本発明は、部分的には、細菌病原体の分泌タンパク質及びそれらの使用法に関する。より具体的には、本発明は、Ａ／Ｅ病原体の幾つかの新規な共通の分泌タンパク質を提供する。本発明のある実施形態において、これらのポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子、又は、それらの一部は、Ａ／Ｅ病原体感染に関するワクチン、診断、若しくは、薬剤スクリーニングのツールとして、又は、試薬として有用である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
【請求項２】
配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
【請求項３】
配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
【請求項４】
配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む細胞培養上清を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、前記組成物中に存在する前記細胞のタンパク質の２０％を構成することを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
さらにＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＰ、Ｔｉｒ、志賀毒素１、志賀毒素２、又は、インチミンポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
さらにアジュバントを含むことを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
細菌又はそれらの調製物であって、該細菌が、配列番号１〜２１又は６０〜７２と実質的に同一なヌクレオチド配列の該細菌ゲノムにおける変異を含むことを特徴とする細菌又はそれらの調製物。
【請求項９】
細菌又はそれらの調製物であって、該細菌が、ｎｌｅＡ、ｎｌｅＢ、ｎｌｅＣ、ｎｌｅＤ、ｎｌｅＥ、ｎｌｅＦ、ｎｌｅＧ若しくはｎｌｅＨ、又は、それらの相同体と実質的に同一な遺伝子における変異を含むことを特徴とする細菌又はそれらの調製物。
【請求項１０】
前記細菌が、Ａ／Ｅ病原体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の細菌。
【請求項１１】
前記細菌が、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウム(Citrobacter rodentium)であることを特徴とする請求項８〜１０の何れか一項に記載の細菌。
【請求項１２】
前記ＥＨＥＣが、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７、又は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭであることを特徴とする請求項１１に記載の細菌。
【請求項１３】
前記ＥＰＥＣが、ＥＰＥＣ Ｏ１２７：Ｈ６であることを特徴とする請求項１１に記載の細菌。
【請求項１４】
前記変異が、病原性を減弱させることを特徴とする請求項８〜１３の何れか一項に記載の細菌。
【請求項１５】
請求項８〜１４の何れか一項に記載の前記細菌を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
【請求項１６】
前記細菌が生きていることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細菌が経口投与されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細菌が死滅していることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細菌が非経口投与されることを特徴とする請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
さらにアジュバントを含むことを特徴とする請求項１５〜１９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アジュバントが、水中油型エマルジョン、又は、非水中油型エマルジョンであることを特徴とする請求項７又は２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アジュバントが、ミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドを含むことを特徴とする請求項７又は２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記アジュバントが、乳化剤、ムラミルジペプチド、水性剤、キトサンベース剤、サポニン、油、リポ多糖（ＬＰＳ）、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、細菌複合体、合成オリゴヌクレオチド、及び、脂肪族窒素性塩基（aliphatic nitrogenous base）から成る群より選択される１又はそれ以上の薬剤を含むことを特徴とする請求項７又は２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記乳化剤が、１又はそれ以上の天然乳化剤、合成乳化剤、陰イオン性乳化剤、陽イオン性乳化剤、及び非イオン性剤から成る群より選択されることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記天然乳化剤が、１又はそれ以上のアカシア、ゼラチン、レシチン、及び、コレステロールから成る群より選択されることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記陰イオン性乳化剤が、ラウリン酸のカリウム塩、オレイン酸のカリウム塩、ラウリン酸のナトリウム塩、オレイン酸のナトリウム塩、ラウリン酸のアンモニウム塩、オレイン酸のアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のアルミニウム塩、金属性セッケン、及び、有機スルホン酸塩から成る群の１又はそれ以上より選択されることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記有機スルホン酸塩が、硫酸ラウリルナトリウムであることを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記陽イオン性乳化剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウムであることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記合成乳化剤が、１又はそれ以上のグリセリルエステル、ポリオキシエチレングリコールエステル、ポリオキシエチレングリコールエーテル、及びソルビタン脂肪酸エステルから成る群より選択されることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
前記グリセリルエステルが、モノステアリン酸グリセリルであることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ソルビタン脂肪酸エステルが、モノパルミチン酸ソルビタン、及び、それらのポリオキシエチレン誘導体から成る群の１又はそれ以上より選択されることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ポリオキシエチレン誘導体が、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンであることを特徴とする請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記水性剤が、水酸化アルミニウムであることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項３４】
前記油が、１又はそれ以上のミネラルオイル、野菜油、及び動物油から成る群より選択されることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記野菜油が、１又はそれ以上のアブラナ油、アーモンド油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、及びダイズ油から成る群より選択されることを特徴とする請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記動物油が、１又はそれ以上のタラ肝油、オヒョウ油、ニシン（menhaden）油、オレンジラッフィー油、及びサメ肝油から成る群より選択されることを特徴とする請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アジュバントが、油成分を含むことを特徴とする請求項７又は２０に記載の組成物。
【請求項３８】
前記油成分が、１又はそれ以上の単一の油、及び油（複数）の混合物から成る群より選択されることを特徴とする請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記非水中油型エマルジョンが、１又はそれ以上の油エマルジョン、油中水型エマルジョン、及び水中油中水型エマルジョンから成る群より選択されることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記水中油型エマルジョンが、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）、又はＥＭＵＬＳＩＧＥＮ ＰＬＵＳ（商標）であることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項４１】
前記油が、アンフィゲン（Amphigen）（登録商標）であることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項４２】
前記アジュバントが、放線菌の細胞壁抽出物を含むことを特徴とする請求項７又は２０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記アジュバントが、放線菌のＤＮＡを含むことを特徴とする請求項７又は２０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記アジュバントが、放線菌の細胞壁複合体を含むことを特徴とする請求項７又は２０に記載の組成物。
【請求項４５】
前記脂肪族窒素性塩基（aliphatic nitrogenous bases）が、１又はそれ以上の、アミン、四級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン、及び、チオウロニウムから成る群より選択されることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記脂肪族窒素性塩基が、Ｎ，Ｎ‐ジオクタデシル‐Ｎ，Ｎ‐ビス（２‐ヒドロキシエチル）プロパンジアミンであることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項４７】
前記アジュバントが、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドを含むことを特徴とする請求項７又は２０に記載の組成物。
【請求項４８】
前記アジュバントが、２０％から４０％（ｖ／ｖ）の濃度で前記組成物中に存在することを特徴とする請求項２１〜４７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
試料中のＡ／Ｅ病原体の存在を検出する方法であって、
（ａ）試料を用意し、そして、
（ｂ）配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の１又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子の存在を検出するか、又は、
（ｃ）配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の１又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出するか、又は、
（ｄ）配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の１又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドの存在を検出する
ことを含み、該核酸分子又は該ポリペプチドの存在が、該試料中におけるＡ／Ｅ病原体の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項５０】
前記試料が、糞便又は血液であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記検出が、
ａ）配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群から選択されるヌクレオチド配列、或いは、
ｂ）配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
と実質的に同一なプローブ又はプライマーと、前記ヌクレオチド配列との接触を含むことを特徴とする請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記検出が、前記アミノ酸配列と、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群より選択される配列と特異的に結合する抗体との接触を含むことを特徴とする請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５３】
Ａ／Ｅ病原体又はそれらの構成成分に対する免疫反応を動物において惹起する方法であって、請求項１〜７又は１５〜４８の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、請求項８〜１４の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物に免疫応答を惹起させることを特徴とする方法。
【請求項５４】
動物において、Ａ／Ｅ病原体のコロニー形成（colonization）を減少させる方法であって、請求項１〜７又は１５〜４８の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、請求項８‐１４の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物におけるＡ／Ｅ病原体のコロニー形成を減少させることを特徴とする方法。
【請求項５５】
動物において、Ａ／Ｅ病原体の脱粒（shedding）を減少させる方法であって、請求項１〜７又は１５〜４８の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、請求項８‐１４の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物におけるＡ／Ｅ病原体の脱粒を減少させることを特徴とする方法。
【請求項５６】
前記動物が、反芻動物であることを特徴とする請求項５３〜５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記反芻動物が、ウシ又はヒツジ被検体であることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記動物が、ヒトであることを特徴とする請求項５３〜５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５９】
Ａ／Ｅ病原体による感染を治療又は予防する方法であって、
ａ）Ａ／Ｅ病原体感染を有するか、又はそのリスクのある哺乳動物を同定すること；及び、
ｂ）該哺乳動物に有効量の該Ａ／Ｅ病原体病原性を減少させる化合物を投与すること（但し、該化合物は、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現、分泌又は生物学的活性を抑制する）
を含む方法。
【請求項６０】
前記化合物が、配列番号１〜２１、５９若しくは７３〜８４の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列と相補的なアンチセンス核酸分子であることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記化合物が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる方法であって、
Ａ／Ｅ病原体におけるｎｌｅＡ、ｎｌｅＢ、ｎｌｅＣ、ｎｌｅＤ、ｎｌｅＥ、ｎｌｅＦ、ｎｌｅＧ及びｎｌｅＨから成る群より選択される遺伝子又はそれらの相同体遺伝子の１又はそれ以上を変異させるか、或いは、Ａ／Ｅ病原体のゲノムのヌクレオチド配列（但し、該ヌクレオチド配列は配列番号１‐２１又は６０‐７２から選択される）の１又はそれ以上を変異させることを含み、
それによって病原性を減少させることを特徴とする方法。
【請求項６３】
Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の何れかを含むシステム（系）を用意すること：
（ｉ）配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子
（ｉｉ）配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
（ｉｉｉ）配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）被検化合物を用意すること；並びに、
ｃ）該被検化合物が、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌、又は、生物学的活性を調節するか否かを決定すること（但し、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌又は生物学的活性における変化は、前記Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる化合物を示す）
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
前記システムが、細胞であることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記システムが、試験管内のシステムであることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
Ａ／Ｅ病原体ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）を含む組換え細胞を用意すること、並びに、
（ｉ）配列番号１〜２１又は６０〜７２と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子
（ｉｉ）配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
ｂ）該ポリペプチドの分泌が許容される条件下で該組換え細胞を増殖させること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６８】
前記ポリペプチドの分泌が許容される条件下で前記組換え型細胞を増殖させることを更に含むことを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリペプチドが前記細胞から分泌されることを特徴とする請求項６７又は６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ポリペプチドの単離を更に含むことを特徴とする請求項６７〜６９の何れか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ａ／Ｅ病原体が、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする請求項４９〜７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＥＨＥＣが、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７、又は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭであることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＥＰＥＣが、ＥＰＥＣ Ｏ１２７：Ｈ６であることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む組換え型ポリペプチド。
【請求項７５】
配列番号１〜２１又は６０〜７２の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項７６】
請求項７５に記載の前記ヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項７７】
前記ベクターが、Ａ／Ｅ病原体のゲノム中に組み込み可能であることを特徴とする請求項７６に記載のベクター。
【請求項７８】
前記ベクターが、Ａ／Ｅ病原体のゲノム中に組み込み不能であることを特徴とする請求項７６に記載のベクター。
【請求項７９】
請求項７６〜７８の何れか一項に記載の前記ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項８０】
前記宿主細胞が、Ａ／Ｅ病原体であることを特徴とする請求項７９に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
前記Ａ／Ｅ病原体が、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
Ａ／Ｅ病原体若しくはその成分に対する免疫応答を惹起するための、又は、動物におけるＡ／Ｅ病原体の脱粒若しくはコロニー形成を減少させるための、又は、Ａ／Ｅ病原体による感染を治療若しくは予防するための、薬物調製における、請求項１〜７若しくは１５〜４８の何れか一項に記載の前記組成物、請求項８〜１４の何れか一項に記載の前記細菌、請求項７４に記載の前記ポリペプチド、又は、請求項７５に記載の前記核酸分子の使用。
【請求項８３】
試料中のＡ／Ｅ病原体を検出する試薬、及び試料中の該Ａ／Ｅ病原体の検出に関する使用説明の添付文書と、を含むキット。
【請求項８４】
前記試薬が、
ａ）配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群より選択されるヌクレオチド配列、或いは、
ｂ）配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
と実質的に同一なプローブ又はプライマーを含むことを特徴とする請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
前記試薬が、配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群より選択される配列に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする請求項８３に記載のキット。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図２Ｇ】

【図２Ｈ】

【図２Ｉ】

【図２Ｊ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図４Ｆ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図５Ｆ】

【図５Ｇ】

【図５Ｈ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図６Ｆ】

【図６Ｇ】

【図６Ｈ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２５Ａ】

【図２５Ｂ】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【公表番号】特表２００７−５３１５１１（Ｐ２００７−５３１５１１Ａ）
【公表日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３７０２２（Ｐ２００６−５３７０２２）
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００１８９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４２７４６
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０３２６５０９４）ザ　ユニバーシティ　オブ　ブリティッシュ　コロンビア (17)
【出願人】（５０６１５０２４９）ウニベルシダッド　ナシオナル　アウトノマ　デ　メヒコ (2)
【Ｆターム（参考）】