組織保護サイトカイン受容体複合体、組織保護化合物を同定するアッセイおよびそれらの使用
この発明は、組織保護活性を仲介するヘテロ多量体受容体複合体を用いて、組織保護活性を有する化合物を同定する方法に関する。この複合体は、少なくとも１つのβc受容体と複合した少なくとも１つのEPO-Rから構成される。組織保護化合物を同定するアッセイに使用するこれらの化合物には、限定されるものでないが、小分子と生物学的分子が含まれる。これらのアッセイを利用して同定される化合物を用いて、中枢および末梢神経系ならびに他のエリスロポエチン応答性もしくは興奮性細胞、組織、および器官の様々な疾患、障害、または症状を治療または予防することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させるステップ；
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を、試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を測定することにより測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験化合物を標識しかつ標識した試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を試験化合物に結合した標識を検出することにより測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を、試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を測定することにより測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させるステップ；および
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して組織保護サイトカイン受容体複合体活性を増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項６】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を細胞増殖アッセイにより測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が遺伝子組換え操作されて少なくとも１つのEPOまたはβ共通受容体を発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、内在的にEPO受容体を発現し、そして(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が内在的にβ共通受容体を発現し、そして(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)EPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が前記細胞と同じ種に由来する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、遺伝子組換え操作されてEPO受容体を発現する細胞と接触させるステップであって、該細胞が(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されるステップ；
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)対照細胞で測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して、細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少する試験化合物を同定するステップであって、対照細胞がステップ(a)の細胞と同じ細胞型でありかつ(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されないステップ；および
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１２】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、β共通受容体を発現する遺伝子組換え細胞と接触させるステップであって、該細胞が(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)EPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されるステップ；
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)対照細胞で測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して、細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少する試験化合物を同定するステップであって、対照細胞がステップ(a)の細胞と同じ細胞型でありかつ(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されないステップ；および
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１３】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体活性と関連する調節エレメントと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させるステップ；
(b)試験化合物の不在のもとで測定したレポーター遺伝子発現のレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現のレベルを増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；および
(c)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１４】
調節エレメントが血清応答エレメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、(i)転写アクチベーターのDNA結合ドメインに特異的な結合部位と機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子を含む核酸配列；
(ii)(A)転写アクチベーターのDNA結合ドメインと(B)第１の組織保護サイトカイン受容体ポリペプチドまたはその断片を含む第１の融合タンパク質；および
(iii)(A)転写アクチベーターの活性化ドメインと(B)第２の組織保護サイトカイン受容体を含む第２の融合タンパク質；を含む細胞と接触させるステップ；ならびに
(b)レポーター遺伝子発現を検出するステップを含んでなり、
もし(b)のレポーター遺伝子発現が試験化合物不在のもとで検出したレポーター遺伝子発現と比較して異なれば、組織保護活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項１６】
細胞が原核生物細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が真核生物細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
真核生物細胞がヒト細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が組織保護サイトカイン受容体複合体の少なくとも１つの受容体を内在的に発現する、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がBaF3細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、(i)組織保護サイトカイン受容体複合体応答性プロモーターと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子をコードしかつ(ii)組織保護サイトカイン受容体複合体を発現するヌクレオチド配列を含有する改変された酵母株の細胞と接触させるステップ；ならびに
(b)レポーター遺伝子発現のレベルを測定することにより組織保護サイトカイン受容体複合体の活性のレベルを決定するステップを含んでなり、
もし該化合物の存在のもとでのレポーター遺伝子活性のレベルが、該化合物の不在のもとでのレポーター遺伝子活性のレベルと比較して増加または減少すれば、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２２】
組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定する方法であって、(a)結合を誘導する条件下で、組織保護サイトカイン受容体複合体を(i)第１標識を結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドおよび(ii)第２標識を結合した試験化合物の当量と接触させるステップ；(b)未結合の物質を組織保護サイトカイン受容体複合体から除去するステップ、ならびに(c)第１および第２標識のレベルを検出するステップを含んでなり、
ここで、もし第２標識が存在して該化合物が該複合体と結合すれば、ならびに、もし第１標識のレベルが、結合を誘導する条件下で試験化合物の不在のもとで標識リガンドを組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させた場合における未結合物質を除去した後の第１標識のレベルと比較して減少すれば、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物が同定される上記方法
【請求項２３】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを組織保護サイトカイン受容体複合体と、１以上の試験化合物の存在のもとで、結合を誘導する条件下で接触させるステップ；および
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体と結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量を測定するステップを含んでなり；
もし(b)で測定した結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量が、１以上の試験化合物の不在のもとで測定した結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量と異なれば、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２４】
結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンド特異的抗体を用いて測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを標識し、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに結合した標識を検出することにより測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを標識し、標識したリガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに結合した標識を検出することにより測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
標識が蛍光である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの間の相互作用をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)組織保護サイトカイン受容体複合体を1種以上の試験化合物と接触させるステップ、および、
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体活性を測定するステップを含んでなり、
もし(b)で測定した活性が、１以上の試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性と異なれば、組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの間の相互作用をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２９】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を細胞増殖または細胞分化により測定する、請求項１、５、１１、１２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
測定される組織保護サイトカイン受容体複合体活性が組織保護サイトカイン受容体複合体の組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと相互作用する能力である、請求項１、５、１１、１２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
同定した化合物を組織保護活性についてアッセイするステップが細胞内のヌクレオリンの存在を検出することを含む、請求項１、５、１１、１２、１３、２２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
同定した化合物を組織保護活性についてアッセイするステップが細胞内のニューログロビンまたはサイトグロビンの活性レベルの増加を検出または測定するステップを含む、請求項１、５、１１、１２、１３、２２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
組織保護サイトカイン受容体複合体が溶液中にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
組織保護サイトカイン受容体複合体が細胞中にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を阻害する、請求項２３または２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を増強する、請求項２３または２８１項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ(a)で接触させる組織保護サイトカイン受容体複合体が細胞表面上にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
組織保護サイトカイン受容体複合体が単離された細胞膜上にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
組織保護サイトカイン受容体複合体が固体表面に固定化されている、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
固体表面がマイクロタイターディッシュである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
固体表面がチップである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、リガンドが結合している組織保護受容体複合体断片と接触させるステップであって、該組織保護受容体複合体断片が固体支持体に結合したFcフラグメントと融合した少なくとも１つのEPO受容体細胞外ドメインおよび少なくとも１つのβ共通受容体細胞外ドメインを含むステップ；および
(b)未結合の試験化合物を固体支持体から除去するステップ；
(c)組織保護サイトカイン受容体複合体断片と結合した化合物を同定するステップを含んでなり、ここで、固体支持体と結合した化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物として同定する上記方法。
【請求項４３】
試験化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体である、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
試験化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに特異的な抗体である、請求項１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
試験化合物が小分子である、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
試験化合物がペプチドである、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
試験化合物がライブラリーのメンバーである、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドがEPOである、請求項１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する、請求項１、５、１１、１２、１３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと結合する、請求項１６、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
哺乳動物において組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)傷害を加えた直後に第１動物に該化合物を投与するステップであって、ここで第１動物は内在的に組織保護サイトカイン受容体複合体を発現するステップ、および
(b)該化合物をステップ(a)と同じ傷害を加えた直後に第２動物に投与するステップであって、ここで第２動物は組織保護サイトカイン受容体複合体を発現しないステップを含んでなり、
もし傷害からの回復がステップ(b)の動物と比較してステップ(a)の動物において異なれば、組織保護活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法
【請求項５２】
ヒトの疾患または障害を治療または予防する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物の治療上有効な量を、かかる治療または予防を必要とするヒトに投与することを含む、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５３】
前記疾患または障害が興奮組織を冒す疾患または障害である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ヒトにおいて興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物の治療上有効な量を、それを必要とするヒトに投与することを含んでなり、ここで該興奮細胞、組織または器官の機能の増強は連合学習または記憶の増強をもたらす、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５５】
該ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする方法であって、該複合体の活性をモジュレートする化合物を、かかる治療または予防を必要とするヒトに投与することを含む、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５６】
ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートすることを含んでなる、ヒトの疾患また障害を治療または予防する方法。
【請求項５７】
ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートすることを含んでなる、ヒトの興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法。
【請求項５８】
前記化合物を請求項１〜５、１１〜１５、２１〜２３、２８、および４２のいずれか１項に記載の方法により同定する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物が抗体組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに特異的な抗体である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記化合物が小分子、ペプチド、またはライブラリーのメンバーである、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を増強する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を妨害する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記化合物をEPOと一緒に投与する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記疾患または障害が気分障害、不安障害、うつ病、自閉症、注意欠陥多動性障害、アルツハイマー病、加齡または認知機能不全である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患または障害が低酸素、発作障害、神経変性疾患、神経毒中毒、多発性硬化症、低血圧、心停止、照射、または低血糖症が原因である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記疾患または障害が虚血または脳卒中である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患または障害が神経変性症状である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
神経変性症状が脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性麻痺、脳または脊髄外傷、AIDS痴呆、加齢に関係する認知機能の喪失、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、発作障害、アルコール中毒、加齢、またはニューロンの喪失である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患または障害が神経筋または筋肉症状である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
神経筋または筋肉症状が心臓組織のものである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患または障害が心臓のものである、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患または障害がうっ血性心不全、冠動脈疾患、虚血、心筋梗塞
狭心症、先天性心疾患、プリンズメタル型狭心症、心臓破裂、脈管炎、不整脈、頻脈-徐脈不整脈、上室性、心室性伝導異常、心筋炎、肺性心、または鈍傷および穿通外傷である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患または障害が眼のものである、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患または障害が視神経炎、鈍傷および穿通損傷、感染、サルコイド、鎌状赤血球症、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、黄斑変性症、網膜色素変性症、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧、糖尿病性網膜症、および黄斑浮腫である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
興奮組織が中枢神経系組織または末梢神経系組織である、請求項５４または５７に記載の方法。
【請求項７８】
末梢神経系組織が胎盤組織、網膜組織、または心臓組織である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
投与が経口、局所、頭蓋内、管内、吸入、非経口、静脈内、末梢、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、粘膜下または皮内投与である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
投与を医療、外科、または自然処置に先立って行う、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
外科処置が腫瘍切除、動脈瘤修復、または冠動脈バイパス処置である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
医療処置が化学療法である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
自然処置が分娩または娩出である、請求項８０に記載の方法。
【請求項１】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させるステップ；
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を、試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を測定することにより測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験化合物を標識しかつ標識した試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を試験化合物に結合した標識を検出することにより測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を、試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を測定することにより測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させるステップ；および
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して組織保護サイトカイン受容体複合体活性を増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項６】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を細胞増殖アッセイにより測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が遺伝子組換え操作されて少なくとも１つのEPOまたはβ共通受容体を発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、内在的にEPO受容体を発現し、そして(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が内在的にβ共通受容体を発現し、そして(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)EPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が前記細胞と同じ種に由来する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、遺伝子組換え操作されてEPO受容体を発現する細胞と接触させるステップであって、該細胞が(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されるステップ；
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)対照細胞で測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して、細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少する試験化合物を同定するステップであって、対照細胞がステップ(a)の細胞と同じ細胞型でありかつ(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されないステップ；および
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１２】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、β共通受容体を発現する遺伝子組換え細胞と接触させるステップであって、該細胞が(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)EPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されるステップ；
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)対照細胞で測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して、細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少する試験化合物を同定するステップであって、対照細胞がステップ(a)の細胞と同じ細胞型でありかつ(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されないステップ；および
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１３】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体活性と関連する調節エレメントと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させるステップ；
(b)試験化合物の不在のもとで測定したレポーター遺伝子発現のレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現のレベルを増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；および
(c)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１４】
調節エレメントが血清応答エレメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、(i)転写アクチベーターのDNA結合ドメインに特異的な結合部位と機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子を含む核酸配列；
(ii)(A)転写アクチベーターのDNA結合ドメインと(B)第１の組織保護サイトカイン受容体ポリペプチドまたはその断片を含む第１の融合タンパク質；および
(iii)(A)転写アクチベーターの活性化ドメインと(B)第２の組織保護サイトカイン受容体を含む第２の融合タンパク質；を含む細胞と接触させるステップ；ならびに
(b)レポーター遺伝子発現を検出するステップを含んでなり、
もし(b)のレポーター遺伝子発現が試験化合物不在のもとで検出したレポーター遺伝子発現と比較して異なれば、組織保護活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項１６】
細胞が原核生物細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が真核生物細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
真核生物細胞がヒト細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が組織保護サイトカイン受容体複合体の少なくとも１つの受容体を内在的に発現する、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がBaF3細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、(i)組織保護サイトカイン受容体複合体応答性プロモーターと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子をコードしかつ(ii)組織保護サイトカイン受容体複合体を発現するヌクレオチド配列を含有する改変された酵母株の細胞と接触させるステップ；ならびに
(b)レポーター遺伝子発現のレベルを測定することにより組織保護サイトカイン受容体複合体の活性のレベルを決定するステップを含んでなり、
もし該化合物の存在のもとでのレポーター遺伝子活性のレベルが、該化合物の不在のもとでのレポーター遺伝子活性のレベルと比較して増加または減少すれば、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２２】
組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定する方法であって、(a)結合を誘導する条件下で、組織保護サイトカイン受容体複合体を(i)第１標識を結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドおよび(ii)第２標識を結合した試験化合物の当量と接触させるステップ；(b)未結合の物質を組織保護サイトカイン受容体複合体から除去するステップ、ならびに(c)第１および第２標識のレベルを検出するステップを含んでなり、
ここで、もし第２標識が存在して該化合物が該複合体と結合すれば、ならびに、もし第１標識のレベルが、結合を誘導する条件下で試験化合物の不在のもとで標識リガンドを組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させた場合における未結合物質を除去した後の第１標識のレベルと比較して減少すれば、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物が同定される上記方法
【請求項２３】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを組織保護サイトカイン受容体複合体と、１以上の試験化合物の存在のもとで、結合を誘導する条件下で接触させるステップ；および
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体と結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量を測定するステップを含んでなり；
もし(b)で測定した結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量が、１以上の試験化合物の不在のもとで測定した結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量と異なれば、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２４】
結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンド特異的抗体を用いて測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを標識し、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに結合した標識を検出することにより測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを標識し、標識したリガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに結合した標識を検出することにより測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
標識が蛍光である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの間の相互作用をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)組織保護サイトカイン受容体複合体を1種以上の試験化合物と接触させるステップ、および、
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体活性を測定するステップを含んでなり、
もし(b)で測定した活性が、１以上の試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性と異なれば、組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの間の相互作用をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２９】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を細胞増殖または細胞分化により測定する、請求項１、５、１１、１２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
測定される組織保護サイトカイン受容体複合体活性が組織保護サイトカイン受容体複合体の組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと相互作用する能力である、請求項１、５、１１、１２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
同定した化合物を組織保護活性についてアッセイするステップが細胞内のヌクレオリンの存在を検出することを含む、請求項１、５、１１、１２、１３、２２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
同定した化合物を組織保護活性についてアッセイするステップが細胞内のニューログロビンまたはサイトグロビンの活性レベルの増加を検出または測定するステップを含む、請求項１、５、１１、１２、１３、２２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
組織保護サイトカイン受容体複合体が溶液中にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
組織保護サイトカイン受容体複合体が細胞中にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を阻害する、請求項２３または２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を増強する、請求項２３または２８１項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ(a)で接触させる組織保護サイトカイン受容体複合体が細胞表面上にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
組織保護サイトカイン受容体複合体が単離された細胞膜上にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
組織保護サイトカイン受容体複合体が固体表面に固定化されている、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
固体表面がマイクロタイターディッシュである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
固体表面がチップである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、リガンドが結合している組織保護受容体複合体断片と接触させるステップであって、該組織保護受容体複合体断片が固体支持体に結合したFcフラグメントと融合した少なくとも１つのEPO受容体細胞外ドメインおよび少なくとも１つのβ共通受容体細胞外ドメインを含むステップ；および
(b)未結合の試験化合物を固体支持体から除去するステップ；
(c)組織保護サイトカイン受容体複合体断片と結合した化合物を同定するステップを含んでなり、ここで、固体支持体と結合した化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物として同定する上記方法。
【請求項４３】
試験化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体である、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
試験化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに特異的な抗体である、請求項１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
試験化合物が小分子である、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
試験化合物がペプチドである、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
試験化合物がライブラリーのメンバーである、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドがEPOである、請求項１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する、請求項１、５、１１、１２、１３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと結合する、請求項１６、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
哺乳動物において組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)傷害を加えた直後に第１動物に該化合物を投与するステップであって、ここで第１動物は内在的に組織保護サイトカイン受容体複合体を発現するステップ、および
(b)該化合物をステップ(a)と同じ傷害を加えた直後に第２動物に投与するステップであって、ここで第２動物は組織保護サイトカイン受容体複合体を発現しないステップを含んでなり、
もし傷害からの回復がステップ(b)の動物と比較してステップ(a)の動物において異なれば、組織保護活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法
【請求項５２】
ヒトの疾患または障害を治療または予防する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物の治療上有効な量を、かかる治療または予防を必要とするヒトに投与することを含む、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５３】
前記疾患または障害が興奮組織を冒す疾患または障害である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ヒトにおいて興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物の治療上有効な量を、それを必要とするヒトに投与することを含んでなり、ここで該興奮細胞、組織または器官の機能の増強は連合学習または記憶の増強をもたらす、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５５】
該ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする方法であって、該複合体の活性をモジュレートする化合物を、かかる治療または予防を必要とするヒトに投与することを含む、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５６】
ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートすることを含んでなる、ヒトの疾患また障害を治療または予防する方法。
【請求項５７】
ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートすることを含んでなる、ヒトの興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法。
【請求項５８】
前記化合物を請求項１〜５、１１〜１５、２１〜２３、２８、および４２のいずれか１項に記載の方法により同定する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物が抗体組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに特異的な抗体である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記化合物が小分子、ペプチド、またはライブラリーのメンバーである、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を増強する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を妨害する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記化合物をEPOと一緒に投与する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記疾患または障害が気分障害、不安障害、うつ病、自閉症、注意欠陥多動性障害、アルツハイマー病、加齡または認知機能不全である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患または障害が低酸素、発作障害、神経変性疾患、神経毒中毒、多発性硬化症、低血圧、心停止、照射、または低血糖症が原因である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記疾患または障害が虚血または脳卒中である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患または障害が神経変性症状である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
神経変性症状が脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性麻痺、脳または脊髄外傷、AIDS痴呆、加齢に関係する認知機能の喪失、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、発作障害、アルコール中毒、加齢、またはニューロンの喪失である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患または障害が神経筋または筋肉症状である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
神経筋または筋肉症状が心臓組織のものである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患または障害が心臓のものである、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患または障害がうっ血性心不全、冠動脈疾患、虚血、心筋梗塞
狭心症、先天性心疾患、プリンズメタル型狭心症、心臓破裂、脈管炎、不整脈、頻脈-徐脈不整脈、上室性、心室性伝導異常、心筋炎、肺性心、または鈍傷および穿通外傷である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患または障害が眼のものである、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患または障害が視神経炎、鈍傷および穿通損傷、感染、サルコイド、鎌状赤血球症、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、黄斑変性症、網膜色素変性症、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧、糖尿病性網膜症、および黄斑浮腫である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
興奮組織が中枢神経系組織または末梢神経系組織である、請求項５４または５７に記載の方法。
【請求項７８】
末梢神経系組織が胎盤組織、網膜組織、または心臓組織である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
投与が経口、局所、頭蓋内、管内、吸入、非経口、静脈内、末梢、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、粘膜下または皮内投与である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
投与を医療、外科、または自然処置に先立って行う、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
外科処置が腫瘍切除、動脈瘤修復、または冠動脈バイパス処置である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
医療処置が化学療法である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
自然処置が分娩または娩出である、請求項８０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００６−５２４８２７（Ｐ２００６−５２４８２７Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１３３９８（Ｐ２００６−５１３３９８）
【出願日】平成１６年４月２６日（２００４．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３０９９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６１４８
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５０１４０１５８２）ザ ケネス エス．ウォーレン インスティテュート，インコーポレーテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月２６日（２００４．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３０９９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６１４８
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５０１４０１５８２）ザ ケネス エス．ウォーレン インスティテュート，インコーポレーテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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