転移性結腸直腸癌のアッセイ
本発明は、例えば、結腸直腸癌である対象に対して、予後、転移の可能性、または積極的療法を投与する望ましさを予測するための方法に関し、対象からの試料において、（ａ）ＡＫＴ（Ｓ４７３）、（ｂ）ＢＡＤ（Ｓ１１２）、（ｃ）ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、（ｄ）ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、（ｅ）ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、（０ ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、（ｇ）ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、（ｈ）ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、（ｉ）ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、（ｊ）ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）、または（ｋ）ＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）、あるいは、（ｌ）ＣＯＸ−２タンパク質の総量、のうちの１つ以上の陽性および／または陰性の参照基準と比較して、リン酸化レベルを決定するステップを含み、ａ〜ｉのうちの１つ以上のリン酸化レベル、またはＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）が、陰性の参照基準と比較して増加した場合、および／またはｊまたはｋのリン酸化レベルが、陽性の参照基準と比較して減少した場合、その対象は、予後不良である、転位する可能性が高い、および／または積極的療法の好適な候補である。また、転移性結腸直腸癌を発現する可能性の高い対象を治療するための方法、および本発明の方法を実行するための医薬組成物およびキットも記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００６年１０月２７日に出願の米国暫定出願第ＵＳ６０／８５４，７２４号の利益を主張するものであり、参照することによりその全体が本願明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腫瘍は、成長、生存、および転移するため、タンパク質リン酸化のような翻訳後修飾によって引き起こされる、欠陥のあるタンパク質ベースの細胞信号伝達プロセスに依存する。これらの信号伝達ネットワークは、現在の、および今後の分子を標的とした阻害剤の大部分の目標でもある。一つの例は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮであり、これは、乳癌における活動過多の上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の信号伝達システムを遮断することができる薬物である。過度に発現および活性化した、この信号伝達経路を有する患者のみが、治療に応答する。検出できない転移を有しうる進行の速い形態の癌を有する患者と、転移しないか、または急速に転移しない、進行の遅い形態の癌を有する患者とを区別できることが特に重要である。これらの２つの群の患者は、概して、転帰に大きな差があり、腫瘍が転移する悪性度および傾向の差を反映する。かかる２つの患者群を判別することが可能なバイオマーカーは、大きな利益をもたらすであろう。
【０００３】
遺伝子発現解析（核酸）によって、研究者は、特定の癌に対する転帰の予後的特徴を導出することができている。しかしながら、これらのエンドポイントは、単純な階層化だけに限定される。この特徴は、非反応群を治療する方法を医師に示すことができず、単に、誰が反応し、誰が反応しないのかを決めるために使用することしかできない。さらに、遺伝子発現解析での多数の遺伝子の解析は、複雑であり、概して、アルゴリズムおよび大規模なコンピュータ解析の使用を伴う。また、遺伝子発現解析は、タンパク質薬物標的の活性化状態または機能状態を反映しない（信号経路タンパク質のリン酸化状態と相関しない）。対照的に、タンパク質信号伝達のプロファイリングは、予後の特徴を提供することができ、重要なことは、転移性癌である患者を治療するための治療法に関する情報を提供することができる。これは、プロテオームのポートレートが、薬物標的自体に対して構成されることによるものである。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】上述のリンタンパク質標的のリン酸化レベル、およびＣＯＸ−２タンパク質の総量を示し、リン酸化状態またはＣＯＸ−２の量が、転移性結腸直腸癌と相関することを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明を実施するための形態について図面等を参照して説明する。
本発明は、例えば、転移性癌を発現する可能性の高い結腸直腸癌（癌腫）である対象と、非転移性形態の結腸直腸癌である患者とを区別するための組み合わせおよび方法を提供する。本願明細書では、異常なリン酸化状態（過度に、または不十分にリン酸化された）を呈する、および／または転移形態の結腸直腸癌である対象において過度に発現する、少なくとも１２のタンパク質マーカーを同定する。実施例Ｉおよび図１を参照されたい。リン酸化レベルの増加を呈するタンパク質アイソフォームは活性化され、リン酸化レベルの減少を呈するタンパク質アイソフォームは不活性化される。ＣＯＸ−２（別のマーカー）は、器官限局の原発性結腸直腸癌を示す対象と比較して、転移性癌を示す対象において過度に発現することが観察される。また、本願明細書において同定されるマーカーに基づいて、結腸直腸癌の悪性表現型（転移に関連する表現型）を治療するための方法も考察する。「悪性表現型」は、本願明細書で使用する場合、例えば、腸壁の層の厚み全体を通じた侵襲性、局所リンパ節への転移、遠隔転移、短い生存期間、または治療に対する耐性のうちの１つ以上を含み得る。結腸直腸癌は、例えば、肺や肝臓に転移し得る。
【０００６】
本発明のマーカーを特定するために使用される手法は、タンパク質信号伝達のプロファイリングに基づいた。本願明細書に示される観察は、診断アッセイの基準（患者を階層化するのに用いることのできる予後の特徴）を提供し、かつ新しい薬物標的を同定する。この二元性は、「セラノスティック」と称されることがあり、測定した分析物は、診断標的および治療標的の双方の役目を果たす。本発明の診断アッセイは、数種のタンパク質だけのリン酸化状態（または、ＣＯＸ−２の場合は、タンパク質の総量）の決定しか必要としないので、アッセイは、実施が容易であり、また、複雑なコンピュータベースの解析を必要としない。治療方法は、活性化（過度にリン酸化）されたタンパク質を阻害剤で阻害（抑制、不活性化）するステップ、または不十分にリン酸化されたタンパク質を活性化（強化、促進）するステップを含む。
【０００７】
本発明は、例えば、結腸直腸癌である対象が、予後不良であるかどうか、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有するかどうかを予測するための方法であって、陽性および／または陰性の参照基準と比較して、対象からの試料において、
ａ．ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、および／または
ｂ．ｐＢＡＤ（Ｓ１１２）、および／または
ｃ．ｐｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、および／または
ｄ．ｐＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、および／または
ｅ．ｐＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、および／または
ｆ．ｐｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／または
ｇ．ｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、および／または
ｈ．ｐＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、および／または
ｉ．ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、および／または
ｊ．ｐＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）、および／または
ｋ．ｐＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）、および／または
ｌ．ＣＯＸ−２タンパク質の総量、または
それらの組み合わせのうちの１つ以上のリン酸化レベルを決定するステップを含み、
陰性の参照基準と比較して、ａ〜ｉのうちの１つ以上のリン酸化レベルおよび／または前記ＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）の大幅な増加、または陽性の参照基準と統計的に同じレベルであること、および／または
陽性の参照基準と比較して、ｊまたはｋのうちの１つ以上のリン酸化レベルの大幅な減少、または陰性の参照基準と統計的に同じレベルであることは、
対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示す、方法に関する。
【０００８】
「予後不良」は、本願明細書で使用する場合、短い無病期間、および／または短い全生存期間（２４ヵ月未満の全生存）を含む。癌が「転移する可能性の高い」という用語は、対象が転移を発現する可能性が５０％を超えていることを意味する。
【０００９】
本発明の実施形態では、上記の１２種のマーカーのうちの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２種の全て）の、いかなる組み合わせをも試験することができる。例えば、以下のマーカーのサブセットのリン酸化レベルおよび／または（ＣＯＸ−２の場合は）タンパク質の総量を試験することができる。
【００１０】
（１）ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ｐＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、および／またはＣＯＸ２（それらの組み合わせ（例えば、マーカーのうちの２つ、４つ、または６つ全ての組み合わせ）を含む）または
（２）ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２）、およびｐＴＥＮ（Ｓ３８０）、または、
（３）ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２）、およびｐＴＥＮ（Ｓ３８０）、または
（４）ｐＥＲＫ（Ｔ４２／４４）およびｐｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、または
（５）ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）およびｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）。
本発明の方法の実施形態は、以下のステップ（その全ては、当業者に既知である従来の手順を使用する）をさらに含む。
（ａ）対象から組織標本または生検を得るステップ、
（ｂ）上皮細胞を分離するために、組織標本または生検にレーザキャプチャマイクロダイゼーションを受けさせるステップ、
（ｃ）上皮細胞を溶解するステップ、および
（ｄ）陰性および／または陽性の参照基準と比較して、マーカーのリン酸化状態（例えば、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１９２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、および／またはＣＯＸ−２の総量）を決定するように、イムノアッセイによって溶解物を分析するステップ。一実施形態では、イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡである。別の実施形態では、溶解物は、サスペンションビードアレイまたは逆相アレイとして計量分配され、次いでイムノアッセイを受けるか、または溶解物は、抗体またはアプタマのアレイと接触し、イムノアッセイを受ける。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、以下のステップをさらに含む。
【００１２】
（ａ）対象から組織標本または生検を得るステップ、および
（ｂ）リン酸化状態（例えば、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１９２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル、および／またはＣＯＸ−２の総量）が、対照組織標本または生検と比較して、大幅に増加しているかどうかを決定するように、組織化学的方法によって、組織標本または生検を解析するステップ。好適な陰性対照には、例えば、進行の遅い結腸直腸癌患者の集団から得られた組織または生検材料が挙げられ、陽性対照には、例えば、進行の速い結腸直腸癌患者の集団から得られた組織または生検材料が挙げられる。
【００１３】
驚くべきことに、多種多様な信号伝達経路が、本願明細書において考察される転移性表現型と相関すると予想されていたが、上方制御されたマーカー（ａ）〜（ｉ）および（ｌ）は、細胞の表面でのＥＧＦ受容体から始まり、核転写制御タンパク質のＣＯＸ−２で終わる、単一の相互結合したキナーゼの信号伝達経路のメンバである。経路の１つのルートでは、ＥＧＦＲおよびＡＢＬリン酸化は、ＭＡＲＣＫＳリン酸化をもたらし、その結果、ＥＲＫリン酸化およびｐ３８リン酸化をもたらし、次いで、その結果、ＳＴＡＴ１リン酸化をもたらす。経路の他のルートでは、ＥＧＦＲリン酸化およびＡＢＬリン酸化は、ＰＴＥＮリン酸化をもたらし、その結果、ＡＫＴリン酸化をもたらし、次いで、その結果、ＢＡＤリン酸化およびＳＴＡＴ１リン酸化をもたらす。最終的に、ＣＯＸ２タンパク質は、次いで、この経路によって転写に関して制御される。
【００１４】
対照的に、他の多くの信号伝達経路のメンバは、転移性結腸直腸癌表現型との有意な相関を示さない。実施例ＩＩの表２に記載したタンパク質を参照されたい。
本発明によって、予後不良であるか、または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有すると判断された対象は、積極的療法の、および／または標的療法による治療の好適な候補である。
【００１５】
「積極的療法」とは、転移性癌を治療するように、および好ましくは、転移性癌の影響のうちの少なくとも１つ以上を改善するのに有効となるように設計された治療を意味する。これは、用量を増加させた薬剤（例えば、薬物）の投与、または積極的療法の候補ではない患者よりも頻繁な投与、あるいは、積極的療法の候補ではない患者には概して提供しない治療の選択（例えば、より有害な形態の化学療法の投与）が関与し得る。他の形態の積極的療法は、放射線と化学療法との併用、およびより積極的な手術を含む。
【００１６】
「標的療法」は、本願明細書において同定されるリンタンパク質標的のうちの１つのような、特定の標的を標的とした薬剤（例えば、薬物）による治療を指す。
【００１７】
例えば、標的療法は、
対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＢＡＤ（Ｓ１１２）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、またはＣＯＸ−２タンパク質の量の大幅な増加を呈した場合、対象は、それぞれ、有効量のＡＫＴ、ＢＡＤ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、ＭＡＲＣＫＳ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、またはＣＯＸ−２の阻害剤（例えば、酵素阻害剤）で治療されること、および／または
対象が、ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）またはＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）のリン酸化レベルの大幅な減少を呈した場合、対象は、それぞれ、有効量のＰＡＫ１／２またはＰＫＣゼータ／ラムダの活性化剤で治療されることを、含み得る。
【００１８】
「有効量」は、本願明細書で使用する場合、検出可能な抗転移効果を生じさせることができる量を含む。
【００１９】
標的療法は、阻害剤および／または活性化剤のうちの２つ以上の併用治療を含み得る。ｃＡＢＬ阻害剤は、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、および／またはＳＵＴＥＮＴとすることができる。ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴｌＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢとすることができる。また、ＣＯＸ−２阻害剤は、例えば、ＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸとすることができる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、対象が、ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）および／またはＡＢＬ（Ｔ７３５）のリン酸化レベルの大幅な増加を呈した（例えば、受容体、ＥＧＦＲ、および／またはＡＢＬの活性化を呈した）場合、対象は、ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤、および／またはＡＫＴの阻害剤、および／またはＥＲＫの阻害剤のような、信号伝達経路内のそれらのマーカーの下流にある、有効量の信号伝達キナーゼの阻害剤で治療される。
【００２１】
本発明の別の一実施形態では、対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、またはＣＯＸ−２の量の大幅な増加を呈した場合、対象は、それぞれ、ＡＫＴ阻害剤、ｃＡＢＬ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、またはＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた、有効量のカルボキシアミドイミダゾール（ＣＡＩ）で併用治療を受ける。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、対象は、他のインジケーションのためのものであるが、現在ＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：食品医薬品局）に承認されている、または現在第２相または第３相試験にある薬物で治療される。本発明は、これらの標的が、転移によって後に現れる可能性が高く、したがって、極めて不十分な予後、すなわち、以前には認識されなかった兆候を有する、結腸直腸癌に関与すると見なしていることに留意されたい。本発明のこの実施形態では、対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、および／またはＣＯＸ−２タンパク質の総量の大幅な増加を呈した場合、対象は、例えば、それぞれ、有効量のｐＡＫＴ阻害剤であるＶＱＤ−００２および／またはエンザスタウリン、ｃＡＢＬ阻害剤であるＧＬＥＥＶＥＣ、ＳＵＴＥＮＴおよび／またはＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、ＥＲＫ阻害剤であるＣＩ−１０４０および／またはＰＤ０３２５９０１、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＣＩＯ−４６９、ＳＢ ２３９０６３、ＶＸ−７０２、および／またはＢＭＳ−５８２９４９、ｐＥＧＦＲ阻害剤であるＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢ、またはＣＯＸ−２阻害剤であるＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸで治療される。
【００２３】
阻害剤または活性化剤は、そのリン酸化状態が異常である（増加または減少した）ことが分かっている、本発明のマーカーのうちの１つ以上に対する、および／またはＣＯＸ−２に対する標的とすることができる。阻害剤は、概して、本願明細書の実施例において解析したタンパク質の特定のリン酸化アイソフォームに対するものか、または異なるアイソフォームに対するものか、あるいはリンタンパク質に対するものとすることができる。一実施形態では、治療方法に使用される阻害剤または活性化剤は、複数の標的に対するもの（例えば、標的のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の全てに対するもの）とすることができる。１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、まはた、５つ以上）の阻害剤または活性化剤を、いかなる個々の標的に対しても使用することができる。阻害剤の好適な組み合わせは、例えば、ＶＩＯＸＸ、ＣＥＬＥＢＲＥＸ、ＧＬＥＥＶＥＣ、ＳＵＴＥＮＴ、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、ＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢのうちの２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０）を含む。
【００２４】
本願明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。例えば、上記に使用したように、「ａｎ」阻害剤は、複数の阻害剤、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の阻害剤を含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、結腸直腸癌である対象を治療するための方法であって、陽性および／または陰性の参照基準と比較して、対象からの試料において、（ａ）ｐＡＫＴ（例えば、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化レベル）、（ｂ）ｐＢＡＤ（例えば、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２）のリン酸化レベル）、（ｃ）ｐｃＡＢＬ（例えば、ｐｃＡＢＬ（Ｔ７３５）のリン酸化レベル）、（ｄ）ｐＥＲＫ（例えば、ｐＥＲＫ（Ｔ４２／４４）のリン酸化レベル）、（ｅ）ｐＭＡＲＣＫＳ（例えば、ｐＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）のリン酸化レベル）、（ｆ）ｐｐ３８ＭＡＰＫ（例えば、ｐｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）のリン酸化レベル）、（ｇ）ｐＳＴＡＴ１（例えば、ｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）のリン酸化レベル）、（ｈ）ｐＴＥＮ（例えば、ｐＴＥＮ（Ｓ３８０）のリン酸化レベル）、（ｉ）ｐＥＧＦＲ（例えば、ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル）、（ｊ）ｐＰＡＫ１／２（例えば、ｐＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）のリン酸化レベル）、および／または（ｋ）ｐＰＫＣゼータ／ラムダ（例えば、ｐＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）のリン酸化レベル）、および／または（ｌ）ＣＯＸ−２タンパク質の総量（それらの組み合わせを含んで）、のうちの１つ以上のリン酸化状態を決定するステップを含み、
（ａ）〜（ｉ）のうちの１つ以上のリン酸化状態および／またはＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）が、陰性の参照基準と比較して大幅に増加したか、または陽性の参照基準と統計的に同じレベルにあり、対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示した場合、対象に、有効量の、（ａ）〜（ｉ）のうちの１つ以上の阻害剤（例えば、キナーゼ阻害剤または酵素阻害剤）、またはＣＯＸ−２の阻害剤が投与され、
（ｊ）または（ｋ）のリン酸化状態が、陽性の参照基準と比較して大幅に減少したか、または陰性の参照基準と統計的に同じレベルにあり、対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示した場合、対象に、有効量の（ｊ）および／または（ｋ）の活性化剤（例えば、キナーゼ）が投与される。
【００２６】
これらの阻害剤および／または活性化剤の組み合わせを対象に投与することができる。
【００２７】
タンパク質の「リン酸化状態」は、タンパク質のリン酸化の程度（総量）を指す。これは、リン酸化されたタンパク質の部位数（例えば、好適なセリン、トレオニン、またはチロシンアミノ酸残基）、およびアミノ酸鎖上の任意の所与の受容体部位のリン酸化レベルの両方を含む。タンパク質のリン酸化状態の増加は、リン酸化されたタンパク質の好適なアミノ酸残基の数（例えば、セリン、トレオニン、またはチロシン）の増加、または特定のアミノ酸残基でのリン酸化度数の増加のいずれかを反映し得る。「異常な」リン酸化状態は、陰性または陽性の参照基準よりも、それぞれ、統計的に大幅に高い（増加）こと、または低い（減少）リン酸化状態を指す。
【００２８】
当業者は、本願明細書に記載されるリン酸化アミノ酸残基に加えて、本発明のマーカーは、タンパク質の他のアミノ酸残基のリン酸化によって、活性化し得（または、ｐＰＡＫ１／２またはｐＰＫＣゼータ／ラムダの場合は、不活性化または阻害し得）、本発明の方法では、それらのリン酸化残基のうちの１つ以上でのリン酸化レベルは、記載した残基に加えて、またはその代わりに分析することができることが認識されよう。例えば、ｃ−ＡＢＬの場合、他の部位は、Ｙ２４５、Ｔ７３５、および／またはＹ４１２を含み、ＥＧＦＲの場合、他の部位は、Ｔ６６９、Ｓ９６７、Ｙ９９２、Ｓ１００２、Ｙ１０４５、Ｓ１０４６、Ｓ１０５７、Ｙ１０６８、Ｙ１０８６、Ｙ１１１４、Ｓ１１４２、Ｙ１１４８、および／またはＹ１１７３を含み、ＡＫＴの場合、他の部位は、４７３、３０８、および／またはＴ４５０を含み、ｐＴＥＮの場合、他の部位は、Ｓ３８０、Ｔ３８２、および／またはＴ３８３を含み、ＳＴＡＴ１の場合、他の部位は、Ｙ７０１および／またはＳ７２７を含み、ＢＡＤの場合、他の部位は、Ｓ１５５および／またはＳ１１２を含む。
【００２９】
本発明の実施形態では、上述の治療方法は、従来の化学療法剤を阻害剤と組み合わせて対象に投与するステップをさらに含むことができる。本願明細書で使用する場合、「従来の化学療法剤」は、本願明細書において考察される１２のマーカーのうちの１つの阻害剤または活性化剤以外の化学療法剤を指す。従来の化学療法剤は、阻害剤または活性化剤とともに（と同時に）投与することができ、または、薬剤を逐次的に投与することができる。
【００３０】
特定のリンタンパク質アイソフォームのリン酸化レベルを測定する、本願明細書に記載の方法のうちのいずれでも、代わりに、そのタンパク質のリン酸化状態（例えば、その活性化に寄与する、またはｐＰＡＫ１／２またはｐＰＫＣゼータ／ラムダの場合はその不活性化に寄与する、タンパク質の他のアミノ酸残基のうちの１つ以上のリン酸化レベルを含む）を測定することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、対象の結腸直腸癌を治療するための方法において、その改善は、対象が、予後不良である、および／または後に転移するか、後に転移を発現する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを予測するステップと、次に、対象を本発明の標的療法で治療するステップを含む。
【００３２】
本発明の治療方法は、結腸直腸癌の転移を阻害および／または予防することができる。
【００３３】
本発明の別の態様は、本願明細書において考察される１１のリン酸マーカーのうちの１つ以上のリン酸化状態、および／またはＣＯＸ−２タンパク質の総量、またはそれらの組み合わせのアッセイに好適な１つ以上の薬剤の群である。薬剤は、実施例Ｉに示される特定のリン酸化アイソフォームに対して特異的、および／またはタンパク質の他のリン酸化アミノ酸残基に対して特異的であり得る。群は、上述のマーカーのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１種のマーカーのリン酸化状態、および／またはＣＯＸ−２の総量の、あるいは、その任意の組み合わせのアッセイに好適な薬剤を含み得る。一実施形態では、薬剤は、ＡＫＴ（例えば、Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（例えば、Ｔ７３５）、ＥＲＫ（例えば、Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（例えば、Ｔ１８０−１８２）、ＥＧＦＲ（例えば、Ｙ９９２）のリン酸化状態、および／またはＣＯＸ−２のアッセイに好適である。薬剤は、例えば、上述のリンタンパク質のうちの１つの特定のリン酸化アイソフォームに対して、またはＣＯＸ−２に対して特異的な抗体（モノクローナル抗体等）または他のリガンドとしてもよい。本発明の別の態様は、結腸直腸癌である対象に対して、予後、後の転移の発現の可能性、または積極的療法を投与する望ましさを予測するための、任意選択で１つ以上の容器内に充填された、上述の一群の薬剤を含むキットである。
【００３４】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象を治療するための、有効量の、本願明細書に述べた阻害剤または促進剤のうちの１つ以上、あるいはそれらの組み合わせを含む医薬組成物またはキットである。例えば、医薬組成物は、有効量の、（ａ）ＥＧＦＲ阻害剤および／またはｃＡＢＬ阻害剤、および（ｂ）ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、および／またはＡＫＴ阻害剤、および／またはＥＲＫ阻害剤を含むことができる。本発明の別の態様は、ｐＡＫＴ阻害剤、ｐｃＡＢＬ阻害剤、ｐＥＲＫ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、またはｐＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた、有効量のカルボキシアミドイミダゾール（ＣＡＩ）を含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物では、ｐＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢとすることができ、ｐＡＢＬ阻害剤は、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣおよび／またはＳＵＴＥＮＴとすることができ、および／またはＣＯＸ−２阻害剤は、例えば、ＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸとすることができる。
【００３５】
医薬組成物は、薬剤として許容される担体を含む。キットでは、阻害剤または促進剤は、容器内にあり得る。本発明の医薬組成物またはキットはまた、阻害剤および／または活性化剤とともに投与することができる、１つ以上の従来の化学療法剤を含み得る。
【００３６】
上述の遺伝子およびタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は既知であり、日常的な方法で決定することができ、また、種々の既知のデータベースからダウンロードすることができる。例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールドワイド・ウェブサイトを参照されたい。
【００３７】
「試料」は、本願明細書で使用する場合、その中のリンタンパク質のうちの１つ以上のリン酸化状態、またはＣＯＸ−２タンパク質の総量を決定するようにアッセイすることができる、あらゆる好適な細胞または組織を含み得る。好適な試料には、例えば、末梢血細胞、および腫瘍の一次切除時に得られる針生検または肉眼的外科標本のような生検が挙げられる。試料は、例えば、新鮮なもの、冷凍（例えば、急速冷凍）したもの、またはタンパク質のリン酸化レベルを含む、細胞のタンパク質含有量を保持する形で保存したものであることができる。
【００３８】
「対象」は、本願明細書で使用する場合、結腸直腸癌であるあらゆる動物を含む。好適な対象（患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、家畜、および飼育動物、すなわちペット（ネコまたはイヌ等）が挙げられる。ヒト以外の霊長類、および好ましくは、人間の患者が含まれる。
【００３９】
リン酸化レベルの「大幅な増加」は、本願明細書で使用する場合、当技術分野で適切かつ既知である統計的手法を使用しての、その陰性の参照基準との差が、統計的に有意なレベルであり、概して、不規則変動によって変化する可能性が５パーセント未満の確率値を有する。例えば、転移形態の結腸直腸癌を有するか、その可能性の高い対象における、本発明の診断バイオマーカー内の残基のリン酸化は、癌ではない対象、または転移性ではない結腸直腸癌の形態を有する対象において観察されたレベルよりも、２０％から２００％を超える範囲で高くなり得る。
【００４０】
リン酸化レベルの「大幅な減少」は、本願明細書で使用する場合、陽性の参照基準との、または転移形態の結腸直腸癌である対象との、同様の差である。リン酸化レベルの大幅な減少は、適切かつ既知である統計的手法を使用しての、その陽性の参照基準との差が、統計的に有意なレベルであり、概して、不規則変動によって変化する可能性が５パーセント未満の確率値を有する。例えば、転移形態の結腸直腸癌である可能性の低い対象における、本発明の診断バイオマーカー内の残基のリン酸化は、転移形態の結腸直腸癌である対象において観察されたレベルよりも、２０％から約９０％の範囲で低くなり得る（例えば、陽性の参照基準の約８０％未満のレベルまで、または検出できない量までの減少）。
【００４１】
バイオマーカーのリン酸化レベルは、本願明細書で使用する場合、タンパク質（例えば、アミノ酸側鎖上）の所与のアミノ酸残基でのリン酸化レベルを指す。タンパク質のリン酸化の量の増加（例えば、対象となるリンタンパク質アイソフォームの、細胞ごとの総量の増加）は、リン酸化タンパク質の総量、またはアミノ酸残基でのリン酸化の増加度数を反映し得る。概して、上述のアミノ酸残基においてリン酸化されたタンパク質の総量は、試料ごとに、または試料内の細胞ごとに測定される。
【００４２】
本発明の一実施形態では、バイオマーカーのリン酸化レベルは、組織培養細胞から導出した陽性および陰性の参照基準を調製することによって決定される。
【００４３】
「陽性の」参照基準を生成するために、最初に、転移形態の結腸直腸癌であることが分かっている対象（または対象のプール）からの（ヒトの生検標本のような）生検標本から得られた細胞を処理することができる。タンパク質抽出物は、組織から調製することができ、対象となるリン酸化したエンドポイントでの、リン酸化レベル（または値の範囲）が、ここで説明されるように決定される。このような試料の中央値は、陽性の参照基準となる。
【００４４】
「陰性の」参照基準を生成するために、癌ではないことが分かっている（「正常な」対象）、または非転移性形態の結腸直腸癌であることが分かっている対象（または対象のプール）の同等の組織からの細胞を処理することができる。タンパク質抽出物は、組織から調製することができ、対象となるリン酸化したエンドポイントでの、リン酸化レベル（または値の範囲）が、ここで説明されるように決定される。このような試料の中央値は、陰性の参照基準となる。
【００４５】
上述の方法の変形例では、陽性または陰性の基準の決定は、公表されたデータ、転移性の無い対象からの組織の遡及研究、および本発明の方法を実行する当業者に明らかである他の情報に基づき得る。
【００４６】
しかしながら、このような対象からの組織を臨床診断の参照基準として使用することは、概して、日常的には、現実的ではない。その代わりに、培養細胞からの溶解物を使用し、細胞培養の溶解物と、真陽性（例えば、上述のように、転移形態の結腸直腸癌である対象から導出したエンドポイント値）、および真陰性（例えば、上述のように、転移形態の結腸直腸癌ではない対象から導出したエンドポイント値）との直接比較による、カットポイント値を確立することによって、陰性および陽性の参照基準を生成することが好ましい。これを達成するために、最初に、種々の培養細胞、一次細胞か、好ましくは細胞系をスクリーニングすることができる（例えば、ＥＧＦまたは過バナジン酸（ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）のようなマイトジェンで治療する種々の既知の細胞系のいずれかが、リン酸化を誘起する）。
【００４７】
これらの、または他の種類の培養細胞は、本発明のタンパク質が、リン酸化されないように、またはリン酸化の程度が最小になるように、従来の条件下で、直接増殖させるか、または培養細胞は、過バナジン酸のような信号伝達ネットワーク、または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のような成長因子を全体的に活性化する、好適なマイトジェンによって、従来の条件下で培養することができる。
【００４８】
次いで、タンパク質抽出物を、従来の手順を使用して、種々の条件下で培養した種々の細胞系から調製し、対象となるリン酸化したエンドポイントでのリン酸化レベルを、本願明細書に記載したように決定し、架橋実験として、真陽性および真陰性の臨床試料と直接比較する。このようにして、特定の既定条件下で培養された（促進有無を問わず）特定の細胞が、転移形態の結腸直腸癌である、またはそうでない対象の量と直接比較可能な、本発明のリンタンパク質アイソフォームのリン酸化量を発現するように、条件を確立することができる。既知の真の臨床的な陽性および陰性から導出されたカットポイント値を利用し、また、これらの値を細胞系の参照基準に架橋することで、その後、それぞれ、「陽性の参照基準」または「陰性の参照基準」を提供することができる。陽性および陰性の値は、陰性の参照基準値よりも高い臨床試料から測定した値を、転移を予測するものとして受け入れることができ、また、陽性の参照基準よりも低い測定値を、転移しないことを予測するものとして受け入れることができるように、従来の統計ツールを使用して選択することができる。
【００４９】
代替的に、既知の濃度の検体（例えば、本発明のリン酸化タンパク質アイソフォームのうちの１つ以上）の、精製試料内のリン酸化レベルを使用することができる。
そのリン酸化レベルが決定されたタンパク質ごとに、値を、細胞内の総タンパク質量に正規化するか、またはアクチンのような、（ハウスキーピング遺伝子から）構成的に発現したタンパク質の量に標準化することができ、またはリンタンパク質の量を、そのリン酸化されていない対応部分の量と比較することができる。
【００５０】
所与のアミノ酸残基のリン酸化レベルは、質的または定量的に測定することができる。所与の残基におけるリン酸化の量（分量）は、対照試料内の同じ残基において観察される量より多くなり得る。すなわち、過リン酸化することができる。検出閾値としての過リン酸化に加えて、上述の残基でのリン酸化の有無を利用することもできる。代替的に、定性的尺度（例えば、１から５の尺度）を使用することができる。
アミノ酸残基でのリン酸化のレベルを測定するための方法、および／または信号伝達経路の活性化を決定する方法は、従来通りで日常的的である。一実施形態では、測定は、（キナーゼ基質のような）対象のタンパク質に照らして、非リン酸化形態またはリン酸化形態の対象となる特定のアミノ酸残基に対して特異的である、複数組の抗体の存在に依存する。抗体は、例えば、本発明のバイオマーカーの非リン酸化またはリン酸化アイソフォームに対して特異的なものを使用することができる。そのような抗体は、市販のものとするか、または従来の手順を使用して日常的に生成することができる。一実施形態では、（非リン酸化形態またはリン酸化形態の）対象となるタンパク質からの、対象となるアミノ酸を含む合成ペプチドを、好適な抗体を調製する抗原として使用する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルとすることができる。当業者は、使用することができる種々の好適な抗体、抗体断片、またはアプタマを認識されよう。抗体は、リン酸化バージョンのタンパク質だけを検出し、非リン酸化バージョンの天然または変性タンパク質は検出しないように、およびその逆となるように、選択および検証される。
【００５１】
そのような抗体は、様々な方法で使用することができる。例えば、患者試料から全細胞溶解物を調製して、それらをアレイ形態で、ニトロセルロース帯またはガラススライドのような、好適な基質上にスポットすることができる。試料内のタンパク質は、スポットする前に変性させることが好ましい。概して、細胞は、広ダイナミックレンジを提供するように、２倍系列希釈法のような連続希釈法でスポットされる。陽性の対照または基線値のための対照のような、好適な対照を含むことができる。各アレイは、次いで、対象となる種々のタンパク質内のどのアミノ酸残基がリン酸化されたのかを決定および／または定量化するように、上述のように、好適な検出可能な抗体でプローブされる。免疫学的定量のための方法は、従来通りである。逆相タンパク質溶解物マイクロアレイ（ＲＰＭＡ）のこの方法に関するさらなる考察に関しては、例えば、Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００、１４２２９−１４２３９を参照されたい。
【００５２】
対象となる残基でのリン酸化のレベルおよび／または程度を評価するために、そのような抗体を用いた他の好適なアッセイ法には、例えば、比色アッセイ、イムノアッセイ（免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ等）、蛍光読み出しに基づくアッセイ、ウエスタンブロット法、サスペンションビードアッセイ、免疫沈降法、質量分光法、およびの従来のアッセイ法が挙げられる。好適な方法には、非常に小さい試料（例えば、約２００の細胞）内のリンタンパク質を検出できるものが挙げられる。代替的に、大きなサイズの試料（例えば、約２０，０００乃至２５，０００の細胞）に好適な方法を使用することができる。
【００５３】
リン酸化残基の存在および／または量を測定するアッセイ法は、例えばロボティクスを使用して、高スループットの形態に容易に適合させることができる。
好適な陽性および陰性の参照基準を決定するための方法、および陰性の参照基準と比較して、対象内にタンパク質の量の大幅な増加があるかどうかを決定するための方法のように、ＣＯＸ−２のような非リン酸化タンパク質の総量を決定するための方法は、従来通りである。
【００５４】
本発明のアッセイ法のための好適な対照は、当業者に明らかとなろう。例えば、品質管理を提供するために、（例えば、タンパク質マイクロアレイの形態で）試験されるタンパク質の各組は、抗原対照、細胞溶解物対照および／または参照溶解物を含んでもよい。各患者検体試料は、総タンパク質量に正規化し、同じアレイ上に「印刷された」参照と関連する単位で数量化することができる。各参照および対照溶解物は、患者試料と同じ希釈系列で印刷することができ、患者試料と同一の試料で、同時に免疫染色することができる。全ての試料は、複製して４点希釈曲線で印刷されることができる。
【００５５】
品質保証を提供するために、試料は、例えば、適用可能な規制基準を満たす好適な処理施設でそれらを受け取った時に、リアルタイムで処理および分析することができる。試料は、細胞溶解保存した試料から構成してもよい。適合する凍結試料を有する試験セットは、標本保存の妥当性を検証することができる。手法は、室温で実行することができる。試料は、コア針生検によって得てもよい。
【００５６】
本願明細書に述べられる方法によるマーカータンパク質のリン酸化レベルの決定に続いて、それらの患者に対する治療の決定を向上させるように、値を、例えばパネルまたは一連の値の形態で、医師に報告することができる。このような報告により、共通の診断を有する癌および他の疾患を、有効であると考えられる治療に従って、分子レベルで階層化することができる。これによって、最適な個別の患者治療を行うことができる。データを報告するためのいくつかの好適なシステムは、２００７年３月２７日に出願の同時係属の暫定出願第６０／９３５，１０６号に記載されている。このような報告は、当該の特定のリンタンパク質、それぞれに対する正常な参照レベルまたは範囲、および患者試料内のタンパク質の測定したリン酸化レベルの包括的なリストを提供することができる。
【００５７】
本発明の一態様は、本発明の方法によって、予後不良である、後に転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有する、および／または積極的療法および／または標的療法の好適な対象になる、と決定された対象を治療するための方法である。
【００５８】
本発明の阻害剤または活性化剤は、異常なリンタンパク質の総量、または特定の残基でのリン酸化レベル（または、ＣＯＸ−２では、タンパク質の総量）が、対象から得られた試料において、上述の１２のタンパク質マーカーのうちの少なくとも１つで観察された時に、投与することができる。
【００５９】
本発明の一実施形態では、阻害剤は、過度にリン酸化された本発明のリンタンパク質マーカーのリン酸化状態を減少させるキナーゼ阻害剤であるか、過度に活性化または過度に発現した本発明のタンパク質マーカーの活性を減少させる酵素阻害剤である。他の好適な阻害剤には、例えば、過度に活性化された、または過度に発現した本発明のタンパク質マーカーをコード化する核酸に対するｓｉＲＮＡｓ、および抗体、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体、アプタマ、または本発明のタンパク質マーカーに対する他のリガンドが挙げられる。別の実施形態では、活性化剤は、不十分にリン酸化された本発明のリンタンパク質マーカーのリン酸化状態を増加させる、キナーゼである。
【００６０】
ＡＫＴキナーゼ（例えば、Ｓ４７３）（タンパク質キナーゼＢとしても知られる）の阻害剤の実施例には、これに限定されないが、例えば、
Ａｋｔ−１−１（Ａｋｔ１を阻害する）（Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８５（Ｐｔ．２）３９９−４０８）、
Ａｋｔ−１−１，２（Ａｋ１および２を阻害する）（Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８５（Ｐｔ．２）３９９−４０８）、
ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ（例えば、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９１、１８０８−１２）、
１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジニル化合物（例えば、国際公開第ＷＯ０５０１１７００号）、
インドール−３−カルビノールおよびその誘導体（例えば、米国特許第ＵＳ６、６５６、９６３号、Ｓａｒｋａｒ ａｎｄ Ｌｉ（２００４）Ｊ Ｎｕｔｒ．１３４（１２ Ｓｕｐｐｌ）、３４９３Ｓ−３４９８Ｓ）、
ペリホシン（例えば、Ａｋｔの膜局在化を妨害する；Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０（１５）５２４２−５２、２００４）、
ホスファチジルイノシトールエーテル脂質の類似体（例えば、Ｇｉｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｎｎｉｓ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ １３、７８７−９７）、
トリシリビン（ＴＣＮまたはＡＰＩ−２、あるいはＮＣＩ識別子：ＮＳＣ １５４０２０；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４、４３９４−９）、が挙げられる。
【００６１】
ｐｃＡＢＬ（例えば、Ｔ７３５アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＧＬＥＶＥＣ、ＳＵＴＥＮＴ、およびＳＫＩ−６０６（Ｔｈａｉｍａｔｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３、４７０４−１２）が挙げられる。
【００６２】
ｐＥＲＫ（例えば、Ｔ４２／４４アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９およびＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（Ｚｅｌｉｖｉａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０７、４７８−８５）が挙げられる。
【００６３】
ｐＭＡＲＣＫＳ（例えば、Ｓ１５２−１５６アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、イソキノリンスルホンアミド誘導体、Ｈ−１１５２、ＨＡ−１０７７、およびＹ−２７６３２（Ｉｋｅｎｏｙａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｎｅｗｏｃｈｅｍ ８１、９−１６）が挙げられる。
【００６４】
ｐｐ３８ＭＡＰＫ（例えば、Ｔ１８０−１８２アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＳＢ−２３９０６３およびＳＢ ２２００２５（Ｌｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４４７、３７−４２）が挙げられる。
【００６５】
ｐＳＴＡＴ１（例えば、Ｙ７０１アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、フルダラビン（Ｔｅｒｕｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３８０、２０３−２０９）が挙げられる。
【００６６】
ＰＴＥＮ（例えば、Ｓ３８０アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、ビスペルオクソバナジウム化合物が挙げられる。
【００６７】
ｐＥＧＦＲ（例えば、Ｙ９９２アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＩＲＥＳＳＡ、ＬＡＰＳＴＩＮＩＢ、ＥＲＢＩＴＩＸ、およびＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢが挙げられる。
【００６８】
ＣＯＸ−２阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＶＩＯＸＸおよびＣＥＬＥＢＲＥＸが挙げられる。
【００６９】
非リン酸化状態およびリン酸化状態にある上述のリンタンパク質（またはＣＯＸ−２）に関連するアッセイ法または治療方法は、作用の機構に関わりなく、本発明に従って使用することができる。したがって、転移の根底にある機構は、指示マーカーのうちの１つ以上のリン酸化状態またはＣＯＸ−２の量の影響を受け得ると考えられるが、本発明は、治療診断的、治療的、および／または予後的方法がそれらの成功を達成する、いかなる機構にもとらわれない。
【００７０】
本願明細書において考察される阻害剤または活性化剤は、治療上の処置方法に使用するための、医薬組成物等の種々の組成物に処方することができる。医薬組成物は、キットとして一まとめにすることができる。概して、本発明の医薬組成物は、転移抑制有効量の阻害剤を含む。「転移抑制有効量」は、本願明細書で使用する場合、妥当な時間枠内で、少なくとも検出可能な治療反応を生じさせるのに十分な量である。例えば、転移の症状を、少なくとも検出可能な程度まで改善すること、または腫瘍が広がるのを阻害すること、等ができる。
【００７１】
組成物は、薬剤として許容される担体のような、担体を含むことができる。「薬剤として許容される」とは、生物学的に、または、それ以外で有害ではない材料、すなわち、その材料を、あらゆる望ましくない生物学的影響を生じさせずに、または有害な様態で、含まれる医薬組成物の他の構成要素のうちのいずれとも相互作用なしに、対象に投与できることを意味する。担体は、当業者に既知であるように、活性成分のあらゆる劣化を最小にするように、また、対象におけるあらゆる有害な副作用を最小にするように選択される。医薬的に許容される担体および医薬組成物の他の構成要素の考察については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０を参照されたい。
【００７２】
本発明の医薬組成物またはキットは、本発明の阻害剤または促進剤に加えて、（化学療法剤のような）他の医薬品を含むことができる。他の化学療法剤は、患者の治療中のあらゆる好適な時間に、同時に、または逐次的に投与することができる。
当業者は、特定の製剤は、１つには、本発明の特定の阻害剤または促進剤、または用いられる他の化学療法剤、および選択した投与の経路に依存するものと認識されよう。したがって、本発明の組成物には、多種多様な好適な製剤がある。
従来の化学療法剤の中で、本発明の活性化剤のうちの１つ以上の阻害剤とともに対象に投与することができる薬剤を表１に記載する。
【００７３】
【表１】
【００７４】
経口投与に好適な製剤は、水、食塩水、または果物ジュースのような希釈剤に有効量の薬剤を溶解したような液体溶液、それぞれが固体、顆粒または冷凍乾燥させた細胞として、既定量の活性成分を含むカプセル、小袋、または錠剤、水性液体中の溶液または懸濁液、および水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンで構成することができる。錠剤の形態は、乳糖、マンニトール、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、微結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、および薬理学的に適合する担体のうちの１つ以上を含むことができる。経口的な送達に好適な製剤は、合成および天然の高分子微小球体内に、または消化管内での劣化から本発明の薬剤を保護する他の手段内に組み込むこともできる。
【００７５】
非経口投与（例えば、静脈内投与）に好適な製剤には、抗酸化化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象となる受容者の血液と等張性のある製剤を与える溶質を含むことができる、水性および非水性の等張性無菌注射溶液、および懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプルおよびバイアルのような単回服用または複数回服用の密封容器で提供することができ、また、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用の水の添加だけしか必要としないフリーズドライの（凍結乾燥した）状態で貯蔵することができる。即座の注射溶液および懸濁液は、上述した種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００７６】
本発明の阻害剤または促進剤は、単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾルの製剤に作製することができる。これらのエアロゾルの製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容される噴射剤中に収容することができる。
【００７７】
当業者は、好適な、または適切な製剤を、当面の特定の用途に基づいて、選択、構成、または拡張できるものと認識されよう。
【００７８】
本発明の阻害剤または促進剤の用量は、錠剤またはカプセルのような単位用量形態とすることができる。本願明細書で使用する「単位用量形態」という用語は、ヒトおよび動物の対象に対する単位的な用量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、医薬的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと共に所望の効果を発生するのに十分な量に計算された、既定量の本発明の薬剤を単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて含む。
【００７９】
当業者は、個々の患者における所望の抗転移有効量または有効濃度の薬剤を達成するために、正確な処方の組成物を使用するための、適切な用量、スケジュール、および投与方法を容易に決定することができる。当業者は、適切な患者試料（例えば、血液および／または組織）の直接的または間接的な分析によって、本発明の化合物の「有効濃度」の適切な指標を容易に決定、かつ使用することもできる。
【００８０】
動物、特にヒトに投与される、本発明の阻害剤または促進剤、またはその組成物の用量は、本発明に照らして、妥当な時間枠にわたって個体内に少なくとも治療反応を生じさせるのに十分な量（抗転移有効量）とすべきである。正確な用量は、対象の種、年齢、体重、および全体的な状態、治療されるあらゆる疾患の重症度、または機構、使用される特定の薬剤またはビヒクル、その投与方法等に基づいて、対象によって異なる。生体内で所望の転移抑制濃度を達成するために使用される用量は、用いられる特定の阻害剤の効能、宿主内の薬剤に関連する薬力学、感染個体の疾病状態の重症度、および、全身投与の場合は、個体の体重および年齢によって決定される。用量のサイズも、用いられる特定の阻害剤、またはその組成物が伴い得る、あらゆる有害な副作用の存在によって決定される。概して、可能な場合は常に、有害な副作用を最小限に抑えることが望ましい。
【００８１】
併用療法で提供する時には、他の（従来の）化学療法剤を、例えば、阻害剤または活性化剤と同時に提供するか、または必要に応じて、服用の時間をずらすことができる。２つ（またはそれ以上）の薬物を、組成物に組み合わせることもできる。それぞれの用量は、いずれかを単独で使用する時よりも、組み合わせて使用する際に少なくすることができる。
【００８２】
本発明の別の実施形態は、本願明細書に記載された方法のうちのいずれか（例えば、診断または治療方法）に有用なキットであって、かかるキットは、本願明細書において考察する、阻害剤または活性化剤、あるいは診断試薬のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、対象の転移性癌の治療上の処置に好適なキットは、薬剤として許容される担体、および任意選択で、容器または包装材料をさらに含み得る。診断キットは、本発明のマーカーのリン酸化状態（または、ＣＯＸ−２の場合は、その総量）の決定に好適な薬剤を含むことができる。薬剤は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む抗体、または対象となるタンパク質と特異的に結合する（例えば、リンタンパク質の場合、対象となるリン酸化アイソフォームと特異的に結合する）他のリガンドとすることができる。他には、本発明のキットは、実験的応用に使用することができる。当業者は、キットの構成要素が、本発明の方法のうちのいずれの実行にも好適であると認識されよう。
【００８３】
任意選択で、キットは、方法を実行するための指示を含む。本発明のキットの任意選択の要素は、好適な緩衝剤、薬剤として許容される担体等、容器、または包装材料を含む。キットの試薬は、試薬が安定する容器に、例えば、凍結乾燥形態または安定化した液体で収容され得る。また、試薬は、単回使用の形態、例えば単回用量形態としてもよい。
【００８４】
上述した、および以下の実施例では、全ての温度は、補正されていない摂氏で示され、特に指示しない限り、全ての割合およびパーセントは、重量によるものである。
【００８５】
（第１実施形態）材料および方法
１．逆相タンパク質マイクロアレイ 以前に公開された方法（例えば、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３、３６１４−３６２１；Ｌｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３、３１７−３２５；Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ４、３４６−３６５）によって生成した、微小解剖した細胞を溶解させて、逆相タンパク質マイクロアレイを、上記Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）によって説明されているように、全細胞溶解物に２通り印刷した。簡潔に述べると、溶解物を、５００μｍのピンを備えたＧＭＳ ４１７アレイヤ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、ガラスで支持されたニトロセルロースアレイスライド（ＦＡＳＴ Ｓｌｉｄｅｓ Ｗｈａｔｍａｎ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪ）上に印刷した。各溶解物は、原液および陰性対照希釈剤、１：２、１：４、１：８、１：１６を表す希釈曲線に印刷された。スライドは、免疫染色する前に、乾燥剤（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ、Ｗ．Ａ．Ｈａｍｍｏｎｄ、Ｘｅｎｉａ、ＯＨ）とともに、−２０℃で保管した。
２．マイクロアレイ解析のためのバイオインフォマティクス法 各アレイは、走査して、スポット強度を分析し、データを正規化して、標準化し、アレイ上の試料ごとに単一のデータ値を生成した（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ｖ５．２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。スポット強度は、固定領域を通じて積分した。局所領域の背景強度は、隣接するスライドの背景を刷り込んだスポットごとに計算した。これによって、アレイ上のあらゆる他のスポットとの比較のための、試料ごとの単一のデータ点を得た。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの２試料順位和検定を使用して、２つの群間の値を比較した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【００８６】
（第２実施形態）信号経路の変化、および転移する結腸直腸癌と、転移しない結腸直腸癌とを区別することができる薬物標的の同定
研究セットには、肝臓の転移を示した結腸直腸癌腫と、外科的にヒトの対象から採取した、いかなる転移の証拠も無く、フォローアップ時にも転移を示さなかった結腸直腸癌腫とを使用した。外科的試料は、レーザキャプチャマイクロダイセクションによって処理し、純粋な癌細胞集団を溶解して逆相タンパク質マイクロアレイ解析を行った。この手法を使用することで、７０のキナーゼ基質のリン酸化状態を測定することができた。分子ネットワーク分析は、市販のソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｖｉｇｅｎｅ、ＶｉｇｅｎｅＴｅｃｈ、ＭＡ）を使用して実行した。解析した７０のリン酸エンドポイントのうち、１２が、（進行の早い）転移性癌と（進行の遅い）非転移性癌との間で、統計的に有意に異なって発現した（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５により）。これらの結果を図１に示す。これらの１２のリン酸エンドポイントのうち、１０は、転移を示さなかった患者に対して、転移を示した患者において増加し、３つは、非転移性疾患の患者において増加した。予想外に、これらのリン酸化の一部は、特定の標的療法において既に使用している薬物標的を表している。
ｃＡｂｌ（Ｔ２４５）の増加＝ＧＬＥＥＶＥＣ
ＣＯＸ−２の増加＝ＶＩＯＸＸ
ｐＥＧＦＲの増加＝ＴＡＲＣＥＶＡ
さらに、ＥＲＫ、ＡＫＴおよびｐ３８のようなこれらのエンドポイントのうちの多くは、開発中の、他の分子阻害剤の標的である。また、マーカーのパネルとして、これらのエンドポイントは、進行の早い疾患と進行の遅い疾患とを区別すること、良好な予後と不良な予後とを区別すること、および化学予防的療法、またはＣＯＸ−２、ｅｇｆｒ、ａｂｌによる率先的な療法、または他のキナーゼを標的とする療法の基準を提供することができるセラノスティックの機会を示すことができる。
転移と大きく相関しなかった、試験を行ったリン酸エンドポイントのいくつかを下記の表２に示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
（第３実施形態）本発明の標的阻害剤が転移を阻害できることを示す、結腸直腸癌の動物モデルにおける研究
転移プロセスの根拠となる原因、およびそれによって、転移の無い結腸直腸癌を示す患者の将来的な転移の予防のための治療標的として、信号伝達の活性化状態の因果的有意性を、動物モデル系で試験する。
第１の動物モデル系では、ラットＢＤＩＸ菌種を、ＤＨＤ−Ｋ１２細胞系細胞とともに脾静脈に注入し、注入した細胞は、１５日で肝転移を、また、２０日で肺転移を急速に形成する。ラットは、以下のキナーゼ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ｃＡＢＬ阻害剤、ＳＴＡＴ１阻害剤を、単独で、または組み合わせて、本願明細書において考察される阻害剤を使用して、前治療を行う。
第２の動物モデル系では、阻害剤を、脾臓注射と同時にラットに与える。
阻害剤が転移コロニの形成を阻害するものと予想され、転移の形成に、これらのリンタンパク質酵素の活性が必要で、かつに十分であることを確認し、また、ｅｒｋおよびａｋｔの活性化を通じたｅｇｆｒおよびｃａｂｌの成長因子経路内のこれらのタンパク質が、予後の決定および予防のための治療標的の両方の好適な候補であるという機構に関する証拠を提供する。
当業者は、上の説明から本発明の基本的な特徴を容易に確認することができ、また、本発明の精神およびその範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更および改良を行って、様々な用法および条件に適合させることができ、本発明を最大限に利用することができる。上述の好適な特定の実施形態は、例示的なものに過ぎず、またどのような場合であっても本発明の範囲を制限するものではないと解釈されたい。２００６年１０月２７日に出願の米国暫定特許出願第ＵＳ６０／８５４，７２４号、および図面を含む、上述の全ての出願、特許、および刊行物の全ての開示は、参照することによって、その全体が本願明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００６年１０月２７日に出願の米国暫定出願第ＵＳ６０／８５４，７２４号の利益を主張するものであり、参照することによりその全体が本願明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腫瘍は、成長、生存、および転移するため、タンパク質リン酸化のような翻訳後修飾によって引き起こされる、欠陥のあるタンパク質ベースの細胞信号伝達プロセスに依存する。これらの信号伝達ネットワークは、現在の、および今後の分子を標的とした阻害剤の大部分の目標でもある。一つの例は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮであり、これは、乳癌における活動過多の上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の信号伝達システムを遮断することができる薬物である。過度に発現および活性化した、この信号伝達経路を有する患者のみが、治療に応答する。検出できない転移を有しうる進行の速い形態の癌を有する患者と、転移しないか、または急速に転移しない、進行の遅い形態の癌を有する患者とを区別できることが特に重要である。これらの２つの群の患者は、概して、転帰に大きな差があり、腫瘍が転移する悪性度および傾向の差を反映する。かかる２つの患者群を判別することが可能なバイオマーカーは、大きな利益をもたらすであろう。
【０００３】
遺伝子発現解析（核酸）によって、研究者は、特定の癌に対する転帰の予後的特徴を導出することができている。しかしながら、これらのエンドポイントは、単純な階層化だけに限定される。この特徴は、非反応群を治療する方法を医師に示すことができず、単に、誰が反応し、誰が反応しないのかを決めるために使用することしかできない。さらに、遺伝子発現解析での多数の遺伝子の解析は、複雑であり、概して、アルゴリズムおよび大規模なコンピュータ解析の使用を伴う。また、遺伝子発現解析は、タンパク質薬物標的の活性化状態または機能状態を反映しない（信号経路タンパク質のリン酸化状態と相関しない）。対照的に、タンパク質信号伝達のプロファイリングは、予後の特徴を提供することができ、重要なことは、転移性癌である患者を治療するための治療法に関する情報を提供することができる。これは、プロテオームのポートレートが、薬物標的自体に対して構成されることによるものである。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】上述のリンタンパク質標的のリン酸化レベル、およびＣＯＸ−２タンパク質の総量を示し、リン酸化状態またはＣＯＸ−２の量が、転移性結腸直腸癌と相関することを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明を実施するための形態について図面等を参照して説明する。
本発明は、例えば、転移性癌を発現する可能性の高い結腸直腸癌（癌腫）である対象と、非転移性形態の結腸直腸癌である患者とを区別するための組み合わせおよび方法を提供する。本願明細書では、異常なリン酸化状態（過度に、または不十分にリン酸化された）を呈する、および／または転移形態の結腸直腸癌である対象において過度に発現する、少なくとも１２のタンパク質マーカーを同定する。実施例Ｉおよび図１を参照されたい。リン酸化レベルの増加を呈するタンパク質アイソフォームは活性化され、リン酸化レベルの減少を呈するタンパク質アイソフォームは不活性化される。ＣＯＸ−２（別のマーカー）は、器官限局の原発性結腸直腸癌を示す対象と比較して、転移性癌を示す対象において過度に発現することが観察される。また、本願明細書において同定されるマーカーに基づいて、結腸直腸癌の悪性表現型（転移に関連する表現型）を治療するための方法も考察する。「悪性表現型」は、本願明細書で使用する場合、例えば、腸壁の層の厚み全体を通じた侵襲性、局所リンパ節への転移、遠隔転移、短い生存期間、または治療に対する耐性のうちの１つ以上を含み得る。結腸直腸癌は、例えば、肺や肝臓に転移し得る。
【０００６】
本発明のマーカーを特定するために使用される手法は、タンパク質信号伝達のプロファイリングに基づいた。本願明細書に示される観察は、診断アッセイの基準（患者を階層化するのに用いることのできる予後の特徴）を提供し、かつ新しい薬物標的を同定する。この二元性は、「セラノスティック」と称されることがあり、測定した分析物は、診断標的および治療標的の双方の役目を果たす。本発明の診断アッセイは、数種のタンパク質だけのリン酸化状態（または、ＣＯＸ−２の場合は、タンパク質の総量）の決定しか必要としないので、アッセイは、実施が容易であり、また、複雑なコンピュータベースの解析を必要としない。治療方法は、活性化（過度にリン酸化）されたタンパク質を阻害剤で阻害（抑制、不活性化）するステップ、または不十分にリン酸化されたタンパク質を活性化（強化、促進）するステップを含む。
【０００７】
本発明は、例えば、結腸直腸癌である対象が、予後不良であるかどうか、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有するかどうかを予測するための方法であって、陽性および／または陰性の参照基準と比較して、対象からの試料において、
ａ．ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、および／または
ｂ．ｐＢＡＤ（Ｓ１１２）、および／または
ｃ．ｐｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、および／または
ｄ．ｐＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、および／または
ｅ．ｐＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、および／または
ｆ．ｐｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／または
ｇ．ｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、および／または
ｈ．ｐＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、および／または
ｉ．ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、および／または
ｊ．ｐＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）、および／または
ｋ．ｐＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）、および／または
ｌ．ＣＯＸ−２タンパク質の総量、または
それらの組み合わせのうちの１つ以上のリン酸化レベルを決定するステップを含み、
陰性の参照基準と比較して、ａ〜ｉのうちの１つ以上のリン酸化レベルおよび／または前記ＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）の大幅な増加、または陽性の参照基準と統計的に同じレベルであること、および／または
陽性の参照基準と比較して、ｊまたはｋのうちの１つ以上のリン酸化レベルの大幅な減少、または陰性の参照基準と統計的に同じレベルであることは、
対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示す、方法に関する。
【０００８】
「予後不良」は、本願明細書で使用する場合、短い無病期間、および／または短い全生存期間（２４ヵ月未満の全生存）を含む。癌が「転移する可能性の高い」という用語は、対象が転移を発現する可能性が５０％を超えていることを意味する。
【０００９】
本発明の実施形態では、上記の１２種のマーカーのうちの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２種の全て）の、いかなる組み合わせをも試験することができる。例えば、以下のマーカーのサブセットのリン酸化レベルおよび／または（ＣＯＸ−２の場合は）タンパク質の総量を試験することができる。
【００１０】
（１）ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ｐＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、および／またはＣＯＸ２（それらの組み合わせ（例えば、マーカーのうちの２つ、４つ、または６つ全ての組み合わせ）を含む）または
（２）ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２）、およびｐＴＥＮ（Ｓ３８０）、または、
（３）ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２）、およびｐＴＥＮ（Ｓ３８０）、または
（４）ｐＥＲＫ（Ｔ４２／４４）およびｐｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、または
（５）ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）およびｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）。
本発明の方法の実施形態は、以下のステップ（その全ては、当業者に既知である従来の手順を使用する）をさらに含む。
（ａ）対象から組織標本または生検を得るステップ、
（ｂ）上皮細胞を分離するために、組織標本または生検にレーザキャプチャマイクロダイゼーションを受けさせるステップ、
（ｃ）上皮細胞を溶解するステップ、および
（ｄ）陰性および／または陽性の参照基準と比較して、マーカーのリン酸化状態（例えば、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１９２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、および／またはＣＯＸ−２の総量）を決定するように、イムノアッセイによって溶解物を分析するステップ。一実施形態では、イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡである。別の実施形態では、溶解物は、サスペンションビードアレイまたは逆相アレイとして計量分配され、次いでイムノアッセイを受けるか、または溶解物は、抗体またはアプタマのアレイと接触し、イムノアッセイを受ける。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、以下のステップをさらに含む。
【００１２】
（ａ）対象から組織標本または生検を得るステップ、および
（ｂ）リン酸化状態（例えば、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１９２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル、および／またはＣＯＸ−２の総量）が、対照組織標本または生検と比較して、大幅に増加しているかどうかを決定するように、組織化学的方法によって、組織標本または生検を解析するステップ。好適な陰性対照には、例えば、進行の遅い結腸直腸癌患者の集団から得られた組織または生検材料が挙げられ、陽性対照には、例えば、進行の速い結腸直腸癌患者の集団から得られた組織または生検材料が挙げられる。
【００１３】
驚くべきことに、多種多様な信号伝達経路が、本願明細書において考察される転移性表現型と相関すると予想されていたが、上方制御されたマーカー（ａ）〜（ｉ）および（ｌ）は、細胞の表面でのＥＧＦ受容体から始まり、核転写制御タンパク質のＣＯＸ−２で終わる、単一の相互結合したキナーゼの信号伝達経路のメンバである。経路の１つのルートでは、ＥＧＦＲおよびＡＢＬリン酸化は、ＭＡＲＣＫＳリン酸化をもたらし、その結果、ＥＲＫリン酸化およびｐ３８リン酸化をもたらし、次いで、その結果、ＳＴＡＴ１リン酸化をもたらす。経路の他のルートでは、ＥＧＦＲリン酸化およびＡＢＬリン酸化は、ＰＴＥＮリン酸化をもたらし、その結果、ＡＫＴリン酸化をもたらし、次いで、その結果、ＢＡＤリン酸化およびＳＴＡＴ１リン酸化をもたらす。最終的に、ＣＯＸ２タンパク質は、次いで、この経路によって転写に関して制御される。
【００１４】
対照的に、他の多くの信号伝達経路のメンバは、転移性結腸直腸癌表現型との有意な相関を示さない。実施例ＩＩの表２に記載したタンパク質を参照されたい。
本発明によって、予後不良であるか、または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有すると判断された対象は、積極的療法の、および／または標的療法による治療の好適な候補である。
【００１５】
「積極的療法」とは、転移性癌を治療するように、および好ましくは、転移性癌の影響のうちの少なくとも１つ以上を改善するのに有効となるように設計された治療を意味する。これは、用量を増加させた薬剤（例えば、薬物）の投与、または積極的療法の候補ではない患者よりも頻繁な投与、あるいは、積極的療法の候補ではない患者には概して提供しない治療の選択（例えば、より有害な形態の化学療法の投与）が関与し得る。他の形態の積極的療法は、放射線と化学療法との併用、およびより積極的な手術を含む。
【００１６】
「標的療法」は、本願明細書において同定されるリンタンパク質標的のうちの１つのような、特定の標的を標的とした薬剤（例えば、薬物）による治療を指す。
【００１７】
例えば、標的療法は、
対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＢＡＤ（Ｓ１１２）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、またはＣＯＸ−２タンパク質の量の大幅な増加を呈した場合、対象は、それぞれ、有効量のＡＫＴ、ＢＡＤ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、ＭＡＲＣＫＳ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、またはＣＯＸ−２の阻害剤（例えば、酵素阻害剤）で治療されること、および／または
対象が、ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）またはＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）のリン酸化レベルの大幅な減少を呈した場合、対象は、それぞれ、有効量のＰＡＫ１／２またはＰＫＣゼータ／ラムダの活性化剤で治療されることを、含み得る。
【００１８】
「有効量」は、本願明細書で使用する場合、検出可能な抗転移効果を生じさせることができる量を含む。
【００１９】
標的療法は、阻害剤および／または活性化剤のうちの２つ以上の併用治療を含み得る。ｃＡＢＬ阻害剤は、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、および／またはＳＵＴＥＮＴとすることができる。ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴｌＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢとすることができる。また、ＣＯＸ−２阻害剤は、例えば、ＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸとすることができる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、対象が、ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）および／またはＡＢＬ（Ｔ７３５）のリン酸化レベルの大幅な増加を呈した（例えば、受容体、ＥＧＦＲ、および／またはＡＢＬの活性化を呈した）場合、対象は、ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤、および／またはＡＫＴの阻害剤、および／またはＥＲＫの阻害剤のような、信号伝達経路内のそれらのマーカーの下流にある、有効量の信号伝達キナーゼの阻害剤で治療される。
【００２１】
本発明の別の一実施形態では、対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、またはＣＯＸ−２の量の大幅な増加を呈した場合、対象は、それぞれ、ＡＫＴ阻害剤、ｃＡＢＬ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、またはＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた、有効量のカルボキシアミドイミダゾール（ＣＡＩ）で併用治療を受ける。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、対象は、他のインジケーションのためのものであるが、現在ＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：食品医薬品局）に承認されている、または現在第２相または第３相試験にある薬物で治療される。本発明は、これらの標的が、転移によって後に現れる可能性が高く、したがって、極めて不十分な予後、すなわち、以前には認識されなかった兆候を有する、結腸直腸癌に関与すると見なしていることに留意されたい。本発明のこの実施形態では、対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、および／またはＣＯＸ−２タンパク質の総量の大幅な増加を呈した場合、対象は、例えば、それぞれ、有効量のｐＡＫＴ阻害剤であるＶＱＤ−００２および／またはエンザスタウリン、ｃＡＢＬ阻害剤であるＧＬＥＥＶＥＣ、ＳＵＴＥＮＴおよび／またはＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、ＥＲＫ阻害剤であるＣＩ−１０４０および／またはＰＤ０３２５９０１、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＣＩＯ−４６９、ＳＢ ２３９０６３、ＶＸ−７０２、および／またはＢＭＳ−５８２９４９、ｐＥＧＦＲ阻害剤であるＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢ、またはＣＯＸ−２阻害剤であるＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸで治療される。
【００２３】
阻害剤または活性化剤は、そのリン酸化状態が異常である（増加または減少した）ことが分かっている、本発明のマーカーのうちの１つ以上に対する、および／またはＣＯＸ−２に対する標的とすることができる。阻害剤は、概して、本願明細書の実施例において解析したタンパク質の特定のリン酸化アイソフォームに対するものか、または異なるアイソフォームに対するものか、あるいはリンタンパク質に対するものとすることができる。一実施形態では、治療方法に使用される阻害剤または活性化剤は、複数の標的に対するもの（例えば、標的のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の全てに対するもの）とすることができる。１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、まはた、５つ以上）の阻害剤または活性化剤を、いかなる個々の標的に対しても使用することができる。阻害剤の好適な組み合わせは、例えば、ＶＩＯＸＸ、ＣＥＬＥＢＲＥＸ、ＧＬＥＥＶＥＣ、ＳＵＴＥＮＴ、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、ＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢのうちの２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０）を含む。
【００２４】
本願明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。例えば、上記に使用したように、「ａｎ」阻害剤は、複数の阻害剤、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の阻害剤を含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、結腸直腸癌である対象を治療するための方法であって、陽性および／または陰性の参照基準と比較して、対象からの試料において、（ａ）ｐＡＫＴ（例えば、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化レベル）、（ｂ）ｐＢＡＤ（例えば、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２）のリン酸化レベル）、（ｃ）ｐｃＡＢＬ（例えば、ｐｃＡＢＬ（Ｔ７３５）のリン酸化レベル）、（ｄ）ｐＥＲＫ（例えば、ｐＥＲＫ（Ｔ４２／４４）のリン酸化レベル）、（ｅ）ｐＭＡＲＣＫＳ（例えば、ｐＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）のリン酸化レベル）、（ｆ）ｐｐ３８ＭＡＰＫ（例えば、ｐｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）のリン酸化レベル）、（ｇ）ｐＳＴＡＴ１（例えば、ｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）のリン酸化レベル）、（ｈ）ｐＴＥＮ（例えば、ｐＴＥＮ（Ｓ３８０）のリン酸化レベル）、（ｉ）ｐＥＧＦＲ（例えば、ｐＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル）、（ｊ）ｐＰＡＫ１／２（例えば、ｐＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）のリン酸化レベル）、および／または（ｋ）ｐＰＫＣゼータ／ラムダ（例えば、ｐＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）のリン酸化レベル）、および／または（ｌ）ＣＯＸ−２タンパク質の総量（それらの組み合わせを含んで）、のうちの１つ以上のリン酸化状態を決定するステップを含み、
（ａ）〜（ｉ）のうちの１つ以上のリン酸化状態および／またはＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）が、陰性の参照基準と比較して大幅に増加したか、または陽性の参照基準と統計的に同じレベルにあり、対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示した場合、対象に、有効量の、（ａ）〜（ｉ）のうちの１つ以上の阻害剤（例えば、キナーゼ阻害剤または酵素阻害剤）、またはＣＯＸ−２の阻害剤が投与され、
（ｊ）または（ｋ）のリン酸化状態が、陽性の参照基準と比較して大幅に減少したか、または陰性の参照基準と統計的に同じレベルにあり、対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示した場合、対象に、有効量の（ｊ）および／または（ｋ）の活性化剤（例えば、キナーゼ）が投与される。
【００２６】
これらの阻害剤および／または活性化剤の組み合わせを対象に投与することができる。
【００２７】
タンパク質の「リン酸化状態」は、タンパク質のリン酸化の程度（総量）を指す。これは、リン酸化されたタンパク質の部位数（例えば、好適なセリン、トレオニン、またはチロシンアミノ酸残基）、およびアミノ酸鎖上の任意の所与の受容体部位のリン酸化レベルの両方を含む。タンパク質のリン酸化状態の増加は、リン酸化されたタンパク質の好適なアミノ酸残基の数（例えば、セリン、トレオニン、またはチロシン）の増加、または特定のアミノ酸残基でのリン酸化度数の増加のいずれかを反映し得る。「異常な」リン酸化状態は、陰性または陽性の参照基準よりも、それぞれ、統計的に大幅に高い（増加）こと、または低い（減少）リン酸化状態を指す。
【００２８】
当業者は、本願明細書に記載されるリン酸化アミノ酸残基に加えて、本発明のマーカーは、タンパク質の他のアミノ酸残基のリン酸化によって、活性化し得（または、ｐＰＡＫ１／２またはｐＰＫＣゼータ／ラムダの場合は、不活性化または阻害し得）、本発明の方法では、それらのリン酸化残基のうちの１つ以上でのリン酸化レベルは、記載した残基に加えて、またはその代わりに分析することができることが認識されよう。例えば、ｃ−ＡＢＬの場合、他の部位は、Ｙ２４５、Ｔ７３５、および／またはＹ４１２を含み、ＥＧＦＲの場合、他の部位は、Ｔ６６９、Ｓ９６７、Ｙ９９２、Ｓ１００２、Ｙ１０４５、Ｓ１０４６、Ｓ１０５７、Ｙ１０６８、Ｙ１０８６、Ｙ１１１４、Ｓ１１４２、Ｙ１１４８、および／またはＹ１１７３を含み、ＡＫＴの場合、他の部位は、４７３、３０８、および／またはＴ４５０を含み、ｐＴＥＮの場合、他の部位は、Ｓ３８０、Ｔ３８２、および／またはＴ３８３を含み、ＳＴＡＴ１の場合、他の部位は、Ｙ７０１および／またはＳ７２７を含み、ＢＡＤの場合、他の部位は、Ｓ１５５および／またはＳ１１２を含む。
【００２９】
本発明の実施形態では、上述の治療方法は、従来の化学療法剤を阻害剤と組み合わせて対象に投与するステップをさらに含むことができる。本願明細書で使用する場合、「従来の化学療法剤」は、本願明細書において考察される１２のマーカーのうちの１つの阻害剤または活性化剤以外の化学療法剤を指す。従来の化学療法剤は、阻害剤または活性化剤とともに（と同時に）投与することができ、または、薬剤を逐次的に投与することができる。
【００３０】
特定のリンタンパク質アイソフォームのリン酸化レベルを測定する、本願明細書に記載の方法のうちのいずれでも、代わりに、そのタンパク質のリン酸化状態（例えば、その活性化に寄与する、またはｐＰＡＫ１／２またはｐＰＫＣゼータ／ラムダの場合はその不活性化に寄与する、タンパク質の他のアミノ酸残基のうちの１つ以上のリン酸化レベルを含む）を測定することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、対象の結腸直腸癌を治療するための方法において、その改善は、対象が、予後不良である、および／または後に転移するか、後に転移を発現する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを予測するステップと、次に、対象を本発明の標的療法で治療するステップを含む。
【００３２】
本発明の治療方法は、結腸直腸癌の転移を阻害および／または予防することができる。
【００３３】
本発明の別の態様は、本願明細書において考察される１１のリン酸マーカーのうちの１つ以上のリン酸化状態、および／またはＣＯＸ−２タンパク質の総量、またはそれらの組み合わせのアッセイに好適な１つ以上の薬剤の群である。薬剤は、実施例Ｉに示される特定のリン酸化アイソフォームに対して特異的、および／またはタンパク質の他のリン酸化アミノ酸残基に対して特異的であり得る。群は、上述のマーカーのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１種のマーカーのリン酸化状態、および／またはＣＯＸ−２の総量の、あるいは、その任意の組み合わせのアッセイに好適な薬剤を含み得る。一実施形態では、薬剤は、ＡＫＴ（例えば、Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（例えば、Ｔ７３５）、ＥＲＫ（例えば、Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（例えば、Ｔ１８０−１８２）、ＥＧＦＲ（例えば、Ｙ９９２）のリン酸化状態、および／またはＣＯＸ−２のアッセイに好適である。薬剤は、例えば、上述のリンタンパク質のうちの１つの特定のリン酸化アイソフォームに対して、またはＣＯＸ−２に対して特異的な抗体（モノクローナル抗体等）または他のリガンドとしてもよい。本発明の別の態様は、結腸直腸癌である対象に対して、予後、後の転移の発現の可能性、または積極的療法を投与する望ましさを予測するための、任意選択で１つ以上の容器内に充填された、上述の一群の薬剤を含むキットである。
【００３４】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象を治療するための、有効量の、本願明細書に述べた阻害剤または促進剤のうちの１つ以上、あるいはそれらの組み合わせを含む医薬組成物またはキットである。例えば、医薬組成物は、有効量の、（ａ）ＥＧＦＲ阻害剤および／またはｃＡＢＬ阻害剤、および（ｂ）ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、および／またはＡＫＴ阻害剤、および／またはＥＲＫ阻害剤を含むことができる。本発明の別の態様は、ｐＡＫＴ阻害剤、ｐｃＡＢＬ阻害剤、ｐＥＲＫ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、またはｐＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた、有効量のカルボキシアミドイミダゾール（ＣＡＩ）を含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物では、ｐＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢとすることができ、ｐＡＢＬ阻害剤は、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣおよび／またはＳＵＴＥＮＴとすることができ、および／またはＣＯＸ−２阻害剤は、例えば、ＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸとすることができる。
【００３５】
医薬組成物は、薬剤として許容される担体を含む。キットでは、阻害剤または促進剤は、容器内にあり得る。本発明の医薬組成物またはキットはまた、阻害剤および／または活性化剤とともに投与することができる、１つ以上の従来の化学療法剤を含み得る。
【００３６】
上述の遺伝子およびタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は既知であり、日常的な方法で決定することができ、また、種々の既知のデータベースからダウンロードすることができる。例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールドワイド・ウェブサイトを参照されたい。
【００３７】
「試料」は、本願明細書で使用する場合、その中のリンタンパク質のうちの１つ以上のリン酸化状態、またはＣＯＸ−２タンパク質の総量を決定するようにアッセイすることができる、あらゆる好適な細胞または組織を含み得る。好適な試料には、例えば、末梢血細胞、および腫瘍の一次切除時に得られる針生検または肉眼的外科標本のような生検が挙げられる。試料は、例えば、新鮮なもの、冷凍（例えば、急速冷凍）したもの、またはタンパク質のリン酸化レベルを含む、細胞のタンパク質含有量を保持する形で保存したものであることができる。
【００３８】
「対象」は、本願明細書で使用する場合、結腸直腸癌であるあらゆる動物を含む。好適な対象（患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、家畜、および飼育動物、すなわちペット（ネコまたはイヌ等）が挙げられる。ヒト以外の霊長類、および好ましくは、人間の患者が含まれる。
【００３９】
リン酸化レベルの「大幅な増加」は、本願明細書で使用する場合、当技術分野で適切かつ既知である統計的手法を使用しての、その陰性の参照基準との差が、統計的に有意なレベルであり、概して、不規則変動によって変化する可能性が５パーセント未満の確率値を有する。例えば、転移形態の結腸直腸癌を有するか、その可能性の高い対象における、本発明の診断バイオマーカー内の残基のリン酸化は、癌ではない対象、または転移性ではない結腸直腸癌の形態を有する対象において観察されたレベルよりも、２０％から２００％を超える範囲で高くなり得る。
【００４０】
リン酸化レベルの「大幅な減少」は、本願明細書で使用する場合、陽性の参照基準との、または転移形態の結腸直腸癌である対象との、同様の差である。リン酸化レベルの大幅な減少は、適切かつ既知である統計的手法を使用しての、その陽性の参照基準との差が、統計的に有意なレベルであり、概して、不規則変動によって変化する可能性が５パーセント未満の確率値を有する。例えば、転移形態の結腸直腸癌である可能性の低い対象における、本発明の診断バイオマーカー内の残基のリン酸化は、転移形態の結腸直腸癌である対象において観察されたレベルよりも、２０％から約９０％の範囲で低くなり得る（例えば、陽性の参照基準の約８０％未満のレベルまで、または検出できない量までの減少）。
【００４１】
バイオマーカーのリン酸化レベルは、本願明細書で使用する場合、タンパク質（例えば、アミノ酸側鎖上）の所与のアミノ酸残基でのリン酸化レベルを指す。タンパク質のリン酸化の量の増加（例えば、対象となるリンタンパク質アイソフォームの、細胞ごとの総量の増加）は、リン酸化タンパク質の総量、またはアミノ酸残基でのリン酸化の増加度数を反映し得る。概して、上述のアミノ酸残基においてリン酸化されたタンパク質の総量は、試料ごとに、または試料内の細胞ごとに測定される。
【００４２】
本発明の一実施形態では、バイオマーカーのリン酸化レベルは、組織培養細胞から導出した陽性および陰性の参照基準を調製することによって決定される。
【００４３】
「陽性の」参照基準を生成するために、最初に、転移形態の結腸直腸癌であることが分かっている対象（または対象のプール）からの（ヒトの生検標本のような）生検標本から得られた細胞を処理することができる。タンパク質抽出物は、組織から調製することができ、対象となるリン酸化したエンドポイントでの、リン酸化レベル（または値の範囲）が、ここで説明されるように決定される。このような試料の中央値は、陽性の参照基準となる。
【００４４】
「陰性の」参照基準を生成するために、癌ではないことが分かっている（「正常な」対象）、または非転移性形態の結腸直腸癌であることが分かっている対象（または対象のプール）の同等の組織からの細胞を処理することができる。タンパク質抽出物は、組織から調製することができ、対象となるリン酸化したエンドポイントでの、リン酸化レベル（または値の範囲）が、ここで説明されるように決定される。このような試料の中央値は、陰性の参照基準となる。
【００４５】
上述の方法の変形例では、陽性または陰性の基準の決定は、公表されたデータ、転移性の無い対象からの組織の遡及研究、および本発明の方法を実行する当業者に明らかである他の情報に基づき得る。
【００４６】
しかしながら、このような対象からの組織を臨床診断の参照基準として使用することは、概して、日常的には、現実的ではない。その代わりに、培養細胞からの溶解物を使用し、細胞培養の溶解物と、真陽性（例えば、上述のように、転移形態の結腸直腸癌である対象から導出したエンドポイント値）、および真陰性（例えば、上述のように、転移形態の結腸直腸癌ではない対象から導出したエンドポイント値）との直接比較による、カットポイント値を確立することによって、陰性および陽性の参照基準を生成することが好ましい。これを達成するために、最初に、種々の培養細胞、一次細胞か、好ましくは細胞系をスクリーニングすることができる（例えば、ＥＧＦまたは過バナジン酸（ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）のようなマイトジェンで治療する種々の既知の細胞系のいずれかが、リン酸化を誘起する）。
【００４７】
これらの、または他の種類の培養細胞は、本発明のタンパク質が、リン酸化されないように、またはリン酸化の程度が最小になるように、従来の条件下で、直接増殖させるか、または培養細胞は、過バナジン酸のような信号伝達ネットワーク、または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のような成長因子を全体的に活性化する、好適なマイトジェンによって、従来の条件下で培養することができる。
【００４８】
次いで、タンパク質抽出物を、従来の手順を使用して、種々の条件下で培養した種々の細胞系から調製し、対象となるリン酸化したエンドポイントでのリン酸化レベルを、本願明細書に記載したように決定し、架橋実験として、真陽性および真陰性の臨床試料と直接比較する。このようにして、特定の既定条件下で培養された（促進有無を問わず）特定の細胞が、転移形態の結腸直腸癌である、またはそうでない対象の量と直接比較可能な、本発明のリンタンパク質アイソフォームのリン酸化量を発現するように、条件を確立することができる。既知の真の臨床的な陽性および陰性から導出されたカットポイント値を利用し、また、これらの値を細胞系の参照基準に架橋することで、その後、それぞれ、「陽性の参照基準」または「陰性の参照基準」を提供することができる。陽性および陰性の値は、陰性の参照基準値よりも高い臨床試料から測定した値を、転移を予測するものとして受け入れることができ、また、陽性の参照基準よりも低い測定値を、転移しないことを予測するものとして受け入れることができるように、従来の統計ツールを使用して選択することができる。
【００４９】
代替的に、既知の濃度の検体（例えば、本発明のリン酸化タンパク質アイソフォームのうちの１つ以上）の、精製試料内のリン酸化レベルを使用することができる。
そのリン酸化レベルが決定されたタンパク質ごとに、値を、細胞内の総タンパク質量に正規化するか、またはアクチンのような、（ハウスキーピング遺伝子から）構成的に発現したタンパク質の量に標準化することができ、またはリンタンパク質の量を、そのリン酸化されていない対応部分の量と比較することができる。
【００５０】
所与のアミノ酸残基のリン酸化レベルは、質的または定量的に測定することができる。所与の残基におけるリン酸化の量（分量）は、対照試料内の同じ残基において観察される量より多くなり得る。すなわち、過リン酸化することができる。検出閾値としての過リン酸化に加えて、上述の残基でのリン酸化の有無を利用することもできる。代替的に、定性的尺度（例えば、１から５の尺度）を使用することができる。
アミノ酸残基でのリン酸化のレベルを測定するための方法、および／または信号伝達経路の活性化を決定する方法は、従来通りで日常的的である。一実施形態では、測定は、（キナーゼ基質のような）対象のタンパク質に照らして、非リン酸化形態またはリン酸化形態の対象となる特定のアミノ酸残基に対して特異的である、複数組の抗体の存在に依存する。抗体は、例えば、本発明のバイオマーカーの非リン酸化またはリン酸化アイソフォームに対して特異的なものを使用することができる。そのような抗体は、市販のものとするか、または従来の手順を使用して日常的に生成することができる。一実施形態では、（非リン酸化形態またはリン酸化形態の）対象となるタンパク質からの、対象となるアミノ酸を含む合成ペプチドを、好適な抗体を調製する抗原として使用する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルとすることができる。当業者は、使用することができる種々の好適な抗体、抗体断片、またはアプタマを認識されよう。抗体は、リン酸化バージョンのタンパク質だけを検出し、非リン酸化バージョンの天然または変性タンパク質は検出しないように、およびその逆となるように、選択および検証される。
【００５１】
そのような抗体は、様々な方法で使用することができる。例えば、患者試料から全細胞溶解物を調製して、それらをアレイ形態で、ニトロセルロース帯またはガラススライドのような、好適な基質上にスポットすることができる。試料内のタンパク質は、スポットする前に変性させることが好ましい。概して、細胞は、広ダイナミックレンジを提供するように、２倍系列希釈法のような連続希釈法でスポットされる。陽性の対照または基線値のための対照のような、好適な対照を含むことができる。各アレイは、次いで、対象となる種々のタンパク質内のどのアミノ酸残基がリン酸化されたのかを決定および／または定量化するように、上述のように、好適な検出可能な抗体でプローブされる。免疫学的定量のための方法は、従来通りである。逆相タンパク質溶解物マイクロアレイ（ＲＰＭＡ）のこの方法に関するさらなる考察に関しては、例えば、Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００、１４２２９−１４２３９を参照されたい。
【００５２】
対象となる残基でのリン酸化のレベルおよび／または程度を評価するために、そのような抗体を用いた他の好適なアッセイ法には、例えば、比色アッセイ、イムノアッセイ（免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ等）、蛍光読み出しに基づくアッセイ、ウエスタンブロット法、サスペンションビードアッセイ、免疫沈降法、質量分光法、およびの従来のアッセイ法が挙げられる。好適な方法には、非常に小さい試料（例えば、約２００の細胞）内のリンタンパク質を検出できるものが挙げられる。代替的に、大きなサイズの試料（例えば、約２０，０００乃至２５，０００の細胞）に好適な方法を使用することができる。
【００５３】
リン酸化残基の存在および／または量を測定するアッセイ法は、例えばロボティクスを使用して、高スループットの形態に容易に適合させることができる。
好適な陽性および陰性の参照基準を決定するための方法、および陰性の参照基準と比較して、対象内にタンパク質の量の大幅な増加があるかどうかを決定するための方法のように、ＣＯＸ−２のような非リン酸化タンパク質の総量を決定するための方法は、従来通りである。
【００５４】
本発明のアッセイ法のための好適な対照は、当業者に明らかとなろう。例えば、品質管理を提供するために、（例えば、タンパク質マイクロアレイの形態で）試験されるタンパク質の各組は、抗原対照、細胞溶解物対照および／または参照溶解物を含んでもよい。各患者検体試料は、総タンパク質量に正規化し、同じアレイ上に「印刷された」参照と関連する単位で数量化することができる。各参照および対照溶解物は、患者試料と同じ希釈系列で印刷することができ、患者試料と同一の試料で、同時に免疫染色することができる。全ての試料は、複製して４点希釈曲線で印刷されることができる。
【００５５】
品質保証を提供するために、試料は、例えば、適用可能な規制基準を満たす好適な処理施設でそれらを受け取った時に、リアルタイムで処理および分析することができる。試料は、細胞溶解保存した試料から構成してもよい。適合する凍結試料を有する試験セットは、標本保存の妥当性を検証することができる。手法は、室温で実行することができる。試料は、コア針生検によって得てもよい。
【００５６】
本願明細書に述べられる方法によるマーカータンパク質のリン酸化レベルの決定に続いて、それらの患者に対する治療の決定を向上させるように、値を、例えばパネルまたは一連の値の形態で、医師に報告することができる。このような報告により、共通の診断を有する癌および他の疾患を、有効であると考えられる治療に従って、分子レベルで階層化することができる。これによって、最適な個別の患者治療を行うことができる。データを報告するためのいくつかの好適なシステムは、２００７年３月２７日に出願の同時係属の暫定出願第６０／９３５，１０６号に記載されている。このような報告は、当該の特定のリンタンパク質、それぞれに対する正常な参照レベルまたは範囲、および患者試料内のタンパク質の測定したリン酸化レベルの包括的なリストを提供することができる。
【００５７】
本発明の一態様は、本発明の方法によって、予後不良である、後に転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有する、および／または積極的療法および／または標的療法の好適な対象になる、と決定された対象を治療するための方法である。
【００５８】
本発明の阻害剤または活性化剤は、異常なリンタンパク質の総量、または特定の残基でのリン酸化レベル（または、ＣＯＸ−２では、タンパク質の総量）が、対象から得られた試料において、上述の１２のタンパク質マーカーのうちの少なくとも１つで観察された時に、投与することができる。
【００５９】
本発明の一実施形態では、阻害剤は、過度にリン酸化された本発明のリンタンパク質マーカーのリン酸化状態を減少させるキナーゼ阻害剤であるか、過度に活性化または過度に発現した本発明のタンパク質マーカーの活性を減少させる酵素阻害剤である。他の好適な阻害剤には、例えば、過度に活性化された、または過度に発現した本発明のタンパク質マーカーをコード化する核酸に対するｓｉＲＮＡｓ、および抗体、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体、アプタマ、または本発明のタンパク質マーカーに対する他のリガンドが挙げられる。別の実施形態では、活性化剤は、不十分にリン酸化された本発明のリンタンパク質マーカーのリン酸化状態を増加させる、キナーゼである。
【００６０】
ＡＫＴキナーゼ（例えば、Ｓ４７３）（タンパク質キナーゼＢとしても知られる）の阻害剤の実施例には、これに限定されないが、例えば、
Ａｋｔ−１−１（Ａｋｔ１を阻害する）（Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８５（Ｐｔ．２）３９９−４０８）、
Ａｋｔ−１−１，２（Ａｋ１および２を阻害する）（Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８５（Ｐｔ．２）３９９−４０８）、
ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ（例えば、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９１、１８０８−１２）、
１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジニル化合物（例えば、国際公開第ＷＯ０５０１１７００号）、
インドール−３−カルビノールおよびその誘導体（例えば、米国特許第ＵＳ６、６５６、９６３号、Ｓａｒｋａｒ ａｎｄ Ｌｉ（２００４）Ｊ Ｎｕｔｒ．１３４（１２ Ｓｕｐｐｌ）、３４９３Ｓ−３４９８Ｓ）、
ペリホシン（例えば、Ａｋｔの膜局在化を妨害する；Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０（１５）５２４２−５２、２００４）、
ホスファチジルイノシトールエーテル脂質の類似体（例えば、Ｇｉｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｎｎｉｓ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ １３、７８７−９７）、
トリシリビン（ＴＣＮまたはＡＰＩ−２、あるいはＮＣＩ識別子：ＮＳＣ １５４０２０；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４、４３９４−９）、が挙げられる。
【００６１】
ｐｃＡＢＬ（例えば、Ｔ７３５アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＧＬＥＶＥＣ、ＳＵＴＥＮＴ、およびＳＫＩ−６０６（Ｔｈａｉｍａｔｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３、４７０４−１２）が挙げられる。
【００６２】
ｐＥＲＫ（例えば、Ｔ４２／４４アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９およびＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（Ｚｅｌｉｖｉａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０７、４７８−８５）が挙げられる。
【００６３】
ｐＭＡＲＣＫＳ（例えば、Ｓ１５２−１５６アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、イソキノリンスルホンアミド誘導体、Ｈ−１１５２、ＨＡ−１０７７、およびＹ−２７６３２（Ｉｋｅｎｏｙａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｎｅｗｏｃｈｅｍ ８１、９−１６）が挙げられる。
【００６４】
ｐｐ３８ＭＡＰＫ（例えば、Ｔ１８０−１８２アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＳＢ−２３９０６３およびＳＢ ２２００２５（Ｌｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４４７、３７−４２）が挙げられる。
【００６５】
ｐＳＴＡＴ１（例えば、Ｙ７０１アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、フルダラビン（Ｔｅｒｕｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３８０、２０３−２０９）が挙げられる。
【００６６】
ＰＴＥＮ（例えば、Ｓ３８０アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、ビスペルオクソバナジウム化合物が挙げられる。
【００６７】
ｐＥＧＦＲ（例えば、Ｙ９９２アイソフォーム）阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＩＲＥＳＳＡ、ＬＡＰＳＴＩＮＩＢ、ＥＲＢＩＴＩＸ、およびＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢが挙げられる。
【００６８】
ＣＯＸ−２阻害剤の例には、これに限定されないが、例えば、ＶＩＯＸＸおよびＣＥＬＥＢＲＥＸが挙げられる。
【００６９】
非リン酸化状態およびリン酸化状態にある上述のリンタンパク質（またはＣＯＸ−２）に関連するアッセイ法または治療方法は、作用の機構に関わりなく、本発明に従って使用することができる。したがって、転移の根底にある機構は、指示マーカーのうちの１つ以上のリン酸化状態またはＣＯＸ−２の量の影響を受け得ると考えられるが、本発明は、治療診断的、治療的、および／または予後的方法がそれらの成功を達成する、いかなる機構にもとらわれない。
【００７０】
本願明細書において考察される阻害剤または活性化剤は、治療上の処置方法に使用するための、医薬組成物等の種々の組成物に処方することができる。医薬組成物は、キットとして一まとめにすることができる。概して、本発明の医薬組成物は、転移抑制有効量の阻害剤を含む。「転移抑制有効量」は、本願明細書で使用する場合、妥当な時間枠内で、少なくとも検出可能な治療反応を生じさせるのに十分な量である。例えば、転移の症状を、少なくとも検出可能な程度まで改善すること、または腫瘍が広がるのを阻害すること、等ができる。
【００７１】
組成物は、薬剤として許容される担体のような、担体を含むことができる。「薬剤として許容される」とは、生物学的に、または、それ以外で有害ではない材料、すなわち、その材料を、あらゆる望ましくない生物学的影響を生じさせずに、または有害な様態で、含まれる医薬組成物の他の構成要素のうちのいずれとも相互作用なしに、対象に投与できることを意味する。担体は、当業者に既知であるように、活性成分のあらゆる劣化を最小にするように、また、対象におけるあらゆる有害な副作用を最小にするように選択される。医薬的に許容される担体および医薬組成物の他の構成要素の考察については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０を参照されたい。
【００７２】
本発明の医薬組成物またはキットは、本発明の阻害剤または促進剤に加えて、（化学療法剤のような）他の医薬品を含むことができる。他の化学療法剤は、患者の治療中のあらゆる好適な時間に、同時に、または逐次的に投与することができる。
当業者は、特定の製剤は、１つには、本発明の特定の阻害剤または促進剤、または用いられる他の化学療法剤、および選択した投与の経路に依存するものと認識されよう。したがって、本発明の組成物には、多種多様な好適な製剤がある。
従来の化学療法剤の中で、本発明の活性化剤のうちの１つ以上の阻害剤とともに対象に投与することができる薬剤を表１に記載する。
【００７３】
【表１】
【００７４】
経口投与に好適な製剤は、水、食塩水、または果物ジュースのような希釈剤に有効量の薬剤を溶解したような液体溶液、それぞれが固体、顆粒または冷凍乾燥させた細胞として、既定量の活性成分を含むカプセル、小袋、または錠剤、水性液体中の溶液または懸濁液、および水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンで構成することができる。錠剤の形態は、乳糖、マンニトール、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、微結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、および薬理学的に適合する担体のうちの１つ以上を含むことができる。経口的な送達に好適な製剤は、合成および天然の高分子微小球体内に、または消化管内での劣化から本発明の薬剤を保護する他の手段内に組み込むこともできる。
【００７５】
非経口投与（例えば、静脈内投与）に好適な製剤には、抗酸化化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象となる受容者の血液と等張性のある製剤を与える溶質を含むことができる、水性および非水性の等張性無菌注射溶液、および懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプルおよびバイアルのような単回服用または複数回服用の密封容器で提供することができ、また、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用の水の添加だけしか必要としないフリーズドライの（凍結乾燥した）状態で貯蔵することができる。即座の注射溶液および懸濁液は、上述した種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００７６】
本発明の阻害剤または促進剤は、単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾルの製剤に作製することができる。これらのエアロゾルの製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容される噴射剤中に収容することができる。
【００７７】
当業者は、好適な、または適切な製剤を、当面の特定の用途に基づいて、選択、構成、または拡張できるものと認識されよう。
【００７８】
本発明の阻害剤または促進剤の用量は、錠剤またはカプセルのような単位用量形態とすることができる。本願明細書で使用する「単位用量形態」という用語は、ヒトおよび動物の対象に対する単位的な用量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、医薬的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと共に所望の効果を発生するのに十分な量に計算された、既定量の本発明の薬剤を単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて含む。
【００７９】
当業者は、個々の患者における所望の抗転移有効量または有効濃度の薬剤を達成するために、正確な処方の組成物を使用するための、適切な用量、スケジュール、および投与方法を容易に決定することができる。当業者は、適切な患者試料（例えば、血液および／または組織）の直接的または間接的な分析によって、本発明の化合物の「有効濃度」の適切な指標を容易に決定、かつ使用することもできる。
【００８０】
動物、特にヒトに投与される、本発明の阻害剤または促進剤、またはその組成物の用量は、本発明に照らして、妥当な時間枠にわたって個体内に少なくとも治療反応を生じさせるのに十分な量（抗転移有効量）とすべきである。正確な用量は、対象の種、年齢、体重、および全体的な状態、治療されるあらゆる疾患の重症度、または機構、使用される特定の薬剤またはビヒクル、その投与方法等に基づいて、対象によって異なる。生体内で所望の転移抑制濃度を達成するために使用される用量は、用いられる特定の阻害剤の効能、宿主内の薬剤に関連する薬力学、感染個体の疾病状態の重症度、および、全身投与の場合は、個体の体重および年齢によって決定される。用量のサイズも、用いられる特定の阻害剤、またはその組成物が伴い得る、あらゆる有害な副作用の存在によって決定される。概して、可能な場合は常に、有害な副作用を最小限に抑えることが望ましい。
【００８１】
併用療法で提供する時には、他の（従来の）化学療法剤を、例えば、阻害剤または活性化剤と同時に提供するか、または必要に応じて、服用の時間をずらすことができる。２つ（またはそれ以上）の薬物を、組成物に組み合わせることもできる。それぞれの用量は、いずれかを単独で使用する時よりも、組み合わせて使用する際に少なくすることができる。
【００８２】
本発明の別の実施形態は、本願明細書に記載された方法のうちのいずれか（例えば、診断または治療方法）に有用なキットであって、かかるキットは、本願明細書において考察する、阻害剤または活性化剤、あるいは診断試薬のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、対象の転移性癌の治療上の処置に好適なキットは、薬剤として許容される担体、および任意選択で、容器または包装材料をさらに含み得る。診断キットは、本発明のマーカーのリン酸化状態（または、ＣＯＸ−２の場合は、その総量）の決定に好適な薬剤を含むことができる。薬剤は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む抗体、または対象となるタンパク質と特異的に結合する（例えば、リンタンパク質の場合、対象となるリン酸化アイソフォームと特異的に結合する）他のリガンドとすることができる。他には、本発明のキットは、実験的応用に使用することができる。当業者は、キットの構成要素が、本発明の方法のうちのいずれの実行にも好適であると認識されよう。
【００８３】
任意選択で、キットは、方法を実行するための指示を含む。本発明のキットの任意選択の要素は、好適な緩衝剤、薬剤として許容される担体等、容器、または包装材料を含む。キットの試薬は、試薬が安定する容器に、例えば、凍結乾燥形態または安定化した液体で収容され得る。また、試薬は、単回使用の形態、例えば単回用量形態としてもよい。
【００８４】
上述した、および以下の実施例では、全ての温度は、補正されていない摂氏で示され、特に指示しない限り、全ての割合およびパーセントは、重量によるものである。
【００８５】
（第１実施形態）材料および方法
１．逆相タンパク質マイクロアレイ 以前に公開された方法（例えば、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３、３６１４−３６２１；Ｌｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３、３１７−３２５；Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ４、３４６−３６５）によって生成した、微小解剖した細胞を溶解させて、逆相タンパク質マイクロアレイを、上記Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）によって説明されているように、全細胞溶解物に２通り印刷した。簡潔に述べると、溶解物を、５００μｍのピンを備えたＧＭＳ ４１７アレイヤ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、ガラスで支持されたニトロセルロースアレイスライド（ＦＡＳＴ Ｓｌｉｄｅｓ Ｗｈａｔｍａｎ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪ）上に印刷した。各溶解物は、原液および陰性対照希釈剤、１：２、１：４、１：８、１：１６を表す希釈曲線に印刷された。スライドは、免疫染色する前に、乾燥剤（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ、Ｗ．Ａ．Ｈａｍｍｏｎｄ、Ｘｅｎｉａ、ＯＨ）とともに、−２０℃で保管した。
２．マイクロアレイ解析のためのバイオインフォマティクス法 各アレイは、走査して、スポット強度を分析し、データを正規化して、標準化し、アレイ上の試料ごとに単一のデータ値を生成した（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ｖ５．２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。スポット強度は、固定領域を通じて積分した。局所領域の背景強度は、隣接するスライドの背景を刷り込んだスポットごとに計算した。これによって、アレイ上のあらゆる他のスポットとの比較のための、試料ごとの単一のデータ点を得た。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの２試料順位和検定を使用して、２つの群間の値を比較した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【００８６】
（第２実施形態）信号経路の変化、および転移する結腸直腸癌と、転移しない結腸直腸癌とを区別することができる薬物標的の同定
研究セットには、肝臓の転移を示した結腸直腸癌腫と、外科的にヒトの対象から採取した、いかなる転移の証拠も無く、フォローアップ時にも転移を示さなかった結腸直腸癌腫とを使用した。外科的試料は、レーザキャプチャマイクロダイセクションによって処理し、純粋な癌細胞集団を溶解して逆相タンパク質マイクロアレイ解析を行った。この手法を使用することで、７０のキナーゼ基質のリン酸化状態を測定することができた。分子ネットワーク分析は、市販のソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｖｉｇｅｎｅ、ＶｉｇｅｎｅＴｅｃｈ、ＭＡ）を使用して実行した。解析した７０のリン酸エンドポイントのうち、１２が、（進行の早い）転移性癌と（進行の遅い）非転移性癌との間で、統計的に有意に異なって発現した（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５により）。これらの結果を図１に示す。これらの１２のリン酸エンドポイントのうち、１０は、転移を示さなかった患者に対して、転移を示した患者において増加し、３つは、非転移性疾患の患者において増加した。予想外に、これらのリン酸化の一部は、特定の標的療法において既に使用している薬物標的を表している。
ｃＡｂｌ（Ｔ２４５）の増加＝ＧＬＥＥＶＥＣ
ＣＯＸ−２の増加＝ＶＩＯＸＸ
ｐＥＧＦＲの増加＝ＴＡＲＣＥＶＡ
さらに、ＥＲＫ、ＡＫＴおよびｐ３８のようなこれらのエンドポイントのうちの多くは、開発中の、他の分子阻害剤の標的である。また、マーカーのパネルとして、これらのエンドポイントは、進行の早い疾患と進行の遅い疾患とを区別すること、良好な予後と不良な予後とを区別すること、および化学予防的療法、またはＣＯＸ−２、ｅｇｆｒ、ａｂｌによる率先的な療法、または他のキナーゼを標的とする療法の基準を提供することができるセラノスティックの機会を示すことができる。
転移と大きく相関しなかった、試験を行ったリン酸エンドポイントのいくつかを下記の表２に示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
（第３実施形態）本発明の標的阻害剤が転移を阻害できることを示す、結腸直腸癌の動物モデルにおける研究
転移プロセスの根拠となる原因、およびそれによって、転移の無い結腸直腸癌を示す患者の将来的な転移の予防のための治療標的として、信号伝達の活性化状態の因果的有意性を、動物モデル系で試験する。
第１の動物モデル系では、ラットＢＤＩＸ菌種を、ＤＨＤ−Ｋ１２細胞系細胞とともに脾静脈に注入し、注入した細胞は、１５日で肝転移を、また、２０日で肺転移を急速に形成する。ラットは、以下のキナーゼ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ｃＡＢＬ阻害剤、ＳＴＡＴ１阻害剤を、単独で、または組み合わせて、本願明細書において考察される阻害剤を使用して、前治療を行う。
第２の動物モデル系では、阻害剤を、脾臓注射と同時にラットに与える。
阻害剤が転移コロニの形成を阻害するものと予想され、転移の形成に、これらのリンタンパク質酵素の活性が必要で、かつに十分であることを確認し、また、ｅｒｋおよびａｋｔの活性化を通じたｅｇｆｒおよびｃａｂｌの成長因子経路内のこれらのタンパク質が、予後の決定および予防のための治療標的の両方の好適な候補であるという機構に関する証拠を提供する。
当業者は、上の説明から本発明の基本的な特徴を容易に確認することができ、また、本発明の精神およびその範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更および改良を行って、様々な用法および条件に適合させることができ、本発明を最大限に利用することができる。上述の好適な特定の実施形態は、例示的なものに過ぎず、またどのような場合であっても本発明の範囲を制限するものではないと解釈されたい。２００６年１０月２７日に出願の米国暫定特許出願第ＵＳ６０／８５４，７２４号、および図面を含む、上述の全ての出願、特許、および刊行物の全ての開示は、参照することによって、その全体が本願明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌を有する対象が、予後不良であるかどうか、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有するかどうかを予測するための方法であって、陽性および／または陰性の参照基準と比較して、前記対象からの試料において、
ａ．ＡＫＴ、および／または
ｂ．ＢＡＤ、および／または
ｃ．ｃＡＢＬ、および／または
ｄ．ＥＲＫ、および／または
ｅ．ＭＡＲＣＫＳ、および／または
ｆ．ｐ３８ＭＡＰＫ、および／または
ｇ．ＳＴＡＴ１、および／または
ｈ．ＰＴＥＮ、および／または
ｉ．ＥＧＦＲ、および／または
ｊ．ＰＡＫ１／２、および／または
ｋ．ＰＫＣゼータ／ラムダ、および／または
ｌ．ＣＯＸ−２タンパク質の総量、
のうちの少なくとも１つのリン酸化状態を決定するステップを含み、
前記陰性の参照基準と比較して、ａ〜ｉのうちの１つ以上のリン酸化状態および／または前記ＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）の大幅な増加、または前記陽性の参照基準と統計的に同じレベルであること、および／または
前記陽性の参照基準と比較して、ｊまたはｋのうちの１つ以上のリン酸化状態の大幅な減少、または前記陰性の参照基準と統計的に同じレベルであることが、
対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示す、
方法。
【請求項２】
さらに、前記リン酸化状態がは、ＡＫＴ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、３８ＭＡＰＫ、および／またはＥＧＦＲに対して測定される、および／または前記タンパク質の総量が、ＣＯＸ２に対して測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リン酸化状態を決定するステップは、陽性および／または陰性の参照基準と比較して、前記対象からの試料において、
ａ．ＡＫＴ（Ｓ４７３）、および／または
ｂ．ＢＡＤ（Ｓ１１２）、および／または
ｃ．ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、および／または
ｄ．ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、および／または
ｅ．ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、および／または
ｆ．ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／または
ｇ．ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、および／または
ｈ．ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、および／または
ｉ．ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、および／または
ｊ．ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）、および／または
ｋ．ＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）、および／または
ｌ．ＣＯＸ−２タンパク質の総量、
のうちの１つ以上のリン酸化レベルを決定することによって実行され、
前記陰性の参照基準と比較して、ａ〜ｉのうちの１つ以上のリン酸化レベルおよび／または前記ＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）の大幅な増加、または前記陽性の参照基準と統計的に同じレベルであること、および／または
前記陽性の参照基準と比較して、ｊまたはｋのうちの１つ以上のリン酸化レベルの大幅な減少、または前記陰性の参照基準と統計的に同じレベルであることが、
対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記リン酸化レベルが、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）に対して測定され、および／または前記タンパク質の総量が、ＣＯＸ２に対して測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有する場合、前記対象に対して積極的療法を投与するステップをさらに含む、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有する場合、前記対象に対して標的療法を投与するステップをさらに含む、請求項１〜５のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＢＡＤ（Ｓ１１２）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、またはＣＯＸ−２タンパク質の大幅な増加を呈した場合、前記対象は、それぞれ、有効量のＡＫＴ、ＢＡＤ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、ＭＡＲＣＫＳ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、またはＣＯＸ−２の阻害剤で治療される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）またはＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）のリン酸化レベルの大幅な減少を呈した場合、前記対象は、それぞれ、有効量のＰＡＫ１／２またはｐＰＫＣゼータ／ラムダの活性化剤で治療される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的療法は、前記阻害剤および／または活性化剤のうちの２つ以上の併用治療を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）および／またはｃＡＢＬ（Ｔ７３５）のリン酸化レベルの大幅な増加を呈した場合、前記対象は、それぞれ、有効量の（１）ＥＧＦＲまたはｃＡＢＬの阻害剤、および（２）ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤、またはＡＫＴの阻害剤、あるいはＥＲＫの阻害剤で治療される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、またはＣＯＸ−２の量の大幅な増加を呈した場合、前記対象は、それぞれ、ＡＫＴ阻害剤、ｃＡＢＬ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、またはＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた、有効量のカルボキシアミドイミダゾール（ＣＡＩ）で併用治療を受ける、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｃＡＢＬ阻害剤は、ＧＬＥＥＶＥＣ、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、および／またはＳＵＴＥＮＴであり、前記ｐＥＧＦＲ阻害剤は、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢであり、前記ＣＯＸ−２阻害剤は、ＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸである、請求項７〜１１のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル、および／またはＣＯＸ２タンパク質の総量の大幅な増加を呈した場合、前記対象は、それぞれ、ｐＡＫＴ阻害剤であるＶＱＤ−００２およびまたはエンザスタウリン、ｐＡＢＬ阻害剤であるＧＬＥＥＶＥＣ、ＤＡＳＡＴｌＮＩＢ、および／またはＳＵＴＥＮＴ、ｐＥＲＫ阻害剤であるＣＩ−１０４０および／またはＰＤ０３２５９０１、ｐ３８ＭＡＰＫである阻害剤ＳＣＩＯ−４６９、ＳＢ ２３９０６３、ＶＸ−７０２、および／またはＢＭＳ−５８２９４９、ｐＥＧＦＲ阻害剤であるＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢ、または、ＣＯＸ−２阻害剤であるＥＲＢＩＴＵＸおよび／またはＶＩＯＸＸ、で治療される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
結腸直腸癌を有する対象を治療するための方法であって、前記対象が、それぞれ、ＡＫＴ、ＢＡＤ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、ＭＡＲＣＫＳ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲのリン酸化レベルの大幅な増加を呈した場合、またはＣＯＸ−２タンパク質の量の大幅な増加を呈した場合、有効量のＡＫＴ、ＢＡＤ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、ＭＡＲＣＫＳ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、および／またはＣＯＸ−２の阻害剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１５】
対象の結腸直腸癌を治療するための方法であって、その改善は、前記対象が、予後不良である、および／または後に転移するか、後に転移を発現する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の方法によって予測するステップと、次いで、前記対象を標的療法で治療するステップと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記結腸直腸癌の転移の発生が阻害または予防される、請求項５〜１５のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記阻害剤、活性化剤、および／または積極的治療と組み合わせて、前記対象に従来の化学療法剤を投与するステップをさらに含む、請求項５〜１６のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、およびＥＧＦＲ（Ｙ９９２）の前記リン酸化レベル、および前記ＣＯＸ−２の総量のアッセイに好適な一群の薬剤。
【請求項１９】
ＢＡＤ（Ｓ１１２）、ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）、および／またはＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）の前記リン酸化レベルのアッセイに好適な１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項１８に記載の一群の薬剤。
【請求項２０】
前記リンタンパク質の前記リン酸化状態のアッセイに好適な前記薬剤は、前記タンパク質の指示されたリン酸化アイソフォームに対して特異的な抗体である、および／または前記ＣＯＸ−２タンパク質の量を測定するための前記薬剤は、ＣＯＸ−２タンパク質に対して特異的な抗体である、請求項１８または１９に記載の一群の薬剤。
【請求項２１】
前記抗体のうちの１つ以上は、モノクローナル抗体である、請求項２０に記載の一群の薬剤。
【請求項２２】
結腸直腸癌である対象に対して、予後、後の転移の発現の可能性、または積極的療法を投与する望ましさを予測するためのキットであって、任意選択で容器内に、請求項１８〜２１のうちのいずれかに記載の一群の薬剤を含む、キット。
【請求項２３】
有効量の、
（ａ）ＥＧＦＲまたはｃＡＢＬの阻害剤、および
（ｂ）ｐ３８ＭＡＰＫ、またはＡＫＴ、あるいはＥＲＫの阻害剤、ならびに
薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
有効量の、
（ａ）カルボキシアミドイミダゾール（ＣＡＩ）、および
（ｂ）ｐＡＫＴ阻害剤、ｃＡＢＬ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、および／またはｐＥＧＦＲ阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
前記ＥＧＦＲの阻害剤は、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢであり、および／または
前記ｃＡＢＬの阻害剤は、ＧＬＥＥＶＥＣ、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、および／またはＳＵＴＥＮＴであり、および／または
前記ＣＯＸ−２の阻害剤は、ＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸである、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記タンパク質マーカーのうちの２つが測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質マーカーのうちの４つが測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質マーカーのうちの６つ全てが測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象から組織標本または生検を得るステップと、
上皮細胞を分離するために、前記組織標本または生検をレーザキャプチャマイクロダイセクションに供するステップと、
上皮細胞を溶解するステップと、
前記陰性および陽性の参照基準と比較して、前記ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１９２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル、および／または前記ＣＯＸ−２の総量を決定するように、イムノアッセイによって前記溶解物を分析するステップと、
をさらに含む、請求項４または２６〜２８のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶解物は、サスペンションビードアレイまたは逆相アレイとして計量分配され、次いでイムノアッセイに供されるか、または
前記溶解物は、抗体またはアプタマのアレイと接触し、免疫学的アッセイに供される、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象から組織標本または生検を得るステップと、
前記ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１９２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル、および／または前記ＣＯＸ−２の総量が、進行の遅い結腸直腸癌患者の集団から得られた組織標本または生検と比較して、大幅に増加したかどうか、および／または侵襲的な結腸直腸癌患者の集団から得られた組織標本または生検と統計的に同じであるかどうかを決定するように、組織化学的方法によって、前記組織標本または生検を分析するステップと、
をさらに含む、請求項４または２６〜２８のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１】
結腸直腸癌を有する対象が、予後不良であるかどうか、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有するかどうかを予測するための方法であって、陽性および／または陰性の参照基準と比較して、前記対象からの試料において、
ａ．ＡＫＴ、および／または
ｂ．ＢＡＤ、および／または
ｃ．ｃＡＢＬ、および／または
ｄ．ＥＲＫ、および／または
ｅ．ＭＡＲＣＫＳ、および／または
ｆ．ｐ３８ＭＡＰＫ、および／または
ｇ．ＳＴＡＴ１、および／または
ｈ．ＰＴＥＮ、および／または
ｉ．ＥＧＦＲ、および／または
ｊ．ＰＡＫ１／２、および／または
ｋ．ＰＫＣゼータ／ラムダ、および／または
ｌ．ＣＯＸ−２タンパク質の総量、
のうちの少なくとも１つのリン酸化状態を決定するステップを含み、
前記陰性の参照基準と比較して、ａ〜ｉのうちの１つ以上のリン酸化状態および／または前記ＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）の大幅な増加、または前記陽性の参照基準と統計的に同じレベルであること、および／または
前記陽性の参照基準と比較して、ｊまたはｋのうちの１つ以上のリン酸化状態の大幅な減少、または前記陰性の参照基準と統計的に同じレベルであることが、
対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示す、
方法。
【請求項２】
さらに、前記リン酸化状態がは、ＡＫＴ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、３８ＭＡＰＫ、および／またはＥＧＦＲに対して測定される、および／または前記タンパク質の総量が、ＣＯＸ２に対して測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リン酸化状態を決定するステップは、陽性および／または陰性の参照基準と比較して、前記対象からの試料において、
ａ．ＡＫＴ（Ｓ４７３）、および／または
ｂ．ＢＡＤ（Ｓ１１２）、および／または
ｃ．ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、および／または
ｄ．ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、および／または
ｅ．ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、および／または
ｆ．ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／または
ｇ．ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、および／または
ｈ．ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、および／または
ｉ．ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）、および／または
ｊ．ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）、および／または
ｋ．ＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）、および／または
ｌ．ＣＯＸ−２タンパク質の総量、
のうちの１つ以上のリン酸化レベルを決定することによって実行され、
前記陰性の参照基準と比較して、ａ〜ｉのうちの１つ以上のリン酸化レベルおよび／または前記ＣＯＸ−２タンパク質の総量（ｌ）の大幅な増加、または前記陽性の参照基準と統計的に同じレベルであること、および／または
前記陽性の参照基準と比較して、ｊまたはｋのうちの１つ以上のリン酸化レベルの大幅な減少、または前記陰性の参照基準と統計的に同じレベルであることが、
対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記リン酸化レベルが、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）に対して測定され、および／または前記タンパク質の総量が、ＣＯＸ２に対して測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有する場合、前記対象に対して積極的療法を投与するステップをさらに含む、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、予後不良である、および／または転移する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有する場合、前記対象に対して標的療法を投与するステップをさらに含む、請求項１〜５のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＢＡＤ（Ｓ１１２）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、またはＣＯＸ−２タンパク質の大幅な増加を呈した場合、前記対象は、それぞれ、有効量のＡＫＴ、ＢＡＤ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、ＭＡＲＣＫＳ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、またはＣＯＸ−２の阻害剤で治療される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）またはＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）のリン酸化レベルの大幅な減少を呈した場合、前記対象は、それぞれ、有効量のＰＡＫ１／２またはｐＰＫＣゼータ／ラムダの活性化剤で治療される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的療法は、前記阻害剤および／または活性化剤のうちの２つ以上の併用治療を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）および／またはｃＡＢＬ（Ｔ７３５）のリン酸化レベルの大幅な増加を呈した場合、前記対象は、それぞれ、有効量の（１）ＥＧＦＲまたはｃＡＢＬの阻害剤、および（２）ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤、またはＡＫＴの阻害剤、あるいはＥＲＫの阻害剤で治療される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベルの大幅な増加、またはＣＯＸ−２の量の大幅な増加を呈した場合、前記対象は、それぞれ、ＡＫＴ阻害剤、ｃＡＢＬ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、またはＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた、有効量のカルボキシアミドイミダゾール（ＣＡＩ）で併用治療を受ける、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｃＡＢＬ阻害剤は、ＧＬＥＥＶＥＣ、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、および／またはＳＵＴＥＮＴであり、前記ｐＥＧＦＲ阻害剤は、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢであり、前記ＣＯＸ−２阻害剤は、ＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸである、請求項７〜１１のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル、および／またはＣＯＸ２タンパク質の総量の大幅な増加を呈した場合、前記対象は、それぞれ、ｐＡＫＴ阻害剤であるＶＱＤ−００２およびまたはエンザスタウリン、ｐＡＢＬ阻害剤であるＧＬＥＥＶＥＣ、ＤＡＳＡＴｌＮＩＢ、および／またはＳＵＴＥＮＴ、ｐＥＲＫ阻害剤であるＣＩ−１０４０および／またはＰＤ０３２５９０１、ｐ３８ＭＡＰＫである阻害剤ＳＣＩＯ−４６９、ＳＢ ２３９０６３、ＶＸ−７０２、および／またはＢＭＳ−５８２９４９、ｐＥＧＦＲ阻害剤であるＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢ、または、ＣＯＸ−２阻害剤であるＥＲＢＩＴＵＸおよび／またはＶＩＯＸＸ、で治療される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
結腸直腸癌を有する対象を治療するための方法であって、前記対象が、それぞれ、ＡＫＴ、ＢＡＤ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、ＭＡＲＣＫＳ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲのリン酸化レベルの大幅な増加を呈した場合、またはＣＯＸ−２タンパク質の量の大幅な増加を呈した場合、有効量のＡＫＴ、ＢＡＤ、ｃＡＢＬ、ＥＲＫ、ＭＡＲＣＫＳ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、および／またはＣＯＸ−２の阻害剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１５】
対象の結腸直腸癌を治療するための方法であって、その改善は、前記対象が、予後不良である、および／または後に転移するか、後に転移を発現する可能性の高い結腸直腸癌の形態を有することを、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の方法によって予測するステップと、次いで、前記対象を標的療法で治療するステップと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記結腸直腸癌の転移の発生が阻害または予防される、請求項５〜１５のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記阻害剤、活性化剤、および／または積極的治療と組み合わせて、前記対象に従来の化学療法剤を投与するステップをさらに含む、請求項５〜１６のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１８２）、およびＥＧＦＲ（Ｙ９９２）の前記リン酸化レベル、および前記ＣＯＸ−２の総量のアッセイに好適な一群の薬剤。
【請求項１９】
ＢＡＤ（Ｓ１１２）、ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２−１５６）、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＰＴＥＮ（Ｓ３８０）、ＰＡＫ１／２（Ｓ１１９／２０４）、および／またはＰＫＣゼータ／ラムダ（Ｔ４１０−４０３）の前記リン酸化レベルのアッセイに好適な１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項１８に記載の一群の薬剤。
【請求項２０】
前記リンタンパク質の前記リン酸化状態のアッセイに好適な前記薬剤は、前記タンパク質の指示されたリン酸化アイソフォームに対して特異的な抗体である、および／または前記ＣＯＸ−２タンパク質の量を測定するための前記薬剤は、ＣＯＸ−２タンパク質に対して特異的な抗体である、請求項１８または１９に記載の一群の薬剤。
【請求項２１】
前記抗体のうちの１つ以上は、モノクローナル抗体である、請求項２０に記載の一群の薬剤。
【請求項２２】
結腸直腸癌である対象に対して、予後、後の転移の発現の可能性、または積極的療法を投与する望ましさを予測するためのキットであって、任意選択で容器内に、請求項１８〜２１のうちのいずれかに記載の一群の薬剤を含む、キット。
【請求項２３】
有効量の、
（ａ）ＥＧＦＲまたはｃＡＢＬの阻害剤、および
（ｂ）ｐ３８ＭＡＰＫ、またはＡＫＴ、あるいはＥＲＫの阻害剤、ならびに
薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
有効量の、
（ａ）カルボキシアミドイミダゾール（ＣＡＩ）、および
（ｂ）ｐＡＫＴ阻害剤、ｃＡＢＬ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、および／またはｐＥＧＦＲ阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
前記ＥＧＦＲの阻害剤は、ＴＡＲＣＥＶＡ、ＬＡＰＡＴＩＮＩＢ、ＩＲＥＳＳＡ、ＥＲＢＩＴＵＸ、および／またはＢＥＶＴＵＺＩＭＡＢであり、および／または
前記ｃＡＢＬの阻害剤は、ＧＬＥＥＶＥＣ、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ、および／またはＳＵＴＥＮＴであり、および／または
前記ＣＯＸ−２の阻害剤は、ＶＩＯＸＸおよび／またはＣＥＬＥＢＲＥＸである、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記タンパク質マーカーのうちの２つが測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質マーカーのうちの４つが測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質マーカーのうちの６つ全てが測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象から組織標本または生検を得るステップと、
上皮細胞を分離するために、前記組織標本または生検をレーザキャプチャマイクロダイセクションに供するステップと、
上皮細胞を溶解するステップと、
前記陰性および陽性の参照基準と比較して、前記ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１９２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル、および／または前記ＣＯＸ−２の総量を決定するように、イムノアッセイによって前記溶解物を分析するステップと、
をさらに含む、請求項４または２６〜２８のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶解物は、サスペンションビードアレイまたは逆相アレイとして計量分配され、次いでイムノアッセイに供されるか、または
前記溶解物は、抗体またはアプタマのアレイと接触し、免疫学的アッセイに供される、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象から組織標本または生検を得るステップと、
前記ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｃＡＢＬ（Ｔ７３５）、ＥＲＫ（Ｔ４２／４４）、ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔ１８０−１９２）、および／またはＥＧＦＲ（Ｙ９９２）のリン酸化レベル、および／または前記ＣＯＸ−２の総量が、進行の遅い結腸直腸癌患者の集団から得られた組織標本または生検と比較して、大幅に増加したかどうか、および／または侵襲的な結腸直腸癌患者の集団から得られた組織標本または生検と統計的に同じであるかどうかを決定するように、組織化学的方法によって、前記組織標本または生検を分析するステップと、
をさらに含む、請求項４または２６〜２８のうちのいずれかに記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５０８５１２（Ｐ２０１０−５０８５１２Ａ）
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３４６８５（Ｐ２００９−５３４６８５）
【出願日】平成１９年１０月２９日（２００７．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２７９０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５７３０５
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０９１１８３３０）ジョージ メイソン インテレクチュアル プロパティーズ，インコーポレイテッド オブ フェアファックス，バージニア (3)
【出願人】（５９１１０４１０３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２９日（２００７．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２７９０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５７３０５
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０９１１８３３０）ジョージ メイソン インテレクチュアル プロパティーズ，インコーポレイテッド オブ フェアファックス，バージニア (3)
【出願人】（５９１１０４１０３）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]