００ｍｍ×１５０ｍｍ、微小電極２は８μｍ×８μｍの大きさ、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の個々の大きさは２０μｍ×２０μｍ×１０μｍ（高さ）、空間部４1，４2，４3及び４4の幅２μｍ、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間は１２μｍφの円柱状、壁７の外形は５ｍｍ×５ｍｍとし高さは５ｍｍ、比較電極５は５０μｍφの太さの白金線で、リングの径は１ｍｍφである。尚、ここでは、微小電極２は８μｍ×８μｍの正方形としたが、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4の幅とで構成する細胞の収納部となる１０μｍφの円状の電極としてもよい。
【００１７】
図２は、図１に示す細胞応答計測装置１００を光学観察装置のステージに載せて細胞１０0の中心位置で見た断面を示す模式図であり、光学系により細胞の振る舞いを観察するときの概要を示す。２１は光学観察装置のＸＹステージであり、光学的に透明であるとともに、パソコン９が与える信号に応じてＸ−Ｙ駆動装置２０により、任意の位置に移動される。図２では、細胞１０0の培養液１１の供給が壁７の内側の領域にパイプ８1から供給され、壁７の上面に近い位置のパイプ８2から排出されている状態を示す。
【００１８】
２２は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。２３は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞１０0の観察の場合には、波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の光を用いることで細胞１０0の損傷を防ぐことができる。２４はシャッターで、ＸＹステージ２１を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。２５はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。ＸＹステージ２１上には基板１上に形成されている細胞応答計測装置１００が載置されＸ−Ｙ駆動装置２０によって前記ＸＹステージ２１を移動させることで前記細胞応答計測装置１００の任意の位置を観察し、計測することができる。前記細胞応答計測装置１００内の細胞１０0の存在状態は、対物レンズ２６で観察される。対物レンズ２６の焦点位置はパソコン９による信号に応じて駆動装置２７によって移動させることができる。対物レンズ２６の倍率は４０倍以上のものが使用できる。
【００１９】
また、蛍光観察のために、光源３１からの光をバンドパスフィルタ３２によって励起光波長のみ透過させ、シャッター３３によって観察するときのみ励起光が細胞１０0に照射されるように制御される。シャッター３３を通過した励起光はダイクロイックミラー３４によって細胞１０0に照射される。このとき対物レンズ２６で観察されるのは、光源２２から透過された光による細胞１０0の位相差像あるいは微分干渉像と、光源３１からの励起光によって細胞１０0が発した蛍光像である。前記バンドパスフィルタ２３を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー３５およびバンドパスフィルタ３６によって、位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ３７によって観察される。他方、蛍光像は、対物レンズ２６を通過した光のうちミラー３８およびバンドパスフィルタ３９によって、蛍光観察の波長帯のみを選択的に透過させて、カメラ４０で観察することができる。カメラ３７で撮った位相差像あるいは微分干渉像は、パソコン９の画像処理機能で解析され、ＸＹステージ２１の移動量の制御、あるいは対物レンズ２６の高さ制御、ピント合わせ等を行うことができる。カメラ３７は１／２００高速カメラが使用でき、拍動の画像解析に使用できる。
【００２０】
図３（Ａ）、図３（Ｂ）および図３（Ｃ）は、細胞電位の計測に関するノイズ信号の評価の概念を示す図である。それぞれ、横軸に微小電極２と比較電極５との距離をＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向に変化させ、縦軸に微小電極２の引き出し線２’と比較電極５のリード５1との間に検出できる電圧の振幅をとったときのノイズ信号の大きさを示す図である。それぞれ、任意の基点からＬｘ，ＬｙおよびＬｚの位置でノイズが急減することが分かる。このデータを計測に先行して計測しておき、パソコン９から駆動信号Ｄｘ，ＤｙおよびＤｚを与えて比較電極５のＸ−Ｙ軸方向の距離及びＺ軸方向の距離を調整して最適位置で計測するようにする。
【００２１】
以下、本発明の細胞応答計測装置１００の構成例とこれを用いた具体的な計測例を説明する。
【００２２】
図４は、図１および図２で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞１０0の拍動時の電位を計測するときの一つの使い方の例を示す図である。図１と対比して分かるように、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4の幅とで構成する細胞の収納部の微小電極２に心筋細胞１０0が載置される他に、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4の周辺で壁７の内側の領域に心筋細胞１０1，１０2，---，１０8が分散配置されている点を除けば、両者は同じである。この構成では、心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の分散配置の状況に応じた微小電極２に載置された心筋細胞１０0の拍動時の電位が微小電極２の引き出し線２’と比較電極５のリード５1との間の電位として計測される。
【００２３】
一方、図５は、図１および図２で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞１０0の拍動時の電位を計測するときの他の一つの使い方の例を示す図である。図４と対比して分かるように、図４の構成では、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4の周辺で壁７の内側の領域に心筋細胞１０1，１０2，---，１０8が分散配置されるのみでこれらの心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の位置を厳密に管理できるものではなかった。これに対して、図５の構成では、心筋細胞１０0のみならず心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の全てをアガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と空間部４1，４2，４3及び４4で囲ったので、心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の位置も厳密に管理できる。さらに、図５の構成では、心筋細胞１０0，１０1，１０2，---，１０8が載置されたそれぞれの微小電極２0，２1，２2，---，２8（図面では参照符号の表示を省略した）と心筋細胞１０0，１０1，１０2，---，１０8のすべてに対して共通に設けられる共通の比較電極５との間でそれぞれの微小電極２に載置されたそれぞれの心筋細胞１０0，１０1，１０2，---，１０8の拍動時の電位がそれぞれの微小電極２の引き出し線２’0，２’1，２’2，---，２’8と比較電極５のリード５1との間の電位として計測できる。
【００２４】
図６（Ａ）は、心筋細胞１０0が孤立している状態、すなわち、図４、図５に示す心筋細胞１０1，１０2，---，１０8が無い状態（図１に示す状態）での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ｂ）は、心筋細胞１０0の周辺に図４、図５に示す心筋細胞１０1，１０2，---，１０8のうちの一つのみが配置された２細胞状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ｃ）は心筋細胞１０0の周辺に図４、図５に示す心筋細胞１０1，１０2，---，１０8の全てが分散配置された９細胞状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ａ）〜（Ｃ）を対比して分かるように、心筋細胞１０0の孤立状態が最も不安定な拍動状態であり、２細胞状態では少し改善が見られ、９細胞状態は安定な拍動状態であることが分かる。
【００２５】
図７（Ａ）〜（Ｃ）は、心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）について心筋細胞がネットワークを組む細胞の配置パターンに関してネットワークを組む心筋細胞の数との関係を評価した実験結果を示す図である。図の左側に、横軸にネットワークを組む心筋細胞の数を取り、縦軸に心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）を取った特性を示し、図の右側に細胞ネットワークを組む細胞の配置パターンをアガロースゲル３が作る壁の構造として示したものである。すなわち、図７（Ａ）は細胞の配置パターンが格子状である場合、図７（Ｂ）は細胞の配置パターンが放射状である場合、図７（Ｃ）は細胞の配置パターンが直線状である場合である。細胞の配置パターンを放射状とするため、図７（Ｂ）では、対角位置にある外側のアガロースゲル３が作る壁は４５°回転した構成とし、対角位置にある中心位置のアガロースゲル３が作る壁は対角線の方向にも空間部を持つ構成とした。細胞の配置パターンがどういう形になっていても、心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）がネットワークを組む心筋細胞の数の増加によって改善されることが分かる。
【００２６】
図７（Ｄ）は、図７（Ａ）〜（Ｃ）に示す特性を重ねて表示した特性である。図７（Ａ）〜（Ｃ）に示す特性は実質的に重なったものであることが分かる。すなわち、ネットワークを組む心筋細胞の心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）は、細胞の配置パターンには依存しないことが分かる。
【００２７】
図８は、心筋細胞が受ける薬剤の効果を評価するためのタイムスケジュールを最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ａ）〜（ｅ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。拍動の波形は縦軸に信号強度を採り、横軸に時間をとったものであり、拍動分布は縦軸に頻度をとり、横軸に拍動周期をとったものである。図８は、図５に示す構成で４細胞を格子状に配置し、パイプ８1から培養液を供給しながらパイプ８2から排出して培養液を壁７の領域内に還流させながら、パイプ８1に接続されたパイプ８3を通して、抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）を培養液に添加して薬剤の効果を評価する実験の結果を示すものである。
【００２８】
時点（ａ）はコントロール状態であり、薬剤の効果の評価の基準状態となる。コントロール状態の期間には図５のパイプ８1から培養液が供給され、パイプ８2から排出されている。コントロール状態が６分継続された後、パイプ８3を通して抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）が添加された培養液が壁７の領域内に還流されるようにする。時点（ｂ）はＨＰＬ投与１分後であり、時点（ｃ）はＨＰＬ投与５分後である。ＨＰＬ投与を７分間継続した後、パイプ８3を通した抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）の添加を停止し、培養液のみが壁７の領域内に還流されるようにする。すなわち、ＨＰＬにさらされた細胞を洗浄する。時点（ｄ）はＨＰＬ洗浄６分後であり、時点（ｅ）はＨＰＬ洗浄１２分後である。
【００２９】
コントロール状態においては、時点（ａ）の拍動の信号波形は安定しており、拍動分布も拍動周期がほぼ１秒の範囲に収まっている。コントロール状態を６分間継続した後、ＨＰＬ投与を開始した。ＨＰＬ投与１分後の時点（ｂ）について見ると拍動の信号波形に乱れが生じており、矢印で示すように大きな変形を示すときが見られる。さらにＨＰＬ投与が継続され、ＨＰＬ投与６分後の時点（ｃ）について見ると拍動の信号波形の乱れはより大きくなっており、矢印で示すように大きな変形を示す状況が増大している。ＨＰＬ投与を７分間継続した後、ＨＰＬ投与を停止して、培養液のみを還流させて、細胞のＨＰＬを洗浄する。ＨＰＬの洗浄６分後の時点（ｄ）について見ると拍動の周期は伸びているが信号波形の乱れは低下している。さらにＨＰＬの洗浄を継続し、ＨＰＬの洗浄１２分後の時点（ｅ）について見ると拍動の周期も短くなってくるとともに、信号波形の乱れは低下している。
【００３０】
図９（Ａ）、（Ｂ）はＨＰＬ投与・洗浄過程での心筋細胞の拍動ゆらぎ変化を統括的に説明する図であり、図９（Ａ）はコントロール、ＨＰＬ投与および洗浄過程の時間の経過に応じた拍動周期の揺らぎを示し、下向きの三角で示すのがそれぞれの過程の最終状態における値である。図９（Ｂ）は横軸には拍動周期をとり、縦軸に拍動周期の揺らぎをとったときのコントロール、ＨＰＬ投与および洗浄過程の最終状態における値を示す図である。
【００３１】
図９（Ａ）から分かるように、ＨＰＬ投与の時間経過とともにＨＰＬの効果が高まり、拍動状態が不安定になる。すなわち、拍動周期の揺らぎが増大する。次いで、ＨＰＬ投与を停止して、培養液のみを還流させて、細胞のＨＰＬを洗浄しても、しばらくは拍動周期の揺らぎが増大した状態が続き、洗浄を継続することにより、拍動周期の揺らぎは低下する。すなわち、培地交換により徐々に拍動状態が回復する傾向を示す。しかしながら、図９（Ｂ）から分かるように、コントロール、ＨＰＬ投与およびＨＰＬ洗浄のそれぞれの過程の最終状態を見ると、拍動周期および拍動周期の揺らぎはＨＰＬ洗浄によりＨＰＬ投与により受けた影響は低減されるが、太い矢印で示すように、元の状態には戻らない。
【００３２】
図１０は、図５に示す構成で９細胞を格子状に配置して図８で説明したと同様の薬剤の効果の評価をするためのタイムスケジュールを最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ａ）〜（ｄ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。拍動の波形は縦軸に信号強度を採り、横軸に時間をとったものであり、拍動分布は縦軸に頻度を採り、横軸に拍動周期をとったものである。細胞に対してパイプ８1から培養液を供給しながらパイプ８2から排出して培養液を壁７の領域内に還流させ、且つ、パイプ８1に接続されたパイプ８3を通して、抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）を培養液に添加して薬剤の効果を評価する実験の結果を示すものである。
【００３３】
図８および図１０に示す時点（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、（ａ）はコントロール状態、（ｂ）はＨＰＬ投与１分後、（ｃ）はＨＰＬ投与５分後であり、（ｄ）はＨＰＬ投与を７分間継続した後、ＨＰＬにさらされた細胞を洗浄した後の、ＨＰＬ洗浄６分後である。
【００３４】
図８の時点（ａ）から（ｃ）と図１０の時点（ａ）から（ｃ）を対比して見ると、図１０では、９細胞を格子状に配置した細胞群としたので、ＨＰＬ投与による拍動の基本的なパターンの変化が小さい、すなわち、拍動の周期の変化が小さい一方で、本来の拍動の波形の直後に表れるピークが大きいことが観察される。図８（ｄ）と図１０（ｄ）を対比してみると、図１０（ｄ）では、拍動の周期および拍動の波形がともにコントロール状態に近いことが観察される。
【００３５】
図１１は、図１０を参照して説明したタイムスケジュールでの薬剤の効果の評価に続けて、さらにＨＰＬを投与するＨＰＬ再投与およびこのＨＰＬ再投与に続けてＨＰＬを洗浄するＨＰＬ再洗浄をした場合の薬剤の効果の評価を最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ｅ）〜（ｇ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。図１１における時点（ｄ）は図１０における時点（ｄ）と同じ時点である。図１１においても、拍動の波形は縦軸に信号強度を採り、横軸に時間をとったものであり、拍動分布は縦軸に頻度を採り、横軸に拍動周期をとったものである。細胞に対してパイプ８1から培養液を供給しながらパイプ８2から排出して培養液を壁７の領域内に還流させ、且つ、パイプ８1に接続されたパイプ８3を通して、抗精神病薬ハロペリドール（ＨＰＬ）を培養液に添加して薬剤の効果を評価する実験の結果を示すものである。
【００３６】
図１１に示す時点（ｅ）〜（ｇ）は、それぞれ、（ｅ）はＨＰＬの再投与１分後、（ｆ）はＨＰＬの再投与５分後であり、（ｇ）はＨＰＬの再投与を７分間継続した後、ＨＰＬにさらされた細胞を再度洗浄したＨＰＬの再洗浄６分後である。
【００３７】
図１１の時点（ｅ）、（ｆ）と図１０の時点（ｂ）、（ｃ）を対比して見ると、ＨＰＬの再投与による薬剤が細胞に及ぼす影響は、ＨＰＬの最初の投与による薬剤が細胞に及ぼす影響よりはるかに大きなものであることが分かる。すなわち、図１１の時点（ｅ）、（ｆ）では、図１０の時点（ｂ）、（ｃ）に矢印で示す拍動の信号波形の変形と比較してはるかに大きい信号波形の変形が生じている。一方、図１１の時点（ｇ）に示すＨＰＬの再洗浄６分後の拍動の信号波形、拍動周期と図１０の時点（ａ）に示すコントロール状態の拍動の信号波形、拍動周期とは類似したものとなっている。
【００３８】
図１２（Ａ），（Ｂ）はＨＰＬ投与・洗浄過程、ＨＰＬ再投与・再洗浄過程での心筋細胞の拍動ゆらぎ変化を統括的に説明する図であり、図１２（Ａ）はコントロール、ＨＰＬ投与および洗浄過程、これに続くＨＰＬ再投与・再洗浄過程の時間の経過に応じた拍動周期の揺らぎを示し、下向きの三角で示すのがそれぞれの過程の最終状態における値である。図１２（Ｂ）は横軸には拍動周期をとり、縦軸に拍動周期の揺らぎをとったときのコントロール、ＨＰＬ投与および洗浄過程、これに続くＨＰＬ再投与・再洗浄過程の最終状態における値を示す図である。
【００３９】
図１２（Ａ）から分かるように、ＨＰＬ投与の時間経過とともにＨＰＬの効果が高まり、拍動状態が不安定になる。すなわち、拍動周期の揺らぎが増大する。次いで、ＨＰＬ投与を停止して、培養液のみを還流させて、細胞のＨＰＬを洗浄しても、しばらくは拍動周期の揺らぎが増大した状態が続き、洗浄を継続することにより、拍動周期の揺らぎは低下する。すなわち、培地交換により徐々に拍動状態が回復する傾向を示す。次いで、ＨＰＬの再投与によりＨＰＬの効果が非常に強く表れ、拍動周期の揺らぎが大きく増大する。次いで、ＨＰＬ再投与を停止して、培養液のみを還流させて、細胞のＨＰＬを再洗浄すると拍動周期の揺らぎは大きく改善され、再洗浄を継続することにより、拍動周期の揺らぎはコントロールと同程度まで低下する。すなわち、培地交換による拍動状態の回復は再洗浄では大きな効果を示す。
【００４０】
図１２（Ｂ）から分かるように、しかしながら、９細胞を格子状に配置した細胞群により薬剤が細胞に及ぼす影響を評価した場合には、図９（Ｂ）に示した４細胞を格子状に配置した細胞群による評価結果と比較して、洗浄、再洗浄の結果、コントロール状態とほぼ同じ状態まで戻る。すなわち、コントロール、ＨＰＬ洗浄、ＨＰＬ再洗浄の過程の最終状態における拍動周期および拍動周期の揺らぎが狭い範囲に収まり、ＨＰＬ投与およびＨＰＬ再投与の過程の最終状態における拍動周期および拍動周期の揺らぎが狭い範囲に収まる。これは、図８（Ｂ）に示されるコントロール、ＨＰＬ投与およびＨＰＬ洗浄のそれぞれの過程の最終状態がＨＰＬ洗浄によってもＨＰＬ投与により受けた影響は低減されるが、太い矢印で示すように、元の状態には戻らないのとは大きく異なることである。
【００４１】
図１３（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、上述した心筋細胞の集団化効果に着目して、図５で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞の拍動リズム解析への応用の一例を説明する図である。すなわち、数個から成る小細胞集団でも安定性獲得が獲得できることに着目して、電気計測による拍動波形解析および薬剤に対するイオンチャネルレベルの応答の計測により、ＱＴ延長症候群の評価が可能となり、分子レベルの理解・薬剤スクリーニングへの応用が可能となる。
【００４２】
図１３（Ａ）は心臓の拍動波形（心電図）の例を示す図であり、左側に正常な心電図波形を右側にＱＴ延長症候群を発症している心電図波形を示す。ＱＴ延長症候群は致死性不整脈誘導あるいは抗不整脈薬により誘導することができるから、薬剤スクリーニングにおいてＱＴ延長症候群の評価ができることが重要である。図１３（Ｂ）は培養した心筋細胞の電気計測による拍動波形の計測例を示す図であり、左側に細胞外電位記録法による正常な波形を、右側にＱＴ延長症候群の波形を示す。図１３（Ａ）と図１３（Ｂ）とを対比して分かるように、培養心筋細胞の電気計測では、（１）波形の翻訳が心電図と相似、（２）Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ2+チャネルの働き計測可能、（３）再分極の波形がＴ波様の形状を示す、メリットがあり、ＱＴ延長の評価が可能である。図１３（Ｃ）は、図５に示す構成の細胞応答計測装置１００により９個の培養心筋細胞の電気計測による拍動波形の取得（左側）と、パイプ８3経由で付与した抗不整脈薬により誘導した薬剤スクリーニングによるＱＴ延長検出結果（右側）を示す図である。
【００４３】
図１４（Ａ）および（Ｂ）は、上述した心筋細胞の集団化効果を利用した計測における注意点の一つを説明する図である。図１４（Ａ）は、図５で説明した細胞応答計測装置１００の壁７の内部に８×８（＝６４）細胞の配置が可能となるように構成して、その内の１列の８個の細胞を用いて、チャンネルＣＨ１からＣＨ８への心筋細胞の拍動の伝播を計測した結果を示す電圧のピーク波形図である。図１４（Ｂ）は、均等に配列された微小電極上に８個の細胞が載置された列の各微小電極間の伝播時間を解析した結果を示す図である。図１４（Ａ）および（Ｂ）から分かるように、細胞間での伝播時間には大きなばらつきがある。したがって、計測にあたっては、心筋細胞の集団化効果を利用した安定化とともに、集団内の１細胞に着目した計測とすることが重要となる。
【００４４】
さらに、図面による説明は省略するが、細胞が受ける薬剤の効果を評価するに際しては、細胞に刺激を与えない方式の連続還流系の付加が重要であるが、本発明の実施例では、薬剤は培養液の還流系の中に注入されてから細胞に作用することになり、細胞に対する刺激は低減されたものとできる。
【００４５】
図１５は、図５で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、２０細胞からなる細胞群の心筋細胞の拍動リズムを光学的に解析する応用の一例を説明する図である。図１５では、右肩に番号１から２０を付して示すように、２０細胞を配列して、１／３０カメラによる拍動画像解析を行った。２０細胞の輝度の平均変化量を測定し、最初の点を０として表示したものである。
【００４６】
図１６は、図５で説明した細胞応答計測装置１００と対極となる細胞応答計測装置２００の実施例を示す斜視図である。すなわち、図５で説明した細胞応答計測装置１００は壁７で囲われた領域内に複数個の細胞が所定の関係を保持できるように配置され、これらのすべての細胞に共通の培養液が供給されるものとした。これに対して、図１６では図１で説明した細胞応答計測装置１００を単位とする計測装置１００1，１００2，１００3，---，１００9を共通の恒温層２００に収納したものとした。もちろん、図１６でも、図５で説明した細胞応答計測装置１００を単位とする計測装置１００1，１００2，１００3，---，１００9を共通の恒温層２００に収納するものとしてもよい。この実施例では、共通の恒温層２００によって与えられる同一の環境の下で、それぞれの細胞応答計測装置１００にここに設定される条件化での細胞の反応を容易に評価できる。なお、図１６に示す実施例は、図が煩雑となるので、個々の構成要素の参照符号は省略した。
【００４７】
図１、図５で説明した細胞応答計測装置１００は共通の培養液の下での一つの細胞の振る舞い、あるいは、細胞集団での細胞の振る舞い、細胞集団内での個々の細胞の振る舞いを評価するのに適した実施例と言うことができるのに対して、図１６説明した細胞応答計測装置は、共通の環境の下での一つの細胞の振る舞い、あるいは、細胞集団での細胞の振る舞い、細胞集団内での個々の細胞の振る舞いを評価するのに適した実施例と言うことができる。
【００４８】
図１７（Ａ）〜（Ｄ）は、図１で説明した透明基板１、微小電極２、微小電極２の引き出し線２’の具体例を説明する図である。図１７（Ａ）は平面図を示す顕微鏡写真、図１７（Ｂ）は微小電極の部分を拡大して示す顕微鏡写真（左側）、説明図（右側）、図１７（Ｃ）は、図１７（Ｂ）に示す顕微鏡写真のａ−ａ位置で矢印方向に見た断面図、図１７（Ｄ）は微小電極の部分の実体顕微鏡像である。
【００４９】
図１７（Ａ）〜（Ｄ）は、心筋細胞が組むネットワークを図７（Ｃ）に示す細胞の配置パターンを直線状とした場合の評価を一度に多数の心筋細胞グループに対して実施できるように工夫されたものである。すなわち、８個の微小電極２を直線状に縦方向に配列したパターンを４本、８個の微小電極２を直線状に横方向に配列したパターンを４本構成し、それぞれの微小電極２に接続されている引き出し線２’を基板周辺に引き出している構造である。この実施例では、８本のパターンのそれぞれに異なった細胞グループを対応させて評価すれば、一度に８グループの細胞の評価ができる。
【００５０】
この実施例を実現するには、まず、基板１の上面に、微小電極２および引き出し線２’を形成するためのＩＴＯ膜４１を全面に形成する。その後、図１７（Ｂ）右側に示すように、微小電極２および引き出し線２’を一体とした導電パターンとして周辺のＩＴＯ膜を微小電極２（たとえば、４μｍφ）および引き出し線２’（たとえば、幅４μｍ）を一体とした導電パターンに沿った周辺部の狭い幅（たとえば１μｍ）をエッチングしたエッチング部４２，４３により除去する。この結果、全ての微小電極２および引き出し線２’を一体とした導電パターンがＩＴＯ膜４１から切り離されるとともに、残りのＩＴＯ膜４１は全体が接続された導電体として基板１に残る。次いで、ＩＴＯ膜４１からエッチングにより切り出された微小電極２および引き出し線２’を一体とした導電パターンを含む全面にポリイミドによる絶縁膜４７を形成する。これにより、図１７（Ｃ）に示すように、エッチングにより除去された微小電極２および引き出し線２’を一体とした導電パターンに沿った周辺のエッチング部４２，４３をポリイミドによる絶縁膜４７で埋めるとともに全面をポリイミドによる絶縁膜４７で覆う。次いで、図１７（Ｃ）、（Ｄ）に示すように、微小電極２に対応する位置のポリイミドによる絶縁膜４７を除去して微小電極２の上にＰｔ／Ｐｔ−ｂｌａｃｋよりなる細胞載置膜４６を形成する。微小電極２と細胞載置膜４６とは電気的に接続されているのは当然である。
【００５１】
この実施例では微小電極２および引き出し線２’を一体としたパターン以外の部分の全面のＩＴＯ膜はグランド層として利用することができる。したがって、隣接した微小電極２および引き出し線２’相互の間で信号の干渉が起こることはない。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明に関する細胞応答計測装置に関する産業上の利用の形態についてみると、研究者あるいは製薬会社等の細胞応答計測装置を利用する立場と、細胞応答計測装置のためのチップを供給するメーカの立場での利用があり得る。利用する立場から言えば、細胞応答計測装置の細胞収納部となる空間に心筋細胞を収納した細胞応答計測装置のためのチップを供給されるのが簡便である。しかし、チップの状態では、培養液が入れられた状態でも、細胞収納部となる空間に収納された心筋細胞は長時間生存し得ないので、チップを供給するメーカは、使用期限を短期間に限った形でのチップの供給とするか、あるいは、図１に示す基板部分の要素からなるチップの供給とがあり得る。チップの供給の場合は、細胞応答計測装置の細胞収納部となる空間への心筋細胞の収納および全体の組み立てはユーザに任せることになる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の実施例に係る細胞応答計測装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。
【図２】図１に示す細胞応答計測装置を光学観察装置のステージに載せて縦方向の中心位置において奥行方向に見た断面図である。
【図３】（Ａ）は細胞電位の計測に関するノイズ信号の評価の例を示す図、（Ｂ）は、微小電極と比較電極の距離をパラメータとして、横軸に比較電極のリングの径のサイズ、縦軸に微小電極の引き出し線と比較電極のリードとの間に検出できる電圧信号の信号／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を採ったときの特性図、（Ｃ）は、比較電極のリングの径のサイズをパラメータとして、横軸に、微小電極と比較電極の距離、縦軸に微小電極の引き出し線と比較電極のリードとの間に検出できる電圧信号の信号／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を採ったときの特性図、である。
【図４】（Ａ）は、の細胞保持区画の細胞収納部となる空間に一つの心筋細胞を収納して心筋細胞の拍動を計測した測定結果を模式的に示す図、（Ｂ）は細胞保持区画の細胞収納部となる空間の周辺部にいくつかの心筋細胞を入れ、この心筋細胞と周辺部の心筋細胞が突起を伸ばし接触してギャップジャンクションを形成して、お互いの細胞とインタラクションしている状態で心筋細胞の拍動を計測した測定結果を模式的に示す図、である。
【図５】図１および図２で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞１０0の拍動時の電位を計測するときの他の一つの使い方の例を示す図である。
【図６】（Ａ）は、心筋細胞１０0が孤立している状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ｂ）は、心筋細胞１０0の周辺に一つの細胞が配置された２細胞状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。図６（Ｃ）は心筋細胞１０0の周辺に９細胞が分散配置された９細胞状態での心筋細胞１０0の拍動時の電位を示す図である。
【図７】（Ａ）〜（Ｃ）は、心拍の間隔の揺らぎ（ＣＶ％）について心筋細胞がネットワークを組む細胞の配置パターンに関してネットワークを組む心筋細胞の数との関係を評価した実験結果を示す図である。
【図８】心筋細胞が受ける薬剤の効果を評価するためのタイムスケジュールを最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ａ）〜（ｅ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。
【図９】（Ａ）、（Ｂ）はＨＰＬ投与・洗浄過程での心筋細胞の拍動ゆらぎ変化を統括的に説明する図である。
【図１０】図５に示す構成で９細胞を格子状に配置して図８で説明したと同様の薬剤の効果の評価をするためのタイムスケジュールを最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ａ）〜（ｄ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。
【図１１】図１０を参照して説明したタイムスケジュールでの薬剤の効果の評価に続けて、さらにＨＰＬを投与するＨＰＬ再投与およびこのＨＰＬ再投与に続けてＨＰＬを洗浄するＨＰＬ再洗浄をした場合の薬剤の効果の評価を最上段に示し、タイムスケジュールに示す時点（ｅ）〜（ｇ）における心筋細胞の拍動の波形（左側）と拍動分布（右側）を下段に示す図である。
【図１２】（Ａ），（Ｂ）はＨＰＬ投与・洗浄過程、ＨＰＬ再投与・再洗浄過程での心筋細胞の拍動ゆらぎ変化を統括的に説明する図である。
【図１３】（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、心筋細胞の集団化効果に着目して、図５で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、心筋細胞の拍動リズム解析への応用の一例を説明する図である。
【図１４】（Ａ）および（Ｂ）は、心筋細胞の集団化効果を利用した計測における注意点の一つを説明する図である。
【図１５】図５で説明した細胞応答計測装置１００を用いて、２０細胞からなる細胞群の心筋細胞の拍動リズムを光学的に解析する応用の一例を説明する図である。
【図１６】図５で説明した細胞応答計測装置１００と対極となる細胞応答計測装置２００の実施例を示す斜視図である。
【図１７】（Ａ）〜（Ｄ）は、図１で説明した透明基板１、微小電極２、微小電極２の引き出し線２’を含む多電極基板の具体例を説明する図である。
【符号の説明】
【００５４】
１…基板、２…微小電極、２’…微小電極２の引き出し線、３1，３2，３3及び３4…アガロースゲルによる壁、４1，４2，４3及び４4…空間部、５…白金リングによる比較電極、５1…比較電極５を保持するリード部、６…位置調整装置、７…周辺を取り巻く壁、６1…Ｚ軸方向の駆動装置、６2…Ｙ軸方向の駆動装置、６3…Ｘ軸方向の駆動装置、Ｄｘ，ＤｙおよびＤｚ…駆動信号、８1，８2，８3…パイプ、９…パソコン、Ｍｓ…パソコンの操作信号、１０0，１０2，１０3---，１０9…心筋細胞、２０…Ｘ−Ｙ駆動装置、２１…光学観察装置のステージ、２２…光源、２３…バンドパスフィルタ、２４…シャッター、２５…コンデンサレンズ、２６…対物レンズ、２７…駆動装置、３１…光源、３２，３６，３９…バンドパスフィルタ、３３…シャッター、３４，３５…ダイクロイックミラー、３７，４０…カメラ、４１…ＩＴＯ膜、４２，４３…エッチング部、４６…細胞載置膜、４７…ポリイミドによる絶縁膜、２００…恒温層。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板、
該透明基板上に配置した微小電極、
該微小電極上に１細胞が位置するように前記微小電極周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段、
前記細胞に作用する薬剤を培養液に加える手段、
前記微小電極の上方に位置した環状の比較電極、
前記微小電極に接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した１細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする細胞応答計測装置。
【請求項２】
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項１記載の細胞応答計測装置。
【請求項３】
前記微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項１記載の細胞応答計測装置。
【請求項４】
前記細胞非接着性の壁が前記微小電極周囲で複数に区分されたものである請求項１記載の細胞応答計測装置。
【請求項５】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数の微小電極、
該複数の微小電極上のそれぞれに１細胞が位置するように前記微小電極のそれぞれの周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記複数の微小電極上の細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段、
前記細胞に作用する薬剤を培養液に加える手段、
前記複数の微小電極の上方に位置した環状の比較電極、
前記複数の微小電極に接続された複数の引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて複数の細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、および
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする細胞応答計測装置。
【請求項６】
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項５記載の細胞応答計測装置。
【請求項７】
前記複数の微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項５記載の細胞応答計測装置。
【請求項８】
前記複数の細胞非接着性の壁が前記複数の微小電極周囲でそれぞれ複数に区分されたものである請求項５記載の細胞応答計測装置。
【請求項９】
透明基板上に配置した微小電極、
該微小電極上に１細胞が位置するように前記微小電極周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段、
前記細胞に作用する薬剤を培養液に加える手段、
前記微小電極の上方に位置した環状の比較電極、
を備える細胞応答計測要素、
前記細胞応答計測要素を複数個備える共通の透明基板、
前記複数個の細胞応答計測要素を格納する上下の壁が透明の恒温槽、
前記複数個の細胞応答計測要素のそれぞれの微小電極に接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いてそれぞれの細胞電位を計測し記録する手段、および
前記共通の透明基板上に配置した前記細胞応答計測要素の１細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする細胞応答計測装置。
【請求項１０】
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項９記載の細胞応答計測装置。
【請求項１１】
前記微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項９記載の細胞応答計測装置。
【請求項１２】
前記細胞非接着性の壁が前記微小電極周囲で複数に区分されたものである請求項９記載の細胞応答計測装置。
【請求項１３】
透明基板、
該透明基板上に配置した微小電極、
該微小電極上に１細胞が位置するように電極周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記微小電極の上方に位置した環状の比較電極、および
前記微小電極に接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を有することを特徴とする細胞応答計測チップ。
【請求項１４】
前記微小電極と比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項１３記載の細胞応答計測チップ。
【請求項１５】
前記細胞非接着性の壁が前記電極周囲で複数に区分されたものである請求項１３記載の細胞応答計測チップ。
【請求項１６】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数の微小電極、
該複数の微小電極上のそれぞれに１細胞が位置するように前記微小電極のそれぞれの周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記複数の微小電極上の細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記複数の微小電極の上方に位置した環状の比較電極、および
前記複数の微小電極に接続された複数の引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を有することを特徴とする細胞応答計測チップ。
【請求項１７】
前記複数の微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項１６記載の細胞応答計測チップ。
【請求項１８】
前記細胞非接着性の壁が前記微小電極周囲で複数に区分されたものである請求項１６記載の細胞応答計測チップ。
【請求項１９】
透明基板上に配置した微小電極、
該微小電極上に１細胞が位置するように前記微小電極周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記微小電極の上方に位置した環状の比較電極、および
前記微小電極に接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を備える細胞応答計測要素の複数個が共通の透明基板上に形成された細胞応答計測チップ。
【請求項２０】
前記複数の微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項１９記載の細胞応答計測チップ。
【請求項２１】
前記細胞非接着性の壁が前記微小電極周囲で複数に区分されたものである請求項１９記載の細胞応答計測チップ。
【請求項２２】
透明基板上に配置した微小電極と該微小電極に接続された引き出し線よりなる導電パターンを複数個備えた多電極基板であって、
前記微小電極と該微小電極に接続された引き出し線なる導電パターンが前記透明基板上の全面に形成された透明電極から前記導電パターンの周辺部を狭い幅でエッチングして形成されたものであるとともに、前記導電パターンを除く透明電極部分を前記複数の導電パターンの共通のグランド層とされる多電極基板。
【請求項１】
透明基板、
該透明基板上に配置した微小電極、
該微小電極上に１細胞が位置するように前記微小電極周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段、
前記細胞に作用する薬剤を培養液に加える手段、
前記微小電極の上方に位置した環状の比較電極、
前記微小電極に接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した１細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする細胞応答計測装置。
【請求項２】
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項１記載の細胞応答計測装置。
【請求項３】
前記微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項１記載の細胞応答計測装置。
【請求項４】
前記細胞非接着性の壁が前記微小電極周囲で複数に区分されたものである請求項１記載の細胞応答計測装置。
【請求項５】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数の微小電極、
該複数の微小電極上のそれぞれに１細胞が位置するように前記微小電極のそれぞれの周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記複数の微小電極上の細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段、
前記細胞に作用する薬剤を培養液に加える手段、
前記複数の微小電極の上方に位置した環状の比較電極、
前記複数の微小電極に接続された複数の引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて複数の細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、および
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする細胞応答計測装置。
【請求項６】
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項５記載の細胞応答計測装置。
【請求項７】
前記複数の微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項５記載の細胞応答計測装置。
【請求項８】
前記複数の細胞非接着性の壁が前記複数の微小電極周囲でそれぞれ複数に区分されたものである請求項５記載の細胞応答計測装置。
【請求項９】
透明基板上に配置した微小電極、
該微小電極上に１細胞が位置するように前記微小電極周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段、
前記細胞に作用する薬剤を培養液に加える手段、
前記微小電極の上方に位置した環状の比較電極、
を備える細胞応答計測要素、
前記細胞応答計測要素を複数個備える共通の透明基板、
前記複数個の細胞応答計測要素を格納する上下の壁が透明の恒温槽、
前記複数個の細胞応答計測要素のそれぞれの微小電極に接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いてそれぞれの細胞電位を計測し記録する手段、および
前記共通の透明基板上に配置した前記細胞応答計測要素の１細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする細胞応答計測装置。
【請求項１０】
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項９記載の細胞応答計測装置。
【請求項１１】
前記微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項９記載の細胞応答計測装置。
【請求項１２】
前記細胞非接着性の壁が前記微小電極周囲で複数に区分されたものである請求項９記載の細胞応答計測装置。
【請求項１３】
透明基板、
該透明基板上に配置した微小電極、
該微小電極上に１細胞が位置するように電極周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記微小電極の上方に位置した環状の比較電極、および
前記微小電極に接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を有することを特徴とする細胞応答計測チップ。
【請求項１４】
前記微小電極と比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項１３記載の細胞応答計測チップ。
【請求項１５】
前記細胞非接着性の壁が前記電極周囲で複数に区分されたものである請求項１３記載の細胞応答計測チップ。
【請求項１６】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数の微小電極、
該複数の微小電極上のそれぞれに１細胞が位置するように前記微小電極のそれぞれの周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記複数の微小電極上の細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記複数の微小電極の上方に位置した環状の比較電極、および
前記複数の微小電極に接続された複数の引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を有することを特徴とする細胞応答計測チップ。
【請求項１７】
前記複数の微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項１６記載の細胞応答計測チップ。
【請求項１８】
前記細胞非接着性の壁が前記微小電極周囲で複数に区分されたものである請求項１６記載の細胞応答計測チップ。
【請求項１９】
透明基板上に配置した微小電極、
該微小電極上に１細胞が位置するように前記微小電極周囲を覆う細胞非接着性の壁、
前記透明基板上に形成され、前記細胞の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記微小電極の上方に位置した環状の比較電極、および
前記微小電極に接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を備える細胞応答計測要素の複数個が共通の透明基板上に形成された細胞応答計測チップ。
【請求項２０】
前記複数の微小電極と前記比較電極間の位置関係を調整するための手段が付加された請求項１９記載の細胞応答計測チップ。
【請求項２１】
前記細胞非接着性の壁が前記微小電極周囲で複数に区分されたものである請求項１９記載の細胞応答計測チップ。
【請求項２２】
透明基板上に配置した微小電極と該微小電極に接続された引き出し線よりなる導電パターンを複数個備えた多電極基板であって、
前記微小電極と該微小電極に接続された引き出し線なる導電パターンが前記透明基板上の全面に形成された透明電極から前記導電パターンの周辺部を狭い幅でエッチングして形成されたものであるとともに、前記導電パターンを除く透明電極部分を前記複数の導電パターンの共通のグランド層とされる多電極基板。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−２６３８５８（Ｐ２００８−２６３８５８Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１１３２２（Ｐ２００７−１１１３２２）
【出願日】平成１９年４月２０日（２００７．４．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 モデル細胞を用いた遺伝子機能等解析技術開発（研究用モデル細胞の創製技術開発）委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２０日（２００７．４．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 モデル細胞を用いた遺伝子機能等解析技術開発（研究用モデル細胞の創製技術開発）委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]