肺炎球菌血清型
血清型６Ｃと命名されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの新しく新興の血清型、およびそれを同定するのに有用なアッセイ方法およびモノクローナル抗体が開示される。また、反復単位｛→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→リン酸｝を持つ新規な肺炎球菌多糖体が開示される。この新しい血清型は肺炎球菌ワクチンに含まれ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌学、免疫学および疫学に関する。より詳細には、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の新しい新興の血清型、ならびにこれらの血清型を同定するのに有用なアッセイ方法およびモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
（連邦政府支援研究の記載）
本発明は、部分的に、ＮＩＨ助成金番号ＡＩ ３００２１下、米国連邦政府によって資金供給された。従って、連邦政府は本発明においてある種の権利を有し得る。
【０００３】
（関連出願）
本願は、２００５年１２月２８日付で出願された米国仮特許出願第６０／７５４,３５４号および２００５年４月２８日付で出願された米国仮特許出願第６０／７９６,１３９号に関連し、それらの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００４】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、主として幼児および高齢者間の肺炎、髄膜炎、中耳炎ならびに敗血症についてのよく知られているヒト病原菌および主要な病原体である。ストレプトコッカス・ニューモニエは、血清学的に別個の炭水化物莢膜のその発現に基づいて９０種の血清型に分類されている。莢膜多糖体（ＰＳ）に対する抗体は、同一莢膜血清型を発現する肺炎球菌に対する防御を提供し得る。現在利用可能な肺炎球菌ワクチンは、複数の血清型の莢膜ＰＳの混合物を含む。例えば、ある肺炎球菌ワクチン（ＰＳワクチンと呼ばれる）は、２３種の一般的に見出された血清型からの莢膜ＰＳを含む。最も最近開発されたタイプのワクチン（共役ワクチンと呼ばれる）は、蛋白質分子に結合する７〜１３種の血清型からの莢膜ＰＳを含む。７価結合型ワクチンは、米国における臨床使用のために２０００年に導入され、小児および成人における侵襲性肺炎球菌疾病の発生率を低下させた。
【０００５】
肺炎球菌血清型の分布は、ワクチン効力を見積るのに有用である。理想的には、有効な肺炎球菌ワクチンは、ワクチンに含まれた血清型を発現する肺炎球菌の有病率を低下させ、非ワクチン血清型を発現する肺炎球菌の有病率を同じままとする。実際には、非ワクチンタイプを発現する肺炎球菌の有病率は、ワクチン血清型を発現するものに置き換わるように増加する。さらに、特定の血清型の有病率は、知られていない理由のために経時的に変化し得る。結果的に、肺炎球菌単離物の正確でかつ効率的な血清型別は肺炎球菌ワクチンの効力をモニターするのに重要である。実際には、新興の肺炎球菌血清型の同定は、公衆衛生における非常に重要な目標のままである。
【０００６】
そのためには、現在のポリクローナル抗体が肺炎球菌血清型を同定およびモニタリングするのに有用であるが、モノクローナル抗体技術を利用し得る改善された同定アッセイ方法についての必要性、ならびに新しい血清型を同定する必要性が残っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は細菌学、免疫学および疫学に関する。より詳細には、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエの新しい新興の血清型、ならびにこれらの血清型を同定するのに有用なアッセイ方法およびモノクローナル抗体に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に示した具体例は、新しい新興の肺炎球菌血清型の同定およびそれを同定するための手段を提供する。より詳細には、本発明は、血清型６Ａβまたは６Ｃ（それらは同義である）として本明細書に同定された、血清型６Ａと密接に関係する新規な肺炎球菌血清型を提供する。
【０００９】
さらなる要旨は、ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃと命名された細菌の単離培養物を提供することである。
【００１０】
もう一つの具体例は、反復単位｛→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→リン酸｝を持つ新規な多糖体を提供する。
【００１１】
もう一つの要旨は、新興の肺炎球菌血清型を同定するのに有用なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を提供することである。かくして、本発明は、本明細書でｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ３、ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ６およびｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＧｌと同定された血清型６Ｃを識別するのに有用なモノクローナル抗体を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（図面の簡潔な記載）
図１は、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。肺炎球菌の溶解物の希釈（Ｘ軸）に対する結合した抗体（Ｙ軸）。溶解物は、２つの６Ａβ単離物（連続線の黒記号）、３つの６Ａα単離物（点線の白記号）および２つの６Ｂ単離物（破線の連絡線）を含む。アッセイに用いた抗体は、Ｈｙｐ６ＡＧｌ（パネルＡ）、Ｈｙｐ６ＡＭ３（パネルＢ）、ウサギプール血清Ｑ（パネルＣ）およびウサギ「因子６ｂ」血清（パネルＤ）であった。
【００１３】
図２は、種々の肺炎球菌でのオプソニン化アッセイデータを示す。オプソニン化アッセイ反応の始めに反応ウェルに添加された細菌のパーセンテージとして測定された生存細菌数（Ｙ軸）を、オプソニン化貪食作用死滅アッセイに用いたヒト血清の希釈（Ｘ軸）に対してプロットした。そのアッセイは種々の肺炎球菌を用い、６Ｂ単離物（白丸）、２つの６Ａα単離物（白四角、白三角）、および７つの６Ａβ単離物（破線で連結されたデータポイント）を含む。７つの６Ａβ単離物は、ブラジル、韓国および米国からのものを含む。
【００１４】
図３は、オプソニン化力価比較を示す。６Ａ亜型に対するオプソニン化力価（Ｙ軸）−対−６Ｂ血清型に対するオプソニン化力価（Ｘ軸）。円および三角形は、各々、６Ａαまたは６Ａβに対するオプソニン化力価を示す。この試験は、ワクチン接種しなかった２０名の成人（左パネル）、あるいは結合型ワクチン（黒記号）または２３価多糖体ワクチン（白記号）でワクチン接種した２０名の成人（右パネル）からの血清を用いた。各ワクチン群は１０名であった。アッセイの検出限界は４であり、検出できないオプソニン化力価を持つ試料を２の力価を有するように割り当てた。１つのスポットに複数データポントが存在した場合に、データポイントは人為的に広げて、データポイント数を示した。
【００１５】
図４は、種々の肺炎球菌単離物からの一部のｗｃｉＰ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【００１６】
図５は、９つの６Ａα単離物（レーン１〜９）および６つの６Ａβ単離物（レーン１０〜１５）で得られたＰＣＲ生成物を示すアガロースゲルの写真である。Ｍとマークされた２つのレーンに、ＤＮＡサイズマーカーを負荷した。２つのレーンは、ゲルの右側における分子が左側のものより速く移動したことを示す。肺炎球菌のＰＣＲ生成物の上下の２本のマーカーバンドは、各々、２.０３６ｋｂおよび１.６３６ｋｂ長である。６Ａαおよび６Ａβは、各々、約２ｋｂおよび１.８ｋｂ長であったＰＣＲ生成物を生じた。
【００１７】
図６は、単離物ＡＡＵ９（中央バー）およびＳＴ７４５（２つのパーツでの底部バー）の肺炎球菌莢膜遺伝子座のｗｃｈＡ、ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯ領域のダイアグラムを示す。比較のために、上部バーは、ＣＲ９３１６３８（ＧｅｎＢａｎｋ受入れ）に基づいた肺炎球菌莢膜遺伝子座のｗｃｈＡ、ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯ領域のダイアグラムを示す。遺伝子ｗｃｈＡ、ｗｃｉＮおよびｗｃｉＯは、それらの長さと共に上部バーの上に標識されている。ヌクレオチド配列の位置は上部バーの下に示され、本明細書に示した配列位置１は、ＣＲ９３１６３８の４９０２の配列位置に対応する。ＳＴ７４５株配列は１９３塩基対短く、その不足は２３９８および２５９１位間のギャップとして示された。
【００１８】
図７は、過ヨウ素酸塩処理前後の６Ａα（上部）および６Ｃ（６Ａβ、底部）からの莢膜ＰＳの炭水化物組成物（パネルＡ）を示す。単糖体は上部のクロマトグラムにおいて同定される。このＧＬＣ分析において、単糖体は、特有の保持時間および相対的比率を持つ複数のピークを生成できる。例えば、ガラクトースは、３つのピーク：第１のピーク（短い）、第２のピーク（最高）および第３のピーク（中間）を有するであろう。パネルＢは、６Ａα（灰色バー）および６Ｃ（６Ａβ、黒色バー）についての各単糖体の標準化されたピーク面積を示す。各ＰＳからのすべての単糖体のピーク面積は、関連するラムノースのピーク面積に標準化されている。６Ｃ（６Ａβ）はガラクトースピークを示さないが、６Ａαが示す２倍のグルコースを有する。
【００１９】
図８は、６Ａα（パネルＡ）および６Ａβ（パネルＢ）の反復単位およびそれらの娘イオン（各々、パネルＣおよびＤ）の質量スペクトルを示す。質量電荷比（ｍ／ｚ）は、２つの小数点に丸められた。
【００２０】
図９は、酸化および還元（パネルＡ）後の６ＡβＰＳの反復単位およびそれらの娘イオン（パネルＢおよびＣ）の質量スペクトルを示す。パネルＢに用いた試料は、ＮａＢＨ４で還元し、パネルＣについてのそれはＮａＢＤ４で還元した。質量電荷比（ｍ／ｚ）は、２つの小数点に丸められた。（パネルＢおよびＣにおける）ＲｌおよびＲ２は、ピークが逆断片化によって誘導されたイオンに対応することを示す。デルタ記号に続く数は、ピーク間のｍ／ｚ単位の差を示し、フラグメントの名称と一体にした。パネルＣにおける全ピークは、パネルＢにおいて再生されず、汚染物質で有り得る１３６.９８のピークを除いてパネルＢにおけるピークに対応する。
【００２１】
図１０は、６Ｃ莢膜多糖体の提唱された化学構造およびその切断生成物の構造を示す。その６Ｃの反復単位の提唱された構造を、パネルＣに示す。パネルＡおよびＢは、リン酸基がリビトールに結合されている場合およびホスホジエステルがグルコース１の第２の炭素に連結される場合の可能な分子イオンを示す。パネルＤ、ＥおよびＦは、ホスホジエステルがグルコース１の第２の炭素（パネルＤ）、第４の炭素（パネルＥ）または第６の炭素（パネルＦ）に連結される場合の反復単位の潜在的な切断パターンを示す。水和形態が示され、水和に関与する残基は、括弧内に示される。過ヨウ素酸塩感受性部位は太字で示され、切断生成物はパネルＡおよびＦに示される。潜在的な分子イオンはそれらの原子質量単位と共に矢印を持つ点線で示される。ＧｘおよびＧｙは潜在的なグルコース１フラグメントであり、Ｒｘは、酸化および還元反応後に残るリボースフラグメントである。それらの原子質量単位は括弧内に示される。
【００２２】
図１１．この図はｗｃｉＮ領域交換実験ダイアグラムを示す：工程Ａにおいて、ＴＩＧＲ６Ａ４のｗｃｈＡ／ｗｃｉＮα／ｗｃｉＯ−Ｐ領域はカセット１と置換された。カセット１は３つのパーツ（中核および２つのフランキング領域）を有し、各パーツは約１ｋｂ長である。中核は抗生物質感受性遺伝子のｋａｎＲおよびｒｐｓＬ＋を有する。２つのフランキング領域はＡＡＵ３３株からのｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ−Ｐ領域で調製された。工程Ｂにおいて、ＴＩＧＲ６ＡＸ中のカセット１は、カセット２と置換された。カセット２は、６Ｃ株（ＣＨＰＡ３８８）からのｗｃｉＮβ遺伝子、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ−Ｐ領域を有する。ＴＩＧＲ６Ｃ４は、カセット２が挿入された後得られる最終産物を示す。遺伝子操作を単純化するために導入したＰＣＲプライマー中のＸｂａｌおよびＢａｍＨＩの部位を示した。
【００２３】
図１２は、６Ａおよび６Ｃの単離物のｗｃｉＮ領域のＰＣＲ生成物の電気泳動パターンを示す。ＰＣＲに用いたプライマーは、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ遺伝子に各々位置する５１０６および３１０１であった。Ｍでマークしたレーンは、ＤＮＡラダーを有する。２０００および１６５０ｂｐを持つ標準マーカーを左に示した。レーン１−１３は、６Ｃ単離物のＰＣＲ生成物を含み、それらは、ＣＨＰＡ３７（レーン１）、ＣＨＰＡ３８８（レーン２）、ＢＧ２１９７（レーン３）、ＢＺ１７（レーン４）、ＢＺ３９（レーン５）、ＢＺ８６（レーン６）、ＢＺ６５０（レーン７）、ＫＫ１７７（レーン８）、ＣＨ６６（レーン９）、ＣＨ１５８（レーン１０）、ＣＨ１９９（レーン１１）、ＭＸ−６７（レーン１２）およびＡＣＡ−Ｃ２１（レーン１３）である。レーン１４−１８は、６Ａ単離物のＰＣＲ生成物を含み、それらは、ＣＨＰＡ６７（レーン１４）、ＣＨＰＡ７８（レーン１５）、ＢＺ６５２（レーン１６）、ＫＫ５８（レーン１７）およびＡＡＵ３３（レーン１８）である。
【００２４】
図１３は、ｗｃｈＡの３’末端およびｗｃｉＯ遺伝子の５’末端のヌクレオチド配列と共にｗｃｉＮβＯＲＦのヌクレオチド配列を示す。ｗｃｉＮβＯＲＦの潜在的なアミノ酸配列をヌクレオチド配列下に示す。また、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＮβの推定終止部位ならびにｗｃｉＮβおよびｗｃｉＯ遺伝子の推定開始部位を示す。ｗｃｉＯ遺伝子は、２つの潜在的な開始部位を有する。
【００２５】
図１４は、６Ａ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＲ９３１６３８）および６Ｂ株（ＣＨＰ Ａ３８８）のｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβ領域のＤＮＡ配列を示す。ｗｃｉＮ（約９００−１１１０塩基）の非相同性中央領域の配列を示していない。ＰＣＲプライマー（５１０６、３１０１、５１１４および３１１３）の部位を示す。また、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＮβの潜在的な終止部位；およびｗｃｉＮβおよびｗｃｉＯの潜在的な開始部位を示す。
【００２６】
図１５は、６Ａおよび６Ｃの単離物のｗｃｉＮ遺伝子を囲む莢膜遺伝子座の遺伝子地図を示す。地図はｗｃｈＡ（斜線）、ｗｃｉＮ（水平バーまたは黒色）、ｗｃｉＯ（格子縞模様）およびｗｃｉＰ（波状）遺伝子を示す。６Ａ座は、ｗｃｉＮα遺伝子に上流（９５塩基長）および下流（３１２塩基長）に２つの予期しないＤＮＡ断片（矢印で示す）を有する。ｗｃｉＯ遺伝子についての代替的な開始部位は、その示された開始部位（６Ａにつき２７２１位）に対して３２塩基上流である。６Ｃ単離物について、ｗｃｉＮα領域における古いＤＮＡ（１２２２塩基、水平バーの領域）は、新しいＤＮＡ（１０２９塩基、黒色領域）と置換される。置換は、１１２５塩基を有する新しいＯＲＦ（ｗｃｉＮβと命名された）を創製する。
【００２７】
図１６は、６Ａ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＲ９３１６３８）および６Ｃ株（ＣＨＰ Ａ３８８）の莢膜遺伝子座を示す。莢膜合成に関与するすべてのＯＲＦは、水平の矢印として示され、それらの方向は転写の配向を示す。６Ａおよび６Ｃの座の双方について、推定転写開始部位（曲った矢印）および推定終止部位（黒丸を含む縦線）を同定する。「トランスポサーゼ」配列（「ｔｎｐ」と標識されたブラックボックス）は莢膜遺伝子座の両末端で見出される。
【００２８】
図１７は、６Ｃの血清型（単離物ＣＨＰＡ３８８）莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列を示す。
【００２９】
（発明の詳細な記載）
本発明は、本明細書に記載された特定の方法、プロトコールおよび試薬等に制限されず、それ自体が変化し得ると理解されるべきである。本明細書に用いた用語は、特定の具体例だけを記載するためのもので、特許請求の範囲により単に規定される本発明の範囲を制限するように意図するものではない。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲に用いた単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に特記しない限りは、複数の参照を含む。かくして、例えば、抗体に対する参照は、当業者に知られていた等価物を含めた１以上のかかる抗体に対する参照である。操作例以外のまたは特記する場合の本明細書に用いた成分または反応条件の量を示す全ての数は、「約」なる用語により全ての例において修飾されると理解されるべきである。パーセンテージと関連して用いたその「約」なる用語は、平均±１％を意味し得る。
【００３１】
同定されたすべての特許および他の刊行物は、例えば、本発明と関連して用い得るかかる刊行物に記載された方法を記載および開示する目的で引用により明確に本明細書の一部とみなす。これらの刊行物は、本願の出願日に先立ってそれらの開示のために単に提供される。この点に関して、発明者が、先行発明により、または他の理由のためにかかる開示を事前日時とする権利を与えられないという承認として解釈されるべきではない。日付に関する記載またはこれらの文書の内容に関する表示の全ては、出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していずれの承認も構成しない。
【００３２】
特に定義されない限りは、本明細書に用いた技術的および科学的な用語は、本発明が関係する当業者に一般的に理解されるようなものと同一の意味を有する。いずれの公知の方法、装置および材料も本発明の実施または試験に用い得るが、その方法、装置および材料はこの点に関して本明細書に記載される。
【００３３】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、グラム陽性の、ランセット形の球菌（わずかに鋭い外部の曲がりを持つ長方形の球菌）である。通常、それらは対の球菌（双球菌）と考えられるが、それらは単独で短連鎖中で生じ得る。血液寒天培地上で培養された場合、それらはアルファ溶血性である。個々の細胞は、直径が０.５〜１.２５マイクロメートルである。それらは、胞子を形成せず、それらは非運動性である。他の連鎖球菌のように、それらはカタラーゼを欠き、グルコースを乳酸に発酵させる。他の連鎖球菌と異なり、それらはＭ蛋白質を示さず、それらはイヌリンを加水分解し、それらの細胞壁組成はそれらのペプチドグリカンおよびそれらのタイコ酸の双方に関して特有である。
【００３４】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、主として幼児および高齢者間の肺炎、髄膜炎、中耳炎ならびに敗血症についてのよく知られたヒト病原菌および主要な病原体である。Ｆｅｄｓｏｎ ＆ Ｍｕｓｈｅｒ ｉｎ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ２ｎｄ ＥＤ. （Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ ｅｄｓ., Ｗ．Ｂ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．, Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ, ＰＡ, １９９４）. 完全に多糖体からなる莢膜は肺炎球菌細胞を包む。侵襲中に、莢膜は毒性の必須の決定因子である。莢膜は、細菌細胞のＣ３ｂオプソニン化を防ぐことにより食作用と干渉する。抗肺炎球菌ワクチンは、高度に流行性の株に由来した種々の莢膜（多糖体）抗原の処方に基づいている。
【００３５】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、血清学的に区別される炭水化物莢膜のその発現に基づいて９０種の血清型に分類されている。Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ, ３３ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２７５９−６２（１９９５）. 莢膜多糖体（ＰＳ）に対する抗体は、同一莢膜の血清型を発現する肺炎球菌に対する防御を提供し得る。現在利用可能な肺炎球菌ワクチンは、複数の血清型の莢膜ＰＳの混合物を含む。例えば、１つの肺炎球菌ワクチン（ＰＳワクチンと呼ばれる）は、２〜３種の一般的に見出された血清型からの莢膜ＰＳを含む。Ｒｏｂｂｉｎｓら, １４８ Ｊ. Ｉｎｆｅｃｔ. Ｄｉｓ. １１３６−５９（１９８３）. 最も最近開発されたタイプのワクチン（共役ワクチンと呼ばれる）は、蛋白質分子にコンジュゲートする７〜１３種の血清型の莢膜ＰＳを含む。Ｗｕｏｒｉｍａａ ＆ Ｋａｙｈｔｙ, ５６ Ｓｃａｎｄ. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １１１−２９（２００２）. ７価結合型ワクチンは、米国における臨床使用のために２０００年に導入され、小児における侵襲性の肺炎球菌疾病の発生率を低下させた。Ｗｈｉｔｎｅｙ, ３４８ Ｎ. Ｅｎｇｌ. Ｊ. Ｍｅｄ. １７３７−４６（２００３）．
【００３６】
正確で有効な血清型別用の肺炎球菌単離物は、肺炎球菌ワクチンの効力を測定するために重要である。新しい肺炎球菌ワクチンの導入後に、ワクチン誘導抗体は血清型特異的な防御を提供する。従って、ワクチンに含まれた血清型を発現する肺炎球菌は余り多く発生せず、一方、非ワクチンタイプを発現する肺炎球菌の有病率は同一のままで有り得る。いくらかの場合において、非ワクチンタイプを発現する肺炎球菌は、ワクチン血清型を発現するものに置き換わり、非ワクチンタイプの有病率はより高くなり得る。Ｐｅｌｔｏｎ, １９（１） Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓ９６−Ｓ９９（２０００）. さらに、血清型の有病率は、知られていない理由のために経時的に変化しかねない。Ｆｉｎｌａｎｄ ＆ Ｂａｒｎｅｓ, ５ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. １５４−６６（１９７７）. これらの変化がワクチンの臨床的有効性に影響するために、多数の肺炎球菌単離物の血清型別は、肺炎球菌ワクチンをモニタリングする重要な部分である。
【００３７】
さらに、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａに関して、現在のワクチン製剤は６Ａ ＰＳを運ばないが、６Ｂに対して生起された抗体が６Ａに交差反応すると考えられるために、６Ｂ ＰＳを運ぶ。しかしながら、この現象は１００パーセントではない：６Ｂ ＰＳを含むいくつかのワクチンは、６Ａに対する抗体を生起しない。Ｙｕら, １８０（５） Ｊ. Ｉｎｆｅｃｔ. Ｄｉｓ. １５６９−７６（１９９９）. 事実、６Ａのごとき非ワクチン血清型は、依然としてワクチン接種した小児において疾病を引き起しているようである。Ｃｌｏｖｅｒ ＆ Ｋｌｅｉｎ, Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ, ４４ｔｈ Ａｎｎ. ＩＣＡＡＣ Ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ, ＤＣ, ２００４）. 従って、さらなる６Ａ血清型の新興および重要はさらに重要になり得る。
【００３８】
さらに、６Ａおよび６Ｂの血清型は、侵襲性の肺炎球菌疾病の、各々、４.７パーセントおよび７パーセントを占める。Ｒｏｂｂｉｎｓら, １４８ Ｊ. Ｉｎｆｅｃｔ. Ｄｉｓ. １１３６ ５９（１９８３）. その医学的重要性のために、血清型６Ａおよびその関連する血清型６Ｂの分子の性質は、広範囲に研究されている。生化学試験は、血清型が６Ａおよび６Ｂ ＰＳが、４つの単糖体：ラムノース、リビトール、ガラクトースおよびグルコースを含有する反復単位の線状ポリマーを含むことを見出した。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, ｉｎ Ｓ. ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ：ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＆ ＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳ ＯＦ ＤＩＳＥＡＳＥ ８１ １１４（Ｔｏｍａｓｚ, ｅｄ．, Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ, Ｉｎｃ, Ｌａｒｃｈｍｏｎｔ, ＮＹ, ２０００）. ２つのＰＳはラムノースをリビトールに連結することの差を除いて同一で有り得る。より詳細には、６Ａ ＰＳは、１→３のラムノース−対−リビトール連結を有し、６Ｂ ＰＳは、１→４のラムノース−対−リビトール連結を有する。
【００３９】
遺伝学研究は、いずれの血清型を発現する肺炎球菌も、サイズが約１７.５ｋｂのほとんど同一の莢膜遺伝子座（ＣＧＬ）を有することを報告する。配列情報は、例えば、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｊｅｃｔｓサイトにてオンラインで入手可能である。一貫した相違点は、ラモノシルトランスフェラーゼをコードするｗｃｉＰ遺伝子に存在する。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, １８６ Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ８１８１−９２（２００４）. 血清型６Ａ ｗｃｉＰ遺伝子は、残基１９５でセリンをコード化するが、血清型６Ｂ遺伝子はその残基でアスパラギンをコード化する。同上。セリンを含むラモノシルトランスフェラーゼが１−３の連結を作成し、アスパラギンを含むそれは１−４連結を作成すると考えられる。
【００４０】
当該技術分野においてよく知られている他の種々の血清型別方法が存在するが、古典的方法は膨化（Ｎｅｕｆｅｌｄ）方法と呼ばれ；現在使用される方法は大部分はマニュアルで、遅く、遂行するのに単調である。「マルチビーズアッセイ」と命名された改善された血清型別アッセイは、フローサイトメーターで半自動的に行なうことができる多重免疫学的アッセイに基づいている。Ｐａｒｋら, ７ Ｃｌｉｎ. Ｄｉａｇｎ. Ｌａｂ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ４８６−８９（２０００）. マルチビーズアッセイ特異性は、９０種のすべての公知の血清型を表わす肺炎球菌株を用いて、十分に確立された。Ｙｕら, ４３（１） Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. １５６−６２（２００５）. このアッセイが、肺炎球菌莢膜ＰＳに対して特異的な多数のｍＡｂを用いるために、優れた特異性を提供する。加えて、マルチビーズアッセイは、大部分は自動化され、高生産性を提供できる。結果的に、アッセイは多数の疫学的研究に有用で有り得る。
【００４１】
モノクローナル抗体がポリクローナル試薬より特異的であるために、マルチビーズアッセイは特に有利である。６Ａ血清型に関して、大部分の「６Ａ」単離物（膨張反応およびポリクローナルの試薬によって規定された）は、６Ａに特異的なモノクローナル抗体（Ｈｙｐ６ＡＧｌ、Ｈｙｐ６ＡＭ６およびＨｙｐ６ＡＭ３）と反応し、いくらかの「６Ａ」単離物は、１つのｍＡｂ（Ｈｙｐ６ＡＧｌ）と反応したが、他のもの（Ｈｙｐ６ＡＭ６またはＨｙｐ６ＡＭ３）とは反応しなかった。本明細書に記載された他のテストは、Ｈｙｐ６ＡＭ６またはＨｙｐ６ＡＭ３と反応しなかった６Ａ単離物が従前に未同定の６Ａ亜型であったことを確認した。換言すれば、そのモノクローナル抗体は、６Ａ血清型内の亜型を認識した。Ｌｉｎら, ４４（２） Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３８３ ８８（２００６）参照. 発明者らは、６Ａαとしての双方のｍＡｂｓと反応する単離物、および６ＡβとしてＨｙｐ６ＡＧｌだけと反応するもののを従前に標識したが、実質的には本明細書において、６Ａαが依然として６Ａのままであり、その新しい血清型が、６Ａβよりむしろ６Ｃとして同定されることをここに提唱する。換言すれば、６Ａβおよび６Ｃの双方を本明細書に用いて、新規な肺炎球菌血清型を命名したが、それらは等価物である。そのため、血清型６Ｃは、９１番目の肺炎球菌血清型を表わす。実際に、「６Ａ」は、膨張反応によって「６Ａ」として型別された単離物をいい、６Ａ（６Ａα）および６Ｃ（６Ａβ）の双方を含む。
【００４２】
新しい血清型の定義における考察はヒト化抗体とのその結合特性である。ヒト抗血清は、莢膜ＰＳ以外の肺炎球菌抗原に結合する非オプソニンの抗体を一般的に有するために、オプソニン化アッセイはＥＬＩＳＡより特異的である。また、オプソニン化能力は、より直接的に肺炎球菌感染に対する免疫防御と関係する。従って、種々の６Ａα、６Ａβおよび６Ｂ単離物は、オプソニン化アッセイおよび高レベルの抗６Ｂ抗体を持つヒト血清を用いて比較された。ヒト血清は６Ｂならびに６Ａαをオプソニン化したが（図２）、それはブラジル、韓国および米国からの７つの異なった６Ａβ単離物をオプソニン化しなかった（図２）。一緒にすると、これらのデータは、６Ａβ単離物が区別されるが、均一である血清学的特性を表示することを示す。
【００４３】
また、遺伝学研究は、６Ｃ単離物が確かに、（密接に関連する６Ｂ血清型またはいくかの他の無関係な血清型よりむしろ）６Ａ血清型のメンバーであることを確認した。ブラジル、韓国および米国から集められた１０種の単離物の試験において、６Ａβとして同定された１０種の単離物のすべてが、血清型６ＡにおけるｗｃｉＰ遺伝子と一致する残基１９５にてセリンを有した。いくつかの肺炎球菌の単離物のｗｃｉＰ遺伝子のＤＮＡ配列を図４に示す。
【００４４】
また、トランスフェラーゼ遺伝子ｗｃｉＮおよびｗｃｉＯの遺伝子配列を比較した。ｗｃｉＮ領域が、プライマー５０１６および３１０１（５１０６：５’−ＴＡＣ ＣＡＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＴおよび３１０１：５’−ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＧＣ）を用いてＰＣＲによって検討された場合、検討された９つの６Ａαのすべてが、検討された６つの６Ｃ単離物のすべてで行ったよりも２００塩基対（ｂｐ）長い生成物を得た（図５）。６つの単離物は、韓国、米国およびブラジルからの６Ｃ単離物を含んだ。かくして、このＰＣＲは、６Ａ亜型に対する遺伝子テストとして用いることができる。
【００４５】
次いで、１つの６Ａα単離物（ＡＡＵ９）および１つの６Ｃ単離物（ＳＴ７４５）からのＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列を比較した（図６）。ＡＡＵ９ ＰＣＲ生成物における１２０３〜２９５９位（１７５７塩基）間の全塩基を配列決定し、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて報告された６Ａ単離物の莢膜座配列であるＣＲ９３１６３８に相同性であることが判明した。対照的に、そのＳＴ７４５配列は、１３６８位までで、次に、２５９１位から再び出発する６Ａαのものとほとんど同一であることが判明した。介在する１０２９ｂｐ配列（１３６９〜２３９７）は、６Ａαのものとは全く異なる。介在配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓによる多糖体合成に用いたトランスフェラーゼ（ＥｐｓＧ）に類似する約９８ｂｐを含む。
【００４６】
かくして、本明細書に示した研究は、新しい肺炎球菌血清型についての遺伝子的基礎を支持する。６Ｃの莢膜遺伝子座は、ｗｃｉＮ遺伝子を除いて６Ａ座に非常に類似し：６Ａ株はｗｃｉＮα遺伝子を有するが、６Ｃ株は、ｗｃｉＮα遺伝子とは（約５０％だけの相同性で）劇的に異なるｗｃｉＮβ遺伝子を有する。２つの遺伝子がサイズにおいて異なるために、６Ａおよび６Ｃの血清型は、容易にＰＣＲによって識別できる。ｗｃｉＮα遺伝子は、３１４個のアミノ酸を持つＷＣＩＮαをコード化し、一方、ｗｃｉＮβ遺伝子は１１２５塩基長のＯＲＦを生成し、その生成物のＷＣＩＮβは３７４個のアミノ酸を有する。これらの２つの蛋白質は、アミノ酸レベルでほとんど相同性を有さない。
【００４７】
推定ｗｃｉＮ遺伝子産物の配列は、それらのグリコシルトランスフェラーゼ機能を示唆する。ＷＣＩＮβは、ブドウ球菌のｃａｐＨ遺伝子産物との類似性を有し、グリコシルトランスフェラーゼグループ１ファミリーに属する１６０アミノ酸長のトランスフェラーゼドメインを有する。対照的に、ＷＣＩＮαは、多数のガラクトシルトランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラーゼ・ファミリー８（ｅｘ）に属する。Ｃａｍｐｂｅｌｌら, ３２６ Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｊ. ９２９−３９（１９９７）. これらの観察は、６Ａおよび６Ｃの莢膜ＰＳの化学構造と一致し、ｗｃｉＮが６Ａおよび６Ｃの血清型間の差を担うという主張を支持する。実際に、６Ａ株はｗｃｉＮα遺伝子をｗｃｉＮβ遺伝子と置換することにより６Ｃ株に変換できる。
【００４８】
６Ａおよび６Ｃにつき観察されたガラクトース／グルコース交換は、他の肺炎球菌血清型について見出される。肺炎双球菌の９Ｌ血清型ＰＳはガラクトース分子を有するが、９Ｎ ＰＳはグルコース分子を有する。その９Ｌおよび９Ｎ血清型の莢膜遺伝子座は相互に似ているが、９Ｌについてのガラクトシルトランスフェラーゼおよび９Ｎについてのグルコシルトランスフェラーゼをコード化する１つの遺伝子ｗｃｊＡにおいて異なる。９Ｌおよび９Ｎ血清型のｗｃｊＡ遺伝子は非常に類似し；一方は変異により他方から生起したようである。対照的に、ｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβの遺伝子は非常に異なり、ｗｃｉＮβ遺伝子はデータベース中で利用可能な他の肺炎球菌の遺伝子に相同性ではない。おそらく、ｗｃｉＮβ遺伝子は肺炎球菌以外の生物体が起源で有り得る。この仮説の支持において、ｗｃｉＮβ遺伝子の検討は、相同組換えに関与し、肺炎球菌における相同組換えに非常に重要であることが知られている２つのフランキング領域を示す。Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅら, ９９ Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ. ＵＳＡ ２１００ ０５（２００２）. 加えて、抗生物質耐性遺伝子の研究は、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびもう一つの細菌種間の水平の遺伝子導入を示した。例えば、Ｆｅｉｌら, １５１（６） Ｒｅｓ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ４６５−６９（２０００）；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｇｒａｆら, １４５（１１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３２８３−９３（１９９９）；Ｃｏｆｆｅｙら, ５（９） Ｍｏｌ. ２２５５−６０（１９９１）参照．
【００４９】
ｗｃｉＮβ遺伝子源はまだ知られていない。ｗｃｉＮβ遺伝子の一部は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓによってエキソポリサッカライドの合成に関与する遺伝子のＥｐｓＧ遺伝子に類似（８１％相同性）している。しかしながら、その相同性は、非常に短いピースのＤＮＡだけに見出され、かくして、Ｓ. ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓはｗｃｉＮβについての源ではないであろう。ＷＣＩＮβの蛋白質配列は、大腸菌Ｋ−１２株のｗａａＧ（ｒｆａＧ）遺伝子産物に似ており、いくらかの肺炎球菌遺伝子はグラム陰性細菌に由来し得る。かくして、ｗｃｉＮβ遺伝子がグラム陰性種から同様に由来できた可能性がある。しかしながら、それらが肺炎球菌と口腔内で共存し、多数の抗生物質耐性遺伝子がＳ．ｏｒａｌｉｓに連結されたために、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓ. ｍｉｔｉｓおよびＳ．ｏｒａｌｉｓは主要な候補である。
【００５０】
ｗｃｉＮβ領域を複数の６Ｃ単離物につき検討した場合、それらの重なるポイントおよびフランキング領域配列は同一であると判明した。また、それらの莢膜遺伝子座プロフィールは６Ａ単離物とは対照的に９−１０−１に高度に制限され、多数の異なる莢膜遺伝子座プロフィールを有する。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４. 加えて、９−１０−１莢膜遺伝子プロフィールは６Ａおよび６Ｂ単離物の莢膜遺伝子プロフィール間で独特であり、その莢膜遺伝子プロフィールとは大きく分離している。これらの知見は、ｗｃｉＮβ遺伝子の捕捉が以前に起こったに違いなく、６Ｃ単離物のすべてが世界中で、多数のタイプの疾病を引き起して見出され、それは、元来は６Ｃになった単一細菌からの莢膜遺伝子座を有することを明白に示す。６Ｃが外来遺伝子捕捉のユニークでかつ明確な例を提供し得るために、それは細菌の遺伝進化を研究するためのよいモデルになるであろう。また、これは、抗生物質耐性遺伝子と異なり、安定した変化を構成し得る。
【００５１】
６Ｃ血清型はわずか１または２の莢膜遺伝子座プロフィールしか有さないが、６Ａおよび６Ｂの血清型は、種々の莢膜遺伝子座プロフィールを有する。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４. かくして、６Ｃ莢膜遺伝子座は、６Ａまたは６Ｂ莢膜遺伝子座と比較して非常に最近、出現したかもしれない。６Ｃは２７年以上前に出現したかもしれないが、これらの知見は、６Ｃ血清型莢膜遺伝子座が、１つの場所で「最近」出現し、世界中に急速に広まったことを示唆する。ある遺伝子が強力な生存優位性を提供する場合、その遺伝子は、世界中に急速に広がりかねない。例えば、抗生物質耐性遺伝子は、たった何年のうちに世界的に広がり得る。おそらく天然のヒト化抗体は、６Ａまたは６Ｂより６Ｃに対してあまり有効ではない。６Ｃ莢膜遺伝子座が６Ａまたは６Ｂより多くの生存優位性を提供するかを調査すべきである。
【００５２】
ＭＬＳＴ研究は、６Ｃが複数の独立したＳＴを発現することを示す。かくして、６Ｃ莢膜遺伝子座は、異なる肺炎球菌単離物中で交換されたに違いない。６Ｃ莢膜遺伝子座がさらなる生存優位性を提供するＳＴと結合し得るかが調査され得る。多剤耐性遺伝子を有する国際的な株における６Ｃの拡散および６Ｃ莢膜座の発生がモニターされるべきである。
【００５３】
本明細書に供された新規な肺炎球菌単離物は、化学的に区別されるＰＳ構造を有する。より詳細には、単糖体分析は、６Ａα莢膜ＰＳで見出されたガラクトースが、グルコースを代わりに含む６ＡβＰＳにおいて不存在であることを示した。６ＡβＰＳの反復単位は、１つのリビトール、１つのラムノースおよび２つのグルコース部位を明確に含む。従って、本明細書に記載された２の亜型６Ａαおよび６Ａβは、異なる血清型と認められるべきである。６Ａβ亜型は、血清型６Ａに命名されたＡα亜型を残しつつ、血清型６Ｃと記載され得る。血清型６Ｃは、血清型６Ａに対するその血清学的および構造的な関係に徴して、血清群６の第３のメンバーとして含まれるべきである。かくして、血清型６Ｃは、９１番目の肺炎球菌血清型を表し、９０種の肺炎球菌血清型は、以前に認識されている。Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ, ３３ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２７５９−６２（１９９５）．
【００５４】
ガラクトースおよびグルコース分子は、それらの第４の炭素に結合した水酸基の配向においてだけ異なり、６Ａおよび６ＣのＰＳの反復単位は１つの水酸基の配向においてだけ異なる。この小さな構造の差は、６Ｃが過去においてポリクローナル抗血清で同定されなかった理由を説明する。化学構造の解明で、６Ｃは、生化学的に炭水化物組成分析またはＮＭＲにより６Ａと識別できる。肺炎球菌莢膜ＰＳは、アノマープロトンの単純なプロトンＮＭＲによって同定できる。Ａｂｅｙｇｕｎａｗａｒｄａｎａら, ２７９ Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２２６−４０（２０００）. ６Ａおよび６ＣのＮＭＲパターンは異なるが、６ＣのアノマープロトンのＮＭＲパターンは６Ａのそれに非常に類似する。化学および遺伝子テストを用いることができるが、血清学的方法は、吸収により特異的になされた発明者らのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清のいずれを用いても６Ｃを同定する最も有用な方法で有り得る。
【００５５】
血清群６は、３つのエピトープ：６ａ、６ｂおよび６ｃを含むことが知られている。Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ, １９９５. エピトープ６ａは、血清型６Ａおよび６Ｂの双方に存在することが知られ、一方、エピトープ６ｂおよび６ｃは、各々、血清型６Ａまたは６Ｂのいずれかでのみ見出されている。６Ｃ血清型の知見は、血清群６内のさらなるエピトープの存在を示す。６Ｃではなく６Ａおよび６Ｂを認識するｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ３は、エピトープ６ｂを認識するであろう。ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＧｌが６Ａおよび６Ｃを認識するために、それは新しいエピトープ「６ｄ」を認識すると定義し得る。３種の血清型（６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）および共有されるエピトープのすべてに結合するもう一つのｍＡｂは、「６ｅ」と定義し得る。また、血清型６Ａおよび６Ｂについての立体構造依存性（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）エピトープが記載されている。Ｓｕｎら, ６９ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ３３６−４４（２００１）. 血清群６についての非常に多数のエピトープの観察は、シアル酸の単純な線形ホモポリマーでさえ、少なくとも３つのエピトープを有することができるという従前の観察と一致する。Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｔｅｉｎ, １４１ Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ４３５７−６２（１９８８）. 実際に、肺炎球菌のＰＳは、従前に定義された（Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ、１９９５年）よりさらに多数のエピトープを有し、多数のエピトープの存在は、肺炎球菌結合型ワクチンの製造中にエピトープを変更する機会を増加させる。
【００５６】
血清型６Ｃの知見は、血清群６が１９２９年におけるその知見に続いて広範囲に研究されたために、全く予期されなかった。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｒｅｂｅｒｓ, １９６０. 従って、さらなる亜型（または血清型）が良好に確立され広範囲に特徴づけられた血清群中でさえ存在するという可能性を考えるべきである。例えば、１９Ａ莢膜ＰＳについての２つの化学構造が報告されたために、血清型１９Ａ中の亜型の可能な存在を考えることが必要で有り得る。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖｉｅｗ, ｉｎ ＭＯＬ. ＢＩＯＬ. ＆ ＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳ ＯＦ ＤＩＳＥＡＳＥ ８１−１１４（Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ, Ｌａｒｃｈｍｏｎｔ, ２０００）. １９Ａ亜型が見出されたならば、それらの存在は発明者らが、肺炎球菌の結合型ワクチンの導入後にみられた血清型「１９Ａ」の有病率における急速な増加を説明するのを助け得る。Ｐａｉら, １９２ Ｊ. Ｉｎｆｅｃｔ. Ｄｉｓ. １９８８−９５（２００５）. 加えて、６Ｃが最近発生したかもしれないという可能性を考慮するべきである。この可能性と一致して、遺伝学研究は、６Ｃ血清型莢膜遺伝子座が、多様ではなく（Ｌｉｎら, ４４ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏ. ３８３−（１９８８））、６Ａ座である（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４）ことを示唆する。ずっと以前に（おそらく５０−１００年前に）得られた肺炎球菌単離物を研究することにより、６Ｃ株の起源および拡散を調べることは興味深いであろう。
【００５７】
現在入手可能な肺炎球菌ワクチンは、６Ａに対する交差防御を誘導すると推定されるために単に６Ｂ ＰＳを含む。肺炎球菌ワクチン効力調査の一部として、米国で見出された肺炎球菌単離物のすべてが、今や血清型６Ａおよび６Ｂにつきテストされる。しかしながら、６Ｃに対する交差防御は、６Ａに対するものと異なり得る。６Ｃおよび６Ｂ ＰＳが２つの構造の差を有するが、６Ａおよび６ＢのＰＳには１つだけの構造の差を有するために、６Ｃに対する交差防御が不適当で有り得、現在入手可能な肺炎球菌ワクチンは、６Ｃではなく６Ａの有病率を低下し得る。実際、現在の肺炎球菌ワクチンは、血清型１９Ａについてまさに生じるように、６Ｃが以前より優勢になるのを助け得る。かくして、すべての肺炎球菌単離物は、血清型６Ｃならびに血清型６Ａおよび６Ｂにつきテストされるべきである。
【００５８】
重要なことには、本明細書に提供された新規な血清型６Ｃは、ワクチンまたは肺炎球菌ワクチン開発に有用で有り得る。例えば、６Ｃ ＰＳ、そのＰＳの一部、ＰＳのミメティックまたはそのＰＳの一部は、肺炎球菌ワクチンに組み入み得る。連鎖球菌および肺炎球菌のＰＳを含む結合型ワクチンは、当該技術分野においてよく知られている。米国特許第６,２４８,５７０号；第５,８６６,１３５号；第５,７７３,００７号参照。また、多糖分子の蛋白質またはペプチドのミメティックのごときＰＳミモトープは、代替抗原あるいは免疫原として可能である。例えば、Ｐｉｎｃｕｓら, １６０. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２９３−９８（１９９８）；Ｓｈｉｎら, １６８ Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ６２７３−７８（２００２）参照. 加えて、６Ｃの蛋白質または核酸は、当該技術分野において公知の多数の技術を用いてワクチンまたはワクチン開発における抗原または免疫原として機能し得る。例えば、米国特許第６,９３６,２５２号参照。１以上のアジュバント剤がかかるワクチンに含まれる。非経口、粘膜または他の投与により肺炎球菌ワクチンの送達、ならびにかかるワクチンを設け、モニタリングおよび投与方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００５９】
加えて、細菌が、テストワクチンによって産生された血清または抗体を用いてオプソニン化またはＥＬＩＳＡアッセイにおける標的として用いられるために、６Ｃ血清型はワクチン開発に有用で有り得る。また、６Ｃ血清型の抗原は、受動的保護に用いられ得る抗体を産生するために用い得る。また、かかる方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００６０】
また、６Ｃ血清型はワクチン効力をモニターするのに有用である：６Ａαおよび６Ｃ血清型は、肺炎球菌ワクチンに関する疫学的調査、および肺炎球菌ワクチン効力の試験において区別されなければならない。例えば、肺炎球菌ワクチンが６Ｃではなく６Ａαに対して有効ならば、そのワクチンは６Ａβ血清型が蔓延している領域に有効ではないかもしれない。これは、肺炎球菌ワクチンが６Ａβだけを時々オプソニン化する抗体を導くために、そのケースになるであろう。また、従来の肺炎球菌ワクチンの使用法は、たぶん６Ｃの有病率を変更するだろう：６Ａαの有病率は減少するが、６Ｃの有病率は増加し得る。後記の予備的データは、６Ｃ有病率が不変であるが、６Ａα有病率が２０００年以来の結合型ワクチン剤の使用で減少したことを示唆する。血清型を区別せずに、ワクチンを開発する、またはその効力を検討するのは難しいかもしれない。現在、新しい血清型は本明細書に開示された抗体によって同定できるが、さらなる遺伝学的および生化学的なテストを発明でき、本発明によって構想される。
【００６１】
さらに、６Ｃ血清型の有病率は全世界的にモニターされ、肺炎球菌ワクチン分布の有無での領域における新しい肺炎球菌の出現についての価値のある情報を提供するであろう。また、６Ｃ血清型は、ブラジル、カナダ、中国、韓国、メキシコおよび米国で同定された。
【００６２】
その目的のために、本発明のモノクローナル抗体は６Ａβ血清型を同定するのに有用である。すなわち、６Ａ血清型（６Ａαおよび６Ａβの双方）は、ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＧｌによって同定されるが、６Ｃ血清系は、ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ６またはｍＡｂ Ｈｙｐ６Ａｍ３と反応しない。従って、Ｈｙｐ６ＡＭ６またはＨｙｐ６ＡＭ３は、６Ａαおよび６Ｃが同定できる陰性対照として用いられ得る。
【００６３】
これらのモノクローナル抗体を用いて、ＣＤＣに提出された米国肺炎球菌単離物中の６Ａおよび６Ａβ（６Ｃ） の有病率を分析した。ほぼ、同数の肺炎球菌単離物は１９９９年から２００６年までＣＤＣに提出された。旧方法により「６Ａ」として型別された標本を本明細書に記載されたモノクローナル抗体を用いて再分析した。１９９９年、２００３年および２００４年に受け取られた「６Ａ」標本はほとんどすべて再分析した。ＣＤＣが２００５年および２００６年に受け取った試料のわずかだけが再分析された。表に見られるように、６Ａ（６Ａα）の有病率は減少したが、６Ｃの有病率は同じままであった。これは、現在利用可能な肺炎球菌ワクチンが６Ｃに対して有効ではないかもしれないことを示唆する。
【００６４】
【表１】
【００６５】
加えて、６Ｃの同定は、抗６Ｃ抗体の産生および単離を提供する。また、その同定は、６Ａ（６Ａα）および６Ｃ（６Ａβ）の双方を認識する通常の「６Ａ」特異的試薬により示されるような６Ａ（６Ａα）に特異的な試薬を生成することを可能にする。これらは、本明細書に徴して当該技術分野においてよく知られている通常の手段によって調製できる。これに関して、抗６Ｃ抗体は、無傷の免疫グロブリン分子ならびにその部分、フラグメント、ペプチドおよび誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ領域、あるいは６Ｃ抗原、エピトープ、またはミモトープを結合できる抗体のいずれかの部分またはペプチド配列を含み、その全てを「抗原結合蛋白質」という。抗体または抗原結合蛋白質は、その分子と特異的に反応し、それにより、分子が抗体または抗原結合蛋白質に結合できるならば、分子を「結合できる」と言われる、例えば、ＷＯ／ＵＳ２００６／０１４７２０；ＷＯ／ＵＳ２００６／０１５３７３参照。
【００６６】
血清型６Ｃはブダペスト条約に合わせて米国微生物系統保存機関に寄託された。
本発明は、今や、さらに非限定の実施例によって記載されるであろう。
【実施例】
【００６７】
実施例１．肺炎球菌血清型の同定
肺炎球菌溶解物の収集：肺炎球菌血清型６Ａβ（Ｌｉｎら, ４４ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏ. ３８３−８８（２００６）参照）を４９５種の臨床分離株を用いる盲検試験において単離し：５０の単離物はメキシコから、１００はデンマーク、３４５はブラジルからであった。２２の単離物は、鼻咽腔における肺炎球菌の無症状保菌者からのものであり、４７５の単離物は、髄膜炎および敗血症のごとき侵襲性の肺炎球菌感染の患者からのものであった。加えて、血清型１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄおよび１１Ｆを発現する対照肺炎球菌株をＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ, Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入した。
【００６８】
臨床分離株の溶解物は、起源国で調製された。０.５％酵母抽出物（ＴＨＹ培地）を含む３００マイクロリットルのトッド・ヒューイット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ）培地に単一コロニーの肺炎球菌を接種した。３７℃にて一晩培養後、細胞を０μｌの溶解用溶液（０.２％デオキシコール酸ナトリウム、０.０２％ＳＤＳ、０.１％アジ化ナトリウム、０.３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.８）で溶解した。ブラジルにおいて、４００μｌのＴＨＹ培地を細菌増殖に用い、１００μｌを取り出して、凍結した細菌を貯蔵した後、残りの３００μｌを５０μｌの溶解用溶液と混合した。デンマークにおいて、３２５μｌのＴＨＹ培地、および２５μｌの溶解溶液を用いた。細菌は３７℃にて混合物をインキュベートすることにより溶解した。その溶解物をコード化し、周囲温度で普通郵便によって血清型試験のためにアラバマ大学バーミンガム校（ＵＡＢ）の研究所へ送った。
【００６９】
マルチビーズアッセイのための離れた場所からＵＡＢまでの細菌溶解物の発送を単純化するために、細菌溶解物の安定性を室温（ＲＴ）または３７℃で貯蔵後に比較した。その仕事は、マルチビーズアッセイの結果に影響することなく、１か月までのＲＴ、または数日間の３７℃にて細菌溶解物を貯蔵できることを明らかにした。かくして、普通郵便システムを用いて、いずれの熱の保護なくして周囲温度にてこの試験における全溶解物をを発送した。
【００７０】
血清学試薬：ポリクローナル血清型別用血清を、ウサギにおいて調製し、Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔから得た。それらは、血清グループ化および種々のタイプまたは因子特異的な抗血清のために１２の血清プールを含む。Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, ３１ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２０９７−２１００（１９９３）. 全てのｍＡｂｓは、記載のごとく生成し、ハイブリドーマ培養液上清を用いた。Ｙｕら, ２００５．
【００７１】
マルチビーズアッセイ：このアッセイ方法は、２つの異なるセットのラテックスビーズを用いて記載されるように行なった。Ｙｕら, ２００５。１組のビーズ（セット１）は、１４の異なるラテックスビーズの混合物であり、各々は、１つの肺炎球菌ＰＳ抗原で被覆した。１４の肺炎球菌のＰＳ抗原は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆであった。ビーズセット２は、１０のビーズタイプの各々を１０の異なる肺炎球菌ＰＳ（血清型２、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０、２２Ｆおよび３３Ｆ）の一つでコーティングすることにより創製した。
【００７２】
セット１ビーズは、５×または２０×希釈した細菌溶解物、およびビーズ上に含まれた肺炎球菌莢膜ＰＳに特異的なｍＡｂｓの混合物と混合した。インキュベーションおよび洗浄後、ビーズ混合物をフルオレセイン結合した抗マウス免疫グロブリン抗体と反応させた。セット２ビーズを、ポリクローナルウサギ抗血清（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）およびフルオレセイン結合した抗ウサギ免疫グロブリン抗体の混合物を用いる以外はセット１ビーズと同様に用いた。インキュベーション後、各ビーズタイプの蛍光量をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ, Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ, Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）で決定した。次いで、各ビーズタイプの蛍光を用いて、その血清型を決定した。６７％を超える蛍光阻害を陽性として用いた。
【００７３】
Ｎｅｕｆｅｌｄテスト：このアッセイは、標準的血清グループ化（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, １９９３）およびＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔからの血清型別用ウサギ抗血清を用いてデンマーク、ブラジルおよびメキシコにおける参考研究室により記載されたごとく行った（Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ, ３３ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２７５９−６２（１９９５）；Ｋｏｎｒａｄｓｅｎ, ２３ Ｖａｃｃｉｎｅ １３６８−７３（２００５）；Ｌｕｎｄ, ２３ Ｂｕｌｌ．Ｗｌｄ Ｈｌｔｈ Ｏｒｇ. ５−１３. （１９６０））。
【００７４】
ドットブロットアッセイ：異なる結果を調査するために、このアッセイを、記載される（Ｆｅｎｏｌｌら, ３５ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏ. ７６４−７６（１９９７））ように、以下の血清群あるいは血清型：１、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１４、１８および２３に対するＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔからの肺炎球菌抗血清を用いて行なった。また、６Ａ（Ｈｙｐ６ＡＭ３）および１８Ｃ（Ｈｙｐｌ８ＣＭｌ）に特異的なモノクローナル抗体をいくらかの場合に用いた。略言すると、ＴＨＹ培地中で増殖した加熱死滅させた肺炎球菌をニトロセルロース膜の条片上でスポットした。乾燥後、条片をブロックし、洗浄した。次いで、条片を希釈した抗血清またはｍＡｂ溶液中で１時間インキュベートし、洗浄して、希釈したヤギ抗ウサギまたはマウス免疫グロブリンペルオキシダーゼコンジュゲートに曝露した。室温での１時間のインキュベーション後、条片を洗浄し、３−アミノ−９ エチルカルバゾール溶液に曝露した。スポットが現われた場合、条片を洗浄し、評価した。
【００７５】
ＰＣＲ反応：肺炎球菌を６５０ｎｍの波長で０.８のＯＤまでＴＨＹ培地中で増殖させた。染色体ＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＥＡＳＹ−ＤＮＡキットを用いて所与の説明書に従い調製し、ＴＨＹ肺炎球菌の４ｍｌの試料から開始して、１ｍｌに濃縮した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ）。血清群６決定については、ＰＣＲをテンプレートとして染色体ＤＮＡおよびプライマーｗｃｉＰ−上方、５’−ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＴＧＴ ＣＡＣ−３’およびｗｃｉＰ−下方、５’−ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＡ ＴＡＴ ＡＡＧ ＣＣ−３を用いて行なった。ＰＣＲ熱循環条件はＭａｖｒｏｉｄｉら, ２００４に記載されたごとくであった。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラム（Ｑｉａｇｅｎ, Ｖａｌｅｎｃｉａ, ＣＡ）を用いて、ＰＣＲ反応から過剰のプライマーを除去し、ＰＣＲはｗｃｉＰ−上方プライマーを用いる自動ＤＮＡ配列決定のためのＤＮＡテンプレートとして提出した。結果をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ, Ｉｎｃ．, Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ, ＭＩ）およびＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃｃｅｌｙｒｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ））の援助によって分析した。
【００７６】
血清型１１Ａ決定については、一部分の莢膜遺伝子座についてのＰＣＲは、記載されるように（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４）、テンプレートとして染色体ＤＮＡ、１μｌの順方向プライマー（５０ ｐｍｏｌ）および１μｌの逆方向プライマー（５０ ｐｍｏｌ）を用いて行なった。プライマーは、１１Ａ順方向の５’−ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＣＣ ＣＡＡ ＴＡＴ、ＡＧＴ Ｇ−３’および１１Ａ逆方向の５’−ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＧ ＴＧＴ ＡＡＴ ＴＴＡ、ＴＴＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＣ−３’であった。ＰＣＲサイクリングは、９４℃、５分から開始し、９４℃、１分間、５０℃、１分間および７２℃、２分間の３０サイクル、７２℃、１０分間の最終伸張であった。ＰＣＲ反応生成物をアンプリコンサイズを決定するためにアガロースゲル電気泳動（トリス緩衝酢酸溶液０.８％アガロース）によって分析した。
【００７７】
メキシコからの５０の単離物の試験：メキシコからの５０の単離物をＴＨＹ培地中で増殖し、溶解し、タイピングのためにＵＡＢに送った。マルチビーズアッセイ結果をＮｅｕｆｅｌｄのテスト結果と比較し、１０の試料からの結果は異なった。異なる試料のうちの８つの新しい溶解物を得て、盲検様式にて再調査した場合、全ての結果が一致し、それは大部分が誤標識によることを示唆した。Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより血清型３および１０Ａであると型別された２つの単離物（ＭＸ２４およびＭＸ３７）を、マルチビーズアッセイによって型別できない（ＮＴ）ものとして本来型別した。２つの血清型がマルチビーズによって同定されるべきだったので、その２つの細菌単離物をさらなる研究のためにＵＡＢ研究所へ送った。そこで、ＴＨＹ培地中で良好に成長すると判明し、新しい溶解物は、Ｎｅｕｆｅｌｄテスト結果と一致する結果を生じた。かくして、２つの単離物は、最もありそうなことには、肺炎球菌の不十分な増殖によりマルチビーズにより最初に誤って陰性として同定した。
【００７８】
デンマークからの１００の単離物の試験：１００のデンマーク単離物のマルチビーズアッセイ結果をＮｅｕｆｅｌｄテスト結果と比較した場合、発明者らは、Ｎｅｕｆｅｌｄテスト結果の転写における４つの誤りを見出し、１つの株（ＤＫ９４）をＮｅｕｆｅｌｄテストによる血清型２０、およびマルチビーズアッセイによるＮＴとして型別した（表１）。
【００７９】
【表２】
【００８０】
ＤＫ９４単離物をＴＨＹ中で再成長させ、再調査した場合、１：５希釈にてほとんど阻害（９％）を生成しなかったが、より高希釈でより大きな阻害を生成した（１：２０希釈にて３５％および１：３２０希釈にて５０％）。この予期しない挙動は、この特定の単離物の溶解物中の非特異的な結合物質の存在を示唆した。溶解物中のＰＳが７０％エタノールで沈殿し、エタノール沈殿物がマルチビーズアッセイで検討された場合、その沈殿物は、血清型２０につき明瞭な阻害を生成した（１：５希釈にて８６％および１：２０希釈にて８１％）。かくして、最初の不一致は、非特異性結合に起因し、それはポリクローナル血清で行なったアッセイで時々観察され、臨床単離物とのアッセイ感度および特異性に固有の問題は存在しない。
【００８１】
ブラジルからの３４５の試料の試験：２つのアッセイ方法で得られた３４５のブラジル単離物の結果を比較する場合、３８の不対合があった。これらの３８の試料は、試験記録を調査しブラジルにおけるＮｅｕｆｅｌｄテストによって再テストすることにより再調査した場合、１７の不対合は、型別ミス（ｔｙｐｉｎｇ ｍｉｓｔａｋｅ）または試料誤同定として説明できた。１７の不対合のうちの１つは株ＢＺ６５２であった。これは、１８Ｂとして最初に型別されたが、それがＮｅｕｆｅｌｄテストによって弱く６Ａとして型別され、ポリクローナル抗血清およびｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ３を用いる、ドットブロットアッセイにより血清群６として型別されたため、６Ａであると決定された。２１の残る誤対合の試料をＴＨＹ培地中で再増殖し、マルチビーズアッセイによって再テストした場合、１３の単離物の新しい結果はＮｅｕｆｅｌｄテスト結果と一致した。その１３の単離物の本来のマルチビーズアッセイ結果を再調査した場合、３つの単離物は、本来のマルチビーズにおける適当な血清型につき弱く不完全な阻害（阻害は６７％未満であった）を生成した。１２の単離物が、最初にＮＴとして型別されたが、１つの単離物（ＢＺ５２）は最初にタイプ３として型別された。それは、第２の試料でＮＴとして再型別され、その結果は、Ｎｅｕｆｅｌｄテスト結果（表１）（前記）と一致するようになった。
【００８２】
これらの再検討後に、８つの不一致が再現でき、依然として説明されなかった（表２および表３）：５つの単離物は、Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより６Ａと型別されたが、マルチビーズアッセイによりＮＴとして型別され、２つの単離物（ＢＺ４３５およびＢＺ７０５）は、Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより１１Ａと型別されたが、マルチビーズアッセイによりＮＴとして型別され、また、１つの単離物（ＢＺ４３８）は、ＮｅｕｆｅｌｄテストによりＮＴと型別され、マルチビーズアッセイによって、１８Ｃと型別された。Ｎｅｕｆｅｌｄテストによって、ＢＺ４３８は、いくらかのロットの血清グループ化プール血清ＡおよびＱ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, １９９３）と反応せず、それは血清群１８肺炎球菌と反応するであろう。また、それは、血清群１８に特異的な、または因子１８ｃ、１８ｄ、１８ｅおよび１８ｆに特異的な抗血清のいくつかの異なるロットと反応しなかった。しかしながら、ＢＺ４３８は、血清群１８に特異的なポリクローナル血清またはｍＡｂ Ｈｙｐ１８ＣＭ１（Ｙｕら、２００５）で陽性のドットブロット結果を生成した。かくして、ＢＺ４３８単離物は、１８Ｃであると考えられた。
【００８３】
株ＢＺ４３５およびＢＺ７０５は、Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより１１Ａであるが、マルチビーズアッセイにより１１Ａ、１１Ｄまたは１１Ｆではないと考えられた。標準的なマルチビーズアッセイが、血清群１１（Ｙｕら、２００５）に対するポリクローナル抗血清を用いるために、発明者らは、血清型１１Ａ、１１Ｄおよび１１Ｆに特異的であり、ＵＡＢ研究所において最近生成された２つのｍＡｂ（Ｈｙｐ１１ＡＭｌおよびＨｙｐ１１ＡＭ２）で２つの株を検討した（表２）。発明者らは、Ｈｙｐ１１ＡＭｌはＢＺ７０５ではなくＢＺ４３５を認識することを見出した。興味深いことには、Ｈｙｐ１１ＡＭ２はどちらの株も認識せず、それは１１Ａ血清型を発現する株中の不均一性を示す。ＰＣＲテストは、１１Ｂおよび１１Ｃについてではなく、１１Ａ、１１Ｄおよび１１Ｆについての株と４６３の塩基対アンプリマーを生成する（表２）。双方の株がこのＰＣＲによってテストされた場合、ＢＺ４３５は陽性であったが、ＢＺ７０５はそうではなかった。Ｎｅｕｆｅｌｄテストが、双方の株が因子ｌ１Ｃに特異的な抗血清と反応したことを示したが、Ｎｅｕｆｅｌｄテストは、さらにそれらの間の差を明らかにした：ＢＺ７０５ではなくＢＺ４３５がプール血清Ｔ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, １９９３）、血清群１１抗血清、または１１ｆ因子血清と反応した。ＢＺ７０５は、因子１１ｂ発現についてのあいまいな結果を与え、これは、それが血清型１１Ｄであり得ることを示唆した。しかしながら、ウサギタイピング血清を用いる血清群１１に対するドットブロットテストにおいて、ＢＺ４３５は陽性であったが、ＢＺ７０５は陰性であった。これらの結果のすべてを考慮すると、ＢＺ４３５が１１Ａ株、ＢＺ７０５は１１Ａ、１１Ｄまたは１１Ｆではないようであった。ＢＺ７０５が、１１Ｂ株で発現しない１１Ｃエピトープを発現する（そして、１１ｃ抗血清と反応する）ので、ＢＺ７０５は１１Ｃの血清型に属するかもしれない。
【００８４】
【表３】
【００８５】
６Ａであった残る矛盾した株を調査するために、ｗｃｉＰ遺伝子のＤＮＡ配列を検討した。最近の研究は、６Ａおよび６Ｂの莢膜ＰＳがリビトールに連結したラムノースとの反復単位を有すると報告した。連結は６Ａにつき１−３、６Ｂにつき１−４である。研究により、ラムノシルトランスフェラーゼが莢膜座中のｗｃｉＰ遺伝子によっておそらくコード化され、６ＡについてのｗｃｉＰが残基１９５にてセリンをコード化し、６ＢについてのｗｃｉＰが残基１９５にてアスパラギンをコード化することが判明した（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４）。また、ｗｃｉＰ対立遺伝子１、２、１、９および１１は、排他的に血清型６Ａに関連し、対立遺伝子３、４、５、６、８および１２は、血清型６Ｂに関連する。（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４）．
【００８６】
細菌ＤＮＡを６Ａと標識された５つの単離物ならびに、Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより単に弱く６Ａであると考えられたＢＺ６５２から得た。このＤＮＡは、ＰＣＲによりｗｃｉＰ遺伝子の一部を増幅し、アンプリコンを配列決定し、その配列（６４５塩基対）を検討した。５つの試料をうまく増幅し、６Ａ血清型（表３）と関連した対立遺伝子を発現し、アミノ酸残基１９５にてセリンを発現したため、それらの配列は６Ａ血清型と一致した。対立遺伝子２ ｗｃｉＰの原型配列と比較して、ＢＺ６５２のｗｃｉＰ配列は、３つの潜在的なアミノ酸置換を持つ５つの塩基対変更を有する。３つの単離物（ＢＺｌ７、ＢＺ３９およびＢＺ８６）は、対立遺伝子＃９についての原型配列から１つの同一ヌクレオチド変化を持つ同一のｗｃｉＰ遺伝子配列を発現し、従って、クローン的に関連付け得る（表３）。
【００８７】
【表４】
【００８８】
ＤＮＡ試験がこれらの単離物が６Ａ血清型に属し得ることを示唆したために、これらの単離物をポリクローナル抗血清を用いてマルチビーズアッセイで検討した。６つの単離物のすべては、６Ａと型別された（表３）。それらが、Ｈｙｐ６ＡＭ３に加えて１９の異なる６Ａ特異的ｍＡｂで型別された場合、１つのｍＡｂ（Ｈｙｐ６ＡＧｌ）は、６つの単離物を６Ａと同定した（表３）。Ｈｙｐ６ＡＧｌを用いて、４６の６Ａ単離物（この試験からの２１およびＵＡＢ研究所収集における２４）を再テストした場合、このｍＡｂは、それらのすべてを６Ａと同定し、６Ｂ血清型を発現する４３の単離物を含めて８９の非６Ａ血清型のいずれも認識しないことが判明した。かくして、これらの６つの単離物のすべてが６Ａであり、Ｈｙｐ６ＡＧｌはすべての６Ａ単離物を認識することは明らかであった。また、ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ３は、そのサブセットが非常に大きいが、６Ａ単離物のサブセットを認識する。
【００８９】
実施例２．異なる国からの肺炎球菌血清型６Ａβ単離物は、６Ａと関係する分子特性を有する
前記のごとく、６Ａ血清型と従前に関連した双方のｍＡｂｓと反応しなかったブラジルの単離物は、ｗｃｉＰ対立遺伝子の検討により６Ａ血清型に属することが示された。かくして、発明者らは、地理的に多様な位置からの１０の６Ａβ単離物のｗｃｉＰ遺伝子を検討した。２００３年および２００４年に集めたブラジルの単離物、米国の単離物および韓国からの１つの単離物を検討した。その配列は、１０の単離物のすべてが、６Ａ血清型に関係する遺伝特性を有することを明白に示した。
【００９０】
実施例３．異なる領域からの６Ａβ単離物は、一定の血清学的特性を有する
定量的方法で６Ａβ単離物の血清学的特性を調査するために、単離物を阻害アッセイを用いて検討した。アッセイは、６Ａ ＰＳを被覆したＥＬＩＳＡプレートに結合する種々の抗６Ａ抗体の細菌溶解物による阻害を測定した。略言すると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．, Ａｃｔｏｎ, ＭＡ）のウェルを、ＰＢＳ中で一晩、５μｇ／ｍＬの６Ａ莢膜ＰＳ（Ｇ. Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ, Ｂｒｏｏｋｌｙｎ, ＮＹの贈与）で３７℃にてコーティングした。０.０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄した後に、従前に希釈した細菌培養上清（または溶解物）を、抗６Ａ抗体と共にウェルに加えた。肺炎球菌溶解物を、チューブが不明瞭になるまで振盪せずに０.５％酵母抽出物（ＴＨＹ）を補足した１０ｍＬのトッド−ヒューレットブロス中で肺炎球菌を増殖させ、次いで、溶解緩衝液（脱イオン水中の０.１％デオキシコール酸ナトリウム、０.０１％ ＳＤＳおよび０.１５Ｍクエン酸ナトリウム）で３７℃にて１５分間チューブをインキュベートすることにより調製した。Ｈｙｐ６ＡＧｌ ｍＡｂは１：２５０希釈で用い、Ｈｙｐ６ＡＮ３ ｍＡｂは１：１００希釈で用いた。Ｓｔａｔｅｎ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ, ＤＫ）からのプールＱおよび因子「６ｂ」ウサギ抗血清を、１：５００希釈で用いた。３７℃の湿性インキュベーター中での３０分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ, Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）またはアルカリホスファターゼを結合したヤギ抗ウサギＩｇ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ, Ｃａｍａｒｉｌｌｏ, ＣＡ）で２時間インキュベートした。そのウェルに固定化した酵素の量をジエタノールアミン緩衝液中のパラニトロフェニルホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ）で決定した。４０５ｎｍでの光学密度は、マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ. Ｗｉｎｏｏｓｋｉ, ＶＴ）で読み取った。
【００９１】
膨張反応の定性的な性質が６Ａ亜型の検出を防止し得るために、亜型が、膨張反応に用いたウサギ血清を用いる定量的アッセイで同定可能で有り得るかを決定した。これは、肺炎球菌の溶解物が、ＥＬＩＳＡプレート上で固定化された６Ａ ＰＳに対するウサギ抗血清の結合を阻害することを可能とする阻害アッセイに対してウサギ血清を適合することにより決定した（図１）。対照として、肺炎球菌溶解物を２つのｍＡｂ：Ｈｙｐ６ＡＧｌおよびＨｙｐ６ＡＭ３の阻害につきテストした（図１Ａおよび１Ｂ）。３つの６Ａα単離物の溶解物（米国からのＣＨＰＡ３７８、韓国からのＫＫ５８およびブラジルからのＳＴ５５８）は、双方のｍＡｂを阻害し、２つの６Ｂ単離物（ブラジルからのＳＴ４００およびＳＴ５１８）の溶解物は、いずれのｍＡｂも阻害しかかった（図１Ａおよび１Ｂ）。６Ａβ単離物の２つの溶解物（ブラジルからの株ＢＺ１７およびＢＺ６５０）は、１：１０００希釈でさえ、Ｈｙｐ６ＡＧｌの結合を明確に阻害した（図１Ａ）。しかしながら、それらは１：１０希釈でさえ、Ｈｙｐ６ＡＭ３に、ほとんど阻害を示さなかった（図１Ｂ）。
【００９２】
肺炎球菌溶解物が、プールＱ（血清型別につきしばしば用いるウサギ抗血清（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, ３１ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２０９７−２１００（１９９３））の阻害につき検討された場合、６Ａαおよび６Ａβの双方の溶解物は同様に良好に阻害できたが、６Ｂ溶解物は阻害できなっかた（図１Ｃ）。「６ｂ」因子特異的ウサギ血清をテストした場合、６Ａα、６Ａβおよび６Ｂ単離物のすべてが、因子血清を同様に良好に阻害できた（図１Ｄ）。６ｂ−因子血清が６Ａ特異的に設計されるために、これは予期されなかった。しかしながら、その因子血清は、この阻害アッセイにおいてではなく、膨張反応において特異的であるように設計する。しかしながら、この実験は、肺炎球菌の型別に一般的に用いられるウサギ抗血清が６Ａおよび６Ｃの亜型を同定しないことを示した。
【００９３】
また、発明者らは、オプソニン化アッセイおよび高レベルの抗６Ｂ抗体を含むヒト血清を用いて、種々の６Ａα、６Ａβおよび６Ｂ単離物を比較した。ヒト血清は６Ｂならびに６Ａαをオプソニン化した（図２）が、それは、ブラジル、韓国および米国からの７つの異なる６Ａβ単離物をオプソニン化しなかった（図２）。
【００９４】
実施例４．ヒト抗血清は、２つの６Ａ亜型に対して等しく防御的ではない。
ヒト抗血清が６Ａβではなく６Ａαおよび６Ｂをオプソニン化しかねないために、発明者らは６Ａα、６Ｂおよび６Ａβ血清型をオプソニン化させるために系統的に２０名の成人からの血清試料を検討した（図３Ａ）。血清ドナーは少なくとも５年間肺炎球菌ワクチンを予防接種されなかった。大部分の個体は低オプソニン化力価を有したが、４名の個体が血清型６Ｂにつき１００を超えるオプソニン化力価を有した。その４つの個体からの血清は、６Ａαに対する有意なオプソニン化力価を有したが、１つだけは６Ａβに対する有意な力価を有した。その観察は、成人集団が６Ａαより６Ａβに対してより少ない自然免疫を有することを示唆する。
【００９５】
６Ｂでの免疫化が６Ａβと交差反応する抗体を誘導するかを検討するために、発明者らは、肺炎球菌ワクチンで免疫した２０名の成人からの血清を試験した（図３Ｂ）。１０名は９価の肺炎球菌結合型ワクチン（ＰＣＶ）で免疫し、１０名は２３価のＰＳ結合ワクチン（ＰＰＶ）で免疫した。ＰＣＶで免疫した１０名のうちの８名は、６Ｂにつき高い（＞１００）オプソニン化力価を有した。これらの８名のうち７名が、６Ｂ力価と相応した６Ａαに対するオプソニン化力価を有したが、１名だけが６Ｂ力価と相応した６Ａβ力価を有した。その人の血清がほとんど、６Ｂと同様に６Ａαをオプソニン化したため、６Ａβと交差反応する抗６Ｂ抗体を誘発したようである。ＰＰＶワクチン被接種者を検討した場合、５名が６Ｂに対する高オプソニン化力価（＞１００）を有し、２名が６Ａαに対する高力価を有したが、６Ａβに対する高力価を有したものはなかった（図３Ｂ）。総合すれば、これらの知見は、現在、利用可能な肺炎球菌ワクチンが６Ａβ感染に対してより、良好に６Ａαに対する保護を提供し得ることを示唆する。
【００９６】
実施例５．肺炎球菌を同定するのに有用なモノクローナル抗体の開発
従前に記載のごとく、マウスハイブリドーマを生成した。Ｙｕら, ２００５（Ｓｕｎら, ６９ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ３３６−４４（２００１）を引用）. 略言すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＰＳ蛋白質コンジュゲートで２回（第０および２１日に）皮下的に、および第５９日に１回腹腔内にて免疫した。７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４および１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）についての免疫原は、Ｐｒｅｖｎａｒ（Ｗｙｅｔｈ Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ, Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ, ＮＹ）であった。血清型５および７Ｆに用いたコンジュゲートは、米国食品薬品局（Ｂｅｔｈｅｓｄａ, ＭＤ）で調製され、その６ＡコンジュゲートはＰｏｒｔｅｒ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ, ＮＹ）の贈与であり、卵白アルブミンに対する血清型１、３および９Ｎのコンジュゲートは以下のように調製した。臭化シアン活性化ＰＳは、一晩培養中に卵白アルブミンにカップリングした。ＰＳ蛋白質コンジュゲートは、分子量サイズ分離カラムで反応混合物から精製した。各用量は、血清型４、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆについて１μｇのＰＳ；血清型３および６Ｂについて２μｇ；および血清型１、５、６Ａ、７Ｆおよび９Ｎについて１０μｇを含有した。一次および二次の免疫原は、１０μｇのＱｕｉｌ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ, Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）を含有した。
【００９７】
最後の免疫化の３日後に、従前に記載されたように、マウスを犠牲にし、脾臓を採取し、脾細胞をＳＰ２／０ Ａｇ−１４と融合させた。Ｎａｈｍら, １２９ Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １５１３−１８（１９８２）. 初代培養ウェルを望ましい抗体の産生につきスクリーニングし、かかる抗体を産生するウェルを限界希釈によって２回クローニングした。ヒト−マウスハイブリドーマＤｏｂ９を、従前に記載のごとく、２３−価のＰＢワクチンで免疫した人からの末梢血リンパ球をハイブリダイズすることにより生成した。Ｓｕｎら, ６７ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. １１７２−７９（１９９９）．
【００９８】
ヒト−マウスハイブリドーマは、肺炎球菌血清型１９Ａおよび１９Ｆに特異的である。全てのハイブリドーマは、１つの１１ｇＡ産生株を除いて、ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体のいずれかを生成した。ＨｙｐβＡＧｌはＩｇＧであり、Ｈｙｐ６ＡＭ６はＩｇＭである。
【００９９】
６Ａ血清型に特異的な合計２１種のハイブリドーマを単離した。多数が同様の血清学的挙動を有し、いくらかは姉妹クローン（すなわち、いくらかは同一の可変領域構造を有し得る）であり得る。生成された６Ａ特異的ハイブリドーマの名称は、Ｈｙｐ６Ａｌ、ＨｙｐβＡＭｌ、Ｈｙｐ６ＡＭ２、Ｈｙｐ６ＡＭ３、Ｈｙｐ６ＡＭ４、Ｈｙｐ６ＡＭ５、Ｈｙｐ６ＡＭ６、Ｈｙｐ６ＡＭ７、Ｈｙｐ６ＡＭ８、Ｈｙｐ６ＡＭ９、Ｈｙｐ６ＡＭｌＯ、Ｈｙｐ６ＡＭ１１、Ｈｙｐ６ＡＭ１２、Ｈｙｐ６ＡＭ１３、Ｈｙｐ６ＡＧｌ、Ｈｙｐ６ＡＧ２、Ｈｙｐ６ＡＧ３、Ｈｙｐ６ＡＧ４、Ｈｙｐ６ＡＧ５、Ｈｙｐ６ＡＧ６、Ｈｙｐ６ＡＧ７である。
【０１００】
実施例６．６Ａβの遺伝学的試験
非莢膜の肺炎球菌株を６Ａβ単離物からの遺伝子で容易に形質転換できた（未発表データ）。この知見は、６Ａβ莢膜合成が１つの（複数ではない）遺伝子断片、おそらく莢膜遺伝子座を必要とすることを示唆する。６Ａβ発現を担う遺伝子を同定するために、発明者らは３つのトランスフェラーゼ（ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯおよびｗｃｉＰ）を検討した。ｗｃｉＰ遺伝子は６Ａαと６Ａβ単離物との間で同一で有り得る（前記のごとく）。ｗｃｉＮ領域がプライマー５０１６および３１０１（５１０６：５’−ＴＡＣ ＣＡＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＴおよび３１０１：５’−ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＧＣ）を用いるＰＣＲによって検討された場合、検討した９つの６Ａα単離物のすべては、検討した６つの６Ａβ単離物のすべてより約２００塩基対（ｂｐ）長い生成物を与えた（図５）。６つの単離物は、韓国、米国およびブラジルからの６Ａβ単離物を含んだ。かくして、このＰＣＲは６Ａ亜型についての遺伝子テストとして用いることができる。
【０１０１】
次いで、１つの６Ａα単離物（ＡＡＵ９）および１つの６Ａβ単離物（ＳＴ７４５）からのＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列を決定した（図６）。ＡＡＵ９ ＰＣＲ生成物における１２０３〜２９５９位間の塩基（１７５７塩基）のすべてを配列決定し、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて報告された６Ａ単離物の莢膜座配列であるＣＲ９３１６３８に相同性であることが判明した。対照的に、そのＳＴ７４５配列は、１３６８位までで、２５９１位から再び開始する６Ａαのそれとほとんど同一であることが判明した。介在する１０２９ｂｐ配列（１３６９〜２３９７）は、６Ａαのそれとは全く異なる。介在配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにより多糖体合成に用いられたトランスフェラーゼに類似する約９８ｂｐを含む。
【０１０２】
実施例７．６Ｃ単離物は化学的に区別される莢膜を有する
２つの６Ｃ単離物（ＢＺ１７およびＢＺ６５０）、４つの６Ａ株（ＳＰ８５、ＳＴ５５８およびＣＨＰＡ３７８）および２つの６Ｂ株（ＳＴ４００およびＳＴ５１８）を比較した。全ての肺炎球菌単離物は、肺炎球菌の典型的なコロニー形態学を有し、オプトヒン感受性で、かつ胆汁可溶であった。上記実施例３に記載のごとく、サブタイピングアッセイを行った。
【０１０３】
多糖体単離および精製：肺炎球菌株（ＳＰ８５またはＢＺ１７）を、塩化コリン、炭酸水素ナトリウムおよびシステイン−ＨＣｌを補足したＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ, ＫＳ）からの２リットルの化学的に規定された培地（ｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎら, ２７ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ４４４−４９（１９８０））中で増殖させ、０.０５％デオキシコール酸塩で溶解した。遠心によって細胞片を除去後、ＰＳを７０％エタノール中で沈殿させ、１２０ｍＬの０.２Ｍ ＮａＣｌにそれを溶解することにより回収した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）中でＰＳを透析後、ＰＳをＤＥＡＥセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｕｐｐｓａｌａ, Ｓｗｅｄｅｎ）カラム（５０ｍｌ）に負荷し、ＮａＣｌ濃度勾配で溶出した。得られた画分を前記のごとき阻害アッセイで６Ａαまたは６ＡβＰＳにつきテストした。ＰＳ含有画分をプールし、エタノール沈澱（７０％）により濃縮し、透析し、次いで凍結乾燥した。凍結乾燥したＰＳを３ｍｌの水に溶解し、１２０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するゲル濾過カラムに負荷した。ＰＳを水でカラムから溶出し、次いで、全画分を阻害アッセイで６ＡβＰＳにつきテストした。第１の６Ａαまたは６ＡβＰＳピークを含む画分をプールし、凍結乾燥した。
【０１０４】
単糖体分析：凍結乾燥した莢膜ＰＳを８０℃にて１６時間１.５Ｍ ＨＣｌ中のメタノリシスに付した。メタノール性ＨＣｌを蒸発後、残渣を室温で２０分間 Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ. Ｉｎｃ. Ｒｏｃｋｆｏｒｄ, ＩＬ）で処理した。反応生成物を、３０ｍ（直径０.２５ｍｍ）のＶＦ−５キャピラリーカラムを取付けたＧＬＣ／ＭＳ（Ｖａｒｉａｎ ４０００, Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ. Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ, ＣＡ）で分析した。カラム温度は、１００℃にて５分間維持し、次いで、２０℃／分にて２７５℃まで増加させ、最終的に２７５℃に５分間保持した。溶出物は電子衝撃イオン化モードを用いる質量分析法により分析した。
【０１０５】
酸化、還元および加水分解：莢膜ＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を、８０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４）中の４０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムで暗所４℃にて４日間処理した。過剰の過ヨウ素酸塩をエチレングリコールで中和後、試料を透析し、次いで凍結乾燥した。Ｓｔｒｏｏｐら, ３３７ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ. Ｒｅｓ. ３３５−４４（２００２）. ＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を、２００ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４またはそのジューテリウム形態ＮａＢＤ４でＲＴにて３時間還元し、透析し、次いで凍結乾燥した。酸化／還元した６Ｃ ＰＳを０.０１Ｍ ＮａＯＨ中で８５℃にて３０分間加水分解し、０.０１Ｍ ＨＣｌを添加することにより中和し、次いで脱塩なくして質量分析法に直接的に用いた。
【０１０６】
タンデム型質量分析：天然および酸化／還元した６Ｃのタンデム型質量分析を電子スプレーイオン源を装備したＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｌｔｄ. Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ, ＵＫ）を用いてアラバマ大学バーミンガム校のＭａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて行った。蒸留水に溶解した試料をハーバードシリンジポンプを用いて、１μＬ／分の速度にて、泳動用緩衝液（０.１％ギ酸を含有する５０／５０のアセトニトリル／水）と共に質量分析計に注入した。注入した試料は、電子スプレー（ニードル電圧＝２.８ｋＶ）で負にイオン化され、ＴＯＦ質量分析計で検出した。注入した試料は、電子スプレー（ニードル電圧＝２.８ｋＶ）で負にイオン化され、ＴＯＦ質量分析計で検出した。ＭＳ／ＭＳについて、親イオンをアルゴンガスとの衝突前に４０ｅＶまでそれを印加することにより、娘イオンに断片化した。娘イオンはＴＯＦ質量分析計で分析した。ＭＳ／ＭＳスペクトルはＭａｓｓＬｙｎｘ ３.５のＭａｘ−Ｅｎｔ３モジュールを用いて処理した。
【０１０７】
スミス勾配およびグリセロール検出：過ヨウ素酸塩で処理した６Ａαおよび６Ａβ ＰＳを１Ｍ水酸化アンモニウム中の１０ｍｇ／ｍｌナトリウムボロジューテリドで１６時間還元した。過剰のナトリウムボロジューテリドを氷酢酸の添加により除去し、０.５ｍｌのメタノール：酢酸（９：１）を添加した。試料を窒素流下で乾燥し、０.２５ｍｌのメタノールで２回洗浄した。乾燥試料を０.５ｍｌの１.５Ｍメタノール性ＨＣｌ中に懸濁し、８０℃にて１６時間インキュベートした。試料を窒素流下で乾燥し、０.２５ｍｌのメタノールで２回洗浄した。乾燥試料を０.１ｍｌのＴｒｉ−Ｓｉｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）中に懸濁し、８０℃にて２０分間インキュベートした。１μｌの試料を、６０ｍのＶＦ−Ｉカラムを装備したＶａｒｉａｎ ４０００ガスクロマトグラフ‐質量分析計（Ｖａｒｉａｎ ４０００, Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ. Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ, ＣＡ）に注入した。ヘリウムを１.２ｍｌ／分の一定流速にてキャリヤーガスとして用いた。オーブン条件は、２分間保持した５０℃の初期温度、１５Ｏ℃まで３０℃／分の温度増加、次いで２２０℃まで３℃／分にてさらに増加させ、それを２分間保持した。注入温度を２５０℃に、ＭＳトランスファーラインを２８０℃に維持した。ＭＳデータ取得パラメーターは、アセトニトリルを用いる電子衝撃（ＥＩ）モード、または化学イオン化（ＣＩ）モードにおいてｍ／ｚ ４０〜１０００を走査することを含んだ。
【０１０８】
６Ａα ＰＳのクロマトグラフィーは、従前の刊行物と一致するリビトール、ラムノース、グルコースおよびガラクトースの特性である全てのピークを示した（図７Ａ）。Ｋｉｍら, ３４７ Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２６２−７４（２００５）. 例えば、ガラクトースは、１１.２〜１１.６分の保持時間に出現する３つの主要なピークを与え、その第２のピークは最も高かった。Ｋｉｍら（２００５）. ６ＡβＰＳクロマトグラムを検討した場合、リビトール、ラムノースおよびグルコースの特徴的なピークが見出されたが、ガラクトースのピークは不存在であった。各炭水化物ピークの面積をラムノースのピーク面積に標準化し、６Ａαおよび６Ａβ間で比較した場合（図７Ｂ）、６Ａαおよび６Ａβ ＰＳは、リビトールピークの等価な面積を有する。しかしながら、６Ａβのグルコースピーク面積は、６Ａαの２倍であった（図７Ｂ）。この知見は、６Ａβの反復単位は、６Ａαとして１つのリビトールおよび１つのラムノースを有するが、１つの各々のグルコースとガラクトースの分子に代わる２つのグルコース分子を有することを示唆した。かくして、６Ａβは、ガラクトースに代えてグルコースを用いることによる６Ａαにより生成したＰＳとは化学上異なる莢膜ＰＳを生成する。
【０１０９】
６Ａβ ＰＳに存在すると推定した２つのグルコース分子をさらに調査するために、６Ａαおよび６Ａβ ＰＳを、隣接するグリコールを選択的に破壊する過ヨウ素酸塩で処理した。
６Ａ ＰＳの公表した構造から期待されるように、６Ａα ＰＳのガラクトースおよびリビトールピークを検出できなくなるが、グルコースおよびラムノースのピークは影響を受けなかった。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖｉｅｗ, ｉｎ Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ＆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ８１−１１４（Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ, Ｌａｒｃｈｍｏｎｔ, ２０００）；Ｋｉｍら, ３４７ Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２６２−７４（２００５）；Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, ８３ Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. ３０５６−５９（１９６１）. ６Ａβ ＰＳを過ヨウ素酸塩処理した場合、そのリビトールは検出できなくなり、そのグルコースピークは約半分だけ低下し、一方、そのラムノースピークは影響を受けないままであった（図７Ｂ）。この知見は、６Ａα ＰＳ構造がその文献において公表された６Ａ ＰＳ構造と同一であることを強く示唆する。また、それは、６Ａβ ＰＳが６Ａα ＰＳとは化学的に異なり、６Ａβ ＰＳが２つのグルコース分子を有し、その一方は過ヨウ素酸塩に感受性であり、他方は感受性ではないことを示す。
【０１１０】
実施例８．反復単位内の単糖体／リビトール配列の決定
６Ａ ＰＳの穏やかなアルカリ加水分解は、各反復単位におけるホスホジエステル結合を壊し、負電荷を持つ反復単位を生成し、次いで、それをタンデム型質量分析で検討できる。（株ＳＰ８５からの）６Ａα ＰＳの加水分解生成物は、負電荷を持つ３つの十分に規定されたピーク：６８３.２１、７０１.２１および７５９.１９の質量電荷比（ｍ／ｚ）単位を持つピーク（図８Ａ）を示した。６８３.２１ｍ／ｚ単位のピークは、７０１.２１ｍ／ｚ単位のピークの無水形態を表わし、７５９.１９でのピークは、ＮａＣｌ塩で７０１.２１ｍ／ｚ単位を持つ分子を表わす。これは、反復単位の質量が記載のごとき６８３.２１質量単位であることを示す。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, ２０００；Ｋｉｍ, ２００５. ７０１.２１のピークの娘イオン（生成物イオン）を検討し、５３９.１３、３７７.０８および２１２.９９ｍ／ｚ単位の質量を持つ娘イオンを与え、それらは、各々、グルコース−ラムノース−リビトール−Ｐ、ラムノース−リビトール−Ｐおよびリビトール−Ｐフラグメントの質量に対応する（図８Ｃ）。また、７０１.２１、５３９.１４、３７７.０８および２１２.９９ｍ／ｚ単位のそれらの無水相当物。９６.９４および７８.９３ｍ／ｚ単位で観察したさらなるピークは、Ｈ２ＰＯ４−およびＰＯ３−イオンを表わす（図８Ｃ）。
【０１１１】
６Ａα ＰＳに用いた同一手順を用いる６Ａβ ＰＳの分析は、６Ａα ＰＳにつき見出された３つの主要なピークに対応する６８３.２４、７０１.２５および７５９.２２ｍ／ｚ単位での３つの主要なピークを示した（図８Ｂ）。また、６Ａβ切断生成物は、６Ａαのものと同一の質量スペクトルを有した（図８Ｄ）。この知見は、６Ａβ ＰＳの反復単位の質量が６８３.２ｍ／ｚ単位であり、６Ａβ反復単位の炭水化物配列がグルコース１−グルコース２−ラムノース−リビトール−Ｐであることを示した。（その２つのグルコースを区別するために、それらをグルコース１およびグルコース２と標識する。グルコース１は６Ａαのガラクトースに対応する。）かくして、６Ａβの単糖体配列は、ガラクトースのグルコース１での置換を除いて、６Ａαのそれと同一である。
【０１１２】
実施例９.６Ａβ反復単位の炭水化物およびリビトール間の連結の決定。
過ヨウ素酸塩感受性の６Ａβグルコースを同定するために、６Ａβ ＰＳを酸化し、穏やかなアルカリ加水分解により反復単位を還元し、その反復単位をタンデム型質量分析で試験した。それらの質量スペクトルを、６５０および７００ｍ／ｚ単位間のいくつかの主要な（および優位な）ピークを示した（図９Ａ）。優位なピークは、６５５.２３、６５９.７３、６６１.２４、６６４.２５、６７３.２５および６７５.２４ｍ／ｚ単位にあった。天然同位元素により、各優位なピークは１または２のさらなる質量単位を持つサテライトピークを有し、これらのサテライトピークを用いて、優位のピークの荷電状態および真の質量を決定できる。Ｃｏｌｅ、エレクトロスプレーイオン化質量分析：基礎、計測および適用（Ｗｉｌｅｙ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ２０００）。例えば、６６１.２４ｍ／ｚ単位の優位なピークは、６６１.５７ｍ／ｚ単位を持つサテライトピークを有する。これらの２つのピークが０.３３ｍ／ｚ単位によって分離されるために、６６１.２４のピークは、３つの負電荷を持つ分子イオンおよび１９８３.７２の質量単位（すなわち、１つの水分子を含む３つの反復単位；６５５.２３＊２＋６７３.７６＝１９８３.７２）を表わす。同様に、その６６４.２５および６７５.２４のピークは、２つの負電荷を持つ２つの反復単位を表すが、その６７５.２４のピークは陽子を交換するナトリウムイオンを有する。６７３.２５および６５５.２３のピークは、水分子がある、または水分子のない１つの負電荷を持つ１つの反復単位を表わす。酸化／還元に先立って無水反復単位の質量が６８３.２６であったために、反復単位は酸化および還元により２８質量単位を損失した。リビトールおよびグルコースの過ヨウ素酸塩反応生成物を同定するために、リビトールフラグメントをＲｘフラグメントと命名し、その２つのグルコースフラグメントをＧｘおよびＧｙフラグメントと命名した（図１０Ａ）。
【０１１３】
娘イオンは、６７３.２５ｍ／ｚ単位を持つ親イオンを断片化することにより得た（図９Ｂ）。断片化中に、１つのフラグメントは１つの原子質量単位（ＡＭＵ）を他のフラグメントと交換し得る。Ｇｒｏｓｓｅｒｔら, ２０ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ. Ｍａｓｓ. Ｓｐｅｃｔｒｏｍ. １５１１−１６（２００６）；ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ ３１ Ａｎａｌ. Ｃｈｅｍ. ８２−８７（１９５９）. また、分子イオンは、アルゴン衝突セル内で不定に水和されるようになる。Ｓｕｎら, ６９ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ３３６−４４（２００１）. 事実、娘イオンを１８ｍ／ｚ単位（図９Ｂ）の差に基づいて水和および無水ピークにグループ化できた。６７３.２５、５８１.１６、５０９.１３、３４７.０７および２００.９９ｍ／ｚ単位で見出されたピークは水和したピークであり、その各々は、１８ＡＭＵ小さい対応する無水ピークを有する。また、２００.９９、３４７.０７および５０９.１３ｍ／ｚ単位のピークは、切断化中に切断化サイト（図１０Ｂ）に加えられた１つの水素原子を持つ２００、３４６のおよび５０８ＡＭＵを持つフラグメントに対応する。２００.９９ｍ／ｚ単位のピークは、リビトールが過ヨウ素酸塩処理中にＣＨ２ＯＨを損失したことを確認する。３４７.０７および５０９.１３でのピークは、ラムノースおよびグルコース２が過ヨウ素酸塩抵抗性であることを示す。５８１.１６でのピークの存在は、グルコース１が切断されることを示す。
【０１１４】
過ヨウ素酸塩切断は、グルコース１を２部（それらを図１０Ａ中のＧｘおよびＧｙと命名した）に分割した。２部の組み合わせた質量は、グルコース１が炭素を損失しなかったが、酸化還元反応中に切断部位で２つの水素原子を得たために、１６２（無傷のグルコースの質量）に代わる１６４である。図９に示した質量スペクトルは、各々、９１および７４ＡＭＵを有するＧｘおよびＧｙと一致する。５８１.１６ｍ／ｚ単位のピークは、反復単位がＧｘおよび１つの余分な陽子を損失したことを示す（図１０）。ＧｘおよびＧｙ（７４ＡＭＵ）の双方の中性の損失の結果、Ｇｙが既にＧｘに対する１つの水素を損失し、グルコース２に１つの水素を残すために、７２ｍ／ｚ単位をさらなる損失を生じる。同一パターンが、無水ピーク：すなわち、６５５.２２、５６３.１６および４９１.１２ｍ／ｚ単位につき判明した。さらに、６Ａβ ＰＳをＮａＢＤ４で還元した場合、２つのさらなる質量単位はグルコース１に関係していた：Ｇｘフラグメントの中性の損失は９２に代えて９３であり、Ｇｙのそれは７２に代えて７３であった（図４Ｃ）。これらの知見は、グルコース１が、図１ＯＡに示すサイズを持つＧｘおよびＧｙに切断することを明確に示した。
【０１１５】
また、娘イオンの質量スペクトルは、６Ａβ ＰＳのグリコシド結合についての情報を提供した。グルコースおよびラムノースはそれらの最初の炭素にて先の炭水化物に連結されなければならない。Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, １９６１. また、それらは過ヨウ素酸塩に抵抗性であるために第３の炭素もて次の炭水化物に連結されなければならない。Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, １９６１. かくして、６Ａβ ＰＳは、グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→）を有しなければならない。娘イオンのさらなる検討は、それらのグルコース１がその第２の炭素にてホスホジエステル結合を有することを示す。過ヨウ素酸塩感受性であるために、グルコース１は、２、４または６位でのみそのホスホジエステルリンクを有しなければならない。ホスホジエステル結合連結は、６での結合がグルコース１中の炭素原子の損失を生じるために６位ではない（図１０Ｆ）。ホスホジエステル連結が４位ならば、切断は第２および第３の炭素間で生じる。次いで、ＧｘおよびＧｙは１２０および４２ＡＭＵを有し、５５２ｍ／ｚ単位を持つピークは５８１ｍ／ｚ単位（図１０Ｅ）でのピークに代わって検出されるであろう。
【０１１６】
加水分解はグルコース１とのホスホジエステル結合を切断するが、それは時々代わりにリビトールとのホスホジエステル結合を壊す。この逆切断生成物の検討は、ホスホジエステル結合がグルコース１の第２の炭素になければならないことをさらに確認する。１５０.９５および２４３.００ｍ／ｚ単位を持つピークは、これらのｍ／ｚ単位を持つ生成物が、第２の炭素（図１０Ｄ）でのホスホジエステル結合でグルコース１から生成でき、これらのピークが、還元がＮａＢＨ４に代えてＮａＢＤ４で行う（図９Ｃ）ならば、１（１５０.９５→１５１.９７）または２（２４３.００→２４５.０２）を超えるｍ／ｚ単位を有するので、グルコース１の逆切断生成物である（図９Ｂ）。また、１２０.９５ｍ／ｚ単位のイオンは、１５０ｍ／ｚ単位でのイオンが末端のメタノール基を損失するならば得ることができる。これらのピークは、ホスホジエステル結合が第４または第６の炭素（図１０Ｅおよび１０Ｆ）にあれば、説明できない。かくして、逆の切断生成物でのデータも、ホスホジエステル結合がグルコース１の第２の炭素に連結することを示す。
【０１１７】
質量スペクトルのさらなる検討は、ラムノース−リビトール連結が（１→３）でなければならないことを示した。肺炎球菌がそれらの莢膜合成のためのタイコ酸合成のために同様に生成されるＣＤＰ−５−リビトールを用いる（Ｐｅｒｅｉｒａ ＆ Ｂｒｏｗｎ ４３ Ｂｉｏｃｈｅｍ. １１８０２１２（２００４））ために、リビトールおよびグルコース１間の連結はリビトール（５→Ｐ→２）グルコース１でなければならない。７８.９４および９６.９４のピークは、ＰＯ３−およびＨ２ＰＯ４−に対応するが、１８２.９８および２００.９９でのピーク（図９Ｂ）は、ＰＯ３−およびＨ２ＰＯ４−に結合したＲｘフラグメントに対応する（図１０Ａ）。かくして、リビトールは、酸化還元反応中にヒドロキシメチル基を失うに違いなく、ラムノースおよびリビトール間の連結はラムノース（１→３）リビトールでなければならない。上記の全てを考慮すると、６Ａβ反復単位は、｛Ｐ→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→｝となるべきである（図１０Ｃ）。
【０１１８】
６Ａα ＰＳを分析した場合、６Ａβ ＰＳピークと同一のピークを見出し、それはガラクトースおよびリビトールが過ヨウ素酸塩によって破壊したが、グルコース２およびラムノースが無傷のままであったことを示す。かくして、６Ａα ＰＳの構造は、｛→２）ガラクトース（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→Ｐ）に違いなく、それは文献に公表された６Ａ ＰＳ構造と同一である。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, ２０００；Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, １９６１. 要約すると、６Ａおよび６Ｃ ＰＳ間の唯一の構造の差は、グルコース１（またはガラクトース）の第４の炭素での水酸基の配向である。
【０１１９】
古典的に、６Ａ ＰＳのホスホジエステル結合は、酸化および還元した６Ａ ＰＳのスミス分解後にグリセロールが遊離されることを示すことにより、ガラクトースの第２の炭素にあることが決定された。Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, １９６１．この古典的アプローチを用いて６Ａβホスホジエステル結合の位置を確認するために、前記のごとく、酸化および還元後の６Ａαおよび６Ａβ ＰＳのスミス分解を行なった。６Ａαおよび６Ａβ ＰＳの反応生成物は、２つのＰＳからのグリセロールを示した。かくして、グルコース１は、グルコース１の第２の炭素にてホスホジエステル結合を有する。
【０１２０】
実施例１０．血清型６Ｃの遺伝子起原
菌株および培養：その試験に用いた肺炎球菌株を表４にリストする：
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
早期に報告されたブラジルからの６Ｃ単離物（Ｌｉｎら, ２００６）に加えて、さらなる６Ｃ株を「６Ａ」血清型としてその研究所で保管された、前から存在する肺炎球菌単離物を再型別することにより同定した。収集は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら, １８４ Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ６３６７−７５（２００２）；Ｍａｖｖｏｉｄｉ, ２００４；およびＰａｙｎｅ（Ｐａｙｎｅ, ２００６年提出）による試験に用いた６Ａ単離物を含む。１つの株（ＢＧＯ−２１９７）をＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ, Ａｌａｂａｍａ, ＵＳＡにて１９７９年に単離した。ＴＩＧＲ４ＪＳ４株は、ＴＩＧＲ４株（Ｔｅｔｔｅｌｉｎら, ２９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４９８−５０６（２００１））の非莢膜の変種であり、ヤーヌスカセット（Ｊａｎｕｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ）（ｋａｎＲ−ｒｐｓＬ＋）でタイプ４莢膜遺伝子座を置換し、野性型ＴＩＧＲ４（Ｔｒｚｃｉｎｓｋｉら, ６９ Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ. ７３６４−７０（２００３）；Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ（未発表））に３回戻し交配することにより生成した。ＴＩＧＲ６ＡＸ、ＴＩＧＲ６Ａ４およびＴＩＧＲ６Ｃ４は各々、無、６Ａまたは６Ｃの莢膜タイプを発現するＴＩＧＲ４ＪＳ４変種である。これらの変種を、後記に示すように生成した。
【０１２３】
ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定：この試験に用いたＰＣＲプライマーのすべてを表５にリストした。多座配列解析（ＭＬＳＴ）に用いたプライマーは、Ｅｎｒｉｇｈｔ ＆ Ｓｐｒａｔｔ, １４４（１１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３０４９−６０（１９９８）により記載した通りであり、ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯおよびｗｃｉＰ遺伝子を増幅するのに用いたプライマーは、Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４に記載された。さらなるプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ中の６Ａおよび６Ｂ莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列（各々、受入れ番号ＣＲ９３１６３ＳおよびＣＲ９３１６３９）を用いて設計した。
【０１２４】
【表６】
【０１２５】
莢膜遺伝子座ＰＣＲについて、反応混合物は１０〜３０ｎｇの染色体ＤＮＡ、１００−ｐｍｏｌストックからの１μｌの各プライマー、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌの１０×緩衝液、０.５μｌ（２.５Ｕ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ, Ｓｈｉｇａ, Ｊａｐａｎ）、および３９.５μｌの滅菌水（Ｓｉｇｍａ, Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ, ＭＩ）を有した。多座配列解析用の反応混合物は、１０〜３０ナノグラムの染色体ＤＮＡ、５０−ｐｍｏｌストックからの１μｌの各プライマー、２μｌのＭｇＣｌ２、５μｌのＱ溶液（Ｑｉａｇｅｎ, Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ, ＣＡ）、１２.５μｌのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）および４μｌの滅菌水（Ｓｉｇｍａ）を有した。染色体ＤＮＡは、製造者の説明書に従いＷｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ, Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）で単離した。熱循環条件は：９５℃、３分間での最初の変性、３０サイクルの９５℃、１分間での変性、５２℃〜５８℃、１分間でのアニーリング、７２℃、２分間での伸張、および７２℃、１０分間での最後の伸長であった。多座配列解析は３０サイクルを用い、莢膜座遺伝子ＰＣＲは３５サイクルを用いた。ＰＣＲ生成物のサイズは、１％〜１.５％アガロースゲル中の電気泳動によって決定した。
【０１２６】
ＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列は自動ＤＮＡシークエンサーを用いて、アラバマ大学でのゲノミクスコア施設により決定し、ＰＣＲ生成物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。ＤＮＡ配列はＬａｓｅｒｇｅｎｅ ｖ. ５.１ ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ, Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）およびＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨサイトでのオンラインで位置したＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）で分析した。
【０１２７】
莢膜遺伝子座からの配列を従前に報告された配列と比較した。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４. 各配列タイプの対立遺伝子は、オンライン肺炎球菌多座配列解析（ＭＬＳＴ）ウェブサイトを用いて割り当てた。配列が異なっていた場合、新しい対立遺伝子番号を割り当てた。次いで、全てのｗｃｉＮβ配列を肺炎球菌ＭＬＳＴに寄託した。次いで、肺炎球菌単離物ＣＨＰＡ３８８の全莢膜遺伝子座をＧｅｎＢａｎｋに寄託した。
【０１２８】
世界的規模の出所から収集した６Ｃ株の遺伝プロフィールを表６に示す：
【０１２９】
【表７】
【０１３０】
６Ａおよび６Ｃ莢膜遺伝子座を持つＴ１ＧＲ４変種の生成：６Ｃ莢膜発現におけるｗｃｉＮ遺伝子の役割を調べるために、所望の遺伝子または遺伝子断片を、ＴＩＧＲ４に由来するが莢膜遺伝子座を欠いているＴＩＧＲ４ＪＳ４株に挿入した（図１１）。凍結した形質転換成分ＴＩＧＲ４ＪＳ４のアリコートを、６００ｎｍでの光電密度が約０.４〜０.５になるまで、３７℃でＴＨＹブロス中で増殖させ；０.５％酵母抽出物、０.２％ウシ血清アルブミン、０.０１％ＣａＣｌ２および１３％グリセロールを補足したトッド−ヒューウィット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ）培地（ｐＨ７.２）中でそれを１：１００希釈し；次いで、−８０℃にて２５０μｌアリコート中で凍結することにより調製した。
【０１３１】
ＴＩＧＲ４ＪＳ４を形質転換するために、冷凍した細菌アリコートを解凍し、５０ｎｇのコンピテンス刺激ペプチド変種２と混合した。Ｔｒｚｃｉｎｓｋｉら, ２００３. ３７℃での１４分間のインキュベーション後、１００μｌのＴＩＧＲ４ＪＳ４を、１０μｌの細菌溶解物（ＡＡＵ３３株）または１００ｎｇのＤＮＡカセットと混合した。３７℃での２時間のインキュベーション後、細菌を２００μｇ／ｍｌカナマイシンまたは３００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するヒツジ血液寒天培地プレートに捲き、ロウソクジャー中で３７℃にて培養した。抗生物質培地中で増殖させた形質転換体のコロニーを回収し、ＤＮＡレシピエントコンピテント細菌で３回戻し交配させた。
【０１３２】
形質転換のためのＡＡＵ３３の細菌溶解物を調製するために、１０ｍｌのＴＨＹブロスにＡＡＵ３３株を接種し、６００ｎｍでの光電密度が約０.４〜０.５となるまで３７℃にて約５時間培養した。そのＴＨＹブロスを遠心して、細菌ペレットを得、そのペレットを０.１％デオキシコール酸ナトリウムおよび０.０１％ナトリウム硫酸ドデシルを含有する０.１ｍｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（０.１５Ｍ、ｐＨ７.５）中に再懸濁し、次いで、３７℃で１０分間インキュベートすることによりそのペレットを溶解させた。次いで、溶解物（０.１ｍｌ）を、０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）で緩衝した０.９ｍｌの通常のセーラインと混合し、６５℃で１５分間加熱不活性化した。
【０１３３】
ＴＩＧＲ６Ａ４のｗｃｉＮα遺伝子領域をＣＨＰＡ３８８からのｗｃｉＮβ遺伝子領域と置換するために、発明者らは、図１１中のカセット１およびカセット２と標識した２つの異なるＤＮＡカセットを調製した。各カセットは３つのパーツ：標的ＤＮＡを含有する中核および２つのフランキングＤＮＡを有する。その２つのフランキングＤＮＡは相同性組換え用であり、各々約１ｋｂであり、ｗｃｈＡまたはｗｃｉＯ−Ｐ遺伝子のいずれかから得た。カセット１の中核は、カナマイシン抵抗性（ｋａｎａＲ）およびストレプトマイシン感受性（ｒｐｓＬ＋）遺伝子を有し、テンプレートとしてＴＩＧＲ４ＪＳ４株ＤＮＡを用いるＰＣＲによって得る。フランキングＤＮＡ断片を、テンプレートとしてＡＡＵ３３の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲによって得た。図１１および表５に示す全てのプライマーペアは制限酵素部位を有し、３つのＤＮＡ断片の連結を促す。その３つのＤＮＡ断片は、適当な制限酵素での消化、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ, Ｂｅｖｅｒｌｙ, ＭＡ）での連結により一緒に連結した。連結生成物をプライマー５１１３および３１０２を用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製し、ヌクレオチド配列決定に付した。次いで、ＰＣＲ生成物を形質転換においてドナーＤＮＡとして用いた。
【０１３４】
カセット２を用いて、抗生物質選択遺伝子をｗｃｉＮβ遺伝子と置換した。その中核はＣＨＰ Ａ３８８からのｗｃｉＮβ遺伝子を有する。ｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ−Ｐ ＤＮＡ断片はカセット１につき記載されたＡＡＵ３３からＰＣＲによって得た（図１１）。
【０１３５】
「６Ａ」コレクション中のさらなる６Ｃ株の同定：種々の位置から６Ｃ血清型の代表的なコレクションを得るために、発明者らは、膨張反応（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら, ２００２）により「６Ａ」株の発明者らの先在するコレクションを再テストし、３つの異なる大陸の５か国からのさらなる９つの６Ｃ単離物を同定した（表４）。これらの単離物を髄液、血液および鼻咽腔試料から得、これは６Ｃが侵襲性の肺炎球菌感染ならびに無症候性保因に関与し得ることを示す。１つの単離物（ＢＧＯ２１９７）はアラバマのバーミンガムで１９７９年に得られた。この知見は、本明細書に記載されるように最初に同定および単離した６Ｃ血清型が２７年間を超えて存在し得、今や世界中で見出されていることを示す。
【０１３６】
多数の６Ｃ株は、異なる配列タイプを除いて同一の莢膜遺伝子座プロフィールを有する：血清型６Ｃにつき遺伝的基礎を調査するのを始めるために、１２の単離物の莢膜遺伝子座プロフィールおよび配列タイプ（ＳＴ）を検討した。ブラジル６Ｃ単離物（Ｌｉｎら, ２００６）につき従前に観察されたものと同様に、すべての６Ｃ単離物は、ヌクレオチド差を持たないか、または１つのヌクレオチド差を持つｗｃｉＰ遺伝子の対立遺伝子９を有する。同様に、全ての６Ｃ単離物は、ヌクレオチド差を持たないか、または１つのヌクレオチド差を持つｗｚｘ遺伝子の対立遺伝子１を有する。全ての６Ｃ対立遺伝子は、対立遺伝子１を発現する１つの単離物を除いて、ｗｚｙ遺伝子につき対立遺伝子１０を有する。６Ｃ単離物の制限された莢膜遺伝子座プロフィールとは対照的に、多座配列解析は、６Ｃ単離物が様々なＳＴを発現することを示す。６Ｃが、複数のＳＴを持つが、１つの単一莢膜遺伝子座プロフィール（１つの単離物を除いて）と関係するという事実は、６Ｃ血清型を担う遺伝子がおそらく莢膜遺伝子座にあることを示唆する。
【０１３７】
６Ａおよび６Ｃの莢膜遺伝子座は、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ遺伝子間の領域において異なる：血清型６Ａおよび６Ｃ間の遺伝子差はグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子であり、この同一遺伝子は、血清型６Ａおよび６Ｂ間の差を担う同じ遺伝子であることを仮定した。ＰＣＲを用いて、それらのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のサイズを比較した場合、それらのｗｃｉＮ遺伝子のサイズが異なることが判明した。全ての６Ｃ単離物のｗｃｉＮ ＰＣＲ生成物は、約１.８ｋｂ長であったが、全ての６Ａ単離物のｗｃｉＮ ＰＣＲ生成物は約２ｋｂ長であった（図１２）。６Ａおよび６Ｃ血清型から２つのｗｃｉＮ遺伝子間を区別するために、それらを各々、ｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβと命名した。
【０１３８】
ｗｃｉＮβ遺伝子をさらに調査するために、５つの６Ｃ株（ＢＺ１７、ＢＺ８６、ＣＨＰＡ３８８、ＫＫｌ ７７およびＳＴ ２６０）からのｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ遺伝子を含むｗｃｉＮβ遺伝子領域のＤＮＡ配列を比較した。それらの配列がほとんど同一であったため、実際のＤＮＡ配列はＣＨＰＡ３８８のみにつき示し（図１３）、他の単離物の配列をＧｅｎＢａｎｋに寄託する。次いで、ＣＨＰＡ３８８からのｗｃｉＮβ遺伝子の配列をＧｅｎＢａｎｋ（第ＣＲ９３１６３８号）で利用可能な対応する領域の６Ａ配列と比較した（図１３）。比較の要約を図１４に示す。
【０１３９】
配列比較は、ｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβ遺伝子の明確な差を明らかにした：６Ｃ血清型は、６Ａ中の１２２２ｂｐ長のＤＮＡに代えて１０２９ｂｐ長のＤＮＡを有する（図１４および図１５）。２つのｗｃｉＮ遺伝子は完全に異なり、配列相同性はわずか約５０パーセントである。ＤＮＡ差はｗｃｈＡ遺伝子（１３６８位）の終了直後に始まり、ｗｃｉＯ遺伝子の始めの１３０塩基上流で終了する（６Ｃにつき２３９８位、６Ａにつき２６３１位）（図１４および図１５）。置換した遺伝子に隣接して位置するＤＮＡ配列を６Ａおよび６Ｃ間で比較した場合、かなり多数のＤＮＡ多形性が、２つのフランキング領域の外側の領域よりもフランキング領域中で判明した。例えば、置換した遺伝子から３００塩基上流は、２５の異なるヌクレオチドを有したが、その３００塩基から直ちに上流に位置した１５０塩基はたった１つの異なる塩基を有する（Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定によりｐ＜０.００１）（図１５）。同様に、３’方向において、２０塩基が近位の１１０塩基において異なるが、１塩基だけが次の３００塩基において異なる（Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定によりｐ＜０.００１）（図１５）。同様の結果が７つの異なる６Ａ株ＡＡＵ３３、Ｄ０２０−１Ｂ、ＨＳ３０５０、ＣＨＰＡ７８、ＫＫ６５、ＳＴ１９およびＳＴ５５８の配列で得られたために、これらの知見はこの特定の６Ａ配列（ＣＲ９３１６３８）にユニークではない。これらの知見は、２つのフランキング領域が、６Ａに挿入して６Ｃを創製する新しい遺伝子の一部分であったことを示唆する。
【０１４０】
フランキング領域は、６Ａ莢膜座へのｗｃｉＮβ遺伝子の相同組換えに関与していたのかもしれない。さらに、全ての６Ｃ単離物は同一のフランキング領域配列を有する。これは、遺伝子置換が１回だけ行なわれ、全ての６Ｃ単離物が、この単一の樹立細菌の子孫でなければならないことを示唆する。
【０１４１】
この遺伝子置換で、ｗｃｉＮβは、１１２５塩基長であって、新しいオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を有し、ＷＣＩＮβ蛋白質と命名される３７４アミノ酸を持つペプチドをコードする（図１３）。新しいＯＲＦの終止コドンは、６Ｃの２４９７および２５２８位に位置するｗｃｉＯ遺伝子についての２つの潜在的な開始コドン間にある。ｗｃｉＮβ遺伝子の配列をデータベース中の配列と比較した場合、６Ｃの１１０塩基（６Ｃ中の１６２７〜１７３６）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＲＺ１０６６のエキソポリサッカライド合成遺伝子の９０塩基に８１％相同性を示した（Ｂｏｌｏｔｉｎら, ２２ Ｎａｔ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. １５５４−５８（２００４）（図１３）。また、ｗｃｉＮβ遺伝子の翻訳配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｃａｐＨ遺伝子の翻訳した配列に２２％のアミノ酸同一性、および４４％の類似性を有する。Ｌｉｎら, １７６ Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ７００５ １６（１９９４）. ｗｃｉＮβ遺伝子産物はｗａａＧファミリーのメンバーである。付随的に、Ｅ. ｃｏｌｉ Ｋ−１２のｗａａＧ遺伝子産物はＬＰＳ合成に関与するαｌ,３−グルコシルトランスフェラーゼである。Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓら, ３０ Ｍｏｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２２１−３２（１９９８）．
【０１４２】
６Ａおよび６Ｃ血清型の莢膜遺伝子座の配列は、ｗｃｉＮ遺伝子以外の領域においてわずかだけ異なる：６Ａおよび６Ｃの莢膜遺伝子座がｗｃｉＮ部位においてのみ異なるかどうかを決定するために、６Ｃ単離物（ＣＨＰＡ３８８）の全莢膜座の配列を６つのオーバーラップするＤＮＡ断片中のｄｅｘＢおよびａｌｉＡ座間の全莢膜遺伝子座を増幅するＰＣＲによって分析した。図１６は、莢膜遺伝子座の配列の遺伝子地図を示す。全ＣＨＰＡ３８８座を図１７に示す。６Ｃ莢膜遺伝子座は、莢膜ＰＳ合成に関与する１４のＯＲＦを含んでいた。ＯＲＦは同一転写配向にあり、６Ａ莢膜遺伝子座につき判明したものに正確に対応する。６ＣのＯＲＦは５’末端でのｃｐｓＡ遺伝子から始まり、３’末端でのｒｍｌＤ遺伝子で終了する。図１６に示されるように、６Ｃ莢膜遺伝子座についての推定プロモーター結合部位および転写開始部位は、５’からｃｐｓＡ遺伝子までに見出され、推定転写ターミネーター部位は３’からｒｍｌＤ遺伝子までに見出される。加えて、多数の肺炎球菌莢膜遺伝子座につき一般的に見出された莢膜遺伝子座の両端での挿入配列（または「ｔｎｐ」または「トランスポサーゼ」）配列がある。Ｂｅｎｔｌｅｙら, ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ２：ｅ３１（２００６）. 全ての座のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託される。
【０１４３】
その配列を、前記のｗｃｉＮ領域を除いて、６Ａ株の莢膜遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＲ３１６３８）と比較した場合、６Ｃの莢膜遺伝子座は、６Ａのそれと非常に相同性（約９８％）であった。また、相同性は、ｃｐｓＡ ＯＲＦの中央での約６０ｂｐについてかなり低く（約７８％）、莢膜遺伝子座の両末端で見出された「ｔｎｐ」は、６Ａおよび６Ｃ莢膜遺伝子座間で異なっていた。６Ｃの莢膜遺伝子座はいくらかの６Ａまたは６Ｂ莢膜遺伝子座中のｗｃｉＯ遺伝子の上流に存在するＩＮＤＥＬを有しなかった。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４. これらの差にもかかわらず、６Ａおよび６Ｃ莢膜遺伝子座間の最も顕著な差が、ｗｃｉＮ領域において見出される。
【０１４４】
ｗｃｉＮ遺伝子部位は６Ａから６Ｃ血清型への変換を担う。莢膜遺伝子座の前記の比較は主要な差がｗｃｉＮ領域にあることを示したが、小さな差は、全莢膜遺伝子領域（例えば、ｃｐｓＡ ＯＲＦ）中に存在する。莢膜座の外側のいくらかの他の小さな遺伝子の差が６Ｃ発現に関与できることが可能である。ｗｃｉＮ領域だけが関与することを示すために、ｗｃｉＮβ領域でのｗｃｉＮα領域の交換が６Ａ血清型を６Ｃ血清型（図１１）に変換できるかを検討した。ＴＩＧＲ６Ａは、ＴＩＧＲ４の莢膜座を株ＡＡＵ３３からの６Ａ莢膜遺伝子座に置換することにより生成した。次いで、ｗｃｉＮα遺伝子はカセット１でそれを形質転換することによりＴＩＧＲ６Ａから取り出した。ＴＩＧＲ６ＡＸと命名された得られた株は、非莢膜であり、ＰＣＲを介して１３２５および２５１８位間のｗｃｉＮα遺伝子を喪失していることが判明した。次いで、ｗｃｉＮβ領域をＣＨＰＡ３８８からのｗｃｉＮβ遺伝子を含んでいたカセット２を用いてＴＩＧＲ６ＡＸに挿入した。ＰＣＲは、得られた株ＴＩＧＲ６Ｃが、予期した位置でｗｃｉＮβを有することを確認した。ＴＩＧＲ６Ｃは、血清型６Ｃを発現すると判明し、これはｗｃｉＮβ遺伝子領域が血清型転換に十分であることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】図２は、種々の肺炎球菌でのオプソニン化アッセイデータを示す。
【図３】図３は、オプソニン化力価比較を示す。
【図４】図４は、種々の肺炎球菌単離物からの一部のｗｃｉＰ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【図５】図５は、９つの６Ａα単離物で得られたＰＣＲ生成物を示すアガロースゲルの写真である。
【図６】図６は、単離物ＡＡＵ９（中央バー）およびＳＴ７４５（２つのパーツでの底部バー）の肺炎球菌の莢膜遺伝子座のｗｃｈＡ、ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯ領域のダイアグラムを示す。
【図７】図７は、過ヨウ素酸塩処理前後の６Ａα（上部）および６Ｃ（６Ａβ、底部）からの莢膜ＰＳの炭水化物組成物（パネルＡ）を示す。
【図８】図８は、６Ａα（パネルＡ）および６Ａβ（パネルＢ）の反復単位およびそれらの娘イオン（各々、パネルＣおよびＤ）の質量スペクトルを示す。
【図９】図９は、酸化および還元（パネルＡ）後の６ＡβＰＳの反復単位およびそれらの娘イオン（パネルＢおよびＣ）の質量スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、６Ｃ莢膜多糖体の提唱された化学構造およびその切断生成物の構造を示す。
【図１１】図１１は、ｗｃｉＮ領域交換実験ダイアグラムを示す
【図１２】図１２は、６Ａおよび６Ｃの単離物のｗｃｉＮ領域のＰＣＲ生成物の電気泳動パターンを示す。
【図１３】図１３は、ｗｃｈＡの３’末端およびｗｃｉＯ遺伝子の５’末端のヌクレオチド配列と共にｗｃｉＮβＯＲＦのヌクレオチド配列を示す。
【図１４】図１４は、６Ａ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＲ９３１６３８）および６Ｂ株（ＣＨＰ Ａ３８８）のｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβ領域のＤＮＡ配列を示す。
【図１５】図１５は、６Ａおよび６Ｃの単離物のｗｃｉＮ遺伝子を囲む莢膜遺伝子座の遺伝子地図を示す。
【図１６】図１６は、６Ａ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＲ９３１６３８）および６Ｃ株（ＣＨＰ Ａ３８８）の莢膜遺伝子座を示す。
【図１７】図１７は、６Ｃの血清型（単離物ＣＨＰＡ３８８）莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌学、免疫学および疫学に関する。より詳細には、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の新しい新興の血清型、ならびにこれらの血清型を同定するのに有用なアッセイ方法およびモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
（連邦政府支援研究の記載）
本発明は、部分的に、ＮＩＨ助成金番号ＡＩ ３００２１下、米国連邦政府によって資金供給された。従って、連邦政府は本発明においてある種の権利を有し得る。
【０００３】
（関連出願）
本願は、２００５年１２月２８日付で出願された米国仮特許出願第６０／７５４,３５４号および２００５年４月２８日付で出願された米国仮特許出願第６０／７９６,１３９号に関連し、それらの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００４】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、主として幼児および高齢者間の肺炎、髄膜炎、中耳炎ならびに敗血症についてのよく知られているヒト病原菌および主要な病原体である。ストレプトコッカス・ニューモニエは、血清学的に別個の炭水化物莢膜のその発現に基づいて９０種の血清型に分類されている。莢膜多糖体（ＰＳ）に対する抗体は、同一莢膜血清型を発現する肺炎球菌に対する防御を提供し得る。現在利用可能な肺炎球菌ワクチンは、複数の血清型の莢膜ＰＳの混合物を含む。例えば、ある肺炎球菌ワクチン（ＰＳワクチンと呼ばれる）は、２３種の一般的に見出された血清型からの莢膜ＰＳを含む。最も最近開発されたタイプのワクチン（共役ワクチンと呼ばれる）は、蛋白質分子に結合する７〜１３種の血清型からの莢膜ＰＳを含む。７価結合型ワクチンは、米国における臨床使用のために２０００年に導入され、小児および成人における侵襲性肺炎球菌疾病の発生率を低下させた。
【０００５】
肺炎球菌血清型の分布は、ワクチン効力を見積るのに有用である。理想的には、有効な肺炎球菌ワクチンは、ワクチンに含まれた血清型を発現する肺炎球菌の有病率を低下させ、非ワクチン血清型を発現する肺炎球菌の有病率を同じままとする。実際には、非ワクチンタイプを発現する肺炎球菌の有病率は、ワクチン血清型を発現するものに置き換わるように増加する。さらに、特定の血清型の有病率は、知られていない理由のために経時的に変化し得る。結果的に、肺炎球菌単離物の正確でかつ効率的な血清型別は肺炎球菌ワクチンの効力をモニターするのに重要である。実際には、新興の肺炎球菌血清型の同定は、公衆衛生における非常に重要な目標のままである。
【０００６】
そのためには、現在のポリクローナル抗体が肺炎球菌血清型を同定およびモニタリングするのに有用であるが、モノクローナル抗体技術を利用し得る改善された同定アッセイ方法についての必要性、ならびに新しい血清型を同定する必要性が残っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は細菌学、免疫学および疫学に関する。より詳細には、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエの新しい新興の血清型、ならびにこれらの血清型を同定するのに有用なアッセイ方法およびモノクローナル抗体に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に示した具体例は、新しい新興の肺炎球菌血清型の同定およびそれを同定するための手段を提供する。より詳細には、本発明は、血清型６Ａβまたは６Ｃ（それらは同義である）として本明細書に同定された、血清型６Ａと密接に関係する新規な肺炎球菌血清型を提供する。
【０００９】
さらなる要旨は、ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃと命名された細菌の単離培養物を提供することである。
【００１０】
もう一つの具体例は、反復単位｛→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→リン酸｝を持つ新規な多糖体を提供する。
【００１１】
もう一つの要旨は、新興の肺炎球菌血清型を同定するのに有用なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を提供することである。かくして、本発明は、本明細書でｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ３、ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ６およびｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＧｌと同定された血清型６Ｃを識別するのに有用なモノクローナル抗体を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（図面の簡潔な記載）
図１は、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。肺炎球菌の溶解物の希釈（Ｘ軸）に対する結合した抗体（Ｙ軸）。溶解物は、２つの６Ａβ単離物（連続線の黒記号）、３つの６Ａα単離物（点線の白記号）および２つの６Ｂ単離物（破線の連絡線）を含む。アッセイに用いた抗体は、Ｈｙｐ６ＡＧｌ（パネルＡ）、Ｈｙｐ６ＡＭ３（パネルＢ）、ウサギプール血清Ｑ（パネルＣ）およびウサギ「因子６ｂ」血清（パネルＤ）であった。
【００１３】
図２は、種々の肺炎球菌でのオプソニン化アッセイデータを示す。オプソニン化アッセイ反応の始めに反応ウェルに添加された細菌のパーセンテージとして測定された生存細菌数（Ｙ軸）を、オプソニン化貪食作用死滅アッセイに用いたヒト血清の希釈（Ｘ軸）に対してプロットした。そのアッセイは種々の肺炎球菌を用い、６Ｂ単離物（白丸）、２つの６Ａα単離物（白四角、白三角）、および７つの６Ａβ単離物（破線で連結されたデータポイント）を含む。７つの６Ａβ単離物は、ブラジル、韓国および米国からのものを含む。
【００１４】
図３は、オプソニン化力価比較を示す。６Ａ亜型に対するオプソニン化力価（Ｙ軸）−対−６Ｂ血清型に対するオプソニン化力価（Ｘ軸）。円および三角形は、各々、６Ａαまたは６Ａβに対するオプソニン化力価を示す。この試験は、ワクチン接種しなかった２０名の成人（左パネル）、あるいは結合型ワクチン（黒記号）または２３価多糖体ワクチン（白記号）でワクチン接種した２０名の成人（右パネル）からの血清を用いた。各ワクチン群は１０名であった。アッセイの検出限界は４であり、検出できないオプソニン化力価を持つ試料を２の力価を有するように割り当てた。１つのスポットに複数データポントが存在した場合に、データポイントは人為的に広げて、データポイント数を示した。
【００１５】
図４は、種々の肺炎球菌単離物からの一部のｗｃｉＰ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【００１６】
図５は、９つの６Ａα単離物（レーン１〜９）および６つの６Ａβ単離物（レーン１０〜１５）で得られたＰＣＲ生成物を示すアガロースゲルの写真である。Ｍとマークされた２つのレーンに、ＤＮＡサイズマーカーを負荷した。２つのレーンは、ゲルの右側における分子が左側のものより速く移動したことを示す。肺炎球菌のＰＣＲ生成物の上下の２本のマーカーバンドは、各々、２.０３６ｋｂおよび１.６３６ｋｂ長である。６Ａαおよび６Ａβは、各々、約２ｋｂおよび１.８ｋｂ長であったＰＣＲ生成物を生じた。
【００１７】
図６は、単離物ＡＡＵ９（中央バー）およびＳＴ７４５（２つのパーツでの底部バー）の肺炎球菌莢膜遺伝子座のｗｃｈＡ、ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯ領域のダイアグラムを示す。比較のために、上部バーは、ＣＲ９３１６３８（ＧｅｎＢａｎｋ受入れ）に基づいた肺炎球菌莢膜遺伝子座のｗｃｈＡ、ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯ領域のダイアグラムを示す。遺伝子ｗｃｈＡ、ｗｃｉＮおよびｗｃｉＯは、それらの長さと共に上部バーの上に標識されている。ヌクレオチド配列の位置は上部バーの下に示され、本明細書に示した配列位置１は、ＣＲ９３１６３８の４９０２の配列位置に対応する。ＳＴ７４５株配列は１９３塩基対短く、その不足は２３９８および２５９１位間のギャップとして示された。
【００１８】
図７は、過ヨウ素酸塩処理前後の６Ａα（上部）および６Ｃ（６Ａβ、底部）からの莢膜ＰＳの炭水化物組成物（パネルＡ）を示す。単糖体は上部のクロマトグラムにおいて同定される。このＧＬＣ分析において、単糖体は、特有の保持時間および相対的比率を持つ複数のピークを生成できる。例えば、ガラクトースは、３つのピーク：第１のピーク（短い）、第２のピーク（最高）および第３のピーク（中間）を有するであろう。パネルＢは、６Ａα（灰色バー）および６Ｃ（６Ａβ、黒色バー）についての各単糖体の標準化されたピーク面積を示す。各ＰＳからのすべての単糖体のピーク面積は、関連するラムノースのピーク面積に標準化されている。６Ｃ（６Ａβ）はガラクトースピークを示さないが、６Ａαが示す２倍のグルコースを有する。
【００１９】
図８は、６Ａα（パネルＡ）および６Ａβ（パネルＢ）の反復単位およびそれらの娘イオン（各々、パネルＣおよびＤ）の質量スペクトルを示す。質量電荷比（ｍ／ｚ）は、２つの小数点に丸められた。
【００２０】
図９は、酸化および還元（パネルＡ）後の６ＡβＰＳの反復単位およびそれらの娘イオン（パネルＢおよびＣ）の質量スペクトルを示す。パネルＢに用いた試料は、ＮａＢＨ４で還元し、パネルＣについてのそれはＮａＢＤ４で還元した。質量電荷比（ｍ／ｚ）は、２つの小数点に丸められた。（パネルＢおよびＣにおける）ＲｌおよびＲ２は、ピークが逆断片化によって誘導されたイオンに対応することを示す。デルタ記号に続く数は、ピーク間のｍ／ｚ単位の差を示し、フラグメントの名称と一体にした。パネルＣにおける全ピークは、パネルＢにおいて再生されず、汚染物質で有り得る１３６.９８のピークを除いてパネルＢにおけるピークに対応する。
【００２１】
図１０は、６Ｃ莢膜多糖体の提唱された化学構造およびその切断生成物の構造を示す。その６Ｃの反復単位の提唱された構造を、パネルＣに示す。パネルＡおよびＢは、リン酸基がリビトールに結合されている場合およびホスホジエステルがグルコース１の第２の炭素に連結される場合の可能な分子イオンを示す。パネルＤ、ＥおよびＦは、ホスホジエステルがグルコース１の第２の炭素（パネルＤ）、第４の炭素（パネルＥ）または第６の炭素（パネルＦ）に連結される場合の反復単位の潜在的な切断パターンを示す。水和形態が示され、水和に関与する残基は、括弧内に示される。過ヨウ素酸塩感受性部位は太字で示され、切断生成物はパネルＡおよびＦに示される。潜在的な分子イオンはそれらの原子質量単位と共に矢印を持つ点線で示される。ＧｘおよびＧｙは潜在的なグルコース１フラグメントであり、Ｒｘは、酸化および還元反応後に残るリボースフラグメントである。それらの原子質量単位は括弧内に示される。
【００２２】
図１１．この図はｗｃｉＮ領域交換実験ダイアグラムを示す：工程Ａにおいて、ＴＩＧＲ６Ａ４のｗｃｈＡ／ｗｃｉＮα／ｗｃｉＯ−Ｐ領域はカセット１と置換された。カセット１は３つのパーツ（中核および２つのフランキング領域）を有し、各パーツは約１ｋｂ長である。中核は抗生物質感受性遺伝子のｋａｎＲおよびｒｐｓＬ＋を有する。２つのフランキング領域はＡＡＵ３３株からのｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ−Ｐ領域で調製された。工程Ｂにおいて、ＴＩＧＲ６ＡＸ中のカセット１は、カセット２と置換された。カセット２は、６Ｃ株（ＣＨＰＡ３８８）からのｗｃｉＮβ遺伝子、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ−Ｐ領域を有する。ＴＩＧＲ６Ｃ４は、カセット２が挿入された後得られる最終産物を示す。遺伝子操作を単純化するために導入したＰＣＲプライマー中のＸｂａｌおよびＢａｍＨＩの部位を示した。
【００２３】
図１２は、６Ａおよび６Ｃの単離物のｗｃｉＮ領域のＰＣＲ生成物の電気泳動パターンを示す。ＰＣＲに用いたプライマーは、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ遺伝子に各々位置する５１０６および３１０１であった。Ｍでマークしたレーンは、ＤＮＡラダーを有する。２０００および１６５０ｂｐを持つ標準マーカーを左に示した。レーン１−１３は、６Ｃ単離物のＰＣＲ生成物を含み、それらは、ＣＨＰＡ３７（レーン１）、ＣＨＰＡ３８８（レーン２）、ＢＧ２１９７（レーン３）、ＢＺ１７（レーン４）、ＢＺ３９（レーン５）、ＢＺ８６（レーン６）、ＢＺ６５０（レーン７）、ＫＫ１７７（レーン８）、ＣＨ６６（レーン９）、ＣＨ１５８（レーン１０）、ＣＨ１９９（レーン１１）、ＭＸ−６７（レーン１２）およびＡＣＡ−Ｃ２１（レーン１３）である。レーン１４−１８は、６Ａ単離物のＰＣＲ生成物を含み、それらは、ＣＨＰＡ６７（レーン１４）、ＣＨＰＡ７８（レーン１５）、ＢＺ６５２（レーン１６）、ＫＫ５８（レーン１７）およびＡＡＵ３３（レーン１８）である。
【００２４】
図１３は、ｗｃｈＡの３’末端およびｗｃｉＯ遺伝子の５’末端のヌクレオチド配列と共にｗｃｉＮβＯＲＦのヌクレオチド配列を示す。ｗｃｉＮβＯＲＦの潜在的なアミノ酸配列をヌクレオチド配列下に示す。また、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＮβの推定終止部位ならびにｗｃｉＮβおよびｗｃｉＯ遺伝子の推定開始部位を示す。ｗｃｉＯ遺伝子は、２つの潜在的な開始部位を有する。
【００２５】
図１４は、６Ａ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＲ９３１６３８）および６Ｂ株（ＣＨＰ Ａ３８８）のｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβ領域のＤＮＡ配列を示す。ｗｃｉＮ（約９００−１１１０塩基）の非相同性中央領域の配列を示していない。ＰＣＲプライマー（５１０６、３１０１、５１１４および３１１３）の部位を示す。また、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＮβの潜在的な終止部位；およびｗｃｉＮβおよびｗｃｉＯの潜在的な開始部位を示す。
【００２６】
図１５は、６Ａおよび６Ｃの単離物のｗｃｉＮ遺伝子を囲む莢膜遺伝子座の遺伝子地図を示す。地図はｗｃｈＡ（斜線）、ｗｃｉＮ（水平バーまたは黒色）、ｗｃｉＯ（格子縞模様）およびｗｃｉＰ（波状）遺伝子を示す。６Ａ座は、ｗｃｉＮα遺伝子に上流（９５塩基長）および下流（３１２塩基長）に２つの予期しないＤＮＡ断片（矢印で示す）を有する。ｗｃｉＯ遺伝子についての代替的な開始部位は、その示された開始部位（６Ａにつき２７２１位）に対して３２塩基上流である。６Ｃ単離物について、ｗｃｉＮα領域における古いＤＮＡ（１２２２塩基、水平バーの領域）は、新しいＤＮＡ（１０２９塩基、黒色領域）と置換される。置換は、１１２５塩基を有する新しいＯＲＦ（ｗｃｉＮβと命名された）を創製する。
【００２７】
図１６は、６Ａ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＲ９３１６３８）および６Ｃ株（ＣＨＰ Ａ３８８）の莢膜遺伝子座を示す。莢膜合成に関与するすべてのＯＲＦは、水平の矢印として示され、それらの方向は転写の配向を示す。６Ａおよび６Ｃの座の双方について、推定転写開始部位（曲った矢印）および推定終止部位（黒丸を含む縦線）を同定する。「トランスポサーゼ」配列（「ｔｎｐ」と標識されたブラックボックス）は莢膜遺伝子座の両末端で見出される。
【００２８】
図１７は、６Ｃの血清型（単離物ＣＨＰＡ３８８）莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列を示す。
【００２９】
（発明の詳細な記載）
本発明は、本明細書に記載された特定の方法、プロトコールおよび試薬等に制限されず、それ自体が変化し得ると理解されるべきである。本明細書に用いた用語は、特定の具体例だけを記載するためのもので、特許請求の範囲により単に規定される本発明の範囲を制限するように意図するものではない。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲に用いた単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に特記しない限りは、複数の参照を含む。かくして、例えば、抗体に対する参照は、当業者に知られていた等価物を含めた１以上のかかる抗体に対する参照である。操作例以外のまたは特記する場合の本明細書に用いた成分または反応条件の量を示す全ての数は、「約」なる用語により全ての例において修飾されると理解されるべきである。パーセンテージと関連して用いたその「約」なる用語は、平均±１％を意味し得る。
【００３１】
同定されたすべての特許および他の刊行物は、例えば、本発明と関連して用い得るかかる刊行物に記載された方法を記載および開示する目的で引用により明確に本明細書の一部とみなす。これらの刊行物は、本願の出願日に先立ってそれらの開示のために単に提供される。この点に関して、発明者が、先行発明により、または他の理由のためにかかる開示を事前日時とする権利を与えられないという承認として解釈されるべきではない。日付に関する記載またはこれらの文書の内容に関する表示の全ては、出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していずれの承認も構成しない。
【００３２】
特に定義されない限りは、本明細書に用いた技術的および科学的な用語は、本発明が関係する当業者に一般的に理解されるようなものと同一の意味を有する。いずれの公知の方法、装置および材料も本発明の実施または試験に用い得るが、その方法、装置および材料はこの点に関して本明細書に記載される。
【００３３】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、グラム陽性の、ランセット形の球菌（わずかに鋭い外部の曲がりを持つ長方形の球菌）である。通常、それらは対の球菌（双球菌）と考えられるが、それらは単独で短連鎖中で生じ得る。血液寒天培地上で培養された場合、それらはアルファ溶血性である。個々の細胞は、直径が０.５〜１.２５マイクロメートルである。それらは、胞子を形成せず、それらは非運動性である。他の連鎖球菌のように、それらはカタラーゼを欠き、グルコースを乳酸に発酵させる。他の連鎖球菌と異なり、それらはＭ蛋白質を示さず、それらはイヌリンを加水分解し、それらの細胞壁組成はそれらのペプチドグリカンおよびそれらのタイコ酸の双方に関して特有である。
【００３４】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、主として幼児および高齢者間の肺炎、髄膜炎、中耳炎ならびに敗血症についてのよく知られたヒト病原菌および主要な病原体である。Ｆｅｄｓｏｎ ＆ Ｍｕｓｈｅｒ ｉｎ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ２ｎｄ ＥＤ. （Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ ｅｄｓ., Ｗ．Ｂ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．, Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ, ＰＡ, １９９４）. 完全に多糖体からなる莢膜は肺炎球菌細胞を包む。侵襲中に、莢膜は毒性の必須の決定因子である。莢膜は、細菌細胞のＣ３ｂオプソニン化を防ぐことにより食作用と干渉する。抗肺炎球菌ワクチンは、高度に流行性の株に由来した種々の莢膜（多糖体）抗原の処方に基づいている。
【００３５】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、血清学的に区別される炭水化物莢膜のその発現に基づいて９０種の血清型に分類されている。Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ, ３３ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２７５９−６２（１９９５）. 莢膜多糖体（ＰＳ）に対する抗体は、同一莢膜の血清型を発現する肺炎球菌に対する防御を提供し得る。現在利用可能な肺炎球菌ワクチンは、複数の血清型の莢膜ＰＳの混合物を含む。例えば、１つの肺炎球菌ワクチン（ＰＳワクチンと呼ばれる）は、２〜３種の一般的に見出された血清型からの莢膜ＰＳを含む。Ｒｏｂｂｉｎｓら, １４８ Ｊ. Ｉｎｆｅｃｔ. Ｄｉｓ. １１３６−５９（１９８３）. 最も最近開発されたタイプのワクチン（共役ワクチンと呼ばれる）は、蛋白質分子にコンジュゲートする７〜１３種の血清型の莢膜ＰＳを含む。Ｗｕｏｒｉｍａａ ＆ Ｋａｙｈｔｙ, ５６ Ｓｃａｎｄ. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １１１−２９（２００２）. ７価結合型ワクチンは、米国における臨床使用のために２０００年に導入され、小児における侵襲性の肺炎球菌疾病の発生率を低下させた。Ｗｈｉｔｎｅｙ, ３４８ Ｎ. Ｅｎｇｌ. Ｊ. Ｍｅｄ. １７３７−４６（２００３）．
【００３６】
正確で有効な血清型別用の肺炎球菌単離物は、肺炎球菌ワクチンの効力を測定するために重要である。新しい肺炎球菌ワクチンの導入後に、ワクチン誘導抗体は血清型特異的な防御を提供する。従って、ワクチンに含まれた血清型を発現する肺炎球菌は余り多く発生せず、一方、非ワクチンタイプを発現する肺炎球菌の有病率は同一のままで有り得る。いくらかの場合において、非ワクチンタイプを発現する肺炎球菌は、ワクチン血清型を発現するものに置き換わり、非ワクチンタイプの有病率はより高くなり得る。Ｐｅｌｔｏｎ, １９（１） Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓ９６−Ｓ９９（２０００）. さらに、血清型の有病率は、知られていない理由のために経時的に変化しかねない。Ｆｉｎｌａｎｄ ＆ Ｂａｒｎｅｓ, ５ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. １５４−６６（１９７７）. これらの変化がワクチンの臨床的有効性に影響するために、多数の肺炎球菌単離物の血清型別は、肺炎球菌ワクチンをモニタリングする重要な部分である。
【００３７】
さらに、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａに関して、現在のワクチン製剤は６Ａ ＰＳを運ばないが、６Ｂに対して生起された抗体が６Ａに交差反応すると考えられるために、６Ｂ ＰＳを運ぶ。しかしながら、この現象は１００パーセントではない：６Ｂ ＰＳを含むいくつかのワクチンは、６Ａに対する抗体を生起しない。Ｙｕら, １８０（５） Ｊ. Ｉｎｆｅｃｔ. Ｄｉｓ. １５６９−７６（１９９９）. 事実、６Ａのごとき非ワクチン血清型は、依然としてワクチン接種した小児において疾病を引き起しているようである。Ｃｌｏｖｅｒ ＆ Ｋｌｅｉｎ, Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ, ４４ｔｈ Ａｎｎ. ＩＣＡＡＣ Ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ, ＤＣ, ２００４）. 従って、さらなる６Ａ血清型の新興および重要はさらに重要になり得る。
【００３８】
さらに、６Ａおよび６Ｂの血清型は、侵襲性の肺炎球菌疾病の、各々、４.７パーセントおよび７パーセントを占める。Ｒｏｂｂｉｎｓら, １４８ Ｊ. Ｉｎｆｅｃｔ. Ｄｉｓ. １１３６ ５９（１９８３）. その医学的重要性のために、血清型６Ａおよびその関連する血清型６Ｂの分子の性質は、広範囲に研究されている。生化学試験は、血清型が６Ａおよび６Ｂ ＰＳが、４つの単糖体：ラムノース、リビトール、ガラクトースおよびグルコースを含有する反復単位の線状ポリマーを含むことを見出した。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, ｉｎ Ｓ. ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ：ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＆ ＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳ ＯＦ ＤＩＳＥＡＳＥ ８１ １１４（Ｔｏｍａｓｚ, ｅｄ．, Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ, Ｉｎｃ, Ｌａｒｃｈｍｏｎｔ, ＮＹ, ２０００）. ２つのＰＳはラムノースをリビトールに連結することの差を除いて同一で有り得る。より詳細には、６Ａ ＰＳは、１→３のラムノース−対−リビトール連結を有し、６Ｂ ＰＳは、１→４のラムノース−対−リビトール連結を有する。
【００３９】
遺伝学研究は、いずれの血清型を発現する肺炎球菌も、サイズが約１７.５ｋｂのほとんど同一の莢膜遺伝子座（ＣＧＬ）を有することを報告する。配列情報は、例えば、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｊｅｃｔｓサイトにてオンラインで入手可能である。一貫した相違点は、ラモノシルトランスフェラーゼをコードするｗｃｉＰ遺伝子に存在する。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, １８６ Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ８１８１−９２（２００４）. 血清型６Ａ ｗｃｉＰ遺伝子は、残基１９５でセリンをコード化するが、血清型６Ｂ遺伝子はその残基でアスパラギンをコード化する。同上。セリンを含むラモノシルトランスフェラーゼが１−３の連結を作成し、アスパラギンを含むそれは１−４連結を作成すると考えられる。
【００４０】
当該技術分野においてよく知られている他の種々の血清型別方法が存在するが、古典的方法は膨化（Ｎｅｕｆｅｌｄ）方法と呼ばれ；現在使用される方法は大部分はマニュアルで、遅く、遂行するのに単調である。「マルチビーズアッセイ」と命名された改善された血清型別アッセイは、フローサイトメーターで半自動的に行なうことができる多重免疫学的アッセイに基づいている。Ｐａｒｋら, ７ Ｃｌｉｎ. Ｄｉａｇｎ. Ｌａｂ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ４８６−８９（２０００）. マルチビーズアッセイ特異性は、９０種のすべての公知の血清型を表わす肺炎球菌株を用いて、十分に確立された。Ｙｕら, ４３（１） Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. １５６−６２（２００５）. このアッセイが、肺炎球菌莢膜ＰＳに対して特異的な多数のｍＡｂを用いるために、優れた特異性を提供する。加えて、マルチビーズアッセイは、大部分は自動化され、高生産性を提供できる。結果的に、アッセイは多数の疫学的研究に有用で有り得る。
【００４１】
モノクローナル抗体がポリクローナル試薬より特異的であるために、マルチビーズアッセイは特に有利である。６Ａ血清型に関して、大部分の「６Ａ」単離物（膨張反応およびポリクローナルの試薬によって規定された）は、６Ａに特異的なモノクローナル抗体（Ｈｙｐ６ＡＧｌ、Ｈｙｐ６ＡＭ６およびＨｙｐ６ＡＭ３）と反応し、いくらかの「６Ａ」単離物は、１つのｍＡｂ（Ｈｙｐ６ＡＧｌ）と反応したが、他のもの（Ｈｙｐ６ＡＭ６またはＨｙｐ６ＡＭ３）とは反応しなかった。本明細書に記載された他のテストは、Ｈｙｐ６ＡＭ６またはＨｙｐ６ＡＭ３と反応しなかった６Ａ単離物が従前に未同定の６Ａ亜型であったことを確認した。換言すれば、そのモノクローナル抗体は、６Ａ血清型内の亜型を認識した。Ｌｉｎら, ４４（２） Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３８３ ８８（２００６）参照. 発明者らは、６Ａαとしての双方のｍＡｂｓと反応する単離物、および６ＡβとしてＨｙｐ６ＡＧｌだけと反応するもののを従前に標識したが、実質的には本明細書において、６Ａαが依然として６Ａのままであり、その新しい血清型が、６Ａβよりむしろ６Ｃとして同定されることをここに提唱する。換言すれば、６Ａβおよび６Ｃの双方を本明細書に用いて、新規な肺炎球菌血清型を命名したが、それらは等価物である。そのため、血清型６Ｃは、９１番目の肺炎球菌血清型を表わす。実際に、「６Ａ」は、膨張反応によって「６Ａ」として型別された単離物をいい、６Ａ（６Ａα）および６Ｃ（６Ａβ）の双方を含む。
【００４２】
新しい血清型の定義における考察はヒト化抗体とのその結合特性である。ヒト抗血清は、莢膜ＰＳ以外の肺炎球菌抗原に結合する非オプソニンの抗体を一般的に有するために、オプソニン化アッセイはＥＬＩＳＡより特異的である。また、オプソニン化能力は、より直接的に肺炎球菌感染に対する免疫防御と関係する。従って、種々の６Ａα、６Ａβおよび６Ｂ単離物は、オプソニン化アッセイおよび高レベルの抗６Ｂ抗体を持つヒト血清を用いて比較された。ヒト血清は６Ｂならびに６Ａαをオプソニン化したが（図２）、それはブラジル、韓国および米国からの７つの異なった６Ａβ単離物をオプソニン化しなかった（図２）。一緒にすると、これらのデータは、６Ａβ単離物が区別されるが、均一である血清学的特性を表示することを示す。
【００４３】
また、遺伝学研究は、６Ｃ単離物が確かに、（密接に関連する６Ｂ血清型またはいくかの他の無関係な血清型よりむしろ）６Ａ血清型のメンバーであることを確認した。ブラジル、韓国および米国から集められた１０種の単離物の試験において、６Ａβとして同定された１０種の単離物のすべてが、血清型６ＡにおけるｗｃｉＰ遺伝子と一致する残基１９５にてセリンを有した。いくつかの肺炎球菌の単離物のｗｃｉＰ遺伝子のＤＮＡ配列を図４に示す。
【００４４】
また、トランスフェラーゼ遺伝子ｗｃｉＮおよびｗｃｉＯの遺伝子配列を比較した。ｗｃｉＮ領域が、プライマー５０１６および３１０１（５１０６：５’−ＴＡＣ ＣＡＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＴおよび３１０１：５’−ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＧＣ）を用いてＰＣＲによって検討された場合、検討された９つの６Ａαのすべてが、検討された６つの６Ｃ単離物のすべてで行ったよりも２００塩基対（ｂｐ）長い生成物を得た（図５）。６つの単離物は、韓国、米国およびブラジルからの６Ｃ単離物を含んだ。かくして、このＰＣＲは、６Ａ亜型に対する遺伝子テストとして用いることができる。
【００４５】
次いで、１つの６Ａα単離物（ＡＡＵ９）および１つの６Ｃ単離物（ＳＴ７４５）からのＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列を比較した（図６）。ＡＡＵ９ ＰＣＲ生成物における１２０３〜２９５９位（１７５７塩基）間の全塩基を配列決定し、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて報告された６Ａ単離物の莢膜座配列であるＣＲ９３１６３８に相同性であることが判明した。対照的に、そのＳＴ７４５配列は、１３６８位までで、次に、２５９１位から再び出発する６Ａαのものとほとんど同一であることが判明した。介在する１０２９ｂｐ配列（１３６９〜２３９７）は、６Ａαのものとは全く異なる。介在配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓによる多糖体合成に用いたトランスフェラーゼ（ＥｐｓＧ）に類似する約９８ｂｐを含む。
【００４６】
かくして、本明細書に示した研究は、新しい肺炎球菌血清型についての遺伝子的基礎を支持する。６Ｃの莢膜遺伝子座は、ｗｃｉＮ遺伝子を除いて６Ａ座に非常に類似し：６Ａ株はｗｃｉＮα遺伝子を有するが、６Ｃ株は、ｗｃｉＮα遺伝子とは（約５０％だけの相同性で）劇的に異なるｗｃｉＮβ遺伝子を有する。２つの遺伝子がサイズにおいて異なるために、６Ａおよび６Ｃの血清型は、容易にＰＣＲによって識別できる。ｗｃｉＮα遺伝子は、３１４個のアミノ酸を持つＷＣＩＮαをコード化し、一方、ｗｃｉＮβ遺伝子は１１２５塩基長のＯＲＦを生成し、その生成物のＷＣＩＮβは３７４個のアミノ酸を有する。これらの２つの蛋白質は、アミノ酸レベルでほとんど相同性を有さない。
【００４７】
推定ｗｃｉＮ遺伝子産物の配列は、それらのグリコシルトランスフェラーゼ機能を示唆する。ＷＣＩＮβは、ブドウ球菌のｃａｐＨ遺伝子産物との類似性を有し、グリコシルトランスフェラーゼグループ１ファミリーに属する１６０アミノ酸長のトランスフェラーゼドメインを有する。対照的に、ＷＣＩＮαは、多数のガラクトシルトランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラーゼ・ファミリー８（ｅｘ）に属する。Ｃａｍｐｂｅｌｌら, ３２６ Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｊ. ９２９−３９（１９９７）. これらの観察は、６Ａおよび６Ｃの莢膜ＰＳの化学構造と一致し、ｗｃｉＮが６Ａおよび６Ｃの血清型間の差を担うという主張を支持する。実際に、６Ａ株はｗｃｉＮα遺伝子をｗｃｉＮβ遺伝子と置換することにより６Ｃ株に変換できる。
【００４８】
６Ａおよび６Ｃにつき観察されたガラクトース／グルコース交換は、他の肺炎球菌血清型について見出される。肺炎双球菌の９Ｌ血清型ＰＳはガラクトース分子を有するが、９Ｎ ＰＳはグルコース分子を有する。その９Ｌおよび９Ｎ血清型の莢膜遺伝子座は相互に似ているが、９Ｌについてのガラクトシルトランスフェラーゼおよび９Ｎについてのグルコシルトランスフェラーゼをコード化する１つの遺伝子ｗｃｊＡにおいて異なる。９Ｌおよび９Ｎ血清型のｗｃｊＡ遺伝子は非常に類似し；一方は変異により他方から生起したようである。対照的に、ｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβの遺伝子は非常に異なり、ｗｃｉＮβ遺伝子はデータベース中で利用可能な他の肺炎球菌の遺伝子に相同性ではない。おそらく、ｗｃｉＮβ遺伝子は肺炎球菌以外の生物体が起源で有り得る。この仮説の支持において、ｗｃｉＮβ遺伝子の検討は、相同組換えに関与し、肺炎球菌における相同組換えに非常に重要であることが知られている２つのフランキング領域を示す。Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅら, ９９ Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ. ＵＳＡ ２１００ ０５（２００２）. 加えて、抗生物質耐性遺伝子の研究は、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびもう一つの細菌種間の水平の遺伝子導入を示した。例えば、Ｆｅｉｌら, １５１（６） Ｒｅｓ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ４６５−６９（２０００）；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｇｒａｆら, １４５（１１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３２８３−９３（１９９９）；Ｃｏｆｆｅｙら, ５（９） Ｍｏｌ. ２２５５−６０（１９９１）参照．
【００４９】
ｗｃｉＮβ遺伝子源はまだ知られていない。ｗｃｉＮβ遺伝子の一部は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓによってエキソポリサッカライドの合成に関与する遺伝子のＥｐｓＧ遺伝子に類似（８１％相同性）している。しかしながら、その相同性は、非常に短いピースのＤＮＡだけに見出され、かくして、Ｓ. ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓはｗｃｉＮβについての源ではないであろう。ＷＣＩＮβの蛋白質配列は、大腸菌Ｋ−１２株のｗａａＧ（ｒｆａＧ）遺伝子産物に似ており、いくらかの肺炎球菌遺伝子はグラム陰性細菌に由来し得る。かくして、ｗｃｉＮβ遺伝子がグラム陰性種から同様に由来できた可能性がある。しかしながら、それらが肺炎球菌と口腔内で共存し、多数の抗生物質耐性遺伝子がＳ．ｏｒａｌｉｓに連結されたために、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓ. ｍｉｔｉｓおよびＳ．ｏｒａｌｉｓは主要な候補である。
【００５０】
ｗｃｉＮβ領域を複数の６Ｃ単離物につき検討した場合、それらの重なるポイントおよびフランキング領域配列は同一であると判明した。また、それらの莢膜遺伝子座プロフィールは６Ａ単離物とは対照的に９−１０−１に高度に制限され、多数の異なる莢膜遺伝子座プロフィールを有する。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４. 加えて、９−１０−１莢膜遺伝子プロフィールは６Ａおよび６Ｂ単離物の莢膜遺伝子プロフィール間で独特であり、その莢膜遺伝子プロフィールとは大きく分離している。これらの知見は、ｗｃｉＮβ遺伝子の捕捉が以前に起こったに違いなく、６Ｃ単離物のすべてが世界中で、多数のタイプの疾病を引き起して見出され、それは、元来は６Ｃになった単一細菌からの莢膜遺伝子座を有することを明白に示す。６Ｃが外来遺伝子捕捉のユニークでかつ明確な例を提供し得るために、それは細菌の遺伝進化を研究するためのよいモデルになるであろう。また、これは、抗生物質耐性遺伝子と異なり、安定した変化を構成し得る。
【００５１】
６Ｃ血清型はわずか１または２の莢膜遺伝子座プロフィールしか有さないが、６Ａおよび６Ｂの血清型は、種々の莢膜遺伝子座プロフィールを有する。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４. かくして、６Ｃ莢膜遺伝子座は、６Ａまたは６Ｂ莢膜遺伝子座と比較して非常に最近、出現したかもしれない。６Ｃは２７年以上前に出現したかもしれないが、これらの知見は、６Ｃ血清型莢膜遺伝子座が、１つの場所で「最近」出現し、世界中に急速に広まったことを示唆する。ある遺伝子が強力な生存優位性を提供する場合、その遺伝子は、世界中に急速に広がりかねない。例えば、抗生物質耐性遺伝子は、たった何年のうちに世界的に広がり得る。おそらく天然のヒト化抗体は、６Ａまたは６Ｂより６Ｃに対してあまり有効ではない。６Ｃ莢膜遺伝子座が６Ａまたは６Ｂより多くの生存優位性を提供するかを調査すべきである。
【００５２】
ＭＬＳＴ研究は、６Ｃが複数の独立したＳＴを発現することを示す。かくして、６Ｃ莢膜遺伝子座は、異なる肺炎球菌単離物中で交換されたに違いない。６Ｃ莢膜遺伝子座がさらなる生存優位性を提供するＳＴと結合し得るかが調査され得る。多剤耐性遺伝子を有する国際的な株における６Ｃの拡散および６Ｃ莢膜座の発生がモニターされるべきである。
【００５３】
本明細書に供された新規な肺炎球菌単離物は、化学的に区別されるＰＳ構造を有する。より詳細には、単糖体分析は、６Ａα莢膜ＰＳで見出されたガラクトースが、グルコースを代わりに含む６ＡβＰＳにおいて不存在であることを示した。６ＡβＰＳの反復単位は、１つのリビトール、１つのラムノースおよび２つのグルコース部位を明確に含む。従って、本明細書に記載された２の亜型６Ａαおよび６Ａβは、異なる血清型と認められるべきである。６Ａβ亜型は、血清型６Ａに命名されたＡα亜型を残しつつ、血清型６Ｃと記載され得る。血清型６Ｃは、血清型６Ａに対するその血清学的および構造的な関係に徴して、血清群６の第３のメンバーとして含まれるべきである。かくして、血清型６Ｃは、９１番目の肺炎球菌血清型を表し、９０種の肺炎球菌血清型は、以前に認識されている。Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ, ３３ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２７５９−６２（１９９５）．
【００５４】
ガラクトースおよびグルコース分子は、それらの第４の炭素に結合した水酸基の配向においてだけ異なり、６Ａおよび６ＣのＰＳの反復単位は１つの水酸基の配向においてだけ異なる。この小さな構造の差は、６Ｃが過去においてポリクローナル抗血清で同定されなかった理由を説明する。化学構造の解明で、６Ｃは、生化学的に炭水化物組成分析またはＮＭＲにより６Ａと識別できる。肺炎球菌莢膜ＰＳは、アノマープロトンの単純なプロトンＮＭＲによって同定できる。Ａｂｅｙｇｕｎａｗａｒｄａｎａら, ２７９ Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２２６−４０（２０００）. ６Ａおよび６ＣのＮＭＲパターンは異なるが、６ＣのアノマープロトンのＮＭＲパターンは６Ａのそれに非常に類似する。化学および遺伝子テストを用いることができるが、血清学的方法は、吸収により特異的になされた発明者らのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清のいずれを用いても６Ｃを同定する最も有用な方法で有り得る。
【００５５】
血清群６は、３つのエピトープ：６ａ、６ｂおよび６ｃを含むことが知られている。Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ, １９９５. エピトープ６ａは、血清型６Ａおよび６Ｂの双方に存在することが知られ、一方、エピトープ６ｂおよび６ｃは、各々、血清型６Ａまたは６Ｂのいずれかでのみ見出されている。６Ｃ血清型の知見は、血清群６内のさらなるエピトープの存在を示す。６Ｃではなく６Ａおよび６Ｂを認識するｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ３は、エピトープ６ｂを認識するであろう。ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＧｌが６Ａおよび６Ｃを認識するために、それは新しいエピトープ「６ｄ」を認識すると定義し得る。３種の血清型（６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）および共有されるエピトープのすべてに結合するもう一つのｍＡｂは、「６ｅ」と定義し得る。また、血清型６Ａおよび６Ｂについての立体構造依存性（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）エピトープが記載されている。Ｓｕｎら, ６９ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ３３６−４４（２００１）. 血清群６についての非常に多数のエピトープの観察は、シアル酸の単純な線形ホモポリマーでさえ、少なくとも３つのエピトープを有することができるという従前の観察と一致する。Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｔｅｉｎ, １４１ Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ４３５７−６２（１９８８）. 実際に、肺炎球菌のＰＳは、従前に定義された（Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ、１９９５年）よりさらに多数のエピトープを有し、多数のエピトープの存在は、肺炎球菌結合型ワクチンの製造中にエピトープを変更する機会を増加させる。
【００５６】
血清型６Ｃの知見は、血清群６が１９２９年におけるその知見に続いて広範囲に研究されたために、全く予期されなかった。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｒｅｂｅｒｓ, １９６０. 従って、さらなる亜型（または血清型）が良好に確立され広範囲に特徴づけられた血清群中でさえ存在するという可能性を考えるべきである。例えば、１９Ａ莢膜ＰＳについての２つの化学構造が報告されたために、血清型１９Ａ中の亜型の可能な存在を考えることが必要で有り得る。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖｉｅｗ, ｉｎ ＭＯＬ. ＢＩＯＬ. ＆ ＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳ ＯＦ ＤＩＳＥＡＳＥ ８１−１１４（Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ, Ｌａｒｃｈｍｏｎｔ, ２０００）. １９Ａ亜型が見出されたならば、それらの存在は発明者らが、肺炎球菌の結合型ワクチンの導入後にみられた血清型「１９Ａ」の有病率における急速な増加を説明するのを助け得る。Ｐａｉら, １９２ Ｊ. Ｉｎｆｅｃｔ. Ｄｉｓ. １９８８−９５（２００５）. 加えて、６Ｃが最近発生したかもしれないという可能性を考慮するべきである。この可能性と一致して、遺伝学研究は、６Ｃ血清型莢膜遺伝子座が、多様ではなく（Ｌｉｎら, ４４ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏ. ３８３−（１９８８））、６Ａ座である（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４）ことを示唆する。ずっと以前に（おそらく５０−１００年前に）得られた肺炎球菌単離物を研究することにより、６Ｃ株の起源および拡散を調べることは興味深いであろう。
【００５７】
現在入手可能な肺炎球菌ワクチンは、６Ａに対する交差防御を誘導すると推定されるために単に６Ｂ ＰＳを含む。肺炎球菌ワクチン効力調査の一部として、米国で見出された肺炎球菌単離物のすべてが、今や血清型６Ａおよび６Ｂにつきテストされる。しかしながら、６Ｃに対する交差防御は、６Ａに対するものと異なり得る。６Ｃおよび６Ｂ ＰＳが２つの構造の差を有するが、６Ａおよび６ＢのＰＳには１つだけの構造の差を有するために、６Ｃに対する交差防御が不適当で有り得、現在入手可能な肺炎球菌ワクチンは、６Ｃではなく６Ａの有病率を低下し得る。実際、現在の肺炎球菌ワクチンは、血清型１９Ａについてまさに生じるように、６Ｃが以前より優勢になるのを助け得る。かくして、すべての肺炎球菌単離物は、血清型６Ｃならびに血清型６Ａおよび６Ｂにつきテストされるべきである。
【００５８】
重要なことには、本明細書に提供された新規な血清型６Ｃは、ワクチンまたは肺炎球菌ワクチン開発に有用で有り得る。例えば、６Ｃ ＰＳ、そのＰＳの一部、ＰＳのミメティックまたはそのＰＳの一部は、肺炎球菌ワクチンに組み入み得る。連鎖球菌および肺炎球菌のＰＳを含む結合型ワクチンは、当該技術分野においてよく知られている。米国特許第６,２４８,５７０号；第５,８６６,１３５号；第５,７７３,００７号参照。また、多糖分子の蛋白質またはペプチドのミメティックのごときＰＳミモトープは、代替抗原あるいは免疫原として可能である。例えば、Ｐｉｎｃｕｓら, １６０. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２９３−９８（１９９８）；Ｓｈｉｎら, １６８ Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ６２７３−７８（２００２）参照. 加えて、６Ｃの蛋白質または核酸は、当該技術分野において公知の多数の技術を用いてワクチンまたはワクチン開発における抗原または免疫原として機能し得る。例えば、米国特許第６,９３６,２５２号参照。１以上のアジュバント剤がかかるワクチンに含まれる。非経口、粘膜または他の投与により肺炎球菌ワクチンの送達、ならびにかかるワクチンを設け、モニタリングおよび投与方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００５９】
加えて、細菌が、テストワクチンによって産生された血清または抗体を用いてオプソニン化またはＥＬＩＳＡアッセイにおける標的として用いられるために、６Ｃ血清型はワクチン開発に有用で有り得る。また、６Ｃ血清型の抗原は、受動的保護に用いられ得る抗体を産生するために用い得る。また、かかる方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００６０】
また、６Ｃ血清型はワクチン効力をモニターするのに有用である：６Ａαおよび６Ｃ血清型は、肺炎球菌ワクチンに関する疫学的調査、および肺炎球菌ワクチン効力の試験において区別されなければならない。例えば、肺炎球菌ワクチンが６Ｃではなく６Ａαに対して有効ならば、そのワクチンは６Ａβ血清型が蔓延している領域に有効ではないかもしれない。これは、肺炎球菌ワクチンが６Ａβだけを時々オプソニン化する抗体を導くために、そのケースになるであろう。また、従来の肺炎球菌ワクチンの使用法は、たぶん６Ｃの有病率を変更するだろう：６Ａαの有病率は減少するが、６Ｃの有病率は増加し得る。後記の予備的データは、６Ｃ有病率が不変であるが、６Ａα有病率が２０００年以来の結合型ワクチン剤の使用で減少したことを示唆する。血清型を区別せずに、ワクチンを開発する、またはその効力を検討するのは難しいかもしれない。現在、新しい血清型は本明細書に開示された抗体によって同定できるが、さらなる遺伝学的および生化学的なテストを発明でき、本発明によって構想される。
【００６１】
さらに、６Ｃ血清型の有病率は全世界的にモニターされ、肺炎球菌ワクチン分布の有無での領域における新しい肺炎球菌の出現についての価値のある情報を提供するであろう。また、６Ｃ血清型は、ブラジル、カナダ、中国、韓国、メキシコおよび米国で同定された。
【００６２】
その目的のために、本発明のモノクローナル抗体は６Ａβ血清型を同定するのに有用である。すなわち、６Ａ血清型（６Ａαおよび６Ａβの双方）は、ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＧｌによって同定されるが、６Ｃ血清系は、ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ６またはｍＡｂ Ｈｙｐ６Ａｍ３と反応しない。従って、Ｈｙｐ６ＡＭ６またはＨｙｐ６ＡＭ３は、６Ａαおよび６Ｃが同定できる陰性対照として用いられ得る。
【００６３】
これらのモノクローナル抗体を用いて、ＣＤＣに提出された米国肺炎球菌単離物中の６Ａおよび６Ａβ（６Ｃ） の有病率を分析した。ほぼ、同数の肺炎球菌単離物は１９９９年から２００６年までＣＤＣに提出された。旧方法により「６Ａ」として型別された標本を本明細書に記載されたモノクローナル抗体を用いて再分析した。１９９９年、２００３年および２００４年に受け取られた「６Ａ」標本はほとんどすべて再分析した。ＣＤＣが２００５年および２００６年に受け取った試料のわずかだけが再分析された。表に見られるように、６Ａ（６Ａα）の有病率は減少したが、６Ｃの有病率は同じままであった。これは、現在利用可能な肺炎球菌ワクチンが６Ｃに対して有効ではないかもしれないことを示唆する。
【００６４】
【表１】
【００６５】
加えて、６Ｃの同定は、抗６Ｃ抗体の産生および単離を提供する。また、その同定は、６Ａ（６Ａα）および６Ｃ（６Ａβ）の双方を認識する通常の「６Ａ」特異的試薬により示されるような６Ａ（６Ａα）に特異的な試薬を生成することを可能にする。これらは、本明細書に徴して当該技術分野においてよく知られている通常の手段によって調製できる。これに関して、抗６Ｃ抗体は、無傷の免疫グロブリン分子ならびにその部分、フラグメント、ペプチドおよび誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ領域、あるいは６Ｃ抗原、エピトープ、またはミモトープを結合できる抗体のいずれかの部分またはペプチド配列を含み、その全てを「抗原結合蛋白質」という。抗体または抗原結合蛋白質は、その分子と特異的に反応し、それにより、分子が抗体または抗原結合蛋白質に結合できるならば、分子を「結合できる」と言われる、例えば、ＷＯ／ＵＳ２００６／０１４７２０；ＷＯ／ＵＳ２００６／０１５３７３参照。
【００６６】
血清型６Ｃはブダペスト条約に合わせて米国微生物系統保存機関に寄託された。
本発明は、今や、さらに非限定の実施例によって記載されるであろう。
【実施例】
【００６７】
実施例１．肺炎球菌血清型の同定
肺炎球菌溶解物の収集：肺炎球菌血清型６Ａβ（Ｌｉｎら, ４４ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏ. ３８３−８８（２００６）参照）を４９５種の臨床分離株を用いる盲検試験において単離し：５０の単離物はメキシコから、１００はデンマーク、３４５はブラジルからであった。２２の単離物は、鼻咽腔における肺炎球菌の無症状保菌者からのものであり、４７５の単離物は、髄膜炎および敗血症のごとき侵襲性の肺炎球菌感染の患者からのものであった。加えて、血清型１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄおよび１１Ｆを発現する対照肺炎球菌株をＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ, Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入した。
【００６８】
臨床分離株の溶解物は、起源国で調製された。０.５％酵母抽出物（ＴＨＹ培地）を含む３００マイクロリットルのトッド・ヒューイット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ）培地に単一コロニーの肺炎球菌を接種した。３７℃にて一晩培養後、細胞を０μｌの溶解用溶液（０.２％デオキシコール酸ナトリウム、０.０２％ＳＤＳ、０.１％アジ化ナトリウム、０.３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.８）で溶解した。ブラジルにおいて、４００μｌのＴＨＹ培地を細菌増殖に用い、１００μｌを取り出して、凍結した細菌を貯蔵した後、残りの３００μｌを５０μｌの溶解用溶液と混合した。デンマークにおいて、３２５μｌのＴＨＹ培地、および２５μｌの溶解溶液を用いた。細菌は３７℃にて混合物をインキュベートすることにより溶解した。その溶解物をコード化し、周囲温度で普通郵便によって血清型試験のためにアラバマ大学バーミンガム校（ＵＡＢ）の研究所へ送った。
【００６９】
マルチビーズアッセイのための離れた場所からＵＡＢまでの細菌溶解物の発送を単純化するために、細菌溶解物の安定性を室温（ＲＴ）または３７℃で貯蔵後に比較した。その仕事は、マルチビーズアッセイの結果に影響することなく、１か月までのＲＴ、または数日間の３７℃にて細菌溶解物を貯蔵できることを明らかにした。かくして、普通郵便システムを用いて、いずれの熱の保護なくして周囲温度にてこの試験における全溶解物をを発送した。
【００７０】
血清学試薬：ポリクローナル血清型別用血清を、ウサギにおいて調製し、Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔから得た。それらは、血清グループ化および種々のタイプまたは因子特異的な抗血清のために１２の血清プールを含む。Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, ３１ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２０９７−２１００（１９９３）. 全てのｍＡｂｓは、記載のごとく生成し、ハイブリドーマ培養液上清を用いた。Ｙｕら, ２００５．
【００７１】
マルチビーズアッセイ：このアッセイ方法は、２つの異なるセットのラテックスビーズを用いて記載されるように行なった。Ｙｕら, ２００５。１組のビーズ（セット１）は、１４の異なるラテックスビーズの混合物であり、各々は、１つの肺炎球菌ＰＳ抗原で被覆した。１４の肺炎球菌のＰＳ抗原は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆであった。ビーズセット２は、１０のビーズタイプの各々を１０の異なる肺炎球菌ＰＳ（血清型２、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０、２２Ｆおよび３３Ｆ）の一つでコーティングすることにより創製した。
【００７２】
セット１ビーズは、５×または２０×希釈した細菌溶解物、およびビーズ上に含まれた肺炎球菌莢膜ＰＳに特異的なｍＡｂｓの混合物と混合した。インキュベーションおよび洗浄後、ビーズ混合物をフルオレセイン結合した抗マウス免疫グロブリン抗体と反応させた。セット２ビーズを、ポリクローナルウサギ抗血清（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）およびフルオレセイン結合した抗ウサギ免疫グロブリン抗体の混合物を用いる以外はセット１ビーズと同様に用いた。インキュベーション後、各ビーズタイプの蛍光量をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ, Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ, Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）で決定した。次いで、各ビーズタイプの蛍光を用いて、その血清型を決定した。６７％を超える蛍光阻害を陽性として用いた。
【００７３】
Ｎｅｕｆｅｌｄテスト：このアッセイは、標準的血清グループ化（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, １９９３）およびＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔからの血清型別用ウサギ抗血清を用いてデンマーク、ブラジルおよびメキシコにおける参考研究室により記載されたごとく行った（Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ, ３３ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２７５９−６２（１９９５）；Ｋｏｎｒａｄｓｅｎ, ２３ Ｖａｃｃｉｎｅ １３６８−７３（２００５）；Ｌｕｎｄ, ２３ Ｂｕｌｌ．Ｗｌｄ Ｈｌｔｈ Ｏｒｇ. ５−１３. （１９６０））。
【００７４】
ドットブロットアッセイ：異なる結果を調査するために、このアッセイを、記載される（Ｆｅｎｏｌｌら, ３５ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏ. ７６４−７６（１９９７））ように、以下の血清群あるいは血清型：１、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１４、１８および２３に対するＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔからの肺炎球菌抗血清を用いて行なった。また、６Ａ（Ｈｙｐ６ＡＭ３）および１８Ｃ（Ｈｙｐｌ８ＣＭｌ）に特異的なモノクローナル抗体をいくらかの場合に用いた。略言すると、ＴＨＹ培地中で増殖した加熱死滅させた肺炎球菌をニトロセルロース膜の条片上でスポットした。乾燥後、条片をブロックし、洗浄した。次いで、条片を希釈した抗血清またはｍＡｂ溶液中で１時間インキュベートし、洗浄して、希釈したヤギ抗ウサギまたはマウス免疫グロブリンペルオキシダーゼコンジュゲートに曝露した。室温での１時間のインキュベーション後、条片を洗浄し、３−アミノ−９ エチルカルバゾール溶液に曝露した。スポットが現われた場合、条片を洗浄し、評価した。
【００７５】
ＰＣＲ反応：肺炎球菌を６５０ｎｍの波長で０.８のＯＤまでＴＨＹ培地中で増殖させた。染色体ＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＥＡＳＹ−ＤＮＡキットを用いて所与の説明書に従い調製し、ＴＨＹ肺炎球菌の４ｍｌの試料から開始して、１ｍｌに濃縮した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ）。血清群６決定については、ＰＣＲをテンプレートとして染色体ＤＮＡおよびプライマーｗｃｉＰ−上方、５’−ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＴＧＴ ＣＡＣ−３’およびｗｃｉＰ−下方、５’−ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＡ ＴＡＴ ＡＡＧ ＣＣ−３を用いて行なった。ＰＣＲ熱循環条件はＭａｖｒｏｉｄｉら, ２００４に記載されたごとくであった。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラム（Ｑｉａｇｅｎ, Ｖａｌｅｎｃｉａ, ＣＡ）を用いて、ＰＣＲ反応から過剰のプライマーを除去し、ＰＣＲはｗｃｉＰ−上方プライマーを用いる自動ＤＮＡ配列決定のためのＤＮＡテンプレートとして提出した。結果をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ, Ｉｎｃ．, Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ, ＭＩ）およびＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃｃｅｌｙｒｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ））の援助によって分析した。
【００７６】
血清型１１Ａ決定については、一部分の莢膜遺伝子座についてのＰＣＲは、記載されるように（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４）、テンプレートとして染色体ＤＮＡ、１μｌの順方向プライマー（５０ ｐｍｏｌ）および１μｌの逆方向プライマー（５０ ｐｍｏｌ）を用いて行なった。プライマーは、１１Ａ順方向の５’−ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＣＣ ＣＡＡ ＴＡＴ、ＡＧＴ Ｇ−３’および１１Ａ逆方向の５’−ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＧ ＴＧＴ ＡＡＴ ＴＴＡ、ＴＴＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＣ−３’であった。ＰＣＲサイクリングは、９４℃、５分から開始し、９４℃、１分間、５０℃、１分間および７２℃、２分間の３０サイクル、７２℃、１０分間の最終伸張であった。ＰＣＲ反応生成物をアンプリコンサイズを決定するためにアガロースゲル電気泳動（トリス緩衝酢酸溶液０.８％アガロース）によって分析した。
【００７７】
メキシコからの５０の単離物の試験：メキシコからの５０の単離物をＴＨＹ培地中で増殖し、溶解し、タイピングのためにＵＡＢに送った。マルチビーズアッセイ結果をＮｅｕｆｅｌｄのテスト結果と比較し、１０の試料からの結果は異なった。異なる試料のうちの８つの新しい溶解物を得て、盲検様式にて再調査した場合、全ての結果が一致し、それは大部分が誤標識によることを示唆した。Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより血清型３および１０Ａであると型別された２つの単離物（ＭＸ２４およびＭＸ３７）を、マルチビーズアッセイによって型別できない（ＮＴ）ものとして本来型別した。２つの血清型がマルチビーズによって同定されるべきだったので、その２つの細菌単離物をさらなる研究のためにＵＡＢ研究所へ送った。そこで、ＴＨＹ培地中で良好に成長すると判明し、新しい溶解物は、Ｎｅｕｆｅｌｄテスト結果と一致する結果を生じた。かくして、２つの単離物は、最もありそうなことには、肺炎球菌の不十分な増殖によりマルチビーズにより最初に誤って陰性として同定した。
【００７８】
デンマークからの１００の単離物の試験：１００のデンマーク単離物のマルチビーズアッセイ結果をＮｅｕｆｅｌｄテスト結果と比較した場合、発明者らは、Ｎｅｕｆｅｌｄテスト結果の転写における４つの誤りを見出し、１つの株（ＤＫ９４）をＮｅｕｆｅｌｄテストによる血清型２０、およびマルチビーズアッセイによるＮＴとして型別した（表１）。
【００７９】
【表２】
【００８０】
ＤＫ９４単離物をＴＨＹ中で再成長させ、再調査した場合、１：５希釈にてほとんど阻害（９％）を生成しなかったが、より高希釈でより大きな阻害を生成した（１：２０希釈にて３５％および１：３２０希釈にて５０％）。この予期しない挙動は、この特定の単離物の溶解物中の非特異的な結合物質の存在を示唆した。溶解物中のＰＳが７０％エタノールで沈殿し、エタノール沈殿物がマルチビーズアッセイで検討された場合、その沈殿物は、血清型２０につき明瞭な阻害を生成した（１：５希釈にて８６％および１：２０希釈にて８１％）。かくして、最初の不一致は、非特異性結合に起因し、それはポリクローナル血清で行なったアッセイで時々観察され、臨床単離物とのアッセイ感度および特異性に固有の問題は存在しない。
【００８１】
ブラジルからの３４５の試料の試験：２つのアッセイ方法で得られた３４５のブラジル単離物の結果を比較する場合、３８の不対合があった。これらの３８の試料は、試験記録を調査しブラジルにおけるＮｅｕｆｅｌｄテストによって再テストすることにより再調査した場合、１７の不対合は、型別ミス（ｔｙｐｉｎｇ ｍｉｓｔａｋｅ）または試料誤同定として説明できた。１７の不対合のうちの１つは株ＢＺ６５２であった。これは、１８Ｂとして最初に型別されたが、それがＮｅｕｆｅｌｄテストによって弱く６Ａとして型別され、ポリクローナル抗血清およびｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ３を用いる、ドットブロットアッセイにより血清群６として型別されたため、６Ａであると決定された。２１の残る誤対合の試料をＴＨＹ培地中で再増殖し、マルチビーズアッセイによって再テストした場合、１３の単離物の新しい結果はＮｅｕｆｅｌｄテスト結果と一致した。その１３の単離物の本来のマルチビーズアッセイ結果を再調査した場合、３つの単離物は、本来のマルチビーズにおける適当な血清型につき弱く不完全な阻害（阻害は６７％未満であった）を生成した。１２の単離物が、最初にＮＴとして型別されたが、１つの単離物（ＢＺ５２）は最初にタイプ３として型別された。それは、第２の試料でＮＴとして再型別され、その結果は、Ｎｅｕｆｅｌｄテスト結果（表１）（前記）と一致するようになった。
【００８２】
これらの再検討後に、８つの不一致が再現でき、依然として説明されなかった（表２および表３）：５つの単離物は、Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより６Ａと型別されたが、マルチビーズアッセイによりＮＴとして型別され、２つの単離物（ＢＺ４３５およびＢＺ７０５）は、Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより１１Ａと型別されたが、マルチビーズアッセイによりＮＴとして型別され、また、１つの単離物（ＢＺ４３８）は、ＮｅｕｆｅｌｄテストによりＮＴと型別され、マルチビーズアッセイによって、１８Ｃと型別された。Ｎｅｕｆｅｌｄテストによって、ＢＺ４３８は、いくらかのロットの血清グループ化プール血清ＡおよびＱ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, １９９３）と反応せず、それは血清群１８肺炎球菌と反応するであろう。また、それは、血清群１８に特異的な、または因子１８ｃ、１８ｄ、１８ｅおよび１８ｆに特異的な抗血清のいくつかの異なるロットと反応しなかった。しかしながら、ＢＺ４３８は、血清群１８に特異的なポリクローナル血清またはｍＡｂ Ｈｙｐ１８ＣＭ１（Ｙｕら、２００５）で陽性のドットブロット結果を生成した。かくして、ＢＺ４３８単離物は、１８Ｃであると考えられた。
【００８３】
株ＢＺ４３５およびＢＺ７０５は、Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより１１Ａであるが、マルチビーズアッセイにより１１Ａ、１１Ｄまたは１１Ｆではないと考えられた。標準的なマルチビーズアッセイが、血清群１１（Ｙｕら、２００５）に対するポリクローナル抗血清を用いるために、発明者らは、血清型１１Ａ、１１Ｄおよび１１Ｆに特異的であり、ＵＡＢ研究所において最近生成された２つのｍＡｂ（Ｈｙｐ１１ＡＭｌおよびＨｙｐ１１ＡＭ２）で２つの株を検討した（表２）。発明者らは、Ｈｙｐ１１ＡＭｌはＢＺ７０５ではなくＢＺ４３５を認識することを見出した。興味深いことには、Ｈｙｐ１１ＡＭ２はどちらの株も認識せず、それは１１Ａ血清型を発現する株中の不均一性を示す。ＰＣＲテストは、１１Ｂおよび１１Ｃについてではなく、１１Ａ、１１Ｄおよび１１Ｆについての株と４６３の塩基対アンプリマーを生成する（表２）。双方の株がこのＰＣＲによってテストされた場合、ＢＺ４３５は陽性であったが、ＢＺ７０５はそうではなかった。Ｎｅｕｆｅｌｄテストが、双方の株が因子ｌ１Ｃに特異的な抗血清と反応したことを示したが、Ｎｅｕｆｅｌｄテストは、さらにそれらの間の差を明らかにした：ＢＺ７０５ではなくＢＺ４３５がプール血清Ｔ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, １９９３）、血清群１１抗血清、または１１ｆ因子血清と反応した。ＢＺ７０５は、因子１１ｂ発現についてのあいまいな結果を与え、これは、それが血清型１１Ｄであり得ることを示唆した。しかしながら、ウサギタイピング血清を用いる血清群１１に対するドットブロットテストにおいて、ＢＺ４３５は陽性であったが、ＢＺ７０５は陰性であった。これらの結果のすべてを考慮すると、ＢＺ４３５が１１Ａ株、ＢＺ７０５は１１Ａ、１１Ｄまたは１１Ｆではないようであった。ＢＺ７０５が、１１Ｂ株で発現しない１１Ｃエピトープを発現する（そして、１１ｃ抗血清と反応する）ので、ＢＺ７０５は１１Ｃの血清型に属するかもしれない。
【００８４】
【表３】
【００８５】
６Ａであった残る矛盾した株を調査するために、ｗｃｉＰ遺伝子のＤＮＡ配列を検討した。最近の研究は、６Ａおよび６Ｂの莢膜ＰＳがリビトールに連結したラムノースとの反復単位を有すると報告した。連結は６Ａにつき１−３、６Ｂにつき１−４である。研究により、ラムノシルトランスフェラーゼが莢膜座中のｗｃｉＰ遺伝子によっておそらくコード化され、６ＡについてのｗｃｉＰが残基１９５にてセリンをコード化し、６ＢについてのｗｃｉＰが残基１９５にてアスパラギンをコード化することが判明した（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４）。また、ｗｃｉＰ対立遺伝子１、２、１、９および１１は、排他的に血清型６Ａに関連し、対立遺伝子３、４、５、６、８および１２は、血清型６Ｂに関連する。（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４）．
【００８６】
細菌ＤＮＡを６Ａと標識された５つの単離物ならびに、Ｎｅｕｆｅｌｄテストにより単に弱く６Ａであると考えられたＢＺ６５２から得た。このＤＮＡは、ＰＣＲによりｗｃｉＰ遺伝子の一部を増幅し、アンプリコンを配列決定し、その配列（６４５塩基対）を検討した。５つの試料をうまく増幅し、６Ａ血清型（表３）と関連した対立遺伝子を発現し、アミノ酸残基１９５にてセリンを発現したため、それらの配列は６Ａ血清型と一致した。対立遺伝子２ ｗｃｉＰの原型配列と比較して、ＢＺ６５２のｗｃｉＰ配列は、３つの潜在的なアミノ酸置換を持つ５つの塩基対変更を有する。３つの単離物（ＢＺｌ７、ＢＺ３９およびＢＺ８６）は、対立遺伝子＃９についての原型配列から１つの同一ヌクレオチド変化を持つ同一のｗｃｉＰ遺伝子配列を発現し、従って、クローン的に関連付け得る（表３）。
【００８７】
【表４】
【００８８】
ＤＮＡ試験がこれらの単離物が６Ａ血清型に属し得ることを示唆したために、これらの単離物をポリクローナル抗血清を用いてマルチビーズアッセイで検討した。６つの単離物のすべては、６Ａと型別された（表３）。それらが、Ｈｙｐ６ＡＭ３に加えて１９の異なる６Ａ特異的ｍＡｂで型別された場合、１つのｍＡｂ（Ｈｙｐ６ＡＧｌ）は、６つの単離物を６Ａと同定した（表３）。Ｈｙｐ６ＡＧｌを用いて、４６の６Ａ単離物（この試験からの２１およびＵＡＢ研究所収集における２４）を再テストした場合、このｍＡｂは、それらのすべてを６Ａと同定し、６Ｂ血清型を発現する４３の単離物を含めて８９の非６Ａ血清型のいずれも認識しないことが判明した。かくして、これらの６つの単離物のすべてが６Ａであり、Ｈｙｐ６ＡＧｌはすべての６Ａ単離物を認識することは明らかであった。また、ｍＡｂ Ｈｙｐ６ＡＭ３は、そのサブセットが非常に大きいが、６Ａ単離物のサブセットを認識する。
【００８９】
実施例２．異なる国からの肺炎球菌血清型６Ａβ単離物は、６Ａと関係する分子特性を有する
前記のごとく、６Ａ血清型と従前に関連した双方のｍＡｂｓと反応しなかったブラジルの単離物は、ｗｃｉＰ対立遺伝子の検討により６Ａ血清型に属することが示された。かくして、発明者らは、地理的に多様な位置からの１０の６Ａβ単離物のｗｃｉＰ遺伝子を検討した。２００３年および２００４年に集めたブラジルの単離物、米国の単離物および韓国からの１つの単離物を検討した。その配列は、１０の単離物のすべてが、６Ａ血清型に関係する遺伝特性を有することを明白に示した。
【００９０】
実施例３．異なる領域からの６Ａβ単離物は、一定の血清学的特性を有する
定量的方法で６Ａβ単離物の血清学的特性を調査するために、単離物を阻害アッセイを用いて検討した。アッセイは、６Ａ ＰＳを被覆したＥＬＩＳＡプレートに結合する種々の抗６Ａ抗体の細菌溶解物による阻害を測定した。略言すると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．, Ａｃｔｏｎ, ＭＡ）のウェルを、ＰＢＳ中で一晩、５μｇ／ｍＬの６Ａ莢膜ＰＳ（Ｇ. Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ, Ｂｒｏｏｋｌｙｎ, ＮＹの贈与）で３７℃にてコーティングした。０.０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄した後に、従前に希釈した細菌培養上清（または溶解物）を、抗６Ａ抗体と共にウェルに加えた。肺炎球菌溶解物を、チューブが不明瞭になるまで振盪せずに０.５％酵母抽出物（ＴＨＹ）を補足した１０ｍＬのトッド−ヒューレットブロス中で肺炎球菌を増殖させ、次いで、溶解緩衝液（脱イオン水中の０.１％デオキシコール酸ナトリウム、０.０１％ ＳＤＳおよび０.１５Ｍクエン酸ナトリウム）で３７℃にて１５分間チューブをインキュベートすることにより調製した。Ｈｙｐ６ＡＧｌ ｍＡｂは１：２５０希釈で用い、Ｈｙｐ６ＡＮ３ ｍＡｂは１：１００希釈で用いた。Ｓｔａｔｅｎ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ, ＤＫ）からのプールＱおよび因子「６ｂ」ウサギ抗血清を、１：５００希釈で用いた。３７℃の湿性インキュベーター中での３０分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ, Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）またはアルカリホスファターゼを結合したヤギ抗ウサギＩｇ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ, Ｃａｍａｒｉｌｌｏ, ＣＡ）で２時間インキュベートした。そのウェルに固定化した酵素の量をジエタノールアミン緩衝液中のパラニトロフェニルホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ）で決定した。４０５ｎｍでの光学密度は、マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ. Ｗｉｎｏｏｓｋｉ, ＶＴ）で読み取った。
【００９１】
膨張反応の定性的な性質が６Ａ亜型の検出を防止し得るために、亜型が、膨張反応に用いたウサギ血清を用いる定量的アッセイで同定可能で有り得るかを決定した。これは、肺炎球菌の溶解物が、ＥＬＩＳＡプレート上で固定化された６Ａ ＰＳに対するウサギ抗血清の結合を阻害することを可能とする阻害アッセイに対してウサギ血清を適合することにより決定した（図１）。対照として、肺炎球菌溶解物を２つのｍＡｂ：Ｈｙｐ６ＡＧｌおよびＨｙｐ６ＡＭ３の阻害につきテストした（図１Ａおよび１Ｂ）。３つの６Ａα単離物の溶解物（米国からのＣＨＰＡ３７８、韓国からのＫＫ５８およびブラジルからのＳＴ５５８）は、双方のｍＡｂを阻害し、２つの６Ｂ単離物（ブラジルからのＳＴ４００およびＳＴ５１８）の溶解物は、いずれのｍＡｂも阻害しかかった（図１Ａおよび１Ｂ）。６Ａβ単離物の２つの溶解物（ブラジルからの株ＢＺ１７およびＢＺ６５０）は、１：１０００希釈でさえ、Ｈｙｐ６ＡＧｌの結合を明確に阻害した（図１Ａ）。しかしながら、それらは１：１０希釈でさえ、Ｈｙｐ６ＡＭ３に、ほとんど阻害を示さなかった（図１Ｂ）。
【００９２】
肺炎球菌溶解物が、プールＱ（血清型別につきしばしば用いるウサギ抗血清（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ, ３１ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２０９７−２１００（１９９３））の阻害につき検討された場合、６Ａαおよび６Ａβの双方の溶解物は同様に良好に阻害できたが、６Ｂ溶解物は阻害できなっかた（図１Ｃ）。「６ｂ」因子特異的ウサギ血清をテストした場合、６Ａα、６Ａβおよび６Ｂ単離物のすべてが、因子血清を同様に良好に阻害できた（図１Ｄ）。６ｂ−因子血清が６Ａ特異的に設計されるために、これは予期されなかった。しかしながら、その因子血清は、この阻害アッセイにおいてではなく、膨張反応において特異的であるように設計する。しかしながら、この実験は、肺炎球菌の型別に一般的に用いられるウサギ抗血清が６Ａおよび６Ｃの亜型を同定しないことを示した。
【００９３】
また、発明者らは、オプソニン化アッセイおよび高レベルの抗６Ｂ抗体を含むヒト血清を用いて、種々の６Ａα、６Ａβおよび６Ｂ単離物を比較した。ヒト血清は６Ｂならびに６Ａαをオプソニン化した（図２）が、それは、ブラジル、韓国および米国からの７つの異なる６Ａβ単離物をオプソニン化しなかった（図２）。
【００９４】
実施例４．ヒト抗血清は、２つの６Ａ亜型に対して等しく防御的ではない。
ヒト抗血清が６Ａβではなく６Ａαおよび６Ｂをオプソニン化しかねないために、発明者らは６Ａα、６Ｂおよび６Ａβ血清型をオプソニン化させるために系統的に２０名の成人からの血清試料を検討した（図３Ａ）。血清ドナーは少なくとも５年間肺炎球菌ワクチンを予防接種されなかった。大部分の個体は低オプソニン化力価を有したが、４名の個体が血清型６Ｂにつき１００を超えるオプソニン化力価を有した。その４つの個体からの血清は、６Ａαに対する有意なオプソニン化力価を有したが、１つだけは６Ａβに対する有意な力価を有した。その観察は、成人集団が６Ａαより６Ａβに対してより少ない自然免疫を有することを示唆する。
【００９５】
６Ｂでの免疫化が６Ａβと交差反応する抗体を誘導するかを検討するために、発明者らは、肺炎球菌ワクチンで免疫した２０名の成人からの血清を試験した（図３Ｂ）。１０名は９価の肺炎球菌結合型ワクチン（ＰＣＶ）で免疫し、１０名は２３価のＰＳ結合ワクチン（ＰＰＶ）で免疫した。ＰＣＶで免疫した１０名のうちの８名は、６Ｂにつき高い（＞１００）オプソニン化力価を有した。これらの８名のうち７名が、６Ｂ力価と相応した６Ａαに対するオプソニン化力価を有したが、１名だけが６Ｂ力価と相応した６Ａβ力価を有した。その人の血清がほとんど、６Ｂと同様に６Ａαをオプソニン化したため、６Ａβと交差反応する抗６Ｂ抗体を誘発したようである。ＰＰＶワクチン被接種者を検討した場合、５名が６Ｂに対する高オプソニン化力価（＞１００）を有し、２名が６Ａαに対する高力価を有したが、６Ａβに対する高力価を有したものはなかった（図３Ｂ）。総合すれば、これらの知見は、現在、利用可能な肺炎球菌ワクチンが６Ａβ感染に対してより、良好に６Ａαに対する保護を提供し得ることを示唆する。
【００９６】
実施例５．肺炎球菌を同定するのに有用なモノクローナル抗体の開発
従前に記載のごとく、マウスハイブリドーマを生成した。Ｙｕら, ２００５（Ｓｕｎら, ６９ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ３３６−４４（２００１）を引用）. 略言すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＰＳ蛋白質コンジュゲートで２回（第０および２１日に）皮下的に、および第５９日に１回腹腔内にて免疫した。７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４および１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）についての免疫原は、Ｐｒｅｖｎａｒ（Ｗｙｅｔｈ Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ, Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ, ＮＹ）であった。血清型５および７Ｆに用いたコンジュゲートは、米国食品薬品局（Ｂｅｔｈｅｓｄａ, ＭＤ）で調製され、その６ＡコンジュゲートはＰｏｒｔｅｒ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ, ＮＹ）の贈与であり、卵白アルブミンに対する血清型１、３および９Ｎのコンジュゲートは以下のように調製した。臭化シアン活性化ＰＳは、一晩培養中に卵白アルブミンにカップリングした。ＰＳ蛋白質コンジュゲートは、分子量サイズ分離カラムで反応混合物から精製した。各用量は、血清型４、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆについて１μｇのＰＳ；血清型３および６Ｂについて２μｇ；および血清型１、５、６Ａ、７Ｆおよび９Ｎについて１０μｇを含有した。一次および二次の免疫原は、１０μｇのＱｕｉｌ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ, Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）を含有した。
【００９７】
最後の免疫化の３日後に、従前に記載されたように、マウスを犠牲にし、脾臓を採取し、脾細胞をＳＰ２／０ Ａｇ−１４と融合させた。Ｎａｈｍら, １２９ Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １５１３−１８（１９８２）. 初代培養ウェルを望ましい抗体の産生につきスクリーニングし、かかる抗体を産生するウェルを限界希釈によって２回クローニングした。ヒト−マウスハイブリドーマＤｏｂ９を、従前に記載のごとく、２３−価のＰＢワクチンで免疫した人からの末梢血リンパ球をハイブリダイズすることにより生成した。Ｓｕｎら, ６７ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. １１７２−７９（１９９９）．
【００９８】
ヒト−マウスハイブリドーマは、肺炎球菌血清型１９Ａおよび１９Ｆに特異的である。全てのハイブリドーマは、１つの１１ｇＡ産生株を除いて、ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体のいずれかを生成した。ＨｙｐβＡＧｌはＩｇＧであり、Ｈｙｐ６ＡＭ６はＩｇＭである。
【００９９】
６Ａ血清型に特異的な合計２１種のハイブリドーマを単離した。多数が同様の血清学的挙動を有し、いくらかは姉妹クローン（すなわち、いくらかは同一の可変領域構造を有し得る）であり得る。生成された６Ａ特異的ハイブリドーマの名称は、Ｈｙｐ６Ａｌ、ＨｙｐβＡＭｌ、Ｈｙｐ６ＡＭ２、Ｈｙｐ６ＡＭ３、Ｈｙｐ６ＡＭ４、Ｈｙｐ６ＡＭ５、Ｈｙｐ６ＡＭ６、Ｈｙｐ６ＡＭ７、Ｈｙｐ６ＡＭ８、Ｈｙｐ６ＡＭ９、Ｈｙｐ６ＡＭｌＯ、Ｈｙｐ６ＡＭ１１、Ｈｙｐ６ＡＭ１２、Ｈｙｐ６ＡＭ１３、Ｈｙｐ６ＡＧｌ、Ｈｙｐ６ＡＧ２、Ｈｙｐ６ＡＧ３、Ｈｙｐ６ＡＧ４、Ｈｙｐ６ＡＧ５、Ｈｙｐ６ＡＧ６、Ｈｙｐ６ＡＧ７である。
【０１００】
実施例６．６Ａβの遺伝学的試験
非莢膜の肺炎球菌株を６Ａβ単離物からの遺伝子で容易に形質転換できた（未発表データ）。この知見は、６Ａβ莢膜合成が１つの（複数ではない）遺伝子断片、おそらく莢膜遺伝子座を必要とすることを示唆する。６Ａβ発現を担う遺伝子を同定するために、発明者らは３つのトランスフェラーゼ（ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯおよびｗｃｉＰ）を検討した。ｗｃｉＰ遺伝子は６Ａαと６Ａβ単離物との間で同一で有り得る（前記のごとく）。ｗｃｉＮ領域がプライマー５０１６および３１０１（５１０６：５’−ＴＡＣ ＣＡＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＴおよび３１０１：５’−ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＧＣ）を用いるＰＣＲによって検討された場合、検討した９つの６Ａα単離物のすべては、検討した６つの６Ａβ単離物のすべてより約２００塩基対（ｂｐ）長い生成物を与えた（図５）。６つの単離物は、韓国、米国およびブラジルからの６Ａβ単離物を含んだ。かくして、このＰＣＲは６Ａ亜型についての遺伝子テストとして用いることができる。
【０１０１】
次いで、１つの６Ａα単離物（ＡＡＵ９）および１つの６Ａβ単離物（ＳＴ７４５）からのＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列を決定した（図６）。ＡＡＵ９ ＰＣＲ生成物における１２０３〜２９５９位間の塩基（１７５７塩基）のすべてを配列決定し、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて報告された６Ａ単離物の莢膜座配列であるＣＲ９３１６３８に相同性であることが判明した。対照的に、そのＳＴ７４５配列は、１３６８位までで、２５９１位から再び開始する６Ａαのそれとほとんど同一であることが判明した。介在する１０２９ｂｐ配列（１３６９〜２３９７）は、６Ａαのそれとは全く異なる。介在配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにより多糖体合成に用いられたトランスフェラーゼに類似する約９８ｂｐを含む。
【０１０２】
実施例７．６Ｃ単離物は化学的に区別される莢膜を有する
２つの６Ｃ単離物（ＢＺ１７およびＢＺ６５０）、４つの６Ａ株（ＳＰ８５、ＳＴ５５８およびＣＨＰＡ３７８）および２つの６Ｂ株（ＳＴ４００およびＳＴ５１８）を比較した。全ての肺炎球菌単離物は、肺炎球菌の典型的なコロニー形態学を有し、オプトヒン感受性で、かつ胆汁可溶であった。上記実施例３に記載のごとく、サブタイピングアッセイを行った。
【０１０３】
多糖体単離および精製：肺炎球菌株（ＳＰ８５またはＢＺ１７）を、塩化コリン、炭酸水素ナトリウムおよびシステイン−ＨＣｌを補足したＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ, ＫＳ）からの２リットルの化学的に規定された培地（ｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎら, ２７ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ４４４−４９（１９８０））中で増殖させ、０.０５％デオキシコール酸塩で溶解した。遠心によって細胞片を除去後、ＰＳを７０％エタノール中で沈殿させ、１２０ｍＬの０.２Ｍ ＮａＣｌにそれを溶解することにより回収した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）中でＰＳを透析後、ＰＳをＤＥＡＥセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｕｐｐｓａｌａ, Ｓｗｅｄｅｎ）カラム（５０ｍｌ）に負荷し、ＮａＣｌ濃度勾配で溶出した。得られた画分を前記のごとき阻害アッセイで６Ａαまたは６ＡβＰＳにつきテストした。ＰＳ含有画分をプールし、エタノール沈澱（７０％）により濃縮し、透析し、次いで凍結乾燥した。凍結乾燥したＰＳを３ｍｌの水に溶解し、１２０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するゲル濾過カラムに負荷した。ＰＳを水でカラムから溶出し、次いで、全画分を阻害アッセイで６ＡβＰＳにつきテストした。第１の６Ａαまたは６ＡβＰＳピークを含む画分をプールし、凍結乾燥した。
【０１０４】
単糖体分析：凍結乾燥した莢膜ＰＳを８０℃にて１６時間１.５Ｍ ＨＣｌ中のメタノリシスに付した。メタノール性ＨＣｌを蒸発後、残渣を室温で２０分間 Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ. Ｉｎｃ. Ｒｏｃｋｆｏｒｄ, ＩＬ）で処理した。反応生成物を、３０ｍ（直径０.２５ｍｍ）のＶＦ−５キャピラリーカラムを取付けたＧＬＣ／ＭＳ（Ｖａｒｉａｎ ４０００, Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ. Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ, ＣＡ）で分析した。カラム温度は、１００℃にて５分間維持し、次いで、２０℃／分にて２７５℃まで増加させ、最終的に２７５℃に５分間保持した。溶出物は電子衝撃イオン化モードを用いる質量分析法により分析した。
【０１０５】
酸化、還元および加水分解：莢膜ＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を、８０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４）中の４０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムで暗所４℃にて４日間処理した。過剰の過ヨウ素酸塩をエチレングリコールで中和後、試料を透析し、次いで凍結乾燥した。Ｓｔｒｏｏｐら, ３３７ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ. Ｒｅｓ. ３３５−４４（２００２）. ＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を、２００ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４またはそのジューテリウム形態ＮａＢＤ４でＲＴにて３時間還元し、透析し、次いで凍結乾燥した。酸化／還元した６Ｃ ＰＳを０.０１Ｍ ＮａＯＨ中で８５℃にて３０分間加水分解し、０.０１Ｍ ＨＣｌを添加することにより中和し、次いで脱塩なくして質量分析法に直接的に用いた。
【０１０６】
タンデム型質量分析：天然および酸化／還元した６Ｃのタンデム型質量分析を電子スプレーイオン源を装備したＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｌｔｄ. Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ, ＵＫ）を用いてアラバマ大学バーミンガム校のＭａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて行った。蒸留水に溶解した試料をハーバードシリンジポンプを用いて、１μＬ／分の速度にて、泳動用緩衝液（０.１％ギ酸を含有する５０／５０のアセトニトリル／水）と共に質量分析計に注入した。注入した試料は、電子スプレー（ニードル電圧＝２.８ｋＶ）で負にイオン化され、ＴＯＦ質量分析計で検出した。注入した試料は、電子スプレー（ニードル電圧＝２.８ｋＶ）で負にイオン化され、ＴＯＦ質量分析計で検出した。ＭＳ／ＭＳについて、親イオンをアルゴンガスとの衝突前に４０ｅＶまでそれを印加することにより、娘イオンに断片化した。娘イオンはＴＯＦ質量分析計で分析した。ＭＳ／ＭＳスペクトルはＭａｓｓＬｙｎｘ ３.５のＭａｘ−Ｅｎｔ３モジュールを用いて処理した。
【０１０７】
スミス勾配およびグリセロール検出：過ヨウ素酸塩で処理した６Ａαおよび６Ａβ ＰＳを１Ｍ水酸化アンモニウム中の１０ｍｇ／ｍｌナトリウムボロジューテリドで１６時間還元した。過剰のナトリウムボロジューテリドを氷酢酸の添加により除去し、０.５ｍｌのメタノール：酢酸（９：１）を添加した。試料を窒素流下で乾燥し、０.２５ｍｌのメタノールで２回洗浄した。乾燥試料を０.５ｍｌの１.５Ｍメタノール性ＨＣｌ中に懸濁し、８０℃にて１６時間インキュベートした。試料を窒素流下で乾燥し、０.２５ｍｌのメタノールで２回洗浄した。乾燥試料を０.１ｍｌのＴｒｉ−Ｓｉｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）中に懸濁し、８０℃にて２０分間インキュベートした。１μｌの試料を、６０ｍのＶＦ−Ｉカラムを装備したＶａｒｉａｎ ４０００ガスクロマトグラフ‐質量分析計（Ｖａｒｉａｎ ４０００, Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ. Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ, ＣＡ）に注入した。ヘリウムを１.２ｍｌ／分の一定流速にてキャリヤーガスとして用いた。オーブン条件は、２分間保持した５０℃の初期温度、１５Ｏ℃まで３０℃／分の温度増加、次いで２２０℃まで３℃／分にてさらに増加させ、それを２分間保持した。注入温度を２５０℃に、ＭＳトランスファーラインを２８０℃に維持した。ＭＳデータ取得パラメーターは、アセトニトリルを用いる電子衝撃（ＥＩ）モード、または化学イオン化（ＣＩ）モードにおいてｍ／ｚ ４０〜１０００を走査することを含んだ。
【０１０８】
６Ａα ＰＳのクロマトグラフィーは、従前の刊行物と一致するリビトール、ラムノース、グルコースおよびガラクトースの特性である全てのピークを示した（図７Ａ）。Ｋｉｍら, ３４７ Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２６２−７４（２００５）. 例えば、ガラクトースは、１１.２〜１１.６分の保持時間に出現する３つの主要なピークを与え、その第２のピークは最も高かった。Ｋｉｍら（２００５）. ６ＡβＰＳクロマトグラムを検討した場合、リビトール、ラムノースおよびグルコースの特徴的なピークが見出されたが、ガラクトースのピークは不存在であった。各炭水化物ピークの面積をラムノースのピーク面積に標準化し、６Ａαおよび６Ａβ間で比較した場合（図７Ｂ）、６Ａαおよび６Ａβ ＰＳは、リビトールピークの等価な面積を有する。しかしながら、６Ａβのグルコースピーク面積は、６Ａαの２倍であった（図７Ｂ）。この知見は、６Ａβの反復単位は、６Ａαとして１つのリビトールおよび１つのラムノースを有するが、１つの各々のグルコースとガラクトースの分子に代わる２つのグルコース分子を有することを示唆した。かくして、６Ａβは、ガラクトースに代えてグルコースを用いることによる６Ａαにより生成したＰＳとは化学上異なる莢膜ＰＳを生成する。
【０１０９】
６Ａβ ＰＳに存在すると推定した２つのグルコース分子をさらに調査するために、６Ａαおよび６Ａβ ＰＳを、隣接するグリコールを選択的に破壊する過ヨウ素酸塩で処理した。
６Ａ ＰＳの公表した構造から期待されるように、６Ａα ＰＳのガラクトースおよびリビトールピークを検出できなくなるが、グルコースおよびラムノースのピークは影響を受けなかった。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖｉｅｗ, ｉｎ Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ＆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ８１−１１４（Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ, Ｌａｒｃｈｍｏｎｔ, ２０００）；Ｋｉｍら, ３４７ Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２６２−７４（２００５）；Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, ８３ Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. ３０５６−５９（１９６１）. ６Ａβ ＰＳを過ヨウ素酸塩処理した場合、そのリビトールは検出できなくなり、そのグルコースピークは約半分だけ低下し、一方、そのラムノースピークは影響を受けないままであった（図７Ｂ）。この知見は、６Ａα ＰＳ構造がその文献において公表された６Ａ ＰＳ構造と同一であることを強く示唆する。また、それは、６Ａβ ＰＳが６Ａα ＰＳとは化学的に異なり、６Ａβ ＰＳが２つのグルコース分子を有し、その一方は過ヨウ素酸塩に感受性であり、他方は感受性ではないことを示す。
【０１１０】
実施例８．反復単位内の単糖体／リビトール配列の決定
６Ａ ＰＳの穏やかなアルカリ加水分解は、各反復単位におけるホスホジエステル結合を壊し、負電荷を持つ反復単位を生成し、次いで、それをタンデム型質量分析で検討できる。（株ＳＰ８５からの）６Ａα ＰＳの加水分解生成物は、負電荷を持つ３つの十分に規定されたピーク：６８３.２１、７０１.２１および７５９.１９の質量電荷比（ｍ／ｚ）単位を持つピーク（図８Ａ）を示した。６８３.２１ｍ／ｚ単位のピークは、７０１.２１ｍ／ｚ単位のピークの無水形態を表わし、７５９.１９でのピークは、ＮａＣｌ塩で７０１.２１ｍ／ｚ単位を持つ分子を表わす。これは、反復単位の質量が記載のごとき６８３.２１質量単位であることを示す。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, ２０００；Ｋｉｍ, ２００５. ７０１.２１のピークの娘イオン（生成物イオン）を検討し、５３９.１３、３７７.０８および２１２.９９ｍ／ｚ単位の質量を持つ娘イオンを与え、それらは、各々、グルコース−ラムノース−リビトール−Ｐ、ラムノース−リビトール−Ｐおよびリビトール−Ｐフラグメントの質量に対応する（図８Ｃ）。また、７０１.２１、５３９.１４、３７７.０８および２１２.９９ｍ／ｚ単位のそれらの無水相当物。９６.９４および７８.９３ｍ／ｚ単位で観察したさらなるピークは、Ｈ２ＰＯ４−およびＰＯ３−イオンを表わす（図８Ｃ）。
【０１１１】
６Ａα ＰＳに用いた同一手順を用いる６Ａβ ＰＳの分析は、６Ａα ＰＳにつき見出された３つの主要なピークに対応する６８３.２４、７０１.２５および７５９.２２ｍ／ｚ単位での３つの主要なピークを示した（図８Ｂ）。また、６Ａβ切断生成物は、６Ａαのものと同一の質量スペクトルを有した（図８Ｄ）。この知見は、６Ａβ ＰＳの反復単位の質量が６８３.２ｍ／ｚ単位であり、６Ａβ反復単位の炭水化物配列がグルコース１−グルコース２−ラムノース−リビトール−Ｐであることを示した。（その２つのグルコースを区別するために、それらをグルコース１およびグルコース２と標識する。グルコース１は６Ａαのガラクトースに対応する。）かくして、６Ａβの単糖体配列は、ガラクトースのグルコース１での置換を除いて、６Ａαのそれと同一である。
【０１１２】
実施例９.６Ａβ反復単位の炭水化物およびリビトール間の連結の決定。
過ヨウ素酸塩感受性の６Ａβグルコースを同定するために、６Ａβ ＰＳを酸化し、穏やかなアルカリ加水分解により反復単位を還元し、その反復単位をタンデム型質量分析で試験した。それらの質量スペクトルを、６５０および７００ｍ／ｚ単位間のいくつかの主要な（および優位な）ピークを示した（図９Ａ）。優位なピークは、６５５.２３、６５９.７３、６６１.２４、６６４.２５、６７３.２５および６７５.２４ｍ／ｚ単位にあった。天然同位元素により、各優位なピークは１または２のさらなる質量単位を持つサテライトピークを有し、これらのサテライトピークを用いて、優位のピークの荷電状態および真の質量を決定できる。Ｃｏｌｅ、エレクトロスプレーイオン化質量分析：基礎、計測および適用（Ｗｉｌｅｙ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ２０００）。例えば、６６１.２４ｍ／ｚ単位の優位なピークは、６６１.５７ｍ／ｚ単位を持つサテライトピークを有する。これらの２つのピークが０.３３ｍ／ｚ単位によって分離されるために、６６１.２４のピークは、３つの負電荷を持つ分子イオンおよび１９８３.７２の質量単位（すなわち、１つの水分子を含む３つの反復単位；６５５.２３＊２＋６７３.７６＝１９８３.７２）を表わす。同様に、その６６４.２５および６７５.２４のピークは、２つの負電荷を持つ２つの反復単位を表すが、その６７５.２４のピークは陽子を交換するナトリウムイオンを有する。６７３.２５および６５５.２３のピークは、水分子がある、または水分子のない１つの負電荷を持つ１つの反復単位を表わす。酸化／還元に先立って無水反復単位の質量が６８３.２６であったために、反復単位は酸化および還元により２８質量単位を損失した。リビトールおよびグルコースの過ヨウ素酸塩反応生成物を同定するために、リビトールフラグメントをＲｘフラグメントと命名し、その２つのグルコースフラグメントをＧｘおよびＧｙフラグメントと命名した（図１０Ａ）。
【０１１３】
娘イオンは、６７３.２５ｍ／ｚ単位を持つ親イオンを断片化することにより得た（図９Ｂ）。断片化中に、１つのフラグメントは１つの原子質量単位（ＡＭＵ）を他のフラグメントと交換し得る。Ｇｒｏｓｓｅｒｔら, ２０ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ. Ｍａｓｓ. Ｓｐｅｃｔｒｏｍ. １５１１−１６（２００６）；ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ ３１ Ａｎａｌ. Ｃｈｅｍ. ８２−８７（１９５９）. また、分子イオンは、アルゴン衝突セル内で不定に水和されるようになる。Ｓｕｎら, ６９ Ｉｎｆｅｃｔ. Ｉｍｍｕｎ. ３３６−４４（２００１）. 事実、娘イオンを１８ｍ／ｚ単位（図９Ｂ）の差に基づいて水和および無水ピークにグループ化できた。６７３.２５、５８１.１６、５０９.１３、３４７.０７および２００.９９ｍ／ｚ単位で見出されたピークは水和したピークであり、その各々は、１８ＡＭＵ小さい対応する無水ピークを有する。また、２００.９９、３４７.０７および５０９.１３ｍ／ｚ単位のピークは、切断化中に切断化サイト（図１０Ｂ）に加えられた１つの水素原子を持つ２００、３４６のおよび５０８ＡＭＵを持つフラグメントに対応する。２００.９９ｍ／ｚ単位のピークは、リビトールが過ヨウ素酸塩処理中にＣＨ２ＯＨを損失したことを確認する。３４７.０７および５０９.１３でのピークは、ラムノースおよびグルコース２が過ヨウ素酸塩抵抗性であることを示す。５８１.１６でのピークの存在は、グルコース１が切断されることを示す。
【０１１４】
過ヨウ素酸塩切断は、グルコース１を２部（それらを図１０Ａ中のＧｘおよびＧｙと命名した）に分割した。２部の組み合わせた質量は、グルコース１が炭素を損失しなかったが、酸化還元反応中に切断部位で２つの水素原子を得たために、１６２（無傷のグルコースの質量）に代わる１６４である。図９に示した質量スペクトルは、各々、９１および７４ＡＭＵを有するＧｘおよびＧｙと一致する。５８１.１６ｍ／ｚ単位のピークは、反復単位がＧｘおよび１つの余分な陽子を損失したことを示す（図１０）。ＧｘおよびＧｙ（７４ＡＭＵ）の双方の中性の損失の結果、Ｇｙが既にＧｘに対する１つの水素を損失し、グルコース２に１つの水素を残すために、７２ｍ／ｚ単位をさらなる損失を生じる。同一パターンが、無水ピーク：すなわち、６５５.２２、５６３.１６および４９１.１２ｍ／ｚ単位につき判明した。さらに、６Ａβ ＰＳをＮａＢＤ４で還元した場合、２つのさらなる質量単位はグルコース１に関係していた：Ｇｘフラグメントの中性の損失は９２に代えて９３であり、Ｇｙのそれは７２に代えて７３であった（図４Ｃ）。これらの知見は、グルコース１が、図１ＯＡに示すサイズを持つＧｘおよびＧｙに切断することを明確に示した。
【０１１５】
また、娘イオンの質量スペクトルは、６Ａβ ＰＳのグリコシド結合についての情報を提供した。グルコースおよびラムノースはそれらの最初の炭素にて先の炭水化物に連結されなければならない。Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, １９６１. また、それらは過ヨウ素酸塩に抵抗性であるために第３の炭素もて次の炭水化物に連結されなければならない。Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, １９６１. かくして、６Ａβ ＰＳは、グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→）を有しなければならない。娘イオンのさらなる検討は、それらのグルコース１がその第２の炭素にてホスホジエステル結合を有することを示す。過ヨウ素酸塩感受性であるために、グルコース１は、２、４または６位でのみそのホスホジエステルリンクを有しなければならない。ホスホジエステル結合連結は、６での結合がグルコース１中の炭素原子の損失を生じるために６位ではない（図１０Ｆ）。ホスホジエステル連結が４位ならば、切断は第２および第３の炭素間で生じる。次いで、ＧｘおよびＧｙは１２０および４２ＡＭＵを有し、５５２ｍ／ｚ単位を持つピークは５８１ｍ／ｚ単位（図１０Ｅ）でのピークに代わって検出されるであろう。
【０１１６】
加水分解はグルコース１とのホスホジエステル結合を切断するが、それは時々代わりにリビトールとのホスホジエステル結合を壊す。この逆切断生成物の検討は、ホスホジエステル結合がグルコース１の第２の炭素になければならないことをさらに確認する。１５０.９５および２４３.００ｍ／ｚ単位を持つピークは、これらのｍ／ｚ単位を持つ生成物が、第２の炭素（図１０Ｄ）でのホスホジエステル結合でグルコース１から生成でき、これらのピークが、還元がＮａＢＨ４に代えてＮａＢＤ４で行う（図９Ｃ）ならば、１（１５０.９５→１５１.９７）または２（２４３.００→２４５.０２）を超えるｍ／ｚ単位を有するので、グルコース１の逆切断生成物である（図９Ｂ）。また、１２０.９５ｍ／ｚ単位のイオンは、１５０ｍ／ｚ単位でのイオンが末端のメタノール基を損失するならば得ることができる。これらのピークは、ホスホジエステル結合が第４または第６の炭素（図１０Ｅおよび１０Ｆ）にあれば、説明できない。かくして、逆の切断生成物でのデータも、ホスホジエステル結合がグルコース１の第２の炭素に連結することを示す。
【０１１７】
質量スペクトルのさらなる検討は、ラムノース−リビトール連結が（１→３）でなければならないことを示した。肺炎球菌がそれらの莢膜合成のためのタイコ酸合成のために同様に生成されるＣＤＰ−５−リビトールを用いる（Ｐｅｒｅｉｒａ ＆ Ｂｒｏｗｎ ４３ Ｂｉｏｃｈｅｍ. １１８０２１２（２００４））ために、リビトールおよびグルコース１間の連結はリビトール（５→Ｐ→２）グルコース１でなければならない。７８.９４および９６.９４のピークは、ＰＯ３−およびＨ２ＰＯ４−に対応するが、１８２.９８および２００.９９でのピーク（図９Ｂ）は、ＰＯ３−およびＨ２ＰＯ４−に結合したＲｘフラグメントに対応する（図１０Ａ）。かくして、リビトールは、酸化還元反応中にヒドロキシメチル基を失うに違いなく、ラムノースおよびリビトール間の連結はラムノース（１→３）リビトールでなければならない。上記の全てを考慮すると、６Ａβ反復単位は、｛Ｐ→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→｝となるべきである（図１０Ｃ）。
【０１１８】
６Ａα ＰＳを分析した場合、６Ａβ ＰＳピークと同一のピークを見出し、それはガラクトースおよびリビトールが過ヨウ素酸塩によって破壊したが、グルコース２およびラムノースが無傷のままであったことを示す。かくして、６Ａα ＰＳの構造は、｛→２）ガラクトース（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→Ｐ）に違いなく、それは文献に公表された６Ａ ＰＳ構造と同一である。Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ, ２０００；Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, １９６１. 要約すると、６Ａおよび６Ｃ ＰＳ間の唯一の構造の差は、グルコース１（またはガラクトース）の第４の炭素での水酸基の配向である。
【０１１９】
古典的に、６Ａ ＰＳのホスホジエステル結合は、酸化および還元した６Ａ ＰＳのスミス分解後にグリセロールが遊離されることを示すことにより、ガラクトースの第２の炭素にあることが決定された。Ｒｅｂｅｒｓ ＆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ, １９６１．この古典的アプローチを用いて６Ａβホスホジエステル結合の位置を確認するために、前記のごとく、酸化および還元後の６Ａαおよび６Ａβ ＰＳのスミス分解を行なった。６Ａαおよび６Ａβ ＰＳの反応生成物は、２つのＰＳからのグリセロールを示した。かくして、グルコース１は、グルコース１の第２の炭素にてホスホジエステル結合を有する。
【０１２０】
実施例１０．血清型６Ｃの遺伝子起原
菌株および培養：その試験に用いた肺炎球菌株を表４にリストする：
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
早期に報告されたブラジルからの６Ｃ単離物（Ｌｉｎら, ２００６）に加えて、さらなる６Ｃ株を「６Ａ」血清型としてその研究所で保管された、前から存在する肺炎球菌単離物を再型別することにより同定した。収集は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら, １８４ Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ６３６７−７５（２００２）；Ｍａｖｖｏｉｄｉ, ２００４；およびＰａｙｎｅ（Ｐａｙｎｅ, ２００６年提出）による試験に用いた６Ａ単離物を含む。１つの株（ＢＧＯ−２１９７）をＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ, Ａｌａｂａｍａ, ＵＳＡにて１９７９年に単離した。ＴＩＧＲ４ＪＳ４株は、ＴＩＧＲ４株（Ｔｅｔｔｅｌｉｎら, ２９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４９８−５０６（２００１））の非莢膜の変種であり、ヤーヌスカセット（Ｊａｎｕｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ）（ｋａｎＲ−ｒｐｓＬ＋）でタイプ４莢膜遺伝子座を置換し、野性型ＴＩＧＲ４（Ｔｒｚｃｉｎｓｋｉら, ６９ Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ. ７３６４−７０（２００３）；Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ（未発表））に３回戻し交配することにより生成した。ＴＩＧＲ６ＡＸ、ＴＩＧＲ６Ａ４およびＴＩＧＲ６Ｃ４は各々、無、６Ａまたは６Ｃの莢膜タイプを発現するＴＩＧＲ４ＪＳ４変種である。これらの変種を、後記に示すように生成した。
【０１２３】
ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定：この試験に用いたＰＣＲプライマーのすべてを表５にリストした。多座配列解析（ＭＬＳＴ）に用いたプライマーは、Ｅｎｒｉｇｈｔ ＆ Ｓｐｒａｔｔ, １４４（１１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３０４９−６０（１９９８）により記載した通りであり、ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯおよびｗｃｉＰ遺伝子を増幅するのに用いたプライマーは、Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４に記載された。さらなるプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ中の６Ａおよび６Ｂ莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列（各々、受入れ番号ＣＲ９３１６３ＳおよびＣＲ９３１６３９）を用いて設計した。
【０１２４】
【表６】
【０１２５】
莢膜遺伝子座ＰＣＲについて、反応混合物は１０〜３０ｎｇの染色体ＤＮＡ、１００−ｐｍｏｌストックからの１μｌの各プライマー、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌの１０×緩衝液、０.５μｌ（２.５Ｕ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ, Ｓｈｉｇａ, Ｊａｐａｎ）、および３９.５μｌの滅菌水（Ｓｉｇｍａ, Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ, ＭＩ）を有した。多座配列解析用の反応混合物は、１０〜３０ナノグラムの染色体ＤＮＡ、５０−ｐｍｏｌストックからの１μｌの各プライマー、２μｌのＭｇＣｌ２、５μｌのＱ溶液（Ｑｉａｇｅｎ, Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ, ＣＡ）、１２.５μｌのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）および４μｌの滅菌水（Ｓｉｇｍａ）を有した。染色体ＤＮＡは、製造者の説明書に従いＷｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ, Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）で単離した。熱循環条件は：９５℃、３分間での最初の変性、３０サイクルの９５℃、１分間での変性、５２℃〜５８℃、１分間でのアニーリング、７２℃、２分間での伸張、および７２℃、１０分間での最後の伸長であった。多座配列解析は３０サイクルを用い、莢膜座遺伝子ＰＣＲは３５サイクルを用いた。ＰＣＲ生成物のサイズは、１％〜１.５％アガロースゲル中の電気泳動によって決定した。
【０１２６】
ＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列は自動ＤＮＡシークエンサーを用いて、アラバマ大学でのゲノミクスコア施設により決定し、ＰＣＲ生成物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。ＤＮＡ配列はＬａｓｅｒｇｅｎｅ ｖ. ５.１ ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ, Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）およびＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨサイトでのオンラインで位置したＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）で分析した。
【０１２７】
莢膜遺伝子座からの配列を従前に報告された配列と比較した。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４. 各配列タイプの対立遺伝子は、オンライン肺炎球菌多座配列解析（ＭＬＳＴ）ウェブサイトを用いて割り当てた。配列が異なっていた場合、新しい対立遺伝子番号を割り当てた。次いで、全てのｗｃｉＮβ配列を肺炎球菌ＭＬＳＴに寄託した。次いで、肺炎球菌単離物ＣＨＰＡ３８８の全莢膜遺伝子座をＧｅｎＢａｎｋに寄託した。
【０１２８】
世界的規模の出所から収集した６Ｃ株の遺伝プロフィールを表６に示す：
【０１２９】
【表７】
【０１３０】
６Ａおよび６Ｃ莢膜遺伝子座を持つＴ１ＧＲ４変種の生成：６Ｃ莢膜発現におけるｗｃｉＮ遺伝子の役割を調べるために、所望の遺伝子または遺伝子断片を、ＴＩＧＲ４に由来するが莢膜遺伝子座を欠いているＴＩＧＲ４ＪＳ４株に挿入した（図１１）。凍結した形質転換成分ＴＩＧＲ４ＪＳ４のアリコートを、６００ｎｍでの光電密度が約０.４〜０.５になるまで、３７℃でＴＨＹブロス中で増殖させ；０.５％酵母抽出物、０.２％ウシ血清アルブミン、０.０１％ＣａＣｌ２および１３％グリセロールを補足したトッド−ヒューウィット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ）培地（ｐＨ７.２）中でそれを１：１００希釈し；次いで、−８０℃にて２５０μｌアリコート中で凍結することにより調製した。
【０１３１】
ＴＩＧＲ４ＪＳ４を形質転換するために、冷凍した細菌アリコートを解凍し、５０ｎｇのコンピテンス刺激ペプチド変種２と混合した。Ｔｒｚｃｉｎｓｋｉら, ２００３. ３７℃での１４分間のインキュベーション後、１００μｌのＴＩＧＲ４ＪＳ４を、１０μｌの細菌溶解物（ＡＡＵ３３株）または１００ｎｇのＤＮＡカセットと混合した。３７℃での２時間のインキュベーション後、細菌を２００μｇ／ｍｌカナマイシンまたは３００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するヒツジ血液寒天培地プレートに捲き、ロウソクジャー中で３７℃にて培養した。抗生物質培地中で増殖させた形質転換体のコロニーを回収し、ＤＮＡレシピエントコンピテント細菌で３回戻し交配させた。
【０１３２】
形質転換のためのＡＡＵ３３の細菌溶解物を調製するために、１０ｍｌのＴＨＹブロスにＡＡＵ３３株を接種し、６００ｎｍでの光電密度が約０.４〜０.５となるまで３７℃にて約５時間培養した。そのＴＨＹブロスを遠心して、細菌ペレットを得、そのペレットを０.１％デオキシコール酸ナトリウムおよび０.０１％ナトリウム硫酸ドデシルを含有する０.１ｍｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（０.１５Ｍ、ｐＨ７.５）中に再懸濁し、次いで、３７℃で１０分間インキュベートすることによりそのペレットを溶解させた。次いで、溶解物（０.１ｍｌ）を、０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）で緩衝した０.９ｍｌの通常のセーラインと混合し、６５℃で１５分間加熱不活性化した。
【０１３３】
ＴＩＧＲ６Ａ４のｗｃｉＮα遺伝子領域をＣＨＰＡ３８８からのｗｃｉＮβ遺伝子領域と置換するために、発明者らは、図１１中のカセット１およびカセット２と標識した２つの異なるＤＮＡカセットを調製した。各カセットは３つのパーツ：標的ＤＮＡを含有する中核および２つのフランキングＤＮＡを有する。その２つのフランキングＤＮＡは相同性組換え用であり、各々約１ｋｂであり、ｗｃｈＡまたはｗｃｉＯ−Ｐ遺伝子のいずれかから得た。カセット１の中核は、カナマイシン抵抗性（ｋａｎａＲ）およびストレプトマイシン感受性（ｒｐｓＬ＋）遺伝子を有し、テンプレートとしてＴＩＧＲ４ＪＳ４株ＤＮＡを用いるＰＣＲによって得る。フランキングＤＮＡ断片を、テンプレートとしてＡＡＵ３３の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲによって得た。図１１および表５に示す全てのプライマーペアは制限酵素部位を有し、３つのＤＮＡ断片の連結を促す。その３つのＤＮＡ断片は、適当な制限酵素での消化、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ, Ｂｅｖｅｒｌｙ, ＭＡ）での連結により一緒に連結した。連結生成物をプライマー５１１３および３１０２を用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製し、ヌクレオチド配列決定に付した。次いで、ＰＣＲ生成物を形質転換においてドナーＤＮＡとして用いた。
【０１３４】
カセット２を用いて、抗生物質選択遺伝子をｗｃｉＮβ遺伝子と置換した。その中核はＣＨＰ Ａ３８８からのｗｃｉＮβ遺伝子を有する。ｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ−Ｐ ＤＮＡ断片はカセット１につき記載されたＡＡＵ３３からＰＣＲによって得た（図１１）。
【０１３５】
「６Ａ」コレクション中のさらなる６Ｃ株の同定：種々の位置から６Ｃ血清型の代表的なコレクションを得るために、発明者らは、膨張反応（Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら, ２００２）により「６Ａ」株の発明者らの先在するコレクションを再テストし、３つの異なる大陸の５か国からのさらなる９つの６Ｃ単離物を同定した（表４）。これらの単離物を髄液、血液および鼻咽腔試料から得、これは６Ｃが侵襲性の肺炎球菌感染ならびに無症候性保因に関与し得ることを示す。１つの単離物（ＢＧＯ２１９７）はアラバマのバーミンガムで１９７９年に得られた。この知見は、本明細書に記載されるように最初に同定および単離した６Ｃ血清型が２７年間を超えて存在し得、今や世界中で見出されていることを示す。
【０１３６】
多数の６Ｃ株は、異なる配列タイプを除いて同一の莢膜遺伝子座プロフィールを有する：血清型６Ｃにつき遺伝的基礎を調査するのを始めるために、１２の単離物の莢膜遺伝子座プロフィールおよび配列タイプ（ＳＴ）を検討した。ブラジル６Ｃ単離物（Ｌｉｎら, ２００６）につき従前に観察されたものと同様に、すべての６Ｃ単離物は、ヌクレオチド差を持たないか、または１つのヌクレオチド差を持つｗｃｉＰ遺伝子の対立遺伝子９を有する。同様に、全ての６Ｃ単離物は、ヌクレオチド差を持たないか、または１つのヌクレオチド差を持つｗｚｘ遺伝子の対立遺伝子１を有する。全ての６Ｃ対立遺伝子は、対立遺伝子１を発現する１つの単離物を除いて、ｗｚｙ遺伝子につき対立遺伝子１０を有する。６Ｃ単離物の制限された莢膜遺伝子座プロフィールとは対照的に、多座配列解析は、６Ｃ単離物が様々なＳＴを発現することを示す。６Ｃが、複数のＳＴを持つが、１つの単一莢膜遺伝子座プロフィール（１つの単離物を除いて）と関係するという事実は、６Ｃ血清型を担う遺伝子がおそらく莢膜遺伝子座にあることを示唆する。
【０１３７】
６Ａおよび６Ｃの莢膜遺伝子座は、ｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ遺伝子間の領域において異なる：血清型６Ａおよび６Ｃ間の遺伝子差はグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子であり、この同一遺伝子は、血清型６Ａおよび６Ｂ間の差を担う同じ遺伝子であることを仮定した。ＰＣＲを用いて、それらのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のサイズを比較した場合、それらのｗｃｉＮ遺伝子のサイズが異なることが判明した。全ての６Ｃ単離物のｗｃｉＮ ＰＣＲ生成物は、約１.８ｋｂ長であったが、全ての６Ａ単離物のｗｃｉＮ ＰＣＲ生成物は約２ｋｂ長であった（図１２）。６Ａおよび６Ｃ血清型から２つのｗｃｉＮ遺伝子間を区別するために、それらを各々、ｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβと命名した。
【０１３８】
ｗｃｉＮβ遺伝子をさらに調査するために、５つの６Ｃ株（ＢＺ１７、ＢＺ８６、ＣＨＰＡ３８８、ＫＫｌ ７７およびＳＴ ２６０）からのｗｃｈＡおよびｗｃｉＯ遺伝子を含むｗｃｉＮβ遺伝子領域のＤＮＡ配列を比較した。それらの配列がほとんど同一であったため、実際のＤＮＡ配列はＣＨＰＡ３８８のみにつき示し（図１３）、他の単離物の配列をＧｅｎＢａｎｋに寄託する。次いで、ＣＨＰＡ３８８からのｗｃｉＮβ遺伝子の配列をＧｅｎＢａｎｋ（第ＣＲ９３１６３８号）で利用可能な対応する領域の６Ａ配列と比較した（図１３）。比較の要約を図１４に示す。
【０１３９】
配列比較は、ｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβ遺伝子の明確な差を明らかにした：６Ｃ血清型は、６Ａ中の１２２２ｂｐ長のＤＮＡに代えて１０２９ｂｐ長のＤＮＡを有する（図１４および図１５）。２つのｗｃｉＮ遺伝子は完全に異なり、配列相同性はわずか約５０パーセントである。ＤＮＡ差はｗｃｈＡ遺伝子（１３６８位）の終了直後に始まり、ｗｃｉＯ遺伝子の始めの１３０塩基上流で終了する（６Ｃにつき２３９８位、６Ａにつき２６３１位）（図１４および図１５）。置換した遺伝子に隣接して位置するＤＮＡ配列を６Ａおよび６Ｃ間で比較した場合、かなり多数のＤＮＡ多形性が、２つのフランキング領域の外側の領域よりもフランキング領域中で判明した。例えば、置換した遺伝子から３００塩基上流は、２５の異なるヌクレオチドを有したが、その３００塩基から直ちに上流に位置した１５０塩基はたった１つの異なる塩基を有する（Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定によりｐ＜０.００１）（図１５）。同様に、３’方向において、２０塩基が近位の１１０塩基において異なるが、１塩基だけが次の３００塩基において異なる（Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定によりｐ＜０.００１）（図１５）。同様の結果が７つの異なる６Ａ株ＡＡＵ３３、Ｄ０２０−１Ｂ、ＨＳ３０５０、ＣＨＰＡ７８、ＫＫ６５、ＳＴ１９およびＳＴ５５８の配列で得られたために、これらの知見はこの特定の６Ａ配列（ＣＲ９３１６３８）にユニークではない。これらの知見は、２つのフランキング領域が、６Ａに挿入して６Ｃを創製する新しい遺伝子の一部分であったことを示唆する。
【０１４０】
フランキング領域は、６Ａ莢膜座へのｗｃｉＮβ遺伝子の相同組換えに関与していたのかもしれない。さらに、全ての６Ｃ単離物は同一のフランキング領域配列を有する。これは、遺伝子置換が１回だけ行なわれ、全ての６Ｃ単離物が、この単一の樹立細菌の子孫でなければならないことを示唆する。
【０１４１】
この遺伝子置換で、ｗｃｉＮβは、１１２５塩基長であって、新しいオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を有し、ＷＣＩＮβ蛋白質と命名される３７４アミノ酸を持つペプチドをコードする（図１３）。新しいＯＲＦの終止コドンは、６Ｃの２４９７および２５２８位に位置するｗｃｉＯ遺伝子についての２つの潜在的な開始コドン間にある。ｗｃｉＮβ遺伝子の配列をデータベース中の配列と比較した場合、６Ｃの１１０塩基（６Ｃ中の１６２７〜１７３６）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＲＺ１０６６のエキソポリサッカライド合成遺伝子の９０塩基に８１％相同性を示した（Ｂｏｌｏｔｉｎら, ２２ Ｎａｔ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. １５５４−５８（２００４）（図１３）。また、ｗｃｉＮβ遺伝子の翻訳配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｃａｐＨ遺伝子の翻訳した配列に２２％のアミノ酸同一性、および４４％の類似性を有する。Ｌｉｎら, １７６ Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ７００５ １６（１９９４）. ｗｃｉＮβ遺伝子産物はｗａａＧファミリーのメンバーである。付随的に、Ｅ. ｃｏｌｉ Ｋ−１２のｗａａＧ遺伝子産物はＬＰＳ合成に関与するαｌ,３−グルコシルトランスフェラーゼである。Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓら, ３０ Ｍｏｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２２１−３２（１９９８）．
【０１４２】
６Ａおよび６Ｃ血清型の莢膜遺伝子座の配列は、ｗｃｉＮ遺伝子以外の領域においてわずかだけ異なる：６Ａおよび６Ｃの莢膜遺伝子座がｗｃｉＮ部位においてのみ異なるかどうかを決定するために、６Ｃ単離物（ＣＨＰＡ３８８）の全莢膜座の配列を６つのオーバーラップするＤＮＡ断片中のｄｅｘＢおよびａｌｉＡ座間の全莢膜遺伝子座を増幅するＰＣＲによって分析した。図１６は、莢膜遺伝子座の配列の遺伝子地図を示す。全ＣＨＰＡ３８８座を図１７に示す。６Ｃ莢膜遺伝子座は、莢膜ＰＳ合成に関与する１４のＯＲＦを含んでいた。ＯＲＦは同一転写配向にあり、６Ａ莢膜遺伝子座につき判明したものに正確に対応する。６ＣのＯＲＦは５’末端でのｃｐｓＡ遺伝子から始まり、３’末端でのｒｍｌＤ遺伝子で終了する。図１６に示されるように、６Ｃ莢膜遺伝子座についての推定プロモーター結合部位および転写開始部位は、５’からｃｐｓＡ遺伝子までに見出され、推定転写ターミネーター部位は３’からｒｍｌＤ遺伝子までに見出される。加えて、多数の肺炎球菌莢膜遺伝子座につき一般的に見出された莢膜遺伝子座の両端での挿入配列（または「ｔｎｐ」または「トランスポサーゼ」）配列がある。Ｂｅｎｔｌｅｙら, ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ２：ｅ３１（２００６）. 全ての座のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託される。
【０１４３】
その配列を、前記のｗｃｉＮ領域を除いて、６Ａ株の莢膜遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＲ３１６３８）と比較した場合、６Ｃの莢膜遺伝子座は、６Ａのそれと非常に相同性（約９８％）であった。また、相同性は、ｃｐｓＡ ＯＲＦの中央での約６０ｂｐについてかなり低く（約７８％）、莢膜遺伝子座の両末端で見出された「ｔｎｐ」は、６Ａおよび６Ｃ莢膜遺伝子座間で異なっていた。６Ｃの莢膜遺伝子座はいくらかの６Ａまたは６Ｂ莢膜遺伝子座中のｗｃｉＯ遺伝子の上流に存在するＩＮＤＥＬを有しなかった。Ｍａｖｒｏｉｄｉら, ２００４. これらの差にもかかわらず、６Ａおよび６Ｃ莢膜遺伝子座間の最も顕著な差が、ｗｃｉＮ領域において見出される。
【０１４４】
ｗｃｉＮ遺伝子部位は６Ａから６Ｃ血清型への変換を担う。莢膜遺伝子座の前記の比較は主要な差がｗｃｉＮ領域にあることを示したが、小さな差は、全莢膜遺伝子領域（例えば、ｃｐｓＡ ＯＲＦ）中に存在する。莢膜座の外側のいくらかの他の小さな遺伝子の差が６Ｃ発現に関与できることが可能である。ｗｃｉＮ領域だけが関与することを示すために、ｗｃｉＮβ領域でのｗｃｉＮα領域の交換が６Ａ血清型を６Ｃ血清型（図１１）に変換できるかを検討した。ＴＩＧＲ６Ａは、ＴＩＧＲ４の莢膜座を株ＡＡＵ３３からの６Ａ莢膜遺伝子座に置換することにより生成した。次いで、ｗｃｉＮα遺伝子はカセット１でそれを形質転換することによりＴＩＧＲ６Ａから取り出した。ＴＩＧＲ６ＡＸと命名された得られた株は、非莢膜であり、ＰＣＲを介して１３２５および２５１８位間のｗｃｉＮα遺伝子を喪失していることが判明した。次いで、ｗｃｉＮβ領域をＣＨＰＡ３８８からのｗｃｉＮβ遺伝子を含んでいたカセット２を用いてＴＩＧＲ６ＡＸに挿入した。ＰＣＲは、得られた株ＴＩＧＲ６Ｃが、予期した位置でｗｃｉＮβを有することを確認した。ＴＩＧＲ６Ｃは、血清型６Ｃを発現すると判明し、これはｗｃｉＮβ遺伝子領域が血清型転換に十分であることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】図２は、種々の肺炎球菌でのオプソニン化アッセイデータを示す。
【図３】図３は、オプソニン化力価比較を示す。
【図４】図４は、種々の肺炎球菌単離物からの一部のｗｃｉＰ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【図５】図５は、９つの６Ａα単離物で得られたＰＣＲ生成物を示すアガロースゲルの写真である。
【図６】図６は、単離物ＡＡＵ９（中央バー）およびＳＴ７４５（２つのパーツでの底部バー）の肺炎球菌の莢膜遺伝子座のｗｃｈＡ、ｗｃｉＮ、ｗｃｉＯ領域のダイアグラムを示す。
【図７】図７は、過ヨウ素酸塩処理前後の６Ａα（上部）および６Ｃ（６Ａβ、底部）からの莢膜ＰＳの炭水化物組成物（パネルＡ）を示す。
【図８】図８は、６Ａα（パネルＡ）および６Ａβ（パネルＢ）の反復単位およびそれらの娘イオン（各々、パネルＣおよびＤ）の質量スペクトルを示す。
【図９】図９は、酸化および還元（パネルＡ）後の６ＡβＰＳの反復単位およびそれらの娘イオン（パネルＢおよびＣ）の質量スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、６Ｃ莢膜多糖体の提唱された化学構造およびその切断生成物の構造を示す。
【図１１】図１１は、ｗｃｉＮ領域交換実験ダイアグラムを示す
【図１２】図１２は、６Ａおよび６Ｃの単離物のｗｃｉＮ領域のＰＣＲ生成物の電気泳動パターンを示す。
【図１３】図１３は、ｗｃｈＡの３’末端およびｗｃｉＯ遺伝子の５’末端のヌクレオチド配列と共にｗｃｉＮβＯＲＦのヌクレオチド配列を示す。
【図１４】図１４は、６Ａ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＲ９３１６３８）および６Ｂ株（ＣＨＰ Ａ３８８）のｗｃｉＮαおよびｗｃｉＮβ領域のＤＮＡ配列を示す。
【図１５】図１５は、６Ａおよび６Ｃの単離物のｗｃｉＮ遺伝子を囲む莢膜遺伝子座の遺伝子地図を示す。
【図１６】図１６は、６Ａ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＲ９３１６３８）および６Ｃ株（ＣＨＰ Ａ３８８）の莢膜遺伝子座を示す。
【図１７】図１７は、６Ｃの血清型（単離物ＣＨＰＡ３８８）莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）６Ｃと命名された細菌の単離培養物。
【請求項２】
ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃと命名された細菌に由来する多糖体または多糖体の一部分を含むワクチン。
【請求項３】
反復単位｛→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→リン酸｝を含む、精製された多糖体。
【請求項４】
反復単位｛→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→リン酸｝を有する多糖体を含むワクチン。
【請求項５】
ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃに結合する抗原結合分子。
【請求項６】
ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ａ（６Ａα）およびストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃに異なって結合する抗原結合分子。
【請求項７】
ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃを区別する化学的または遺伝子試験。
【請求項１】
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）６Ｃと命名された細菌の単離培養物。
【請求項２】
ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃと命名された細菌に由来する多糖体または多糖体の一部分を含むワクチン。
【請求項３】
反復単位｛→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→リン酸｝を含む、精製された多糖体。
【請求項４】
反復単位｛→２）グルコース１（１→３）グルコース２（１→３）ラムノース（１→３）リビトール（５→リン酸｝を有する多糖体を含むワクチン。
【請求項５】
ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃに結合する抗原結合分子。
【請求項６】
ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ａ（６Ａα）およびストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃに異なって結合する抗原結合分子。
【請求項７】
ストレプトコッカス・ニューモニエ６Ｃを区別する化学的または遺伝子試験。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ−Ｂ】
【図８Ｃ−Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ−Ｃ】
【図１０Ｄ−Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１７Ａ−２】
【図１７Ａ−３】
【図１７Ｂ−１】
【図１７Ｂ−２】
【図１７Ｂ−３】
【図１７Ｃ−１】
【図１７Ｃ−２】
【図１７Ｃ−３】
【図１７Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ−Ｂ】
【図８Ｃ−Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ−Ｃ】
【図１０Ｄ−Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１７Ａ−２】
【図１７Ａ−３】
【図１７Ｂ−１】
【図１７Ｂ−２】
【図１７Ｂ−３】
【図１７Ｃ−１】
【図１７Ｃ−２】
【図１７Ｃ−３】
【図１７Ｄ】
【公表番号】特表２００９−５２７２２２（Ｐ２００９−５２７２２２Ａ）
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４８７１１（Ｐ２００８−５４８７１１）
【出願日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９３９１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８７０６４
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（３０１０４４０１５）ザ ユーエイビー リサーチ ファウンデイション (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９３９１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８７０６４
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（３０１０４４０１５）ザ ユーエイビー リサーチ ファウンデイション (4)
【Ｆターム（参考）】
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